CN102558341B - 猪cd28受体，编码其的基因及其应用 - Google Patents

猪cd28受体，编码其的基因及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供猪CD28受体分子，其为：1)由SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质，或2)在SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列中经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等活性的由1)衍生的蛋白质。本发明还提供编码其的基因，其核苷酸序列如SEQ IDNo.1所示。本发明提供的共刺激受体CD28特异性地高表达于T细胞，可以增强T细胞在受到抗原刺激时的激活、增殖和细胞因子分泌活性，进而增强宿主后天性免疫应答、增强疫苗免疫效果。

Description

猪CD28受体,编码其的基因及其应用
技术领域
本发明属于动物基因工程领域，具体涉及猪CD28受体，编码其的基因及其应用。
背景技术
中国是一个猪肉生产和消费大国，然而目前猪瘟、繁殖和呼吸综合症(蓝耳病，PRRSV)等疫病严重流行是我国养猪行业面临的最大困难，因此疫病防控成为稳定和发展养猪业亟待解决的重大问题。然而，近年来猪病普遍呈现多病原交叉混合感染，猪的抗病能力和疫苗的防治效果明显降低。因此要做好疫病防控工作，需要寻找疫苗研发的新策略，或者寻求替代或辅助途径，如培育出具有抗病性的新品种猪。然而已有的研究成果多致力于利用特定疾病抗性基因培养单一抗病特性的家畜新品种。而这种策略显然与当前我国养猪业疫病多发的现实状况差距太大。因此，培育出具有广谱抗病性的新品种猪成为众多科研人员的理想。
适应性免疫应答反应在动物抵抗病原体侵袭过程中发挥着至关重要的作用。T细胞的活化更是该反应的重中之重。近年来的研究证明，T细胞的有效激活需要双信号刺激。一是MHC-抗原肽与TCR结合产生的第一信号，二是共刺激受体，主要是CD28与其配体结合产生的第二信号。在正常的机体微环境下，抗原递呈细胞递呈出来的抗原肽往往数量较少，其与TCR的结合不足以活化T细胞，容易造成T细胞反应无能。而T细胞共刺激受体CD28等提供的共刺激信号通路可以弥补较弱的TCR信号，从而激活T细胞。再者，当TCR与抗原肽的亲和不足时，往往难以活化T细胞，而足够的共刺激信号也能起到增强TCR信号通路的作用，从而激活T细胞。总之，足够的共刺激信号，既可以克服TCR占有率较少的问题，还可以弥补TCR亲和力的不足。因此共刺激受体介导的信号能增强适应性免疫系统功能，从而具备成为广谱抗病基因候选的潜能。
CD28受体作为共刺激受体中的典型代表，其基因序列信息和蛋白功能在人和小鼠的相关研究中，已有详尽的描述。CD28受体是公认的T细胞起始增殖及存活的主要共刺激分子。该受体与其配体B7.1(亦名CD80)或B7.2(亦名CD86)连接后，对T细胞的激活、增殖和存活都有明显的促进作用，而且可以影响T细胞的分化方向，并上调IFN-γ等细胞因子的表达。已有研究发现老年人T细胞表面的CD28分子表达水平明显下调，某些免疫系统激活滞后的病例也表现为CD28分子表达水平较低。因此，CD28分子的表达水平直接影响免疫系统的有效激活，进而影响生物个体的抗病能力。
CD28受体对T细胞免疫反应的建立、增强及其维持都具有重要作用，这预示着他们作为靶基因在转基因育种研究及应用中具有良好的前景。但是目前绝大多数共刺激分子相关研究都是基于基因敲除或者是利用抗CD28的单抗来除去或者增强共刺激信号的方式进行的。这些策略明显不适于育种研究。再者，猪的CD28受体目前只有预测的基因序列信息被公布，其确切的编码序列及其蛋白功能在此之前均未有报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种猪CD28受体，编码其的基因及其应用。
为实现上述目的，本发明首先提供一种猪CD28受体，其为：由SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质。
