WO2004038420A1 - Gpc3の検出による癌の診断方法 - Google Patents

Gpc3の検出による癌の診断方法 Download PDF

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WO2004038420A1
WO2004038420A1 PCT/JP2003/011320 JP0311320W WO2004038420A1 WO 2004038420 A1 WO2004038420 A1 WO 2004038420A1 JP 0311320 W JP0311320 W JP 0311320W WO 2004038420 A1 WO2004038420 A1 WO 2004038420A1
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cancer
antibodies
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Hiroyuki Aburatani
Yutaka Midorikawa
Kiyotaka Nakano
Iwao Ohizumi
Yukio Ito
Susumu Tokita
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Perseus Proteomics Inc.
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    • Y02A90/10—Information and communication technologies [ICT] supporting adaptation to climate change, e.g. for weather forecasting or climate simulation

Definitions

  • the present invention relates to a blood soluble cancer marker. Specifically, the present invention relates to a method for detecting soluble glypican 3 (GPC3) in a test sample and diagnosing cancer.
  • GPC3 soluble glypican 3
  • the glypican family has been reported as a new family of heparan sulfate proteodaricans on the cell surface. To date, five glypicans have been reported to exist as members of the glypican family (daribican 1, glypican 2, dalibican 3, dalipican 4 and dalipican 5). Members of this family have a uniform size (approximately 60 kDa) of core protein, share a specific, well-retained sequence of cysteines, and are anchored by glycosylphosphatidylinositol (GPI) anchors. It is bound to the cell membrane.
  • GPI glycosylphosphatidylinositol
  • Glypican 3 (GPC3) is known to be closely involved in the control of cell division and its pattern in development. It is also known that the GPC3 gene is highly expressed in hepatocellular carcinoma cells, and that the GPC3 gene may be used as a hepatocellular carcinoma marker.
  • the anti-GPC3 antibody has ADCC activity and CDC activity and is useful for the treatment of liver cancer, and filed a patent application (Japanese Patent Application No. 2001-189443).
  • GPC3 is a membrane-bound protein and the existence of a secreted PGC3 protein has not been reported, and the use of GPC3 protein itself as a cancer marker in blood has not been studied. Disclosure of the invention
  • GPC3 glypican 3
  • soluble GPC3 was secreted into the blood of liver cancer patients, established a GPC3 sandwich ELISA system, and developed a human liver cancer cell HepG2 with high GPC3 expression. The presence of secreted GPC3 was clarified in the culture supernatant.
  • soluble GPC3 tends to be difficult to detect with an anti-GPC3 antibody that recognizes the C-terminal fragment side, so that secreted GPC3 was presumed to be dominant in the N-terminal fragment. Therefore, it was considered preferable to use an anti-GPC3 antibody that recognizes the N-terminus, and further intensive studies were made, thereby completing the present invention.
  • GPC3 has been confirmed to be expressed not only in liver cancer cell lines, but also in cancer cell lines such as lung cancer, colon cancer, breast cancer, prostate cancer, knee cancer, and lymphoma.Therefore, GPC3 may be applicable to diagnosis other than liver cancer. .
  • the present invention is as follows.
  • a peptide fragment in which the N-terminal peptide of GPC3 is contained in the amino acid sequence consisting of the first amino acid to the 374th amino acid or the amino acid sequence consisting of the first amino acid to the 358th amino acid of GPC3 (2) a method for diagnosing cancer,
  • test sample is blood, serum, or plasma
  • a diagnostic agent for cancer containing an anti-GPC3 antibody (10) The diagnostic agent according to (9), comprising an anti-GPC3 antibody immobilized on a support and an antibody labeled with a labeling substance.
  • the diagnostic kit according to (13), comprising an anti-GPC3 antibody immobilized on a support, and an antibody labeled with a labeling substance.
  • the present invention is a method for detecting cancer by detecting solubilized dalipican in a test sample.
  • Detection includes quantitative or non-quantitative detection.
  • non-quantitative detection simply measures whether or not GPC3 protein is present, and whether or not GPC3 protein is present in a certain amount or more. Measurement, comparing the amount of GPC3 protein with another sample (for example, a control sample). Examples of quantitative detection include measuring the concentration of GPC3 protein and measuring the amount of GPC3 protein. Measurement.
  • test sample is not particularly limited as long as it is a sample that may contain the GPC3 protein, but is preferably a sample collected from the body of an organism such as a mammal, and more preferably a sample collected from a human.
  • test samples include, for example, blood, interstitial fluid, plasma, extravascular fluid, cerebrospinal fluid, synovial fluid, pleural fluid, serum, lymph, saliva, urine, etc. Preferred are blood, serum and plasma. Samples obtained from the test sample, such as a culture of cells collected from the body of an organism, are also included in the test sample of the present invention.
  • the cancer to be diagnosed is not particularly limited, and specific examples thereof include liver cancer, knee cancer, lung cancer, colon cancer, breast cancer, prostate cancer, leukemia, lymphoma, and the like. Preferred is liver cancer.
  • the anti-GPC3 antibody used in the present invention may specifically bind to the GPC3 protein, regardless of its origin, type (monoclonal or polyclonal) and shape. Specifically, known antibodies such as a mouse antibody, a rat antibody, a human antibody, a chimeric antibody, and a humanized antibody can be used.
  • the antibody may be a polyclonal antibody, but is preferably a monoclonal antibody.
  • the anti-GPC3 antibody immobilized on the support and the anti-GPC antibody labeled with a labeling substance may recognize the same epitope of the GPC3 molecule, but preferably recognize different epitopes.
  • the site to be recognized as an epitope is not particularly limited, but it can recognize the epitope located on the N-terminal side of the GPC3 protein (amino acids 1st Met to 358th Arg or 1st Met to 374th Lys). preferable.
  • the anti-GPC3 antibody used in the present invention can be obtained as a polyclonal or monoclonal antibody using known means.
  • a mammal-derived monoclonal antibody is particularly preferable.
  • Monoclonal antibodies derived from mammals include those produced in hybridomas and those produced in hosts transformed with expression vectors containing antibody genes by genetic engineering techniques.
  • a monoclonal antibody-producing hybridoma can be basically produced using a known technique as follows. That is, GPC3 is used as a sensitizing antigen, immunized according to a normal immunization method, and the obtained immune cells are fused with a known parent cell by a normal cell fusion method, and are then screened by a normal screening method. It can be prepared by screening monoclonal antibody-producing cells.
  • a monoclonal antibody may be prepared as follows.
  • GPC3 used as a sensitizing antigen for obtaining an antibody is expressed by expressing the Z amino acid sequence of the GPC3 (MXR7) gene disclosed in Germany, H. et al., Gene 188 (1997), 151-156. obtain. That is, after a gene sequence encoding GPC3 is inserted into a known expression vector system and transformed into an appropriate host cell, The target human GPC3 protein is purified from the culture supernatant by a known method. Also, natural GPC3 can be purified and used.
  • this purified GPC3 protein is used as a sensitizing antigen.
  • a partial peptide of GPC3 can be used as a sensitizing antigen.
  • the partial peptide can be obtained by chemical synthesis from the amino acid sequence of human GPC3, or can be obtained by incorporating a part of the GPC gene into an expression vector, and further, natural GPC3 can be degraded by a protease. Can also be obtained.
  • the part of GPC3 used as a partial peptide is not limited, but when an antibody that recognizes the N-terminal epitope is to be obtained, the GPC3 amino acid 1st Met to 358th Arg or the 1st Met A peptide up to the 374th Lys may be used, or a smaller peptide containing this portion of the epitope may be used.
  • the mammal to be immunized with the sensitizing antigen is not particularly limited, but is preferably selected in consideration of compatibility with the parent cell used for cell fusion.
  • rodents Animals, for example, mice, rats, hamsters, or egrets, sals, and the like are used.
  • Immunization of an animal with a sensitizing antigen is performed according to a known method.
  • a sensitizing antigen is injected intraperitoneally or subcutaneously into a mammal.
  • the sensitizing antigen is diluted and suspended in an appropriate amount with PBS (Phosphate-Buff fered Saline), physiological saline, or the like, and then mixed with an appropriate amount of a normal adjuvant, for example, Freund's complete adjuvant, if desired.
  • a suitable carrier can be used during immunization of the sensitizing antigen.
  • a partial peptide having a small molecular weight when used as a sensitizing antigen, it is desirable to immunize a carrier protein such as albumin or keyhole linditol with a carrier protein such as mosinein.
  • immunocytes are collected from the mammal and subjected to cell fusion. Splenocytes.
  • a mammalian myeloma cell is used as the other parent cell fused with the immune cell.
  • This myeloma cell can be selected from various known cell lines, for example, P3 (P3x63Ag8.6553) (J. Immnol. (1979) 123, 1548-1550), P3x63Ag8U.1 (Current Topics in Microbiology and Immunology (1978) 81 , 1-7), NS-1 (Kohler.G. And Milste in, C. Eur.J.I.dragon unol. (1976) 6, 511-519), MPC-
  • Cell fusion between the immune cells and myeloma cells is basically performed by a known method, for example, the method of Kohler and Milstein (Kohler. G. and Milstein,
  • the cell fusion is performed, for example, in a normal nutrient medium in the presence of a cell fusion promoter.
  • a cell fusion promoter for example, polyethylene glycol (PEG), Sendai virus (HVJ) and the like are used, and if necessary, an auxiliary agent such as dimethyl sulfoxide can be added and used to enhance the fusion efficiency.
  • the ratio of the use of the immune cells and the myeloma cells can be arbitrarily set. For example, it is preferable that the number of immune cells be 1 to 10 times that of myeloma cells.
  • Examples of the culture solution used for the cell fusion include, for example, those suitable for growing the myeloma cell line.
  • RPMI 1640 culture solution MEM culture solution, and other normal culture solutions used for this type of cell culture can be used, and a serum supplement such as fetal calf serum (FCS) can also be used in combination.
  • FCS fetal calf serum
  • a predetermined amount of the immune cells and myeloma cells are mixed well in the culture solution, and a PEG solution (for example, an average molecular weight of about 1000 to 6000), which has been heated to about 37 ° C. in advance, is usually 30 to 60%. (w / v) is added and mixed to form the desired fused cells (hybrid cells). Subsequently, an appropriate culture solution is sequentially added, and the operation of removing the supernatant by centrifugation is repeated to remove cell fusion agents and the like that are unfavorable for the growth of the hybridoma.
  • a PEG solution for example, an average molecular weight of about 1000 to 6000
  • the hybridoma thus obtained is selected by culturing it in a normal selective culture medium, for example, a HAT medium (a culture medium containing hypoxanthine, aminopterin and thymidine).
  • a HAT medium a culture medium containing hypoxanthine, aminopterin and thymidine.
  • the culturing in the HAT culture medium is continued for a time (usually several days to several weeks) sufficient for cells other than the desired hybridoma (non-fused cells) to die.
  • the usual limiting dilution method is performed, and screening and single cloning of hybridomas producing the desired antibody are performed.
  • the screening and single cloning of the target antibody may be performed by a screening method based on a known antigen-antibody reaction.
  • the antigen is bound to a carrier such as beads made of polystyrene or a commercially available 96-well microtiter plate and reacted with the culture supernatant of the hybridoma.
  • the enzyme-labeled secondary antibody is used.
  • it can be determined whether or not the target antibody that reacts with the sensitizing antigen is contained in the culture supernatant.
  • Hybridomas producing the desired antibody can be cloned by a limiting dilution method or the like.
  • an antigen used for immunization may be used.
  • the N-terminal fragment may be used as a screening antigen.
  • human lymphocytes are sensitized to GPC3 in vitro, and the sensitized lymphocytes are derived from a human-derived myeloma capable of permanent division.
  • a desired human antibody having a binding activity to GPC3 can be obtained (see Japanese Patent Publication No. 59878).
  • GPC3 which serves as an antigen, was administered to transgenic animals having all the leverages of the human antibody gene to obtain anti-GPC3 antibody-producing cells.From these immortalized cells, a human antibody against GPC3 was obtained. (See International Patent Application Publication Nos. WO94 / 25585, WO93 / 12227, WO92 / 03918, WO94 / 02602).
  • the hybridoma producing the monoclonal antibody thus produced can be subcultured in a normal culture solution, and can be stored for a long time in liquid nitrogen.
  • a method of culturing the hybridoma according to a usual method and obtaining a culture supernatant thereof, or a method of hybridizing For example, a method in which a lidoma is administered to a mammal that is compatible with the same and allowed to proliferate, and obtained as ascites is used.
  • the former method is suitable for obtaining high-purity antibodies, while the latter method is suitable for mass production of antibodies.
  • a monoclonal antibody a recombinant antibody produced by cloning an antibody gene from a hybridoma, incorporating the antibody gene into an appropriate vector, introducing this into a host, and using a gene recombination technique, is used.
  • Can be used for example,
  • mRNA encoding the variable (V) region of the anti-GPC3 antibody is isolated from the hybridoma producing the anti-GPC3 antibody.
  • mRNA can be isolated by known methods, for example, guanidine ultracentrifugation (Chirgwin, JM et al., Biochemistry (1979) 18, 5294-5299), AGPC method (Chomczynski, P. et al., Anal. Biochem. (1987) 162, 156-159) to prepare total RNA, and then use mRNA Purification Kit (Pharmacia) to prepare the target mRNA.
  • mRNA can be directly prepared by using QuickPrep mRNA Purification Kit (Pharmacia).
  • cDNA for the antibody V region is synthesized using reverse transcriptase.
  • cDNA synthesis is performed using AMV Reverse Transcriptase First-strand cDNA Synthesis Kit (manufactured by Seikagaku Corporation).
  • AMV Reverse Transcriptase First-strand cDNA Synthesis Kit manufactured by Seikagaku Corporation.
  • the target DNA fragment is purified from the obtained PCR product and ligated to vector DNA. Further, a recombinant vector is prepared from this, introduced into E. coli, etc., and colonies are selected to prepare a desired recombinant vector. Then, the nucleotide sequence of the target DNA is confirmed by a known method, for example, the dideoxynucleotide chain reaction method.
  • an antibody gene is expressed in an expression control region, For example, it is incorporated into an expression vector so that it is expressed under the control of an enhancer or promoter.
  • a host cell is transformed with the expression vector to express an antibody.
