CN112048001A

CN112048001A - 一种肿瘤新生抗原多肽及其应用

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Publication number: CN112048001A
Application number: CN202010936245.0A
Authority: CN
Inventors: 郭琼玉; 胡小燕; 肖靖雨; 高雅楠
Original assignee: Southwest University of Science and Technology
Current assignee: Southwest University of Science and Technology; Southern University of Science and Technology
Priority date: 2020-09-08
Filing date: 2020-09-08
Publication date: 2020-12-08
Anticipated expiration: 2040-09-08
Also published as: CN112048001B

Abstract

本发明提供一种肿瘤新生抗原多肽及其应用。所述肿瘤新生抗原多肽包含氨基酸序列FX₁YDASNQX₂；其中，X₁选自亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、缬氨酸或谷氨酰胺中的任意一种，X₂选自丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、半胱氨酸、缬氨酸或苏氨酸中的任意一种。本发明利用所筛选得到的肿瘤新生抗原多肽，诱导并产业化制备能够高效、特异性杀伤肿瘤细胞的细胞毒性T细胞，在个体化肝癌免疫细胞治疗中具有重大的临床价值。

Description

一种肿瘤新生抗原多肽及其应用

技术领域

本发明涉及免疫治疗技术领域，具体涉及一种肝癌细胞的免疫治疗方法，尤其涉及一种肿瘤新生抗原多肽及其应用。

背景技术

肝癌是目前全球第五大常见恶性肿瘤，死亡率高居我国恶性肿瘤的第二位。肝癌的主要致病因素包括：乙型(HBV)和丙型(HCV)肝炎病毒、酒精、高脂食物以及致癌物质等。早期肝癌没有明显症状，目前，确诊的病例大多处于中晚期，且缺乏有效的治疗措施，导致预后效果极差。

传统的肝癌治疗方法，例如手术、局部消融、放疗和化疗等，具有较大的局限性。其中，手术切除和局部消融后残留的癌细胞可能会发生转移，复发率较高；放疗和化疗会严重损伤机体自身的正常细胞，对于中晚期患者很难达到较好的远期及预后疗效。因此，寻找更有效的肝癌治疗方法极为紧迫且具有重大的临床价值。

免疫治疗(immunotherapy)是指针对机体低下或亢进的免疫状态，人为地增强或抑制机体的免疫功能以达到治疗疾病目的的治疗方法。免疫治疗是一种可能彻底清除癌细胞的方法，其弥补了传统疗法的弊端，被认为是二十一世纪肿瘤综合治疗模式中最有发展前途的一种治疗手段。目前，针对免疫抑制分子(PD-1)、程序性细胞死亡-配体1(PD-L1)和细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(CTLA-4)的单克隆抗体相继获批上市。但是研究发现，在其他实体瘤，例如中晚期肝癌中，由于肿瘤组织的异质性、抗体治疗引发的免疫耐受、肿瘤细胞内相关分子介导的复杂炎症信号通路等因素的影响，导致中晚期肝癌的临床治疗效果不理想。

免疫治疗中，细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocytes，CTL)回输疗法因毒副作用小，针对性强，持久性好，适应症广等良好特性而被广泛研究。CTL细胞免疫生物疗法利用患者自身静脉血的淋巴细胞，在体外通过靶细胞抗原和淋巴因子的诱导，分化扩增成具有强大杀伤力的CTL细胞，再经静脉回输体内，从而有效地发挥免疫效应，促使其发挥杀伤杀死肿瘤细胞的功能。CTL制备过程中抗原负载是必需的过程，在CTL产业化和临床应用中，必需解决负载抗原多肽的特异性和有效性的问题。目前，针对肝癌的CTL疗法研发中，虽然已有相关文献报道肝癌与病毒(HBV，HCV)相关的阳性多肽序列；以及肝癌高表达的抗原多肽序列。但是无相关报道它们的免疫原性强弱，更无报道通过DC等抗原呈递细胞，CTL能否负载这些肝癌相关抗原，以及负载了这些抗原多肽的CTL杀伤能力强弱。

新生抗原(neoantigen)是一种基于肿瘤细胞高频突变产生的表位特异性抗原，这种抗原在正常细胞中是不存在的。研究表明，新生抗原在肿瘤免疫治疗中起着关键作用，新生抗原的识别筛选和鉴定促进了肿瘤患者个体化免疫治疗的发展，终将使更多患者特别是中晚期患者受益。

因此，如何筛选高效特异性强的肝癌新生抗原，并使之诱导CTL，量化生产这种靶向肝癌的CTL，对于CTL细胞免疫治疗产业化应用至关重要。

发明内容

鉴于现有技术中存在的问题，本发明提供一种肿瘤新生抗原多肽及其应用。本发明利用所筛选得到的肿瘤新生抗原多肽，诱导并产业化制备能够高效、特异性杀伤肿瘤细胞的CTL，在个体化肝癌免疫细胞治疗中具有重大的临床价值。