应当理解，本领域技术人员可根据本发明公开的氨基酸序列，在不影响其活性的前提下，取代、缺失和/或增加一个或几个氨基酸，得到所述蛋白的突变序列。因此，本发明猪CD28受体还包括由SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列中经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等活性的由SEQ ID NO.2所示的蛋白质衍生的蛋白质。例如在非活性区段，将第181位的丝氨酸替换为苏氨酸，或是将第188位的谷氨酰胺缺失，或是在198位后面增加3个脯氨酸。
优选的，衍生蛋白的氨基酸序列与SEQ ID No.2所示的氨基酸序列的同源性可为70％以上，优选80％以上，更优选90％以上。
本发明还提供编码上述蛋白的基因。优选的，本发明提供的编码猪CD28受体的基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
应理解，考虑到密码子的简并性以及不同物种密码子的偏爱性，本领域技术人员可以根据需要使用适合特定物种表达的密码子。
本发明还提供的含有猪CD28受体基因的载体、细胞系及宿主菌均属于本发明的保护范围。
本发明还提供所述的猪CD28受体在提高猪广谱抗病性中的应用。如通过制备抗猪CD28单抗来研制生物制剂，以口服或注射方式给药后，该单抗与CD28受体的结合可增强T细胞激活所需的第二信号，进而增强T细胞免疫反应，提高猪的抗病能力。
本发明还提供上述的猪CD28受体基因在培育广谱抗病性猪中的应用。具体方法为：
1)将猪CD28受体基因克隆到真核表达载体上，或通过体外转录的方法获得猪CD28受体基因mRNA；
2)利用电穿孔法将制备的重组载体或mRNA导入猪胚胎细胞；
3)获得CD28表达水平上调，从而广谱性抗病性提高的转基因猪。
本发明基于共刺激受体CD28的转基因策略是动物育种研究的一项新型策略。将共刺激受体CD28特异性地高表达于T细胞，可以增强T细胞在受到抗原刺激时的激活、增殖和细胞因子分泌活性，进而增强宿主后天性免疫应答、增强疫苗免疫效果。所以，本领域技术人员可以预见转基因动物个体培育成功后，在病原感染时的免疫功能及其抗病能力也将明显提高。基于高表达CD28的策略，与培养单一抗病特性的家畜新品种相比，可以更有效地地增强宿主在受到多病原交叉混合感染时的抗病能力，并提高疫苗效果。
附图说明
图1是载体pIRES-CD28HA构成模式图，其中CMV：巨细胞病毒(CMV)启动子，可调控目的基因在真核细胞内表达的启动子；CD28：猪CD28基因编码区；HA：编码一个HA(流感病毒血细胞凝集素抗原决定簇)短肽的一段基因序列，可作为标签来检测所融合蛋白的表达情况；IRES：真核mRNA 5′端具有一段较短的RNA序列，能独立地起始翻译；EGFP：增强型绿荧光蛋白基因编码区；SV40：是是猴空泡病毒40mRNA末端的一段多聚腺苷酸残基，具有终止转录、增强RNA的稳定性的作用。
图2是用鼠CD28 mRNA转染鼠T细胞后，用流式细胞术检测其CD28高表达的情况。其中A为转染20μg CD28 mRNA后，高表达CD28的T细胞数量增多；B为高表达CD28的T细胞荧光强度增强，即平均每个T细胞表面CD28分子数量增多。
图3是用鼠CD28 mRNA转染鼠T细胞后，在受到抗原递呈系统刺激时，细胞表面激活标志分子(Marker)表达水平上调的情况。其中A为转染20μg CD28 mRNA后，激活marker(CD25、CD44和CD69)高表达的T细胞数量增多；B为高表达激活Marker(CD25、CD44和CD69)的T细胞荧光强度增强，即平均每个T细胞表面激活Marker数量增多。
图4是用鼠CD28 mRNA转染鼠T细胞后，在受到抗原递呈系统刺激时，细胞分泌IFN-γ的量增多，但IL-4的分泌量较未转染CD28 mRNA的细胞没有明显变化。
图5是用鼠CD28 mRNA转染鼠T细胞后，在受到抗原递呈系统刺激时，细胞分化方向受到明显影响。其中转录因子T-bet，GATA3，RORγt的上调表明更多T细胞向Th1，Th2和Th17这些具有正向免疫调控作用的亚型分化，Foxp3因子的下调表明T细胞向Treg方向(负向调控)的分化受到抑制。
图6是猪外周血单个核细胞(PBMC)转染pIRES-CD28HA质粒后，用Western blot方法检测其外源蛋白表达情况。
图7是猪外周血单个核细胞(PBMC)转染pIRES-CD28HA质粒后在受到抗原(PRRSV)刺激时，其T细胞激活marker CD25分子的转录水平明显提高。
