CN111088270A

CN111088270A - 一种制备永生化树突状细胞的基因、载体、方法和永生化树突状细胞

Info

Publication number: CN111088270A
Application number: CN201911397010.2A
Authority: CN
Inventors: 焦顺昌; 张嵘; 陈寅
Original assignee: Beijing Dingcheng Taiyuan Biotechnology Co ltd
Current assignee: Beijing Dingcheng Taiyuan Biotechnology Co ltd
Priority date: 2019-12-30
Filing date: 2019-12-30
Publication date: 2020-05-01
Anticipated expiration: 2039-12-30
Also published as: CN111088270B

Abstract

本发明提供了一种制备永生化树突状细胞的基因、载体、方法和永生化树突状细胞，属于基因工程技术领域，将ST40基因经linker与TAX2基因连接后，得到制备永生化树突状细胞的基因；所述ST40基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；所述TAX2基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。采用本发明提供的基因制备得到的永生化树突状细胞，除包括HLA‑A0201以外，还涵盖了中国人群常见的HLA‑A1101、HLA‑A2402、HLA‑A0301等近9种类型，大大增加了应用范围。

Description

一种制备永生化树突状细胞的基因、载体、方法和永生化树突状细胞

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，尤其涉及一种制备永生化树突状细胞的基因、载体、方法和永生化树突状细胞。

背景技术

以T淋巴细胞为主体的过继细胞治疗在抗肿瘤免疫治疗中的作用日益显著，如何获得足够数量的抗原特异性T细胞成为目前最重要的技术难点。传统的特异性T淋巴细胞的扩增方式主要是抗原肽和患者的PBMC共培养，其主要依赖于PBMC天然存在的抗原提呈细胞，特别是DC的提呈，进而活化T细胞；天然DC在体外培养存活时间短，在患者PBMC中所占的比例低，提呈能力有限。目前存在的永生化DC技术，虽然能解决上述提呈能力低的问题，但是仅适用于HLA-0201的患者，应用范围有限。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种制备永生化树突状细胞的基因、载体、方法和永生化树突状细胞，将本发明提供的基因插入原始载体，构建制备永生化树突状细胞的载体，所述载体增加了构建永生化树突状细胞的成功率，进而增加了HLA的应用范围。

为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：

本发明提供了一种制备永生化树突状细胞的基因，将ST40基因经linker与TAX2基因连接后，得到制备永生化树突状细胞的基因；

所述ST40基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；

所述TAX2基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

优选的，所述linker的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。

本发明还提供了一种制备永生化树突状细胞的载体，将上述技术方案所述的基因插入原始载体中，得到制备永生化树突状细胞的载体。

优选的，所述原始载体包括pCDH MSCV和/或pCDH-CMV。

本发明提供了一种制备永生化树突状细胞的方法，包括以下步骤：

1)将上述技术方案所述的载体包装慢病毒，得到包装病毒，将所述包装病毒感染树突状细胞，得到感染树突状细胞；

2)将滋养细胞接种于细胞培养器的上层培养室，将所述步骤1)得到的感染树突状细胞接种于细胞培养器的下层培养室，培养4～6周，除去CD3+细胞后继续培养1～2周，除去CD3+细胞后继续培养2个月以上，得到永生化树突状细胞。

优选的，所述步骤2)滋养细胞的制备包括：将外周血单个核细胞在含有质量百分含量为10％的FBS的1640培养基中培养过夜，得到滋养细胞。

优选的，所述步骤1)树突状细胞来源于外周血单个核细胞。

优选的，所述步骤1)滋养细胞的接种量为0.5～1.5×10⁶个/孔，所述感染树突状细胞的接种量为0.5～1.5×10⁶个/孔。

本发明还提供了上述技术方案所述的方法制备得到的永生化树突状细胞，所述永生化树突状细胞的表型包括：CD3-、CD4+、CD8-、CD16-、CD19-、CD56-、CD11c+、CD11b-、CD58+、CD40+、CD70+、CD80+、CD83+、CD86+、TCR-、CD11b-、CD197-、CD303-、CD1c-、CD205+、CD141和CD123+。

