CN102060910A - 锌转运蛋白8的hla-a*0201限制性ctl表位及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物医药领域，特别涉及锌转运蛋白8的HLA-A^*0201限制性CTL表位及其应用，该CTL表位的氨基酸序列如SEQ ID No.1、SEQ ID No.2或SEQ ID No.3所示，其能够有效结合HLA-A^*0201分子，二者之间具有高亲和力，所形成的复合物稳定，而且能够有效激发特异性的CTL应答，分泌高水平的IFN-γ，并对负载相应表位的T2细胞具有高效杀伤能力，可用于制备1型糖尿病治疗性肽疫苗，在1型糖尿病的临床免疫治疗领域有着潜在、良好的开发应用前景。

Description

锌转运蛋白8的HLA-A*0201限制性CTL表位及其应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，涉及一种抗原蛋白的细胞毒性T细胞(CTL)表位，特别涉及1型糖尿病(T1DM)主要自身抗原锌转运蛋白8(ZnT8)的HLA-A^*0201限制性CTL表位，还涉及该CTL表位的应用。 

背景技术

T1DM是由淋巴细胞介导的以胰岛β细胞特异性损伤导致胰岛素生成绝对不足为特征的一种自身免疫性疾病，多发生于儿童和青少年，起病急，如不及时治疗可引发累及心、肝、肾、神经、眼等重要组织器官的严重并发症，是儿童和青少年致残及早亡的主要原因之一。近年来，我国儿童和青少年患T1DM的人数逐年递增，T1DM正在成为危害我国儿童和青少年健康的主要疾病。T1DM目前以胰岛素终身替代疗法和非特异性免疫抑制为主要治疗手段，治疗费用高昂且副作用大，因此急需建立一种特异性免疫干预治疗策略。 

ZnT8又称SLC30A8，是SLC30(solute-linked carrier 30)基因编码的阳离子扩散辅助(CDF)家族的一个新成员，主要以二聚体形式定位于β细胞胰岛素分泌/储存性囊泡膜上，介导锌离子从胞浆至囊泡的转运，参与胰岛素的合成、储存和分泌的调节。大鼠胰岛素瘤INS-1E细胞实验表明，血糖水平正常情况下只采取补锌措施提高胞外锌离子水平，并不能使胞内锌总含量相应升高，而ZnT8过表达能促进细胞摄取和储存锌离子，增加胞内锌总含量。此外，ZnT8可能在血糖升高刺激的胰岛素分泌过程中发挥关键作用。血糖水平正常时，ZnT8过表达虽可使胞内锌总含量升高，但胰岛素分泌量并不明显增加，而血糖水平升高时，ZnT8过表达可明显使胰岛素分泌量增加，几乎是非过表达ZnT8β细胞的两倍。研究发现，ZnT8与糖尿病的发生、发展密切相关。当ZnT8变异时，锌离子转运功能降低，囊泡内锌离子浓度下降，其参与形成的胰岛素六聚体明显减少，胰岛素储存水平降低，外界高糖刺激下分泌至胞外的胰岛素相应不足；囊泡内锌离子浓度下降还导致囊泡内胰岛素原与胰岛素的比值升高，胞吐作用时胰岛素原不能完全转变为胰岛素，β细胞分泌胰岛素的功能损伤；同时，锌离子转运功能降低使过量锌离子积聚在胞浆中，当达到或超过毒性阈值时可诱发大量β细胞死亡。ZnT8也可作为自身抗原引起T细胞介导的以β细胞受损为特征的自身免疫反应，甚至诱发T1DM。ZnT8引起β细胞自身免疫损伤的可能机制为：ZnT8抗原表位被MHC-I分子提呈，表达在β细胞表面，CD8⁺T细胞识别后经穿孔素依赖性途径和/或Fas/FasL途径杀伤β细胞；β细胞经细胞因子IFN-g 和TNF-α联合诱导后可能表达MHC-II分子，从而将ZnT8抗原表位递呈给CD4+T细胞，后者分泌多种细胞因子，并能激活巨噬细胞发挥细胞毒性作用，最终损伤β细胞。ZnT8还能激活B细胞产生特异性的ZnT8抗体(ZnT8A)，参与诱导β细胞死亡。研究还发现，ZnT8基因rs13266634(R325W)的单核苷酸多态性(SNP)与T1DM抗原抗体特异性和2型糖尿病(T2DM)易感性均存在显著相关性，但其导致β细胞功能异常并最终诱发T1DM和T2DM的分子机制目前尚不清楚。综上，ZnT8过表达可增加囊泡锌储备和胞浆锌总含量并能在血糖升高时促进胰岛素分泌，因此，刺激ZnT8使其合成增加或功能增强有望降低糖尿病患者低锌血症带来的损害，防止胞内锌耗竭引起的β细胞凋亡和/或其诱发的氧化应激损伤；ZnT8具有免疫原性，可作为抗原引起β细胞自身免疫损伤，因此，针对ZnT8研制的相关疫苗或抗体也许可以预防或治疗T1DM。 

