ES2228115T3

ES2228115T3 - Material biologico para la preparacion de composiciones farmaceuticas destinadas al tratamiento de mamiferos.

Info

Publication number: ES2228115T3
Application number: ES99950801T
Authority: ES
Inventors: Bruce Acres; Stephane Paul
Original assignee: Transgene SA
Current assignee: Transgene SA
Priority date: 1998-10-22
Filing date: 1999-10-20
Publication date: 2005-04-01
Anticipated expiration: 2019-10-20
Also published as: AU6344499A; CA2344207A1; ATE276364T1; DE69920216D1; DE69920216T2; EP1084246B1; JP2002528466A; WO2000024896A3; US20050221435A1; EP1084246A2; FR2784997A1; PT1084246E; WO2000024896A2; DK1084246T3; AU754505C; AU754505B2

Abstract

Material biológico para la preparación de composiciones farmacéuticas destinadas al tratamiento de mamíferos que comprenden por lo menos una secuencia de ácido nucleico que comprende: (i) un gen que codifica para un anticuerpo o fragmento de anticuerpo fusionado con el campo transmembranario de un polipéptido transmembranario, y (ii) unos elementos que aseguran la expresión de dicho gen in vivo en unas células diana destinadas a ser genéticamente modificadas por dicha secuencia de ácido nucleico; caracterizado porque dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo está expresado en la superficie de la célula diana y es capaz de fijarse a un receptor seleccionado entre el grupo que consiste en el receptor del complejo TCR, más particularmente el TCR-, el TCR- o el CD3, el CD8, el CD4, CD28, LFA-1, 4-1BB, CD47, CD2, CD9, CD45, CD40, a los receptores de citoquinas, tales como IL-7, IL-4, IL-2, IL-15 o GM-CSF, al V14NKT, NKAR, al receptor Fc.

Description

Material biológico para la preparación de composiciones farmacéuticas destinadas al tratamiento de mamíferos.

La invención se refiere al campo de la terapia génica aplicada a la inmunoterapia específica, más particularmente en el marco de tratamientos de enfermedades cuyo agente responsable es un organismo patógeno, tal como en particular un agente bacteriano, parasitario o viral, o en el marco del tratamiento del cáncer. Más particularmente, la invención se refiere a la transferencia a unas células tumorales o infectadas por un agente patógeno, de secuencias de ácido nucleico que codifica para la totalidad o parte de anticuerpos de manera que las células genéticamente modificadas por estas secuencias de ácido nucleico expresan en su superficie dichos anticuerpos, y más particularmente unos anticuerpos capaces de fijarse a un polipéptido presente en la superficie de una célula efectora citotóxica o de un linfocito T helper e implicado en el procedimiento de activación de dicha célula.

Desde hace largo tiempo, la terapia génica ha sido propuesta para corregir los desórdenes observados en el marco de las enfermedades genéticas. Estas enfermedades se explican en particular por un mal funcionamiento de la expresión de genes específicos o por una expresión de polipéptidos mutados no funcionales en por lo menos un tipo celular. La terapia génica consiste en este caso en transferir a estas células diana específicas extraídas y después reintroducidas en el cuerpo humano, o directamente en los órganos afectados, la información genética capaz de corregir el defecto observado. Podrá tratarse por ejemplo de un gen que codifica para la proteína CFTR en el caso de la mucoviscidiosis o del gen que codifica para la distrofina en el caso de la miopatía de Duchenne. En el marco de esta aproximación, la información genética es introducida o bien in vitro en una célula extraída del órgano, siendo la célula modificada a continuación reintroducida en el organismo (procedimiento ex vivo) o bien directamente in vivo en el tejido apropiado. Numerosas publicaciones describen la utilización de protocolos de terapia génica a fin de obtener en las células diana la expresión de una proteína que presenta un interés terapéutico por introducción de la información genética correspondiente.

Sin embargo, el interés de este tipo de terapia no se aplica al tratamiento de las afecciones puramente genéticas y puede también permitir la eliminación de tumores, o de agentes patógenos, tales como los agentes bacterianos o virales, o de células infectadas por dichos agentes patógenos, o por defecto retardar su progresión.

La respuesta inmune dirigida contra un antígeno específico puede ser dividida en dos categorías distintas, una que pone en juego los anticuerpos (respuesta inmune de tipo humoral), la otra las células efectoras citotóxicas tales como por ejemplo los macrófagos, los linfocitos citotóxicos (CTL) o las células asesinas (NK) así como los linfocitos T helper, en particular los LTCD4 (respuesta inmune de tipo celular). Más particularmente, los dos tipos de respuestas se distinguen en que los anticuerpos reconocen los antígenos en su forma tridimensional mientras que los linfocitos T, por ejemplo, reconocen unas porciones peptídicas de dichos antígenos, asociadas a unas glicoproteínas codificadas por los genes del complejo principal de histocompatibilidad (o CNH), en particular los genes del complejo principal de histocompatibilidad de tipo I que son expresados de forma ubicuitaria en la superficie de las células o los genes del complejo principal de histocompatibilidad del tipo II que son expresados de forma específica en la superficie de las células implicadas en la presentación de los antígenos (APC).

Según un primer aspecto, la respuesta inmune de tipo celular está caracterizada porque las células T de tipo CD4+ (células T "helper"), a consecuencia de un fenómeno de activación bien conocido (para una revista ver Alberola-Ila, 1997, Annu. Rev. Immunol., 15, 125-154) producen unas citoquinas que a su vez inducen la proliferación de células APC capaces de producir dichas citoquinas; la diferenciación celular de los linfoncitos B capaces de producir unos anticuerpos específicos; y la estimulación de los linfocitos T citotóxicos (CTL). Según un segundo aspecto de la respuesta inmune celular, las células efectoras citotóxicas tales como por ejemplo los linfocitos de tipo CD8+ (CTL) son activados a) después de interacción con unos péptidos antigénicos fijados sobre y presentados por las glicoproteínas soportadas por las células ubicuitarias y codificadas por los genes que pertenecen al sistema CMH I, y b) eventualmente por las citoquinas producidas por los CD4+. Los CTL así activados son entonces capaces de destruir las células que expresan dicho péptido antigénico.

En el caso particular de los cánceres, Hellstrom et al., (1969, Adv. Cancer Res. 12, 167-223) han demostrado que la defensa del organismo con respecto a los tumores descansa muy particularmente en la respuesta inmunitaria que ponen en juego los linfocitos T, en particular los linfocitos T citotóxicos. Sin embargo, numerosos trabajos han demostrado que la mayor parte de estos efectores inmunitarios, específicos o no, son ineficaces para permitir la eliminación o la detención de progresión de un tumor. Es la razón por la cual es deseable disponer de un procedimiento de estimulación de la respuesta inmune dirigida contra los tumores, y más particularmente de la respuesta que hace intervenir los linfocitos citotóxicos CTL, a fin de disponer de procedimientos de prevención o de tratamiento de los estados cancerosos más eficaces. De manera idéntica, se ha demostrado que el sistema inmunitario es a menudo ineficaz en el caso de infecciones, virales en particular, ver ejemplo el caso de las infecciones debidas al VIH (Virus de Inmunodeficiencia Humana).

Según una primera alternativa, se ha propuesta adaptar los procedimientos de terapia génica ya bien conocidos y transferir a las células diana, más particularmente a las células cancerosas, unos genes inmunoestimuladores (inmunoterapia) susceptibles de inducir o de activar una respuesta inmune por mediación celular con respecto al tumor, de genes que codifican para las citoquinas (Colombo et al., 1994, Inmumology Today, 15, 48-51), de genes citotóxicos que confieren una toxicidad a las células que los expresan, por ejemplo, el gen tk del virus Herpes Simplex de tipo I (HSV-1), o de antioncógenos, tales como el gen asociado al retinoblastoma o p53, o de polinucleótidos capaces de inhibir la actividad de un oncógeno, tales como por ejemplo las moléculas antisentidos o los ribónimos capaces de degradar los ARN mensajeros específicos de los oncógenos. No obstante, en la mayoría de los casos, las células así modificadas adolecen de falta de especifidad con respecto al tumor y no permiten una aproximación terapéutica satisfactoria.