图8是猪外周血单个核细胞(PBMC)转染pIRES-CD28HA质粒后在受到抗原(PRRSV)刺激时，其PBMC细胞内IFN-γ转录水平明显提高。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1 CD28基因的克隆
本发明以人和猪基因序列比对结果具有较高相似性为理论基础，根据人的CD28序列设计引物，以五指山猪的cDNA为模板调取猪的CD28疑似序列。具体操作步骤为：
(1)通过与人类的CD28基因序列进行比对，在猪的基因组中找到相似性较高的基因片段，并据此设计引物(见表1：P1和P2)。
(2)猪外周血单个核细胞(PBMC)cDNA的提取：
从猪的前腔静脉无菌采取20ml肝素钠抗凝血，经PBS等体积稀释、混匀后，将其缓慢加于等体积的猪淋巴细胞分离液(天津灏翔，中国)上，水平转子离心1800rpm，20min。之后吸取血浆下的淋巴细胞层，获得PBMC。利用Invitrogen公司的Trizol试剂(
Figure BDA0000122009770000051
LSReagent)提取PBMC的总RNA，再用ABI公司的反转录试剂盒(FirstStrand Synthesis Kit for RT-PCR)合成猪的cDNA。
(3)以猪的cDNA为模板，利用NEB公司的phusion高保真聚合酶试剂盒扩增其CD28的疑似序列。
扩增反应体系：双蒸水，34.5μl；5×HF buffer，10μl；10mM dNTPmix，1μl；25μM P1，1μl；25μM P2，1μl；phusion聚合酶，0.5μl；cDNA，2μl。
反应程序：预变性：98℃，1min；
          循环(35个)：98℃，10s；55℃，20s；72℃，1min；
          补充延伸：72℃，10min。
扩增所得产物连接到商品化克隆载体(pEASY-Blunt Simple)上，送至上海美吉生物医药科技有限公司测序。
(4)根据步骤(3)所测得的序列信息设计5’RACE和3’RACE所需引物(表1：5’GSP1和5’GSP2；3’GSP1和3’GSP2)，利用TAKARA公司的试剂盒(5’-Full RACE Kit和3’-Full RACE Core SetVer.2.0)，获取其5’和3’末端的转录非翻译区(UTR)序列信息，cDNA全长序列如SEQ ID No.1所示，该蛋白的全长氨基酸序列如SEQ IDNo.2所示。
表1 猪CD28基因克隆所用的引物
Figure BDA0000122009770000061
实施例2 小鼠模型中CD28基因上调表达对T细胞免疫反应的影响
以BALB/C小鼠系统为模型，检测其CD28分子过表达后的细胞功能变化情况。具体操作步骤为：
(1)质粒pGEM4Z/mCD28/A64的构建：以pGEM4Z(购自Promega)为出发载体，按照David Boczkowski，Smita K.Nair，Jong-Hee Nam，et al.，Induction of Tumor Immunity and Cytotoxic TLymphocyte Responses Using Dendritic Cells Transfected withMessenger RNA Amplified from Tumor Cells，2000公开的方法构建质粒pGEM4Z/mCD28/A64。
(2)CD28 mRNA的合成与纯化：CD28 mRNA的合成遵照Promega公司的RiboMAXTM Large Scale RNA Production Systems-T7的说明书进行。CD28 mRNA合成后，用试剂盒RNessy Mini Kit(Qiagen)纯化RNA，最后将RNA溶于DEPC水中，分光光度计测定浓度后分装保存于-80℃。
(3)模拟抗原递呈系统的建立(即在96孔细胞培养板上包被抗CD3抗体和B7分子)：将抗鼠CD3抗体(Anti-murine CD3e，BD)用PBS(pH7.2-7.4)稀释为2μg/ml，B7分子(recombinant B7-1/Fcchimeric protein(R&D Systems，Minneapolis，MN))也用PBS(pH7.2-7.4)稀释为0.4μg/ml，向每个细胞孔中加入稀释后的抗CD3抗体和B7分子各50μl，4℃过夜孵育平板。用PBS洗涤两次后，可向孔中加入T细胞。
