CN110184238A - 一种靶向kras多发突变肿瘤的特异性ctl细胞的制备方法及应用 - Google Patents

一种靶向kras多发突变肿瘤的特异性ctl细胞的制备方法及应用 Download PDF

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张嵘
周子珊
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Abstract

本发明提供了一种靶向KRAS多发突变肿瘤的特异性CTL的制备方法，属于肿瘤治疗技术领域，所述制备方法包括以下步骤：1)将突变多肽KRAS‑12D、KRAS‑12C、KRAS‑12V、KRAS‑12A、KRAS‑12S、KRAS‑13D和KRAS‑61H进行混合，得到KRAS突变多肽混合液；2)将DC加入到步KRAS突变多肽混合液中，进行培养，得到抗原递呈细胞；3)将抗原递呈细胞和外周血单个核细胞进行共培养，获得靶向KRAS多发突变肿瘤的特异性CTL。本发明的方法通过同时提呈上述7种KRAS突变抗原，制备得到的CTL能够特异性识别7种KRAS突变抗原。

Description

一种靶向KRAS多发突变肿瘤的特异性CTL细胞的制备方法及 应用
技术领域
本发明涉及肿瘤治疗技术领域，尤其涉及一种靶向KRAS多发突变肿瘤的特异性CTL细胞的制备方法及应用。
背景技术
ras基因家族与人类肿瘤相关的基因有三种：HRAS、KRAS突变和 NRAS，分别定位在11、12和1号染色体上。KRAS突变因编码21kD的ras 蛋白又名p21基因。在ras基因中，KRAS突变对人类癌症影响最大，当KRAS 突变正常时能控制调控细胞生长的路径；发生异常时，则导致细胞持续生长，并阻止细胞自我毁灭。它参与细胞内的信号传递，当KRAS突变基因突变时，该基因永久活化，不能产生正常的ras蛋白，使细胞内信号传导紊乱，细胞增殖失控而癌变。
肠癌患者中，KRAS突变，是对靶向药抗药的原因之一。因此，KRAS 突变患者很难从靶向药中获益，生存期短，因此，迫切需要开发针对KRAS 突变的免疫细胞治疗手段。现有技术中的CTL多是针对单一靶向KRAS突变的CTL，但是由于KRAS突变位点不固定，单一靶向KRAS突变的CTL 往往治疗效果并不理想。
发明内容
本发明的目的在于提供一种靶向KRAS多发突变肿瘤的特异性CTL细胞的制备方法及应用，该方法制备得到的CTL能够识别7种KRAS突变抗原。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种靶向KRAS多发突变肿瘤的特异性CTL的制备方法，包括以下步骤：
1)将突变多肽KRAS-12D、KRAS-12C、KRAS-12V、KRAS-12A、 KRAS-12S、KRAS-13D和KRAS-61H进行混合，得到KRAS突变多肽混合液；
2)将DC加入到步骤1)所述KRAS突变多肽混合液中，进行培养，得到抗原递呈细胞；
3)将步骤2)所述抗原递呈细胞和外周血单个核细胞进行共培养，获得靶向KRAS多发突变肿瘤的特异性CTL；
所述KRAS-12D、KRAS-12C、KRAS-12V、KRAS-12A、KRAS-12S、 KRAS-13D和KRAS-61H的氨基酸序列如SEQ ID NO.1～7所示。
优选的，步骤1)所述KRAS突变多肽混合液中KRAS-12D的浓度为 4～6μg/mL、KRAS-G13D的浓度为8～12μg/mL、KRAS-G12V的浓度为 8～12μg/mL、KRAS-G12C的浓度为8～12μg/mL、KRAS-G12S的浓度为 18～22μg/mL、KRAS-G12A的浓度为8～12μg/mL、KRAS-Q61H的浓度为 1～3μg/mL。
优选的，步骤2)所述培养的温度为35～40℃；所述培养的时间为4～12h。
优选的，步骤2)所述DC采用以下方法制备获得：
a)分析某一肠癌患者的HLA分型和KRAS突变序列组合的亲和力，选择亲和力最高的组合合成融合基因；
b)将步骤a)中合成的融合基因连接到表达载体上获得重组载体；
c)将步骤b)所述重组载体转入健康来源的单核细胞，进行诱导培养获得靶向KRAS突变的DC。
优选的，所述亲和力最高的组合为HLA-A0206和KRAS-G12D。
优选的，步骤3)所述抗原递呈细胞和外周血单个核细胞的数量比为 1:100～600。
优选的，步骤3)所述共培养的温度为35～40℃；所述共培养的时间为 12～16d；所述共培养的CO2体积浓度为4％～6％。
优选的，步骤3)所述共培养采用的培养液包括OKM-100和体积百分含量为12％的FBS。
本发明还提供了上述方案所述制备方法制备得到的靶向KRAS多发突变肿瘤的特异性CTL。
本发明还提供了上述方案所述靶向KRAS多发突变肿瘤的特异性CTL 在制备治疗KRAS多发突变肿瘤疾病的药物中的应用。
