CN102250206A - 一种新的hla-a2限制性表位多肽及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种新的HLA-A2限制性表位多肽及其应用。具体而言，本发明涉及序列为FLFCQGFEV的HLA-A2限制性表位多肽(即1F7F肽)，以及该表位及其相关的重组蛋白、编码核苷酸序列、抗原递呈细胞、组合物在表达人磷脂酰乙醇胺结合蛋白4(hPEBP4)的肿瘤治疗及预防中的用途。

Description

一种新的HLA-A2限制性表位多肽及其应用

技术领域

本发明涉及生物学和医学领域，更具体地涉及一种HLA-A2限制性表位多肽，以及该表位及其相关的重组蛋白、编码核苷酸序列、抗原递呈细胞、组合物在表达人磷脂酰乙醇胺结合蛋白(hPEBP4蛋白)肿瘤治疗及预防中的用途。

背景技术

人磷脂酰乙醇胺结合蛋白4(human phosphatidylethanolamine(PE)-bindingprotein 4，hPEBP4)，其核苷酸序列和氨基酸可参见中国专利CN02136556.3。它是通过从正常成人骨髓细胞体外原代培养获得骨髓基质细胞(Bone marrowstromal cell，BMSC)并构建BMSC cDNA文库，利用cDNA文库大规模测序的手段，从BMSC cDNA文库中分离到的一种全长基因，属于磷脂酰乙醇胺结合蛋白(PEBP)家族，在GenBank/EMBL数据库中登录(序列号为AY037148)。hPEBP4蛋白包含227个氨基酸，其氨基酸序列在75-195位为典型的磷脂酰乙醇胺结合保守区域(PBP)。

功能研究发现，hPEBP4能通过抑制Ras/Raf/MEK/ERK途径、JNK活化和PE外翻来抑制TNFα诱导的细胞凋亡，这些功能均由其PE结合保守区域(PBP)介导。hPEBP4表达下调后能够促进TNF-α诱导的乳腺癌细胞、前列腺癌细胞和卵巢癌细胞凋亡，提示hPEBP4很可能是治疗hPEBP4高表达肿瘤的一个新的作用靶点。

研究者通过组织芯片和免疫组化证实，在临床肿瘤标本中，hPEBP4蛋白高表达于50％以上的乳腺癌肿瘤组织中，而仅表达于4％的正常乳腺组织中。在人前列腺癌组织和卵巢癌组织中也发现hPEBP4蛋白的优势表达模式，提示hPEBP4很可能是一个相对特异性表达于肿瘤组织的肿瘤特异性/肿瘤相关抗原。

因此，如果以hPEBP4为靶标，对机体进行免疫，将会使机体产生针对hPEBP4蛋白的特异性免疫应答，从而使机体能有效地抑制、清除肿瘤细胞，为相关肿瘤的预防及治疗提供措施。

据此，本发明人前期已鉴定出来自hPEBP4的肿瘤抗原表位肽p40-48(TLFCQGLEV)(SEQ ID NO：1)，其氨基酸序列见中国专利申请CN200510030532.0。该表位肽在HLA-A2.1/K^b转基因鼠体内和HLA-A2.1阳性乳腺癌病人外周血中有较强的免疫原性，其诱导出的效应细胞能特异性杀伤表达hPEBP4⁺/HLA-A2.1⁺的肿瘤细胞。

细胞免疫在抗肿瘤和抗病毒免疫中起关键作用。T细胞识别的抗原是与细胞表面的MHC-I类或II类分子结合的肽，其长度约为8-12个氨基酸。而作为杀伤肿瘤细胞的主要效应细胞CTL(细胞毒T淋巴细胞，Cytotoxic TLymphocytes)则识别与MHC-I类分子结合的内源性肽。但是，许多能被CTL识别的天然肿瘤抗原肽的免疫原性都相对较弱。免疫原性的强弱与肽和MHC-I类分子亲和力的高低有关。在一定程度上，亲和力越高，其免疫原性越强。

