CN111978375A - 具有细胞毒性t细胞诱导能力的蛋白质或多肽 - Google Patents

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Abstract

具有细胞毒性T细胞诱导能力的蛋白质或多肽，含有如下氨基酸序列中的至少一种：A1)YMHXLVYPA(SEQ ID NO:2)，X选自蛋氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、缬氨酸、谷氨酰胺中的任一种；A2)如SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:7至SEQ ID NO:12任一项所示多肽片段；A3)氨基酸序列与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:7至SEQ ID NO:12任意一项所示多肽具有80％以上同源性，且具有A1)或A2)限定的多肽片段功能的多肽片段。上述蛋白质或多肽可诱导高效特异性杀伤肿瘤细胞的CTL，在肝癌等癌症的免疫细胞治疗临床应用中具有巨大潜力。

Description

具有细胞毒性T细胞诱导能力的蛋白质或多肽
技术领域
本发明涉及生命科学领域，具体涉及具有细胞毒性T细胞诱导能力的蛋白质或多肽。
背景技术
免疫细胞治疗是现有科技中唯一有可能彻底清除癌细胞的方法，弥补了传统疗法的弊端，被认为是二十一世纪肿瘤综合治疗模式中最有发展前途的一种治疗手段。
CTL(细胞毒性T淋巴细胞)制备过程中抗原负载是必需的过程，在CTL产业化和临床应用中，必需解决负载抗原多肽的特异性、有效性的问题。
目前针对肝癌等癌症的CTL疗法研发中，虽然已有相关文献报道，包括肝癌等癌症与病毒(HBV，HCV)相关的阳性多肽序列，以及肝癌高表达的抗原多肽序列。但是无相关报道它们的免疫原性强弱，更无报道通过DC(树突细胞)等抗原呈递细胞(Antigen-presentingcells,APC)，CTL能否负载这些肝癌相关抗原，以及负载了这些抗原多肽的CTL杀伤能力强弱。
发明内容
本发明提供具有细胞毒性T细胞诱导能力的蛋白质或多肽。
根据第一方面，一种实施例中提供一种具有细胞毒性T细胞(CTL)诱导能力的蛋白质或多肽，所述蛋白质或多肽含有如下氨基酸序列中的至少一种：
A1)YMHXLVYPA(SEQ ID NO:2)，所述X选自蛋氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、缬氨酸、谷氨酰胺中的任意一种；
A2)如SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:7至SEQ ID NO:12任意一项所示多肽片段；
A3)氨基酸序列与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:7至SEQ ID NO:12任意一项所示多肽具有80％以上同源性，且具有A1)或A2)限定的多肽片段的功能的多肽片段。
根据第二方面，一种实施例中提供分离的或纯化的第一方面所述蛋白质或多肽。
根据第三方面，一种实施例中提供分离的多核苷酸，所述多核苷酸编码第一方面或第二方面所述蛋白质或多肽。
在一实施例中，上述蛋白质或多肽可以诱导高效特异性杀伤肿瘤细胞的CTL，在肝癌等癌症的免疫细胞治疗临床应用中具有巨大潜力。
附图说明
图1显示为本发明实施例中的肝癌抗原筛选多肽诱导的特异性CTL细胞制备流程图；
图2显示为本发明实施例中的AID读板结果图；
图3显示为本发明实施例中负载抗原CTL阳性率测试的的流式检测荧光结果图；
图4显示为本发明实施例中负载抗原CTL阳性率测试的置换效率标准曲线图；
图5显示为本发明实施例中流式细胞术检测抗原多肽诱导的CTL阳性细胞率分析结果图；
图6显示为本发明实施例中新生抗原多肽AP1G1诱导刺激后的CTL细胞(即效应细胞)对靶细胞T2的杀伤实验结果图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式结合附图对本发明作进一步详细说明。其中不同实施方式中类似元件采用了相关联的类似的元件标号。在以下的实施方式中，很多细节描述是为了使得本申请能被更好的理解。然而，本领域技术人员可以毫不费力的认识到，其中部分特征在不同情况下是可以省略的，或者可以由其他元件、材料、方法所替代。在某些情况下，本申请相关的一些操作并没有在说明书中显示或者描述，这是为了避免本申请的核心部分被过多的描述所淹没，而对于本领域技术人员而言，详细描述这些相关操作并不是必要的，他们根据说明书中的描述以及本领域的一般技术知识即可完整了解相关操作。
另外，说明书中所描述的特点、操作或者特征可以以任意适当的方式结合形成各种实施方式。同时，方法描述中的各步骤或者动作也可以按照本领域技术人员所能显而易见的方式进行顺序调换或调整。因此，说明书和附图中的各种顺序只是为了清楚描述某一个实施例，并不意味着是必须的顺序，除非另有说明其中某个顺序是必须遵循的。
本文中为部件所编序号本身，例如“第一”、“第二”等，仅用于区分所描述的对象，不具有任何顺序或技术含义。
本申请中的编号例如，“Seq ID No.”、“第一方面”、“第二方面”、“第三方面”、“(a)”、“(b)”、“(c)”等，仅用于区分所描述的对象，不具有任何顺序或技术含义。
术语“多肽”是指氨基酸残基的聚合物。除天然存在的氨基酸聚合物外，该术语也适用于非天然存在的氨基酸聚合物，其包含一种或多种非天然存在的氨基酸残基。非天然存在的氨基酸包括氨基酸类似物、氨基酸模拟物或其他类似物。
术语“蛋白质”是指由氨基酸以“脱水缩合”的方式组成的多肽链经过盘曲折叠形成的具有一定空间结构的物质。
抗原是被免疫应答的产物识别的物质。在适当的条件下，抗原能够充当免疫原：在体内诱导特异性免疫应答；并且因此，抗原能够与该应答的产物反应。一般而言，特异性免疫应答产物可以是特异性结合抗原的抗体，或者是被敏化以对抗原反应的T淋巴细胞。
根据第一方面，一种实施例中提供具有细胞毒性T细胞(CTL)诱导能力的蛋白质或多肽，其含有如下氨基酸序列中的至少一种：
A1)YMHXLVYPA(SEQ ID NO:2)，所述X选自蛋氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、缬氨酸、谷氨酰胺中的任意一种；根据预测软件分析，上述X的选择不影响氨基酸序列的特异性和/或功能。
A2)如SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:7至SEQ ID NO:12任意一项所示多肽片段；
A3)氨基酸序列与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:7至SEQ ID NO:12任意一项所示多肽具有80％以上同源性，且具有A1)或A2)限定的多肽片段的功能的多肽片段。
在一实施例中，氨基酸序列与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:7至SEQ IDNO:12任意一项所示多肽具有80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％以上同源性。
根据第二方面，一种实施例中提供分离的或纯化的第一方面所述蛋白质或多肽。
根据第三方面，一种实施例中提供分离的多核苷酸，所述多核苷酸编码第一方面或第二方面所述蛋白质或多肽。
在一实施例中，所述多核苷酸含有如下序列中的至少一种：
B1)如SEQ ID NO:1所示片段或其RNA等同物；
B2)与B1)中任意序列互补的序列；
B3)与B1)或B2)中的序列编码相同蛋白质或多肽的序列。
根据第四方面，一种实施例中提供抗原呈递细胞，其表面呈递HLA抗原与第一方面或第二方面所述蛋白质或多肽。
在一实施例中，抗原呈递细胞(APC)通过第七方面所述方法诱导。
根据第五方面，一种实施例中提供一种组合物，包含选自组C1)至组C5)中的至少一种成分：
C1)一种或多种类型的第一方面或第二方面所述的蛋白质或多肽；
C2)一种或多种类型的第三方面所述的多核苷酸；
C3)抗原呈递细胞(APC)，其在其细胞表面上呈递第一方面或第二方面所述的蛋白质或多肽与HLA抗原的复合物；
C4)外来体，其在其细胞表面上呈递第一方面或第二方面所述的蛋白质或多肽与HLA抗原的复合物；
C5)CTL(细胞毒性T淋巴细胞)，其靶向第一方面或第二方面所述的蛋白质或多肽。
在一实施例中，外来体可以是细胞内分泌蛋白的运输载体，如细胞内囊泡等。这些外来体在它们的表面上呈递本发明肽与HLA抗原之间形成的复合体。外来体可以通过，例如在JPH11-510507和WO99/03499中详细描述的方法来制备，并可以用从作为治疗和/或预防(防范)对象的患者获得的APC制备。本发明的外来体可以作为疫苗以与本发明的肽相似的方式进行接种。
在一实施例中，上述组合物还包含药学上可接受的载体。
不限于此，本说明书中使用的术语“药学上可接受的载体”或“生理学上可接受的载体”包括液体或固体填充剂，可以包括稀释剂、赋形剂、溶剂和包封材料中的至少一种；并且是指药学或生理学上可接受的材料、组合物、物质或介质。
在一实施例中，上述组合物是用于诱导CTL的组合物。
在一实施例中，C3)中所述抗原呈递细胞包括树突状细胞(DCs)。
根据第六方面，一种实施例中提供第五方面所述组合物在制备组D1)至D3)中至少一种药物中的用途：
D1)制备癌症治疗的药物；
D2)制备癌症预防的药物；
D3)制备手术后癌症复发的预防的药物。
在一实施例中，所述药物用于诱导针对癌症的免疫应答。
在一实施例中，所述癌症包括但不限于肝癌、肺癌、胰腺癌等等中的至少一种。
在一优选的实施例中，所述癌症为肝癌。
在一实施例中，所述药物用于对至少一种选自下组的HLA阳性的受试者施用：HLA-A2、HLA-A3、HLA-A24。
根据第七方面，一种实施例中提供诱导具有CTL诱导能力的APC的方法，包括如下方法中的至少一种：
E1)在体外或体内将APC与第一方面或第二方面所述蛋白质或多肽接触；
E2)将编码第一方面或第二方面所述蛋白质或多肽的多核苷酸导入APC。
根据第八方面，一种实施例中提供诱导CTL的方法，包括如下方法中的至少一种：
F1)将CD8阳性T细胞与APC共培养，所述APC在其表面上呈递HLA抗原与第一方面或第二方面所述蛋白质或多肽的复合物；
F2)将CD8阳性T细胞与外来体共培养，所述外来体在其表面上呈递HLA抗原与第一方面或第二方面所述蛋白质或多肽的复合物；
F3)将多核苷酸引入CD8阳性T细胞，所述多核苷酸编码T细胞受体(TCR)的每个亚基，所述T细胞受体能够结合细胞表面上由HLA抗原呈递的第一方面或第二方面所述蛋白质或多肽。
根据第九方面，一种实施例中提供CTL，其靶向第一方面或第二方面所述蛋白质或多肽。
在一实施例中，CTL通过第七方面所述方法诱导。
根据第十方面，一种实施例中提供抗体，其结合第一方面或第二方面所述蛋白质或多肽。
根据第十一方面，一种实施例中提供筛选具有CTL诱导能力的肽的方法，其包括以下步骤：
(a)产生由氨基酸序列组成的候选序列，其中对SEQ ID NO:2、、SEQ ID NO:4或SEQID NO:7至SEQ ID NO:12任意一项所示氨基酸序列组成的原始氨基酸序列取代、缺失、插入和/或添加一个、两个或数个氨基酸残基；
(b)从在(a)中产生的候选序列中选择除HLA-A0201外与任何已知的人基因产物不具有显著同源性(序列同一性)的候选序列；
(c)将APC与由在(b)中选择出的候选序列组成的肽接触；
(d)将(c)中的APC与CD8阳性T细胞接触；和
(e)选择与由原始氨基酸序列组成的肽相比，具有相等或更高的CTL诱导能力的肽。
根据第十二方面，一种实施例中提供一种构建体，所述构建体含有如第三方面所述的多核苷酸。所述构建体通常可以通过将所述分离的多核苷酸插入合适的载体中构建获得，本领域技术人员可选择合适的载体，所述载体可以是噬菌体、质粒、或病毒载体、或人工染色体，诸如细菌或酵母人工染色体。换言之，本发明的实施方案的载体包含能够在宿主细胞或其分离的级分中表达的感兴趣的多核苷酸。载体通常还适合作为克隆载体，即在微生物系统中可复制；克隆载体可以被设计用于在一种宿主中复制，而构建体被设计用于在不同的宿主中表达。包含本发明的实施方案的多肽和蛋白的载体还可以包含用于在宿主细胞中繁殖或选择的选择标记。载体可以通过常规转化或转染技术引入到原核或真核细胞中。
根据第十三方面，一种实施例中提供一种表达系统，所述表达系统含有如第十二方面所述的构建体或基因组中整合有外源的如第三方面所述的多核苷酸。所述表达系统可以是宿主细胞，所述宿主细胞可以表达如第一方面或第二方面所述的蛋白质或多肽。在本发明另一具体实施例中，所述宿主细胞可以是真核细胞和/或原核细胞，更具体可以是小鼠细胞、人细胞等。
根据第十四方面，一种实施例中提供乳剂，其包含第一方面或第二方面所述蛋白质或多肽。
根据第十五方面，一种实施例中提供试剂盒，其包含容纳第五方面所述组合物的容器和容纳佐剂的容器。
根据第十六方面，一种实施例中提供T细胞抗原受体(TCR)，或所述T细胞抗原受体的氨基酸序列，或编码所述T细胞抗原受体的核苷酸序列；所述T细胞抗原受体可特异性靶向第一方面或第二方面所述蛋白质或多肽。
根据第十七方面，一种实施例中提供可特异性靶向第一方面或第二方面所述蛋白质或多肽的T细胞抗原受体嵌合型T细胞(TCR-T细胞)。
TCR-T，又称T细胞受体(TCR)嵌合型T细胞，通过转导嵌合抗原受体(融合抗原结合域及T细胞信号结构域)或者TCRα/β异二聚体识别肿瘤相关抗原(Tumor AssociatedAntigen,TAA)。TCR-T疗法直接改造T细胞结合肿瘤抗原的“探头”——TCR，加强了T细胞针对肿瘤细胞的特异性识别过程，而且提高了T淋巴细胞对于肿瘤细胞的亲和力，使得原来无肿瘤识别能力的T细胞能够有效地识别并杀伤肿瘤细胞。
上述T细胞受体(TCR)嵌合型T细胞可应用于TCR－T疗法，TCR－T疗法的基本步骤是：首先鉴定出一种或多种肿瘤抗原作为治疗靶点，再获得特异识别肿瘤抗原的的TCR序列；然后采用基因工程技术，将编码抗原特异的TCR基因序列导入患者自身T细胞中，从而获得特异识别肿瘤抗原的TCR－T细胞。这些TCR－T细胞通过体外培养进行大量扩增之后，被回输到患者体内以杀死肿瘤细胞。
在一实施例中，可通过流式细胞仪筛选出负载本发明一些实施例中所筛选的肝癌抗原多肽的CTL，在收集之后，通过高通量单细胞TCR(T细胞受体)全长测序，并进行TCR特异引物扩增，得到相应针对肝癌抗原的TCR序列，对于后续制备TCR-T细胞有相应指导意义，可推动TCR-T疗法在肝癌免疫细胞治疗中的靶点开发。
在一些实施例中，本发明筛选和验证了一种肿瘤抗原多肽，它能高效诱导肿瘤特异性的CTL(细胞毒性T淋巴细胞)，并证明了通过它诱导的CTL在免疫原性、负载抗原CTL细胞的阳性率及其在细胞体外实验中的杀伤效能，均优于其他抗原多肽诱导的CTL。在免疫细胞治疗领域应用后，将有效地增强人们对负载新生抗原的CTL在肝癌临床治疗中的正确认识。
在一实施例中，所筛选的能够高效诱导CTL特异性杀伤靶细胞的肝癌抗原肽段的核苷酸序列及氨基酸序列如下：
核苷酸序列：AGCAGGGTAGACCAGCATGTGCATATA(SEQ ID NO:1)；
氨基酸序列：YMHMLVYPA(SEQ ID NO:3)。
在一实施例中，通过筛选出来的抗原多肽，可以诱导高效特异性杀伤肿瘤细胞的CTL，其制备方法高效、便捷，相比其他免疫细胞疗法，具有成本低、产量高、工艺流程简洁的特点，在肝癌免疫细胞治疗临床应用中潜力大。
在一实施例中，成本低主要体现如下：对比其他类型免疫细胞治疗方案，本发明采用的抗原制备成本比使用质粒/病毒载体表达转染抗原到细胞的成本低。
在一实施例中，CTL高效杀伤肿瘤细胞的性能，也可以减少CTL的回输剂量，降低CTL培养成本。
在一实施例中，工艺流程简洁指的是：相对TCR-T/CAR-T等细胞治疗工艺中需要构建质粒库、病毒细胞库等工艺，CTL的工艺流程简洁。
实施例1
图1显示为本实施例的肝癌抗原筛选多肽诱导的特异性CTL细胞制备流程图，主要流程包括：从364例肝癌病人TCGA数据库中进行全外显子测序(Whole exome sequencing)，肿瘤新生抗原及多肽预测(Tumor neoantigen)，抗原与MHCⅠ类分子结合亲合力分析(Antigen binding affinity prediction)，筛选出亲合力较强的新生目的多肽，之后刺激抗原递呈细胞，细胞因子(IL-4,GM-CSF,IFN-γ,LPS)刺激过的APC细胞将抗原递呈给CD8+T细胞(Antigen presenting)，并用相应的细胞因子(IL-21,IL-2,IL-7,IL-15)刺激成熟之后，CTLs分泌细胞因子(IFN-γ)杀伤靶细胞或肿瘤细胞，进而治疗肿瘤患者。
1、为了评估本实施例所筛选出的新生抗原肽相对病毒相关性抗原和肿瘤相关性抗原更具有高抗原免疫原性，进行了以下实验步骤的筛选及验证。
1.肿瘤抗原筛选
1.1肿瘤新生抗原的筛选
根据生物信息学软件(具体是PSSMHCpan、NetMHC-4.0、NetMHCpan-3.0、NetMHCpan-4.0、PickPocket和SMM这六款软件)预测出HLA-A0201分型的肝癌人群中的多个人高频突变位点，并对这几个位点对应的突变位点进行了多肽-MHC亲和性预测。
由于肝癌抗原表位可以被HLA-A2、HLA-A3、HLA-A24等不同的MHC-I类分子所递呈，中国的HLA-A2阳性人群高达到50％，因此，研究HLA-A0201限制性CTL表位更具有现实意义。
参考文献：Liang B,Zhu L,Liang Z,et al.A simplified PCR-SSP method forHLA-A2subtype in a population of Wuhan,China.Cellular and molecularimmunology.2006,3:453-458.
