CN105859866B - Fap来源的抗肿瘤ctl表位肽p265及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物化学领域中的多肽技术领域，具体涉及一种FAP来源的抗肿瘤CTL表位肽P265及其在制备肿瘤治疗性多肽疫苗中的应用。所述抗肿瘤CTL表位肽P265为九肽，分子量1040.18，具体为：FIIDTTYPA。本发明中，我们利用90%以上的上皮性肿瘤高表达而正常组织中几乎不表达的特异性抗原FAP，根据其一级结构，对FAP进行HLA‑A2限制性的CTL表位进行了预测与筛选，确定这一种CTL表位肽能够与HLA‑A2分子产生较强的结合能力，且可有效激活特异性CTL反应，具有成为治疗性肿瘤多肽疫苗的可行性。

Description

FAP来源的抗肿瘤CTL表位肽P265及其应用

技术领域

本发明属于生物化学领域中的多肽技术领域，具体涉及一种FAP来源的抗肿瘤CTL表位肽P265及其应用。

背景技术

成纤维细胞激活蛋白(Fibroblast Activation Protein α，FAP)存在于肿瘤基质成纤维细胞中，于1986年首次发现，1990年正式命名为FAP。FAP表达于90%以上的上皮性肿瘤的基质成纤维细胞的胞膜和胞浆中，包括卵巢癌，结肠癌，膀胱癌，肺癌，乳腺癌等，而在正常的成纤维细胞中几乎不表达，是一个特异性非常强的肿瘤诊断和治疗的靶点。而且作用于肿瘤基质成纤维细胞相对于直接作用于肿瘤细胞自身而言也有一些吸引人的优点：如肿瘤基质成纤维细胞是非转化细胞，与快速增殖的肿瘤细胞相比其基因组更加稳定，其表面抗原表达相对来说也更加稳定，而且基质细胞在各种肿瘤中的差异较小，针对肿瘤基质的治疗可用于多种实体肿瘤。尤其近几年来发现其在肿瘤免疫抑制方面发挥着很大的作用。因此，综合来看，FAP作为一种肿瘤基质抗原，在免疫治疗等方面具有较大的应用价值。

如今，随着对免疫学的研究进展，人们逐渐发现细胞毒性T淋巴细胞（Cytotoxic Tlymphocyte，CTL）在抗病毒、抗细菌、抗肿瘤等过程中发挥的重要作用，是机体免疫的一条重要防线。尤其是近些年来发现的其在肿瘤免疫过程中发挥的重要作用更是引起了研究人员的广泛兴趣。

肿瘤抗原为内源性抗原，主要通过MHC-I类分子途径所递呈。基于MHC-I类分子封闭的结构特性，其只能识别由8~12个氨基酸所组成的短肽段，这些肽段被称为抗原表位。肿瘤抗原经APC细胞摄取加工后形成相应的短肽，进而与MHC-I类分子结合，并最终递呈到细胞表面以便CD8+ T细胞表面的TCR所识别，从而活化CTL细胞，引发CTL特异性免疫应答。目前，研究较多的抗原表位为九肽。该领域的发现也逐渐催生了治疗性肿瘤多肽疫苗的研究。然而，如何快速寻找并利用CTL表位去有效激发其介导的特异性细胞免疫应答，发挥抗肿瘤作用，却成为难点。

而随着现代生物信息学与免疫学的迅速发展与融合，研究人员已经可以利用多种在线抗原表位预测工具，准确、快速的寻找到理想的抗原表位，大大的提升了工作效率。目前常用的有BIMAS（主要是计算8~10肽与MHC-I类分子解离的半衰期）、NetCTL 1.2（主要是能够对12种MHC-I类超型限制性的表位进行预测）和SYFPEITHI（主要预测抗原肽与MHC的亲和力）等。不同的软件有不同的特点，因此，综合运用这些软件可以提高抗原表位预测的准确性，这也是本领域研究的一般策略。