为达此目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供一种肿瘤新生抗原多肽，所述肿瘤新生抗原多肽包含氨基酸序列FX₁YDASNQX₂。

具体为：苯丙氨酸-X₁-酪氨酸-天冬氨酸-丙氨酸-丝氨酸-天冬酰胺-谷氨酰胺-X₂。其中，X₁选自亮氨酸L、异亮氨酸I、甲硫氨酸M、缬氨酸V或谷氨酰胺Q中的任意一种，X₂选自丙氨酸A、亮氨酸L、异亮氨酸I、甲硫氨酸M、半胱氨酸C、缬氨酸V或苏氨酸T中的任意一种。

本发明中提供的肿瘤新生抗原多肽，通过对肝癌病人的TCGA数据库中进行分析得到，与MHC I类分子的结合亲和力较强，可以诱导产生高效特异性杀伤肿瘤细胞的CTL，并且其免疫原性、CTL细胞的阳性率及其在细胞体外实验中的杀伤效能均较好；同时，利用其制备的CTL可形成的TCR序列，进一步制备成另一种高效特异性杀伤的TCR(T cell receptor，T细胞抗原受体)T细胞，利用其构建的免疫细胞疗法，具有成本低、产量高、工艺流程简洁的特点，在肝癌免疫细胞治疗临床应用中潜力大。

作为本发明优选的技术方案，所述肿瘤新生抗原多肽包含如SEQ ID NO.1～26中的任意一种所示的氨基酸序列；

具体序列如下表1所示：

优选地，所述肿瘤新生抗原多肽包含如SEQ ID NO.8所示的氨基酸序列，即FIYDASNQV。所述肿瘤新生抗原多肽的氨基酸序列为SEQ ID NO.8所示的氨基酸序列。

第二方面，本发明还提供一种编码如第一方面所述的肿瘤新生抗原多肽的核苷酸。其中，SEQ ID NO.8所示的氨基酸序列对应的核苷酸序列如SEQ ID NO.27所示，即TTCATTTATGATGCTTCTAACCAGGTA。

第三方面，本发明还提供一种基因表达载体，所述基因表达载体包括：编码如第一方面所述的肿瘤新生抗原多肽的核苷酸。

第四方面，本发明还提供一种重组工程菌，所述重组工程菌包括至少一个拷贝的如第三方面所述的基因表达载体。

本发明中，所述核苷酸、基因表达载体以及重组工程菌均能够用于合成所述肿瘤新生抗原多肽。

第五方面，本发明提供一种如第一方面所述的肿瘤新生抗原多肽制备得到的抗原递呈细胞(antigen-presenting cell，APC)和/或细胞毒性T细胞。

优选地，所述细胞毒性T细胞靶向第一方面所述的肿瘤新生抗原多肽，所述细胞毒性T细胞具有抗原特异性，能够针对抗原多肽从而起到治疗肝癌的目的。

第六方面，本发明提供一种如第五方面中所述的细胞毒性T细胞的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：

(1)合成肿瘤新生抗原多肽；

(2)分选外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)，得到CD8阳性细胞和CD14阳性细胞；

(3)培养步骤(2)中得到的CD14阳性细胞，再加入所述肿瘤新生抗原多肽，得到负载所述肿瘤新生抗原多肽的CD14阳性细胞；其中，负载肿瘤新生抗原多肽的CD14阳性细胞即为第五方面中所述的抗原递呈细胞。

(4)将步骤(3)中得到的CD14阳性细胞与CD8阳性细胞共培养，所述CD14阳性细胞将肿瘤细胞新生抗原递呈至所述CD8阳性细胞，诱导所述CD8阳性细胞转变为细胞毒性T细胞。

需要注意的是，所述制备方法中，步骤(1)与步骤(2)并没有先后顺序，步骤(1)和步骤(2)可分别进行，即先进行步骤(1)再进行步骤(2)、或先进行步骤(2)再进行步骤(1)，或同时进行均可。

本发明所述的制备方法中，CD14阳性细胞为树突状细胞(DC细胞)，以其作为抗原递呈细胞，先将其与肿瘤新生抗原多肽混合培养，在与CD8阳性细胞共培养，在共培养过程中，CD14阳性细胞将肿瘤细胞新生抗原递呈至所述CD8阳性细胞，CD8阳性细胞接收该信号之后，诱导形成成熟的细胞毒性T细胞。

作为本发明优选的技术方案，步骤(3)所述培养时使用的培养基中包括细胞因子IL-4、巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、脂多糖(LPS)或IFN-γ中的任意一种或至少两种的组合。

优选地，步骤(3)所述肿瘤新生抗原多肽的工作浓度为5～15μg/mL，例如可以是6μg/mL、7μg/mL、8μg/mL、9μg/mL、10μg/mL、11μg/mL、12μg/mL、13μg/mL或14μg/mL等。

优选地，步骤(4)所述共培养中，CD14阳性细胞与CD8阳性细胞的数量比为1:(4～8)，例如可以是1:4.5、1:5、1:5.5、1:6、1:6.5、1:7或1:7.5等。

