PT1923463E - Péptido antigénico de rejeição do cancro derivado de glipicano 3 (gpc3) para ser utilizado em doentes positivos para hla-a2 e composições farmacêuticas que contêm o antigénio - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO

PÉPTIDO ANTIGÉNICO DE REJEIÇÃO DO CANCRO DERIVADO DE GLIPICANO 3 (GPC3) PARA SER UTILIZADO EM DOENTES POSITIVOS PARA HLA-A2 E COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS QUE CONTÊM O ANTIGÉNIO

Dominio técnico A presente invenção tem por objecto novos péptidos que são eficazes como uma vacina para cancros que expressam num nivel muito elevado glipicano-3 (GPC3), tais como carcinoma hepatocelular ou melanoma maligno (melanoma) e um produto farmacêutico compreendendo os péptidos mencionados antes, utilizado para tratar e prevenir tumores. Técnica anterior 0 carcinoma hepatocelular primário é uma doença maligna que ocorre com uma frequência elevada em vários países em todo o mundo. Como resultado de grandes surtos de hepatite B e C em todo o mundo, a incidência do carcinoma hepatocelular tem vindo a aumentar rapidamente em países asiáticos e europeus. Tendo em consideração o longo período de incubação da infecção pelo vírus da hepatite, até ao aparecimento da doença, espera-se que essa tendência continuará nos próximos cinquenta anos. 0 carcinoma hepatocelular cuja condição piorou tem um prognóstico mau. Assim, é desejável que se desenvolva rapidamente uma nova estratégia de tratamento.

Por outro lado, com o desenvolvimento da biologia molecular e da imunologia dos tumores nos últimos anos, tem 1 sido revelado que as células T citotóxicas (assassinas) e as células T auxiliares reconhecem péptidos formados pela decomposição de proteínas altamente expressas, especificamente nas células cancerosas, que estão presentes nas superfícies das células cancerosas ou nas células que apresentam antigénios por via das moléculas de HLA e que exibem uma reacção imunológica para destruir essas células cancerosas. Além disso, foi identificado um grande número de proteínas e péptidos antigénicos de tumor, que estimulam essa reacção imunitária para atacar os cancros e tem sido avançada a aplicação clínica de uma imunoterapia do tumor específica do antigénio.

As moléculas HLA da classe I são expressas na superfície de todas as células nucleares num organismo. Os péptidos derivados das proteínas citoplásmicas e nucleares decompostas estão ligados às moléculas HLA da classe I e que são expressas na superfície dessas células. Nas superfícies das células normais, os péptidos derivados de proteínas autólogas normais ligados a moléculas HLA da classe I e a células T do sistema imunológico não reconhecem nem respondem a esses péptidos ligados a moléculas HLA da classe I. Por outro lado, num processo no qual as células normais são convertidas num cancro, essas células cancerosas podem expressar grandes quantidades de proteínas, que dificilmente são expressas ou que são expressas apenas em pequenas quantidades nas células normais. Se um péptido gerado pela decomposição dessa proteína no citoplasma, que é altamente e especificamente expressa numa célula cancerosa, liga-se a uma molécula de HLA da classe I e é expressa na superfície dessas células cancerosas, uma célula T citotóxica reconhece o péptido e destrói apenas a célula de cancro. Além disso, por meio da administração desse antigénio ou péptido, específico do 2 cancro, a um organismo de um indivíduo, é possível destruir as células cancerosas e inibir o crescimento de um cancro, sem prejudicar as células normais. Isto é referido como imunoterapia do cancro utilizando um antigénio específico do cancro. Além disso, uma molécula de HLA da classe II é expressa principalmente na superfície de uma célula gue apresenta o antigénio. Essa molécula de HLA da classe II liga-se a um péptido derivado de um antigénio específico do cancro, gerado pela incorporação do antigénio específico de cancro de uma célula exógena e decompondo-o na célula e gue é expresso na superfície da célula. Uma célula T auxiliar, gue tenha reconhecido o péptido ligado pela molécula HLA da classe II, é activada para gerar várias citocinas gue activam outras células imunocompetentes, de modo a induzir ou a reforçar uma reacção imunitária contra um tumor.

Assim, se se puder desenvolver uma imunoterapia visando um antigénio que é altamente e especificamente expresso nesse cancro, ela pode tornar-se um processo de tratamento para eliminar eficazmente apenas o cancro, sem prejudicar os órgãos normais autólogos. Além disso, prevê-se que essa imunoterapia pode tornar-se um processo de tratamento aplicável a doentes que sofrem de um cancro num estádio terminal, para quem não se podem realizar outros tratamentos. Além disso, se se administra, a um ser humano com um elevado risco de desenvolver tal cancro, um antigénio específico do cancro e um péptido, sob a forma de uma vacina, existe a possibilidade de se poder evitar o aparecimento do cancro.

Tem sido relatado que, em tecidos normais, uma a-fetoproteína (AFP) é expressa apenas no período pré-natal e isso é o que se chama uma proteína carcinoembrionária cuja expressão é activada novamente em muitos carcinomas 3 hepatocelulares. Além disso, vários tipos de células T de murganho e de seres humanos reconhecem um epítopo de péptido derivado de AFP apresentado por uma molécula MHC da classe I. Durante o estádio de desenvolvimento, o feto é exposto à AFP existente num nivel elevado no plasma. No entanto, as células T maduras não adquirem tolerância imunológica completa à AFP e as células T especificas da AFP são detectadas no sangue periférico. Isto é, essa proteína carcinoembrionária pode ser um alvo da imunoterapia.

Existem vários processos para o tratamento do carcinoma hepatocelular. No entanto, o prognóstico desse carcinoma hepatocelular é pior do que o de outros tipos de cancros e, portanto, esse tipo de cancro é considerado um cancro intratável. Isto pode dever-se ao facto de o carcinoma hepatocelular se desenvolver com base na cirrose hepática e, portanto, os pacientes com carcinoma hepatocelular têm funções hepáticas ineficientes. Isto também se pode dever ao facto de, apesar de uma massa de cancro ter sido tratada, desenvolver-se outro cancro noutro sítio. De acordo com isto, é necessário desenvolver rapidamente uma nova estratégia de tratamento. Se se pode desenvolver uma imunoterapia visando um antigénio que é altamente e especificamente expresso no carcinoma hepatocelular, existe a possibilidade de que tal imunoterapia se torne um processo terapêutico para eliminar eficazmente apenas o cancro sem prejudicar os órgãos normais autólogos. Além disso, prevê-se que a imunoterapia mencionada antes possa ser um processo terapêutico, que está disponível para os doentes que estão em fase terminal de cancro e, ainda, para doentes cujas funções hepáticas são demasiado fracas para permitir que se realizem outros tratamentos. Actualmente, diz-se que, no Japão, mais de 4 2.000.000 de pessoas estão infectadas com o virus da hepatite C e que tais pessoas são potenciais doentes com carcinoma hepatocelular. Há uma possibilidade de a imunoterapia mencionada antes também poder ser aplicada para evitar que esses doentes infectados sofram de carcinoma hepatocelular. O melanoma é um tipo de cancro da pele, que é muitas vezes chamado de melanoma maligno. Existem muitos tipos de cancro de pele. Entre esses cancros da pele, o melanoma é classificado como tendo o mais alto grau de malignidade e, portanto, é muito temido. Entre as células que constituem a pele, várias células geram o pigmento de melanina. Essas células são chamadas melanócitos. Quando os melanócitos se tornam cancerosas, ocorre o melanoma.

