CN107722118B

CN107722118B - 以FAPα的CTL表位肽为基础的肽类疫苗和微基因疫苗的应用

Info

Publication number: CN107722118B
Application number: CN201711060548.5A
Authority: CN
Inventors: 张海红; 孔维; 于湘晖; 张芳芳; 刘晨露; 徐平; 耿飞; 谢雨; 郭倩倩; 陆臻桢
Original assignee: Jilin University
Current assignee: Jilin University
Priority date: 2017-10-31
Filing date: 2017-10-31
Publication date: 2021-10-26
Anticipated expiration: 2037-10-31
Also published as: CN107722118A

Abstract

本发明涉及一种以FAPα的CTL表位肽为基础的肽类疫苗和微基因疫苗的应用，属于以成纤维细胞激活蛋白α为靶点的肿瘤肽类疫苗和DNA疫苗领域。FAPα来源的抗肿瘤表位肽FAP.291及其模拟肽FAP.291I9和它们所构建的微基因DNA疫苗在制备肿瘤治疗性疫苗中的应用。本发明通过筛选鉴定确定了表位FAP.291和模拟表位FAP.291I9可以有效激活BALB/c小鼠特异性的CTL反应。本发明还涉及使用FAP.291和FAP.291I9小肽同佐剂联用方式及构建它们的微基因形式的疫苗在抗肿瘤中的应用。

Description

以FAPα的CTL表位肽为基础的肽类疫苗和微基因疫苗的应用

技术领域

本发明涉及肿瘤CTL表位肽疫苗和微基因疫苗领域，尤其是涉及FAPα来源的抗肿瘤CTL表位肽，本发明还涉及该表位以肽类疫苗及微基因疫苗形式在制备抗肿瘤疫苗中的应用。

背景技术

成纤维细胞激活蛋白α(FAPα)是肿瘤微环境中肿瘤相关成纤维细胞(CAFs)表面的特异性标志物，FAPα在90％的人类上皮细胞癌组织的CAFs中均有表达。FAPα同肿瘤的生长，侵袭和转移有着密切的关系：1)FAPα通过酶解作用，解离激活同基质蛋白结合的生长因子，利于肿瘤的增殖和血管生成，促进肿瘤的生长；2)通过胶原酶活性，降解细胞外基质，提供血管生成进入的空间，协助构建肿瘤细胞微血管营养网络；3)水解肿瘤细胞外基质以及基质中的底物，有利于肿瘤脱离原发灶，促进了肿瘤侵袭和转移。大量国外文献研究表明，以FAPα为靶点的肿瘤疫苗可以诱导机体产生免疫反应和抗肿瘤效应。但目前疫苗多采用鼠源或者人源的FAPα全长蛋白的形式，还未见表位肽类形式的疫苗的相关报道。

表位肽具有安全，稳定，可更加高效地诱导特异性免疫反应等优势。表位肽的鉴定筛选是表位肽疫苗研究的首要内容，表位肽HLA亲和性计算机模拟预测可以大大提高筛选效率，节约成本。人HLA-A*2402亚型在亚洲具有超过半数人群的广泛分布，常常被选为表位肽疫苗的限制性分子类型。有报道指出小鼠的主要组织相容性复合体H2-Kd分子同人HLA-A*2402分子具有相似的表位肽锚定结合基序，即他们对相同的表位肽具有相似的亲和力，而亲和力是决定表位肽免疫原性的主要因素，研究发现某些应用在表达有H2-Kd MHC亚型的小鼠中具有抑瘤作用的人鼠同源性很高的表位肽，同样能够刺激诱导HLA-A*2402阳性个体外周血特异性CTL的产生。此外，报道显示FAPα具有很高的人鼠同源性，这就提示我们表达H2-Kd的BALB/c小鼠十分合适用做HLA-A*2402限制性表位肽疫苗的初步鉴定有效性的初期探究模型。

表位肽同MHC分子结合的亲和力的强弱取决于锚定位点的氨基酸类型。研究表明TCR只同表位肽中1-2个氨基酸发生作用，导致一个TCR可以识别多个pMHC(肽-MHC分子复合物)，这就决定了活化同一个TCR的表位肽并不是单一的。有报道指出，可以通过改变第二位或者第九位锚定残基氨基酸的类型来增强pMHC的稳定性，从而更有效地刺激免疫应答。这种残基替换只改变了锚定部位，而TCR的识别区域没有改变，即TCR识别的交叉活性使得这种方法的应用成为可能。通过这种方式改变的CTL表位肽被称作“不规则肽”或者“模拟肽”，大量国外文献报道，模拟肽在多种类型的肿瘤中发挥了抗肿瘤作用，包括慢性淋巴细胞白血病，慢性髓性白血病和急性髓性白血病。

