CN103360465B

CN103360465B - 胞质多聚腺苷酸化成分结合蛋白4的hla-a*0201限制性ctl表位及其应用

Info

Publication number: CN103360465B
Application number: CN201310314445.2A
Authority: CN
Inventors: 杨曌; 杨清武
Original assignee: Second Affiliated Hospital of TMMU
Current assignee: Second Affiliated Hospital of TMMU
Priority date: 2013-07-24
Filing date: 2013-07-24
Publication date: 2015-01-28
Anticipated expiration: 2033-07-24
Also published as: CN103360465A

Abstract

本发明公开了胞质多聚腺苷酸化成分结合蛋白4的HLA-A*0201限制性CTL表位，该CTL表位能够以高亲和力结合HLA-A*0201，所形成的复合物稳定，能够诱导肽特异性的CTL应答，刺激肽特异性CTL分泌高水平的IFN-γ，并对胶质瘤细胞产生特异性杀伤效应，从而为中国人群和北美高加索人群中CPEB4表达异常升高的胶质瘤患者提供了免疫治疗的基础，其可用于制备胶质瘤治疗性肽疫苗，在胶质瘤特异性免疫治疗领域有着潜在、良好的开发应用前景。

Description

胞质多聚腺苷酸化成分结合蛋白4的HLA-A*0201限制性CTL表位及其应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，涉及一种抗原细胞毒性T细胞（CTL）表位及其在制药领域中的应用。

背景技术

胶质瘤是最常见的原发性颅内肿瘤，约占中枢神经系统肿瘤的31%，且近30年来发生率逐年递增。其中，恶性胶质瘤（WHO分类III、IV级）约占所有胶质瘤的77.5%，是34岁以下肿瘤患者的第二位死亡原因，其5年病死率在全身肿瘤中列第三位，仅次于胰腺癌和肺癌。胶质瘤最大的生物学特性是肿瘤细胞呈浸润性生长，难以清除完全，术后易复发。目前治疗的主流方案是以手术为主的综合治疗，即先行手术切除肿瘤，术后加以放疗、化疗、生物靶向治疗等辅助治疗。

肿瘤特异性免疫治疗由于不伤及无关正常组织，是近年来发展迅速的肿瘤治疗方法。其基本原理是肿瘤抗原多肽在抗原提呈细胞（APC）的作用下以MHC-I-肽复合物的形式被提呈于APC表面（与MHC-I类分子结合的抗原多肽被定义为CTL表位），CTL通过其T细胞受体特异识别APC表面的MHC-I-肽复合物而得以活化，最终特异识别存在于肿瘤细胞表面的抗原多肽而特异杀伤肿瘤细胞。因此，寻求特异肿瘤抗原及其相应的CTL表位是肿瘤特异性免疫治疗的关键。

胞质多聚腺苷酸化成分结合蛋白（CPEBs）是一组介导mRNA胞质多聚腺苷酸化和翻译的RNA结合蛋白。近年来，人们发现其在大多数肿瘤细胞中有异常表达现象。胞质多聚腺苷酸化成分结合蛋白4（CPEB4）是CPEBs家族中的一员。文献报道，CPEB4能激活与肿瘤发育有关的数百个基因，将健康细胞变成癌细胞，因此抑制CPEB4有望为治疗癌症开辟全新途径。

由于HLA-A*0201是中国人群最为常见的HLA-I类分子的型别，阳性率高达50%，同时也是北美高加索人种最常见的HLA-I类分子的型别，阳性率高达98%。因此，鉴定出肿瘤特异抗原的HLA-A*0201限制性CTL表位，将会为中国人群和北美高加索人群中的恶性肿瘤患者提供免疫治疗的基础。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的之一在于提供CPEB4的HLA-A*0201限制性CTL表位，从而为中国人群和北美高加索人群中CPEB4表达异常升高的恶性肿瘤患者提供免疫治疗的基础；目的之二在于提供CPEB4的HLA-A*0201限制性CTL表位在制药领域中的应用。