本发明的有益效果：本发明提供了一种靶向KRAS多发突变肿瘤的特异性CTL的制备方法，该方法通过同时提呈包括KRAS-12D、KRAS-12C、 KRAS-12V、KRAS-12A、KRAS-12S、KRAS-13D和KRAS-61H在内的7 种KRAS突变抗原，制备得到的CTL能够特异性识别上述7种KRAS突变抗原。
附图说明：
图1为KRAS-G12D与PBMC的结合曲线；
图2为KRAS-G12S与PBMC的结合曲线；
图3为KRAS-G12C与PBMC的结合曲线；
图4为KRAS-G12A与PBMC的结合曲线；
图5为KRAS-G12V与PBMC的结合曲线；
图6为KRAS-G13D与PBMC的结合曲线；
图7为KRAS-Q61H与PBMC的结合曲线；
图8为KRAS突变多肽刺激CTL释放IFN-gamma的水平；
图9为KRAS-G12D刺激CTL释放IFN-gamma的细胞比例；
图10为KRAS-G12V刺激CTL释放IFN-gamma的细胞比例；
图11为KRAS-G12S刺激CTL释放IFN-gamma的细胞比例；
图12为KRAS-G12V刺激CTL释放IFN-gamma的细胞比例；
图13为KRAS-G12V刺激CTL释放IFN-gamma的细胞比例；
图14为KRAS-G12A刺激CTL释放IFN-gamma的细胞比例；
图15为KRAS-Q61H刺激CTL释放IFN-gamma的细胞比例。
具体实施方式
本发明提供了一种靶向KRAS多发突变肿瘤的特异性CTL的制备方法，包括以下步骤：
1)将突变多肽KRAS-12D、KRAS-12C、KRAS-12V、KRAS-12A、 KRAS-12S、KRAS-13D和KRAS-61H进行混合，得到KRAS突变多肽混合液；
2)将DC加入到步骤1)所述KRAS突变多肽混合液中，进行培养，得到抗原递呈细胞；
3)将步骤2)所述抗原递呈细胞和外周血单个核细胞进行共培养，获得靶向KRAS多发突变肿瘤的特异性CTL；
所述KRAS-12D、KRAS-12C、KRAS-12V、KRAS-12A、KRAS-12S、 KRAS-13D和KRAS-61H的氨基酸序列如SEQ ID NO.1～7所示。
本发明首先将突变多肽KRAS-12D、KRAS-12C、KRAS-12V、 KRAS-12A、KRAS-12S、KRAS-13D和KRAS-61H进行混合，得到KRAS 突变多肽混合液。
本发明中，KRAS-12D、KRAS-12C、KRAS-12V、KRAS-12A、KRAS-12S、 KRAS-13D和KRAS-61H优选的由金斯瑞生物科技有限公司进行合成；所述 KRAS突变多肽混合液中KRAS-12D的浓度优选为4～6μg/mL，更优选为 5μg/mL；KRAS-G13D的浓度优选为8～12μg/mL，更优选为10μg/mL； KRAS-G12V的浓度优选为8～12μg/mL，更优选为10μg/mL；KRAS-G12C 的浓度优选为8～12μg/mL，更优选为10μg/mL；KRAS-G12S的浓度优选为 18～22μg/mL，更优选为20μg/mL；KRAS-G12A的浓度优选为8～12μg/mL，更优选为10μg/mL；KRAS-Q61H的浓度优选为1～3μg/mL，更优选为2μg/mL。
本发明中，所述KRAS突变多肽混合液的溶剂优选为RPMI-1640培养基。本发明对所述混合的温度和时间没有特殊限制，以混合均匀为准。
本发明具体实施过程中，设置每种KRAS突变多肽的浓度梯度(0μg/mL、 2μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL和50μg/mL)，分析不同浓度的KRAS 突变多肽与HLA的结合情况，根据KRAS突变多肽与PBMC的结合曲线，选择与HLA结合20％时的浓度，以1640将各KRAS多肽进行混合。本发明选择与HLA结合20％时的浓度能够保证每种抗原都能够与HLA结合充分。
得到KRAS突变多肽混合液后，将DC加入到KRAS突变多肽混合液中，进行培养，得到抗原递呈细胞；所述培养的温度优选为35～40℃，更优选为 37℃；所述培养的时间优选为4～12h；所述培养的设备优选为5％CO2培养箱。
本发明对所述DC的来源没有特殊限制，本发明具体实施过程中，所述 DC优选的采用以下方法制备获得：
a)分析某一肠癌患者的HLA分型和KRAS突变序列组合的亲和力，选择亲和力最高的组合合成融合基因；
b)将步骤a)中合成的融合基因连接到表达载体上获得重组载体；
c)将步骤b)所述重组载体转入健康来源的单核细胞，进行诱导培养获得靶向KRAS突变的DC。
本发明首先分析某一肠癌患者的HLA分型和KRAS突变序列组合的亲和力，选择亲和力最高的组合合成融合基因；所述亲和力最高的组合优选为 HLA-A0206和KRAS-G12D。
得到合成的融合基因后，本发明将合成的融合基因连接到表达载体上获得重组载体，本发明对所述重组载体的制备方法没有特殊限定，采用本领域常规的重组载体的制备方法即可。