本发明提供了一种制备永生化树突状细胞的基因、载体和方法，将ST40基因经linker与TAX2基因连接后，得到；所述ST40基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；所述TAX2基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。采用本发明提供的基因制备得到的永生化树突状细胞，除包括HLA-A0201以外，还涵盖了中国人群常见的HLA-A1101、HLA-A2402、HLA-A0301、HLA-A0206、HLA-A2601、HLA-A0207、HLA-A3303、HLA-B3901、HLA-B4601 HLA-B0702HLA-B1501 HLA-B1301 HLA-B5401、HLA-B5501、HLA-B5101、HLA-C0102、HLA-C0702、HLA-C0303、HLA-C1202、HLA-C1602共21种类型，大大增加了该技术的应用范围。

附图说明

图1-1为流式检测DC细胞株表型CD3、CD4、CD8；

图1-2为流式检测DC细胞株表型CD80、CD58、CD70；

图1-3为流式检测DC细胞株表型CD11c、CD205、CD123；

图1-4为流式检测DC细胞株表型CD83、CD86、CD197；

图1-5为流式检测DC细胞株表型CD11b、CD16、CD1c；

图1-6为流式检测DC细胞株表型CD141、CD80、CD40；

图1-7为流式检测DC细胞株表型CD56、CD303、TCR；

图2为PBMC 1来源的DC的功能验证结果，其中深灰色为对照组，浅灰色为利用DC培养的CTL；

图3为PBMC 4来源的DC的功能验证结果，其中深灰色为对照组，浅灰色为利用DC培养的CTL；

图4为PBMC 6来源的DC的功能验证结果，其中深灰色为对照组，浅灰色为利用DC培养的CTL；

图5为PBMC 8来源的DC的功能验证结果，其中深灰色为对照组，浅灰色为利用DC培养的CTL；

图6为PBMC 10来源的DC的功能验证结果，其中深灰色为对照组，浅灰色为利用DC培养的CTL。

具体实施方式

本发明提供了一种制备永生化树突状细胞的基因，将ST40基因经linker与TAX2基因连接后，得到制备永生化树突状细胞的基因；所述ST40基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；所述TAX2基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

在本发明中，所述ST40基因为永生化基因，所述ST40基因的核苷酸序列如SEQ IDNo.1所示，具体如下所示：

atgaacatcaaagacgaatggtactggggtaagagtaagcacgcggtgactgagctcaacgcggagggatggatctttactctcccgccaagtgacaactacatcggacgtcaccggttgccggacgtccgattcagccaggagctacccgacgggacggtctactggtcggtgaaccggaagaacttcttccgccgggacgacagcctcccctcgggatgggtgcagcgcatctacccgcgtgtagctaccagcttcaggaccgcggaatga。

在本发明中，所述TAX2基因能够永生化T细胞，所述TAX2基因的核苷酸序列如SEQID No.2所示，具体如下所示：

gcccatttcccaggatttggacagagcctcctatatggataccccgtctacgtgtttggcgattgtgtacaggccgattggtgtcccgtctcaggtggtctatgttccacccgcctacatcgacatgccctcctggccacctgtccagagcaccaactcacctgggaccccatcgatggacgcgttgtcagctctcctctccaataccttatccctcgcctcccctccttccccacccagagaacctcaaggaccctcaaggtccttacccctcccaccactcctgtctcccccaaggttccacctgccttctttcaatcaatgcgaaagcacaccccctaccgaaatggatgcctggaaccaaccctcggggatcagctcccctccctcgccttccccgaacctggcctccgtccccaaaacatctacaccacctggggaaaaaccgtagtatgcctatacctataccagctttccccacccatgacatggccacttataccccatgtcatattctgccaccccagacaattaggagccttcctcaccaaggtgcctctaaaacgattagaagaacttctatacaaaatgttcctacacacagggacagtcatagtcctcccggaggacgacctacccaccacaatgttccaacccgtgagggct。