各种动物特别是哺乳动物都有MHC，为避免混淆，人类中的MHC基因称为人白细胞抗原（HLAs），其编码产物称为HLA分子或HLA抗原，分别为对应的HLA-I类和HLA-II类分子。而HLA-I类分子具有高度的多态性，具有几十种亚型，而在中国人群中，HLA-A2人群所占多数，比例高达53%，因此筛选由HLA-A2分子递呈的限制性CTL表位在肿瘤免疫治疗中具有广泛的应用价值。

发明内容

本发明主要是利用FAP的一级结构，通过BIMAS、NetCTL 1.2以及SYFPEITHI等多种表位预测软件，筛选、合成并提供了一种FAP来源的HLA-A2限制性的CTL表位肽P265。

下面对本发明的技术方案介绍如下：

FAP来源的抗肿瘤CTL表位肽P265，该类表位肽与HLA-A2特异性结合，为九肽，具体为：

表位肽P265，分子量1040.18，其序列如SEQ ID NO.1所示，具体为：FIIDTTYPA，即：Phe- Ile- Ile- Asp- Thr- Thr- Tyr- Pro- Ala；

所述FAP来源的抗肿瘤CTL表位肽P265，采用Fmoc固相合成法制备而成，具体过程如下：

（1）从C端到N端开始合成，合成肽C端的第一个Fmoc-氨基酸的羧基与Wang树脂以共价键结合，这样C端第一个氨基酸就连接到固相载体上，随后将氨基端的Fmoc保护基脱去；

（2）然后以第一个氨基酸的氨基末端作为结合位点，与下一个氨基酸的羧基末端在缩合剂的活化作用发生缩合反应形成肽键，生成一个带有保护基的二肽；然后不断重复这一过程，直至合成目的肽；

（3）最后将目的肽段从树脂上切割下来，经过洗涤、沉淀等步骤获得粗肽；

（4）再经HPLC纯化后，得到精肽，其纯度大于95%，最后经质谱分析并验证其分子量是否符合理论值。

所述FAP来源的抗肿瘤CTL表位肽作为肿瘤治疗药剂的应用，具体而言，可作为治疗性多肽疫苗应用。

在肿瘤多肽疫苗研究当中，目前大多数选用的都是肿瘤细胞自身所表达的抗原，较少有人关注肿瘤基质抗原。而随着研究的进展，肿瘤基质在肿瘤的发生、发展过程中所发挥的巨大作用逐渐得到揭示，其参与了多种病理进程，如：肿瘤血管的生成、肿瘤细胞的增殖侵润和转移、慢性炎症、肿瘤免疫抑制等。肿瘤相关成纤维细胞是肿瘤基质中所占比例最大的类群，而FAP是其所表达的特异性抗原，因此，靶向于FAP可有效破坏肿瘤基质，进而抑制肿瘤的发生发展。

在本发明中，我们利用90%以上的上皮性肿瘤高表达而正常组织中几乎不表达的特异性抗原FAP，利用其一级结构，通过BIMAS、NetCTL 1.2以及SYFPEITHI等多种表位预测软件分别对FAP进行HLA-A2限制性的CTL表位进行了预测与筛选，在综合各预测筛选结果的基础上，进一步通过实验验证，筛选确定了P265这种具有抗肿瘤活性的表位肽结构，确定这种CTL表位肽能够与HLA-A2分子产生较强的结合能力，且可有效激活特异性CTL反应，具有成为治疗性肿瘤多肽疫苗的可行性。

附图说明

图1是本发明所述表位肽P265的质谱分析图谱；

图2是本发明所述表位肽在体外活性实验中诱导的特异性CTL的ELISPOT检测结果；

图3是本发明所述表位肽在体外活性实验中诱导的特异性CTL对T2A2细胞的杀伤实验的检测结果。

图4是本发明所述表位肽在进行HLA-A2.1/Kb 转基因小鼠实验时体重变化；

图5是本发明所述表位肽在转基因小鼠体内活性实验中诱导的特异性CTL的ELISPOT检测结果；

图6是本发明所述表位肽在转基因小鼠体内活性实验中诱导的特异性CTL对T2A2细胞的杀伤实验的检测结果。

具体实施方式

下面结合具体实施例及实验对本发明的技术方案进行详细介绍，介绍具体实施例前，首先对本发明中所用到部分实验试剂、实验设备、细胞来源等简单介绍如下，其他未说明试剂、实验设备等以本领域常用为准，不再重复介绍。