No Japão, a incidência do melanoma varia de 1,5 a 2 pessoas em 100.000 na população geral. Assim, estima-se que cerca de 1.500 a 2.000 pessoas por ano desenvolvam melanoma. Por outro lado, nos países ocidentais, mais de uma dúzia de pessoas desenvolvem melanoma em cada 100.000 na população geral. Em particular, na Austrália, vinte ou mais pessoas desenvolvem esses melanomas em cada 100.000 pessoas na população em geral e, portanto, diz-se que a incidência do melanoma na Austrália é a maior do mundo. Nestas circunstâncias, as pessoas que vivem na Europa, nos Estados Unidos e na Austrália estão interessadas no melanoma e prestam atenção à ocorrência de melanomas. Além disso, a frequência de ocorrência de melanoma tem vindo a aumentar, especialmente entre os caucasianos, como resultado de um aumento da exposição aos raios ultravioleta devido a uma redução da camada de ozono na atmosfera causada pela destruição ambiental. Além disso, a ocorrência de melanoma tende a ser crescente ano após ano também no 5

Japão. De acordo com estudos recentes, o número anual de mortes resultantes de melanoma, no Japão, aumentou para aproximadamente 450. 0 melanoma desenvolve-se independentemente da idade. No entanto, a incidência desta doença aumenta para as pessoas com mais de 40 anos e a mais elevada verifica-se para os que têm 60 e 70 anos. O aparecimento desta doença na infância é extremamente raro, mas isso não significa que a doença nunca se desenvolva na infância. Recentemente, a ocorrência de melanoma tende a ser cada vez maior em pacientes jovens com 20 e 30 anos. 0 melanoma desenvolve-se independentemente do género e tanto os doentes masculinos como os femininos sofrem desta doença. No caso de doentes japoneses, o local em que o melanoma é mais propensos a desenvolver-se é a planta (planta do pé) e é responsável por 30 % de todos os casos de melanoma. Como caracteristicas dos pacientes japoneses, o melanoma também se desenvolve nos pés e partes das unhas dos dedos das mãos. Além disso, tal como no caso de doentes ocidentais, o melanoma desenvolve-se em todas as partes da pele, tais como corpo, mãos, pés, rosto e cabeça, tal como também entre os doentes japoneses.

Em primeiro lugar, os requerentes realizaram uma análise da expressão génica ao longo do genoma, incluindo a observação de 23.040 tipos de genes humanos, utilizando a análise de microarranjos do ADNc. Os requerentes analisaram perfis de expressão destes genes em 20 casos de carcinoma hepatocelular primário e em vários tipos de órgãos normais, incluindo os presentes no período pré-natal. Como resultado, os requerentes descobriram que o glipicano-3 (GPC3) é expresso no fígado, rim e pulmão durante o período pré-natal e também que esse glipicano-3 é altamente expressa em muitos carcinomas hepatocelulares, embora quase nunca seja expresso em órgãos normais de adultos, embora 6 seja expresso na placenta. Os requerentes também relataram que essa GPC3 é uma proteína secretora, que essa GPC3 pode ser detectada no soro de 40 % dos doentes com carcinoma hepatocelular pelo método ELISA e que isso é útil como um novo marcador tumoral do carcinoma hepatocelular (Nakatsura, T. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 306, 16-25 (2003) ) . Além disso, também relataram que a GPC3 é detectada no soro de doentes com melanoma e que também é útil como um marcador tumoral de melanoma (Nakatsura, T. et al., Clin. Câncer Res. 10: 6612-6621 (2004)).

Os requerentes já identificaram um péptido GPC3, que se liga a HLA-A24 e está presente numa célula T citotóxica humana e que é útil para uma imunoterapia que tem como alvo doentes com carcinoma hepatocelular ou melanoma, positivo para HLA-A24. Os requerentes têm realizado experiências em animais utilizando murganhos BALB/C que expressam moléculas Kd de murganhos, às quais se liga um péptido que tenha a mesma estrutura de um péptido de ligação a HLA-A24. Com isso, demonstraram a eficácia da imunoterapia utilizando o péptido mencionado antes e já relataram os resultados (pedido de patente internacional No. PCT/JP2004/016374; data de registo internacional: 28 de Outubro de 2004) . Em órgãos normais, dado que GPC3 só se expressa na placenta e no figado, no período pré-natal, mesmo quando se realiza uma imunoterapia dirigida a GPC3 para suprimir o crescimento do tumor, não ocorrem eventos adversos, tais como doenças auto-imunes. Isto foi confirmado por uma experiência usando murganhos.

Até à data, em relação ao glipicano-3 (GPC3) como um antigénio de rejeição do tumor, os requerentes identificaram um péptido, que é principalmente apresentado por HLA-A24 à célula T citotóxica (pedido de patente 7 PCT/JP03/10459, internacional No. PCT/JP03/10459, data do depósito internacional: 19 de Agosto de 2003). No entanto, apenas com esses péptidos apresentados por HLA-A24 para as células T citotóxicas, podem administrar-se vacinas de péptido a apenas 60 % dos japoneses que têm HLA-A24. Se um péptido apresentado a uma célula T citotóxica por HLA-A2, para a qual 40 % do povo japonês teve um teste positivo, pode ser identificado, aproximadamente 85 % do povo japonês pode tornar-se o alvo dos dois tipos de vacinas peptidicas. Além disso, dado que nos caucasianos, nos países ocidentais, a frequência de HLA-A2 é relativamente elevada, esse péptido apresentado por HLA-A2 pode ser aplicado a muitas pessoas ocidentais. De acordo com isto, constitui um importante objecto para identificar o péptido mencionado antes apresentado por HLA-A2 a uma célula T citotóxica. Em particular, uma vez que o melanoma é um cancro, que frequentemente se desenvolve em caucasianos nos países ocidentais e para os quais uma imunoterapia é eficaz e, mais uma vez, dado que o carcinoma hepatocelular também tem vindo a aumentar rapidamente nos países ocidentais, presume-se que haveria um grande número de pacientes a quem se podia aplicar uma imunoterapia utilizando o péptido GPC3 de ligação a HLA-A2. A patente WO 2004/038420 AI descreve a sequência completa do glipicano-3 humano (SEQ ID NO: 3). O documento WOOl/47944 A2 descreve um péptido FFQRLQPGLWVPE (Sequência ID NO: 8700; página 2451 do documento).

