CN118028235A - 人工抗原提呈细胞及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物医药技术领域，公开了一种制备人工抗原提呈细胞的方法，其特征在于，该方法包括：(1)构建表达HLA的K562细胞；(2)使表达HLA的K562细胞负载RNA；(3)使用固定剂固定负载了RNA的K562细胞。本发明提供的人工抗原提呈细胞的制备方法可以使外周血单核细胞中的抗原特异性T细胞得到有效扩增，扩增特异性T细胞的能力优于负载多肽的K562细胞和天然的DC细胞。

Description

人工抗原提呈细胞及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，具体地，涉及人工抗原提呈细胞及其制备方法和应用。
背景技术
自体抗原提呈细胞(antigen presenting cells，APCs)如树突状细胞(dendriticcells，DCs)、单核细胞和活化B细胞最初被用于体外扩增肿瘤特异性T细胞。在递呈肿瘤抗原给T细胞识别的过程中，T细胞获得的信号刺激会影响其编程和治疗效果，从而调控T细胞分化为最适的表现型。从肿瘤患者的血液中分离出同源的APC十分困难，DC数量稀少，只占外周血单核细胞(Peripheral Blood Mononuclear Cell，PBMC)的1％以下，经体外培养得到成熟的DC同样较少，且难以扩增，诱导产生的特异性T细胞数量难以满足临床治疗和检测的要求。为了克服上述弊端，以人源细胞系为基础的人工抗原提呈细胞(artificial APC，aAPC)系统目前已经发展并且广泛用于免疫治疗中肿瘤特异性T细胞的扩增。
人工抗原提呈细胞(aAPC)能够有效地激活和扩增抗原特异性T细胞，具有高效率和良好的可行性。不同类型的aAPC能够表达不同的分子，产生相应的信号刺激，促使所需的T细胞迁移和发挥效应功能，同时有助于编程细胞建立持久的T细胞记忆。一种aAPC也可以同时表达多种抗体和抗原，易于操控，满足实验需求。总之，aAPC的应用有效地提高了肿瘤特异性T细胞治疗的临床疗效。
K562细胞属于人白血病细胞系，来源于急变期的慢性髓细胞性白血病患者。尽管已存在用K562细胞构建aAPC的报道，但K562细胞对T细胞的增殖会产生一定的抑制作用且抗原提呈的效率仍有待进一步提高。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术的存在的问题，提供一种制备人工抗原提呈细胞的方法。
为了实现上述目的，本发明第一方面提供一种制备人工抗原提呈细胞的方法，该方法包括：
(1)构建表达HLA的K562细胞；
(2)使表达HLA的K562细胞负载RNA；
(3)使用固定剂固定负载了RNA的K562细胞。
本发明第二方面提供本发明第一方面所述的方法制备得到的人工抗原提呈细胞。
本发明第三方面提供一种制备T细胞的方法，所述方法包括：用人工抗原提呈细胞与外周血单核细胞共培养；
其中，所述外周血单核细胞来自供体对象，所述人工抗原提呈细胞为本发明第一方面所述的方法制备得到的人工抗原提呈细胞。
本发明第四方面提供一种药物组合物，该药物组合物包括本发明第一方面所述的方法制备得到的人工抗原提呈细胞。
本发明第五方面提供一种本发明第一方面所述的制备人工抗原提呈细胞的方法在制备T细胞免疫疗法的药物中的应用。
本发明第六方面提供本发明所述的制备人工抗原提呈细胞的方法在制备检测T细胞的制剂和/或设备中的应用。
通过上述技术方案，本发明至少具有以下有益效果：
(1)本发明提供的人工抗原提呈细胞的制备方法可以使外周血单核细胞中的抗原特异性T细胞得到有效扩增，扩增特异性T细胞的能力优于负载多肽的K562细胞和天然的DC细胞，有利于进一步促进肿瘤特异性T细胞治疗的推广。
(2)本发明提供的方法简单易行，省去了辐照对设备与场地的高要求，在使细胞失活的同时最大程度的保留了其人工抗原提呈细胞的功能，而且省去了分离诱导DC细胞的复杂过程，同时与通过天然的DC培养抗原提呈细胞相比，能减少患者的取血量；用于T细胞检测时，能够提高抗原特异性T细胞的检测灵敏度，实用性更强；在一些优选实施方式中，本发明所述方法不导入共刺激分子，简化了制备方法，节约了时间和成本。
附图说明
图1是单一HLA K562细胞系构建过程，图1A为HLA-A0201慢病毒表达质粒图谱；图1B为过表达细胞系HLA表达水平检测，包括HLA-A0201、HLA-A1101以及HLA-A2402三个HLA亚型。
图2是电转CMV mRNA的K562-A02细胞经多聚甲醛固定后，可以刺激特异性T细胞增殖。图2A和图2B是特异性T细胞扩增比例检测结果，图2C显示培养过程中总T细胞的增殖曲线。
图3是加入共刺激分子后抗原特异性T细胞扩增情况。图3A和3B是特异性T细胞扩增比例检测结果，图3C显示培养过程中总T细胞的增殖曲线。
图4是aAPC与自体DC对特异性T细胞扩增的效果。
图5是不同HLA亚型的aAPC抗原提呈效果。
具体实施方式
在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
在本发明中，HLA-A1101等同于HLA-A*11:01，HLA-A0201等同于HLA-A*02:01，HLA-A2402等同于HLA-A*24:02。
本发明第一方面提供一种制备人工抗原提呈细胞的方法，该方法包括：
(1)构建表达HLA的K562细胞；
(2)使表达HLA的K562细胞负载RNA；
(3)使用固定剂固定负载了RNA的K562细胞。
K562细胞(人慢性髓系白血病细胞)是从一名患有慢性粒细胞白血病的病人骨髓中分离出来。K562的原始细胞是一种具有多向分化潜能的造血系统的恶性肿瘤细胞，能自发分化为红系、粒系和单核系的可辨识的祖细胞等。该细胞为本领域常见的成熟细胞系，可通过商购获得，例如购自美国典型培养物保藏中心(ATCC)、中国科学院细胞库和国家实验细胞资源共享平台等。
在本发明中，优选地，步骤(1)中构建表达HLA的K562细胞的方式为：将HLA表达基因整合到K562细胞的基因组内。所述整合的方法没有特殊限定，可以为本领域常用的基因整合的方法，能够使得HLA基因能够在K562细胞内稳定遗传和表达即可，例如通过使用转座子、病毒载体、重组酶或基因编辑技术将目标序列整合到宿主基因组；也可以根据实际需要采用本领域常规技术手段进行优化。