主要实验试剂：

人β2微球蛋白，Merck公司；

rhIL-2、rhIL-7、rmIL-2， PEPROTECH公司；

IFN-γ ELISPOT试剂盒、单克隆抗体Anti-Human HLA-A2，eBioscience公司；

LDH细胞毒性检测试剂盒，Promega公司；

主要实验设备：

RP-HPLC分析仪，日本岛津公司；

流式细胞仪（Calibur），美国BD公司；

酶标仪，MD公司；

血液来源：

HLA-A2⁺健康供者的外周血来自郑州大学学生中招募的志愿者，样品的采集经郑州大学伦理委员会备案批准；

阳性对照肽P321：参考《Identification of a new broad-spectrum CD8+ Tcell epitope from over-expressed antigen COX-2 in esophageal carcinoma》（Cancer Letters，2009，24（1）：55~61），由发明人自行合成获得；

细胞来源：

T2A2细胞（TAP缺陷），由第三军医大学吴玉章教授惠赠；所用T2A2细胞系是转入了人HLA-A*0201的T、B淋巴母细胞的杂交系，其不表达HLA-DR和MHC -II类分子，可以很好的用于MHC-I类分子的抗原递呈和T细胞识别的研究；且所使用的T2A2细胞呈TAP缺陷状，抗原肽不能进入到内质网中与HLA-I分子进行组装，空载的HLA-I分子被递呈到靶细胞表面，但是其在低温条件下极其不稳定，构象极易发生改变，此时HLA-A2 mAb不能检测出HLA-A2 阳性的细胞，而当HLA-A2分子处于抗原肽荷载状态时，构象便被稳定下来，通过孵育HLA-A2抗体便能检测出HLA-A2阳性的细胞；如此，抗原肽结合力便可通过靶细胞表面 HLA-A2的表达情况加以反映；

小鼠来源：

HLA-A2.1/K^b转基因小鼠为第二军医大学曹雪涛院士惠赠，于IVC独立送风隔离笼具中饲养；实验室选择6~8周龄的转基因小鼠进行实验。

实施例1

本发明所提供的FAP来源的抗肿瘤CTL表位肽，与HLA-A2特异性结合，为九肽，包括1种，具体为：

表位肽P265，分子量1040.18，其序列如SEQ ID NO.1所示，具体为：FIIDTTYPA，即：Phe- Ile- Ile- Asp- Thr- Thr- Tyr- Pro- Ala；

所述CTL表位肽P265采用Fmoc固相合成法制备而成。合成时，合成肽从C端到N端逐个延长。合成时所用氨基酸均为α-氨基被Fmoc（芴甲氧羰酰基）所保护的氨基酸，其中个别氨基酸的侧链也有保护基团，分别为Thr、Tyr（tBu，叔丁基），Asp（OtBu，氧叔丁基）。详细制备步骤如下所述。

（1）称量0.3g Wang树脂用DMF（N，N-二甲基甲酰胺）充分溶胀，置于合成仪当中；然后在DIC （N，N-二异丙基碳二亚胺，促进氨基酸缩合）、HoBt（1-羟基苯并三唑，活化羧基、抑制外消旋）、DMAP（4-二甲氨基吡啶，催化缩合反应，只在添加第一个氨基酸时使用）的作用下，加入C端第一个氨基酸，即将Fmoc-Ala-OH连接到Wang树脂上，连接时，将合成仪置于摇床中，室温、200r、反应2.5小时；

反应结束后依次使用DMF洗涤2次，无水甲醇洗涤2次， DCM（二氯甲烷) 洗涤3次，最后再用 DMF洗涤2次，每次均为2min，洗涤时溶液量控制在高出树脂表面1cm左右，不宜过多或过少；

洗涤结束后，挑出少量树脂（1mg左右），烘干，用紫外分光光度计于290 nm下测量其OD值，以备取代值计算，取代值SD=OD/（1.65×树脂质量）；

随后用封头液（体积比，醋酸酐：吡啶=1：1）封闭未反应的树脂，恒温震荡15 min，将液体负压条件下抽干；此步骤的主要目的是对未发生反应的基团进行封闭，以减少副产物；

