WO2007018199A1 - HLA-A2陽性者用glypican-3(GPC3)由来癌拒絶抗原ペプチド及びこれを含む医薬 - Google Patents
HLA-A2陽性者用glypican-3(GPC3)由来癌拒絶抗原ペプチド及びこれを含む医薬 Download PDFInfo
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Definitions
- Glypican-3 (GPC3) -derived cancer rejection antigen peptide for HLA-A2-positive individuals and pharmaceuticals containing the same
- the present invention is a novel peptide effective as a vaccine against cancers that highly express glypican-3 (GPC3), such as hepatocellular carcinoma and malignant melanoma (melanoma), and treatment and prevention of tumors containing the peptide.
- GPC3 glypican-3
- melanoma hepatocellular carcinoma and malignant melanoma
- hepatocellular carcinoma is one of the most frequently occurring and malignant diseases in the world. Due to the global epidemic of hepatitis B and C, the incidence of hepatocellular carcinoma in Asia and European countries has risen sharply, and considering the long incubation period until hepatitis virus infectivity, 50 This trend is expected to continue over the years. The prognosis for advanced hepatocellular carcinoma is poor, and the development of new treatment strategies is urgently needed.
- HLA class I molecules are expressed on the surface of all nucleated cells of the body. Proteins produced in the cytoplasm and nucleus are bound to peptides produced by degradation in the cell, and the cell surface Expressed in On the surface of normal cells, peptides derived from normal self proteins are bound to HLA class I molecules, which are not identified and destroyed by T cells of the immune system. On the other hand, cancer cells are in the process of becoming cancerous and may be expressed in a large amount of protein with little or no expression in normal cells. A peptide made by degrading in the cytoplasm a protein that is highly expressed specifically in these cancer cells is HLA.
- the killer T cell When bound to a class I molecule and expressed on the surface of a cancer cell, the killer T cell recognizes it and destroys only the cancer cell. In addition, by administering such a cancer-specific antigen or peptide to an individual, cancer cells that do not cause harm to normal cells can be destroyed and cancer growth can be suppressed. This is called cancer immunotherapy using a cancer-specific antigen.
- HLA class II molecules are mainly expressed on the surface of antigen-presenting cells, and bind to peptides derived from cancer-specific antigens that are formed by antigen-presenting cells taken from outside the cells and degraded in the cells. Expressed in Recognizing this, helper T-cells are activated and produce various site forces that activate other immunocompetent cells, thereby inducing or enhancing an immune response against the tumor.
- AFP a-foot protein
- MHC class I molecules MHC class I molecules
- Melanoma is a type of skin cancer called malignant melanoma.
- malignant skin cancer There are various types of skin cancer, but the most malignant skin cancer is very fearful.
- melanocytes melanin pigment cells
- these cells have become cancerous.
- the present inventors previously analyzed 20 cases of primary hepatocellular carcinoma and fetus by genome-wide gene expression analysis including 23,040 human genes using cDNA microarray analysis.
- Glypican-3 (Glypic an -3; GPC3) is expressed in the liver, kidneys, and lungs in the embryonic period, and the placenta in adult normal organs.
- GPC3 Glypican-3
- GPC3 is a secreted protein, and GPC3 can be detected in the serum of 40% hepatocellular carcinoma patients using ELISA, which is useful as a new tumor marker for hepatocellular carcinoma.
- ELISA ELISA-associated hepatocellular carcinoma
- GPC3 was also detected in the serum of melanoma patients and reported to be useful as a tumor marker for melanoma (Nakatsura, T. et al., Clin. Cancer Res. 10: 6612-6621 (2004)).
- the present inventors have already used GPC3 peptides that bind to HLA-A24 and are presented to human killer T cells, which is useful for immunotherapy in patients with HLA-A24-positive hepatocellular carcinoma or melanoma.
- the effectiveness of immunotherapy using this peptide has also been confirmed in animal experiments using BALB / C mice that express mouse K d molecules that bind to peptides having the same structure as the peptide that binds to HLA-A24. It has been proved and already reported (international application number PC T / JP2004 / 016374: international filing date October 28, 2004)). Since GPC3 is expressed only in the normal organ! And only in the placenta and the liver in the embryonic period, even if immunotherapy targeting GPC3 is used to suppress tumor growth, harmful effects such as autoimmune diseases may occur. Confirm that the event does not occur through mouse experiments.
- the present inventors have mainly studied HL for glypican-3 (GPC3), which is a tumor rejection antigen.
- A-A24 has identified peptides presented to killer T cells (International Application No. PCT /
- melanoma is a cancer that is effective for white and white Caucasian immunotherapy, and hepatocellular carcinoma is also rapidly increasing in the West. It is estimated that many patients are eligible for immunotherapy using HLA-A2 binding GPC3 peptide.
- the present invention relates to an immunity that can target about 40% of various cancer patients who highly express GPC3 in Japanese by identifying peptides presented to killer T cells by HLA-A2. Providing means to enable therapy was an issue to be solved.
- GPC3 glypican 3
- soluble GPC3 protein was detected in the serum of patients with hepatocellular carcinoma, and it was revealed that GPC3 could be a new tumor marker for hepatocellular carcinoma.
- the present inventors have discovered that GPC3 is expressed in the mouse melanoma cell line B16, and GPC3 is highly expressed in melanoma as well as hepatocellular carcinoma, and may not be a useful tumor marker. As a result, we conducted experiments to confirm that GPC3 is a tumor marker that can be diagnosed early in melanoma.
- (B) A peptide having an amino acid sequence ability in which one or two amino acids are substituted or added in the amino acid sequence shown in any one of SEQ ID NOs: 1 to 3, and has the ability to induce killer T cells. De ,.
- An immunity-inducing agent for cancer comprising at least one peptide according to (1).
- a medicament for treating and / or preventing tumor comprising at least one peptide according to (1).
- An agent for inducing a tumor antigen-presenting cell having an ability to induce tumor-reactive T cells comprising the peptide according to (1).
- (B) A peptide having an amino acid sequence ability in which one or two amino acids are substituted or added in the amino acid sequence shown in any one of SEQ ID NOs: 1 to 3, and having the ability to induce killer T cells.
- An antigen-presenting cell presenting a complex of the HLA molecule and the peptide according to claim 1.
- the peptide of the present invention is any of the following peptides.
- the peptide having the ability to induce killer T cells referred to in this specification is a killer T cell (killer).
- TTL T cell-inducing activity that stimulates T cells
- the method for obtaining the peptide of the present invention is not particularly limited, and even a chemically synthesized protein may be used. Any of recombinant proteins produced by gene recombination techniques may be used.
- a chemically synthesized peptide for example, according to a chemical synthesis method such as Fmoc method (fluorenylmethyloxycarbon method) or tBoc method (tbutyloxycarbon method).
- Inventive peptides can be synthesized.
- the peptides of the present invention can be synthesized using various commercially available peptide synthesizers.
- DNA having a base sequence encoding the peptide or a mutant or homologue thereof is obtained and introduced into a suitable expression system.
- Inventive peptides can be produced.
- the expression vector is preferably a force capable of autonomous replication in a host cell, or a position capable of expressing a gene encoding a peptide as long as it can be inserted into the host cell chromosome.
- the one containing a promoter is used.
- a transformant having a gene encoding the peptide of the present invention can be prepared by introducing the above expression vector into a host.
- the host may be any of bacteria, yeast, animal cells, and insect cells, and the introduction of the expression vector into the host may be performed by a known method according to each host.
- the transformant produced as described above is cultured, the peptide of the present invention is produced and accumulated in the culture, and the peptide of the present invention is collected from the culture. By this, the recombinant peptide can be isolated.
- the medium for culturing these microorganisms contains a carbon source, a nitrogen source, inorganic salts and the like that can be assimilated by the microorganism.
- a natural medium or a synthetic medium can be used as long as it is a medium that can efficiently contain the transformant.
- the culture conditions may be the same as those usually used for culturing the microorganism.
- ordinary methods for peptide isolation and purification may be used.
- the peptide consisting of an amino acid sequence in which one or two amino acids are substituted or added in the amino acid sequence shown in any one of SEQ ID NOs: 1 to 3 is any one of SEQ ID NOs: 1 to 3.