表位肽疫苗还可以串联用作DNA疫苗的形式，也被称作微基因疫苗，是近年来肽类疫苗设计应用的一个新方向。应用这种形式的表位肽疫苗的优势有：1)DNA分子设计合成方便，可以加入蛋白佐剂类组分，并且可进行多表位，多靶点，多HLA限制性类型的疫苗设计；2)DNA疫苗由于包含大量未甲基化的GC序列，免疫后自身可以作为佐剂刺激先天性免疫反应，活化免疫系统；3)疫苗可以在注射位点的细胞内表达，活化抗原提呈细胞，从而诱导炎症反应和促进抗原的处理、递呈；4)微基因疫苗通过体内合成加工的方式表达新蛋白，能够增加MHCⅠ类分子和共刺激分子的表达，而后以内源蛋白的方式递呈，可以更高效、更长效的诱导特异性CTL反应。

发明内容

本发明的目在于提供一种具有抗肿瘤活性的FAPα来源的CTL表位肽及模拟肽，并且本发明还构建了它们的微基因DNA疫苗形式。同时该发明还提供了两种表位作为肽类疫苗和微基因疫苗在抗肿瘤治疗中的应用。

下面对本发明的技术方案介绍如下：

本发明所述的FAPα来源的抗肿瘤CTL表位肽FAP.291，该表位肽为9肽，序列如SEQID NO:1所示，具体为：YYFSWLTWV，即：Tyr-Tyr-Phe-Ser-Trp-Leu-Thr-Trp-Val。

本发明所述的FAPα来源的抗肿瘤CTL模拟肽FAP.291I9，该表位肽为9肽，序列如SEQ ID NO:2所示，具体为：YYFSWLTWI，即：Tyr-Tyr-Phe-Ser-Trp-Leu-Thr-Trp-Ile。

本发明的研究，同时还预测到了FAPα来源的抗肿瘤CTL表位肽FAP.291的模拟肽FAP.291F9，FAP291L9，FAP.291W9,FAP.291M9，FAP.291V2，FAP.291I2，其特征在于，所述表位肽氨基酸序列如，SEQ ID NO:3，SEQ ID NO:4，SEQ ID NO:5，SEQ ID NO:6，SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8所示。

本发明所述的一种SEQ ID NO:9所示的tPA-FAP.291-LTB核酸序列，其特征在于所述序列包含一个分泌信号肽tPA序列，4个所述的FAPα来源的抗肿瘤CTL表位肽FAP.291序列和一个C末端融合有Myc标签序列的LTB序列，各组分之间通过水解酶敏感切割短肽REKR序列连接。

本发明所述一种SEQ ID NO:10所示的tPA-FAP.291I9-LTB核酸序列，其特征在于所述序列包含一个分泌信号肽tPA序列4个所述的FAPα来源的抗肿瘤CTL模拟肽FAP.291I9序列和一个C末端融合有Myc标签序列的LTB序列，各组分之间通过水解酶敏感切割短肽REKR序列连接。

本发明还包括上述表位及序列制备的疫苗在抗肿瘤免疫治疗中的应用。

本发明的优点在于利用FAPα的人鼠同源性及H2-Kd和HLA-A*2402的结合相似性鉴定出具有抗肿瘤活性的同源表位肽，并构建了其同样具有抗肿瘤活性的微基因DNA疫苗。鉴定的九肽未见报道，为基于肿瘤微基质抗原FAPα表位的长肽疫苗，微基因疫苗，多表位疫苗的应用奠定了基础。

附图说明

图1A：检测小鼠脾细胞释放IFN-γ的能力。表位肽FAP.291及模拟肽FAP.291I9免疫健康小鼠后，ELISPOT法检测脾细胞释放IFN-γ的能力，阴性刺激物为培养基(R10)，阳性刺激物为对应原表位肽；

图1B：检测小鼠CTL杀伤靶细胞能力。表位肽FAP.291及模拟肽FAP.291I9免疫健康小鼠后，从被免疫小鼠脾细胞中分离的淋巴细胞作为效应细胞，并用特异抗原肽标记的P815细胞作为靶细胞，CFSE荧光标记法检测免疫小鼠的CTL应答能力(E：T＝50)；