为了增强肽的免疫原性，可对肽序列中的某些位点的氨基酸进行置换以改善、优化其与MHC-I类分子的亲和力。经过氨基酸置换后，应保持表位肽的抗原特异性(即对野生型肽的特异性识别能力)不改变，但增强其免疫原性(即诱导体内特异性CTL的杀伤能力)。氨基酸置换后的抗原肽已经被用于癌症病人，以改善了病人的抗肿瘤免疫应答。

然而，由于多肽氨基酸内部的微小变化就会对其结构和功能造成巨大的影响，甚至于使得多肽失去原有的活性(例如结合亲和力)，并且对多肽序列中氨基酸的修饰和改变方式和组合纷繁芜杂，要从众多修饰中筛选获得具有增强的活性(例如免疫活性)的修饰多肽并非易事。

因此，本领域中仍然迫切需要在已知表位多肽的序列的基础上开发出具有增强的免疫原性的修饰表位多肽。

发明内容

本发明的目的就是提供一种具有高免疫原性的合成肽及其应用。

在本发明的第一方面中，提供了一种HLA-A2限制性表位多肽，所述多肽具有诱导细胞毒T细胞杀伤活性，且所述的多肽具有FLFCQGFEV(SEQ IDNO：2)的序列。

在本发明的一个实施方式中，所述多肽的序列为FLFCQGFEV(SEQ IDNO：2)。

在本发明的第二方面中，提供一种重组蛋白，所述的重组蛋白含有如前所述的HLA-A2限制性表位多肽。

在一个优选例中，所述重组蛋白的序列如SEQ ID NO：2所示。

在本发明的第三方面中，涉及一种敏化的抗原递呈细胞，所述的抗原递呈细胞是被如前所述的HLA-A2限制性表位多肽致敏的。

在一个优选例中，所述抗原递呈细胞选自下组：树突状细胞、巨噬细胞、B细胞、成纤维细胞或内皮细胞。

在本发明的第四方面中，提供了一种制备敏化的抗原递呈细胞的方法，所述方法包括：用本发明的HLA-A2限制性表位多肽致敏抗原递呈细胞。

在一个优选例中，所述抗原递呈细胞选自下组：树突状细胞、巨噬细胞、B细胞、成纤维细胞或内皮细胞。

在本发明的第五方面中，提供了一种组合物，所述的组合物含有：

(a)0.001-99.99wt％如前所述的HLA-A2限制性表位多肽或如前所述的敏化的抗原递呈细胞；和

(b)免疫学或药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。

在本发明的一个实施方式中，所述的组合物是药物组合物，并且所述的载体、稀释剂或赋形剂是药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。

在一个优选例中，所述组分(a)的含量为0.001-99.99wt％，优选0.1-99.0wt％，更优选1-90wt％。

在另一个优选例中，所述组合物还包含一种或多种治疗肿瘤的其它药物，优选所述药物选自：烷化剂、抗代谢药、抗肿瘤抗生素、植物类抗癌药、激素、或免疫制剂，更优选：抗肿瘤抗生素，如阿霉素。

在本发明的第六方面中，提供了一种用本发明的HLA-A2限制性表位多肽或敏化的抗原递呈细胞的用途，其用于制备预防和/或治疗肿瘤的药物。

在本发明的一个实施方式中，所述肿瘤选自下组：前列腺癌、乳腺癌、肝癌、胶质瘤、结肠癌、子宫颈癌、非小细胞肺癌、肺癌、胰腺癌、胃癌、或膀胱癌、或卵巢癌。

在本发明的第七方面，提供了本发明所述的HLA-A2限制性表位多肽的用途，它被用于制备包含该限制性表位多肽的重组蛋白(如融合蛋白)，或用于制备致敏的抗原提呈细胞。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

