CN110551198A - 一种肺癌抗原组合及其应用、细胞毒性t淋巴细胞 - Google Patents

一种肺癌抗原组合及其应用、细胞毒性t淋巴细胞 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种肺癌抗原组合及其应用、细胞毒性T淋巴细胞，属于生物医药技术领域，所述肺癌抗原的氨基酸序列如SEQ ID No.1～10所示。采用本发明提供的肺癌抗原组合共培养外周血单个核细胞，得到的细胞毒性T淋巴细胞，能够有效杀伤表达肺癌相关抗原的细胞。

Description

一种肺癌抗原组合及其应用、细胞毒性T淋巴细胞
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，尤其涉及一种肺癌抗原组合及其应用、细胞毒性T淋巴细胞。
背景技术
我国肺癌发病率最高，且死亡率高，随着精准治疗的推广，常规的化疗、放疗和靶向已无法满足肿瘤的个性化和多变性，因此，寻找个性化的肿瘤新抗原，培养识别个性化肿瘤新抗原的CTL(细胞毒性T淋巴细胞)，将是彻底清除肿瘤的有效方法。
靶向肿瘤新抗原的CTL的培养，关键是如何选择肿瘤新抗原，目前常用的手段是，通过生物信息学方法，对肿瘤新抗原与HLA的亲和力进行预测，选取亲和力高的，作为备选的肿瘤新抗原，优点是快速且高通量，缺点是，基于算法脱离实验，结果不准确；另一种经典方法是，对在体外，检测肿瘤新抗原与HLA四聚体的亲和力，进而判断肿瘤新抗原的有效性，优点是，基于检测的亲和力，结果较为准确，缺点是，成本高，耗时长，且脱离细胞，有效性需进一步验证。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种肺癌抗原组合及其应用、细胞毒性T淋巴细胞，采用本发明提供的肺癌抗原组合共培养外周血单个核细胞得到的细胞毒性T淋巴细胞，能够有效杀伤肺癌细胞。
为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：
本发明提供了一种肺癌抗原组合，所述肺癌抗原的氨基酸序列如SEQ ID No.1～10所示。
本发明还提供了上述技术方案所述的肺癌抗原组合在制备细胞毒性T淋巴细胞中的应用。
优选的，所述应用包括：以每种肺癌抗原的终浓度为10～50μg/ml共培养外周血单个核细胞，得到细胞毒性T淋巴细胞。
优选的，所述每种肺癌抗原的终浓度为15～30μg/ml。
优选的，所述每种肺癌抗原的终浓度为20μg/ml。
本发明还提供了上述技术方案所述的肺癌抗原组合在制备治疗肺癌的药物中的应用。
本发明还提供了一种细胞毒性T淋巴细胞，采用上述技术方案所述的肺癌抗原组合共培养外周血单个核细胞，得到。
本发明还提供了上述技术方案所述的细胞毒性T淋巴细胞在制备治疗肺癌的药物中的应用。
本发明提供了一种肺癌抗原组合及其应用、细胞毒性T淋巴细胞，采用本发明提供的肺癌抗原组合共培养外周血单个核细胞，得到的细胞毒性T淋巴细胞，能够有效杀伤肺癌细胞。
附图说明
图1为1-20号肿瘤新抗原筛选结果；
图2为21-40号肿瘤新抗原筛选结果；
图3为41-60号肿瘤新抗原筛选结果；
图4为61-80号肿瘤新抗原筛选结果；
图5为流式检测淋巴细胞亚群结果；
图6为PBMC对靶细胞的杀伤结果；
图7为CTL对靶细胞的杀伤结果。
具体实施方式
本发明提供了一种肺癌抗原组合，所述肺癌抗原的氨基酸序列如SEQ ID No.1～10所示，具体如下所示：
SEQ ID No.1：TVLYTAAKK；
SEQ ID No.2：AEVVLAHLGV；
SEQ ID No.3：KEIIQYVL；
SEQ ID No.4：GENLSVGQHQL；
SEQ ID No.5：TRSVLKVFL；
SEQ ID No.6：TAYTCSFVFTY；
SEQ ID No.7：EGVIQNFKK；
SEQ ID No.8：IQNFKKTLSKK；
SEQ ID No.9：KDWSRALQL；
SEQ ID No.10：LTNWALRR。
在本发明中，所述SEQ IDNo.1、6、8和10对应的HLA等位基因是HLA-A*11:01；所述SEQ ID No.2～4对应的HLA等位基因是HLA-B*40:01；所述SEQ IDNo.5、7和9对应的HLA等位基因是HLA-C*07:02。
本发明还提供了上述技术方案所述的肺癌抗原组合在制备细胞毒性T淋巴细胞中的应用。在本发明中，所述应用优选包括：以每种肺癌抗原的终浓度为10～50μg/ml共培养外周血单个核细胞，得到细胞毒性T淋巴细胞。本发明对培养得到细胞毒性T淋巴细胞的方法没有特殊限定，采用常规培养细胞毒性T淋巴细胞的方法即可。在本发明中，所述每种肺癌抗原的终浓度更优选为15～30μg/ml，最优选为20μg/ml。
本发明还提供了上述技术方案所述的肺癌抗原组合在制备治疗肺癌的药物中的应用。在本发明中，所述药物优选以肺癌抗原为唯一活性成分，还包括药学上可接受的辅料或辅助性成分，肺癌抗原的质量比优选为0.5～1.5：0.5～1.5：0.5～1.5：0.5～1.5：0.5～1.5：0.5～1.5：0.5～1.5：0.5～1.5：0.5～1.5：0.5～1.5，更优选为1：1：1：1：1：1：1：1：1：1。在本发明中，所述药物的剂型优选包括片剂、粉剂、颗粒剂、胶囊、口服液或缓释剂。本发明对所述肺癌抗原组合在上述剂型中的用量没有特殊限定，采用常规剂型中药物的用量即可。本发明对所述上述剂型使用的辅料或者辅助性成分的种类和含量没有特殊限定，采用常规即可。
本发明还提供了一种细胞毒性T淋巴细胞，采用上述技术方案所述的肺癌抗原组合共培养外周血单个核细胞，得到。在本发明中，采用肺癌抗原组合共培养外周血单个核细胞得到细胞毒性T淋巴细胞的方法与上述相同，在此不再赘述。在本发明中，采用肺癌抗原组合共培养外周血单个核细胞，得到的细胞毒性T淋巴细胞能够识别肺癌抗原组合，具有特异性杀伤作用并且提高杀伤作用，进而来治疗肺癌。
本发明还提供了上述技术方案所述的细胞毒性T淋巴细胞在制备治疗肺癌的药物中的应用。在本发明中，所述药物优选以细胞毒性T淋巴细胞为唯一活性成分，还包括药学上可接受的辅料或辅助性成分。在本发明中，所述药物的剂型优选包括片剂、粉剂、颗粒剂、胶囊、口服液或缓释剂。本发明对所述细胞毒性T淋巴细胞在上述剂型中的用量没有特殊限定，采用常规剂型中药物的用量即可。本发明对所述上述剂型使用的辅料或者辅助性成分的种类和含量没有特殊限定，采用常规即可。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
1.肺癌相关肿瘤新抗原：
患者李某的肿瘤组织的全外显子测序结果，进行肿瘤新抗原分析(鼎成肽源生物信息技术有限公司)，对80条抗原进行合成(南京金斯瑞多肽合成部)；
表1多肽序列及对应编号
2、共培养制备APC：
1)复苏冻存PBMC(2.5×107cells)，以1640+10％FBS稀释冻存液，1500rpm 5min，以10mL1640+10％FBS重悬，1×106cells/mL，37℃、5％CO2复苏培养24h；
2)配制多肽，1640+10％FBS+200U/mL IL-2+1600U/mL GM-CSF，多肽终浓度为50ng/mL，混匀后备用；
3)1500rpm 5min，离心收集细胞，以多肽溶液重悬细胞，密度调整至1×106cells/mL；
4)37℃、5％CO2培养24h后，细胞为APC，轻轻吹打细胞混匀备用；
3、共培养
1)离心收集PBMC，1640+10％FBS重悬，计数调整至1×106cells/mL；
2)按照100：1的比例加入APC，混匀，记为Day 0；
3)37℃、5％CO2培养48h后，每天按照总体家补加终浓度为500U/mL IL-2；
4)培养至Day 21时，收集细胞即为CTL；
4、肿瘤新抗原的筛选：
1)收集CTL细胞，以1640+10％FBS重悬，计数调整至2.5×106cells/mL；
2)10mL cells+10mL 1640+10％FBS将细胞调整至2.5×105cells/mL，再加入8μL500U/μL IL-2，IL-2终浓度为200U/mL，再分至96孔板中(平底)，200μL/孔；
3)每孔加入对应多肽，5μL2μg/mL多肽；设置阳性对照OKT3167ng/mL、medium对照、CTL；
4)37℃5％CO2培养24h后，1500rpm离心10min，转移170μL上清至新的96孔板中；
5)为避免吸到细胞，再将96孔板进行1500rpm离心10min，转移110μL上清至新的96孔板；
6)以R&D ELISA试剂盒检测细胞上清中IFN-γ的释放量，以此来进行抗原的筛选。
5、靶细胞的构建
1)通过人工合成的方法，进行HLA-A1101，HLA-B4001和HLA-C0702基因合成(金维智公司)，合成的基因构建到pCDH表达载体上；
HLA-A1101的核苷酸序列如SEQ ID No.81所示，具体如下：
atggccgtcatggcgccccgaaccctcctcctgctactctcgggggccctggccctgacccagacctgggcgggctcccactccatgaggtatttctacacctccgtgtcccggcccggccgcggggagccccgcttcatcgccgtgggctacgtggacgacacgcagttcgtgcggttcgacagcgacgccgcgagccagaggatggagccgcgggcgccgtggatagagcaggaggggccggagtattgggaccaggagacacggaatgtgaaggcccagtcacagactgaccgagtggacctggggaccctgcgcggctactacaaccagagcgaggacggttctcacaccatccagataatgtatggctgcgacgtggggccggacgggcgcttcctccgcgggtaccggcaggacgcctacgacggcaaggattacatcgccctgaacgaggacctgcgctcttggaccgcggcggacatggcagctcagatcaccaagcgcaagtgggaggcggcccatgcggcggagcagcagagagcctacctggagggccggtgcgtggagtggctccgcagatacctggagaacgggaaggagacgctgcagcgcacggacccccccaagacacatatgacccaccaccccatctctgaccatgaggccaccctgaggtgctgggccctgggcttctaccctgcggagatcacactgacctggcagcgggatggggaggaccagacccaggacacggagctcgtggagaccaggcctgcaggggatggaaccttccagaagtgggcggctgtggtggtgccttctggagaggagcagagatacacctgccatgtgcagcatgagggtctgcccaagcccctcaccctgagatgggagctgtcttcccagcccaccatccccatcgtgggcatcattgctggcctggttctccttggagctgtgatcactggagctgtggtcgctgccgtgatgtggaggaggaagagctcagatagaaaaggagggagttacactcaggctgcaagcagtgacagtgcccagggctctgatgtgtctctcacagcttgtaaagtgtga；
HLA-B4001的核苷酸序列如SEQ ID No.82所示，具体如下：
atgcgggtcacggcaccccgaaccgtcctcctgctgctctcggcggccctggccctgaccgagacctgggcgggctcccactccatgaggtatttccacaccgccatgtcccggcccggccgcggggagccccgcttcatcaccgtgggctacgtggacgacacgctgttcgtgaggttcgacagcgacgccacgagtccgaggaaggagccgcgggcgccatggatagagcaggaggggccggagtattgggaccgggagacacagatctccaagaccaacacacagacttaccgagagagcctgcggaacctgcgcggctactacaaccagagcgaggccgggtctcacaccctccagaggatgtacggctgcgacgtggggccggacgggcgcctcctccgcgggcataaccagtacgcctacgacggcaaggattacatcgccctgaacgaggacctgcgctcctggaccgccgcggacacggcggctcagatctcccagcgcaagttggaggcggcccgtgtggcggagcagctgagagcctacctggagggcgagtgcgtggagtggctccgcagatacctggagaacgggaaggacaagctggagcgcgctgaccccccaaagacacacgtgacccaccaccccatctctgaccatgaggccaccctgaggtgctgggccctgggtttctaccctgcggagatcacactgacctggcagcgggatggcgaggaccaaactcaggacactgagcttgtggagaccagaccagcaggagatagaaccttccagaagtgggcagctgtggtggtgccttctggagaagagcagagatacacatgccatgtacagcatgaggggctgccgaagcccctcaccctgagatgggagccgtcttcccagtccaccgtccccatcgtgggcattgttgctggcctggctgtcctagcagttgtggtcatcggagctgtggtcgctgctgtgatgtgtaggaggaagagttcaggtggaaaaggagggagctactctcaggctgcgtgcagcgacagtgcccagggctctgatgtgtctctcacagcttga；
HLA-C0702的核苷酸序列如SEQ ID No.83所示，具体如下所示：
atgcgggtcatggcgccccgagccctcctcctgctgctctcgggaggcctggccctgaccgagacctgggcctgctcccactccatgaggtatttcgacaccgccgtgtcccggcccggccgcggagagccccgcttcatctcagtgggctacgtggacgacacgcagttcgtgcggttcgacagcgacgccgcgagtccgagaggggagccgcgggcgccgtgggtggagcaggaggggccggagtattgggaccgggagacacagaagtacaagcgccaggcacaggctgaccgagtgagcctgcggaacctgcgcggctactacaaccagagcgaggacgggtctcacaccctccagaggatgtctggctgcgacctggggcccgacgggcgcctcctccgcgggtatgaccagtccgcctacgacggcaaggattacatcgccctgaacgaggacctgcgctcctggaccgccgcggacaccgcggctcagatcacccagcgcaagttggaggcggcccgtgcggcggagcagctgagagcctacctggagggcacgtgcgtggagtggctccgcagatacctggagaacgggaaggagacgctgcagcgcgcagaacccccaaagacacacgtgacccaccaccccctctctgaccatgaggccaccctgaggtgctgggccctgggcttctaccctgcggagatcacactgacctggcagcgggatggggaggaccagacccaggacaccgagcttgtggagaccaggccagcaggagatggaaccttccagaagtgggcagctgtggtggtgccttctggacaagagcagagatacacgtgccatatgcagcacgaggggctgcaagagcccctcaccctgagctgggagccatcttcccagcccaccatccccatcatgggcatcgttgctggcctggctgtcctggttgtcctagctgtccttggagctgtggtcaccgctatgatgtgtaggaggaagagctcaggtggaaaaggagggagctgctctcaggctgcgtgcagcaacagtgcccagggctctgatgagtctctcatcacttgtaaagcctga。
2)上述得到的重组质粒转化感受态细胞，挑取单克隆，进行测序，选择测序结果正确的克隆，进行后续实验；
3)以天根质粒大提试剂盒(购自于天根生化科技(北京)有限公司)进行质粒的提取，方法按照厂家说明书操作。
4)慢病毒包装：复苏293T细胞，传两代后用于慢病毒包装；细胞转染：(T175培养瓶)细胞密度为2×107个/瓶；取一支15ml离心管(标记为A)，将包装质粒4K(17μg)、6K(34μg)和目的质粒(51μg)加入1mLjetPRIME配套的Buffer中，轻轻地混匀。将jetPRIME(标记为B)缓慢滴加入A离心管中，加入同时匀速晃动A管，得到C溶液，之后静置10min；将T175中旧的培养基倒出，将18mLDMEM(不含抗生素和血清)加入C中，加入T175培养瓶中，置于37℃，5％CO2培养箱中培养。转染4-6h后，吸去含有转染复合物的培养基，更换为37℃预热的新鲜培养基。培养48h和72h并收集。
5)慢病毒转染3T3细胞：使用DMEM配制含有7％FBS的全细胞培养基，记为DMEM。使用DMEM把3T3细胞浓度调整到5X10^5/ml，加入6孔板，每孔1mL，37℃培养箱孵育过夜。弃去6孔板中DMEM培养基，使用1mLAIM-V-P混匀病毒液加入对应各孔中。培养3天后转入T75培养瓶中，加入嘌呤霉素进行筛选；筛选6天后，得到稳定表达HLA-A1101、HLA-B4001和HLA-C0702的3T3细胞，标记为3T3-HLA；
6、杀伤实验——LDH法
1)收集靶细胞3T3和3T3-HLA，1000rpm离心5min；
2)以PBS洗一遍，1000rpm离心5min；
3)加入多肽溶液，进行有效新抗原组合的负载，37℃2-12h，优选4h；
4)多肽溶液：多肽溶液以1640培养基进行配制，每种多肽的终浓度为20μg/mL；
5)1000rpm离心5min，除去多余溶液，并以PBS洗2次；
6)以1640+2％FBS重悬后，计数调整至8×104cells/mL，分至96孔板中(U型底)，50μL/孔，备用；
7)收集CTL细胞，1000rpm离心5min；
8)以PBS洗一遍，1000rpm离心5min；
9)以1640+2％FBS重悬细胞计数后，分至96孔板中(U型底)，50μL/孔，设置效靶比为40：1、20：1、10：1、5：1、2.5：1和1.25：1；
10)37℃5％CO2共孵育20h后，进行LDH检测。
7、流式分型
1)收集CTL，1000rpm离心5min；
2)1×106cells/管，加入CD3、CD4、CD8和CD56的抗体，室温避光30min；
3)PBS洗两次，1000rpm离心5min；
4)PBS重悬，上机检测。
结果：
1、肺癌相关肿瘤新抗原的筛选
20条多肽为一组，进行筛选，筛选结果见图1-4，IFN-γ的释放水水平超过对照的，认为是有效的新抗原，4组新抗原中，有效的新抗原见表2。
表2有效的多肽抗原序列及对应编号
多肽编号 基因名 HLA等位基因 突变的抗原表位
8 IPO8 HLA-A*11:01 TVLYTAAKK
10 RPN1 HLA-B*40:01 AEVVLAHLGV
17 TRIP4 HLA-B*40:01 KEIIQYVL
18 ABCC1 HLA-B*40:01 GENLSVGQHQL
19 HIST1H4B HLA-C*07:02 TRSVLKVFL
37 FOS HLA-A*11:01 TAYTCSFVFTY
65 MLLT4 HLA-C*07:02 EGVIQNFKK
66 MLLT4 HLA-A*11:01 IQNFKKTLSKK
67 ZFYVE26 HLA-C*07:02 KDWSRALQL
68 LDOC1L HLA-A*11:01 LTNWALRR
2、以筛选到有效新抗原(表2)进行组合，每种多肽抗原的终浓度为20μg/mL进行CTL的培养，流式分析细胞表型，结果如图5所示，NKT(CD56+CD3+)比例为8.99％，90％以上为T细胞，其中74.09％为CD8+T细胞。
3、CTL对靶细胞的杀伤作用
以没有共培养的PBMC作为对照，分别比较了PBMC和CTL对靶细胞的杀伤情况，结果如图6和图7所示：PBMC对负载抗原多肽的靶细胞和对照靶细胞的杀伤情况没有区别；但经过抗原刺激培养的CTL，对负载抗原多肽的靶细胞具有更高的杀伤效率，说明，培养的CTL，可以识别此抗原组合，且具有特异的杀伤作用，可以作为肺癌治疗的首选抗原组合。
由以上实施例可以得出，采用本发明提供的肺癌抗原组合共培养得到CTL后，对负载抗原多肽的靶细胞具有更高的杀伤效率，进而可治疗肺癌。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 北京鼎成肽源生物技术有限公司
<120> 一种肺癌抗原组合及其应用、细胞毒性T淋巴细胞
<160> 83
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Thr Val Leu Tyr Thr Ala Ala Lys Lys
1 5
<210> 2
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Ala Glu Val Val Leu Ala His Leu Gly Val
1 5 10
<210> 3
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Lys Glu Ile Ile Gln Tyr Val Leu
1 5
<210> 4
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Gly Glu Asn Leu Ser Val Gly Gln His Gln Leu
1 5 10
<210> 5
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Thr Arg Ser Val Leu Lys Val Phe Leu
1 5
<210> 6
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Thr Ala Tyr Thr Cys Ser Phe Val Phe Thr Tyr
1 5 10
<210> 7
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
Glu Gly Val Ile Gln Asn Phe Lys Lys
1 5
<210> 8
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
Ile Gln Asn Phe Lys Lys Thr Leu Ser Lys Lys
1 5 10
<210> 9
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
Lys Asp Trp Ser Arg Ala Leu Gln Leu
1 5
<210> 10
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
Leu Thr Asn Trp Ala Leu Arg Arg
1 5
<210> 11
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
Lys Thr Phe Gly Leu Asp Val Ser Lys
1 5
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<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
Arg Lys Thr Phe Gly Leu Asp Val Ser Lys
1 5 10
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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Ala Glu Lys Leu His Glu Thr Ala Leu
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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Val Thr Ser Glu Ser Gly Pro Pro Lys
1 5
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<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
Leu Ile Tyr Glu Glu Thr Arg Ser Val Leu Lys
1 5 10
<210> 16
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
Thr Val Leu Tyr Thr Ala Ala Lys
1 5
<210> 17
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
Cys Tyr Val Asp Gly Arg Val Pro Phe
1 5
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<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
Thr Val Leu Tyr Thr Ala Ala Lys Lys Arg Lys
1 5 10
<210> 19
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
Ile Tyr Glu Glu Thr Arg Ser Val Leu
1 5
<210> 20
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