在本发明中，所述linker的核苷酸序列优选如SEQ ID No.3所示，具体如下所示：

gccacgaacttctctctgttaaagcaagcaggagatgttgaagaaaaccccgggcct。

在本发明中，所述制备永生化树突状细胞的基因如SEQ ID No.5所示，具体如下所示：

atgaacatcaaagacgaatggtactggggtaagagtaagcacgcggtgactgagctcaacgcggagggatggatctttactctcccgccaagtgacaactacatcggacgtcaccggttgccggacgtccgattcagccaggagctacccgacgggacggtctactggtcggtgaaccggaagaacttcttccgccgggacgacagcctcccctcgggatgggtgcagcgcatctacccgcgtgtagctaccagcttcaggaccgcggaatgagccacgaacttctctctgttaaagcaagcaggagatgttgaagaaaaccccgggcctgcccatttcccaggatttggacagagcctcctatatggataccccgtctacgtgtttggcgattgtgtacaggccgattggtgtcccgtctcaggtggtctatgttccacccgcctacatcgacatgccctcctggccacctgtccagagcaccaactcacctgggaccccatcgatggacgcgttgtcagctctcctctccaataccttatccctcgcctcccctccttccccacccagagaacctcaaggaccctcaaggtccttacccctcccaccactcctgtctcccccaaggttccacctgccttctttcaatcaatgcgaaagcacaccccctaccgaaatggatgcctggaaccaaccctcggggatcagctcccctccctcgccttccccgaacctggcctccgtccccaaaacatctacaccacctggggaaaaaccgtagtatgcctatacctataccagctttccccacccatgacatggccacttataccccatgtcatattctgccaccccagacaattaggagccttcctcaccaaggtgcctctaaaacgattagaagaacttctatacaaaatgttcctacacacagggacagtcatagtcctcccggaggacgacctacccaccacaatgttccaacccgtgagggct。

在本发明中，所述原始载体优选包括pCDH MSCV和/或pCDH-CMV等慢病毒表达载体。本发明对所述将基因插入到原始载体中的方法没有特殊限定，采用常规即可。

本发明还提供了一种制备永生化树突状细胞的方法，包括以下步骤：

在本发明中，所述慢病毒优选包括293T细胞。本发明对所述包装慢病毒的方法没有特殊限定，采用常规包装293T细胞的方法即可。

本发明对所述包装病毒感染树突状细胞的方法没有特殊限定，采用本领域常规慢病毒感染树突状细胞的方法即可。在本发明中，所述树突状细胞优选来源于外周血单个核细胞，本发明对将外周血单核核细胞分化为树突状细胞的方法没有特殊限定，采用常规即可。

本发明将滋养细胞接种于细胞培养器的上层培养室。在本发明中，所述滋养细胞的制备优选包括：将外周血单个核细胞在含有质量百分含量为10％的FBS的1640培养基中培养过夜，得到滋养细胞，在本发明中，所述外周血单个核细胞在1640培养基的数量优选为1×10⁶个/mL。在本发明中，所述培养的温度优选为35～42℃，更优选为37℃；所述培养的二氧化碳的体积浓度优选为5％。在本发明中，所述滋养细胞在上层培养室的接种量优选为0.5～1.5×10⁶个/孔，更优选为1×10⁶个/孔。本发明将得到的感染树突状细胞接种于细胞培养器的下层培养室。在本发明中，所述感染树突状细胞的接种量优选为0.5～1.5×10⁶个/孔，更优选为1×10⁶个/孔。在本发明中，所述培养的温度优选为37℃，所述培养需要的二氧化碳的体积浓度优选为5％。本发明优选在培养第1d至第4周前，每天观察下层细胞的状态，当细胞液变黄时，进行半量换液，每天对上层细胞进行计数和活率检测，当上层滋养细胞的活率低于50％时，更换新的滋养细胞。

本发明优选使用美天旎的CD3+分选磁珠(CD3 MicroBeads human#130-050-101)除去CD3+细胞。

本发明还提供了上述技术方案所述的制备方法制备得到的永生化树突状细胞，所述永生化树突状细胞的表型包括：CD3-、CD4+、CD8-、CD16-、CD19-、CD56-、CD11c+、CD11b-、CD58+、CD40+、CD70+、CD80+、CD83+、CD86+、TCR-、CD11b-、CD197-、CD303-、CD1c-、CD205+、CD141和CD123+。

