CN102206678A - 应用核转染法体外转染猪t淋巴细胞的方法 - Google Patents
应用核转染法体外转染猪t淋巴细胞的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN102206678A CN102206678A CN 201110090995 CN201110090995A CN102206678A CN 102206678 A CN102206678 A CN 102206678A CN 201110090995 CN201110090995 CN 201110090995 CN 201110090995 A CN201110090995 A CN 201110090995A CN 102206678 A CN102206678 A CN 102206678A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- pig
- cell
- transfection
- lymphocyte
- activated
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Images
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明涉及一种应用核转染法体外转染猪T淋巴细胞的方法。该方法包括应用电穿孔技术及细胞特异性的细胞核转染液将含有外源基因的表达载体或外源基因的mRNA导入猪T淋巴细胞中，转染后的细胞经过培养、分选出表达外源基因的猪T淋巴细胞。本发明的方法转染效率高，操作简便，所需质粒量少，目的基因表达迅速，有利于研究T细胞激活、效应阶段的特异性基因功能。
Description
技术领域
本发明涉及体外转染猪T淋巴细胞的方法，尤其涉及一种应用核转染法体外转染猪T淋巴细胞的方法。
背景技术
转基因技术是研究哺乳动物细胞的基因功能的重要手段，它包括逆转录病毒介导的感染、脂质体介导的转染、显微注射、电转染等。T细胞属于难以转染的细胞，外源核酸物质很难在T细胞中得以表达。经过数十年的努力，人们已经建立了较为完善且有效的转染T细胞的方法。这些方法主要包括慢病毒、腺病毒等病毒颗粒介导的转染法和电转法。但是这些方法有其固有的缺陷，首先这些方法大多是基于人和鼠源的T细胞开发出来的，并不完全适用于猪的T淋巴细胞。其次，这些方法都需要预先刺激T细胞后再进行转染，无法用来有效研究T细胞激活阶段的特异性基因功能。再次，病毒介导的转染法效率高，但是包装病毒需要高技术、高成本的支持，不利于推广。同时考虑到中国现有的养猪业现状，即我国是一个猪肉生产和消费大国，目前猪瘟、繁殖和呼吸综合症(蓝耳病)等疫病仍严重流行，且常呈现多病原交叉混合感染，猪的抗病能力和疫苗的防治效果明显降低，有必要开发一种新型的适用于猪源T细胞转染的转基因方法，深入研究猪的T细胞的相关免疫功能。
发明内容
本发明的目的是提供一种应用核转染法体外转染猪T淋巴细胞的方法。
本发明所提供的应用核转染法体外转染猪T淋巴细胞的方法，包括如下步骤：应用电穿孔技术及细胞特异性的细胞核转染液将含有外源基因的表达载体或外源基因的mRNA导入猪T淋巴细胞中，然后将转染的细胞经过培养、分选出表达外源基因的猪T淋巴细胞。
上述的猪T淋巴细胞可以是激活的猪T淋巴细胞。
猪T淋巴细胞的激活可以用现有的一种或几种激活剂进行激活，如用刀豆蛋白A。
上述的猪T淋巴细胞在上述细胞特异性的细胞核转染液中的浓度为1×106-1×107/100μl。
每1×106猪T淋巴细胞可加入0.4～0.8μg所述的含有外源基因的表达载体或3～7μg外源基因的mRNA。
上述的电穿孔条件为核转仪(AMAXALONZA)中的固有程序Z001或X001。
转染后的细胞可以在多种细胞培养基中培养，如在完全1640培养基中培养。
转染后的细胞可用荧光素(PE)标记的鼠抗猪CD3ε抗体和7-AAD染色，然后通过流式细胞仪分选。
本发明的体外转染猪T淋巴细胞的方法，应用电穿孔技术及细胞特异性的细胞核转染液将含有目的基因的质粒或目的基因的mRNA高效率地转入猪外周血初始T淋巴细胞和激活的T淋巴细胞中，以模式蛋白GFP为例，质粒介导的核转染法可实现对猪外周血初始T细胞约35％的细胞转染率和约50％的细胞活率，对激活的T细胞约20％的细胞转染率和约50％的细胞活率。RNA介导的核转染法可实现对猪外周血初始T细胞约50％的细胞转染率和约60％的细胞活率，对激活的T细胞约40％的细胞转染率和约60％的细胞活率；与传统的电转法相比，本发明方法操作简便，所需质粒量少，细胞转染率和细胞活率高，目的基因表达迅速，通常在转染后2h内即可观察到目的基因的表达(如图2所示)；有利于研究T细胞激活、效应阶段的特异性基因功能。
附图说明
图1应用核转染法体外转染猪T淋巴细胞的方法的流程示意图。
图2转染后2h GFP蛋白的表达荧光图。
图中A为质粒DNA转染后的表达情况、B为mRNA转染后的表达情况。图A和B中的黄色标尺代表10μm。
图3质粒介导的核转法。其中，A为猪外周血初始T淋巴细胞的转染、B为激活的T淋巴细胞的转染。
图4RNA介导的核转法。其中，A为猪外周血初始T淋巴细胞的转染、B为激活的T淋巴细胞的转染。