以下结合附图对本发明进行进一步阐述。

图1：1F7F肽致敏的树突状细胞(DC)体内诱导HLA-A2.1/K^b转基因小鼠细胞毒T淋巴细胞的杀伤活性。

图2：1F7F肽致敏的树突状细胞(DC)体内诱导HLA-A2.1/K^b转基因小鼠细胞毒T淋巴细胞IFN-γ分泌细胞情况。

具体实施方式

本发明人在对hPEBP4来源的表位肽P40-48进行分析(例如计算机模拟分析等)的基础上，通过对表位肽P40-48的氨基酸进行置换，选择性地合成了众多候选抗原肽，以期从中筛选出与HLA-A*0201高亲和力结合并能诱导机体产生更强的特异性CTL应答的抗原肽。

具体而言，发明人最初通过计算机模拟分析获得了可能的候选序列。然而，通过计算机模拟预测所获得的候选多肽的数量少则数百条，多则上千条。并且，发明人通过试验证明了：在已知序列的不同位置、甚至包含部分相同位置进行置换的计算机模拟分析候选表位肽，其免疫原性与野生型相比可能并未得到有效的提高，甚至反而明显降低，这就提示了在复杂的生物体系中计算机模拟预测的较高不确定性。

因此，要从数量如此众多、且生物效应具有较高不确定性的候选多肽中筛选获得高亲和力、高免疫原性、能够诱导更强的hPEBP4特异性细胞免疫应答的多肽序列并非易事。

发明人进一步通过T2肽结合实验，从众多序列中筛选出与HLA-A^*0201具有强亲合力的表位肽，并对其免疫原性进行评价，终于发现置换优化后的表位肽1F7F是HLA-A0201限制性的hPEBP4抗原特异性的T细胞表位，其在体内、外均可诱导出明显强于野生肽(P40-48)的细胞毒性T效应细胞。

作为免疫原性提高而抗原特异性不变的氨基酸修饰的肽，表位肽1F7F在乳腺癌或其他高表达hPEBP4的肿瘤的免疫治疗中有着潜在的应用价值。同时也为制备更高效力的肿瘤疫苗提供了新的实验依据，对其肿瘤疫苗以及治疗制剂的研制有重要的意义。

在此基础上，本发明人完成了本发明。

HLA-A2限制性表位多肽

如本文所用，“本发明多肽”、“1F7F肽”、“置换的特异性多肽”等可互换使用，指将已鉴别的HLA-A2限制性表位多肽的氨基酸序列P40-48(SEQ IDNO：1)的第1位和第7位氨基酸残基置换为“F”所得的特异性多肽，该多肽序列入SEQ ID NO：2所示，即FLFCQGFEV。此外，该术语还包括在其C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸所形成的序列。例如，在本领域中，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。

一种优选的衍生多肽是在1F7F肽的上游添加对应于hPEBP4中第36-39位的1个或2个或3个或4个氨基酸(如D、ED、DED或LDED)，和/或在其下游添加对应于hPEBP4中第49-52位的1个或2个或3个或4个氨基酸(如F、FY、FYP或FYPE)。

本发明多肽可用常规方法人工合成，也可用重组方法生产。

本发明多肽也可用于与BSA等分子量的蛋白偶联，从而形成多肽偶联物。通常，所述的偶联物由多肽、交联剂、和BSA构成，其中所述的交联剂优选戊二醛、EDAC。

组合物

本发明的多肽和偶联物还可用于制备治疗性的药物组合物或预防性及治疗性的疫苗组合物。

因此，另一方面，本发明还提供了一种组合物，它含有(a)安全有效量的本发明多肽、偶联物或其组合物；以及(b)药学上可接受的载体或赋形剂。本发明多肽的数量通常为10微克-100毫克/剂，较佳地为100-1000微克/剂。

本文所用的术语“有效量”指治疗剂治疗、缓解或预防目标疾病或状况的量，或是表现出可检测的治疗或预防效果的量。对于某一对象的精确有效量取决于该对象的体型和健康状况、病症的性质和程度、以及选择给予的治疗剂和/或治疗剂的组合。因此，预先指定准确的有效量是没用的。然而，对于某给定的状况而言，可以用常规实验来确定该有效量，临床医师是能够判断出来的。

