MX2014008009A

MX2014008009A - Anticuerpo anti-epirregulina humanizado, y agente terapeutico contra el cancer que comprende dicho anticuerpo como ingrediente activo.

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Publication number: MX2014008009A
Application number: MX2014008009A
Authority: MX
Inventors: Yoshinori Watanabe; Tomoyuki Igawa; Hirotake Shiraiwa; Taichi Kuramochi; Atsuhiko Maeda; Tatsuhiko Tachibana; Keiko Esaki; Shigero Tamba; Hiroyuki Tsunoda; Yasuko Kinoshita; Masami Suzuki; Atsuhiko Kato; Etsuko Takeiri; Eri Hashimoto
Original assignee: Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2011-12-28
Filing date: 2012-12-28
Publication date: 2014-11-14
Also published as: RU2634383C2; AU2012361510B9; CN104136610A; CA2862254A1; NZ627024A; US9556264B2; CL2014001730A1; EP2799543A4; MX350044B; PH12014501468A1; JPWO2013100120A1; US20150110793A1; UA115046C2; AU2012361510B8; KR20140107610A; SG10201508095UA; JP6010551B2; PE20141560A1; TW201335183A; TWI593705B

Abstract

Los presentes inventores tuvieron éxito en la producción de un anticuerpo antiepiregulina que exhibe una reactividad cruzada de las especies entre un animal no humano, mono cancrívoro, y un animal humano, de un anticuerpo antiepiregulina que raramente experimenta la descomposición química, de un anticuerpo antiepiregulina que tiene un punto isoeléctrico disminuido, de un anticuerpo antiepiregulina que tiene una elevada temperatura de punto medio de desnaturalización térmica y de un anticuerpo antiepiregulina que tiene una cantidad reducida de agregados, al sustituir correctamente un residuo de aminoácido en la secuencia por una región variable de un anticuerpo EP27 humanizado que puede exhibir una actividad citotóxica y una actividad de neutralización en una célula cancerosa expresadora de epiregulina antihumana (es decir, la célula cancerosa que exhibe a una epiregulina antihumana) de tal modo que inhiba la proliferación de la célula cancerosa.

Description

ANTICUERPO ANTI-EPIRREGULINA HUMANIZADO Y AGENTE TERAPÉUTICO CONTRA EL CÁNCER QUE COMPRENDE DICHO ANTICUERPO COMO INGREDIENTE ACTIVO Campo de la Invención La presente invención se refiere a métodos para tratar el cáncer, agentes para inhibir la proliferación de células cancerosas, y agentes antineoplásicos.

Antecedentes déla Invención El cáncer es la principal causa de mortalidad en los países industrializados. Muchos agentes quimioterapéuticos han sido desarrollados en los últimos 50 años con el propósito de tratar el cáncer. La mayoría de los agentes quimioterapéuticos se pueden clasificar en agentes alquilantes, antimetabolitos, antraciclinas, alcaloides de plantas, inhibidores de la topoisomerasa, y agentes antitumorales. Todos estos agentes farmacéuticos afectan la división celular o la síntesis de ADN y provocan efectos terapéuticos a través de un mecanismo que funciona de cierta manera.

La efectividad de un agente quimioterapéutico en particular es diferente entre los distintos tipos de cáncer o pacientes, o es diferente en función del curso temporal en pacientes individuales. Las células cancerosas expuestas a agentes quimioterapéuticos desarrollan resistencia a estos agentes quimioterapéuticos y, de manera similar, a menudo desarrollan resistencia cruzada a una pluralidad de otros agentes antineoplásicos. Además, para controlar los efectos secundarios resultantes del daño celular causado por estos agentes quimioterapéuticos en células normales - a través del mecanismo, antes mencionado, que usan estos agentes- es a menudo limitado la dosificación o el uso de los agentes.

En lugar de los agentes quimioterapéuticos convencionales, recientemente se han estado desarrollando fármacos molecularmente dirigidos que se dirigen a moléculas que se expresan específicamente en las células cancerígenas. Con la aparición de estos fármacos molecularmente dirigidos, se pueden evitar los efectos secundarios intrínsecos de los agentes quimioterapéuticos convencionales, y se están haciendo posibles tratamientos contra el cáncer que contribuyen a la calidad de vida (QOL por sus siglas en inglés) de los pacientes con cáncer. Tales fármacos molecularmente dirigidos incluyen agentes farmacéuticos de molécula pequeña, así como también agentes farmacéuticos de alto peso molecular, como anticuerpos. Los anticuerpos terapéuticos son moléculas que están inherentemente presentes en el cuerpo, y tienen la ventaja de tener baja toxicidad en organismos vivos, así como la ventaja de exhibir efectos terapéuticos al dañar específicamente las células objetivo por un mecanismo de acción distinto al mecanismo de acción de los agentes farmacéuticos de molécula pequeña, como la actividad citotóxica mediada por funciones efectoras. En consecuencia, muchos anticuerpos terapéuticos han sido puestos recientemente a disposición en el mercado.

Los anticuerpos terapéuticos dirigidos a Epirregulina, que está altamente expresada en el cáncer de colon, adenocarcinoma de pulmón, cáncer de páncreas, cáncer de estómago, y cáncer de riñón, han sido descritos como anticuerpos que dañan específicamente las células objetivo por un mecanismo de acción distinto al del mecanismo de los agentes farmacéuticos de molécula pequeña, como la actividad citotóxica mediada por tales funciones efectoras (Documento de Patente 1). Específicamente, la medición de la actividad de la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC por sus siglas en inglés) y de la actividad de la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC por sus siglas en inglés) de anticuerpos anti-Epirregulina describe que los anticuerpos anti-Epirregulina tienen actividad CDC y actividad ADCC en células que expresan Epirregulina. Además, se encontró que los anticuerpos anti-Epirregulina tenían efectos inhibitorios sobre la proliferación de líneas celulares de cáncer a través de una acción neutralizante. Además, a partir de los hallazgos mencionados anteriormente, los anticuerpos anti-Epirregulina se describieron como efectivos para el diagnóstico, prevención y tratamiento de varios cánceres primarios y metastásicos.

Cualquier nuevo agente farmacéutico candidato que incluye agentes antineoplásicos, como los descritos anteriormente, debe pasar pruebas estrictas para llegar a estar disponibles en el mercado. Por ejemplo, estos ensayos se clasifican en ensayos preclínicos y ensayos clínicos. En general, estos últimos se clasifican además en ensayos de fase I, fase II y fase III del ensayo, y se realiza en pacientes humanos, mientras que los estudios anteriores se realizaron usando animales. Generalmente, un objetivo de los estudios preclínicos es demostrar que el fármaco candidato es potente, así como efectivo y seguro. Específicamente, los objetivos de estos estudios en animales son demostrar que el agente farmacéutico no es cancerígeno, mutagénico o teratogénico, así como también el entender la farmacocinética del agente farmacéutico. Los estudios clínicos sobre administración de un agente farmacéutico de prueba a humanos sólo se permiten cuando la seguridad y eficacia del agente farmacéutico de prueba han sido establecidas en los estudios preclínicos en animales.

En muchos casos, la acción de un agente farmacéutico de molécula pequeña de prueba (por ejemplo, un agente antineoplásico novedoso derivado de antraciclina) en animales puede transformarse en un indicador de las acciones previstas del agente farmacéutico al ser administrado en humanos. Por lo tanto, en general, los datos obtenidos de estos estudios preclínicos pueden predecir en gran medida lo que ocurrirá cuando sean administrados a humanos. Sin embargo, tal predictibilidad no se obtiene para todos los tipos de agentes farmacéuticos de prueba; y la predictibilidad de los resultados de los estudios preclínicos, y la posibilidad de que los agentes farmacéuticos candidatos sean aprobados en estudios clínicos disminuye considerablemente.