优选地，步骤(4)所述共培养中，培养密度为(1.0～1.5)×10⁶cells/cm²，例如可以是1.1×10⁶cells/cm²、1.2×10⁶cells/cm²、1.3×10⁶cells/cm²或1.4×10⁶cells/cm²等。

优选地，在步骤(4)所述共培养的过程中，加入IL-21、IL-2、IL-7或IL-15中的任意一种或至少两种的组合。

作为本发明优选的技术方案，步骤(4)所述共培养的具体操作步骤为：

将CD14阳性细胞与CD8阳性细胞混合，加入浓度为20～30ng/mL(例如可以是22ng/mL、24ng/mL、25ng/mL、26ng/mL或28ng/mL等)的IL-21，培养48～72h(例如可以是50h、52h、55h、56h、60h、65h、68h或70h等)后；

加入5～15ng/mL(例如可以是6ng/mL、8ng/mL、10ng/mL、12ng/mL或13ng/mL等)的IL-2、5～15ng/mL(例如可以是6ng/mL、8ng/mL、10ng/mL、12ng/mL或13ng/mL等)的IL-7和5～15ng/mL(例如可以是6ng/mL、8ng/mL、10ng/mL、12ng/mL或13ng/mL等)的IL-15，培养48～72h(例如可以是50h、52h、55h、56h、60h、65h、68h或70h等)；

而后更换培养基并补加IL-2、IL-7和IL-15，继续培养，得到细胞毒性T细胞。其中，所述更换培养基的步骤可以是半量换液或者全量换液，换液之后都需要补充细胞因子IL-2、IL-7和IL-15。

作为本发明优选的技术方案，所述制备方法包括如下步骤：

(1)合成肿瘤新生抗原多肽，所述肿瘤新生抗原多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1～26中的任意一种所示；

(2)分选外周血单个核细胞，得到CD8阳性细胞和CD14阳性细胞；

(3)培养所述CD14阳性细胞，再加入终浓度为5～15μg/mL的肿瘤新生抗原多肽，得到负载所述肿瘤新生抗原多肽的CD14阳性细胞；

(4)将步骤(3)中得到的CD14阳性细胞与CD8阳性细胞以1:(4～8)的数量比混合，培养密度为(1.0～1.5)×10⁶cells/cm²，加入浓度为20～30ng/mL的IL-21，培养48～72h后，加入5～15ng/mL的IL-2、5～15ng/mL的IL-7和5～15ng/mL的IL-15，培养48～72h，而后更换培养基并补加IL-2、IL-7和IL-15，继续培养，所述CD14阳性细胞将肿瘤细胞新生抗原递呈至所述CD8阳性细胞，诱导所述CD8阳性细胞转变为细胞毒性T细胞。

第七方面，本发明还提供一种如第一方面所述的肿瘤新生抗原多肽或如第五方面中所述的细胞毒性T细胞在制备TCR-T细胞或肿瘤治疗药物中的应用。

本发明所述的数值范围不仅包括上述列举的点值，还包括没有列举出的上述数值范围之间的任意的点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。

与现有技术相比，本发明至少具有以下有益效果：

(1)本发明提供了一种肿瘤新生抗原多肽FX₁YDASNQX₂，所述多肽能高效诱导肿瘤特异性的细胞毒性T细胞，尤其是多肽序列FIYDASNQV，其免疫原性、抗原特异性CTL细胞的阳性率及其在细胞体外实验中的杀伤效能均较好，将该肿瘤新生抗原多肽应用于免疫细胞治疗领域后，将有效地增强人们对负载新生抗原的CTL在肝癌临床治疗中的正确认识；

(2)本发明中，收集负载所述肿瘤新生抗原多肽的CTL后，只需要通过高通量单细胞TCR全长测序，并进行TCR特异引物扩增，容易得到相应针对肝癌抗原的TCR序列，对于后续制备TCR-T有相应指导意义，可推动TCR-T在肝癌免疫细胞治疗中的靶点开发。

附图说明

图1为本发明中提供的肿瘤新生抗原多肽的筛选及诱导CTL细胞生成的流程图。

图2为实施例2中不同的多肽序列经过EliSpot assay筛选后的结果图，其中a表示多肽FIYDASNQV，b表示多肽ILLGFSDYLQL，c表示多肽FLLTRILT，d表示多肽AMFFWLLLV。

图3为实施例3中空白对照组进行四聚体置换实验后得到的流式检测荧光结果图，A图为多肽荧光分布散点图，B为对应的FITC的荧光峰图。

图4为实施例3中阳性多肽四聚体置换实验后得到的流式检测荧光结果图，其中A图为多肽荧光分布散点图，B为对应的FITC的荧光峰图。

图5为实施例3中目的多肽进行四聚体置换实验后得到的流式检测荧光结果图，其中A图为多肽荧光分布散点图，B为对应的FITC的荧光峰图。

图6为实施例3中多肽置换效率计算曲线图。

图7为实施例3中对照组刺激T细胞后得到的流式检测结果图。

图8为实施例3中实验组刺激T细胞后得到的流式检测结果图。

图9为实施例4中多肽诱导刺激后的得到的CTL细胞的杀伤能力柱状图。

具体实施方式

下面结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案，但下述的实例仅仅是本发明的简易例子，并不代表或限制本发明的权利保护范围，本发明的保护范围以权利要求书为准。

