CN112694519A - 抗原、核酸、表达载体、抗原呈递细胞和细胞毒性t细胞及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种抗原、核酸、表达载体、抗原呈递细胞和细胞毒性T细胞及其应用。该抗原包括下述多肽片段或与下述多肽片段具有至少80％的序列同一性的多肽片段：A‑X1‑S‑K‑W‑V‑G‑K‑X2，其中，X1是L或M，X2是V、L或I。上述抗原可以诱导产生对肝癌细胞具有特异性杀伤的细胞毒性T细胞。

Description

抗原、核酸、表达载体、抗原呈递细胞和细胞毒性T细胞及其 应用

技术领域

本发明涉及免疫治疗技术领域，特别是涉及一种抗原、核酸、表达载体、抗原呈递细胞和细胞毒性T细胞及其应用。

背景技术

肝癌是目前全球第五大常见恶性肿瘤。肝癌的主要致病因素包括：乙型(HBV)和丙型(HCV)肝炎病毒的感染、饮酒过度和食用高脂食物过多诱发的肝硬化、和某些危险致癌物质和环境的感染等。早期肝癌没有明显症状，目前确诊的病例大多处于中晚期，且缺乏有效的治疗措施，预后效果极差。传统的肝癌治疗方法(例如手术切除、局部消融、放疗和化疗)具有较大的局限性：手术切除和局部消融后残留的癌细胞发生转移的概率大，复发率较高；放疗和化疗会严重损伤机体自身的正常细胞，对于中晚期患者很难达到较好的远期及预后疗效。因此，寻找更有效的肝癌治疗方法极为紧迫且具有重大的临床意义。

肿瘤免疫治疗是一种有可能彻底清除癌细胞的方法，弥补了传统疗法的弊端，被认为是二十一世纪肿瘤综合治疗模式中最有发展前途的一种治疗手段。2010年，肿瘤免疫疗法首次在黑色素瘤中大获成功。自此，针对免疫抑制分子PD-1、程序性细胞死亡-配体1(PD-L1)和细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(CTLA-4)的单克隆抗体相继获批上市。但研究发现在其他实体瘤中，例如中晚期肝癌，由于抗体治疗引发的免疫耐受以及肿瘤细胞内相关分子介导的复杂炎症信号通路等原因，其临床治疗效果并不理想。

发明内容

基于此，有必要提供一种抗原，以改善目前肝癌的治疗效果。

一种抗原，所述抗原包括下述多肽片段或与下述多肽片段具有至少80％的序列同一性的多肽片段：A-X1-S-K-W-V-G-K-X2，其中，X1是L或M，X2是V、L或I。

上述抗原能够诱导对肝癌细胞具有特异性杀伤的细胞毒性T细胞。通过该细胞毒性T细胞特异性杀伤肝癌细胞，可以改善目前肝癌的治疗效果。

一种核酸，含有用于编码上述的抗原的核酸序列。

在其中一个实施例中，所述核酸包含如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。

一种表达载体，包含上述的核酸。

一种抗原呈递细胞，由上述的抗原诱导具有抗原呈递能力的细胞得到。

在其中一个实施例中，所述具有抗原呈递能力的细胞为树突细胞。

一种细胞毒性T细胞的诱导剂，包括上述的抗原、上述的核酸、上述的表达载体或上述的抗原呈递细胞。

一种细胞毒性T细胞，经上述的抗原呈递细胞与T细胞在体外共培养得到。

上述的细胞毒性T细胞在制备治疗肝癌的药物中的应用。

一种用于治疗肝癌的药物，包括活性成分，所述活性成分包括上述的细胞毒性T细胞。

附图说明

图1为实施例1的EliSpot Assay的斑点结果；

图2为实施例1的EliSpot Assay的统计结果；

图3为实施例2中的置换效率的标准曲线；

图4为实施例2中的四聚体的流式结果；

图5为用四聚体检测实施例2中的用TPST1抗原刺激后的T细胞的流式结果；

图6为实施例3中的乳酸脱氢酶LDH杀伤实验的结果。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使本发明公开内容更加透彻全面。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。