为了本发明的目的，有效的剂量为给予个体约0.01毫克/千克至50毫克/千克，较佳地0.05毫克/千克至10毫克/千克体重的本发明多肽。此外，本发明的多肽还可与其他治疗剂一起使用。

药物组合物还可含有药学上可接受的载体。术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体。该术语指这样一些药剂载体：它们本身不诱导产生对接受该组合物的个体有害的抗体，且给药后没有过分的毒性。这些载体是本领域普通技术人员所熟知的。在Remington′s Pharmaceutical Sciences(Mack Pub.Co.，N.J.1991)中可找到关于药学上可接受的赋形剂的充分讨论。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、佐剂、及其组合。

治疗性组合物中药学上可接受的载体可含有液体，如水、盐水、甘油和乙醇。另外，这些载体中还可能存在辅助性的物质，如润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等。此外，免疫组合物中还可以含有免疫佐剂。

通常，可将治疗性组合物制成可注射剂，例如液体溶液或悬液；还可制成在注射前适合配入溶液或悬液中、液体载体的固体形式。

一旦配成本发明的组合物，可将其直接给予对象。待预防或治疗的对象可以是动物；尤其是人。

本发明的含本发明多肽的治疗或预防性药物组合物(包括疫苗)，可以经口服、皮下、皮内、静脉注射等方式应用。治疗剂量方案可以是单剂方案或多剂方案。

本发明的优点

本发明的主要优点在于：本发明的表位肽是在已知HLA-A2限制性的细胞毒T淋巴细胞表位肽的基础上经氨基酸置换而得的，其与已知的表位肽相比，可更为有效地引起针对肿瘤细胞的免疫应答，这不仅对进一步深入研究肿瘤发病机制具有重要意义，而且对更强有效的肿瘤治疗性疫苗以及治疗制剂的研制均有重要的意义。

实施例

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

实施例1.HLA-A^＊0201高亲和力肽的筛选

本实施例通过肽结合实验筛选出与HLA-A^*0201具有高亲和力的表位肽。

试验步骤

首先，收集T2细胞(一种缺失抗原加工能力的细胞，购买自ATCC：CRL-1991)，用无血清1640培养基(购自Invitrogen公司)洗三次后，调细胞浓度至2×10⁵个/ml，铺于24孔板中，0.5ml/孔。然后，加入50μM的候选多肽，2.5μg/ml的β2微球蛋白(购自R&D公司)于37℃，5％CO₂孵箱中共孵育18h。孵育后的细胞用冰PBS(pH7.2，PBS为缓冲液，自配)洗三遍，加入FITC标记的HLA-A2特异性的mAb BB7.2(Sterotec Ltd，Oxford，UK)，冰浴45分钟，PBS洗后用流式细胞仪(Beckton Dickinson公司FACSCalibur)检测平均荧光强度。

以阳性已知肽CEA HLA-A2限制性表位多肽CAP-1(SEQ ID NO：8，序列为YLSGANLNL)作为阳性对照，未加肽刺激的单纯T2细胞作为背景对照。

检测方法

免疫荧光法检测肽与HLA-A^*0201分子的结合情况，该方法基于外源性多肽与T2细胞表面MHC-I类分子的结合可使其表面的MHC-I类分子的表达量增加的，两者结合越稳固，则可检测到的MHC-I类分子的表达量越多，以平均荧光强度为检测指标。结果以荧光系数(FI)作为衡量指标。

其中，多肽的FI＞1被认为是高亲和力的表位。

试验结果

免疫荧光法测得的hPEBP4蛋白来源多肽的T2-HLA-A^*0201结合的亲和力结果如表1所示。表中所示多肽为通过计算机软件模拟分析(通过美国国立卫生研究院生物信息及分子分析部(BIMAS)HLA  肽结合预测网站http://bimas.dcrt.nih.gov/molbio/hla bind/index.html)获得的部分候选序列，由上海吉尔生化有限公司人工合成。