为达到上述目的，经研究，本发明提供如下技术方案：

1.CPEB4的HLA-A*0201限制性CTL表位，其氨基酸序列如SEQ ID No.1、SEQ ID No.2或SEQ ID No.3所示。

2.CPEB4的HLA-A*0201限制性CTL表位在制备胶质瘤治疗性肽疫苗中的应用。

本发明的有益效果在于：本发明提供了CPEB4的HLA-A*0201限制性CTL表位，该CTL表位能够以高亲和力结合HLA-A*0201，所形成的复合物稳定，能够诱导肽特异性的CTL应答，刺激肽特异性CTL分泌高水平的IFN-γ，并对胶质瘤细胞产生特异性杀伤效应，从而为中国人群和北美高加索人群中CPEB4表达异常升高的胶质瘤患者提供了免疫治疗的基础，其可用于制备胶质瘤治疗性肽疫苗，在胶质瘤特异性免疫治疗领域有着潜在、良好的开发应用前景。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：

图1为CTL表位P1与HLA-A*0201的复合物模型。

图2为CTL表位P2与HLA-A*0201的复合物模型。

图3为CTL表位P3与HLA-A*0201的复合物模型。

图4为CTL表位P1的分子动力学模拟构象。

图5为CTL表位P2的分子动力学模拟构象。

图6为CTL表位P3的分子动力学模拟构象。

图7为CTL表位肽P1、P2、P3与HLA-A*0201的亲和力检测结果。

图8为CTL表位肽P1、P2、P3与HLA-A*0201的复合物稳定性检测结果。

图9为CTL表位肽P1、P2、P3刺激肽特异性CTL杀伤靶细胞的能力检测结果。

图10为CTL表位肽P1、P2、P3刺激肽特异性CTL分泌IFN-γ的能力检测结果。

具体实施方式

下面将结合附图，对CPEB4的HLA-A*0201限制性CTL表位的结构及其活性进行详细的描述。

本发明提供的CPEB4（Genbank登录号为NP_085130.2）的HLA-A*0201限制性CTL表位有3个，分别命名为P1、P2、P3，各自对应的氨基酸序列如下：

P1：LLINGQSSL（SEQ ID No.1）；

P2：LLFQDESSV（SEQ ID No.2）；

P3：SLESSLIDI（SEQ ID No.3）。

在ABI431A型固相多肽合成仪上采用标准芴甲氧羰基（Fmoc）方案合成上述CTL表位肽P1、P2、P3，合成表位肽的纯度均达到95%以上。

实施例1、CTL表位P1、P2、P3与HLA-A*0201的复合物模型及CTL表位P1、P2、P3的分子动力学模拟构象

运用Silicon graphics工作站及Insight II软件包中的Discover3模块（采用CVFF力场），分别对CTL表位P1、P2、P3与HLA-A2.1的复合物进行分子动力学模拟。HLA-A*0201的初始坐标来自于蛋白质晶体结构数据库（Protein Data Bank）登录的流感病毒蛋白M1_58-66（T细胞表位）与HLA-A*0201的复合物模型（登录号为1HH I），CTL表位P1、P2、P3是运用Bioploymer模块对1HH I中的M1_58-66进行氨基酸替换而得。分子动力学模拟过程如下：第一步，将HLA-A*0201与β2m固定，运用最陡下降法对CTL表位进行2000步优化计算，再用共扼梯度法优化，直到能量均方根误差（RMS）小于1.0187K/J.mol；第二步，在CTL表位与HLA-A*0201复合物周围加一层的水分子，再固定复合物对水分子进行2000步能量优化，以消除水分子之间以及水分子与蛋白质之间的不合理接触；第三步，对溶液状态下的CTL表位与HLA-A*0201复合物进行能量最小化计算，非键相互作用采用的截断值，先后运用最陡下降法和共扼梯度法优化，直到能量RMS小于1.0187K/J.mol；第四步，在298K的恒定温度下进行20皮秒的分子动力学计算；第五步，对动力学优化得到的最后构象进行分子力学优化5000步，获得CTL表位与HLA-A*0201复合物的最终构象。最后，借助Homology模块，计算3个CTL表位的肽链第2位（P2’）和第9位（P9’）的氨基酸残基锚定间距等结合参数。

CTL表位P1、P2、P3与HLA-A*0201的复合物模型分别见图1-3。CTL表位P1、P2、P3的分子动力学模拟构象分别见图4-6。3个CTL表位的P2’、P9’锚定间距均在范围内，满足大部分HLA-A*0201限制性CTL表位的锚定间距在范围的要求。3个CTL表位与HLA-A*0201结合槽的氨基酸残基之间均形成5个以上的稳定氢键。

实施例2、CTL表位肽P1、P2、P3与HLA-A*0201的亲和力检测

实验分为4组：CTL表位肽P1组、CTL表位肽P2组、CTL表位肽P3组和阴性对照组（无关表位肽AAVEEVRAL）。将3×10⁵个T2细胞接种于1ml含有100mol/L表位肽（按实验分组加入相应表位肽）和10%(w/w)的胎牛血清（FCS）的RPMI 1640培养基中，在温度37℃、CO₂气体体积分数为5%的条件下培养16小时，用PBS洗涤细胞2次，加入BB7.2杂交瘤细胞分泌的鼠抗人HLA-A*0201单克隆抗体100μL，4℃培养30分钟，再用PBS洗涤细胞2次，加入按体积比为1:50稀释的FITC标记的羊抗鼠IgG抗体100μL，4℃培养30分钟，用PBS洗涤并重悬细胞后，用流式细胞仪于波长488nm处测定荧光强度，计算荧光系数（FI）。

结果如图7所示，CTL表位肽P1组、P2组和P3组的FI值均明显高于阴性对照组，说明CTL表位肽P1、P2、P3均能以高亲和力结合HLA-A*0201。

实施例3、CTL表位肽P1、P2、P3与HLA-A*0201的复合物稳定性检测

实验分为4组：CTL表位肽P1组、CTL表位肽P2组、CTL表位肽P3组和阴性对照组（无关表位肽AAVEEVRAL）。将1×10⁶个T2细胞接种于1ml含有100mol/L表位肽（按实验分组加入相应表位肽）和10%(w/w)FCS的RPMI 1640培养基中，在温度37℃、CO₂气体体积分数为5%的条件下培养16小时，用PBS洗涤细胞2次，再加入无血清RPMI 1640培养基，在温度37℃、CO₂气体体积分数为5%的条件下继续培养，分别于0、2、4、6、8小时取出细胞，加入BB7.2杂交瘤细胞分泌的鼠抗人HLA-A*0201单克隆抗体100μL，4℃培养30分钟，用PBS洗涤细胞2次，再加入按体积比为1:50稀释的FITC标记的羊抗鼠IgG抗体100μL，4℃培养30分钟，用PBS洗涤并重悬细胞后，用流式细胞仪于波长488nm处测定荧光强度，计算表位肽与HLA-A*0201复合物的半数解离时间（DC50）。

结果如图8所示，CTL表位肽P1组、P2组和P3组的DC50值均明显高于阴性对照组，说明CTL表位肽P1、P2、P3与HLA-A*0201的复合物均具有较高的稳定性。

实施例4、CTL表位肽P1、P2、P3促进特异性CTL应答检测

实验分为4组：CTL表位肽P1组、CTL表位肽P2组、CTL表位肽P3组和阴性对照组（无关表位肽AAVEEVRAL）。

1、CTL表位肽体外诱导特异性CTL

采用聚蔗糖-泛影葡氨分层液密度梯度离心法从HLA-A*0201阳性健康者的外周血浓缩白细胞中分离出外周血单个核细胞（PBMC）。将PBMC用RPMI 1640培养基在温度37℃、CO₂气体体积分数为5%的条件下孵育2小时，分离非贴壁细胞和贴壁细胞，非贴壁细胞主要为淋巴细胞（PBL），贴壁细胞为树突状细胞（DC）。将所得DC细胞按密度为2×10⁶/3ml加入含有800IU/mL集落刺激因子（GM-CSF）、1000IU/mL白介素4（IL-4）和10%(w/w)FCS 的RPMI 1640培养基中，在温度37℃、CO₂气体体积分数为5%的条件下培养，每2天半量换液并补充GM-CSF和IL-4，第5天加入终浓度为10ng/mL的肿瘤坏死因子（TNF-α），第7天获得成熟DC细胞。向成熟DC细胞中加入终浓度为10mol/L的表位肽（按实验分组加入相应表位肽），在温度37℃、CO₂气体体积分数为5%的条件下孵育2小时，行30Gy放射性处理，获得负载表位肽的DC细胞。将PBL细胞按密度为1.5×10⁶/2ml加入含有10ng/mL白介素7（IL-7）和10%(w/w)FCS的RPMI 1640培养基中，按PBL与DC的数量比为3:1～6:1加入负载表位肽的DC细胞，在温度37℃、CO₂气体体积分数为5%的条件下培养，第11天加入负载表位肽的DC细胞再次刺激，继续培养24～48小时后向培养液中加入10IU/ml白介素2（IL-2）并补充IL-7，之后每隔7天按照上述相同方法加入负载表位肽的DC细胞进行刺激，连续刺激4次，获得肽特异性CTL，用含有10%(w/w)FCS的RPMI1640培养基调整至适当浓度，作为效应细胞。

2、肽特异性CTL对胶质瘤细胞的体外杀伤能力检测

将1×10⁶个胶质瘤细胞U251转移至离心管中，加入含有10%(w/w)FCS的RPMI1640培养基洗涤细胞，然后吸除大部分培养基，剩余约0.1mL于管底，重悬细胞，加入⁵¹Cr溶液，在温度37℃、CO₂气体体积分数为5%的条件下培养2小时，获得⁵¹Cr标记的靶细胞。在96孔板中，每孔分别按效靶比（E/T）为100∶1、50∶1和25∶1加入效应细胞与上述⁵¹Cr标记的靶细胞，每种效靶比设3个复孔，同时设最大释放孔（用2mol/L盐酸替代效应细胞）和最小释放孔（用含有10%(w/w)FCS的RPMI1640培养基替代效应细胞），然后将96孔板1200r/min离心30秒，37℃孵育4小时，向最大释放孔中加入终浓度为2%(w/w)的Triton X-100并吹打混匀，孵育l0分钟，再将96孔板1200r/min离心5分钟，分别吸取各孔上清液至SiCr计数管，用计数仪计数，计算不同效靶比时的杀伤率。

结果如图9所示，CTL表位肽P1组、P2组和P3组在各效靶比对U251细胞均有特异性杀伤作用，且随着效靶比增大，特异性杀伤作用逐渐增强，说明CTL表位肽P1、P2、P3均能有效激发CTL的细胞毒活性，从而特异性杀伤靶细胞。

3、肽特异性CTL分泌IFN-γ的能力检测

采用ELISPOT检测试剂盒（购自美国SIGMA公司）进行检测，具体操作参照试剂盒说明书：调整效应细胞密度至1×10⁶/mL，取100μL铺板，加入终浓度为10mol/L的表位肽（按实验分组加入相应表位肽），刺激48小时后去除细胞，按试剂盒说明书依次加入一抗、二抗和显色剂进行反应，显色晾干后读数。

结果如图10所示，CTL表位肽P1组、P2组和P3组的斑点数均明显高于阴性对照组，说明CTL表位肽P1、P2、P3均具有良好的免疫原性，能够有效激发CTL分泌IFN-γ。

综合上述实验结果：CTL表位肽P1、P2、P3均能以高亲和力结合HLA-A*0201，所形成的复合物稳定，能够诱导肽特异性的CTL应答，刺激肽特异性CTL分泌高水平的IFN-γ，并对胶质瘤细胞产生特异性杀伤效应，可用于制备胶质瘤治疗性肽疫苗。

最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。

Claims

1.胞质多聚腺苷酸化成分结合蛋白4的HLA-A*0201限制性CTL表位，其特征在于，氨基酸序列如SEQ ID No.1、SEQ ID No.2或SEQ ID No.3所示。

2. 权利要求1所述胞质多聚腺苷酸化成分结合蛋白4的HLA-A*0201限制性CTL表位在制备胶质瘤治疗性肽疫苗中的应用。