在肿瘤免疫细胞疗法中，细胞毒性T淋巴细胞(即CTL细胞)免疫疗法因毒副作用小，针对性强，持久性好，适应症广等良好特性而被广泛研究。CTL细胞免疫疗法可以利用患者自身静脉血的淋巴细胞，在体外通过靶细胞抗原和淋巴因子的诱导，分化扩增成具有强大杀伤力的CTL细胞，再经静脉回输体内，从而有效地发挥免疫效应，促使其发挥杀伤杀死肿瘤细胞的功能。在肝癌的CTL细胞免疫疗法中，目前还缺乏特异性强的肝癌的抗原。

本发明一实施方式提供了一种抗原，该抗原包括氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的多肽片段。具体地，如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列为：A-X1-S-K-W-V-G-K-X2，其中，X1是L或M，X2是V、L或I。本文氨基酸序列中的A、S、K、W、V、G、L、M和I均是本领域技术人员熟知的氨基酸的简写符号。

在一个可选地具体示例中，上述抗原包括氨基酸序列为ALSKWVGKV(SEQ ID NO:3)的多肽片段。也即是如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列中X1是L，X2是V。在一个可选地具体示例中，上述抗原包括氨基酸序列为AMSKWVGKL(SEQ ID NO:4)的多肽片段。也即是如SEQID NO:2所示的氨基酸序列中X1是M，X2是L。在另一个可选地具体示例中，上述抗原包括氨基酸序列为AMSKWVGKV(SEQ ID NO:5)的多肽片段。也即是如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列中X1是M，X2是V。在一个可选地具体示例中，上述抗原包括氨基酸序列为ALSKWVGKI(SEQID NO:6)的多肽片段。也即是如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列中X1是L，X2是I。在一个可选地具体示例中，上述抗原包括氨基酸序列为ALSKWVGKL(SEQ ID NO:7)的多肽片段。也即是如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列中X1是L，X2是L。

进一步地，上述抗原为氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示的多肽。

在一些实施例中，上述抗原包括与氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的多肽片段具有至少80％序列同一性的多肽片段。进一步地，上述抗原包括与氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的多肽片段具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的多肽片段。

上述抗原为肝癌的新生抗原(Neoantigen)或其变体，经验证，上述抗原能够成功诱导特异性识别肝癌细胞的CTL，并且其免疫原性、负载抗原CTL细胞的阳性率及其在细胞体外实验中的杀伤效能高。

本发明一实施方式还提供了一种核酸，该核酸含有用于编码上述任一实施例的抗原的核酸序列。该核酸可以用于构建表达载体，转染宿主细胞，进而生产上述抗原。在本文中，核酸序列包含其保守置换的变体(例如简并密码子的置换)和互补序列。术语“核酸”和“多核苷酸”是同义的，包含基因、cDNA分子、mRNA分子以及它们的片段例如寡核苷酸。在一个可选地具体示例中，核酸包含如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。具体地，如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列为：5’-GCTCTATCAAAATGGGTTGGGAAGGTA-3’。

本发明一实施方式还提供了一种载体。具体地，该载体是由上述核酸或其片段插入到合适的空载体中以形成携带有上述核酸的克隆载体或表达载体。更具体地，空载体可以是质粒、噬菌体、黏粒、微型染色体或病毒，也可以是只在特定细胞中瞬时表达的裸DNA。进一步地，上述克隆载体能够自发的复制，因此能够为用于随后克隆的高水平表达或高水平复制目的提供高拷贝数。表达载体可以包括用于驱动上述核酸片段表达的启动子，可选的编码使所述核酸片段的表达产物分泌或整合到膜上的信号肽的核酸序列以及可选的编码终止子的核酸序列。当在生产菌株或细胞系中操作表达载体时，载体引入到宿主细胞中时可以整合到宿主细胞的基因组中，也可以不能被整合到宿主细胞基因组中。当然，空载体通常携带复制位点，以及能够在转化细胞中提供表型选择的标记序列。

本发明一实施方式还提供了一种宿主细胞，该宿主细胞包含有上述核酸或表达载体。该宿主细胞可以是用于增殖上述核酸和载体，也可以用于重组制备表达上述抗原的培养细胞或细胞系。上述宿主细胞可以是微生物如细菌(如大肠杆菌、芽抱杆菌等)，也可以来自多细胞生物如真菌、昆虫细胞、植物细胞或哺乳动物细胞。在一个可选地具体示例中，宿主细胞为哺乳动物的细胞，例如CHO细胞。