以下实施例中，所用的试剂和耗材等若无特殊说明，均可由常规的试剂厂商购得；所用的实验方法若无特殊说明，均采用本领域常规的实验方法。

首先结合图1对本发明中提供的新生抗原多肽的筛选及其作用机理进行简单描述：

(1)对肝癌病人的TCGA数据库中进行全外显子测序(Whole exome sequencing)、肿瘤新生抗原及多肽预测(Tumor neoantigen)以及抗原与MHC I类分子的结合亲和力分析(Antigen binding affinity prediction)，筛选出亲和力较强的肿瘤新生抗原多肽；

(2)利用细胞因子(如IL-4、GM-CSF、IFN-γ、LPS等)刺激抗原递呈细胞(antigen-presenting cell，APC)，例如树突状细胞(DC)，APC细胞将肿瘤新生抗原多肽递呈(Antigenpresenting)给CD⁸⁺T细胞，并用细胞因子(如IL-21、IL-2、IL-7、IL-15等)诱导T细胞得到CTLs，CTLs分泌细胞因子(如IFN-γ等)杀伤靶细胞或肿瘤细胞，进而治疗肿瘤患者。

实施例1

本实施例提供一种肿瘤新生抗原多肽。所述多肽的序列通过如下方法筛选得到：

(1)基于TCGA数据库的肝癌高频突变位点的筛选，筛选出Top 10高频突变位点

从TCGA数据库(https://portal.gdc.cancer.gov/projects/TCGA-LIHC)下载了364例肝癌全外显子测序结果的体细胞突变数据(版本：20170929)，筛选了至少复现在2例病人身上的missense SNV位点，得到以HLA-A0201分型为例的肝癌病人群体里最高频的突变位点，并根据变异信息将氨基酸序列截取成长度为9mer且含有变异氨基酸的短肽；

(2)对肿瘤特异肽段进行预测

为了鉴定可用作候选标记物以开发抗肿瘤疫苗的新生抗原，以及预测精度最优化，经过亲和力预测分析后，得到肿瘤新生抗原多肽，如序列SEQ ID NO.1～26所示，其中基因名称为SI，氨基酸序列为FIYDASNQV(SEQ ID NO.8)的亲和力最强；

同时，通过上述方法，还筛选出提供一条亲和力较高的多肽序列，其基因名称为OR2G2，氨基酸序列为ILLGFSDYLQL(SEQ ID NO.28)。

实施例2

本实施例用于证明所述新生抗原多肽相对于病毒相关性抗原和肿瘤相关性抗原更具有高抗原免疫原性。

其中，所使用的病毒相关性抗原为：HBV_01，序列为FLLTRILT(记为SEQ IDNO.29)；肿瘤相关性抗原为：VEGFR2-775，序列为AMFFWLLLV(记为SEQ ID NO.30)。

CTL细胞的制备步骤如下：

(1)合成SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.28～30所示的多肽；

(2)使用特异性磁珠和MS柱对将外周血单个核细胞中的CD⁸⁺T细胞和DC细胞进行分选。

具体操作过程如下：

a、收集100mL HLA-A0201分型的健康人外周血，用PBS重悬后，加入等体积的Ficoll分离液，经过密度梯度离心后，用吸管吸出单核细胞层，转移至离心管中，用无菌PBS重悬后离心，重复洗涤一次，去除多余的Ficoll分离液和血小板，得到PBMCs，冻存备用；

b、取50×10⁶个PBMCs，复苏之后用1640培养基清洗一遍，300g，离心5min，计数，使用含有质量分数为10％FBS(胎牛血清)的640培养基，37℃孵育12h；

c、孵育之后，300g离心5min，并用MACS buffer重悬，计数；

d、加入CD14磁珠(使用量为20μL/10⁷cells)和MACS buffer(使用量为80μL/10⁷cells)，4℃，孵育15min，每5min摇一次；

e、取出用20mL MACS buffer清洗一遍，300g，离心10min，并用MACS重悬，过MC柱子(用1mL MACS润洗一遍)，滤过的为CD14阴性细胞；

f、细胞悬液滤过之后用1mL MACS清洗旧管一次，并用1mL MACS清洗柱子两次，最后取下MC柱子，用活塞猛推出的为CD14阳性细胞即DC细胞，计数1.722×10⁷个；其中，一半用含有质量分数为5％FBS、10ng/mL IL-4和86ng/mL GM-CSF的CG-DC培养基培养，一半用CS10冻存液冻存；

g、取CD14阴性细胞计数，加入相应体积的CD8磁珠(20μL/10⁷cells)和MACSbuffer(80μL/10⁷cells)，4℃，孵育15min，每5min摇一次；

h、取出后用20mL MACS buffer清洗一遍，300g离心10min，并用MACS重悬，过MC柱子(用1mL MACS润洗一遍)，滤过的为CD8阴性细胞；

i、细胞悬液滤过之后用1mL MACS清洗旧管一次，并用1mL MACS清洗柱子两次，用活塞猛推出的为CD8阳性细胞即T细胞，计数3.42×10⁶个并冻存。

(3)分选之后，先加入IL-4和GM-CSF细胞因子培养DC细胞，再加入IL-4、GM-CSF、LPS和IFN-γ细胞因子，刺激成熟24h，之后分别用SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.28～30所示的多肽刺激所述DC细胞；

