KR20050057205A

KR20050057205A - Ｇｐｃ3의 검출에 의한 암의 진단방법

Info

Publication number: KR20050057205A
Application number: KR1020057003814A
Authority: KR
Inventors: 히로유키 아부라타니; 유타카 미도리가와; 기요타카 나카노; 이와오 오이즈미; 유키오 이토; 스스무 토키타
Original assignee: 가부시키가이샤 페르세우스 프로테오믹스
Priority date: 2002-09-04
Filing date: 2003-09-04
Publication date: 2005-06-16
Also published as: US20150132782A1; AU2002330482A1; HK1079568A1; EP1548442B1; EP1548442A4; WO2004023145A1; CA2497418A1; JP4283227B2; AU2003261943A1; US9513292B2; US20060014223A1; DE60335813D1; CA2497418C; KR101043921B1; CN100554964C; WO2004038420A1; CN1678911A; ATE496301T1; AU2003261943B2; JPWO2004038420A1

Abstract

신규한 혈중 암 마커의 검출에 의한 암의 진단방법을 제공한다. 피검시료 중의 가용화 글리피칸3(soluble glypican3)을 검출함으로써 암을 진단할 수 있다.

Description

ＧＰＣ3의 검출에 의한 암의 진단방법{METHOD OF DIAGNOSING CANCER BY DETECTING GPC3}

본 발명은 혈중 가용성 암 마커에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로, 피검시료 중의 가용성 글리피칸3(GPC3)을 검출하여 암을 진단하는 방법에 관한 것이다.

세포표면 상에 존재하는 황산헤파란 프로테오글리칸(heparan sulfate proteoglycan)의 새로운 족(family)으로 글리피칸(glypican) 족의 존재가 보고되고 있다. 현재까지의 경우, 글리피칸 족의 단백질로는 5종류의 글리피칸(글리피칸1, 글리피칸2, 글리피칸3, 글리피칸4 및 글리피칸5)이 존재한다고 알려져 있는데, 이들 글리피칸 족의 단백질은 균일한 크기(약 60kDa)의 코어단백질을 가지고, 특이적으로 잘 보존된 시스테인의 서열을 공유하고 있으며, 글리코실 포스파티딜 이노시톨(GPI) 앵커에 의해 세포막에 결합하고 있다.

글리피칸3(GPC3)은 발생(development) 동안의 세포분열이나 그 패턴의 제어에 매우 깊이 관여하고 있음이 알려져 있다. 또한, GPC3 유전자가 간암세포에서 높은 발현을 보이고 있어, GPC3 유전자가 간세포암 마커로 이용될 수 있는 가능성이 있다고 알려져 있다.

이전에 본 발명자들은 항 GPC3 항체가 ADCC 활성 및 CDC 활성을 가지고 있어서 간암의 치료에 유용하다는 것을 확인하고 특허출원을 하였다(참조: 특원2001-189443).

그러나, GPC3은 막결합 단백질이며 분비형의 GPC3 단백질이 존재한다는 것은 보고되어 있지 않아서 GPC3 단백질 자체를 혈중의 암 마커로 이용할 수 있음은 검토되지 않았다.

도 1은 유전자칩(gene chip)을 이용한 GPC mRNA의 발현해석의 결과를 도시한 도면이며, 도 1A는 GPC3의 발현을, 도 1B는 알파페토프로틴(AFP: alpha-fetoprotein)의 발현을 도시한다. 횡축의 NL, CH, LC, WD, MD 및 PD는 각각 정상 간장, 간염증 부위, 간경변 부위, 고분화암, 중분화암 및 저분화암을 도시한다.

도 2는 정제 황산헤파란(heparan sulfate) 부가형의 GPC3 및 GPC3 코어단백질의 CBB 염색상을 도시한 표시한 도면이다.

도 3는 사람의 간암에서의 GPC3 유전자의 발현을 도시한 도면이다.

도 4는 항 GPC3 항체를 이용하여 수행한 가용형 코어단백질의 웨스턴 블로팅의 결과를 도시한 도면이다.

도 5는 항 GPC3 항체를 이용한 샌드위치 ELISA의 원리를 도시한 도면이다.

도 6은 M6B1 및 M18D4을 이용한 GPC3 샌드위치 ELISA의 표준곡선을 도시한 도면이다.

도 7은 GPC3의 구조를 도시한 모식도이다.

도 8은 ELISA에서의 항 GPC3 항체의 조합을 도시한 도면이다.

도 9는 여러가지 조합의 항 GPC3 항체를 이용한 GPC3 샌드위치 ELISA 시스템의 표준곡선을 도시한 도면이다.

발명의 개시

본 발명자들은 글리피칸3(GPC3)이 358번째의 아르기닌과 359번째의 세린 사이에서 절단된다는 사실을 확인하고, 가용형 GPC3가 간암환자의 혈중에 분비될 것이라는 가설을 세웠으며, GPC3 샌드위치 ELISA 시스템을 확립하고, GPC3 고발현인 사람 간암세포 HepG2의 배양 상등액 중에서 분비형 GPC3의 존재를 확인하였다. 또한, HepG2를 이식한 마우스 혈장만이 아니라, 사람 간암환자 혈청 중의 가용형 GPC3 측정에도 성공하였다. GPC3는 간암 마커인 AFP 보다도 조기의 간암에서 유전자 발현이 확인되기 때문에, GPC3의 검출은 암의 진단으로 유용하다고 생각된다. 또한, 가용형 GPC3은 C 말단 단편 쪽을 인식하는 항 GPC3 항체로는 검출하기 어려운 경향이 있기 때문에, 분비형 GPC3은 N 말단 펩티드 단편이 우위인 것으로 추정되었다. 따라서, N 말단을 인식하는 항 GPC3 항체를 이용하는 것이 바람직하다고 생각되어 더욱 예의검토하여, 본 발명을 완성시키기에 이르렀다.

GPC3는 간암세포주 이외에, 폐암, 대장암, 유방암, 전립선암, 췌장암, 림프종(lymphoma) 등의 암세포주에서도 발현이 확인되고 있어, 간암 이외의 진단에도 적용할 수 있을 가능성이 있다.

구체적으로, 본 발명은 이하와 같다.

(1) 피검시료 중의 가용화 GPC3 단백질을 검출하는 단계를 포함하는 암의 진단방법,

(2) 상기 가용화 GPC3 단백질은 GPC3의 N 말단 펩티드인 (1)의 암의 진단방법,

(3) 상기 GPC3의 N 말단 펩티드는 GPC3의 제 1번째 아미노산부터 제 374번째 아미노산까지로 구성된 아미노산 서열 중 또는 제 1번째 아미노산부터 제 358번째 아미노산까지로 구성된 아미노산 서열 중에 포함되는 펩티드 단편이며, (2)의 암의 진단방법,

(4) 상기 피검시료는 혈액, 혈청, 혈장 중 어느 하나인 (1) 내지 (3) 중 어느 하나의 진단방법,

(5) 상기 암은 간암인 (1) 내지 (4)의 어느 하나의 진단방법,

(6) 항 GPC3 항체를 이용하는 것을 특징으로 하는 (1) 내지 (5) 중 어느 하나의 방법,

(7) 지지체에 고정된 항 GPC3 항체와 표지물질로 표지된 항 GPC3 항체를 이용하는 것을 특징으로 하는 (6)의 방법,

(8) 상기 표지물질은 비오틴인 (7)의 방법,

(9) 항 GPC3 항체를 포함하는 암의 진단시약,

(10) 지지체에 고정된 항 GPC3 항체와 표지물질로 표지된 항체를 포함하는 것을 특징으로 하는 (9)의 진단시약,

(11) 상기 암은 간암인 (9) 또는 (10)의 진단시약,

(12) 항 GPC3 항체는 GPC3의 N 말단 펩티드를 인식하는 것을 특징으로 하는 (9) 내지 (11) 중 어느 하나의 진단시약,

(13) 항 GPC3 항체를 포함하는 진단키트, 및,

(14) 지지체에 고정된 항 GPC3 항체와 표지물질로 표지된 항체를 포함하는 것을 특징으로 하는 (13)의 진단키트.

이하, 본 발명에 대하여 상세히 설명한다.

본 발명은 피검시료 중의 가용화 글리피칸3(GPC3)을 검출함으로써 암을 진단하는 방법이다.

검출로는 정량적 또는 비정량적인 검출을 포함하고, 예를 들어, 비정량적인 검출로는 단순히 GPC3 단백질이 존재하는 지의 여부의 측정, GPC3 단백질이 일정량 이상 존재하는지의 측정 또는 GPC3 단백질의 양을 다른 시료(예를 들어, 대조구 시료 등)와 비교하는 측정 등을 들 수 있고, 정량적인 검출로는 GPC3 단백질의 농도 측정, GPC3 단백질의 양의 측정 등을 들 수 있다.

피검시료로는 GPC3 단백질이 포함되어 있을 가능성이 있는 시료이면 특별히 제한되지 않지만, 포유류 등의 생물체로부터 채취된 시료가 바람직하며, 더욱 바람직한 것은 사람으로부터 채취된 시료이다. 피검시료의 구체적인 예를 들면, 혈액, 간질액(interstitial fluid), 혈장, 혈관외액, 뇌척수액(cerebrospinal fluid), 활액(synovial fluid), 늑막액(pleural fluid), 혈청, 림프액, 타액 또는 뇨 등을 들 수 있지만, 바람직한 것으로는 혈액, 혈청, 혈장이다. 또한, 생물의 몸으로부터 채취된 세포 배양액 등과 같은 피검시료로부터 수득된 시료도 본 발명의 피검시료에 포함된다.

진단되는 암은 특별히 제한되지는 않으나, 구체적으로는 간암, 췌장암, 폐암, 대장암, 유방암, 전립선암, 백혈병, 림프종 등을 들 수 있으며, 바람직한 것은 간암이다.

1. 항 GPC3 항체의 제작

본 발명에서 이용되는 항 GPC3 항체는 GPC3 단백질에 특이적으로 결합하면 좋고, 그의 유래, 종류(모노클로날, 폴리클로날) 및 형상을 불문한다. 구체적으로는 마우스 항체, 랫(rat) 항체, 인간 항체, 키메라 항체, 인간화 항체 등의 공지의 항체를 이용할 수 있다.

항체는 폴리클로날 항체이어도 무방하지만 모노클로날 항체인 것이 바람직하다.

또한, 지지체에 고정되는 항 GPC3 항체와 표지물질로 표지되는 항 GPC3 항체는 GPC3 분자의 동일한 에피토프를 인식하여도 좋지만, 다른 에피토프를 인식하는 것이 바람직하다.

에피토프로 인식하는 부위는 특별히 제한되지는 않지만, GPC3 단백질의 N 말단 측(아미노산 제 1번째의 Met부터 제 358번째의 Arg까지 또는 제 1번째의 Met부터 제 374번째의 Lys)에 존재하는 에피토프를 인식하는 것이 바람직하다.

본 발명에서 사용되는 항 GPC3 항체는 공지의 수단을 이용하여 폴리클로날 또는 모노클로날 항체로 수득할 수 있다. 본 발명에서 사용되는 항 GPC3 항체로서는 특별히 포유동물 유래의 모노클로날 항체가 바람직하다. 포유동물 유래의 모노클로날 항체는 하이브리도마에 의해 생산된 것 및 유전공학적 방법에 의해 항체 유전자를 포함하는 발현벡터로 형질전환한 숙주에 의해 생산되는 것을 포함한다.