Generalmente, los anticuerpos pueden funcionar a través del reconocimiento altamente específico de moléculas objetivo que son típicamente proteináceas. En la mayoría de los casos, los anticuerpos usados como agentes farmacéuticos de prueba son anticuerpos monoclonales, y sólo reconocen un solo sitio o un único epítopo en una molécula objetivo. Dado que los anticuerpos monoclonales tienen convencionalmente una elevada función de identificación de objetivo, los anticuerpos se han convertido en candidatos de gran interés para el desarrollo de agentes farmacéuticos, pero por otro lado, esta función de identificación hace que en algunos casos los estudios preclínicos sean difíciles. Esto se debe a que hay variaciones específicas de cada especie en las secuencias de las moléculas objetivo a las que se unen estos anticuerpos. Por ejemplo, un anticuerpo monoclonal que reconoce específicamente la molécula Y a través del epítopo X en humanos y se une a esta molécula será probado para el epítopo X' correspondiente en una molécula objetivo Y' (ortólogo) correspondiente en especies animales usadas para estudios preclínicos, pero X' puede ser diferente del X presente en la molécula objetivo correspondiente en humanos. Por lo tanto, muchas veces, el anticuerpo monoclonal puede no reconocer específicamente el ortólogo Y' y unirse a la molécula. Incluso entre grupos de anticuerpos monoclonales que tienen reactividad frente a antígenos humanos y primates, hay muchos ejemplos de anticuerpos que sólo reaccionan con antígenos homólogos de humanos y chimpancés. Por ejemplo, tales casos han sido observados en anticuerpos monoclonales anti-CD3. Uno de los anticuerpos monoclonales específicos para el complejo CD3 más usados y que tiene la mayor cantidad de propiedades determinadas es el OKT-3. El OKT-3 reacciona con CD3 de chimpancé, pero no reacciona con CD3 homólogos de otros primates como monos rhesus o CD3 canino (Documento No Patente 2). Por otro lado, hay ejemplos de anticuerpos monoclonales que reconocen antígenos de rhesus pero no sus ortólogos humanos. Un ejemplo de este grupo es FN-18, que es un anticuerpo monoclonal contra CD3 derivado de mono rhesus (Documento No Patente 2).

Varias estrategias han sido adoptadas para hacer frente a los problemas causados por la alta especificidad de estos anticuerpos monoclonales en los estudios preclínicos en animales.

El primero enfoque conocido es realizar estudios preclínicos en productos farmacéuticos de anticuerpos de prueba usando un modelo de chimpancé. Los chimpancés son el pariente genético más cercano a los humanos, y ya que su genoma tiene un 99% de identidad con el genoma humano, es altamente probable que las variaciones de la molécula objetivo a la que se une específicamente el producto farmacéutico de anticuerpo de prueba en chimpancés sean idénticas a las variaciones de esta molécula en humanos. De hecho, Schlereth et al., han descubierto que las variaciones en CD3 son comunes entre humanos y chimpancés (Documento No Patente 3). Por lo tanto, el riesgo de que esta molécula no sea reconocida por los productos farmacéuticos de anticuerpos de prueba en chimpancés se considera bajo. Sin embargo, los estudios que usan chimpancés son muy costosos, y también presentan problemas éticos. Además, dado que los chimpancés son animales en peligro de extinción y que el número de animales que se pueden usar en experimentos es muy limitado, tales estudios preclínicos con chimpancés están excluidos del desarrollo de la mayoría de los productos farmacéuticos de anticuerpos de prueba.

El segundo enfoque es el de la adaptación de la molécula usada en estudios preclínicos para el animal usado en los estudios. Con este enfoque se obtiene en los estudios preclínicos información esencial sobre seguridad mediante la construcción de un denominado anticuerpo "sustituto" para la administración en animales de prueba. Generalmente, tal anticuerpo sustituto es un anticuerpo que reconoce específicamente un ortólogo de la molécula objetivo al que se une el anticuerpo no sustituto (el anticuerpos farmacéutico de prueba real para humanos) en el animal prueba, y es un anticuerpo que ha sido modificado para unirse al ortólogo. Por lo tanto, en el enfoque que usa un anticuerpo "sustituto", uno debe desarrollar individualmente dos moléculas diferentes: el agente farmacéutico para ensayo clínico, y un agente farmacéutico para ensayo preclínico para ser usados en los estudios preclínicos en especies animales, que tiene la misma especificidad a objetivo que la correspondiente al agente farmacéutico clínico, y del cual se deben examinar seguridad y similares. La gran desventaja de un enfoque usando un sustituto es que el anticuerpo sustituto para los estudios preclínicos es un producto modificado del producto farmacéutico de anticuerpo para la prueba clínica. Por lo tanto, los datos obtenidos en los estudios preclínicos usando un anticuerpo sustituto pueden a veces no ser directamente aplicables a humanos. Por lo tanto, usando estos enfoques puede disminuir la predictibilidad de los resultados de los estudios clínicos sobre la base de los resultados del estudio preclínicos.

El enfoque antes mencionado se adapta al producto farmacéutico de anticuerpo de prueba de modo que sea apropiado para el animal usado en los estudios preclínicos. Por otro lado, otros enfoques conocidos adaptan los animales usados en los estudios preclínicos al agente farmacéutico candidato a ser administrado en humanos.

Un ejemplo de la adaptación de un animal de prueba a un productos farmacéuticos de anticuerpo de prueba destinado a la administración en humanos es la producción de un animal transgénico que expresa la molécula humana a la que se une específicamente el producto farmacéutico de anticuerpo de prueba en lugar de expresar la molécula no humana intrínseca a las especies de animales de prueba. En este método, se espera que el producto farmacéutico de anticuerpo de prueba administrado en estudios preclínicos se una a un antigeno humano en el animal de prueba transgénico. Por ejemplo, en un estudio realizado por Bugelski et al., la evaluación de seguridad preclínica se realizó para el anticuerpo monoclonal keliximab usando ratones transgénicos para CD4 humano para predecir el tratamiento a largo plazo de la artritis reumatoide en pacientes humanos. Keliximab es un anticuerpo monoclonal que tiene especificidad para CD4 de humanos y chimpancés. Bugelski et al., concluyeron que el uso de un ratón transgénico que expresa una proteína humana proporciona un método alternativo útil en estudios realizados en chimpancés que usan productos farmacéuticos biológicos que tienen una especificidad cruzada entre especies limitada. Sin embargo, la producción de animales transgénicos con fines de prueba es lenta y costosa, ya que requiere una gran cantidad de trabajo.

Documentos de la Técnica Anterior Documentos de Patentes Documento de Patente 1 WO2008/047723 Documento no Patente Documento no Patente 1 J. Med. Primatol. (1986) 15, 441- 451 Documento no Patente 2 J. Med. Primatol. (2001) 40, 141- 147 Documento no Patente 3 Cáncer Immunol. Immunother. (2005) 20, 1-12 Documento no Patente 4 Hum. Exp. Toxicol. (2000) 19, 230- 243 Breve Descripción de la Invención Problemas a Resolver por la Invención La presente invención se refiere a anticuerpos anti-Epirregulina que muestran reactividad cruzada entre animales no humanos y humanos. La presente invención se refiere además a anticuerpos anti-Epirregulina con degradación química suprimida. La presente invención también se refiere a anticuerpos anti-Epirregulina con punto isoeléctrico reducido. Además, la presente invención se refiere a anticuerpos anti-Epirregulina con cantidad de agregado reducida. Además, la presente invención se refiere a composiciones farmacéuticas o agentes terapéuticos para el cáncer que comprenden los anticuerpos anti-Epirregulina antes mencionados. La presente invención también se refiere a métodos para producir los anticuerpos anti-Epirregulina antes mencionados.