(4)鼠脾脏T细胞提取：遵照Miltenyi Biotec公司的Pan T CellIsolation Kit说明书进行。
(5)鼠脾脏T细胞的转染：将分离的到的2×106T细胞溶于100μl鼠T细胞转染液(Solution，AMAXA)，加入20μg CD28 mRNA，同时设立阴性对照，即不加RNA，轻轻混匀后转移到2mm核转杯(AMAXA)中。将核转杯放入核转仪(AMAXA)中，用X001程序进行转染，然后迅速加入0.5ml 37℃预热的完全1640培养基，并将细胞加入抗CD3抗体和B7分子包被处理过的细胞培养板上(约0.7×106细胞/孔)进行刺激。将培养板置于37℃，5％CO2的细胞培养箱中培养。
(6)鼠脾脏T细胞转染后CD28表达水平的检测：转染后的T细胞，受模拟抗原递呈系统(CD3抗体和B7分子包被体系)刺激24小时后，用APC标记的抗鼠CD28抗体(Biolegend)进行染色，再用流式细胞术对CD28的表达水平进行检测。
(7)鼠脾脏T细胞转染后在受到抗原递呈系统刺激时，其激活情况的检测：转染后的T细胞，受模拟抗原递呈系统(CD3抗体和B7分子包被体系)刺激24小时后，用FITC标记的抗鼠CD25抗体，APC标记的抗鼠CD44抗体和PerCP/Cy5.5标记的抗鼠CD69抗体(Biolegend)进行染色，再用流式细胞术对CD25，CD44和CD69等激活marker的表达水平进行检测。
(8)鼠脾脏T细胞转染后在受到抗原递呈系统刺激时，其细胞因子(IFN-γ和IL-4)分泌情况的检测：转染后的T细胞，受模拟抗原递呈系统(CD3抗体和B7分子包被体系)刺激48小时后，收集细胞培养上清，用ELISA方法对所分泌的细胞因子进行定量分析。IFN-γ的测定是参照eBioscience公司的Mouse IFN-λ ELISA kit说明书进行。IL-4的测定是参照SouthernBiotech公司的Rat Anti-MouseInterleukin-4(IL-4)ELISA Set说明书进行。
(9)鼠脾脏T细胞转染后在受到抗原递呈系统刺激时，其分化方向的检测：转染后的T细胞，受模拟抗原递呈系统(CD3抗体和B7分子包被体系)刺激48小时后，提取细胞RNA，并进行反转录。用相对荧光定量PCR(SYBGreen染料法)对T-bet，GATA3，RORγt和Foxp3等转录因子的转录水平进行分析，并设置Beta-Actin基因为内参基因。反应所用的引物见下表。
表2 用相对荧光定量PCR(SYBGreen染料法)对鼠各转录因子的转录水平进行分析时所用的引物
Figure BDA0000122009770000081
Figure BDA0000122009770000091
结果表明，用mRNA转染T细胞后，高APC荧光强度的细胞数量明显增多，即CD28表达水平明显上调(图2)。高表达CD28的T细胞在受到抗原递呈系统刺激时，其细胞表面的激活标志分子CD25，CD44和CD69的表达水平均明显上调(图3)。ELISA结果显示，转染CD28mRNA后的T细胞在受到刺激后，其细胞因子IFN-γ的分泌活性也明显增强(图4)。而且，据转录水平的检测结果，其T-bet(Th1型)，GATA3(Th2型)，RORγt(Th17型)转录因子的表达水平明显上调，表明T细胞向Th1，Th2和Th17这些具有正向免疫调控作用的亚型分化趋势增强(图5)。
实施例3 猪CD28基因上调表达对猪T细胞免疫反应的影响
利用本发明提供的策略，将含有猪CD28基因的质粒转染猪外周血单个核细胞(PBMC，主要包含T淋巴细胞)，在细胞水平上检测其受到抗原(PRRSV)刺激时细胞的激活和细胞因子分泌活性。
(1)真核表达载体pIRES-CD28HA的构建。设计上游引物：5′(EcoRI)GAATTCATGATCCTCGGGTTACTCCTGG 3′和下游引物：5′(BamHI)GGATCCTCAAGCAACGTCCGGAACGTCGTACGGGTAGGAGCGGTAGGCTGCAAAG 3′(阴影部分为HA标签序列)，以含CD28基因的克隆载体为模板，扩增猪CD28片段。反应体系和程序同实施例1中的步骤3。所克隆的片段两端分别含有EcoRI和BamHI酶切位点，且下游引入了HA标签序列，便于用western-blot检测融合蛋白表达情况。最后，将扩增所得的片段连接到经EcoRI和BamHI共酶切后的骨架载体pIRES2-EGFP(购自BD Biosciences Clontech)上。构建后的质粒见图1。