图2A：微基因疫苗构建载体CpVR；

图2B：微基因疫苗D-FAP.291，该重组质粒为编码微基因序列SEQ ID NO:9于CpVR载体中形成；

图2C：微基因疫苗D-FAP.291I9，该重组质粒为编码微基因序列SEQ ID NO:10于CpVR载体中形成；

图2D：D-FAP.291与D-FAP.291I9真核表达，两种质粒瞬时转染293T细胞后通过蛋白印记法证明融合蛋白表达；

图3A：小鼠的平均肿瘤生长。FAP.291和FAP.291I9表位肽混合同CpG佐剂联用后，在按照实施方式描述中进行间隔为2周的3次接种，疫苗注射后一周，对BALB/c小鼠进行皮下致死量的4T1肿瘤注射，描述10只小鼠的平均肿瘤生长，平均值±SEM，P<0.05；

图3B：小鼠的肿瘤称重结果，FAP.291和FAP.291I9表位肽混合同CpG佐剂联用后，在按照实施方式描述中进行间隔为2周的3次接种，在第21天对小鼠进行肿瘤的剥取后各组小鼠肿瘤称重的结果，与单独佐剂组(CpG)比较，混合表位肽佐剂联用组(FAP₂₉₁ Peptides)的肿瘤生长抑制率为20％；

图3C：ELISPOT法检测荷瘤鼠脾细胞释放IFN-γ的能力，FAP.291和FAP.291I9表位肽混合同CpG佐剂联用后，在按照实施方式描述中进行间隔为2周的3次接种，刺激小鼠脾细胞检测其释放IFN-γ的能力，阴性刺激物为培养基(R10)，阳性刺激物为FAP.291小肽；

图3D：检测小鼠CTL杀伤靶细胞能力。FAP.291和FAP.291I9表位肽混合同CpG佐剂联用后，在按照实施方式描述中进行间隔为2周的3次接种，被免疫荷瘤小鼠脾细胞中分离的淋巴细胞作为效应细胞，并用特异抗原肽标记的P815细胞作为靶细胞，CFSE荧光标记法检测免疫小鼠的CTL应答(E：T＝50)；

图4A：检测脾细胞释放IFN-γ的能力，微基因疫苗D-FAP.291及D-FAP.291I9免疫健康小鼠后，ELISPOT法检测脾细胞释放IFN-γ的能力，阴性刺激物为培养基(R10)，阳性刺激物为FAP.291小肽；

图4B：检测小鼠CTL杀伤靶细胞能力，微基因疫苗D-FAP.291及D-FAP.291I9免疫健康小鼠后，从被免疫小鼠脾细胞中分离的淋巴细胞作为效应细胞，并用特异抗原肽标记的P815细胞作为靶细胞，采用CFSE荧光标记法检测免疫小鼠的CTL应答(E：T＝50)；

图5A：小鼠的平均肿瘤生长，按照实施方式描述，对BALB/c小鼠(n＝8)进行皮下致死量的4T1肿瘤注射，7天后进行间隔为3天的3次DFAP.291和D-FAP.291I9微基因疫苗和空载体的接种，描述8只小鼠的平均肿瘤生长，平均值±SEM，P<0.01；

图5B：小鼠肿瘤称重的结果，按照实施方式描述，对BALB/c小鼠(n＝8)进行皮下致死量的4T1肿瘤注射，7天后进行间隔为3天的3次DFAP.291和D-FAP.291I9微基因疫苗和空载体的接种，在第24天对小鼠进行肿瘤的剥取后各组小鼠肿瘤称重的结果，与空载体组(Vector)比较，D-FAP.291和D-FAP.291I9微基因疫苗免疫组模型小鼠肿瘤生长抑制率分别为65％和50％；

图5C：微基因疫苗对荷瘤小鼠的生存期延长作用，按照实施方式描述，对BALB/c小鼠(n＝8)进行皮下致死量的4T1肿瘤注射，7天后进行间隔为3天的3次DFAP.291和D-FAP.291I9微基因疫苗和空载体的接种，与Vector组相比，微基因疫苗的生命延长率为10％(P<0.001)；

图5D：检测荷瘤鼠脾细胞释放IFN-γ的能力，按照实施方式描述，对BALB/c小鼠(n＝8)进行皮下致死量的4T1肿瘤注射，7天后进行间隔为3天的3次DFAP.291和D-FAP.291I9微基因疫苗和空载体的接种，ELISPOT法检测处死荷瘤鼠脾细胞释放IFN-γ的能力，阴性刺激物为培养基(R10)，阳性刺激物为FAP.291小肽；