本发明一实施方式提供了一种抗原呈递细胞的制备方法，该制备方法包括以下步骤：将上述任一实施例的抗原与具有抗原呈递能力的细胞在体外接触。当上述抗原与具有抗原呈递能力的细胞在体外接触后，通过具有抗原呈递能力的细胞胞吞抗原，并经其胞内的溶酶体修饰成具有免疫原性的抗原肽后，与内质网中合成的MHC I类抗原结合形成复合物，并展示到抗原呈递细胞的表面，便于T细胞识别并发生免疫反应。具体地，具有抗原呈递能力的细胞可以树突细胞(DC细胞)。

更具体地，上述抗原呈递细胞的制备方法包括将上述抗原与具有抗原呈递能力的细胞共培养。在一些实施例中，在将上述抗原与具有抗原呈递能力的细胞共培养的过程中，还包括添加细胞因子的操作，例如添加GM-CSF、LPS、IL-4、IFN-γ等。通过添加细胞因子，刺激具有抗原呈递能力的细胞的成熟。

需要说明的是，在一些实施例中，上述抗原呈递细胞的制备方法包括以下步骤：将上述任一实施例的抗原与具有抗原呈递能力的细胞在体内接触。

本发明一实施方式还提供了一种抗原呈递细胞，该抗原呈递细胞由上述抗原呈递细胞的制备方法制得。

本发明一实施方式提供了一种细胞毒性T细胞的诱导剂，该细胞毒性T细胞的诱导剂包括上述任一实施例的抗原、上述任一实施例的核酸、上述任一实施例的表达载体或上述任一实施例的抗原呈递细胞。

上述抗原和上述抗原呈递细胞具有诱导外周血淋巴细胞产生细胞毒性或淋巴因子的作用，上述核酸可以编码上述抗原、上述表达载体含有能编码上述抗原的核酸序列。因此，上述抗原、上述抗原呈递细胞、上述核酸和上述表达载体均可以作为细胞毒性T细胞的诱导剂的组分。

本发明一实施方式还提供了一种细胞毒性T细胞的制备方法，该制备方法包括以下步骤：将上述抗原呈递细胞与T细胞在体外接触。

具体地，将上述任一实施例的抗原呈递细胞与T细胞共培养。在其中一个实施例中，上述细胞毒性T细胞的制备方法包括以下步骤：将上述任一实施例的抗原呈递细胞和CD8阳性T细胞共培养。上述抗原呈递细胞与CD8阳性T细胞共培养时，通过T细胞的受体特异性地识别抗原呈递细胞的表面MHC I类抗原与修饰后的抗原形成的复合物而激活T细胞，进而刺激T细胞产生免疫反应，释放细胞因子杀伤肿瘤细胞。

进一步地，上述细胞毒性T细胞的制备方法包括以下步骤：分选外周血淋巴细胞中的DC细胞和T细胞；将上述任一实施例的抗原与DC细胞共培养，以诱导DC细胞的表面形成MHC I类抗原与修饰后的上述任一实施例的抗原的复合物；将上述抗原诱导后的DC细胞与T细胞共培养，以使诱导后的DC细胞将上述抗原递呈给T细胞，进而使得T细胞被诱导成能够特异性识别并杀伤肝癌细胞的细胞毒性T细胞。当然，在一些实施例中，在将抗原诱导后的DC细胞与T细胞共培养的过程中，包括添加细胞因子的操作。例如添加IL-21、IL-2、IL-7及IL-15等。

在一个可选地具体示例中，在将抗原诱导后的DC细胞与T细胞共培养的过程中，抗原诱导后的DC细胞与T细胞的数量之比为1：(4～8)。含有抗原诱导后的DC细胞的细胞悬液与含有T细胞的细胞悬液的体积之比为1：1。抗原诱导后的DC细胞与T细胞共培养的培养密度为1.0×10⁶个/cm²～1.5×10⁶个/cm²。进一步地，在将抗原诱导后的DC细胞与T细胞共培养的过程中，抗原诱导后的DC细胞与T细胞的数量之比为1：4、1：4.5、1：5、1：6、1：7或1：8。