Medios para Resolver los Problemas Los presentes inventores descubrieron que la relación de la actividad de unión a Epirregulina aislada de mono cynomolgus a la actividad de unión Epirregulina humana aumenta mediante la sustitución de un residuo de aminoácido en la secuencia de la región variable de un anticuerpo EP27 humanizado, el cual inhibe el crecimiento de las células cancerosas al presentar actividad citotóxica y actividad neutralizante contra las células cancerosas que expresan Epirregulina humana, con un residuo de arginina. Más específicamente, los presentes inventores construyeron anticuerpos anti-Epirregulina que muestran reactividad cruzada entre humanos y monos cynomolgus, que son animales no humanos. Además, los anticuerpos anti-Epirregulina con degradación química suprimida fueron construidos sustituyendo apropiadamente residuos de aminoácidos en la secuencia de la región variable de un anticuerpo EP27 humanizado. Además, los anticuerpos anti-Epirregulina con punto isoeléctrico reducido fueron construidos sustituyendo apropiadamente residuos de aminoácidos en la secuencia de la región variable de un anticuerpo EP27 humanizado. Los anticuerpos anti-Epirregulina con cantidad de agregado reducida fueron construidos sustituyendo apropiadamente residuos de aminoácidos en la secuencia de la región variable de un anticuerpo EP27 humanizado. Los presentes inventores describieron que los anticuerpos anti-Epirregulina que tienen estas propiedades muestran efectos inhibidores del crecimiento al ejercer actividad citotóxica y actividad neutralizante sobre líneas celulares de cáncer. Además, a partir de los hallazgos anteriormente mencionados, los presentes inventores descubrieron que los anticuerpos anti-Epirregulina son efectivos en el tratamiento de varios cánceres primarios y metastásicos, y de este modo se completó la presente invención.

Más específicamente, la presente invención se refiere a lo siguiente: [1] un anticuerpo anti-Epirregulina que es un anticuerpo que se une a un epítopo al que está unido un anticuerpo anti-Epirregulina que comprende CDRs de región variable de cadena pesada de SEC ID Nos.: 9, 10, y 11 CDRs de región variable de cadena ligera de SEC ID No.: 12, 13, y 14, en donde el anticuerpo se caracteriza por tener una razón entre el valor KD de Epirregulina de mono de SEC ID No.: 170 (KD de cEREG) y el valor KD de la Epirregulina humana de SEC ID No.: 34 (KD de hEREG) (KD de cEREG/ KD de hEREG) más pequeña que la razón KD de cEREG/ KD de hEREG del anticuerpo anti-Epirregulina que comprende CDRs de región variable de cadena pesada de SEC ID Nos.: 9, 10, y 11 y CDRs de región variable de cadena ligera de la SEC ID No.: 12, 13, y 14; [2] el anticuerpo de [1], en donde KD de cEREG/ KD de hEREG es inferior a 40; [3] el anticuerpo de [1], en donde KD de cEREG/ KD de hEREG es inferior a 10; [4] el anticuerpo de [1], en donde KD de cEREG/ KD de hEREG es inferior a 6; [5] el anticuerpo de [1], en donde KD de cEREG/ KD de hEREG es inferior a 4; [6] el anticuerpo de cualquiera de [1] a [5], que comprende una región variable de cadena pesada que comprende una CDR1 de cadena pesada de SEC ID No.: 9, una CDR2 de cadena pesada seleccionada del grupo que consiste de SEC ID Nos.: 161, 160, 159, 157, 156, 155, 153,108,107, 106, 105, 104, 103, 102, 101, y 100, una CDR3 de cadena pesada seleccionada del grupo que consiste de SEC ID Nos.: 158, 154, 152, 151, 112, 111, 110, y 11; y una región variable de cadena ligera que comprende una CDR1 de cadena ligera seleccionada del grupo que consiste de SEC ID Nos.: 163, 68, 67, y 12, una CDR2 de cadena ligera seleccionada del grupo que consiste de SEC ID Nos.: 71, 69, y 13, y una CDR3 de cadena ligera seleccionada del grupo que consiste de SEC ID Nos.: 164, 48, 47, y 14; [7] el anticuerpo de cualquiera de [1] a [5], que comprende una región variable de cadena pesada seleccionada del grupo que consiste en SEC ID Nos.: 150, 149, 148, 147, 146, 145, 144, 143, 142, 140, 139, 138, 137, 135, 134, 133, 132, 131, 127, 126, 125, 124, 123, 122, 121, 120, 119, 118, 117, 116, y 115, y una región variable de cadena ligera seleccionada del grupo que consiste de SEC ID Nos.: 141, 136, 130, 129, 128, 99, 85, 84, 83, 82, 81, 80, 58, 57, y 29; [8] un anticuerpo anti-Epirregulina selecciona de uno cualquiera de los de abajo: (1) un anticuerpo anti-Epirregulina que comprende una región variable de cadena pesada seleccionada del grupo que consiste de SEC ID Nos.: 150, 149, 148, 147, 146, 145, 144, 143, 142, 140, 139, 138, 137, 135, 134, 133, 132, 131, 127, 126, 125, 124, 123, 122, 121, 120, 119, 118, 117, 116, 115, 98, 97, 96, 95, 94, 93, 92, 79, 78, 77, 76, 75, 74, 73, 72, 56, 55, 54, 53, 52, 51, 50, 49, y 38; (2) un anticuerpo anti-Epirregulina que comprende una región variable de cadena ligera seleccionada del grupo que consiste de SEC ID Nos.: 141, 136, 130, 129, 128, 99, 85, 84, 83, 82, 81, 80, 58, 57, y 29; y (3) un anticuerpo anti-Epirregulina que comprende una región variable de cadena pesada seleccionada del grupo que consiste de SEC ID Nos.: 150, 149, 148, 147, 146, 145, 144, 143, 142, 140, 139, 138, 137, 135, 134, 133, 132, 131, 127, 126, 125, 124, 123, 122, 121, 120, 119, 118, 117, 116, 115, 98, 97, 96, 95, 94, 93, 92, 79, 78, 77, 76, 75, 74, 73, 72, 56, 55, 54, 53, 52, 51, 50, 49, y 38, y una región variable de cadena ligera seleccionada del grupo que consiste de SEC ID Nos.: 141, 136, 130, 129, 128, 99, 85, 84, 83, 82, 81, 80, 58, 57, y 29; [9] el anticuerpo de cualquiera de [6] a [8], que comprende región constante de cadena pesada de SEC ID No.: 26; [10] el anticuerpo de cualquiera de [6] a [9], que comprende región constante de cadena ligera de SEC ID No.: 27; [11] el anticuerpo de cualquiera de [1] a [10], que tiene una actividad neutralizante; [12] el anticuerpo de cualquiera de [1] a [11], que tiene citotoxicidad; [13] el anticuerpo de [12], en donde la citotoxicidad es CDC y/o ADCC; [14] el anticuerpo de cualquiera de [1] a [12], en donde un inhibidor del crecimiento o una sustancia citotóxica está enlazado al anticuerpo; [15] el anticuerpo de [14], en donde el anticuerpo es un anticuerpo de bajo peso molecular; [16] el anticuerpo de cualquiera de [12] a [15], en donde la región constante de cadena pesada de SEC ID No.: 26 comprende al menos una sustitución de aminoácido en una posición seleccionada del grupo que consiste de 230, 240, 244, 245, 247, 262, 263, 266, 273, 275, 299, 302, 313, 323, 325, 328, y 332, como se indica de acuerdo con la numeración Estadounidense; [17] un vector que comprende un polinucleótido que codifica una región variable de cadena pesada que comprende una CDR1 de cadena pesada de SEC ID No.: 9, una CDR2 de cadena pesada seleccionada del grupo que consiste de SEC ID Nos.: 161, 160, 159, 157, 156, 155, 153, 108, 107, 106, 105, 104, 103, 102, 101, y 100, y una CDR3 de cadena pesada seleccionado del grupo que consiste de SEC ID Nos.: 158, 154, 152, 151, 112, 111, 110, y 11; [18] el vector de [17], que comprende un polinucleótido que codifica la región constante de cadena pesada de SEC ID No.: 26; [19] un vector que comprende un polinucleótido que codifica una región variable de cadena ligera que comprende una CDR1 de cadena ligera seleccionada del grupo que consiste de SEC ID Nos.: 163, 68, 67, y 12, una CDR2 de cadena ligera seleccionada entre el grupo que consiste de SEC ID Nos.: 71, 69, y 13, y una CDR3 de cadena ligera seleccionada del grupo que consiste de SEC ID Nos.: 164, 48, 47, y 14; [20] el vector de la reivindicación [19], que comprende un polinucleótido que codifica la región constante de cadena ligera de SEC ID No.: 27; [21] un vector que comprende: (1) un polinucleótido que codifica una región variable de cadena pesada que comprende una CDR1 de cadena pesada de SEC ID No.: 9, una CDR2 de cadena pesada seleccionada del grupo que consiste de SEC ID Nos.: 161, 160, 159, 157, 156, 155, 153, 108, 107, 106, 105, 104, 103, 102, 101, y 100, y una CDR3 de cadena pesada seleccionado del grupo que consiste de SEC ID Nos.: 158, 154, 152, 151 , 112, 111 , 110, y 11 ; y (2) un polinucleótido que codifica una región variable de cadena ligera que comprende una CDR1 de cadena ligera seleccionada del grupo que consiste de SEC ID Nos.: 163, 68, 67, y 12, una CDR2 de cadena ligera seleccionada del grupo que consiste de SEC ID Nos.: 71, 69, y 13, y una CDR3 de cadena ligera seleccionada del grupo que consiste de SEC ID Nos.: 164, 48, 47, y 14; [22] un vector que comprende: (1) un polinucleótido que codifica una región variable de cadena pesada que comprende una CDR1 de cadena pesada de SEC ID No.: 9, una CDR2 de cadena pesada seleccionada del grupo que consiste de SEC ID Nos.: 161, 160, 159, 157, 156, 155, 153, 108, 107, 106, 105, 104, 103, 102, 101, y 100, y una CDR3 de cadena pesada seleccionada del grupo que consiste de SEC ID Nos.: 158, 154, 152, 151, 112, 111, 110, y 11, y un polinucleótido que codifica la región constante de cadena pesada de SEC ID No.: 26; y (2) un polinucleótido que codifica una región variable de cadena ligera que comprende una CDR1 de cadena ligera seleccionada del grupo que consiste de SEC ID Nos.: 163, 68, 67, y 12, una CDR2 de cadena ligera seleccionada del grupo que consiste de SEC ID Nos.: 71, 69, y 13, y una CDR3 de cadena ligera seleccionada del grupo que consiste de SEC ID Nos.: 164, 48, 47, y 14, y un polinucleótido que codifica la región constante de cadena ligera de SEC ID No.: 27; [23] un vector que comprende el polinucleótido de [18] o [22], que comprende un nucleótido mutado que codifica una región constante de cadena pesada con al menos una sustitución de aminoácido en una posición seleccionada del grupo que consiste de 221, 222, 223, 224, 225, 227, 228, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 243, 244, 245, 246, 247, 249, 250, 251, 254, 255, 256, 258, 260, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 288, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 311, 313, 315, 317, 318, 320, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 339, 376, 377, 378, 379, 380, 382, 385, 392, 396, 421, 427, 428, 429, 434, 436, y 440 como se indica por la numeración Estadounidense en la región constante de cadena pesada de SEC ID No.: 26; [24] una célula huésped que comprende los vectores de [17] y [19], los vectores de [18] y [20], o el vector de [21] o [22]; [25] una célula huésped que comprende el vector de [23]; [26] la célula huésped de [25], en donde la capacidad de añadir fucosa a una cadena de azúcar en la célula huésped es baja; [27] la célula huésped de [26], en donde la célula huésped con una baja capacidad para añadir fucosa a una cadena de azúcar es una célula huésped deficiente en una o más proteínas funcionales seleccionadas del grupo que consiste de fucosiltransferasa, transportador de fucosa, GMD (GDP -manosa-4,6-deshidratasa), Fx(GDP GDP -ceto-6-desoximanosa-3,5-epimerasa, 4-reductasa), y GFPP (GDP-3-fucosa pirofosforilasa); [28] la célula huésped de [25], en donde la célula huésped tiene una capacidad para formar una estructura de N- acetilglucosamina bisectante en una cadena de azúcar; [29] la célula huésped de [28], en donde la célula huésped que tiene una capacidad para formar una estructura de N-acetilglucosamina bisectante en una cadena de azúcar es una célula huésped que tiene actividad ß(1 ,4)-galactosiltransferasa y comprende un vector que comprende un polinucleótido que codifica el dominio de localización funcional de Golgi de un polipéptido residente en Golgi; [30] la célula huésped de [29], que comprende un vector que comprende un polinucleótido que codifica un dominio de localización funcional de Golgi seleccionado del grupo que consiste del dominio de localización de la manosidasa II, el dominio de localización de ß(1 ,2)-/V-acetilglucosaminiltransferasa I, el dominio de localización de ß(1,2)-?/-acetilglucosaminiltransferasa II, el dominio de localización de manosidasa I, y el dominio de localización de core a1-6 fucosiltransferasa; y un polinucleótido que codifica un polipéptido de fusión que comprende el dominio catalítico de ß(1,4)-galactosiltransferasa; [31] la célula huésped de cualquiera de [24] a [30], en donde la célula huésped se selecciona del grupo que consiste de una célula CHO, una célula BHK, una célula NSO, una célula SP2/0, un célula de mieloma YO, una célula de mieloma de ratón P3X63, una célula PER, una célula PER.C6, una célula HEK293, y una célula de hibridoma; [32] a método para producir el anticuerpo de cualquiera de [1] a [16], que comprende recolectar la célula huésped de cualquiera de [24] a [31] desde una solución de cultivo; [33] un anticuerpo producido por el método de [32]; [34] el anticuerpo de [33], en donde un agente inhibidor del crecimiento o una sustancia citotóxica está enlazada al anticuerpo; [35] una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo de cualquiera de [1] a [16] o [33] o [34] como un ingrediente activo; [36] un agente terapéutico para el cáncer o un agente para suprimir la recurrencia o metástasis del cáncer, que comprende el anticuerpo de cualquiera de [1] o [16] o [33] o [34] como un ingrediente activo; [37] el agente terapéutico para el cáncer o el agente para suprimir la recurrencia o metástasis del cáncer de [36], en donde el cáncer es cualquier tipo de cáncer seleccionado del grupo que consiste de cáncer de colon, adenocarcinoma de pulmón, cáncer de páncreas, cáncer de estómago, y cáncer de riñón; [38] el agente terapéutico para el cáncer o el agente para suprimir la recurrencia o metástasis del cáncer de [37], en donde el cáncer de colon es un cáncer de colon pobremente diferenciado, un cáncer de colon moderadamente diferenciado, o un cáncer de colon bien diferenciado; y [39] el agente terapéutico para el cáncer o el agente para suprimir la recurrencia o metástasis del cáncer de cualquiera de [36] o [38], en donde un sujeto al que se le ha administrado el agente terapéutico para el cáncer es un sujeto que porta células cancerosas que expresan la proteína Epirregulina detectadas en una muestra de tejido aislada.