具体步骤如下：

a、第一天(D1)：磁珠分选之后，DC细胞计数1.722×10⁷个，一半冻存，一半培养，使用含有质量分数为5％FBS、10ng/mL IL-4和86ng/mL GM-CSF(巨噬细胞集落刺激因子)的CG-DC培养基重悬，1mL/孔，置于12孔板中培养，共12孔(5×10⁵个/孔)，培养48h；

b、D3：每孔补充含有质量分数为5％FBS、20ng/mL IL-4和172ng/mL GM-CSF的CG-DC培养基500μL(即原先的1/2体积，双倍的细胞因子浓度)，培养48h；

c、D5：配置含有质量分数为5％FBS、10ng/mL IL-4、86ng/mL GM-CSF、10ng/mL LPS和10ng/mL IFN-γ的CG-DC培养基，全量换液，300g离心10min，使用配置的培养基重悬，成熟培养24h；同时复苏T细胞，使用含有质量分数为5％FBS、10ng/mL IL-7的CG-DC培养基重悬；

d、D6：将DC细胞负载相应的多肽(即分别负载SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.28～30所示的多肽，终浓度为10μg/mL)，37℃，CO₂培养箱培养16h。

(4)将步骤(3)中得到的DC细胞与CD8⁺T细胞共培养一周；

a、D7(继上述步骤的时间线)：待多肽负载完成后，DC细胞和T细胞共培养，数量比DC:T＝1:5，体积比1:1，培养密度为1.0×10⁶cells/cm²；此时加入30ng/mL IL-21，培养72h；

b、D10：3天后加入IL-2(10ng/mL)，IL-7(10ng/mL)，IL-15(10ng/mL)，培养48h；

c、D12：半量换液，并补加细胞因子IL-2(10ng/mL)，IL-7(10ng/mL)，IL-15(10ng/mL)，保证细胞密度在1×10⁶/mL左右，培养72h；

d、D15：全量换液，补加细胞因子IL-2(10ng/mL)，IL-7(10ng/mL)，IL-15(10ng/mL)。

(5)CD8⁺T细胞刺激成熟之后，收集并做EliSpot assay检测，通过分泌的IFN-γ产生紫色斑点的情况观察多肽是否具有免疫原性，再将EliSpot板进行AID读板；

a、D20(继上述步骤的时间线)：复苏HLA-0201分型的T2细胞(购自ATCC)，记为T2-0201细胞(以含有10wt％FBS的IMDM培养基进行培养)，300g离心5min，计数；

b、D22：收集T2-0201细胞，300g离心5min，计数用无血清IMDM重悬细胞，加入1.5mLEP管，分别负载相应的多肽(即分别负载SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.28～30所示的多肽，终浓度为10μg/mL)，为实验组；

单独设置一组为阴性对照组，在T2-0201细胞中加入DMSO(体积与多肽体积一致)，37℃培养4h；

4h后，收集负载过多肽的T2-0201细胞，并用含有2％的FBS的CG-DC培养基重悬，调整细胞浓度为5×10⁴个/mL；

PBS洗elispot板5次，150μL/孔，每5min洗一次，之后加入含有质量分数为10％FBS的IMDM培养基，100μL/孔，37℃，30min；

取待检测的T细胞样品，用含有质量分数为2％的FBS的CG-DC培养基重悬，调整细胞浓度为2×10⁵个/mL；

取出elispot板，在干净的纸巾上拍掉液体，按照铺板顺序加入T2-0201和T细胞各100μL/孔，同时加入阳性对照组OKT3和阴性对照组，37℃孵育20h；

c、D23：除去板上的细胞，PBS洗elispot板5次，150μL/孔，每5min洗一次，加入配制好的7-b6-1-ALP抗体，100μL/孔，37℃，孵育2h；

配制含有质量分数为0.5％FBS的PBS缓冲液，以抗体与PBS缓冲液的体积比为1:200加入抗体，0.22μm过滤；

除去一抗，PBS洗elispot板5次，150μL/孔，每5min洗一次，加入100μL/孔的NBT/BCIP避光显色8min；

冲洗、用烘箱烘干后用AID读数仪读取孔板的紫色斑点数，整理并统计。

读板结果如图2所示，其中，a～d分别表示多肽FIYDASNQV、ILLGFSDYLQL、FLLTRILT和AMFFWLLLV刺激后的读板结果，且图中编号1～6分别表示实验组和阴性对照组各重复三次。由上述结果可知，本发明中提供的新生抗原多肽FIYDASNQV具有高免疫原性，且具有统计学意义。