本发明人从数条基于表位p40-48置换得到的优化肽中筛选出HLA-A2高亲和力的表位1F7F，其序列为FLFCQGFEV(SEQ ID NO：2)。该表位肽与HLA-A^*0201分子的亲和力比野生型表位肽p40-48(SEQ ID NO：1)显著提高。

表1hPEBP4蛋白来源多肽的T2-HLA-A^*0201结合的亲和力

实施例2.HLA-A2.1/K^b转基因小鼠体内针对hPEBP4来源的HLA-A2限制性多肽特异性细胞毒T淋巴细胞的诱导

效应细胞的制备

按常规方法(参照Inaba实验室方法，【Inaba，K.等，J Exp Med.1992；176：1693-1702】)制备HLA-A2.1/K^b转基因小鼠骨髓来源的树突状细胞(DC)。收集培养(参照Inaba实验室方法，同上)至第7天的DC，调细胞浓度至1×10⁶个细胞/ml，加入表位肽(实施例1表1中的各表位肽，终浓度10μM/ml)及β2微球蛋白(终浓度3μg/ml)，37℃，5％CO₂孵箱中孵育3h。

收集肽致敏的DC，用PBS(pH7.2，PBS为缓冲液，自配)洗三遍，调细胞浓度至1×10⁶个/0.2ml(免疫用量即为0.2ml)免疫转基因小鼠(HLA-A2.1/K^b转基因小鼠，购自美国JaxMice，4-6周龄，雌性，每组5只)。每只小鼠腹腔注射0.2ml，共免疫三次，间隔一周。

末次免疫后7天，无菌操作摘取小鼠脾脏，溶解红细胞，制成单细胞悬液。将脾细胞悬液(5×10⁶个/ml)与肽致敏的经⁶⁰Coγ射线照射(总剂量为30Gy)的自体(即同一小鼠)树突状细胞以10∶1比例(数量比)置于RPMI 1640完全培养基中培养。培养6天后，收集效应细胞。

检测方法

(1)特异性杀伤活性的检测

本实施例采用了标准的4小时⁵¹Cr释放试验检测特异性杀伤活性。

分别用负载P40-48WT表位肽的T2细胞、负载了无关肽SSp-1(无关对照，SEQ ID NO：9)的T2细胞及未加任何多肽负载的T2细胞作为靶细胞(即作为实施例2制备的效应细胞的靶细胞)，加入⁵¹Cr(Na₂ ⁵¹CrO₄，100μCi/10⁶个细胞)，置37℃水浴中标记90分钟，每间隔15分钟轻混匀一次。PBS洗3遍，彻底洗去残余Na₂ ⁵¹CrO₄，将标记好的靶细胞用完全1640培养基调整细胞浓度为1×10⁵个细胞/ml，加入96孔圆底板，每孔100μl。按50∶1、25∶1和12.5∶1(数量比)三个不同效靶比加入效应细胞，37℃孵育4小时，收集各孔上清各100μl，用γ计数仪(Wallac公司1470)检测cpm值(counts per minute每分钟计数)。

按下式计算特异性裂解率或杀伤率：

其中，最大释放组各孔为单独的靶细胞加100μl 1％SDS；自发释放孔为单独的靶细胞加100μl完全培养基。

(2)肽特异性CTL IFN-γ释放的检测

用商业化的试剂盒进行ELISPOT检测(购自R&D公司)。将1×10⁵个效应细胞加入包被有特异性抗小鼠IFN-γ单克隆抗体的96孔平底硝酸纤维素板中，同时加入P40-48野生型表位肽刺激的T2细胞(1×10⁴个)、无关肽SSp-1刺激的T2细胞或未刺激的T2细胞，37℃5％二氧化碳孵箱中培养24小时。移去细胞，洗板4次甩干，加入生物素化的抗小鼠IFN-γ特异性抗体，4℃孵育过夜；洗板4次甩干，再加入碱性磷酸酶标记的链亲和素，室温作用2小时；洗板4次甩干，加入底物5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸/氮蓝四唑(BCIP/NBT)，室温避光作用1h，弃去显色液，双蒸水清洗，终止反应。参照试剂盒说明书的方法检测分泌IFN-γ的T细胞集落。