大量动物实验证实，给非肥胖性糖尿病(NOD)小鼠口服或接种自身抗原，可以减缓甚至完全阻断T1DM的发生、发展。同时，有愈来愈多的证据表明自身反应性CD8⁺T细胞(即CTL)在T1DM中具有十分重要的致病作用。因此，近年来发展了用CTL表位替代完整自身抗原来诱导免疫耐受的策略。相对于结构复杂的大分子天然抗原，小分子表位肽具有更易诱导免疫耐受、相对安全、易于实现规模化制备和纯化等优点，还可以通过一些氨基酸位点的化学修饰最大限度地增强其免疫调节的能力。已有研究利用自身抗原CTL表位或其改造肽配体(APL)在NOD小鼠体内成功诱导了特异性CTL免疫耐受，对T1DM有一定的防治作用。同时研究报道，T1DM的发生与人类HLA-A^*0201分子密切相关。据统计，约60％的T1DM患者携带HLA-A^*0201等位基因。因此，从自身抗原中筛选出其HLA-A^*0201限制性CTL表位，对人类T1DM的防治研究具有重要意义。 

据发明人所知，ZnT8的HLA-A^*0201限制性CTL表位目前国内外尚未见报道。 

发明内容

有鉴于此，本发明的目的之一在于提供ZnT8的HLA-A^*0201限制性CTL表位，该表位能够有效结合HLA-A^*0201分子，二者之间具有高亲和力，所形成的复合物稳定，而且能够有效激发特异性的CTL应答，分泌高水平的IFN-γ，并能对负载相应表位的靶细胞产生高效杀伤作用。 

为达到此目的，本发明首先采用基于肽与MHC-I分子结合强度的算法BIMAS和SYFPEITHI以及基于蛋白酶体剪切特异性的算法PAProc对ZnT8的HLA-A^*0201限制性CTL表位进行了预测，然后根据预测结果合成了可能的表位肽，并通过以下实验：(1)肽与HLA-A^*0201分子的亲和力检测，(2)肽与HLA-A^*0201分子复合物的稳定性检测，(3)肽 刺激肽特异性CTL杀伤靶细胞的能力和分泌IFN-γ的能力检测，对这些可能的表位肽进行了功能鉴定，最终获得了ZnT8的HLA-A^*0201限制性CTL表位，其氨基酸序列如SEQ ID No.1、SEQ ID No.2或SEQ ID No.3所示，优选氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。 

本发明的目的之二在于提供所述的ZnT8的HLA-A^*0201限制性CTL表位在制药方面的应用。 

为达到此目的，本发明提供如下技术方案：ZnT8的HLA-A^*0201限制性CTL表位可单独或联合其他免疫显性自身抗原CTL表位和/或药学上可接受的载体，按照药学领域的常规方法，制成TIDM治疗性肽疫苗，用于T1DM的临床免疫治疗。 

本发明的有益效果在于：本发明提供了ZnT8的HLA-A^*0201限制性CTL表位，该表位能够有效结合HLA-A^*0201分子，二者之间具有高亲和力，所形成的复合物稳定，而且能够有效激发特异性的CTL应答，分泌高水平的IFN-γ，并对负载相应表位的T2细胞具有高效杀伤能力，可用于制备T1DM治疗性肽疫苗，在T1DM的临床免疫治疗领域有着潜在、良好的开发应用前景。 