Descrição da invenção

Problemas a serem resolvidos pela invenção

Constitui um objecto da presente invenção identificar péptidos apresentados por HLA-A2 a uma célula T citotóxica, de modo a proporcionar um meio para a realização de imunoterapia, que é capaz de atingir cerca de 40 % dos doentes japoneses que sofrem de diversos tipos de cancro, que expressam GPC3 a um nível elevado.

Meios para resolver os problemas

Anteriormente, os requerentes já tinham identificado o glipicano-3 (GPC3) como uma nova proteína carcino-embrionária que é especificamente e excessivamente expressa no carcinoma hepatocelular humano, com base na análise de microarranjos (medição dos níveis de expressão de transcritos) de ADNc. Os requerentes ainda clarificaram que se detecta uma proteína GPC3 solúvel no soro de um doente com carcinoma hepatocelular e que essa GPC3 pode ser um novo marcador tumoral do carcinoma hepatocelular. Os requerentes constataram que GPC3 é expressa numa linha de células B16 de melanoma de murganho e é altamente expressa, a um nível elevado em doentes com melanoma, assim como no carcinoma hepatocelular. Assim, os requerentes pensaram que GPC3 também se pode tornar um marcador tumoral útil do melanoma. Como resultado de uma experiência de confirmação, verificaram que GPC3 actua como um marcador tumoral de melanoma permitindo um diagnóstico precoce, que nunca tinha sido realizado até agora. Agora, os requerentes têm estimulado células T citotóxicas humanas positivas para CD8 pela sua co-cultura in vitro, em conjunto com células dendríticas derivadas de monócitos humanos do sangue 9 periférico, com as quais foi pulsado um péptido GPC3 humano com um elemento de ligação a HLA-A2, induzindo assim as células T citotóxicas especificas do péptido GPC3. A presença ou a ausência da indução de células T citotóxicas específicas para cada péptido GPC3 foi detectada pelo método ELISPOT de detecção de interferões γ (IFN-γ) gerados pelas células T citotóxicas activadas que reconhecem péptidos apresentados por HLA-A2 e identificou-se um novo péptido GPC3 que poderia ser um candidato a um antigénio-alvo aplicável em imunoterapia.

Ou seja, a presente invenção tem por objecto as seguintes características da presente invenção. (1) Um péptido que consiste na sequência de aminoácidos como se mostra em qualquer uma das SEQ ID NOS: 1 até 3; (2) Uma composição induzida pelo sistema imunitário utilizada para o cancro, que compreende pelo menos um tipo do péptido anterior de (1). (3) Uma composição farmacêutica para ser utilizada no tratamento e/ou na prevenção de tumores, que compreende pelo menos um tipo do péptido anterior de (1). (4) Uma composição de um agente ou a indução de células portadoras do antigénio com uma elevada capacidade para induzir células T reactivas ao tumor, que compreende o péptido anterior de (1). (5) Uma composição de um agente para induzir células portadoras de antigénio com uma elevada capacidade para induzir células T reactivas a tumores para serem utilizadas no tratamento e/ou na prevenção de tumores que compreendem um gene que codifica um péptido de qualquer um dos seguintes (A) ou (B): 10 (A) um péptido que consiste na sequência de aminoácidos como se mostra em uma qualquer das SEQ ID NOS: 1 a 3; ou (B) um péptido, que consiste numa sequência de aminoácidos compreendendo uma substituição ou uma adição de um ou dois aminoácidos, em relação à sequência de aminoácidos que se mostra em qualquer uma das SEQ ID NOS: 1 a 3 e que tem capacidade de induzir as células T citotóxica. (6) Uma composição de um agente para induzir células T reactivas a tumores, que compreende o péptido anterior de (1) . (7) Um anticorpo contra o péptido anterior de (1). (8) Uma célula T auxiliar, uma célula T citotóxica ou uma população imunocitica compreendendo essas células, que é induzida utilizando o péptido anterior de (1). (9) Uma célula portadora do antiqénio, que apresenta um complexo que consiste numa molécula de HLA e no péptido anterior de (1). (10) Células portadoras do antigénio de (9) anterior, que são induzidas utilizando a composição do agente anterior de (4) ou (5). (11) Um processo in vitro para induzir células portadoras de antigénio com uma elevada capacidade para induzir células T reactivas a tumores, que compreendem um gene que codifica um péptido de qualquer um dos seguintes (A) ou (B): (A) um péptido que consiste na sequência de aminoácidos como se mostra em uma qualquer uma das SEQ ID NOS: 1 a 3; ou (B) um péptido, que consiste numa sequência de aminoácidos compreendendo uma substituição ou uma 11 adição de um ou dois aminoácidos, em relação à sequência de aminoácidos que se mostra em qualquer uma das SEQ ID NOS: 1 a 3 e que tem capacidade de induzir as células T citotóxicas.

Melhor prática para a realização da presente invenção (1) Péptido da presente invenção e composição do indutor imunológico que o contém, utilizada para cancros 0 péptido da presente invenção é um péptido que consiste na sequência de aminoácidos tal como se mostra em uma qualquer das SEQ ID NOS: 1 a 3. A expressão "péptido com capacidade para induzir células T citotóxicas" é usada na presente memória descritiva com o significado de um péptido com uma actividade de indução de células T que estimulam células T citotóxicas (linfócitos T citotóxicos/LTC). 0 processo para a obtenção/produção do péptido da presente invenção não está particularmente limitado. Pode-se utilizar ou uma proteína sintetizada quimicamente ou uma proteína recombinante produzida por recombinação genética.