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

质粒提取

1)摇菌方案：冰上融化甘油菌，甘油菌含有制备永生化树突状细胞的载体P-ST40-TAX2，(载体中含有ST40基因和TAX2基因)，各取100μL至3mL含有100μg/mL氨苄霉素的LB培养基内，37℃，220rpm活化6h。将活化后的菌液分别扩大培养至100mL含有100μg/mL氨苄霉素的LB培养基内，37℃，220rpm培养过夜。次日4000×g离心10min收取各菌液沉淀。

其中，甘油菌：将含有ST40基因和TAX2基因的载体转化感受态细胞Stbl3后挑取单克隆摇菌，菌液离心后弃上清，保留菌体沉淀，加入25％的甘油将菌体沉淀重悬，获得甘油菌。感受态细胞Stbl3从厂家唯地生物购买，货号DL1046；含有ST40基因和TAX2基因的载体由金唯智公司合成。

2)准备工作：

a)将RNase A加入Solution I中，4℃保存。

b)在DNA Wash Buffer中加入180mL ethanol(乙醇)。

c)在HBC Buffer中加入76mL isopropanol(异丙醇)。

d)将BufferN3置于冰上，准备42℃水浴。

3)加入3mLGPS Buffer到DNA色谱柱上，室温放置4min，4000×g离心3min，弃废液后备用。

4)取100mL菌沉淀，分别加入10mL SolutionI/RNase，上下旋转，吸打混匀。

5)加入10mL SolutionII，轻轻反转8-10次，室温3min。

6)加入5mL预冷的BufferN3，轻轻反转8-10次，直至白色絮状沉淀形成，室温2min。

7)利用过滤注射器将上述液体转移至新的50mL离心管内，并测量其体积。

8)加入0.1倍体积的ETR Solution，轻轻反转8-10次。

9)冰上放置10min，期间不断翻转(液体由浑浊变澄清)。

10)42℃水浴5min，液体再次变浑浊。

11)4000×g离心3min，ETR Solution会在底部结成一层。

12)将上清转移至另一新的50mL离心管内，并测量其体积。

13)加入0.5倍体积的酒精，轻轻反转8-10次，室温2min。

14)取20mL上述液体加入到DNA色谱柱内，4000×g离心3min，后弃废液。

15)重复步骤14。

16)向柱内加入10mLHBC Buffer，4000×g离心3min，后弃废液。

17)向柱内加入15mL DNA WashBuffer，4000×g离心3min，后弃废液。

18)向柱内加入10mL DNA WashBuffer，4000×g离心3min，后弃废液。

19)4000×g空离10min后，将色谱柱放入一新的50mL离心管内，向中央膜处滴加800μL dH₂O，室温放置5min，4000×g离心5min，将质粒溶液收集到离心管内。

20)将质粒溶液重新加回到柱内，室温放置5min，4000×g离心5min，将质粒溶液重新收集到离心管内，分装冻存。

21)取个样品2μL，2μL dH₂O作为对照，测定浓度。

以上试剂来源于Qiagen质粒大提试剂盒。

结果得到制备永生化树突状细胞的质粒P-ST40-TAX2。

实施例2

贴壁法分离外周血来源的树突状细胞并活化(DC)

1)单采血，分离PBMC；

2)将PBMC以培养基1640+10％FBS调整至1×10⁶细胞/mL，至于培养皿中，于37℃5％CO₂培养箱，静止过夜；收集悬浮细胞，标记为T+B细胞，备用；

3)以培养基1640+10％FBS+100IU/mL IL-2对贴在培养皿底部的细胞进行吹打，收集贴壁的单核细胞，即为外周血来源的DC，

4)加入35μg/mL的PHA，刺激并培养细胞24h后备用，得到树突状细胞。

实施例3

构建慢病毒载体并转化DC

1)包装慢病毒：293T细胞铺板密度：1.8×10⁷，20mL OPTI-MEM培养基置于37℃5％CO₂培养。实施例1得到的转染质粒用量：包装质粒用量：15μg，P-ST40-TAX2质粒(制备永生化树突状细胞的质粒)：15μg，将质粒加入到缓冲液中震荡混匀5s，加入转染试剂：60μL，移液器混匀5下，室温孵育10min，将转染混合物均匀分布滴入细胞中，37℃5％CO₂培养。转染后3h，更换新鲜培养基，每个T175的培养瓶加入37mL OPTI-MEM(6％FBS)培养基，96h收获上清后备用。