附图说明

图1为合成的候选表位肽P1、P2、P3的高效液相色谱图(左)和质谱图(右)。 

图2为候选表位肽P1、P2、P3与HLA-A^*0201分子的亲和力检测结果。 

图3为候选表位肽P1、P2、P3与HLA-A^*0201分子复合物的稳定性检测结果。 

图4为候选表位肽P1、P2、P3刺激肽特异性CTL杀伤靶细胞的能力检测结果。 

图5为候选表位肽P1、P2、P3刺激肽特异性CTL分泌IFN-γ的能力检测结果。 

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步的详细描述。 

一、预测ZnT8的HLA-A^＊0201限制性CTL表位 

根据Genbank登录的人类ZnT8的氨基酸序列(登录号为AAH28419)，结合两种不同方法：基于肽与MHC-I分子结合强度的方法(包括BIMAS和SYFPEITHI两种算法)和基于蛋白酶体剪切特异性的方法(PAProc算法)来预测ZnT8的HLA-A^*0201限制性CTL表位。BIMAS和SYFPEITHI两种算法均是基于量化矩阵来预测肽与MHC-I分子的结合强度。PAProc算法是建立在单层神经网络算法以及体外实验蛋白酶体剪切数据上的，其最大优势在 于区分了组成性蛋白酶体(constitutive proteasome)和免疫蛋白酶体(immunoproteasome)不同的剪切特异性。 

综合BIMAS、SYFPEITHI和PAProc三种算法的预测结果，本发明从人类ZnT8的氨基酸序列中筛选出三条综合得分较高的片段即可能的表位序列：P1：LLIDLTSFL(SEQ IDNo.1)；P2：LLSLFSLWL(SEQ ID No.2)和P3：LLSILCIWV(SEQ ID No.3)。 

二、合成筛选出的候选表位肽 

根据筛选出的可能的表位序列P1、P2和P3，委托上海生工生物工程技术服务有限公司合成相应的候选表位肽P1、P2和P3。合成方案采用标准Fmoc方案，即由去保护和激活交联两个反应反复循环直至合成目的多肽。合成的多肽粗品用高效液相色谱法进行纯化。纯化后的目的多肽经反相高效液相色谱法鉴定纯度均大于95％，经质谱法鉴定分子量与理论值一致(图1)。最后冷冻干燥，温度-70℃保存备用。 

三、候选表位肽与HLA-A^＊0201分子的亲和力检测 

采用HLA-A^*0201表达阳性但内源性抗原肽递呈途径必需的抗原加工相关转运体(TAP)缺陷的T2细胞进行实验。T2细胞表面空载的HLA-A^*0201分子表达极不稳定，呈递后很快降解，而结合了抗原肽的HLA-A^*0201分子表达稳定，且抗原肽与HLA-A^*0201分子的结合力越强，HLA-A^*0201分子的表达量越高。因T2细胞的内源性抗原肽加工处理能力缺失，故T2细胞表面HLA-A^*0201分子的表达量增加直观地反应了外源性抗原肽与HLA-A^*0201分子的结合力。 

实验分为4个大组：P1组(候选表位肽P1)、P2组(候选表位肽P2)、P3组(候选表位肽P3)和阴性对照组(无关表位肽RKKRRQRRR)，每个大组又分为2个小组：10M组和100M组。将3×10⁵个T2细胞接种于1ml含有浓度为10M(10M组)或100M(100M组)的肽(按实验分组加入相应肽，空白对照不加肽而加入对应量的二甲亚砜)以及浓度为10％(w/w)的胎牛血清(FCS)的RPMI 1640培养基中，在温度为37℃、CO₂气体体积分数为5％的条件下培养16小时，用PBS洗涤细胞2次，加入BB7.2杂交瘤细胞分泌的鼠抗人HLA-A^*0201单克隆抗体100μl，4℃培养30分钟，再用PBS洗涤细胞2次，加入按体积比为1∶50稀释的FITC标记的羊抗鼠IgG抗体100μl，4℃培养30分钟，用PBS洗涤并重悬细胞后，用流式细胞仪于波长488nm处测定荧光强度，计算荧光系数(FI)。 

结果如图2所示，可见不管肽浓度为10M或100M，P1组、P2组和P3组的FI值均明显高于阴性对照组，说明候选表位肽P1、P2和P3均能有效结合HLA-A^*0201分子，二者之间具有高亲和力，其中候选表位肽P1与HLA-A^*0201分子的亲和力最高，其次为候选表位肽 P2。 

四、候选表位肽与HLA-A^＊0201分子复合物的稳定性检测 

实验分为4组：P1组(候选表位肽P1)、P2组(候选表位肽P2)、P3组(候选表位肽P3)和阴性对照组(无关表位肽RKKRRQRRR)。将1×10⁶个T2细胞接种于1ml含有浓度为100M的肽(按实验分组加入相应肽，空白对照不加肽而加入对应量的二甲亚砜)以及浓度为10％(w/w)的FCS的RPMI 1640培养基中，在温度为37℃、CO₂气体体积分数为5％的条件下培养16小时，用PBS洗涤细胞2次，再加入无血清RPMI 1640培养基，在温度为37℃、CO₂气体体积分数为5％的条件下继续培养，分别于0、2、4、6、8小时取出细胞，加入BB7.2杂交瘤细胞分泌的鼠抗人HLA-A^*0201单克隆抗体100μl，4℃培养30分钟，用PBS洗涤细胞2次，再加入按体积比为1∶50稀释的FITC标记的羊抗鼠IgG抗体100μl，4℃培养30分钟，用PBS洗涤并重悬细胞后，用流式细胞仪于波长488nm处测定荧光强度，计算肽与HLA-A^*0201分子复合物的半数解离时间(DC50)。 

结果如图3所示，可见P1组、P2组和P3组的DC50值均明显高于阴性对照组，说明候选表位肽P1、P2和P3均能有效结合HLA-A^*0201分子，且二者结合形成的复合物稳定，其中候选表位肽P1与HLA-A^*0201分子的复合物最稳定，其次为候选表位肽P2。 

五、候选表位肽促进特异性的CTL应答 

实验分为4组：P1组(候选表位肽P1)、P2组(候选表位肽P2)、P3组(候选表位肽P3)和阴性对照组(无关表位肽RKKRRQRRR)。 

1、候选表位肽体外诱导肽特异性CTL 

采用聚蔗糖-泛影葡氨分层液密度梯度离心法从HLA-A^*0201阳性健康者的外周血浓缩白细胞中分离出外周血单个核细胞(PBMC)。将PBMC用RPMI 1640培养基在温度37℃、CO₂气体体积分数为5％的条件下孵育2小时，分离非贴壁细胞[主要为淋巴细胞(PBL)]和贴壁细胞[树突状细胞(DC)]。将DC按细胞密度为2×10⁶/3ml加入含有浓度为800IU/ml的集落刺激因子(GM-CSF)、浓度为1000IU/ml的白介素4(IL-4)以及浓度为10％(w/w)的FCS的RPMI 1640培养基，在温度为37℃、CO₂气体体积分数为5％的条件下培养，每2天半量换液并补充GM-CSF和IL-4，第5天加入终浓度为10ng/ml的肿瘤坏死因子(TNF-α)，第7天获得成熟DC。向成熟DC中加入终浓度为10M的肽(按实验分组加入相应肽)，在温度37℃、CO₂气体体积分数为5％的条件下孵育2小时，30Gy放射性处理，获得负载肽的DC。按PBL与DC的数量比为3∶1～6∶1向PBL中加入负载肽的DC，再按PBL细胞密度为1.5×10⁶/2ml加入含有浓度为10ng/ml的白介素7(IL-7)以及浓度为10％(w/w)的FCS的 RPMI 1640培养基，在温度为37℃、CO₂气体体积分数为5％的条件下培养，第11天加入负载肽的DC再次刺激培养的PBL，24～48小时后向细胞培养液中加入浓度为10IU/ml的白介素2(IL-2)并补充IL-7至终浓度为10ng/ml，之后每隔7天按照上述相同方法再次刺激培养的PBL，连续刺激4次，获得肽特异性CTL，用含有浓度为10％(w/w)的FCS的RPMI1640培养基调整至适当浓度，作为效应细胞。 