图5转染后细胞成活率的检测。其中，A为猪外周血初始T淋巴细胞、B为激活的T淋巴细胞。
具体实施方式
下面结合图1详细描述本发明的应用核转染法体外转染猪T淋巴细胞的方法。
将初始的T淋巴细胞或激活后的T淋巴细胞分散到淋巴细胞转染液中，再加入含有外源基因的表达载体或外源基因的mRNA，将混和液进行电穿孔，再将含有外源基因的表达载体或外源基因的mRNA导入猪T淋巴细胞中，然后将转染的细胞经过培养、分选出表达外源基因的猪T淋巴细胞。
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1
本发明所应用的质粒介导的核转染法的操作步骤为：
(1)pMaxGFP(AMAXA)质粒的大量提取：
参照OMEGA公司生产的E.Z.N.A.TM Endo-Free Plsamid Maxi Kit说明书进行。质粒提取完成后，用分光光度计测定质粒的浓度。
(2)猪外周血单个核细胞(PBMC)的提取：
从猪的前腔静脉无菌采取20ml肝素钠抗凝血，经PBS等体积稀释、混匀后，将其缓慢加于等体积的猪淋巴细胞分离液(天津灏翔，中国)上，水平转子离心1800rpm，20min。之后吸取血浆下的淋巴细胞层，获得PBMC。
(3)猪外周血PBMC的转染：
细胞计数后，将5×106未激活的或激活的PMBC溶于100μl恢复至室温的鼠淋巴细胞转染缓冲液中(AMAXA，鼠T细胞转染试剂盒)，加入4μg pMaxGFP，同时设立阴性组，即不加质粒，轻轻混匀后转移到2mm核转杯(AMAXA Lonza，德国)中。将核转杯放入核转仪中，用核转仪中的固有程序X001和Z001程序分别进行转染初始T细胞，X001和Z001程序分别进行转染激活的T细胞，然后迅速将细胞转移至2ml 37℃预热的完全1640培养基中，并置于37℃，5％CO2的细胞培养箱中培养。
激活的PMBC：先将3×106/ml PBMCs经2μg/ml conA刺激两天。
(4)T细胞转染效率和细胞成活率的检测：
转染24h后，将细胞从细胞板小心吸出，离心沉淀，并计数。然后取1×106细胞进行染色：将106细胞悬于100μl染色缓冲液(含有0.5％BSA和2mM EDTA的PBS)中，加入0.2μg荧光素(PE)标记的鼠抗猪CD3ε抗体(克隆号PPT3，SouthernBiotech)，混匀后置于冰上反应20分钟。之后用PBS清洗三遍，洗去未结合抗体。最后一遍洗涤后再将细胞悬于100μl染色缓冲液，加入0.25μg 7-AAD(BD Biosciences)，混匀后置于冰上反应10分钟。反应后直接加入适量PBS，用流式细胞仪(ACCRI C6，美国)检测细胞的成活率和T细胞的转染率(转染率＝表达GPF的T细胞比例/T细胞比例)。
结果如图3和5所示，对于初始T淋巴细胞而言，X001是最佳的转染程序；对于激活的T细胞，Z001是最佳的转染程序。质粒介导的核转染法可实现对猪外周血初始T细胞约35％的细胞转染率和约50％的细胞活率，对激活的T细胞约20％的细胞转染率和约50％的细胞活率。
实施例2
本发明所应用的RNA介导的核转染法的操作步骤为：
(1)质粒pGEM4Z/GFP/A64的构建：以pGEM4Z(购自Promega)为出发载体，按照David Boczkowski，Smita K.Nair，Jong-Hee Nam，et al.， Induction of Tumor Immunity and Cytotoxic T Lymphocyte Responses Using Dendritic Cells Transfected w
用实施例1(1)中的方法提取质粒pGEM4Z/GFP/A64，然后用限制性内切酶Spe1(NEB)对其进行酶切，过夜。经琼脂糖凝胶电泳法确定酶切完全后，用试剂盒PCR纯化试剂盒(Qiagen)纯化线性化质粒，最后将质粒溶于DEPC水中，并用分光光度计测定其浓度。
(2)GFP mRNA的合成与纯化：
GFP mRNA的合成遵照Promega公司的RiboMAXTM Large Scale RNA Production Systems-T7的说明书进行，反应体系如下：
GFP mRNA合成后，用试剂盒RNessy Mini Kit(Qiagen)纯化RNA，最后将RNA溶于DEPC水中，分光光度计测定浓度后分装保存于-80℃；
(3)猪外周血单个核细胞(PBMC)的提取：同实施例1中的(2)
(4)猪PBMC的转染：将3×106未激活的和激活的PBMCs溶于100μl鼠T细胞转染液中后加入10μg或20μg GFP mRNA，同时设立阴性对照，即不加RNA，轻轻混匀后转移到2mm核转杯(AMAXA)中。将核转杯放入核转仪(AMAXA)中，用Z001(初始的和激活的T细胞)程序进行转染。其余步骤同实施例1中的(3)。
激活的PMBC：先将3×106/ml PBMCs经2μg/ml conA刺激两天。
(5)T细胞转染效率和存活率的检测：基本步骤同实施例1中的(4)。
结果如图4和5所示。这两种T细胞转染效率与GFP mRNA的转染量呈正相关。RNA介导的核转染法可实现对猪外周血初始T淋巴细胞细胞约50％的细胞转染率和约60％的细胞活率，对激活的T细胞约40％的细胞转染率和约60％的细胞活率。
Claims (7)