图5E：检测免疫小鼠CTL杀伤靶细胞能力，按照实施方式描述，对BALB/c小鼠(n＝8)进行皮下致死量的4T1肿瘤注射，7天后进行间隔为3天的3次DFAP.291和D-FAP.291I9微基因疫苗和空载体的接种，被免疫荷瘤小鼠脾细胞中分离的淋巴细胞作为效应细胞，并用特异抗原肽标记的P815细胞作为靶细胞，采用CFSE荧光标记法检测免疫小鼠的CTL应答(E：T＝50)。

具体实施方式

1.FAP.291和FAP.291I9的预测和免疫原性鉴定

1.1FAP.291和FAP.291I9的预测

基于FAPα的人鼠同源性以及H2-Kd和HLA-A24的结合相似性，我们采用IEDB数据库对FAPα人源蛋白HLA-A*2402限制性表位及FAPα鼠源蛋白H2-Kd限制性表位进行了同源表位肽的预测，结果获得了3个同HLA-A*2402和H2-Kd均有高亲和力的同源表位肽，他们分别为：FAP.291(YYFSWLTWV，SEQ ID NO:1)，FAP.624(SYGGYVSSL)以及FAP.744(LYTHMTHFL)。随后我们将FAP.291，FAP.624以及FAP.744三个表位肽的C末端残基进行能与HLA-A*2402结合的F，L，I，W，M 5种氨基酸的替换，并对它们同HLA-A*2402和H2-Kd亲和力进行预测，我们最终选定FAP.291I9(SEQ ID NO:2)，FAP.624I9，FAP.744I9三种有效提高亲和力的模拟肽用于后续的鉴定。

1.2FAP.291和FAP.291I9的鉴定

对BALB/c小鼠进行随机分组，每组5只，设置PBS对照组，原表位肽混合组(MixedNative Peptides)以及模拟肽混合组(Mixed Analog Peptides)。实验组中每只小鼠的免疫组分包括：三种混合的原表位肽或者模拟肽，CpG ODN和H-peptide(HBV衍生的Th辅助表位肽)。以上三种组分溶于PBS中，再与等体积的不完全弗氏佐剂乳化后进行皮下免疫。共免疫两次，中间间隔两周，免疫结束后一周取脾进行免疫原性检测。

本发明主要对免疫后小鼠的细胞免疫活性进行了相关检测，检测内容主要包括两部分：一方面是通过酶联免疫斑点试验检测小肽特性的脾细胞IFN-γ分泌水平。另一方面则是通过CTL实验检测了脾细胞对于孵育原表位肽的靶细胞杀伤活性；其中酶联免疫斑点实验采用试剂盒法进行，具体方法如下：

用IFN-γ抗体包被Elispot板，4℃过夜；取分离好的脾淋巴细胞，调整浓度并计数；弃去包被抗体，用含10％胎牛血清的完全培养基洗涤一次，每孔加入200μL R10，加盖于室温封闭2小时，弃去培养基；每孔加入1×10⁶脾细胞；实验组每孔加入100μL的刺激表位肽，终浓度为10μg/mL；阴性对照组加入100μL不含表位肽的培养基；阳性对照组加入ConA，终浓度为1μg/mL；将各孔混匀于37℃，5％CO₂培养箱中培养24小时；用无菌水洗板2次，用1×PBST缓冲液洗涤6次，每次洗涤时浸洗1～2min；将抗体(biotinylated mAb for IFN-γ)加至稀释缓冲液(含10％胎牛血清的PBS)中，终浓度为2μg/mL；每孔加入50μL混合液，4℃过夜；用PBST洗涤3次；将Streptavidin-HRP concentratio A加至稀释缓冲液比值为1:100。每孔加入50μL混合液；室温培养2小时；用PBST洗涤4次，用PBS洗涤2次；每孔加50μLElispot染色液(20μL的chronogen加入到1mL的AEC substratio溶液中)，避光室温放置5～60分钟；弃去染色液，用蒸馏水洗涤；室温空气干燥2小时或过夜干燥，保存数据。

结果如图1A所示：，Mixed Native Peptides和Mixed Analog Peptides组经FAP.291表位肽刺激后均能够检测到特异性的IFN-γ增多(P<0.01)，其中Mixed AnalogPeptides组受原表位肽刺激后产生的分泌IFN-γ细胞数目要明显多于Mixed NativePeptides组(P<0.001)；然而经FAP.624和FAP.744小肽刺激后各组脾细胞的斑点数则没有明显的变化。