在本发明中，所述HLA表达基因的型别可以为任意型别，例如为HLA数据库https://hla.alleles.org/nomenclature/index.html中记载的所有型别，如：HLA-I类基因，包括HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-E、HLA-F、HLA-G，其中，HLA-A中又包括A*01:01、A*01:02、A*01:03、A*01:06、A*01:07、A*01:08、A*01:09、A*01:10、A*01:12、A*01:13等，HLA-B中又包括B*07:02、B*07:03、B*07:04、B*07:05、B*07:06、B*07:07、B*07:08、B*07:09、B*07:10、B*07:11等；HLA-II类基因，包括HLA-DRA、HLA-DRB1、HLA-DRB2-9、HLA-DQA1、HLA-DQB1、HLA-DPA1、HLA-DPB1，各类中还包括多种分型。实施例中以HLA-A*02:01、HLA-A*11:01和HLA-A*24:02作为示范性说明本发明的优势，但不因此限制本发明的范围，本发明所述的方法可以根据需要，将不同的HLA表达基因整合到K562细胞内。
优选地，为了进一步提高人工抗原提呈细胞扩增抗原特异性T细胞的能力，所述HLA表达基因为HLA-I类基因，更优选为HLA-A，进一步优选为HLA-A*02:01、HLA-A*11:01、HLA-A*24:02、HLA-A*01:01、HLA-A*01:02、HLA-A*01:03、HLA-A*01:06、HLA-A*01:07、HLA-A*01:08、HLA-A*01:09、HLA-A*01:10、HLA-A*01:12和HLA-A*01:1中的至少一种。
在本发明中，所述构建表达HLA的K562细胞的方法和条件可以为本领域常规选择，本领域技术人员可以根据实际情况对构建表达HLA的K562细胞的方法和条件进行调整，例如可以为将含有HLA表达基因的载体转染K562细胞，得到转染后的目标细胞，将所述转染后的目标细胞进行单克隆筛选得到单克隆，将所述单克隆进行PCR鉴定，得到阳性克隆，最后将所述阳性克隆进行扩大培养，得到表达HLA的K562细胞，其中，所述载体的构建、转染、单克隆筛选和扩大培养为本领域常规技术手段，本领域技术人员可以根据情况进行调整。
在本发明中，优选地，所述步骤(2)中负载RNA的方式为转染，所述转染的方法和条件可以为本领域常规选择，本领域技术人员可以根据实际情况对细胞转染的方法和条件进行调整，为了进一步提高人工抗原提呈细胞扩增抗原特异性T细胞的能力，所述转染的方法为电转。
在本发明中，优选地，为了进一步提高人工抗原提呈细胞扩增抗原特异性T细胞的能力，每2×106个细胞，所述RNA的用量为5-20μg，例如可以为5μg、6μg、7μg、8μg、9μg、10μg、11μg、12μg、13μg、14μg、16μg、16μg、17μg、18μg、19μg、20μg以及上述任意两个数值组成的范围和范围中的任意值，更优选为12-20μg。
在本发明中，优选地，为了进一步提高人工抗原提呈细胞扩增抗原特异性T细胞的能力，所述RNA为抗原mRNA，可以为任何能够促使所需的T细胞迁移和发挥效应功能的抗原(多肽)的mRNA，以及优化的mRNA(比如为了增强蛋白质表达水平而优化获得的mRNA)，如可以为肿瘤抗原的mRNA，更优选为人巨细胞病毒mRNA，进一步优选为碱基序列如SEQ ID NO:4所示的RNA。
未经失活的K562细胞对T细胞的增殖会产生一定的抑制作用，为辐照手段使K562细胞失活，常用辐照的方式，但该方式对设备与环境的要求较高，本发明的发明人在研究中意外发现，将负载RNA的K562细胞进行固定后，不但可以使所述细胞失活，使其不会抑制T细胞增殖，而且还能促进T细胞的增殖。
为了进一步提高人工抗原提呈细胞扩增抗原特异性T细胞的能力，在本发明中，优选地，使用固定剂固定负载了RNA的K562细胞，所述固定剂为多聚甲醛溶液和/或甲醛溶液。
为了进一步提高人工抗原提呈细胞扩增抗原特异性T细胞的能力，在本发明中，优选地，所述多聚甲醛溶液中多聚甲醛的浓度为0.5重量％-3重量％，更优选为0.5重量％-1.5重量％。
为了进一步提高人工抗原提呈细胞扩增抗原特异性T细胞的能力，在本发明中，优选地，所述甲醛溶液中甲醛的浓度为0.1重量％-2重量％，更优选为0.8-1.2重量％。
在本发明中，所述多聚甲醛溶液和甲醛溶液均可以购自本领域已知的供应商，并且根据需要进行调配，这些供应商包括但不限于Solarbio(例如4重量％的多聚甲醛溶液，产品编号为P1110)，Sigma-Aldrich(例如甲醛溶液，产品编号F8775-25ML)。
在本发明中，所述固定剂的用量可以根据实际需要进行调整，为了进一步提高人工抗原提呈细胞扩增抗原特异性T细胞的能力，优选地，每1×106个细胞负载了RNA的K562细胞，所述固定剂的用量为0.5-1.5mL，例如可以为0.5mL、0.6mL、0.7mL、0.8mL、0.9mL、1mL、1.1mL、1.2mL、1.3mL、1.4mL、1.5mL，以及上述任意两个数值组成的范围和范围中的任意值，更优选为0.8-1.2mL。
在本发明中，为了进一步提高人工抗原提呈细胞扩增抗原特异性T细胞的能力，优选地，所述固定的条件包括：温度为15-30℃，更优选为22-28℃；时间为5-15min，更优选为8-12min。
本发明中，所共刺激因子介导的协同刺激信号可导致T细胞的活化、增殖、分化及上调细胞因子的产生，K562细胞本身不表达共刺激分子4-1BBL和OX40L，为了促进特异性T细胞的扩增，通常在K562细胞中导入共刺激分子，在本发明中，所述人工抗原提呈细胞可以导入共刺激分子，然而，本发明的发明人在研究中发现，与本领域常规手段不同，采用上述方法制得的人工抗原提呈细胞不导入共刺激分子时，不会影响扩增抗原特异性T细胞的能力。在本发明中，优选地，所述人工抗原提呈细胞不导入共刺激分子，更优选地，所述人工抗原提呈细胞不导入4-1BBL和/或OX40L。
本发明第二方面提供本发明第一方面所述的方法制备得到的人工抗原提呈细胞。
本发明第三方面提供一种制备T细胞的方法，该方法包括：用人工抗原提呈细胞与外周血单核细胞共培养；
其中，所述外周血单核细胞来自供体对象，所述人工抗原提呈细胞为本发明第一方面所述的方法制备得到的人工抗原提呈细胞。
在本发明中，所述供体对象可以是将要用本发明描述的方法生成的细胞群体进行治疗的癌症患者(即自源性供体)，也可以是捐赠外周血单核细胞样品的个体。
在本发明中，所述外周血单核细胞可以通过任何合适的体外方法、静脉穿刺或其它获得血液样品的采血方法来获得。
在本发明中，所述外周血单核细胞可以为富集后的外周血单核细胞，所述富集的方法为本领域常规使用的方法，没有特殊限定，例如可以为梯度密度离心法。
在本发明中，所述人工抗原提呈细胞与外周血单核细胞的数量比可以根据需要进行调整，为了进一步提高制备T细胞的效果，优选地，所述人工抗原提呈细胞与外周血单核细胞的数量比为1：(0.5-2)，例如可以为1:0.5、1:0.6、1:0.7、1:0.8、1:0.9、1:1、1:1.1、1:1.2、1:1.3、1:1.4、1:1.5、1:1.6、1:1.7、1:1.8、1:1.9、1:2，以及上述任意数值组成的任意范围以及范围中的任意值，更优选为1：(0.8-1.2)。