Se ha propuesto también otra aproximación que alía las ventajas de la terapia génica y la utilización de anticuerpos específicos. En el curso de los últimos años han sido caracterizados numerosos antígenos tumorales que han permitido más particularmente la identificación de anticuerpos, en particular de anticuerpos monoclonales específicos de estos antígenos. Por otra parte, ha sido descrita la producción in vitro de anticuerpos, de fragmentos de anticuerpos o de derivados de anticuerpos tales como los anticuerpos quiméricos, por ingeniería genética, en unas células eucariotas (EP 120 694 ó EP 125 023). Así, numerosas estrategias terapéuticas han sido propuestas, por ejemplo, para el tratamiento o la prevención de linfomas B (Yefenof et al., 1993, Current Opinion in Immunology, 5, 740-744), que descansan en la administración al paciente de anticuerpos terapéuticos que apuntan a unos antígenos tumorales a fin de neutralizar el agente causal de la enfermedad. Desgraciadamente, estos anticuerpos aunque muy útiles para la detección y el diagnóstico de los cánceres han resultado no satisfactorios desde un punto de vista terapéutico puesto que conducen, por ejemplo, a unas reacciones inmunes limitadas, dirigidas únicamente contra unos epitopos inmunodominantes o contra unos antígenos que presentan una gran variabilidad.

La solicitud de patente internacional (WO 94/29446) describe la expresión intracelular de secuencias de ADN que codifican para unos anticuerpos. Esta aproximación permite prever una terapia génica que descansa en el apuntado de componentes celulares no accesibles por los procedimientos de vacunación y se caracteriza porque la aproximación descrita no implica el desarrollo de una respuesta inmunitaria, actúa intracelularmente y por consiguiente no permite el tratamiento eficaz de tumores.

La solicitud de patente internacional (WO 98/31808) se refiere por el contrario a la expresión in vivo de genes que codifican para unos anticuerpos o unos fragmentos de anticuerpos por unas células capaces de segregar dichos anticuerpos en la circulación sanguínea del mamífero portador de las células genéticamente modificadas por el gen que codifica para el anticuerpo. La ventaja de esta invención descansa en la posibilidad de mantener a largo plazo un nivel basal de anticuerpos en el paciente tratado.

Se ha encontrado ahora que es posible dirigir de nuevo la respuesta inmunitaria celular expresando en la superficie de células diana, en particular tumorales o infectadas por un agente patógeno, la totalidad o parte de un anticuerpo capaz de fijarse a un polipéptido presente en la superficie de células efectoras citotóxicas o de linfocitos T helper. Más particularmente, se ha demostrado que según la presente invención, estas células diana genéticamente modificadas permiten dirigir la activación de las células efectoras citotóxicas o de linfocitos T helper, aumentar el efecto citotóxico de estas células, en particular activadas, con respecto a las células diana, y dinamizar la respuesta inmune por mediación celular que se produce naturalmente con respecto a las células tumorales o infectadas, genéticamente modificadas o no. Esto puede así traducirse por la lisis y la eliminación de dichas células diana, de las células próximas y al término por la eliminación del tumor o de la infección.

La presente invención se refiere en primer lugar a un material biológico para la preparación de composiciones farmacéuticas destinadas al tratamiento de mamíferos que comprende:

-: o bien por lo menos una secuencia de ácido nucleico que comprende por lo menos un gen de interés terapéutico y unos elementos que aseguran la expresión de dicho gen in vivo en unas células diana destinadas a ser modificadas genéticamente por dicha secuencia de ácido nucleico;

-: o bien por lo menos una célula de mamífero que no produce naturalmente unos anticuerpos y modificada genéticamente in vitro por lo menos por una secuencia de ácido nucleico anterior,

caracterizado porque dicho gen de interés terapéutico codifica para la totalidad o una parte de un anticuerpo que se expresará en la superficie de dicha célula del mamífero y porque dicho anticuerpo es capaz de fijarse en un polipéptido presente en la superficie de una célula efectora citotóxica o de un linfocito T helper, e implicado en el procedimiento de activación de dicha célula.

Por "secuencia de ácido nucleico", se entiende designar un fragmento de ADN y/o de ARN, de doble rama o simple rama, lineal o circular, natural aislado o de síntesis, que designa un encadenamiento preciso de nucleótidos, modificados o no, que permiten definir un fragmento o una región de un ácido nucleico sin limitación de tamaño. Según un modo de realización preferido, se trata de un ácido nucleico elegido entre el grupo que consiste en un cADN; un ADN genómico; un ADN plasmídico; un ARN mensajero.

Según la invención, dicha "secuencia de ácido nucleico" comprende por lo menos un "gen de interés terapéutico" y unos elementos de expresión de dicho gen de interés. Un "gen de interés terapéutico" de este tipo codifica en para la totalidad o una parte de un anticuerpo transmembranario nativo, o para un derivado de dicho anticuerpo, siempre y cuando dicho anticuerpo, fragmento o derivado de anticuerpo se exprese en la superficie de la célula diana de mamífero genéticamente modificada y porque dicho anticuerpo es capaz de fijarse en un polipéptido presente en la superficie de una célula efectora citotóxica o de un linfocito T helper e implicado en el procedimiento de activación de dicha célula. Más particularmente, por "fragmento" de anticuerpos se entiende designar los fragmentos F(ab)_{2}, Fab', Fab, sFv (Blazar et al., 1997, Journal of Immunology, 159, 5821-5833; Bird et al., 1988, Science, 242, 423-426) de un anticuerpo nativo y por "derivado" por ejemplo un derivado quimérico de dicho anticuerpo (ver por ejemplo los quiméricos, los anticuerpos anti CD3 Rata/Hombre en Arakawa et al., 1996, J. Biochem., 120, 657-662 o las inmunotoxinas tales como sFv-toxina de Chaudary et al., 1989, Nature 339, 394-397). Por "anticuerpo transmembranario" se entiende designar un anticuerpo del que por lo menos la región funcional capaz de reconocer y fijarse a su antígeno específico está expresada en la superficie de las células diana para permitir dichos reconocimiento y fijación. Más particularmente, los anticuerpos según la presente invención consisten en unos polipéptidos de fusión que comprenden los aminoácidos que definen dicha región funcional y una secuencia de aminoácidos (polipéptido transmembranario) que permite el anclaje en el seno de una doble capa lipídica membranaria de la célula diana o en la superficie externa de esta bicapa. Las secuencias nucleicas que codifican para numerosos polipéptidos trasnmembranarios se describen en la literatura. Según un caso preferido de la invención, dicho polipéptido transmembranario se selecciona entre el grupo que consiste en una glicoproteína, una lipoproteína, en un receptor tal como la totalidad o parte de los complejos evocados más adelante en la solicitud (CD4, Fc, gp160 del VIH por ejemplo), y más particularmente entre el grupo que consiste en la glicoproteína del virus de la rabia (solicitud de patente francesa nº FR 97 09152), el CD4 (Weitjens et al., 1998, Gene Therapy, 5, 1195-1203), la gp160, el Fc. Según un caso totalmente ventajoso, la secuencia de ácido nucleico que codifica para la cadena pesada del anticuerpo será fusionada con la secuencia de ácido nucleico que codifica para un llamado polipéptido transmembranario.