  • Expression of the antibody gene can be performed by co-transforming host cells by separately incorporating DNA encoding the antibody heavy chain (H chain) or light chain Oil) into an expression vector, or by co-transforming host cells.
  • the host cell may be transformed by incorporating a DNA encoding the DNA into a single expression vector (see TO94 / 11523).
  • transgenic animals For the production of recombinant antibodies, not only the above host cells but also transgenic animals can be used.
  • an antibody gene is inserted into a gene encoding a protein (eg, goat j3 casein) that is specifically produced in milk to prepare a fusion gene.
  • a DNA fragment containing the fusion gene into which the antibody gene has been inserted is injected into a goat embryo, and the embryo is introduced into a female goat.
  • the desired antibody is obtained from milk produced by the transgenic goat born from the goat that has received the embryo or its progeny.
  • Hormones may also be used in transgenic goats as appropriate to increase the amount of milk containing the desired antibody produced by transgenic goats (Ebert, KM et al., Bio / Technology). (1994) 12, 699-702).
  • artificially modified recombinant antibodies for example, chimeric antibodies and humanized antibodies can be used. These modified antibodies can be produced using known methods.
  • a chimeric antibody can be obtained by ligating the DNA encoding the antibody V region obtained as described above with the DNA encoding the human antibody C region, inserting the DNA into an expression vector, introducing the resultant into a host, and producing the antibody. Using this known method, chimeric antibodies useful in the present invention can be obtained.
  • Humanized antibodies are also referred to as reshaped human antibodies, which are used to replace the complementarity determining regions (CDRs) of non-human mammals, such as mouse antibodies, with human antibodies. It has been transplanted into the sex-determining region, and its general genetic recombination technique is also known (see European Patent Application Publication No. EP 125023, WO 96/02576). Specifically, a DNA sequence designed to link the CDR of a mouse antibody to the framework region (FR) of a human antibody is modified so that it has a portion that overlaps both CDR and FR terminal regions. Using the prepared several oligonucleotides as primers, PCR is used to synthesize them (see the method described in W098 / 13388).
  • the framework region of the human antibody to be linked via CDR is selected so that the complementarity determining region forms a favorable antigen-binding site. If necessary, the amino acids of the framework region in the variable region of the antibody may be substituted so that the complementarity-determining region of the reshaped human antibody forms an appropriate antigen-binding site (Sato, K. et al. , Cancer Res. (1993) 53, 851-856).
  • the human antibody C region of the chimeric antibody and the humanized antibody those of a human antibody are used.
  • C ⁇ 1, Cr2, CT3, and CT4 are used for the H chain
  • C / c and C4 are used for the L chain.
  • ⁇ can be used.
  • the human antibody C region may be modified.
  • a chimeric antibody is composed of a variable region of an antibody derived from a mammal other than human and a constant region derived from a human antibody.
  • a humanized antibody is composed of a complementarity determining region of a non-human mammal-derived antibody, a human antibody-derived framework region and a C region. Since the humanized antibody has reduced antigenicity in a human body, it is useful as an active ingredient of the therapeutic agent of the present invention.
  • the antibody used in the present invention is not limited to the whole antibody molecule, and may be an antibody fragment or a modified product thereof as long as it binds to GPC3, and includes both bivalent antibodies and monovalent antibodies.
  • antibody fragments Fab, F (ab ') 2, Fv, Fab / c having one Fab and complete Fc, or Hv or L chain Fv were linked by an appropriate linker.
  • Single chain Fv scFv.
  • the antibody is treated with an enzyme such as papain or pepsin to generate an antibody fragment, or a gene encoding these antibody fragment is constructed and introduced into an expression vector.
  • an enzyme such as papain or pepsin
  • scFv can be obtained by linking the H chain V region and L chain V region of the antibody.
  • the H chain V region and L chain V region are linked via a linker, preferably a peptide linker (Huston, J.S. et al., Pro Natl. Acad. Sc. U.S.A.
  • the H chain V region and L chain V region in the scFv may be from any of the antibodies described herein.
  • the peptide linker for connecting the V regions for example, any single-chain peptide consisting of 12 to 19 amino acid residues is used.
  • the DNA encoding the scFv may be any of the DNAs encoding the H chain or H chain V region and the DNA encoding the L chain or L chain V region of the antibody, or all or a desired amino acid sequence thereof. Is amplified by PCR using a pair of primers that define both ends of the DNA, and then the DNA encoding the peptide linker, and both ends are linked to the H and L chains, respectively. It is obtained by combining and amplifying primer pairs that are defined as follows.
  • DNAs encoding scFv are prepared, expression vectors containing them and a host transformed with the expression vector can be obtained according to a conventional method.
  • scFv can be obtained according to a conventional method.
  • antibody fragments can be obtained and expressed in the same manner as described above, and produced by a host.
  • the “antibody” in the present invention also includes fragments of these antibodies.
  • an anti-glypican antibody bound to various molecules such as a labeling substance can also be used.
  • the “antibody” in the present invention also includes these modified antibodies.
  • Such a modified antibody is obtained by chemically modifying the obtained antibody. Can be obtained. Methods for modifying antibodies have already been established in this field.
  • the antibody used in the present invention may be a bispecific antibody (bispecific antibody).
  • the bispecific antibody may be a bispecific antibody having an antigen-binding site that recognizes a different epitope on the GPC3 molecule, or one of the antigen-binding sites may recognize GPC3 and the other may bind to the other antigen-binding site. A labeling substance or the like may be recognized.
  • Bispecific antibodies can be produced by combining the HL pairs of two types of antibodies, or by fusing hybridomas producing different monoclonal antibodies to produce bispecific antibody-producing fusion cells. You can also get.
  • bispecific antibodies can be produced by genetic engineering techniques.
  • the antibody gene constructed as described above can be expressed and obtained by a known method.
  • expression can be achieved by operably linking a useful promoter commonly used, an antibody gene to be expressed, and a polyA signal downstream of the 3 ′ side thereof.
  • the promoter "Zenhansa” includes the human cytomegalovirus early promoter / enhancer.
  • Z virus promoters such as retrovirus, poliovirus, adenovirus, simian virus 40 (SV40), and human promoter.
  • promoters / enhancers derived from mammalian cells such as Gation Factor la (HEF la).
  • a useful promoter commonly used a signal sequence for antibody secretion, and an antibody gene to be expressed can be functionally linked to express the gene.
  • Promoters include, for example, lacz promoter overnight, araB promoter Can be mentioned.
  • the method of Ward et al. (Nature (1098) 341, 544-546; FASEB J. (1992) 6, 2422-2427) is used. It can be expressed by these methods (Science (1988) 240, 1041-1043).
  • a pelB signal sequence (Lei, S. P. et al. J. Bacteriol. (1987) 169, 4379) may be used in the case of production in the periplasm of E. coli. Then, after separating the antibody produced in the periplasm, the antibody structure is appropriately refolded and used.
  • the origin of replication those derived from SV40, poliovirus, adenovirus, pipapi virus (BPV), etc. can be used.
  • the expression vector must be used to amplify the gene copy number in the host cell system. Including the aminoglycoside transferase (APH) gene, thymidine kinase (TK) gene, Escherichia coli xanthinguanine phospholiposyltransferase (Ecogpt) gene, dihydrofolate reductase (dhfr) gene, etc. Can be.
  • APH aminoglycoside transferase
  • TK thymidine kinase
  • dhfr dihydrofolate reductase
  • Eukaryotic cells include, for example, established mammalian cell lines, insect cell lines, animal cells such as fungal cells and yeast cells, and prokaryotic cells include, for example, bacterial cells such as E. coli cells.
  • Eukaryotic cells include, for example, established mammalian cell lines, insect cell lines, animal cells such as fungal cells and yeast cells, and prokaryotic cells include, for example, bacterial cells such as E. coli cells.
  • the antibodies used in the present invention are expressed in mammalian cells, such as CH0, COS, myeloma, BHK, Vero, HeLa cells.
  • the transformed host cells are cultured in vitro or in vivo to produce the desired antibody.
  • Culture of the host cell is performed according to a known method.
  • DMEM, MEM, RPMI 1640, IMDM can be used as a culture solution, and a serum replacement solution such as fetal calf serum (FCS) can also be used in combination.
  • FCS fetal calf serum
  • Antibodies expressed and produced as described above can be separated from cells and host animals and purified to homogeneity. Separation and purification of the antibody used in the present invention can be carried out using an affinity column.
  • an affinity column For example, as a column using a protein A column, Hyper D, P0R0S, Sepharose FF (Pharmacia) and the like can be mentioned. So in addition, the separation and purification methods used for ordinary proteins may be used, and there is no limitation.
  • antibodies can be separated and purified by appropriately selecting and combining chromatographic columns other than the above affinity columns, filters, ultrafiltration, salting out, dialysis, etc. (Antibodies A Laboratory Manual. Ed Harlow, David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988).
  • GPC3 to be detected in the present invention is not particularly limited, and may be full-length GPC3 or a fragment thereof. When a GPC3 fragment is detected, it may be an N-terminal fragment or a C-terminal fragment, but is preferably an N-terminal fragment.
  • the GPC3 protein to which heparan sulfate or the like is added, or the GPC3 core protein may be used.
  • the method for detecting the GPC3 protein contained in the test sample is not particularly limited, but detection by an immunological method using an anti-GPC3 antibody is preferable.
  • Immunological methods include, for example, radioimmunoassay, enzymimnoassy, fluorescent immunoassay, luminescence immunoassay, immunoprecipitation, immunoturbidimetry, western plot, immunostaining, immunodiffusion, etc.
  • preferred is Enzymim Noassy, and particularly preferred is an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) (for example, sandwich ELISA).
  • ELISA enzyme-linked immunosorbent assay
  • the above-described immunological methods such as ELISA can be performed by methods known to those skilled in the art.
  • an anti-GPC3 antibody is immobilized on a support, a test sample is added thereto, incubated, and after binding the anti-GPC3 antibody and the GPC3 protein, After washing, a GPC3 protein in a test sample can be detected by detecting GPC3 protein bound to the support via an anti-GPC3 antibody.
  • Examples of the support used in the present invention include insoluble polysaccharides such as agarose and cellulose; synthetic resins such as silicone resin, polystyrene resin, polyacrylamide resin, nylon resin, and polycarbonate resin; Soluble supports can be mentioned. These supports can be used in the form of beads or plates. In the case of beads, a column packed with these can be used. In the case of a plate, a multiwell plate (such as a 96-well multiwell plate) or a biosensor chip can be used. The binding between the anti-GPC3 antibody and the support can be achieved by a commonly used method such as chemical bonding or physical adsorption. All of these supports can be used commercially.
  • the binding between the anti-GPC3 antibody and the GPC3 protein is usually performed in a buffer.
  • a buffer for example, a phosphate buffer, a Tris buffer, a citrate buffer, a borate buffer, a carbonate buffer, and the like are used.
  • Incubation is performed under conditions that are already commonly used, such as incubation at 4 ° C to room temperature for 1 hour to 24 hours. Washing after incubation may be any as long as it does not hinder the binding between the GPC3 protein and the anti-GPC3 antibody.
  • a buffer containing a surfactant such as Tween20 is used.
  • a control sample may be provided in addition to the test sample from which the GPC3 protein is to be detected.
  • Control samples include a negative control sample containing no GPC3 protein and a positive control sample containing GPC3 protein.
  • the GPC3 protein in the test sample is detected by comparing the results obtained with the negative control sample containing no GPC3 protein with the results obtained with the positive control sample containing GPC3 protein. It is possible.
  • a series of control samples in which the concentration is changed stepwise is prepared, the detection results for each control sample are obtained as numerical values, a standard curve is created, and the test values are determined from the numerical values of the test samples based on the standard curve. It is also possible to quantitatively detect the GPC3 protein contained in the sample.
  • a method using an anti-GPC3 antibody labeled with a labeling substance can be mentioned.
  • a test sample is brought into contact with an anti-GPC3 antibody immobilized on a support, washed, and then detected using a labeled antibody that specifically recognizes a GPC3 protein.
  • Labeling of the anti-GPC3 antibody can be performed by a generally known method.
  • the labeling substance it is possible to use a labeling substance known to those skilled in the art, such as a fluorescent dye, an enzyme, a coenzyme, a chemiluminescent substance, and a radioactive substance.
  • radioisotope 32
  • 14 C 14 C
  • 125 I 3 ⁇ 4, etc.
  • 131 1) Furuoresein, rhodamine, men Rukurorido, Unberifueron, luciferase, Peruokishida Ichize, alkaline phosphatase, jS - galactosidase, 3 - Darukoshida Ichize ho one Suradisshi Yupaokishida Ichize, Examples include darcoamylase, lysozyme, saccharidoxidase, microperoxidase, and biotin.
  • biotin-labeled antibody When using biotin as a labeling substance, it is preferable to add a biotin-labeled antibody and then add avidin to which an enzyme such as alkaline phosphatase is bound.
  • a known method such as a dartalaldehyde method, a maleimide method, a pyridyl disulfide method, a periodate method, or the like can be used.
  • a solution containing an anti-GPC3 antibody is added to a support such as a plate, and the anti-GPC3 antibody is immobilized on the support. After washing the plate, block with, for example, BSA, gelatin, or albumin to prevent non-specific binding of proteins.
  • Detection can be performed by a method known to those skilled in the art. For example, in the case of labeling with a radioactive substance, detection can be performed by liquid scintillation or the RIA method. In the case of labeling with an enzyme, a substrate is added, and enzymatic change of the substrate, for example, color development can be detected by an absorptiometer.
  • the substrate examples include 2,2-azinobis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) diammonium salt (ABTS), 1,2-phenylenediamine (ortho-phenylenediamine) , 3, 3 ', 5, 5'-tetramethylbenzidine (TME) and the like.
  • ABTS 2,2-azinobis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) diammonium salt
  • TME 1,2-phenylenediamine
  • TME 5, 5'-tetramethylbenzidine
  • a fluorescent substance it can be detected by a fluorometer.
  • a particularly preferred embodiment of the GPC3 protein detection method of the present invention includes a method using an anti-GPC3 antibody labeled with biotin and avidin.