모노클로날 항체생산 하이브리도마는 기본적으로는 공지 기술을 사용하고, 이하와 같이 하여 제작할 수 있다. 즉, GPC3를 감작항원(sensitizing antigen)으로 사용하여, 이것을 통상의 면역방법에 따라 면역시키고, 수득된 면역세포를 통상의 세포 융합법에 의해 공지의 친세포(parent cell)와 융합시켜, 통상의 스크리닝법에 따라 모노클로날 항체생산 세포를 스크리닝함으로써 제작할 수 있다.

구체적으로는, 모노클로날 항체를 제작할 때, 하기와 같이 하면 좋다.

우선, 항체취득의 감작항원으로 사용된 GPC3을 「Lage, H. et al., Gene 188(1997), 151-156」에 개시된 GPC3(MXR7) 유전자/ 아미노산 서열을 발현함으로써 수득한다. 즉, GPC3을 암호화하는 유전자 서열을 공지의 발현벡터 시스템에 삽입하여 적당한 숙주세포를 형질전환 시킨 후, 그 숙주세포 내 또는 배양 상등액으로부터 목적하는 사람 GPC3 단백질을 공지의 방법으로 정제한다.

또한, 천연의 GPC3을 정제하여 사용할 수도 있다.

다음으로, 상기 정제된 GPC3 단백질을 감작항원으로 이용한다. 또는 GPC3의 부분 펩티드를 감작항원으로 이용할 수도 있다. 이 때, 부분 펩티드는 사람 GPC3의 아미노산 서열을 기초로 한 화학합성에 의해 수득할 수도 있고, GPC 유전자의 일부를 발현벡터에 삽입하여 수득할 수도 있으며, 또한 천연의 GPC3을 단백질 분해효소에 의해 분해함으로써 수득할 수도 있다. 부분 펩티드로 사용하는 GPC3의 부분은 제한되지 않지만, N 말단 측에 존재하는 에피토프를 인식하는 항체를 수득하려고 하는 경우는, GPC3의 아미노산 1번째의 Met부터 358번째의 Arg까지 또는 1번째의 Met부터 374번째의 Lys까지의 펩티드를 이용하면 좋고, 이 부분의 에피토프를 포함하는 보다 작은 펩티드 단편을 사용할 수도 있다.

감작항원으로 면역되는 포유동물로는 특별히 한정되는 것은 아니지만, 세포융합에 사용하는 친세포와의 적합성을 고려하여 선택하는 것이 바람직하고, 일반적으로는 설치류(rodent)의 동물, 예를 들어, 마우스, 랫, 햄스터 또는 토끼, 원숭이 등이 사용된다.

감작항원을 동물에 면역시키는 것은 공지의 방법에 따라 수행한다. 예를 들어, 일반적 방법으로 감작항원을 포유동물의 복강내 또는 피하에 주사함으로써 면역시킨다. 구체적으로는 감작항원을 PBS(phosphate-buffered saline)나 생리식염수 등으로 적당량 희석, 현탁한 것에 프로인트 완전 어쥬번트(Freund's complete adjuvant)와 같은 통상의 어쥬번트를 적절한 양으로 혼합하고, 유화(emulsification)한 후, 포유동물에 4 내지 21일마다 수회 투여한다. 또한, 감작항원 면역시에 적당한 담체(carrier)를 사용할 수도 있다. 특히, 분자량이 작은 부분 펩티드를 감작항원으로 이용하는 경우에는, 알부민, 키홀 림페트 헤모시아닌(keyhole limpet hemocyanin) 등의 담체 단백질과 결합시켜 면역하는 것이 바람직하다.

이와 같이, 포유동물을 면역시키고, 혈청 중에 원하는 항체 수준까지 상승하는 것을 확인한 후에, 포유동물로부터 면역세포를 채취하여 세포융합시키는데, 바람직한 면역세포의 예로는 특히, 비장세포를 들 수 있다.

상기 면역세포와 융합되는 다른 친세포로 포유동물의 골수종(myeloma) 세포를 이용한다. 전기 골수종 세포는 공지의 여러가지 세포주, 예를 들어, P3(P3x63Ag8. 653)(J. Immunol. (1979) 123, 1548-1550), P3x63Ag8U.1(Current Topics in Microbiology and Immunology(1978) 81, 1-7), NS-1(Kohler. G. and Milstein, C. Eur. J. Immunol. (1976) 6, 511-519), MPC-11(Margulies. D. H. et al., Cell(1976) 8, 405-415), SP2/0 (Shulman, M. et al., Nature(1978) 276, 269-270), FO(de St. Groth, S. F. et al., J. Immunol. Methods(1980) 35, 1-21), S194(Trowbridge, I. S. J. Exp. Med. (1978) 148, 313-323), R210(Galfre, G. et al., Nature(1979) 277, 131-133) 등이 적절히 사용된다.

상기 면역세포와 골수종 세포는 기본적으로는 공지된 방법, 예를 들어, 콜러와 밀스타인의 방법(참조: Kohler. G. and Milstein, C., Methods Enzymol. (1981) 73, 3-46) 등에 준하여 세포융합 시킬 수 있으며, 보다 구체적으로 전기 세포융합은 예를 들어, 세포융합 촉진제의 존재하에서 통상의 영양배양액 중에서 실시된다. 융합 촉진제로는 예를 들어, 폴리에틸렌글리콜(PEG), 센다이 바이러스(HVJ) 등이 사용되며, 바람직하게는 융합효율을 높이기 위하여 디메틸설폭사이드(dimethyl sulfoxide) 등의 보조제를 첨가하여 사용할 수도 있다.

면역세포와 골수종 세포의 사용비율은 임의로 설정할 수 있다. 예를 들어, 골수종 세포에 대하여 면역세포를 1 내지 10배로 하는 것이 바람직하다. 전기 세포융합에 이용하는 배양액으로는 예를 들어, 전기 골수종 세포주의 증식에 적절한 RPMI1640 배양액, MEM 배양액, 기타, 전기 종의 세포배양에 이용되는 통상의 배양액이 사용가능하며, 또한, 소 태아 혈청(FCS: fetal calf serum) 등의 혈청 보조액을 병용할 수도 있다.

세포융합은 전기 면역세포와 골수종 세포의 소정의 양을 전기 배양액 중에 잘 혼합하고, 미리 37℃ 정도로 가온한 PEG 용액(예를 들어, 평균 분자량 1,000 내지 6,000 정도)을 통상 30 내지 60%(w/v)의 농도로 첨가하고, 혼합함으로써 목적하는 융합세포(하이브리도마)를 형성한다. 계속하여, 적당한 배양액을 첨가하고, 원심분리하여 상등액을 제거하는 조작을 반복함으로써, 하이브리도마의 생육에 바람직하지 않은 세포융합제 등을 제거한다.

상기와 같이 하여 수득된 하이브리도마는 통상의 선택배양액, 예를 들어, HAT 배양액(hypoxanthine, aminopterin 및 thymidine을 포함하는 배양액)으로 배양함으로써 선택된다. 상기 HAT 배양액에서의 배양은 목적하는 하이브리도마 이외의 세포(비융합세포)가 사멸하기에 충분한 시간(통상, 수일 내지 수주간)동안 계속한다. 이어서, 통상의 한계 희석법을 실시하고, 목적하는 항체를 생산하는 하이브리도마의 스크리닝 및 단일 클로닝을 수행한다.

목적하는 항체의 스크리닝 및 단일 클로닝은 공지의 항원항체 반응에 기초한 스크리닝 방법으로 수행하면 좋다. 예를 들어, 폴리스티렌 등으로 만들어진 비드(bead)나 시판의 96웰 마이크로타이터 플레이트(microtiter plate) 등의 담체에 항원을 결합시키고, 하이브리도마의 배양 상등액과 반응시켜 담체를 세척한 후에 효소표지 제 2차 항체 등을 반응시킴으로써, 배양 상등액 중에 감작항원과 반응하는 목적의 항체가 포함되어 있는지를 결정할 수 있다. 목적하는 항체를 생산하는 하이브리도마를 한계 희석법(limited dilution method) 등으로 클로닝할 수 있다. 이 때, 항원으로서는 면역에 이용한 것을 사용하면 좋고, 또한 예를 들어, GPC3의 N 말단 단편에 대한 항체를 수득하려는 경우에는, N 말단 단편을 스크리닝용 항원으로 사용하면 좋다.

또한, 사람이외의 동물에 항원을 면역시켜 상기 하이브리도마를 수득하는 이외에, 사람 림프구를 실험실적 조건으로 GPC3에 감작하고, 감작 림프구를 사람 유래의 영구분열능을 가지는 골수종 세포와 융합시켜, GPC3와의 결합활성을 가지는 원하는 사람 항체를 수득할 수도 있다(참조: 특공평 1-59878호 공보). 또한, 사람 항체 유전자 전체의 레퍼토리를 가지는 형질전환 동물에 항원으로 GPC3을 투여하여 항 GPC3 항체생산세포를 취득하고, 이것을 불멸화(immortalization)시킨 세포로부터 GPC3 N 말단 펩티드에 대한 사람 항체 또는 GPC3 C 말단 펩티드에 대한 사람 항체를 취득하여도 좋다(참조: 국제특허출원 공개번호 WO 94/25585호 공보, WO 93/12227호 공보, WO 92/03918호 공보, WO 94/02602호).

상기와 같이 하여 제작된 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마는 통상의 배양액 중에서 계대배양하는 것이 가능하며, 또한, 액체질소 내에서 장기보존하는 것이 가능하다.

상기 하이브리도마로부터 모노클로날 항체를 수득하는 방법에는, 상기 하이브리도마를 통상의 방법으로 배양하고, 그 배양 상등액으로 수득하는 방법 또는 하이브리도마를 이것과 적합성이 있는 포유동물에 투여하여 증식시키고, 그 복수(ascite)의 형태로 수득하는 방법 등이 채용된다. 전자의 방법은 고순도의 항체를 얻는데 적절한 방법인데 반해, 후자의 방법은 항체의 대량생산에 적합한 방법이다.

본 발명에서는 모노클로날 항체로서, 항체 유전자를 하이브리도마로부터 클로닝하여 적당한 벡터에 끼워넣어 이를 숙주에 도입하고, 유전자 재조합 기술을 이용하여 생산시킨 유전자 재조합 항체를 이용할 수 있다(참조: Vandamme, A. M. et al., Eur. J. Biochem., 192, 767-775, 1990). 구체적으로는, 항 GPC3 항체를 생산하는 하이브리도마로부터, 항 GPC3 항체의 가변(V) 영역을 암호화하는 mRNA을 단리한다. mRNA의 단리는 공지의 방법, 예를 들어, 구아니딘 초원심분리법(참조: Chirgwin, J. M. et al., Biochemistry., Vol 18, 5294-5299, 1979), AGPC법(참조: Chomczynski, P. et al., Anal. Biochem., 162, 156-159) 등에 따라 수행하여 전 RNA를 제조하고, mRNA Purification Kit(Pharmacia사 제품) 등을 사용하여 목적의 mRNA를 제조한다. 또한, QuickPrep mRNA Purification Kit(Pharmacia사 제품)을 이용함으로써, mRNA를 직접 제조할 수도 있다.

수득된 mRNA로부터 역전사 효소를 이용하여 항체 V 영역의 cDNA를 합성한다. cDNA의 합성은 AMV Reverse Transcriptase First-strand cDNA Synthesis Kit(생화학공업사 제품) 등을 사용하여 합성한다. 또한, cDNA의 합성 및 증폭을 수행하는 데에는 5'-Ampli FINDER RACE Kit(Clontech사 제품) 및 PCR을 이용한 5'-RACE법(참조: Frohman, M. A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1988) 85, 8998-9002; Belyavsky, A. et al., Nucleic Acids Res. (1989) 17, 2919-2932) 등을 사용할 수 있다.