洗涤后（洗涤步骤同上），加入脱保护液（体积比，DMF：哌啶=4：1），恒温震荡反应20min，除去Fmoc保护基，按前述方法再次洗涤；

随后进行茚检（Kaiser法）：取少量树脂于玻璃试管中，加入茚检试剂，沸水浴1min，观察溶液颜色改变情况；若溶液以及树脂颗粒颜色变成蓝色，说明氨基酸保护基团已经被成功脱除，可以进行下一个氨基酸的缩合；反之则说明氨基酸的保护基团没有或者只是极少部分被脱除；

然后，根据取代值SD计算C端下一个氨基酸，即Fmoc-Pro-OH的所需质量，计算公式为：m_氨基酸=M_氨基酸×2.5×m_树脂×SD；在 DIC、HoBt的作用下，将其连接到Phe的氨基上，再次按前述方法洗涤；

茚检结束后（此次茚检后溶液和树脂颗粒颜色应为无色，才能说明氨基酸成功加上，因为此时第二个氨基酸加入后还未进行脱保护），得到Pro - Ala -Wang树脂；

（2）重复步骤（1），依次按顺序将Tyr、Thr、Thr、Asp、Ile、Ile、Phe连接到肽链上；

（3）最后用脱保护液脱去Fmoc保护基，按前述方法洗涤后，用切割试剂（体积比，三蒸水：苯酚：苯甲硫醚：1,2-乙二硫醇：三氟乙酸= 2：2：2：1：33）将P265从Wang树脂上切下，经旋转蒸发、离心、洗涤、沉淀、烘干等步骤，得到抗肿瘤CTL表位肽P265粗肽；

（4）RP-HPLC分离纯化：用HPLC制备柱（ODS-39.4×250mm，安捷伦公司）分离纯化，具体为：

取步骤（3）中表位肽P265粗肽15~20mg溶于4mL三氟乙酸和乙腈的混合溶液（二者体积比4:1）中，过滤并超声波震荡除气；

制备时，选择流动相 A为含有0.1% 的TFA的超纯水溶液，流动相 B为100% 的色谱级乙腈溶液，二者比例为4:1，进行梯度洗脱，流速设置为5mL/min，收集主峰，用冻干机（Genentech，US）冷冻干燥获得精肽（高纯度肽）。

对所制得的精肽采用电喷雾电离质谱（ESI/MS）进行质谱分析（此部分由上海科肽生物科技有限公司完成），以进行分子量鉴定。

表位肽P265鉴定结果如图1所示，从图中可以看出，所制得精肽分子量为1040.0，与理论值相吻合。

实施例2

对于实施例1所制备的表位肽P265，为验证其是否具有免疫活性，本实施进行了一系列体内外实验。首先，运用结合力实验对其表位肽与HLA-A2分子的亲和性进行了检验；随后，通过酶联免疫斑点实验（ELISPOT）检测了表位肽诱导获得的IFN-γ+的CTL频率，同时LDH靶细胞杀伤实验和CTL胞内因子染色实验；最后，根据所建立的HLA-A2.1/K^b转基因动物模型，对表位肽的体内免疫效果进行了测定。相关实验简要介绍如下。

一、细胞结合力、及表位肽/MHC复合物的稳定性实验（即CTL表位肽与HLA-A2分子间的结合力和结合稳定性实验）

具体实验过程如下：

（1）取培养中的T2A2细胞，选择分裂增殖明显状态较好的细胞进行实验，实验时，用电动移液器轻轻贴壁吹吸培养体系均匀的细胞悬液，收集于15 mL离心管中，800rpm离心10分钟收集T2A2细胞，无血清IMDM培养基洗涤3次，弃上清，调整细胞密度为1×10⁶/mL，铺于无菌24孔板中，每孔1mL；

（2）分别设置空白对照组（不加任何肽）、P321阳性对照组、PBS阴性对照组和实验组，各两个复孔；

除空白对照组外，各孔分别加入PBS（阴性对照组）和50 µg/mL的表位肽（实验组和阳性对照组）以及3 µg/mL的β2微球蛋白，置于37℃、5% CO₂培养箱中孵育18 h；