  • a solution containing an anti-GPC3 antibody is added to a support such as a plate, and the anti-GPC3 antibody is added. Fix your body. After washing the plate, block with, for example, BSA to prevent non-specific binding of proteins. Wash again and add the test sample to the plate. After incubation, wash and add a biotin-labeled anti-GPC3 antibody. After moderate incubation, wash the plate and add avidin conjugated to enzymes such as alkaline phosphatase and peroxidase. After the incubation, the plate is washed, a substrate corresponding to the enzyme bound to avidin is added, and the GPC3 protein is detected using the substrate's enzymatic change as an index.
  • inventions for detecting a GPC3 protein of the present invention include a method using a primary antibody that specifically recognizes a GPC3 protein and a method using a secondary antibody that specifically recognizes the primary antibody.
  • a test sample is brought into contact with an anti-GPC3 antibody immobilized on a support, incubated, washed, and after washing, the bound GPC3 protein is specifically bound to the primary anti-GPC3 antibody and the primary antibody. It is detected by a secondary antibody that recognizes.
  • the secondary antibody is preferably labeled with a labeling substance.
  • a solution containing an anti-GPC3 antibody is added to a support such as a plate to fix the anti-GPC3 antibody. After washing the plate, block with, for example, BSA to prevent non-specific binding of proteins. Wash again and add the test sample to the plate. After incubation, wash and add primary anti-GPC3 antibody. After moderate incubation, the plate is washed, and then a secondary antibody that specifically recognizes the primary antibody is added. After appropriate incubation, wash and detect any remaining secondary antibody on the plate. Detection of the secondary antibody can be performed by the method described above.
  • Another embodiment of the method for detecting a GPC3 protein of the present invention includes a detection method utilizing an agglutination reaction.
  • GPC3 can be detected using a carrier sensitized with an anti-GPC3 antibody.
  • a carrier for sensitizing the antibody any carrier may be used as long as it is insoluble, does not cause nonspecific reaction, and is stable.
  • latex particles, bentonite, collodion, kaolin, fixed sheep erythrocytes and the like can be used, but it is preferable to use latex particles.
  • latex particles examples include polystyrene latex particles and styrene-butane Gen-copolymer latex particles, polyvinyl toluene latex particles and the like can be used, but polystyrene latex particles are preferably used.
  • the concentration of the GPC3 antibody in the sample the greater the degree of particle aggregation.
  • GPC3 can be detected by looking at the aggregation with the naked eye. it can.
  • the turbidity due to aggregation can be detected by measuring with a spectrophotometer or the like.
  • Another embodiment of the method for detecting a GPC3 protein of the present invention includes, for example, a method using a biosensor utilizing the surface plasmon resonance phenomenon.
  • Biosensors utilizing surface plasmon resonance can observe protein-protein interactions in real time as surface plasmon resonance signals using a small amount of protein and without labeling.
  • a biosensor such as BIAcore (Pharmacia).
  • BIAcore Pharmacia
  • a test sample is brought into contact with a sensor chip on which an anti-GPC3 antibody is immobilized, and the GPC3 protein binding to the anti-GPC3 antibody can be detected as a change in resonance signal.
  • the detection method of the present invention can be automated using various automatic inspection devices, and it is possible to inspect a large number of samples at once.
  • the present invention also aims at providing a diagnostic agent or kit for detecting GPC3 protein in a test sample for cancer diagnosis, wherein the diagnostic agent or kit contains at least an anti-GPC3 antibody.
  • the diagnostic agent or kit may contain a carrier for immobilizing the antibody, and the antibody may be bound to the carrier in advance.
  • the carrier may contain a carrier to which an antibody is adsorbed.
  • the kit may appropriately contain a blocking solution, a reaction solution, a reaction stop solution, a reagent for treating a sample, and the like.
  • BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGSFIG. 1 shows the results of GPC3 mRNA expression analysis using Gene Chip.
  • FIG. 1A shows the expression of GPC3
  • FIG. 1B shows the expression of alpha phytoprotein (AFP).
  • AFP alpha phytoprotein
  • FIG. 2 is a diagram showing CBB-stained images of purified heparan sulfate-added GPC3 and GPC3 core protein.
  • FIG. 3 shows the expression of the GP.C3 gene in human liver cancer.
  • FIG. 4 shows the results of Western blotting of a soluble core protein performed using an anti-GPC3 antibody.
  • FIG. 5 is a diagram showing the principle of sandwich ELISA using an anti-GPC3 antibody.
  • FIG. 6 is a diagram showing a standard curve of a GPC3 sandwich ELISA using M6B1 and M18D4.
  • FIG. 7 is a schematic diagram showing the structure of GPC3.
  • FIG. 8 is a diagram showing combinations of anti-GPC3 antibodies in ELISA.
  • FIG. 9 is a diagram showing a standard curve of a GPC3 sandwich ELISA system using various combinations of anti-GPC3 antibodies.
  • pCXND2 and pCXND3 As expression vectors for soluble GPC3 and soluble GPC3 core protein, pCXND2 and pCXND3 in which DHFR gene and neomycin resistance gene were incorporated into pCAGGS were used.
  • DXB11 cells purchased from ATCC were used, and 5% FBS (GIBC0 BL CAT * 10099-141, drawing A0275242) / Minimum Essential Medium Alpha medium (MEM (+)) (GIBCO BRL CAT * 12571-071) / 13 ⁇ 4 Penicillin-Streptomycin (GIBCO BRL CAT # 15140-122) was used.
  • HepG2 cells purchased from ATCC were used and 10% FBS / Dulbecco's modified Eagle culture was used. The culture was carried out on ground (Dulbecco's Modified Eagle Medium, DMEM) (GIBCO BRL CAT # 11995-065) / PS.
  • DMEM Dulbecco's Modified Eagle Medium
  • Hybridomas are cultured in 10% FBS / RPMI 1640/1 x HAT medi a supplement (SIGMA CA T # H-0262) / 0.5 x BM-Cond imed HI Hybridoma c loning suppl ement (Roche CA T # 1088947) did.
  • SIGMA CA T # H-0262 / 0.5 x BM-Cond imed HI Hybridoma c loning suppl ement
  • FucDNA human GPC3
  • GPC3 Cloning of full-length cDNA encoding human glypican 3 (hereinafter GPC3)
  • the full-length cDNA encoding human GPC3 was obtained from a colon cancer cell line Caco2 using a 1st st rand cDNA prepared by a conventional method as type II, and Advantage2 kit (CL0NTECH Cat. No. 8430-
  • Amplification was performed by PCR reaction using 1). That is, 21 &(; 02 derived from 08, 11 sense primers (SEQ ID NO: 1), 11 antisense primers (SEQ ID NO: 1)
  • sequence shown is the nucleotide sequence of the human GPC3 gene, and the sequence represented by SEQ ID NO: 4 is the amino acid sequence of the human GPC3 protein SEQ ID NO 1: GATATC-ATGGCCGGGACCGTGCGCACCGCGT
  • liver cancer tumor well differentiated cancer: WD, moderately differentiated cancer: MD, poorly differentiated cancer: PD
  • 16 cases of non-cancerous liver cancer hepatitis site: CH, cirrhosis site: LC
  • Normal liver mRNA expression analysis in NL (Informed consent obtained, obtained at the University of Tokyo School of Medicine and Saitama Cancer Center) using GeneChip TM UG-95A Target (Af fymetryx)
  • NL Informed consent obtained, obtained at the University of Tokyo School of Medicine and Saitama Cancer Center
  • GeneChip TM UG-95A Target Af fymetryx
  • the human GPC3 gene (Probe Set ID: 39350-at) showed significantly higher mRNA expression levels in many cases than normal liver tissues, regardless of the degree of liver cancer differentiation. confirmed. Furthermore, compared to the mRNA expression of alpha phytoprotein (Probe Set ID: 40114-at), which is currently most frequently used as a diagnostic marker for liver cancer, there is almost no mRNA expression of alpha phytoprotein. In the well-differentiated carcinoma, GPC3 showed sufficient enhancement of mRNA expression, and it was revealed that the rate of enhanced mRNA expression was high in GPC3. Based on the above, GPC3 detection is considered to be useful as an early diagnostic method for liver cancer.
  • Example 2 Preparation of anti-GPC 3 antibody
  • a soluble GPC3 protein lacking a C-terminal hydrophobic region was prepared.
  • a soluble GPC3 cDNA expression plasmid DNA was constructed using plasmid DNA containing full-length human GPC3 cDNA provided by the UIST.
  • a downstream primer (5'-ATA GAA TTC CAC CAT GGC CGG GAC CGT GCG C-3 '(SEQ ID NO: 5)) designed to remove the C-terminal hydrophobic region (564-580 amino acids) and an EcoRI recognition sequence
  • Kozak PCR was performed using the upstream primer (5′-ATA GGA TCC CTT CAG CGG GGA ATG AAC GTT C-3 ′) (SEQ ID NO: 6) to which the sequence was added.
  • the prepared expression plasmid DNA was introduced into the MB11 strain of CH0 cells, and the soluble GPC3 high-expressing CH0 strain was obtained by selection with 500 / xg / mL Genetic in.
  • cDNA was prepared by substituting Ala for Sers at positions 495 and 509 by assembly PCR.
  • a primer was designed so that a His tag was added to the C-terminus, and the obtained cDNA was cloned into the pCXND3 vector.
  • the resulting expression plasmid DNA was introduced into the DXB11 strain, and selection with 500 g / mL Genetic in was performed to obtain a soluble GPC3 core protein highly expressing CH0 strain.
  • Mass culture was performed using a 1700 cm 2 roller bottle, and the culture supernatant was collected and purified.
  • the culture supernatant was charged into Q sepharose Fast Flow (Amersham CAT * 17-0510-01), washed, and eluted with phosphate buffer containing 500 mM NaCl.
  • affinity purification was carried out using Chelating Sepharose Fast Flow (Amersham CAT * ⁇ -0575-Ol). Gradient elution was performed with 10-150 mM imidazole. Finally, the mixture was concentrated using Q Sepharose Fast Flow, and eluted with a phosphate buffer containing 500 mM NaCl.
  • GPC3 is a 69 kDa proteodarican having a heparan sulfate addition sequence at the C-terminal.
  • the smear band was considered to be GPC3 modified with heparan sulfate.
  • the band of about 40 kDa originated from the N-terminal fragment of GPC3, and it was predicted that GPC3 had undergone some cleavage.
  • a soluble GPC3 core protein was prepared in which Ser 495 and 509 at the heparan sulfate addition signal sequence were substituted with Ala.
  • construct a strain with high expression of CH0 It was constructed and subjected to affinity purification using a His tag from the culture supernatant.
  • affinity purification using a His tag from the culture supernatant As a result of SDS polyacrylamide gel electrophoresis, three bands of 70 kDa, 40 kDa, and 30 kDa were obtained.
  • GPC3 on the membrane would be cleaved even in liver cancer patients, and that GPC3 would be secreted into the blood as a soluble form.
  • GPC3 was found to have higher gene expression in patients with early-stage liver cancer than AFP, a hepatocellular carcinoma tumor marker (Fig. 1), and could be a new tumor marker with higher clinical utility than AFP.
  • a sandwich ELISA system was constructed as described in Example 2 and thereafter. Preparation of anti-GPC3 antibody
  • MRL / lpr Mice were used as immunized animals.
  • Five MRL / lpr mice (CRL) were immunized with soluble GPC3.
  • FCA Full's complete adjuvant (H37 Ra).
  • Difco (3113-60), Becton Dickinson (cat # 231131)) The compound was administered subcutaneously.
  • Cell fusion was performed with Nostic, cat # 783 641). The seeds were inoculated on a 96-well culture plate, selected on a HAT medium from the next day, and the culture supernatant was screened by ELISA. Positive clones were subjected to monocloning by the limiting dilution method, then expanded, and the culture supernatant was collected. Screening by ELISA was performed using the binding activity to the GPC3 core protein as an index, and six clones of anti-GPC3 antibodies having strong binding ability were obtained.
  • the antibody was purified using Hi Trap ProteinG HP (Amersham CAT # 17-0404-01). The hybridoma culture supernatant was directly charged onto the column, washed with a binding buffer (sodium phosphate 20 (PH7.0)), and then eluted with an elution buffer (0.1 M glycine-HC1 (pH 2.7)). Elution was performed in a tube to which a neutralization buffer (1 M Tris-HC1 (pH 9.0)) had been added, and the mixture was immediately neutralized. After pooling the antibody fractions, dialysis was performed overnight with 0.05% Tween20 / PBS to replace the buffer. The purified antibody was stored at 4 ° C. after adding NaN 3 to 0.02%. Analysis of anti-GPC3 antibody
  • Antibody concentrations were mouse IgG sandwich using goat anti-mouse IgG (gamma) (ZYMED CAT # 62-6600) and alkaline phosphatase goat anti-mouse IgG (gamma) (ZYMED CAT # 62-6622). ELISA was performed and quantification was performed using a commercially available purified mouse IgG1 antibody (ZYMED CAT # 02-6100) as a standard.
  • Isotyping of the anti-GPC3 antibody was performed using I MarunoPure Monoclonal Antibody Isotyping Kit II (PIERCE CAT # 37502), and the method was in accordance with the attached manual. All were of IgGl type as a result of isotyping.
  • Epitope classification of anti-GPC3 antibodies was performed by Western blotting using the GPC3 core protein.
  • the soluble GPC3 core protein is charged to 10% SDS-PAGE mini (TEFC0 CAT # 075) at 100ng / lane, electrophoresed (60V 30min, 120V 90min), and then trans-Blot SD Semi-Dry It was transferred to Immobilon-P (Millipore CATIIPVH R8510) using an Electrophoretic Transfer Cell (BIO-RAD) (15 V, 60 min). After washing the membrane lightly with TBS-T (0.05% Tween20, TBS), 5 Shake with TBS-T containing skim milk for 1 hour (room temperature) or overnight (4 ° C).
  • each anti-GPC3 antibody diluted to 0.1 to 10 g / mL with TBS-T containing 1% skim milk was added and shaken for 1 hour. Wash with TBS-T (10 minutes x 3 times), shake with HRP-anti-mouse IgG antibody (Amersham CAT A931) diluted to 1.1000 with TBS-T containing 1% skim milk for 1 hour, and wash with TBS-T. (10 minutes x 3 times).
  • the color was developed using ECL-Plus (Amersham RPN2132) and developed using Hyperii lm ECL (Amersham CAT # RPN2103K).
  • Figure 4 shows the results of Western plot analysis.