2、肽特异性CTL对靶细胞的体外杀伤能力检测 

将1×10⁶个T2细胞接种于1ml含有浓度为100M的肽(按实验分组加入相应肽)以及浓度为10％(w/w)的FCS的RPMI 1640培养基中，在温度为37℃、CO₂气体体积分数为5％的条件下培养16小时，获得负载肽的T2细胞，作为靶细胞。将1×10⁶个靶细胞转移至离心管中，用含有浓度为10％(w/w)的FCS的RPMI1640培养基洗涤1次，吸除大部分上清液，剩余约0.1ml培养基于管底，重悬细胞，加入相应量的SiCr溶液，在温度为37℃、CO₂气体体积分数为5％的条件下培养2小时，获得⁵¹Cr标记的靶细胞。在96孔板中，每孔分别按效靶比(E/T)为100∶1、50∶1和25∶1加入效应细胞与上述⁵¹Cr标记的靶细胞，每种效靶比设3个复孔，同时设最大释放孔(用浓度为2mol/L的盐酸替代效应细胞)和最小释放孔[用含有浓度为10％(w/w)的FCS的RPMI1640培养基替代效应细胞]。将96孔板1200r/min离心30秒，温度37℃孵育4小时，向最大释放孔中加入终浓度为2％(w/w)的Triton X-100并吹打混匀，孵育10分钟，再将96孔板1200r/min离心5分钟，分别吸取各孔上清液至SiCr计数管，用计数仪计数，计算不同效靶比时的杀伤率。 

结果如图4所示，可见P1组、P2组和P3组在各效靶比对负载相应肽的T2细胞均有特异性杀伤作用，且随着效靶比增大，特异性杀伤作用逐渐增强，说明候选表位肽P1、P2和P3均能有效激发CTL的细胞毒活性，从而特异性杀伤靶细胞。 

3、肽特异性CTL分泌IFN-γ的能力检测 

采用ELISPOT检测试剂盒(北京达科为生物技术有限公司)进行检测，具体操作参照试剂盒说明书：调整效应细胞密度至1×10⁶/ml，取100μl铺板，加入终浓度为10M的肽(按实验分组加入相应肽)，刺激48小时后去除细胞，按试剂盒说明书依次加入一抗、二抗和显色剂进行反应，显色晾干后读数。 

结果如图5所示，可见P1组、P2组和P3组的斑点数均明显高于阴性对照组，说明候选表位肽P1、P2和P3均具有良好的免疫原性，能够有效激发CTL分泌IFN-γ。 

综合上述实验结果：候选表位肽P1、P2和P3均能够有效结合HLA-A^*0201分子，二者 之间具有高亲和力，所形成的复合物稳定，而且能够有效激发特异性的CTL应答，分泌高水平的IFN-γ，并对负载相应表位的T2细胞具有高效杀伤能力；从而可得出以下结论：序列P1、P2和P3均为ZnT8的HLA-A^*0201限制性CTL表位，相应的合成多肽P1、P2和P3均为ZnT8的HLA-A^*0201限制性CTL表位肽，其可用于制备T1DM治疗性肽疫苗。 

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过参照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述，但本领域的普通技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围。 

Claims (3)

1.锌转运蛋白8的HLA-A^*0201限制性CTL表位，其特征在于：氨基酸序列如SEQ IDNo.1、SEQ ID No.2或SEQ ID No.3所示。

2.根据权利要求1所述的锌转运蛋白8的HLA-A^*0201限制性CTL表位，其特征在于：氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

3.权利要求1所述的锌转运蛋白8的HLA-A^*0201限制性CTL表位在制备1型糖尿病治疗性肽疫苗中的应用。

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