上述细胞毒性T细胞的制备方法操作简捷。

本发明一实施方式还提供了一种细胞毒性T细胞，该细胞毒性T细胞由上述细胞毒性T细胞的制备方法制得。

上述细胞毒性T细胞能够特异性识别和杀伤肝癌细胞。

本发明一实施方式还提供了一种特异性结合上述抗原的抗体。该抗体可以特异性地结合上述抗原，可以应用于肝癌的诊断中。例如，一种检测肝癌的新生抗原的试剂盒，包括上述抗体。上述抗体可以采用本领域的常规方法制备，例如单克隆抗体制备技术。在一个可选地具体示例中，上述抗体是能与氨基酸序列为ALSKWVGKV的多肽特异性结合的多肽。

本发明一实施方式还提供了上述抗原、上述核酸、上述表达载体、上述抗原呈递细胞或上述细胞毒性T细胞在制备治疗肝癌的药物中的应用。

本发明一实施方式还提供了一种用于治疗肝癌的药物，该药物包括活性成分，该活性成分包括上述细胞毒性T细胞。当然，在一些实施例中，用于治疗肝癌的药物还包括药学上可以接受的辅料。

具体实施例

以下结合具体实施例进行详细说明。以下实施例如未特殊说明，则不包括除不可避免的杂质外的其他组分。实施例中采用药物和仪器如非特别说明，均为本领域常规选择。实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规条件，例如文献、书本中所述的条件或者生产厂家推荐的方法实现。以下实施例中FBS指胎牛血清，PBS指磷酸缓冲液。

实施例1

1.设计并合成抗原：

(1)根据生物信息学软件预测出HLA-A0201分型的肝癌人群中的多个人高频突变位点，并对这几个位点对应的突变位点进行了多肽-MHC亲和性预测后，得到两条亲和力最强的新生抗原TPST1和SUCNR(氨基酸序列如表1所示)；同时发现，TPST1的氨基酸序列中的第二位和第九位的突变后的多肽对多肽-MHC也有强的亲和性，TPST1突变后的氨基酸序列如表1所示。查阅文献获得HBV相关的阳性多肽作为抗原(氨基酸序列具体见表1中HBV_04所对应的氨基酸序列)，以比较筛选出的抗原与病毒相关性的抗原的免疫原性；查阅文献获得肝癌高表达的相关多肽作为抗原(氨基酸序列具体见表1中GPC3_144–152所对应的氨基酸序列)，以比较筛选出的抗原与肿瘤高表达的相关抗原多肽的免疫原性。

表1

表1中，“PSSM”是Position Specific ScoringMyopathy的缩写，指位置特异性得分矩阵，用于下一步特征提取的过程中作为比对的模板；“EPIC”是Emulsion,PairedIsolation and Concatenation的缩写，指乳化，成对分离和连接，用于探究单个细胞内的特定功能基因；“NetMHC”指运用人工神经网络预测MHC I型分子的亲和性的软件；“NetMHCpan”用于预测肽段与MHC I型分子的亲和性的软件；“NetMHCpan4”指整合亲和力(binding affinity，BA)和质谱数据(MS)，从两个不同的角度获得更多的信息的软件；“PSSMHCpan”、“PickPocket”及“SMM”均是对新抗原进行预测的软件；“Count”是指采用上述六个软件进行预测时有多个软件测出的值小于500；“Score”是上述六个软件中最小的分析值，分析值越小越好，小于500为阳性的结果，如果大于500表示没有预测出来。

(2)根据表1中各抗原的氨基酸序列信息合成表1中的各抗原。

2.抗原的效果的验证

将PBMC细胞用特异性磁珠和MS柱对CD8阳性T细胞和DC细胞进行分选，分选之后先培养DC细胞(加入IL-4和GM-CSF细胞因子)，相应细胞因子(加入IL-4、GM-CSF、LPS和IFN-γ细胞因子)刺激成熟24h，之后分别用表1中的抗原刺激DC细胞。然后将DC细胞与CD8阳性T细胞共培养一周(IL-21培养72h，之后使用IL-2、IL-7和IL-15培养)。在CD8阳性T细胞刺激成熟之后收集并做EliSpot Assay检测，通过分泌的IFN-γ产生紫色斑点的情况观察多肽是否具有免疫原性，具体实验步骤如下：