수득된 PCR 산물로부터 목적하는 DNA 단편을 정제하고, 벡터 DNA와 연결한다. 또한, 이에 따라 재조합 벡터를 제작하고, 대장균 등에 도입하여 콜로니를 선택하여 원하는 재조합 벡터를 제조한다. 그리고, 목적으로 하는 DNA의 염기서열을 공지의 방법, 예를 들어, 디데옥시뉴클레오티드 체인 터미네이션 법(dideoxynucleotide chain termination method) 등으로 확인한다.

목적으로 하는 항 GPC3 항체의 V 영역을 암호화하는 DNA를 수득한 후, 전기 DNA를 원하는 항체 정상영역(C 영역)을 암호화하는 DNA를 함유하는 발현벡터에 삽입한다.

본 발명에서 사용되는 항 GPC3 항체를 제조하는 데는, 항체 유전자를 발현제어영역, 예를 들어, 인핸서(enhancer), 프로모터의 제어하에서 발현되도록 하는 발현벡터에 삽입된다. 다음으로, 이 발현벡터에 의해, 숙주세포를 형질전환하고, 항체를 발현시킨다.

항체 유전자의 발현은 항체 중쇄(H쇄) 또는 경쇄(L쇄)를 암호화하는 DNA를 각각 발현벡터에 재조합하여 숙주세포를 동시 형질전환시켜도 무방하며, 또는, H쇄 및 L쇄를 암호화하는 DNA를 단일의 발현벡터에 삽입하여 숙주세포를 형질전환시켜도 좋다(참조: WO 94/11523호 공보).

또한, 재조합형 항체의 생산에는 상기 숙주세포만이 아닌, 형질전환 동물을 사용할 수 있다. 예를 들어, 항체 유전자를 우유중에 고유하게 생산된 단백질(염소 β 카제인 등)을 암호화하는 유전자의 도중에 삽입하여 융합 유전자로 제조한다. 항체 유전자가 삽입된 융합 유전자를 포함하는 DNA 단편을 염소의 배(胚: embryo)에 주입하고, 전기 배를 암컷의 염소에 도입한다. 배를 수용한 염소로부터 출생하는 형질전환(transgenic) 염소 또는 그의 자손이 생산하는 우유로부터 원하는 항체를 수득한다. 또한, 형질전환 염소로부터 생산되는 원하는 항체를 포함하는 우유량을 증가시키기 위해, 적절한 호르몬을 형질전환 염소에 사용하여도 무방하다(참조: Ebert, K. M. et al., Bio/Technology (1994) 12, 699-702).

본 발명에서는, 상기 항체 이외에 인위적으로 개조된 유전자 재조합형 항체, 예를 들어, 키메라 항체, 인간화 항체를 사용할 수 있다. 이들의 개변항체는 기지의 방법을 이용하여 제조할 수 있다.

키메라 항체는 상기와 같이 하여 수득한 항체 V영역을 암호화하는 DNA를 사람 항체 C영역을 암호화하는 DNA와 연결하고, 이것을 발현벡터에 삽입하고 숙주에 도입하여 생산시킴으로써 수득된다. 이러한 기지의 방법을 이용하여, 본 발명에 유용한 키메라 항체를 수득할 수 있다.

인간화 항체는 재구성(reshaped) 인간항체로도 불리며, 이것은 인간 이외의 포유동물, 예를 들어, 마우스 항체의 상보성 결정영역(CDR: complementarity determining region)을 인간항체의 상보성 결정영역으로 대체한 것이며, 그의 일반적인 유전자 재조합 방법도 알려져 있다(참조: 유럽특허출원 공개번호 EP 125023호 공보, WO 96/02576호).

구체적으로는, 마우스 항체의 CDR과 인간항체의 프레임워크 영역(framework region: FR)을 연결하기 위해 설계한 DNA 서열을, CDR 및 FR 양쪽의 말단영역에 오버랩하는 부분을 가지도록 제작된 수 개의 올리고뉴클레오티드를 프라이머로 이용하는 PCR법에 의해 합성한다(참조: WO 98/13388호 공보에 기재된 방법).

CDR에 연결된 인간항체의 FR 영역은 상보성 결정영역이 양호한 항원결합부위를 형성하는 것이 선택된다. 필요에 따라, 재구성 인간항체의 상보성 결정영역이 적절한 항원결합부위를 형성하도록, 항체 가변영역 중 FR 영역의 아미노산을 치환하여도 무방하다(참조: Sato, K. et al., Cancer Res. (1983) 53, 851-856).

키메라 항체 및 인간항체의 C 영역에는 인간항체의 것이 사용되며, 예를 들어, H쇄에서는 Cγ1, Cγ2, Cγ3, Cγ4를 L쇄에서는 Cκ, Cλ를 사용할 수 있다. 또한, 항체 또는 그의 생산의 안정성을 개선하기 위해서, 인간항체 C 영역을 수식하여도 좋다.

키메라 항체는 인간이외의 포유동물 유래 항체의 가변영역과 인간항체 유래의 정상영역으로 이루어진다. 한편, 인간화 항체는 인간 이외의 포유동물 유래 항체의 상보성 결정영역과 인간 항체 유래의 FR 영역 및 C 영역으로 구성된다. 인간화 항체는 인간 체내에서의 항원성이 저하되어 있기 때문에, 본 발명의 치료제의 유효성분으로 유용하다.

본 발명에서 사용되는 항체는 항체 전체 분자에 한정되지 않고, GPC3에 결합하는 한, 항체의 단편 또는 그의 수식물이어도 좋고, 2가항체(divalent antibody)도 1가항체(monovalent antibody)도 모두 포함된다. 예를 들어, 항체의 단편으로는 Fab, F(ab') 2, Fv, 1개의 Fab와 완전한 Fc를 가지는 Fab/c 또는 H쇄나 L쇄의 Fv를 적당한 링커로 연결시킨 단일체인 Fv(scFv)를 들 수 있다. 구체적으로는, 항체를 효소, 예를 들어, 파파인, 펩신으로 처리하여 항체단편을 생성시키거나, 이들 항체단편을 암호화하는 유전자를 구축하여, 이를 발현벡터에 도입한 후, 적당한 숙주세포에서 발현시킨다(참조: Co, M. S. et al., J. Immunol. (1994) 152, 2968-2976; Better, M. & Horwitz, A. H. Methods in Enzymology(1989) 178, 476-496, Academic Press, Inc.; Plueckthun, A. & Skerra, A. Methods in Enzymology(1989) 178, 476-496, Academic Press, Inc.; Lamoyi, E., Methods in Enzymology(1989) 121, 652-663; Rousseaux, J. et al., Methods in Enzymology(1989) 121, 663-669; Bird, R. E. et al., TIBTECH(1991) 9, 132-137).

scFv는 항체의 H쇄 V영역과 L쇄 V영역을 연결함으로써 수득된다. 전기 scFv에 있어서, H쇄 V영역과 L쇄 V영역은 링커, 바람직하게는 펩티드 링커를 매개체로 하여 연결된다(참조: Huston, J. S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA(1998) 85, 5879-5883). scFv에서의 H쇄 V영역 및 L쇄 V영역은 본 명세서에서 항체로 기재된 것 중 어느 하나의 유래이어도 좋다. V영역을 연결하는 펩티드 링커로는 예를 들어, 아미노산 12 내지 19잔기로 구성되는 임의의 단일사슬 펩티드가 이용될 수 있다.

scFv를 암호화하는 DNA는 전기 항체의 H쇄 또는 H쇄 V영역을 암호화하는 DNA 및 L쇄 또는 L쇄 V영역을 암호화하는 DNA 중, 이들의 서열 내의 전부 또는 원하는 아미노산 서열을 암호화하는 DNA 부분을 주형으로 하여, 그 양단을 규정하는 한쌍의 프라이머를 이용하여 PCR법에 의해 증폭하고, 이어서, 펩티드 링커 일부분을 암호화하는 DNA 및 그 양단이 각각 H쇄, L쇄와 연결되도록 규정하는 프라이머 한 쌍을 조합하여 증폭함으로써 수득된다.

또한, 일단 scFv를 암호화하는 DNA가 제작되면, 그들을 포함하는 발현벡터 및 전기 발현벡터에 의해 형질전환된 숙주를 통상의 방법에 따라 수득할 수 있으며, 또한, 그 숙주를 이용함으로써, 통상의 방법에 따라 scFv를 수득할 수 있다.

이들 항체의 단편은 전기와 마찬가지로 하여 그 유전자를 취득하고 발현시켜, 숙주에 의해 생산시킬 수 있다. 본 발명에서의 「항체」에는 이들 항체의 단편도 포함된다.

항체의 수식물로써, 표지물질, 톡신, 방사성 물질 등의 각종 분자와 결합한 항 글리피칸 항체를 사용할 수도 있다. 본 발명에서의 「항체」에는 이들의 항체 수식물도 포함된다. 이러한 항체 수식물은 수득된 항체에 화학적인 수식을 함으로써 수득될 수 있다. 또한, 항체의 수식방법은 이 분야에서 이미 확립되어 있다.

또한, 본 발명에서 사용되는 항체는 2중 특이성 항체(bispecific antibody)이어도 무방하다. 2중 특이성 항체는 GPC3 분자 상의 다른 에피토프를 인식하는 항원결합 부위를 가지는 이중 특이성 항체이어도 좋고, 한쪽의 항원결합 부위가 GPC3을 인식하고, 다른 쪽의 항원결합 부위가 표지물질 등을 인식하여도 좋다. 2중 특이성 항체는 2종류의 항체의 HL 한쌍을 결합시켜 제작할 수도 있고, 다른 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마를 융합시켜 2중 특이성 항체생산 융합세포를 제작할 수도 있다. 또한, 유전공학적 방법에 의해 2중 특이성 항체를 제작하는 것도 가능하다.

전기와 같이 구축한 항체 유전자는 공지의 방법에 의해 발현시켜 취득할 수 있다. 포유류 세포의 경우, 상용되는 유용한 프로모터, 발현시키는 항체 유전자, 그의 3'측 하류에 폴리A 시그널을 기능적으로 결합시켜 발현시킬 수 있다. 예를 들어, '프로모터/인핸서(promoter/enhancer)'로는 인간 사이토메갈로바이러스 전기 프로모터/인핸서(human cytomegalovirus immediate early promoter/enhancer)를 들 수 있다.

또한, 그 외에 본 발명에서 사용되는 항체발현에 사용할 수 있는 프로모터/인핸서로서, 레트로바이러스, 폴리오마 바이러스(polyoma virus), 아데노바이러스, 시미안 바이러스40(SV40: simian virus40) 등의 바이러스 프로모터/인핸서 또는 인간 신장인자 1a(HEF1a: human elongation factor 1a) 등의 포유류 세포유래의 프로모터/인핸서 등을 들 수 있다.

SV40 프로모터/인핸서를 사용하는 경우는 멀리간(Mulligan) 등의 방법(참조: Nature (1979) 277, 108)에 의해, 또한, HEF1a 프로모터/인핸서를 사용하는 경우는 미즈시마(Mizushima) 등의 방법(참조: Nucleic Acids Res. (1990) 18, 5322)에 의해, 용이하게 유전자 발현을 수행할 수 있다.