(2)pIRES-CD28HA质粒的大量提取：
参照OMEGA公司生产的E.Z.N.A.TM Endo-Free Plsamid MaxiKit说明书进行。质粒提取完成后，用分光光度计测定质粒的浓度。
(3)猪外周血单个核细胞(PBMC)的提取：
从猪的前腔静脉无菌采取20ml肝素钠抗凝血，经PBS等体积稀释、混匀后，将其缓慢加于等体积的猪淋巴细胞分离液(天津灏翔，中国)上，水平转子离心1800rpm，20min。之后吸取血浆下的淋巴细胞层，获得PBMC。
(4)猪外周血PBMC的转染：
细胞计数后，将5×106PMBC溶于100μl恢复至室温的鼠淋巴细胞转染缓冲液中(AMAXA，mouse T cell transfection kit)，加入4μgpIRES-CD28HA，同时设立阴性组，即不加质粒，轻轻混匀后转移到2mm核转杯(AMAXA)中。将核转杯放入核转仪(AMAXA)中，用核转仪(AMAXA LONZA)中的固有程序Z001程序进行转染，然后迅速将细胞转移至2ml 37℃预热的完全1640培养基中，并置于37℃，5％CO2的细胞培养箱中培养。
(5)用Eestern-blot方法检测外源基因的表达情况。因转染所用的载体pIRES-CD28HA，其携带的CD28基因已与HA标签融合，故可用鼠源抗HA标签的商品化抗体与融合蛋白杂交，再用HRP(辣根过氧化物酶)标记的抗鼠二抗对杂交情况进行检测。
(6)猪外周血单个核细胞(PBMC)转染后在受到抗原(PRRSV)刺激时，其激活情况的检测：用载体pIRES-CD28HA转染猪PBMC8小时后，用0.1MOI PRRSV感染这些细胞。感染24小时后，利用相对荧光定量PCR(SYBGreen染料法)对其T细胞激活Marker CD25分子的转录水平进行分析，并设置GAPDH基因为内参基因。所用引物见下表3。
表3 用相对荧光定量PCR(SYBGreen染料法)对猪的激活Marker(CD25分子)和IFN-γ的转录水平进行分析时所用的引物
Figure BDA0000122009770000101
Figure BDA0000122009770000111
(7)猪外周血单个核细胞(PBMC)转染后在受到抗原(PRRSV)刺激时，其IFN-γ转录水平的检测：用载体pIRES-CD28HA转染猪PBMC 8小时后，用0.1MOI PRRSV感染这些细胞。感染24小时后，利用相对荧光定量PCR(SYBGreen染料法)对PBMC细胞内IFN-γ转录水平进行分析，并设置GAPDH基因为内参基因。所用引物见表3。
结果如附图所示，载体pIRES-CD28HA转染猪PBMC细胞后，用抗HA单抗检测到融合蛋白在细胞内可成功表达(图6)。高表达CD28的PBMC细胞在受到感染PRRSV的递呈细胞刺激后，其激活标志分子CD25的转录水平明显上调(图7)，激活的PBMC其细胞因子IFN-γ的转录水平(图8)也明显提高。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Figure IDA0000122009850000011
Figure IDA0000122009850000021
Figure IDA0000122009850000031
Figure IDA0000122009850000041
Figure IDA0000122009850000051
Figure IDA0000122009850000061

Claims (7)

1.猪CD28受体分子，其为由SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质。
2.编码权利要求1所述的猪CD28受体的基因。
3.根据权利要求2所述的基因，其特征在于，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
4.含有权利要求2或3所述基因的载体。
5.含有权利要求4所述载体的宿主细胞。
6.权利要求1所述的猪CD28受体在制备CD28的单克隆抗体制剂中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，以权利要求1所述的猪CD28受体分子为免疫原，制备CD28的单克隆抗体，再制备成制剂。
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