同时，除多肽FIYDASNQV之外，本实施例中虽然未对其他FX₁YDASNQX₂进行验证。但是，由于实施例1中经过亲和力筛选，预测结果呈阳性，且其序列与FIYDASNQV的序列仅有一个或两个氨基酸发生突变，因此，可合理地认为SEQ ID NO.1～26所示的氨基酸序列均具有较高的免疫原性。

实施例3

本实施例用于验证实施例1中提供的新生抗原多肽能够通过抗原呈递细胞将抗原肽呈递给CD8⁺T细胞，并且激活产生相应的抗原特异性CTL细胞。

本实施例中进行四聚体染色实验检测抗原特异性CTL细胞的阳性率。

具体步骤如下：

(1)四聚体置换实验：

用DMSO制备2mg/mL置换用的目的多肽(序列FIYDASNQV)溶液和阳性多肽标准品，将50μL的四聚体加入圆底96孔板；加入制备的多肽溶液1μL，并用移液器混匀，加入多肽置换因子1μL，并用移液器混匀；避光于25℃下孵育4h，然后于4℃避光保存；所用的四聚体置换试剂盒为QuickSwitch^TM、PE染色试剂盒，购自MBL生物公司；

(2)四聚体置换效率检测：

a、在锥形底96孔板的孔1至孔5中各加入20μL捕获磁珠；将5μL的1×检测缓冲液加入孔2，5μL未置换的四聚体加入孔1和孔3，将已置换的四聚体加入孔4和孔5；用锡纸包裹96孔板，并将96孔板置于平板摇床上，550rpm室温振荡45min；

b、振荡结束后，将1×检测缓冲液加入孔1至孔5，每孔150μL清洗，将96孔板植于磁力板上静置5min，静置后弃上清，保持96孔板置于磁力板上状态下，用涡旋混匀器搅拌2s，然后将96孔板从磁力板上取下；

c、将1×抗体-FITC(试剂盒四聚体中多肽的特异性抗体)各25μL加入孔2～5，将1×检测缓冲液加入孔1中；用锡纸包裹96孔板，并将96孔板置于平板摇床上，550rpm室温振荡45min；

d、振荡结束后，将1×检测缓冲液加入孔1至孔5，每孔150μL清洗，将96孔板置于磁力板上静置5min，静置后弃上清，保持96孔板置于磁力板上状态下，用涡旋混匀器搅拌2s，然后将96孔板从磁力板上取下；

e、将1×检测缓冲液加入孔6，再加入5μL捕获磁珠并混匀；将所有孔的液体转移到流式管中，置于冰上，之后上流式细胞分析仪检测试剂盒四聚体中多肽的荧光强度，其流式检测荧光结果如图3、图4和图5所示。

如图所示，图3为空白对照组即未置换多肽的检测结果，图4为阳性多肽的检测结果，图5为目的多肽的检测结果；由图可知，目的多肽的置换效率较高，与阳性多肽的结果较为相近；其中，图3～图5中A图均为多肽荧光分布散点图，B为对应的多肽FITC平均荧光峰图。

进而，计算出多肽的置换效率，其计算曲线如图6所示，具体为：

y＝-5.0505x+101.01，R²＝1；

y表示置换效率，x表示四聚体置换试剂盒中配套的FITC的荧光强度。

以未置换多肽组的置换效率为0计，目的多肽组和阳性多肽组的置换效率分别为95.09％和95.75％，大于75％则为有效置换，因此上述实验结果说明，此新生多肽置换成功，四聚体可用于后续检测。

(3)抗原特异性细胞毒性T细胞的阳性率检测：

a、收集成熟的效应细胞(细胞数约为2×10⁶)于1.5mL离心管中，400g离心5min，弃上清，使用PBS缓冲液(含有质量分数为0.5％的FBS)重悬细胞，每管200μL；

b、加入四聚体-PE(各2μL)及CD8表面抗体-FITC(1:1000)染色，4℃孵育30min，同时，还准备一支未染色(双阴)，一支仅使用PE染色(单染PE)和一支仅使用FIFC染色(单染FITC的细胞)作为对照组实验；

c、孵育结束之后，每管加入PBS(含有质量分数为0.5％的FBS)各400μL清洗，400g，离心5min，每管再加入PBS(0.5％FBS)各400μL清洗，400g，离心5min；

d、每管加入300μL PBS(0.5％FBS)重悬，并转移到流式管，置于冰上，之后上流式细胞分析仪检测细胞的荧光强度，结果如图7和图8所示；Q2象限即为抗原特异性细胞毒性T细胞的阳性细胞。

其中，图7为对照组的检测结果；如图8为实验组的检测结果，实验组用目的多肽FIYDASNQV抗原刺激后的T细胞可以用四聚体检测出0.66％的抗原特异性细胞毒性T细胞。