대장균의 경우, 상용되는 유용한 프로모터, 항체분비를 위한 시그널 배열 및 발현시키는 항체 유전자를 기능적으로 결합시켜 전기 유전자를 발현시킬 수 있다. 프로모터로는 예를 들어, lacz 프로모터, araB 프로모터를 들 수 있다. lacz 프로모터를 사용하는 경우는 워드(Ward) 등의 방법(참조: Nature (1098) 341, 544-546; FASEB J. (1992) 6, 2422-2427)에 의하거나 araB 프로모터를 사용하는 경우는 베터(Better) 등의 방법(참조: Science (1988) 240, 1041-1043)에 의하여 발현할 수 있다.

항체분비를 위한 시그널 배열로는 대장균의 원형질막공간(periplasm)에서 생산시키는 경우, pelB 시그널 배열(참조: Lei, S. P. et al J. Bacteriol. (1987) 169, 4379)을 사용하면 좋다. 그리고, 원형질막공간에서 생산된 항체를 분리한 다음, 항체의 구조를 적절하게 재접힘(refolding)하여 사용한다.

복제기원으로는 SV40, 폴리오마 바이러스, 아데노바이러스, 소 파필로마 바이러스(BPV: bovine papilloma virus) 등의 유래의 것을 사용할 수 있고, 또한, 숙주세포 시스템에서 유전자 카피수 증폭을 위해, 발현벡터는 선택마커로 아미노 글리코시드 트랜스퍼라제(APH) 유전자, 티미딘키나아제(TK) 유전자, 대장균 크산틴구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제(Ecogpt) 유전자, 디히드로엽산 환원효소(dhfr) 유전자 등을 포함할 수 있다.

본 발명에서 사용되는 항체의 제작을 위해, 임의의 발현계, 예를 들어, 진핵세포 또는 원핵세포계를 사용할 수 있다. 진핵세포로는 예를 들어, 수립된 포유류 세포계, 곤충세포계, 진사상균세포 및 효모세포 등의 동물세포 등을 들 수 있으며, 원핵세포로는 예를 들어, 대장균 세포 등의 세균세포를 들 수 있다.

바람직하게는 본 발명에서 사용되는 항체는 포유류세포, 예를 들어, CHO, COS, 골수종, BHK, Vero, HeLa 세포 중에서 발현된다.

다음에, 형질전환된 숙주세포를 실험실적 조건(in vitro) 또는 생체 조건(in vivo)에서 배양하여 목적하는 항체를 생산시킨다. 숙주세포의 배양은 공지의 방법을 따른다. 예를 들어, 배양액으로, DMEM, MEM, RPMI1640, IMDM을 사용할 수 있고, 소 태아 혈청(FCS) 등의 혈청보조액을 병용할 수도 있다.

전기와 같이 발현, 생산된 항체는 세포, 숙주동물로부터 분리하고 단일물질로 정제할 수 있다. 본 발명에서 사용되는 항체의 분리, 정제는 친화크로마토그래피 칼럼을 사용하여 수행할 수 있다. 예를 들어, 프로틴A 칼럼을 이용한 칼럼으로, Hyper D, POROS, Sepharose F.F. (Pharmacia사 제품) 등을 들 수 있다. 그 외에, 통상의 단백질에서 사용되고 있는 분리, 정제방법을 사용하여도 무방하고, 정제방법이 한정되는 것은 아니다. 예를 들어, 상기 친화크로마토그래피 칼럼 이외의 크로마토그래피 칼럼, 필터, 한외여과, 염석, 투석 등을 적절히 선택, 조합하여 항체를 분리, 정제할 수 있다(참조: Antibodies A Laboratory Manual. Ed Harlow, David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988).

2. GPC3의 검출

본 발명에서 검출하는 GPC3은 특별히 한정되지 않으며, 전장 GPC3 또는 그의 단편이어도 무방하다. GPC3 단편을 검출하는 경우에는 N 말단 단편이어도 좋고, C 말단 단편이어도 좋지만, N 말단 단편을 검출하는 것이 바람직하다. 또한, 황산헤파란 등이 부가된 GPC3 단백질이어도 좋고, GPC3 코어단백질이어도 좋다.

피검시료에 포함된 GPC3 단백질의 검출방법은 특별히 한정되지는 않지만, 항 GPC3 항체를 이용한 면역학적 방법에 따라 검출하는 것이 바람직하다. 면역학적 방법으로서는 예를 들어, 방사성면역분석법(radioimmunoassay), 효소면역분석법(enzyme immunoassay), 형광면역분석법(fluorescent immunoassay), 발광면역분석법(luminescent immunoassay), 면역침강법(immunoprecipitation method), 면역비탁법(immunonephelometry), 웨스턴블로팅(Western blot), 면역염색(immunostaining), 면역확산법(immunodiffusion method) 등을 들 수 있지만, 바람직하게는 효소면역분석법을 사용하며, 가장 바람직한 것은 효소결합 면역흡착 정량법(ELISA: enzyme-linked immunosorbent assay, 예를 들어, 샌드위치 ELISA)이다. ELISA 등의 상술한 면역학적 방법은 당업자에게 공지된 방법에 따라 수행할 수 있다.

항 GPC3 항체를 이용한 일반적인 검출방법으로는 예를 들어, 항 GPC3 항체를 지지체에 고정하고, 여기에 피검시료를 가하고 반응시켜서, 항 GPC3 항체와 GPC3 단백질을 결합시킨 후에, 세척하여 항 GPC3 항체를 매개체로 지지체에 결합한 GPC3 단백질을 검출함으로써, 피검시료 중의 GPC3 단백질의 검출을 수행하는 방법을 들 수 있다.

본 발명에서 이용되는 전기 지지체로는 예를 들어, 아가로스, 셀룰로스 등의 불용성의 다당류, 실리콘 수지, 폴리스티렌 수지, 폴리아크릴아미드 수지, 나일론 수지, 폴리카보네이트 수지 등의 합성수지나 유리 등의 불용성 지지체를 들 수 있다. 이들 지지체는 비드나 플레이트의 형상으로 이용할 수 있다. 비드의 경우, 이들이 충진된 칼럼 등을 이용할 수 있다. 플레이트의 경우, 멀티웰 플레이트(96멀티웰 플레이트 등)나 바이오센서 칩 등을 이용할 수 있다. 항 GPC3 항체와 지지체의 결합은 화학결합이나 물리적인 흡착 등의 통상 이용되는 방법에 따라 결합할 수 있다. 이들 지지체는 전부 시판되는 것을 사용할 수 있다.

항 GPC3 항체와 GPC3 단백질의 결합은 통상적으로 완충액에서 수행된다. 완충액으로는 예를 들어, 인산 완충액, Tris 완충액, 구연산 완충액, 붕산염 완충액(borate salt buffer), 탄산염 완충액 등이 사용된다. 또한, 반응조건으로는 이미 자주 이용되는 조건, 예를 들어, 4℃ 내지 실온에서 1시간 내지 24시간 동안 반응시킨다. 반응 후의 세척은 GPC3 단백질과 항 GPC3 항체의 결합을 방해하지 않는다면 어떤 것도 좋고, 예를 들어, Tween 20 등의 계면활성제를 포함하는 완충액 등이 사용된다.

본 발명의 GPC3 단백질 검출방법에서는 GPC3 단백질을 검출하고 싶은 피검시료 외에 대조구 시료를 사용하여도 좋다. 대조구 시료로는 GPC3 단백질을 포함하지 않는 음성 대조구 시료나 GPC3 단백질을 포함하는 양성 대조구 시료 등이 있다. 이 경우, GPC3 단백질을 포함하지 않는 음성 대조구 시료에서 얻어진 결과를, GPC3 단백질을 포함하는 양성 대조구 시료에서 얻어진 결과와 비교함으로써, 피검시료 중의 GPC3 단백질을 검출하는 것이 가능하다. 또한, 농도를 단계적으로 변화시킨 일련의 대조구 시료를 제조하고, 각 대조구 시료에 대한 검출결과를 수치로 하여 얻고, 표준곡선을 작성하여 피검시료의 수치로부터 표준곡선에 근거하여 피검시료에 포함된 GPC3 단백질을 정량적으로 검출할 수도 있다.

항 GPC3 항체를 매개체로 지지체에 결합한 GPC3 단백질의 검출의 바람직한 구현예로서, 표지물질로 표지된 항 GPC3 항체를 이용하는 방법을 들 수 있다.

예를 들어, 지지체에 고정된 항 GPC3 항체에 피검시료를 접촉시키고, 세척한 후에 GPC3 단백질을 특이적으로 인식하는 표지항체를 이용하여 검출한다.

항 GPC3 항체의 표지는 통상 알려져 있는 방법에 의하여 표지할 수 있다. 표지물질로는 형광색소, 효소, 보효소, 화학발광물질, 방사성물질 등의 당업자에 공지된 표지물질을 이용하는 것이 가능하며, 구체적인 예로서는 방사성 동위원소(³²P, ¹⁴C, ¹²⁵I, ³H, ¹³¹I 등), 플루오레세인(fluorescein), 로다민(rhodamine), 단실클로라이드, 움베리페론(umbelliferone), 루시퍼라제, 페록시다제, 알칼라인포스파타제, β-갈락토시다제, β-글루코시다제, 호스 래디쉬 페록시다제(horse radish peroxidase), 글루코아밀라제, 리소자임, 사카라이드 옥시다제(saccharide oxidase), 마이크로페록시다제, 비오틴 등을 들 수 있다. 표지물질로 비오틴을 이용하는 경우에는 비오틴 표지항체를 첨가한 후에 알칼라인포스파타제 등의 효소를 결합시킨 아비딘(avidine)을 또한 첨가하는 것이 바람직하다. 표지물질과 항 GPC3 항체와의 결합에는 글루탈알데히드법, 말레이미드법, 피리딜디설파이드법, 과요오드산법 등의 공지된 방법을 이용할 수 있다.

구체적으로는, 항 GPC3 항체를 포함하는 용액을 플레이트 등의 지지체에 가하고, 항 GPC3 항체를 고정시킨다. 플레이트를 세척한 후, 단백질의 비특이적인 결합을 막기위해, 예를 들어, BSA, 젤라틴, 알부민 등으로 블로킹한다. 다시 세척하고, 피검시료를 플레이트에 가한다. 반응시킨 후, 세척하고, 표지된 항 GPC3 항체를 가한다. 적당히 반응시킨 후, 플레이트를 세척하고, 플레이트에 남아있는 표지된 항 GPC3 항체를 검출한다. 검출은 당업자에게 공지된 방법에 의해 수행할 수 있는데, 예를 들어, 방사성 물질에 의한 표지의 경우에는 액체 섬광계수법(liquid scintillation method)이나 RIA법에 의해 검출할 수 있다. 효소에 의한 표지의 경우에는 기질을 가하여, 기질의 효소적 변화, 예를 들어, 발색을 흡광도계에 의해 검출할 수 있다. 기질의 구체적인 예로서는 2,2-아디노비스(adinobis: 3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) 디암모늄염(ABTS), 1,2-페닐렌디아민(ortho-phenylenediamine), 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘(TME: 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine) 등을 들 수 있다. 형광물질의 경우에는 형광광도계에 의해 검출할 수 있다.

본 발명의 GPC3 단백질 검출방법의 특히 바람직한 구현예로서는 비오틴으로 표지된 항 GPC3 항체 및 아비딘을 사용하는 방법을 들 수 있다.