La presente invención también se refiere a métodos para suprimir la proliferación celular, métodos para prevenir o tratar el cáncer, y métodos para suprimir la recurrencia o metástasis del cáncer, los cuales comprenden la etapa de administrar a un sujeto un anticuerpo de la presente invención o un anticuerpo producido por un método de producción de la presente invención. Además, la presente invención se refiere a usos de un anticuerpo de la presente invención o de un anticuerpo producido por un método de producción de la presente invención en la producción de agentes para la inhibición de la proliferación celular, agentes para prevenir o tratar el cáncer, o agentes para suprimir la recurrencia o metástasis del cáncer. La presente invención también se refiere a anticuerpos de la presente invención o anticuerpos producidos por un método de producción de la presente invención para uso en la supresión de la proliferación celular, la prevención o el tratamiento del cáncer, o la supresión de la recurrencia o metástasis del cáncer. Además, la presente invención se refiere a métodos para la producción de agentes para la inhibición de la proliferación celular, agentes para prevenir o tratar el cáncer, o agentes para suprimir la recurrencia o metástasis del cáncer, que comprenden la etapa de usar un anticuerpo de la presente invención o un anticuerpo producido por un método de producción de la presente invención.

Breve Descripción de los Dibujos Figura 1 representa un gráfico que muestra la razón de afinidad a Epirregulina humana de cada uno de los anticuerpos (valor KD de cada anticuerpo/valor KD del anticuerpo EP27 quimérico). Mientras que la notación del nombre del anticuerpo se describe sólo por el nombre de la región variable, la Figura representa los resultados de las pruebas de anticuerpos que contienen las regiones constantes de la cadena ligera kappa y cadena pesada G1d.

Figura 2 representa un gráfico que muestra la razón de afinidad de cada uno de los anticuerpos (valor KD de Epirregulina de mono/valor KD de Epirregulina humana). Mientras que la notación del nombre del anticuerpo se describe sólo por el nombre de la región variable, la Figura representa los resultados de las pruebas de anticuerpos que contienen las regiones constantes de la cadena ligera kappa y cadena pesada G1d.

Figura 3 representa un gráfico que muestra la razón de afinidad a Epirregulina humana de cada uno de los anticuerpos (valor KD de cada anticuerpo/ valor KD del anticuerpo EP27 quimérico).

Figura 4 representa un gráfico que muestra la razón de afinidad de cada uno de los anticuerpos (valor KD de Epirregulina de mono/valor KD de Epirregulina humana).

Figura 5 representa un gráfico que muestra la actividad ADCC de cada uno de los anticuerpos (tasa de liberación específica de calceína AM).

Figura 6 representa un gráfico que muestra la actividad neutralizante de cada uno de los anticuerpos en términos de la tasa de inhibición de la proliferación de células BAF_EGFR dependiente de Epirregulina humana.

Figura 7 representa un gráfico que muestra la actividad neutralizante de cada uno de los anticuerpos en términos de la tasa de inhibición de la proliferación de células BAF_EGFR dependiente de Epirregulina de mono.

Figura 8 representa gráficos que muestran la actividad de cada uno de los anticuerpos para suprimir el crecimiento tumoral humano in vivo en términos de la actividad antitumoral en modelos de ratones trasplantados con células de cáncer humano.

Figura 9 es una imagen que muestra los patrones electroforéticos de Epirregulina humana (hsEREG-His) y Epirregulina de mono (cysEREG-His).

Figura 10 muestra los resultados de la tinción de fluorescencia de células que expresan, cada una, diferentes cantidades de la proteína Epirregulina, y tinción inmunohistoquímica de ratones trasplantados con estas células.

Figura 11 representa gráficos que muestran la actividad de ADCC contra células que expresan, cada una, diferentes cantidades de la proteína Epirregulina.

Figura 12 representa gráficos que muestran la actividad de inhibición de crecimiento de tumores humanos ¡n vivo en términos de la actividad antitumoral en modelos de ratones trasplantados con células que expresan, cada una, diferentes cantidades de la proteína Epirregulina.

Figura 13 presenta fotografías que muestran la expresión de Epirregulina en casos clínicos de cáncer de colon pobremente diferenciado.

Figura 14 es un diagrama que muestra la eficacia del fármaco del anticuerpo EP27 humanizado Glycomab, contra la tumorigénesis de células madre de cáncer de colon PLR123, que muestra la eficacia del fármaco contra la metástasis de cáncer de colon.

Figura 15 muestra la eficacia del fármaco del anticuerpo EP27 humanizado Glycomab, contra la metástasis pulmonar de células madre de cáncer de colon PLR123, que muestra la eficacia del fármaco contra la metástasis de cáncer de colon.

Figura 16 es un gráfico que muestra la eficacia del fármaco del anticuerpo EP27 humanizado Glycomab, contra el cáncer de colon pobremente diferenciado usando el modelo de cáncer de colon pobremente diferenciado COL-53-JCK.

Figura 17 es un gráfico que muestra la eficacia del fármaco del anticuerpo EP27 humanizado Glycomab, contra el cáncer de colon moderadamente diferenciado usando el modelo de cáncer de colon moderadamente diferenciado PLR379.

Figura 18 presenta fotografías que muestran la expresión de Epirregulina en casos clínicos de adenocarcinoma de pulmón.

Figura 19 es un gráfico que muestra la actividad ADCC (tasa de liberación específica de calceína AM) del anticuerpo EP27 humanizado Glycomab, contra la línea celular Calu-3de adenocarcinoma de pulmón humano.

Figura 20 es un gráfico que muestra la eficacia del fármaco del anticuerpo EP27 humanizado Glycomab, contra adenocarcinoma de pulmón usando el modelo de adenocarcinoma de pulmón Calu-3.

Figura 21 muestra que el conjugado anticuerpo-fármaco que comprende el anticuerpo EP27 humanizado Glycomab es internalizado en las células de la línea celular DLD-1 que expresan Epirregulina, y causan daño celular contra la línea celular DLD-1.

Modo de Realizar la Invención La presente invención se refiere a anticuerpos anti-Epirregulina que muestran reactividad cruzada entre especies de animales no humanos y humanos. La presente invención se refiere además a anticuerpos anti-Epirregulina con degradación química suprimida. La presente invención también se refiere a anticuerpos anti-Epirregulina punto isoeléctrico reducido. Además, la presente invención se refiere a anticuerpos anti-Epirregulina con cantidad de agregado reducida. Además, la presente invención se refiere a composiciones farmacéuticas o agentes terapéuticos para el cáncer que comprende los anticuerpos anti-Epirregulina antes mencionados. La presente invención también se refiere a métodos para producir los anticuerpos anti-Epirregulina antes mencionados.

A continuación, se proporcionan las definiciones y descripción detallada para ayudar a la comprensión de la presente invención ilustrada en el presente documento.

Definiciones Aminoácidos En el presente documento, los aminoácidos se describen con códigos de una o tres letras o ambos, por ejemplo, Ala/A, Leu/L, Arg/R, Lys/K, Asn/N, Met/M, Asp/D, Phe/F, Cys/C, Pro/P, Gln/Q, Ser/S, Glu/E, Thr/T, Gly/G, Trp/W, His/H, Tyr/Y, I le/1 , o Val/V. Los aminoácidos contenidos en las secuencias de aminoácidos de la presente invención puede ser modificados después de la traducción (por ejemplo, la modificación de una glutamina N-terminal en un ácido piroglutámico por piroglutamilación es bien conocida por los expertos en la técnica. Naturalmente, tales aminoácidos modificados después de la traducción están incluidos en las secuencias de aminoácidos en la presente invención.

Antígenos Los anticuerpos proporcionados por la presente invención se unen a Epirregulina como un antígeno. La Epirregulina es una proteína de unión a membrana del factor de crecimiento epidérmico. Su secuencia de aminoácidos se describe en el Número de Acceso GenBank NP_001423 (SEC ID No.: 167). En la presente invención, la definición de Epirregulina incluye tanto la proteína de longitud completa y fragmentos de la misma. "Fragmentos" se refiere a polipéptidos que comprenden alguna región de Epirregulina, y pueden no tener la función de la Epirregulina nativa. Un ejemplo de fragmentos incluye un fragmento que comprende la región extracelular de Epirregulina. Las posiciones 30 a 118 en la secuencia de aminoácidos de SEC ID No.: 167 corresponden a la región extracelular de la Epirregulina. Las posiciones 119 a 140 en la secuencia de aminoácidos de SEC ID No.: 167 corresponden a la región transmembrana. En el presente documento, la Epirregulina puede ser nombrada como EREG, ambos términos se usan como sinónimos.

"Epítopo" significa un determinante antigénico en un antígeno, y se refiere a un sitio del antígeno al se une que el dominio de unión a antígeno de un anticuerpo anti-Epirregulina descrito en el presente documento. Así, por ejemplo, el epítopo puede ser definido de acuerdo con su estructura. De manera alternativa, el epítopo se puede definir de acuerdo a la actividad de unión a antígeno de un anticuerpo anti-Epirregulina que reconoce el epítopo. Cuando el antígeno es un péptido o polipéptido, el epítopo puede ser especificado por los residuos de aminoácidos que forman el epítopo. De manera alternativa, cuando el epítopo es una cadena de azúcar, el epítopo puede ser especificado de acuerdo a la estructura específica de la cadena de azúcar.

Un epítopo lineal es un epítopo cuya secuencia primaria de aminoácidos es reconocida como un epítopo que consiste de un número de aminoácidos consecutivos en la secuencia primaria de aminoácidos. Un epítopo lineal de este tipo contiene típicamente al menos tres y más comúnmente al menos de cinco, por ejemplo, alrededor de 8 a 10 o de 6 a 20 aminoácidos en su secuencia específica.

En contraste con el epítopo lineal, el "epítopo conformacional" es un epítopo en donde la secuencia primaria de aminoácidos que contiene al epítopo no es el único factor determinante del epítopo reconocido (por ejemplo, la secuencia primaria de aminoácidos de un epítopo conformacional no es necesariamente reconocida por un anticuerpo definido por epítopo). Los epítopos conformacionales pueden contener un mayor número de aminoácidos en comparación con los epítopos lineales. Un anticuerpo que reconoce un epítopo conformacional reconoce la estructura tridimensional de un péptido o proteína. Por ejemplo, cuando una molécula de proteína se pliega y forma una estructura tridimensional, las cadenas principales de aminoácidos y/o polipéptido que forman un epítopo conformacional quedan alineadas, y el epítopo se hace reconocible para el anticuerpo. Los métodos para determinar las conformaciones de epltopos incluyen, por ejemplo, cristalografía de rayos X, resonancia magnética nuclear de dos dimensiones, marcado con sondas de espín, y resonancia paramagnética electrónica, pero no están limitados a los mismos. Véase, por ejemplo, Epitope apping Protocols en Methods in Molecular Biology (1996), Vol. 66, Morris (ed.).

Actividad de Unión A continuación se muestran los ejemplos de un método para confirmar la unión de un anticuerpo a Epirregulina, o más específicamente a un epítopo presente en la molécula de Epirregulina, pero el método no se limita a los siguientes métodos, y un experto en la técnica puede usar apropiadamente métodos conocidos para medir la actividad de unión a antígeno de un anticuerpo.

Por ejemplo, sí un anticuerpo anti-Epirregulina reconoce un epítopo lineal en la molécula de Epirregulina se puede confirmar por ejemplo como se menciona a continuación. Un péptido lineal que comprende una secuencia de aminoácidos que forman el dominio extracelular de Epirregulina es sintetizado con el propósito antes mencionado. El péptido se puede sintetizar químicamente, o se obtiene por técnicas de ingeniería genética usando una región que codifica la secuencia de aminoácidos correspondiente al dominio extracelular en un ADNc que codifica Epirregulina (ejemplos incluyen CR541887 (SEC ID No.: 169) como una secuencia de ADNc y NM_001432 como una secuencia de ARNm). Después, se evalúa n anticuerpo anti-Epirregulina para determinar su actividad de unión a un péptido lineal que comprende la secuencia de aminoácidos que forman el dominio extracelular. Por ejemplo, un péptido lineal inmovilizado se puede usar como un antígeno en ELISA para evaluar la actividad de unión del anticuerpo al péptido. De manera alternativa, se puede evaluar la actividad de unión a un péptido lineal basándose en el nivel al que el péptido lineal inhibe la unión del anticuerpo a las células que expresan Epirregulina. Estos ensayos pueden demostrar la actividad de unión del anticuerpo al péptido lineal.

Para determinar si un anticuerpo anti-Epirregulina reconoce un epitopo conformacional se puede realizar la siguiente evaluación. Células que expresan Epirregulina se preparan con el propósito antes mencionado. Se puede determinar que un anticuerpo anti-Epirregulina reconoce un epitopo conformacional cuando, tras el contacto, se une fuertemente a las células que expresan Epirregulina, pero no se une sustancialmente a un péptido lineal inmovilizado que comprende una secuencia de aminoácidos que forman el dominio extracelular de Epirregulina. En el presente documento, "se une sustancialmente" significa que la actividad de unión es del 80% o menos, en general 50% o menos, preferiblemente 30% o menos, y particularmente preferiblemente 15% o menos en comparación con la actividad de unión a células que expresan Epirregulina humana.

Los métodos para determinar mediante ensayos la actividad de unión de un anticuerpo anti-Epirregulina a las células que expresan Epirregulina incluyen, por ejemplo, los métodos descritos en Antibodies: A Laboratory Manual (Ed Harlow, David Lañe, Cold Spring Harbor Laboratory (1988) 359-420). Específicamente, la evaluación puede llevarse a cabo basándose en el principio de ELISA o clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS por sus siglas en inglés) usando como antígeno células que expresan Epirregulina.

En el formato ELISA, la actividad de unión de un anticuerpo anti-Epirregulina a las células que expresan Epirregulina se puede evaluar cuantitativamente mediante la comparación de los niveles de señal generados por la reacción enzimática. Específicamente, se añade un anticuerpo de prueba a una placa de ELISA en donde las células que expresan Epirregulina están inmovilizadas. Entonces, se detecta el anticuerpo de prueba unido a las células usando un anticuerpo marcado con enzima que reconoce el anticuerpo de prueba. De manera alternativa, cuando se usa FACS, se prepara una serie de diluciones de un anticuerpo de prueba, y el título de unión a anticuerpo de las células que expresan Epirregulina se puede determinar al comparar la actividad de unión del anticuerpo de prueba a las células que expresan Epirregulina.

La unión de un anticuerpo de prueba a un antígeno expresado en la superficie de células suspendidas en amortiguador o similar se puede detectar usando un citómetro de flujo. Citómetro de flujo conocido incluyen, por ejemplo, los siguientes dispositivos: FACSCanto™ II FACSAria™ FACSArray™ FACSVantage™ SE FACSCalibur™ (todos son nombres comerciales de BD Biosciences) EPICS ALTRA HyPerSort Cytomics FC 500 EPICS XL- CLADC EPICS XL ADC Cell Lab Quanta/Cell Lab Quanta SC (todos son nombres comerciales de Beckman Coulter).

Métodos preferentes para detectar mediante ensayo la actividad de unión de un anticuerpo anti-Epirregulina a Epirregulina incluyen, por ejemplo, el siguiente método. Primero, las células que expresan Epirregulina se hacen reaccionar con un anticuerpo de prueba, y después este se tiñe con un anticuerpo secundario marcado con FITC que reconoce el anticuerpo de prueba. El anticuerpo anti-Epirregulina de prueba se diluye apropiadamente con un amortiguador adecuado para preparar el anticuerpo a una concentración deseada. Por ejemplo, el anticuerpo se puede usar a una concentración dentro del intervalo de 10 Mg/ml a 10 ng/ml. Entonces, se determina la intensidad de fluorescencia y el recuento de células usando FACSCalibur (BD). La intensidad de la fluorescencia obtenida mediante el análisis usando el software CELL QUEST (BD), es decir, el valor de la Media Geométrica refleja la cantidad de anticuerpo unido a las células. Es decir, la actividad de unión de un anticuerpo de prueba, que es representada por la cantidad del anticuerpo de prueba unido, se puede determinar mediante la medición del valor de la Media Geométrica.

Para determinar si un anticuerpo anti-Epirregulina tiene un epítopo en común con otro anticuerpo la evaluación se puede llevar a cabo en base a la competencia entre las dos moléculas por el mismo epítopo. La competencia entre los anticuerpos se puede detectar mediante un ensayo de bloqueo cruzado de o similar. Por ejemplo, el ensayo ELISA competitivo es un ensayo de bloqueo cruzado preferido.

Específicamente, en el ensayo de bloqueo cruzado, la proteína Epirregulina inmovilizada en los pocilios de una placa de microtitulación se pre-incubó en presencia o ausencia de un anticuerpo competidor candidato, y después se añadió un anticuerpo de prueba al mismo. La cantidad de anticuerpo de prueba unido a la proteína Epirregulina en los pocilios se correlaciona indirectamente con la capacidad de unión de un anticuerpo competidor candidato que compite por la unión al mismo epítopo. Es decir, cuanto mayor es la afinidad del anticuerpo competidor para el mismo epítopo, menor es la actividad de unión del anticuerpo de prueba a los pocilios recubiertos de proteína Epirregulina.