对于CTL杀伤功能的检测主要采用荧光比例测定法，具体如下：

培养与BALB/c实验鼠组织相容性的SP2/0细胞；1640培养基调整细胞浓度为2×10⁶个/mL，加表位肽至终浓度为5μg/mL标记，并准备同体积的不加表位肽标记的SP2/0细胞；37℃孵育2小时以上，经常振动，使得充分接触。离心，用等量的无血清1640培养基重悬细胞。高浓度的CFSE(5μM)标记的孵育表位肽的SP2/0细胞，低浓度的CFSE(0.5μM)标记的不孵育表位肽的SP2/0细胞；37℃孵育10～15min，每3～5min混匀细胞。用等体积冰冷小牛血清中止2～5min，以R10洗2次，200g离心细胞5min(注意观察细胞沉淀的颜色是否呈现淡黄色，是淡黄色，说明染色成功，否则不成功)，最后分别用适量的R10培养基重悬并且记数(靶细胞浓度变为1×10⁶个/mL)。整个洗涤及离心过程中要注意避光。取分离好的脾淋巴细胞，调整浓度并计数。按照效应细胞:靶细胞＝50:1的比例进行混合。每个实验组取用高浓度的CFSE(5μM)标记的孵育表位肽的SP2/0细胞5×10⁴个(50μL的1×10⁶个/mL靶细胞)，用低浓度的CFSE(0.5μM)标记的不孵育表位肽的SP2/0细胞5×10⁴个(50μL的1×10⁶个/mL靶细胞)，效应细胞加入50×10⁵个(500μL的1×10⁷个/mL的脾细胞)。不加入效应细胞的为阴性对照组。200g，离心4min，使靶细胞和淋巴细胞充分接触，37℃培养，杀伤8～10小时。收集细胞，并且用含有1％胎牛血清的PBS清洗重悬，纱网过滤后进行流式细胞仪检测。根据对照的设置圈中有活性的细胞群进行分析，其中高浓度CFSE标记的细胞群为特异性的靶细胞群，低浓度CFSE标记的细胞群为非特异性杀伤细胞群，计算CTL杀伤率(％)公式为：

结果如图1B所示：，Mixed Native Peptides和Mixed Analog Peptides组均能够显示FAP.291特异性杀伤活性(P<0.01)，其中Mixed Analog Peptides组的杀伤活性要高于Mixed Native Peptides组(P<0.05)；然而对于FAP.624和FAP.744小肽而言，各组脾细胞的特异性杀伤活性没有明显的变化。

综上，我们成功鉴定得到FAP.291(SEQ ID NO:1)和FAP.291I9(SEQ ID NO:2)进行表位疫苗的应用。

2.D-FAP.291和D-FAP.291I9微基因疫苗的构建及鉴定

CpVR载体含有CpG基序，CMV启动子，卡那霉素抗性基因，内含子A和BGH PolyA翻译终止信号等常规部件组成，共5294bp，图谱见图2A。

通过基因合成的方式合成目的微基因序列SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10并引入酶切位点PstI和BamHI，将包含目的基因的质粒及载体经PstI和BamHI双酶切后用胶回收试剂盒回收目的片段和载体，以T4DNA连接酶，在16℃下连接过夜。涂布卡那霉素抗性的LB平板，并于37℃下培养过夜，挑选阳性菌落于5mlLB培养基中37℃下培养16h，12000rpm离心收获菌体，用质粒提取试剂盒提取质粒，用PstI和BamHI进行双酶切和测序鉴定，结果正确，即得到了重组质粒D-FAP.291和D-FAP.291I9，图谱见图2B和2C。

分别将D-FAP.291和D-FAP.291I9以及CpVR空质粒转染293细胞，48小时后收集细胞并裂解，取上清进行Western Blot蛋白免疫印迹分析，结果如图2D所示：D-FAP.29，D-FAP.291I9和CpVR质粒转染的293细胞所表达的蛋白能够被Myc标签抗体染色，并且其分子量大小与各质粒表达的融合蛋白的预期分子量23.5kD相符合；而作为阴性对照的CpVR则不能被抗体染色。结果表明，D-FAP.291和D-FAP.291I9两种质粒均能够正确表达目的基因编码的融合蛋白。