구체적으로는 항 GPC3 항체를 포함하는 용액을 플레이트 등의 지지체에 가하여, 항 GPC3 항체를 고정한다. 플레이트를 세척한 후, 단백질의 비특이적인 결합을 방지하기 위해, 예를 들어 BSA 등으로 블로킹한다. 다시 세척하고, 피검시료를 플레이트에 가한다. 반응시킨 후, 세척하고, 비오틴 표지 항 GPC3 항체를 가한다. 적당히 반응시킨 후, 플레이트를 세척하고, 알칼라인포스파타제, 페록시다제 등의 효소와 결합한 아비딘을 가한다. 반응시킨 후, 플레이트를 세척하고, 아비딘에 결합해 있는 효소에 대응한 기질을 가하여 기질의 효소적 변화 등을 지표로 GPC3 단백질을 검출한다.

본 발명의 GPC3 단백질 검출방법의 다른 구현예로서, GPC3 단백질을 특이적으로 표지하는 1차 항체 및 전기 1차 항체를 특이적으로 인식하는 2차 항체를 이용하는 방법을 들 수 있다.

예를 들어, 지지체에 고정된 항 GPC3 항체에 피검시료를 가하여 반응시킨 후, 세척하고, 세척 후에 결합하고 있는 GPC3 단백질을 1차 항 GPC3 항체 및 전기 1차 항체를 특이적으로 인식하는 2차 항체에 의해 검출한다. 이 경우, 2차 항체는 바람직하게는 표지물질에 의해 인식된다.

구체적으로, 항 GPC3 항체를 포함하는 용액을 플레이트 등의 지지체에 가하여, 항 GPC3 항체를 고정시킨다. 플레이트를 세척한 후, 단백질의 비특이적인 결합을 방지하기 위해 BSA등으로 블로킹한다. 다시 세척하고, 피검시료를 플레이트에 가한다. 반응시킨 후, 세척하고, 1차 항 GPC3 항체를 가한다. 적당히 반응시킨 후, 플레이트를 세척하고, 계속하여 1차 항체를 특이적으로 인식하는 2차 항체를 가한다. 적당히 반응시킨 후, 세척하고, 플레이트에 남아있는 2차 항체를 검출한다. 2차 항체의 검출은 전술한 방법에 의해 검출할 수 있다.

본 발명의 GPC3 단백질의 검출방법의 다른 구현예로서는 응집반응(aggregation reaction)을 이용한 검출방법을 들 수 있다. 전기 방법에서는 항 GPC3 항체를 감작한 담체를 이용하여 GPC3을 검출할 수 있다. 항체를 감작하는 담체로서는 불용성이고, 비특이적인 반응을 일으키지 않으면서 안정하다면 어떤 담체를 사용하여도 무방하다. 예를 들어, 라텍스 입자(latex particle), 벤토나이트(bentonite), 콜로디온(collodion), 카올린(kaolin), 고정된 양 적혈구(immobilized sheep erythrocyte) 등을 사용할 수 있지만, 라텍스 입자를 사용하는 것이 바람직하다. 라텍스 입자로서는 예를 들어, 폴리스티렌 라텍스 입자, 스티렌-부타디엔 공중합체 라텍스 입자, 폴리비닐톨루엔 라텍스 입자 등을 사용할 수 있지만, 폴리스티렌 라텍스 입자를 사용하는 것이 바람직하다. 감작한 입자를 시료를 혼합하고, 일정 시간 교반한 후에 시료 중에 GPC3 항체가 고농도로 포함됨에 따라 입자의 응집도가 크게 되기 때문에, 응집을 육안으로 봄으로써 GPC3를 검출할 수 있다. 또한, 응집에 의한 탁도를 분광 광도계 등으로 측정함으로써도 검출할 수 있다.

본 발명의 GPC3 단백질의 검출방법의 다른 구현예로서는 예를 들어, 표면 플라즈몬 공명(surface plasmon resonance)현상을 이용한 바이오 센서로 검출하는 방법을 들 수 있다. 표면 플라즈몬 공명현상을 이용한 바이오 센서는 단백질-단백질 간의 상호작용을 미량의 단백질을 이용하며, 표지하지 않고도 표면 플라즈몬 공명 시그널로 실시간으로 관찰할 수 있다. 예를 들어, BIAcore(Pharmacia사 제품) 등의 바이오 센서를 이용함으로써 GPC3 단백질과 항 GPC3 항체의 결합을 검출할 수 있다. 구체적으로는, 항 GPC3 항체를 고정화한 센서 칩에 피검시료를 접촉시켜, 항 GPC3 항체에 결합하는 GPC3 단백질을 공명 시그널의 변화로 검출할 수 있다.

본 발명의 검출방법은 각종의 자동 검사 장치를 이용하여 자동화할 수도 있고, 한번에 대량의 시료에 대해 검사할 수도 있다.

본 발명은 암의 진단을 위한 피검시료 중의 GPC3 단백질을 검출하기 위한 진단시약 또는 키트의 제공을 목적으로 하지만, 전기 진단시약 또는 키트는 적어도 항 GPC3 항체를 포함한다. 진단시약 또는 키트가 EIA법에 기초하는 경우에는, 항체를 고정화(immobilization)하는 담체를 포함하여도 좋고, 항체가 미리 담체에 결합하고 있어도 좋다. 전기 진단시약 또는 키트가 라텍스 등의 담체를 이용한 응집법에 기초하는 경우는 항체가 흡착된 담체를 포함하여도 좋다. 또한, 전기 키트는 블로킹 용액, 반응용액, 반응정지액, 시료를 처리하기 위한 시약 등을 적절히 포함하여도 좋다.

발명을 실시하기 위한 최량의 형태

이하, 실시예에 의해, 본 발명을 구체적으로 설명한다. 단, 본 발명은 이들의 실시예에 한정되는 것은 아니다.

본 명세서 기재의 실시예에 있어서, 이하의 재료를 이용하였다.

가용형 GPC3, 가용형 GPC3 코어단백질의 발현벡터로 pCAGGS에 DHFR 유전자 및 네오마이신(neomycin) 내성 유전자를 삽입한 pCXND2, pCXND3을 이용하였다.

DXB11은 ATCC에 의해 구입한 세포를 이용하였고, 배양에는 5% FBS(GIBCO BRL CAT# 10099-141, LOT# A0275242)/ 최소필수배지 α배지(Minimum Essential Medium Alpha medium(αMEM(+))(GIBCO BRL CAT# 12571-071)/ 1% 페니실린-스트렙토마이신(Penicillin-Streptomycin)(GIBCO BRL CAT# 15140-122)을 이용하였다. DXB11을 이용한 발현주의 선발에는 500㎍/mL 제네티신(Geneticin)(GIBCO BRL CAT# 10131-027)/ 5% FBS/ 리보뉴클레오시드 및 디옥시리보뉴클레오시드가 배제된 α배지(αMEM without ribonucleosides and deoxyribonucleosides)((GIBCO BRL CAT# 12561-056)(αMEM(-))/ PS 또는 동일배지에 최종농도 25nM이 되도록 MTX를 가한 것을 이용하였다.

HepG2는 ATCC에 의해 구입한 세포를 이용하였으며, 10% FBS/ DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium)(GIBCO BRL CAT# 11995-065)/ PS에서 배양하였다.

하이브리도마는 10% FBS/ RPMI640/ 1x HAT media supplement(SIGMA CAT# H-0262)/ 0.5x BM-Condimed H1 Hybridoma cloning supplement(Roche CAT# 1088947)에서 배양하였다.

실시예 1: 사람 GPC3(GPC3) cDNA의 클로닝 및 발현해석, 사람 글리피칸3(이하, GPC3)을 암호화하는 전장 cDNA의 클로닝

사람 GPC3을 암호화하는 전장 cDNA는 대장암 세포주 Caco2에 의한 통상의 방법에 의해 제조한 제 1사슬(1st strand) cDNA를 주형으로 하고, 어드밴티지2 키트(Advantage2 kit)(CLONTECH사 Cat. No. 8430-1)을 이용한 PCR 반응에 의해 증폭하였다. 즉, 2㎕의 Caco2 유래의 cDNA, 1㎕의 센스 프라이머(서열번호 1), 1㎕의 안티센스 프라이머(서열번호 2), 5㎕의 어드밴티지2 10x PCR 완충액, 8㎕의 dNTP 혼합물(1.25mM), 1.0㎕의 어드밴티지 중합효소 혼합물을 포함하는 50㎕의 반응액을, 94℃에서 1분, 63℃에서 30초, 68℃에서 3분으로 구성된 사이클을 35회 수행하였다. PCR 반응에 의한 증폭산물은 (pGEM-T Easy Vector System I(Promega사 Cat. No. A1360)을 이용하여 TA벡터 pGEM-T easy에 삽입하였다) ABI3100 DNA 시퀀서를 이용하여 서열을 확인한 결과, 사람 GPC3의 전장을 암호화하는 cDNA를 단리하였다. 서열번호 3으로 표시되는 서열은 사람 GPC3 유전자의 염기서열을, 서열번호 4로 표시되는 서열은 사람 GPC3 단백질의 아미노산 서열을 표시한다.

서열번호 1: GATATC-ATGGCCGGGACCGTGCGCACCGCGT

서열번호 2: GCTAGC-TCAGTGCACCAGGAAGAAGAAGCAC

GeneChip^TM을 이용한 사람 GPC3 mRNA 발현해석

24 사례의 간암 종양부(고분화암: WD, 중분화암: MD, 저분화암: PD), 16 사례의 간암 비암부(간염부위: CH, 간경변 부위: LC), 8 사례의 정상간장: NL(informed consent 취득, 도쿄대학 의학부 및 사이타마 암센터에서 입수)에서의 mRNA 발현해석을 GeneChip^TM (UG-95A Target, Affymetryx사)을 이용하여 해석하였다. 구체적으로, 상기 각 조직에 의한 아이소젠(ISOGEN, Nippongene사)을 이용하여 총 세포 RNA를 정제한 후, 각각 15㎍의 총 세포 RNA를 사용하여 발현분석기술 매뉴얼(Expression Analysis Technical Manual, Affymetryx사)대로 유전자 발현을 해석하였다.

그 결과, 도 1에 도시한 바와 같이, 사람 GPC3 유전자(Probe Set ID: 39350_at)는 간암의 분화정도에 관계없이 많은 증상 사례에서 mRNA의 발현량이 정상 간암 조직에 비하여 명백히 높음이 확인되었다. 또한, 현재 가장 빈번하게 간암의 진단 마커로 사용되고 있는 알파페토프로틴(Probe Set ID: 40114_at)의 mRNA 발현과 비교한 결과, 알파페토프로틴의 mRNA 발현이 거의 보이지 않는 고분화 암에서도 GPC3은 충분한 mRNA 발현의 항진이 확인되었으며, 또한, mRNA 발현항진 비율이 GPC3에서 더 높다는 것이 밝혀지게 되었다. 상술한 바에 따라, GPC3의 검출은 간암의 조기 진단법으로 유용하다고 생각된다.

실시예 2: 항 GPC3 항체의 제작

가용형 사람 GPC3의 제작

항 GPC3 항체 제작을 위한 재료로서, C 말단 측의 소수성 영역을 결손시킨 가용형 GPC3 단백질을 제작하였다.

도쿄대학교 선단연구소에 의해 제공받은 완전장 사람 GPC3 cDNA(full length human GPC3 cDNA)를 포함하는 플라스미드 DNA를 사용하여, 가용형 GPC3 cDNA 발현 플라스미드 DNA를 구축하였다. C 말단측의 소수영역(564-580 아미노산)을 제거하기 위해 설계한 하류 프라이머(5'-ATA GAA TTC CAC CAT GGC CGG GAC CGT GCG C-3' (서열번호 5))와 EcoRI 인식서열, 코작(Kozak)서열을 가한 상류 프라이머(5'-ATA GGA TCC CTT CAG CGG GGA ATG AAC GTT C-3' (서열번호 6))를 이용하여 PCR을 수행하였다. 수득된 PCR단편(1,711bp)을 pCXND2-Flag에 클로닝하였다. 제작된 발현 플라스미드 DNA를 CHO 세포 DXB11주에 도입하고, 500㎍/mL 제네티신(Geneticin)으로 선발함에 따라, 가용형 GPC3 고발현 CHO 세포주를 수득하였다.