得到重组载体后，将重组载体转入健康来源的单核细胞，进行诱导培养获得靶向KRAS突变的DC。在本发明中，所述重组载体转入健康来源的单核细胞的方法优选的电击转化法。在本发明中，所述健康来源的单核细胞为外周血单个核细胞(PBMC)。
得到抗原递呈细胞后，本发明将抗原递呈细胞和外周血单个核细胞进行共培养，获得靶向KRAS多发突变肿瘤的特异性CTL；所述抗原递呈细胞和外周血单个核细胞的数量比优选为1:100～600，更优选为1:500；所述共培养的温度优选为35～40℃，更优选为37℃；所述共培养的时间优选为12～16d，更优选为14～15d；所述共培养的CO2体积浓度优选为4％～6％，更优选为5％；所述共培养采用的培养液优选的包括OKM-100和体积百分含量为12％的 FBS。
本发明对所述共培养的方式没有特殊限制，采用本领域常规方法即可。
本发明还提供了上述方案所述制备方法制备得到的靶向KRAS多发突变肿瘤的特异性CTL在制备治疗KRAS多发突变肿瘤疾病的药物中的应用。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
1.选择KRAS突变序列：
KRAS-12D：TEYKLVVVGADGVGKSALTIQ
KRAS-12C：TEYKLVVVGACGVGKSALTIQ
KRAS-12V：TEYKLVVVGAVGVGKSALTIQ
KRAS-12A：TEYKLVVVGAAGVGKSALTIQ
KRAS-12S：TEYKLVVVGASGVGKSALTIQ
KRAS-13D：EYKLVVVGAGDVGKSALTIQL
KRAS-61H：CLLDILDTAGHEEYSAMRDQY
2.合成KRAS突变多肽：
多肽有金斯瑞生物科技有限公司进行合成，合成多肽的要求：98％纯度，带FITC荧光标签，每种多肽以1640进行溶解，浓度为1mg/mL，备用。
3.KRAS突变多肽与PBMC上HLA的结合曲线
1)取30mLPBMC，2000rpm离心5min；
2)细胞用20mLPBS重悬并计数后，2000rpm离心5min，以1.5mL PBS 重悬使细胞浓度为2×107cells/mL；
3)取50μL细胞(106个)分别加入0、3.2、6.3、12.5、25、50μL 1mg/mL 的荧光标记的KRAS突变多肽，最后以PBS补齐至100μL，在37℃避光孵育1h；
4)再加入800μLPBS，2000rpm离心10min；
5)再以1mLPBS洗一次，最后以500μL PBS重悬，流式细胞仪检测荧光信号；
6)每种KRAS突变多肽设置0、2、5、10、20和50几个浓度，分析不同浓度的KRAS突变多肽，与HLA的结合情况。KRAS-G12D与PBMC的结合曲线参见图1；KRAS-G12S与PBMC的结合曲线参见图2；KRAS-G12C 与PBMC的结合曲线参见图3；KRAS-G12A与PBMC的结合曲线参见图4；KRAS-G12V与PBMC的结合曲线参见图5；KRAS-G13D与PBMC的结合曲线参见图6；KRAS-Q61H与PBMC的结合曲线参见图7。
4.KRAS突变多肽组合浓度的确定：
根据KRAS突变多肽与PBMC的结合曲线，选择与HLA结合20％时的浓度，以1640将各KRAS多肽进行混合，确定KRAS突变多肽的浓度如下： KRAS-G12D 5μg/mL、KRAS-G13D 10μg/mL、KRAS-G12V 10μg/mL、 KRAS-G12C 10μg/mL、KRAS-G12S 20μg/mL、KRAS-G12A 10μg/mL、KRAS-Q61H 2μg/mL。
实施例2以混合抗原负载DC
1)单采血，分离PBMC；
2)将PBMC以培养基1640+10％FBS调整至1×106细胞/mL，至于培养皿中，于37℃5％CO2培养箱，静止过夜；
3)以培养基X-VIVO+1％人血白蛋白对贴在培养皿底部的细胞进行吹打，收集贴壁的单核细胞；计数，调整至1×106细胞/mL，至于平皿中，加入1000IU/mL IL-4和800IU/mLGM-CSF，于37℃5％CO2培养箱；
4)培养3天后，离心收集成熟的DC，以5mL KRAS突变多肽混合液重选，至于37℃5％CO2培养箱，冲击12h；
5)2000rpm离心5min，收集DC，以OKM100+12％FBS重悬备用。
实施例3制备靶向KRAS突变的特异性CTL细胞
1)OKM-25预铺板，10μL OKM-25+1mL PBS，1mL/孔(6孔板)室温 4h，4℃备用；
2)新鲜PBMC，或冻存PBMC提前拿1天复苏，离心，以 OKM100+12％FBS重悬后计数，并至于铺有OKM25的6孔板中；
3)按照500：1(PBMC：APC)的比例加入抗原递呈细胞，终体积为4mL，晃匀，37℃5％CO2培养，记为Day 0；
4)观察共培养细胞情况，适当补充培养液，根据细胞密度，在Day5左右，将共培养细胞转移至大培养瓶中，补新鲜的培养液OKM-100+12％FBS， 20mL于75cm2培养瓶中；
5)根据细胞生长情况补充培养液OKM-100+12％FBS；细胞密度维持在 1～2×106/mL；