2.1 DC细胞和T细胞的分选

(1)购买冻存的人外周血单核细胞(Peripheral blood monocyte cells，PBMCs，购于上海妙顺生物科技有限公司)，复苏之后用1640培养基清洗一遍，300g离心5min，计数。然后使用1640培养基+10％FBS在37℃孵育6～12h。

(2)孵育结束后，300g离心5min，并用MACS缓冲液(下文简写为MACS)重悬，计数。根据数量加入相应的CD14磁珠(20μL/10⁷个细胞)和MACS buffer(80μL/10⁷个细胞)，4℃，孵育15min，每5分钟摇一次。

(3)取出步骤(2)中加入CD14磁珠和MACS并孵育后的混合物，用20mL MACS清洗一遍，300g离心10min，用MACS重悬，过MS柱子(用1mL MACS润洗一遍)，滤过的滤液含有CD14阴性细胞。将细胞悬液滤过之后用1mL MACS清洗承装细胞悬液的离心管一次，并用1mL MACS清洗柱子两次，最后取下MS柱子，用活塞猛推出的为CD14阳性细胞即DC细胞。接着半量换液，培养基的组成为CG-DC+5％FBS+10ng/mL IL-4+86ng/mL GM-CSF。本文中的“CG-DC”是CG-DC培养基的简写，本文中的CG-DC培养基购自德国Cell Genix公司。

(4)将步骤(3)得到的CD14阴性细胞计数，并加入相应体积的CD8磁珠(20μL/10⁷个细胞)和MACS(80μL/10⁷个细胞)，4℃，孵育15min，每5分钟摇一次；

(5)将步骤(4)孵育结束后的混合物取出，用20mL MACS清洗一遍，300g离心10min，并用MACS重悬，过MS柱子(用1mL MACS润洗一遍)，滤过的为CD8阴性细胞。细胞悬液滤过之后用1mL MACS清洗旧管一次，并用1mL MACS清洗柱子两次，用活塞猛推出的为CD8阳性细胞，即T细胞，计数并用CS10冻存液冻存。

2.2 DC细胞和T细胞的培养

(1)第一天：磁珠分选之后，DC细胞计数约1×10⁷个，使用CG-DC+5％FBS+10ng/mLIL-4+86ng/mL GM-CSF的培养基重悬，1mL/孔，置于12孔板中培养，共12孔，培养48h。

(2)第三天：每孔补充CG-DC+5％FBS+20ng/mL IL-4+176ng/mL GM-CSF培养基500μL(原来培养基的1/2体积，双倍的细胞因子浓度)，培养48h。

(3)第五天：配制CG-DC+5％FBS+10ng/mL IL-4+86ng/mL GM-CSF+10ng/mL LPS+10ng/mL IFN-γ培养基。将培养的细胞全量换液，300g离心10min，使用配制的CG-DC+5％FBS+10ng/mL IL-4+86ng/mL GM-CSF+10ng/mL LPS+10ng/mL IFN-γ培养基重悬，培养24h。同时，复苏2.1DC细胞和T细胞的分选中步骤(5)中的T细胞，使用CG-DC+5％FBS+10ng/mLIL-7培养基重悬。

(4)第六天：将DC细胞分别负载表1中相应的抗原(10μg/mL)，37℃，CO₂培养箱培养16h。

2.3 DC细胞和T细胞的共培养

(1)第七天(在2.2DC细胞和T细胞的培养的基础上继续计算)：待抗原负载完成后，将负载有抗原的DC细胞和2.2DC细胞和T细胞的培养中步骤(3)中复苏的T细胞在CG-DC+5％FBS+IL-21的培养基中共培养，两种细胞的数量比为：DC细胞：T细胞＝1:4～1:8，体积比1：1，培养密度为1.0×10⁶个/cm²～1.5×10⁶个/cm²，培养基中IL-21的终浓度为30ng/mL，培养72h。

(2)第十天：3天后加入IL-2(IL-2在培养基中的终浓度为10ng/mL)、IL-7(IL-7在培养基中的终浓度为10ng/mL)和IL-15(IL-15在培养基中的终浓度为10ng/mL)，培养72h；

(3)第十三天：半量换液，并补加细胞因子IL-2(IL-2在培养基中的终浓度为10ng/mL)、IL-7(IL-7在培养基中的终浓度为10ng/mL)和IL-15(IL-15在培养基中的终浓度为10ng/mL)，保证细胞密度在1×10⁶/mL左右，培养48h。