Por "elementos que aseguran la expresión de dicho gen in vivo", se entiende designar los elementos necesarios a fin de asegurar la expresión de dicho gen después de su transferencia a una célula diana. Se trata en particular de las secuencias promotoras y/o de las secuencias de regulación eficaces en dicha célula, y eventualmente las secuencias requeridas para permitir la expresión en la superficie de las células diana de dicho polipéptido. El promotor utilizado puede ser un promotor viral ubicuitario o específico de tejido o también un promotor sintético. A título de ejemplo, se mencionarán los promotores tales como los promotores de los virus RSV (Rous Sarcoma Virus), MPSV, SV40 (Simian Virus), CMV (Cytomegalovirus) o del virus de la viruela, los promotores del gen que codifican para la creatinaquinasa muscular, para la actina, para el surfactante pulmonar. Es además posible elegir una secuencia promotora específica de un tipo celular dado, o activable en unas condiciones definidas. La literatura proporciona un gran número de informaciones relativas a dichas secuencias promotoras. Por otra parte, dicho ácido nucleico puede comprender por lo menos dos secuencias, idénticas o diferentes, que presentan una actividad de promotor de transcripción y/o por lo menos dos genes, idénticos o diferentes, situados uno con respecto al otro de manera contigua, alejada, en el mismo sentido o en sentido inverso, para que la función de promotor de trancripción o la transcripción de dichos genes no sea afectada. Asimismo, en este tipo de construcción de ácido nucleico, es posible introducir unas secuencias nucleicas "neutras" o intrones que no perjudican la transcripción y son empalmadas antes de la etapa de traducción. Dichas secuencias y sus utilizaciones están descritas en la literatura (WO 94/29471). Dicho ácido nucleico puede también contener unas secuencias requeridas para el transporte intracelular, para la replicación y/o para la integración, para la transcripción o la traducción. Dichas secuencias son bien conocidas por el experto en la materia. Por otra parte, los ácidos nucleicos utilizables según la presente invención pueden también ser unos ácidos nucleicos modificados de manera que no les es posible integrarse en el genoma de la célula diana o unos ácidos nucleicos estabilizados con la ayuda de agentes, tales como por ejemplo la espermina, que como tales no tienen efecto sobre la eficacia de la transfección.

Según un primer modo de realización de la invención, la secuencia de ácido nucleico es una secuencia de ADN o ARN desnuda, es decir libre de cualquier compuesto que facilite su introducción en las células (transferencia de secuencia de ácido nucleico). Sin embargo, a fin de favorecer su introducción en las células diana a fin de obtener las células genéticamente modificadas de la invención, esta secuencia de ácido nucleico puede estar en forma de un vector, y más particularmente en forma de un vector viral tal como por ejemplo un vector adenoviral, retroviral, un vector derivado de un poxvirus, en particular el derivado del virus de la viruela vacuna o del Modified Virus Ankara (MVA) o de un vector no viral tal como por ejemplo un vector que consiste en por lo menos una llamada secuencia de ácido nucleico complejada o conjugada con por lo menos una molécula o sustancia portadora seleccionada entre el grupo que consiste en un anfifilo catiónico, en particular un lípido catiónico, un polímero catiónico o neutro, un compuesto polar prótico en particular elegido entre el propilenglicol, el polietilenglicol, el glicerol, el etanol, la 1-metil L -2-pirrolidona o sus derivados, y un compuesto polar aptrótico en particular elegido entre el dimetilsulfóxido (DMSO) el dietilsulfóxido, el di-n-propilsulfóxido, la dimetilsulfona, el sulfolano, la dimetilformamida, la dimetilacetamida, la tetrametilurea, el acetonitrilo o sus derivados.

Por otra parte, dichos vectores pueden además comprender unos elementos de apuntado que pueden permitir dirigir la transferencia de secuencia de ácido nucleico hacia ciertos tipos celulares o ciertos tejidos particulares (células tumorales, células del epitelio pulmonar, célula hematopoyética, célula muscular, célula nerviosa...). Pueden también permitir dirigir la transferencia de una sustancia activa hacia ciertos compartimientos intracelulares preferidos tales como el núcleo y los mitocondrios, por ejemplo. Puede además tratarse de elementos que facilitan la penetración en el interior de la célula o la lisis de los endosomas. Dichos elementos de apuntado están ampliamente descritos en la literatura. Puede por ejemplo tratarse de la totalidad o parte de lectinas, de péptidos, en particular el péptido JTS-1 (ver solicitud de patente WO 94/40958), de oligonucleótidos, de lípidos, de hormonas, de vitaminas, de antígenos, de anticuerpos, de ligandos específicos de receptores membranarios, de ligandos susceptibles de reaccionar con un antiligando, de péptidos fusogénicos, de péptidos de localización nuclear, o de una combinación de dichos compuestos. En particular, puede tratarse de residuos galactosil que permiten apuntar el receptor de las asialoglicoproteínas a la superficie de las células hepáticas, de ligandos que pueden interactuar con unos receptores tales como los receptores de factores de crecimiento, unos receptores de citoquinas, de lectinas, de proteínas de adhesión, puede también tratarse de un fragmento de anticuerpo tal como el fragmento Fab, de un péptido fusogénico INF-7 derivado de la subunidad HA-2 de la hemaglutinina del virus influenza (Planck et al., 1994, J. Biol. Chem. 269, 12918-12924), de una señal de localización nuclear derivada del antígeno T del virus SV40 o de la proteína EBNA-1 del virus Epstein Barr.

Según la invención, el anticuerpo expresado en la superficie de las células diana es capaz de fijarse a un polipéptido presente en la superficie de una célula efectora citotóxica o de un linfocito T helper, en particular un linfocito T helper CD4, e implicado en el procedimiento de activación de dicha célula, y más particularmente a un receptor directamente implicado en dicho procedimiento. Como se ha descrito anteriormente, este fenómeno de activación de las células efectoras citotóxicas o de linfocitos T helper es un elemento determinante de la reacción inmunitaria con mediación celular. Sin embargo, conviene destacar que en el marco de la realización de la presente invención, no es indispensable que el procedimiento de activación tenga lugar después de la fijación por el anticuerpo expresado según la invención en la superficie de las células diana. En efecto, de acuerdo con la invención, este anticuerpo puede también ligarse a los péptidos tales como los definidos pero presentes en unas células efectoras citotóxicas o de linfocitos helper ya activados. Por "células efectoras citotóxicas" se entiende designar los macrófagos, los linfocitos T citotóxicos (TCL) y las células asesinas (NK), así como sus células derivadas tales como por ejemplo las LAK, (^{2}Versteeg, 1992, Immunology Today, 13, 244-247; Brittende et al., 1996, Cancer 77, 1226-1243; Poplack et al., 1976, Blood 48, 809-816). Por "linfocitos T helper", se entiende designar en particular los CD4 que permiten, después de activación, la secreción de factores de activación de las células efectoras de la respuesta inmune (ver más adelante). Los polipéptidos, y en particular los receptores, expresados en la superficie de estas células y que están implicados en la activación de dichas células consisten en particular en la totalidad o parte del complejo TCR, más particularmente el TCR-\alpha, el TCR-\beta o el CD3, la totalidad o parte de los complejos CD8, CD4, CD28, LFA-1, 4-1BB (Melero et al., 1998, Eur. J. Immunol., 28, 1116-1121), CD47, CD2, CD1, CD9, CD45, CD30, CD40, la totalidad o parte de los receptores de citoquinas (Finke et al., 1998, Gene Therapy, 5, 31-39), tales como IL-7, IL-4, IL-2, IL-15 o GM-CSF, la totalidad o parte del complejo receptor de las células NK tal como por ejemplo V\alpha14NKT (Kawano et al., 1998, Immunology, 95, 5690-5693), NKAR, Nkp46 (Pessino et al., 1998, J. Exp. Med., 188, 953-960), Nkp44, la totalidad o parte de los receptores de macrófagos tales como por ejemplo el receptor Fc (Deo et al., 1997, Immunology Today, 18, 127-135). Según un modo de realización particular, es también posible prever modificar genéticamente, y en particular in vivo, las células efectoras citotóxicas o los linfocitos T helper de manera que expresen en su superficie un polipéptido, naturalmente no expresado por estas células, y capaz de inducir el procedimiento de activación de dichas células, por la introducción en estas células de secuencias de ácido nucleico que contienen el gen que codifica para dicho polipéptido. De acuerdo con la presente invención, es entonces posible seleccionar una secuencia de ácido nucleico que contiene un gen de interés terapéutico que codifica para la totalidad o parte de un anticuerpo susceptible de ser expresado en la superficie de las células diana del paciente a tratar, siendo dicho anticuerpo capaz de fijarse a dicho polipéptido naturalmente no expresado por estas células efectoras citotóxicas o linfocitos T helper.

Más particularmente, la presente invención descansa en la posibilidad de clonar los genes que codifican para la totalidad o parte del anticuerpo y expresar dicho anticuerpo en unas células después de transferencia de dichos genes a dichas células a partir de los vectores tales como los descritos anteriormente. La literatura propone un gran número de ejemplos de genes que codifican para unos anticuerpos capaces de reaccionar con dichos polipéptidos o receptores. Está al alcance del experto en la materia obtener las secuencias de ácidos nucleicos que codifican para dichos anticuerpos. Se citarán por ejemplo los genes que codifican para las cadenas ligera y pesada del anticuerpo YTH 12.5 (anti CD3) (Routledge et al., 1991, Eur. J. Immuno. 211, 2717-2725), del anti CD3 según Arakawa et al., 1996, J. Biochem., 120, 657-662). Las secuencias de ácido nucleico de dichos anticuerpos son fácilmente identificables a partir de las bases de datos comúnmente utilizadas por el experto en la materia.

Es también posible, a partir de hibridomas disponibles en la ATCC y que segregan unos anticuerpos específicos de polipéptidos presentes en la superficie de células efectoras citotóxicas o de linfocitos T helper e implicados en el procedimiento de activación de dichas células (por ejemplo un hibridoma excretado por unas immunoglobulinas G\gamma2b-k dirigidas contra los receptores de TCR), clonar las secuencias de ácidos nucleicos que codifican para las cadenas pesadas y/o ligeras de estos diferentes anticuerpos por los procedimientos de amplificación tales como la RT-PCR con la ayuda de oligonucleótidos específicos o las técnicas que utilizan unos bancos de cADN (Maniatis et al., 1982, Molecular cloning. A laboratory manual. C.S.H. Laboratory, Cold Spring Harbor, New York). Las secuencias así clonadas están entonces disponibles para su clonado en unos vectores. Según un caso preferido de la invención, la secuencia de ácido nucleico que codifica para la cadena pesada del anticuerpo es fusionada por recombinación homóloga con al secuencia de ácido nucleico que codifica para un polipéptido transmembranario tal como la glicoproteína rábica (estas técnicas de biología moleculares están perfectamente descritas en la solicitud de patente francesa nº FR 97 09152) o la gp160 (Polydefkis et al., 1990, J. Exp. Med., 171, 875-887).

Entre las células diana de mamífero que la invención se propone eliminar o limitar en su progresión, se pueden citar más significativamente las células tumorales, las células infectadas por un agente patógeno viral o las células infectadas por un agente patógeno bacteriano. Según la invención, la expresión en la superficie de estas células de la totalidad o parte de un anticuerpo capaz de fijarse a un polipéptido presente en la superficie de una célula efectora citotóxica o de un linfocito T helper e implicado en el procedimiento de activación de dicha célula, permite dirigir la repuesta immune citotóxica hacia una diana dada, y más particularmente dirigir esta respuesta al nivel de un tumor o de un foco infeccioso.

A título de "agente patógeno viral" se puede por ejemplo citar el virus VIH, EBV, CMV, el virus de la hepatitis y los papilomavirus. Por "agente patógeno parasitario", se puede por ejemplo citar la Leishmania lesmmaniae y Plasmodium falciparum.

Según un modo de realización particular, la invención se refiere a un material biológico constituido por lo menos por una célula diana, tal como en particular una célula tumoral o una célula infectada por un agente patógeno viral, que no produce naturalmente unos anticuerpos, en una forma que permita su administración en el organismo de un mamífero, humano o animal, así como eventualmente su cultivo previo, siendo dicha célula genéticamente modificada in vitro por lo menos por una secuencia de ácido nucleico que contiene por lo menos un gen que codifica para la totalidad o parte de un anticuerpo expresado en la superficie de dicha célula diana, y siendo dicho anticuerpo capaz de fijarse a un polipéptido presente en la superficie de una célula efectora citotóxica o de un linfocito T helper tal como los anteriormente descritos. Más particularmente, dicha célula diana proviene o bien del mamífero a tratar, o bien de otro mamífero que el que se ha de tratar. En este último caso, conviene observar que dicha célula diana habrá sufrido un tratamiento que la hace compatible con el mamífero a tratar. Según un caso preferido, por "mamífero" se entiende designar un mamífero humano.

Dicho material biológico, cuando es administrado a un paciente, y más particularmente administrado por vía intratumoral, es capaz de inducir en éste una respuesta inmunitaria por mediación celular que puede conducir a la producción de citoquinas y al efecto citotóxico de las células efectoras que se traducen no solamente por la eliminación de las células administradas sino también por la eliminación de las células próximas que presentan los antígenos, en particular tumorales, susceptibles de ser reconocidos por dichas células citotóxicas activadas.

La invención se refiere por otra parte a la utilización de un material biológico tal como el descrito anteriormente para la preparación de una composición farmacéutica destinada al tratamiento o a la prevención de cánceres o de infecciones virales. Más particularmente, la invención se refiere a la utilización de una secuencia de ácido nucleico que comprende por lo menos un gen de interés terapéutico y unos elementos que aseguran la expresión de dicho gen in vivo en unas células diana modificadas genéticamente por una denominada secuencia de ácido nucleico, codificando dicho gen de interés terapéutico para la totalidad o para una parte de un anticuerpo expresado en la superficie de dicha célula diana y capaz de fijarse en un polipéptido presente en la superficie de una célula efectora citotóxica o de un linfocito T helper e implicado en el procedimiento de activación de dicha célula, para la preparación de composiciones farmacéuticas destinadas a tratar a un mamífero por transferencia de genes.

Para la realización del tratamiento del mamífero mencionado en la presente invención, es posible disponer de composiciones farmacéuticas que comprenden un material biológico tal como el anteriormente descrito, ventajosamente asociado con un vehículo farmacéuticamente aceptable para la administración al hombre o al animal. La utilización de dichos soportes se describe en la literatura. Este vehículo farmacéuticamente aceptable es preferentemente isotónico, hipotónico o presenta una baja hipertonicidad y una fuerza iónica relativamente baja, tal como por ejemplo una solución de sucrosa. Por otra parte, dicha composición puede contener unos solventes, unos vehículos acuosos o parcialmente acuosos tales como el agua estéril, libre de agente pirógeno y unos medios de dispersión por ejemplo. El pH de estas composiciones farmacéuticas es convenientemente ajustado y tamponado según las técnicas convencionales.

Según una variante, la invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende en particular un material biológico como el descrito y un compuesto proteínico naturalmente responsable de o implicado en la activación de las células efectoras citotóxicas o de linfocitos T helper. Más particularmente, un compuesto de este tipo consistirá en una citoquina (The cytokine Handbook, 2ª Edición, Ed. A. W. Thomson, Ac. Press, Harcourt Brace&Company), una quemoquina (Rollins et al, 1997, Blood, 90, 909-928 ; Devalaraja et al, 1999, TIPS, 20, 151-156) o cualquier otro compuesto que permita la coestimulación de las células efectoras citotóxicas (por ejemplo la totalidad o parte de un anticuerpo anti-CD28; Stefan et al, 1997, Cancer Research, 59(8), 1961-1967). De manera preferida, dicho compuesto será el IL2. En una variante de realización, el material biológico según la presente invención podrá comprender, además, una secuencia de ADN que asegura la expresión de un compuesto implicado en la activación de las células efectoras citotóxicas o de linfocitos T helper. En este caso, esta secuencia puede estar contenida en una secuencia de ácido nucleico anteriormente descrita o contenida en una secuencia de ácido nucleico independiente del que contiene dicho gen de interés terapéutico (WO 95/09241).