以上每一检测均设3个复孔，计数时取3复孔的均值。该数值显示检测到的可释放IFN-γ的特异性CTL数量。

试验结果

结果显示，优化表位肽1F7F致敏的树突状细胞免疫小鼠后，产生的CTL能有效杀伤负载野生型表位肽的T2细胞，而且优化表位肽1F7F的杀伤靶细胞的效果明显高于野生型表位肽(见图1，*，P＜0.01)。

优化表位肽1F7F刺激后检测到有明显的IFN-γ释放的效应细胞(CTL)数量也明显高于野生型表位肽(见图2，*，P＜0.01)。

以上结果表明：优化表位肽1F7F在体内诱导出特异性识别野生型表位肽CTL的能力(即免疫原性)要明显高于野生型表位肽。

该试验是用效应细胞来杀伤靶细胞，靶细胞是负载野生型表位肽的T2细胞，效应细胞是实施例1中制备的多肽致敏的转基因小鼠来源树突状细胞体内刺激得到的杀伤性T细胞(存在于脾细胞中)。

优化表位肽1F7F致敏的树突状细胞刺激得到T细胞能够特异性杀伤负载有野生型表位肽的T2细胞，这表示优化表位肽1F7F比野生型表位肽能够更有效地诱导出hPEBP4野生型表位肽特异性的杀伤性T细胞，从而证明了优化表位肽1F7F在保持了抗原特异性不变的基础上具有更高的免疫原性，能够诱导更强的hPEBP4特异性细胞免疫应答。

此外，上述结果也显示：不同位置和氨基酸置换的组合(如SEQ ID NOs：3-7)，甚至包含部分相同位置置换或相同氨基酸置换(如SEQ ID NO：4或6)的其它优化表位肽，其免疫原性与野生型相比并未得到有效的提高，甚至反而明显降低，这就提示了在复杂的生物体系中计算机模拟预测具有较高的不确定性。

并且，通过计算机模拟预测可获得候选多肽的数量少则数百条，多则上千条，要从数量如此众多、且生物效应具有较高不确定性的候选多肽中筛选获得高亲和力、高免疫原性、能够诱导更强的hPEBP4特异性细胞免疫应答的多肽序列并非易事。

实施例3.优化表位肽1F7F致敏的人外周血单核细胞来源DC的培养

HLA-A2.1+/hPEBP4+乳腺癌病人抗凝外周全血通过淋巴细胞分离液(Ficoll-Histopaque 1.077，购自Sigma公司)密度梯度离心(室温，400×g，30分钟)，取界面细胞，置入50ml离心管中，用无钙镁PBS(pH7.2)-EDTA(2mM)悬浮细胞，之后离心(300×g，10分钟)洗细胞一次，弃上清，无钙镁PBS重悬细胞，再次离心(200×g，5分钟)洗细胞2次，获得人外周血单个核细胞(PBMC)。

用完全培养基(含10％胎牛血清的RPMI1640)悬浮PBMC，按1×10⁷细胞/孔铺于6孔板，37℃、5％CO₂孵育2小时后，轻轻吸出悬浮细胞，用预温的培养基小心洗6孔板三遍(此部分细胞连同吸出的悬浮细胞冻存备用)，剩下的细胞即为贴壁的单核细胞。贴壁细胞在含人重组rhGM-CSF(500U/ml)和人重组rhIL-4(10ng/ml)(购自R&D公司)的完全培养基中37℃、5％CO₂进行培养。第3天补充完全培养基，继续培养。