(4)D16：全量换液，并补加细胞因子IL-2(IL-2在培养基中的终浓度为10ng/mL)、IL-7(IL-7在培养基中的终浓度为10ng/mL)和IL-15(IL-15在培养基中的终浓度为10ng/mL)。

2.4 EliSpot assay实验

(1)第二十天(在2.3DC细胞和T细胞的共培养的基础上继续计算)：复苏HLA-0201分型的T2细胞(下文简称T2细胞)，T2细胞(IMDM+10％FBS)，300g离心5min，计数。

(2)第二十二天：收集T2细胞，300g离心5min，计数用无血清IMDM重悬细胞，加入1.5mL EP管，分别负载相应抗原(10μg/mL)作为实验组；单独设置一组为阴性对照组：在T2细胞中加入DMSO(体积与抗原的体积一致)，实验组和对照组的细胞均在37℃培养4h。

(3)4h后，收集负载过抗原的T2细胞，并用CG-DC+2％FBS培养基重悬，调整细胞浓度为5×10⁴个/mL；PBS洗EliSpot板5次，150μL/孔，每5min洗一次，之后加入IMDM+10％FBS，100μL/孔，37℃，30min；取待检测的T细胞样品(2.3DC细胞和T细胞的共培养的步骤(4)获得的T细胞，下文简称2.3(4)中的T细胞)，用CG-DC+2％FBS培养基重悬，调整细胞浓度为2×10⁵个/mL；取出加了IMDM+10％FBS的EliSpot板，在干净的纸巾上拍掉液体，按照铺板顺序加入T2细胞和2.3(4)中的T细胞各100μL/孔，同时加入阴性对照组，37℃，16h。

(4)第二十三天：除去EliSpot板上的细胞，PBS洗EliSpot板5次，150μL/孔，每5min洗一次；然后加入配制好的7-b6-1-ALP抗体(配制PBS+0.5％FBS，1：200加入抗体，0.22μm过滤)，100μL/孔，37℃，孵育2h。

(5)除去一抗，PBS洗EliSpot板5次，150μL/孔，每5min洗一次，加入NBT/BCIP避光显色2-8min，100μL/孔；观察，水冲洗。用烘箱烘干后，拍照并用AID读数仪计每个孔板的紫色斑点数，整理并统计。结果如图1～图2所示。

由图1和图2可知，在TPST1组、SUCNR组、HBV_04组和GPC3_144–152组中，TPST1组的IFN-γ斑点数最多，且其与阴性对照组存在极显著差异。由此可知，TPST1组所采用的抗原相对病毒相关性抗原(HBV_04)和肿瘤相关性抗原(GPC3_144–152)具有更高的免疫原性。

实施例2

为了评估实施例1的表1中的氨基酸序列为ALSKWVGKV的抗原(即TPST1抗原)能够通过DC等抗原呈递细胞，将抗原呈递给CD8⁺T细胞，并且激活产生相应的抗原特异性CTL细胞，进行了相应四聚体染色检测抗原特异性CTL细胞的阳性率。其中四聚体置换试剂盒(QuickSwitch^TM，PE染色)购买MBL生物公司，具体步骤如下：

1.四聚体置换实验：

(1)用DMSO制备2mg/mL置换用的TPST1抗原溶液和阳性多肽标准品溶液。

(2)将50μL的四聚体加入圆底96孔板。

(3)将1μL步骤(1)制备的多肽溶液分别加入圆底96孔板的不同孔中，并用移液器混匀。

(4)在步骤(3)加有多肽溶液的孔中加入多肽置换因子1μL，并用移液器混匀；避光于室温下孵育4h；然后于4℃避光保存。

2.四聚体置换效率检测：

(1)在锥形底96孔板上将孔编号1～5，并在孔1～5的中加入20μL捕获磁珠。

(2)将5μL的1×检测缓冲液加入孔2，5μL未置换的四聚体加入孔1和孔3，将已置换的四聚体加入孔4和孔5。

(3)用锡纸包裹96孔板，并将96孔板置于平板摇床上，550rpm室温振荡45min。

(4)振荡结束后，将1×检测缓冲液加入孔1～5，每孔150μL清洗，将96孔板置于磁力板上静置5min，静置后弃上清，保持96孔板置于磁力板上状态下，用涡旋混匀器搅拌2秒，然后将96孔板从磁力板上取下。