在本发明中，优选地，所述共培养的时间没有特别限定，可以根据需要的T细胞的数量确定，为了进一步提高制备T细胞的效果，所述共培养的时间优选为7-14天。
在本发明中，所述共培养的温度没有特别限定，可以为本领域常规选择，为了进一步提高制备T细胞的效果，所述共培养的温度优选为20-35℃。
本发明第四方面提供一种药物组合物，该药物组合物包括本发明第一方面所述的方法制备得到的人工抗原提呈细胞。
在本发明中，如前所述，本发明的人工抗原提呈细胞可以在不引入共刺激分子的情况下有效扩增抗原特异性T细胞，因此，优选地，其中，所述药物组合物不包含共刺激分子，更优选地，所述药物组合物不包含4-1BBL和/或OX40L。
在本发明中，所述药物组合物也可以包含临床需要的治疗剂，包括但不限于所述的方法制备得到的人工抗原提呈细胞诱导的T细胞、化学治疗剂、放射治疗剂或免疫治疗剂。
在本发明中，所述药物组合物也可以包含药学上可接受的载体，例如稀释剂、赋形剂、润湿剂、缓冲剂、悬浮剂、润滑剂、佐剂、乳化剂、崩解剂、吸收剂、储存剂、表面活性剂、着色剂、着香剂或甜味剂等。
在本发明中，所述药物组合物的剂型没有特殊限定，可以根据临床需要进行调整，例如可以为注射剂、冷冻干燥品、片剂、硬胶囊剂、软胶囊剂、颗粒剂、散剂、丸剂、糖浆剂、栓剂、巴布剂、软膏剂、霜剂或滴眼剂等。
本发明第五方面提供一种本发明第一方面所述的制备人工抗原提呈细胞的方法在制备T细胞免疫疗法的药物中的应用。
在本发明中，所述T细胞免疫疗法的药物可以为本领域常规使用的T细胞免疫疗法的药物，例如可以为CAR-T(嵌合抗原受体T细胞)药物、TCR-T(T细胞受体工程化T细胞)药物。
本发明提供的所述的制备人工抗原提呈细胞的方法还可以用于制备治疗人巨细胞病毒感染性疾病药物。
本发明提供的人工抗原提呈细胞的制备方法可以使外周血单核细胞中的抗原特异性T细胞(CTL)得到有效扩增，可以使用本领域常规技术手段将扩增的抗原特异性T细胞与人工抗原提呈细胞分离，所得CTL可以用于制备细胞治疗产品、T细胞免疫疗法的药物。
本发明所述的药物还可以包括药学上可接受的辅料，包括稀释剂、粘合剂、润滑剂、崩解剂、着色剂、乳化剂、pH缓冲剂和防腐剂等。本发明中使用的辅料可以为各种常规用于制药的辅料。
本发明所述制备人工抗原提呈细胞的方法还可以用于细胞治疗产品的质量控制，例如，可以进行自体细胞供体或异体细胞供体的病原体筛查和检测(例如CMV抗原检测)、CAR-T细胞产品的生产工艺质量控制、细胞产品中的细胞的活力等。
本发明第六方面提供本发明所述的制备人工抗原提呈细胞的方法在制备检测T细胞的制剂和/或设备中的应用。
DC数量稀少，经体外培养得到成熟的DC同样较少，且难以扩增，而且，而且，检测时临床患者取血量少，通常为10ml作用，因此，进行临床检测时，难以使用天然的DC细胞与PBMC共培养诱导产生特异性T细胞，本发明的发明人在研究中发现，采用本发明所述的制备人工抗原提呈细胞的方法可以提高人工抗原提呈细胞呈递抗原的能力，所得的人工抗原提呈细胞与PBMC共培养时，扩增特异性T细胞的数量高于同样进行共培养天然的DC细胞，因此，与常规技术手段相比，本发明提供的方法能够增强检测抗原特异性T细胞的灵敏度，根据需要可以使K562细胞负载一种及以上不同的抗原RNA，以检测不同的抗原特异性T细胞。
在本发明中，所述制剂和/或设备可以用于临床、科研、药物开发等领域，如疾病筛查、临床检测、临床诊断、疗效评价、疾病进展监测、免疫监测、预后监测等；具体地，可以采用本发明所述的方法制备人工抗原提呈细胞，与患者或健康个体的PBMC共培养后检测抗原特异性T细胞内和/或分泌物中与疾病诊断、治疗相关的物质，以实现肿瘤早期筛查、评价乳腺癌手术效果等。
在本发明中，所述制剂包括但不限于药物、试剂等。
在本发明中，所述设备包括但不限于试剂盒、检测系统、仪器等。
本发明还涉及一种检测T细胞的方法，该方法包括制备人工抗原提呈细胞，再用人工抗原提呈细胞与外周血单核细胞共培养，然后进行T细胞检测；
其中，所述外周血单核细胞来自供体对象，所述制备人工抗原提呈细胞的方法为本发明第一方面所述的方法。
所述的检测T细胞的方法能增加T细胞数量，增强检测抗原特异性T细胞的灵敏度。
在本发明中，所述进行T细胞检测的方法可以为本领域常规方法，例如可以为流式检测法、酶联免疫斑点技术(ELISPOT)等。
在本发明中，所述进行T细胞检测可以为进行T细胞数量、活性、质量等的检测。
在本发明中，所述T细胞的检测方法可以用于可以用于临床、科研、药物开发等领域，如疾病筛查、临床检测、临床诊断、疗效评价、疾病进展监测、免疫监测、预后监测等，具体地，例如在患者用药前或用药时判断免疫治疗药物是否有效以及患者预后情况。
以下将通过实施例对本发明进行详细描述。在本发明中，除非有特别说明，否则本发明中采用的所有试剂、原料和设备均可以通过商业渠道购买。
PBMC的完全培养基为：X-VIVO 15(Lonza，牌号：04-418Q)+10％hAB+5ng/ml采用IL-7(PeproTech，牌号：200-07-1-UG)+5ng/ml IL-15(PeproTech，牌号：200-15-10UG)+100U/ml IL-2(PeproTech，牌号：200-02-1MG))+20μg/ml聚肌胞苷酸(Sigma，牌号：P0913-10MG)，用于共混培养使用。
K562过表达细胞系完全培养基：RPMI 1640培养基(购自Gibco)+10％FBS+1％P/S。
mDC完全培养基：RPMI-1640(Gibco，牌号：11875-093)+10％ FBS(Cytiva，牌号：SV30208.02)+20ng/mL IL-4(RD，牌号：204-GMP-010)+100ng/mL GM-CSF(RD，牌号：7954-GM-010/CF)。
4重量％多聚甲醛固定液购自Solarbio，产品编号为P1110。使用时使用PBS稀释至浓度为1％重量即可。
以下实施例中使用的多聚甲醛，若无特别说明，均为1重量％多聚甲醛。
实施例1：单一HLA K562细胞系的构建
本实施例用于说明单一HLA K562细胞系的构建。
首先利用293FT工具细胞将HLA表达基因包装成慢病毒，然后利用慢病毒感染的方式将HLA基因稳定整合到K562细胞的基因组内，使其能够稳定遗传和表达。
实验过程：
(1)细胞培养：按照细胞培养操作手册对野生型293FT(购自北纳生物)和K562细胞(购自浙江美森)进行复苏、培养。
复苏:取1支293FT和k562野生型冻存细胞，37℃水浴轻柔且快速使其融化，然后转入15mL离心管内，室温离心1次，离心力为350g，5min，弃上清后，用适量完全培养基将细胞重悬，之后转移至T75培养瓶，于37℃、5％CO2培养箱培养；