3.表位肽疫苗的抗肿瘤应用

3.1FAP.291同FAP.291I9混合联用CpG佐剂的抗肿瘤效果

将体重为16～18g的BALB/c小鼠随机分为三组，每组10只，包括单独的佐剂组(CpGODN)佐剂组分包括CpG ODN、IFA和H-Peptide；单独FAP.291同FAP.291I9表位肽混合组(FAP₂₉₁ Peptides)；以及混合表位肽同佐剂联用组(CpG+FAP₂₉₁ Peptides)。采用混合组分皮下注射的方式进行免疫，应用预防性治疗策略，免疫分为三次，每次之间间隔两周，并且在第三次免疫结束一周后对小鼠进行致死剂量的4T1细胞攻瘤，成瘤后进行肿瘤大小的测定，并且在初免后的第57天进行瘤重的测定及相关细胞免疫反应检测。

对比CpG+FAP₂₉₁ Peptides组和CpG ODN组，我们看到表位肽组分是发挥抑瘤作用的关键因素，虽然从整体生长曲线及瘤重结果(3A)上看，其抑瘤作用并不显著，但是从攻瘤后的第15天开始，抑瘤曲线上开始呈现出两组小鼠肿瘤体积显著的差异(P<0.05)。并且瘤重结果(3B)显示，与单独佐剂组(CpG ODN)比较，混合表位肽佐剂联用组(FAP₂₉₁ peptides)的肿瘤生长抑制率为20％。以上结果表明，FAP₂₉₁表位肽具有一定的抗肿瘤作用。

随后，我们对小鼠脾细胞表位肽特异性的IFN-γ分泌水平以及特异性T淋巴细胞杀伤活性进行了检测。如图3C所示，对于FAP.291小肽的刺激，相比于CpG ODN组，CpG+FAP₂₉₁Peptides组的分泌细胞数都有明显的提高(P<0.01)。从图3D的细胞特异性杀伤结果我们也可以看到，对比于CpG ODN组，联用佐剂后的CpG+FAP₂₉₁ Peptides更为明显地提高了特异性杀伤活性(P<0.05)。

以上结果表明：综上，FAP.291同FAP.291I9混合联用CpG ODN佐剂对4T1荷瘤鼠进行预防性治疗，可以在一定程度上发挥抑瘤效果，并且这种抑瘤作用同疫苗活化的表位肽特异性的细胞免疫反应具有一定相关性。

3.2微基因疫苗D-FAP.291和D-FAP.291I9的抗肿瘤应用

3.2.1D-FAP.291和D-FAP.291I9微基因疫苗的免疫原性检测

将体重约18～20g的BALB/c小鼠进行随机分组，每组5只。包括PBS阴性对照组，Vector空载体对照组，D-FAP.291疫苗组以及D-FAP.291I9疫苗组。采用小鼠双侧腿部肌肉注射的方式，对各组小鼠进行免疫间隔为3天的三次快速免疫。并且在初免后的第24天，取脾进行相关细胞免疫检测。分离各组小鼠的脾脏，制备单细胞悬液，检测脾细胞FAP.291表位肽特异性IFN-γ分泌水平以及CTL杀伤能力。如图4A所示，当用不加刺激物的培养基R10刺激后，D-FAP.291以及D-FAP.291I9两组分泌IFN-γ的斑点数均多于Vector组，其中D-FAP.291I9更加明显(P<0.05)，这种非特异性斑点的增多说明微基因疫苗在一定程度上活化了小鼠的免疫系统，当用FAP.291小肽刺激后，同Vector组相比，免疫有微基因疫苗的两组IFN-γ分泌的斑点数明显提高(P<0.01)，并且D-FAP.291I9相比于D-FAP.291疫苗提高的更为明显(P<0.05)。如图4B所示，脾细胞的特异性杀伤活性同IFN-γ的分泌细胞数相一致，即相比Vector组，免疫有微基因疫苗的两组特异性细胞杀伤活性明显提高(P<0.01)，并且D-FAP.291I9相比于D-FAP.291提高的更为明显(P<0.01)。以上结果表明，D-FAP.291和D-FAP.291I9微基因疫苗均可以有效诱导表位肽特异性的细胞免疫反应，并且D-FAP.291I9诱导的特异性反应更强。