(5)将1×抗体-FITC(试剂盒四聚体中多肽的特异性抗体)各25μL加入孔2～5，将1×检测缓冲液加入孔1中；

(6)用锡纸包裹96孔板，并将96孔板置于平板摇床上，550rpm室温振荡45min。

(7)振荡结束后，将1×检测缓冲液加入孔1～5，每孔150μL清洗，将96孔板置于磁力板上静置5min，静置后弃上清，保持96孔板置于磁力板上状态下，用涡旋混匀器搅拌2秒钟，然后将96孔板从磁力板上取下。

(8)将1×检测缓冲液加入孔6，再加入5μL捕获磁珠并混匀。

(9)将所有孔的液体转移到流式管中，置于冰上，之后上流式细胞分析仪检测四聚体中多肽的荧光强度，计算出多肽的置换效率，其中，置换效率的标准曲线如图3所示，流式结果如图4所示，置换效率结果如表2所示。

表2

由表2可知，TPST1抗原的置换效率为92.63％(大于75％)，说明该抗原置换成功，四聚体可用于后续检测。

3.抗原特异性细胞毒性T细胞的阳性率检测：

(1)收集成熟的效应细胞(即2.3(4)中T细胞，细胞数大约在2×10⁶个)于1.5mL离心管中，400g离心5min。

(2)弃步骤(1)离心后的上清，使用PBS(0.5％FBS)重悬细胞，每管200μL。

(3)加入四聚体-PE(各2μL)及CD8表面抗体-FITC(1：1000)染色，4℃孵育30min(还准备一支双阴，一支单染PE和一支单染FITC的细胞)。

(4)孵育结束之后，每管加入PBS(0.5％FBS)各400μL清洗，400g离心5min，弃上清。

(5)每管再加入PBS(0.5％FBS)各400μL清洗，400g，离心5min。

(6)每管加入300μL PBS(0.5％FBS)重悬，并转移到流式管，置于冰上，之后上流式细胞分析仪检测细胞的荧光强度。结果如图5所示，图5中Q2象限即为抗原特异性细胞毒性T细胞的阳性细胞。

由图5可知，用TPST1抗原刺激后的T细胞可以用四聚体检测出1.32％的阳性新生抗原特异性T细胞。

实施例3

为了评估实施例1的表1中的氨基酸序列为ALSKWVGKV的抗原(即TPST1抗原)诱导的CTL具有体外细胞杀伤能力，进行了乳酸脱氢酶LDH杀伤实验：

选取实施例1的EliSpot Assay实验中筛选出的具有免疫原性的抗原(TPST1抗原)，采用乳酸脱氢酶检测试剂盒(LDH Assay Kit)进行靶细胞杀伤性能测试。乳酸脱氢酶(LDH)是活细胞胞浆内含酶之一，在正常情况下，不能透过细胞膜。当靶细胞T2受到效应细胞CTL的攻击而损伤时，细胞膜通透性改变，LDH可释放至介质中，释放出来的LDH在催化乳酸生成丙酮酸的过程中，使氧化型辅酶I(NAD+)变成还原型辅酶I(NADH2)，后者再通过递氢体-吩嗪二甲酯硫酸盐(PMS)还原碘硝基氯化氮唑蓝(INT)或硝基氯化四氮唑蓝(NBT)形成有色的甲簪类化合物，在490nm波长处有一高吸收峰，使用酶标仪读取的OD值，经过计算即可得靶细胞活性，从而检测抗原多肽的杀伤性能。具体操作步骤如下：

1.取T2细胞(HLA-0201分型的T2细胞)，计数，用无血清IMDM重悬，实验组负载TPST1抗原，对照组加入等体积的DMSO替代TPST1抗原，抗原浓度为10μg/mL(抗原在培养基中的浓度)，37℃，负载4h。

2.4h后，离心T2细胞，用培养基(CG-DC+5％FBS)重悬T2细胞，调整浓度至2×10⁵个/mL。

3.取效应细胞(即，2.3(4)中的T细胞)，按照表3示意的铺板方案，效靶比为5:1(效应细胞与负载有抗原的T2细胞的个数之比为5：1，E：T＝5：1)进行培养(CG-DC+5％FBS)稀释。