2)慢病毒感染DC：使用1mL 1640+10％FBS+0.1％polybrene+100μL病毒上清将实施例2中得到的活化DC重悬，按照3×10⁵个/孔加入到6孔板中，32℃孵育4～6h后放入CO₂培养箱培养，4h后补加2mL 1640+10％FBS。培养至第3天时，以流式分选GFP+的细胞，即获得转染成功的DC细胞。

实施例4

永生DC的培养：

1)以实施例2中得到的T+B细胞，以1640+10％FBS+100IU/mL的IL-2重悬，作为滋养细胞加入到插入式细胞培养器(12孔板)的上层培养室，接入细胞数为1×10⁶细胞/孔；

2)将实施例3中得到的DC细胞，以1640+10％+FBS100 IU/mL IL-2重悬，按照1×10⁶细胞/孔，接入下层培养室；每个培养室以1640+10％FBS+100IU/mL IL-2补齐至4mL，标记为Day 0；

3)置于37℃5％CO₂培养箱中，培养，每天观察下层细胞状态，当细胞液变黄时，进行半量换液；

4)每天对上层细胞，进行计数及活率检测，当上层滋养细胞的活率低于50％时，更换新的滋养细胞；

5)根据生长情况，将细胞进行转接，转接的细胞数与起始一致，培养得到永生化树突状细胞。

实施例5

实施例4得到的永生DC的分离：

1)培养4-6周时，收集所有下层细胞，利用美天旎的CD3+分选磁珠，进行CD3+细胞的去除；

2)将剩余细胞，以1640+10％FBS+100IU/mL IL-2重悬，置于37℃5％CO₂培养箱中，培养1-2周；

3)以流式细胞分析仪对细胞表型进行检测，如还有CD3+细胞，则可以重复以上分离步骤；如果没有CD3+细胞，以1640+10％FBS+100IU/mL IL-2培养基中继续培养，2个月后，即可得到永生DC；

对永生的DC进行表面标志物的检测；

以流式细胞分析仪对永生DC的CD3、CD4、CD8、CD16、CD19、CD56、CD11c、CD58、CD40、CD70、CD80、CD83、CD86、TCR、CD11b、CD197、CD303、CD1c、CD205、CD141进行检测。

对永生的DC进行功能验证

1)将抗原KRAS-G12D(SEQ ID No.4：TEYKLVVVGADGVGKSALTIQ)构建到慢病毒表达载体pCDH MSCV、pCDH-CMV等慢病毒表达载体上；

2)按照步骤2提取质粒；

3)包装慢病毒：293T细胞铺板密度：1.8×10⁷，20mL OPTI-MEM培养基置于37℃5％CO₂培养。实施例1的转染质粒用量：包装质粒用量：15μg，KRAS-G12D：16μg，将质粒加入到缓冲液中震荡混匀5s，加入转染试剂：60μL，移液器混匀5下，室温孵育10min，将转染混合物均匀分布滴入细胞中，37℃5％CO₂培养。转染后3h，更换新鲜培养基，每个T175的培养瓶加入37mL OPTI-MEM(6％FBS)培养基，96h收获上清后备用。

4)慢病毒感染永生DC：观察细胞达到一定数量后，离心弃去培养基，使用PBS进行清洗，900rpm，离心5min，使用1mL 1640+10％FBS+0.1％polybrene+100μL病毒上清，将细胞加入到6孔板中(3×10⁵个/孔)，摇晃均匀，32℃孵育4～6h后放入CO₂培养箱培养，4h后补加2mL 1640+10％FBS。