1,700cm² 롤러병(roller bottle)을 이용하여 가용형 GPC3 고발현 CHO 세포주를 대량 배양하고, 배양 상등액을 회수하여 정제하였다. 배양 상등액을 DEAE 세파로스 패스트플로우(DEAE Sepharose Fast Flow, Amersham CAT# 17-0709-01)에 로딩하고, 워싱한 후, 500mM NaCl을 포함하는 완충액으로 용출하였다. 다음에, 항-플랙 M2 아가로스 친화젤(Anti-Flag M2 agarose affinity gel, SIGMA CAT# A-2220)을 이용하여 정제하였다. 용출은 200㎍/mL의 FLAG 펩티드로 용출하였다. 센트리프렙-10(Centriprep-10, Millipore CAT#4304)에 의한 농축 후, 수퍼덱스 200(Superdex 200 HR 10/30, Amersham CAT# 17-1088-01)에 의한 겔여과를 수행하여 FLAG 펩티드를 제거하였다. 마지막으로, DEAE 세파로스 패스트플로우(DEAE Sepharose Fast Flow) 컬럼을 이용하여 농축하고, 동시에 Tween 20을 포함하지 않는 PBS(500mM NaCl 포함)로 용출함으로써 완충액 치환을 하였다.

가용형 사람 GPC3 코어단백질의 제작

상기 야생형 사람 GPC3 cDNA를 주형으로 하여, 어셈블리 PCR법에 의해 495번째와 509번째의 Ser을 Ala로 치환시킨 cDNA를 제작하였다. 이 때, C 말단에 His 태그(tag)이 붙도록 프라이머를 설계하고, 수득된 cDNA를 pCXND3 벡터에 클로닝하였다. 제작된 발현 플라스미드 DNA를 DXB11 세포주에 도입하고, 500㎍/mL 제네티신(Geneticin)에서의 선발에 의해, 가용형 GPC3 코어단백질 고발현 CHO 세포주를 얻었다.

1,700cm² 롤러병(roller bottle)을 이용하여 대량 배양하고, 배양 상등액을 회수하여 정제하였다. 배양 상등액을 Q 세파로스 패스트플로우(Q Sepharose Fast Flow, Amersham CAT# 17-0510-01)에 로딩하고, 워싱한 후, 500mM NaCl을 포함하는 인산 완충액으로 용출하였다. 다음에, 킬레이팅 세파로스 패스트플로우(Chelating Sepharose Fast Flow, Amersham CAT# 17-0575-01)을 이용하여 정제하였다. 10 내지 150mM의 이미다졸로 농도구배 용출을 하였다. 마지막으로, Q 세파로스 패스트플로우(Q sepharose Fast Flow)를 이용하여 농축하고, 500mM NaCl을 포함하는 인산 완충액으로 용출하였다.

SDS 폴리아크릴아미드 젤 전기영동 결과, 50 내지 300kDa의 약한(smear) 밴드와 약 40kDa의 밴드를 얻었다. 도 2에 전기영동의 결과를 나타내었다. GPC3은 69kDa의 C 말단에 황산헤파란 부가서열을 가지는 프로테오글리칸이다. 약한 밴드는 황산헤파란 수식을 받은 GPC3로 생각된다. 약 40kDa의 밴드는 아미노산 서열의 결과, GPC3의 N 말단 측 단편을 기점으로 하고 있으며, GPC3은 다소 잘린 단편이라고 예상되었다.

이하의 하이브리도마의 스크리닝에서 황산헤파란에 대한 항체를 배제하기 위해, 황산헤파란 부가 시그널 서열인 495번째와 509번째의 Ser을 Ala로 치환시킨 가용형 GPC3 코어단백질을 제작하였다. 마찬가지로, CHO 고발현 주를 구축하고, 배양 상등액으로 His 태그를 이용한 친화 크로마토그래피 정제를 하였다. SDS 폴리아크릴아미드 젤 전기영동의 결과, 70kDa, 40kDa, 30kDa의 3개의 밴드가 수득되었다. 아미노산 서열분석 결과, 30kDa의 밴드는 GPC3의 C 말단측 단편임이 밝혀졌으며, GPC3은 358번째의 아르기닌과 359번째의 세린 사이에서 어떠한 효소적인 절단을 받고 있음이 시사되었다. 황산헤파란 부가형 GPC3에서 전기 30kDa의 밴드가 확인되지 않은 것은 황산헤파란이 부가되어 있어, 약한 밴드로 되었기 때문으로 생각된다. GPC3이 특정의 아미노산 서열로 효소적인 절단을 받는다는 것은 새롭게 알려진 사실이며, 생물학적 의의에 관해서는 아직 명확하게 밝혀지지 않았다.

본 발명자들은 상기 결과에 의해, 간암 환자에 있어서도 막 위의 GPC3이 절단되어, 가용형으로 GPC3이 혈중에 분비될 것이라는 가설을 세웠다. GPC3은 간암 종양 마커인 AFP와 비교하여 볼 때, 보다 조기(earlier stage)의 간암환자에서 유전자의 발현이 고수치인 것으로 확인되었기 때문에(참조: 도 1), AFP보다 임상적 유용성이 높은 새로운 종양 마커로의 가능성에 대해 검토하기 위해, 실시예 2 이하에 기재한 바와 같이, 항 GPC3 항체를 제작하고, 샌드위치 ELISA 시스템을 구축하였다.

항 GPC3 항체의 제작

사람 GPC3와 마우스 GPC3의 상동성은 아미노산 수준에서 94%의 높은 상동성을 나타내기 때문에, 통상의 마우스에 면역시켜도 항 GPC3 항체를 얻기가 어려울 수 있음을 감안하여, 자기 면역질환 마우스인 MRL/lpr 마우스(CRL) 5마리에 가용형 GPC3을 면역시켰다. 첫회 면역에는 면역 단백질을 마리당 100㎍이 되도록 제작하고, FCA(프로인트 완전 어쥬번트(H37 Ra), Difco(3113-60), 벡턴 디킨슨(Becton Dickinson, cat# 231131))를 이용하여 에멀전화 한 것을 피하에 투여하였다. 2주간 후에 마리당 50㎍이 되도록 제조한 것을 FIA(프로인트 불완전 어쥬번트, Difco(0639-60), Becton Dickinson(cat#263910))로 에멀전화하여 이를 피하에 투여하였다. 이후, 1주간 간격으로 추가면역을 총 5회 수행하였다. 최종 면역에 대해서는 마리당 50㎍이 되도록 PBS에 희석하고, 꼬리 정맥(caudal vein) 내에 투여하였다. GPC3 코어단백질을 코팅한 면역 플레이트를 이용한 ELISA에 의해 GPC3에 대한 혈청 중의 항체가가 포화하고 있는지를 확인한 후, 마우스 골수종 세포 P3U1과 마우스 비장세포를 혼합하여, PEG1500(Roche Diagnostics, cat# 783641)에 의해 세포융합을 수행하였다. 96웰 배양 플레이트에 접종하고, 다음날부터 HAT 배지로 선택후 배양 상등액을 ELISA로 스크리닝하였다. 양성 클론에 대해서는 한계 희석법에 의해 모노클론화 한 후, 확대배양을 하여, 배양 상등액을 회수하였다. ELISA에 의한 스크리닝은 GPC3 코어단백질과의 결합 활성을 지표로 하여, 강한 결합능을 가지는 항 GPC3 항체를 6클론 수득하였다.

항체는 하이트랩 프로틴G HP(Hi Trap ProteinG HP, Amersham CAT# 17-0404-01)를 이용하여 정제하였다. 하이브리도마 배양 상등액을 직접 컬럼에 로딩하고, 결합 완충액(20mM 인산 나트륨(pH 7.0))으로 세척한 후, 용출 완충액(0.1M 글리신-HCl(pH 2.7))으로 용출하였다. 용출은 중화 완충액(1M Tris-HCl(pH 9.0))을 포함하는 시험관 내로 용출하도록 하여 중화하였다. 항체 분획을 모은 후, 0.05% Tween 20/ PBS로 주야로 투석(dialysis)을 하여 완충액 치환을 하였다. 정제된 항체는 0.02%가 되도록 NaN₃을 첨가한 후, 4℃에서 보관하였다.

항 GPC3 항체의 해석

항체농도는 염소 항 마우스 IgG(gamma)(ZYMED CAT# 62-6600)와 알칼라인포스파타제-염소 항 마우스 IgG(gamma)(ZYMED CAT# 62-6622)를 이용한 마우스 IgG 샌드위치 ELISA를 수행하고, 시판의 정제 마우스 IgG1 항체(ZYMED CAT# 02-6100)을 스탠다드로 하여 정량하였다.

항 GPC3 항체의 아이소타이핑(isotyping)은 이뮤노푸어 단클론 항체 아이소타입 키트II(ImmunoPure Monoclonal Antibody Isotyping Kit II, PIERCE CAT# 37502)를 이용하였으며, 방법은 첨부의 매뉴얼에 따랐다. 아이소타이핑의 결과 전부 IgG 형이었다.

GPC3 코어단백질을 이용한 웨스턴 블로팅으로 항 GPC3 항체의 에피토프를 분류하였다. 레인당 100ng이 되도록 가용형 GPC3 코어단백질을 10% SDS-PAGE mini(TEFCO CAT# 01-075)에 로딩하고, 전기영동(60V 30min, 120V 90min)을 한 후, 트랜스-블롯 SD 세미드라이 전기영동 전이장치(Trans-Blot SD Semi-Dry Electrophoretic Transfer Cell, BIO-RAD)를 이용하여 이모빌론-P(Immobilon-P, Millipore CAT# IPVH R85 10)에 상기 가용형 GPC3 코어단백질을 옮겼다(15V 60min). 멤브레인을 TBS-T(0.05% Tween 20, TBS)로 가볍게 세척한 후, 5% 스킴밀크가 들어있는 TBS-T로 1시간(실온) 또는 하룻밤(4℃) 쉐이킹하였다. TBS-T로 약 10분간 흔들어 준 후, 1% 스킴밀크가 들어있는 TBS-T로 0.1 내지 10㎍/mL로 희석한 각 항 GPC3 항체를 가하여 1시간 흔들어주었다. TBS-T로 세척하고(10분간 x 3회), 1% 스킴밀크가 들어있는 TBS-T로 1.1000로 희석한 HRP-항 마우스 IgG 항체(Amersham CAT# NA931)로 1시간 흔들어 준 후, TBS-T로 세척하였다(10분간 x 3회). 발색은 ECL-Plus(Amersham RPN2132)를 이용하고, 하이퍼필름 ECL(Hyperfilm ECL, Amersham CAT# RPN2103K)을 이용하여 현상하였다. 도 4에 웨스턴블로팅 해석의 결과를 도시하였다. 40kDa의 밴드에 반응하는 항체는 N 말단에 에피토프를 가지고, 30kDa의 밴드에 반응하는 항체는 C 말단에 에피토프를 가지는 것으로 판단하고 분류하였다. N 말단 측을 인식하는 항체로 M6B1, M18D4, M19B11, C 말단 측을 인식하는 항체로 M3C11, M13B3, M3B8을 수득하였다. BIACORE를 이용한 해석의 결과, 각 항체의 KD 값은 0.2 내지 17.6nM 이었다.