筛选过程具体如下：
从TCGA数据库(https://portal.gdc.cancer.gov/projects/TCGA-LIHC)下载了364例肝癌全外显子测序结果的体细胞突变数据(版本20170929)。筛选了至少复现在2例病人身上的missense SNV位点，得到以HLA-A0201分型为例的肝癌病人群体里最高频的10个突变位点，并根据变异信息将氨基酸序列截取成长度为9mer且含有变异氨基酸的短肽。
根据筛选得到的10个高频突变位点，运用内部脚本根据变异信息生成含有变异氨基酸的长度为9mer的短肽序列。为了鉴定可用作候选标记物以开发抗肿瘤疫苗的新生抗原，以及预测精度最优化，本实施例将PSSMHCpan、NetMHC-4.0、NetMHCpan-3.0、NetMHCpan-4.0、PickPocket和SMM这六款软件纳入亲和力预测流程，以检测TCGA肝癌样本中的候选新生抗原。最后，选择符合以下条件的候选新生抗原：通过至少3个软件预测为结合物(IC50<500nM)，并将预测为结合物的几个软件对应的IC50值的最小值作为最终预测结果且IC50<50nM。
运用六款软件组合的方法预测生成的短肽与MHC的结合能力，IC50<500nM表示有亲和力，IC50<50nM表示有高亲和力。按照IC50分值从低到高进行排序，本实施例选择了IC50分值<50nM的短肽，最终得到亲和力最强的前8条高频突变短肽。其中的IC50<50nM意味着此短肽与该HLA(HLA-A0201)类型的高亲和。IC50分值越低，亲和性越高。
本实施例筛选得到亲和力最强的2条高频突变多肽并进行合成，突变位点及合成的多肽信息如下表1所示。
表1以HLA-A0201分型为例的肝癌人群高频突变位点及合成新抗原多肽的信息
序号 HLA分型 基因名称 氨基酸序列 多肽长度 序列编号
1 HLA-A0201 AP1G1 YMHMLVYPA 9 SEQ ID NO:3
2 HLA-A0201 SUCNR FLFTLPMLI 9 SEQ ID NO:4
3 HLA-A0201 GPR137B YIIPLQVPGL 10 SEQ ID NO:7
4 HLA-A0201 PIK3CA FLFTLPMLI 9 SEQ ID NO:8
5 HLA-A0201 ZDHHC22 TLTPAVPHYV 10 SEQ ID NO:9
6 HLA-A0201 TGIF2LX FIYDASNQVLL 11 SEQ ID NO:10
7 HLA-A0201 SI LLTNGMIVTL 10 SEQ ID NO:11
8 HLA-A0201 OPRK1 FVLQFFLFL 9 SEQ ID NO:12
1.2病毒相关性抗原筛选
为了将预测的新抗原多肽与病毒相关性的抗原多肽的免疫原性相比较，我们根据查阅文献获得HBV(hepatitis B virus,乙型肝炎病毒)相关的阳性多肽序列，多肽信息如下表2所示。
表2合成HBV、HCV相关病毒多肽的信息
序号 名称 氨基酸序列 多肽长度 序列编号
1 HBV_04 GLSPTVWLSV 10 SEQ ID NO:5
1.3肿瘤相关性抗原筛选
同时为了将预测的新抗原多肽与肿瘤高表达的相关抗原多肽的免疫原性相比较，本实施例也查阅文献获得肝癌高表达的相关多肽序列，获得了6条肿瘤高表达相关多肽序列，挑选其中表达量相对较高的一条多肽序列作为对照组，如表3所示。
表3合成肝癌高表达相关多肽的信息
序号 名称 氨基酸序列 多肽长度 序列编号
1 GPC3144–152 FVGEFFTDV 9 SEQ ID NO:6
肿瘤相关性抗原筛选参考文献如下：Tada Y,Yoshikawa T,Shimomura M,SawadaY,Sakai M,Shirakawa H,Nobuoka D,Nakatsura T:Analysis of cytotoxic Tlymphocytes from a patient with hepatocellular carcinoma who showed aclinical response to vaccination with a glypican3derived peptide.Int J Oncol2013,43(4):1019-1026.
Kan Z,Zheng H,Liu X,Li S,Barber TD,Gong Z,Gao H,Hao K,Willard MD,Xu Jet al:Whole-genome sequencing identifies recurrent mutations inhepatocellular carcinoma.Genome Res2013,23(9):1422-1433.