3.2.2D-FAP.291和D-FAP.291I9微基因疫苗的抗肿瘤活性

选取体重为16～18g的BALB/c小鼠，在第0天以致死剂量的4T1细胞对小鼠进行右后背部皮下攻瘤，在第7天瘤体有明显触感时(直径>2mm)随机分为4组，每组8～9只，包括PBS阴性对照组，单独的佐剂组(Vector)，原表位肽微基因疫苗组(D-FAP.291)，以及模拟表位肽微基因疫苗组(D-FAP.291I9)。采用腿部肌肉注射的方式，对各组小鼠进行免疫间隔为3天的三次快速免疫。跟踪进行肿瘤体积的测定，并且在种瘤后的第24天进行剥瘤称重。肿瘤生长曲线和瘤重结果(图5A，5B)显示：对比PBS组和Vector载体组，两者在肿瘤的生长趋势以及瘤重大小上并不存在明显差别，说明DNA疫苗中载体本身没有抑制肿瘤生长的作用；再对比Vector组和微基因疫苗组，D-FAP.291和D-FAP.291I9都表现了明显的抑制4T1荷瘤鼠肿瘤生长的作用(P<0.01)；根据疫苗组和佐剂组的平均瘤重计算抑瘤率，D-FAP.291I9疫苗的抑瘤率为50％，D-FAP.291疫苗的抑瘤率更是高达67％。对比D-FAP.291和D-FAP.291I9两组，两种疫苗无论是从肿瘤生长曲线还是瘤重水平上都没有表现出明显的差别，不过从趋势上可以看出D-FAP.291疫苗的抑瘤效果似乎略优于D-FAP.291I9疫苗。综上，在4T1荷瘤鼠模型上，D-FAP.291和D-FAP.291I9两种微基因疫苗都具有抑制肿瘤生长的作用，并且两者之间并没有明显的差别。

为了考察疫苗对生存期的延长作用，我们采用同抑瘤率实验相同的免疫策略，对4T1荷瘤小鼠进行了治疗，如图5C所示，PBS阴性对照组小鼠肿瘤接种后第34天开始发生迅速死亡的现象，而D-FAP.291和D-FAP.291I9疫苗组小鼠生存期则观察至种瘤后的第51天。生存数据分析显示，PBS组的中位生存期为35.5天，D-FAP.291疫苗以及D-FAP.291I9疫苗治疗组的生存期可达到38.5天和39天。通过计算得到两种疫苗生命延长率约为10％，即与PBS对照组相比，两种疫苗能够明显延长荷瘤小鼠的生存期(P<0.001)，但两种疫苗相比并没有显著区别。

随后，我们对小鼠脾细胞表位肽特异性的IFN-γ分泌水平以及特异性T淋巴细胞杀伤活性进行了检测。如图5D所示：D-FAP.291和D-FAP.291I9微基因疫苗组脾细胞在FAP.291的刺激下，分泌IFN-γ的细胞数要显著多于Vector佐剂组(P<0.01)，其中D-FAP.291I9组略高于D-FAP.291组(P<0.05)。图5E显示了各组脾细胞对FAP.291孵育的特异靶细胞杀伤水平，同IFN-γ分泌水平相一致，疫苗组对比Vector组明显提高了T细胞的特异性杀伤活性，但两种疫苗之间无显著差异。结果表明两种疫苗能诱导荷瘤鼠体内FAP.291的特异性的T细胞反应并发挥良好的抗肿瘤作用。

序列表

<110> 吉林大学

<120> 以FAPα的CTL表位肽为基础的肽类疫苗和微基因疫苗的应用

<130> 1

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 9

<212> PRT

<213> 成纤维激活蛋白α(FAPα)

<400> 1

Tyr Tyr Phe Ser Trp Leu Thr Trp Val

1 5

<210> 2

<211> 9

<212> PRT

<213> 成纤维激活蛋白α(FAPα表位模拟肽)

<400> 2

Tyr Tyr Phe Ser Trp Leu Thr Trp Ile

1 5

<210> 3

<211> 9

<212> PRT

<213> 成纤维激活蛋白α(FAPα表位模拟肽)

<400> 3

Tyr Tyr Phe Ser Trp Leu Thr Trp Phe

1 5

<210> 4

<211> 9

<212> PRT

<213> 成纤维激活蛋白α(FAPα表位模拟肽)

<400> 4

Tyr Tyr Phe Ser Trp Leu Thr Trp Leu

1 5

<210> 5

<211> 9

<212> PRT

<213> 成纤维激活蛋白α(FAPα表位模拟肽)

<400> 5

Tyr Tyr Phe Ser Trp Leu Thr Trp Trp

1 5

<210> 6

<211> 9

<212> PRT

<213> 成纤维激活蛋白α(FAPα表位模拟肽)