- Those skilled in the art can appropriately produce or obtain the DNA sequence encoding the described amino acid sequence based on the information on the base sequence of the DNA sequence. That is, any one of SEQ ID NOS: 1 to 3
- a gene encoding a peptide having the ability to induce killer T cells consists of an amino acid sequence in which one or two amino acids are substituted or added in the amino acid sequence shown in Fig. 1, such as chemical synthesis, genetic engineering techniques, or mutagenesis. It can also be prepared by any method known to those skilled in the art.
- site-directed mutagenesis which is one of the genetic engineering methods, is useful because it can introduce a specific mutation at a specific position.
- Molecular Cloning A laboratory Mannual, 2 Ed. , Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY., 1989 (hereinafter abbreviated as Molecular Cloning, 2nd Edition), Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1-38, John Wiley & Sons (1987-1997, Current “Protocols” in “Molecular” (abbreviated as “biology”) and the like.
- the peptide of the present invention described above can induce immunity against cancer, as shown in Examples below. Therefore, according to this invention, the immunity induction agent with respect to cancer containing the peptide of this invention is provided.
- the immunity-inducing agent for cancer of the present invention can induce helper T cells, killer T cells, or an immune cell population containing these by using in vitro or in vivo, preferably in vitro, and thereby cancer. Immunity against can be conferred.
- the present invention also relates to an antibody that recognizes part or all of the peptide of the present invention as an epitope (antigen), and killer T cells induced by in vitro stimulation using the protein or peptide.
- antigen an epitope
- killer T cells exhibit stronger antitumor activity than antibodies.
- the antibody of the present invention may be a polyclonal antibody or a monoclonal antibody, and can be produced by a conventional method.
- a polyclonal antibody can be obtained by immunizing a mammal or a bird using the peptide of the present invention as an antigen, collecting blood from the mammal or bird, and separating and purifying the antibody from the collected blood.
- mammals such as mice, mice, mussels, guinea pigs, chickens, rats, rabbits, dogs, goats, hidges, and rabbits can be immunized.
- Methods of immunization are known to those skilled in the art and include, for example, antigen, eg 7-30 days
- Two to three doses may be given at intervals. The dose can be about 0.05 to 2 mg of antigen per dose, for example.
- the administration route is not particularly limited, and subcutaneous administration, intradermal administration, intraperitoneal administration, intravenous administration, intramuscular administration, and the like can be appropriately selected.
- the antigen can be used after being dissolved in an appropriate buffer solution, for example, an appropriate buffer solution containing a commonly used adjuvant such as complete Freund's adjuvant or hydrated aluminum hydroxide.
- booster immunization can be performed using, for example, 100 g to 1000 g of antigen.
- the blood of mammals or birds that have been immunized 1 to 2 months after the last administration is also collected, and the blood is collected by centrifugation, precipitation using ammonium sulfate or polyethylene glycol, gel filtration chromatography, etc. Separation and purification by conventional methods such as chromatography such as ion exchange chromatography and affinity chromatography, etc., a polyclonal antibody that recognizes the peptide of the present invention can be obtained as a polyclonal antiserum. .
- monoclonal antibodies can be obtained by preparing nobridomas.
- a hyperidoma can be obtained by cell fusion between an antibody-producing cell and a myeloma cell line.
- the hyperidoma producing the monoclonal antibody of the present invention can be obtained by the following cell fusion method.
- spleen cells As antibody-producing cells, spleen cells, lymph node cells, B lymphocytes and the like from immunized animals are used.
- the peptide of the present invention is used as the antigen.
- Mice, rats, and the like can be used as immunized animals, and antigens are administered to these animals by conventional methods. For example, by administering a suspension or emulsion of an adjuvant such as complete Freund's adjuvant or incomplete Freund's adjuvant and the peptide of the present invention as an antigen several times into the animal's vein, subcutaneous, intradermal, intraperitoneal, etc. Immunize.
- an adjuvant such as complete Freund's adjuvant or incomplete Freund's adjuvant
- the peptide of the present invention as an antigen several times into the animal's vein, subcutaneous, intradermal, intraperitoneal, etc. Immunize.
- spleen cells are obtained as antibody-producing cells from the immunized animal, and this and myeloma cells are fused by a known method (G. Kohler et al., Nature, 256 495 (1975)) to obtain hyperidoma. Can be produced.
- Examples of myeloma cell lines used for cell fusion include the P3X63Ag8, P3U1 and Sp2Z0 strains in mice.
- a fusion promoter such as polyethylene glycol or Sendai virus is used.
- hypoxanthine 'aminopterin' thymidine (HAT) medium is used according to a conventional method.
- Hypridoma obtained by cell fusion is cloned by a limiting dilution method or the like.
- cell lines producing monoclonal antibodies that specifically recognize the peptide of the present invention can be obtained by performing screening by an enzyme immunoassay using the peptide of the present invention.
- the hybridoma is cultured by an ordinary cell culture method or ascites formation method, and the monoclonal antibody is then cultured from the culture supernatant or ascites. If you refine it. Purification of the monoclonal antibody from the culture supernatant or ascites can be performed by a conventional method. For example, ammonium sulfate fractionation, gel filtration, ion exchange chromatography, and affinity chromatography can be used in appropriate combinations.
- antibody fragments are also within the scope of the present invention.
- antibody fragments include F (ab ′) 2 fragments, Fab ′ fragments, and the like.
- the present invention also relates to herbal T cells, killer T cells, or immune cell populations containing these induced by in vitro stimulation using the peptides of the present invention.
- peptides of the present invention when peripheral blood lymphocytes or tumor-infiltrating lymphocytes are stimulated in vitro using the peptides of the present invention, tumor-reactive activated T cells are induced, and these activated T cells are effectively used for adoptive immunotherapy. be able to.
- the peptide of the present invention can be expressed in vivo or in vitro in rod cells that are strong antigen-presenting cells, and immunity induction can be carried out by administering the antigen-expressing rod cells.
- helper T cells, killer T cells, or immune cell populations containing these can be induced by in vitro stimulation using the peptide of the present invention and an immunostimulant.
- immunostimulant examples include cell growth factor and cytodynamic force-in.
- the tumor By transferring the helper T cell, killer T cell, or immune cell population containing these obtained as described above into the body, the tumor can be suppressed, and cancer can be prevented and / or treated. It is possible.
- the tumor can be suppressed as described above.
- helper ⁇ cells By using this cell culture solution, it is possible to produce helper ⁇ cells, killer ⁇ cells, or immune cell populations containing these that can suppress tumors. Furthermore, according to the present invention, there is also provided a cell culture kit for producing helper sputum cells, Kira ⁇ cells, or an immune cell population containing these cells, which includes the cell culture medium and a cell culture container. .
- the peptide of the present invention can induce cancer cell-specific killer cells, it can be expected as an agent for treating or preventing cancer.
- a BCG bacterium transformed with this recombinant DNA containing the gene encoding the peptide of the present invention into an appropriate vector, or a vaccinia virus integrated with the DNA encoding the peptide of the present invention in the genome Such viruses can be effectively used as a live vaccine for the treatment and prevention of human cancer.
- the dose and method of administration of cancer vaccine are the same as those for normal vaccination and BCG vaccine.
- the DNA encoding the peptide of the present invention (as it is or in the form of plasmid DNA incorporated into an expression vector), the recombinant virus or recombinant bacteria containing the DNA as it is or dispersed in an adjuvant.
- the peptide of the present invention can be administered as a cancer vaccine in a state dispersed with adjuvant.
- adjuvants examples include Freund's incomplete adjuvant, BCG, trehalose dimycolate (TDM), lipopolysaccharide (LPS), myoban adjuvant, silica adjuvant, and the like. It is preferable to use Freund's incomplete adjuvant (IFA) because of its induction ability.