5)培养至第3天时，以流式分选GFP+的细胞，即获得表达抗原的永生DC：标记为DC-KRAS-G12D；

6)在DC-KRAS-G12D细胞中，按照1:100的比例，加入实施例3中得到的T+B细胞，培养基为1640+10％FBS+500IU/mL IL2，共培养21天，期间培养基变黄时，进行半量换液，即获得DC-KRAS-G12D-CTL细胞；

7)将DC-KRAS-G12D-CTL，对SW-480(含有KRAS-G12D抗原，A0201)的靶细胞，进行杀伤功能的检测，采用LDH法，方法参照厂家提供的说明书。

实施例1～5结果如下：

1、永生DC成功率统计：

选取了10份PBMC，进行永生DC的制备，HLA的情况如表1所示，在永生话过程中，仅有PBMC1、PBMC4、PBMC6、PBMC8和PBMC10获得了永生的DC细胞，成功率为45.5％；

表1 PBMC的HLA类型

PBMC1

A0207

A1101

B3901

B4601

C0102

C0702

PBMC2

A0101

A2601

B3501

B3701

C0401

C0602

PBMC3

A0101

A3303

B3801

B5801

C0302

C1203

PBMC4

A0201

B0702

B1501

C0303

C0702

PBMC5

A1101

A3001

B1302

B4601

C0102

C0602

PBMC6

A2601

A3303

B1301

B5401

C0102

C1202

PBMC7

A0301

A1101

B3503

B3901

C0702

C1203

PBMC8

A0301

A2402

B1501

B5501

C0102

C0702

PBMC9

A0206

A0207

B1501

B4601

C0102

C0401

PBMC10

A0206

A3001

B4601

B5101

C0102

C1602

PBMC11

A0101

A2402

B3701

B5102

C0602

C1502

2、DC表型的鉴定：

流式分析结果如表2所示，5株永生DC一致的表型有：CD3-、CD4+、CD8-、CD16-、CD19-、CD56-、CD11c+、CD11b-、CD58+、CD40+、CD70+、CD80+、CD83+、CD86+、TCR-、CD11b-、CD197-、CD303-、CD1c-、CD205+、CD141、CD123+；PBMC 4的结果如图1-1至图1-7所示；

表2不同PBMC来源的永生DC细胞的表型检测

3、杀伤功能检测

以五组不同PBMC来源的DC，转入抗原后，与T+B细胞，共培养，检测相应的CTL细胞对靶细胞的杀伤作用，结果如图2-图6所示，五个来源的DC，均可以诱导特异性细胞的产生，对靶细胞有很强的杀伤作用。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 北京鼎成肽源生物技术有限公司

<120> 一种制备永生化树突状细胞的基因、载体、方法和永生化树突状细胞

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 273

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgaacatca aagacgaatg gtactggggt aagagtaagc acgcggtgac tgagctcaac 60

gcggagggat ggatctttac tctcccgcca agtgacaact acatcggacg tcaccggttg 120

ccggacgtcc gattcagcca ggagctaccc gacgggacgg tctactggtc ggtgaaccgg 180

aagaacttct tccgccggga cgacagcctc ccctcgggat gggtgcagcg catctacccg 240

cgtgtagcta ccagcttcag gaccgcggaa tga 273

<210> 2

<211> 666

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gcccatttcc caggatttgg acagagcctc ctatatggat accccgtcta cgtgtttggc 60

gattgtgtac aggccgattg gtgtcccgtc tcaggtggtc tatgttccac ccgcctacat 120

cgacatgccc tcctggccac ctgtccagag caccaactca cctgggaccc catcgatgga 180

cgcgttgtca gctctcctct ccaatacctt atccctcgcc tcccctcctt ccccacccag 240

agaacctcaa ggaccctcaa ggtccttacc cctcccacca ctcctgtctc ccccaaggtt 300

ccacctgcct tctttcaatc aatgcgaaag cacaccccct accgaaatgg atgcctggaa 360

ccaaccctcg gggatcagct cccctccctc gccttccccg aacctggcct ccgtccccaa 420

aacatctaca ccacctgggg aaaaaccgta gtatgcctat acctatacca gctttcccca 480

cccatgacat ggccacttat accccatgtc atattctgcc accccagaca attaggagcc 540

ttcctcacca aggtgcctct aaaacgatta gaagaacttc tatacaaaat gttcctacac 600

acagggacag tcatagtcct cccggaggac gacctaccca ccacaatgtt ccaacccgtg 660

agggct 666

<210> 3

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gccacgaact tctctctgtt aaagcaagca ggagatgttg aagaaaaccc cgggcct 57