Según una primera posibilidad, el medicamento puede ser administrado directamente in vivo o por una aproximación ex vivo que consiste en extraer unas células diana del mamífero a tratar, y transfectarlas in vitro según la invención y administrarlas de nuevo a dicho mamífero.

El material biológico según la invención puede ser administrado in vivo en particular en forma inyectable, en especial por vía intratumoral. Se puede también prever una inyección por vía intratraqueal, intranasal, epidérmica, intravenosa, intraarterial, intramuscular, intrapleural, intracerebral por jeringa o cualquier otro medio equivalente. Según otro modo de realización, se pueden utilizar unos sistemas adaptados al tratamiento de las vías aéreas o de las mucosas tales como la inhalación, la instilación, o la aerosolización, por vía tópica, por administración oral o cualquier otro medio perfectamente conocido por el experto en la materia y aplicable a la presente invención. La administración puede tener lugar en dosis única o repetida, una o varias veces después de un cierto plazo de intervalo. La vía de administración y la dosificación más apropiadas varían en función de diferentes parámetros tales como por ejemplo el individuo o de la enfermedad a tratar, o también del ácido nucleico a transferir o del órgano/tejidos diana.

La invención se refiere también a una célula de mamífero que reproduce naturalmente anticuerpos, caracterizada porque es genéticamente modificada por lo menos por una secuencia de ácido que comprende por lo menos un gen de interés terapéutico y unos elementos que aseguran la expresión de dicho gen en dicha célula, codificando dicho gen de interés terapéutico para la totalidad o para una parte de un anticuerpo expresado en la superficie de dicha célula genéticamente modificada y porque dicho anticuerpo es capaz de fijarse en un polipéptido presente en la superficie de una célula efectora citotóxica o de un linfocito T helper e implicado en el procedimiento de activación de dicha célula descrita anteriormente.

Finalmente, la invención se refiere a un procedimiento de preparación de una célula tal como la descrita anteriormente, caracterizado porque se introduce en una célula de mamífero que no produce naturalmente anticuerpos, por cualquier medio apropiado, por lo menos una secuencia de ácido nucleico que comprende por lo menos un gen de interés terapéutico y unos elementos que aseguran la expresión de dicho gen en dicha célula, codificando dicho gen de interés terapéutico para la totalidad o para una parte de un anticuerpo expresado en la superficie de dicha célula diana genéticamente modificada y porque dicho anticuerpo es capaz de fijarse en un polipéptido presente en la superficie de una célula efectora citotóxica o de un linfocito T helper e implicado en el procedimiento de activación de dicha célula, y porque se seleccionan a continuación de entre estas células las modificadas genéticamente por dicha secuencia de ácido nucleico.

Los ejemplos siguientes que ilustran la invención sin limitarla en modo alguno.

Leyenda de las figuras

Figura 1: Test de proliferación sobre esplenocitos murinos (2E5 células/pocillo) activados con unas células P815 armadas con los anticuerpos TR310 y H57-597. Puesta en presencia durante 5 días. Marcado con timidina tritiada 8h. los resultados están expresados en cantidad de timidina tritiada incorporada (10E3 cpm).

Figura 2: Análisis por citometría de flujo de la expresión de los diferentes anticuerpos después de infección de células BHK21 con los diferentes virus recombinantes. A-B-C corresponden a las infecciones realizadas con los virus MVATG14205, MVATG14240 y MVATG14237, respectivamente. (T: marcado negativo con la ayuda de un anticuerpo testigo negativo; m antirrata IgG: marcado con la ayuda de un anticuerpo de rata dirigido contra los IgG de rata; r antihamster IgG: marcado con la ayuda de un anticuerpo de rata dirigido contra los IgG de hamster).

Figura 2A: Análisis de la expresión del anticuerpo TR310

Figura 2B: Análisis de la expresión del anticuerpo KT3

Figura 2C: Análisis de la expresión del anticuerpo H57-597.

Figura 3: Modelo P815 (baja inmunogeneicidad; H2d; CMH1; ICAM1; CD48). Test de proliferación sobre esplenocitos murinos (2.10^{5} células/pocillo) activados con unas células P815 infectadas con los diferentes virus MVA recombinantes. A-B corresponde a la puesta en contacto de 2.10^{5} esplenocitos con 20000 ó 2000 de las diferentes células P815 respectivamente. P815/TR310, P815/H57-597 y P815/R2: P815 armados con los anticuerpos TR310, H57-597 y un anticuerpo testigo, respectivamente; P815/MVATG14205, P815/MVATG14237, P815/MVATG14240: P815 infectadas con los diferentes virus MVA recombinantes; con A y IL-2: testigos positivos que corresponden a la estimulación de esplenocitos con concanavalina A o la interleucina-2 recombinante; células: esplenocitos solos. Se ha indicado el porcentaje de infección con los diferentes virus MVA recombinantes.

Figura 4: Modelo B16F0 (no inmunógeno; H2b) test de proliferación sobre esplenocitos murinos (2.10^{5} células/pocillo) activados con las células B16F0 infectadas con los diferentes virus MVA recombinantes. A-B-C corresponde a la puesta en contacto de 2.10^{5} de esplenocitos con 20000, 10000 ó 2000 de las diferentes células B16F0. B16F0/MVATG14205, B16F0/MVATG14237, B16F0/MVATG14240: B16F0 infectadas con los diferentes virus MVA recombinantes; con A: testigo positivo que corresponde a la estimulación de esplenocitos con concanavalina A; células: esplenocitos solos. Se ha indicado el porcentaje de infección con los diferentes virus MVA recombinantes.

Ejemplo 1 1- Procedimientos 1-1 Construcción de los virus MVA recombinantes

A fin de permitir el clonado de las secuencias de ácido nucleico que codifican para diferentes anticuerpos elegidos por su capacidad para activar los linfocitos T, se han seleccionado tres hibridomas diferentes:

-: hibridoma TR310 (rata anti-Vb7 murino (IgG2b); ATCC HB-219; I. L. Weissman; fusion myelomes murin/splénocytes rat.

-: hibridoma H57-597 (hamster anti-TCRab murino /IgG); ATCC HB-218; Kubo et al, 1989, J. Immunology, 142: 2736-2742; fusion myelomes murin/splénocytes hamster).

-: hibridoma KT3 (rata anti-CD3e murino (IgG2a); Tomonari et al, 1988, Immunogenetics, 28: 455-458; fusion myelomes murin/splénocytes rat).

El clonado de las secuencias que codifican para la totalidad de las diferentes cadenas pesadas y ligeras de estos anticuerpos ha sido realizado según dos procedimientos diferentes a partir de los ARN totales extraídos de los 3 hibridomas:

a): por RT-PCR con la ayuda de oligonucleótidos específicos (Bca BEST^{TM} RNA PCRKit, Takara Shuzo Co., Ltd; Frohman et al, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 8998-9002) definidos de manera que se hibriden a nivel de las regiones conservadas de las secuencias 3' constante y 5' variable que codifican para las inmunoglobulinas correspondientes (ver C. A. Kettleborough et al, 1993, Eur. J. Immunol. 23: 206-211). Más particularmente, estas secuencias han sido definidas con la ayuda de las informaciones siguientes disponibles en el Genebank:

Hibridoma TR310 y KT3 (cadenas pesadas y ligeras de rata):

-: cadena pesada de tipo gamma: Rat anti-acetylcholine receptor antibody gene, rearranged Ig gamma-2a chain, VDJC region, complete cds. Author: Agius, M. A. and Bharati, S. 1993. Número de acceso en el genebank=L22654.