Loffler MW,Mohr C,Bichmann L,Freudenmann LK,Walzer M,Schroeder CM,Trautwein N,Hilke FJ,Zinser RS,Muhlenbruch L et al:Multi-omics discovery ofexome-derived neoantigens in hepatocellular carcinoma.Genome Med 2019,11(1):28.
Schulze K,Nault JC,Villanueva A:Genetic profiling of hepatocellularcarcinoma using next-generation sequencing.J Hepatol 2016,65(5):1031-1042.
Meyerson M,Gabriel S,Getz G:Advances in understanding cancer genomesthrough second-generation sequencing.Nat Rev Genet 2010,11(10):685-696.
表1、表2、表3中用于实验的多肽均是委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
2.抗原合成、筛选和验证
合成以上多肽之后，购买PBMC细胞(外周血单个核细胞，Peripheral bloodmononuclear cell，简称PBMC，购自妙通(上海)生物科技有限公司，产品编号：PER-F，名称：人周细胞)，并用特异性磁珠和MS柱对CD8阳性T细胞和DC细胞进行分选。
分选之后先培养DC细胞(加入IL-4和GM-CSF细胞因子)，相应细胞因子(加入IL-4、GM-CSF、LPS和IFN-γ细胞因子)刺激成熟24h，之后用相应的目的多肽刺激。
其中：采购的磁珠和磁力架都为赛默飞世尔科技公司(Thermo FisherScientific)产品。
磁珠名称：DynabeadsTMCD8，货号：11147D。
磁珠名称：DynabeadsTMFlowCompTMHuman CD14 Kit，货号：11367D。
磁珠分离器，名称：DynaMagTM-2Magnet，货号：12321D。
特异性是指针对CD8靶点阳性的磁珠和针对DC细胞阳性的磁珠(CD14+磁珠)。
各细胞因子均采购于Stemcell公司(STEMCELL Technologies，加拿大)。DC细胞与CD8阳性T细胞共培养一周(IL-21培养72h，之后使用IL-2、IL-7和IL-15培养)。CD8阳性T细胞刺激成熟之后收集并做EliSpot assay检测，通过分泌的IFN-γ产生紫色斑点的情况观察多肽是否具有免疫原性，再将EliSpot板进行AID读板，读板结果见图2。具体实验步骤如下：
2.1 DC(树突细胞)和T细胞的分选
2.1.1收集50-100mL HLA-A*0201分型的健康人外周血，用PBS重悬后，加入相应体积的Ficoll分离液，经过密度梯度离心后，用吸管吸出单核细胞层，转移至离心管中，用无菌PBS重悬后离心，重复洗涤一次，去除多余的Ficoll分离液和血小板，得到外周血单个核细胞(Peripheral blood monocyte cells，PBMCs)，冻存备用。
2.1.2取50*10^6外周血单核细胞，复苏之后用1640培养基(购自gibco公司)清洗一遍300g，离心5min，计数，使用1640培养基+10％FBS，37℃孵育6-12h。
2.1.3孵育之后，300g，离心5min，并用MACS buffer重悬，计数。根据数量加入相应的CD14磁珠(20μL/10^7cells)和MACS buffer(80μL/10^7cells)，4℃，孵育15min，每5分钟摇一次。CD14磁珠、MACS buffer均采购自thermo fisher公司，即赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher Scientific)。
2.1.4取出用20ml MACS buffer清洗一遍，300g，离心10min，并用MACS重悬，过MC柱子(用1mL MACS润洗一遍)，滤过的为CD14阴性细胞，细胞悬液滤过之后用1ml MACS清洗旧管一次，并用1ml MACS清洗柱子两次，最后取下MC柱子，用活塞猛推出的为CD14阳性细胞，即DC细胞，计数1.722*10^7个，一半用CG-DC+5％FBS+10ng/mL IL-4+86ng/mL GM-CSF培养基培养，一半用CS10冻存液冻存。
CG-DC培养基购自CellGenix公司(德国)，产品名称：
Figure BDA0002656533260000091
GMP DC Medium，货号：20801-0500。
2.1.5取CD14阴性细胞计数，加入相应体积的CD8磁珠(20μL/10^7cells)和MACSbuffer(80μL/10^7cells)，4℃，孵育15min，每5分钟摇一次。
2.1.6取出用20mL MACS buffer清洗一遍300g，离心10min，并用MACS重悬，过MC柱子(用1mL MACS润洗一遍)，滤过的为CD8阴性细胞，细胞悬液滤过之后用1mL MACS清洗旧管一次，并用1mL MACS清洗柱子两次，用活塞猛推出的为CD8阳性细胞，即T细胞，计数3.42*10^6个并冻存。
2.2 DC和T细胞的培养
2.2.1 D1(即第一天)，磁珠分选之后，DC细胞计数1.722*10^7个，一半冻存，一半培养，使用CG-DC+5％FBS+10ng/mL IL-4+86ng/mL GM-CSF培养基重悬，1mL/孔，置于12孔板中培养，共12孔(5*10^5个/孔)，培养48h。
2.2.2 D3，每孔补充CG-DC+5％FBS+20ng/mL IL-4+176ng/mL GM-CSF培养基500μL(原先的1/2体积，双倍的细胞因子浓度)，培养48h。
2.2.3 D5，配置CG-DC+5％FBS+10ng/mL IL-4+86ng/ml GM-CSF+10ng/mL LPS+10ng/mL IFN-γ培养基，全量换液，300g，离心10min，使用配置的培养基重悬，成熟培养24h；同时复苏T细胞，使用CG-DC+5％FBS+10ng/ml IL-7培养基重悬。