- IFA Freund's incomplete adjuvant
- the type of cancer referred to herein is not particularly limited, and specific examples include esophageal cancer, breast cancer, thyroid cancer, colon cancer, knee cancer, melanoma (melanoma), malignant lymphoma, osteosarcoma, Pheochromocytoma, head and neck cancer, uterine cancer, ovarian cancer, brain tumor, chronic myeloid leukemia, acute myeloid leukemia, kidney cancer, prostate cancer, lung cancer, stomach cancer, liver cancer, gallbladder cancer, testicular cancer, thyroid cancer, bladder cancer Or sarcoma.
- the peptide of the present invention can induce cancer cell-specific killer T cells as T cell epitopes, it is useful as a prophylactic / therapeutic agent for human cancer.
- the antibody of the present invention is also useful as a prophylactic / therapeutic agent for human cancer as long as it can inhibit the activity of GPC3, which is a cancer antigen.
- the peptide or antibody of the present invention may be administered as an injection as it is, together with a pharmaceutically acceptable carrier and Z or diluent, and optionally with the following adjuvants. It can also be administered by transdermal absorption from the mucous membrane by a method such as spraying.
- the carrier referred to here is, for example, human serum albumin, and examples of the diluent include PBS, distilled water and the like.
- the dosage is not limited to this range, and can be administered such that the peptide or antibody of the present invention is in the range of, for example, O.Olmg to 100mg per adult per adult.
- the form of the preparation is not particularly limited, and it may be freeze-dried or granulated by adding an excipient such as sugar! /.
- MDP muramyl dipeptide
- other bacterial cell components such as BCG bacteria, Nature, vol. ISCOM described in J. Immunol. vol. 148, pl438 (1992), ribosomes, aluminum hydroxide, and the like.
- immunostimulants such as lentinan, schizophyllan, and picibanil can be used as adjuvants.
- IL-2, IL-4, IL12, IL-1, IL-6, TNF and other T cell proliferation, cyto force-in to enhance sorting, etc., and ⁇ -galactosyl that activates NKT cells Ceramid can be used as an adjuvant such as CpG or lipopolysaccharide (LPS), which binds to a ToU-like receptor and activates the innate immune system.
- an adjuvant such as CpG or lipopolysaccharide (LPS), which binds to a ToU-like receptor and activates the innate immune system.
- the antigen peptide is added in vitro to a cell collected from a patient or from another person's (mouth) cell that shares some of the HLA alleles. It is also possible to induce killer T cells effectively in the patient's body.
- killer ⁇ cells can be induced in the test tube and then returned to the patient's blood vessel. Such treatment by cell transfer has already been carried out as a cancer treatment method and is well known among those skilled in the art.
- killer T cells are induced and activated.
- an antitumor effect can be expected.
- lymphocytes are stimulated with the peptide of the present invention in vitro, activated T cells are induced, and can be effectively used for adoptive immunotherapy by injecting the activated T cells into the affected area.
- the amino acid sequence of human GPC3 was searched using the BIMAS system, and four types with an estimated binding affinity for HLA-A2 of 20 or more were selected.
- Killer T cells were derived from isolated peripheral blood mononuclear cells using the previously reported method (Monji, M et al. Clin Cancer Res10, 60 47-6057, 2004). First, CD8 positive cells and CD14 positive cells in peripheral blood mononuclear cells were separated using MACS, and CD14 positive cells were separated from GM-CSF (100 ng / ml) and IL-4 (20 ng / ml) in the presence of 5 days to induce differentiation of the rod-shaped cells, followed by TNF-a (20 ng / ml) supplementation and maturation. GPC3 peptide was added (10 M) and co-cultured with CD8 positive cells.
- Antigen stimulation with rod-like cells derived from autologous CD14-positive cells was repeated 3 to 4 times per week to induce peptide-specific killer T cells.
- the medium during induction was changed by half every 2 days, and IL-2 was added at a concentration of lOU / ml.
- IFN- ⁇ was detected using ELI SPOT Human IFN- ⁇ ELISPOT set (BD).
- killer T cells effectors
- stimulating cells targets
- the target cells used were SK-Hep-1 cells of the parent strain that were HLA-A2-positive and did not express GPC3, and SK-Hep-1 / GPC3 cells that had been transfected to express GPC3.
- an anti-human IFN- ⁇ antibody was coated on an ELISPOT plate (BD Bioscience) for 18 hours.
- FIG. 1 shows the results of analysis of killer T cells induced by the typical GPC3 155-163 peptide.
- the cytotoxic activity of the induced killer T cells is HLA-A2-positive and expresses GPC3 and is ⁇ ⁇ Parental SK-Hep-1 cells and SK-Hep-1 / gene-transfected to express GPC3 GPC 3 cells were used as stimulating cells and examined by cytotoxicity tests.
- the cytotoxic activity of killer T cells was evaluated by a cytotoxicity test using Terascan VP. First, target cells Fluorescently labeled with force lucein AM stain for 30 minutes at ° C. These cells were co-cultured with killer T cells on Coster 96-well half-area plates, and the degree of cytotoxicity was measured by detecting fluorescent cells over time.
- Cancer immunotherapy targeting the GPC3 peptide presented by HLA-A24 has been shown to be effective in animal experiments with mice. 60% of Japanese can not be subject to force vaccine administration. By identifying peptides presented to killer T cells by HLA-A2 this time, 85% of Japanese can be targeted for vaccine administration. If the efficacy of exploratory medicine using peptides presented to killer T cells by HLA-A2 is demonstrated, the possibility of clinical application to Western whites will increase. In addition, by identifying peptides presented to killer T cells by HLA-A2, which has a high frequency of positive in Western whites, it can only be applied to 40% of Japanese patients with hepatocellular carcinoma and melanoma. It can be applied to many Western whites.
- FIG. 1 shows representative results of detecting IFN- ⁇ produced by killer T cells activated specifically by recognizing GPC3 peptide by ELISPOT analysis.
- Killer T cells induced by stimulating CD8-positive cells in the peripheral blood of patients with hepatocellular carcinoma with CD14-positive monocytes loaded with GPC3 155-163 peptide appear to express GPC3
- SK-Hep-1 / GPC3 cells introduced with the gene are used as stimulating cells (right figure)
- HLA-A2 positive and GPC3 is expressed, and the parental SK-Hep-1 cells are stimulated cells.
- the number of spots and the total spot area were significantly larger.
- GPC3 155-163 peptide was determined to be an epitope peptide capable of inducing GPC3-specific killer T cells.
- FIG. 2 shows the results of ELISPOT analysis and cytotoxicity test.
- HLA-A2 positive liver Peripheral blood power of patients with cystic cancer also selected CD8 + T cells and stimulated with monocyte-derived cells loaded with each GPC3 peptide. Whether or not IFN- ⁇ was produced was examined by Elispot Atsy, and whether or not GPC3-expressing cells were specifically damaged was examined by a cytotoxicity test.
- target cells parental SK-Hep-1 cells positive for HLA-A2 and not expressing GPC3, and SK-Hep-1 / GPC3 cells transfected with GPC3 were used.
- killer T cells induced with GPC3 44-5 2 144-152, 155-163 peptides produced GFN3- ⁇ by specifically identifying SK-Hep-1 / GPC3 cells, and The killer cells induced by GPC3 169-177 peptide, which showed high cytotoxic activity, did not exhibit GPC3-specific killer cell activity. Based on the above, it was determined that GPC3 44-52, 144-152, and 155-163 peptides are epitope peptides that can induce GPC3-specific killer cells.