La cantidad del anticuerpo de prueba unido a los pocilios a través de la proteína Epirregulina puede ser determinada fácilmente marcando el anticuerpo con antelación. Por ejemplo, un anticuerpo marcado con biotina se mide usando un conjugado de avidina/peroxidasa y un sustrato apropiado. En particular, el ensayo de bloqueo cruzado que usa marcadores enzimáticos como peroxidasa se llama "ensayo de ELISA competitivo". El anticuerpo también se puede marcar con otras sustancias de etiquetado que permiten la detección o medición. Específicamente, marcadores radiactivos, marcadores fluorescentes, y otros similares conocidos.

Cuando el anticuerpo competidor candidato puede bloquear la unión de un anticuerpo a Epirregulina en al menos 20%, preferentemente al menos 20 a 50%, y más preferentemente al menos 50% en comparación con la actividad de unión en un experimento de control llevado a cabo en ausencia de la anticuerpo competidor, se determina que el anticuerpo de prueba se une sustancialmente al mismo epítopo al que está unido el anticuerpo competidor, o compite por la unión al mismo epítopo.

Cuando la estructura de un epítopo al que se le une un anticuerpo anti-Epirregulina ya ha sido identificada, se puede determinar si los anticuerpos de prueba y de control comparten un epítopo común mediante la comparación de las actividades de unión de los dos anticuerpos a un péptido preparado mediante la introducción de mutaciones de aminoácidos en el péptido que forma el epítopo.

Para medir las actividades de unión antes mencionadas, por ejemplo, se comparan en el formato de ELISA ya mencionado, las actividades de unión de anticuerpos de prueba y de control a un péptido lineal en donde se ha introducido una mutación. Además de los métodos de ELISA, se puede determinar la actividad de unión al péptido mutante unido a una columna haciendo fluir anticuerpos de prueba y de control a lo largo de la columna, y después cuantificando el anticuerpo eluido en la solución de elución. Los métodos para la adsorción de un péptido mutante en una columna, por ejemplo, en la forma de un péptido de fusión GST, son conocidos.

De manera alternativa, cuando el epítopo identificado es un epítopo conformacional, se puede determinar si los anticuerpos de prueba y de control comparten un epítopo en común mediante el siguiente método. Primero, se preparan células que expresan Epirregulina y células que expresan Epirregulina con una mutación introducida en el epítopo. Se añaden los anticuerpos de prueba y de control a una suspensión celular preparada suspendiendo estas células en un amortiguador apropiado como PBS. Después, las suspensiones celulares se lavan apropiadamente con un amortiguador, y se añaden a ellas un anticuerpo marcado con FITC que reconoce los anticuerpos de prueba y de control. La intensidad de la fluorescencia y el número de células teñidas con el anticuerpo marcado se determinan usando FACSCalibur (BD). Los anticuerpos de prueba y control se diluyen apropiadamente usando un amortiguador adecuado, y se usan en concentraciones deseadas. Por ejemplo, se pueden usar a una concentración dentro del intervalo de 10 pg/ml a 10 ng/ml. La intensidad de fluorescencia se determinó mediante análisis usando el software CELL QUEST (BD), es decir, el valor de la Media Geométrica refleja la cantidad de anticuerpo marcado unido a las células. Es decir, las actividades de unión de los anticuerpos de prueba y de control, que están representadas por la cantidad de anticuerpo marcado unido, se pueden determinar midiendo el valor de la Media Geométrica.

En el método anterior, para determinar si un anticuerpo "no se une sustancialmente a las células que expresan Epirregulina mutante", por ejemplo, se puede usar el siguiente método. En primer lugar, los anticuerpos de prueba y control unidos a las células que expresan Epirregulina mutante son teñidos con un anticuerpo marcado. Después, se determina la intensidad de fluorescencia de las células. Cuando se usa FACSCalibur para la detección de fluorescencia por citometría de flujo, la intensidad de fluorescencia determinada puede ser analizada usando el software CELL QUEST. A partir de los valores de la Media Geométrica en presencia y ausencia del anticuerpo, el valor de comparación (AGeo-Mean) puede ser calculado de acuerdo con la siguiente fórmula (Fórmula 1) para determinar la relación de aumento en la intensidad de fluorescencia como resultado de la unión del anticuerpo.

Fórmula 1 AGeo-Mean = Geo-Mean (en presencia de anticuerpo)/Geo-Mean (en ausencia de anticuerpo) El valor de comparación de la Media Geométrica (valor AGeo-Mean de la molécula de Epirregulina mutante) determinado mediante el análisis anterior, el cual refleja la cantidad de un anticuerpo de prueba unido a las células que expresan la Epirregulina mutante, se compara con el valor de comparación AGeo-Mean que refleja la cantidad del anticuerpo de prueba unido a las células que expresan Epirregulina. En este caso, las concentraciones del anticuerpo de prueba usado para determinar los valores de comparación AGeo-Mean de las células que expresan Epirregulina y células que expresan Epirregulina mutante se ajustan preferentemente, de forma particular, para que sean iguales o sustancialmente iguales. Se usa como un anticuerpo de control un anticuerpo que se ha confirmado es capaz de reconocer un epitopo en Epirregulina.

Si el valor de comparación AGeo-Mean de un anticuerpo de prueba de las células que expresan la Epirregulina mutante es menor que el valor de comparación AGeo-Mean del anticuerpo de prueba de las células que expresan Epirregulina en al menos 80%, preferentemente 50%, más preferentemente 30%, y particularmente preferentemente 15%, entonces el anticuerpo de prueba "no se une sustancialmente a las células que expresan la Epirregulina mutante". La fórmula para determinar el valor Geo-Mean (Media Geométrica, del inglés Geometric Mean) se describe en la Guía del Usuario del software CELL QUEST (BD biosciences). Cuando la comparación muestra que los valores de comparación son sustancialmente equivalentes, se puede determinar que el epítopo de la prueba y los anticuerpos anti-Epirregulina de control son los mismos.

Anticuerpos En el presente documento, "anticuerpo" se refiere a una inmunoglobulina natural o una inmunoglobulina producida mediante síntesis completa o parcial. Los anticuerpos pueden ser aislados de fuentes naturales como plasma y suero de origen natural, o sobrenadantes de cultivo de hibridomas productores de anticuerpos. De manera alternativa, los anticuerpos pueden ser completa o parcialmente sintetizados usando técnicas como recombinación genética. Los anticuerpos preferidos incluyen, por ejemplo, los anticuerpos de un isotipo de una inmunoglobulina o subclase pertenecientes a la misma. Las inmunoglobulinas humanas conocidas incluyen anticuerpos de las nueve clases siguientes (isotipos): lgG1, lgG2, lgG3, lgG4, lgA1, lgA2, IgD, IgE, y Ig . De estos isotipos, los anticuerpos de la presente invención incluyen IgG 1 , lgG2, lgG3, y lgG4.

Los métodos para producir un anticuerpo con la actividad de unión deseada son conocidos para los expertos en la técnica. A continuación se muestra un ejemplo no limitante que describe un método para producir un anticuerpo que se une a Epirregulina (anticuerpo anti-Epirregulina).

Los anticuerpos anti-Epirregulina pueden ser obtenidos como anticuerpos policlonales o monoclonales usando métodos conocidos. Los anticuerpos anti-Epirregulina producidos son preferentemente anticuerpos monoclonales derivados de mamíferos. Tales anticuerpos monoclonales derivados de mamífero incluyen anticuerpos producidos por hibridomas o células huésped transformadas mediante técnicas de ingeniería genética con un vector de expresión que porta un gen de anticuerpo. Los "anticuerpos humanizados" o "anticuerpos quiméricos" se incluyen entre los anticuerpos monoclonales de la presente invención.

Los hibridomas productores de anticuerpos monoclonales se pueden producir usando técnicas conocidas, por ejemplo, como las que se describe a continuación. Específicamente, mamíferos se inmunizan mediante métodos de inmunización convencionales usando una proteína Epirregulina como un antígeno sensibilizante. Las células inmunes resultantes se fusionan con células parentales conocidas mediante métodos convencionales de fusión celular. Entonces, los hibridomas que producen un anticuerpo anti-Epirregulina pueden ser seleccionados mediante el cribado de células monoclonales productoras de un anticuerpo que se une a un epítopo en la molécula de Epirregulina usando métodos de cribado convencionales.