Quando se obtém um péptido sintetizado quimicamente, o péptido da presente invenção pode ser sintetizado, por exemplo, por um processo de síntese química, tal como um processo de Fmoc (processo de fluorenilmetiloxicarbonilo) ou um processo de tBoc (processo de t-butiloxicarbonilo). Além disso, o péptido da presente invenção também pode ser sintetizado usando vários tipos de sintetizadores de péptidos disponíveis comercialmente. 12

Quando o péptido da presente invenção é produzido sob a forma de uma proteína recombinante, obtém-se ADN com uma sequência de nucleótidos que codifica o péptido mencionado antes, um seu mutante deste ou um seu homólogo e é então introduzido num sistema de expressão adequado, de modo a produzir o péptido da presente invenção.

Como vector de expressão, pode-se utilizar, de preferência, um vector capaz de se replicar, de forma autónoma, numa célula hospedeira ou capaz de ser incorporado no cromossoma de uma célula hospedeira. Utiliza-se um vector de expressão compreendendo um promotor numa posição capaz de expressar um gene que codifica o péptido. Além disso, pode-se produzir um transformante com um gene que codifica o péptido da presente invenção, por meio da introdução do vector de expressão mencionado antes num hospedeiro. Como hospedeiro, pode-se utilizar qualquer bactéria, fermento, célula de animal e célula de insecto. Pode-se introduzir um vector de expressão num hospedeiro, de acordo com um processo conhecido, consoante o tipo desse hospedeiro.

Na presente invenção, faz-se uma cultura do transformante, tal como produzido antes e gera-se então o péptido da presente invenção que é acumulado numa cultura. Depois, recolhe-se o péptido da presente invenção a partir da cultura, de modo a isolar um péptido recombinante.

Quando esse transformante é um procarioto, tal como Escherichia coli ou um eucarioto, tal como levedura, o meio utilizado para a cultura desses microrganismos pode ser um meio natural ou um meio sintético, desde que contenha uma fonte de carbono, uma fonte de azoto, sais inorgânicos e similares que possam ser assimilados pelos microrganismos 13 mencionados antes e é capaz de realizar eficientemente a cultura dos transformantes. Além disso, essa cultura poderá ser realizada em condições que são normalmente aplicadas para a cultura dos microrganismos mencionados antes. Após a conclusão da cultura, o péptido da presente invenção pode ser isolado e purificado a partir da cultura dos transformantes, de acordo com um processo comum de isolamento e de purificação de péptidos.

Um péptido consiste numa sequência de aminoácidos compreendendo uma substituição ou uma adição de um ou dois aminoácidos, em relação à sequência de aminoácidos que se mostra em qualquer uma das SEQ ID NOS: 1 a 3 que podem ser adequadamente produzidas ou adquiridas por especialistas na matéria, com base em informações respeitantes à sequência de nucleótidos do ADN que codifica a sequência de aminoácidos que se mostra em qualquer uma das SEQ ID NOS: 1 a 3. Isto é, um gene que codifica um péptido que consiste numa sequência de aminoácidos compreendendo uma substituição ou uma adição de um ou dois aminoácidos em relação à sequência de aminoácidos que se mostra em qualquer uma das SEQ ID NOS: 1 a 3 e tem a capacidade para induzir as células T citotóxicas, podem ser produzido por qualquer processo conhecido dos especialistas na matéria, tal como síntese química, por meio de engenharia genética ou mutagénese. Por exemplo, a mutagénese dirigida ao sitio, como um meio de engenharia genética, é útil porque é um meio para a introdução de uma mutação específica numa posição específica. Essa mutagénese dirigida ao sítio pode ser realizada por um processo descrito em Molecular Cloning: A laboratory Manual, 2a ed, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1989 (a seguir abreviado como Molecular Cloning, 2a ed.), Current Protocols in Molecular Biology, suplementos 1 a 38, John 14

Wiley & Sons (1987-1997) (a seguir abreviado como Current Protocols in Molecular Biology), etc.

Tal como descrito a seguir nos exemplos, o péptido da presente invenção mencionado antes é capaz de induzir imunidade contra cancros. Assim, a presente invenção tem por objecto um indutor imunológico utilizado para cancros, que compreende o péptido da presente invenção. 0 indutor imunológico da presente invenção utilizado para os cancros é utilizado in vitro ou in vivo e, de preferência in vitro, de modo que possa induzir uma célula T auxiliar, uma célula T citotóxica ou uma população imunocitica compreendendo essas células, conferindo assim imunidade contra o cancro. (2) Anticorpo da presente invenção A presente invenção também tem por objecto um anticorpo que reconhece uma parte ou a totalidade do péptido da presente invenção mencionado antes como um epitopo (antigénio) e uma célula T citotóxica induzida por estimulação in vitro utilizando a proteína ou péptido mencionados antes. Em geral, essa célula T citotóxica exibe uma actividade antitumoral que é mais forte do que a de um anticorpo. 0 anticorpo da presente invenção pode ser um anticorpo policlonal ou um anticorpo monoclonal. Esse anticorpo pode ser produzido por um processo comum.

Por exemplo, pode-se produzir um anticorpo policlonal através da imunização de um mamífero ou de macacos com o péptido da presente invenção utilizado como antigénio, 15 depois recolhe-se sangue do mamífero ou dos macacos e depois separa-se e purifica-se um anticorpo a partir do sangue recolhido. Por exemplo, podem vacinar-se mamíferos ou macacos, tais como um murganhos, hamsters, cobaias, frangos, ratos, coelhos, cães, cabras, ovelhas ou gado bovino. Esse processo de imunização é conhecido dos especialistas nesta técnica. Por exemplo, pode-se administrar um antigénio 2 ou 3 vezes, a intervalos de 7 a 30 dias. Como dosagem, pode-se administrar, uma vez, por exemplo, aproximadamente 0,05 a 2 mg de antigénio. A via de administração não está particularmente limitada e pode-se seleccionar a administração subcutânea, administração intracutânea, administração intraperitoneal, administração intravenosa, administração intramuscular, etc., conforme o caso. Além disso, pode-se dissolver um antigénio num tampão adequado, por exemplo, um tampão adequado que contém um adjuvante completo de Freund ou pode-se utilizar um adjuvante normalmente utilizado, tal como óxido de alumínio.