<400> 6

Tyr Tyr Phe Ser Trp Leu Thr Trp Met

1 5

<210> 7

<211> 9

<212> PRT

<213> 成纤维激活蛋白α(FAPα表位模拟肽)

<400> 7

Tyr Val Phe Ser Trp Leu Thr Trp Val

1 5

<210> 8

<211> 9

<212> PRT

<213> 成纤维激活蛋白α(FAPα表位模拟肽)

<400> 8

Tyr Ile Phe Ser Trp Leu Thr Trp Val

1 5

<210> 9

<211> 594

<212> DNA

<213> 人工合成（人工序列）

<400> 9

ctgcagatgg atgcaatgaa gagagggctc tgctgtgtgc tgctgctgtg tggagcagtc 60

ttcgtttcgc ccagcagaga aaaaagatat tatttcagct ggctcacatg ggtgagagaa 120

aaaagatatt atttcagctg gctcacatgg gtgagagaaa aaagatatta tttcagctgg 180

ctcacatggg tgagagaaaa aagatattat ttcagctggc tcacatgggt gagagaaaaa 240

agaatggctc ctcagtctat tacagaacta tgttcggaat atcgcaacac acaaatatat 300

acgataaatg acaagatact atcatatacg gaatcgatgg caggcaaaag agaaatggtt 360

atcattacat ttaagagcgg cgcaacattt caggtcgaag tcccgggcag tcaacatata 420

gactcccaaa aaaaagccat tgaaaggatg aaggacacat taagaatcac atatctgacc 480

gagaccaaaa ttgataaatt atgtgtatgg aataataaaa cccccaattc aattgcggca 540

atcagtatgg aaaacgagca gaaactcatc tctgaagagg atctgtaagg atcc 594

<210> 10

<211> 594

<212> DNA

<213> 人工合成（人工序列）

<400> 10

ctgcagatgg atgcaatgaa gagagggctc tgctgtgtgc tgctgctgtg tggagcagtc 60

ttcgtttcgc ccagcagaga aaaaagatat tatttcagct ggctcacatg gatcagagaa 120

aaaagatatt atttcagctg gctcacatgg atcagagaaa aaagatatta tttcagctgg 180

ctcacatgga tcagagaaaa aagatattat ttcagctggc tcacatggat cagagaaaaa 240

agaatggctc ctcagtctat tacagaacta tgttcggaat atcgcaacac acaaatatat 300

acgataaatg acaagatact atcatatacg gaatcgatgg caggcaaaag agaaatggtt 360

atcattacat ttaagagcgg cgcaacattt caggtcgaag tcccgggcag tcaacatata 420

gactcccaaa aaaaagccat tgaaaggatg aaggacacat taagaatcac atatctgacc 480

gagaccaaaa ttgataaatt atgtgtatgg aataataaaa cccccaattc aattgcggca 540

atcagtatgg aaaacgagca gaaactcatc tctgaagagg atctgtaagg atcc 594

Claims

1.一种CTL表位肽，其特征在于，来源于成纤维细胞激活蛋白α（FAPα），所述的表位肽为FAP.291，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

2.一种CTL模拟表位肽，该表位肽为权利要求1所述的表位肽FAP.291的模拟表位肽FAP.291I9，其特征在于，所述表位肽氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

3.权利要求1~2任一项所述的表位肽在制备防治FAP表达阳性肿瘤的产品中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述产品中包括疫苗。

5.根据权利要求4所述的疫苗，其特征在于，所述疫苗包括表达权利要求1~2中表位肽的重组DNA疫苗、病毒载体疫苗、肽类疫苗。

6.根据权利要求5所述的疫苗，其特征在于，包含一种SEQ ID NO:9 所示的tPA-FAP.291-LTB核酸序列或SEQ ID NO:10 所示的tPA-FAP.291I9-LTB核酸序列。

7.根据权利要求5所述的疫苗中的DNA疫苗，其特征在于载体骨架为CpVR，在所述CpVR载体上以多克隆酶切位点的连接方式插入SEQ ID NO:9 或SEQ ID NO:10所示的核酸序列。

8.根据权利要求7所述的疫苗中的DNA疫苗，所述插入的多克隆位点为PstI/BamHI。

9.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述产品中还包括免疫佐剂和/或化疗药物。

10.根据权利要求9所述的应用，其中所述的免疫佐剂包括CpG、IL-2、氢氧化铝、MF59、可溶性PD-1分子。