（3）18h后，用预冷的PFA buffer（100 mL PBS7.4+ 5 mL FBS+ 90mg叠氮化钠）洗涤三次，弃掉上清，

细胞结合力时，避光加入50 μL已用PFA缓冲液 50:1稀释后的带有PE荧光标记的单克隆抗体Anti-Human HLA-A2 PE-Cyanine7，4℃避光孵育35min；

表位肽/MHC复合物的稳定性实验时，毎孔加入10 μg/mL的 BFA（BrefeldinA，eBioscience公司）孵育1h，洗涤后，置于37℃、5%CO₂培养箱中分别孵育0h、2h、4h、6h；孵育结束后，洗涤，再避光加入50μL已用PFA溶液50:1稀释后的鼠抗人单克隆抗体Anti-HumanHLA-A2 PE-Cyanine7，4℃避光孵育35min；

（4）预冷的PFA buffer洗涤后，置于冰上，流式细胞仪检测，记录各组平均荧光值MFI（MEAN Fluorescence Intensity）和DC₅₀值（DC50表示50%肽/MHC分子复合物解离所需的时间）。

荧光指数FI= (实验组MFI－背景组MFI)/背景组MFI；结果分析：当FI＞1.5时，表明实验组肽（表位肽）与HLA-A2分子具有高结合力；当1.5＞FI＞0.5时，表明其结合力中等；当FI＜0.5时，表明其结合力较弱。

结合力及稳定性的统计结果如下表所示：

表位肽	FI	DC<sub>50</sub>/h
			P265	1.13	＞6h

结果显示，P265显示出了中等结合力；且半衰期＞6h，表明表位肽与MHC分子形成的复合物稳定性很好，可较好激活免疫反应，具有一定的应用潜力。

二、CTL体外免疫活性检测

CTL体外免疫活性检测主要是先体外诱导激活CTL，然后通过ELISPOT技术对IFN-γ的分泌情况的检测和LDH细胞杀伤情况的检测对免疫活性情况进行评价，相关实验过程介绍如下。

1 、体外诱导激活CTL

该实验主要是对外周血的单个核细胞进行诱导，使其激活转化为特异性表达CD8+的CTL（细胞毒性T淋巴细胞），相关实验过程介绍如下。

（1）选取若干名健康的HLA-A2+的志愿者，由医护人员抽取每人20 mL外周血，加入到有肝素钠（抗凝血试剂）的50 mL无菌离心管中，按1:1的体积比例与的PBS（pH =7.2）进行等体积混合，缓慢吹打混匀；

（2）在15 mL无菌离心管中加入4 mL淋巴细胞分离液（天津灏洋），然后轻轻缓慢地加入步骤（1）中的混匀的抗凝血8 mL；室温、2000 rpm，离心30 min；

（3）离心完毕后，缓慢取出，可见液体明显的分为四层，从上到下依次为血浆层，淋巴细胞层，分离液层，红细胞层。用弯管小心吸取第二层乳白色的外周血单个核细胞层（PBMCs）于已加有约5倍体积PBS的离心管中，2000 rpm、离心15 min；

（4）离心完毕后，尽弃上清，用含10%胎牛血清的IMDM培养基重悬细胞，计数，调整细胞密度为1~1.5×l0⁶个/mL，铺于24孔板中，每孔1 mL，置于37℃、5%CO₂培养箱中过夜；

（5）设置阳性对照组（COX-2_321-329，即P321）、PBS阴性对照组、无关肽对照组（HBVc18-27，即HBV）和实验组；

于次日分别加入各组的多肽 10μg/mL，β2微球蛋白（3μg/mL），第三日加入50 U/mL的rhIL-2（Peprotech公司），其后隔天加入rhIL-2进行刺激，到第七天结束为一轮周期；