培养：293FT为贴壁细胞，待培养瓶底部细胞融合度达80-90％时，对细胞进行1：3传代培养；K562为悬浮细胞，2-3天观察一次培养基状态，溶液变黄后可进行传代或补液操作，调整细胞起始密度为5×105cells/mL。
(2)慢病毒包装及浓缩：待细胞状态稳定后，使用Lipo3000转染试剂盒，将HLA慢病毒表达质粒(由金斯瑞合成)及2个辅助质粒(psPAX2载体和pMD2G载体)共转进293FT细胞中，收集48h细胞上清，换液后收集上清，两次上清混合后使用PEG8000浓缩试剂(加入总病毒体积的1/5)，4℃过夜浓缩后离心收集沉淀，4500rpm，4℃，50min，得到纯化后的慢病毒。
(3)慢病毒感染及稳定克隆筛选：将培养的K562野生型细胞离心，调整密度至3×105cells/mL，接种至12孔板内，1mL/well，同时每孔加入5μL的Polybrene促感染试剂和50μL纯化后的慢病毒，继续培养2代后，流式检测HLA表达情况(BV510 Mouse Anti-Human HLA-ABC，BD)，将HLA表达阳性的细胞孔进行流式分选，Top5％的单克隆分选至1个孔内，继续培养；重复流式检测及流式分选步骤，选取比K562野生型显著升高的克隆进行扩增冻存。
结果如图1所示。
结果分析：通过流式检测其HLA表达强度与阳性率，挑选表达效果最好的细胞，结果如图1B所示。K562-HLA-A1101OE(以下简称HLA-A11)细胞HLA阳性率为98.68％；K562-HLA-A0201OE(以下简称HLA-A02)细胞HLA阳性率为98.61％；K562-HLA-A2402OE(以下简称HLA-A24)细胞HLA阳性率为98.15％。
HLA-A1101基因序列：
SEQ ID NO:1
ATGGCCGTCATGGCGCCCCGAACCCTCCTCCTGCTACTCTCGGGGGCCCTGGCCCTGACCCAGACCTGGGCGGGCTCCCACTCCATGAGGTATTTCTACACCTCCGTGTCCCGGCCCGGCCGCGGGGAGCCCCGCTTCATCGCCGTGGGCTACGTGGACGACACGCAGTTCGTGCGGTTCGACAGCGACGCCGCGAGCCAGAGGATGGAGCCGCGGGCGCCGTGGATAGAGCAGGAGGGGCCGGAGTATTGGGACCAGGAGACACGGAATGTGAAGGCCCAGTCACAGACTGACCGAGTGGACCTGGGGACCCTGCGCGGCTACTACAACCAGAGCGAGGACGGTTCTCACACCATCCAGATAATGTATGGCTGCGACGTGGGGCCGGACGGGCGCTTCCTCCGCGGGTACCGGCAGGACGCCTACGACGGCAAGGATTACATCGCCCTGAACGAGGACCTGCGCTCTTGGACCGCGGCGGACATGGCAGCTCAGATCACCAAGCGCAAGTGGGAGGCGGCCCATGCGGCGGAGCAGCAGAGAGCCTACCTGGAGGGCCGGTGCGTGGAGTGGCTCCGCAGATACCTGGAGAACGGGAAGGAGACGCTGCAGCGCACGGACCCCCCCAAGACACATATGACCCACCACCCCATCTCTGACCATGAGGCCACCCTGAGGTGCTGGGCCCTGGGCTTCTACCCTGCGGAGATCACACTGACCTGGCAGCGGGATGGGGAGGACCAGACCCAGGACACGGAGCTCGTGGAGACCAGGCCTGCAGGGGATGGAACCTTCCAGAAGTGGGCGGCTGTGGTGGTGCCTTCTGGAGAGGAGCAGAGATACACCTGCCATGTGCAGCATGAGGGTCTGCCCAAGCCCCTCACCCTGAGATGGGAGCTGTCTTCCCAGCCCACCATCCCCATCGTGGGCATCATTGCTGGCCTGGTTCTCCTTGGAGCTGTGATCACTGGAGCTGTGGTCGCTGCCGTGATGTGGAGGAGGAAGAGCTCAGATAGAAAAGGAGGGAGTTACACTCAGGCTGCAAGCAGTGACAGTGCCCAGGGCTCTGATGTGTCTCTCACAGCTTGTAAAGTGTAG
HLA-A0201基因序列：
SEQ ID NO:2
ATGGCCGTCATGGCGCCCCGAACCCTCGTCCTGCTACTCTCGGGGGCTCTGGCCCTGACCCAGACCTGGGCGGGCTCTCACTCCATGAGGTATTTCTTCACATCCGTGTCCCGGCCCGGCCGCGGGGAGCCCCGCTTCATCGCAGTGGGCTACGTGGACGACACGCAGTTCGTGCGGTTCGACAGCGACGCCGCGAGCCAGAGGATGGAGCCGCGGGCGCCGTGGATAGAGCAGGAGGGTCCGGAGTATTGGGACGGGGAGACACGGAAAGTGAAGGCCCACTCACAGACTCACCGAGTGGACCTGGGGACCCTGCGCGGCTACTACAACCAGAGCGAGGCCGGTTCTCACACCGTCCAGAGGATGTATGGCTGCGACGTGGGGTCGGACTGGCGCTTCCTCCGCGGGTACCACCAGTACGCCTACGACGGCAAGGATTACATCGCCCTGAAAGAGGACCTGCGCTCTTGGACCGCGGCGGACATGGCAGCTCAGACCACCAAGCACAAGTGGGAGGCGGCCCATGTGGCGGAGCAGTTGAGAGCCTACCTGGAGGGCACGTGCGTGGAGTGGCTCCGCAGATACCTGGAGAACGGGAAGGAGACGCTGCAGCGCACGGACGCCCCCAAAACGCATATGACTCACCACGCTGTCTCTGACCATGAAGCCACCCTGAGGTGCTGGGCCCTGAGCTTCTACCCTGCGGAGATCACACTGACCTGGCAGCGGGATGGGGAGGACCAGACCCAGGACACGGAGCTCGTGGAGACCAGGCCTGCAGGGGATGGAACCTTCCAGAAGTGGGCGGCTGTGGTGGTGCCTTCTGGACAGGAGCAGAGATACACCTGCCATGTGCAGCATGAGGGTTTGCCCAAGCCCCTCACCCTGAGATGGGAGCCGTCTTCCCAGCCCACCATCCCCATCGTGGGCATCATTGCTGGCCTGGTTCTCTTTGGAGCTGTGATCACTGGAGCTGTGGTCGCTGCTGTGATGTGGAGGAGGAAGAGCTCAGATAGAAAAGGAGGGAGCTACTCTCAGGCTGCAAGCAGTGACAGTGCCCAGGGCTCTGATGTGTCTCTCACAGCTTGTAAAGTGTAG