-: cadena ligera de tipo kappa: Rat anti-acetylcholine receptor antibody gene, kappa-chain, VJC region, complete cds. Author: Agius, M. A. and Bharati, S. 1993. Unpublished. Número de acceso en el genebank=L22653.

Hibridoma H57-597: (cadena pesada y ligera de hamster):

-: cadena pesada de tipo gamma: Cricetulus migratorius IgG heavy chain mRNA, complete cds. Author: Whitters, M. J. and Collins, M. 1995. Immunogenetics. 42(3): 227-228. Número de acceso en el genebank=U17166.

-: cadena ligera de tipo lambda: Mus Musculus immunoglobulin lambda cadena (IgL) mRNA, complete cds. Author: Reidl, L. S. Kinoshita, C.M. and Steiner, L.A. 1992. J. Immunol. 149: 471-480. Número de acceso en el genebank=M94349.

b): por construcciones de bancos de cDNA en pBluescript (Universal Riboclone System, Promega, Madison, USA; Maniatis et al, 1982, Molecular cloning. A laboratory manual. C. S. H. Laboratory, Cold Spring Harbor, New York) y screening (investigación) de estos bancos con los fragmentos amplificados según a).

Las cadenas así aisladas son subclonadas por recombinación en un virus MVA recombinante que contiene la secuencia de ácido nucleico que codifica para la región transmembranaria del virus de la rabia (Modified Vaccinia Ankara; Antoine et al, 1988, Virology, 244: 365-396 y solicitud de patente francesa nº FR 97 09152) a fin de obtener unos virus recombinantes capaces de expresar unos anticuerpos funcionales capaces de reconocer y de ligarse con su antígeno específico y expresados de forma transmembranaria en la superficie de las células recombinadas.

1-2 Estudio in vitro del efecto de los anticuerpos TR310 y H57-597 sobre la proliferación de esplenocitos murinos

Unos esplenocitos murinos (cepa DBA/2) han sido estimulados con unas células tumorales murinas P815HT (cepa C57/B16; Acres et al, 1993, J. Immunother. 14: 136-143) en presencia del uno o el otro de los dos anticuerpos (TR310 y H57-597) purificados a partir de los sobrenadantes de hibridoma correspondiente, durante 1h a 37ºC. La presencia en la superficie de las células P815HT de receptores con inmunoglobulinas de tipo Fc permite el recubrimiento de dichas células con los anticuerpos. Después de 5 días de incubación entre las células P815 que presentan en su superficie los anticuerpos seleccionados y los esplenocitos, la proliferación de los linfocitos T es medida por un test de incorporación de timidina tritiada (Gimmi et al, 1996, Nat. Med. 12: 1367-1371).

Por otra parte, cuando tuvo lugar ese estudio, fueron analizados varios parámetros:

a): número de células P815 que presentan en su superficie los anticuerpos seleccionados necesarios para la estimulación;

b): coestimulación eventual con la ayuda de IL-2 recombinante humano en el día 4 (100 ng/ml o sea 50 UI/ml; R&Dsystems)

1-3 Estudio de la respuesta Th (T helper) asociada a la estimulación de los esplenocitos por los diferentes anticuerpos (TR310 y H57-597) presentados en la superficie de las células P815

Para evaluar esta respuesta, los sobrenadantes del test de proliferación anterior, realizado en presencia de IL-2 recombinante humano, han sido extraídos el día 4 ó 5. La presencia en estos sobrenadantes de IL-4 (respuesta de tipo Th2) o de IFN\gamma (respuesta de tipo Th1) ha sido medida con la ayuda de kits específicos disponibles en el comercio, según las recomendaciones del proveedor (Kit Quantikine, R&D systems).

2- Resultados 2-1 Estudio in vitro del efecto de los anticuerpos TR310 y H57-597 sobre la proliferación de esplenocitos murinos 2-1-1- Controles

Paralelamente a este estudio, se han analizado también un cierto número de testigos.

Se trata más particularmente de medir los efectos observados en unas condiciones idénticas al test propiamente dicho de:

RPMI CT: testigo negativo que contiene el medio solo.

Spléno: testigo negativo que contiene las células esplenocitos solas.

Spléno+P815+/-IL-2: testigo negativo que contiene las células esplenocitos+las células P815 diana no armadas, en presencia o en ausencia (+/-) de IL-2 (100 ng/ml) añadido el día 4.

Spléno+P815/R2+/-IL-2: testigo negativo que contiene las células esplenocitos+las células P815 diana que llevan en su superficie un anticuerpo neutro (no capaz de inducir la activación de los linfocitos)+/-IL-2 (100 ng/ml) añadidos el día 4.

Spléno+ConA: testigo positivo que corresponde a la estimulación de los esplenocitos murinos con la ayuda de concanavalina A (10 \mug/ml) que es un mitógeno murino potente.

Spléno+PHA-P: testigo positivo que corresponde a la estimulación de los esplenocitos murinos con la ayuda de la fitohematoglutinina A (1 \mug/ml) que es un mitógeno humano potente.

2-1-2- Test

P815/TR310 (20000/2000/200)+/-IL-2: Evaluación de la estimulación de esplenocitos murinos por unas células P815 diana que llevan en su superficie un anticuerpo TR310 (2E4, 2E3, 2E2 células/test) en presencia o no de IL-2 recombinante humano a partir de J+4.

P815/H57-597 (20000/2000/200)+/-IL-2: Evaluación de la estimulación de esplenocitos murinos por unas células P815 diana que llevan en su superficie un anticuerpo H57-597 (2E4, 2E3, 2E2 células/test) en presencia o no de IL-2 recombinante humano a partir de J+4.

Los resultados de estimulación obtenidos están presentados en la figura 1. Estos resultados muestran que la presentación de anticuerpos "activadores" de linfocitos T en la superficie de las células diana P815 permite la activación y la proliferación de esplenocitos murinos (visualizados por la incorporación de timidina tritiada). La adición de interleucina-2 recombinante humana no parece amplificar esta estimulación anticuerpo-dependiente. Por otra parte, se ha demostrado también que la activación de los linfocitos tal como se ha medido se acompaña de la lisis de las células diana P815.

2-2 Estudio de la respuesta Th (T helper) asociada a la estimulación de los esplenocitos por los diferentes anticuerpos (TR310 y H57-597)

Los resultados observados están representados en la tabla 1 siguiente que indica las mediciones de las dosificaciones de IL-4 y de IFN\gamma después de activación de esplenocitos murinos por los anticuerpos TR310 y H57-597 presentes en la superficie de células tumorales murinas P815.

Células	P815	P815/TR310	P815-H57-597
Activadoras	2000	2000	2000
	células/test	células/test	células/test
Dosificación del IL-4 producido en pg/ml	0	31	23,5
Dosificación del IFNg producido en pg/ml	0	92,9	162,75

Estas dosificaciones muestran que los anticuerpos TR310 y H57-597 en un contexto de presentación embrionaria inducen los 2 tipos de respuesta Th1 y Th2 (tabla 1). Los anticuerpos TR310 y H57-597 son por tanto capaces, cuando se presentan en la superficie de células tumorales, de activar una respuesta de tipo "helper" Th1 pero también Th2 ligándose a su receptor membranario presente en la superficie de las células T CD4+. La secreción de estas citoquinas permite en particular aumentar la respuesta inmunitaria dirigida contra las células tumorales.