2.2.4 D6，将DC细胞负载相应目的多肽(10μg/mL)，37℃，CO2培养箱培养16h。
2.3 DC和T细胞共培养
2.3.1 D7，待多肽负载完成后，DC细胞和T细胞共培养，数量比DC：T＝1:4～1:8，体积比1：1，培养密度为1.0-1.5×10^6cells/cm2；此时加入30ng/mL IL-21，培养72h。
2.3.2 D10，3天后加入IL-2(10ng/mL)、IL-7(10ng/mL)、IL-15(10ng/mL)，培养48-72h。
2.3.3 D12或D13，半量换液，并补加细胞因子IL-2(10ng/mL)，IL-7(10ng/mL)，IL-15(10ng/mL)，保证细胞密度在1x10^6/mL左右，培养48-72h。
2.3.4 D14或D16，全量换液，补加细胞因子IL-2(10ng/mL)、IL-7(10ng/mL)、IL-15(10ng/mL)。
2.4酶联免疫斑点检测(ELISPOT，Enzyme-linked Immunospot Assay)
2.4.1 D20，复苏HLA-0201分型的T2细胞(购自ATCC，美国模式培养物集存库，American Type Culture Collection)，即T02-0201细胞(IMDM完全培养基(含10％FBS))，300×g离心5min，计数。
IMDM完全培养基采购自，mabtech公司，名称：Human IFN-γELISpot kit(ALP)，货号：3420-2APW-2。
2.4.2 D22，收集T02-0201细胞，300×g离心5min，用无血清IMDM完全培养基重悬细胞，计数，加入1.5mL EP管，分别负载相应目的多肽(10μg/mL)，记为实验组；单独设置一组为阴性对照组，在T02-0201细胞中加入DMSO(体积与多肽体积一致)，37℃孵育4h。
2.4.3 4h后，收集负载过多肽的T02-0201细胞，并用CG-DC+2％FBS培养基重悬，调整细胞浓度为5*10^4个/mL。
2.4.4 PBS洗elispot板5次，150μL/孔，每5min洗一次，之后加入IMDM+10％FBS，100μL/孔，37℃，30min。
2.4.5取待检测的T细胞样品，用CG-DC+2％FBS培养基重悬，调整细胞浓度为2*10^5个/mL。
2.4.6取出elispot板，在干净的纸巾上拍掉液体，按照铺板顺序加入T02和T细胞各100μL/孔，同时加入阳性对照组OKT3和阴性对照组，37℃，16-20h。
2.4.7 D23，除去板上的细胞，PBS洗elispot板5次，150μL/孔，每5min洗一次，加入配制好的7-b6-1-ALP抗体，100μL/孔，37℃，孵育2h。
7-b6-1-ALP抗体试剂盒采购自Mabtech公司(艾美捷科技有限公司，瑞典)，产品名称：Human IFN-γELISpot kit(ALP)，货号：3420-2APW-2。
7-b6-1-ALP抗体的配制方法如下：配制PBS+0.5％FBS，1：200加入抗体，0.22μm过滤，得到抗体。其中，1:200是指7-b6-1-ALP抗体与PBS+0.5％FBS的体积比，抗体浓度与试剂盒说明书一致。
2.4.8除去一抗，PBS洗elispot板5次，150μL/孔，每5min洗一次，加入NBT/BCIP避光显色2-8min，100μL/孔。
2.4.9观察，大量自来水冲洗。
2.4.10用烘箱烘干后，再用AID读数仪计各孔板的紫色斑点数，整理并统计。
图2显示为EliSpot assay筛选的具有免疫原性的抗原多肽免疫原性结果图。A图为AID读板数据图，第一列为新生抗原多肽筛选组AP1G1；第二列为新生抗原多肽筛选组SUCNR；第三列为病毒相关抗原多肽组-HBV_04；第四列为肿瘤高表达抗原多肽组-GPC3144–152。
图2的A图中，第1至3行为实验组(3次重复实验)，第4至6行为阴性对照组(3次重复实验)；B图为多肽序列信息图。
图2的结果显示，新生抗原多肽筛选组(即AP1G1号多肽)有高免疫原性，且具有统计学意义。
3、为了评估本实施例所筛选出的新生抗原肽能够通过DC等抗原呈递细胞，将抗原肽呈递给CD8阳性T细胞，并且激活产生相应的抗原特异性CTL细胞，进行了相应四聚体染色检测抗原特异性CTL细胞的阳性率。购买MBL生物公司(北京博尔迈生物技术有限公司)的四聚体置换试剂盒(QuickSwitchTM，PE染色)，具体步骤如下：
3.1四聚体置换实验：
3.1.1用DMSO制备2mg/mL(2mM)置换用目的多肽溶液和阳性多肽标准品。
3.1.2将50μL的四聚体加入圆底96孔板。
3.1.3加入1μL步骤3.1.1制备的多肽溶液，并用移液器混匀。
3.1.4加入1μL多肽置换因子，并用移液器混匀。
3.1.5避光于室温下孵育4h。
3.1.6然后于4℃避光保存。
3.2四聚体置换效率检测：
3.2.1在锥形底96孔板孔1-5加入20μL捕获磁珠。
3.2.2将5μL的1x检测缓冲液加入孔2，5μL未置换的四聚体加入孔1和孔3，将已置换的四聚体加入孔4和孔5。
3.2.3用锡纸包裹96孔板，并将96孔板置于平板摇床上，550rpm室温振荡45min。
3.2.4振荡结束后，将1x检测缓冲液加入孔1-5，每孔150μL清洗，将96孔板植于磁力板上静置5min，静置后弃上清，保持96孔板置于磁力板上状态下，用涡旋混匀器搅拌2秒钟，然后将96孔板从磁力板上取下。
3.2.5将1x抗体-FITC(试剂盒四聚体中多肽的特异性抗体)各25μL加入孔2-5，将1x检测缓冲液加入孔1中。
3.2.6用锡纸包裹96孔板，并将96孔板置于平板摇床上，550rpm室温振荡45min。
3.2.7振荡结束后，将1x检测缓冲液加入孔1-5，每孔150μL清洗，将96孔板植于磁力板上静置5min，静置后弃上清，保持96孔板置于磁力板上状态下，用涡旋混匀器搅拌2秒钟，然后将96孔板从磁力板上取下。
3.2.8将1x检测缓冲液加入孔6，再加入5μL捕获磁珠并混匀。
3.2.9将所有孔的液体转移到流式管中，置于冰上，之后上流式细胞分析仪检测试剂盒四聚体中多肽的荧光强度，进而计算出多肽的置换效率，计算公式及置换效率如图4和表4所示。