Os mamíferos ou os macacos assim imunizados são criados durante um determinado período de tempo. Depois disso, se os títulos de anticorpos aumentarem, pode-se dar uma dose de reforço utilizando, por exemplo, 100 a 1.000 pg de antigénio. Um ou dois meses após a imunização final, colhe-se o sangue do mamífero ou dos macacos imunizados. O sangue assim colhido é então separado e purificado através de um processo comum, incluindo centrifugação, precipitação usando sulfato de amónio ou polietileno-glicol, cromatografia tal como cromatografia por filtração em gel, cromatografia de permuta iónica ou cromatografia de afinidade, etc., de modo a obter-se um anticorpo policlonal que reconheça o péptido da presente invenção sob a forma de um anti-soro policlonal. 16

Por outro lado, pode-se obter um anticorpo monoclonal através da preparação de um hibridoma. Por exemplo, esse hibridoma pode ser obtido pela fusão de células de uma célula que gera o anticorpo e uma célula de mieloma. 0 hibridoma que gera o anticorpo monoclonal da presente invenção pode ser obtido através do seguinte processo de fusão de células.

Como célula que gera anticorpos, pode-se utilizar uma célula de baço, uma célula de nódulo linfático, um linfócito B ou similar, provenientes do animal imunizado. Como antigénio, utiliza-se o péptido da presente invenção. Como animal a ser imunizado, pode-se utilizar um murganho, um rato ou similar. Administra-se um antigénio ao animal, de acordo com um processo comum. Por exemplo, administra-se a um animal, como antigénio, uma suspensão ou um liquido emulsionado que compreende um adjuvante, tal como um adjuvante completo de Freund ou um adjuvante incompleto de Freund e o péptido da presente invenção, através de administração intravenosa, administração subcutânea, administração intradérmica, administração intraperitoneal, etc., várias vezes, de modo a imunizar o animal. Depois disso, obtém-se uma célula que gera anticorpos, tal como uma célula esplénica, a partir do animal imunizado e a célula esplénica assim obtida funde-se então com uma célula de mieloma, de acordo com um processo conhecido (G Kohler et al., Nature, 256 495 (1975)), produzindo assim um hibridoma.

Exemplos de estirpes de linhas de células de mieloma utilizadas na fusão de células incluem uma estirpe P3X63Ag8, uma estirpe P3U1 e uma estirpe Sp2/0, no caso de um murganho. Quando se realiza a fusão celular, utiliza-se um promotor de fusão tal como polietileno-glicol ou o vírus 17 de Sendai. Para a selecção de um hibridoma, após a conclusão da fusão celular, utiliza-se o meio de hipoxantina e aminopterina-timidina (HAT), de acordo com um processo comum. 0 hibridoma obtido como resultado da fusão celular é clonado por um processo de diluição limitativo. Além disso, se necessária, faz-se um rastreio por meio de um ensaio imunoenzimático utilizando o péptido da presente invenção, de modo a obter uma estirpe celular que gera um anticorpo monoclonal que reconhece especificamente o péptido da presente invenção.

Para produzir um anticorpo monoclonal de interesse, a partir do hibridoma assim obtido, pode-se fazer uma cultura do hibridoma por um processo comum de cultura de células ou um processo de formação de ascites e o anticorpo monoclonal de interesse pode então ser purificado a partir do sobrenadante da cultura ou das ascites. 0 anticorpo monoclonal pode ser purificado a partir do sobrenadante da cultura ou das ascites, de acordo com um processo comum. Por exemplo, pode-se combinar, conforme for o caso e utilizar o fraccionamento com sulfato de amónio, filtração em gel, cromatografia de permuta iónica, cromatografia de afinidade e outros processos.

Além disso, os fragmentos do anticorpo mencionado antes também estão incluídos no âmbito da presente invenção. Exemplos desses fragmentos de um anticorpo incluem um fragmento F(ab')2 e um fragmento Fab'. (3) Células T auxiliares, células T citotóxicas ou uma população imunocítica que compreende essas células A presente invenção também tem por objecto uma célula T auxiliar, uma célula T citotóxica ou uma população 18 imunocítica compreendendo essas células, que é induzida pela estimulação in vítro utilizando o péptido da presente invenção. Por exemplo, quando os linfócitos do sangue periférico ou os linfócitos que se infiltram no tumor são estimulados in vitro, utilizando o péptido da presente invenção, são induzidas células T activadas reactivas ao tumor. As células T assim activadas, portanto, podem ser efectivamente utilizadas para uma imunoterapia adoptiva. Além disso, deixa-se que as células dendriticas, que são células que comportam fortemente antigénios, expressem o péptido da presente invenção in vivo ou in vitro e as células dendriticas que expressam os antigénios são então utilizadas para realizar a indução imunitária.

De preferência, uma célula T auxiliar, uma célula T citotóxica ou uma população imunocítica compreendendo essas células podem ser induzidas pela estimulação in vitro utilizando o péptido da presente invenção e um imuno-estimulante. Exemplos desses imunoestimulantes utilizados aqui incluem um factor de crescimento celular e uma citocina.

As células T auxiliares, as, células T citotóxicas ou a população imunocítica que compreendendo essas células, assim obtidas, são transferidas para um organismo, de modo que o tumor possa ser suprimido e que o cancro possa ser prevenido e/ou tratado.

Além disso, usando o péptido da presente invenção, pode-se produzir uma célula T auxiliar, uma célula T citotóxica ou uma população imunocítica compreendendo essas células, que é capaz de suprimir o tumor, como descrito antes. De acordo com isto, a presente invenção tem por objecto uma solução de cultura de células que contém o 19 péptido da presente invenção. Usando essa solução de cultura de células, pode-se produzir uma célula T auxiliar, uma célula T citotóxica ou uma população imunocitica compreendendo essas células, que são capazes de suprimir tumores. Além disso, a presente invenção também tem por objecto um kit de cultura de células para a produção de células T auxiliares, células T citotóxicas ou uma população imunocitica compreendendo essas células, que compreende a solução de cultura de células referida antes e um dispositivo de cultura de células. (4) Produto farmacêutico da presente invenção para o tratamento e/ou a prevenção de tumores (vacina contra o cancro)

Uma vez que o péptido da presente invenção é capaz de induzir células T citotóxicas especificas de células de cancro, pode-se esperar que seja um agente para o tratamento e/ou a prevenção do cancro. Por exemplo, bactérias como a BCG (bacilo de Calmette-Guérin) transformadas com ADN recombinante, produzidas pela incorporação de um gene, que codifica o péptido da presente invenção, num vector apropriado ou num virus como o vírus vaccinia, no genoma cujo ADN, que codifica o péptido da presente invenção, tinha sido incorporado, pode ser efectivamente usado como uma vacina para o tratamento e/ou a prevenção de cancros humanos. É de notar que a dosagem e o processo de administração dessa vacina contra o cancro são os mesmos no caso de uma vacinação contra a varíola comum ou a vacinação da BCG.