  • Antibodies that react with the 40 kDa band have an epitope at the N-terminus, and antibodies that react with the 30 kDa band have an epitope at the C-terminus, and were classified.
  • M6B1, M18D4, and M3C11, M13B3, and M3B8 were obtained as antibodies recognizing the N-terminal side of M6B1, M18D4, and M19B1.
  • the KD value of each antibody was 0.2 to 17.6 nM.
  • HepG2-transplanted SCID mouse # 2 was subjected to whole blood collection from the posterior vena cava 62 days after HepG2 transplantation, and HepG2-transplanted nude mice # 1 and 2 were collected 66 days after transplantation.
  • plasma was prepared from normal SCID mice of the same age by the same procedure.
  • a sandwich ELISA system for GPC3 was constructed.
  • M6B1 was used as the antibody coated on the 96-well plate, and M18D4 labeled with biotin was used as the antibody for detecting GPC3 bound to M6B1.
  • DAK0 AMP AK was used to achieve high detection sensitivity.
  • 96 ⁇ El I Takeno plates 10 g / mL to become like the anti-GPC3 antibody coated bar Ffa coated with those diluted with (0.1M NaHC0 3 (pH9.6), 0.02% (w / v) NaN 3) was incubated at 4 ° C.
  • a biotin-labeled anti-GPC3 antibody diluted to 102 g / mL with a dilution buffer was added and incubated for 1 hour at room temperature.
  • AP-streptavidin ZYMED
  • color was developed using AMPAK (DAK0 CAT # K6200) according to the attached protocol, and the absorbance was measured with a microplate reader.
  • FIG. 5 shows the principle of the sandwich ELISA of this embodiment.
  • FIG. 6 shows the standard curve of GPC3 sandwich ELISA using M6B1 and M18D4.
  • soluble GPC3 was below the detection limit, whereas soluble GPC3 was detected in the culture supernatant of HepG2 and mouse serum transplanted with human hepatoma HepG2 cells.
  • concentration of purified soluble GPC3 was 1.2 ⁇ g / mL in HepG2 culture supernatant and 23-90ng / mL in mouse serum (Table 1). table 1
  • Table 1 shows the measurement results.As shown in Table 1, detection of secreted GPC3 in the culture supernatant of HepG2 and mouse serum transplanted with human hepatoma HepG2 cells was performed using a pair of antibodies that recognize N-terminal fragments. The combined value showed a high value, and the system containing the antibody recognizing the C-terminal fragment was below the detection limit in many mice. This suggests that the secretory GPC3 revealed this time has a superior N-terminal fragment. Industrial applicability
  • GPC3 highly expressed in liver cancer cells may be present in blood as a partially secreted form. Since GPC3 has gene expression in cancers earlier than the liver cancer marker AFP, GPC3 detection is considered to be useful as a cancer diagnosis. GPC3 has been confirmed to be expressed not only in liver cancer cell lines but also in cancer cell lines such as lung cancer, colon cancer, breast cancer, prostate cancer, knee cancer, and lymphoma. It may be applicable to
  • the secreted GPC3 might be dominated by the N-terminal fragment cleaved between arginine at amino acid position 358 and serine at position 359. This suggests that an antibody recognizing the N-terminal fragment is useful as a diagnostic antibody.
  • a C-terminal fragment-recognizing antibody is used as an antibody for treating liver cancer having ADCC activity and CDC activity, it can efficiently reach liver cancer cells without being trapped by secreted GPC3 in blood. it is conceivable that.

Abstract

新規な血中癌マーカーの検出による癌の診断方法を提供する。被験試料中の可溶化グリピカン３を検出することにより癌を診断することができる。

Description

明細書
GPC3の検出による癌の診断方法 技術分野
本発明は血中可溶性癌マーカーに関する。 具体的には、 被検試料中の可溶性グ リピカン 3 (GPC3)を検出し、 癌を診断する方法に関する。 背景技術
細胞表面上に存在するへパラン硫酸プロテオダリカンの新しいファミリ一とし てグリピカンファミリーの存在が報告されている。 現在までのところ、 グリピ力 ンファミリーのメンバーとして、 5種類のグリピカン （ダリビカン 1、 グリピ力 ン 2、 ダリビカン 3、 ダリピカン 4およびダリピカン 5 ) が存在することが報告 されている。 このファミリーのメンバ一は、 均一なサイズ （約 60kDa) のコア夕 ンパク質を持ち、 特異的でよく保持されたシスティンの配列を共有しており、 グ リコシルフォスファチジルイノシトール (GPI) アンカーにより細胞膜に結合し ている。
グリピカン 3 (GPC3)は、 発生における細胞分裂やそのパターンの制御に深く関 わっていることが知られている。 又、 GPC3遺伝子が肝癌細胞において高発現して おり、 GPC3遺伝子が肝細胞癌マーカーとして利用できる可能性があること知られ ている。
以前、 本発明者らは抗 GPC3抗体が ADCC活性及び CDC活性を有しており肝癌の治 療に有用であることを見出し、 特許出願を行った （特願 2001- 189443) 。
しかしながら、 GPC3は膜結合タンパク質であり分泌型の PGC3タンパク質が存在 することは報告されておらず、 GPC3タンパク質自体を血中の癌マーカーとして用 いることは検討されていなかった。 発明の開示
本発明者らは、 グリピカン 3 (GPC3) が 358番目のアルギニンと 359番目のセリ ンの間で切断される事実を見出し、 可溶型 GPC3が肝癌患者の血中に分泌されると いう仮説を立て、 GPC3サンドイッチ ELISA系を確立し、 GPC3高発現であるヒト肝 癌細胞 HepG2の培養上清中に分泌型 GPC3の存在を明らかにした。 さらに、 HepG2を 移植したマウス血漿中のみならずヒト肝癌患者血清中の可溶型 GPC3測定にも成功 した。 GPC3は肝癌マ一力一である AFPよりも早期の肝癌で遺伝子発現が認められ るので、 GPC3の検出は癌の診断として有用であると考えられた。 また可溶型 GPC3 は C末端断片側を認識する抗 GPC3抗体では検出しにくい傾向にあることから、 分 泌型 GPC3は N端断片優位と推定された。 従って、 N端を認識する抗 GPC3抗体を用 いるのが好ましいと考え、 さらに鋭意検討を行い、 本発明を完成させるに至った。
GPC3は肝癌細胞株以外に、 肺癌、 大腸癌、 乳癌、 前立腺癌、 膝臓癌、 リンパ腫 などの癌細胞株においても発現が確認されているので、 肝癌以外の診断にも適用 できる可能性がある。
すなわち、 本発明は以下の通りである。
(1) 被検試料中の可溶化 GPC3タンパク質を検出することを特徴とする癌の診断 方法、
(2) 可溶化 GPC3タンパク質が、 GPC3の N端ペプチドである （1) の癌の診断方 法、
(3) GPC3の N端ペプチドが GPC3の第 1番目のアミノ酸から第 374番目のァミノ 酸からなるアミノ酸配列中または第 1番目のアミノ酸から第 358番目のアミノ酸 からなるアミノ酸配列中に含まれるペプチド断片である、 （2) の癌の診断方法、
(4) 被検試料が血液、 血清、 血漿のいずれかである （1) から （3) のいずれ かの診断方法、
(5) 肝臓癌である （1) から （4) のいずれかの診断方法、
(6) 抗 GPC3抗体を用いることを特徴とする （1) から （5) のいずれかの方法。
(7) 支持体に固定した抗 GPC3抗体と標識物質で標識された抗 GPC3抗体を用いる ことを特徴とする （6) の方法、
(8) 標識物質がピオチンである （7) の方法、
(9) 抗 GPC3抗体を含む癌の診断薬、 (10) 支持体に固定した抗 GPC3抗体と、 標識物質で標識された抗体を含むこと を特徴とする （9) の診断薬、
(11) 肝臓癌である （9) 又は （10) の診断薬、
(12) 抗 GPC3抗体が GPC3の N端ペプチドを認識することを特徴とする （9) か ら （11) のいずれかの診断薬、
(13) 抗 GPC3抗体を含む診断キット、 および
(14) 支持体に固定した抗 GPC3抗体と、 標識物質で標識された抗体を含むこと を特徴とする （1 3) の診断キット。
以下、 本発明について詳細に説明する。
本発明は、 被験試料中の可溶化ダリピカンを検出することにより癌を検出する 方法である。
検出とは、 定量的又は非定量的な検出を含み、 例えば、 非定量的な検出として は、 単に GPC3タンパク質が存在するか否かの測定、 GPC3タンパク質が一定の量以 上存在するか否かの測定、 GPC3タンパク質の量を他の試料 (例えば、 コント口一 ル試料など） と比較する測定などを挙げることができ、 定量的な検出としては、 GPC3タンパク質の濃度の測定、 GPC3タンパク質の量の測定などを挙げることがで きる。
被検試料とは、 GPC3タンパク質が含まれる可能性のある試料であれば特に制限 されないが、 哺乳類などの生物の体から採取された試料が好ましく、 さらに好ま しくはヒトから採取された試料である。 被検試料の具体的な例としては、 例えば、 血液、 間質液、 血漿、 血管外液、 脳脊髄液、 滑液、 胸膜液、 血清、 リンパ液、 唾 液、 尿などを挙げることができるが、 好ましいのは血液、 血清、 血漿である。 又、 生物の体から採取された細胞の培養液などの、 被検試料から得られる試料も本発 明の被検試料に含まれる。
診断される癌は、 特に制限されず、 具体的には、 肝癌、 膝臓癌、 肺癌、 大腸癌、 乳癌、 前立腺癌、 白血病、 リンパ腫などを挙げることができるが、 好ましいのは 肝癌である。
1. 抗 GPC3抗体の作製 本発明で用いられる抗 GPC3抗体は GPC3タンパク質に特異的に結合すればよく、 その由来、 種類 （モノクローナル、 ポリクローナル） および形状を問わない。 具 体的には、 マウス抗体、 ラット抗体、 ヒト抗体、 キメラ抗体、 ヒト型化抗体など の公知の抗体を用いることができる。
抗体はポリクロ一ナル抗体でもよいが、 モノクローナル抗体であることが好ま しい。
又、 支持体に固定される抗 GPC3抗体と標識物質で標識される抗 GPC抗体は GPC3 分子の同じェピトープを認識してもよいが、 異なるェピトープを認識することが 好ましい。
ェピトープとして認識する部位は特に制限されないが、 GPC3夕ンパク質の N端 側 （アミノ酸 1番目の Met〜358番目の Argまたは 1番目の Met〜374番目の Lys) に 存在するェピトープを認識することが好ましい。
本発明で使用される抗 GPC3抗体は、 公知の手段を用いてポリクローナルまたは モノクローナル抗体として得ることができる。 本発明で使用される抗 GPC3抗体と して、 特に哺乳動物由来のモノクローナル抗体が好ましい。 哺乳動物由来のモノ クローナル抗体は、 ハイプリドーマに産生されるもの、 および遺伝子工学的手法 により抗体遺伝子を含む発現ベクターで形質転換した宿主に産生されるものを含 む。
モノクローナル抗体産生ハイブリド一マは、 基本的には公知技術を使用し、 以 下のようにして作製できる。 すなわち、 GPC3を感作抗原として使用して、 これを 通常の免疫方法にしたがって免疫し、 得られる免疫細胞を通常の細胞融合法によ つて公知の親細胞と融合させ、 通常のスクリーニング法により、 モノクローナル な抗体産生細胞をスクリーニングすることによって作製できる。
具体的には、 モノクローナル抗体を作製するには次のようにすればよい。
まず、 抗体取得の感作抗原として使用される GPC3を、 Lage， H. et al. , Gene 188 ( 1997) ， 151- 156に開示された GPC3 (MXR 7 ) 遺伝子 Zアミノ酸配列を発現 することによって得る。 すなわち、 GPC3をコードする遺伝子配列を公知の発現べ クタ一系に挿入して適当な宿主細胞を形質転換させた後、 その宿主細胞中または 培養上清中から目的のヒト GPC3タンパク質を公知の方法で精製する。 また、 天然の GPC3を精製して用いることもできる。
次に、 この精製 GPC3タンパク質を感作抗原として用いる。 あるいは、 GPC3の部 分ペプチドを感作抗原として使用することもできる。 この際、 部分ペプチドはヒ ト GPC3のアミノ酸配列より化学合成により得ることもできるし、 GPC遺伝子の一 部を発現ベクターに組込んで得ることもでき、 さらに天然の GPC3をタンパク質分 解酵素により分解することによつても得ることができる。 部分ペプチドとして用 いる GPC3の部分は限られないが、 N端側に存在するェピトープを認識する抗体を 得ようとする場合は、 GPC3のアミノ酸 1番目の Met〜358番目の Argまたは 1番目 の Met〜374番目の Lysまでのべプチドを用いればよいし、 この部分のェピトープ を含むより小さいペプチドを用いることもできる。
感作抗原で免疫される哺乳動物としては、 特に限定されるものではないが、 細 胞融合に使用する親細胞との適合性を考慮して選択するのが好ましく、 一般的に はげつ歯類の動物、 例えば、 マウス、 ラット、 ハムスター、 あるいはゥサギ、 サ ル等が使用される。
感作抗原を動物に免疫するには、 公知の方法にしたがって行われる。 例えば、 一般的方法として、 感作抗原を哺乳動物の腹腔内または皮下に注射することによ り行われる。 具体的には、 感作抗原を PBS (Phosphate-Buf fered Sal ine) や生理 食塩水等で適当量に希釈、 懸濁したものに所望により通常のアジュバント、 例え ばフロイント完全アジュバントを適量混合し、 乳化後、 哺乳動物に 4〜21日毎に 数回投与する。 また、 感作抗原免疫時に適当な担体を使用することもできる。 特 に分子量の小さい部分ペプチドを感作抗原として用いる場合には、 アルブミン、 キーホールリンぺッ卜へモシァニン等の担体タンパク質と結合させて免疫するこ とが望ましい。
このように哺乳動物を免疫し、 血清中に所望の抗体レベルが上昇するのを確認 した後に、 哺乳動物から免疫細胞を採取し、 細胞融合に付されるが、 好ましい免 疫細胞としては、 特に脾細胞が挙げられる。
前記免疫細胞と融合される他方の親細胞として、 哺乳動物のミエローマ細胞を 用いる。 このミエローマ細胞は、 公知の種々の細胞株、 例えば、 P3 ( P3x63Ag8. 653 ) ( J. Immnol. ( 1979 ) 123, 1548-1550 ) 、 P3x63Ag8U. 1 (Current Topics in Microbiol ogy and Immunology ( 1978) 81, 1-7) 、 NS-1 (Kohler. G. and Mi l s te in, C. Eur. J. I龍 unol. ( 1976) 6, 511-519) 、 MPC-
11 (Margul ies. D. H. et al. , Ce l l ( 1976) 8, 405-415) 、 SP2/0 (S ulman, M. et al. , ature (1978) 276, 269-270) 、 F0 (de St. Groth, S. F. et al. , J.