Ala Ala Gln Thr Val Leu Tyr Thr Ala Ala Lys
1 5 10
<210> 21
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
Val Leu Tyr Thr Ala Ala Lys Lys
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
Asp Arg Glu Pro Gly Gly Val Thr His
1 5
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<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
Gln Thr Phe Asn Val Ile Glu Arg Cys Pro Lys
1 5 10
<210> 24
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
Gly Val Ile Gln Asn Phe Lys Lys
1 5
<210> 25
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
Ala Val Ser Leu Pro Arg Cys Glu Lys
1 5
<210> 26
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
Tyr Thr Cys Ser Phe Val Phe Thr Tyr
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<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
Val Ile Gln Asn Phe Lys Lys Thr Leu Ser Lys
1 5 10
<210> 28
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
Lys Ile Ala Val Ser Leu Pro Arg Cys Glu Lys
1 5 10
<210> 29
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
Gln Thr Phe Asn Val Ile Glu Arg
1 5
<210> 30
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
Thr Ser Glu Ser Gly Pro Pro Lys
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<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
Glu Val Thr Ser Glu Ser Gly Pro Pro Lys
1 5 10
<210> 32
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
Ala Glu Thr Gly Glu Leu Thr Asp Asn Leu
1 5 10
<210> 33
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
Ala Arg Asp Ser Glu Lys Arg Val Gln
1 5
<210> 34
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
Lys Ser Gln Leu Gln Ala His Thr Lys
1 5
<210> 35
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
Leu Glu Met Glu Asn Arg Leu Gln Asp Leu
1 5 10
<210> 36
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
Met Glu Asn Arg Leu Gln Asp Leu
1 5
<210> 37
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 37
Gly Thr Ser Gly Leu Arg Lys Arg Leu Lys
1 5 10
<210> 38
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 38
Pro Glu Gly Pro Glu Gln Ala Gln Leu
1 5
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<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 39
Tyr Tyr Ser Cys Glu Thr Ala Lys Lys Ala Met
1 5 10
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<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 40
Ser Gln Leu Gln Ala His Thr Lys
1 5
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<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 41
Ile Gln Asn Phe Lys Lys Thr Leu Ser Lys
1 5 10
<210> 42
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 42
Leu Gly Lys Pro Pro Gln Val Thr Asn
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 43
Val Leu Gln Leu Phe Ser Asp Gln Lys
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 44
Val Ser Leu Pro Arg Cys Glu Lys Leu
1 5
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<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 45
Glu Lys Glu Arg Asp Thr Leu Gln Ala Trp Lys
1 5 10
<210> 46
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 46
Ile Arg Gln Asn Asn Thr Ser Leu Arg Leu
1 5 10
<210> 47
<211> 9
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 47
Lys Thr Leu Ser Lys Lys Glu Lys Lys
1 5
<210> 48
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 48
Ile Ile Thr Arg Tyr Gln Gln Thr Phe
1 5
<210> 49
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 49
Tyr Ser Cys Glu Thr Ala Lys Lys
1 5
<210> 50
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 50
Phe Cys Gly Asp Thr Val Lys Ile Leu
1 5
<210> 51
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 51
Gln Val Thr Asn Arg Tyr Leu Ser Gln Leu Lys
1 5 10
<210> 52
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 52
Ile Arg Gln Asn Asn Thr Ser Leu
1 5
<210> 53
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 53
Asn Arg Leu Gln Asp Leu Glu Asn Gln
1 5
<210> 54
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 54
Glu Gly Ser Gly Asp Tyr Gln Val Glu
1 5
<210> 55
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 55
Asp Trp Ala Gly Gly Arg Leu Thr Leu
1 5
<210> 56
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 56
Tyr Leu Phe Cys Gly Asp Thr Val Lys
1 5
<210> 57
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 57
Ser Lys Glu Ile Ile Gln Tyr Val Leu
1 5
<210> 58
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 58
Val Lys Ile Leu Glu Gly Lys Asp Ala Gly Lys
1 5 10
<210> 59
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 59
Thr Ser Leu Arg Leu Thr Asn Trp Ala Leu Arg
1 5 10
<210> 60
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 60
Gln Ser Gln His Met Thr Glu Val Leu Arg Arg
1 5 10
<210> 61
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 61
Ser Gln His Met Thr Glu Val Leu Arg Arg
1 5 10
<210> 62
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 62
Ile Ala Val Ser Leu Pro Arg Cys Glu Lys
1 5 10
<210> 63
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 63
Leu Arg Leu Thr Asn Trp Ala Leu
1 5
<210> 64
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 64
Trp Thr Asn Asp Ala Met Ala Asp Ile Arg Gln
1 5 10
<210> 65
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 65
Ile Arg Asp Trp Ala Gly Gly Arg Leu Thr Leu
1 5 10
<210> 66
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 66
Leu Glu Glu Glu Lys Lys Asn Thr Val Asp Leu
1 5 10
<210> 67
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 67
Cys Gly Asp Thr Val Lys Ile Leu Glu Gly Lys
1 5 10
<210> 68
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 68
Val Leu Tyr Thr Ala Ala Lys Lys Arg Lys
1 5 10
<210> 69
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 69
Gly Gly Val Thr His Gln Gly Cys Gly
1 5
<210> 70
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 70
Asn Trp Ala Leu Arg Arg Glu Ala Ser