Ejemplo 2 1- Procedimientos 1-1 Construcción de los virus MVA recombinantes

Han sido construidos tres virus MVA recombinantes (MVATG14205 que expresa el anticuerpo de rata TR310 (anti-V beta 7 murin); MVATG14237 que expresa el anticuerpo de hamster H57-597 (anti-TCR alpha/beta de hasmter) y MVATG14240 que expresa el anticuerpo de rata KT3 (anti-CD3 epsilon de rata). Los cassettes de expresión han sido introducidos en la deleción II del MVA (Modified Virus Ankara) como se ha descrito en la solicitud de patente WO 9903885. La cadena ligera de cada anticuerpo ha sido puesta bajo control del promotor de la viruela early-late p7.5 (Goebel et al, 1990, Virology, 179, 247-266). La secuencia que codifica para la cadena pesada de cada anticuerpo ha sido puesta bajo el control del promotor viruela early-late pH5R (Goebel et al, 1990, Virology, 179, 247-266). A fin de facilitar la selección de los virus MVA recombinantes, se ha utilizado el gen de selección GPT (chantina-guanina fosforribosiltransferasa) de E. coli. El extremo C-teminal de la cadena pesada de cada anticuerpo es además fusionada con el campo transmembranario e intracitoplásmico de la glicoproteína rábica a fin de permitir el anclaje de los anticuerpos en una membrana plásmica.

1-2 Evaluación de la expresión de los diferentes anticuerpos después de infección de células embrionarias de pollo (CEP) con los diferentes virus MVA recombinantes

La expresión es analizada por Western Blot respetando las condiciones del kit "ECL^{TM} Western Blotting" de Amersham Life Science (UK). Para ello, unas células embrionarias de pollo son infectadas con una multiplicidad de infección (MOI) de 1 con los suficientes virus MVA recombinantes. Las mismas células son también infectadas con el virus control MVAN33. Después de 24h con la infección, las células son lavadas con PBS y después sometidas a sonicado en el tampón de depósito. La suspensión es a continuación desnaturalizada 3 min a 95ºC antes de ser fraccionada sobre un gel de poliacrilamida 13%. Las proteínas así fraccionadas son a continuación transferidas sobre una membrana PVDF (porablot; Macherey-Nagel). La expresión de los anticuerpos TR310 Y KT3 es analizada después de hibridación con la ayuda de un anticuerpo de rata dirigido contra los IgG de rata acoplado a la HRPO (peroxidasa de rábano silvestre; 10 \mu/ml). La expresión del anticuerpo H57-597 es analizada después de hibridación con la ayuda de un anticuerpo de rata dirigido contra los IgG de hamster acoplado a la HRPO.

1-3 Análisis por citometría de flujo de la expresión de los diferentes anticuerpos después de infección de células BHK21 con los diferentes virus recombinantes

La expresión es analizada por FACS después de infección de células BHK21 (Baby Hamster Kidney) con una MOI de 1 con los diferentes virus MVA recombinantes. Después de 12 h de infección, las células son desprendidas y después analizadas. La detección de los anticuerpos TR310 y KT3 es realizada después de incubación con una anticuerpo de rata dirigido contra los IgG de rata, acoplado a la FITC (Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc (Pennsylvania; USA)). La detección del anticuerpo H57-597 es realizada con la ayuda de un anticuerpo de rata dirigido contra los IgG de hamster acoplado con la FITC (Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc (Pennsylvania; USA)). Las células infectadas han sido también incubadas con un anticuerpo testigo.

1-4 Estudio in vitro de la funcionalidad de los diferentes virus MVA recombinantes

La funcionalidad de los virus MVA recombinantes es ensayada realizando unos test de proliferación sobre esplenocitos murinos. Unos esplenocitos murinos (cepa DBA/2) son estimulados con unas células tumorales murinas P815HT o B16F0 infectadas con los tres virus MVA recombinantes. Para ello, unas células P815HT y B16F0 son infectadas con una MOI de 1 durante 20h con los virus MVATG14205, MVATG14237, MVATG14240 Y MVAN33 (control negativo). Para el modelo P815HT, las células son también puestas en contacto con 10\mug/ml de los anticuerpos TR310 y H57-597 purificados a partir del sobrenadante de hibridoma. Las células infectadas o armadas son a continuación tratadas durante 1 h con mitomicina C (Sigma; 50 \mug/ml) a fin de parar su división. Después de 5 días de incubación en las diferentes condiciones de células P815 y B16F0 y los esplenocitos murinos, la proliferación de los linfocitos T es medida por un test de incorporación de timidina tritiada.

2- Resultados 2-1 Construcción de los MVA recombinantes

Los virus MVA recombinantes (MVATG14205; MVATG14237 Y MVATG14240) son generados por recombinación homóloga en unas células embrionarias de pollo con la ayuda de los diferentes plásmidos de transferencia (pTG14205; pTG14237 y pTg14240) y de un virus MVA salvaje MVAN33 como se ha descrito en la solicitud de patente WO 9903885.

2-2 Evaluación de la expresión de los diferentes anticuerpos después de infección de células embrionarias de pollo (CEP) con los diferentes virus MVA recombinantes

La expresión de los diferentes anticuerpos (TR310, H57-597 y KT3) es analizada por Western Blot después de infección de CEP con los virus MVA recombinantes. Los resultados observados muestran que hay expresión de inmunoglobulina de tipo IgG de rata en las células infectadas con los virus MVATG14205 y MVATG14240. Después de la infección con el MVATG14237, hay también expresión de una inmunoglobulina de tipo IgG de hamster. Estos resultados son revelados por la presencia de una banda específica que emigra a aproximadamente 60 kDa y que corresponde a la cadena pesada de la inmunoglobulina. Ninguna banda específica ha podido ser observada después de infección de CEP por los virus control MVAN33.

2-3 Análisis por citometría de flujo de la expresión de los diferentes anticuerpos después de infección de células BHK21 con los diferentes virus recombinantes

La expresión y el ensamblaje de los 3 anticuerpos son evaluados por citometría de flujo (figura 2). Unas células BHK21 son infectadas con una MOI de 1 con los 3 virus recombinantes. El análisis por FACS ha permitido poner en evidencia la expresión de IgG de superficie de hamster (H57-597) y de rata (TR310 y KT3) después de incubación de las células infectadas con unos anticuerpos dirigidos específicamente contra unos IgG de rata y de hamster. Este análisis ha permitido también mostrar la expresión de cadena ligera de tipo kappa en las células BHK21 infectadas con los virus MVATG14205 y MVATG14240. Estos resultados permiten mostrar que la infección de células BHK21 por los diferentes virus MVA recombinantes provoca la expresión de inmunoglobulinas membranarias correctamente reordenadas.

2-4 Estudio in vitro de la funcionalidad de los diferentes virus MVA recombinantes

La funcionalidad de los virus MVA recombinantes es ensayada realizando unos test de proliferación sobre esplenocitos murinos. Para ello se utilizan 2 tipos de modelos murinos, las células P815HT (figura 3) y las células B16F0 (figura 4). Estos 2 tipos de células son infectados con los virus recombinantes a fin de expresar en su superficie unos anticuerpos transmembranarios dirigidos contra la totalidad o parte del complejo TCR/CD3 murino. Se ha medido la proliferación inducida por la puesta en contacto de células P815HT y B16F0 infectadas con unos esplenocitos murinos simples de un haplotipo parecido. En un primer tiempo, unas células P815HT (débilmente inmunógena; H2d; que expresa el CMHI, ICAMI y CD48) son infectadas con los 3 virus recombinantes y un virus MVAN33 de control. En paralelo las mismas células P815HT son incubadas con los anticuerpos TR310 y H57-597 a fin de armarlas de anticuerpos por medio de su receptor Fc. Para el virus MVATG14205 (estimulación de las células Vbéta 7 murines), la estimulación inducida por unas células P815 infectadas es ligeramente superior a la obtenida con las células armadas. Además, el nivel de proliferación permanece muy bajo como era de esperar con la especifidad del anticuerpo. Con los virus MVATG14237 Y MVATG14240, el índice obtenido con las células infectadas es netamente superior al obtenido con las células armadas. Los índices obtenidos con las células infectadas por los 3 virus son muy netamente superiores a los obtenidos con unos agentes mitógenos potentes como la concanavalina A o la interleucina-2. Finalmente, se ha podido poner en evidencia en todos los casos un efecto dosis proporcional al número de células infectadas puestas en contacto con los esplenocitos. Ninguna estimulación ha podido ser observada con las células P815HT no infectadas, armadas con un anticuerpo testigo o infectadas con un virus control.