图3显示为流式检测荧光结果图；图4显示为置换效率标准曲线；表4显示为新生目的多肽的置换效率结果，表4中FITC为置换后原四聚体的平均荧光强度。
表4置换效率测试结果
多肽 FITC x 倍数 y效率计算 置换效率
未置换多肽 13421 20 671.05 y＝5.0505x+101.01 0
阳性多肽 699 1.041651 671.05 y＝5.0505x+101.01 95.7491409
AP1G1 789 1.10722 671.05 y＝5.0505x+101.01 95.07177707
图3、图4和表4的结果显示，本实施例的新生抗原多肽筛选组-AP1G1号多肽的置换效率为95.07％，根据试剂盒标准，置换率75％以上就说明是阳性结果，AP1G1号多肽的置换效率高达95.07％，说明此新生多肽置换成功，四聚体可用于后续检测。
3.3抗原特异性细胞毒性T细胞的阳性率检测：
3.3.1收集成熟的效应细胞(细胞数大约在2×10^6次方)于1.5mL离心管中，400g，离心5min。
3.3.2弃上清，使用PBS(0.5％FBS)重悬细胞，每管200μL。
3.3.3加入四聚体-PE(各2μL)及CD8表面抗体-FITC(1：1000)染色，4℃孵育30min(还准备一支双阴，一支单染PE和一支单染FITC的细胞)。
3.3.4孵育结束之后，每管加入PBS(0.5％FBS)各400μL清洗，400g，离心5min。
3.3.5每管再加入PBS(0.5％FBS)各400μL清洗，400g，离心5min。
3.3.6每管加入300μL PBS(0.5％FBS)重悬，并转移到流式管，置于冰上，之后上流式细胞分析仪检测细胞的荧光强度，Q2象限即为抗原特异性细胞毒性T细胞的阳性细胞。
图5显示为流式细胞术检测新生抗原肽诱导的CTL阳性细胞率分析结果图，其中，左图“Control”为对照组，右图为新生多肽AP1G1试验组。
从图5可以看出，本实施例用AP1G1抗原多肽抗原刺激后的T细胞，可以用四聚体检测出1.57％的阳性新生抗原特异性T细胞，Q2象限框内为阳性细胞群。而对照组的CTL阳性细胞率仅仅为0.075％。现有技术中，一般诱导后的CTL阳性细胞率低于0.5％，甚至无法诱导出可以用流式细胞术检测的CTL。图5的结果说明，本实施例的AP1G1抗原多肽诱导产生的肝癌特异性细胞毒性T淋巴细胞，其阳性率明显高于现有肝癌抗原多肽诱导后的CTL。
4、为了评估本发明所描述的筛选出的新生抗原肽诱导的CTL具有体外细胞杀伤能力，进行了乳酸脱氢酶LDH杀伤实验，实验原理如下：
选取EliSpot assay实验中筛选出的具有免疫原性的新生抗原多肽，采用乳酸脱氢酶检测试剂盒(LDH Assay Kit)进行靶细胞杀伤性能测试。乳酸脱氢酶(LDH)是活细胞胞浆内含酶之一，在正常情况下，不能透过细胞膜。当靶细胞T2受到效应细胞CTL的攻击而损伤时，细胞膜通透性改变，LDH可释放至介质中，释放出来的LDH在催化乳酸生成丙酮酸的过程中，使氧化型辅酶I(NAD+)变成还原型辅酶I(NADH2)，后者再通过递氢体-吩嗪二甲酯硫酸盐(PMS)还原碘硝基氯化氮唑蓝(INT)或硝基氯化四氮唑蓝(NBT)形成有色的甲簪类化合物，在490nm波长处有一高吸收峰，使用酶标仪读取的OD值，经过计算即可得靶细胞活性，从而检测抗原多肽的杀伤性能。具体操作步骤如下：
4.1取T2细胞，计数，用无血清IMDM完全培养基重悬，实验组为负载筛选到的新生抗原多肽，对照组为加入等体积的DMSO，多肽浓度为10μg/ml，37℃，负载4h。
4.2 4h后，离心T2细胞，用培养基(CG-DC+5％FBS)重悬T2，调整浓度至2*10^5/mL。
4.3取效应细胞，按照表4所示的铺板方案，效靶比为5:1(E:T＝5：1)进行培养稀释，培养基为CG-DC+5％FBS。效靶比是指效应细胞与靶细胞的数量之比。
4.4.使用尖底或圆底96孔板进行铺板，所有孔终体积为100μL。
表5 LDH铺板情况
Figure BDA0002656533260000141
表5中，“①”表示实验组(50μL效应细胞+50μL靶细胞)，“②”表示效应细胞自然释放(50μL效应细胞+50μL培养基)，“③”表示靶细胞自然释放(50μL靶细胞+50μL培养基)，“④”表示靶细胞最大释放(50μL靶细胞+50μL培养基+10μL裂解液)，“⑤”表示体积校正(110μL)，“⑥”表示培养液对照(100μL)。
4.5 96孔板在37℃，5％CO2培养箱中培养4小时。
4.6在培养3.5h时，加入10μL的lysis buffer到靶细胞最大释放组和体积校正组。
4.7孵育结束离心96孔板，250g，离心4min。
4.8取上清50μL/孔至检测用的平底96孔板，避免气泡。
4.9加入50μL/孔的Substrate Mix(用完放-20℃保存)。Substrate Mix采购自上海碧云天生物技术有限公司的乳酸脱氢酶细胞毒性检测试剂盒(LDH Cytotoxicity AssayKit)，货号：C0017。
4.10室温，避光反应30min。
4.11加入50μL/孔Stop solution，轻拍混匀(避免气泡)。
4.12检查孔内，用注射器戳破气泡，于全波长读数仪上读取吸收光490nm，导出原始数据。
4.13计算杀伤率(％)：
4.13.1所有实验组、对照组应减去背景平均值。
4.13.2矫正后的值用于杀伤效率计算，细胞杀伤率(％)＝[(实验组释放-效应细胞自发释放-靶细胞自发释放)/(靶细胞最大释放-靶细胞自发释放)]×100％。
图6显示为靶细胞杀伤实验结果图。
图6的结果显示，用筛选出的新生抗原多肽诱导刺激后的CTL细胞具有体外细胞杀伤能力，在E:T(效靶比)为5:1时，杀伤效率为60％，具有统计学意义。本实施例中，DMSO组即为阴性对照组，未负载多肽的T细胞本底组，杀伤率低于5％。可见，一般T细胞的本底杀伤率低于10％。本实施例的AP1G1抗原多肽诱导的肝癌特异性CTL具有较强的体外杀伤能力。
以上应用了具体个例对本发明进行阐述，只是用于帮助理解本发明，并不用以限制本发明。对于本发明所属技术领域的技术人员，依据本发明的思想，还可以做出若干简单推演、变形或替换。
序列表