HLA-A2402基因序列：
SEQ ID NO:3
ATGGCCGTCATGGCGCCCCGAACCCTCGTCCTGCTACTCTCGGGGGCCCTGGCCCTGACCCAGACCTGGGCAGGCTCCCACTCCATGAGGTATTTCTCCACATCCGTGTCCCGGCCCGGCCGCGGGGAGCCCCGCTTCATCGCCGTGGGCTACGTGGACGACACGCAGTTCGTGCGGTTCGACAGCGACGCCGCGAGCCAGAGGATGGAGCCGCGGGCGCCGTGGATAGAGCAGGAGGGGCCGGAGTATTGGGACGAGGAGACAGGGAAAGTGAAGGCCCACTCACAGACTGACCGAGAGAACCTGCGGATCGCGCTCCGCTACTACAACCAGAGCGAGGCCGGTTCTCACACCCTCCAGATGATGTTTGGCTGCGACGTGGGGTCGGACGGGCGCTTCCTCCGCGGGTACCACCAGTACGCCTACGACGGCAAGGATTACATCGCCCTGAAAGAGGACCTGCGCTCTTGGACCGCGGCGGACATGGCGGCTCAGATCACCAAGCGCAAGTGGGAGGCGGCCCATGTGGCGGAGCAGCAGAGAGCCTACCTGGAGGGCACGTGCGTGGACGGGCTCCGCAGATACCTGGAGAACGGGAAGGAGACGCTGCAGCGCACGGACCCCCCCAAGACACATATGACCCACCACCCCATCTCTGACCATGAGGCCACTCTGAGATGCTGGGCCCTGGGCTTCTACCCTGCGGAGATCACACTGACCTGGCAGCGGGATGGGGAGGACCAGACCCAGGACACGGAGCTTGTGGAGACCAGGCCTGCAGGGGATGGAACCTTCCAGAAGTGGGCAGCTGTGGTGGTACCTTCTGGAGAGGAGCAGAGATACACCTGCCATGTGCAGCATGAGGGTCTGCCCAAGCCCCTCACCCTGAGATGGGAGCCATCTTCCCAGCCCACCGTCCCCATCGTGGGCATCATTGCTGGCCTGGTTCTCCTTGGAGCTGTGATCACTGGAGCTGTGGTCGCTGCTGTGATGTGGAGGAGGAACAGCTCAGATAGAAAAGGAGGGAGCTACTCTCAGGCTGCAAGCAGTGACAGTGCCCAGGGCTCTGATGTGTCTCTCACAGCTTGTAAAGTGTAG
实施例2：多聚甲醛固定电转CMV mRNA(巨细胞病毒mRNA)的K562-A02细胞，可以刺激特异性T细胞增殖
CMV mRNA的序列为：
SEQ ID NO:4AUGAACCUCGUCCCCAUGGUGGCCACCGUGUAA
实验过程：
(一)aAPC制备
(1)K562-A02细胞准备：
复苏：取1支k562-A02冻存细胞，37℃水浴轻柔且快速使其融化，然后转入15mL离心管内，室温离心1次，离心力为350g，5min，弃上清后，用适量完全培养基将细胞重悬，之后转移至T75培养瓶，于37℃、5％CO2培养箱培养；
培养：K562-A02为悬浮细胞，2-3天观察一次培养基状态，溶液变黄后可进行传代或补液操作，调整细胞起始密度为5×105cells/mL，传代2-3代细胞状态稳定后可进行电转操作。
(2)K562-A02细胞电转：
将准备好的细胞以350g的离心力室温离心5min，弃去上清，使用0.5-1ml D-PBS重悬细胞并计数，根据计数结果算出所需细胞悬液的体积，吸取所需数目细胞放置1.5ml无菌EP管中，以350g的离心力室温离心5min，弃去上清；
取用相应NeonTM试剂盒中的重悬缓冲液重悬细胞，按15μg/2×106cells加入CMVmRNA(注：重悬体积＝重悬缓冲液体积+mRNA体积)；
用NeonTM移液器吸取准备好的细胞，将带有样本的NeonTM移液器垂直插入位于NeonTM移液器吸头架的管中，直至听到咔嗒一声，确保将移液器突出部插入到移液器架内的凹槽内，设置好电转参数，脉冲电压为1300V，脉冲宽度为30ms，脉冲数为1次，点击Start，待仪器发出“滴”声后，取出NeonTM移液器，将细胞轻轻打入到已预热的促成熟培养基中，放回培养箱，完成电转；
将电转后的细胞按照1×106/ml的密度接种至完全培养基重扩散充分，再将孔板放入CO2培养箱重培养，培养温度为37℃，CO2浓度为5％。
(3)电转后的K562-A02细胞固定：
电转24h后，收获电转后的K562-A02细胞；离心后弃上清(尽量去除全部液体)，用900μl无菌PBS重悬后，用加入300uL的1重量％多聚甲醛，混合均匀，室温(25℃)固定10min；
10min后，离心，450g×10min，弃上清。用1mL PBMC完全培养基重复洗2次。最后用PBMC完全培养基重悬，用细胞计数板计数，无需DAPI染色。(K2明场计数)。
(二)PBMC制备
PBMC分离：
将外周血(HLA-A02:01，27岁女性健康供者取血，15ml)从采血管转移至离心管中，1000g，升9降9，10min；
自体血浆(BLP)制备：吸取上层血浆至新的15ml离心管中，封口膜封口后，水浴锅内灭活备用(56℃，30min后1000g离心10min后，上清分装后保存至-20℃备用)；
去除血浆的剩余外周血溶液用于后续密度梯度离心，往上述去除血浆后的剩余外周血溶液中加入D-PBS缓冲液，使总体积18ml，拧紧管盖，混匀约5次；
取50ml离心管，加入13.5mlFicoll溶液，吸取外周血D-PBS混合液，分别缓慢加载到Ficoll液面，使其没有较大幅度晃动，拧紧瓶盖，选择离心力600g，升速9，降速0，离心时间20min(离心启动时开始计时)，离心温度19℃，开始离心；
吸取白膜层：离心结束后，确认密度梯度离心后的离心管有明显的四层，分层清晰。将白膜吸取至新的50ml离心管中，D-PBS缓冲液补齐至50ml，拧紧瓶盖颠倒混匀约5次；
初洗离心：离心力700g、升速9，降速9，离心时间10min、离心温度19℃；
离心结束后，去上清，吹弹细胞，补充D-PBS至50ml；
终次离心：离心力300g、升速9，降速9，离心时间10min、离心温度19℃；
旋开管盖，将管中全部液体倾倒至废液瓶中，拧紧管盖，吹弹细胞，震散细胞沉淀，细胞计数。
(三)aAPCs与PBMC共培养