Ou seja, o ADN que codifica o péptido da presente invenção (que é usado tal qual ou sob a forma de ADN de plasmido incorporado num vector de expressão) ou um vírus 20 recombinante ou bactérias recombinantes compreendendo o ADN mencionado antes, pode ser administrado como uma vacina contra o cancro de mamíferos, incluindo seres humanos, directamente ou num estado em que está dispersa num adjuvante. Da mesma forma, o péptido da presente invenção também pode ser administrado como uma vacina contra o cancro, num estado em que está dispersa num adjuvante.

Exemplos de adjuvantes utilizados na presente invenção incluem um adjuvante incompleto de Freund, BCG, dimicolato de trealose (DMT), lipopolissacárido (LPS), um adjuvante de alúmen e um adjuvante de sílica. Do ponto de vista da capacidade para induzir anticorpos, utiliza-se preferencialmente um adjuvante incompleto de Freund (AIF). 0 tipo de cancro não é uma particularidade na presente memória descritiva. Exemplos específicos de cancros incluem cancro do esófago, cancro da mama, cancro da tiróide, cancro do cólon, cancro pancreático, melanoma maligno (melanoma), linfoma maligno, osteossarcoma, feocromocitoma, cancro de cabeça e do pescoço, cancro do útero, cancro dos ovários, tumor cerebral, leucemia mielogénica crónica, leucemia mielogénica aguda, cancro renal, cancro da próstata, cancro do pulmão, cancro de estômago, cancro hepático, cancro de vesícula biliar, cancro dos testículos, cancro da tiróide, cancro de bexiga e sarcoma. 0 péptido da presente invenção funciona como um epítopo de células T e induz as células T citotóxicas específicas de um cancro. Assim, o péptido da presente invenção é útil como um agente para a prevenção e/ou o tratamento de cancros humanos. Além disso, se o anticorpo da presente invenção for capaz de inibir a actividade de GPC3 como um antigénio do cancro, é também útil como agente 21 para a prevenção e/ou o tratamento de cancros humanos. Como utilização actual, o péptido ou o anticorpo da presente invenção pode ser administrado como um produto para injecção, directamente ou em conjunto com um veículo e/ou um diluente aceitável sob o ponto de vista farmacêutico e, se necessário, também, juntamente com as substâncias auxiliares mencionadas a seguir. Além disso, o péptido ou o anticorpo da presente invenção também pode ser administrado por um processo tal como pulverização, por meio de absorção transdérmica através da mucosa. 0 termo "veículo" é usado aqui para significar, por exemplo, albumina de soro humano. Além disso, como diluente, pode-se utilizar SBF, água destilada ou similar.

Como dose, o péptido ou o anticorpo da presente invenção podem ser administrados dentro de um intervalo entre 0,01 e 100 mg por adulto e por administração. No entanto, a dose não está limitada ao intervalo mencionado antes. A forma farmacêutica não está particularmente limitada. Um produto liofilizado ou um grânulo produzido pela adição de um excipiente tal como o açúcar, também podem estar disponíveis.

Exemplos de substâncias auxiliares, que podem ser adicionados ao agente da presente invenção para melhorar a actividade que induz as células T reactivas ao tumor, incluem: muramil-dipéptido (MDP); componentes bacterianos tais como a bactéria da BCG; ISCOM descrito em Nature, vol. 344, p. 873 (1990); saponina QS-21 descrita em J. Immunol. vol. 148, p. 1438 (1992); lipossoma; e óxido de alumínio. Além disso, também podem ser utilizados, como substâncias auxiliares, imunoestimulantes como lentinano, esquizofilano ou picibanilo. Outros exemplos de produtos aqui utilizados como substâncias auxiliares incluem: citocinas para 22 aumentar o crescimento ou a diferenciação de células T, tais como IL-2, IL-4, IL-12, IL-1, IL-6 ou FNT; uma galactosilceramida para activar as células NKT; CpG que se liga a um receptor como Toll para activar um sistema imunitário inato; e lipopolissacárido (LPS).

Além disso, adiciona-se o péptido do antigénio mencionado antes, in vitro, às células recolhidas de um doente ou as células (alogénicas) de qualquer outra pessoa que compartilha vários alelos de HLA, seguida da apresentação do antigénio das células. Posteriormente, as células são administradas ao vaso sanguíneo do doente, para que as células T citotóxicas possam ser eficazmente induzidas no organismo do doente. Além disso, adiciona-se o péptido da presente invenção aos linfócitos do sangue periférico de um paciente e a mistura obtida é então posta em cultura in vitro. Assim, as células T citotóxicas podem ser induzida in vitro e podem, em seguida, voltar para o vaso sanguíneo do paciente. Essa terapêutica envolvendo a transferência de células já foi realizada como um processo para o tratamento de cancros e, portanto, é um processo bem conhecido dos especialistas na matéria.

Com a introdução do péptido da presente invenção num organismo, as células T citotóxicas são induzidas e activadas e, como resultado, pode-se antecipar um efeito antitumoral. Além disso, quando os linfócitos são estimulados pelo péptido da presente invenção, in vitro, são induzidas células T activadas. As células T activadas são injectadas numa área afectada. Assim, esta técnica pode ser efectivamente utilizada para uma imunoterapia adoptiva. A presente invenção será melhor descrita nos exemplos que se seguem. 23

Exemplos [Exemplo 1] (1) Selecção do péptido GPC3 exibindo capacidade de ligação a HLA-A2 A sequência de aminoácidos de GPC3 humana foi pesquisada através um sistema BIMAS e seleccionaram-se 4 tipos de sequências com uma afinidade de ligação estimada a HLA-A2 de 20 ou mais. Quadro 1

Pontuação da afinidade de ligação 879 828 162 1055

Posição do péptido Sequência de aminoácidos do péptido

GPC3 44- 52 RLQPGLKWV GPC3 144-152 FVGEFFTDV GPC3 155-163 YILGSDINV GPC3 169-177 ELFDSLFPV

[Exemplo 2]

Indução de células T citotóxicas humanas pelo péptido GPC3 de ligação a HLA-A2 (1) Colheita de sangue

Obteve-se o consentimento informado de doentes com carcinoma hepatocelular positivo para HLA-A2, que estavam em tratamento na Gastroenterological Surgery, Kumamoto University School of Medicine e no Hospital East, no National Câncer Center. Depois, obteve-se 30 ml da amostra de sangue de doentes individuais e isolaram-se as células mononucleares de sangue periférico utilizando o processo de centrifugação de gradiente de densidade de Ficoll-Conray, de acordo com um processo relatado anteriormente (Nakatsura, T et al., Eur. J. Immunol. 32, 826-836 (2002)). 24 (2) Separação de células positivas CD8 e células positivas CD14 a partir de células mononucleares do sangue periférico e indução de células T citotóxicas