1.应用核转染法体外转染猪T淋巴细胞的方法，包括如下步骤：应用电穿孔技术及细胞特异性的细胞核转染液将含有外源基因的表达载体或外源基因的mRNA导入猪T淋巴细胞中，转染后的细胞经过培养、分选出表达外源基因的猪T淋巴细胞。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的猪T淋巴细胞是初始的猪T淋巴细胞或激活的猪T淋巴细胞。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述激活的猪T淋巴细胞是用刀豆蛋白A进行激活的。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述猪T淋巴细胞在所述细胞特异性的细胞核转染液中的浓度为1×106-1×107/100μl。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于每1×106所述猪T淋巴细胞加入0.4～0.8μg所述的含有外源基因的表达载体或3～7μg所述的外源基因的mRNA。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述转染后的细胞在完全1640培养基中培养。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述转染后的细胞用荧光素标记的鼠抗猪CD3ε抗体和7-AAD染色，然后通过流式细胞仪分选。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201110090995.1A CN102206678B (zh) | 2011-04-12 | 2011-04-12 | 应用核转染法体外转染猪t淋巴细胞的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201110090995.1A CN102206678B (zh) | 2011-04-12 | 2011-04-12 | 应用核转染法体外转染猪t淋巴细胞的方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN102206678A true CN102206678A (zh) | 2011-10-05 |
| CN102206678B CN102206678B (zh) | 2015-07-15 |
Family
ID=44695738
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201110090995.1A Active CN102206678B (zh) | 2011-04-12 | 2011-04-12 | 应用核转染法体外转染猪t淋巴细胞的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN102206678B (zh) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102558341A (zh) * | 2011-12-19 | 2012-07-11 | 中国农业大学 | 猪cd28受体，编码其的基因及其应用 |
| CN102558342A (zh) * | 2011-12-27 | 2012-07-11 | 中国农业大学 | 猪4-1bb受体，编码其的基因及其应用 |
| CN103424294A (zh) * | 2013-07-12 | 2013-12-04 | 北京大北农科技集团股份有限公司 | 一种检测猪外周血和脾脏淋巴细胞膜表面分子的样品制备试剂盒及其制备方法 |
| CN108342364A (zh) * | 2018-02-05 | 2018-07-31 | 翁炳焕 | 一种spa介导双抗体捕获的杂交瘤技术 |
-
2011
- 2011-04-12 CN CN201110090995.1A patent/CN102206678B/zh active Active
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| 《Nature Immunology》 20040125 Jagan R Muppidi et al Ligand-independent redistribution of Fas (CD95) into lipid rafts mediates clonotypic T cell death 全文 1-7 , * |
| 《中国畜牧兽医》 20101130 赵世云等 柔嫩艾美耳球虫电穿孔转染条件的优化 全文 1-7 第37卷, 第11期 * |
| 《易展仪表展览网http://www.18show.cn/bbs/showtopic-4096.html》 20101209 blizarrd 细胞核转染技术 正文第二、三、四部分 1-7 , * |
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102558341A (zh) * | 2011-12-19 | 2012-07-11 | 中国农业大学 | 猪cd28受体，编码其的基因及其应用 |