1 5
<210> 71
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 71
Glu Glu Lys Lys Asn Thr Val Asp Leu
1 5
<210> 72
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 72
Thr Arg Tyr Gln Gln Thr Phe Asn Val Ile
1 5 10
<210> 73
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 73
Asn Asp Ala Met Ala Asp Ile Arg Gln
1 5
<210> 74
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 74
Ser Glu Ser Gly Pro Pro Lys Val Glu
1 5
<210> 75
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 75
Ala His Phe Arg Arg Asp Lys Phe Leu
1 5
<210> 76
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 76
Tyr Gln Gln Thr Phe Asn Val Ile
1 5
<210> 77
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 77
Cys Ser Gly Asp Gly Val Gly Ala Leu
1 5
<210> 78
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 78
Tyr Gln Val Glu Glu Ile Pro Phe
1 5
<210> 79
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 79
Gly Glu Asn Leu Ser Val Gly Gln His
1 5
<210> 80
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 80
Glu Arg Asp Thr Leu Gln Ala Trp Lys
1 5
<210> 81
<211> 1098
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 81
atggccgtca tggcgccccg aaccctcctc ctgctactct cgggggccct ggccctgacc 60
cagacctggg cgggctccca ctccatgagg tatttctaca cctccgtgtc ccggcccggc 120
cgcggggagc cccgcttcat cgccgtgggc tacgtggacg acacgcagtt cgtgcggttc 180
gacagcgacg ccgcgagcca gaggatggag ccgcgggcgc cgtggataga gcaggagggg 240
ccggagtatt gggaccagga gacacggaat gtgaaggccc agtcacagac tgaccgagtg 300
gacctgggga ccctgcgcgg ctactacaac cagagcgagg acggttctca caccatccag 360
ataatgtatg gctgcgacgt ggggccggac gggcgcttcc tccgcgggta ccggcaggac 420
gcctacgacg gcaaggatta catcgccctg aacgaggacc tgcgctcttg gaccgcggcg 480
gacatggcag ctcagatcac caagcgcaag tgggaggcgg cccatgcggc ggagcagcag 540
agagcctacc tggagggccg gtgcgtggag tggctccgca gatacctgga gaacgggaag 600
gagacgctgc agcgcacgga cccccccaag acacatatga cccaccaccc catctctgac 660
catgaggcca ccctgaggtg ctgggccctg ggcttctacc ctgcggagat cacactgacc 720
tggcagcggg atggggagga ccagacccag gacacggagc tcgtggagac caggcctgca 780
ggggatggaa ccttccagaa gtgggcggct gtggtggtgc cttctggaga ggagcagaga 840
tacacctgcc atgtgcagca tgagggtctg cccaagcccc tcaccctgag atgggagctg 900
tcttcccagc ccaccatccc catcgtgggc atcattgctg gcctggttct ccttggagct 960
gtgatcactg gagctgtggt cgctgccgtg atgtggagga ggaagagctc agatagaaaa 1020
ggagggagtt acactcaggc tgcaagcagt gacagtgccc agggctctga tgtgtctctc 1080
acagcttgta aagtgtga 1098
<210> 82
<211> 1089
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 82
atgcgggtca cggcaccccg aaccgtcctc ctgctgctct cggcggccct ggccctgacc 60
gagacctggg cgggctccca ctccatgagg tatttccaca ccgccatgtc ccggcccggc 120
cgcggggagc cccgcttcat caccgtgggc tacgtggacg acacgctgtt cgtgaggttc 180
gacagcgacg ccacgagtcc gaggaaggag ccgcgggcgc catggataga gcaggagggg 240
ccggagtatt gggaccggga gacacagatc tccaagacca acacacagac ttaccgagag 300