实施例4

本实施例为了验证所述新生抗原多肽诱导的CTL具有体外细胞杀伤能力，进行了乳酸脱氢酶LDH杀伤实验。

乳酸脱氢酶(LDH)是活细胞胞浆内含酶之一，在正常情况下，不能透过细胞膜。当靶细胞T2受到效应细胞CTL的攻击而损伤时，细胞膜通透性改变，LDH可释放至介质中，释放出来的LDH在催化乳酸生成丙酮酸的过程中，使氧化型辅酶I(NAD+)变成还原型辅酶I(NADH2)，后者再通过递氢体-吩嗪二甲酯硫酸盐(PMS)还原碘硝基氯化氮唑蓝(INT)或硝基氯化四氮唑蓝(NBT)形成有色的甲簪类化合物，在490nm波长处有一高吸收峰，使用酶标仪读取的OD值，经过计算即可得靶细胞活性，从而检测抗原多肽的杀伤性能。

具体实验步骤如下：

选取EliSpot assay实验中筛选出的具有免疫原性的新生抗原多肽FIYDASNQV，采用乳酸脱氢酶检测试剂盒(LDH Assay Kit)进行靶细胞杀伤性能测试。

a、取T2细胞，计数，用无血清IMDM重悬，实验组为负载筛选到的新生抗原多肽，对照组为加入等体积的DMSO，多肽浓度为10μg/mL，37℃，负载4h；

b、4h后，离心T2细胞，用培养基(含有质量分数为5％FBS的CG-DC培养基)重悬T2，调整浓度至2×10⁵/mL；

c、取效应细胞(实施例2中制备得到的CTL细胞)，按照表2示意的铺板方案、以效应细胞数:靶细胞数即效靶比为5:1(E:T＝5:1)进行培养稀释；

表2

其中，①～⑥的含义分别为：

①实验组(50μL效应细胞和50μL靶细胞)，②效应细胞自然释放组(50μL效应细胞和50μL培养基)

③靶细胞自然释放组(50μL靶细胞和50μL培养基)，④靶细胞最大释放组(50μL靶细胞、50μL培养基和10μL裂解液)

⑤培养液对照组(100μL)，⑥体积校正组(110μL)。

d、使用圆底96孔板进行铺板，所有孔终体积为100μL，在37℃，5％CO₂培养箱中培养4h；在培养3.5h时，加入10μL的裂解液(lysis buffer)到靶细胞最大释放组和体积校正组；

e、孵育结束离心96孔板，250g离心4min，取上清50μL/孔至检测用的平底96孔板，避免气泡，加入50μL/孔的底物混合物(Substrate Mix)，25℃避光反应30min，加入50μL/孔终止反应液(Stop solution)，轻拍混匀；

f、于全波长读数仪上读取吸收光490nm的对应数值，计算杀伤率。

计算过程中，所有实验组、对照组应减去背景平均值，矫正后的值用于杀伤效率计算：

细胞杀伤率(％)＝[(实验组释放-效应细胞自发释放-靶细胞自发释放)/(靶细胞最大释放-靶细胞自发释放)]×100％；

所得结果如图9所示，由图可知，用筛选出的新生抗原多肽诱导刺激后的CTL细胞具有体外细胞杀伤能力，在E:T为5:1时，杀伤效率为92.9％，且具有统计学意义。

综上所述，本发明中提供的肿瘤新生抗原多肽FX₁YDASNQX₂，所述多肽能高效诱导肿瘤特异性的细胞毒性T细胞，相比于多肽序列ILLGFSDYLQL、FLLTRILT以及AMFFWLLLV，其免疫原性、抗原特异性CTL细胞的阳性率及其在细胞体外实验中的杀伤效能均较好。

申请人声明，以上所述仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，所属技术领域的技术人员应该明了，任何属于本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 南方科技大学