De manera idéntica, las células B16F0 son utilizadas en el mismo tipo de experiencia (figura 4). Estas células murinas B16F0 son no inmunógenas y no poseen ninguna molécula de coestimulación. Se ha podido así poner en evidencia una fuerte proliferación de esplenocitos simples después del contacto con las células infectadas. De manera idéntica, las células infectadas con el MVATG14205 inducen una proliferación inferior a las células afectadas con los virus MVATG14237 y MVATG14240. Para estos dos últimos, el índice de proliferación obtenido con 20000 células es comparable con el obtenido con la Con A. En este modelo, la cantidad de células infectadas parece también actuar sobre el índice de proliferación obtenido (efecto dosis).

En conclusión, aparece muy claramente que los 3 virus recombinantes son funcionales. La expresión de los anticuerpos TR310, H57-597 y KT3 en la superficie de células permite inducir, según la invención, una fuerte proliferación de células T simples. Esta estimulación es de manera ventajosa más importante que la obtenida con unas células armadas con los mismos anticuerpos por medio de receptor de tipo Fc, pero también que la obtenida con potentes agentes mitógenos tales como la ConA.

Claims

1. Material biológico para la preparación de composiciones farmacéuticas destinadas al tratamiento de mamíferos que comprenden por lo menos una secuencia de ácido nucleico que comprende:

(i) un gen que codifica para un anticuerpo o fragmento de anticuerpo fusionado con el campo transmembranario de un polipéptido transmembranario, y

(ii) unos elementos que aseguran la expresión de dicho gen in vivo en unas células diana destinadas a ser genéticamente modificadas por dicha secuencia de ácido nucleico;

caracterizado porque dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo está expresado en la superficie de la célula diana y es capaz de fijarse a un receptor seleccionado entre el grupo que consiste en el receptor del complejo TCR, más particularmente el TCR-\alpha, el TCR-\beta o el CD3, el CD8, el CD4, CD28, LFA-1, 4-1BB, CD47, CD2, CD9, CD45, CD40, a los receptores de citoquinas, tales como IL-7, IL-4, IL-2, IL-15 o GM-CSF, al V\alpha14NKT, NKAR, al receptor Fc.

2. Material biológico para la preparación de composiciones farmacéuticas destinadas al tratamiento de mamíferos que comprende por lo menos una célula diana que no produce naturalmente unos anticuerpos, caracterizado porque dicha célula diana es modificada in vitro por lo menos por una secuencia de ácido nucleico tal como la definida en la reivindicación 1.

3. Material biológico según la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque dicha secuencia de ácido nucleico está en forma de una secuencia de ADN o de ARN desnuda.

4. Material biológico según la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque dicha secuencia de ácido nucleico es un vector que permite la transferencia de dicho gen a dichas células diana.

5. Material biológico según la reivindicación 4, caracterizado porque dicho vector es un vector viral.

6. Material biológico según la reivindicación 5, caracterizado porque dicho vector viral es un vector adenoviral, retroviral, un poxvirus, en particular derivado del virus de la viruela vacuna o del Modified Virus Ankara (MVA).

7. Material biológico según la reivindicación 4, caracterizado porque dicho vector consiste en por lo menos una dicha secuencia de ácido nucleico complejada o conjugada con por lo menos una molécula o sustancia portadora seleccionada entre el grupo que consiste en un anfifilo catiónico, en particular un lípido catiónico, un polímero catiónico o neutro, un compuesto polar prótico en particular elegido entre el propilenglicol, el polietilenglicol, el glicerol, el etanol, la 1-metil L-2 pirrolidona o sus derivados, y un compuesto polar aprótico elegido en particular entre el dimetilsulfóxido (DMSO), el dietilsulfóxido, el di-n-propilsulfóxido, la dimetilsulfona, el sulfulano, la dimetilformamida, la dimetilacetamida, la tetrametilurea, el acetonitrilo o sus derivados.

8. Material biológico según una de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque dicho polipéptido transmembranario es seleccionado entre el grupo que consiste en una glicoproteína, una lipoproteína, un receptor membranario.

9. Material biológico según la reivindicación 8, caracterizado porque dicho polipéptido transmembranario es seleccionado entre el grupo que consiste en la glicoproteína del virus de la rabia, la gp160, el CD4.

10. Material biológico según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque dicha célula diana es una célula de mamífero tumoral, una célula de mamífero infectada por un agente patógeno viral o una célula de mamífero infectada por un agente patógeno bacteriano.

11. Material biológico según la reivindicación 2, caracterizado porque está en una forma que permite su administración en el organismo de un mamífero así como eventualmente su cultivo previo.

12. Material biológico según la reivindicación 11, caracterizado porque dichas células diana provienen del mamífero a tratar.

13. Material biológico según la reivindicación 11, caracterizado porque dichas células diana provienen de otro mamífero que el que se ha de tratar y han sufrido un tratamiento que las hace compatibles.

14. Material biológico según una de las reivindicaciones 1 a 13, caracterizado, porque comprende, además, por lo menos una secuencia de ADN que asegura la expresión de un compuesto implicado en la activación de las células efectoras citotóxicas o de linfocitos T helper.

15. Utilización de un material biológico según una de las reivindicaciones 1 a 13 para la preparación de una composición farmacéutica destinada al tratamiento o a la prevención de cánceres o de infecciones virales.

16. Utilización de una secuencia de ácido nucleico que comprende:

(i): un gen que codifica para un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo fusionado con el campo transmembranario de un polipéptido transmembranario, y

(ii): unos elementos que aseguran la expresión de dicho gen in vivo en unas células diana destinadas a ser genéticamente modificadas por dicha secuencia de ácido nucleico;

caracterizada porque dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo capaz de fijarse a un receptor que está seleccionado entre el grupo que consiste en la totalidad o parte del complejo TCR para la preparación de composiciones farmacéuticas destinadas a tratar un mamífero por transferencia de genes.

17. Composición farmacéutica que comprende un material biológico según una de las reivindicaciones 1 a 14, ventajosamente en asociación con un vehículo farmacéuticamente aceptable.

18. Composición farmacéutica según la reivindicación 17, que comprende un material biológico según una de las reivindicaciones 11 a 13 y un compuesto naturalmente responsable de la activación de las células efectoras citotóxicas o de linfocitos T helper.

19. Composición farmacéutica según la reivindicación 18, caracterizada porque dicho compuesto es una citoquina o una quemoquina.

20. Célula de mamífero no germinal que no produce naturalmente anticuerpos, caracterizada porque es genéticamente modificada por lo menos por una secuencia de ácido nucleico que comprende:

(i): un gen que codifica para un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo fusionado con el cuerpo transmembranario de un polipéptido transmembranario, y

(ii): unos elementos que aseguran la expresión de dicho gen in vivo en unas células dianas destinadas a ser genéticamente modificadas por dicha secuencia de ácido nucleico;

y porque dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo es capaz de fijarse a un receptor que es seleccionado entre el grupo que consiste en la totalidad o parte del complejo TCR.

21. Procedimiento de preparación in vitro de una célula según la reivindicación 20, caracterizado porque se introduce en una célula de mamífero no germinal que no produce naturalmente anticuerpos, por cualquier medio apropiado, por lo menos una secuencia de ácido nucleico que comprende:

y porque dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo es capaz de fijarse a un receptor que está seleccionado entre el grupo que consiste en la totalidad o parte del complejo TCR, y porque después se seleccionan entre estas células las genéticamente modificadas por dicha secuencia de ácido nucleico.