共三轮刺激；

刺激过程中，实时观察细胞状态，根据需要每2~3 d进行半量换液；

第三轮需要额外补加10μg/mL的rhIL-7（Peprotech公司）和5μg/mL CD3刺激性单克隆抗体（eBioscience公司）。

三轮刺激后，在第21d时即得到效应CTL细胞。

2 、ELISPOT技术检测体外诱导的CTL分泌产生IFN-γ的能力

取体外诱导的CTL细胞，利用ELISPOT实验技术对其分泌产生的IFN-γ的量进行检测，具体过程介绍如下：

（1）包被板条：板条使用的是密理博公司（Millipore）的非预包被板，先用15μL、35%乙醇活化PVDF膜1min，然后用200μL的PBS（pH=7.2）洗3遍，每次停留一分钟；完成后，4℃过夜孵育IFN-γ抗体（Capture Antibody IFN-γ，eBioscience）；

（2）封闭：于次日每孔加入200 μL含10% FBS的RPMI-1640培养基，室温放置10 min后尽弃培养基；

（3）细胞荷肽：调整T2A2细胞的浓度为2×l0⁶个/mL，加入相应的表位肽（加入量50μg/mL）、和人β2M（β2微球蛋白，3μg/mL）、或PBS后，置于37℃、5%CO₂培养箱中孵育4 h，作为刺激细胞；

（4）收集体外诱导的CTL，即上述三轮刺激后所得效应CTL细胞，用无血清的IMDM洗2次，调整细胞密度为2×l0⁶个/mL，作为效应细胞；

（5）以总体积100μL，接种到已活化的Millipore板条上（步骤（2）中所制备），设置各组如下：

实验孔：（荷载表位肽的T2A2细胞悬液50 μL+效应细胞悬液50 μL）（效应细胞和刺激细胞按1:1的数量比计数）；

阴性对照孔：荷载PBS的T2A2悬液50 μL+效应细胞悬液50 μL；

自发对照孔：效应细胞悬液50 μL+无血清IMDM培养基50 μL；

阳性对照孔：效应细胞悬液50 μL+荷载表位肽P321的T2A2细胞悬液50 μL；

空白对照孔：100 μL无血清IMDM培养基；

每组设置三个复孔，铺板完成后，放入无菌锡纸袋内，置于37℃、5% CO₂培养箱中孵育18 h；期间避免培养箱的频繁开闭和不必要的震动，以免影响斑点的形成；

（6）18h后，将板条内液体扣干，加入200μL预冷的无菌三蒸水，4℃裂解10min；

然后将孔内液体扣干，1×Washing Buffer洗6次，每次停留1min，扣干时需在无菌、无粉的卫生纸上扣干；

（7）每孔加入100μL生物素标记的IFN-γ检测抗体（eBioscience），置于37℃、5%CO₂培养箱中孵育1 h，时间到后尽弃孔内液体，重复上述步骤（6）洗涤；

（8）然后每孔加入100μL的酶联亲和素溶液（eBioscience），置于37℃、5%CO₂培养箱中孵育1 h，完成后尽弃孔内液体，重复上述步骤（6）洗涤；

（9）按要求配制AEC底物显色液，100μL/孔，室温条件下，避光显色约35 min，逐渐能观察到淡红色斑点；

显色结束后，尽弃孔内液体，将孔板底座去掉（避免背景加深），用蒸馏水反复冲洗孔板以终止反应，然后将板条置于避光干燥处，室温自然晾干；用超微距相机拍照，记录各孔中的斑点数。

对其中3名志愿者的具体统计结果如图2所示。

从图2中可以看出，通过检测IFN-γ的分泌情况，可以发现P265能成功诱导产生特异性CTL；在三个志愿者中所产生的斑点数分别为50、141和21个，其数目与阳性对照P321组（分别为72、69和12个）基本相当甚至还多于它。虽然在不同志愿者之间P265表现出一定的差异性，但这可能是由于个体间的差异所造成。综合分析考虑，P265具有诱导产生特异性CTLs的能力。

3 、LDH细胞杀伤实验

参考CytoTox 96® Non-Radioactive Cytotoxicity Assay试剂盒（Promega公司）说明书，进一步进行了LDH细胞杀伤实验，相关实验过程介绍如下。

（1）收集效应细胞：将第三轮诱导的CTL收集起来（即步骤1中体外诱导的CTL），调整细胞密度为5×10⁶个/mL；

（2）准备靶细胞：收集T2A2细胞，调整细胞密度为1×10⁵ /mL，加入相应的表位肽（加入量50 μg/mL）、和人β2M（β2微球蛋白，3μg/mL），置于37℃、5% CO₂培养箱中孵育4 h；

（3）检测板的设立：100μL体系；具体分组情况为：

实验组：以T2A2细胞作为靶细胞，按12.5:1、25:1、50:1的效靶比加入各相关细胞；（12.5:1 效靶比组，12.5 μL CTL+50 μL荷载表位肽的T2A2细胞+37.5μL无血清 IMDM 培养基；25:1 效靶比组，25 μL CTL+50 μL荷载表位肽的T2A2细胞+25μL无血清 IMDM 培养基；50:1 效靶比组，50μL CTL+50 μL荷载表位肽的T2A2细胞）

背景对照组：100 μL无血清 IMDM 培养基；

靶细胞最大释放LDH组：50 μL荷载表位肽的T2A2细胞+50 μL无血清IMDM 培养基；

靶细胞自发释放LDH组：50 μL荷载表位肽的T2A2细胞+50 μL无血清 IMDM 培养基；

效应细胞自发释放LDH组：12.5:1 自发组，12.5 μL CTL+87.5μL无血清 IMDM 培养基；25:1 自发组，25 μL CTL+75μL无血清 IMDM 培养基；50:1 自发组，50μL CTL+50 μL无血清 IMDM 培养基；

体积校正对照组：100 μL无血清 IMDM 培养基；

以上各组均设3个复孔；

（4）按上述加入相应细胞后，置于37℃、5%CO₂培养箱中孵育4 h；

（5）在孵育结束前45min时，在靶细胞最大释放LDH组和体积校正对照组中分别加入10μL裂解液；

（6）1000 rpm、离心10min；然后取50μL上清转入到另一个96孔酶标板对应的孔中，每孔加入50 μL 37℃预热的已稀释的底物混合液，在室温条件下避光反应30 min；

时间到后，每孔加入终止液50 μL；去除气泡（以免影响OD值）；

在1 h内，用酶标仪（Bio-Red公司），490 nm处检测OD值。

细胞杀伤率计算公式：

细胞杀伤率（%）=(实验组释放-靶细胞自发释放-效应细胞自发释放)/ (靶细胞最大释放-靶细胞自发释放) ×100%，

所有组均需减去背景对照组，而靶细胞最大释放组应减去体积校正组。

实验结果如图3所示。可以看出，在志愿者1中，P265组在各个效靶比下的杀伤率均高于P321阳性对照组，其中在效靶比为25:1时杀伤率最高，达到27%。在志愿者2中，P265组在不同效靶比下的杀伤率均较高，最大杀伤率达到47%，与阳性对照P321组相当。而在志愿者3中，P265组的杀伤率虽然随着效靶比的升高而逐渐升高，最大达到22%，但均没有P321组效果好，且与阴性对照组相差不多，效果较差，这也与之前的ELISPOT结果基本保持一致。综合以上分析，我们认为P265组能诱导出特异性CTLs，并且能在体外表现出对靶细胞较明显的杀伤作用。

三、HLA-A2.1/K^b 转基因小鼠体内免疫活性检测实验

基于上述体外实验结果，发明人进一步对表位肽P265在小鼠体内的免疫性能进行了进一步检测实验，具体过程介绍如下。

（一）转基因小鼠的免疫

（1）选取6~8周龄的小鼠，称量并记录体重后进行分组，每组3雌2雄，且尽量使得每组小鼠的平均体重基本一致；共分为3组：

P265+Th表位（I-Ab乙肝病毒核心抗原来源的Th细胞表位，序列为：TPPAYRPPNAPIL）+IFA（弗氏不完全佐剂，Sigma公司）组，

PBS +IFA组，

Th表位+IFA组；

分别于第1天、第6天、第11天免疫三次（免疫方式如下述步骤（3）所述）；

（2）表位肽的乳化：免疫时采用乳化后混合物，具体乳化方式为，

按CTL表位肽100 μg/只、Th表位140 μg/只的量与IFA按 1:1的质量比例混匀；

将各体系在10 mL离心管中混合均匀后，将灭菌的玻璃注射器插入离心管中反复吹打约30 min；起初体系粘稠度低，很难挂壁，随着不断吹吸乳化的进行，体系最后呈现粘稠度较高的状态；此时，取一盛有冰水混合物的小烧杯，用1 mL注射器吸取少许乳白色的乳化液，滴入冰水混合物中，若是凝聚为滴状漂浮于水面说明乳化成功，若是入水后弥散，说明乳化操作并不充分，还未形成理想的油包水状态，需要继续连续吸打；