agcctgcgga acctgcgcgg ctactacaac cagagcgagg ccgggtctca caccctccag 360
aggatgtacg gctgcgacgt ggggccggac gggcgcctcc tccgcgggca taaccagtac 420
gcctacgacg gcaaggatta catcgccctg aacgaggacc tgcgctcctg gaccgccgcg 480
gacacggcgg ctcagatctc ccagcgcaag ttggaggcgg cccgtgtggc ggagcagctg 540
agagcctacc tggagggcga gtgcgtggag tggctccgca gatacctgga gaacgggaag 600
gacaagctgg agcgcgctga ccccccaaag acacacgtga cccaccaccc catctctgac 660
catgaggcca ccctgaggtg ctgggccctg ggtttctacc ctgcggagat cacactgacc 720
tggcagcggg atggcgagga ccaaactcag gacactgagc ttgtggagac cagaccagca 780
ggagatagaa ccttccagaa gtgggcagct gtggtggtgc cttctggaga agagcagaga 840
tacacatgcc atgtacagca tgaggggctg ccgaagcccc tcaccctgag atgggagccg 900
tcttcccagt ccaccgtccc catcgtgggc attgttgctg gcctggctgt cctagcagtt 960
gtggtcatcg gagctgtggt cgctgctgtg atgtgtagga ggaagagttc aggtggaaaa 1020
ggagggagct actctcaggc tgcgtgcagc gacagtgccc agggctctga tgtgtctctc 1080
acagcttga 1089
<210> 83
<211> 1101
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 83
atgcgggtca tggcgccccg agccctcctc ctgctgctct cgggaggcct ggccctgacc 60
gagacctggg cctgctccca ctccatgagg tatttcgaca ccgccgtgtc ccggcccggc 120
cgcggagagc cccgcttcat ctcagtgggc tacgtggacg acacgcagtt cgtgcggttc 180
gacagcgacg ccgcgagtcc gagaggggag ccgcgggcgc cgtgggtgga gcaggagggg 240
ccggagtatt gggaccggga gacacagaag tacaagcgcc aggcacaggc tgaccgagtg 300
agcctgcgga acctgcgcgg ctactacaac cagagcgagg acgggtctca caccctccag 360
aggatgtctg gctgcgacct ggggcccgac gggcgcctcc tccgcgggta tgaccagtcc 420
gcctacgacg gcaaggatta catcgccctg aacgaggacc tgcgctcctg gaccgccgcg 480
gacaccgcgg ctcagatcac ccagcgcaag ttggaggcgg cccgtgcggc ggagcagctg 540
agagcctacc tggagggcac gtgcgtggag tggctccgca gatacctgga gaacgggaag 600
gagacgctgc agcgcgcaga acccccaaag acacacgtga cccaccaccc cctctctgac 660
catgaggcca ccctgaggtg ctgggccctg ggcttctacc ctgcggagat cacactgacc 720
tggcagcggg atggggagga ccagacccag gacaccgagc ttgtggagac caggccagca 780
ggagatggaa ccttccagaa gtgggcagct gtggtggtgc cttctggaca agagcagaga 840
tacacgtgcc atatgcagca cgaggggctg caagagcccc tcaccctgag ctgggagcca 900
tcttcccagc ccaccatccc catcatgggc atcgttgctg gcctggctgt cctggttgtc 960
ctagctgtcc ttggagctgt ggtcaccgct atgatgtgta ggaggaagag ctcaggtgga 1020
aaaggaggga gctgctctca ggctgcgtgc agcaacagtg cccagggctc tgatgagtct 1080
ctcatcactt gtaaagcctg a 1101

Claims (8)

1.一种肺癌抗原组合，其特征在于，所述肺癌抗原的氨基酸序列如SEQ ID No.1～10所示。
2.权利要求1所述的肺癌抗原组合在制备细胞毒性T淋巴细胞中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述应用包括：以每种肺癌抗原的终浓度为10～50μg/ml共培养外周血单个核细胞，得到细胞毒性T淋巴细胞。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述每种肺癌抗原的终浓度为15～30μg/ml。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述每种肺癌抗原的终浓度为20μg/ml。
6.权利要求1所述的肺癌抗原组合在制备治疗肺癌的药物中的应用。
7.一种细胞毒性T淋巴细胞，其特征在于，采用权利要求1所述的肺癌抗原组合共培养外周血单个核细胞，得到。
8.权利要求7所述的细胞毒性T淋巴细胞在制备治疗肺癌的药物中的应用。
CN201910924264.9A 2019-09-27 2019-09-27 一种肺癌抗原组合及其应用、细胞毒性t淋巴细胞 Active CN110551198B (zh)

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