收集制备完成的不同种aAPC完全加入至制备的PBMC(细胞数量比为1：1)中，以PBMC的细胞总数以及活细胞密度为准，按照1×106cells/ml进行培养，每天对PBMC细胞进行观察，根据PBMC细胞生长速度每天或隔天进行计数及补液(使用PBMC完全培养基)。每次补液后PBMC活细胞密度应在1×106/ml。从Day9当天开始，PBMC细胞培养基中不需要加入自体血浆，即PBMC培养基成分为X-VIVO15+100U IL-2。
检测与结果判定：
分别在Day0和Day14两个时间点收集每组细胞，CMV Tetramer检测特异性T细胞扩增比例，检测Panel为CD3(Biolegend，Cat：45-0037-42)/CD8(BD，Cat：563256)/CD4(BD，Cat：344616)/CMV Tetramer(MBL，Cat:TS-0010-1C)。
实验结果如图2中A、B、C所示。
各实验组如下：
(1)K562-A02：K562-A02细胞不使用1重量％多聚甲醛固定，直接作为aAPC；
(2)K562-A02-1％F：K562-A02细胞使用1重量％多聚甲醛固定后的aAPC；
(3)K562-A02-CMV：电转CMV mRNA的K562-A02细胞不使用1重量％多聚甲醛固定，直接作为aAPC；
(4)K562-A02-CMV-1％F：电转CMV mRNA的K562-A02细胞使用1重量％多聚甲醛固定后作为aAPC；
结果分析：
由图2中A和B表明：Day0基线特异性T细胞比例为1.29％，共培养Day14时，未固定的K562-A02和K562-A02-CMV组中CMV tetramer阳性CD8+T细胞比例分别为0.55％和7.54％，经多聚甲醛固定的固定组K562-A0201-1％F和K562-A0201-CMV-1％F比例分别0.66％和10.05％。可见，K562-A02细胞转染CMV mRNA后，CMV抗原可被有效提呈，无论细胞多聚甲醛固定与否均能显著诱导CMV特异性T细胞的扩增，且多聚甲醛固定后对特异性T细胞的诱导能力更强，提示多聚甲醛固定不影响细胞的抗原提呈能力。
另一方面，如图2C，从整个培养过程中总T细胞增殖曲线看，未经固定的K562细胞(K562-A02)显著抑制T细胞增殖；而经多聚甲醛固定后的K562-A2 CMV细胞(K562-A0201-CMV-1％F)对总T细胞和特异性T细胞(图2A-B)的扩增能力都最强；说明本发明制备aAPC时使用1重量％多聚甲醛室温固定后保留了抗原递呈效力，同时不影响T细胞的增殖，能更好的用于特异性T细胞扩增。
本实施例证明，未失活的K562细胞将影响T细胞的增殖，用本发明方法，使用多聚甲醛固定转染CMV mRNA的K562-A02细胞可使细胞失活同时使CMV特异性T细胞得到增殖。
实施例3：探索有无共刺激分子对aAPC效果的影响
4-1BBL属于肿瘤坏死因子(TNF)配体超家族成员，OX40L是一种具有激活T细胞功能的肿瘤坏死因子受体(NGFR/TNFR)家族成员。4-1BBL与OX40L均为共刺激分子，它们活化后介导的协同刺激信号可导致T细胞的活化、增殖、分化及上调细胞因子的产生。
本实施例用于说明固定后的aAPC细胞导入共刺激分子是否可以增强对特异性T细胞的扩增能力。
OX40L mRNA的序列：
SEQ ID NO:5
AUGGAAAGGGUCCAACCCCUGGAAGAGAAUGUGGGAAAUGCAGCCAGGCCAAGAUUCGAGAGGAACAAGCUAUUGCUGGUGGCCUCUGUAAUUCAGGGACUGGGGCUGCUCCUGUGCUUCACCUACAUCUGCCUGCACUUCUCUGCUCUUCAGGUAUCACAUCGGUAUCCUCGAAUUCAAAGUAUCAAAGUACAAUUUACCGAAUAUAAGAAGGAGAAAGGUUUCAUCCUCACUUCCCAAAAGGAGGAUGAAAUCAUGAAGGUGCAGAACAACUCAGUCAUCAUCAACUGUGAUGGGUUUUAUCUCAUCUCCCUGAAGGGCUACUUCUCCCAGGAAGUCAACAUUAGCCUUCAUUACCAGAAGGAUGAGGAGCCCCUCUUCCAACUGAAGAAGGUCAGGUCUGUCAACUCCUUGAUGGUGGCCUCUCUGACUUACAAAGACAAAGUCUACUUGAAUGUGACCACUGACAAUACCUCCCUGGAUGACUUCCAUGUGAAUGGCGGAGAACUGAUUCUUAUCCAUCAAAAUCCUGGUGAAUUCUGUGUCCUUUGA
4-1BBL mRNA的序列：
SEQ ID NO:6
AUGGAAUACGCCUCUGACGCUUCACUGGACCCCGAAGCCCCGUGGCCUCCCGCGCCCCGCGCUCGCGCCUGCCGCGUACUGCCUUGGGCCCUGGUCGCGGGGCUGCUGCUGCUGCUGCUGCUCGCUGCCGCCUGCGCCGUCUUCCUCGCCUGCCCCUGGGCCGUGUCCGGGGCUCGCGCCUCGCCCGGCUCCGCGGCCAGCCCGAGACUCCGCGAGGGUCCCGAGCUUUCGCCCGACGAUCCCGCCGGCCUCUUGGACCUGCGGCAGGGCAUGUUUGCGCAGCUGGUGGCCCAAAAUGUUCUGCUGAUCGAUGGGCCCCUGAGCUGGUACAGUGACCCAGGCCUGGCAGGCGUGUCCCUGACGGGGGGCCUGAGCUACAAAGAGGACACGAAGGAGCUGGUGGUGGCCAAGGCUGGAGUCUACUAUGUCUUCUUUCAACUAGAGCUGCGGCGCGUGGUGGCCGGCGAGGGCUCAGGCUCCGUUUCACUUGCGCUGCACCUGCAGCCACUGCGCUCUGCUGCUGGGGCCGCCGCCCUGGCUUUGACCGUGGACCUGCCACCCGCCUCCUCCGAGGCUCGGAACUCGGCCUUCGGUUUCCAGGGCCGCUUGCUGCACCUGAGUGCCGGCCAGCGCCUGGGCGUCCAUCUUCACACUGAGGCCAGGGCACGCCAUGCCUGGCAGCUUACCCAGGGCGCCACAGUCUUGGGACUCUUCCGGGUGACCCCCGAAAUCCCAGCCGGACUCCCUUCACCGAGGUCGGAAUAA
实验过程：
参照实施例2中电转及固定方法对共转CMV、OX40L和4-1BBL三种mRNA的K562-A02细胞进行处理以制备aAPC，使用K562-A02分别电转CMV mRNA，或电转CMV mRNA+OX40L mRNA+4-1BBL mRNA，电转系数为：2×106cells/100μl/15μgmRNA，电转24h后，收集细胞，室温离心1次(350g，5min)，弃上清后PBS重悬，细胞计数重复离心1次，用1重量％多聚甲醛(Solarbio，Cat：P1110)重悬细胞，调整细胞密度为1×106cells/ml，室温固定10min后，室温离心1次(350g，5min)，弃上清后PBS洗1次。使用完全培养基重悬。