실시예 3: 가용성 GPC3의 검출

마우스 이종이식(xenograft) 모델

6주된 자성의 SCID 마우스(Fox CHASE C.B-17/ Icr-scid Jcl, 일본 클레어 주식회사) 및 누드 마우스(BALB/cA Jcl-nu, 일본 클레어 주식회사)의 복부피하에 사람 간염 HepG2 세포를 300만개 이식하였다. 종양이 충분히 형성된 53일 후에 HepG2 이식 SCID 마우스 #1,3,4의 후대정맥에서 전채혈하고, EDTA-2Na와 아프로티닌(Nipro Neotube vacuum blood tube, NIPRO, NT-EA0205) 존재하에서 혈장을 제조하였으며, 측정일까지 -20℃에서 보관하였다. 또한, HepG2 이식 SCID 마우스 #2는 HepG2 이식 62일 후에, HepG2 이식 누드 마우스 #1,2는 이식 66일 후에 후대정맥에서 전채혈하였다. 대조구로서, 동일 연령의 정상 SCID 마우스로부터 동일한 조작으로 혈장을 제조하였다.

샌드위치 ELISA

혈중의 가용형 GPC3을 검출하기 위해, GPC3의 샌드위치 ELISA 시스템을 구축하였다. 96웰 플레이트에 코팅하는 항체에는 M6B1을, M6B1에 결합한 GPC3을 검출하는 항체로 비오틴으로 표지한 M18D4를 이용하였다. 발색에는 높은 검출감도를 달성하기 위해 DAKO사의 AMPAK를 이용하였다.

96웰 면역 플레이트에 10㎍/mL이 되도록 항 GPC3 항체를 코팅 완충액(0.1M NaHCO₃(pH 9.6), 0.02%(w/v) NaN₃)으로 희석한 것을 코팅하고, 4℃에서 하룻밤 방치하였다. 다음날 300㎕/well의 세척 완충액(0.05%(v/v) Tween 20, PBS)으로 3회 세척한 후, 200㎕의 희석 완충액(50mM Tris-HCl(pH 8.1), 1mM MgCl₂, 150mM NaCl, 0.05%(v/v) Tween 20, 0.02%(w/v) NaN₃, 1%(w/v) BSA)을 가하여 블로킹하였다. 실온에서 수 시간 후 또는 4℃에서 하룻밤 보관한 후, 마우스 혈장 또는 배양 상등액을 희석 완충액으로 적당히 희석한 것을 가하여 1시간 실온에서 반응시켰다. 300㎕/well의 RB로 3회 세척한 후, 희석 완충액으로 10㎍/mL이 되도록 희석한 비오틴을 표지한 항 GPC3 항체를 가하여 1시간 실온에서 반응시켰다. 300㎕/well의 RB로 3회 세척한 후, 희석 완충액으로 1/1000로 희석한 AP-스트렙토아비딘(ZYMED)을 가하여, 1시간 실온에서 반응시켰다. 300㎕/well의 세척 완충액으로 5회 세척한 후, 첨부의 프로토콜에 따라 AMPAK(DAKO CAT# K6200)을 이용하여 발색시키고, 마이크로플레이트 리더기로 흡광도를 측정하였다.

항체의 비오틴화에는 Roche사의 비오틴 표지 키트(Biotin Labeling Kit, CAT# 1 418 165)을 이용하였다. 또한, 샘플 중의 가용형 GPC3 농도의 환산에는 표 계산 소프트 GlaphPad PRISM(GlaphPad software Inc. ver.3.0)을 이용하여 해석하였다. 도 5에 본 실시예의 샌드위치 ELISA의 원리를 도시하였다.

정제 가용형 GPC3를 이용하여 표준곡선을 제작한 결과, 검출한계가 수 ng/mL의 시스템을 구축할 수 있었다. 도 6에 M6B1 및 M18D4를 이용한 GPC3 샌드위치 ELISA의 표준곡선을 나타내었다. 전기 시스템을 이용하여, 전술한 HepG2의 배양 상등액 및 사람 간암 HepG2 세포를 이식한 마우스 혈청 중의 분비형 GPC3 검출을 시험하였다. 대조구의 배지 및 대조구 마우스 혈청에서는 가용형 GPC3이 검출한계 이하였던 것에 대해, HepG2의 배양 상등액 및 사람 간암 HepG2 세포를 이식한 마우스 혈청 중에 가용형 GPC3이 검출되었다. 정제 가용형 GPC3의 농도로 환산하면, HepG2 배양 상등액에서는 1.2㎍/mL, 마우스 혈청에서도 23 내지 90ng/mL이었다(참조: 표 1).

표 1: HepG2 이식 마우스 혈장 중의 가용형 GPC3 농도의 측정(ng/mL)

분비형 GPC3의 구조

이전에 세웠던 가설대로, GPC3이 358번째의 아르기닌과 359번째의 세린 사이에서 절단을 받아 분비되는 지에 대하여 검토하였다. 분비형 GPC3이 N 말단 단편이었던 경우, N 말단 인식항체와 C 말단 인식항체의 조합의 샌드위치 ELISA에서는 검출할 수 없다고 생각되었다. N 말단 단편을 인식하는 항체 및 C 말단 단편을 인식하는 항체 각각 3종씩을 이용하여, 다양한 조합의 샌드위치 ELISA 시스템을 구축하였다. 도 7에 분비형 가용화 GPC3의 구조를, 도 8에 항체의 조합을 도시하였다. 도 9에 이러한 샌드위치 ELISA의 표준곡선을 도시하였다. 표 1에 측정결과를 나타내었지만, 표 1에 나타낸 바와 같이, HepG2의 배양 상등액 및 사람 간암 HepG2 세포를 이식한 마우스 혈청 중의 분비형 GPC3의 검출은 N 말단 단편 인식항체끼리의 조합에서는 높은 수치를 보이고, C 말단 단편 인식항체를 포함하는 시스템에서는 많은 마우스에서 검출한계 이하를 보였다. 이러한 사실로부터, 이번에 밝혀진 분비형 GPC3은 N 말단 단편이 우위인 것으로 예상되었다.

실시예에 나타낸 바와 같이, 간암세포에서 고발현하고 있는 GPC3은 일부 분비형으로 혈액 중에 존재할 가능성이 시사되었다. GPC3은 간암 마커인 AFP보다도 조기의 암에서 유전자 발현이 확인되고 있어서, GPC3의 검출은 암의 진단으로 유용하다고 생각된다. GPC3은 간암세포주 이외에, 폐암, 대장암, 유방암, 전립선암, 췌장암, 림프종 등의 암세포주에 있어서도 발현이 확인되고 있어서, 간암 이외의 진단에도 적용할 수 있을 것이다.

또한, 분비형 GPC3은 아미노산 358번째의 아르기닌과 359번째의 세린 사이에서 절단된 N 말단 단편이 우위일 가능성이 시사되었다. 이로써, 진단용 항체로는 N 말단 단편 인식항체가 유용하다고 생각된다. 또한, ADCC 활성 및 CDC 활성을 가지는 간암 치료용 항체로는 C 말단 단편 인식항체를 사용하면, 혈중의 분비형 GPC3에 포획되지 않고, 효율적으로 간암세포에 도달하는 것이 가능하다고 생각된다.

본 명세서에 인용된 모든 간행물은 그 내용의 전체를 본 명세서에 도입하는 것으로 한다. 또한, 첨부의 청구범위에 기재되는 기술사상 및 발명의 범위를 일탈하지 않는 범위 내에서, 본 발명의 여러가지 형태 및 변경이 가능하다는 것은 당업자에게 쉽게 이해될 것이다. 본 발명은 이러한 변형 및 변경도 포함하는 것을 의도하고 있다.