Das células mononucleares do sangue periférico isoladas foram induzidas células T citotóxicas pelo processo relatado anteriormente (Monji, M et al., Clin Câncer Res 10, 6047-6057, 2004). Primeiro, separaram-se células positivas CD-8 e células positivas CD14 das células mononucleares do sangue periférico utilizando MACS. As células positivas CD 14 foram postas em cultura na presença de GM-CSF (100 ng/ml) e IL-4 (20 ng/ml) durante 5 dias, de modo a induzir a diferenciação das células dendriticas. Depois, adicionou-se FNT-a (20 ng/ml) para a maturação. No 7o dia, adicionou-se cada péptido GPC3 (10 μΜ) e realizou-se então a co-cultura com células CD8 positivas. Esta estimulação de antigénio com células dendriticas autólogas derivadas de células positivas CD14 repetiu-se 3 ou 4 vezes por semana, de modo a induzir essas células T citotóxicas especificas do péptido. Durante a indução, mudou-se metade do meio com meio fresco, uma vez de dois em dois dias e adicionou-se IL-2 numa concentração de 10 U/ml.

(3) Análise da actividade das células T citotóxicas especificas de GPC3 pelo processo de ELISPOT A presença ou ausência de uma célula T citotóxica que, de forma confiável e especificamente, reage com GPC3 e produz IFN-γ nas células T citotóxicas assim induzidas foi analisada pelo processo de ELISPOT. Detectou-se ΒΡΝ-γ utilizando o conjunto (BD) de ELISPOT de IFN-γ humano de ELISPOT. Quando uma célula T citotóxica (efectora) reage 25 com uma célula de estimulador (alvo) para gerar IFN-γ, cada IFN-γ é detectado como uma mancha vermelha. Como células-alvo utilizaram-se células SK-Hep-1 como células parentais, que são positivas para HLA-A2 e não expressam GPC3 e células SK-Hep-l/GPC3, em que o gene GPC3 tenha sido introduzido nas células SK-Hep-1 para expressar a proteína de GPC3. Em primeiro lugar, revestiu-se uma placa de ELISPOT (BD Bioscience) com um anticorpo anti-humano de IFN-γ dueante 18 horas. Depois, foi bloqueado com FCS/RPMI a 10 % durnate 2 horas. As células efectoras (100 μΐ/poço) foram misturadas com as células-alvo (100 μΐ/poço) e a mistura foi então posta em cultura, a 37 °C, durante 22 horas. Realizou-se uma experiência com uma relação entre células efectoras e células-alvo (proporção de E/A) de 5:1. Posteriormente, a placa foi lavada com água esterilizada e depois deixou-se reagir com um anticorpo de IFN-γ anti-humano biotinilado, durante 2 horas e depois com estreptavidina-PRS (peroxidase de rábano silvestre) durante 1 hora. Depois, detectaram-se manchas positivas de IFN-γ com uma solução de substrato. O número dessas manchas foi contado usando o programa informático de análise automática MINERVA.TECH. Como resultado, a actividade das células T citotóxicas específicas de GPC3 pode ser detectada no caso de células T citotóxicas induzidas pelos péptidos 44-52, 114-152 e 155-163 de GPC3. No entanto, não se detectou actividade das células T citotóxicas específicas de GPC3 no caso de células T citotóxicas induzida por um péptido 169-177 de GPC3 (figuras 1 e 2) . Os resultados analíticos das células T citotóxicas induzidas por um péptido 155-163 representativo de GPC3 estão ilustrados na figura 1. (3) Análise da actividade citotóxica de células T citotóxicas pelo teste da citotoxicidade 26 A actividade citotóxica das células T citotóxicas induzidas foi analisada por um teste de citotoxicidade utilizando, como células estimuladas, células SK-Hep-1, como células parentais, que são positivas para HLA-A2 e não expressam GPC3 e células SK-Hep-l/GPC3, em que o gene GPC3 foi introduzido nas células SK-Hep-1 para expressar a proteína GPC3. A actividade citotóxica das células T citotóxicas foi avaliada por um ensaio de citotoxicidade utilizando Terascan VP. Primeiro, as células-alvo foram marcadas por fluorescência com uma solução de coloração de calceína AM, a 37 °C, durante 30 minutos. Essas células foram co-cultivadas com células T citotóxicas, numa placa Coster com uma semi-área de 96 poços e detectaram-se as células marcads por fluorescência, ao longo do tempo, medindo-se assim o grau de citotoxicidade. A análise foi realizada utilizando o programa de computador de análise da citotoxicidade CalCt-961 da MINERVA TECH, que foi utilizado num processo de fluorescência. Realizou-se uma experiência numa proporção de E/A de 20:1. Como resultado, a actividade citotóxica específica de GPC3 foi confirmada nas células T citotóxicas, induzida pelos péptidos 44-52, 144-152 e 155-163 de GPC3. No entanto, a actividade citotóxica especifica de GPC3, não foi observada nas células T citotóxicas induzidas por um péptido 169-177 de GPC3 (figura 2).

Aplicabilidade industrial A eficácia de uma imunoterapêutica do cancro que atinge um péptido de GPC3 apresentado por HLA-A24 foi confirmada por uma experiência em animais usando ratos. No entanto, utilizando esses péptidos introduzidos por HLA-A24 nas células T citotóxicas, podem administrar-se vacinas de péptido apenas a 60 % da população japonesa. Desta vez, através da identificação de um péptido introduzido numa 27 célula T citotóxica por HLA-A2, aproximadamente 85 % do povo japonês pode tornar-se o alvo da combinação de dois tipos de vacinas peptídicas. Se a eficácia da terapêutica experimental, utilizando um péptido introduzido por HLA-A2 numa célula T citotóxica for demonstrada, é altamente provável que esse péptido seja aplicado clinicamente também a caucasianos nos países ocidentais. Além disso, através da identificação desses péptidos introduzidos por HLA-A2 numa célula T citotóxica, o péptido identificados não só pode ser aplicado a 40 % dos doentes japoneses que sofrem de carcinoma hepatocelular e melanoma, mas também pode ser aplicado a muitos caucasianos em que a frequência de HLA-A2 é maior do que nos japoneses.