检测与结果判定：
将aAPC与PBMCs按照1：1的比例共混后，体外培养至D14，分别在D0、D14取细胞进行流式检测特异性T细胞扩增比例检测Panel为CD3(Biolegend，Cat：45-0037-42)/CD8(BD，Cat：563256)/CD4(BD，Cat：344616)/CMV Tetramer(MBL，Cat:TS-0010-1C)。
各实验组如下：
(1)K562-A02-CMV：电转后的细胞直接作为aAPC；
(2)K562-A02-CMV-1％F：多聚甲醛固定电转CMV的K562-A02细胞作为aAPC；
(3)K562-A02-CMV-OX40L-41BBL：共转CMV-OX40L-41BBL三种mRNA后的细胞直接作为aAPC；
(4)K562-A02-CMV-OX40L-41BBL-1％F：多聚甲醛固定共转CMV-OX40L-41BBL三种mRNA后的细胞作为aAPC。
实验结果如图3。
结果分析：
由图3A和3B所示，设置不同的aAPC实验组，转染或不转染共刺激分子的K562-A2CMV细胞经多聚甲醛固定或不固定，分别与PBMC1：1共混培养，基线CMV tetramer阳性比例为0.79％；
加入aAPC共培养后，Day14时，转染或不转染共刺激分子的K562-A2 CMV细胞均可显著诱导CMV特异性T细胞扩增。图3A-B表明，电转后的细胞直接作为aAPC(K562-A02-CMV)时，诱导的特异性T细胞比例为2.53％，在此基础上转染OX40L-41BBL能显著提升K562-A2对CMV抗原的递呈能力，特异性T细胞比例增加至6.63％(K562-A02-CMV-OX40L-41BBL)，且总T细胞数的也有所增加(图3C)，提示4-1BBL和OX40L可增强T细胞和抗原提呈细胞增殖。但相对于不转染OX40L-41BBL而仅采用多聚甲醛固定的aAPC K562-A2 CMV细胞，转染OX40L-41BBL aAPC并不具有优势，前者诱导的特异性T细胞比例可达10.38％；而转染OX40L-41BBL后再经多聚甲醛固定的aAPC诱导的特异性T细胞比例(9.47％)未有显著提高。以上实验结果说明加入共刺激分子后不影响通过基于K562-HLA细胞经多聚甲醛固定制备aAPC的抗原提呈效果。
本实施例结果发现固定后的aAPC无需加入共刺激分子即可有效扩增特异性T细胞，加入共刺激分子后无显著差异。
实施例4：比较aAPC与自体DC对特异性T细胞扩增的效果
本实施例用于证明本发明所述方法制备的aAPC对特异性T细胞扩增的效果与自体DC相当，且电转mRNA抗原的方式优于负载抗原肽的方式。
DC使用自体贴壁分离的方法制备：
(1)PBMC静置：
根据外周血分离所得的PBMC活细胞总量(细胞数量)，按照铺板密度，用静置培养基，轻柔吹打均匀后将细胞铺至6孔培养板中培养。将PBMC接种到孔板后，盖好盖子，轻轻十字晃动6孔板3-5次，使得细胞均匀铺在6孔板中，在盖子上标记样品编号。将上述6孔板放入二氧化碳培养箱中，培养温度为37.0℃，CO2浓度为5.0％。静置2-3h使单核细胞贴壁。注意移动孔板过程中避免孔板剧烈晃动。
(2)DC分离：
将6孔板平放至生物安全柜内的操作台上，使用1ml移液枪吸取上清，之后分两次共加入2ml mDC完全培养基，沿着孔板壁缓慢将培养基打出；
再使用移液枪向每孔mDC培养液中加入GM-CSF的工作液、IL-4的工作溶液，平行于底面轻轻十字晃动培养容器4次，使得因子充分溶解在培养液中(提前配置好混合液直接加入)，将上述6孔板放入CO2培养箱中培养，培养温度为培养温度为37.0℃，CO2浓度为5.0％。
培养的DC细胞用于后面的实验。
实验过程：
(1)多聚甲醛固定电转CMV的K562-A02细胞作为aAPC(K562-A02-CMV-1％F)：
参照实施例1中电转及固定方法对电转CMV mRNA的K562-A02细胞进行处理以制备aAPC，使用K562-A02电转CMV mRNA，电转系数为：1×106cells/100μl/15μg mRNA，电转24h后，收集细胞，室温离心1次(350g，5min)，弃上清后PBS重悬，细胞计数重复离心1次，用1重量％多聚甲醛(Solarbio，Cat：P1110)重悬细胞，调整细胞密度为1×106cells/ml，室温固定10min后，室温离心1次(350g，5min)，弃上清后PBS洗1次，使用完全培养基重悬。
(2)负载HLA-A*02:01阳性抗原肽后的K562-A02细胞作为aAPC(K562-A02-CMVPeptied)：
HLA-A*02:01阳性抗原肽：来源于人巨细胞病毒(HCMV)基质磷酸蛋白pp65的HLA-A*02:01限制性抗原肽，pp65 495-504：NLVPMVATV(SEQ ID NO:7)。
负载方法：将细胞与多肽共孵育过夜。
负载后按照本实施例(1)的方法用1重量％多聚甲醛固定。
(3)电转CMV的DC(DC-CMV)：
参照实施例2中电转方法进行制备。
(4)负载HLA-A*02:01阳性抗原肽的DC(K562-A02-CMV Peptied)：
参照本实施例(2)中的方法制备，负载后不固定。
检测与结果判定：
同时使用电转CMV的DC和负载HLA-A*02:01阳性抗原肽的DC作为APC作为对照组，将各组细胞与PBMCs按照数量比为1：1的比例共混，体外培养至D14，分别在D0、D14取细胞进行流式检测特异性T细胞扩增比例检测Panel为CD3(Biolegend，Cat：45-0037-42)/CD8(BD，Cat：563256)/CD4(BD，Cat：344616)/CMV Tetramer(MBL，Cat:TS-0010-1C)。
各实验组如下：
(1)K562-A02-CMV-1％F：多聚甲醛固定电转CMV的K562-A02细胞作为aAPC；
(2)K562-A02-CMV Peptied：负载HLA-A*02:01阳性抗原肽后的K562-A02细胞作为aAPC；
(3)DC-CMV：DC电转CMV后作为APC；
(4)DC-CMV Peptied：负载HLA-A*02:01阳性抗原肽后的DC细胞作为APC。
实验结果如图4。
结果分析：
由图4A和4B所示，设置不同的aAPC实验组，Day0基线特异性T细胞比例为0.45％；加入aAPC共培养后，Day14时，均可显著诱导CMV特异性T细胞扩增。以电转CMV mRNA的K562-A2使用多聚甲醛固定后的细胞作为aAPC(即K562-A02-CMV-1％F)时，诱导的特异性细胞比例为11.15％，使用自体DC电转CMV mRNA作为APC(DC-CMV)诱导的特异性细胞比例为9.99％，说明本发明制备的aAPC对CMV特异性T细胞扩增的效果达到甚至优于使用自体DC细胞的水平；