6)Day10左右，当培养体积扩增至200mL时，需转入T175培养瓶，则开始补充培养液OKM200+5％；
7)共培养Day 14可获得靶向多种KRAS突变的CTL。
实施例4检测CTL对不同KRAS突变抗原的反应
1)CTL培养至14天时，1500rpm离心5min，收集T-cells，加入10mL PBS 重悬细胞并计数，1500rpm离心5min，收集T-cells以1640+10％FBS+200 U/mL IL2重悬，计数调整至1×106cells/mL；
2)以排枪将T-cells分至96孔平底板中，200μL/孔，细胞数为2×105cells；再分别加入10μL 1mg/mL的突变多肽，终浓度为50μg/mL，每条多肽设置3 复孔；
3)设置阳性对照：T-cells+100ng/mL OKT3；阴性对照： 1640+10％FBS+200U/mLIL2；一个T-cells对照作为本底释放检测；
4)37℃、5％CO2刺激24h后，1500rpm离心10min，转移140μL上清至新的96孔板中；
5)再将96孔板进行离心，1500rpm 10min，取样品进行ELISA检测。
T细胞在遇到可以识别的抗原时，将特异性的释放IFN-gamma，因此，检测T细胞是否释放IFN-gamma是评价，T细胞对抗原是否有特异性反应的标准；以制备的CTL分别以KRAS突变多肽进行刺激，检测释放 IFN-gamma的释放，结果如图8，可以看出，与T细胞的本底释放相比，制备的CTL对7种KRAS突变多肽均有特异性反应，且IFN-gamma的释放水平相似。
实施例5检测靶向不同KRAS突变的特异性T细胞的比例
1)CTL培养至14天时，1500rpm 5min离心收集T-cells，以1640+10％FBS+200U/mLIL2重悬，计数调整至1×106cells/mL，将细胞分至 6孔板中，3mL/孔；每孔30μL 5mg/mLKRAS突变多肽(终浓度为50μg/mL)；
3)37℃5％CO2培养24h；
4)加入BrefeldinA，收集细胞，进行IFN-γ、CD8染色，并以流式细胞仪检测细胞比例。
以制备的CTL分别以KRAS突变多肽进行刺激，检测释放IFN-gamma 的细胞比例，结果如图9～15，其中图9为KRAS-G12D刺激CTL释放 IFN-gamma的细胞比例；图10为KRAS-G12V刺激CTL释放IFN-gamma 的细胞比例；图11为KRAS-G12S刺激CTL释放IFN-gamma的细胞比例；图12为KRAS-G12V刺激CTL释放IFN-gamma的细胞比例；图13为 KRAS-G12V刺激CTL释放IFN-gamma的细胞比例；图14为KRAS-G12A 刺激CTL释放IFN-gamma的细胞比例；图15为KRAS-Q61H刺激CTL释放IFN-gamma的细胞比例。
可以看出，CTL中对7种KRAS突变抗原的特异性T细胞(CD8+和 IFN-gamma+的细胞)比例略有不同(KRAS-G12D：9.5％；KRAS-G12V： 7.3％；KRAS-G12S：7.1％；KRAS-G12V：8.9％；KRAS-G12V：6.5％； KRAS-G12A：13.9％；KRAS-Q61H：4.9％)，但都有特异性识别的T细胞，这也说明，经过科学配比后，制备的CTL可以识别7种KRAS突变抗原。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 北京鼎成肽源生物技术有限公司
<120> 一种靶向KRAS多发突变肿瘤的特异性CTL细胞的制备方法及应用
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> PRT
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 1
Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala Asp Gly Val Gly Lys Ser
1 5 10 15
Ala Leu Thr Ile Gln
20
<210> 2
<211> 21
<212> PRT
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 2
Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala Cys Gly Val Gly Lys Ser
1 5 10 15
Ala Leu Thr Ile Gln
20
<210> 3
<211> 21
<212> PRT
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 3
Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala Val Gly Val Gly Lys Ser
1 5 10 15
Ala Leu Thr Ile Gln
20