| CN102558341B (zh) * | 2011-12-19 | 2014-05-07 | 中国农业大学 | 猪cd28受体，编码其的基因及其应用 |
| CN102558342A (zh) * | 2011-12-27 | 2012-07-11 | 中国农业大学 | 猪4-1bb受体，编码其的基因及其应用 |
| CN102558342B (zh) * | 2011-12-27 | 2014-05-07 | 中国农业大学 | 猪4-1bb受体，编码其的基因及其应用 |
| CN103424294A (zh) * | 2013-07-12 | 2013-12-04 | 北京大北农科技集团股份有限公司 | 一种检测猪外周血和脾脏淋巴细胞膜表面分子的样品制备试剂盒及其制备方法 |
| CN108342364A (zh) * | 2018-02-05 | 2018-07-31 | 翁炳焕 | 一种spa介导双抗体捕获的杂交瘤技术 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN102206678B (zh) | 2015-07-15 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN102206678B (zh) | 应用核转染法体外转染猪t淋巴细胞的方法 | |
| CN105924533A (zh) | Ror1特异性嵌合抗原受体及其应用 | |
| CN101736062B (zh) | 一种重组猪α干扰素标准品的制备方法 | |
| CN106867967A (zh) | Midkine稳定低表达的LM3细胞系及其构建方法 | |
| CN112048469A (zh) | 一种增强间充质干细胞分泌功能的方法及应用 | |
| CN114835778A (zh) | 一种h9n2亚型aiv mhc b2限制性表位肽及其应用 | |
| Hao et al. | The evaluation of cellular immunity to avian viral diseases: methods, applications, and challenges | |
| CN111088270A (zh) | 一种制备永生化树突状细胞的基因、载体、方法和永生化树突状细胞 | |
| CN107794269A (zh) | 促进基因编辑t细胞活化及扩增的生物膜、制法及应用 | |
| CN107365742A (zh) | 一种CD4+T细胞来源的exosomes及其应用 | |
| CN104109653A (zh) | 利用无动物血清培养体系大规模扩增人外周血dnt细胞的方法 | |
| CN106957822A (zh) | 体外扩增基因编辑活化t细胞的培养方法、试剂盒及应用 | |
| CN105925544A (zh) | 一种包含4-1bb的慢病毒制备方法及应用 | |
| CN103266086B (zh) | 一种有效递呈胃癌抗原的树突状细胞的制备方法 | |
| CN102676678B (zh) | 用于区分五种贝类饵料微藻的pcr引物组 | |
| CN101368180A (zh) | 一类能将间充质干细胞分化为造血细胞的小rna分子及其作用靶点 | |
| Heger et al. | XCR1 expression distinguishes human conventional dendritic cell type 1 with full effector functions from their immediate precursors | |
| CN106480003B (zh) | 基于cd4+t细胞免疫的幽门螺杆菌优势抗原组合及筛选方法 | |
| CN109776661B (zh) | 一种牛结核病γ-干扰素ELISA检测用鸡尾酒刺激抗原 | |
| CN107619438A (zh) | 新型环二核苷酸受体及其激动剂或抑制剂筛选的方法和试剂盒 | |
| Sjaastad et al. | Reduced T Cell Priming in Microbially Experienced “Dirty” Mice Results from Limited IL-27 Production by XCR1+ Dendritic Cells | |
| Macke et al. | Evaluating maturation and genetic modification of human dendritic cells in a new polyolefin cell culture bag system | |
| CN106635986B (zh) | 促进cik细胞增殖分化的人参多糖、培养基、培养方法和应用 | |
| CN105219727A (zh) | 一种用于激活结直肠癌特异性免疫反应的试剂盒 | |
| Drake III et al. | Induction of polyomavirus-specific CD8+ T lymphocytes by distinct dendritic cell subpopulations |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant |