KR20170003972A - Gpc3 표적 치료제 요법이 유효한 환자에게 투여되는 gpc3 표적 치료제 - Google Patents

Gpc3 표적 치료제 요법이 유효한 환자에게 투여되는 gpc3 표적 치료제 Download PDF

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Abstract

GPC3 표적 치료제 요법을 받기 전의 환자 또는 환자에 있어서의 암에 대한 GPC3 표적 치료제 요법의 유효성을 결정하거나, 또는 환자에 대한 GPC3 표적 치료제 요법의 계속을 결정하는 방법으로서, GPC3 표적 치료제 요법을 받기 전의 환자 및/또는 GPC3 표적 치료제 요법을 받은 환자로부터 단리된 생물학적 시료 중의 면역 세포수 또는 당해 면역 세포 상에 발현되어 있는 분자의 발현량을 측정하는 것을 포함하고, 당해 세포수 또는 발현량이 소정의 값인 경우에 당해 GPC3 표적 치료제 요법이 유효하다고 결정하거나, 또는 당해 GPC3 표적 치료제 요법의 계속을 결정하는 방법이 개시된다. 또한, GPC3 표적 치료제 요법이 유효하다고 결정되거나, 또는 GPC3 표적 치료제 요법을 계속하는 것이 결정된 환자에게 투여하기 위한 GPC3 표적 치료제 또는 제제도 개시된다.

Description

GPC3 표적 치료제 요법이 유효한 환자에게 투여되는 GPC3 표적 치료제{GPC3-TARGETED THERAPEUTIC AGENT FOR ADMINISTRATION TO PATIENTS FOR WHOM GPC3-TARGETED THERAPEUTIC AGENT THERAPY IS EFFECTIVE}
본 발명은 환자에 있어서의 암에 대한 GPC3 표적 치료제 요법의 유효성을 결정하거나, 또는 환자에 대한 GPC3 표적 치료제 요법의 계속을 결정하는 방법, GPC3 표적 치료제 요법이 유효하다고 결정되거나, 또는 GPC3 표적 치료제 요법을 계속하는 것이 결정된 환자에게 추가로 투여하기 위한 GPC3 표적 치료제 또는 제제를 제공한다.
간 세포 암에 기인하는 사망은 연중으로 60만에 상당하여, 세계의 암에 의한 사망 중에서는 5번째에 위치한다고 일컬어지고 있다(비특허문헌 1). 간 세포 암의 대부분은 그 질환이라는 진단 후 1년 이내에 사망한다. 불행하게도, 간 세포 암은 치유 가능한 요법이 그다지 주효하지 않은 후기 스테이지에서 진단되는 예가 빈번하다. 이러한 환자에 대한 화학 요법, 화학 색전술, 소작(燒灼)이나 양자 빔 요법을 포함하는 의료 처치의 효과는 여전히 불충분하다. 많은 환자가 질환의 재발을 나타내며, 이는 혈관 침윤 및 다부위 간내 전이를 수반하여 진행 스테이지로 급속히 진행되어, 그의 5년 생존율은 7%에 지나지 않는다(비특허문헌 2). 국부 암의 절제술이 가능한 간 세포 암의 환자의 예후는 비교적 좋지만, 그의 5년 생존율은 15% 내지 39%에 머문다(비특허문헌 3). 당해 기술 분야에 있어서는, 이와 같은 악성 질환인 간 세포 암에 대한 신규 요법이 요구되고 있다.
간 세포 암은 일본에 있어서의 원발성 간암의 90% 이상의 원인을 차지한다고 일컬어지고 있다. 이러한 간 세포 암에 대한 내과적 치료 방법으로서는, 예를 들면, 화학 요법제를 이용해서, 종양에 대한 영양 공급 경로가 되는 간 동맥에 유성 조영제(리피오돌)와 항암제, 색전 물질(젤폼)을 혼화한 것을 주입하여, 영양 동맥을 폐색하는 것에 의해, 선택적으로 간 세포 암을 괴사로 유도하는 치료법인 TAE(간 동맥 색전 요법) 외에, 경피적 에탄올 주입법, 경피적 마이크로파 응고 요법, 라디오파 소작 요법 등의 침습을 수반하는 수법이 이용되고 있다. 또한, 화학 요법제로서 5-FU(플루오로우라실), UFT(우라실과 테가푸르), MMC(마이토마이신C), DHAD(미톡산트론), ADR(아드리아마이신), EPI(에피루비신), CDDP(시스플라틴) 등이 단독으로, 또는 IFN(인터페론)과의 병용 요법으로서, 전신 화학 요법의 임상 시험이 행해졌다(비특허문헌 4).
이러한 가운데, Raf/MEK/ERK 시그널 전달을 Raf 키나제의 단계에서 저해하는 것에 의해 암 세포의 증식을 블록하고, 또한 VEGFR-2, VEGFR-3 및 PDGFR-β 티로신 키나제를 표적으로 하는 것에 의해 항혈관 형성 효과를 발휘하여, 상기의 화학 요법제에 비해 유리한 효과를 나타낸 경구 활성형의 소라페닙(Nexavar, BAY43-9006)이 승인되어 있다. 소라페닙의 유효성에 대해서는, 진행성 간 세포 암을 대상으로 한 2개의 제III상 다시설 공동 플라시보 대조 비교 시험(SHARP 시험 및 아시아·태평양 지역에 있어서 실시된 시험)에 있어서 검토가 행해져 있다. 이들 중 어느 시험에 있어서도 생존 기간의 연장이 확인되어, 모두 HR은 0.68이었다. SHARP 시험에서는 생존 기간은 7.9개월로부터 10.7개월로 연장되었다. 한편, 아시아의 시험에서는, 생존 기간은 4.2개월로부터 6.5개월로 연장되었다. 그러나, 객관적 주효율은 낮아, 화상상의 종양 진행까지의 기간은 연장되었지만(구미의 시험에서는 2.8개월로부터 5.5개월, 아시아의 시험에서는 1.4개월로부터 2.8개월), 증상 악화까지의 기간의 연장은 확인되지 않았다. 아시아인 코호트에서는 생존 연장 기간이 짧았지만, 이는 아시아 지역에서는 구미와 비교하여 질환 경과가 약간 늦은 시기에 치료가 개시되었기 때문이다고 생각된다(비특허문헌 5, 6).
일반적으로, 간암의 진행에 수반하여 간 기능 장애를 수반하는, 식욕 부진, 체중 감소, 전신 권태감, 우계륵부 종기 촉지, 우계륵부 통증, 복부 팽만감, 발열, 황달 등의 간암 특유의 증상이 관찰된다. 그렇지만 소라페닙 등의 화학 요법제는, 설사 또는 변비, 빈혈, (치사적인 위독도의) 감염이나 패혈증을 야기할 정도의 면역계의 억제, 출혈, 심독성, 간독성, 신독성, 식욕 부진, 체중 감소 등의 화학 요법제에 고유의 부작용도 병발한다는, 극복해야 할 과제를 갖고 있다.
일반적으로, 간암은 초기에는 특별한 초기 증상은 관찰되지 않지만, 간암의 진행에 수반하여 간 기능 장애를 수반하는, 식욕 부진, 체중 감소, 전신 권태감, 우계륵부 종기 촉지, 우계륵부 통증, 복부 팽만감, 발열, 황달 등의 간암 특유의 증상이 관찰된다. 이러한 증상은 상기의 화학 요법제의 사용에 의해 증폭되는 것이 임상상 관찰된다. 예를 들어, 간암 세포가 검출되는 환자의 식욕 부진, 및 그에 수반되거나 또는 그와는 독립하여 생기는 체중 감소 등의 증상은, 당해 환자에 대한 화학 요법제의 투여에 의해, 비투여와 비교하여 보다 증폭되는 경우가 있다. 이러한 증상이 나타나는 경우에는 당해 화학 요법제의 사용을 단념하지 않을 수 없게 되는 경우도 있어, 상기의 증상의 증폭은 화학 요법제에 의한 치료를 방해하는 요인이 된다. 따라서, 치료 효과의 향상이나 치료를 받는 환자의 QOL의 개선 등의 관점에서 보다 우수한 치료법의 확립이 요구되고 있었다.
글리피칸3(GPC3)은 간암에서 빈번하게 고발현되고 있기 때문에, GPC3은, GPC3의 간암에 있어서의 기능의 동정, 간암의 치료의 표적 또는 간암의 진단의 표적으로서 유용할 것이라고 생각되고 있다.
상기의 정황하에서, GPC3을 간암의 치료의 표적으로 하는 치료제의 개발이 진행되고 있다. GPC3을 발현하는 세포에 대해서 항체 의존성 세포 상해(Antibody-dependent cellular cytotoxicity, 이하 「ADCC」라고 기술된다) 활성 및/또는 보체 의존성 세포 상해(Complement-dependent cytotoxicity, 이하 「CDC」라고 기술된다) 활성을 나타내는 항GPC3 항체를 유효 성분으로서 포함하는 간암 치료제가 개발되었다(특허문헌 1). 또한, ADCC 활성 및 CDC 활성을 갖는 인간화 항GPC3 항체를 유효 성분으로서 포함하는 GPC3 표적 치료제가 개발되었다(특허문헌 2). 또, ADCC 활성이 증강된 인간화 항GPC3 항체(특허문헌 3, 4)에 더하여, ADCC 활성 및 CDC 활성을 갖고, 혈장 중 동태가 개선된 GPC3 항체(특허문헌 5)를 포함하는 GPC3 표적 치료제가 개발되었다. 또한, 이들 항GPC3 항체와 소라페닙 등의 화학 요법제의 병용 요법에 의해 소라페닙 등의 화학 요법제에 의한 단독 요법이 가져오는 부작용 등이 감약됨과 더불어, 양 약제에 의한 상승적 효과를 나타내는 것도 발견되어 있고(특허문헌 6), 치료 효과의 향상이나 치료를 받는 환자의 QOL의 개선 등의 관점에서, GPC3 표적 치료제를 핵심으로 하는 보다 우수한 간암의 치료법이 확립되고 있다.
한편으로, GPC3을 간암의 진단의 표적으로 하는 진단 방법의 개발도 또한 진행되고 있다. GPC3은 세포 표면에 대한 발현 도중 또는 발현 후, 그의 특정 부위에 있어서 콘버타제, 포스포리파제 D, Notum 또는 미동정의 메커니즘에 의해 프로세싱을 받는 것이 알려져 있다(비특허문헌 7, 8). 이러한 현상을 이용하는 것에 의해, 환자의 혈장 중에 존재하는, 프로세싱을 받아 혈장 중에 분비된 가용형 GPC3의 에피토프에 결합하는 항체를 포함하는 간암의 진단약 또는 진단 방법이 개발되어 있다(특허문헌 7). 또한, 환자로부터 단리된 조직 표본 등에 존재하는, 프로세싱을 받은 후에 세포 표면에 여전히 존재하는 계류형 GPC3의 에피토프에 결합하는 항체를 포함하는 간암의 진단약 또는 진단 방법이 개발되어 있다(특허문헌 8). 그렇지만, 이상의 진단약 또는 진단 방법은, 피험 환자에 있어서의 간암의 존재를 검출하는 방법이고, GPC3 표적 치료제 요법을 받은 환자에 있어서의, 당해 요법의 유효성을 결정하는 방법, 또는 당해 환자에 대한 GPC3 표적 치료제 요법의 계속을 결정하는 방법에 대해서는 알려져 있지 않았다.
본 명세서에 있어서 인용되는 참고 문헌은 이하와 같다. 이들 문헌에 기재되는 내용은 모두 본 명세서에 참조로서 도입된다. 한편, 이들 문헌 중 어느 것이 본 명세서에 대한 선행 기술이라고 인정하는 것은 아니다.
WO2003/000883 WO2006/006693 WO2006/046751 WO2007/047291 WO2009/041062 WO2009/122667 WO2004/038420 WO2009/116659
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본 발명은 이와 같은 정황에 비추어 이루어진 것으로, 그 목적은, GPC3 표적 치료제 요법을 받은 환자에 있어서의, 당해 요법의 유효성을 결정하는 방법, 또는 당해 환자에 대한 GPC3 표적 치료제 요법의 계속을 결정하는 방법을 제공하는 것에 있다. 또한, 아울러, GPC3 표적 치료제 요법이 유효하다고 결정되거나, 또는 GPC3 표적 치료제 요법을 계속하는 것이 결정된 환자에게 추가로 투여하기 위한 GPC3 표적 치료제 또는 제제를 제공하는 것에 있다.
본 발명자들은 상기와 같은 정황하에서 예의 연구를 진행시킨 바, GPC3 표적 치료제 요법을 받은 환자로부터 단리된 생물학적 시료 중의 면역 세포수 또는 당해 면역 세포 상에 발현되어 있는 분자의 발현량을 측정하여, 당해 세포수 또는 발현량이 소정의 값인 경우, 또는 GPC3 표적 치료제 요법을 받은 후에 당해 세포수 또는 발현량이 소정의 값인 경우, 당해 GPC3 표적 치료제 요법이 유효하다고 결정하거나, 또는 당해 GPC3 표적 치료제 요법의 계속을 결정하는 방법을 창작했다. 또한, GPC3 표적 치료제 요법이 유효하다고 결정되거나, 또는 GPC3 표적 치료제 요법을 계속하는 것이 결정된 환자에게 투여하기 위한 GPC3 표적 치료제 또는 제제를 창작했다.
보다 구체적으로는 이하의 발명이 제공된다.
〔1〕 환자에 있어서의 암에 대한 GPC3 표적 치료제 요법의 유효성을 결정하거나, 또는 환자에 대한 GPC3 표적 치료제 요법의 계속을 결정하는 방법으로서, GPC3 표적 치료제 요법을 받기 전의 환자 및/또는 GPC3 표적 치료제 요법을 받은 환자로부터 단리된 생물학적 시료 중의, 면역 세포수 또는 당해 세포 상에 발현되어 있는 분자의 발현량을 측정하는 것을 포함하고, 당해 면역 세포수 또는 당해 세포 상에 발현되어 있는 분자의 발현량이 소정의 값인 경우에 당해 GPC3 표적 치료제 요법이 유효하다고 결정하거나, 또는 당해 GPC3 표적 치료제 요법의 계속을 결정하는 방법,
〔2〕 상기 생물학적 시료가 환자로부터 단리된 말초혈인, 〔1〕에 기재된 방법,
〔3〕 상기 면역 세포가 백혈구, 단구, 호중구 및 임파구로부터 선택되는 적어도 1개의 세포인, 〔1〕 또는 〔2〕에 기재된 방법,
〔4〕 상기 임파구가 CD45+ 임파구, CD3+ T세포, CD4+ T세포, 및 CD8+ T세포로부터 선택되는 적어도 1개의 임파구 세포인, 〔3〕에 기재된 방법,
〔5〕 상기 임파구가 CD16+ NK세포, NKp46+ NK세포, 및 CD56-CD16+ NK세포로부터 선택되는 적어도 1개의 임파구 세포인, 〔3〕에 기재된 방법,
〔6〕 상기 면역 세포 상에 발현되어 있는 분자가 CD16 또는 CD107a인, 〔1〕 또는 〔2〕에 기재된 방법,
〔7〕 상기 환자가, FcγRIIIA의 158위의 적어도 1개의 아미노산 잔기가 Val인 다형 및/또는 FcγRIIA의 131위의 적어도 1개의 아미노산 잔기가 His인 다형을 갖는 환자인, 〔1〕 내지 〔6〕 중 어느 하나에 기재된 방법,
〔8〕 상기 암이 간암인 〔1〕 내지 〔7〕 중 어느 하나에 기재된 방법,
〔9〕 상기 GPC3 표적 치료제가 암 환자의 혈중 트러프값으로 200μg/ml 이상이 되도록 투여되는, 〔1〕 내지 〔8〕 중 어느 하나에 기재된 방법,
〔10〕 상기 GPC3 표적 치료제가 항GPC3 항체를 유효 성분으로서 포함하는 치료제인, 〔1〕 내지 〔9〕 중 어느 하나에 기재된 방법,
〔11〕 상기 항GPC3 항체가 항체 의존성 세포 상해(ADCC) 활성 및/또는 보체 의존성 세포 상해(CDC) 활성을 갖는 항체인, 〔10〕에 기재된 방법,
〔12〕 상기 항GPC3 항체가 이하의 (1) 내지 (5) 중 어느 하나;
(1) 서열번호: 4, 서열번호: 5 및 서열번호: 6으로 각각 표시되는 중쇄 CDR1, 중쇄 CDR2 및 중쇄 CDR3, 및 서열번호: 7, 서열번호: 8 및 서열번호: 9로 각각 표시되는 경쇄 CDR1, 경쇄 CDR2 및 경쇄 CDR3;
(2) 서열번호: 12, 서열번호: 13 및 서열번호: 14로 각각 표시되는 중쇄 CDR1, 중쇄 CDR2 및 중쇄 CDR3, 및 서열번호: 15, 서열번호: 16 및 서열번호: 17로 각각 표시되는 경쇄 CDR1, 경쇄 CDR2 및 경쇄 CDR3;
(3) 서열번호: 20, 서열번호: 21 및 서열번호: 22로 각각 표시되는 중쇄 CDR1, 중쇄 CDR2 및 중쇄 CDR3, 및 서열번호: 23, 서열번호: 24 및 서열번호: 25로 각각 표시되는 경쇄 CDR1, 경쇄 CDR2 및 경쇄 CDR3;
(4) 서열번호: 28, 서열번호: 29 및 서열번호: 30으로 각각 표시되는 중쇄 CDR1, 중쇄 CDR2 및 중쇄 CDR3, 및 서열번호: 31, 서열번호: 32 및 서열번호: 33으로 각각 표시되는 경쇄 CDR1, 경쇄 CDR2 및 경쇄 CDR3; 또는
(5) 서열번호: 36, 서열번호: 37 및 서열번호: 38로 각각 표시되는 중쇄 CDR1, 중쇄 CDR2 및 중쇄 CDR3, 및 서열번호: 39, 서열번호: 40 및 서열번호: 41로 각각 표시되는 경쇄 CDR1, 경쇄 CDR2 및 경쇄 CDR3;
을 포함하는 항GPC3 키메라 항체 또는 인간화 항GPC3 항체인 〔10〕 또는 〔11〕에 기재된 방법,
〔13〕상기 항GPC3 항체가 이하 중 어느 하나;
(1) 서열번호: 44, 서열번호: 45, 서열번호: 46, 서열번호: 47, 서열번호: 48, 서열번호: 49 및 서열번호: 50으로 표시되는 중쇄 가변 영역의 군으로부터 선택되는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호: 51로 표시되는 경쇄 가변 영역;
(2) 서열번호: 44, 서열번호: 45, 서열번호: 46, 서열번호: 47, 서열번호: 48, 서열번호: 49 및 서열번호: 50으로 표시되는 중쇄 가변 영역의 군으로부터 선택되는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호: 52, 서열번호: 53, 서열번호: 54, 서열번호: 55, 서열번호: 56, 서열번호: 57, 서열번호: 58, 서열번호: 59, 서열번호: 60, 서열번호: 61, 서열번호: 62, 서열번호: 63, 서열번호: 64, 서열번호: 65 및 서열번호: 66으로 표시되는 경쇄 가변 영역의 군으로부터 선택되는 경쇄 가변 영역;
(3) 서열번호: 67로 표시되는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호: 68로 표시되는 경쇄 가변 영역;
(4) 서열번호: 69로 표시되는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호: 70으로 표시되는 경쇄 가변 영역;
(5) 서열번호: 71로 표시되는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호: 72로 표시되는 경쇄 가변 영역; 또는
(6) 서열번호: 71로 표시되는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호: 73으로 표시되는 경쇄 가변 영역;
을 포함하는 항체인, 〔10〕 내지 〔12〕 중 어느 하나에 기재된 방법,
〔14〕 상기 GPC3 표적 치료제가 항GPC3 항체에 세포 상해성 물질이 연결된 항체를 포함하는, 〔10〕에 기재된 방법,
〔15〕 면역 세포수 또는 당해 면역 세포 상에 발현되어 있는 분자의 발현량이 소정의 값을 갖는 암 환자에게 투여하기 위한 GPC3 표적 치료제,
〔16〕 면역 세포수 또는 당해 면역 세포 상에 발현되어 있는 분자의 발현량이 암 환자로부터 단리된 생물학적 시료 중의 면역 세포수 또는 당해 면역 세포 상에 발현되어 있는 분자의 발현량인, 〔15〕에 기재된 GPC3 표적 치료제,
〔17〕 상기 생물학적 시료가 암 환자로부터 단리된 말초혈인, 〔16〕에 기재된 치료제,
〔18〕 상기 면역 세포가 백혈구, 단구, 호중구 및 임파구로부터 선택되는 적어도 1개의 세포인, 〔15〕 내지 〔17〕 중 어느 하나에 기재된 치료제,
〔19〕 상기 임파구가 CD45+ 임파구, CD3+ T세포, CD4+ T세포, 및 CD8+ T세포로부터 선택되는 적어도 1개의 임파구 세포인, 〔18〕에 기재된 치료제,
〔20〕 상기 임파구가 CD16+ NK세포, NKp46+ NK세포, 및 CD56-CD16+ NK세포로부터 선택되는 적어도 1개의 임파구 세포인, 〔18〕에 기재된 치료제,
〔21〕 상기 면역 세포 상에 발현되어 있는 분자가 CD16 또는 CD107a인, 〔15〕 내지 〔17〕 중 어느 하나에 기재된 치료제,
〔22〕 상기 환자가, FcγRIIIA의 158위의 적어도 1개의 아미노산 잔기가 Val인 다형 및/또는 FcγRIIA의 131위의 적어도 1개의 아미노산 잔기가 His인 다형을 갖는 환자인, 〔15〕 내지 〔21〕 중 어느 하나에 기재된 치료제,
〔23〕 상기 암 환자가 간암 환자인 〔15〕 내지 〔22〕 중 어느 하나에 기재된 치료제,
〔24〕 상기 GPC3 표적 치료제가 암 환자의 혈중 트러프값으로 200μg/ml 이상이 되도록 투여되는, 〔15〕 내지 〔23〕 중 어느 하나에 기재된 치료제,
〔25〕 상기 GPC3 표적 치료제가 항GPC3 항체를 유효 성분으로서 포함하는 치료제인, 〔15〕 내지 〔24〕 중 어느 하나에 기재된 치료제,
〔26〕 상기 항GPC3 항체가 항체 의존성 세포 상해(ADCC) 활성 및/또는 보체 의존성 세포 상해(CDC) 활성을 갖는 항체인, 〔25〕에 기재된 치료제,
〔27〕 상기 항GPC3 항체가 이하의 (1) 내지 (5) 중 어느 하나;
(1) 서열번호: 4, 서열번호: 5 및 서열번호: 6으로 각각 표시되는 중쇄 CDR1, 중쇄 CDR2 및 중쇄 CDR3, 및 서열번호: 7, 서열번호: 8 및 서열번호: 9로 각각 표시되는 경쇄 CDR1, 경쇄 CDR2 및 경쇄 CDR3;
(2) 서열번호: 12, 서열번호: 13 및 서열번호: 14로 각각 표시되는 중쇄 CDR1, 중쇄 CDR2 및 중쇄 CDR3, 및 서열번호: 15, 서열번호: 16 및 서열번호: 17로 각각 표시되는 경쇄 CDR1, 경쇄 CDR2 및 경쇄 CDR3;
(3) 서열번호: 20, 서열번호: 21 및 서열번호: 22로 각각 표시되는 중쇄 CDR1, 중쇄 CDR2 및 중쇄 CDR3, 및 서열번호: 23, 서열번호: 24 및 서열번호: 25로 각각 표시되는 경쇄 CDR1, 경쇄 CDR2 및 경쇄 CDR3;
(4) 서열번호: 28, 서열번호: 29 및 서열번호: 30으로 각각 표시되는 중쇄 CDR1, 중쇄 CDR2 및 중쇄 CDR3, 및 서열번호: 31, 서열번호: 32 및 서열번호: 33으로 각각 표시되는 경쇄 CDR1, 경쇄 CDR2 및 경쇄 CDR3; 또는
(5) 서열번호: 36, 서열번호: 37 및 서열번호: 38로 각각 표시되는 중쇄 CDR1, 중쇄 CDR2 및 중쇄 CDR3, 및 서열번호: 39, 서열번호: 40 및 서열번호: 41로 각각 표시되는 경쇄 CDR1, 경쇄 CDR2 및 경쇄 CDR3;
을 포함하는 항GPC3 키메라 항체 또는 인간화 항GPC3 항체인 〔25〕 또는 〔26〕에 기재된 치료제,
〔28〕 상기 항GPC3 항체가 이하 중 어느 하나;
(1) 서열번호: 44, 서열번호: 45, 서열번호: 46, 서열번호: 47, 서열번호: 48, 서열번호: 49 및 서열번호: 50으로 표시되는 중쇄 가변 영역의 군으로부터 선택되는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호: 51로 표시되는 경쇄 가변 영역;
(2) 서열번호: 44, 서열번호: 45, 서열번호: 46, 서열번호: 47, 서열번호: 48, 서열번호: 49 및 서열번호: 50으로 표시되는 중쇄 가변 영역의 군으로부터 선택되는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호: 52, 서열번호: 53, 서열번호: 54, 서열번호: 55, 서열번호: 56, 서열번호: 57, 서열번호: 58, 서열번호: 59, 서열번호: 60, 서열번호: 61, 서열번호: 62, 서열번호: 63, 서열번호: 64, 서열번호: 65 및 서열번호: 66으로 표시되는 경쇄 가변 영역의 군으로부터 선택되는 경쇄 가변 영역;
(3) 서열번호: 67로 표시되는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호: 68로 표시되는 경쇄 가변 영역;
(4) 서열번호: 69로 표시되는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호: 70으로 표시되는 경쇄 가변 영역;
(5) 서열번호: 71로 표시되는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호: 72로 표시되는 경쇄 가변 영역; 또는
(6) 서열번호: 71로 표시되는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호: 73으로 표시되는 경쇄 가변 영역;
을 포함하는 항체인 〔25〕 내지 〔27〕 중 어느 하나에 기재된 치료제,
〔29〕 상기 GPC3 표적 치료제가 항GPC3 항체에 세포 상해성 물질이 결합된 항체인, 〔25〕에 기재된 치료제,
〔30〕 GPC3 표적 치료제 요법을 받기 전의 암 환자로부터 단리된 생물학적 시료 중의 면역 세포수 또는 당해 면역 세포 상에 발현되어 있는 분자의 발현량이 소정의 값인 환자에게 투여하는 취지의 지시서를 포함하는 GPC3 표적 치료를 위한 제제,
〔31〕 GPC3 표적 치료제 요법을 받은 암 환자로부터 단리된 생물학적 시료 중의 면역 세포수 또는 당해 면역 세포 상에 발현되어 있는 분자의 발현량이 소정의 값인 환자에게 추가로 투여하는 취지의 지시서를 포함하는 GPC3 표적 치료를 위한 제제,
〔32〕 상기 생물학적 시료가 암 환자로부터 단리된 말초혈인, 〔30〕 또는 〔31〕에 기재된 제제,
〔33〕 상기 면역 세포가 백혈구, 단구, 호중구 및 임파구로부터 선택되는 적어도 1개의 세포인, 〔30〕 내지 〔32〕 중 어느 하나에 기재된 제제,
〔34〕 상기 임파구가 CD45+ 임파구, CD3+ T세포, CD4+ T세포, 및 CD8+ T세포로부터 선택되는 적어도 1개의 임파구 세포인, 〔33〕에 기재된 제제,
〔35〕 상기 임파구가 CD16+ NK세포, NKp46+ NK세포, 및 CD56-CD16+ NK세포로부터 선택되는 적어도 1개의 임파구 세포인, 〔33〕에 기재된 제제,
〔36〕 상기 면역 세포 상에 발현되어 있는 분자가 CD16 또는 CD107a인, 〔30〕 내지 〔32〕 중 어느 하나에 기재된 제제,
〔37〕 상기 환자가, FcγRIIIA의 158위의 적어도 1개의 아미노산 잔기가 Val인 다형 및/또는 FcγRIIA의 131위의 적어도 1개의 아미노산 잔기가 His인 다형을 갖는 환자인, 〔30〕 내지 〔36〕 중 어느 하나에 기재된 제제,
〔38〕 상기 암 환자가 간암 환자인 〔30〕 내지 〔37〕 중 어느 하나에 기재된 제제,
〔39〕 상기 GPC3 표적 치료제가 암 환자의 혈중 트러프값으로 200μg/ml 이상이 되도록 투여되는, 〔30〕 내지 〔38〕 중 어느 하나에 기재된 제제,
〔40〕 상기 GPC3 표적 치료제가 항GPC3 항체를 유효 성분으로서 포함하는 치료제인, 〔30〕 내지 〔39〕 중 어느 하나에 기재된 제제,
〔41〕 상기 항GPC3 항체가 항체 의존성 세포 상해(ADCC) 활성 및/또는 보체 의존성 세포 상해(CDC) 활성을 갖는 항체인, 〔40〕에 기재된 제제,
〔42〕 상기 항GPC3 항체가 이하의 (1) 내지 (5) 중 어느 하나;
(1) 서열번호: 4, 서열번호: 5 및 서열번호: 6으로 각각 표시되는 중쇄 CDR1, 중쇄 CDR2 및 중쇄 CDR3, 및 서열번호: 7, 서열번호: 8 및 서열번호: 9로 각각 표시되는 경쇄 CDR1, 경쇄 CDR2 및 경쇄 CDR3;
(2) 서열번호: 12, 서열번호: 13 및 서열번호: 14로 각각 표시되는 중쇄 CDR1, 중쇄 CDR2 및 중쇄 CDR3, 및 서열번호: 15, 서열번호: 16 및 서열번호: 17로 각각 표시되는 경쇄 CDR1, 경쇄 CDR2 및 경쇄 CDR3;
(3) 서열번호: 20, 서열번호: 21 및 서열번호: 22로 각각 표시되는 중쇄 CDR1, 중쇄 CDR2 및 중쇄 CDR3, 및 서열번호: 23, 서열번호: 24 및 서열번호: 25로 각각 표시되는 경쇄 CDR1, 경쇄 CDR2 및 경쇄 CDR3;
(4) 서열번호: 28, 서열번호: 29 및 서열번호: 30으로 각각 표시되는 중쇄 CDR1, 중쇄 CDR2 및 중쇄 CDR3, 및 서열번호: 31, 서열번호: 32 및 서열번호: 33으로 각각 표시되는 경쇄 CDR1, 경쇄 CDR2 및 경쇄 CDR3; 또는
(5) 서열번호: 36, 서열번호: 37 및 서열번호: 38로 각각 표시되는 중쇄 CDR1, 중쇄 CDR2 및 중쇄 CDR3, 및 서열번호: 39, 서열번호: 40 및 서열번호: 41로 각각 표시되는 경쇄 CDR1, 경쇄 CDR2 및 경쇄 CDR3;
을 포함하는 항GPC3 키메라 항체 또는 인간화 항GPC3 항체인 〔40〕 또는 〔41〕에 기재된 제제,
〔43〕 상기 항GPC3 항체가 이하 중 어느 하나;
(1) 서열번호: 44, 서열번호: 45, 서열번호: 46, 서열번호: 47, 서열번호: 48, 서열번호: 49 및 서열번호: 50으로 표시되는 중쇄 가변 영역의 군으로부터 선택되는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호: 51로 표시되는 경쇄 가변 영역;
(2) 서열번호: 44, 서열번호: 45, 서열번호: 46, 서열번호: 47, 서열번호: 48, 서열번호: 49 및 서열번호: 50으로 표시되는 중쇄 가변 영역의 군으로부터 선택되는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호: 52, 서열번호: 53, 서열번호: 54, 서열번호: 55, 서열번호: 56, 서열번호: 57, 서열번호: 58, 서열번호: 59, 서열번호: 60, 서열번호: 61, 서열번호: 62, 서열번호: 63, 서열번호: 64, 서열번호: 65 및 서열번호: 66으로 표시되는 경쇄 가변 영역의 군으로부터 선택되는 경쇄 가변 영역;
(3) 서열번호: 67로 표시되는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호: 68로 표시되는 경쇄 가변 영역;
(4) 서열번호: 69로 표시되는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호: 70으로 표시되는 경쇄 가변 영역;
(5) 서열번호: 71로 표시되는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호: 72로 표시되는 경쇄 가변 영역; 또는
(6) 서열번호: 71로 표시되는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호: 73으로 표시되는 경쇄 가변 영역;
을 포함하는 항체인 〔40〕 내지 〔42〕 중 어느 하나에 기재된 제제,
〔44〕 상기 GPC3 표적 치료제가 항GPC3 항체에 세포 상해성 물질이 결합된 항체인, 〔40〕에 기재된 제제,
〔45〕 GPC3 표적 치료제를 〔1〕 내지 〔14〕 중 어느 하나에 기재된 방법에 의해 결정되는 환자에게 투여하는 것에 의한, 암의 치료 방법,
을 제공한다.
본 발명에 의하면, 간편하고 적확하게, GPC3 표적 치료제 요법이 유효한지 여부, 또는 GPC3 표적 치료제 요법을 계속해야 할지 여부를 결정할 수 있다. 이에 의해, GPC3 표적 치료제 요법의 효과의 향상과, 치료를 받는 환자의 QOL 개선이 가능해져, 보다 우수한 암의 치료가 실현된다.
도 1은 GPC3 표적 치료제 요법 또는 플라시보를 받은 환자의 무악화(無惡化) 생존 기간 또는 전체 생존 기간을 나타낸 도면이다. 파선은 GC33 투여군, 실선은 플라시보군, 각각의 무악화 생존 기간, 또는 전체 생존 기간을 나타낸다.
도 2는 GPC3 표적 치료제 요법 또는 플라시보를 받은 환자의 무악화 생존 기간 또는 전체 생존 기간을 나타낸 도면이다. 실선은 플라시보군, 점선은 GC33 고폭로군, 파선은 GC33 저폭로군 각각의 무악화 생존 기간, 또는 전체 생존 기간을 나타낸다.
도 3은 GPC3 표적 치료제 요법을 받기 전의 환자로부터 채취된 혈액 중의 호중구가 중앙값(3,607개/μL)보다 적은 군, 또는 많은 군에 있어서의 당해 환자의 무악화 생존 기간과의 상관 관계를 나타낸 도면이다. 파선은 GC33 투여군, 실선은 플라시보군, 각각의 무악화 생존 기간을 나타낸다. 호중구수가 적은 군에 있어서는, 플라시보군에 대해, GC33 투여군의 해저드비는 1.229(p=0.369)였던 것에 비해, 호중구가 많은 군에서는 해저드비가 0.607(p=0.030)이었다.
도 4는 GPC3 표적 치료제 요법을 받기 전의 환자로부터 채취된 혈액 중의 CD4 양성 T세포가 중앙값(490개/μL)보다 적은 군, 또는 많은 군에 있어서의 당해 환자의 무악화 생존 기간과의 상관 관계를 나타낸 도면이다. 파선은 GC33 투여군, 실선은 플라시보군, 각각의 무악화 생존 기간을 나타낸다. CD4 양성 T세포수가 적은 군에 있어서는, 플라시보군에 대해, GC33 투여군의 해저드비는 1.273(p=0.307)이었던 것에 비해, 많은 군에서는 해저드비가 0.635(p=0.05)이었다.
도 5는 GPC3 표적 치료제 요법을 받기 전의 환자로부터 채취된 혈액 중의 CD56 음성 CD16 양성 NK세포가 중앙값(6.3개/μL)보다 적은 군, 또는 많은 군에 있어서의 당해 환자의 무악화 생존 기간과의 상관 관계를 나타낸 도면이다. 파선은 GC33 투여군, 실선은 플라시보군, 각각의 무악화 생존 기간을 나타낸다. CD56 음성 CD16 양성 NK세포가 적은 군에 있어서는, 플라시보군에 대해, GC33 투여군의 해저드비는 1.259(p=0.344)였던 것에 비해, 많은 군에서는 해저드비가 0.571(p=0.022)이었다.
도 6은 GPC3 표적 치료제 요법을 받기 전의 환자로부터 채취된 혈액 중의 NK세포 상의 CD16 발현량(MESF)이 중앙값(372,254mesf)보다 적은 군, 또는 많은 군에 있어서의 당해 환자의 무악화 생존 기간과의 상관 관계를 나타낸 도면이다. 파선은 GC33 투여군, 실선은 플라시보군, 각각의 무악화 생존 기간을 나타낸다. CD16 발현이 적은 군에 있어서는, 플라시보군에 대해, GC33 투여군의 해저드비는 1.130(p=0.612)이었던 것에 비해, 많은 군에서는 해저드비가 0.668(p=0.101)이었다.
도 7은 GPC3 표적 치료제 요법을 받기 전의 환자로부터 채취된 혈액 세포를 이용한 ADCC 활성값을 세포 표면 상의 CD16 발현량의 변화에 따라 평가했을 때의 CD16 발현 변화량이 중앙값(-64.33%)보다 적은 군(ADCC 고활성군), 또는 많은 군(ADCC 저활성군)에 있어서의 당해 환자의 무악화 생존 기간과의 상관 관계를 나타낸 도면이다. 실선은 플라시보군, 점선은 GC33 고폭로군, 파선은 GC33 저폭로군, 각각의 무악화 생존 기간을 나타낸다.
도 8은 GPC3 표적 치료제 요법을 받기 전의 환자로부터 채취된 혈액 세포를 이용한 ADCC 활성값을 세포 표면 상의 CD107a 발현량의 변화에 따라 평가했을 때의 CD107a 발현 변화량이 중앙값(34.15%)보다 많은 군(ADCC 고활성군), 또는 적은 군(ADCC 저활성군)에 있어서의 당해 환자의 무악화 생존 기간과의 상관 관계를 나타낸 도면이다. 실선은 플라시보군, 점선은 GC33 고폭로군, 파선은 GC33 저폭로군, 각각의 무악화 생존 기간을 나타낸다.
정의
본 명세서에 있어서 특별한 정의가 없는 한, 본 발명에 관련하여 이용되는 화학적 용어 및 기술적 용어는, 당업자에 의해 일반적으로 이해되고 있는 의미를 갖는 것으로 한다.
부정관사
「하나의(a)」 및 「하나의(an)」라는 부정관사는, 본 발명에 있어서, 하나의 또는 둘 이상의(즉, 적어도 하나의) 그 부정관사의 문법상의 대상을 말한다. 예를 들면 「하나의(a) 요소」는, 하나의 요소 또는 둘 이상의 요소를 의미한다.
아미노산
본 명세서에 있어서, 예를 들어, Ala/A, Leu/L, Arg/R, Lys/K, Asn/N, Met/M, Asp/D, Phe/F, Cys/C, Pro/P, Gln/Q, Ser/S, Glu/E, Thr/T, Gly/G, Trp/W, His/H, Tyr/Y, Ile/I, Val/V로 표시되는 바와 같이, 아미노산은 1문자 코드 또는 3문자 코드, 또는 그의 양쪽으로 표기되고 있다.
아미노산의 개변
항원 결합 분자의 아미노산 서열 중의 아미노산의 개변을 위해서는, 부위 특이적 변이 유발법(Kunkel 등 Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1985) 82, 488-492))이나 Overlap extension PCR 등의 공지의 방법이 적절히 채용될 수 있다. 또한, 천연의 아미노산 이외의 아미노산으로 치환하는 아미노산의 개변 방법으로서, 복수의 공지의 방법도 또한 채용될 수 있다(Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. (2006) 35, 225-249, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (2003) 100 (11), 6353-6357). 예를 들면, 종지 코돈의 하나인 UAG 코돈(앰버 코돈)의 상보적 앰버 서프레서 tRNA에 비천연 아미노산이 결합된 tRNA가 포함되는 무세포 번역계 시스템(Clover Direct(Protein Express)) 등도 적합하게 이용된다.
본 명세서에 있어서, 아미노산의 개변 부위를 나타낼 때에 이용되는 「및/또는」의 용어의 의의는, 「및」 과 「또는」이 적절히 조합된 모든 조합을 포함한다. 구체적으로는, 예를 들면 「43위, 52위, 및/또는 105위의 아미노산이 치환되어 있다」란 이하의 아미노산의 개변의 배리에이션이 포함된다;
(a) 43위, (b) 52위, (c) 105위, (d) 43위 및 52위, (e) 43위 및 105위, (f) 52위 및 105위, (g) 43위 및 52위 및 105위.
EU 넘버링 및 Kabat 넘버링
본 발명에서 사용되고 있는 방법에 의하면, 항체의 CDR과 FR에 할당되는 아미노산 위치는 Kabat에 따라 규정된다(Sequences of Proteins of Immunological Interest(National Institute of Health, Bethesda, Md., 1987년 및 1991년). 본 명세서에 있어서, 항원 결합 분자가 항체 또는 항원 결합 단편인 경우, 가변 영역의 아미노산은 Kabat 넘버링에 따르고, 정상 영역의 아미노산은 Kabat의 아미노산 위치에 준한 EU 넘버링에 따라 표시된다.
생물학적 시료
본 발명에 있어서 「생물학적 시료」라는 용어는, 대상으로부터 단리되는 조직 또는 유체의 시료를 말한다. 그와 같은 시료의 비한정된 일 태양으로서, 예를 들면 혈장, 혈청, 골수액, 림프액, 피부, 기도, 장관, 및 요 생식로의 외부 절편, 눈물, 타액, 담, 젖, 전혈(全血) 또는 모든 혈액 분획, 혈액 유도체, 혈구, 종양, 신경 조직, 기관 또는 모든 타입의 조직, 세정에 의해 얻어지는 모든 시료(예를 들면 기관지계의 것), 및 인비트로에서의 세포 배양물의 구성 성분의 시료가 포함된다.
면역 세포수 또는 면역 세포 상에 발현되어 있는 분자의 발현량은, 환자로부터 단리되는 생물학적 시료에 있어서 측정할 수 있다. 예를 들면, 생물학적 시료로서 혈액을 이용하는 경우는, 말초혈이 바람직하고, 단리된 말초혈 중의 면역 세포수 또는 면역 세포 상에 발현되어 있는 분자의 발현량이 측정될 수 있다. 비한정된 일 태양으로서, 환자로부터 단리된 말초혈 중의 면역 세포수는, 예를 들면, 김자 염색에 의한 백혈구 분획이나, 자동 혈구 계수 측정기 등을 이용하여 측정될 수 있다. 또한, 비한정된 일 태양으로서, 환자로부터 단리된 말초혈 중의 면역 세포 상에 발현되어 있는 분자의 발현량은, 예를 들면, 특이적인 항체를 이용한 플로우 사이토메트리에 의해 측정될 수 있다.
「단리된」이란, 그의 천연 상태로부터 「인위적」으로 변화된 것, 즉, 천연으로 생긴 경우, 그의 본래의 환경으로부터 변화 및/또는 취출된 것을 말한다. 예를 들면, 생물 중에 존재하는 세포, 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드는 단리되어 있지 않지만, 천연 상태로 함께 존재하는 재료로부터 분리된 동일한 세포, 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드는 단리되어 있는 것을 본 발명에서는 의미한다. 또, 형질 전환, 유전학적 조작 또는 어느 다른 재조합 방법에 의해 생물에게 도입되는 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드는, 생물(생존하고 있어도 비생존이어도 된다) 내에 아직 존재하고 있는 경우에서도, 단리되어 있다.
면역 세포
본 발명에 있어서 「면역 세포」란, 백혈구 등의 생체 내의 면역 반응에 관여하는 세포를 의미하고, 구체적으로는, 예를 들면, 과립구(호중구, 호염기구, 호산구), 단구(매크로파지), 임파구(T세포, B세포, NK세포), 수상 세포 등을 들 수 있다.
면역 세포수 의 측정 방법
본 발명에 있어서, 대상이 되는 환자의 말초혈 중의 면역 세포수를 측정하는 방법은, 특별히 한정되지 않는다. 예를 들면, 대상이 되는 환자로부터 생물학적 시료로서 혈액을 채취하고, 채취한 혈액을 시료로 하여 자동 혈구 계수기에 의해 측정할 수 있다. 또한, 예를 들면 혈구 계산판을 이용하여, 적혈구나 백혈구를 계수하고, 또한 김자 염색에 의해 혈액 세포를 염색한 후, 염색이 되는 방법이나 형상의 차이에 의해 호중구, 호산구, 호염기구, 단구, 임파구로 구분할 수 있고, 그 비율로부터 각각의 세포수를 산출할 수 있다. 여기에서 채취되는 생물학적 시료는, 환자 유래의 면역 세포를 측정할 수 있는 시료이면 특별히 한정되지 않고, 예를 들면, 말초혈을 들 수 있다. 구체적으로는, 예를 들면 실시예에 기재된 방법에 의해 측정될 수 있다.
면역 세포 상에 발현되어 있는 분자의 발현량의 측정 방법
본 발명에 있어서, 대상이 되는 환자의 면역 세포 상에 발현되어 있는 분자의 발현량을 측정하는 방법은, 특별히 한정되지 않는다. 예를 들면, 대상이 되는 환자로부터 생물학적 시료로서 혈액을 채취하고, 세포에 발현되어 있는 분자에 대한 특이적인 항체와 반응시켜, 플로우 사이토메트리 등을 이용하여 측정할 수 있다. 또, 형광 표지된 캘리브레이션 비즈를 이용하여 가용성 형광 색소 분자 등량(Molecules of Equivalent Soluble Fluorochrome: MESF)을 설정함으로써, 어떤 세포 집단의 플로우 사이토메트리에 의한 형광 강도 측정값을 MESF값으로 변환시켜 정량화할 수 있다. 구체적으로는, 예를 들면 Journal of Research of the National Institute of Standard and Technology, vol. 107, No. 4 (2002) pp339-353에 기재된 방법에 따라 측정할 수 있다. 여기에서 채취되는 생물학적 시료는, 환자 유래의 면역 세포를 측정할 수 있는 시료이면 특별히 한정되지 않고, 예를 들면, 말초혈을 들 수 있다. 구체적으로는, 예를 들면 실시예에 기재된 방법에 의해 측정될 수 있다.
Fc γ 수용체 다형의 확인
본 발명에 있어서, 대상이 되는 환자가 Fcγ 수용체의 유전자 다형을 갖는지 여부를 확인하는 방법은, 특별히 한정되지 않는다. 예를 들면, 대상이 되는 환자로부터 생물학적 시료를 채취하고, 채취한 시료로부터 게놈 유전자를 단리하여 Fcγ 수용체에 해당하는 유전자의 염기 서열을 결정하는 것에 의해 확인할 수 있다. 구체적으로는 예를 들면, Journal of Clinical Oncology, vol. 21, No. 21 (2003) pp3940-3947에 기재된 방법에 따라 측정할 수 있다. 여기에서 채취되는 생물학적 시료는, 환자 유래의 게놈 유전자를 취득할 수 있는 시료이면 특별히 한정되지 않고, 예를 들면, 말초혈, 피부 절편 등을 들 수 있다.
본 발명에 있어서, 조직에 있어서의 GPC3의 발현량을 검출하기 위해서 이용되는 생물학적 시료로서 피험체 표본을 적합하게 들 수 있다. 바람직한 피험체 표본은, 피험체로부터 얻어진 조직이며, 더 바람직하게는, 피험체의 간암 또는 간 세포 암 조직이다. 간암 또는 간 세포 암 조직을 채취하는 방법으로서는 공지의 방법인 생검(바이옵시)이 적합하게 이용된다. 간 생검이란 가늘고 긴 바늘이 피부의 표면으로부터 직접 간장으로 꽂혀, 간장의 조직이 채취되는 방법을 말한다. 통상, 바늘이 천자(穿刺)되는 부위는 우흉 하부의 늑간이다. 수술 전에 초음파 검사 장치를 이용하여 천자부의 안전성이 확인된 다음, 천자부가 소독된다. 또 피부로부터 간장의 표면까지가 마취의 대상이 되고, 천자부의 피부가 소절개된 후에 천자침이 천자된다.
조직 표본이 현미경하에서 투과 광선에 의해 관찰되기 위해서, 조직 표본이 현미경에 사용되는 광선을 충분히 투과시킬 정도로 박절(薄切)된다. 박절의 전단계로서 조직 표본이 고정된다. 즉, 조직·세포의 단백질에 탈수나 변성을 일으키게 하여 응고시키는 것에 의해, 조직을 구성하는 세포가 신속하게 사멸되고, 그 구조가 안정화 및 불용화된다. 우선, 고정의 대상이 되는 조직 표본이, 파라핀 포매 절편을 만드는 데 적합한 크기 및 형태의 단편으로서 수술용 메스 등의 칼날로 절취된다. 이어서, 고정을 실시하기 위해서 이용되는 시약인 고정액 중에서 당해 단편이 침지된다. 고정액으로서는, 폼알린, 더 바람직하게는 중성 완충 폼알린이 적합하게 사용된다. 중성 완충 폼알린의 농도는 조직 표본의 특성 또는 물성에 따라 적절히 선택된다. 농도는 1∼50%, 바람직하게는 5∼25%, 더 바람직하게는 10∼15% 사이에서 적절히 변경되어 사용될 수 있다. 조직 표본이 침지된 고정액이 진공 펌프를 이용하여 적절히 탈기된다. 고정은 조직 표본을 상압 및 실온의 조건하에서 고정액 중에 수시간 방치하는 것에 의해 실시된다. 고정에 필요로 하는 시간은, 1시간 내지 7일간, 바람직하게는 2시간 내지 3일간, 또한 바람직하게는 3시간 내지 24시간, 더 바람직하게는 4시간 내지 16시간의 범위에서 적절히 선택될 수 있다. 고정된 후에 인산 완충액 등에 추가로 수시간(2시간 내지 48시간, 바람직하게는 3시간 내지 24시간, 더 바람직하게는 4시간 내지 16시간의 범위에서 적절히 선택될 수 있는 시간) 적절히 침지된다.
다음으로, 고정이 적용된 조직 표본으로부터, 동결 절편법 또는 파라핀 절편법을 이용하여 절편이 적합하게 제작될 수 있다. 동결 절편법의 적합한 예로서는, O.C.T.compound(Miles. Inc) 중에 조직을 투입하여 동결시킨 것을, 크리오스태트(동결 절편 제작 장치)를 이용하여 박절하는 방법을 들 수 있다. 파라핀 절편법에 있어서는, 고정이 적용된 조직 표본이 포매제에 침지되어 굳어지는 것에 의해, 균일하고 적절한 경도가 부여된다. 포매제로서는, 파라핀이 적합하게 사용될 수 있다. 고정이 적용된 조직 표본은 에탄올을 이용하여 탈수된다. 구체적으로는, 조직 표본이 70% 에탄올, 80% 에탄올, 100% 에탄올에 순차 침지되는 것에 의해, 당해 조직 표본이 탈수된다. 침지에 필요로 하는 시간 및 횟수는, 1시간 내지 수일 및 1회 내지 3회의 범위에서 적절히 선택될 수 있다. 또한, 실온 또는 4℃에서도 침지될 수 있지만, 4℃에서 침지되는 경우에는, 침지 시간은 종야 등 그 시간이 긴 편이 바람직하다. 이어서 그 액상이 자일렌으로 치환된 후에, 조직 표본이 파라핀에 의해 포매된다. 그 액상의 자일렌으로의 치환에 필요로 하는 시간은 1시간 내지 수시간의 범위에서 적절히 선택될 수 있다. 그때에, 실온에서 치환될 수 있고, 4℃에서도 치환될 수 있지만, 4℃에서 치환되는 경우에는, 치환의 시간은, 종야 등 그 시간이 긴 편이 바람직하다. 파라핀 포매에 필요로 하는 시간 및 횟수는, 1시간 내지 수시간 및 1회 내지 4회의 범위에서 적절히 선택될 수 있다. 그때에, 실온에서 포매될 수 있고, 4℃에서도 포매될 수 있지만, 4℃에서 포매되는 경우에는, 포매의 시간은, 종야 등 그 시간이 긴 편이 바람직하다. 또한, 파라핀 포매 반응이 자동화 처리되는 파라핀 포매 장치(EG1160, Leica 등)를 이용하는 것에 의해, 조직 표본이 적합하게 파라핀 포매될 수 있다.
전술한 바와 같이 하여 파라핀 포매된 조직 표본을 대목(臺木)에 접착하는 것에 의해 「블록」이 제작되고, 이 블록이 마이크로톰에 의해 1 내지 20μm의 두께로부터 선택되는 원하는 두께로 박절된다. 박절된 조직 절편은 투과성의 지지체인 슬라이드 글라스 상에 정치되는 것에 의해 고착된다. 이 경우에 있어서, 조직 절편의 박리를 방지하기 위해서 슬라이드 글라스에 0.01% 폴리-L-라이신(Sigma)을 도포하여 건조시킨 슬라이드 글라스도 적합하게 사용될 수 있다. 고착된 조직 절편은 수분 내지 1시간 사이로부터 선택되는 적절한 시간 풍건된다.
항원 부활(賦活)화
바람직한 태양에 있어서는, 폼알린 고정에 의해 항체와의 반응성이 감약된 항원의 반응성을 부활화한다. 본 발명에 있어서는, 프로테아제 항원 부활화법(PIER법)을 적용하는 것도 가능하고, 열유도 항원 부활화법(HIER법)을 적용하는 것도 가능하다. 또한, 비한정된 일 태양에서는, 하기에서 나타나는 바와 같이 조제되는 「동일시될 수 있는 2개의 조직 표본」 중 하나의 표본에 대해서 PIER법을 적용하고, 다른 쪽의 표본에 대해서 HIER법을 적용하여, 항체와 반응시켰을 때의 양자 사이의 염색 정도의 상위를 수치화하는 것도 가능하다.
비한정된 일 태양에 있어서는, 「생물학적 시료」의 항에서 나타나는 바와 같이 조제되어, 투과성의 지지체 상에 부착된 2개의 조직 표본이 1조(組) 준비된다. 이 당해 조직 표본은 조직상 동일시될 수 있는 2개의 조직 표본인 것이 바람직하다. 「동일시될 수 있다」란, 상 비교하는 2개의 조직 표본이 그 조직 표본이 유래하는 피험체 표본 중에서 거의 동일한 세포 또는 조직으로 구성되어 있는 것을 의미한다. 예를 들면, 인접하는 절편으로서 조제된 2개의 조직 표본은 동일시될 수 있는 2개의 조직 표본이다. 본 발명에 있어서도 특별히 달리 기재하지 않는 한, 「동일시될 수 있는 2개의 조직 표본」이란 인접하는 절편으로서 조제된 2개의 조직 표본을 말하지만, 이에 더하여, 인접하는 절편으로서 조제되어 있지 않아도 2개의 조직 표본을 구성하는 세포 또는 조직의 구성이 당해 2개의 조직 표본 사이에서 동일시될 수 있는 것이면 「동일시될 수 있는 2개의 조직 표본」에 해당한다. 세포 또는 조직의 구성이 당해 2개의 조직 표본 사이에서 동일시될 수 있는 경우로서는, 예를 들면, (1) 조직 절편 중의 평면 좌표 상에서 동일한 위치에 동일한 세포로부터 유래하는 세포의 절편이 존재하는 경우, (2) 당해 세포의 절편이 당해 평면 좌표 상의 동일한 위치에 존재하는 비율이 적어도 50% 이상, 바람직하게는 60% 이상, 또한 바람직하게는 70% 이상, 더 바람직하게는 80% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상, 특히 바람직하게는 95% 이상인 경우 등이 적합하게 예시된다.
열유도 항원 부활화법은, 마이크로파에 의한 가열 방법이나 오토클레이브에 의한 가열 방법, 또는 자비 처리에 의한 가열 방법 등이 적절히 이용된다. 액 온도가 약 98℃로 유지되도록 780W의 출력으로 자비 처리하는 경우, 처리 등 부활화에 필요로 하는 시간은 5분-60분 사이로부터 적절히 선택되고, 예를 들면 10분간이다. 항원의 부활화 처리는, 10mM 시트르산 나트륨 완충액 외에, 시판 중인 Target Retrieval Solution(DakoCytomation) 등 중에서 행할 수 있다. 하기의 실시예에 있어서는 Target Retrieval Solution을 사용한다. 부활화 처리의 결과로서 항GPC3 항체가 인식하는 항원 중의 에피토프가 항체와의 결합성을 획득하여, 후술하는 항원과 항체의 복합체의 검출이 가능해지는 것이면, 어느 완충액, 수용액도 적합하게 이용된다.
프로테아제 항원 부활화법에 있어서 사용되는 프로테아제는, 그 종류나 유래에 대해 특별히 한정되는 것이 아니고, 일반적으로 입수 가능한 프로테아제를 적절히 선택하여 사용될 수 있다. 이용되는 프로테아제의 예로서, 0.01N 염산 중 0.05% 농도의 펩신, 또는 pH 7.6의 Tris 완충액 중 0.01% 농도의 CaCl2를 추가로 함유하는 0.1% 농도의 트립신, 10mM의 EDTA 및 0.5%의 SDS를 포함하는 pH 7.8의 10mM Tris 염산 완충액 중 1∼50μg/ml 농도의 프로테아제 K 등을 적합하게 들 수 있다. 또 프로테아제 K를 이용하는 경우, 그 반응액의 pH는 6.5 내지 9.5 사이에서 적절히 선택되며, SH 시약이나 트립신 저해제나 키모트립신 저해제도 적절히 이용될 수 있다. 히스토파인 HER2 키트(MONO)(니치레이바이오사이언스)에 첨부되는 프로테아제도 이러한 적합한 프로테아제의 구체예로서 들 수 있다. 프로테아제 항원 부활화는 통상 37℃에서 행해지지만, 반응 온도는 25℃ 내지 50℃의 범위 내에 있어서 적절히 변경될 수 있다. 프로테아제 항원 부활화가 37℃에서 행해지는 경우에는, 반응 시간은 예를 들면 1분 내지 5시간 사이에서 적절히 선택되고, 예를 들면, 15분, 30분, 45분, 1시간, 2시간, 3시간, 4시간 등이다. 부활화 처리가 종료한 후, 당해 처리가 실시된 조직 표본은 세정용 완충액에 의해 세정된다. 세정용 완충액은 PBS(Phosphate buffer saline)가 적합하게 이용되는 것 외에, Tris 염산 완충액도 적합하게 사용될 수 있다. 통상, 세정 조건으로서는 실온에서 5분간의 세정을 3회 실시하는 방법이 채용되지만, 세정의 시간 및 온도는 적절히 변경될 수 있다.
조직 표본과 항 GPC3 항체의 반응
열유도 항원 부활화법에 의한 항원 부활화 처리가 실시된 조직 표본 및/또는 프로테아제 항원 부활화법에 의한 항원 부활화 처리가 실시된 조직 표본에 대해서, 후술되는 항GPC3 항체를 1차 항체로서 반응시킨다. 당해 반응은 항GPC3 항체가 항원 중의 에피토프를 인식하여 항원 항체 복합체를 형성하는 데 적절한 조건하에서 실시된다. 통상, 당해 반응은 4℃에서 종야, 또는 37℃에서 1시간 실시되지만, 반응 조건은, 항체가 항원 중의 에피토프를 인식하여 항원 항체 복합체를 형성하는 데 적절한 범위에서 적절히 변경될 수 있다. 예를 들면, 반응 온도는 4℃ 내지 50℃의 범위 내에서 변경될 수 있고, 반응 시간은 1분 내지 7일 사이에서 변경될 수 있다. 저온에서의 반응이 실시되는 경우에는 긴 시간 반응시키는 것이 바람직하다. 1차 항체 반응이 종료한 후, 조직 표본은 세정용 완충액에 의해 세정된다. 세정용 완충액은 PBS(Phosphate buffer saline)가 적합하게 이용되는 것 외에, Tris 염산 완충액도 적합하게 사용될 수 있다. 통상, 세정 조건으로서는 실온에서 5분간의 세정을 3회 실시하는 방법이 채용되지만, 세정의 시간 및 온도는 적절히 변경될 수 있다.
이어서, 1차 항체 반응이 실시된 조직 표본에 대해서, 1차 항체를 인식하는 2차 항체를 반응시킨다. 통상, 2차 항체를 가시화하기 위한 표지 물질에 의해 미리 표지된 2차 항체가 이용된다. 표지 물질로서는, FITC(플루오레세인아이소싸이오사이아네이트)나 Cy2(Amersham), Alexa488(Molecular Probe) 등의 형광 색소, 퍼옥시다제나 알칼리 포스파타제 등의 효소, 또는 금 콜로이드 등을 적합하게 들 수 있다.
2차 항체와의 반응은, 항GPC3 항체와 당해 항GPC3 항체를 인식하는 2차 항체가 항원 항체 복합체를 형성하는 데 적절한 조건하에서 실시된다. 통상, 당해 반응은 실온 또는 37℃에서 30분 내지 1시간 실시되지만, 항GPC3 항체와 2차 항체가 항원 항체 복합체를 형성하는 데 적절한 범위에서 적절히 변경될 수 있다. 예를 들면, 반응 온도는 4℃ 내지 50℃의 범위 내에서 변경될 수 있고, 반응 시간은 1분 내지 7일 사이에서 변경될 수 있다. 저온에서의 반응이 실시되는 경우에는 긴 시간 반응시키는 것이 바람직하다. 2차 항체 반응이 종료한 후, 조직 표본은 세정용 완충액에 의해 세정된다. 세정용 완충액은 PBS(Phosphate buffer saline)가 적합하게 이용되는 것 외에, Tris 염산 완충액도 적합하게 사용될 수 있다. 통상, 세정 조건으로서는 실온에서 5분간의 세정을 3회 실시하는 방법이 채용되지만, 세정의 시간 및 온도는 적절히 변경될 수 있다.
다음으로, 2차 항체 반응이 실시된 조직 표본에 대해서, 표지 물질을 가시화하는 물질을 반응시킨다. 2차 항체의 표지 물질로서 퍼옥시다제를 이용한 경우에는, 0.02% 과산화 수소수와 pH 7.2의 0.1M 트리스 염산 완충액으로 0.1% 농도로 조정된 DAB(다이아미노벤지딘) 용액을 인큐베이트 직전에 등량 혼합하는 것에 의해 얻어지는 반응액으로 조직 표본이 인큐베이트된다. DAB 외에는, DAB-Ni나 AEC+(이상, DAKO) 등의 발색 기질이 적절히 선택될 수 있다. 인큐베이트의 과정에 있어서, 때때로 현미경하에서 발색의 정도를 관찰하고, 적절한 발색이 확인된 단계에서 조직 표본을 PBS에 침지하는 것에 의해 가시화 반응이 정지된다.
2차 항체의 표지 물질로서, 알칼리 포스파타제를 이용한 경우에는, BCIP(5-브로모-4-클로로-3-인돌릴인산)/NBT(나이트로블루테트라졸륨)(Zymed) 기질 용액(10mM 농도의 MgCl2 및 28mM 농도의 NaCl을 함유하는 pH 9.8의 50mM 탄산 나트륨 완충액에, 0.4mM 농도로 NBT 및 0.38mM 농도로 BCIP가 용해된 것)에서 조직 표본이 인큐베이트된다. 또한, BCIP 및 NBT 외에는, Permanent Red, Fast Red, 또는 Fuchsin+(이상, DAKO) 등도 적절히 사용될 수 있다. 인큐베이트에 앞서, 1mM 농도의 내재성 알칼리 포스파타제의 저해제인 염화 레바미솔(나칼라이테스크), 0.1M 염화 나트륨 및 50mM 염화 마그네슘을 포함하는 0.1M 트리스 염산 완충액(pH 9.5)과 실온에서 1분 내지 수시간 프리인큐베이트해도 된다. 인큐베이트의 과정에 있어서, 때때로 현미경하에서 관찰하고, 반응 최종 산물인 보라색의 폼아잔의 침착이 관찰된 단계에서, 조직 표본을 수세 또는 2% 폴리바이닐 알코올을 포함하는 TBS에 의한 반응 정지 후, TBST(0.1%의 Tween20을 포함하는 TBS)로 세정된다. 금 콜로이드가 2차 항체의 표지로서 사용되는 경우에는, 은 증감에 의해 금 입자에 금속 은이 부착되는 것에 의해 금 콜로이드가 가시화된다. 은 증감의 방법은 당업자에게 공지이다.
FITC(플루오레세인아이소싸이오사이아네이트)나 Cy2(Amersham), Alexa488(Molecular Probe) 등의 형광 색소를 2차 항체의 표지 물질로서 이용한 경우에는, 가시화 물질의 반응 공정은 불필요하고, 당해 형광 물질의 여기 파장의 광을 조사하여, 방출되는 광이 형광 현미경을 이용하는 것에 의해 적절히 검출될 수 있다.
조직 면역 염색 스코어
본 발명의 비한정된 일 태양에서는, 유리 GPC3 농도에 더하여, 상기의 방법에 의해 검출된 조직에 있어서의 GPC3의 발현량으로부터, GPC3 표적 치료제 요법이 유효하다고 결정하거나, 또는 당해 GPC3 표적 치료제 요법의 계속을 결정하는 방법도 제공된다. 비한정된 일 태양에서는, 상기의 방법에 의해 검출된 조직에 있어서의 GPC3의 발현이, 예를 들면 하기에 예시되는 비한정된 방법에 의해 수치화된다. 본 발명에 있어서, 그와 같이 수치화된 조직에 있어서의 GPC3의 발현량을 「GPC3의 조직 면역 염색 스코어」라고 한다.
WO2009116659에 기재된 방법에 따라, 표 1에 나타내는 기준에 따라 산출된, 양성 세포율(Positive cell rate: PR), 세포질 또는 세포막에 있어서의 염색 강도(Staining intensity of cytoplasm: SI-cp, Staining intensity of cell membrane: SI-cm) 및 세포막 염색 패턴(Staining pattern of cell membrane: Sp-cm)의 각각의 스코어를 식 1 및 식 2의 계산식에 기초해서 가산하여 얻어지는 스코어가 본 발명의 비한정된 GPC3의 조직 면역 염색 스코어(편의적으로, 「복합 평가 스코어 1」이라고 칭한다)로서 예시된다.
[표 1-1]
Figure pct00001
(Sp-Cm의 평가에 있어서, 4배 또는 10배의 대물 렌즈를 이용한 검경하에서의 시야 중 세포의 염색이 평가되었다.)
식 1
IHC total = PR + SI-Cp + SI-Cm + Sp-Cm
식 2
IHC cm = PR + SI-Cm + Sp-Cm
[표 1-2]
Figure pct00002
그 밖에, 세포막, 또는 세포질 내의 염색 강도를 0∼3으로 분류하고, 각각의 염색 강도를 나타내는 세포의 비율을 바탕으로 산출하는 H 스코어(문헌: KS. McCarty Jr. et al., Use of a monoclonal anti-Estrogen receptor antibody in the immunohistochemical evaluation of human tumors. Cancer Res. Suppl. (1986) 46, 4244s-4248s)가 알려져 있다.
한편, 막 및 세포질의 염색 강도, 염색의 비율을 바탕으로 0∼3+로 분류하는 하기 스코어링 알고리즘 및 동 알고리즘에 기초하는 평가 스코어(복합 평가 스코어 2)가 예시된다.
[표 2]
Figure pct00003
본 발명에 있어서, 「GPC3의 조직 면역 염색 스코어」로서는, 예를 들면 이들 복합 평가 스코어 1, H 스코어, 복합 평가 스코어 2 등의 단독으로 또는 이들을 조합하여 이용하는 것이 가능하다. 비한정된 일 태양으로서는, 「GPC3의 조직 면역 염색 스코어」는 복합 평가 스코어 1이 사용될 수 있고, 다른 비한정된 일 태양으로서는, 「GPC3의 조직 면역 염색 스코어」는 복합 평가 스코어 2가 사용될 수 있다.
GPC3 표적 치료제
본 발명에 있어서 「GPC3 표적 치료제」라는 용어는, GPC3에 의해 매개되는 시그널 경로를 포함한, GPC3의 생물학적 활성의 차단, 억제, 저해, 또는 저감을 가져오거나, 또는 GPC3을 발현하는 세포에 대한 세포 상해를 가져오는 모든 분자를 말한다. 「표적 치료」라는 용어는, 생물학적 작용이 있는 특정한 메커니즘도 시사하는 것은 아니고, GPC3의 약리학적, 생리학적, 및 생화학적 상호 작용 중 가능성이 있는 작용을 모두 포함하는 개념이다. GPC3 표적 치료제의 예로서, (1) GPC3에 결합하는 리간드에 대한 GPC3의 결합의 길항 저해제 또는 비길항 저해제, 이에 GPC3과 그의 리간드의 결합에 간섭하는 작용 물질, (2) GPC3과 그의 리간드의 결합에는 간섭하지 않지만, 그 대신, GPC3에 의한 그의 리간드에 대한 결합에 의해 생기는 활성을 저해 또는 감소시키는 작용 물질, (3) GPC3의 발현을 감소시키는 작용 물질, (4) GPC3을 발현하는 세포에 대해서 세포 상해 활성을 유기하는 것이 가능한 작용 물질이 포함된다. 리간드의 비한정된 일 태양으로서, wnt(Cancer Res. (2005) 65, 6245-6254), IGF-II(Carcinogenesis (2008) 29 (7), 1319-1326) 또는 Fibroblast Growth Factor 2(Int. J. Cancer (2003) 103 (4), 455-465) 등이 예시될 수 있다. 이와 같은 작용 물질의 비한정된 일 태양으로서, 항체(그의 항원 결합 도메인을 포함한다), 핵산 분자(안티센스 또는 RNAi 분자 등), 펩티드, 비펩티드 저분자 유기물 등이 포함될 수 있다.
본 발명의 GPC3 표적 치료제로서 사용되는 비펩티드성의 저분자 유기물의 비한정된 일 태양으로서, 메틸화 억제 유전자에 작용하는 비펩티드성의 저분자 퀴놀린 유도체(WO2008/046085) 등이 예시된다. 또한, 세포 상해성 T세포의 세포 상해 활성을 유기하는 HLA-A2 구속성 GPC3 펩티드 144-152(서열번호: 2) 또는 HLA-A24 구속성 GPC3 펩티드 298-306(서열번호: 3)(Clin. Cancer Res. (2006) 12 (9), 2689-2697) 등도 또한 예시될 수 있다.
항 GPC3 항체
본 발명의 GPC3 표적 치료제로서 사용되는 항GPC3 항체의 비한정된 일 태양으로서, (BioMosaic사로부터 카탈로그 번호 B0134R하에 판매되고 있는) 1G12 항체(WO2003/100429)에 세포 상해성 물질이 연결된 항체 약물 복합체(Antibody drug conjugate(ADC))(WO2007/137170)가 예시될 수 있다.
또한, 상기와 상이한 비한정된 일 태양으로서, WO2006/006693 또는 WO2009/041062에 기재된 인간화 항GPC3 항체가 예시된다. 즉, 서열번호: 4, 서열번호: 5 및 서열번호: 6으로 각각 표시되는 중쇄 CDR1, 중쇄 CDR2 및 중쇄 CDR3, 및 서열번호: 7, 서열번호: 8 및 서열번호: 9로 각각 표시되는 경쇄 CDR1, 경쇄 CDR2 및 경쇄 CDR3을 포함하는 인간화 항GPC3 항체가, 본 발명의 GPC3 표적 치료제로서 사용될 수 있다. 당해 인간화 항GPC3 항체의 제작에 있어서, 서열번호: 10으로 표시되는 중쇄 프레임워크 서열 또는 서열번호: 11로 표시되는 경쇄 프레임워크 서열과 서열의 동일성이 높은 인간 프레임워크 서열이 적절히 선택 후에 인간화 시의 템플릿으로서 사용된다.
또 상이한 비한정된 일 태양으로서, 서열번호: 12, 서열번호: 13 및 서열번호: 14로 각각 표시되는 중쇄 CDR1, 중쇄 CDR2 및 중쇄 CDR3, 및 서열번호: 15, 서열번호: 16 및 서열번호: 17로 각각 표시되는 경쇄 CDR1, 경쇄 CDR2 및 경쇄 CDR3을 포함하는 항GPC3 키메라 항체 또는 인간화 항GPC3 항체가, 본 발명의 GPC3 표적 치료제로서 사용될 수 있다. 당해 인간화 항GPC3 항체의 제작에 있어서, 서열번호: 18로 표시되는 중쇄 프레임워크 서열 또는 서열번호: 19로 표시되는 경쇄 프레임워크 서열과 서열의 동일성이 높은 인간 프레임워크 서열이 적절히 선택 후에 인간화 시의 템플릿으로서 사용된다.
다른 상이한 비한정된 일 태양으로서, 서열번호: 20, 서열번호: 21 및 서열번호: 22로 각각 표시되는 중쇄 CDR1, 중쇄 CDR2 및 중쇄 CDR3, 및 서열번호: 23, 서열번호: 24 및 서열번호: 25로 각각 표시되는 경쇄 CDR1, 경쇄 CDR2 및 경쇄 CDR3을 포함하는 항GPC3 키메라 항체 또는 인간화 항GPC3 항체가, 본 발명의 GPC3 표적 치료제로서 사용될 수 있다. 당해 인간화 항GPC3 항체의 제작에 있어서, 서열번호: 26으로 표시되는 중쇄 프레임워크 서열 또는 서열번호: 27로 표시되는 경쇄 프레임워크 서열과 서열의 동일성이 높은 인간 프레임워크 서열이 적절히 선택 후에 인간화 시의 템플릿으로서 사용된다.
또 다른 상이한 비한정된 일 태양으로서, 서열번호: 28, 서열번호: 29 및 서열번호: 30으로 각각 표시되는 중쇄 CDR1, 중쇄 CDR2 및 중쇄 CDR3, 및 서열번호: 31, 서열번호: 32 및 서열번호: 33으로 각각 표시되는 경쇄 CDR1, 경쇄 CDR2 및 경쇄 CDR3을 포함하는 항GPC3 키메라 항체 또는 인간화 항GPC3 항체가, 본 발명의 GPC3 표적 치료제로서 사용될 수 있다. 당해 인간화 항GPC3 항체의 제작에 있어서, 서열번호: 34로 표시되는 중쇄 프레임워크 서열 또는 서열번호: 35로 표시되는 경쇄 프레임워크 서열과 서열의 동일성이 높은 인간 프레임워크 서열이 적절히 선택 후에 인간화 시의 템플릿으로서 사용된다.
또한, 다른 상이한 비한정된 일 태양으로서, 서열번호: 36, 서열번호: 37 및 서열번호: 38로 각각 표시되는 중쇄 CDR1, 중쇄 CDR2 및 중쇄 CDR3, 및 서열번호: 39, 서열번호: 40 및 서열번호: 41로 각각 표시되는 경쇄 CDR1, 경쇄 CDR2 및 경쇄 CDR3을 포함하는 항GPC3 키메라 항체 또는 인간화 항GPC3 항체가, 본 발명의 GPC3 표적 치료제로서 사용될 수 있다. 당해 인간화 항GPC3 항체의 제작에 있어서, 서열번호: 42로 표시되는 중쇄 프레임워크 서열 또는 서열번호: 43으로 표시되는 경쇄 프레임워크 서열과 서열의 동일성이 높은 인간 프레임워크 서열이 적절히 선택 후에 인간화 시의 템플릿으로서 사용된다.
또한, 또 다른 상이한 비한정된 일 태양으로서, 서열번호: 44, 서열번호: 45, 서열번호: 46, 서열번호: 47, 서열번호: 48, 서열번호: 49 및 서열번호: 50으로 표시되는 중쇄 가변 영역의 군으로부터 선택되는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호: 51로 표시되는 경쇄 가변 영역을 포함하는 인간화 항GPC3 항체가, 본 발명의 GPC3 표적 치료제로서 사용될 수 있다. 그 외의 비한정된 일 태양으로서, 서열번호: 44, 서열번호: 45, 서열번호: 46, 서열번호: 47, 서열번호: 48, 서열번호: 49 및 서열번호: 50으로 표시되는 중쇄 가변 영역의 군으로부터 선택되는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호: 52, 서열번호: 53, 서열번호: 54, 서열번호: 55, 서열번호: 56, 서열번호: 57, 서열번호: 58, 서열번호: 59, 서열번호: 60, 서열번호: 61, 서열번호: 62, 서열번호: 63, 서열번호: 64, 서열번호: 65 및 서열번호: 66으로 표시되는 경쇄 가변 영역의 군으로부터 선택되는 경쇄 가변 영역을 포함하는 인간화 항GPC3 항체가, 본 발명의 GPC3 표적 치료제로서 사용될 수 있다.
또한, 다른 상이한 비한정된 일 태양으로서, 서열번호: 67로 표시되는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호: 68로 표시되는 경쇄 가변 영역을 포함하는 인간화 항GPC3 항체, 서열번호: 69로 표시되는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호: 70으로 표시되는 경쇄 가변 영역을 포함하는 인간화 항GPC3 항체, 서열번호: 71로 표시되는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호: 72로 표시되는 경쇄 가변 영역을 포함하는 인간화 항GPC3 항체, 또는 서열번호: 71로 표시되는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호: 73으로 표시되는 경쇄 가변 영역을 포함하는 인간화 항GPC3 항체도 또한, 본 발명의 GPC3 표적 치료제로서 사용될 수 있다.
세포 상해 활성
본 발명의 항GPC3 항체로서, 세포 상해 활성을 갖는 항GPC3 항체가 예시된다. 본 발명에 있어서 세포 상해 활성의 비한정된 예로서, 예를 들면 항체 의존성 세포 개재성 세포 상해(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity: ADCC) 활성, 보체 의존성 세포 상해(complement-dependent cytotoxicity: CDC) 활성 및 T세포에 의한 세포 상해 활성 등을 들 수 있다. 본 발명에 있어서, CDC 활성이란 보체계에 의한 세포 상해 활성을 의미한다. 한편 ADCC 활성이란, 표적 세포의 세포막에 발현된 막형 분자에 결합하는 항원 결합 도메인을 포함하는 항원 결합 분자의 Fc 영역에, 면역 세포 등이 당해 면역 세포에 발현된 Fcγ 리셉터를 개재시켜 결합하여, 당해 면역 세포가 표적 세포에 상해를 주는 활성을 의미한다. 목적의 항원 결합 분자가 ADCC 활성을 갖는지 여부, 또는 CDC 활성을 갖는지 여부는 공지의 방법에 의해 측정될 수 있다(예를 들면, Current protocols in Immunology, Chapter 7. Immunologic studies in humans, Coligan 등 편(1993) 등 ).
구체적으로는, 우선, 이팩터 세포, 보체 용액, 표적 세포가 조제된다.
(1) 이팩터 세포의 조제
CBA/N 마우스 등으로부터 적출된 비장으로부터, RPMI1640 배지(Invitrogen) 중에서 비장 세포가 분리된다. 10% 소 태아 혈청(FBS, HyClone)을 포함하는 동일 배지에서 세정된 당해 비장 세포의 농도를 5×106/mL로 조제하는 것에 의해, 이팩터 세포가 조제될 수 있다.
(2) 보체 용액의 조제
10% FBS 함유 배지(Invitrogen)에 의해 Baby Rabbit Complement(CEDARLANE)를 10배로 희석하는 것에 의해, 보체 용액이 조제될 수 있다.
(3) 표적 세포의 조제
항원을 발현하는 세포를 0.2mCi의 51Cr-크로뮴산 나트륨(GE헬스케어바이오사이언스)과 함께, 10% FBS 함유 DMEM 배양기 중에서 37℃에서 1시간 배양하는 것에 의해 해당 표적 세포가 방사성 표지될 수 있다. 방사성 표지 후, 10% FBS 함유 RPMI1640 배지에서 3회 세정된 세포의 농도를 2×105/mL로 조제하는 것에 의해, 당해 표적 세포가 조제될 수 있다.
ADCC 활성, 또는 CDC 활성은 하기에 기술하는 방법에 의해 측정될 수 있다. ADCC 활성의 측정인 경우는, 96웰 U바닥 플레이트(Becton Dickinson)에 가해진 각 50μl씩의 표적 세포와 항원 결합 분자가 얼음 상에서 15분간 반응된다. 그 후, 이팩터 세포 100μl가 가해진 당해 플레이트가, 탄산 가스 인큐베이터 내에서 4시간 정치된다. 항체(항원 결합 분자)의 최종 농도는 예를 들면 0 또는 10μg/ml 등의 농도가 설정될 수 있다. 정치 후, 각 웰로부터 회수된 100μl 상청의 방사 활성이, 감마 카운터(COBRAII AUTO-GAMMA, MODEL D5005, Packard Instrument Company)를 이용하여 측정된다. 측정값을 이용하여 세포 상해 활성(%)이 (A-C)/(B-C)×100의 계산식에 기초하여 계산될 수 있다. A는 각 시료에 있어서의 방사 활성(cpm), B는 1% NP-40(nacalai tesque)을 가한 시료에 있어서의 방사 활성(cpm), C는 표적 세포만을 포함하는 시료의 방사 활성(cpm)을 나타낸다.
한편, CDC 활성의 측정인 경우는, 96웰 평저 플레이트(Becton Dickinson)에 가해진 각 50μl씩의 표적 세포와 항원 결합 분자가 얼음 상에서 15분간 반응된다. 그 후, 보체 용액 100μl가 가해진 당해 플레이트가, 탄산 가스 인큐베이터 내에서 4시간 정치된다. 항체 항원 결합 분자의 최종 농도는 예를 들면 0 또는 3μg/mL 등의 농도가 설정될 수 있다. 정치 후, 각 웰로부터 회수된 100μl 상청의 방사 활성이 감마 카운터를 이용하여 측정된다. 세포 상해 활성은 ADCC 활성의 측정과 마찬가지로 계산될 수 있다.
세포 상해성 물질
또한, 본 발명의 항GPC3 항체의 비한정된 일 태양으로서, 세포 상해성 물질이 연결된 항GPC3 항체도 예시된다. 그와 같은 항GPC3-항체 약물 복합체(Antibody drug conjugate(ADC))는 WO2007/137170 등에 구체적으로 개시되어 있지만 이에 한정되지 않는다. 즉, 세포 상해성 물질로서는, 이하에 예시되는 화학 요법제여도 되고, 또한 Alley 등(Curr. Opin. Chem. Biol. (2010) 14, 529-537)이나 WO2009/140242에 개시되어 있는 화합물이어도 되며, 이들 화합물이 적절한 링커 등으로 항원 결합 분자에 결합된다.
본 발명의 항GPC3 항체에 결합되는 화학 요법제가 이하에 예시될 수 있다; 아자리빈(azaribine), 아나스트로졸(anastrozole), 아자시티딘(azacytidine), 블레오마이신(bleomycin), 볼테조미브(bortezomib), 브리오스타틴-1(bryostatin-1), 부설판(busulfan), 캄프토테신(camptothecin), 10-하이드록시캄프토테신(10-hydroxycamptothecin), 카머스틴(carmustine), 셀레브렉스(celebrex), 클로람부실(chlorambucil), 시스플라틴(cisplatin), 이리노테칸(irinotecan), 카보플라틴(carboplatin), 클래드리빈(cladribine), 사이클로포스파마이드(cyclophosphamide), 시타라빈(cytarabine), 다카바진(dacarbazine), 도세탁셀(docetaxel), 닥티노마이신(dactinomycin), 다우노마이신 글루쿠로니드(daunomycin glucuronide), 다우노루비신(daunorubicin), 덱사메타손(dexamethasone), 다이에틸스틸베스트롤(diethylstilbestrol), 독소루비신(doxorubicin), 독소루비신 글루쿠로니드(doxorubicin glucuronide), 에피루비신(epirubicin), 에틴일 에스트라다이올(ethinyl estradiol), 에스트라무스틴(estramustine), 에토포시드(etoposide), 에토포시드 글루쿠로니드(etoposide glucuronide), 플록수리딘(floxuridine), 플루다라빈(fludarabine), 플루타마이드(flutamide), 플루오로우라실(fluorouracil), 플루옥시메스테론(fluoxymesterone), 젬시타빈(gemcitabine), 하이드록시프로게스테론 카프로에이트(hydroxyprogesterone caproate), 하이드록시유레아(hydroxyurea), 이다루비신(idarubicin), 이포스파마이드(ifosfamide), 로이코보린(leucovorin), 로무스틴(lomustine), 마이탄시노이드(maytansinoid), 메크로레타민(mechlorethamine), 메드록시프로게스테론 아세테이트(medroxyprogesterone acetate), 메게스트롤 아세테이트(megestrol acetate), 멜팔란(melphalan), 머캅토퓨린(mercaptopurine), 메토트렉세이트(methotrexate), 미톡산트론(mitoxantrone), 미트라마이신(mithramycin), 미토마이신(mitomycin), 미토테인(mitotane), 페닐뷰티레이트(phenylbutyrate), 프레드니손(prednisone), 프로카바진(procarbazine), 파클리탁셀(paclitaxel), 펜토스타틴(pentostatin), 세무스틴(semustine), 스트렙토조신(streptozocin), 타목시펜(tamoxifen), 탁세인류(taxanes), 탁솔(taxol), 테스토스테론 프로피오네이트(testosterone propionate), 쌀리도마이드(thalidomide), 싸이오구아닌(thioguanine), 싸이오테파(thiotepa), 테니포시드(teniposide), 토포테칸(topotecan), 우라실 머스타드(uracil mustard), 빈블라스틴(vinblastine), 비노렐빈(vinorelbine), 빈크리스틴(vincristine).
본 발명에 있어서, 바람직한 화학 요법제는, 저분자의 화학 요법제이다. 저분자의 화학 요법제는, 본 발명의 항GPC3-항체 약물 복합체가 결합한 후에도, 항GPC3 항체의 기능에 간섭할 가능성이 낮다. 본 발명에 있어서, 저분자의 화학 요법제는, 통상 100∼2000, 바람직하게는 200∼1000의 분자량을 갖는다. 여기에 예시한 화학 요법제는, 모두 저분자의 화학 요법제이다. 이들 본 발명에 있어서의 화학 요법제는, 생체 내에서 활성인 화학 요법제로 변환되는 프로드러그를 포함한다. 프로드러그의 활성화는 효소적인 변환일 수 있고, 비효소적인 변환이기도 할 수 있다.
또한, 본 발명의 항GPC3-항체 약물 복합체에 연결되는 세포 상해성 물질로서는, Pseudomonas exotoxin A, Saporin-s6, Diphtheria toxin, Cnidarian toxin 등의 독성 펩티드(톡신)나 Radioiodine, Photosensitizer도 예시될 수 있다. 독성 펩티드의 예로서는, 예를 들면, 다음의 것을 적합하게 들 수 있다.
다이프테리아 톡신 A 쇄(Diphtheria toxin A Chain)(Langone 등 (Methods in Enzymology (1983) 93, 307-308));
슈도모나스 엑소톡신(Pseudomonas Exotoxin)(Nature Medicine (1996) 2, 350-353);
라이신 쇄(Ricin A Chain)(Fulton 등(J. Biol. Chem. (1986) 261, 5314-5319), Sivam 등(Cancer Res. (1987) 47, 3169-3173), Cumber 등(J. Immunol. Methods (1990) 135, 15-24, Wawrzynczak 등(Cancer Res. (1990) 50, 7519-7562), 및 Gheeite 등(J. Immunol.Methods (1991) 142, 223-230));
무당 쇄 라이신 A 쇄(Deglycosylated Ricin A Chain)(Thorpe 등(Cancer Res. (1987) 47, 5924-5931));
아브린 A 쇄(Abrin A Chain)(Wawrzynczak 등(Br. J. Cancer (1992) 66, 361-366), Wawrzynczak 등(Cancer Res. (1990) 50, 7519-7562), Sivam 등(Cancer Res. (1987) 47, 3169-3173), 및 Thorpe 등(Cancer Res. (1987) 47, 5924-5931));
젤로닌(Gelonin)(Sivam 등(Cancer Res. (1987) 47, 3169-3173), Cumber 등(J. Immunol. Methods (1990) 135, 15-24), Wawrzynczak 등(Cancer Res., (1990) 50, 7519-7562), 및 Bolognesi 등(Clin. exp. Immunol. (1992) 89, 341-346));
포크위드 항바이러스 단백(PAP-s; Pokeweed anti-viral protein fromseeds)(Bolognesi 등(Clin. exp. Immunol. (1992) 89, 341-346));
브리오딘(Bryodin)(Bolognesi 등(Clin. exp. Immunol. (1992) 89, 341-346));
사포린(Saporin)(Bolognesi 등(Clin. exp. Immunol. (1992) 89, 341-346));
모몰딘(Momordin)(Cumber 등(J. Immunol. Methods (1990) 135, 15-24); Wawrzynczak 등(Cancer Res. (1990) 50, 7519-7562), 및 Bolognesi 등(Clin. exp. Immunol. (1992) 89, 341-346));
모몰코킨(Momorcochin)(Bolognesi 등(Clin. exp. Immunol. (1992) 89, 341-346));
다이안씬 32(Dianthin 32)(Bolognesi 등(Clin. exp. Immunol. (1992) 89, 341-346));
다이안씬 30(Dianthin 30)(Stirpe F., Barbieri L. (FEBS letter (1986) 195, 1-8));
모뎃신(Modeccin)(Stirpe F., Barbieri L. (FEBS letter (1986) 195, 1-8));
비스커민(Viscumin)(Stirpe F., Barbieri L. (FEBS letter (1986) 195, 1-8));
볼켄신(Volkensin)(Stirpe F., Barbieri L. (FEBS letter (1986) 195, 1-8));
도데칸드린(Dodecandrin)(Stirpe F., Barbieri L. (FEBS letter (1986) 195, 1-8));
트리틴(Tritin)(Stirpe F., Barbieri L. (FEBS letter (1986) 195, 1-8));
루핀(Luffin)(Stirpe F., Barbieri L. (FEBS letter (1986) 195, 1-8)); 및
트리코키린(Trichokirin)(Casellas 등(Eur. J. Biochem. (1988) 176, 581-588), 및 Bolognesi 등(Clin. exp. Immunol., (1992) 89, 341-346)).
한편, 본 발명의 항GPC3-항체 약물 복합체에 의한 세포 상해 활성의 측정인 경우는, 96웰 평저 플레이트(Becton Dickinson)에, 표적 세포와 당해 항GPC3-항체 약물 복합체의 50μl씩이 가해지고, 얼음 상에서 15분간의 반응이 실시된다. 당해 플레이트는 탄산 가스 인큐베이터 내에서 1 내지 4시간 인큐베이트된다. 항GPC3-항체 약물 복합체의 최종 농도는 0 내지 3μg/ml의 범위 내에서 적절히 사용될 수 있다. 배양 후, 100μl 상청이 회수되어, 감마 카운터로 당해 상청이 갖는 방사 활성이 측정된다. 세포 상해 활성은 ADCC 활성의 측정과 마찬가지로 하여 계산될 수 있다.
Fc 영역
본 발명의 항GPC3 항체에 포함되는 정상 영역에 포함되는 Fc 영역은, 인간 IgG로부터 취득될 수 있지만, IgG의 특정한 서브클래스로 한정되는 것도 아니다. Fc 영역이란, EU 넘버링으로 표시되는 대략 216위의 아미노산에 있어서의, 파파인 절단 부위의 힌지 영역의 N말단으로부터, 당해 힌지, CH2 및 CH3 도메인을 포함하는 항체의 중쇄 정상 영역을 말한다. 당해 Fc 영역의 적합한 예로서, 후술되는 바와 같이 Fcγ 리셉터에 대한 결합 활성을 갖는 Fc 영역을 들 수 있다. 그와 같은 Fc 영역의 비한정된 일 태양으로서, 인간 IgG1(서열번호: 74), IgG2(서열번호: 75), IgG3(서열번호: 76), 또는 IgG4(서열번호: 77)로 표시되는 정상 영역에 포함되는 Fc 영역이 예시된다.
Fc γ 리셉터 ( Fc γR)
Fcγ 리셉터(FcγR이라고도 기재된다)란, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 모노클로날 항체의 Fc 영역에 결합할 수 있는 리셉터를 말하고, 실질적으로 Fcγ 리셉터 유전자에 코딩되는 단백질의 패밀리 중 어떤 멤버도 의미한다. 인간에서는, 이 패밀리에는, 아이소폼 FcγRIa, FcγRIb 및 FcγRIc를 포함하는 FcγRI(CD64); 아이소폼 FcγRIIa(알로타입 H131 및 R131을 포함한다. 즉, FcγRIIa(H) 및 FcγRIIa(R)), FcγRIIb(FcγRIIb-1 및 FcγRIIb-2를 포함한다) 및 FcγRIIc를 포함하는 FcγRII(CD32); 및 아이소폼 FcγRIIIa(알로타입 V158 및 F158을 포함한다. 즉, FcγRIIIa(V) 및 FcγRIIIa(F)) 및 FcγRIIIb(알로타입 FcγRIIIb-NA1 및 FcγRIIIb-NA2를 포함한다)를 포함하는 FcγRIII(CD16), 및 어떤 미발견된 인간 FcγR류 또는 FcγR 아이소폼 또는 알로타입도 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. FcγR은, 인간, 마우스, 래트, 토끼 및 원숭이를 포함하지만, 이들에 한정되는 것은 아니며, 어떤 생물 유래라도 된다. 마우스 FcγR류에는, FcγRI(CD64), FcγRII(CD32), FcγRIII(CD16) 및 FcγRIII-2(FcγRIV, CD16-2), 및 어떤 미발견된 마우스 FcγR류 또는 FcγR 아이소폼 또는 알로타입도 포함되지만, 이들로 한정되지 않는다. 이러한 Fcγ 리셉터의 적합한 예로서는 인간 FcγRI(CD64), FcγRIIa(CD32), FcγRIIb(CD32), FcγRIIIa(CD16) 및/또는 FcγRIIIb(CD16)를 들 수 있다. 인간 FcγRI의 폴리펩티드 서열은 서열번호: 78(NP_000557.1)에, 인간 FcγRIIa(알로타입 H131)의 폴리펩티드 서열은 서열번호: 79(AAH20823.1)에(알로타입 R131은 서열번호: 79의 166번째의 아미노산이 Arg로 치환되어 있는 서열이다), FcγRIIb의 폴리펩티드 서열은 서열번호: 80(AAI46679.1)에, FcγRIIIa의 폴리펩티드 서열은 서열번호: 81(AAH33678.1)에, 및 FcγRIIIb의 폴리펩티드 서열은 서열번호: 82(AAI28563.1)에 기재되어 있다(괄호 안은 RefSeq 등의 데이터베이스 등록번호를 나타낸다). Fcγ 리셉터가, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 모노클로날 항체의 Fc 영역에 결합 활성을 갖는지 여부는, FACS나 ELISA 포맷 외에, ALPHA 스크린(Amplified Luminescent Proximity Homogeneous Assay)이나 표면 플라즈몬 공명(SPR) 현상을 이용한 BIACORE법 등의 공지의 방법에 의해 확인될 수 있다(Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (2006) 103 (11), 4005-4010).
FcγRIa, FcγRIb 및 FcγRIc를 포함하는 FcγRI(CD64), 및 아이소폼 FcγRIIIa(알로타입 V158 및 F158을 포함한다) 및 FcγRIIIb(알로타입 FcγRIIIb-NA1 및 FcγRIIIb-NA2를 포함한다)를 포함하는 FcγRIII(CD16)는, IgG의 Fc 영역과 결합하는 α쇄와 세포 내에 활성화 시그널을 전달하는 ITAM을 갖는 공통 γ쇄가 회합된다. 한편, 아이소폼 FcγRIIa(알로타입 H131 및 R131을 포함한다) 및 FcγRIIc를 포함하는 FcγRII(CD32)의 자신의 세포질 도메인에는 ITAM이 포함되어 있다. 이들 리셉터는, 매크로파지나 마스트 세포, 항원 제시 세포 등의 많은 면역 세포에 발현되어 있다. 이들 리셉터가 IgG의 Fc 영역에 결합하는 것에 의해 전달되는 활성화 시그널에 의해, 매크로파지의 탐식능이나 염증성 사이토카인의 산생, 마스트 세포의 탈과립, 항원 제시 세포의 기능 항진이 촉진된다. 상기와 같이 활성화 시그널을 전달하는 능력을 갖는 Fcγ 리셉터는, 본 명세서에 있어서 활성형 Fcγ 리셉터로 불린다.
한편, FcγRIIb(FcγRIIb-1 및 FcγRIIb-2를 포함한다)의 자신의 세포질 내 도메인에는 억제형 시그널을 전달하는 ITIM이 포함되어 있다. B세포에서는 FcγRIIb와 B세포 리셉터(BCR)의 가교에 의해 BCR로부터의 활성화 시그널이 억제되는 결과 BCR의 항체 산생이 억제된다. 매크로파지에서는, FcγRIII와 FcγRIIb의 가교에 의해 탐식능이나 염증성 사이토카인의 산생능이 억제된다. 상기와 같이 억제화 시그널을 전달하는 능력을 갖는 Fcγ 리셉터는, 본 명세서에 있어서 억제형 Fcγ 리셉터로 불린다.
Fc γR에 대한 Fc 영역의 결합 활성
전술된 바와 같이, 본 발명의 항GPC3 항체에 포함되는 Fc 영역으로서, Fcγ 리셉터에 대한 결합 활성을 갖는 Fc 영역을 들 수 있다. 그와 같은 Fc 영역의 비한정된 일 태양으로서, 인간 IgG1(서열번호: 74), IgG2(서열번호: 75), IgG3(서열번호: 76), 또는 IgG4(서열번호: 77)로 표시되는 정상 영역에 포함되는 Fc 영역이 예시된다. Fcγ 리셉터가, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 모노클로날 항체의 Fc 영역에 결합 활성을 갖는지 여부는, FACS나 ELISA 포맷 외에, ALPHA 스크린(Amplified Luminescent Proximity Homogeneous Assay)이나 표면 플라즈몬 공명(SPR) 현상을 이용한 BIACORE법 등의 공지의 방법에 의해 확인될 수 있다(Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (2006) 103 (11), 4005-4010).
ALPHA 스크린은, 도너와 억셉터의 2개의 비즈를 사용하는 ALPHA 테크놀로지에 의해 하기의 원리에 기초하여 실시된다. 도너 비즈에 결합한 분자가, 억셉터 비즈에 결합한 분자와 생물학적으로 상호 작용하여, 2개의 비즈가 근접한 상태인 때에만, 발광 시그널이 검출된다. 레이저에 의해 여기된 도너 비즈 내의 포토센서타이저는, 주변의 산소를 여기 상태의 일중항 산소로 변환한다. 일중항 산소는 도너 비즈 주변에 확산되어, 근접되어 있는 억셉터 비즈에 도달하면 비즈 내의 화학 발광 반응을 야기하여, 최종적으로 광이 방출된다. 도너 비즈에 결합한 분자와 억셉터 비즈에 결합한 분자가 상호 작용하지 않을 때는, 도너 비즈가 산생하는 일중항 산소가 억셉터 비즈에 도달하지 않기 때문에, 화학 발광 반응은 일어나지 않는다.
예를 들면, 도너 비즈에 바이오틴 표지된 Fc 영역을 포함하는 항GPC3 항체가 결합되고, 억셉터 비즈에는 글루타티온 S 트란스페라제(GST)로 태그화된 Fcγ 리셉터가 결합된다. 경합하는 Fc 영역 개변체를 포함하는 항GPC3 항체의 비존재하에서는, 천연형 Fc 영역을 갖는 항GPC3 항체와 Fcγ 리셉터는 상호 작용해 520-620nm의 시그널을 생성한다. 태그화되어 있지 않은 Fc 영역 개변체를 포함하는 항GPC3 항체는, 천연형 Fc 영역을 갖는 항GPC3 항체와 Fcγ 리셉터간의 상호 작용과 경합한다. 경합의 결과 나타나는 형광의 감소를 정량하는 것에 의해 상대적인 결합 친화성이 결정될 수 있다. 항체를 Sulfo-NHS-바이오틴 등을 이용하여 바이오틴화하는 것은 공지이다. Fcγ 리셉터를 GST로 태그화하는 방법으로서는, Fcγ 리셉터를 코딩하는 폴리뉴클레오티드와 GST를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 인프레임으로 융합한 융합 유전자가 작동 가능하게 연결된 벡터에 유지한 세포 등에서 발현하여, 글루타티온 컬럼을 이용하여 정제하는 방법 등이 적절히 채용될 수 있다. 얻어진 시그널은 예를 들면 GRAPHPAD PRISM(GraphPad사, San Diego) 등의 소프트웨어를 이용하여 비선형 회귀 해석을 이용하는 일부위 경합(one-site competition) 모델에 적합시키는 것에 의해 적합하게 해석된다.
상호 작용을 관찰하는 물질의 한쪽(리간드)을 센서 칩의 금 박막 상에 고정하고, 센서 칩의 이측(裏側)으로부터 금 박막과 유리의 경계면에서 전반사하도록 광을 쏘이면, 반사광의 일부에 반사 강도가 저하된 부분(SPR 시그널)이 형성된다. 상호 작용을 관찰하는 물질의 다른 쪽(애널라이트)을 센서 칩의 표면에 흘려 리간드와 애널라이트가 결합하면, 고정화되어 있는 리간드 분자의 질량이 증가되어, 센서 칩 표면의 용매의 굴절률이 변화된다. 이 굴절률의 변화에 의해, SPR 시그널의 위치가 시프트된다(반대로 결합이 해리되면 시그널의 위치는 되돌아온다). Biacore 시스템은 상기의 시프트되는 양, 즉 센서 칩 표면에서의 질량 변화를 세로축에 취하고, 질량의 시간 변화를 측정 데이터로서 표시한다(센서그램). 센서그램의 커브로부터 카이네틱스: 결합 속도 상수(ka)와 해리 속도 상수(kd)가, 당해 상수의 비로부터 어피니티(KD)가 구해진다. BIACORE법에서는 저해 측정법도 적합하게 이용된다. 저해 측정법의 예는 Lazor 등(Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (2006) 103 (11), 4005-4010)에 있어서 기재되어 있다.
Fc γ 리셉터 ( Fc γR) 결합 개변 Fc 영역
본 발명의 항GPC3 항체가 포함하는 Fc 영역으로서, 인간 IgG1(서열번호: 74), IgG2(서열번호: 75), IgG3(서열번호: 76), 또는 IgG4(서열번호: 77)로 표시되는 정상 영역에 포함되는 Fc 영역 외에, 천연형 인간 IgG의 Fc 영역의 Fcγ 리셉터에 대한 결합 활성보다도 Fcγ 리셉터에 대한 결합 활성이 높은 FcγR 결합 개변 Fc 영역도 적절히 사용될 수 있다. 본 명세서에 있어서, 「천연형 인간 IgG의 Fc 영역」이란, 서열번호: 74, 75, 76 또는 77로 예시되는 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4의 정상 영역에 포함되는 Fc 영역의 EU 넘버링 297위에 결합한 당쇄가 푸코스 함유 당쇄인 Fc 영역을 의미한다. 그와 같은 FcγR 결합 개변 Fc 영역은, 천연형 인간 IgG의 Fc 영역의 아미노산을 개변하는 것에 의해 제작될 수 있다. FcγR 결합 개변 Fc 영역의 FcγR에 대한 결합 활성이, 천연형 인간 IgG의 Fc 영역의 FcγR에 대한 결합 활성보다 높은지 여부는, 상기의 FACS나 ELISA 포맷 외에, ALPHA 스크린(Amplified Luminescent Proximity Homogeneous Assay)이나 표면 플라즈몬 공명(SPR) 현상을 이용한 BIACORE법 등의 공지의 방법을 이용하여 적절히 실시될 수 있다.
본 발명에 있어서, Fc 영역의 「아미노산의 개변」 또는 「아미노산 개변」이란, 출발 Fc 영역의 아미노산 서열과는 상이한 아미노산 서열로 개변하는 것을 포함한다. 출발 Fc 영역의 수식 개변체가 pH 중성역에 있어서 인간 Fcγ 리셉터에 결합할 수 있는 한, 어느 Fc 영역도 출발 Fc 영역으로서 사용될 수 있다. 또한, 이미 개변이 가해진 Fc 영역을 출발 Fc 영역으로 하여 추가적인 개변이 가해진 Fc 영역도 본 발명의 Fc 영역으로서 적합하게 사용될 수 있다. 출발 Fc 영역이란, 폴리펩티드 그 자체, 출발 Fc 영역을 포함하는 조성물, 또는 출발 Fc 영역을 코딩하는 아미노산 서열을 의미할 수 있다. 출발 Fc 영역에는, 항체의 항에서 개설(槪說)된 재조합에 의해 산생된 공지의 Fc 영역이 포함될 수 있다. 출발 Fc 영역의 기원은, 한정되지 않지만 비인간 동물인 임의의 생물 또는 인간으로부터 취득될 수 있다. 바람직하게는, 임의의 생물로서는, 마우스, 래트, 몰모트, 햄스터, 게르빌루스 쥐, 고양이, 토끼, 개, 염소, 양, 소, 말, 낙타, 및 비인간 영장류로부터 선택되는 생물을 적합하게 들 수 있다. 다른 태양에 있어서, 출발 Fc 영역은 또한, 필리핀 원숭이, 마모셋트, 히말라야 원숭이, 침팬지, 또는 인간으로부터 취득될 수 있다. 바람직하게는, 출발 Fc 영역은, 인간 IgG1로부터 취득될 수 있지만, IgG의 특정한 클래스로 한정되는 것도 아니다. 이것은, 인간 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4의 Fc 영역을 출발 Fc 영역으로서 적절히 이용할 수 있다는 것을 의미한다. 마찬가지로, 본 명세서에 있어서, 상기의 임의의 생물로부터의 IgG의 임의의 클래스 또는 서브클래스의 Fc 영역을, 바람직하게는 출발 Fc 영역으로서 이용할 수 있다는 것을 의미한다. 천연으로 존재하는 IgG의 배리언트 또는 조작된 형태의 예는, 공지의 문헌(Curr. Opin. Biotechnol. (2009) 20 (6), 685-91, Curr. Opin. Immunol. (2008) 20 (4), 460-470, Protein Eng. Des. Sel. (2010) 23 (4), 195-202, 국제공개 WO2009/086320, WO2008/092117, WO2007/041635, 및 WO2006/105338)에 기재되지만 그들로 한정되지 않는다.
개변의 예로서는 1 이상의 변이, 예를 들면, 출발 Fc 영역의 아미노산과는 상이한 아미노산 잔기로 치환된 변이, 또는 출발 Fc 영역의 아미노산에 대해서 1 이상의 아미노산 잔기의 삽입 또는 출발 Fc 영역의 아미노산으로부터 1 이상의 아미노산의 결실 등이 포함된다. 바람직하게는, 개변 후의 Fc 영역의 아미노산 서열에는, 천연으로 생기지 않는 Fc 영역의 적어도 부분을 포함하는 아미노산 서열을 포함한다. 그와 같은 변종은 필연적으로 출발 Fc 영역과 100% 미만의 서열 동일성 또는 유사성을 갖는다. 바람직한 실시형태에 있어서, 변종은 출발 Fc 영역의 아미노산 서열과 약 75%∼100% 미만의 아미노산 서열 동일성 또는 유사성, 보다 바람직하게는 약 80%∼100% 미만, 보다 바람직하게는 약 85%∼100% 미만의, 보다 바람직하게는 약 90%∼100% 미만, 가장 바람직하게는 약 95%∼100% 미만의 동일성 또는 유사성의 아미노산 서열을 갖는다. 본 발명의 비한정된 일 태양에 있어서, 출발 Fc 영역 및 본 발명의 FcγR 결합 개변 Fc 영역 사이에는 적어도 1개의 아미노산의 차가 있다. 출발 Fc 영역과 본 발명의 FcγR 결합 개변 Fc 영역의 아미노산의 차는, 특히 전술된 EU 넘버링으로 특정되는 아미노산 잔기의 위치의 특정된 아미노산의 상위에 의해서도 적합하게 특정 가능하다.
Fc 영역의 아미노산의 개변을 위해서는, 부위 특이적 변이 유발법(Kunkel 등(Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1985) 82, 488-492))이나 Overlap extension PCR 등의 공지의 방법이 적절히 채용될 수 있다. 또한, 천연의 아미노산 이외의 아미노산으로 치환되는 아미노산의 개변 방법으로서, 복수의 공지의 방법도 채용될 수 있다(Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. (2006) 35, 225-249, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (2003) 100 (11), 6353-6357). 예를 들면, 종지 코돈의 하나인 UAG 코돈(앰버 코돈)의 상보적 앰버 서프레서 tRNA에 비천연 아미노산이 결합된 tRNA가 포함된 무세포 번역계 시스템(Clover Direct(Protein Express)) 등도 적합하게 이용된다.
본 발명의 항원 결합 분자에 포함되는, 천연형 인간 IgG의 Fc 영역의 Fcγ 리셉터에 대한 결합 활성보다도 Fcγ 리셉터에 대한 결합 활성이 높은 FcγR 결합 개변 Fc 영역은 어떤 방법에 의해서도 취득될 수 있지만, 구체적으로는, 출발 Fc 영역으로서 이용되는 인간 IgG형 면역 글로블린의 아미노산의 개변에 의해 당해 FcγR 결합 개변 Fc 영역이 취득될 수 있다. 개변을 위한 바람직한 IgG형 면역 글로블린의 Fc 영역으로서는, 예를 들면, 서열번호: 74, 75, 76 또는 77로 예시되는 인간 IgG(IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4, 및 그들의 개변체)의 정상 영역에 포함되는 Fc 영역을 들 수 있다.
다른 아미노산으로의 개변은, 천연형 인간 IgG의 Fc 영역의 Fcγ 리셉터에 대한 결합 활성보다도 Fcγ 리셉터에 대한 결합 활성이 높은 한, 어떤 위치의 아미노산도 개변될 수 있다. 항원 결합 분자가, 인간 Fc 영역으로서 인간 IgG1의 Fc 영역을 포함하고 있는 경우, EU 넘버링 297위에 결합한 당쇄가 푸코스 함유 당쇄인 천연형 인간 IgG의 Fc 영역의 Fcγ 리셉터에 대한 결합 활성보다도 Fcγ 리셉터에 대한 결합 활성이 높은 효과를 가져오는 개변이 포함되어 있는 것이 바람직하다. 이러한 아미노산의 개변으로서는, 예를 들면 국제공개 WO2007/024249, WO2007/021841, WO2006/031370, WO2000/042072, WO2004/029207, WO2004/099249, WO2006/105338, WO2007/041635, WO2008/092117, WO2005/070963, WO2006/020114, WO2006/116260 및 WO2006/023403 등에서 보고되어 있다.
그와 같은 개변이 가능한 아미노산으로서, 예를 들면, EU 넘버링으로 표시되는 221위, 222위, 223위, 224위, 225위, 227위, 228위, 230위, 231위, 232위, 233위, 234위, 235위, 236위, 237위, 238위, 239위, 240위, 241위, 243위, 244위, 245위, 246위, 247위, 249위, 250위, 251위, 254위, 255위, 256위, 258위, 260위, 262위, 263위, 264위, 265위, 266위, 267위, 268위, 269위, 270위, 271위, 272위, 273위, 274위, 275위, 276위, 278위, 279위, 280위, 281위, 282위, 283위, 284위, 285위, 286위, 288위, 290위, 291위, 292위, 293위, 294위, 295위, 296위, 297위, 298위, 299위, 300위, 301위, 302위, 303위, 304위, 305위, 311위, 313위, 315위, 317위, 318위, 320위, 322위, 323위, 324위, 325위, 326위, 327위, 328위, 329위, 330위, 331위, 332위, 333위, 334위, 335위, 336위, 337위, 339위, 376위, 377위, 378위, 379위, 380위, 382위, 385위, 392위, 396위, 421위, 427위, 428위, 429위, 434위, 436위 및 440위의 군으로부터 선택되는 적어도 1개 이상의 아미노산을 들 수 있다. 이들 아미노산의 개변에 의해, 천연형 인간 IgG의 Fc 영역의 Fcγ 리셉터에 대한 결합 활성보다도 Fcγ 리셉터에 대한 결합 활성이 높은 Fc 영역(FcγR 결합 개변 Fc 영역)을 취득할 수 있다.
본 발명에 사용하기 위해서, 특히 바람직한 개변으로서는, 예를 들면, Fc 영역의 EU 넘버링으로 표시되는;
221위의 아미노산이 Lys 또는 Tyr 중 어느 것,
222위의 아미노산이 Phe, Trp, Glu 또는 Tyr 중 어느 것,
223위의 아미노산이 Phe, Trp, Glu 또는 Lys 중 어느 것,
224위의 아미노산이 Phe, Trp, Glu 또는 Tyr 중 어느 것,
225위의 아미노산이 Glu, Lys 또는 Trp 중 어느 것,
227위의 아미노산이 Glu, Gly, Lys 또는 Tyr 중 어느 것,
228위의 아미노산이 Glu, Gly, Lys 또는 Tyr 중 어느 것,
230위의 아미노산이 Ala, Glu, Gly 또는 Tyr 중 어느 것,
231위의 아미노산이 Glu, Gly, Lys, Pro 또는 Tyr 중 어느 것,
232위의 아미노산이 Glu, Gly, Lys 또는 Tyr 중 어느 것,
233위의 아미노산이 Ala, Asp, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp 또는 Tyr 중 어느 것,
234위의 아미노산이 Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp 또는 Tyr 중 어느 것,
235위의 아미노산이 Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp 또는 Tyr 중 어느 것,
236위의 아미노산이 Ala, Asp, Glu, Phe, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp 또는 Tyr 중 어느 것,
237위의 아미노산이 Asp, Glu, Phe, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp 또는 Tyr 중 어느 것,
238위의 아미노산이 Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp 또는 Tyr 중 어느 것,
239위의 아미노산이 Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Thr, Val, Trp 또는 Tyr 중 어느 것,
240위의 아미노산이 Ala, Ile, Met 또는 Thr 중 어느 것,
241위의 아미노산이 Asp, Glu, Leu, Arg, Trp 또는 Tyr 중 어느 것,
243위의 아미노산이 Leu, Glu, Leu, Gln, Arg, Trp 또는 Tyr 중 어느 것,
244위의 아미노산이 His,
245위의 아미노산이 Ala,
246위의 아미노산이 Asp, Glu, His 또는 Tyr 중 어느 것,
247위의 아미노산이 Ala, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Thr, Val 또는 Tyr 중 어느 것,
249위의 아미노산이 Glu, His, Gln 또는 Tyr 중 어느 것,
250위의 아미노산이 Glu 또는 Gln 중 어느 것,
251위의 아미노산이 Phe,
254위의 아미노산이 Phe, Met 또는 Tyr 중 어느 것,
255위의 아미노산이 Glu, Leu 또는 Tyr 중 어느 것,
256위의 아미노산이 Ala, Met 또는 Pro 중 어느 것,
258위의 아미노산이 Asp, Glu, His, Ser 또는 Tyr 중 어느 것,
260위의 아미노산이 Asp, Glu, His 또는 Tyr 중 어느 것,
262위의 아미노산이 Ala, Glu, Phe, Ile 또는 Thr 중 어느 것,
263위의 아미노산이 Ala, Ile, Met 또는 Thr 중 어느 것,
264위의 아미노산이 Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Trp 또는 Tyr 중 어느 것,
265위의 아미노산이 Ala, Leu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp 또는 Tyr 중 어느 것,
266위의 아미노산이 Ala, Ile, Met 또는 Thr 중 어느 것,
267위의 아미노산이 Asp, Glu, Phe, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Thr, Val, Trp 또는 Tyr 중 어느 것,
268위의 아미노산이 Asp, Glu, Phe, Gly, Ile, Lys, Leu, Met, Pro, Gln, Arg, Thr, Val 또는 Trp 중 어느 것,
269위의 아미노산이 Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp 또는 Tyr 중 어느 것,
270위의 아미노산이 Glu, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Trp 또는 Tyr 중 어느 것,
271위의 아미노산이 Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp 또는 Tyr 중 어느 것,
272위의 아미노산이 Asp, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp 또는 Tyr 중 어느 것,
273위의 아미노산이 Phe 또는 Ile 중 어느 것,
274위의 아미노산이 Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Asn, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp 또는 Tyr 중 어느 것,
275위의 아미노산이 Leu 또는 Trp 중 어느 것,
276위의 아미노산이, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp 또는 Tyr 중 어느 것,
278위의 아미노산이 Asp, Glu, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val 또는 Trp 중 어느 것,
279위의 아미노산이 Ala,
280위의 아미노산이 Ala, Gly, His, Lys, Leu, Pro, Gln, Trp 또는 Tyr 중 어느 것,
281위의 아미노산이 Asp, Lys, Pro 또는 Tyr 중 어느 것,
282위의 아미노산이 Glu, Gly, Lys, Pro 또는 Tyr 중 어느 것,
283위의 아미노산이 Ala, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Pro, Arg 또는 Tyr 중 어느 것,
284위의 아미노산이 Asp, Glu, Leu, Asn, Thr 또는 Tyr 중 어느 것,
285위의 아미노산이 Asp, Glu, Lys, Gln, Trp 또는 Tyr 중 어느 것,
286위의 아미노산이 Glu, Gly, Pro 또는 Tyr 중 어느 것,
288위의 아미노산이 Asn, Asp, Glu 또는 Tyr 중 어느 것,
290위의 아미노산이 Asp, Gly, His, Leu, Asn, Ser, Thr, Trp 또는 Tyr 중 어느 것,
291위의 아미노산이 Asp, Glu, Gly, His, Ile, Gln 또는 Thr 중 어느 것,
292위의 아미노산이 Ala, Asp, Glu, Pro, Thr 또는 Tyr 중 어느 것,
293위의 아미노산이 Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Asn, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp 또는 Tyr 중 어느 것,
294위의 아미노산이 Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp 또는 Tyr 중 어느 것,
295위의 아미노산이 Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Met, Asn, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp 또는 Tyr 중 어느 것,
296위의 아미노산이 Ala, Asp, Glu, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr 또는 Val 중 어느 것,
297위의 아미노산이 Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp 또는 Tyr 중 어느 것,
298위의 아미노산이 Ala, Asp, Glu, Phe, His, Ile, Lys, Met, Asn, Gln, Arg, Thr, Val, Trp 또는 Tyr 중 어느 것,
299위의 아미노산이 Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Val, Trp 또는 Tyr 중 어느 것,
300위의 아미노산이 Ala, Asp, Glu, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val 또는 Trp 중 어느 것,
301위의 아미노산이 Asp, Glu, His 또는 Tyr 중 어느 것,
302위의 아미노산이 Ile,
303위의 아미노산이 Asp, Gly 또는 Tyr 중 어느 것,
304위의 아미노산이 Asp, His, Leu, Asn 또는 Thr 중 어느 것,
305위의 아미노산이 Glu, Ile, Thr 또는 Tyr 중 어느 것,
311위의 아미노산이 Ala, Asp, Asn, Thr, Val 또는 Tyr 중 어느 것,
313위의 아미노산이 Phe,
315위의 아미노산이 Leu,
317위의 아미노산이 Glu 또는 Gln,
318위의 아미노산이 His, Leu, Asn, Pro, Gln, Arg, Thr, Val 또는 Tyr 중 어느 것,
320위의 아미노산이 Asp, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Asn, Pro, Ser, Thr, Val, Trp 또는 Tyr 중 어느 것,
322위의 아미노산이 Ala, Asp, Phe, Gly, His, Ile, Pro, Ser, Thr, Val, Trp 또는 Tyr 중 어느 것,
323위의 아미노산이 Ile,
324위의 아미노산이 Asp, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Pro, Arg, Thr, Val, Trp 또는 Tyr 중 어느 것,
325위의 아미노산이 Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp 또는 Tyr 중 어느 것,
326위의 아미노산이 Ala, Asp, Glu, Gly, Ile, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Ser, Thr, Val, Trp 또는 Tyr 중 어느 것,
327위의 아미노산이 Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Arg, Thr, Val, Trp 또는 Tyr 중 어느 것,
328위의 아미노산이 Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp 또는 Tyr 중 어느 것,
329위의 아미노산이 Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp 또는 Tyr 중 어느 것,
330위의 아미노산이 Cys, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp 또는 Tyr 중 어느 것,
331위의 아미노산이 Asp, Phe, His, Ile, Leu, Met, Gln, Arg, Thr, Val, Trp 또는 Tyr 중 어느 것,
332위의 아미노산이 Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp 또는 Tyr 중 어느 것,
333위의 아미노산이 Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Pro, Ser, Thr, Val 또는 Tyr 중 어느 것,
334위의 아미노산이 Ala, Glu, Phe, Ile, Leu, Pro 또는 Thr 중 어느 것,
335위의 아미노산이 Asp, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Asn, Pro, Arg, Ser, Val, Trp 또는 Tyr 중 어느 것,
336위의 아미노산이 Glu, Lys 또는 Tyr 중 어느 것,
337위의 아미노산이 Glu, His 또는 Asn 중 어느 것,
339위의 아미노산이 Asp, Phe, Gly, Ile, Lys, Met, Asn, Gln, Arg, Ser 또는 Thr 중 어느 것,
376위의 아미노산이 Ala 또는 Val 중 어느 것,
377위의 아미노산이 Gly 또는 Lys 중 어느 것,
378위의 아미노산이 Asp,
379위의 아미노산이 Asn,
380위의 아미노산이 Ala, Asn 또는 Ser 중 어느 것,
382위의 아미노산이 Ala 또는 Ile 중 어느 것,
385위의 아미노산이 Glu,
392위의 아미노산이 Thr,
396위의 아미노산이 Leu,
421위의 아미노산이 Lys,
427위의 아미노산이 Asn,
428위의 아미노산이 Phe 또는 Leu 중 어느 것,
429위의 아미노산이 Met,
434위의 아미노산이 Trp,
436위의 아미노산이 Ile, 또는
440위의 아미노산이 Gly, His, Ile, Leu 또는 Tyr 중 어느 것,
의 군으로부터 선택되는 적어도 1개 이상의 아미노산의 개변을 들 수 있다. 또한, 개변되는 아미노산의 수는 특별히 한정되지 않고, 1개소만의 아미노산이 개변될 수 있고, 2개소 이상의 아미노산이 개변될 수 있다. 2개소 이상의 아미노산의 개변의 조합으로서는, 예를 들면 표 3(표 3-1∼표 3-3)에 기재되는 바와 같은 조합을 들 수 있다. 또한, 천연형 인간 IgG의 Fc 영역의 Fcγ 리셉터에 대한 결합 활성보다도 Fcγ 리셉터에 대한 결합 활성이 높은 FcγR 결합 개변 Fc 영역(FcγR 결합 개변 Fc 영역)을 포함하는 항GPC3 항체의 구체적인 예가, WO2007/047291에 기재되어 있다.
[표 3-1]
Figure pct00004
[표 3-2]
Figure pct00005
[표 3-3]
Figure pct00006
본 발명의 항GPC3 항체에 포함되는 Fcγ 리셉터 결합 도메인과 Fcγ 리셉터의 결합 활성을 측정하는 pH의 조건은 pH 산성역 내지 pH 중성역의 조건이 적절히 사용될 수 있다. 본 발명의 항원 결합 분자에 포함되는 Fcγ 리셉터 결합 도메인과 Fcγ 리셉터의 결합 활성을 측정하는 조건으로서의 pH 산성역 내지 pH 중성역이란, 통상 pH 5.8∼pH 8.0을 의미한다. 바람직하게는 pH 6.0∼pH 7.4의 임의의 pH값에 의해 나타나는 범위이며, 바람직하게는 pH 6.0, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9, 7.0, 7.1, 7.2, 7.3, 및 7.4로부터 선택되고, 특히 바람직하게는 암 조직의 pH에 가까운 pH 6.15∼7.4이다(Vaupel 등(Cancer Res. (1989) 49, 6449-6665)). 측정 조건에 사용되는 온도로서, Fc 영역과 인간 Fcγ 리셉터의 결합 어피니티는, 10℃∼50℃의 임의의 온도에서 평가될 수 있다. 바람직하게는, Fc 영역과 인간 Fcγ 리셉터의 결합 어피니티를 결정하기 위해서, 15℃∼40℃의 온도가 사용된다. 보다 바람직하게는, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 및 35℃ 중 어느 1개와 같은 20℃부터 35℃까지의 임의의 온도도 마찬가지로, Fc 영역과 Fcγ 리셉터의 결합 어피니티를 결정하기 위해서 사용된다. 25℃라는 온도는 본 발명의 태양의 비한정된 일례이다.
본 명세서에 있어서, FcγR 결합 개변 Fc 영역의 Fcγ 리셉터에 대한 결합 활성이 천연형 Fc 영역의 Fcγ 리셉터에 대한 결합 활성보다도 높다란, FcγR 결합 개변 Fc 영역의 FcγRI, FcγRIIa, FcγRIIb, FcγRIIIa 및/또는 FcγRIIIb 중 어느 것의 인간 Fcγ 리셉터에 대한 결합 활성이, 이들의 인간 Fcγ 리셉터에 대한 천연형 Fc 영역의 결합 활성보다도 높다는 것을 말한다. 예를 들면, 상기의 해석 방법에 의거하여, 대조로 하는 인간 IgG의 천연형 Fc 영역을 포함하는 항GPC3 항체의 결합 활성과 비교하여 FcγR 결합 개변 Fc 영역을 포함하는 항GPC3 항체의 결합 활성이, 105% 이상, 바람직하게는 110% 이상, 115% 이상, 120% 이상, 125% 이상, 특히 바람직하게는 130% 이상, 135% 이상, 140% 이상, 145% 이상, 150% 이상, 155% 이상, 160% 이상, 165% 이상, 170% 이상, 175% 이상, 180% 이상, 185% 이상, 190% 이상, 195% 이상, 2배 이상, 2.5배 이상, 3배 이상, 3.5배 이상, 4배 이상, 4.5배 이상, 5배 이상, 7.5배 이상, 10배 이상, 20배 이상, 30배 이상, 40배 이상, 50배 이상, 60배 이상, 70배 이상, 80배 이상, 90배 이상, 100배 이상의 결합 활성을 나타낸다는 것을 말한다. 천연형 Fc 영역으로서는, 출발 Fc 영역도 사용될 수 있고, 동일한 서브클래스인 항체의 천연형 Fc 영역도 사용될 수 있다.
본 발명에서는, 대조로 하는 인간 IgG의 천연형 Fc 영역으로서, EU 넘버링으로 표시되는 297위의 아미노산에 결합한 당쇄가 푸코스 함유 당쇄인 천연형 인간 IgG의 Fc 영역이 적합하게 이용된다. EU 넘버링으로 표시되는 297위의 아미노산에 결합한 당쇄가 푸코스 함유 당쇄인지 여부는, 공지의 수법을 이용하여 확인될 수 있다. 예를 들면, 하기와 같은 방법에 의해, 천연형 인간 IgG의 Fc 영역에 결합한 당쇄가 푸코스 함유 당쇄인지 여부를 판정하는 것이 가능하다. 피험 천연형 인간 IgG에 N-Glycosidase F(Roche diagnostics)를 반응시키는 것에 의해, 피험 천연형 인간 IgG로부터 당쇄가 유리된다(Weitzhandler 등(J. Pharma. Sciences (1994) 83, 12, 1670-1675). 다음으로, 에탄올을 반응시켜 단백질이 제거된 반응액(Schenk 등(J. Clin. Investigation (2001) 108 (11) 1687-1695)의 농축 건고물이, 2-아미노벤즈아마이드에 의해 형광 표지된다(Bigge 등(Anal. Biochem. (1995) 230 (2) 229-238). 셀룰로스 카트리지를 이용한 고상 추출에 의해 탈시약된, 형광 표지된 2-AB화 당쇄가 순상 크로마토그래피에 의해 해석된다. 검출되는 크로마토그램의 피크를 관찰하는 것에 의해, 인간 IgG의 천연형 Fc 영역에 결합한 당쇄가 푸코스 함유 당쇄인지 여부를 판정하는 것이 가능하다.
대조로 하는 동일한 서브클래스인 항체의 천연형 Fc 영역을 포함하는 항GPC3 항체로서는, IgG 모노클로날 항체의 Fc 영역을 갖는 항GPC3 항체가 적절히 사용될 수 있다. 당해 Fc 영역의 구조로서, 서열번호: 74(데이터베이스 등록번호 AAC82527.1의 N 끝에 A 부가), 75(데이터베이스 등록번호 AAB59393.1의 N 끝에 A 부가), 76(데이터베이스 등록번호 CAA27268.1), 및 77(데이터베이스 등록번호 AAB59394.1의 N 끝에 A 부가)에 기재되는 정상 영역에 포함되는 Fc 영역이 예시된다. 또한, 어느 특정한 아이소타입의 항GPC3 항체를 피검 물질로서 사용하는 경우에는, 당해 특정한 아이소타입의 항GPC3 항체를 대조로서 이용하는 것에 의해, 피험 Fc 영역을 포함하는 항GPC3 항체에 의한 Fcγ 리셉터에 대한 결합 활성의 효과가 검증된다. 상기와 같이 하여, Fcγ 리셉터에 대한 결합 활성이 높다는 것이 검증된 Fc 영역을 포함하는 항GPC3 항체가 적절히 선택된다.
활성형 Fc γ 리셉터에 대한 결합 활성이 억제형 Fc γ 리셉터에 대한 결합 활성보다도 높은 Fc 영역
상기한 바와 같이, 활성형 Fcγ 리셉터로서는, FcγRIa, FcγRIb 및 FcγRIc를 포함하는 FcγRI(CD64), FcγRIIa, 및 아이소폼 FcγRIIIa(알로타입 V158 및 F158을 포함한다) 및 FcγRIIIb(알로타입 FcγRIIIb-NA1 및 FcγRIIIb-NA2를 포함한다)를 포함하는 FcγRIII(CD16)을 적합하게 들 수 있다. 또한, FcγRIIb(FcγRIIb-1 및 FcγRIIb-2를 포함한다)를 억제형 Fcγ 리셉터의 적합한 예로서 들 수 있다.
본 발명의 비한정된 일 태양으로서, 활성형 Fcγ 리셉터에 대한 결합 활성이 억제형 Fcγ 리셉터에 대한 결합 활성보다도 높은 Fc 영역을 포함하는 항GPC3 항체를 들 수 있다. 이 경우, 활성형 Fcγ 리셉터에 대한 결합 활성이 억제형 Fcγ 리셉터에 대한 결합 활성보다도 높다란, Fc 영역의 FcγRIa, FcγRIIa, FcγRIIIa 및/또는 FcγRIIIb 중 어느 것의 인간 Fcγ 리셉터에 대한 결합 활성이, FcγRIIb에 대한 결합 활성보다도 높다는 것을 말한다. 예를 들면, 상기의 해석 방법에 의거하여, Fc 영역을 포함하는 항원 결합 분자의 FcγRIa, FcγRIIa, FcγRIIIa 및/또는 FcγRIIIb 중 어느 것의 인간 Fcγ 리셉터에 대한 결합 활성이, FcγRIIb에 대한 결합 활성의, 105% 이상, 바람직하게는 110% 이상, 120% 이상, 130% 이상, 140% 이상, 특히 바람직하게는 150% 이상, 160% 이상, 170% 이상, 180% 이상, 190% 이상, 200% 이상, 250% 이상, 300% 이상, 350% 이상, 400% 이상, 450% 이상, 500% 이상, 750% 이상, 10배 이상, 20배 이상, 30배 이상, 40배 이상, 50배, 60배, 70배, 80배, 90배, 100배 이상의 결합 활성을 나타낸다는 것을 말한다. 이러한 Fc 영역을 포함하는 IgG 항체는, 전술한 ADCC 활성이 증강되어 있는 것이 알려져 있기 때문에, 당해 Fc 영역을 포함하는 항GPC3 항체는, 본 발명의 GPC3 표적 치료제로서 유용하다.
본 발명의 비한정된 일 태양에서는, 활성형 Fcγ 리셉터에 대한 결합 활성이 억제형 Fcγ 리셉터에 대한 결합 활성보다도 높은(활성형 Fcγ 리셉터에 대한 선택적인 결합 활성을 갖는) Fc 영역의 예로서, 전술된 EU 넘버링으로 표시되는 221위, 222위, 223위, 224위, 225위, 227위, 228위, 230위, 231위, 232위, 233위, 234위, 235위, 236위, 237위, 238위, 239위, 240위, 241위, 243위, 244위, 245위, 246위, 247위, 249위, 250위, 251위, 254위, 255위, 256위, 258위, 260위, 262위, 263위, 264위, 265위, 266위, 267위, 268위, 269위, 270위, 271위, 272위, 273위, 274위, 275위, 276위, 278위, 279위, 280위, 281위, 282위, 283위, 284위, 285위, 286위, 288위, 290위, 291위, 292위, 293위, 294위, 295위, 296위, 297위, 298위, 299위, 300위, 301위, 302위, 303위, 304위, 305위, 311위, 313위, 315위, 317위, 318위, 320위, 322위, 323위, 324위, 325위, 326위, 327위, 328위, 329위, 330위, 331위, 332위, 333위, 334위, 335위, 336위, 337위, 339위, 376위, 377위, 378위, 379위, 380위, 382위, 385위, 392위, 396위, 421위, 427위, 428위, 429위, 434위, 436위 및 440위의 군으로부터 선택되는 적어도 1개 이상의 아미노산이 천연형 Fc 영역과 상이한 아미노산으로 개변되어 있는 Fc 영역을 적합하게 들 수 있다.
본 발명의 비한정된 일 태양에서는, 활성형 Fcγ 리셉터에 대한 결합 활성이 억제형 Fcγ 리셉터에 대한 결합 활성보다도 높은(활성형 Fcγ 리셉터에 대한 선택적인 결합 활성을 갖는) Fc 영역의 예로서, 표 3-1 내지 3-3에 기재되는 복수의 아미노산이 천연형 Fc 영역과 상이한 아미노산으로 개변되어 있는 Fc 영역을 적합하게 들 수 있다.
당쇄가 수식된 Fc 영역
본 발명이 제공하는 항GPC3 항체에 포함되는 Fc 영역으로서, Fc 영역에 결합한 당쇄의 조성이 푸코스 결손 당쇄를 결합한 Fc 영역의 비율이 높아지도록, 또는 바이섹팅 N-아세틸글루코사민이 부가된 Fc 영역의 비율이 높아지도록 수식된 Fc 영역도 포함될 수 있다. 항체 Fc 영역에 결합하는 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민으로부터 푸코스 잔기를 제거하면, FcγRIIIa에 대한 친화성이 증강되는 것이 알려져 있다(Sato 등(Expert Opin. Biol. Ther. (2006) 6 (11), 1161-1173)). 이러한 Fc 영역을 포함하는 IgG1 항체는, 상기 ADCC 활성이 증강되어 있는 것이 알려져 있기 때문에, 당해 Fc 영역을 포함하는 항원 결합 분자는, 본 발명의 의약 조성물에 포함되는 항원 결합 분자로서도 유용하다. 항체 Fc 영역에 결합하는 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민으로부터 푸코스 잔기가 제거된 항체로서는, 예를 들면, 다음과 같은 항체;
-글리코실화가 수식된 항체(국제공개 WO1999/054342 등),
-당쇄에 부가되는 푸코스가 결손된 항체(국제공개 WO2000/061739, WO2002/031140, WO2006/067913 등),
를 들 수 있다. 또한, Fc 영역에 결합한 당쇄의 조성이 푸코스 결손 당쇄를 결합한 Fc 영역의 비율이 높아지도록, 또는 바이섹팅 N-아세틸글루코사민이 부가된 Fc 영역의 비율이 높아지도록 수식된 Fc 영역을 포함하는 항GPC3 항체의 구체적인 예가, WO2006/046751 및 WO2009/041062에 기재되어 있다.
보다 구체적으로는, 항체 Fc 영역에 결합하는 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민으로부터 푸코스 잔기가 제거된 항체의 상이한 비한정된 일 태양으로서, 당쇄에 부가되는 푸코스가 결손된 항체(국제공개 WO2000/061739, WO2002/031140, WO2006/067913 등)를 제작하기 위해서, 당쇄 수식을 받는 폴리펩티드의 당쇄 구조를 형성하는 활성이 개변된 결과, 당쇄에 푸코스를 부가하는 능력이 낮은 숙주 세포가 제작된다. 당해 숙주 세포에 있어서 원하는 항체 유전자를 발현하는 것에 의해, 당해 숙주 세포의 배양액으로부터 그의 당쇄 중의 푸코스가 결손한 당해 항체가 회수될 수 있다. 폴리펩티드의 당쇄 구조를 형성하는 활성으로서, 푸코실트란스페라제(EC 2.4.1.152), 푸코스트란스포터(SLC35C1), GMD(GDP-만노스4,6-데히드라타제)(EC 4.2.1.47), Fx(GDP-케토-6-데옥시만노스3,5-에피머라제, 4-리덕타제)(EC 1.1.1.271), 및 GFPP(GDP-β-L-푸코스피로포스포릴라제)(EC 2.7.7.30)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 효소 또는 트란스포터의 활성을 비한정된 적합한 예로서 들 수 있다. 이들 효소 또는 트란스포터는, 그의 활성을 발휘할 수 있으면 반드시 그의 구조는 특정되지 않는다. 본 명세서에 있어서는, 이들의 활성을 발휘하는 것이 가능한 단백질을 기능성 단백질이라고 한다. 이들의 활성을 개변하는 방법의 비한정된 일 태양으로서, 이들의 활성의 결실을 들 수 있다. 이들의 활성이 결실된 숙주 세포를 제작하기 위해서, 이들 기능성 단백질의 유전자를 기능 불능으로 파괴하는 방법 등 공지의 방법이 적절히 채용될 수 있다(국제공개 WO2000/061739, WO2002/031140, WO2006/067913 등). 그와 같은 활성이 결실된 숙주 세포는, CHO 세포, BHK 세포, NS0 세포, SP2/0 세포, YO 골수종 세포, P3X63 마우스 골수종 세포, PER 세포, PER.C6 세포, HEK293 세포, 또는 하이브리도마 세포 등에 내재성인 이들 기능성 단백질의 유전자를 기능 불능으로 파괴하는 방법 등에 의해 제작될 수 있다.
바이섹팅 GlcNAc를 갖는 당쇄를 갖는 항체(국제공개 WO2002/079255 등)가 공지이다. 비한정된 일 태양에서는, 바이섹팅 GlcNAc를 갖는 당쇄를 갖는 항체를 제작하기 위해서, GnTIII(β-1,4-만노실-글리코프로테인, 4-β-N-아세틸글루코사민일트란스페라제)(EC 2.4.1.144) 활성 또는 GalT(β-1,4-갈락토실트란스페라제)(EC 2.4.1.38) 활성을 갖는 기능성 단백질을 코딩하는 유전자를 발현하는 숙주 세포가 제작된다. 다른 비한정된 적합한 일 태양에서는, 상기의 기능성 단백질에 더하여, 인간 ManII(만노시다제 II)(3.2.1.114) 활성을 갖는 기능성 단백질을 코딩하는 유전자, GnTI(β-1,2-아세틸글루코사민일트란스페라제 I)(EC 2.4.1.94) 활성을 갖는 기능성 단백질을 코딩하는 유전자, GnTII(β-1,2-아세틸글루코사민일트란스페라제 II)(EC 2.4.1.143) 활성을 갖는 기능성 단백질을 코딩하는 유전자, ManI(만노시다제)(EC 3.2.1.113) 활성을 갖는 기능성 단백질을 코딩하는 유전자, 및 α-1,6-푸코실트란스페라제(EC 2.4.1.68)과 공발현하는 숙주 세포가 제작된다(국제공개 WO2004/065540).
상기와 같은 당쇄에 푸코스를 부가하는 능력이 낮은 숙주 세포, 및 바이섹팅 GlcNAc 구조를 포함하는 당쇄를 형성하는 활성을 갖는 숙주 세포에 항체 유전자를 포함하는 발현 벡터를 형질 도입하는 것에 의해, 항체 Fc 영역에 결합하는 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민으로부터 푸코스 잔기가 제거된 항체, 및 바이섹팅 GlcNAc를 갖는 당쇄를 갖는 항체가 각각 제작될 수 있다. 이들 항체의 제조 방법은 본 발명의 Fc 영역에 결합한 당쇄의 조성이 푸코스 결손 당쇄를 결합한 Fc 영역의 비율이 높아지도록, 또는 바이섹팅 N-아세틸글루코사민이 부가된 Fc 영역의 비율이 높아지도록 수식된 개변 Fc 영역을 포함하는 항원 결합 분자의 제조 방법에도 적용하는 것이 가능하다. 이러한 제조 방법에 의해 제작된 본 발명의 항원 결합 분자에 포함되는 Fc 영역에 결합한 당쇄의 조성은, 상기의 「Fcγ 리셉터(FcγR) 결합 개변 Fc 영역」에서 기재된 방법에 의해 확인될 수 있다.
등전점이 개변된 항 GPC3 항체
본 발명에서 사용되는 항GPC3 항체의 비한정된 일 태양으로서, 그의 등전점(pI)이 변화되도록, 항GPC3 항체의 아미노산 잔기가 개변되어 있는 항GPC3 항체도 예시된다. 본 발명이 제공하는 항GPC3 항체에 있어서의 「아미노산 잔기의 전하의 개변」의 적합한 예로서는 이하의 것을 들 수 있다. pI값을 증가시키는 개변으로서는, 예를 들면, 서열번호: 50으로 표시되는 항GPC3 항체의 중쇄 가변 영역 중의 Kabat 넘버링으로 표시되는 43위의 Q의 K로의 치환, 52위의 D의 N으로의 치환, 105위의 Q의 R로의 치환으로부터 선택되는 적어도 하나의 치환을 행할 수 있고, 예를 들면 서열번호: 67로 표시되는 아미노산 서열로 개변된다. 또한, 예를 들면, 서열번호: 51 또는 서열번호: 66으로 표시되는 항GPC3 항체의 경쇄 가변 영역 중의 Kabat 넘버링으로 표시되는 17위의 E의 Q로의 치환, 27위의 Q의 R로의 치환, 105위의 Q의 R로의 치환으로부터 선택되는 적어도 하나의 치환을 행할 수 있고, 예를 들면 서열번호: 68로 표시되는 아미노산 서열로 개변된다. 한편, pI값을 감소시키는 개변으로서는, 서열번호: 50으로 표시되는 항GPC3 항체의 중쇄 가변 영역 중의 Kabat 넘버링으로 표시되는 19위의 K의 T로의 치환, 43위의 Q의 E로의 치환, 61위의 G의 E로의 치환, 62위의 K의 S로의 치환, 64위의 K의 Q로의 치환, 65위의 G의 D로의 치환으로부터 선택되는 적어도 하나의 치환을 행할 수 있고, 예를 들면 서열번호: 69, 서열번호: 71로 표시되는 아미노산 서열로 개변된다. 또한, 예를 들면, 서열번호: 51 또는 서열번호: 66으로 표시되는 항GPC3 항체의 경쇄 가변 영역 중의 Kabat 넘버링으로 표시되는 24위의 R의 Q로의 치환, 27위의 Q의 E로의 치환, 74위의 K의 T로의 치환, 77위의 R의 S로의 치환, 107위의 K의 E로의 치환으로부터 선택되는 적어도 하나의 치환을 행할 수 있고, 예를 들면 서열번호: 70, 서열번호: 72, 서열번호: 73으로 표시되는 아미노산 서열로 개변된다. 또, pI값을 감소시키는 개변으로서는, 서열번호: 74로 표시되는 중쇄 정상 영역 중에 있어서 EU 넘버링으로 표시되는 268위, 274위, 355위, 356위, 358위, 419위로부터 선택되는 아미노산 중 적어도 하나의 치환을 들 수 있다. 이들 치환은, 예를 들면, 서열번호 31로 표시되는 중쇄 정상 영역의, EU 넘버링으로 표시되는 268위의 H의 Q로의 치환, 274위의 K의 Q로의 치환, 355위의 R의 Q로의 치환, 356위의 D의 E로의 치환, 358위의 L의 M으로의 치환, 419위의 Q의 E로의 치환으로부터 선택되는 적어도 하나의 치환을 적합한 예로서 들 수 있다. 이들 치환의 결과, 인간 항체의 IgG1의 정상 영역과 IgG4의 정상 영역의 키메라체가 구축된다. 즉, 당해 치환에 의해, 개변된 항체의 면역원성에 영향을 미치는 일 없이, 원하는 pI를 갖는 항체의 제작이 가능해진다.
헤테로지니티 저감을 위한 개변
서열번호: 74, 75, 76 또는 77로 표시되는 IgG의 정상 영역에 있어서의 EU 넘버링으로 표시되는 446위의 Gly 및 447위의 Lys가 결손된 IgG 정상 영역도 본 발명의 항GPC3 항체에 포함되는 정상 영역으로서 사용될 수 있다. 이들 아미노산을 양쪽 결손시키는 것에 의해, 항체의 중쇄 정상 영역의 말단에 유래하는 헤테로지니티를 저감하는 것이 가능하다.
항체의 수식
폴리펩티드의 번역 후 수식이란, 폴리펩티드의 생합성에 있어서 번역된 폴리펩티드에 대한 화학 수식을 말한다. 항체의 일차 구조는 폴리펩티드로부터 형성되기 때문에, 본 발명의 항GPC3 항체에는, 항GPC3 항체의 일차 구조인 폴리펩티드의 번역 후 수식을 받은 수식물도 포함된다. 폴리펩티드의 번역 후 수식에는 크게, 작용기 부가, 폴리펩티드 또는 펩티드의 부가(ISG화, SUMO화, 유비키틴화), 아미노산의 화학적 성질의 변환(실릴화 또는 탈아민, 탈아마이드), 및 구조 변환(다이설파이드화, 프로테아제 분해)으로 분류할 수 있다. 본 발명에 있어서의 번역 후 수식의 비한정된 일 태양으로서, 폴리펩티드의 형성 단위인 아미노산 잔기에 대한 펩티드 부가 또는 작용기 부가를 들 수 있다. 이러한 수식으로서 구체적으로는, 인산화(세린, 트레오닌, 티로신, 아스파르트산 등), 글루코실화(세린, 트레오닌, 아스파르트산 등), 아실화(라이신), 아세틸화(라이신), 하이드록실화(라이신, 프롤린), 프레닐화(시스테인), 팔미토일화(시스테인), 알킬화(라이신, 아르기닌), 폴리글루타밀화(글루탐산), 카복실화(글루탐산), 폴리글리실화(글루탐산), 시트룰린화(아르기닌), 석신이미드 형성(아스파르트산) 등을 들 수 있다. 예를 들면, N말단의 글루타민의 피로글루타밀화에 의한 피로글루탐산으로의 수식을 받은 항GPC3 항체도 당연히 본 발명의 항GPC3 항체에 포함된다. 또한, 예를 들면, 2개의 황 원자 사이에 형성되는 공유 결합을 의미하는 「다이설파이드 결합」에 의해 중쇄와 경쇄, 또는 중쇄끼리가 연결된 항GPC3 항체의 번역 후 수식물도, 본 발명의 항GPC3 항체에 포함된다. 아미노산의 시스테인에 포함되는 싸이올기는, 제2의 싸이올기와 다이설파이드 결합 또는 가교를 형성할 수 있다. 일반적으로 IgG 분자에서는, CH1 및 CL영역이 다이설파이드 결합에 의해 연결되고, 중쇄를 형성하는 2개의 폴리펩티드는, EU 넘버링으로 표시되는 226위 및 229위의 시스테인 잔기 사이의 다이설파이드 결합에 의해 연결된다. 이러한 다이설파이드 결합에 의해 연결된 항GPC3 항체의 번역 후 수식물도, 본 발명의 항GPC3 항체에 포함된다.
GPC3 표적 치료제 요법
「GPC3 표적 치료제 요법」이라는 용어는, GPC3 표적 치료제를 환자에게 투여하는 것을 말한다.
「암에 대한 GPC3 표적 치료제 요법의 유효성」 또는 「암에 대한 GPC3 표적 치료제 요법이 유효하다」라는 용어는, 암이라고 진단된 환자에 있어서, GPC3 표적 치료제 요법이, 원하는 또는 유익한 효과를 일으키게 하는 것을 말한다. 원하는 또는 유익한 효과에는, (1) 암 세포의 추가적인 성장 또는 확산의 저해, (2) 암 세포의 사멸, (3) 암의 재발의 저해, (4) 암에 관한 증세(통증 등)의 완화, 저감, 경감, 저해, 또는 상기 증세의 빈도의 저감, 또는 (5) 환자의 생존율의 개선이 포함될 수 있다. 암의 재발의 저해에는, 방사선, 화학 요법, 외과 수술, 또는 다른 기술에 의해 지금까지 치료되고 있는, 암의 원발 부위 및 주변 조직에서의 암의 성장의 저해, 및 새로운 원위(遠位) 부위에서의 암의 성장의 부존재가 포함된다. 원하는 또는 유익한 효과는, 환자에 의해 지각되는 것 또는 타각(他覺)적인 것 중 어느 것일 수 있다. 예를 들면, 환자가 인간인 경우, 인간은, 개선 또는 요법에 대한 응답의, 환자에 의해 지각되는 징후로서, 기력 또는 활력의 개선 또는 통증의 감소를 인식할 수 있다. 또는, 임상의는, 신체적 검사, 실험적 파라미터, 종양 마커, 또는 X선 촬영에 의한 소견에 기초하여, 종양 사이즈 또는 종양 조직량의 감소를 알아차릴 수 있다. 치료에 대한 응답에 대해 임상의가 관찰할 수 있는 어떤 실험적 징후에는, 백혈구수, 적혈구수, 혈소판수, 적혈구 침강 속도, 및 여러 가지 효소 레벨 등의, 시험 결과의 정상화가 포함된다. 더욱이, 임상의는, 검출 가능한 종양 마커의 감소를 관찰할 수 있다. 또는, 타각적인 개선을 평가하기 위해서, 초음파 진단, 핵자기 공명 시험, 및 양전자 방출 시험 등의 다른 시험을 이용할 수 있다.
본 발명의 GPC3 표적 치료제 요법의 대상이 되는 암은, 표적이 되는 GPC3이 고발현되어 있는 암이면 어떤 암도 해당된다. 그와 같은 암의 일례로서 유방암, 자궁경암, 대장암, 자궁체암, 두경부암, 간암, 폐암, 악성 칼시노이드(Malignant carcinoid), 악성 신경교종(Malignant glioma), 악성 임파종(Malignant lymphoma), 악성 흑색종(Malignant melanoma), 난소암, 췌장암, 전립선암, 신장암, 피부암, 위암, 고환암, 갑상선암, 요로 상피암 등으로부터 선택되는 암이 예시된다.
GPC3 표적 치료제 요법의 유효성을 결정하는 방법, 또는 GPC3 표적 치료제 요법의 계속을 결정하는 방법
본 발명의 비한정된 일 태양에서는, GPC3 표적 치료제 요법을 받기 전의 환자 및/또는 GPC3 표적 치료제 요법을 받은 환자로부터 단리된 생물학적 시료 중의, 면역 세포수 및/또는 당해 면역 세포 상에 발현되어 있는 분자의 발현량을 측정하여, 당해 세포수 또는 발현량이 소정의 값인 경우에 당해 GPC3 표적 치료제 요법이 유효하다고 결정하는 방법, 또는 당해 요법의 계속을 결정하는 방법이 제공된다. 「GPC3 표적 치료제 요법을 받기 전의 환자」란, 암이라고 진단된 환자로서, 전술한 GPC 표적 치료제가 투여된 경력이 없는 환자를 말하며, 더욱이, 당해 환자는, 전술한 조직에 있어서의 GPC3의 발현량으로부터 GPC3 표적 치료법이 유효하다고 결정되어 있어도 된다. 또한, 「GPC3 표적 치료제 요법을 받은 환자」란, 전술한 GPC3 표적 치료제가 투여된 경력을 갖는 환자를 말한다. GPC3 표적 치료제의 투여 경로는, 투여되는 GPC3 표적 치료제의 성상 등에 아울러 적합한 투여 경로가 적절히 선택될 수 있다. 예를 들면, 투여 경로의 예로서 비경구 투여가 예시된다. 비경구 투여의 추가적인 예로서, 예를 들면, 주사 투여, 경비 투여, 경폐 투여, 경피 투여가 예시된다. 예를 들면, 주사 투여의 추가적인 예로서 정맥내 주사 투여, 근육내 주사 투여, 복강내 주사 투여, 피하 주사 투여 등에 의한 전신 또는 국부적인 투여가 예시된다.
본 발명의 비한정된 일 태양에서는, 상기 환자로부터 단리된 생물학적 시료 중의 면역 세포수를 측정하는 것을 포함하고, 여기에서, 당해 세포수가 소정의 값인 경우에, 당해 환자에 있어서의 암에 대한 GPC3 표적 치료제 요법이 유효하다는 것이 예측, 예상 또는 결정되거나, 또는 당해 요법의 계속이 결정된다. 본 발명에서 측정되는 면역 세포는, 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면, 백혈구, 단구, 호중구, 임파구를 들 수 있다. 임파구에 대해서는, CD19+ B세포, CD45+ 임파구, CD3+ T세포, CD4+ T세포, CD8+ T세포, 및 CD4+/CD8+ T세포, CD16+ NK세포, NKp46+ NK세포, CD56 강양성 NK세포, CD56-CD16+ NK세포, CD56 약중양성 CD16- NK세포, CD56 약중양성 CD16 강양성 NK세포를 들 수 있다. 이들 세포 중 어느 1종류의 세포수를 측정하여, 암에 대한 GPC3 표적 치료제 요법이 유효하다는 것을 예측, 예상 또는 결정하기 위한 지표로 하는 것도 가능하고, 이들 세포 중 몇 개를 조합하여 지표로 해도 된다.
소정의 값은, 예를 들면, 복수의 암 환자에게 GPC3 표적 치료제 요법을 행하여, 암에 대한 GPC3 표적 치료제 요법의 효과가 확인될 수 없는 환자군의 면역 세포수의 평균값보다 높은 범위에 있는 값이면, 당해 요법의 효과가 기대될 수 있는 소정의 값으로 하는 것이 가능하다. 또한, 예를 들면, 복수의 암 환자에게 GPC3 표적 치료제 요법을 행하여, 유의한 PFS의 연장 또는 유의한 OS의 연장 경향이 확인되는 환자군의 면역 세포수의 평균값에 기초하여 소정의 값을 결정할 수 있다. 또한, 예를 들면, 복수의 암 환자의 면역 세포수를 측정하여, 그의 중앙값보다 높은 값을 소정의 값으로 함으로써도, GPC3 표적 치료제 요법에 의한 유의한 PFS의 연장 또는 유의한 OS의 연장 경향이 확인되는 환자를 높은 확률로 선택하기 위한 소정의 값으로 할 수 있다. 여기에서 복수의 암 환자란, GPC3 표적 치료제 요법의 유효성 또는 계속을 결정하기 위한 기준이 되는, 면역 세포수에 대한 소정의 값을 유의한 값으로서 산출할 수 있는 수이면 되고, 100명 이상이 바람직하고, 150명 이상이 보다 바람직하다. 소정의 값으로서, 구체적으로는 예를 들면, 백혈구수의 경우에는, 2500개/μL, 3000개/μL, 3500개/μL, 4000개/μL, 4350개/μL, 4500개/μL, 4750개/μL, 5000개/μL, 5250개/μL, 5500개/μL, 5750개/μL, 6000개/μL, 6500개/μL, 7000개/μL, 7500개/μL, 8000개/μL, 8500개/μL, 9000개/μL 등의 특정한 값보다 높은 값으로부터 결정될 수 있다. 당해 특정한 값은, 예를 들면, 2500개/μL부터 9000개/μL까지의 수치 범위로부터 적절히 선택될 수 있다. 바람직한 수치 범위로서, 3000개/μL 내지 8000개/μL가 예시된다. 보다 바람직한 수치 범위로서, 3500개/μL 내지 7000개/μL, 더 바람직한 수치 범위로서, 4000개/μL 내지 6000개/μL가 예시되지만 이들로 한정되지 않는다. 당해 수치 범위로부터 선택되는 특정한 값보다 높은 값을 소정의 값으로 할 수 있다.
단구수의 경우에는, 50개/μL, 100개/μL, 200개/μL, 300개/μL, 350개/μL, 400개/μL, 450개/μL, 500개/μL, 550개/μL, 600개/μL, 650개/μL, 700개/μL, 800개/μL, 900개/μL, 1000개/μL, 1100개/μL 등의 특정한 값보다 높은 값으로부터 결정될 수 있다. 당해 특정한 값은, 예를 들면, 50개/μL부터 1100개/μL까지의 수치 범위로부터 적절히 선택될 수 있다. 바람직한 수치 범위로서, 100개/μL 내지 1000개/μL가 예시된다. 보다 바람직한 수치 범위로서, 200개/μL 내지 900개/μL, 더 바람직한 수치 범위로서, 400개/μL 내지 800개/μL가 예시되지만 이들로 한정되지 않는다. 당해 수치 범위로부터 선택되는 특정한 값보다 높은 값을 소정의 값으로 할 수 있다.
호중구의 경우에는, 500개/μL, 1000개/μL, 1500개/μL, 2000개/μL, 2500개/μL, 3000개/μL, 3250개/μL, 3500개/μL, 3750개/μL, 4000개/μL, 4250개/μL, 4500개/μL, 5000개/μL, 5500개/μL, 6000개/μL, 6500개/μL, 7000개/μL 등의 특정한 값보다 높은 값으로부터 결정될 수 있다. 당해 특정한 값은, 예를 들면, 500개/μL부터 7000개/μL까지의 수치 범위로부터 적절히 선택될 수 있다. 바람직한 수치 범위로서, 1000개/μL 내지 6000개/μL가 예시된다. 보다 바람직한 수치 범위로서, 1500개/μL 내지 5000개/μL, 더 바람직한 수치 범위로서, 3000개/μL 내지 4000개/μL가 예시되지만 이들로 한정되지 않는다. 당해 수치 범위로부터 선택되는 특정한 값보다 높은 값을 소정의 값으로 할 수 있다.
임파구의 경우에는, 400개/μL, 500개/μL, 600개/μL, 700개/μL, 800개/μL, 900개/μL, 1000개/μL, 1100개/μL, 1200개/μL, 1250개/μL, 1300개/μL, 1400개/μL, 1500개/μL, 1600개/μL, 1700개/μL, 1800개/μL, 1900개/μL, 2000개/μL, 2100개/μL, 2200개/μL, 2300개/μL, 2400개/μL, 2500개/μL, 3000개/μL, 3500개/μL, 4000개/μL 등의 특정한 값보다 높은 값으로부터 결정될 수 있다. 당해 특정한 값은, 예를 들면, 400개/μL부터 4000개/μL까지의 수치 범위로부터 적절히 선택될 수 있다. 바람직한 수치 범위로서, 450개/μL 내지 3000개/μL가 예시된다. 보다 바람직한 수치 범위로서, 500개/μL 내지 2500개/μL, 더 바람직한 수치 범위로서, 1000개/μL 내지 2000개/μL가 예시되지만 이들로 한정되지 않는다. 당해 수치 범위로부터 선택되는 특정한 값보다 높은 값을 소정의 값으로 할 수 있다.
또, 임파구 중에서도, CD45+ 임파구의 경우에는, 400개/μL, 500개/μL, 600개/μL, 700개/μL, 800개/μL, 900개/μL, 950개/μL, 1000개/μL, 1050개/μL, 1100개/μL, 1200개/μL, 1300개/μL, 1400개/μL, 1500개/μL, 1600개/μL, 1700개/μL, 1800개/μL, 1900개/μL, 2000개/μL, 2100개/μL, 2200개/μL, 2300개/μL, 2400개/μL, 2500개/μL, 2600개/μL, 2700개/μL, 2800개/μL, 2900개/μL, 3000개/μL, 3500개/μL, 4000개/μL 등의 특정한 값보다 높은 값으로부터 결정될 수 있다. 당해 특정한 값은, 예를 들면, 400개/μL부터 4000개/μL까지의 수치 범위로부터 적절히 선택될 수 있다. 바람직한 수치 범위로서, 450개/μL 내지 3500개/μL가 예시된다. 보다 바람직한 수치 범위로서, 500개/μL 내지 3000개/μL, 더 바람직한 수치 범위로서, 1000개/μL 내지 1500개/μL가 예시되지만 이들로 한정되지 않는다. 당해 수치 범위로부터 선택되는 특정한 값보다 높은 값을 소정의 값으로 할 수 있다.
CD3+ T세포의 경우에는, 250개/μL, 300개/μL, 400개/μL, 500개/μL, 600개/μL, 700개/μL, 800개/μL, 900개/μL, 1000개/μL, 1100개/μL, 1200개/μL, 1250개/μL, 1300개/μL, 1400개/μL, 1500개/μL, 1600개/μL, 1700개/μL, 1800개/μL, 1900개/μL, 2000개/μL, 2100개/μL, 2200개/μL, 2300개/μL, 2400개/μL, 2500개/μL, 3000개/μL 등의 특정한 값보다 높은 값으로부터 결정될 수 있다. 당해 특정한 값은, 예를 들면, 250개/μL부터 3000개/μL까지의 수치 범위로부터 적절히 선택될 수 있다. 바람직한 수치 범위로서, 300개/μL 내지 2500개/μL가 예시된다. 보다 바람직한 수치 범위로서, 350개/μL 내지 2000개/μL, 더 바람직한 수치 범위로서, 400개/μL 내지 1000개/μL가 예시되지만 이들로 한정되지 않는다. 당해 수치 범위로부터 선택되는 특정한 값보다 높은 값을 소정의 값으로 할 수 있다.
CD4+ T세포의 경우에는, 150개/μL, 200개/μL, 250개/μL, 300개/μL, 350개/μL, 400개/μL, 450개/μL, 500개/μL, 550개/μL, 600개/μL, 650개/μL, 700개/μL, 750개/μL, 800개/μL, 850개/μL, 900개/μL, 950개/μL, 1000개/μL, 1100개/μL, 1200개/μL, 1300개/μL, 1400개/μL, 1500개/μL, 1600개/μL, 1700개/μL 등의 특정한 값보다 높은 값으로부터 결정될 수 있다. 당해 특정한 값은, 예를 들면, 150개/μL부터 1700개/μL까지의 수치 범위로부터 적절히 선택될 수 있다. 바람직한 수치 범위로서, 200개/μL 내지 1500개/μL가 예시된다. 보다 바람직한 수치 범위로서, 250개/μL 내지 700개/μL, 더 바람직한 수치 범위로서, 300개/μL 내지 600개/μL가 예시되지만 이들로 한정되지 않는다. 당해 수치 범위로부터 선택되는 특정한 값보다 높은 값을 소정의 값으로 할 수 있다.
CD8+ T세포의 경우에는, 50개/μL, 75개/μL, 100개/μL, 125개/μL, 150개/μL, 175개/μL, 200개/μL, 225개/μL, 250개/μL, 275개/μL, 300개/μL, 325개/μL, 350개/μL, 400개/μL, 500개/μL 등의 특정한 값보다 높은 값으로부터 결정될 수 있다. 당해 특정한 값은, 예를 들면, 50개/μL부터 500개/μL까지의 수치 범위로부터 적절히 선택될 수 있다. 바람직한 수치 범위로서, 50개/μL 내지 300개/μL가 예시된다. 보다 바람직한 수치 범위로서, 75개/μL 내지 275개/μL, 더 바람직한 수치 범위로서, 100개/μL 내지 250개/μL가 예시되지만 이들로 한정되지 않는다. 당해 수치 범위로부터 선택되는 특정한 값보다 높은 값을 소정의 값으로 할 수 있다.
CD16+ NK세포의 경우에는, 25개/μL, 50개/μL, 150개/μL, 175개/μL, 200개/μL, 225개/μL, 250개/μL, 300개/μL, 350개/μL, 400개/μL, 450개/μL, 500개/μL, 550개/μL, 600개/μL, 700개/μL, 800개/μL 등의 특정한 값보다 높은 값으로부터 결정될 수 있다. 당해 특정한 값은, 예를 들면, 25개/μL부터 800개/μL까지의 수치 범위로부터 적절히 선택될 수 있다. 바람직한 수치 범위로서, 50개/μL 내지 700개/μL가 예시된다. 보다 바람직한 수치 범위로서, 100개/μL 내지 600개/μL, 더 바람직한 수치 범위로서, 150개/μL 내지 300개/μL가 예시되지만 이들로 한정되지 않는다. 당해 수치 범위로부터 선택되는 특정한 값보다 높은 값을 소정의 값으로 할 수 있다.
NKp46+ NK세포의 경우에는, 20개/μL, 30개/μL, 40개/μL, 50개/μL, 60개/μL, 70개/μL, 80개/μL, 90개/μL, 100개/μL, 110개/μL, 120개/μL, 130개/μL, 140개/μL, 150개/μL, 200개/μL, 250개/μL, 300개/μL, 350개/μL, 400개/μL 등의 특정한 값보다 높은 값으로부터 결정될 수 있다. 당해 특정한 값은, 예를 들면, 20개/μL부터 400개/μL까지의 수치 범위로부터 적절히 선택될 수 있다. 바람직한 수치 범위로서, 30개/μL 내지 300개/μL가 예시된다. 보다 바람직한 수치 범위로서, 50개/μL 내지 250개/μL, 더 바람직한 수치 범위로서, 100개/μL 내지 200개/μL가 예시되지만 이들로 한정되지 않는다. 당해 수치 범위로부터 선택되는 특정한 값보다 높은 값을 소정의 값으로 할 수 있다.
CD56-CD16+ NK세포의 경우에는, 2개/μL, 3개/μL, 4개/μL, 5개/μL, 6개/μL, 7개/μL, 8개/μL, 9개/μL, 10개/μL, 11개/μL, 12개/μL, 13개/μL, 14개/μL, 15개/μL, 20개/μL, 25개/μL, 30개/μL, 40개/μL 등의 특정한 값보다 높은 값으로부터 결정될 수 있다. 당해 특정한 값은, 예를 들면, 2개/μL부터 40개/μL까지의 수치 범위로부터 적절히 선택될 수 있다. 바람직한 수치 범위로서, 2개/μL 내지 30개/μL가 예시된다. 보다 바람직한 수치 범위로서, 2개/μL 내지 20개/μL, 더 바람직한 수치 범위로서, 3개/μL 내지 10개/μL가 예시되지만 이들로 한정되지 않는다. 당해 수치 범위로부터 선택되는 특정한 값보다 높은 값을 소정의 값으로 할 수 있다.
또한, 본 발명의 비한정된 일 태양에서는, 상기 환자로부터 단리된 생물학적 시료 중의 면역 세포 상에서 발현되어 있는 분자의 발현량을 측정하는 것을 포함하고, 여기에서, 당해 발현량이 소정의 값인 경우에, 당해 환자에 있어서의 암에 대한 GPC3 표적 치료제 요법이 유효하다고 하는 것이 예측, 예상 또는 결정되거나, 또는 당해 요법의 계속이 결정된다. 본 발명에서 측정되는 면역 세포 상에서 발현되어 있는 분자는, 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면, CD16을 들 수 있다. 이들 분자의 발현량을 측정하여, 암에 대한 GPC3 표적 치료제 요법이 유효하다는 것을 예측, 예상 또는 결정하기 위한 지표로 하는 것도 가능하고, 이들 발현량 중 몇 개를 조합하여 지표로 해도 된다. 소정의 값은, 예를 들면 CD16의 경우는, 복수의 암 환자에게 GPC3 표적 치료제 요법을 행하여, 암에 대한 GPC3 표적 치료제 요법의 효과가 확인될 수 없는 환자군의 면역 세포 상의 CD16의 발현량의 평균값보다 높은 범위에 있는 값이면, 당해 요법의 효과가 기대될 수 있는 소정의 값으로 하는 것이 가능하다. 또한, 예를 들면, 복수의 암 환자에게 GPC3 표적 치료제 요법을 행하여, 유의한 PFS의 연장 또는 유의한 OS의 연장 경향이 확인되는 환자군의 CD16의 발현량의 평균값에 기초하여 소정의 값을 결정할 수 있다. 또한, 예를 들면, 복수의 암 환자의 CD16의 발현량을 측정하여, 그의 중앙값보다 높은 값을 소정의 값으로 함으로써도, GPC3 표적 치료제 요법에 의한 유의한 PFS의 연장 또는 유의한 OS의 연장 경향이 확인되는 환자를 높은 확률로 선택하기 위한 소정의 값으로 할 수 있다. 여기에서 복수의 암 환자란, GPC3 표적 치료제 요법의 유효성 또는 계속을 결정하기 위한 기준이 되는, CD16의 발현량에 대한 소정의 값을 유의한 값으로서 산출할 수 있는 수이면 되고, 100명 이상이 바람직하고, 150명 이상이 보다 바람직하다. 소정의 값으로서, 구체적으로는 예를 들면, NK세포 상의 CD16의 경우에는, 전술한 플로우 사이토메트리에 의한 형광 강도 측정값이, 150000mesf, 175000mesf, 200000mesf, 225000mesf, 250000mesf, 275000mesf, 300000mesf, 325000mesf, 350000mesf, 375000mesf, 400000mesf, 425000mesf, 450000mesf, 475000mesf, 500000mesf, 525000mesf, 550000mesf, 575000mesf, 600000mesf, 625000mesf, 650000mesf, 675000mesf, 700000mesf, 750000mesf, 800000mesf 등의 특정한 값보다 높은 값으로부터 결정될 수 있다. 당해 특정한 값은, 예를 들면, 150000mesf부터 800000mesf까지의 수치 범위로부터 적절히 선택될 수 있다. 바람직한 수치 범위로서, 200000mesf 내지 700000mesf가 예시된다. 보다 바람직한 수치 범위로서, 300000mesf 내지 650000mesf, 더 바람직한 수치 범위로서, 350000mesf 내지 600000mesf가 예시되지만 이들로 한정되지 않는다. 당해 수치 범위로부터 선택되는 특정한 값보다 높은 값을 소정의 값으로 할 수 있다.
또한, 본 발명의 비한정된 일 태양에서는, 상기 환자로부터 단리된 생물학적 시료 중의 면역 세포를 이용하여 GPC3 발현 세포에 대한 ADCC 활성을 측정하는 것을 포함하고, 여기에서, 당해 면역 세포 상의 CD16 및/또는 CD107a의 발현량이 소정의 값인 경우에, 당해 환자에 있어서의 ADCC 활성이 높아, 암에 대한 GPC3 표적 치료제 요법이 유효하다는 것이 예측, 예상 또는 결정되거나, 또는 당해 요법의 계속이 결정된다. 본 발명에 있어서 면역 세포 상의 CD16, CD107a 중 어느 1종류 또는 양쪽의 발현량을 측정하여, 암에 대한 GPC3 표적 치료제 요법이 유효하다는 것을 예측, 예상 또는 결정하기 위한 지표로 하는 것도 가능하다.
소정의 값은, 예를 들면, 복수의 암 환자에게 GPC3 표적 치료제 요법을 행하여, 암에 대한 GPC3 표적 치료제 요법의 효과가 확인될 수 없는 환자군의 생물학적 시료 중의 면역 세포 상의 CD16 또는 CD107a의 발현량을 GPC3 표적 요법제 존재하와 비존재하에서 비교하여, CD16의 경우는, 소정의 값이, GPC3 표적 요법제가 비존재하에서의 발현량과의 차의 평균값보다 낮은 범위에 있는 값이면, 당해 요법의 효과가 기대될 수 있는 소정의 값으로 하는 것이 가능하고, CD107a의 경우는, 소정의 값이, GPC3 표적 요법제가 비존재하에서의 발현량과의 차의 평균값보다 높은 범위에 있는 값이면, 당해 요법의 효과가 기대될 수 있는 소정의 값으로 하는 것이 가능하다. 또한, 예를 들면, 복수의 암 환자에게 GPC3 표적 치료제 요법을 행하여, 유의한 PFS의 연장 또는 유의한 OS의 연장 경향이 확인되는 환자군의 생물학적 시료 중의 면역 세포 상의 CD16 또는 CD107a의 발현량을 GPC3 표적 요법제 존재하와 비존재하에서 비교하여, GPC3 표적 요법제가 비존재하에서의 발현량과의 차의 평균값에 기초하여 소정의 값을 결정할 수 있다. 또한, 예를 들면, 복수의 암 환자의 생물학적 시료 중의 면역 세포 상의 CD16 또는 CD107a의 발현량을 GPC3 표적 요법제 존재하와 비존재하에서 비교하여, CD16의 경우는, 소정의 값이, GPC3 표적 요법제가 비존재하에서의 발현량과의 차의 중앙값보다 낮은 범위에 있는 값이면, 당해 요법의 효과가 기대될 수 있는 소정의 값으로 하는 것이 가능하고, CD107a의 경우는, 소정의 값이, GPC3 표적 요법제가 비존재하에서의 발현량과의 차의 중앙값보다 높은 범위에 있는 값이면, 당해 요법의 효과가 기대될 수 있는 소정의 값으로 하는 것이 가능하다. 여기에서 복수의 암 환자란, GPC3 표적 치료제 요법의 유효성 또는 계속을 결정하기 위한 기준이 되는, CD16 또는 CD107a의 발현량에 대한 소정의 값을 유의한 값으로서 산출할 수 있는 수이면 되고, 100명 이상이 바람직하고, 150명 이상이 보다 바람직하다.
소정의 값은, 구체적으로는 예를 들면, CD16의 경우에는, GPC3 표적 요법제 존재하에서의 CD16 발현량으로부터 GPC3 표적 요법제 비존재하에서의 발현량을 차감한 값이 -10% 내지 -95%로부터 선택되는 특정한 값보다 낮은 값이 예시된다. 바람직한 수치 범위로서, -20% 내지 -90%, 더 바람직한 수치 범위로서 -50% 내지 -90%가 예시되지만 이들로 한정되지 않는다.
CD107a의 경우에는, GCP 표적 요법제 존재하에서의 CD16 발현량으로부터 GPC3 표적 요법제 비존재하에서의 발현량을 차감한 값이 5% 내지 70%로부터 선택되는 특정한 값보다 높은 값이 예시된다. 바람직한 수치 범위로서, 10% 내지 60%, 더 바람직한 수치 범위로서, 25% 내지 60%가 예시되지만 이들로 한정되지 않는다.
면역 세포수 및 당해 세포 상에 발현되어 있는 분자의 발현량의 소정의 값은, 많은 인자, 예를 들면, 이용되는 에세이 방법, 유리 GPC3을 측정하는 시료의 타입, 시료의 보존 조건(온도 및 기간 등), 환자의 민족적 아이덴티티 등에 의존하여, 약간 변화될 수 있다. 상기의 유효하다는 것을 예측, 예상 또는 결정하는 방법, 또는 당해 요법의 계속을 결정하는 방법에 있어서, 면역 세포수 및 당해 세포 상에 발현되어 있는 분자의 발현량은, 환자로부터 단리된 생물학적 시료, 특히 말초혈에 있어서 측정된다.
상기의 면역 세포수 및 당해 세포 상에 발현되어 있는 분자의 발현량은, GPC3 표적 치료제 요법을 개시하기 전 및/또는 개시한 후에 단리된 시료에 있어서 측정될 수 있지만, 그들은 소정의 시간 간격으로 채취된 복수의 시료에서도 측정될 수 있다. 소정의 시간 간격으로 채취된 복수의 시료 중 어느 하나에 있어서의 면역 세포수 및 당해 세포 상에 발현되어 있는 분자의 발현량이 전술한 소정의 세포수 및/또는 발현량인 경우에, 당해 환자에 있어서의 암에 대한 GPC3 표적 치료제 요법이 유효하다는 것이 예측, 예상 또는 결정되거나, 또는 당해 요법의 계속이 결정된다. 소정의 시간 간격은 적절히 설정되지만, 당해 간격의 비한정된 일 태양으로서 GPC3 표적 치료제의 첫회 투여 후 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일(즉 1주), 8일, 9일, 10일, 11일, 12일, 13일, 14일(즉 2주), 15일, 16일, 17일, 18일, 19일, 20일, 21일(즉 3주), 22일, 23일, 24일, 25일, 26일, 27일, 28일(즉 4주), 29일, 30일, 1월, 5주, 6주, 7주, 8주, 9주, 10주, 2월, 3월, 4월, 5월, 또는 6월, 또는 1회, 2회, 3회, 4회, 또는 그 이상의 치료 사이클 후 등의, 요법의 개시와 종결 사이의 모든 시점에서 채취될 수 있다. 투여 간격 즉 치료 사이클은 적절히 설정될 수 있지만, 예를 들면, 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일(즉 1주), 8일, 9일, 10일, 11일, 12일, 13일, 14일(즉 2주), 15일, 16일, 17일, 18일, 19일, 20일, 21일(즉 3주), 22일, 23일, 24일, 25일, 26일, 27일, 28일(즉 4주), 29일, 30일, 1월, 5주, 6주, 7주, 8주, 9주, 10주, 2월, 3월, 4월, 5월, 6월 등을 비한정된 일례로서 들 수 있다.
상기의, 당해 면역 세포수 및/또는 당해 세포 상에 발현되어 있는 분자의 발현량이 소정의 값인 경우에, 당해 GPC3 표적 치료제 요법이 유효하다고 결정할 때에, 당해 환자가 Fcγ 수용체의 타입 IIA 및/또는 타입 IIIA의 유전자에 있어서, FcγRIIIA의 158위의 적어도 1개의 아미노산 잔기가 Val인 다형 및/또는 FcγRIIA의 131위의 적어도 1개의 아미노산 잔기가 His인 다형을 가지는지 여부도 고려하는 것도 가능하다. 즉, 대상 환자에 있어서의 면역 세포수 및 당해 세포 상에 발현되어 있는 분자의 발현량이 소정의 값이고, 대상 환자가, FcγRIIIA의 158위의 아미노산 잔기의 적어도 1개가 Val인 다형 및/또는 FcγRIIA의 131위의 적어도 1개의 아미노산 잔기가 His인 다형을 갖는 경우에, 당해 GPC3 표적 치료제 요법이 유효하다고 결정하는 것도 포함된다.
또한, 상기의, 당해 면역 세포수 및/또는 당해 세포 상에 발현되어 있는 분자의 발현량이 소정의 값인 경우에, 당해 GPC3 표적 치료제 요법의 계속을 결정할 때에, 당해 환자가 Fcγ 수용체의 타입 IIA 및/또는 타입 IIIA의 유전자에 있어서, FcγRIIIA의 158위의 적어도 1개의 아미노산 잔기가 Val인 다형 및/또는 FcγRIIA의 131위의 적어도 1개의 아미노산 잔기가 His인 다형을 가지는지 여부도 고려하는 것도 가능하다. 즉, 대상 환자에 있어서의 면역 세포수 및 당해 세포 상에 발현되어 있는 분자의 발현량이 소정의 값이고, 대상 환자가, FcγRIIIA의 158위의 아미노산 잔기의 적어도 1개가 Val인 다형 및/또는 FcγRIIA의 131위의 적어도 1개의 아미노산 잔기가 His인 다형을 갖는 경우에, 당해 GPC3 표적 치료제 요법의 계속을 결정하는 것도 포함된다.
여기에서, FcγRIIIA의 158위의 적어도 1개의 아미노산 잔기가 Val인 다형을 갖는다는 것은, 전술한 Fcγ 수용체 다형의 확인에 기재된 방법에 따라, FcγRIIIA의 경우에는 158위의 아미노산 잔기를 코딩하는 염기 서열을 확인하여, Val의 호모형(V/V) 또는 헤테로형(V/F)의 염기 서열인 경우에, 이에 해당된다. 또한, FcγRIIA의 131위의 적어도 1개의 아미노산 잔기가 His인 다형을 갖는다는 것은, 마찬가지로, FcγRIIA의 131위 아미노산 잔기를 코딩하는 염기 서열을 확인하여, His의 호모형(H/H) 또는 헤테로형(H/R)의 염기 서열인 경우에, 이에 해당된다.
상기의, 당해 면역 세포수 및/또는 당해 세포 상에 발현되어 있는 분자의 발현량이 소정의 값인 경우에, 당해 GPC3 표적 치료제 요법이 유효하다고 결정할 때에, 추가로, 당해 환자로부터 단리된 조직, 특히 간암 조직을 포함하는 암 조직에 있어서의 GPC3의 발현량도 고려하는 것도 가능하다. 즉, 대상 환자로부터 단리된 조직, 특히 간암 조직을 포함하는 암 조직에 있어서의 GPC3의 발현량이 특정한 평가 스코어 이상이고, 대상 환자에 있어서의 면역 세포수 및 당해 세포 상에 발현되어 있는 분자의 발현량이 소정의 값인 경우에, 당해 GPC3 표적 치료제 요법이 유효하다고 결정하는 것도 포함된다.
또한, 상기의, 당해 면역 세포수 및/또는 당해 세포 상에 발현되어 있는 분자의 발현량이 소정의 값인 경우에, 당해 GPC3 표적 치료제 요법의 계속을 결정할 때에, 추가로, 당해 환자로부터 단리된 조직, 특히 간암 조직을 포함하는 암 조직에 있어서의 GPC3의 발현량을 아울러 고려하는 것도 가능하다. 즉, 대상 환자로부터 단리된 조직, 특히 간암 조직을 포함하는 암 조직에 있어서의 GPC3의 발현량이 특정한 평가 스코어 이상이고, 대상 환자에 있어서의 면역 세포수 및/또는 당해 세포 상에 발현되어 있는 분자의 발현량이 소정의 값인 경우에, 당해 GPC3 표적 치료제 요법의 계속을 결정하는 것도 포함된다.
환자로부터 단리된 조직, 특히 간암 조직을 포함하는 암 조직에 있어서의 GPC3의 발현량이 특정한 평가 스코어 이상인 경우의 비한정된 일 태양으로서, 소정의 조직 면역 염색 스코어 이상인 것을 들 수 있다. 소정의 조직 면역 염색 스코어 이상인 경우의 비한정된 일 태양으로서, WO2009116659에 기재된 염색법(염색법 1)에 의한 염색의 결과 산출되는 복합 평가 스코어 1이 고발현, 또는 저 또는 중발현(각각 IHC total 스코어가 7 이상 또는 7 미만)이 예시될 수 있다. 또한 복합 평가 스코어 2로 이용되는 염색법(염색법 2)에 의한 염색의 결과 산출되는 GPC3-IHC 스코어(복합 평가 스코어 2)가 1+, 2+, 3+인 경우 등도 또한 소정의 조직 면역 염색 스코어 이상인 경우의 비한정된 일 태양으로서 예시될 수 있다.
치료제 및 제제
본 발명에 있어서 치료제란, 통상, 질환의 치료 또는 예방, 또는 검사·진단을 위한 약제를 말한다. 또한, 본 발명에 있어서, 「GPC3 표적 치료제 요법을 받기 전의 암 환자로부터 단리된 생물학적 시료 중의 면역 세포수 및/또는 당해 세포 상에 발현되어 있는 분자의 발현량이 소정의 값인 환자에게 투여하기 위한 GPC3 표적 치료제」라는 용어는, 「GPC3 표적 치료제 요법을 받기 전의 암 환자로부터 단리된 생물학적 시료 중의 면역 세포수 및/또는 당해 세포 상에 발현되어 있는 분자의 발현량이 소정의 값인 환자에게 GPC3 표적 치료제를 투여하는 것을 포함하는 암의 치료 방법」으로 환언하는 것도 가능하고, 「암을 치료하기 위한 의약의 제조에 있어서의, GPC3 표적 치료제 요법을 받기 전의 암 환자로부터 단리된 생물학적 시료 중의 면역 세포수 및/또는 당해 세포 상에 발현되어 있는 분자의 발현량이 소정의 값인 환자에게 투여하기 위한 GPC3 표적 치료제의 사용」으로 환언하는 것도 가능하다. 또한, 본 발명에 있어서, 「GPC3 표적 치료제 요법을 받은 암 환자로부터 단리된 생물학적 시료 중의 면역 세포수 및/또는 당해 세포 상에 발현되어 있는 분자의 발현량이 소정의 값인 환자에게 추가로 투여하기 위한 GPC3 표적 치료제」라는 용어는, 「GPC3 표적 치료제 요법을 받은 암 환자로부터 단리된 생물학적 시료 중의 면역 세포수 및/또는 당해 세포 상에 발현되어 있는 분자의 발현량이 소정의 값인 환자에게 GPC3 표적 치료제를 추가로 투여하는 것을 포함하는 암의 치료 방법」으로 환언하는 것도 가능하고, 「암을 치료하기 위한 의약의 제조에 있어서의, GPC3 표적 치료제 요법을 받은 암 환자로부터 단리된 생물학적 시료 중의 면역 세포수 및/또는 당해 세포 상에 발현되어 있는 분자의 발현량이 소정의 값인 환자에게 추가로 투여하기 위한 GPC3 표적 치료제의 사용」으로 환언하는 것도 가능하다.
본 발명의 치료제는, 당업자에게 공지의 방법을 이용하여 제제화될 수 있다. 예를 들면, 물 또는 그 이외의 약학적으로 허용될 수 있는 액과의 무균성 용액, 또는 현탁액제의 주사제의 형태로 비경구적으로 사용될 수 있다. 예를 들면, 약리학상 허용되는 담체 또는 매체, 구체적으로는, 멸균수나 생리 식염수, 식물유, 유화제, 현탁제, 계면 활성제, 안정제, 향미제, 부형제, 비이클, 방부제, 결합제 등과 적절히 조합하여, 일반적으로 인정된 제약 실시에 요구되는 단위 용량 형태로 혼화하는 것에 의해 제제화될 수 있다. 이들 제제에 있어서의 유효 성분량은, 지시받은 범위의 적당한 용량이 얻어지도록 설정된다.
주사를 위한 무균 조성물은 주사용 증류수와 같은 비이클을 이용하여 통상의 제제 실시에 따라 처방될 수 있다. 주사용의 수용액으로서는, 예를 들면 생리 식염수, 포도당이나 그 밖의 보조약(예를 들면 D-솔비톨, D-만노스, D-만니톨, 염화 나트륨)을 포함하는 등장액을 들 수 있다. 적절한 용해 보조제, 예를 들면 알코올(에탄올 등), 폴리알코올(프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜 등), 비이온성 계면 활성제(폴리솔베이트 80(TM), HCO-50 등)가 병용될 수 있다.
유성액으로서는 참기름, 콩기름을 들 수 있고, 용해 보조제로서 벤조산 벤질 및/또는 벤질 알코올도 병용될 수 있다. 또한, 완충제(예를 들면, 인산염 완충액 및 아세트산 나트륨 완충액), 무통화제(예를 들면, 염산 프로카인), 안정제(예를 들면, 벤질 알코올 및 페놀), 산화 방지제와 배합될 수 있다. 조제된 주사액은 통상, 적절한 앰플에 충전된다.
본 발명의 치료제는, 바람직하게는 비경구 투여에 의해 투여된다. 예를 들면, 주사제형, 경비 투여제형, 경폐 투여제형, 경피 투여형의 치료제가 투여된다. 예를 들면, 정맥내 주사, 근육내 주사, 복강내 주사, 피하 주사 등에 의해 전신 또는 국부적으로 투여될 수 있다.
투여 방법은, 환자의 연령, 증상에 따라 적절히 선택될 수 있다. 상기 치료제를 함유하는 의약용 제제의 투여량은, 예를 들면, 1회에 대해 체중 1kg당 0.0001mg 내지 1000mg의 범위로 설정될 수 있다. 또는, 예를 들면, 환자당 0.001∼100000mg의 투여량이 설정될 수 있지만, 본 발명은 이들의 수치에 반드시 제한되는 것은 아니다. 투여량 및 투여 방법은, 환자의 체중, 연령, 증상 등에 따라 변동되지만, 당업자이면 그들의 조건을 고려하여 적당한 투여량 및 투여 방법을 설정하는 것이 가능하다. 예를 들면, 본 발명의 바람직한 투여량과 투여 방법의 일례로서, 환자의 혈중 트러프값이 일정량 이상이 되도록 투여할 수 있다. 바람직한 혈중 트러프값으로서는, 예를 들면, 150μg/mL 이상, 160μg/mL 이상, 170μg/mL 이상, 180μg/mL 이상, 190μg/mL 이상, 200μg/mL 이상, 210μg/mL 이상, 220μg/mL 이상, 230μg/mL 이상, 240μg/mL 이상, 250μg/mL 이상, 260μg/mL 이상, 270μg/mL 이상, 280μg/mL 이상, 290μg/mL 이상, 300μg/mL 이상, 400μg/mL 이상을 들 수 있다. 보다 바람직하게는 200μg/mL 이상을 들 수 있다.
본 발명의 제제에는, GPC3 표적 치료제 요법을 받은 암 환자로부터 단리된 생물학적 시료 중의 면역 세포수 및/또는 당해 세포 상에 발현되어 있는 분자의 발현량이 소정의 값인 환자에게 추가로 투여하는 취지의 지시서가 포함된다. 또한, 다른 비한정된 일 태양에서는 GPC3 표적 치료제 요법을 받은 암 환자로부터 단리된 생물학적 시료 중의 면역 세포수 및/또는 당해 세포 상에 발현되어 있는 분자의 발현량이, GPC3 표적 치료제 요법을 받은 후에 증대되어 있는 환자에게 추가로 투여하는 취지의 지시서가 포함된다.
본 발명의 비한정된 일 태양에서는, GPC3 표적 치료제 요법을 받은 환자로부터 단리된 생물학적 시료 중의 면역 세포수 및/또는 당해 세포 상에 발현되어 있는 분자의 발현량을 측정하는 것을 포함하고, 당해 면역 세포수 및/또는 당해 세포 상에 발현되어 있는 분자의 발현량이 소정의 값인 경우에 당해 GPC3 표적 치료제 요법이 유효하다고 결정하거나, 또는 당해 요법의 계속을 결정하는 것이 기재되는 지시서를 포함하는 제제가 제공된다.
본 발명의 비한정된 일 태양에서는, 상기 환자로부터 단리된 생물학적 시료 중의 면역 세포수 및/또는 당해 세포 상에 발현되어 있는 분자의 발현량을 측정하는 것을 포함하고, 여기에서, 당해 세포수 및/또는 발현량이 소정의 값인 경우에, 당해 환자에 있어서의 암에 대한 GPC3 표적 치료제 요법이 유효하다고 하는 것이 예측, 예상 또는 결정되거나, 또는 당해 요법의 계속이 결정되는 것이 기재되는 지시서를 포함하는 제제가 제공된다. 여기에서 당해 지시서에 기재되는 소정의 값은, 전술한 GPC3 표적 치료제 요법의 유효성을 결정하는 방법, 또는 GPC3 표적 치료제 요법의 계속을 결정하는 방법에 기재된 소정의 값이 예시된다.
면역 세포수 및/또는 당해 세포 상에 발현되어 있는 분자의 발현량의 소정의 값은, 많은 인자, 예를 들면, 이용되는 에세이 방법, 면역 세포수 및 당해 세포 상에 발현되어 있는 분자의 발현량을 측정하는 시료의 타입, 시료의 보존 조건(온도 및 기간 등), 환자의 민족적 아이덴티티 등에 의존하여, 약간 변화될 수 있다. 상기의 유효한 것을 예측, 예상 또는 결정하는 방법, 또는 당해 요법의 계속을 결정하는 방법에 있어서, 면역 세포수 및/또는 당해 세포 상에 발현되어 있는 분자의 발현량의 소정의 값으로서, 환자로부터 단리된 생물학적 시료, 특히 말초혈에 있어서의 값이 측정된다.
상기의 면역 세포수 및/또는 당해 세포 상에 발현되어 있는 분자의 발현량은, GPC3 표적 치료제 요법을 개시하기 전 및/또는 개시한 후에 단리된 시료에 있어서 측정될 수 있지만, 그들은 소정의 시간 간격으로 채취된 복수의 시료에서도 측정될 수 있다. 소정의 시간 간격으로 채취된 복수의 시료 중 어느 하나에 있어서의 면역 세포수 및/또는 당해 세포 상에 발현되어 있는 분자의 발현량이 전술한 소정의 값인 경우에, 당해 환자에 있어서의 암에 대한 GPC3 표적 치료제 요법이 유효하다고 하는 것이 예측, 예상 또는 결정되거나, 또는 당해 요법의 계속이 결정된다. GPC3 표적 치료제 요법을 개시한 후의 시료 채취의 소정의 시간 간격은 적절히 설정되지만, 당해 간격의 비한정된 일 태양으로서 GPC3 표적 치료제의 첫회 투여 후 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일(즉 1주), 8일, 9일, 10일, 11일, 12일, 13일, 14일(즉 2주), 15일, 16일, 17일, 18일, 19일, 20일, 21일(즉 3주), 22일, 23일, 24일, 25일, 26일, 27일, 28일(즉 4주), 29일, 30일, 1월, 5주, 6주, 7주, 8주, 9주, 10주, 2월, 3월, 4월, 5월, 또는 6월, 또는 1회, 2회, 3회, 4회, 또는 그 이상의 치료 사이클 후 등의, 요법의 개시와 종결 사이의 모든 시점에서 채취될 수 있다. 투여 간격 즉 치료 사이클은 적절히 설정될 수 있지만, 예를 들면, 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일(즉 1주), 8일, 9일, 10일, 11일, 12일, 13일, 14일(즉 2주), 15일, 16일, 17일, 18일, 19일, 20일, 21일(즉 3주), 22일, 23일, 24일, 25일, 26일, 27일, 28일(즉 4주), 29일, 30일, 1월, 5주, 6주, 7주, 8주, 9주, 10주, 2월, 3월, 4월, 5월, 6월 등이 비한정된 일례로서 들 수 있다.
상기의, 당해 면역 세포수 및/또는 당해 세포 상에 발현되어 있는 분자의 발현량이 소정의 값인 경우에, 당해 GPC3 표적 치료제 요법이 유효하다고 하는 것이 기재되는 지시서에는, 당해 환자가 Fcγ 수용체의 타입 IIA 및/또는 타입 IIIA의 유전자에 있어서, FcγRIIIA의 158위의 적어도 1개의 아미노산 잔기가 Val인 다형 및/또는 FcγRIIA의 131위의 적어도 1개의 아미노산 잔기가 His인 다형을 가지는지 여부도 고려하는 것도 기재될 수 있다. 즉, 대상 환자에 있어서의 면역 세포수 및 당해 세포 상에 발현되어 있는 분자의 발현량이 소정의 값이고, 대상 환자가, FcγRIIIA의 158위의 아미노산 잔기의 적어도 1개가 Val인 다형 및/또는 FcγRIIA의 131위의 적어도 1개의 아미노산 잔기가 His인 다형을 갖는 경우에, 당해 GPC3 표적 치료제 요법이 유효하다고 결정하는 것도 기재될 수 있다.
또한, 상기의, 당해 면역 세포수 및/또는 당해 세포 상에 발현되어 있는 분자의 발현량이 소정의 값인 경우에, 당해 GPC3 표적 치료제 요법의 계속을 결정하는 것이 기재되는 지시서에는, 당해 환자가 Fcγ 수용체의 타입 IIA 및/또는 타입 IIIA의 유전자에 있어서, FcγRIIIA의 158위의 적어도 1개의 아미노산 잔기가 Val인 다형 및/또는 FcγRIIA의 131위의 적어도 1개의 아미노산 잔기가 His인 다형을 가지는지 여부도 고려하는 것도 기재될 수 있다. 즉, 대상 환자에 있어서의 면역 세포수 및 당해 세포 상에 발현되어 있는 분자의 발현량이 소정의 값이고, 대상 환자가, FcγRIIIA의 158위의 아미노산 잔기 중 적어도 1개가 Val인 다형 및/또는 FcγRIIA의 131위의 적어도 1개의 아미노산 잔기가 His인 다형을 갖는 경우에, 당해 GPC3 표적 치료제 요법의 계속을 결정하는 것도 기재될 수 있다.
여기에서, FcγRIIIA의 158위의 적어도 1개의 아미노산 잔기가 Val인 다형을 갖는다는 것은, 전술한 Fcγ 수용체 다형의 확인에 기재된 방법에 따라, FcγRIIIA의 경우에는 158위의 아미노산 잔기를 코딩하는 염기 서열을 확인하여, Val의 호모형(V/V) 또는 헤테로형(V/F)의 염기 서열인 경우에, 이에 해당된다. 또한, FcγRIIA의 131위의 적어도 1개의 아미노산 잔기가 His인 다형을 갖는다는 것은, 마찬가지로, FcγRIIA의 131위 아미노산 잔기를 코딩하는 염기 서열을 확인하여, His의 호모형(H/H) 또는 헤테로형(H/R)의 염기 서열인 경우에, 이에 해당된다.
상기의, 당해 면역 세포수 및/또는 당해 세포 상에 발현되어 있는 분자의 발현량이 소정의 값인 경우에, 당해 GPC3 표적 치료제 요법이 유효하다고 결정하는 것이 기재되는 지시서에는, 추가로, 당해 환자로부터 단리된 조직, 특히 간암 조직을 포함하는 암 조직에 있어서의 GPC3의 발현량을 아울러 고려하는 것도 기재될 수 있다. 즉, 대상 환자로부터 단리된 조직, 특히 간암 조직을 포함하는 암 조직에 있어서의 GPC3의 발현량이 특정한 평가 스코어 이상이고, 대상 환자에 있어서의 면역 세포수 및/또는 당해 세포 상에 발현되어 있는 분자의 발현량이 소정의 값인 경우에, 당해 GPC3 표적 치료제 요법이 유효하다고 결정하는 것도 기재될 수 있다.
또한, 상기의, 당해 면역 세포수 및/또는 당해 세포 상에 발현되어 있는 분자의 발현량이 소정의 값인 경우에, 당해 GPC3 표적 치료제 요법의 계속을 결정하는 것이 기재되는 지시서에는, 당해 환자로부터 단리된 조직, 특히 간암 조직을 포함하는 암 조직에 있어서의 GPC3의 발현량을 아울러 고려하는 것도 기재될 수 있다. 즉, 대상 환자로부터 단리된 조직, 특히 간암 조직을 포함하는 암 조직에 있어서의 GPC3의 발현량이 특정한 평가 스코어 이상이고, 대상 환자에 있어서의 면역 세포수 및/또는 당해 세포 상에 발현되어 있는 분자의 발현량이 소정의 값인 경우에, 당해 GPC3 표적 치료제 요법의 계속을 결정하는 것도 기재될 수 있다.
환자로부터 단리된 조직, 특히 간암 조직을 포함하는 암 조직에 있어서의 GPC3의 발현량이 특정한 평가 스코어 이상인 경우의 비한정된 일 태양으로서, 소정의 조직 면역 염색 스코어 이상인 것을 들 수 있다. 소정의 조직 면역 염색 스코어 이상인 경우의 비한정된 일 태양으로서, WO2009116659에 기재된 염색법(염색법 1)에 의한 염색의 결과 산출되는 복합 평가 스코어 1이 고발현, 또는 저 또는 중발현(각각 IHC total 스코어가 7 이상 또는 7 미만)으로서 예시될 수 있다. 또한 복합 평가 스코어 2에서 이용되는 염색법(염색법 2)에 의한 염색의 결과 산출되는 GPC3-IHC 스코어(복합 평가 스코어 2)가 1+, 2+, 3+인 경우 등도 또한 소정의 조직 면역 염색 스코어 이상인 경우의 비한정된 일 태양으로서 예시될 수 있다.
이하에 본 발명을 실시예에 의해 구체적으로 설명하지만, 본 발명은 이들 실시예에 제한되는 것은 아니다.
실시예 1
본 실시예에서 이용되는 GC33(일반명: codrituzumab)은, 인간 GPC3에 높은 친화성을 가지고 결합하는 유전자 재조합 인간화 IgG1 모노클로날 항체이다(WO2006/006693). GC33의 진행 및/또는 재발성 간 세포 암(HCC) 환자이고 또한 적어도 1제의 전신 요법에 의한 전체 치료 후에 병태 진행을 일으켰거나, 또는 유해 사상 때문에 약제 투여가 중지된, 절제 불능인 진행성 또는 전이성 간 세포 암 환자에 있어서의 효과를 확인하기 위해, 제II상 무작위화 플라시보 대조 이중 맹검 다시설 공동 시험이 실시되었다(NP-27884 시험). 진행성 또는 전이성 HCC 환자에 있어서의 무악화 생존 기간에 의한 유효성 평가를 주요 목적으로 하고, 전체 생존 기간, 병세 컨트롤률, 무악화 기간을 지표로 한 유효성 평가, 및 안전성 및/또는 인용성의 평가, GC33의 약물 동태 프로파일, 및 바이오 마커 탐색을 부차 목적으로 하는 본 시험에서는, HCC 환자에게 GC33(1,600mg)이 최초의 2주는 주 1회, 그 이후는 2주에 1회의 점적을 이용한 정맥 주사에 의해 투여되었다.
투여가 검토된 HCC 환자는, 조직학적으로 확인된, 치유적 요법(외과 절제, 간 이식 등) 및/또는 국소 요법에 적절하지 않거나, 또는 치료 후 악화된 진행성 또는 전이성의 HCC(fibrolamellar형을 제외하다)를 가지고, 적어도 1제의 전신 요법에 의한 전(前)치료역을 가지고 있었다. 적격 환자는 적어도 18세이며, GPC3 측정용의 종양 샘플의 제공이 가능하고, 미국 동해안 암 임상 시험 그룹·퍼포먼스 스테이터스가 0 또는 1이며, 또한 Child-Pugh(차일드-퓨 지수) A 클래스였다. 또한, 고형 종양의 치료 효과 기준(RECIST)에 따라 적어도 1개의 평가 가능한 병변을 가지고 있었다. 다른 기준으로서는, 적절한 조혈 기능(절대 호중구수≥1500/μl, 혈소판≥50000/μl, 헤모글로빈≥8.0g/dl), 간 기능(총 빌리루빈≤2mg/dl, 아스파르트산 아미노트란스페라제 및 알라닌 아미노트란스페라제≤정상 상한값의 5배), 및 신장 기능(혈청 크레아티닌≤정상 상한값의 2배)이 평가되었다. 폐경 전의 여성에 대해서는, 치험약(治驗藥) 투여 개시 전 10일 이내에 실시된 혈청 임신 검사에서 음성이 확인되어 있는 환자, 외과적 피임 처치를 받은, 또는 폐경 후 1년 이상 경과되어 있는 임신의 가능성이 없는 여성, 폐경 후(12개월간 이상 무월경), 또는 외과적 피임 처치를 받은(난소 및/또는 자궁의 절제) 이외의 여성에 대해서는, 2종류의 적절한 피임 방법을, 치험 치료 중 및 치험약 투여 종료 후 적어도 3개월 이상 사용하는 것에 동의한 환자는 등록 가능했다. 남성의 경우는, 치험 치료 중에 더하여, 치험약 투여 종료 후 적어도 40일간의 배리어법에 기초하는 피임 방법을 사용하는 것에 동의한 환자가 등록되었다. 한편으로, GPC3 표적 치료제 투여 전의 2주간 이내에 주요한 외과 수술을 받았거나 또는 위독한 장애로부터 회복되고 있지 않은 환자, 뇌 또는 연수막으로의 전이가 확인되고 있는 환자, 과거 5년 이내에 악성 종양의 기왕(旣往)을 갖는 환자, B형/C형 간염 이외의 치료를 필요로 하는 활동성의 감염증이 있는 환자, 치험약 투여 개시 전 4주간 이내에 NCI CTCAE v4.0에 기초하는 Grade 3 이상의 출혈의 기왕을 갖는 환자, 간 이식을 포함하는 장기 이식의 기왕을 갖는 환자, 본 시험에서 투여되는 약제 이외의 항암제가 투여될 예정이 있거나, 또는 투여 중인 환자, 시험 등록 전 2주간 이내에 항암제가 투여된 환자, 간 세포 암에 대한 전회의 국소 영역 요법 또는 전신 요법에 수반하는 부작용으로부터 완전하게 회복되고 있지 않은 환자, 인터페론 요법을 시행 중인 환자, 베이스라인에 있어서의 QTc가 470ms를 상회하거나, 또는 베이스라인에 있어서 안정 시 서맥(45회/분 미만)을 나타내는 환자, 치험약 투여 개시 전 2주간 이내에, 치료를 목적으로 한 항응혈제 또는 혈전 용해제가 투여된 환자(카테터의 막힘을 제거할 목적, 또는 예방 목적에서의 저용량 투여는 제외하다), 임신 중 또는 수유 중의 환자, HIV 양성 환자, 또는 AIDS 관련 질환이 발병되어 있는 환자, 유사한 약제(모노클로날 항체, 단백 함유 제제, 차이니즈 햄스터 난소 유래 제제)에 대한 과민증의 기왕이 있는 환자, 중요한 병존 질환을 갖고 있어, 치험약에 의한 악화의 가능성이 있다고 치험 책임/분담 의사가 판단한 환자는 등록의 제외 대상으로 여겨졌다.
프로토콜은, 의약품의 임상 시험의 실시의 기준의 가이드 라인에 따라 실시되어, 각각의 참가하는 치험 윤리 심사 위원회에 의해 인가되었다. 모든 환자는, 등록 전에, 서면의 인폼드 콘센트(informed consent)에 서명했다. 환자는, 질환의 진행 또는 허용 불가능한 독성이 발현되지 않는 한, GC33의 투여가 계속되었다. 종양의 평가는 베이스라인에서 실시하고, 질환이 진행될 때까지 투여 개시로부터 4 사이클, 7 사이클, 10 사이클의 시점, 그 후는 4 사이클마다 반복되어 평가되었다. 한편, 1 사이클은 2주간으로 되어 있고, 질환의 상태는 치험 책임 의사에 의해 평가되었다.
환자는, 2:1의 비율로 GC33군(1600mg 고정 용량을 1주 간격으로 2회 투여 후, 격주 투여, n = 121예) 또는 플라시보군(n = 60예)으로 무작위화 할부 및 GPC3-IHC 키트(Ventana사제)를 이용한 IHC 염색에 의해 GPC3 발현 레벨(복합 평가 스코어 2)(0, 1+, 2+/3+)에 기초하여 3 코호트로 계층화되었다. 주요 해석은, 치험 실시 계획서에서 계획되어 있던 128예의 무재발 생존(PFS) 이벤트가 일어난 시점에서 실시되었다.
HCC 종양 조직에 있어서의 GPC3 단백질의 발현은 GPC3 조직 면역 염색(GPC3-IHC), 즉 복합 평가 스코어 2에 의해 평가되었다. GPC3-IHC는 미국 Ventana Medical Systems에서 중앙 측정이 실시되었다. 각 병원에 의해 침 생검에 의해 적출된 후에 폼알린 고정 및 파라핀 법매(法埋)된 종양 블록으로 조제된 HCC 종양 조직의 미염색 슬라이드의 면역 조직 염색이 실시되었다. 항체로서 마우스 GC33 항체(Ventana사제)가 이용되었다.
실시예 2
상기대로 GC33이 투여된 121 증례(症例) 및 플라시보가 투여된 60 증례 중, 128 증례분의 PFS 이벤트가 얻어진 시점에서, GPC3 표적 치료에 있어서의 GC33 투여에 의한 효과가 PFS에 의해 평가되었다. 또한, 부차 평가로서 전체 생존(OS)이 92 이벤트에 도달한 시점에서의 OS에 의해 평가되었다. 그 결과, PFS, OS 모두 GC33 투여에 의한 연장 효과는 확인되지 않았다(도면 1). 또한, 각 GPC3-IHC 스코어(복합 평가 스코어 2)에서의 평가에 있어서도, 어느 스코어에서도 연장 효과는 볼 수 없었다.
또한, GC33 투여군에 있어서는, 본 제II상 임상 시험에 있어서의 GC33 혈청 농도값을 이용할 수 있을 수 있었던 집단 PK모델에 의해 제 3 사이클·1일째(첫회 투여 개시부터 4주째)의 투여 전의 혈중 GC33 트러프값을 추정하고, 트러프값의 중앙값인 230μg/ml를 컷오프하여, GC33의 폭로가 적었던 군(GC33 저폭로군), 또는 GC33의 폭로가 많았던 군(GC33 고폭로군)의 2군으로 나누고, 각각의 군, 또는 플라시보군과의 사이에서 임상 효과의 지표로서의 무악화 생존 기간(PFS) 또는 전체 생존 기간(OS)을 카플란-마이어법에 의해 비교했다. 그 결과, PFS, OS 모두 GC33 고폭로군에 있어서 플라시보군, 또는 GC33 저폭로군에 대해 각각 연장 효과가 발견되었다(도면 2).
또, GC33의 효과와 관련되는 바이오 마커 탐색을 목적으로, 말초혈 중의 면역 세포의 측정, 면역 세포 상에 발현되는 Fc 감마 수용체의 타입 IIA 또는 IIIA의 유전자 다형, 및 GC33 투여 전의 말초혈을 이용한 항체 의존성 세포 상해 활성(ADCC 활성)을 측정하고, 각각 PFS, 또는 OS의 비교를 마찬가지로 카플란-마이어법에 의해 행하여, log-rank 검정을 실시했다.
실시예 3
GC33의 효과와 관련되는 바이오 마커로서, 각 시설에서 증례로부터 채혈된 후, 통상의 방법(자동 혈구 계수기에 의한 방법)으로 계측된 말초혈 면역 세포수와 효과의 관련성을 검토하기 위해, GC33 투여 전의 환자의 말초혈 중의 각종 면역 세포수의 중앙값을 기초로 고가군, 저가군으로 나누고, GC33 투여군과 플라시보군 사이에 PFS 및 OS의 비교를 행한 결과, 표 4에 나타내는 바와 같이, 백혈구수, 단구, 호중구수가 높은 군에서, GC33 투여에 의해 플라시보군보다 PFS의 연장이 확인된 것에 비해, 각각의 면역 세포수가 낮은 군(중앙값 미만)에서는 그와 같은 효과가 확인되지 않았다. 특히, 호중구에 관해서는, 세포수가 높은 군에 있어서 유의하게 PFS의 연장이 확인되었다(도면 3).
또, 상기에서 플라시보군에 비해 PFS 및 OS의 연장이 확인된 GC33 고폭로군에 한정하여 검토하면, 백혈구수, 단구수, 호중구수가 높은 군(백혈구: ≥5,680개/μL, 단구: ≥503개/μL, 호중구수: ≥3,607개/μL)에서는 모두 유의한 PFS 연장에 더하여, OS의 연장이 확인되고, 나아가 임파구수에 관해서도, 임파구수가 높은 군(≥1,246개/μL)에 있어서만, PFS의 연장 경향에 더하여 OS의 유의한 연장이 확인되었다(표 4).
[표 4]
Figure pct00007
실시예 4
더 상세하게 각종 면역 세포의 동정을 행하기 위해, 각종 면역 세포 표면 항원에 대한 항체를 이용한 FACS가 채취된 말초혈을 이용하여 Covance사에서 중앙 측정이 실시되었다. 표 5에 나타내는 바와 같이 임파구의 마커로서, CD19, CD45, CD3, CD4, CD8에 대해서 각각에 대한 항체와 채취된 전혈을 혼합하고, 임파구 서브세트는 Trucount tubes(Becton Dickinson사제)를 이용하여 측정하고, 측정값의 중앙값으로 저가군과 고가군으로 분류한 결과, GC33 투여군과 플라시보군의 비교에 있어서, CD4 양성 T세포수가 높은 군(≥490개/μL)에서 유의하게 PFS의 연장이 확인되었다(도면 4).
또, CD45 양성 세포수가 높은 군(≥1,090개/μL)에서 OS의 연장 경향, CD3 양성 T세포수가 높은 군(≥752개/μL)에서 PFS 및 OS의 연장 경향, 또 CD4 양성 T세포수가 높은 군(≥490개/μL)에서 OS의 연장 경향이 각각 확인되었다(표 5).
GC33 고폭로군으로 한정하여 검토하면, CD3 양성, CD4 양성 세포수가 높은 군(CD3: ≥752개/μL, CD4: ≥490개/μL), 또는 CD8 양성 세포가 낮은 군(<251개/μL)에서만, 모두 유의한 PFS, OS의 연장이 확인되었다(표 5). 한편, 그 이외의 분획에서는, 일부 유의한 생존 기간의 연장, 또는 연장 효과가 보여지고 있지만, 반드시 고가군, 저가군에서 일정한 강한 경향이 얻어지지 않고 있다.
[표 5]
Figure pct00008
계속하여, NK세포에 관해서 보다 상세하게 해석이 실시되었다. 상기와 마찬가지로 환자로부터 채취된 말초혈을 이용하여, Convance사에서 중앙 측정되었다. CD3, CD16, CD56에 대한 항체를 이용한 FACS 해석에 의한 분류에 더하여, NKp46, CD8에 대한 항체의 반응성을 포함하는 분류를 행했다. CD3에 대한 반응성이 음성인 세포군에 관해서는, CD16 양성, NKp46 양성에 더하여, CD56과 CD16에 대한 항체의 반응성을 기초로, CD56bright NK세포 각분(各分), CD56-/CD16+ NK세포 각분, CD56dim/CD16- NK세포 각분 및 CD56dim/CD16bright NK세포 각분으로 분류했다.
각각의 NK세포 각분에 있어서의 GC33 투여에 의한 PFS, OS에 대한 영향은 표 6에 나타내는 바와 같이, 각 NK세포 각분 내, CD56-CD16+의 NK세포 각분이 높은 군(≥6.3개/μL)에서만 GC33 투여에 의한 유의한 PFS의 연장, 및 OS의 연장 경향이 확인되었다(도면 5). 또, GC33 고폭로군과 플라시보군을 비교한 경우에, 생존 기간의 연장 효과는 현저했다. 한편, 그 이외의 각분에서는, 일부 유의한 생존 기간의 연장, 또는 연장 효과가 보이고 있지만, 반드시 고가군, 저가군에서 일정한 강한 경향이 얻어지지 않고 있다.
각 마커에 의한 분획에 더하여, NK세포 상의 CD16 또는 NKp46의 발현량을 마찬가지로 FACS(FACSCanto II, Beckton Diskinson사제)로 측정하고, 측정 결과의 중앙값을 기초로, 고발현군과 저발현군으로 분류하여, 마찬가지로 GC33 투여, 및 GC33 고폭로에 있어서의 PFS, OS를 플라시보군과 비교했다. 각각의 발현량(가용성 형광 색소 분자 등량: mean equivalent soluble fluorescent level(MESF))은, 캘리브레이션 비즈(Quantum MESF bead standard, Banglaboratories사제)의 형광량을 기초로 MESF 표준 곡선을 작성하여, NK세포 분획의 형광량으로 발현량(MESF)을 산출했다. 그 결과, 표 6에 나타내는 바와 같이 CD16의 발현량(CD16 MESF)에 있어서, 발현이 고가의 군(≥372,254mesf)에서만, GC33 투여에 의해 유의한 PFS의 연장, 및 OS의 연장 경향이 확인되고(도면 6), GC33 고폭로군과 플라시보군의 비교에 있어서는, 그의 생존 기간 연장 효과는 보다 현저했다.
[표 6]
Figure pct00009
실시예 5
GC33의 작용 메커니즘으로서 ADCC의 유도가 보고되어 있다(Ishiguro T. et al., Cancer Res. 2008; 68: 9832-9838). 그래서, GC33 투여 전의 환자의 ADCC 활성을 측정하고, GC33의 효과와의 관계가 검토되었다.
GC33 또는 플라시보 투여 전에 채취한 환자의 말초혈을 이용하여 ADCC 활성을 다음과 같이 검토했다. 채혈 후에 액체 질소로 동결하고, -150도에서 보존한 말초혈을 융해한 후, IL-2(Pepro Tech사제)를 포함하는 RPMI II 배지(HyClone사제)를 가하고, 하룻밤 배양한 1×105개의 말초 단핵구에 GC33(0.5μg/mL) 및 타겟 세포를 가하고, 37도에서 1시간 배양하고, 추가로 Monensin을 가하여 2시간 배양한 후, 말초 단핵구을 하비스트하고, CD45, CD3, CD16, CD56 및 CD107에 대한 항체 혼합액을 가하여, NK세포에 있어서의 CD16 발현량, 또는 CD107a 발현량을 각각 FACS(FACSCantII, Beckton Dickinson사제)로 측정했다. 또한, 음성 대상으로서 타겟 세포만을 가하여 배양했을 때의 CD107a 또는 CD16의 발현량으로 하고, 음성 대상과의 차를 ADCC 활성의 지표로 했다. 타겟 세포로서는, ADCC 활성 측정용에는 GPC3을 발현하는 인간 간암 세포주 HepG2 세포(ATCC)를, 항체 비의존적인 NK활성 측정용에 인간 만성 골수성 백혈병 세포주 K562 세포(ATCC)를 이용했다. 한편, 어느 샘플 조제 및 측정에 관해서는 Covance사에서 중앙 측정이 실시되었다.
CD107a에 대해서는 중앙값(34.15%)보다 고가인 것을 ADCC 고활성군, 저가인 것을 ADCC 저활성군으로 하고, 또한 CD16은 중앙값(-64.33%)보다 저가인 것을 ADCC 고활성군, 고가인 것을 ADCC 저활성군으로 했다. 각각에 관하여, 마찬가지로 고폭로군, 저폭로군, 플라시보군에서 PFS, OS의 비교를 행했다. 그 결과, 표 7에 나타내는 바와 같이, CD107a, CD16 중 어느 지표에 있어서도 ADCC 고활성군에서만 PFS, OS의 유의한 연장이 확인되었다(도 7, 도 8).
한편, K562 세포에 대한 CD107a 또는 CD16의 발현의 변화(CD107a 변화량 중앙값: 9.74%, CD16 변화량 중앙값: -15.76%)를 NK활성으로 하여 측정했지만, ADCC와 달리, NK활성 저가군, 고가군 사이의 어느 것에서만 유의한 PFS 또는 OS의 연장은 확인되지 않았다(표 7).
[표 7]
Figure pct00010
실시예 6
항체의 Fc 영역과 결합하는 Fc 감마 수용체의 유전자 다형이 항체의 Fc 영역과의 결합에 영향을 주는 것이 알려져 있다. 그래서, Fc 감마 수용체 타입 IIA 및 IIIA의 유전자 다형과의 관련성을 검토했다. 환자로부터 채취한 말초혈로부터 게놈 유전자를 단리하여, Fc 감마 영역의 타입 IIA의 131위의 아미노산 잔기에 상당하는 염기 서열, 또는 타입 IIIA의 158위의 아미노산 잔기에 상당하는 염기 서열의 다형이 측정되었다. 즉, 환자로부터 채혈한 전혈로부터 MagNa Pure LC DNA Isolation kit 1(Roche Applied Science사제)을 이용하여 단리한 게놈 DNA를 이용하여, 각각의 SNPs에 대응하도록 디자인된 TaqMan(등록상표) probe와 Real-Time PCR에 의해 genotyping을 행했다.
그 결과, FcγRIIIA의 158위의 아미노산 잔기가 Val을 가지는 다형(V/V 또는 V/F)과 Phe만을 가지는 다형(F/F) 사이에 PFS, OS를 고폭로군, 저폭로군과 플라시보군 각각에서 비교한 결과, 표 8에 나타내는 바와 같이 GC33 고폭로군에 있어서, V/V 또는 V/F를 갖는 군에서 PFS, OS 모두 유의하게 플라시보군에 대해 연장이 확인된 것에 비해, F/F에서는 그와 같은 효과가 확인되지 않았다.
[표 8]
Figure pct00011
또한, FcγRIIA의 131위의 유전자 다형에 대해서도 마찬가지로 검토했다. 131위의 아미노산 잔기가 His를 가지는 다형(H/H 또는 H/R)과 Arg만을 가지는 다형(R/R) 사이에 PFS, OS를 고폭로군, 저폭로군과 플라시보군 각각에서 비교한 결과, 표 8에 나타내는 바와 같이 GC33 고폭로군에 있어서, H/H 또는 H/R을 갖는 군에 있어서 PFS, OS 모두 유의하게 플라시보군에 대해 연장이 확인된 것에 비해, R/R에서는 그와 같은 효과가 확인되지 않았다.
이상, 환자의 면역 상태를, 말초혈 면역 세포수, ADCC 활성, 또는 Fc 감마 수용체의 유전자 다형을 각각 측정하는 것, 또는 그들의 조합으로 GPC3 표적 치료법의 유효성을 향상시킬 수 있다는 것으로 나타났다.
실시예 7
NK세포 상의 CD16의 발현량(CD16 MESF)에 관해서는, 추가로 비례 해저드 모델에 기초한 Cox 회귀를 이용한 해석이 실시되었다. 당해 해석에 있어서는, 실시예 5의 측정 결과를 기초로, 상이한 컷오프값에 의해 CD16 MESF 고가군과 CD16 MESF 저가군으로 분류하고, 각 군에 대해 해저드비, 95% 신뢰 구간(95% CI) 및 log-rank 검정의 p값을 산출했다. 한편, 해석에 있어서는 전체 생존 기간을 리스폰스의 변수로서 이용하여, 임상적으로 의의가 있는 배경 인자로 조정했다.
CD16 MESF값의 33%(33퍼센트값)였던 279,736.9mesf, 50%(50퍼센트값)였던 363,594mesf, 또는 67%(33퍼센트값)였던 439,468.3을 컷오프값으로 했다. 그리고, 각 컷오프값에 의해 각각 저가군과 고가군으로 분류하여, GC33 고폭로군에 있어서의 해저드비, 95% 신뢰 구간 및 p값을 플라시보군과 비교했다. 그 결과, 표 9에 나타내는 바와 같이, CD16 MESF 고가군에서는, CD16 MESF값의 컷오프값이 높아짐에 따라 해저드비가 낮아졌기 때문에, GC33의 임상 유효성과 CD16의 발현량이 관계한다는 것이 시사되었다(표 9).
한편으로, CD16 MESF 저가군에서는, CD16의 MESF값의 컷오프값의 변화와 해저드비 사이에 유의한 관계는 확인되지 않았다.
[표 9]
Figure pct00012
본 명세서 중에서 인용한 모든 간행물, 특허 및 특허출원을 그대로 참고로 하여 본 명세서 중에 도입되는 것으로 한다.
본 발명은 GPC3 표적 치료제 요법의 유효성 향상과, 치료를 받는 환자의 QOL 개선에 이바지하는 것이며, 간암을 비롯한 암의 치료에 유용하다.
SEQUENCE LISTING <110> Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha F. HOFFMANN-LA ROCHE AG <120> GPC3-TARGETING DRUG WHICH IS ADMINISTERED TO PATIENT RESPONSIVE TO GPC3-TARGETING DRUG THERAPY <130> PCG-9043WO <150> US 61/990238 <151> 2014-05-08 <160> 82 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 580 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 1 Met Ala Gly Thr Val Arg Thr Ala Cys Leu Val Val Ala Met Leu Leu 1 5 10 15 Ser Leu Asp Phe Pro Gly Gln Ala Gln Pro Pro Pro Pro Pro Pro Asp 20 25 30 Ala Thr Cys His Gln Val Arg Ser Phe Phe Gln Arg Leu Gln Pro Gly 35 40 45 Leu Lys Trp Val Pro Glu Thr Pro Val Pro Gly Ser Asp Leu Gln Val 50 55 60 Cys Leu Pro Lys Gly Pro Thr Cys Cys Ser Arg Lys Met Glu Glu Lys 65 70 75 80 Tyr Gln Leu Thr Ala Arg Leu Asn Met Glu Gln Leu Leu Gln Ser Ala 85 90 95 Ser Met Glu Leu Lys Phe Leu Ile Ile Gln Asn Ala Ala Val Phe Gln 100 105 110 Glu Ala Phe Glu Ile Val Val Arg His Ala Lys Asn Tyr Thr Asn Ala 115 120 125 Met Phe Lys Asn Asn Tyr Pro Ser Leu Thr Pro Gln Ala Phe Glu Phe 130 135 140 Val Gly Glu Phe Phe Thr Asp Val Ser Leu Tyr Ile Leu Gly Ser Asp 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Glu Ala Ala Thr Glu Asp Gly Asn Val Leu Lys Arg 260 265 270 Ser Pro Glu Leu Glu Leu Gln Val Leu Gly Leu Gln Leu Pro Thr Pro 275 280 285 Val Trp Phe His Val Leu Phe Tyr Leu Ala Val Gly Ile Met Phe Leu 290 295 300 Val Asn Thr Val Leu Trp Val Thr Ile Arg Lys Glu Leu Lys Arg Lys 305 310 315 320 Lys Lys Trp Asp Leu Glu Ile Ser Leu Asp Ser Gly His Glu Lys Lys 325 330 335 Val Ile Ser Ser Leu Gln Glu Asp Arg His Leu Glu Glu Glu Leu Lys 340 345 350 Cys Gln Glu Gln Lys Glu Glu Gln Leu Gln Glu Gly Val His Arg Lys 355 360 365 Glu Pro Gln Gly Ala Thr 370 <210> 79 <211> 316 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 79 Met Thr Met Glu Thr Gln Met Ser Gln Asn Val Cys Pro Arg Asn Leu 1 5 10 15 Trp Leu Leu Gln Pro Leu Thr Val Leu Leu Leu Leu Ala Ser Ala Asp 20 25 30 Ser Gln Ala Ala Pro Pro Lys Ala Val Leu Lys Leu Glu Pro Pro Trp 35 40 45 Ile Asn Val Leu Gln Glu Asp Ser Val Thr Leu Thr Cys Gln Gly Ala 50 55 60 Arg Ser Pro Glu Ser Asp Ser Ile Gln Trp Phe His Asn Gly Asn Leu 65 70 75 80 Ile Pro Thr His Thr Gln Pro Ser Tyr Arg Phe Lys Ala Asn Asn Asn 85 90 95 Asp Ser Gly Glu Tyr Thr Cys Gln Thr Gly Gln Thr Ser Leu Ser Asp 100 105 110 Pro Val His Leu Thr Val Leu Ser Glu Trp Leu Val Leu Gln Thr Pro 115 120 125 His Leu Glu Phe Gln Glu Gly Glu Thr Ile Met Leu Arg Cys His Ser 130 135 140 Trp Lys Asp Lys Pro Leu Val Lys Val Thr Phe Phe Gln Asn Gly Lys 145 150 155 160 Ser Gln Lys Phe Ser His Leu Asp Pro Thr Phe Ser Ile Pro Gln Ala 165 170 175 Asn His Ser His Ser Gly Asp Tyr His Cys Thr Gly Asn Ile Gly Tyr 180 185 190 Thr Leu Phe Ser Ser Lys Pro Val Thr Ile Thr Val Gln Val Pro Ser 195 200 205 Met Gly Ser Ser Ser Pro Met Gly Val Ile Val Ala Val Val Ile Ala 210 215 220 Thr Ala Val Ala Ala Ile Val Ala Ala Val Val Ala Leu Ile Tyr Cys 225 230 235 240 Arg Lys Lys Arg Ile Ser Ala Asn Ser Thr Asp Pro Val Lys Ala Ala 245 250 255 Gln Phe Glu Pro Pro Gly Arg Gln Met Ile Ala Ile Arg Lys Arg Gln 260 265 270 Leu Glu Glu Thr Asn Asn Asp Tyr Glu Thr Ala Asp Gly Gly Tyr Met 275 280 285 Thr Leu Asn Pro Arg Ala Pro Thr Asp Asp Asp Lys Asn Ile Tyr Leu 290 295 300 Thr Leu Pro Pro Asn Asp His Val Asn Ser Asn Asn 305 310 315 <210> 80 <211> 291 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 80 Met Gly Ile Leu Ser Phe Leu Pro Val Leu Ala Thr Glu Ser Asp Trp 1 5 10 15 Ala Asp Cys Lys Ser Pro Gln Pro Trp Gly His Met Leu Leu Trp Thr 20 25 30 Ala Val Leu Phe Leu Ala Pro Val Ala Gly Thr Pro Ala Ala Pro Pro 35 40 45 Lys Ala Val Leu Lys Leu Glu Pro Gln Trp Ile Asn Val Leu Gln Glu 50 55 60 Asp Ser Val Thr Leu Thr Cys Arg Gly Thr His Ser Pro Glu Ser Asp 65 70 75 80 Ser Ile Gln Trp Phe His Asn Gly Asn Leu Ile Pro Thr His Thr Gln 85 90 95 Pro Ser Tyr Arg Phe Lys Ala Asn Asn Asn Asp Ser Gly Glu Tyr Thr 100 105 110 Cys Gln Thr Gly Gln Thr Ser Leu Ser Asp Pro Val His Leu Thr Val 115 120 125 Leu Ser Glu Trp Leu Val Leu Gln Thr Pro His Leu Glu Phe Gln Glu 130 135 140 Gly Glu Thr Ile Val Leu Arg Cys His Ser Trp Lys Asp Lys Pro Leu 145 150 155 160 Val Lys Val Thr Phe Phe Gln Asn Gly Lys Ser Lys Lys Phe Ser Arg 165 170 175 Ser Asp Pro Asn Phe Ser Ile Pro Gln Ala Asn His Ser His Ser Gly 180 185 190 Asp Tyr His Cys Thr Gly Asn Ile Gly Tyr Thr Leu Tyr Ser Ser Lys 195 200 205 Pro Val Thr Ile Thr Val Gln Ala Pro Ser Ser Ser Pro Met Gly Ile 210 215 220 Ile Val Ala Val Val Thr Gly Ile Ala Val Ala Ala Ile Val Ala Ala 225 230 235 240 Val Val Ala Leu Ile Tyr Cys Arg Lys Lys Arg Ile Ser Ala Asn Pro 245 250 255 Thr Asn Pro Asp Glu Ala Asp Lys Val Gly Ala Glu Asn Thr Ile Thr 260 265 270 Tyr Ser Leu Leu Met His Pro Asp Ala Leu Glu Glu Pro Asp Asp Gln 275 280 285 Asn Arg Ile 290 <210> 81 <211> 254 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 81 Met Trp Gln Leu Leu Leu Pro Thr Ala Leu Leu Leu Leu Val Ser Ala 1 5 10 15 Gly Met Arg Thr Glu Asp Leu Pro Lys Ala Val Val Phe Leu Glu Pro 20 25 30 Gln Trp Tyr Arg Val Leu Glu Lys Asp Ser Val Thr Leu Lys Cys Gln 35 40 45 Gly Ala Tyr Ser Pro Glu Asp Asn Ser Thr Gln Trp Phe His Asn Glu 50 55 60 Ser Leu Ile Ser Ser Gln Ala Ser Ser Tyr Phe Ile Asp Ala Ala Thr 65 70 75 80 Val Asp Asp Ser Gly Glu Tyr Arg Cys Gln Thr Asn Leu Ser Thr Leu 85 90 95 Ser Asp Pro Val Gln Leu Glu Val His Ile Gly Trp Leu Leu Leu Gln 100 105 110 Ala Pro Arg Trp Val Phe Lys Glu Glu Asp Pro Ile His Leu Arg Cys 115 120 125 His Ser Trp Lys Asn Thr Ala Leu His Lys Val Thr Tyr Leu Gln Asn 130 135 140 Gly Lys Gly Arg Lys Tyr Phe His His Asn Ser Asp Phe Tyr Ile Pro 145 150 155 160 Lys Ala Thr Leu Lys Asp Ser Gly Ser Tyr Phe Cys Arg Gly Leu Val 165 170 175 Gly Ser Lys Asn Val Ser Ser Glu Thr Val Asn Ile Thr Ile Thr Gln 180 185 190 Gly Leu Ser Val Ser Thr Ile Ser Ser Phe Phe Pro Pro Gly Tyr Gln 195 200 205 Val Ser Phe Cys Leu Val Met Val Leu Leu Phe Ala Val Asp Thr Gly 210 215 220 Leu Tyr Phe Ser Val Lys Thr Asn Ile Arg Ser Ser Thr Arg Asp Trp 225 230 235 240 Lys Asp His Lys Phe Lys Trp Arg Lys Asp Pro Gln Asp Lys 245 250 <210> 82 <211> 233 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 82 Met Trp Gln Leu Leu Leu Pro Thr Ala Leu Leu Leu Leu Val Ser Ala 1 5 10 15 Gly Met Arg Thr Glu Asp Leu Pro Lys Ala Val Val Phe Leu Glu Pro 20 25 30 Gln Trp Tyr Ser Val Leu Glu Lys Asp Ser Val Thr Leu Lys Cys Gln 35 40 45 Gly Ala Tyr Ser Pro Glu Asp Asn Ser Thr Gln Trp Phe His Asn Glu 50 55 60 Ser Leu Ile Ser Ser Gln Ala Ser Ser Tyr Phe Ile Asp Ala Ala Thr 65 70 75 80 Val Asn Asp Ser Gly Glu Tyr Arg Cys Gln Thr Asn Leu Ser Thr Leu 85 90 95 Ser Asp Pro Val Gln Leu Glu Val His Ile Gly Trp Leu Leu Leu Gln 100 105 110 Ala Pro Arg Trp Val Phe Lys Glu Glu Asp Pro Ile His Leu Arg Cys 115 120 125 His Ser Trp Lys Asn Thr Ala Leu His Lys Val Thr Tyr Leu Gln Asn 130 135 140 Gly Lys Asp Arg Lys Tyr Phe His His Asn Ser Asp Phe His Ile Pro 145 150 155 160 Lys Ala Thr Leu Lys Asp Ser Gly Ser Tyr Phe Cys Arg Gly Leu Val 165 170 175 Gly Ser Lys Asn Val Ser Ser Glu Thr Val Asn Ile Thr Ile Thr Gln 180 185 190 Gly Leu Ala Val Ser Thr Ile Ser Ser Phe Ser Pro Pro Gly Tyr Gln 195 200 205 Val Ser Phe Cys Leu Val Met Val Leu Leu Phe Ala Val Asp Thr Gly 210 215 220 Leu Tyr Phe Ser Val Lys Thr Asn Ile 225 230

Claims (45)

  1. 환자에 있어서의 암에 대한 GPC3 표적 치료제 요법의 유효성을 결정하거나, 또는 환자에 대한 GPC3 표적 치료제 요법의 계속을 결정하는 방법으로서, GPC3 표적 치료제 요법을 받기 전의 환자 및/또는 GPC3 표적 치료제 요법을 받은 환자로부터 단리된 생물학적 시료 중의, 면역 세포수 또는 당해 세포 상에 발현되어 있는 분자의 발현량을 측정하는 것을 포함하고, 당해 면역 세포수 또는 당해 세포 상에 발현되어 있는 분자의 발현량이 소정의 값인 경우에 당해 GPC3 표적 치료제 요법이 유효하다고 결정하거나, 또는 당해 GPC3 표적 치료제 요법의 계속을 결정하는 방법.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 생물학적 시료가 환자로부터 단리된 말초혈인, 방법.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    상기 면역 세포가 백혈구, 단구, 호중구 및 임파구로부터 선택되는 적어도 1개의 세포인, 방법.
  4. 제 3 항에 있어서,
    상기 임파구가 CD45+ 임파구, CD3+ T세포, CD4+ T세포, 및 CD8+ T세포로부터 선택되는 적어도 1개의 임파구 세포인, 방법.
  5. 제 3 항에 있어서,
    상기 임파구가 CD16+ NK세포, NKp46+ NK세포, 및 CD56-CD16+ NK세포로부터 선택되는 적어도 1개의 임파구 세포인, 방법.
  6. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    상기 면역 세포 상에 발현되어 있는 분자가 CD16 또는 CD107a인, 방법.
  7. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 환자가, FcγRIIIA의 158위의 적어도 1개의 아미노산 잔기가 Val인 다형 및/또는 FcγRIIA의 131위의 적어도 1개의 아미노산 잔기가 His인 다형을 갖는 환자인, 방법.
  8. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 암이 간암인, 방법.
  9. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 GPC3 표적 치료제가 암 환자의 혈중 트러프값으로 200μg/ml 이상이 되도록 투여되는, 방법.
  10. 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 GPC3 표적 치료제가 항GPC3 항체를 유효 성분으로서 포함하는 치료제인, 방법.
  11. 제 10 항에 있어서,
    상기 항GPC3 항체가 항체 의존성 세포 상해(ADCC) 활성 및/또는 보체 의존성 세포 상해(CDC) 활성을 갖는 항체인, 방법.
  12. 제 10 항 또는 제 11 항에 있어서,
    상기 항GPC3 항체가 이하의 (1) 내지 (5) 중 어느 하나;
    (1) 서열번호: 4, 서열번호: 5 및 서열번호: 6으로 각각 표시되는 중쇄 CDR1, 중쇄 CDR2 및 중쇄 CDR3, 및 서열번호: 7, 서열번호: 8 및 서열번호: 9로 각각 표시되는 경쇄 CDR1, 경쇄 CDR2 및 경쇄 CDR3;
    (2) 서열번호: 12, 서열번호: 13 및 서열번호: 14로 각각 표시되는 중쇄 CDR1, 중쇄 CDR2 및 중쇄 CDR3, 및 서열번호: 15, 서열번호: 16 및 서열번호: 17로 각각 표시되는 경쇄 CDR1, 경쇄 CDR2 및 경쇄 CDR3;
    (3) 서열번호: 20, 서열번호: 21 및 서열번호: 22로 각각 표시되는 중쇄 CDR1, 중쇄 CDR2 및 중쇄 CDR3, 및 서열번호: 23, 서열번호: 24 및 서열번호: 25로 각각 표시되는 경쇄 CDR1, 경쇄 CDR2 및 경쇄 CDR3;
    (4) 서열번호: 28, 서열번호: 29 및 서열번호: 30으로 각각 표시되는 중쇄 CDR1, 중쇄 CDR2 및 중쇄 CDR3, 및 서열번호: 31, 서열번호: 32 및 서열번호: 33으로 각각 표시되는 경쇄 CDR1, 경쇄 CDR2 및 경쇄 CDR3; 또는
    (5) 서열번호: 36, 서열번호: 37 및 서열번호: 38로 각각 표시되는 중쇄 CDR1, 중쇄 CDR2 및 중쇄 CDR3, 및 서열번호: 39, 서열번호: 40 및 서열번호: 41로 각각 표시되는 경쇄 CDR1, 경쇄 CDR2 및 경쇄 CDR3;
    을 포함하는 항GPC3 키메라 항체 또는 인간화 항GPC3 항체인, 방법.
  13. 제 10 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 항GPC3 항체가 이하 중 어느 하나;
    (1) 서열번호: 44, 서열번호: 45, 서열번호: 46, 서열번호: 47, 서열번호: 48, 서열번호: 49 및 서열번호: 50으로 표시되는 중쇄 가변 영역의 군으로부터 선택되는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호: 51로 표시되는 경쇄 가변 영역;
    (2) 서열번호: 44, 서열번호: 45, 서열번호: 46, 서열번호: 47, 서열번호: 48, 서열번호: 49 및 서열번호: 50으로 표시되는 중쇄 가변 영역의 군으로부터 선택되는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호: 52, 서열번호: 53, 서열번호: 54, 서열번호: 55, 서열번호: 56, 서열번호: 57, 서열번호: 58, 서열번호: 59, 서열번호: 60, 서열번호: 61, 서열번호: 62, 서열번호: 63, 서열번호: 64, 서열번호: 65 및 서열번호: 66으로 표시되는 경쇄 가변 영역의 군으로부터 선택되는 경쇄 가변 영역;
    (3) 서열번호: 67로 표시되는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호: 68로 표시되는 경쇄 가변 영역;
    (4) 서열번호: 69로 표시되는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호: 70으로 표시되는 경쇄 가변 영역;
    (5) 서열번호: 71로 표시되는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호: 72로 표시되는 경쇄 가변 영역; 또는
    (6) 서열번호: 71로 표시되는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호: 73으로 표시되는 경쇄 가변 영역;
    을 포함하는 항체인, 방법.
  14. 제 10 항에 있어서,
    상기 GPC3 표적 치료제가 항GPC3 항체에 세포 상해성 물질이 연결된 항체를 포함하는, 방법.
  15. 면역 세포수 또는 당해 면역 세포 상에 발현되어 있는 분자의 발현량이 소정의 값을 갖는 암 환자에게 투여하기 위한 GPC3 표적 치료제.
  16. 제 15 항에 있어서,
    면역 세포수 또는 당해 면역 세포 상에 발현되어 있는 분자의 발현량이 암 환자로부터 단리된 생물학적 시료 중의 면역 세포수 또는 당해 면역 세포 상에 발현되어 있는 분자의 발현량인, GPC3 표적 치료제.
  17. 제 16 항에 있어서,
    상기 생물학적 시료가 암 환자로부터 단리된 말초혈인, 치료제.
  18. 제 15 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 면역 세포가 백혈구, 단구, 호중구 및 임파구로부터 선택되는 적어도 1개의 세포인, 치료제.
  19. 제 18 항에 있어서,
    상기 임파구가 CD45+ 임파구, CD3+ T세포, CD4+ T세포, 및 CD8+ T세포로부터 선택되는 적어도 1개의 임파구 세포인, 치료제.
  20. 제 18 항에 있어서,
    상기 임파구가 CD16+ NK세포, NKp46+ NK세포, 및 CD56-CD16+ NK세포로부터 선택되는 적어도 1개의 임파구 세포인, 치료제.
  21. 제 15 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 면역 세포 상에 발현되어 있는 분자가 CD16 또는 CD107a인, 치료제.
  22. 제 15 항 내지 제 21 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 환자가, FcγRIIIA의 158위의 적어도 1개의 아미노산 잔기가 Val인 다형 및/또는 FcγRIIA의 131위의 적어도 1개의 아미노산 잔기가 His인 다형을 갖는 환자인, 치료제.
  23. 제 15 항 내지 제 22 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 암 환자가 간암 환자인, 치료제.
  24. 제 15 항 내지 제 23 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 GPC3 표적 치료제가 암 환자의 혈중 트러프값으로 200μg/ml 이상이 되도록 투여되는, 치료제.
  25. 제 15 항 내지 제 24 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 GPC3 표적 치료제가 항GPC3 항체를 유효 성분으로서 포함하는 치료제인, 치료제.
  26. 제 25 항에 있어서,
    상기 항GPC3 항체가 항체 의존성 세포 상해(ADCC) 활성 및/또는 보체 의존성 세포 상해(CDC) 활성을 갖는 항체인, 치료제.
  27. 제 25 항 또는 제 26 항에 있어서,
    상기 항GPC3 항체가 이하의 (1) 내지 (5) 중 어느 하나;
    (1) 서열번호: 4, 서열번호: 5 및 서열번호: 6으로 각각 표시되는 중쇄 CDR1, 중쇄 CDR2 및 중쇄 CDR3, 및 서열번호: 7, 서열번호: 8 및 서열번호: 9로 각각 표시되는 경쇄 CDR1, 경쇄 CDR2 및 경쇄 CDR3;
    (2) 서열번호: 12, 서열번호: 13 및 서열번호: 14로 각각 표시되는 중쇄 CDR1, 중쇄 CDR2 및 중쇄 CDR3, 및 서열번호: 15, 서열번호: 16 및 서열번호: 17로 각각 표시되는 경쇄 CDR1, 경쇄 CDR2 및 경쇄 CDR3;
    (3) 서열번호: 20, 서열번호: 21 및 서열번호: 22로 각각 표시되는 중쇄 CDR1, 중쇄 CDR2 및 중쇄 CDR3, 및 서열번호: 23, 서열번호: 24 및 서열번호: 25로 각각 표시되는 경쇄 CDR1, 경쇄 CDR2 및 경쇄 CDR3;
    (4) 서열번호: 28, 서열번호: 29 및 서열번호: 30으로 각각 표시되는 중쇄 CDR1, 중쇄 CDR2 및 중쇄 CDR3, 및 서열번호: 31, 서열번호: 32 및 서열번호: 33으로 각각 표시되는 경쇄 CDR1, 경쇄 CDR2 및 경쇄 CDR3; 또는
    (5) 서열번호: 36, 서열번호: 37 및 서열번호: 38로 각각 표시되는 중쇄 CDR1, 중쇄 CDR2 및 중쇄 CDR3, 및 서열번호: 39, 서열번호: 40 및 서열번호: 41로 각각 표시되는 경쇄 CDR1, 경쇄 CDR2 및 경쇄 CDR3;
    을 포함하는 항GPC3 키메라 항체 또는 인간화 항GPC3 항체인, 치료제.
  28. 제 25 항 내지 제 27 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 항GPC3 항체가 이하 중 어느 하나;
    (1) 서열번호: 44, 서열번호: 45, 서열번호: 46, 서열번호: 47, 서열번호: 48, 서열번호: 49 및 서열번호: 50으로 표시되는 중쇄 가변 영역의 군으로부터 선택되는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호: 51로 표시되는 경쇄 가변 영역;
    (2) 서열번호: 44, 서열번호: 45, 서열번호: 46, 서열번호: 47, 서열번호: 48, 서열번호: 49 및 서열번호: 50으로 표시되는 중쇄 가변 영역의 군으로부터 선택되는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호: 52, 서열번호: 53, 서열번호: 54, 서열번호: 55, 서열번호: 56, 서열번호: 57, 서열번호: 58, 서열번호: 59, 서열번호: 60, 서열번호: 61, 서열번호: 62, 서열번호: 63, 서열번호: 64, 서열번호: 65 및 서열번호: 66으로 표시되는 경쇄 가변 영역의 군으로부터 선택되는 경쇄 가변 영역;
    (3) 서열번호: 67로 표시되는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호: 68로 표시되는 경쇄 가변 영역;
    (4) 서열번호: 69로 표시되는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호: 70으로 표시되는 경쇄 가변 영역;
    (5) 서열번호: 71로 표시되는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호: 72로 표시되는 경쇄 가변 영역; 또는
    (6) 서열번호: 71로 표시되는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호: 73으로 표시되는 경쇄 가변 영역;
    을 포함하는 항체인, 치료제.
  29. 제 25 항에 있어서,
    상기 GPC3 표적 치료제가 항GPC3 항체에 세포 상해성 물질이 결합된 항체인, 치료제.
  30. GPC3 표적 치료제 요법을 받기 전의 암 환자로부터 단리된 생물학적 시료 중의 면역 세포수 또는 당해 면역 세포 상에 발현되어 있는 분자의 발현량이 소정의 값인 환자에게 투여하는 취지의 지시서를 포함하는 GPC3 표적 치료를 위한 제제.
  31. GPC3 표적 치료제 요법을 받은 암 환자로부터 단리된 생물학적 시료 중의 면역 세포수 또는 당해 면역 세포 상에 발현되어 있는 분자의 발현량이 소정의 값인 환자에게 추가로 투여하는 취지의 지시서를 포함하는 GPC3 표적 치료를 위한 제제.
  32. 제 30 항 또는 제 31 항에 있어서,
    상기 생물학적 시료가 암 환자로부터 단리된 말초혈인, 제제.
  33. 제 30 항 내지 제 32 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 면역 세포가 백혈구, 단구, 호중구 및 임파구로부터 선택되는 적어도 1개의 세포인, 제제.
  34. 제 33 항에 있어서,
    상기 임파구가 CD45+ 임파구, CD3+ T세포, CD4+ T세포, 및 CD8+ T세포로부터 선택되는 적어도 1개의 임파구 세포인, 제제.
  35. 제 33 항에 있어서,
    상기 임파구가 CD16+ NK세포, NKp46+ NK세포, 및 CD56-CD16+ NK세포로부터 선택되는 적어도 1개의 임파구 세포인, 제제.
  36. 제 30 항 내지 제 32 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 면역 세포 상에 발현되어 있는 분자가 CD16 또는 CD107a인, 제제.
  37. 제 30 항 내지 제 36 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 환자가, FcγRIIIA의 158위의 적어도 1개의 아미노산 잔기가 Val인 다형 및/또는 FcγRIIA의 131위의 적어도 1개의 아미노산 잔기가 His인 다형을 갖는 환자인, 제제.
  38. 제 30 항 내지 제 37 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 암 환자가 간암 환자인, 제제.
  39. 제 30 항 내지 제 38 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 GPC3 표적 치료제가 암 환자의 혈중 트러프값으로 200μg/ml 이상이 되도록 투여되는, 제제.
  40. 제 30 항 내지 제 39 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 GPC3 표적 치료제가 항GPC3 항체를 유효 성분으로서 포함하는 치료제인, 제제.
  41. 제 40 항에 있어서,
    상기 항GPC3 항체가 항체 의존성 세포 상해(ADCC) 활성 및/또는 보체 의존성 세포 상해(CDC) 활성을 갖는 항체인, 제제.
  42. 제 40 항 또는 제 41 항에 있어서,
    상기 항GPC3 항체가 이하의 (1) 내지 (5) 중 어느 하나;
    (1) 서열번호: 4, 서열번호: 5 및 서열번호: 6으로 각각 표시되는 중쇄 CDR1, 중쇄 CDR2 및 중쇄 CDR3, 및 서열번호: 7, 서열번호: 8 및 서열번호: 9로 각각 표시되는 경쇄 CDR1, 경쇄 CDR2 및 경쇄 CDR3;
    (2) 서열번호: 12, 서열번호: 13 및 서열번호: 14로 각각 표시되는 중쇄 CDR1, 중쇄 CDR2 및 중쇄 CDR3, 및 서열번호: 15, 서열번호: 16 및 서열번호: 17로 각각 표시되는 경쇄 CDR1, 경쇄 CDR2 및 경쇄 CDR3;
    (3) 서열번호: 20, 서열번호: 21 및 서열번호: 22로 각각 표시되는 중쇄 CDR1, 중쇄 CDR2 및 중쇄 CDR3, 및 서열번호: 23, 서열번호: 24 및 서열번호: 25로 각각 표시되는 경쇄 CDR1, 경쇄 CDR2 및 경쇄 CDR3;
    (4) 서열번호: 28, 서열번호: 29 및 서열번호: 30으로 각각 표시되는 중쇄 CDR1, 중쇄 CDR2 및 중쇄 CDR3, 및 서열번호: 31, 서열번호: 32 및 서열번호: 33으로 각각 표시되는 경쇄 CDR1, 경쇄 CDR2 및 경쇄 CDR3; 또는
    (5) 서열번호: 36, 서열번호: 37 및 서열번호: 38로 각각 표시되는 중쇄 CDR1, 중쇄 CDR2 및 중쇄 CDR3, 및 서열번호: 39, 서열번호: 40 및 서열번호: 41로 각각 표시되는 경쇄 CDR1, 경쇄 CDR2 및 경쇄 CDR3;
    을 포함하는 항GPC3 키메라 항체 또는 인간화 항GPC3 항체인, 제제.
  43. 제 40 항 내지 제 42 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 항GPC3 항체가 이하 중 어느 하나;
    (1) 서열번호: 44, 서열번호: 45, 서열번호: 46, 서열번호: 47, 서열번호: 48, 서열번호: 49 및 서열번호: 50으로 표시되는 중쇄 가변 영역의 군으로부터 선택되는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호: 51로 표시되는 경쇄 가변 영역;
    (2) 서열번호: 44, 서열번호: 45, 서열번호: 46, 서열번호: 47, 서열번호: 48, 서열번호: 49 및 서열번호: 50으로 표시되는 중쇄 가변 영역의 군으로부터 선택되는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호: 52, 서열번호: 53, 서열번호: 54, 서열번호: 55, 서열번호: 56, 서열번호: 57, 서열번호: 58, 서열번호: 59, 서열번호: 60, 서열번호: 61, 서열번호: 62, 서열번호: 63, 서열번호: 64, 서열번호: 65 및 서열번호: 66으로 표시되는 경쇄 가변 영역의 군으로부터 선택되는 경쇄 가변 영역;
    (3) 서열번호: 67로 표시되는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호: 68로 표시되는 경쇄 가변 영역;
    (4) 서열번호: 69로 표시되는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호: 70으로 표시되는 경쇄 가변 영역;
    (5) 서열번호: 71로 표시되는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호: 72로 표시되는 경쇄 가변 영역; 또는
    (6) 서열번호: 71로 표시되는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호: 73으로 표시되는 경쇄 가변 영역;
    을 포함하는 항체인, 제제.
  44. 제 40 항에 있어서,
    상기 GPC3 표적 치료제가 항GPC3 항체에 세포 상해성 물질이 결합된 항체인, 제제.
  45. GPC3 표적 치료제를 제 1 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 기재된 방법에 의해 결정되는 환자에게 투여하는 것에 의한, 암의 치료 방법.
KR1020167034321A 2014-05-08 2015-05-08 Gpc3 표적 치료제 요법이 유효한 환자에게 투여되는 gpc3 표적 치료제 KR102409014B1 (ko)

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