<210> 4
<211> 21
<212> PRT
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 4
Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala Ala Gly Val Gly Lys Ser
1 5 10 15
Ala Leu Thr Ile Gln
20
<210> 5
<211> 21
<212> PRT
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 5
Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala Ser Gly Val Gly Lys Ser
1 5 10 15
Ala Leu Thr Ile Gln
20
<210> 6
<211> 21
<212> PRT
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 6
Glu Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala Gly Asp Val Gly Lys Ser Ala
1 5 10 15
Leu Thr Ile Gln Leu
20
<210> 7
<211> 21
<212> PRT
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 7
Cys Leu Leu Asp Ile Leu Asp Thr Ala Gly His Glu Glu Tyr Ser Ala
1 5 10 15
Met Arg Asp Gln Tyr
20

Claims (10)

1.一种靶向KRAS多发突变肿瘤的特异性CTL的制备方法，包括以下步骤：
1)将突变多肽KRAS-12D、KRAS-12C、KRAS-12V、KRAS-12A、KRAS-12S、KRAS-13D和KRAS-61H进行混合，得到KRAS突变多肽混合液；
2)将DC加入到步骤1)所述KRAS突变多肽混合液中，进行培养，得到抗原递呈细胞；
3)将步骤2)所述抗原递呈细胞和外周血单个核细胞进行共培养，获得靶向KRAS多发突变肿瘤的特异性CTL；
所述KRAS-12D、KRAS-12C、KRAS-12V、KRAS-12A、KRAS-12S、KRAS-13D和KRAS-61H的氨基酸序列如SEQ ID NO.1～7所示。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤1)所述KRAS突变多肽混合液中KRAS-12D的浓度为4～6μg/mL、KRAS-G13D的浓度为8～12μg/mL、KRAS-G12V的浓度为8～12μg/mL、KRAS-G12C的浓度为8～12μg/mL、KRAS-G12S的浓度为18～22μg/mL、KRAS-G12A的浓度为8～12μg/mL、KRAS-Q61H的浓度为1～3μg/mL。
3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，步骤2)所述培养的温度为35～40℃；所述培养的时间为4～12h。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤2)所述DC采用以下方法制备获得：
a)分析某一肠癌患者的HLA分型和KRAS突变序列组合的亲和力，选择亲和力最高的组合合成融合基因；
b)将步骤a)中合成的融合基因连接到表达载体上获得重组载体；
c)将步骤b)所述重组载体转入健康来源的单核细胞，进行诱导培养获得靶向KRAS突变的DC。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述亲和力最高的组合为HLA-A0206和KRAS-G12D。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤3)所述抗原递呈细胞和外周血单个核细胞的数量比为1:100～600。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤3)所述共培养的温度为35～40℃；所述共培养的时间为12～16d；所述共培养的CO2体积浓度为4％～6％。
8.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤3)所述共培养采用的培养液包括OKM-100和体积百分含量为12％的FBS。
9.权利要求1～8任意一项所述制备方法制备得到的靶向KRAS多发突变肿瘤的特异性CTL。
10.权利要求9所述靶向KRAS多发突变肿瘤的特异性CTL在制备治疗KRAS多发突变肿瘤疾病的药物中的应用。
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