Breve descrição dos desenhos A figura 1 mostra os resultados representativos obtidos pela análise de ELISPOT, o IFN-γ produzido por células T citotóxicas, que tenham reconhecido especificamente os péptidos GPC3 e que tenham sido activadas. No que respeita às células T citotóxicas induzidas pela estimulação de células CD8 positivas no sangue periférico de um doente com carcinoma hepatocelular, por células dendríticas derivadas de monócitos CD 14 positivos carregadas com um péptido 155-163 de GPC3, o número de manchas e a área total dessas manchas num caso em que as células eram SK-Hep-l/GPC3, em que o gene GPC3 foi introduzido nas células SK-Hep-1 para expressar a proteína de GPC3, foram usadas como células estimuladoras (no lado direito da figura ) foram significactivamente maiores do que no caso de células SK-Hep-1, como células parentais, que foram postivas para HLA-A2 e não expressaram GPC3 , foram usadas como

células estimuladoras (no lado esquerdo da figura). A 28 partir desses resultados, determinou-se que o péptido de 155-163 de GPC3 é um péptido de epitopo capaz de induzir as células T citotóxicas especificas de GPC3. A figura 2 mostra os resultados da análise de ELISPOT e um teste de citotoxicidade. As células T positivas CD8 foram seleccionadas a partir do sangue periférico de um doente com carcinoma hepatocelular positivo para HLA-A2 e as células seleccionadas foram então estimuladas por células dendríticas derivadas de monócitos carregados com cada um dos péptidos de GPC3. Através de um ensaio por ELISPOT examinou-se se as células T citotóxicas assim obtidas reagiam ou não especificamente com células que expressam GPC3 e produzam IFN-γ. Além disso examinou-se se as células T citotóxicas mencionadas antes mataram especificamente as células que expressam GPC3, por meio de um ensaio de citotoxicidade. Como células-alvo, utilizaram-se células SK-Hep-1 como células parentais, que são positivas para HLA-A2 e não expressam GPC3 e células SK-Hep-l/GPC3, nas quais o gene GPC3 tinha sido introduzido em células SK-Hep-1 para expressar a proteína GPC3. Como resultado, as células T citotóxicas induzidas pelos péptidos 44-52, 144-152 e 155-163 de GPC3 reconheceram especificamente as células SK-Hep-l/GPC3 e produziram IFN-γ e também exibiram uma forte actividade citotóxica. Pelo contrário, as células T citotóxicas induzidas por um péptido 169-177 de GPC3 não exibiram actividade das células T citotóxicas específica de GPC3. A partir desses resultados, foi demonstrado que os péptidos 44-52, 144-152 e 155-163 de GPC3 são péptidos de epítopos capazes de induzir células T citotóxicas específicas de GPC3.

LISTA DE SEQUÊNCIAS <110> Kumamoto University 29

<120> Péptido de antigénio de rejeição de cancro, derivado de glipicano-3 (GPC3) para indivíduos positivos para HLA-A2 e um medicamento que o contém <130> A61163A <1 60> 3 <210> 1 <211> 9 <212> PRT <213> <22 0> Sequência artificial <223> Descrição da sequência artificial: péptido sintético <4 0 0> 1

Arg Leu Gin Pro Gly Leu Lys Trp Vai 1 S <210> 2 <211> 9 <212> PRT <213> <22 0> Sequência artificial <223> Descrição da sequência artificial: péptido sintético <400> 2

Phe Vai Gly Glu Phe Phe Thr Asp Vai l 5 <210> 3 <211> 9 <212> PRT <213> <22 0> Sequência artificial 30 <223> Descrição da sequência artificial: péptido sintético <400> 3

Tyr Xle Leu Gly Ser Asp He Asn Vai

1 S

Lisboa, 9 de Novembro de 2011. 31

Claims (11)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Péptido caracterizado pelo facto de consistir na sequência de aminoácidos que se mostra em qualquer uma das SEQ ID NOS: 1 a 3.
2. 2. Composição de um indutor imunológico utilizado para cancros, caracterizada pelo facto de compreender pelo menos um tipo de péptido de acordo com a reivindicação 1.
3. 3. Composição farmacêutica caracterizada pelo facto de se utilizar no tratamento e/ou na prevenção de tumores, que compreende pelo menos um tipo dos péptidos de acordo com a reivindicação 1.
4. 4. Composição de um agente para a indução de células que comportam antigénios, caracterizada pelo facto de ter uma capacidade elevada para induzir células T reactivas ao tumor, que compreendem o péptido de acordo com a reivindicação 1.
5. 5. Composição de um agente para a indução de células que comportam antigénios, caracterizada pelo facto de ter uma capacidade elevada para induzir células T reactivas para serem utilizadas no tratamento e/ou na prevenção de tumores, que compreende um gene que codifica um péptido de acordo com o seguinte (A) ou (B): (A) um péptido que consiste na sequência de aminoácidos que se mostra em uma qualquer uma das SEQ ID NOS: 1 a 3; ou (B) um péptido, que consiste numa sequência de aminoácidos compreendendo uma substituição ou uma 1 adição de um ou dois aminoácidos em relação à sequência de aminoácidos que se mostra em qualquer uma das SEQ ID NOS: 1 a 3 e que tem capacidade de induzir as células T citotóxica.
6. 6. Composição de um agente para a indução de células T reactivas ao tumor, caracterizada pelo facto de compreender o péptido de acordo com a reivindicação 1.
7. 7. Anticorpo caracterizado pelo facto de ser contra o péptido de acordo com a reivindicação 1.
8. 8. Célula T auxiliar, célula T citotóxica ou uma população imunocitica compreendendo essas células, caracterizadas pelo facto de serem induzidas utilizando o péptido de acordo com a reivindicação 1.
9. 9. Célula que comporta um antigénio, caracterizada pelo facto de comportar um complexo que consiste numa molécula de HLA e o péptido de acordo com a reivindicação 1.
10. 10. Célula que comporta um antigénio, de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo facto de ser induzida utilizando a composição do agente de acordo com as reivindicações 4 ou 5.
11. 11. Processo in vítro para induzir células que comportam o antigénio, caracterizado pelo facto de essas células terem uma elevada capacidade para induzir células T reactivas ao tumor que compreende um gene que codifica que codifica um péptido de qualquer um de (A) ou (B): 2 (A) um péptido que consiste na sequência de aminoácidos que se mostra em uma qualquer uma das SEQ ID NOS: 1 a 3; ou (B) um péptido, que consiste numa sequência de aminoácidos compreendendo uma substituição ou uma adição de um ou dois aminoácidos em relação à sequência de aminoácidos que se mostra em qualquer uma das SEQ ID NOS: 1 a 3 e que tem capacidade de induzir as células T citotóxicas. Lisboa, 9 de Novembro de 2011. 3