乳化成功后用1 mL注射器吸取乳化的表位肽，小心反复磕实，以免有气柱残存而影响免疫效果；

（3）免疫注射时，采用背部皮下多点免疫方式进行免疫注射；免疫期间每隔一天称量小鼠体重并进行详细记录。

体重统计结果如图4所示。从图4中可以看出，免疫期间小鼠体重未发生明显波动，初步表明P265未对小鼠造成明显的毒副作用。

（二）小鼠脾脏及腿部淋巴结来源的CD8⁺ CTL 体外诱导刺激

（1）第16天处死小鼠（即步骤（一）中免疫16天后），75%酒精浸泡10 min后在超净台内进行解剖，取其脾脏及腿部淋巴结用一次性200目筛网进行研磨；

组织及细胞悬液转移入15 mL离心管，每管约10 mL；水平离心机离心，1300 rpm、10 min，弃上清；

加入红细胞裂解液，置于4℃裂解10 min；离心，1300 rpm、10 min，弃上清；

加入含有2% FBS的PBS（pH 7.2）离心洗涤一次，1300 rpm、10 min，弃上清；

加入10% FBS的RPMI-1640培养基，调整密度为5×10⁶个/mL，铺入6孔板中；

（2）第二天加入表位肽，10 μg/mL，β2-M，3 μg/mL，鼠源IL-2， 50 U/mL；5天后进行实验。

（三）ELISPOT和LDH实验

利用ELISPOT技术对CTL分泌产生IFN-γ的量进行检测，并进一步进行LDH细胞杀伤实验，以对免疫效果进行评价，相关实验参考前述即可，不再重复（注：小鼠LDH实验的效靶比设置不同于之前，分别为20:1,40:1和80:1）。

ELISPOT结果见图5。

从统计结果可以看出，经体内免疫并进行体外诱导刺激得到的转基因小鼠CTLs同样具有显著分泌IFN-γ的能力。P265组的斑点数达到99个，均极显著高于Th表位组和PBS阴性对照组（P＜0.01**）。初步表明我们所构建的免疫模型基本可靠，得到的CTLs能够用于后续的细胞毒性检测等实验。

LDH结果见图6。

从统计结果可以看出，P265组在三个效靶比下的杀伤率分别为38%、47%和44%。其中，在效靶比为40:1和80:1时极显著（P＜0.01**）高于Th组和PBS组（P＜0.01^^）。结果表明P265组所诱导的转基因小鼠CTLs对靶细胞也有较明显的杀伤作用。综上，表位肽P265在转基因小鼠体内也具有一定的免疫活性。

结合上述所有实验结果可知FAP来源的抗肿瘤CTL表位肽能够在治疗性肿瘤多肽疫苗的研究中加以应用。

SEQUENCE LISTING

<110> 郑州大学

<120> FAP来源的抗肿瘤CTL表位肽P265及其应用

<130> none

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 1

Phe Ile Ile Asp Thr Thr Tyr Pro Ala

1 5

Claims (3)

1.FAP来源的抗肿瘤CTL表位肽P265，其特征在于，所述表位肽P265为九肽，其分子量1040.18，其序列如SEQ ID NO.1所示，具体为：FIIDTTYPA，即：Phe- Ile- Ile- Asp- Thr-Thr- Tyr- Pro- Ala。

2.权利要求1所述FAP来源的抗肿瘤CTL表位肽P265的制备方法，其特征在于，采用Fmoc固相合成法制备而成。

3.权利要求1所述FAP来源的抗肿瘤CTL表位肽P265在制备上皮性肿瘤治疗药剂中的应用。