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Abstract
本発明の目的は、HLA-A2に結合してヒト・キラーT細胞を活性化できる、Glypican 3由来のペプチドを同定することにより、日本人においてGPC3を高発現する様々な癌患者の40％を対象とする免疫療法を可能にする手段を提供することである。本発明によれば、以下の何れかのペプチドが提供される。
（Ａ）配列番号１から３の何れかに示すアミノ酸配列からなるペプチド。
（Ｂ）配列番号１から３の何れかに示すアミノ酸配列において１個または２個のアミノ酸が置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、キラーＴ細胞の誘導能を有するペプチド。
Description
明 細 書
HLA-A2陽性者用 glypican-3(GPC3)由来癌拒絶抗原ペプチド及びこれを 含む医薬
技術分野
[0001] 本発明は、肝細胞癌、悪性黒色腫 (メラノーマ)など、 glypican-3(GPC3 )を高発現 する癌に対するワクチンとして有効な、新規ペプチド、当該ペプチドを含む腫瘍の治 療および予防のための医薬に関する。
背景技術
[0002] 原発性肝細胞癌は、世界各国で発生頻度の高!、悪性疾患の一つである。 B型およ び C型肝炎の世界的な流行により、アジアや欧州諸国における肝細胞癌の発生率は 急激に上昇しており、肝炎ウィルス感染力 発病までの長い潜伏期間を考慮すると、 今後 50年にわたって、この傾向が続くものと予想される。病状の進んだ肝細胞癌の 予後は不良であり、新たな治療戦略の開発が緊急に必要とされている。
[0003] 一方、近年の分子生物学及び腫瘍免疫学の発展により、細胞傷害性 (キラー) T細 胞およびヘルパー T細胞力 癌細胞あるいは抗原提示細胞の表面に HLA分子を介 して提示される、癌細胞に特異的に高発現する蛋白質が分解されてできたペプチド を認識して、癌細胞を破壊する免疫反応を示すことが明らかとなった。さらに、このよ うな癌を攻撃する免疫反応を刺激する、腫瘍抗原蛋白質及び、それらに由来するべ プチドが多数同定されてきており、抗原特異的な腫瘍免疫療法の臨床応用が進めら れている。
[0004] HLAクラス I分子は、身体のすべての有核細胞の表面に発現しており、細胞質や核 で産生される蛋白質が、細胞内で分解されて出来たペプチドを結合して、細胞表面 に発現する。正常な細胞の表面には、正常な自己の蛋白質に由来するペプチドが H LAクラス I分子に結合しており、これを免疫系の T細胞が識別して破壊することはない 。一方、癌細胞は癌になる過程で、正常細胞には、ほとんど発現していないか、ある いはごく僅かしか発現して 、な 、蛋白質を大量に発現することがある。このような癌細 胞に特異的に高発現する蛋白質が細胞質内で分解されて出来たペプチドが、 HLA
クラス I分子に結合して癌細胞の表面に発現すると、キラー T細胞がこれを認識して癌 細胞のみを破壊する。また、このような癌特異抗原やペプチドを個体に投与すること により、正常細胞には危害を加えることなぐ癌細胞を破壊して癌の増殖を抑制する ことができる。これを、癌特異抗原を用いた癌免疫療法と呼ぶ。また HLAクラス II分子 は、主に抗原提示細胞の表面に発現しており、抗原提示細胞が細胞外から取り込ん で、細胞内で分解されて出来た癌特異抗原由来のペプチドを結合して細胞表面に 発現する。これを認識したヘルパー T細胞は、活性化され他の免疫担当細胞を活性 化する種々のサイト力インを産生することにより、腫瘍に対する免疫反応を誘導あるい は増強する。
[0005] そこで、これらの癌に特異的に高発現している抗原を標的にした免疫療法を開発 できれば、自己の正常臓器に有害事象を及ぼすことなぐ癌だけを有効に排除する 治療法になる可能性がある。また、他の治療が行えない、どんな末期の癌患者にでも 使用できる治療法になりうると期待される。また、あらかじめ、このような癌を発生する リスクが高いヒトに対して、癌特異抗原およびペプチドをワクチンとして投与することに より、癌の発生を予防できる可能性がある。
[0006] a -フ トタンパク質 (AFP)は、正常組織では胎生期にのみ発現する力 多くの肝細 胞癌において発現が再活性化される、いわゆる癌胎児性蛋白質であることが報告さ れている。またマウス及びヒトの T細胞中には、 MHCクラス I分子により提示された AFP 由来ペプチドェピトープを認識するものが存在する。胎児は発達段階において、血 漿中に高 、レベルで存在する AFPに曝露されて!、るにもかかわらず、成熟 T細胞は A FPに対して完全な免疫寛容（トレランス）を獲得することはなぐ AFP特異的な T細胞 が末梢血中に検出される。すなわち、癌胎児性蛋白質は、免疫治療の標的になりう る。
[0007] 肝細胞癌の治療法には様々なものがあるにも関わらず、他の癌に比べて予後が悪 ぐ難治性癌の一つになっている。その原因として、肝細胞癌のベースに肝硬変があ り、患者の肝機能が悪いことや、一塊の癌を治療しても、また別の場所力 癌が発生 するという特徴が挙げられ、早急かつ新たな治療戦略の開発が要求されている。肝 細胞癌に特異的に高発現している抗原を標的にした免疫療法を開発できれば、自
己の正常臓器に障害を及ぼすことなぐ癌だけを有効に排除する治療法になる可能 性がある。また、どんな末期の癌患者でも、さらに肝機能が悪すぎて他の治療が行え ない患者に対しても、使用できる治療法になると期待される。また、現在、日本では、 肝細胞癌の予備群である C型肝炎感染者が 200万人以上存在すると言われている。 これらの感染者における肝細胞癌の予防に関しても、このような免疫療法が適用でき る可能性がある。
[0008] メラノーマとは悪性黒色腫と呼ばれる皮膚がんの一種である。皮膚がんにもいろい ろ種類があるが、最も悪性度が高い皮膚がんで、非常に恐れられている。皮膚を構 成している細胞のなかに、メラニン色素を産生する細胞があり、これを色素細胞 (メラ ノサイト）と呼ぶが、この細胞ががん化したのがメラノーマである。
[0009] 日本におけるメラノーマの発生数は人口 10万人あたり 1.5〜2人くらいであり、年間 1 500人〜 2000人く b\、が発症して 、ると推測されて 、る。欧米では人口 10万人あたり 1 0数人以上が発症し、オーストラリアでは人口 10万人あたり 20数人以上の発症が認め られ、世界一発生数が高いと言われている。それだけに欧米やオーストラリアの人々 はメラノーマに関心を持ち、メラノーマの発生に注意をしている。またメラノーマは、環 境破壊による大気中のオゾン層の減少による、紫外線への暴露の増加により、特に 白人において発生頻度が増加しつつある。また、日本でもメラノーマの発生は、年々 増加傾向が認められている。最近の調査では、日本におけるメラノーマによる年間死 亡者数は 450人前後に増加している。メラノーマは何歳の人にも発生している力 特 に 40歳以上になると発生が多くなり、 60歳〜 70歳台が最も多くなつている。小児の発 生は非常に少ないが、発生しないということはなぐ最近 20〜30歳台の若年者の発生 が多くなつている傾向がある。性別では特にどちらかに多いという傾向はなぐ男女ど ちらにも発生する。 日本人においてメラノーマが発生しやすい部位は、足底 (足のうら )が最も多ぐ約 3割ぐらいを占めている。足や指の爪の部分にも多くできることが、日 本人の特徴である。そのほか、欧米人と同様に体、手、足、顔、頭など、どこの皮膚に も発生する。
[0010] 本発明者等は先に、 cDNAマイクロアレイ解析を利用した、 23,040種のヒト遺伝子 を含むゲノムワイドの遺伝子発現解析によって、 20症例の原発性肝細胞癌および胎
生期を含む様々な正常臓器における、これらの遺伝子の発現プロファイルを検討し、 グリピカン 3 (glypican-3 ;GPC3)が、胎生期の肝臓、腎臓、肺に発現し、成人の正常 臓器では胎盤以外には、ほとんど発現しないのに対し、多くの肝細胞癌で高発現す ることを見いだした。さらに、この GPC3が、分泌蛋白であり、 ELISA法を用いて 40 %の 肝細胞癌患者の血清中に、 GPC3を検出することができ、これが、肝細胞癌の新しい 腫瘍マーカーとして有用であることを報告した（Nakatsura, T.ら， Biochem. Biophys. R es. Commun. 306, 16-25 (2003))。さらに、 GPC3はメラノーマ患者の血清中にも検出 され、メラノーマの腫瘍マーカーとしても、有用であることを報告した (Nakatsura, T.ら 、 Clin. Cancer Res. 10: 6612-6621 (2004)) .
[0011] 本発明者らは既に、 HLA-A24陽性肝細胞癌あるいはメラノーマ患者を対象とした 免疫療法に有用な、 HLA-A24に結合してヒト 'キラー T細胞に提示される GPC3ぺプ チドを同定した。このペプチドを用いた免疫療法が有効なことを、 HLA-A24に結合す るペプチドと同様の構造を持つペプチドを結合する、マウス Kd分子を発現する BALB /Cマウスを用いた動物実験においても証明し、既に報告している（国際出願番号 PC T/JP2004/016374：国際出願日 2004年 10月 28日））。 GPC3は正常臓器にお!、ては、 胎盤と胎生期の肝臓にしか発現していないため、 GPC3をターゲットとした免疫療法を 行って腫瘍の増殖を抑制しても、自己免疫病などの有害事象が起こらないこともマウ スの実験で確認して 、る。
[0012] 本発明者らは、今までに腫瘍拒絶抗原である glypican-3(GPC3)について、主に HL
A-A24によりキラー T細胞に提示されるペプチドを同定してきた（国際出願番号 PCT/
JP03/10459 ;国際出願日 2003年 8月 19日）。しかしながら、 HLA-A24によりキラー T細 胞に提示されるペプチドだけでは、日本人のうち HLA-A24を有する 60%しかべプチ ドワクチン投与の対象にならない。さらに、 日本人の 40%が陽性の HLA-A2によりキラ 一 T細胞に提示されるペプチドを同定することが出来れば、両者を併せると日本人の 約 85%を対象とできるだけでなく、 HLA-A2は欧米白人にお 、ても陽性者の頻度が 高いため、多くの欧米白人にも応用できることになる。したがって、 HLA-A2によりキラ 一 T細胞に提示されるペプチドの同定は、重要な課題である。特にメラノーマは欧米 白人に多ぐ免疫療法が有効な癌であり、さらに、肝細胞癌も欧米で急速に増加して
きている癌であるため、 HLA-A2結合性 GPC3ペプチドを用いた免疫療法の、適応に なる患者も多いと推定される。
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0013] 本発明は、 HLA-A2によりキラー T細胞に提示されるペプチドを同定することにより、 日本人の GPC3を高発現する様々な癌患者の約 40%を対象とすることができる、免疫 療法を可能にする手段を提供することを解決すべき課題とした。
課題を解決するための手段
[0014] 本発明者等は、先に、 cDNAマイクロアレイ解析に基づいて、ヒト肝細胞癌におい て特異的に過剰発現して 、る新規な癌胎児性タンパク質としてグリピカン 3 (GPC3) を同定し、さらに肝細胞癌患者血清中に可溶性 GPC3タンパク質が検出され、 GPC 3は肝細胞癌の新たな腫瘍マーカーとなり得ることを明らかにした。本発明者等は、 マウスメラノーマ細胞株 B 16に GPC3が発現することを発見し、 GPC3がメラノーマに おいても肝細胞癌と同様に高発現しており、有用な腫瘍マーカーになりうるのではな いかと考え、確認のための実験を行った結果、 GPC3がメラノーマにおいて今までに な力つた早期診断のできる腫瘍マーカーであることを見 、だした。本発明者らは今回 、ヒト CD8陽性キラー T細胞を in vitroにおいて、 HLA- A2結合モチーフを持つヒト GPC 3ペプチドをパルスした、ヒト '末梢血単球由来榭状細胞と共培養することにより刺激し て、 GPC3ペプチド特異的キラー T細胞を誘導した。各 GPC3ペプチドに特異的なキラ 一 T細胞の誘導の有無を、 HLA-A2により提示されたペプチドを認識して活性ィ匕され た、キラー T細胞が産生する γ -インターフェロン（IFN- y )を ELISPOT法を用いて検 出し、免疫治療に応用可能な標的抗原の候補となりうる、新規な GPC3ペプチドを同 し 7こ。
[0015] 即ち、本発明によれば以下の発明が提供される。
(1) 以下の何れかのペプチド。
(A)配列番号 1から 3の何れかに示すアミノ酸配列力 なるペプチド。
(B)配列番号 1から 3の何れかに示すアミノ酸配列において 1個または 2個のアミノ酸 が置換又は付加されたアミノ酸配列力もなり、キラー T細胞の誘導能を有するぺプチ
ド、。
[0016] (2) (1)に記載のペプチドを少なくとも 1種類以上含む、癌に対する免疫誘導剤。
(3) (1)に記載のペプチドを少なくとも 1種類以上含む、腫瘍の治療及び Zまたは 予防のための医薬。
(4) (1)に記載のペプチドを含む、腫瘍反応性 T細胞の誘導能の高 ヽ抗原提示細 胞を誘導するための薬剤。
[0017] (5) 以下の何れかのペプチドをコードする遺伝子を含む、腫瘍反応性 T細胞の誘 導能の高！、抗原提示細胞を誘導するための薬剤。
(A)配列番号 1から 3の何れかに示すアミノ酸配列力 なるペプチド。
(B)配列番号 1から 3の何れかに示すアミノ酸配列において 1個または 2個のアミノ酸 が置換又は付加されたアミノ酸配列力もなり、キラー T細胞の誘導能を有するぺプチ ド、。
[0018] (6) (1)に記載のペプチドを含む、腫瘍反応性 T細胞を誘導するための薬剤。
(7) (1)に記載のペプチドに対する抗体。
(8) (1)に記載のペプチドを用いて誘導される、ヘルパー T細胞、キラー T細胞、又 はこれらを含む免疫細胞集団。
[0019] (9) HLA分子と請求項 1に記載のペプチドとの複合体を提示する抗原提示細胞。
(10) (4)または（5)に記載の薬剤によって誘導される、（9)に記載の抗原提示細胞
発明を実施するための最良の形態
[0020] (1)本発明のペプチド、及びそれを含む癌に対する免疫誘導剤
本発明のペプチドは以下の何れかのペプチドである。
(A)配列番号 1から 3の何れかに示すアミノ酸配列力 なるペプチド。
(B)配列番号 1から 3の何れかに示すアミノ酸配列において 1個または 2個のアミノ酸 が置換又は付加されており、キラー T細胞の誘導能を有するペプチド。
[0021] 本明細書で言うキラー T細胞の誘導能を有するペプチドとは、キラー T細胞 (キラー
T細胞, CTL)を刺激する T細胞誘導活性を有するペプチドを意味する。
[0022] 本発明のペプチドの入手'製造方法は特に限定されず、化学合成した蛋白質でも
、遺伝子組み換え技術により作製した組み換え蛋白質の何れでもよい。
[0023] 化学合成ペプチドを入手する場合には、例えば、 Fmoc法 (フルォレニルメチルォキ シカルボ-ル法)、 tBoc法 (t ブチルォキシカルボ-ル法)等の化学合成法に従って 本発明のペプチドを合成することができる。また、各種の市販のペプチド合成機を利 用して本発明のペプチドを合成することもできる。
[0024] 本発明のペプチドを組み換え蛋白質として産生するには、当該ペプチドをコードす る塩基配列を有する DNA又はその変異体又は相同体を入手し、これを好適な発現 系に導入することにより本発明のペプチドを製造することができる。
[0025] 発現ベクターとしては、好ましくは宿主細胞において自立複製可能である力、ある いは宿主細胞の染色体中へ糸且込み可能であるものであればよぐペプチドをコード する遺伝子を発現できる位置にプロモーターを含有しているものが使用される。また 、本発明のペプチドをコードする遺伝子を有する形質転換体は、上記の発現べクタ 一を宿主に導入することにより作製することができる。宿主は、細菌、酵母、動物細胞 、昆虫細胞のいずれでもよぐまた宿主への発現ベクターの導入は、各宿主に応じた 公知の手法により行えばよい。
[0026] 本発明にお ヽては、上記のようにして作製した形質転換体を培養し、培養物中に 本発明のペプチドを生成蓄積させ、該培養物より本発明のペプチドを採取することに より組み換えペプチドを単離することができる。
[0027] 形質転換体が大腸菌等の原核生物、酵母菌等の真核生物である場合、これら微生 物を培養する培地は、該微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し 、形質転換体の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地のいずれ でもよ!/ヽ。また培養条件も該微生物を培養するのに通常用いられる条件にて行えば よい。培養後、形質転換体の培養物から本発明のペプチドを単離精製するには、通 常のペプチドの単離、精製法を用いればよい。
[0028] なお、配列番号 1から 3の何れかに示すアミノ酸配列において 1個または 2個のアミ ノ酸が置換又は付加されたアミノ酸配列からなるペプチドは、配列番号 1から 3の何 れかに記載のアミノ酸配列をコードする DNA配列の塩基配列の情報に基づいて当 業者であれば適宜製造又は入手することができる。即ち、配列番号 1から 3の何れか
に示すアミノ酸配列において 1個または 2個のアミノ酸が置換又は付加されたアミノ酸 配列からなり、キラー T細胞の誘導能を有するペプチドをコードする遺伝子は、化学 合成、遺伝子工学的手法又は突然変異誘発などの当業者に既知の任意の方法で 作製することもできる。例えば、遺伝子工学的手法の一つである部位特異的変異誘 発法は、特定の位置に特定の変異を導入できる手法であることから有用であり、 Mole cular Cloning: A laboratory Mannual, 2 Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY., 1989 (以下、モレキュラークロー-ング第 2版と略す）、 Current Pr otocols in Molecular Biology, Supplement 1〜38, John Wiley & Sons (1987- 1997 以下、カレント'プロトコールズ'イン'モレキュラー 'バイオロジーと略す)等に記載の 方法に準じて行うことができる。
[0029] 上記した本発明のペプチドは、後記実施例にも示す通り、癌に対する免疫を誘導 することができる。従って、本発明によれば、本発明のペプチドを含む、癌に対する 免疫誘導剤が提供される。
[0030] 本発明の癌に対する免疫誘導剤は、インビトロ又はインビボ、好ましくはインビトロで 用いることにより、ヘルパー T細胞、キラー T細胞、又はこれらを含む免疫細胞集団を 誘導することができ、これにより癌に対する免疫を付与することができる。
[0031] (2)本発明の抗体
本発明は、上記した本発明のペプチドの一部もしくは全部をェピトープ (抗原）とし て認識する抗体、ならびに当該蛋白質又はペプチドを用いてインビトロ刺激により誘 導されたキラー T細胞にも関する。一般的には、キラー T細胞のほうが抗体よりも強い 抗腫瘍活性を示す。
[0032] 本発明の抗体はポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体でもよぐその作製は 定法により行なうことができる。
[0033] 例えば、ポリクローナル抗体は、本発明のペプチドを抗原として哺乳動物又は鳥類 を免疫感作し、該哺乳動物又は鳥類力 血液を採取し、採取した血液から抗体を分 離'精製することにより得ることができる。例えば、マウス、ノ、ムスター、モルモット、 -ヮ トリ、ラット、ゥサギ、ィヌ、ャギ、ヒッジ、ゥシ等の哺乳動物又は鳥類を免疫することが できる。免疫感作の方法は当業者に公知であり、例えば抗原を、例えば 7〜30日間
隔で 2〜3回投与すればよい。投与量は 1回につき、例えば抗原約 0. 05〜2mg程 度とすることができる。投与経路も特に限定されず、皮下投与、皮内投与、腹膜腔内 投与、静脈内投与、筋肉内投与等を適宜選択することができる。また、抗原は適当な 緩衝液、例えば完全フロイントアジュバント又は水酸ィ匕アルミニウム等の通常用いら れるアジュバントを含有する適当な緩衝液に溶解して用いることができる。
[0034] 免疫感作した哺乳動物又は鳥類を一定期間飼育した後、抗体価が上昇してきたら 、例えば 100 g〜1000 gの抗原を用いて追加免疫を行なうことができる。最後の 投与から 1〜2ヶ月後に免疫感作した哺乳動物又は鳥類力も血液を採取して、当該 血液を、例えば遠心分離、硫酸アンモ-ゥム又はポリエチレングリコールを用いた沈 澱、ゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ァフィ-ティーク口マト グラフィ一等のクロマトグラフィー等の常法によって分離.精製することにより、ポリクロ 一ナル抗血清として、本発明のペプチドを認識するポリクローナル抗体を得ることが できる。
[0035] 一方、モノクローナル抗体はノ、イブリドーマを調製して得ることができる。例えば、抗 体産生細胞とミエローマ細胞株との細胞融合によりハイプリドーマを得ることができる 。本発明のモノクローナル抗体を産生するハイプリドーマは、以下のような細胞融合 法によって得ることができる。
[0036] 抗体産生細胞としては、免疫された動物からの脾細胞、リンパ節細胞、 Bリンパ球等 を使用する。抗原としては、本発明のペプチドを使用する。免疫動物としてはマウス、 ラット等を使用でき、これらの動物への抗原の投与は常法により行う。例えば完全フロ インドアジュバント、不完全フロインドアジュバントなどのアジュバントと抗原である本 発明のペプチドとの懸濁液もしくは乳化液を動物の静脈、皮下、皮内、腹腔内等に 数回投与することによって動物を免疫化する。免疫化した動物から抗体産生細胞とし て例えば脾細胞を取得し、これとミエローマ細胞とを公知の方法（G.Kohler et al .,Na ture,256 495(1975))により融合してハイプリドーマを作製することができる。
[0037] 細胞融合に使用するミエローマ細胞株としては、例えばマウスでは P3X63Ag8、 P 3U1株、 Sp2Z0株などが挙げられる。細胞融合を行なうに際しては、ポリエチレング リコール、センダイウィルスなどの融合促進剤を用い、細胞融合後のハイプリドーマの
選択にはヒポキサンチン'アミノプテリン'チミジン (HAT)培地を常法に従って使用す る。細胞融合により得られるハイプリドーマは限界希釈法等によりクローユングする。 さらに必要に応じて、本発明のペプチドを用いた酵素免疫測定法によりスクリーニン グを行うことにより、本発明のペプチドを特異的に認識するモノクローナル抗体を産 生する細胞株を得ることができる。
[0038] このようにして得られたノヽイブリドーマから目的とするモノクローナル抗体を製造す るには、通常の細胞培養法や腹水形成法により該ハイブリドーマを培養し、培養上清 あるいは腹水から該モノクローナル抗体を精製すればょ 、。培養上清もしくは腹水か らのモノクローナル抗体の精製は、常法により行なうことができる。例えば、硫安分画 、ゲルろ過、イオン交換クロマトグラフィー、ァフィ-ティークロマトグラフィーなどを適 宜組み合わせて使用できる。
[0039] また、上記した抗体の断片も本発明の範囲内である。抗体の断片としては、 F (ab' ) 2フラグメント、 Fab'フラグメント等が挙げられる。
[0040] (3)ヘルパー T細胞、キラー T細胞、又はこれらを含む免疫細胞集団
本発明はまた、本発明のペプチドを用いてインビトロ刺激により誘導されたへルバ 一 T細胞、キラー T細胞、又はこれらを含む免疫細胞集団に関する。例えば、末梢血 リンパ球や腫瘍浸潤リンパ球を本発明のペプチドを用いて、インビトロで刺激すると 腫瘍反応性活性化 T細胞が誘導され、この活性化された T細胞は養子免疫療法に 有効に用いることができる。また本発明のペプチドを強力な抗原提示細胞である榭状 細胞にインビボあるいはインビトロで発現させて、その抗原発現榭状細胞投与により 免疫誘導を行うことができる。
[0041] 好ましくは、本発明のペプチドと、免疫賦活剤とを用いてインビトロ刺激により、ヘル パー T細胞、キラー T細胞、又はこれらを含む免疫細胞集団を誘導することができる。 ここで用いる免疫賦活剤としては、細胞増殖因子又はサイト力インなどが挙げられる。
[0042] 上記のようにして得られたヘルパー T細胞、キラー T細胞、又はこれらを含む免疫 細胞集団を体内に移入することにより、腫瘍を抑制することができ、癌を予防及び Z 又は治療することが可能である。
[0043] また、本発明のペプチドを用いることにより、上記した通り腫瘍を抑制することができ
るヘルパー T細胞、キラー Τ細胞、又はこれらを含む免疫細胞集団を作製することが できる。従って、本発明によれば、本発明のペプチドを含む細胞培養液が提供される
。この細胞培養液を用いることにより、腫瘍を抑制することができるヘルパー τ細胞、 キラー τ細胞、又はこれらを含む免疫細胞集団を作製することができる。さらに、本発 明によれば、上記の細胞培養液、及び細胞培養容器を含む、ヘルパー Τ細胞、キラ 一 τ細胞、又はこれらを含む免疫細胞集団を作製するための細胞培養キットも提供さ れる。
[0044] (4)本発明の腫瘍の治療及び Ζまたは予防のための医薬 (癌ワクチン）
本発明のペプチドは、癌細胞特異的キラー Τ細胞を誘導することができるので、癌 の治療、予防剤として期待できる。例えば、本発明のペプチドをコードする遺伝子を 適当なベクターに組み込み、この組換え DNAで形質転換された BCG菌の細菌、ま たは本発明のペプチドをコードする DNAをゲノムに組み込まれたワクシニアウィルス 等のウィルスは、ヒト癌の治療 ·予防用生ワクチンとして有効に利用できる。なお、癌ヮ クチンの投与量及び投与法は通常の種痘や BCGワクチンと同様である。
[0045] 即ち、本発明のペプチドをコードする DNA (そのまま、あるいは発現ベクターに組 み込んだプラスミド DNAの形）、当該 DNAを含む組換えウィルス若しくは組換え細 菌はそのままあるいはアジュバントに分散した状態で癌ワクチンとしてヒトを含む哺乳 動物に投与することができる。本発明のペプチドも同様にアジュバンドと分散した状 態で癌ワクチンとして投与することができる。
[0046] 本発明で用いることができるアジュバントとしては、フロイントの不完全アジュバント、 BCG、トレハロースダイマイコレート（TDM)、リポ多糖 (LPS)、ミヨウバンアジュバント 、シリカアジュバント等が挙げられるが、抗体の誘導能等の関係から、フロイントの不 完全アジュバント (IFA)を使用することが好ま 、。
[0047] 本明細書で言う癌の種類は特に限定されず、具体例としては、食道癌、乳癌、甲状 腺癌、大腸癌、膝癌、悪性黒色腫 (メラノーマ）、悪性リンパ腫、骨肉腫、褐色細胞腫 、頭頸部癌、子宮癌、卵巣癌、脳腫瘍、慢性骨髄性白血病、急性骨髄性白血病、腎 臓癌、前立腺癌、肺癌、胃癌、肝癌、胆嚢癌、精巣癌、甲状腺癌、膀胱癌又は肉腫 などが挙げられる。
[0048] 本発明のペプチドは、 T細胞ェピトープとして癌細胞特異的キラー T細胞を誘導す ることができるので、ヒト癌の予防 ·治療剤として有用である。また、本発明の抗体も、 癌抗原である GPC3の活性を阻害することができるものであれば、ヒト癌の予防 '治療 剤として有用である。実際の使用法としては、本発明のペプチド又は抗体をそのまま 、又は医薬的に許容される担体及び Z又は希釈剤ととともに、必要に応じて下記の 補助剤も加えて、注射剤として投与することもできるし、噴霧などの方法で粘膜からの 経皮吸収などで投与してもよい。尚、ここで言う担体とは例えば、ヒト血清アルブミンで あり、また希釈剤としては、例えば PBS、蒸留水等を挙げることができる。
[0049] 投与量は成人 1人当たり、本発明のペプチド又は抗体を例えば、 1回当たり O.Olmg 〜100mgの範囲になるように投与することができる力 この範囲に限定されるものでは ない。製剤の形態も特に限定されず、凍結乾燥したものや、糖などの賦形剤を加え て顆粒にしたものでもよ！/、。
[0050] 本発明の薬剤に添加することができる腫瘍反応性 T細胞誘導活性を高めるための 補助剤としては、ムラミルジペプチド (MDP)ほかの BCG菌などの菌体成分、 Nature, vol. 344, p873 (1990)に記載される ISCOM、 J.Immunol. vol. 148, pl438(1992)に記載 されるサポニン系の QS-21、リボソーム、水酸化アルミニウムなどが挙げられる。また、 レンチナン、シゾフィラン、ピシバーニールなどの免疫賦活剤を補助剤として用いるこ ともできる。また、 IL— 2、 IL— 4、 IL 12、 IL— 1、 IL— 6、 TNFなどの T細胞の増殖 、分ィ匕を増強するサイト力イン等、ならびに NKT細胞を活性ィ匕する αガラクトシルセラ ミドゃ ToU様レセプターに結合して自然免疫系を活性化する CpG、リポ多糖 (LPS)な ども補助剤として用いることができる。
[0051] また、患者力 採取した細胞または、一部の HLA対立遺伝子を共有する他人の（ァ 口)細胞に試験管内で当該抗原ペプチドを加え、抗原提示させた後、患者血管内に 投与し、患者体内で効果的にキラー T細胞を誘導することもできる。また、患者末梢 血リンパ球に当該ペプチドを加えて試験管内で培養することにより、試験管内でキラ 一 τ細胞を誘導した後に患者血管内に戻すこともできる。このような細胞移入による 治療は既に癌治療法として実施されており、当業者間ではよく知られた方法である。
[0052] 本発明のペプチドを体内に注入することにより、キラー T細胞を誘導活性ィ匕し、その
結果、抗腫瘍効果が期待できる。また、リンパ球をインビトロで本発明のペプチドで刺 激すると活性化 T細胞が誘導され、この活性ィ匕された T細胞を患部に注入することに よる養子免疫療法に有効に用いることができる。
[0053] 以下の実施例により本発明を更に説明するが、本発明はこれら実施例に限定され るものではない。
実施例
[0054] [実施例 1]
(1) HLA-A2に結合性を示す GPC3ペプチドの選択
ヒト GPC3のアミノ酸配列を BIMAS systemにより検索して、 HLA-A2との推定された 結合力 (binding affinity)が 20以上のものを 4種類、選択した。
[0055] [表 1]
. ぺプチドのポジシヨン一ぺプチドのァミノ酸配列 —結合親和性スコァ
GPC3 44- 52 RLQPGLKWV 879
GPC3 144-152 FVGEFFTDV 828
GPC3 155 163 YILGSDINV 162
GPC3 169-177 ELFDSLFPV 1055
[0056] [実施例 2]
HLA-A2結合性 GPC3ペプチドによるヒト ·キラー T細胞の誘導
(1)採血
熊本大学医学部消ィ匕器外科および国立がんセンター東病院にて治療中の、 HLA- A2が陽性の肝細胞癌患者からインフォームドコンセントを得た後、血液サンプル 30ml を得て、先に報告した方法により（ Nakatsura, Tら、 EurJ.Immunol.32, 826-836(2002) ), FicoU-Conray密度勾配遠心法を利用して末梢血単核細胞を単離した。
[0057] (2)末梢血単核細胞からの CD8陽性細胞と CD14陽性細胞の分離とキラー T細胞誘 導
単離した末梢血単核細胞から、先に報告した方法 (Monji,Mら Clin Cancer Resl0,60 47-6057,2004)を用いてキラー T細胞を誘導した。まず MACSを用いて末梢血単核細 胞中の CD8陽性細胞と CD14陽性細胞を分離し、 CD14陽性細胞を GM- CSF(100ng/
ml)と IL-4(20ng/ml)存在下に 5日間培養して榭状細胞を分化誘導した後に、 TNF- a ( 20ng/ml)を添カ卩して成熟させ、 7日目に各 GPC3ペプチドを添加 (10 M)し、 CD8陽性 細胞と共培養した。この自己 CD14陽性細胞由来の榭状細胞による抗原刺激を 1週 毎に 3〜4回繰り返し、ペプチド特異的キラー T細胞を誘導した。誘導中メディウムは 2 日毎に半分交換し、 IL-2を lOU/mlの濃度で添加した。
[0058] (3) ELISPOT法による GPC3特異的キラー T細胞活性の検討
これらの誘導したキラー T細胞の中に、確かに GPC3に特異的に反応して IFN- γを 産生するものが存在するかどうかを ELISPOT法にて検出した。 IFN- γの検出は、 ELI SPOT Human IFN- γ ELISPOT set (BD社)を用いて行った。刺激細胞（ターゲット） に対して、キラー T細胞 (エフェクター）が反応して IFN- γを産生すると、それぞれが 赤いスポットとして検出される。標的細胞として、 HLA-A2陽性で GPC3を発現してい な 、親株の SK-Hep-1細胞と、 GPC3を発現するように遺伝子導入された SK-Hep-l/ GPC3細胞を用いた。まず、抗ヒト IFN- γ抗体を ELISPOTプレート (BD Bioscience社） に 18時間コーティングした。その後、 10%FCS/RPMIにて 2時間ブロッキングを行った 。エフェクター細胞 (100 μ L /well)と標的細胞 (100 μ L /well)を混合し、 37°Cで 22時間 培養した。エフェクター Zターゲット比 (E/T比）は、 5 : 1で実験を行なった。その後、 プレートを滅菌水で洗浄し、ピオチンィ匕抗ヒ HFN- γ抗体と 2時間、さらにストレブトァ ビジン- HRPと 1時間反応させ、基質溶液にて IFN- γ陽性のスポットを検出した。スポ ットのカウントは、 MINERVA TECH社の自動解析ソフトを用いて行った。この結果、 G PC3 44-52、 144-152、 155-163ペプチドで誘導したキラー T細胞において GPC3特異 的キラー T細胞活性に差を認めた力 GPC3 169-177ペプチドで誘導したキラー T細 胞においては GPC3特異的キラー T細胞活性に差を認めな力つた (図 1及び図 2)。代 表的な GPC3 155-163ペプチドで誘導したキラー T細胞の解析結果を図 1に示す。
[0059] (4)細胞傷害性試験によるキラー T細胞の細胞傷害活性の検討
誘導したキラー T細胞の細胞傷害活性は、 HLA-A2陽性で GPC3を発現して ヽな ヽ 親株の SK-Hep-1細胞と、 GPC3を発現するように遺伝子導入された SK-Hep- 1/GPC 3細胞を刺激細胞として、細胞傷害性試験により検討した。キラー T細胞の細胞傷害 活性は、テラスキャン VPによる細胞傷害性試験により評価した。まず、標的細胞を 37
°Cで、 30分間力ルセイン AM染色液にて蛍光標識した。これらの細胞を Coster96穴ハ ーフ 'エリアプレート上でキラー T細胞と共培養し、経時的に蛍光発色細胞を検出す ることにより細胞傷害の程度を測定した。解析は、 MINERVA TECH社の蛍光法によ る細胞傷害試験計算処理ソフト C Ct-961にて行った。 E/T比は、 20 : 1で実験を行な つた。この結果、 GPC3 44-52、 144-152、 155-163ペプチドで誘導したキラー T細胞に おいて GPC3特異的な細胞傷害活性を認めた力 GPC3 169-177ペプチドで誘導し たキラー T細胞にっ 、ては、 GPC3特異的な細胞傷害活性を認めな力つた (図 2)。 産業上の利用可能性
[0060] HLA-A24により提示される GPC3ペプチドを標的とした癌免疫療法は、マウスの動 物実験でも有効性が認められている力 HLA-A24によりキラー T細胞に提示される ペプチドだけでは、日本人の 60%し力ワクチン投与の対象者にできない。今回 HLA- A2によりキラー T細胞に提示されるペプチドを同定することで、両者併せると日本人 の 85%をワクチン投与の対象者にできる。 HLA-A2によりキラー T細胞に提示される ペプチドを用 、た探索医療で有効性を示せれば、欧米白人にも臨床応用される可 能性も高まってくる。また、欧米白人で陽性者の頻度が高い HLA-A2によりキラー T 細胞に提示されるペプチドを同定することにより、 日本人の肝細胞癌およびメラノ一 マ患者の 40%に応用可能であるだけでなぐ多くの欧米白人にも応用できる。
図面の簡単な説明
[0061] [図 1]図 1は、 GPC3ペプチドを特異的に認識して活性ィ匕されたキラー T細胞が産生し た、 IFN- γを ELISPOT解析により検出した代表的な結果を示す。肝細胞癌患者の末 梢血中の CD8陽性細胞を、 GPC3 155-163ペプチドを負荷した CD14陽性単球に由 来する榭状細胞で刺激して誘導したキラー T細胞は、 GPC3を発現するように遺伝子 導入された SK- Hep- 1/GPC3細胞を刺激細胞とした場合 (図右)は、 HLA- A2陽性で G PC3を発現して ヽな 、親株の SK-Hep-1細胞を刺激細胞とした場合 (図左)に比べ、ス ポットの数も、スポットの面積の総和も有意に大きかった。これより GPC3 155-163ぺ プチドは、 GPC3特異的キラー T細胞を誘導できるェピトープペプチドであると判定し た。
[図 2]図 2は、 ELISPOT解析と細胞傷害性試験の結果を示す。 HLA-A2陽性の肝細
胞癌患者末梢血力も CD8陽性 T細胞を選別し、各 GPC3ペプチドを負荷した単球由 来榭状細胞で刺激して得られたキラー Τ細胞力 GPC3発現細胞に対して特異的に 反応して IFN- γを産生するかどうかをエリスポットアツセィで検討し、また、 GPC3発現 細胞を特異的に傷害するかどうかを、細胞傷害性試験により検討した。標的細胞とし て、 HLA-A2陽性で GPC3を発現していない親株の SK- Hep-1細胞と、 GPC3を発現 するように遺伝子導入された SK- Hep- 1/GPC3細胞を用いた。その結果、 GPC3 44-5 2、 144-152、 155-163ペプチドで誘導したキラー T細胞は、 SK-Hep- 1/GPC3細胞を G PC3特異的に識別して IFN- γを産生し、かつ、高い細胞傷害活性を示した力 GPC3 169-177ペプチドで誘導したキラー Τ細胞にぉ 、ては、 GPC3特異的キラー Τ細胞活 性を示さなかった。以上より、 GPC3 44-52、 144-152、 155-163ペプチドは、 GPC3特 異的キラー Τ細胞を誘導できるェピトープペプチドであると判定した。
Claims
[1] 以下の何れかのペプチド。
(A)配列番号 1から 3の何れかに示すアミノ酸配列力 なるペプチド。
(B)配列番号 1から 3の何れかに示すアミノ酸配列において 1個または 2個のアミノ酸 が置換又は付加されたアミノ酸配列力もなり、細胞傷害性 (キラー) T細胞の誘導能を 有するペプチド。
[2] 請求項 1に記載のペプチドを少なくとも 1種類以上含む、癌に対する免疫誘導剤。
[3] 請求項 1に記載のペプチドを少なくとも 1種類以上含む、腫瘍の治療及び Zまたは予 防のための医薬。
[4] 請求項 1に記載のペプチドを含む、腫瘍反応性 T細胞の誘導能の高 ヽ抗原提示細 胞を誘導するための薬剤。
[5] 以下の何れかのペプチドをコードする遺伝子を含む、腫瘍反応性 T細胞の誘導能の 高 ヽ抗原提示細胞を誘導するための薬剤。
(A)配列番号 1から 3の何れかに示すアミノ酸配列力 なるペプチド。
(B)配列番号 1から 3の何れかに示すアミノ酸配列において 1個または 2個のアミノ酸 が置換又は付加されたアミノ酸配列力もなり、キラー T細胞の誘導能を有するぺプチ ド、。
[6] 請求項 1に記載のペプチドを含む、腫瘍反応性 T細胞を誘導するための薬剤。
[7] 請求項 1に記載のペプチドに対する抗体。
[8] 請求項 1に記載のペプチドを用いて誘導される、ヘルパー T細胞、キラー T細胞、又 はこれらを含む免疫細胞集団。
[9] HLA分子と請求項 1に記載のペプチドとの複合体を提示する抗原提示細胞。
[10] 請求項 4または 5に記載の薬剤によって誘導される、請求項 9に記載の抗原提示細 胞。
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