<110> PERSEUS PROTEOMICS INC. <120> METHOD OF DIAGNOSING CANCER BY DETECTING GPC3 <150> PCT/JP02/08997 <151> 2002-09-04 <160> 6 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic DNA <400> 1 gatatcatgg ccgggaccgt gcgcaccgcg t 31 <210> 2 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic DNA <400> 2 gctagctcag tgcaccagga agaagaagca c 31 <210> 3 <211> 2300 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (109)..(1848) <400> 3 cagcacgtct cttgctcctc agggccactg ccaggcttgc cgagtcctgg gactgctctc 60 gctccggctg ccactctccc gcgctctcct agctccctgc gaagcagg atg gcc ggg 117 Met Ala Gly 1 acc gtg cgc acc gcg tgc ttg gtg gtg gcg atg ctg ctc agc ttg gac 165 Thr Val Arg Thr Ala Cys Leu Val Val Ala Met Leu Leu Ser Leu Asp 5 10 15 ttc ccg gga cag gcg cag ccc ccg ccg ccg ccg ccg gac gcc acc tgt 213 Phe Pro Gly Gln Ala Gln Pro Pro Pro Pro Pro Pro Asp Ala Thr Cys 20 25 30 35 cac caa gtc cgc tcc ttc ttc cag aga ctg cag ccc gga ctc aag tgg 261 His Gln Val Arg Ser Phe Phe Gln Arg Leu Gln Pro Gly Leu Lys Trp 40 45 50 gtg cca gaa act ccc gtg cca gga tca gat ttg caa gta tgt ctc cct 309 Val Pro Glu Thr Pro Val Pro Gly Ser Asp Leu Gln Val Cys Leu Pro 55 60 65 aag ggc cca aca tgc tgc tca aga aag atg gaa gaa aaa tac caa cta 357 Lys Gly Pro Thr Cys Cys Ser Arg Lys Met Glu Glu Lys Tyr Gln Leu 70 75 80 aca gca cga ttg aac atg gaa cag ctg ctt cag tct gca agt atg gag 405 Thr Ala Arg Leu Asn Met Glu Gln Leu Leu Gln Ser Ala Ser Met Glu 85 90 95 ctc aag ttc tta att att cag aat gct gcg gtt ttc caa gag gcc ttt 453 Leu Lys Phe Leu Ile Ile Gln Asn Ala Ala Val Phe Gln Glu Ala Phe 100 105 110 115 gaa att gtt gtt cgc cat gcc aag aac tac acc aat gcc atg ttc aag 501 Glu Ile Val Val Arg His Ala Lys Asn Tyr Thr Asn Ala Met Phe Lys 120 125 130 aac aac tac cca agc ctg act cca caa gct ttt gag ttt gtg ggt gaa 549 Asn Asn Tyr Pro Ser Leu Thr Pro Gln Ala Phe Glu Phe Val Gly Glu 135 140 145 ttt ttc aca gat gtg tct ctc tac atc ttg ggt tct gac atc aat gta 597 Phe Phe Thr Asp Val Ser Leu Tyr Ile Leu Gly Ser Asp Ile Asn Val 150 155 160 gat gac atg gtc aat gaa ttg ttt gac agc ctg ttt cca gtc atc tat 645 Asp Asp Met Val Asn Glu Leu Phe Asp Ser Leu Phe Pro Val Ile Tyr 165 170 175 acc cag cta atg aac cca ggc ctg cct gat tca gcc ttg gac atc aat 693 Thr Gln Leu Met Asn Pro Gly Leu Pro Asp Ser Ala Leu Asp Ile Asn 180 185 190 195 gag tgc ctc cga gga gca aga cgt gac ctg aaa gta ttt ggg aat ttc 741 Glu Cys Leu Arg Gly Ala Arg Arg Asp Leu Lys Val Phe Gly Asn Phe 200 205 210 ccc aag ctt att atg acc cag gtt tcc aag tca ctg caa gtc act agg 789 Pro Lys Leu Ile Met Thr Gln Val Ser Lys Ser Leu Gln Val Thr Arg 215 220 225 atc ttc ctt cag gct ctg aat ctt gga att gaa gtg atc aac aca act 837 Ile Phe Leu Gln Ala Leu Asn Leu Gly Ile Glu Val Ile Asn Thr Thr 230 235 240 gat cac ctg aag ttc agt aag gac tgt ggc cga atg ctc acc aga atg 885 Asp His Leu Lys Phe Ser Lys Asp Cys Gly Arg Met Leu Thr Arg Met 245 250 255 tgg tac tgc tct tac tgc cag gga ctg atg atg gtt aaa ccc tgt 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gaa acc tta tcc agc cga 1269 Val Leu Lys Val Ala His Val Glu His Glu Glu Thr Leu Ser Ser Arg 375 380 385 aga agg gaa cta att cag aag ttg aag tct ttc atc agc ttc tat agt 1317 Arg Arg Glu Leu Ile Gln Lys Leu Lys Ser Phe Ile Ser Phe Tyr Ser 390 395 400 gct ttg cct ggc tac atc tgc agc cat agc cct gtg gcg gaa aac gac 1365 Ala Leu Pro Gly Tyr Ile Cys Ser His Ser Pro Val Ala Glu Asn Asp 405 410 415 acc ctt tgc tgg aat gga caa gaa ctc gtg gag aga tac agc caa aag 1413 Thr Leu Cys Trp Asn Gly Gln Glu Leu Val Glu Arg Tyr Ser Gln Lys 420 425 430 435 gca gca agg aat gga atg aaa aac cag ttc aat ctc cat gag ctg aaa 1461 Ala Ala Arg Asn Gly Met Lys Asn Gln Phe Asn Leu His Glu Leu Lys 440 445 450 atg aag ggc cct gag cca gtg gtc agt caa att att gac aaa ctg aag 1509 Met Lys Gly Pro Glu Pro Val Val Ser Gln Ile Ile Asp Lys Leu Lys 455 460 465 cac att aac cag ctc ctg aga acc atg tct atg ccc aaa ggt aga gtt 1557 His Ile Asn Gln Leu Leu Arg Thr Met Ser Met Pro Lys Gly Arg Val 470 475 480 ctg gat aaa aac ctg gat gag gaa ggg ttt gaa agt gga gac tgc ggt 1605 Leu Asp Lys Asn Leu Asp Glu Glu Gly Phe Glu Ser Gly Asp Cys Gly 485 490 495 gat gat gaa gat gag tgc att gga ggc tct ggt gat gga atg ata aaa 1653 Asp Asp Glu Asp Glu Cys Ile Gly Gly Ser Gly Asp Gly Met Ile Lys 500 505 510 515 gtg aag aat cag ctc cgc ttc ctt gca gaa ctg gcc tat gat ctg gat 1701 Val Lys Asn Gln Leu Arg Phe Leu Ala Glu Leu Ala Tyr Asp Leu Asp 520 525 530 gtg gat gat gcg cct gga aac agt cag cag gca act ccg aag gac aac 1749 Val Asp Asp Ala Pro Gly Asn Ser Gln Gln Ala Thr Pro Lys Asp Asn 535 540 545 gag ata agc acc ttt cac aac ctc ggg aac gtt cat tcc ccg ctg aag 1797 Glu Ile Ser Thr Phe His Asn Leu Gly Asn Val His Ser Pro Leu Lys 550 555 560 ctt ctc acc agc atg gcc atc tcg gtg gtg tgc ttc ttc ttc ctg gtg 1845 Leu Leu Thr Ser Met Ala Ile Ser Val Val Cys Phe Phe Phe Leu Val 565 570 575 cac tg actgcctggt gcccagcaca tgtgctgccc tacagcaccc tgtggtcttc 1900 His 580 ctcgataaag ggaaccactt tcttattttt ttctattttt ttttttttgt tatcctgtat 1960 acctcctcca gccatgaagt agaggactaa ccatgtgtta tgttttcgaa aatcaaatgg 2020 tatcttttgg aggaagatac attttagtgg tagcatatag attgtccttt tgcaaagaaa 2080 gaaaaaaaac catcaagttg tgccaaatta ttctcctatg tttggctgct agaacatggt 2140 taccatgtct ttctctctca ctccctccct ttctatcgtt ctctctttgc atggatttct 2200 ttgaaaaaaa ataaattgct caaataaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2260 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2300 <210> 4 <211> 580 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Met Ala Gly Thr Val Arg Thr Ala Cys Leu Val Val Ala Met Leu Leu 1 5 10 15 Ser Leu Asp Phe Pro Gly Gln Ala Gln Pro Pro Pro Pro Pro Pro Asp 20 25 30 Ala Thr Cys His Gln Val Arg Ser Phe Phe Gln Arg Leu Gln Pro Gly 35 40 45 Leu Lys Trp Val Pro Glu Thr Pro Val Pro Gly Ser Asp Leu Gln Val 50 55 60 Cys Leu Pro Lys Gly Pro Thr Cys Cys Ser Arg Lys Met Glu Glu Lys 65 70 75 80 Tyr Gln Leu Thr Ala Arg Leu Asn Met Glu Gln Leu Leu Gln Ser Ala 85 90 95 Ser Met Glu Leu Lys Phe Leu Ile Ile Gln Asn Ala Ala Val Phe Gln 100 105 110 Glu Ala Phe Glu Ile Val Val Arg His Ala Lys Asn Tyr Thr Asn Ala 115 120 125 Met Phe Lys Asn Asn Tyr Pro Ser Leu Thr Pro Gln Ala Phe Glu Phe 130 135 140 Val Gly Glu Phe Phe Thr Asp Val Ser Leu Tyr Ile Leu Gly Ser Asp 145 150 155 160 Ile Asn Val Asp Asp Met Val Asn Glu Leu Phe Asp Ser Leu Phe Pro 165 170 175 Val Ile Tyr Thr Gln Leu Met Asn Pro Gly Leu Pro Asp Ser Ala Leu 180 185 190 Asp Ile Asn Glu Cys Leu Arg Gly Ala Arg Arg Asp Leu Lys Val Phe 195 200 205 Gly Asn Phe Pro Lys Leu Ile Met Thr Gln Val Ser Lys Ser Leu Gln 210 215 220 Val Thr Arg Ile Phe Leu Gln Ala Leu Asn Leu Gly Ile Glu Val Ile 225 230 235 240 Asn Thr Thr Asp His Leu Lys Phe Ser Lys Asp Cys Gly Arg Met Leu 245 250 255 Thr Arg Met Trp Tyr Cys Ser Tyr Cys Gln Gly Leu Met Met Val Lys 260 265 270 Pro Cys Gly Gly Tyr Cys Asn Val Val Met Gln Gly Cys Met Ala Gly 275 280 285 Val Val Glu Ile Asp Lys Tyr Trp Arg Glu Tyr Ile Leu Ser Leu Glu 290 295 300 Glu Leu Val Asn Gly Met Tyr Arg Ile Tyr Asp Met Glu Asn Val Leu 305 310 315 320 Leu Gly Leu Phe Ser Thr Ile His Asp Ser Ile Gln Tyr Val Gln Lys 325 330 335 Asn Ala Gly Lys Leu Thr Thr Thr Ile Gly Lys Leu Cys Ala His Ser 340 345 350 Gln Gln Arg Gln Tyr Arg Ser Ala Tyr Tyr Pro Glu Asp Leu Phe Ile 355 360 365 Asp Lys Lys Val Leu Lys Val Ala His Val Glu His Glu Glu Thr Leu 370 375 380 Ser Ser Arg Arg Arg Glu Leu Ile Gln Lys Leu Lys Ser Phe Ile Ser 385 390 395 400 Phe Tyr Ser Ala Leu Pro Gly Tyr Ile Cys Ser His Ser Pro Val Ala 405 410 415 Glu Asn Asp Thr Leu Cys Trp Asn Gly Gln Glu Leu Val Glu Arg Tyr 420 425 430 Ser Gln Lys Ala Ala Arg Asn Gly Met Lys Asn Gln Phe Asn Leu His 435 440 445 Glu Leu Lys Met Lys Gly Pro Glu Pro Val Val Ser Gln Ile Ile Asp 450 455 460 Lys Leu Lys His Ile Asn Gln Leu Leu Arg Thr Met Ser Met Pro Lys 465 470 475 480 Gly Arg Val Leu Asp Lys Asn Leu Asp Glu Glu Gly Phe Glu Ser Gly 485 490 495 Asp Cys Gly Asp Asp Glu Asp Glu Cys Ile Gly Gly Ser Gly Asp Gly 500 505 510 Met Ile Lys Val Lys Asn Gln Leu Arg Phe Leu Ala Glu Leu Ala Tyr 515 520 525 Asp Leu Asp Val Asp Asp Ala Pro Gly Asn Ser Gln Gln Ala Thr Pro 530 535 540 Lys Asp Asn Glu Ile Ser Thr Phe His Asn Leu Gly Asn Val His Ser 545 550 555 560 Pro Leu Lys Leu Leu Thr Ser Met Ala Ile Ser Val Val Cys Phe Phe 565 570 575 Phe Leu Val His 580 <210> 5 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic DNA <400> 5 atagaattcc accatggccg ggaccgtgcg c 31 <210> 6 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic DNA <400> 6 ataggatccc ttcagcgggg aatgaacgtt c 31

Claims

피검시료 중의 가용화 GPC3 단백질을 검출하는 단계를 포함하는 암의 진단방법.
제 1항에 있어서,

상기 가용화 GPC3 단백질은 GPC3의 N 말단 펩티드인 것을 특징으로 하 는

암의 진단방법.
제 2항에 있어서,

상기 GPC3의 N 말단 펩티드는 GPC3의 제 1번째 아미노산부터 제 374번 째 아미노산까지로 구성된 아미노산 서열 중 또는 제 1번째 아미노산 부터 제 358번째 아미노산까지로 구성된 아미노산 서열 중에 포함되는 펩티드 단편인 것을 특징으로 하는

암의 진단방법.
제 1항 내지 제 3항의 어느 한 항에 있어서,

피검시료는 혈액, 혈청, 혈장 중 어느 하나인 것을 특징으로 하는

암의 진단방법.
제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 암은 간암인 것을 특징으로 하는

암의 진단방법.
제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 있어서,

항 GPC3 항체를 이용하는 것을 특징으로 하는

암의 진단방법.
제 6항에 있어서,

지지체에 고정된 항 GPC3 항체와 표지물질로 표지된 항 GPC3 항체를 이용하는 것을 특징으로 하는

암의 진단방법.
제 7항에 있어서,

상기 표지물질은 비오틴인 것을 특징으로 하는

암의 진단방법.
항 GPC3 항체를 포함하는 암의 진단시약.
제 9항에 있어서,

지지체에 고정된 항 GPC3 항체와 표지물질로 표지된 항체를 포함하는 것을 특징으로 하는

암의 진단시약.
제 9항 또는 제 10항에 있어서,

상기 암은 간암인 것을 특징으로 하는

암의 진단시약.
제 9항 내지 제 11항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 항 GPC3 항체는 GPC3의 N 말단 펩티드를 인식하는 것을 특징으로 하는

암의 진단시약.
항 GPC3 항체를 포함하는 암의 진단키트.
제 13항에 있어서,

지지체에 고정된 항 GPC3 항체와 표지물질로 표지된 항체를 포함하는 것을 특징으로 하는

암의 진단키트.