表3

表3中，①为实验组(50μL 2.3(4)中的T细胞+50μL靶细胞)；②效应细胞自然释放(50μL 2.3(4)中的T细胞+50μL培养基)；③靶细胞自然释放(50μL靶细胞+50μL培养基)；④靶细胞的最大释放(50μL 2.3(4)中的T细胞+50μL靶细胞+10μL裂解液)；⑤体积校正(100μL培养液+10μL裂解液)；⑥培养液对照(100μL培养液)。

4.用圆底96孔板进行铺板，此时，所有孔终体积为100μL。

5.将步骤4的96孔板在37℃，5％CO₂培养箱中培养4h。其中，在培养3.5h时，加入10μL的Lysis buffer到靶细胞最大释放组和体积校正组；

6.孵育结束离心96孔板，250g离心4min；取上清50μL/孔至检测用的平底96孔板，避免气泡。

7.加入50μL/孔的Substrate Mix(用完放-20℃保存)；室温，避光反应30min；

8.加入50μL/孔Stop solution，轻拍混匀(避免气泡)；

9.检查孔内，用注射器戳破气泡，于全波长读数仪上读取吸收光490nm。

10.计算杀伤率(％)：将所有实验组和对照组减去背景平均值作为校正，并将校正后的值用于杀伤效率计算。其中，细胞杀伤率(％)＝[(实验组释放-效应细胞自发释放-靶细胞自发释放)/(靶细胞最大释放-靶细胞自发释放)]×100％。结果如图6所示。

由图6可知，TPST1抗原诱导刺激后的CTL细胞具有体外细胞杀伤能力，在效靶比为5:1时，杀伤效率为92.9％，与对照组相比具有显著差异。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

序列表

<110> 南方科技大学

<120> 抗原、核酸、表达载体、抗原呈递细胞和细胞毒性T细胞及其应用

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gctctatcaa aatgggttgg gaaggta 27

<210> 2

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Ala Xaa Ser Lys Trp Val Gly Lys Xaa

1 5

<210> 3

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Ala Leu Ser Lys Trp Val Gly Lys Val

1 5

<210> 4

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Ala Met Ser Lys Trp Val Gly Lys Leu

1 5

<210> 5

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Ala Met Ser Lys Trp Val Gly Lys Val

1 5

<210> 6

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

Ala Leu Ser Lys Trp Val Gly Lys Ile

1 5

<210> 7

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

Ala Leu Ser Lys Trp Val Gly Lys Leu

1 5

<210> 8

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

Phe Leu Phe Thr Leu Pro Met Leu Ile

1 5

<210> 9

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

Gly Leu Ser Pro Thr Val Trp Leu Ser Val

1 5 10

<210> 10

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

Phe Val Gly Glu Phe Phe Thr Asp Val

1 5

Claims (10)

1.一种抗原，其特征在于，所述抗原包括下述多肽片段：A-X1-S-K-W-V-G-K-X2，其中，X1是L或M，X2是V、L或I。

2.一种核酸，其特征在于，含有用于编码权利要求1所述的抗原的核酸序列。

3.根据权利要求2所述的核酸，其特征在于，所述核酸包含如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。

4.一种表达载体，其特征在于，包含权利要求2或3所述的核酸。

5.一种抗原呈递细胞，其特征在于，由权利要求1所述的抗原诱导具有抗原呈递能力的细胞得到。

6.根据权利要求5所述的抗原呈递细胞，其特征在于，所述具有抗原呈递能力的细胞为树突细胞。

7.一种细胞毒性T细胞的诱导剂，其特征在于，包括权利要求1所述的抗原、权利要求2或3所述的核酸、权利要求4所述的表达载体或权利要求5所述的抗原呈递细胞。

8.一种细胞毒性T细胞，其特征在于，经权利要求5或6所述的抗原呈递细胞与T细胞在体外共培养得到。

9.权利要求8所述的细胞毒性T细胞在制备治疗肝癌的药物中的应用。

10.一种用于治疗肝癌的药物，其特征在于，包括活性成分，所述活性成分包括权利要求8所述的细胞毒性T细胞。

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