<120> 一种肿瘤新生抗原多肽及其应用

<130> 20200819

<160> 30

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 1

Phe Leu Tyr Asp Ala Ser Asn Gln Ala

1 5

<210> 2

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 2

Phe Leu Tyr Asp Ala Ser Asn Gln Leu

1 5

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<211> 9

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 3

Phe Ile Tyr Asp Ala Ser Asn Gln Ile

1 5

<210> 4

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 4

Phe Ile Tyr Asp Ala Ser Asn Gln Ala

1 5

<210> 5

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 5

Phe Met Tyr Asp Ala Ser Asn Gln Met

1 5

<210> 6

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 6

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1 5

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<211> 9

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 7

Phe Leu Tyr Asp Ala Ser Asn Gln Cys

1 5

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<211> 9

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 8

Phe Ile Tyr Asp Ala Ser Asn Gln Val

1 5

<210> 9

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 9

Phe Val Tyr Asp Ala Ser Asn Gln Leu

1 5

<210> 10

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 10

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1 5

<210> 11

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 11

Phe Thr Tyr Asp Ala Ser Asn Gln Leu

1 5

<210> 12

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 12

Phe Met Tyr Asp Ala Ser Asn Gln Leu

1 5

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<211> 9

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 13

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1 5

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<211> 9

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 14

Phe Met Tyr Asp Ala Ser Asn Gln Ala

1 5

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<211> 9

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 15

Phe Gln Tyr Asp Ala Ser Asn Gln Ile

1 5

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<211> 9

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 16

Phe Leu Tyr Asp Ala Ser Asn Gln Thr

1 5

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<211> 9

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 17

Phe Met Tyr Asp Ala Ser Asn Gln Thr

1 5

<210> 18

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 18

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1 5

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<211> 9

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 19

Phe Met Tyr Asp Ala Ser Asn Gln Cys

1 5

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<211> 9

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 20

Phe Leu Tyr Asp Ala Ser Asn Gln Met

1 5

<210> 21

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 21

Phe Leu Tyr Asp Ala Ser Asn Gln Val

1 5

<210> 22

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 22

Phe Thr Tyr Asp Ala Ser Asn Gln Val

1 5

<210> 23

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 23

Phe Val Tyr Asp Ala Ser Asn Gln Ile

1 5

<210> 24

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 24

Phe Ile Tyr Asp Ala Ser Asn Gln Leu

1 5

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<211> 9

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 25

Phe Met Tyr Asp Ala Ser Asn Gln Ile

1 5

<210> 26

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 26

Phe Met Tyr Asp Ala Ser Asn Gln Val

1 5

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<211> 27

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 27

ttcatttatg atgcttctaa ccaggta 27

<210> 28

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 28

Ile Leu Leu Gly Phe Ser Asp Tyr Leu Gln Leu

1 5 10

<210> 29

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 29

Phe Leu Leu Thr Arg Ile Leu Thr

1 5

<210> 30

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 30

Ala Met Phe Phe Trp Leu Leu Leu Val

1 5

Claims

1.一种肿瘤新生抗原多肽，其特征在于，所述肿瘤新生抗原多肽包含氨基酸序列FX₁YDASNQX₂；

其中，X₁选自亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、缬氨酸或谷氨酰胺中的任意一种，X₂选自丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、半胱氨酸、缬氨酸或苏氨酸中的任意一种。

2.根据权利要求1所述的肿瘤新生抗原多肽，其特征在于，所述肿瘤新生抗原多肽包含如SEQ ID NO.1～26中的任意一种所示的氨基酸序列，优选为SEQ ID NO.8所示的氨基酸序列。

3.一种编码如权利要求1或2所述的肿瘤新生抗原多肽的核苷酸。

4.一种基因表达载体，其特征在于，所述基因表达载体包括编码如权利要求1或2所述的肿瘤新生抗原多肽的核苷酸。

5.一种重组工程菌，其特征在于，所述重组工程菌包括至少一个拷贝的如权利要求4所述的基因表达载体。

6.一种利用如权利要求1或2所述的肿瘤新生抗原多肽制备得到的抗原递呈细胞和/或细胞毒性T细胞；

优选地，所述细胞毒性T细胞靶向权利要求1或2的肿瘤新生抗原多肽。

7.一种如权利要求6中所述的细胞毒性T细胞的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：

(1)合成肿瘤新生抗原多肽；

(2)分选外周血单个核细胞，得到CD8阳性细胞和CD14阳性细胞；

(3)培养步骤(2)中得到的CD14阳性细胞，再加入所述肿瘤新生抗原多肽，得到负载所述肿瘤新生抗原多肽的CD14阳性细胞；

8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)所述培养时使用的培养基中包括细胞因子IL-4、巨噬细胞集落刺激因子、脂多糖或IFN-γ中的任意一种或至少两种的组合；

优选地，步骤(3)所述肿瘤新生抗原多肽的工作浓度为5～15μg/mL；

优选地，步骤(4)所述共培养中，CD14阳性细胞与CD8阳性细胞的数量比为1:(4～8)；

优选地，步骤(4)所述共培养中，细胞培养密度为(1.0～1.5)×10⁶cells/cm²；

优选地，在步骤(4)所述共培养的过程中，在培养基中加入IL-21、IL-2、IL-7或IL-15中的任意一种或至少两种的组合；

优选地，步骤(4)所述共培养的具体操作步骤为：将CD14阳性细胞与CD8阳性细胞混合，加入浓度为20～30ng/mL的IL-21，培养48～72h后，加入5～15ng/mL的IL-2、5～15ng/mL的IL-7和5～15ng/mL的IL-15，培养48～72h，而后更换培养基并补加IL-2、IL-7和IL-15，继续培养，得到细胞毒性T细胞。

9.根据权利要求7或8所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：

(1)合成肿瘤新生抗原多肽，所述肿瘤新生抗原多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1～26中的任意一项所示；

(2)分选外周血单个核细胞，得到CD8阳性细胞和CD14阳性细胞；

10.如权利要求1或2所述的肿瘤新生抗原多肽或如权利要求6中所述的细胞毒性T细胞在制备TCR-T细胞或肿瘤治疗药物中的应用。