收集上述培养至第6天的hPEBP4+/HLA-A^*0201+乳腺癌患者外周血单核细胞来源的DC，用人DC完全培养基(RPMI 1640完全培养基，500U/mlrhGM-CSF、10ng/ml rhIL-4)调整细胞浓度为2×10⁵个细胞/ml浓度，1ml/孔分入24孔板，加入20μM优化表位肽1F7F，4小时后收集细胞，弃培养基上清，用RPMI1640培养基离心洗涤细胞两次以除去原培养基中存在的刺激物，最后将2×10⁵个细胞悬浮在0.5ml人DC完全培养基中，即为优化表位肽1F7F致敏的人外周血单核细胞来源DC。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110>中国人民解放军第二军医大学

 

<120>一种新的HLA-A2限制性表位多肽及其应用

 

<130>102221

 

<160>9

 

<170>PatentIn version 3.3

 

<210>1

<211>9

<212>PRT

<213>人工序列

 

<400>1

 

Thr Leu Phe Cys Gln Gly Leu Glu Val

1               5

 

<210>2

<211>9

<212>PRT

<213>人工序列

 

<400>2

 

Phe Leu Phe Cys Gln Gly Phe Glu Val

1               5

 

<210>3

<211>9

<212>PRT

<213>人工序列

 

<400>3

 

Tyr Leu Trp Cys Gln Ile Leu Glu Val

1               5

 

<210>4

<211>9

<212>PRT

<213>人工序列

 

<400>4

Phe Leu Trp Cys Gln Val Phe Glu Val

1               5

 

<210>5

<211>9

<212>PRT

<213>人工序列

 

<400>5

 

Tyr Leu Phe Cys Gln Leu Phe Glu Val

1               5

 

<210>6

<211>9

<212>PRT

<213>人工序列

 

<400>6

 

Tyr Leu Phe Cys Gln Gly Phe Glu Val

1               5

 

<210>7

<211>9

<212>PRT

<213>人工序列

 

<400>7

 

Thr Leu Phe Cys Gln Gly Phe Glu Val

1               5

 

<210>8

<211>9

<212>PRT

<213>人工序列

 

<400>8

 

Tyr Leu Ser Gly Ala Asn Leu Asn Leu

1               5

 

<210>9

<211>9

<212>PRT

<213>人工序列

 

<400>9

 

Arg Leu Asn Glu Val Ala Lys Asn Leu

1               5

Claims (10)

1.一种HLA-A2限制性表位多肽，其特征在于，所述多肽具有诱导细胞毒T细胞杀伤活性，且所述的多肽的序列如SEQ ID NO：2所示，为FLFCQGFEV。

2.一种重组蛋白，其特征在于，它包含权利要求1所述的HLA-A2限制性表位多肽。

3.一种敏化的抗原递呈细胞，其特征在于，所述抗原递呈细胞是被权利要求1所述的HLA-A2限制性表位多肽致敏的。

4.如权利要求3所述的抗原递呈细胞，其特征在于，所述的抗原递呈细胞选自下组：树突状细胞、巨噬细胞、B细胞、成纤维细胞或内皮细胞。

5.一种制备敏化的抗原递呈细胞的方法，所述方法包括：用权利要求1所述的HLA-A2限制性表位多肽致敏抗原递呈细胞。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的抗原递呈细胞选自下组：树突状细胞、巨噬细胞、B细胞、成纤维细胞或内皮细胞。

7.一种组合物，其特征在于，它含有：

(a)0.001-99.99wt％权利要求1所述的HLA-A2限制性表位多肽或权利要求3所述的敏化的抗原递呈细胞；和

(b)可接受的载体、稀释剂或赋形剂。

8.如权利要求7所述的组合物，其特征在于，所述的组合物是药物组合物，并且所述的载体、稀释剂或赋形剂是药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。

9.一种权利要求1所述的HLA-A2限制性表位多肽或权利要求3所述的敏化的抗原递呈细胞的用途，其特征在于，用于制备预防和/或治疗肿瘤的药物。

10.如权利要求9所述的用途，其特征在于，所述肿瘤选自下组：前列腺癌、乳腺癌、肝癌、胶质瘤、结肠癌、子宫颈癌、非小细胞肺癌、肺癌、胰腺癌、胃癌、或膀胱癌。

Images