Immunol. Me thods ( 1980) 35, 1-21) 、 S194 (Trowbridge, I. S. J. Exp. Med. ( 1978) 148， 313-323) 、 R210 (Gal f re, G. et al. , Nature ( 1979) 277, 131-
133) 等が好適に使用される。
前記免疫細胞とミエローマ細胞との細胞融合は、 基本的には公知の方法、 たと えば、 ケーラーとミルスティンらの方法 （Kohler. G. and Mi l s te in, 、
Methods Enzymol. ( 1981) 73, 3 - 46) 等に準じて行うことができる。
より具体的には、 前記細胞融合は、 例えば細胞融合促進剤の存在下に通常の栄 養培養液中で実施される。 融合促進剤としては、 例えばポリエチレングリコール (PEG) 、 センダイウィルス （HVJ) 等が使用され、 更に所望により融合効率を高 めるためにジメチルスルホキシド等の補助剤を添加使用することもできる。
免疫細胞とミエローマ細胞との使用割合は任意に設定することができる。 例え ば、 ミエローマ細胞に対して免疫細胞を 1〜10倍とするのが好ましい。 前記細胞 融合に用いる培養液としては、 例えば、 前記ミエローマ細胞株の増殖に好適な
RPMI 1640培養液、 MEM培養液、 その他、 この種の細胞培養に用いられる通常の培 養液が使用可能であり、 さらに、 牛胎児血清 （FCS) 等の血清補液を併用するこ ともできる。
細胞融合は、 前記免疫細胞とミエローマ細胞との所定量を前記培養液中でよく 混合し、 予め 37°C程度に加温した PEG溶液 （例えば平均分子量 1000〜6000程度） を通常 30〜60 % (w/v) の濃度で添加し、 混合することによって目的とする融合 細胞 （ハイブリド一マ） を形成する。 続いて、 適当な培養液を逐次添加し、 遠心 して上清を除去する操作を繰り返すことによりハイプリドーマの生育に好ましく ない細胞融合剤等を除去する。 このようにして得られたハイプリドーマは、 通常の選択培養液、 例えば HAT培 養液 （ヒポキサンチン、 アミノプテリンおよびチミジンを含む培養液） で培養す ることにより選択される。 上記 HAT培養液での培養は、 目的とするハイプリ ドー マ以外の細胞 （非融合細胞） が死滅するのに十分な時間 （通常、 数日〜数週間） 継続する。 ついで、 通常の限界希釈法を実施し、 目的とする抗体を産生するハイ ブリドーマのスクリーニングおよび単一クローニングを行う。
目的とする抗体のスクリーニングおよび単一クローニングは、 公知の抗原抗体 反応に基づくスクリーニング方法で行えばよい。 例えば、 ポリスチレン等ででき たビーズや市販の 96ゥエルのマイクロタイタープレート等の担体に抗原を結合さ せ、 ハイプリドーマの培養上清と反応させ、 担体を洗浄した後に酵素標識第 2次 抗体等を反応させることにより、 培養上清中に感作抗原と反応する目的とする抗 体が含まれるかどうか決定できる。 目的とする抗体を産生するハイプリ ドーマを 限界希釈法等によりクローニングすることができる。 この際、 抗原としては免疫 に用いたものを用いればよく、 また例えば GPC3の N端断片に対する抗体を得よう とする場合は、 N端断片をスクリーニング用抗原として用いればよい。
また、 ヒト以外の動物に抗原を免疫して上記ハイプリドーマを得る他に、 ヒト リンパ球を in vi t roで GPC3に感作し、 感作リンパ球をヒト由来の永久分裂能を有 するミエローマ細胞と融合させ、 GPC3への結合活性を有する所望のヒ卜抗体を得 ることもできる （特公平卜 59878号公報参照） 。 さらに、 ヒト抗体遺伝子の全て のレバートリーを有するトランスジエニック動物に抗原となる GPC3を投与して抗 GPC3抗体産生細胞を取得し、 これを不死化させた細胞から GPC3に対するヒト抗体 を取得してもよい （国際特許出願公開番号 W0 94/25585 号公報、 W0 93/12227 号 公報、 W0 92/03918 号公報、 W0 94/02602 号公報参照） 。
このようにして作製されるモノクローナル抗体を産生するハイプリドーマは、 通常の培養液中で継代培養することが可能であり、 また、 液体窒素中で長期保存 することが可能である。
当該八イブリドーマからモノクローナル抗体を取得するには、 当該ハイプリド 一マを通常の方法に従い培養し、 その培養上清として得る方法、 あるいはハイブ リドーマをこれと適合性がある哺乳動物に投与して増殖させ、 その腹水として得 る方法などが採用される。 前者の方法は、 高純度の抗体を得るのに適しており、 一方、 後者の方法は、 抗体の大量生産に適している。
本発明では、 モノクローナル抗体として、 抗体遺伝子をハイプリドーマからク ローニングし、 適当なベクタ一に組み込んで、 これを宿主に導入し、 遺伝子組換 え技術を用いて産生させた組換え型のものを用いることができる （例えば、
Vandamme, A. M. et al. , Eur. J. Biochem. (1990) 192, 767-775, 1990参照） 。 具体的には、 抗 GPC3抗体を産生するハイプリ ドーマから、 抗 GPC3抗体の可変 (V) 領域をコードする mRNAを単離する。 mRNAの単離は、 公知の方法、 例えば、 グァニジン超遠心法 （Chirgwin, J. M. et al. , Biochemistry ( 1979) 18， 5294-5299) 、 AGPC法 (Chomczynski, P. et al. , Anal. Biochem. ( 1987) 162, 156-159) 等により行って全 RNAを調製し、 mRNA Purification Kit (Pharmacia 製） 等を使用して目的の mRNAを調製する。 また、 QuickPrep mRNA Purification Kit (Pharmacia製） を用いることにより mRNAを直接調製することもできる。
得られた mRNAから逆転写酵素を用いて抗体 V領域の cDNAを合成する。 cDNAの合 成は、 AMV Reverse Transcriptase First-strand cDNA Synthesis Kit (生化学 工業社製） 等を用いて行う。 また、 cDNAの合成および増幅を行うには、 5'- A即 li FINDER RACE Kit (Clontech製） および PCRを用いた 5' -RACE法 (Frohman, M. A. et al. , Pro Natl. Acad. Sci. USA (1988) 85, 8998—9002、 Belyavsky, A. et al. , Nucleic Acids Res. (1989) 17, 2919-2932) 等を使用することができる。 得られた PCR産物から目的とする DNA断片を精製し、 ベクター DNAと連結する。 さらに、 これより組換えベクターを作製し、 大腸菌等に導入してコロニーを選択 して所望の組換えべクタ一を調製する。 そして、 目的とする DNAの塩基配列を公 知の方法、 例えば、 ジデォキシヌクレオチドチエイン夕ーミネ一シヨン法等によ り確認する。
目的とする抗 GPC3抗体の V領域をコードする DNAを得たのち、 これを、 所望の抗 体定常領域 （C領域） をコードする DNAを含有する発現ベクターへ組み込む。
本発明で使用される抗 GPC3抗体を製造するには、 抗体遺伝子を発現制御領域、 例えば、 ェンハンサー、 プロモーターの制御のもとで発現するよう発現ベクター に組み込む。 次に、 この発現ベクターにより、 宿主細胞を形質転換し、 抗体を発 現させる。
抗体遺伝子の発現は、 抗体重鎖 （H鎖） または軽鎖 Oil) をコードする DNAを 別々に発現ベクターに組み込んで宿主細胞を同時形質転換させてもよいし、 ある いは H鎖および L鎖をコードする DNAを単一の発現ベクターに組み込んで宿主細胞 を形質転換させてもよい （TO 94/11523 号公報参照） 。
また、 組換え型抗体の産生には上記宿主細胞だけではなく、 トランスジェニッ ク動物を使用することができる。 例えば、 抗体遺伝子を、 乳汁中に固有に産生さ れるタンパク質 （ャギ j3カゼインなど） をコードする遺伝子の途中に揷入して融 合遺伝子として調製する。 抗体遺伝子が挿入された融合遺伝子を含む DNA断片を ャギの胚へ注入し、 この胚を雌のャギへ導入する。 胚を受容したャギから生まれ るトランスジエニックャギまたはその子孫が産生する乳汁から所望の抗体を得る。 また、 トランスジエニックャギから産生される所望の抗体を含む乳汁量を増加さ せるために、 適宜ホルモンをトランスジエニックャギに使用してもよい （Ebert, K. M. et al. , Bio/Technology ( 1994) 12, 699-702) 。
本発明では、 上記抗体のほかに、 人為的に改変した遺伝子組換え型抗体、 例え ば、 キメラ抗体、 ヒト型化 （Humanized) 抗体を使用できる。 これらの改変抗体 は、 既知の方法を用いて製造することができる。
キメラ抗体は、 前記のようにして得た抗体 V領域をコードする DNAをヒト抗体 C 領域をコードする DNAと連結し、 これを発現ベクターに組み込んで宿主に導入し 産生させることにより得られる。 この既知の方法を用いて、 本発明に有用なキメ ラ抗体を得ることができる。
ヒト型化抗体は、 再構成 （reshaped) ヒト抗体とも称され、 これは、 ヒト以外 の哺乳動物、 例えばマウス抗体の相補性決定領域 （CDR; co即 lenient ari ty determining region) をヒト抗体の相補性決定領域へ移植したものであり、 その 一般的な遺伝子組換え手法も知られている （欧州特許出願公開番号 EP 125023号 公報、 W0 96/02576 号公報参照） 。 具体的には、 マウス抗体の CDRとヒト抗体のフレームワーク領域 （framework region； FR) とを連結するように設計した DNA配列を、 CDR及び FR両方の末端領域 にオーバーラップする部分を有するように作製した数個のオリゴヌクレオチドを プライマーとして用いて PCR法により合成する W098/13388号公報に記載の方法を 参照）。
CDRを介して連結されるヒト抗体のフレームワーク領域は、 相補性決定領域が 良好な抗原結合部位を形成するものが選択される。 必要に応じ、 再構成ヒト抗体 の相補性決定領域が適切な抗原結合部位を形成するように、 抗体の可変領域にお けるフレームワーク領域のアミノ酸を置換してもよい （Sato, K. et al. , Cancer Res. (1993) 53, 851-856) 。
キメラ抗体及びヒト型化抗体の C領域には、 ヒト抗体のものが使用され、 例え ば H鎖では、 Cァ 1、 C r 2、 C T 3、 C T 4を、 L鎖では C /c、 C λを使用す ることができる。 また、 抗体またはその産生の安定性を改善するために、 ヒ卜抗 体 C領域を修飾してもよい。
キメラ抗体は、 ヒ卜以外の哺乳動物由来抗体の可変領域とヒト抗体由来の定常 領域とからなる。 一方、 ヒト型化抗体は、 ヒト以外の哺乳動物由来抗体の相補性 決定領域と、 ヒ卜抗体由来のフレームワーク領域および C領域とからなる。 ヒト 型化抗体はヒ卜体内における抗原性が低下されているため、 本発明の治療剤の有 効成分として有用である。
本発明で使用される抗体は、 抗体の全体分子に限られず、 GPC3に結合する限り、 抗体の断片又はその修飾物であってもよく、 二価抗体も一価抗体も含まれる。 例 えば、 抗体の断片としては、 Fab、 F (ab' ) 2、 Fv、 1個の Fabと完全な Fcを有する Fab/c、 または H鎖若しくは L鎖の Fvを適当なリンカーで連結させたシングルチ ェイン Fv (scFv) が挙げられる。 具体的には、 抗体を酵素、 例えばパパイン、 ぺ プシンで処理し抗体断片を生成させるか、 または、 これら抗体断片をコードする 遺伝子を構築し、 これを発現ベクターに導入した後、 適当な宿主細胞で発現させ る （例えば、 Co, M. S. et al. , J. I龍 unol. ( 1994) 152, 2968—2976、 Bet ter, M. & Horwi tz, A. H. Methods in Enzymology ( 1989) 178, 476-496, Academic Press, In 、 Plueckthun, A. & Skerra, A. Me thods in Enzymology ( 1989) 178, 476-496, Academic Press, In 、 Lamoyi, E. , Me thods in Enzymology ( 1989 ) 121, 652-663 、 Rousseaux, J. et al. , Methods in Enzymology ( 1989 ) 121, 663-669、 Bi rd, R. E. et al. , TIBTECH ( 1991 ) 9, 132- 137参 照） 。
scFvは、 抗体の H鎖 V領域と L鎖 V領域とを連結することにより得られる。 この scFvにおいて、 H鎖 V領域と L鎖 V領域は、 リンカ一、 好ましくはペプチドリンカ一 を介して連結される （Hus ton, J. S. et al. 、 Pro Nat l. Acad. Sc i. U. S. A.
( 1988) 85, 5879-5883) 。 scFvにおける H鎖 V領域および L鎖 V領域は、 本明細書 に抗体として記載されたもののいずれの由来であってもよい。 V領域を連結する ペプチドリンカ一としては、 例えばアミノ酸 12〜 19残基からなる任意の一本鎖べ プチドが用いられる。
scFvをコードする DNAは、 前記抗体の H鎖または H鎖 V領域をコードする DNA、 お よび L鎖または L鎖 V領域をコードする DNAのうち、 それらの配列のうちの全部又は 所望のアミノ酸配列をコードする DNA部分を錶型とし、 その両端を規定するブラ イマ一対を用いて PCR法により増幅し、 次いで、 さらにペプチドリンカ一部分を コードする DNA、 およびその両端が各々 H鎖、 L鎖と連結されるように規定するプ ライマー対を組み合せて増幅することにより得られる。
また、 一旦 scFvをコードする DNAが作製されると、 それらを含有する発現べク ター、 および該発現べクタ一により形質転換された宿主を常法に従って得ること ができ、 また、 その宿主を用いることにより、 常法に従って scFvを得ることがで きる。
これら抗体の断片は、 前記と同様にしてその遺伝子を取得し発現させ、 宿主に より産生させることができる。 本発明における 「抗体」 にはこれらの抗体の断片 も包含される。
抗体の修飾物として、 標識物質等の各種分子と結合した抗グリピカン抗体を使 用することもできる。 本発明における 「抗体」 にはこれらの抗体修飾物も包含さ れる。 このような抗体修飾物は、 得られた抗体に化学的な修飾を施すことによつ て得ることができる。 なお、 抗体の修飾方法はこの分野においてすでに確立され ている。
さ らに、 本発明で使用される抗体は、 二重特異性抗体 （bi spec i f ic ant ibody) であってもよい。 二重特異性抗体は GPC3分子上の異なるェピトープを 認識する抗原結合部位を有する二重特異性抗体であってもよいし、 一方の抗原結 合部位が GPC3を認識し、 他方の抗原結合部位が標識物質等を認識してもよい。 二 重特異性抗体は 2種類の抗体の HL対を結合させて作製することもできるし、 異な るモノクローナル抗体を産生するハイプリドーマを融合させて二重特異性抗体産 生融合細胞を作製し、 得ることもできる。 さらに、 遺伝子工学的手法により二重 特異性抗体を作製することも可能である。
前記のように構築した抗体遺伝子は、 公知の方法により発現させ、 取得するこ とができる。 哺乳類細胞の場合、 常用される有用なプロモーター、 発現させる抗 体遺伝子、 その 3'側下流にポリ Aシグナルを機能的に結合させて発現させること ができる。 例えばプロモー夕一 Zェンハンサ一としては、 ヒトサイトメガロウイ ルス前期プロモーター /ェンハンサー ( human cytomegalovi rus immed iate early promoter/enhancer) を挙けることができる。
また、 その他に本発明で使用される抗体発現に使用できるプロモーター Zェン ハンサーとして、 レトロウイルス、 ポリオ一マウィルス、 アデノウィルス、 シミ アンウィルス 40 (SV40) 等のウィルスプロモーター Zェンハンサ一、 あるいはヒ トェロンゲーシヨンファクター la (HEF la) などの哺乳類細胞由来のプロモータ 一/ェンハンサ一等が挙げられる。
SV40プロモーター/ェンハンサーを使用する場合は Mul l iganらの方法 （Nature ( 1979) 277, 108) により、 また、 HEFlaプロモータ一 Zェンハンサーを使用す る場合は Mizushimaらの方法 (Nucle ic Acids Res. ( 1990) 18, 5322) により、 容易に遺伝子発現を行うことができる。
大腸菌の場合、 常用される有用なプロモーター、 抗体分泌のためのシグナル配 列及び発現させる抗体遺伝子を機能的に結合させて当該遺伝子を発現させること ができる。 プロモーターとしては、 例えば l aczプロモ一夕一、 araBプロモーター を挙げることができる。 l aczプロモーターを使用する場合は Wardらの方法 (Nature ( 1098) 341， 544-546 ； FASEB J. ( 1992) 6， 2422-2427) により、 あ るいは araBプロモーターを使用する場合は Be t terらの方法 （Sc ience ( 1988) 240, 1041-1043) により発現することができる。
抗体分泌のためのシグナル配列としては、 大腸菌のペリブラズムに産生させる 場合、 pelBシグナル配列 （Lei， S. P. e t al J. Bac ter iol. ( 1987 ) 169, 4379) を使用すればよい。 そして、 ペリブラズムに産生された抗体を分離した後、 抗体の構造を適切に組み直して （refold) 使用する。
複製起源としては、 SV40、 ポリオ一マウィルス、 アデノウイルス、 ゥシパピ口 一マウィルス （BPV) 等の由来のものを用いることができ、 さらに、 宿主細胞系 で遺伝子コピー数増幅のため、 発現べクタ一は、 選択マ一力一としてアミノグリ コシドトランスフェラーゼ （APH) 遺伝子、 チミジンキナーゼ （TK) 遺伝子、 大 腸菌キサンチングァニンホスホリポシルトランスフェラーゼ （Ecogpt) 遺伝子、 ジヒドロ葉酸還元酵素 （dhf r) 遺伝子等を含むことができる。
本発明で使用される抗体の製造のために、 任意の発現系、 例えば真核細胞又は 原核細胞系を使用することができる。 真核細胞としては、 例えば樹立された哺乳 類細胞系、 昆虫細胞系、 真糸状菌細胞および酵母細胞などの動物細胞等が挙げら れ、 原核細胞としては、 例えば大腸菌細胞等の細菌細胞が挙げられる。
好ましくは、 本発明で使用される抗体は、 哺乳類細胞、 例えば CH0、 COS, ミエ ローマ、 BHK、 Vero、 HeLa細胞中で発現される。
次に、 形質転換された宿主細胞を in vi troまたは in vivoで培養して目的とす る抗体を産生させる。 宿主細胞の培養は公知の方法に従い行う。 例えば、 培養液 として、 DMEM、 MEM, RPMI 1640、 IMDMを使用することができ、 牛胎児血清 （FCS) 等の血清補液を併用することもできる。
前記のように発現、 産生された抗体は、 細胞、 宿主動物から分離し均一にまで 精製することができる。 本発明で使用される抗体の分離、 精製はァフィ二ティー カラムを用いて行うことができる。 例えば、 プロテイン Aカラムを用いたカラム として、 Hyper D、 P0R0S、 Sepharose F. F. (Pharmacia製） 等が挙げられる。 そ の他、 通常のタンパク質で使用されている分離、 精製方法を使用すればよく、 何 ら限定されるものではない。 例えば、 上記ァフィ二ティーカラム以外のクロマト グラフィーカラム、 フィルタ一、 限外濾過、 塩析、 透析等を適宜選択、 組み合わ せることにより、 抗体を分離、 精製することができる （Ant ibodies A Laboratory Manual. Ed Harlow, David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988) 。
2 . GPC3の検出
本発明において検出する GPC3は、 特に限定されず、 全長 GPC3でも、 その断片で もよい。 GPC3断片を検出する場合には、 N端断片でも C端断片でもよいが、 好ま しくは N端断片である。 又、 へパラン硫酸などが付加された GPC3タンパク質でも、 GPC3コアタンパク質でもよい。
被検試料に含まれる GPC3タンパク質の検出方法は特に限定されないが、 抗 GPC3 抗体を用いた免疫学的方法により検出することが好ましい。 免疫学的方法として は、 例えば、 ラジオィムノアツセィ、 ェンザィムィムノアツセィ、 蛍光ィムノア ッセィ、 発光ィムノアツセィ、 免疫沈降法、 免疫比濁法、 ウエスタンプロット、 免疫染色、 免疫拡散法などを挙げることができるが、 好ましくはェンザィムィム ノアッセィであり、 特に好ましいのは酵素結合免疫吸着定量法（enzyme- l inked immunosorbent assay： ELISA) (例えば、 sandwich EL ISA) である。 ELISAなどの 上述した免疫学的方法は当業者に公知の方法により行うことが可能である。
抗 GPC3抗体を用いた一般的な検出方法としては、 例えば、 抗 GPC3抗体を支持体 に固定し、 ここに被検試料を加え、 インキュベートを行い抗 GPC3抗体と GPC3タン パク質を結合させた後に洗浄して、 抗 GPC3抗体を介して支持体に結合した GPC3タ ンパク質を検出することにより、 被検試料中の GPC3タンパク質の検出を行う方法 を挙げることができる。
本発明において用いられる支持体としては、 例えば、 ァガロース、 セルロース などの不溶性の多糖類、 シリコン樹脂、 ポリスチレン樹脂、 ポリアクリルアミド 樹脂、 ナイロン樹脂、 ポリカーポネイト樹脂などの合成樹脂や、 ガラスなどの不 溶性の支持体を挙げることができる。 これらの支持体は、 ビーズやプレー卜など の形状で用いることが可能である。 ビーズの場合、 これらが充填されたカラムな どを用いることができる。 プレートの場合、 マルチウエルプレート （96穴マルチ ゥエルプレート等） 、 やバイオセンサ一チップなどを用いることができる。 抗 GPC3抗体と支持体との結合は、 化学結合や物理的な吸着などの通常用いられる方 法により結合することができる。 これらの支持体はすべて市販のものを用いるこ とができる。
抗 GPC3抗体と GPC3タンパク質との結合は、 通常、 緩衝液中で行われる。 緩衝液 としては、 例えば、 リン酸緩衝液、 Tris緩衝液、 クェン酸緩衝液、 ホウ酸塩緩衝 液、 炭酸塩緩衝液、 などが使用される。 また、 インキュベーションの条件として は、 すでによく用いられている条件、 例えば、 4 °C〜室温にて 1時間〜 24時間の インキュベーションが行われる。 インキュベート後の洗浄は、 GPC3タンパク質と 抗 GPC3抗体の結合を妨げないものであれば何でもよく、 例えば、 Tween20等の界 面活性剤を含む緩衝液などが使用される。
本発明の GPC3タンパク質検出方法においては、 GPC3タンパク質を検出したい被 検試料の他に、 コントロール試料を設置してもよい。 コントロール試料としては、 GPC3タンパク質を含まない陰性コント口ール試料や GPC3夕ンパク質を含む陽性コ ントロール試料などがある。 この場合、 GPC3タンパク質を含まない陰性コント口 ール試料で得られた結果、 GPC3夕ンパク質を含む陽性コントロール試料で得られ た結果と比較することにより、 被検試料中の GPC3タンパク質を検出することが可 能である。 また、 濃度を段階的に変化させた一連のコントロール試料を調製し、 各コントロール試料に対する検出結果を数値として得て、 標準曲線を作成し、 被 検試料の数値から標準曲線に基づいて、 被検試料に含まれる GPC3タンパク質を定 量的に検出することも可能である。
抗 GPC3抗体を介して支持体に結合した GPC3タンパク質の検出の好ましい態様と して、 標識物質で標識された抗 GPC3抗体を用いる方法を挙げることができる。 例えば、 支持体に固定された抗 GPC3抗体に被検試料を接触させ、 洗浄後に、 GPC3タンパク質を特異的に認識する標識抗体を用いて検出する。 抗 GPC3抗体の標識は通常知られている方法により行うことが可能である。 標識 物質としては、 蛍光色素、 酵素、 補酵素、 化学発光物質、 放射性物質などの当業 者に公知の標識物質を用いることが可能であり、 具体的な例としては、 ラジオァ イソト一プ（32P、 14C、 125I、 ¾、 1311など）、 フルォレセイン、 ローダミン、 ダンシ ルクロリド、 ゥンベリフエロン、 ルシフェラーゼ、 ペルォキシダ一ゼ、 アルカリ ホスファターゼ、 jS -ガラクトシダーゼ、 3 -ダルコシダ一ゼ、 ホ一スラディッシ ュパーォキシダ一ゼ、 ダルコアミラーゼ、 リゾチーム、 サッカリドォキシダーゼ、 マイクロペルォキシダ一ゼ、 ピオチンなどを挙げることができる。 標識物質とし てビォチンを用いる場合には、 ビォチン標識抗体を添加後に、 アルカリホスファ 夕一ゼなどの酵素を結合させたアビジンをさらに添加することが好ましい。 標識 物質と抗 GPC3抗体との結合には、 ダルタルアルデヒド法、 マレイミド法、 ピリジ ルジスルフイド法、 過ヨウ素酸法、 などの公知の方法を用いることができる。 具体的には、 抗 GPC3抗体を含む溶液をプレートなどの支持体に加え、 抗 GPC3抗 体を支持体に固定する。 プレートを洗浄後、 タンパク質の非特異的な結合を防ぐ ため、 例えば BSA、 ゼラチン、 アルブミンなどでブロッキングする。 再び洗浄し、 被検試料をプレートに加える。 インキュベートの後、 洗浄し、 標識抗 GPC3抗体を 加える。 適度なインキュベーションの後、 プレートを洗浄し、 プレートに残った 標識抗 GPC3抗体を検出する。 検出は当業者に公知の方法により行うことができ、 例えば、 放射性物質による標識の場合には液体シンチレ一シヨンや RIA法により 検出することができる。 酵素による標識の場合には基質を加え、 基質の酵素的変 化、 例えば発色を吸光度計により検出することができる。 基質の具体的な例とし ては、 2, 2-アジノビス （3-ェチルベンゾチアゾリン- 6 -スルホン酸） ジアンモニ ゥム塩 （ABTS) 、 1, 2-フエ二レンジァミン （オルソ-フエ二レンジァミン） 、 3, 3', 5， 5'-テトラメチルベンジジン （TME) などを挙げることができる。 蛍光物質 の場合には蛍光光度計により検出することができる。
本発明の GPC3タンパク質検出方法の特に好ましい態様として、 ピオチンで標識 された抗 GPC3抗体及びアビジンを用いる方法を挙げることができる。
具体的には、 抗 GPC3抗体を含む溶液をプレートなどの支持体に加え、 抗 GPC3抗 体を固定する。 プレートを洗浄後、 タンパク質の非特異的な結合を防ぐため、 例 えば BSAなどでブロッキングする。 再び洗浄し、 被検試料をプレートに加える。 インキュベートの後、 洗浄し、 ピオチン標識抗 GPC3抗体を加える。 適度なインキ ュベーシヨンの後、 プレートを洗浄し、 アル力リホスファターゼ、 ペルォキシダ ーゼなどの酵素と結合したアビジンを加える。 インキュベーション後、 プレート を洗浄し、 アビジンに結合している酵素に対応した基質を加え、 基質の酵素的変 化などを指標に GPC3タンパク質を検出する。
本発明の GPC3タンパク質検出方法の他の態様として、 GPC3タンパク質を特異的 に認識する一次抗体、 及び該一次抗体を特異的に認識する二次抗体を用いる方法 を挙げることができる。
例えば、 支持体に固定された抗 GPC3抗体に被検試料を接触させ、 インキュベー シヨンした後、 洗浄し、 洗浄後に結合している GPC3タンパク質を、 一次抗 GPC3抗 体及び該一次抗体を特異的に認識する二次抗体により検出する。 この場合、 二次 抗体は好ましくは標識物質により標識されている。
具体的には、 抗 GPC3抗体を含む溶液をプレートなどの支持体に加え、 抗 GPC3抗 体を固定する。 プレートを洗浄後、 タンパク質の非特異的な結合を防ぐため、 例 えば BSAなどでブロッキングする。 再び洗浄し、 被検試料をプレートに加える。 インキュベートの後、 洗浄し、 一次抗 GPC3抗体を加える。 適度なインキュベーシ ョンの後、 プレートを洗浄し、 次いで一次抗体を特異的に認識する二次抗体を加 える。 適度なインキュベーションの後、 洗浄して、 プレートに残った二次抗体を 検出する。 二次抗体の検出は前述の方法により行うことができる。
本発明の GPC3タンパク質の検出方法の他の態様としては、 凝集反応を利用した 検出方法を挙げることができる。 該方法においては、 抗 GPC3抗体を感作した担体 を用いて GPC3を検出することができる。 抗体を感作する担体としては、 不溶性で、 非特異的な反応を起こさず、 かつ安定である限り、 いかなる担体を使用してもよ い。 例えば、 ラテックス粒子、 ベントナイト、 コロジオン、 カオリン、 固定羊赤 血球等を使用することができるが、 ラテックス粒子を使用するのが好ましい。 ラ テックス粒子としては、 例えば、 ボリスチレンラテックス粒子、 スチレン -ブ夕 ジェン共重合体ラテックス粒子、 ポリビエルトルエンラテックス粒子等を使用す ることができるが、 ポリスチレンラテックス粒子を使用するのが好ましい。 感作 した粒子を試料を混合し、 一定時間攪拌した後に、 試料中に GPC3抗体が高濃度で 含まれるほど粒子の凝集度が大きくなるので、 凝集を肉眼でみることにより GPC3 を検出することができる。 また、 凝集による濁度を分光光度計等により測定する ことによつても検出することが可能である。
本発明の GPC3タンパク質の検出方法の他の態様としては、 例えば、 表面プラズ モン共鳴現象を利用したバイオセンサーを用いた方法を挙げることができる。 表 面プラズモン共鳴現象を利用したバイォセンサーはタンパク質一タンパク質間の 相互作用を微量のタンパク質を用いてかつ標識することなく、 表面プラズモン共 鳴シグナルとしてリアルタイムに観察することが可能である。 例えば、 BIAcore (Pharmacia製） 等のバイォセンサーを用いることにより GPC3夕ンパク質と抗 GPC3抗体の結合を検出することが可能である。 具体的には、 抗 GPC3抗体を固定化 したセンサーチップに、 被検試料を接触させ、 抗 GPC3抗体に結合する GPC3タンパ ク質を共鳴シグナルの変化として検出することができる。
本発明の検出方法は、 種々の自動検査装置を用いて自動化することもでき、 一 度に大量の試料について検査を行うことも可能である。
本発明は、 癌の診断のための被検試料中の GPC3タンパク質を検出するための診 断薬またはキットの提供をも目的とするが、 該診断薬またはキットは少なくとも 抗 GPC3抗体を含む。 該診断薬またはキットが ELISA法に基づく場合は、 抗体を固 相化する担体を含んでいてもよく、 抗体があらかじめ担体に結合していてもよレ^ 該診断薬またはキッ卜がラテックス等の担体を用いた凝集法に基づく場合は抗体 が吸着した担体を含んでいてもよい。 また、 該キットは、 適宜、 ブロッキング溶 液、 反応溶液、 反応停止液、 試料を処理するための試薬等を含んでいてもよい。 図面の簡単な説明 図 1は、 Gene Chip を用いた GPC3 mRNAの発現解析の結果を示す図であり、 図
1 Aは GPC3の発現を、 図 1 Bはアルファフエトプロテイン （AFP) の発現を示す。 横軸の NL、 CH、 LC、 WD、 MDおよび PDはそれぞれ正常肝臓、 肝炎症部位、 肝硬変部 位、 高分化癌、 中分化癌および低分化癌を示す。
図 2は、 精製へパラン硫酸付加型の GPC3及び GPC3コアタンパク質の CBB染色像 を示す図である。
図 3は、 ヒト肝臓癌における GP.C3遺伝子の発現を示す図である。
図 4は、 抗 GPC3抗体を用いて行った可溶型コアタンパク質のウエスタンブロッ ティングの結果を示す図である。
図 5は、 抗 GPC3抗体を用いたサンドィツチ ELISAの原理を示す図である。
図 6は、 M6B1および M18D4を用いた GPC3サンドィツチ ELISAのスタンダードカー ブを示す図である。
図 7は、 GPC3の構造を示す模式図である。
図 8は、 ELISAにおける抗 GPC3抗体の組み合わせを示す図である。
図 9は、 様々な組み合わせの抗 GPC3抗体を用いた GPC3サンドィツチ ELISA系の スタンダードカーブを示す図である。 発明を実施するための最良の形態
以下、 実施例により、 本発明を具体的に説明する。 但し、 本発明はこれらの実 施例に限定されるものではない。
本願明細書記載の実施例において、 以下の材料を用いた。
可溶型 GPC3、 可溶型 GPC3コアタンパク質の発現ベクターとして、 pCAGGSに DHFR 遺伝子及びネオマイシン耐性遺伝子を組み込んだ pCXND2、 pCXND3を用いた。
DXB11は ATCCより購入した細胞を用い、 培養には 5%FBS(GIBC0 B L CAT* 10099- 141, 画 A0275242)/ Minimum Essential Medium Alpha medium ( MEM (+) ) (GIBCO BRL CAT* 12571-071)/ 1¾ Penicillin- Streptomycin (GIBCO BRL CAT# 15140 - 122)を用いた。 MB11を用いた発現株の選抜には、 500 Mg Geneticin (GIBCO BRL CAT* 10131-027)/ 5¾ FBS/ ひ MEM without ribonucleosides and deoxyribonucleosides (GIBCO BRL CAT# 12561-056) ( «ΜΕΜ (-））/ PSあるいは同 培地に終濃度 25nMとなるように ΜΠを加えたものを用いた。
HepG2は ATCCより購入した細胞を用い、 10% FBS /ダルベッコの改変イーグル培 地（Dulbecco's Modi f ied Eagle Med ium, DMEM) (GIBCO BRL CAT# 11995-065) / PSで培養を行った。
ハイブリド一マは 10%FBS / RPMI 1640 / 1 x HAT medi a supplement (SIGMA CA T# H - 0262) / 0. 5 x BM-Cond imed HI Hybridoma c loning suppl ement (Roche CA T# 1088947)で培養した。 実施例 1 ヒト GPC3 (GPC3) cDNAのクローニングおよび発現解析
ヒトグリピカン 3 (以下 GPC3) をコードする全長 cDNAのクローニング
ヒ卜 GPC3をコードする全長 cDNAは、 大腸癌細胞株 Caco2より常法により調製し た 1s t s t rand cDNAを錶型とし、 Advantage2 ki t (CL0NTECH社 Cat. No. 8430 -
1) を用いた PCR反応により増幅した。 すなわち、 2 1の &(；02由来じ0八、 1 1の センスプライマー （配列番号 1 ) 、 1 1のアンチセンスプライマー (配列番号
2) 、 5 1の Advantage2 lOxPCR buf fer, 8 1の dNTP mix (1. 25 mM)、 1. O Iの Advantage polymerase Mixを含む 50 1の反応液を、 94 。(：で 1分、 63 °Cで 30秒、 68 °Cで 3分からなるサイクルを 35回行った。 PCR反応による増幅産物は （pGEM - T Easy Vec tor Sys tem I (Promega社 Cat. No. A1360) を用いて TAベクター pGEM- T easyに揷入した） ABI3100 DNAシーケンサーを用い配列の確認を行った結果、 ヒ ト GPC3の全長をコ一ドする cDNAを単離した。 配列番号 3で表される配列はヒト GPC3遺伝子の塩基配列を、 配列番号 4で表される配列はヒト GPC3タンパク質のァ ミノ酸配列を示す。 配列番号 1 ： GATATC- ATGGCCGGGACCGTGCGCACCGCGT
配列番号 2 ： GCTAGC-TCAGTGCACCAGGAAGAAGAAGCAC
GeneChipを用いたヒト GPC3 mRNA発現解析
24例の肝臓癌腫瘍部 （高分化癌: WD、 中分化癌: MD、 低分化癌: PD) 、 16例の肝 臓癌非癌部 （肝炎部位： CH、 肝硬変部位: LC) 、 8例の正常肝臓: NL (インフォーム ドコンセント取得済み、 東京大学医学部及び埼玉癌センターにおいて入手） にお ける mRNA発現解析を GeneChip™ UG-95A Targe t (Af fymet ryx社) を用いて行つ た。 すなわち、 上記各組織より IS0GEN (日本ジーン社） を用いてトータル RNAを 調製した後、 それぞれ 15 gの total RNA を使用し、 Express ion Analys is Technical Manual (Aiiymetryx社） に準じて遺伝子発現解析を行った。
その結果、 図 1に示すようにヒト GPC3遺伝子 （Probe Set ID： 39350— at) は肝 癌の分化の程度に関わらず多くの症例において mRNAの発現量が正常肝組織に比べ 明らかに高いことが確認された。 さらに、 現在最もよく肝癌の診断マーカーとし て使用されているアルファフエトプロテイン（Probe Set ID： 40114— at)の mRNA発 現と比較した結果、 アルファフエトプロティンの mRNA発現がほとんどみられな い高分化癌においても GPC3は十分な mRNAの発現の亢進が認められ、 かつ mRNA発現 亢進している割合が GPC3において高いことが明らかとなった。 以上のことより、 GPC3の検出は肝癌の早期診断法として有用と考えられる。 実施例 2 抗 GPC 3抗体の作製
可溶型ヒ卜 GPC3の作製
抗 GPC3抗体作製のための材料として、 C末端側の疎水性領域を欠損させた可溶 型 GPC3タンパク質を作製した。
東大先端研より供与された完全長ヒト GPC3 cDNAを含むプラスミド DNAを用い、 可溶型 GPC3 cDNA発現プラスミド DNAを構築した。 C末端側の疎水領域 （564-580 アミノ酸） を除くように設計した下流プライマー （5' - ATA GAA TTC CAC CAT GGC CGG GAC CGT GCG C -3' (配列番号 5 ) ) と EcoRI認識配列、 Kozak配列を加 えた上流プライマ一 （5' - ATA GGA TCC CTT CAG CGG GGA ATG AAC GTT C -3' (配列番号 6 ) を用いて PCRを行った。 得られた PCR断片（1711bp)を PCXND2- Flag にクローニングした。 作製された発現プラスミド DNAを CH0細胞 MB11株へ導入し、 500 /x g/mL Genet ic in での選抜により、 可溶型 GPC3高発現 CH0株を得た。
1700 cm2ローラ一ボトルを用い可溶型 GPC3高発現 CH0株の大量培養を行い、 培 養上清を回収し精製を行った。 培養上清を DEAE sepharose Fast Flow (Amersham
CAT# 17- 0709-01)にチャージし、 洗浄後、 500mM NaClを含むバッファ一により溶 出した。 次に、 Ant i-Flag M2 agarose af f ini ty gel (SIGMA CAT#A-2220) を用 いてァフィ二ティー精製を行った。 溶出は 200 g/mLの FLAGぺプチドにより行つ た。 Centriprep- 10 (Mi l l ipore CAT#4304) による濃縮後、 Superdex 200 HR 10/30 (Amersham CAT# Π - 1088-01)によるゲルろ過を行い FLAGペプチドを除去し た。 最後に DEAE sep arose Fast Flowカラムを用いて濃縮し、 同時に Tween20を 含まない PBS (500mMの NaClを含む） で溶出を行うことによりバッファー置換を行 つた。
可溶型ヒト GPC3コアタンパク質の作製
上記野生型ヒ卜 GPC3 cDNAをテンプレートとし、 アッセンブリー PCR法によって 495番目と 509番目の Serを Alaに置換させた cDNAを作製した。 この際、 C末端に H i sタグが付加されるようにプライマーを設計し、 得られた cDNAを p CXND3ベクタ 一にクロ一ニングした。 作製された発現プラスミド DNAを DXB11株へ導入し、 500 g/mL Genet ic in での選抜により、 可溶型 GPC3コアタンパク質高発現 CH0株を得 た。
1700 cm2ローラーボトルを用い大量培養を行い、 培養上清を回収し精製を行つ た。 培養上清を Q sepharose Fas t Flow (Amersham CAT* 17- 0510- 01)にチャージ し、 洗浄後、 500mM NaClを含むリン酸バッファ一により溶出した。 次に、 Chelat ing sepharose Fast Flow (Amersham CAT* Π-0575-Ol)を用いてァフィ二 ティ一精製を行った。 10〜 150 mMのイミダゾールでグラジェント溶出を行った。 最後に Q sepharose Fast Flow を用いて濃縮し、 500mM NaClを含むリン酸バッフ ァ一により溶出した。
SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果、 50〜300kDaのスメァなバンドと、 約 40kDaのバンドが得られた。 図 2に電気泳動の結果を示す。 GPC3は 69kDaの C末 端にへパラン硫酸付加配列を有するプロテオダリカンである。 スメァなバンドは へパラン硫酸修飾を受けた GPC3であると考えられた。 約 40kDaのバンドはァミノ 酸シークェンスの結果、 GPC3の N末端側断片を起点としており、 GPC3は何らかの 切断を受けていることが予想された。
以下のハイプリドーマのスクリーニングにおいてへパラン硫酸に対する抗体を 排除するため、 へパラン硫酸付加シグナル配列である 495番目と 509番目の Serを Alaに置換させた可溶型 GPC3コアタンパク質を作製した。 同様に CH0高発現株を構 築し、 培養上清より Hisタグを利用したァフィ二ティー精製を行った。 SDSポリア クリルアミドゲル電気泳動の結果、 70kDa、 40kDa、 30kDaの 3つのパンドが得られ た。 アミノ酸シークェンスの結果、 30kDaのバンドは GPC3の C末端側断片である ことが判明し、 GPC3は 358番目のアルギニンと 359番目のセリンの間で何らかの酵 素的な切断を受けていることが示された。 へパラン硫酸付加型 GPC3でこの 30kDa のバンドが見られなかつたのは、 へパラン硫酸が付加しているためスメァなバン ドになっていたためと思われる。 GPC3が特定のアミノ酸配列で酵素的な切断を受 けることは新しい知見であり、 生物学的意義に関しては明らかにされていない。 本発明者らは、 この結果より肝癌患者においても膜上の GPC3が切断を受け、 可 溶型として GPC3が血中に分泌されるという仮説を立てた。 GPC3は肝癌腫瘍マーカ 一である AFPと比較してより早期肝癌患者で遺伝子の発現が高値であることを見 出した （図 1 ) ので、 AFPより臨床的有用性の高い新しい腫瘍マーカーとしての 可能性について検討するため、 実施例 2以降に記載のように、 抗 GPC3抗体を作製 し、 サンドイッチ ELISA系を構築した。 抗 GPC3抗体の作製
ヒト GPC3とマウス GPC3のホモロジ一はアミノ酸レベルで 94%の高い相同性を示 すため、 通常のマウスに免疫しても抗 GPC3抗体を得難い可能性を考え、 自己免疫 疾患マウスである MRL/lprマウスを免疫動物として用いた。 MRL/lprマウス（CRL) 5 匹に可溶型 GPC3を免疫した。 初回免疫には免疫タンパク質を 100 x g/匹となるよ うに調製し、 FCA (フロイン卜完全アジュバント （H37 Ra) . Di fco (3113-60) 、 べクトンディッキンソン （cat#231131) ) を用いてェマルジヨン化したものを皮 下に投与した。 2週間後に 50 g/匹となるように調製したものを FIA (フロイント 不完全アジュバン ト、 Di fco ( 0639-60 ) 、 べク ト ンディ ッキンソ ン (cat#263910) ) でェマルジヨン化したものを皮下に投与した。 以降 1週間間隔 で追加免疫を合計 5回行った。 最終免疫については 匹となるように PBSに希 釈し尾静脈内に投与した。 GPC3コアタンパク質をコートしたィムノプレートを用 いた ELISAにより GPC3に対する血清中の抗体価が飽和しているのを確認後、 マゥ スミエローマ細胞 P3U1とマウス脾臓細胞を混合し、 PEG1500 (ロシュ '
ノスティック、 cat#783 641) により細胞融合を行った。 96穴培養プレートに播 種し、 翌日より HAT培地で選択後培養上清を ELISAでスクリーニングした。 陽性ク ローンについては限界希釈法によりモノクローン化した後、 拡大培養を行い培養 上清を回収した。 ELISAによるスクリーニングは、 GPC3コアタンパク質との結合 活性を指標に行い、 強い結合能を有する抗 GPC3抗体を 6クローン得た。
抗体の精製は Hi Trap ProteinG HP (Amersham CAT#17- 0404- 01)を用いて行った。 ハイブリド一マ培養上清を直接カラムにチャージし、 結合バッファー （20 リ ン酸ナトリウム （PH7.0) ) にて洗浄後、 溶出バッファー （0.1M グリシン- HC1 (pH2.7) ) で溶出した。 溶出は中和バッファー （1M Tris - HC1 (pH9.0) ) を加えた チューブに行い直ちに中和した。 抗体画分をプールした後、 0.05%Tween20/PBS で一昼夜透析を行いバッファー置換した。 精製された抗体は 0.02%となるように NaN3を添加した後、 4°Cで保管した。 抗 GPC3抗体の解析
抗体濃度はャギ抗マウス IgG (gamma) (ZYMED CAT# 62- 6600)とアルカリフォ スファ夕ーゼ一ャギ抗マウス IgG (gamma) (ZYMED CAT# 62- 6622)を用いたマウ ス IgGサンドイッチ ELISAを行い、 市販の精製マウス IgGl抗体 （ZYMED CAT#02- 6100) をスタンダードとして定量した。
抗 GPC3抗体のァイソタイ ビングは、 I匪 unoPure Monoclonal Antibody Isotyping Kit II (PIERCE CAT# 37502)を用い、 方法は添付のマニュアルに従つ た。 ァイソタイピングの結果全て IgGlタイプであった。
GPC3コアタンパク質を用いたウエスタンブロッテイングにより抗 GPC3抗体のェ ピトープ分類を行った。 100ng/レーンとなるように可溶型 GPC3コアタンパク質を 10%SDS- PAGE mini (TEFC0 CAT#0卜 075)にチャージし、 電気泳動 （60V 30min, 120V 90min) 後、 Trans— Blot SD Semi-Dry Electrophoret ic Transfer Cell (BIO-RAD)を用いてィモビロン- P (Millipore CATIIPVH R85 10) へトランスフ ァ一した（15V 60min)。 membraneを TBS- T (0.05% Tween20, TBS) で軽く洗った後、 5 スキムミルク入り TBS- Tで 1時間 （室温） あるいは一晩 （4°C ) 振とうした。 TBS- Tで約 10分間振とうした後、 1%スキムミルク入り TBS- Tで 0. l〜10 g/mLに希 釈した各抗 GPC3抗体を加え 1時間振とうした。 TBS- Tで洗い （10分間 x3回） 、 1% スキムミルク入り TBS- Tで 1. 1000に希釈した HRP-抗マウス IgG抗体 （Amersham CAT謂 A931) で 1時間振とう後、 TBS- Tで洗った （10分 x3回） 。 発色は ECL- Plus (Amersham RPN2132)を用いて行い、 Hyperii lm ECL (Amersham CAT# RPN2103K) を用いて現像した。 図 4にウェスタンプロット解析の結果を示す。 40kDaのバン ドに反応する抗体は N末端にェピトープを有し、 30kDaのバンドに反応する抗体 は C末端にェピトープを有すると判断し分類した。 N末端側を認識する抗体とし て M6B1、 M18D4、 M19B1 K C末端側を認識する抗体として M3C11、 M13B3, M3B8を 得た。 BIAC0REを用いた解析の結果、 各抗体の KD値は 0. 2〜17. 6nMであった。 実施例 3 可溶性 GPC3の検出
マウス異種移植 （xenograf t) モデル
6週令雌性の SCIDマウス （Fox CHASE C. Β-17/Icr-sc id Jc l、 日本クレア株式会 社） およびヌードマウス （BALB/cA Jcl-nu, 日本クレア株式会社） の腹部皮下へ ヒト肝癌 HepG2細胞を 300万個移植した。 腫瘤が充分に形成された 53日後に HepG2 移植 SCIDマウス #1， 3, 4の後大静脈より全採血し、 EDTA-2Naとァプロチニン存在下 (二プロネオチューブ真空採血管、 NIPR0、 NT- EA0205)で血漿を調製し、 測定日 まで- 20°Cで保管した。 なお、 HepG2移植 SCIDマウス #2は HepG2移植 62日後に、 HepG2移植ヌードマウス # 1, 2は移植 66日後に後大静脈より全採血した。 対照とし て、 同週令の正常 SCIDマウスから同様の操作で血漿を調製した。 サンドイッチ ELISA
血中の可溶型 GPC3を検出するため、 GPC3のサンドィツチ ELISA系を構築した。 96ゥエルプレートにコートする抗体には M6B1を、 M6B1に結合した GPC3を検出する 抗体としてピオチンで標識した M18D4を用いた。 発色には高い検出感度を達成す るため DAK0社の AMP AKを用いた。 96ゥエルィムノプレートに 10 g/mLとなるように抗 GPC3抗体をコーティングバ ッファー （0.1M NaHC03(pH9.6), 0.02% (w/v) NaN3) で希釈したものをコートし、 4°Cでー晚ィンキュベートした。 翌日 300 L/wellの洗浄バッファ一（0.05% (v/v) Tween20, PBS)で 3回洗浄後、 200 Lの希釈バッファー（50mM Tris- HCi (pH8.1) , lmM MgCl2> 150mM NaCl, 0.05% (v/v) Tween20, 0.02¾ (w/v) NaN3, 1% (w/v) BSA) を加えブロッキングを行った。 室温で数時間後、 あるいは 4°Cで一晩保管後、 マ ウス血漿、 あるいは培養上清を希釈バッファーで適当に希釈したものを加え 1時 間室温でインキュベートした。 300 L/ゥエルの RBで 3回洗浄後、 希釈バッファー で 102 g/mLとなるように希釈したピオチン標識した抗 GPC3抗体を加え 1時間室温 でインキュベートした。 300 L/ゥエルの RBで 3回洗浄後、 希釈バッファーで 1ノ 1000に希釈した AP-ストレプトアビジン （ZYMED) を加え、 1時間室温でインキュ ペートした。 300 L/wellの洗浄バッファーで 5回洗浄した後、 添付のプロトコ一 ルに従い AMPAK (DAK0 CAT#K6200) を用いて発色させ、 マイクロプレートリーダ 一で吸光度を測定した。
抗体のピオチン化には: Roche社の Biotin Labeling Kit (CAT* 1 418 165)を用 いた。 また、 サンプル中の可溶型 GPC3濃度の換算には、 表計算ソフト GlaphPad PRISM (GlaphPad software Inc. ver.3.0)を用いて解析した。 図 5に本実施例の サンドィツチ EL ISAの原理を示す。
精製可溶型 GPC3を用いてスタンダードカーブを作製した結果、 検出限界が数 ng/mLの系を構築することができた。 図 6に M6B1および M18D4を用いた GPC3サンド イッチ ELISAのスタンダードカーブを示した。 この系を用い、 前述の HepG2の培養 上清、 及びヒト肝癌 HepG2細胞を移植したマウス血清中の分泌型 GPC3の検出を試 みた。 コントロールの培地、 及びコントロールマウス血清では可溶型 GPC3は検出 限界以下であつたのに対し、 HepG2の培養上清、 及びヒト肝癌 HepG2細胞を移植し たマウス血清中に可溶型 GPC3が検出された。 精製可溶型 GPC3の濃度に換算すると、 HepG2培養上清では 1.2^g/mL、 マウス血清でも 23〜90ng/mLであった （表 1 ) 。 表 1
HepG2移植マウス plasma中の可溶型 GPC3濃度の測定（ng/mL
Figure imgf000028_0001
分泌型 GPC3の構造
先に立てた仮説通り GPC3が 358番目のアルギニンと 359番目のセリンとの間で切 断を受けて分泌されているかについて検討を行った。 分泌型 GPC3が N末端断片で あった場合、 N末端認識抗体と C末端認識抗体の組み合わせのサンドィツチ ELI SAでは検出できないと考えられる。 N末端断片を認識する抗体及び C末端側 断片を認識する抗体それぞれ 3種ずつを用いて、 様々な組み合わせのサンドィッ チ ELISA系を構築した。 図 7に分泌可溶化型 GPC3の構造を、 図 8に抗体の組み合 わせを示す。 図 9にこのサンドイッチ ELISAのスタンダードカーブを示す。 表 1 に測定結果を示すが、 表 1に示すように HepG2の培養上清、 及びヒト肝癌 HepG2細 胞を移植したマウス血清中の分泌型 GPC3の検出は N末端側断片認識抗体同士の組 み合わせでは高い値を示し、 C末端断片認識抗体を含む系では多くのマウスで検 出限界以下であった。 このことから、 今回明らかになった分泌型 GPC3は N末端断 片が優位であることが予想された。 産業上の利用可能性
実施例に示したように、 肝癌細胞で高発現している GPC3は一部分泌型として血 液中に存在する可能性が示された。 GPC3は肝癌マ一カーである AFPよりも早期の 癌で遺伝子発現が認められるので、 GPC3の検出は癌の診断として有用であると考 えられる。 GPC 3は肝癌細胞株以外に、 肺癌、 大腸癌、 乳癌、 前立腺癌、 膝臓癌、 リンパ腫などの癌細胞株においても発現が確認されているので、 肝癌以外の診断 にも適用できる可能性がある。
また、 分泌型の GPC3はアミノ酸 358番目のアルギニンと 359番目のセリンの間で 切断された N末端断片が優位である可能性が示された。 このことから診断用抗体 としては N末端断片認識抗体が有用と考えられる。 また、 ADCC活性及び CDC活性 を有する肝癌治療用抗体としては C末端断片認識抗体を用いれば、 血中の分泌型 G PC3にトラップされること無く効率的に肝癌細胞に到達することが可能であると 考えられる。
本明細書に引用されたすベての刊行物は、 その内容の全体を本明細書に取 り込むものとする。 また、 添付の請求の範囲に記載される技術思想および発 明の範囲を逸脱しない範囲内で本発明の種々の変形および変更が可能である ことは当業者には容易に理解されるであろう。 本発明はこのような変形およ び変更をも包含することを意図している。

Claims

請求の範囲
1 . 被検試料中の可溶化 GPC3タンパク質を検出することを特徴とする癌の診断方 法。
2 . 可溶化 GPC3タンパク質が、 GPC3の N端ペプチドである請求項 1記載の癌の診 断方法。
3 . GPC3の N端ペプチドが GPC3の第 1番目のアミノ酸から第 374番目のアミノ酸 からなるアミノ酸配列中または第 1番目のアミノ酸から第 358番目のアミノ酸か らなるアミノ酸配列中に含まれるペプチド断片である、 請求項 2記載の癌の診断 方法。
4 . 被検試料が血液、 血清、 血漿のいずれかである請求項 1から 3のいずれか 1 項に記載の診断方法。
5 . 肝臓癌である請求項 1から 4のいずれか 1項に記載の診断方法。
6 . 抗 GPC3抗体を用いることを特徴とする請求項 1から 5のいずれか 1項に記載 の方法。
7 . 支持体に固定した抗 GPC3抗体と標識物質で標識された抗 GPC3抗体を用いるこ とを特徴とする請求項 6記載の方法。
8 . 標識物質がピオチンである請求項 7記載の方法。
9 . 抗 GPC3抗体を含む癌の診断薬。
1 0 . 支持体に固定した抗 GPC3抗体と、 標識物質で標識された抗体を含むことを 特徴とする請求項 9記載の診断薬。
1 1. 肝臓癌である請求項 9又は 1 0記載の診断薬。
1 2. 抗 GPC3抗体が GPC3の N端ペプチドを認識することを特徴とする請求項 9か ら 1 1のいずれか 1項に記載の診断薬。
13. 抗 GPC3抗体を含む診断キット。
14. 支持体に固定した抗 GPC3抗体と、 標識物質で標識された抗体を含むことを 特徴とする請求項 13記載の診断キッ卜。
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