同时设置HLA-A*02:01阳性抗原肽分别负载K562-A02(固定后与T细胞共混培养)和DC细胞作为比较(K562-A02-CMV Peptied与DC-CMV Peptied)，结果显示两组诱导的特异性T细胞比例分别为4.58％和4.18％，两组间无明显差异，虽然相比于基线特异性T细胞的比例均显著升高，但比例低于转染mRNA各组。
本实施例说明本发明所述方法制备的aAPC对特异性T细胞扩增的效果优于自体DC，且电转mRNA抗原的方式优于负载抗原肽的方式。
实施例5：不同HLA亚型制备的aAPC均能有效扩增特异性T细胞
本实施例用以证明不同HLA亚型使用上述方法制备成的aAPC，均可有效扩增特异性T细胞。
实验过程：
选择分别过表达HLA-A11和HLA-A02的K562细胞进行aAPC制备，制备方法参考实施例2，然后分别使用K562-A02和K562-A11电转CMV mRNA，电转系数为：1×106cells/100μl/15μgmRNA，电转24h后，收集细胞，室温离心1次(350g，5min)，弃上清后PBS重悬，细胞计数重复离心1次，用1重量％多聚甲醛(Solarbio，Cat：P1110)重悬细胞，调整细胞密度为1×106cells/ml，室温固定10min后，室温离心1次(350g，5min)，弃上清后PBS洗1次。
使用完全培养基重悬，选择不同HLA亚型的健康供者进行PBMCs分离，两种HLA亚型分别为HLA-A*02:01(HLA-A02)和HLA-A*11:01(HLA-A11)。将aAPC与PBMCs按照1：1的比例共混后，体外培养至D14。
检测与结果判定：
分别在D0、D14取细胞进行流式检测特异性T细胞扩增比例检测Panel为CD3(Biolegend，Cat：45-0037-42)/CD8(BD，Cat：563256)/CD4(BD，Cat：344616)/CMV Tetramer(MBL，Cat:TS-0010-1C)。
实验结果如图5所示。
结果分析：
如图5所示，选择HLA-A02和HLA-A11两个亚型的志愿者，分别使用对应过表达HLA亚型的K562细胞，电转CMV mRNA，使用1重量％多聚甲醛固定后，作为aAPC与PBMC 1：1共混，体外培养至D14，分别在的Day0、Day14进行流式检测CMV Tetramer阳性比例，对于A02亚型供者，显示Day14检测的特异性T细胞比例为9.61％，显著高于基线0.38％；对于A11亚型供者显示，Day14检测的特异性T细胞比例为7.70％，显著高于基线0％，以上结果证明不同HLA亚型K562细胞使用上述方法制备成aAPC时，均能有效的扩增特异性T细胞。
本实施例说明，本发明所构建不同HLA亚型的人工抗原提呈细胞能覆盖绝大部分人群，可用于多种HLA亚型的特异性T细胞扩增。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于此。在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，包括各个技术特征以任何其它的合适方式进行组合，这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种制备人工抗原提呈细胞的方法，其特征在于，该方法包括：
(1)构建表达HLA的K562细胞；
(2)使表达HLA的K562细胞负载RNA；
(3)使用固定剂固定负载了RNA的K562细胞。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤(1)中构建表达HLA的K562细胞的方式为：将HLA表达基因整合到K562细胞的基因组内；
优选地，所述HLA表达基因为HLA-I类基因；
更优选地，所述HLA表达基因为HLA-A；
进一步优选地，所述HLA表达基因为HLA-A*02:01、HLA-A*11:01、HLA-A*24:02、HLA-A*01:01、HLA-A*01:02、HLA-A*01:03、HLA-A*01:06、HLA-A*01:07、HLA-A*01:08、HLA-A*01:09、HLA-A*01:10、HLA-A*01:12和HLA-A*01:13中的至少一种。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，步骤(2)中负载RNA的方式为转染；
和/或，每2×106个细胞，所述RNA的用量为5-20μg，优选为12-20μg；
和/或，所述RNA为抗原mRNA，优选为人巨细胞病毒mRNA，更优选为碱基序列如SEQ IDNO:4所示的RNA。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述固定剂为多聚甲醛溶液和/或甲醛溶液；
优选地，所述多聚甲醛溶液中多聚甲醛的浓度为0.5-3重量％，更优选为0.5-1.5重量％；
和/或，所述甲醛溶液中甲醛的浓度为0.1-2重量％，更优选为0.8-1.2重量％；
和/或，每1×106个负载了RNA的K562细胞，所述固定剂的用量为0.5-1.5mL；
和/或，所述固定的条件包括：温度为15-30℃，时间为5-15min。
5.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述人工抗原提呈细胞导入或不导入共刺激分子，优选为不导入共刺激分子；
优选地，所述共刺激分子为4-1BBL和/或OX40L。
6.权利要求1-5中任意一项所述的方法制备得到的人工抗原提呈细胞。
7.一种制备T细胞的方法，其特征在于，该方法包括：用人工抗原提呈细胞与外周血单核细胞共培养；
其中，所述外周血单核细胞来自供体对象，所述人工抗原提呈细胞为权利要求1-5中任意一项所述的方法制备得到的人工抗原提呈细胞；
优选地，所述人工抗原提呈细胞与外周血单核细胞的数量比为1：(0.5-2)，更优选为1：(0.8-1.2)。
8.一种药物组合物，该药物组合物包括权利要求1-5中任意一项所述的方法制备得到的人工抗原提呈细胞；
优选地，所述药物组合物包含或不包含共刺激分子，更优选不包含共刺激分子；
进一步优选地，所述共刺激分子为4-1BBL和/或OX40L。
9.权利要求1-5中任意一项所述的方法在制备T细胞免疫疗法的药物中的应用。
10.权利要求1-5中任意一项所述的方法在制备检测T细胞的制剂和/或设备中的应用。
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