<210> 4

<211> 21

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala Asp Gly Val Gly Lys Ser

1 5 10 15

Ala Leu Thr Ile Gln

20

<210> 5

<211> 996

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

atgaacatca aagacgaatg gtactggggt aagagtaagc acgcggtgac tgagctcaac 60

gcggagggat ggatctttac tctcccgcca agtgacaact acatcggacg tcaccggttg 120

ccggacgtcc gattcagcca ggagctaccc gacgggacgg tctactggtc ggtgaaccgg 180

aagaacttct tccgccggga cgacagcctc ccctcgggat gggtgcagcg catctacccg 240

cgtgtagcta ccagcttcag gaccgcggaa tgagccacga acttctctct gttaaagcaa 300

gcaggagatg ttgaagaaaa ccccgggcct gcccatttcc caggatttgg acagagcctc 360

ctatatggat accccgtcta cgtgtttggc gattgtgtac aggccgattg gtgtcccgtc 420

tcaggtggtc tatgttccac ccgcctacat cgacatgccc tcctggccac ctgtccagag 480

caccaactca cctgggaccc catcgatgga cgcgttgtca gctctcctct ccaatacctt 540

atccctcgcc tcccctcctt ccccacccag agaacctcaa ggaccctcaa ggtccttacc 600

cctcccacca ctcctgtctc ccccaaggtt ccacctgcct tctttcaatc aatgcgaaag 660

cacaccccct accgaaatgg atgcctggaa ccaaccctcg gggatcagct cccctccctc 720

gccttccccg aacctggcct ccgtccccaa aacatctaca ccacctgggg aaaaaccgta 780

gtatgcctat acctatacca gctttcccca cccatgacat ggccacttat accccatgtc 840

atattctgcc accccagaca attaggagcc ttcctcacca aggtgcctct aaaacgatta 900

gaagaacttc tatacaaaat gttcctacac acagggacag tcatagtcct cccggaggac 960

gacctaccca ccacaatgtt ccaacccgtg agggct 996

Claims

1.一种制备永生化树突状细胞的基因，其特征在于，将ST40基因经linker与TAX2基因连接后，得到制备永生化树突状细胞的基因；

所述ST40基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；

所述TAX2基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

2.根据权利要求1所述的基因，其特征在于，所述linker的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。

3.一种制备永生化树突状细胞的载体，其特征在于，将权利要求1或2所述的基因插入原始载体中，得到制备永生化树突状细胞的载体。

4.根据权利要求3所述的载体，其特征在于，所述原始载体包括pCDH MSCV和/或pCDH-CMV。

5.一种制备永生化树突状细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)将权利要求3或4所述的载体包装慢病毒，得到包装病毒，将所述包装病毒感染树突状细胞，得到感染树突状细胞；

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤2)滋养细胞的制备包括：将外周血单个核细胞在含有质量百分含量为10％的FBS的1640培养基中培养过夜，得到滋养细胞。

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤1)树突状细胞来源于外周血单个核细胞。

8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤1)滋养细胞的接种量为0.5～1.5×10⁶个/孔，所述感染树突状细胞的接种量为0.5～1.5×10⁶个/孔。

9.权利要求5～9任一项所述的方法制备得到的永生化树突状细胞，所述永生化树突状细胞的表型包括：CD3-、CD4+、CD8-、CD16-、CD19-、CD56-、CD11c+、CD11b-、CD58+、CD40+、CD70+、CD80+、CD83+、CD86+、TCR-、CD11b-、CD197-、CD303-、CD1c-、CD205+、CD141和CD123+。