<120> 具有细胞毒性T细胞诱导能力的蛋白质或多肽
<160> 12
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
agcagggtag accagcatgt gcatata 27
<210> 2
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Tyr Met His Xaa Leu Val Tyr Pro Ala
1 5
<210> 3
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Tyr Met His Met Leu Val Tyr Pro Ala
1 5
<210> 4
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Phe Leu Phe Thr Leu Pro Met Leu Ile
1 5
<210> 5
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Gly Leu Ser Pro Thr Val Trp Leu Ser Val
1 5 10
<210> 6
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Phe Val Gly Glu Phe Phe Thr Asp Val
1 5
<210> 7
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
Tyr Ile Ile Pro Leu Gln Val Pro Gly Leu
1 5 10
<210> 8
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
Phe Leu Phe Thr Leu Pro Met Leu Ile
1 5
<210> 9
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
Thr Leu Thr Pro Ala Val Pro His Tyr Val
1 5 10
<210> 10
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
Phe Ile Tyr Asp Ala Ser Asn Gln Val Leu Leu
1 5 10
<210> 11
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
Leu Leu Thr Asn Gly Met Ile Val Thr Leu
1 5 10
<210> 12
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
Phe Val Leu Gln Phe Phe Leu Phe Leu
1 5

Claims (12)

1.具有细胞毒性T细胞诱导能力的蛋白质或多肽，其特征在于，所述蛋白质或多肽含有如下氨基酸序列中的至少一种：
A1)YMHXLVYPA(SEQ ID NO:2)，所述X选自蛋氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、缬氨酸、谷氨酰胺中的任意一种；
A2)如SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:7至SEQ ID NO:12任意一项所示多肽片段；
A3)氨基酸序列与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:7至SEQ ID NO:12任意一项所示多肽具有80％以上同源性，且具有A1)或A2)限定的多肽片段的功能的多肽片段。
2.分离的或纯化的权利要求1所述蛋白质或多肽。
3.一种分离的多核苷酸，所述多核苷酸编码权利要求1或2所述蛋白质或多肽。
4.如权利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸含有如下序列中的至少一种：
B1)如SEQ ID NO:1所示片段或其RNA等同物；
B2)与B1)中任意序列互补的序列；
B3)与B1)或B2)中的序列编码相同蛋白质或多肽的序列。
5.抗原呈递细胞，其表面呈递HLA抗原与权利要求1或2所述蛋白质或多肽。
6.一种组合物，其特征在于，含有组C1)至组C5)中的至少一种成分：
C1)一种或多种类型的权利要求1或2所述的蛋白质或多肽；
C2)一种或多种类型的权利要求3或4所述的多核苷酸；
C3)抗原呈递细胞，其在其细胞表面上呈递权利要求1或2所述的蛋白质或多肽与HLA抗原的复合物；
C4)外来体，其在其细胞表面上呈递权利要求1或2所述的蛋白质或多肽与HLA抗原的复合物；
C5)具有细胞毒性T细胞，其靶向权利要求1或2所述的蛋白质或多肽；
任选地，所述组合物还含有药学上可接受的载体；
任选地，所述组合物是用于诱导细胞毒性T细胞的组合物。
7.如权利要求5或6所述的组合物在制备组D1)至D3)中至少一种药物中的用途：
D1)制备癌症治疗的药物；
D2)制备癌症预防的药物；
D3)制备手术后癌症复发的预防的药物；
任选地，所述药物用于诱导针对癌症的免疫应答；
任选地，所述癌症包括肝癌、肺癌、胰腺癌，优选地，所述癌症为肝癌；
任选地，所述药物用于对至少一种选自下组的HLA阳性的受试者施用：HLA-A2、HLA-A3、HLA-A24。
8.具有细胞毒性T细胞，其靶向权利要求1或2所述蛋白质或多肽。
9.一种构建体，所述构建体含有如权利要求3或4所述的多核苷酸。
10.一种表达系统，所述表达系统含有如权利要求9所述的构建体或基因组中整合有外源的如权利要求3或4所述的多核苷酸。
11.T细胞抗原受体，或所述T细胞抗原受体的氨基酸序列，或编码所述T细胞抗原受体的核苷酸序列；所述T细胞抗原受体可特异性靶向权利要求1或2所述蛋白质或多肽。
12.可特异性靶向权利要求1或2所述蛋白质或多肽的T细胞抗原受体嵌合型T细胞。
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