A continuación se menciona específicamente como se preparan anticuerpos monoclonales. En primer lugar, el gen de Epirregulina humana cuya secuencia de nucleótidos se describe en la SEC ID No.: 169 puede ser expresado para producir una proteína Epirregulina humana que se muestra en la SEC ID No.: 167, que será usado como un antígeno sensibilizante para la preparación de anticuerpos. Es decir, una secuencia génica que codifica Epirregulina humana se inserta en un vector de expresión conocido, y con este vector se transforman las células huésped adecuadas. La proteína Epirregulina humana deseada se purifica desde las células huésped mediante métodos conocidos. Con el fin de obtener Epirregulina humana soluble a partir de sobrenadantes de cultivo, por ejemplo, un polipéptido que comprende los aminoácidos en las posiciones 30 a 118 en la secuencia polipeptídica de Epirregulina humana de SEC ID No.: 167 o una proteína incluida en los aminoácidos en las posiciones 30 a 108 mostrada como SEC ID No.: 34. La proteína natural Epirregulina humana también se puede usar como un antígeno sensibilizante.

La proteína Epirregulina purificada se puede usar como un antígeno sensibilizante en la inmunización de mamíferos. También se puede usar como un antígeno sensibilizante un péptido parcial de Epirregulina. En este caso, se puede preparar un péptido parcial mediante síntesis química en base a la secuencia de aminoácidos de Epirregulina humana, o mediante la inserción de un gen de Epirregulina humana parcial en un vector de expresión para su expresión. De manera alternativa, se puede producir un péptido parcial mediante la degradación con una proteasa de una proteína Epirregulina humana. La longitud y la región del péptido parcial de Epirregulina humana no están limitadas a modalidades particulares. Una región preferida se puede seleccionar de forma arbitraria de la secuencia de aminoácidos en las posiciones de aminoácidos 30 a 118 o las posiciones 30 a 108 en la secuencia de aminoácidos de SEC ID No.: 167. El número de aminoácidos que forman un péptido a ser usado como un antígeno sensibilizante es preferentemente de al menos cinco o más, por ejemplo, seis o más, o siete o más. Más específicamente, se puede usar como un antígeno sensibilizante un péptido de 8 a 50 residuos, más preferentemente de 10 a 30 residuos.

Como antígeno sensibilizante, es posible usar de forma alternativa una proteína de fusión preparada mediante la fusión de un polipéptido parcial deseado o péptido de la proteína Epirregulina con un polipéptido diferente. Por ejemplo, fragmentos de anticuerpo Fe y etiquetas de péptidos son usados preferentemente para producir proteínas de fusión a ser usadas como antígenos sensibilizantes. Los vectores para la expresión de tales proteínas de fusión pueden ser construidos mediante la fusión en marco de los genes que codifica dos o más fragmentos de polipéptido deseados e insertando el gen de fusión en un vector de expresión como se describió anteriormente. Los métodos para producir proteínas de fusión se describen en Molecular Cloning 2a ed. (Sambrook, J et al., Molecular Cloning 2a ed., 9.47-9.58 (1989) Cold Spring Harbor Lab. Press). Métodos para preparar Epirregulina para ser usada como un antígeno sensibilizante, y métodos de inmunización que usan Epirregulina se describe específicamente en el documento WO 2008/047723, y similares.

No hay limitación particular con respecto a los mamíferos a inmunizar con el antígeno sensibilizante. Sin embargo, es preferible seleccionar los mamíferos teniendo en cuenta su compatibilidad con las células parentales a ser usadas para fusión celular. En general, se usan preferentemente roedores como ratones, ratas y hámsteres, conejos y monos.

Los animales antes mencionados son inmunizados con un antígeno sensibilizante mediante métodos conocidos. Los métodos de inmunización que se aplican generalmente incluyen, por ejemplo, inyección intraperitoneal o subcutánea de un antígeno sensibilizante en mamíferos. Específicamente, un antígeno sensibilizante se diluye apropiadamente con PBS (solución salina amortiguador con fosfato), solución salina fisiológica, o similares. Si se desea, se puede mezclar con el antígeno un adyuvante convencional como adyuvante completo de Freund, y la mezcla se emulsiona. Después, el antígeno sensibilizante se administra a un mamífero varias veces en intervalos de 4 a 21 días. Se pueden usar portadores apropiados en la inmunización con el antígeno sensibilizante. En particular, cuando se usa como el antígeno sensibilizante un péptido parcial de bajo peso molecular, a veces es deseable acoplar el péptido de antígeno sensibilizante a una proteína portadora, como albúmina o hemocianina de lapa ojo de cerradura, para la inmunización.

De manera alternativa, los hibridomas que producen un anticuerpo deseado pueden prepararse usando la inmunización con ADN como se menciona a continuación. La inmunización con ADN es un método de inmunización que confiere inmunoestimulación mediante la expresión de un antígeno sensibilizante en un animal inmunizado como resultado de la administración de un Vector de ADN construido para permitir la expresión de un gen que codifica la proteína antígena en el animal. En comparación con los métodos de inmunización convencionales en los que se administra una proteína antígena a los animales para ser inmunizados, se espera que la inmunización con ADN sea superior en que: - se puede proporcionar inmunoestimulación al tiempo que se conserva la estructura de una proteína de membrana como Epirregulina; y - no hay necesidad de purificar el antígeno para la inmunización.

Con el fin de preparar un anticuerpo monoclonal de la presente invención usando inmunización con ADN, en primer lugar, un ADN que expresa una proteína Epirregulina se administra a un animal a inmunizar. El ADN que codifica Epirregulina se puede sintetizar mediante métodos conocidos, como PCR. El ADN obtenido se inserta en un vector de expresión apropiado, y después éste se administra a un animal a ser inmunizado. Los vectores de expresión preferentemente usados incluyen, por ejemplo, vectores de expresión comercialmente disponibles como pcDNA3.1. Los vectores pueden ser administrados a un organismo usando métodos convencionales. Por ejemplo, la inmunización con ADN se lleva a cabo mediante el uso de una pistola de genes para introducir partículas de oro recubiertas con el vector de expresión en células en el cuerpo de un animal a inmunizar. Los anticuerpos que reconocen Epirregulina también se pueden producir por los métodos descritos en el documento WO 2003/104453.

Después de la inmunización de un mamífero como se describe anteriormente, se confirma en suero un aumento en el titulo de un anticuerpo de unión a Epirregulina. Después, se recolectan células inmunes del mamífero, y después se someten a fusión celular. En particular, se usan preferentemente esplenocitos como células inmunes.

Una célula de mieloma de mamífero es usada como una célula para ser fusionada con las células inmunes antes mencionadas. Las células de mieloma comprenden preferentemente un marcador de selección adecuado para el cribado. Un marcador de selección les confiere características a las células para su supervivencia (o muerte) bajo una condición de cultivo específica. Marcadores de selección conocidos son el de déficit de hipoxantina-guanina fosforribosiltransferasa (en adelante abreviado como déficit de HGPRT) y el déficit de timidina quinasa (en adelante abreviado como déficit de TK). Las células con déficit de HGPRT o TK tienen sensibilidad a hipoxantina-aminopterina-timidina (en adelante abreviada como sensibilidad a HAT). Las células sensibles a HAT no pueden sintetizar ADN en un medio de selección HAT, y por lo tanto mueren. Sin embargo, cuando las células se fusionan con las células normales, que pueden continuar la síntesis de ADN usando la ruta de rescate de las células normales, y por lo tanto pueden crecer incluso en el medio de selección HAT.

Las células deficientes en HGPRT y las células deficientes en TK se pueden seleccionar en un medio que contiene 6-tioguanina, 8-azaguanina (en adelante abreviada como 8AG), o 5'-bromodesoxiuridina, respectivamente. Las células normales mueren porque incorporan estos análogos de pirimidina en su ADN. Mientras tanto, las células que son deficientes en estas enzimas pueden sobrevivir en el medio de selección, ya que no pueden incorporar estos análogos de pirimidina. Además, un marcador de selección conocido como resistencia a G418, proporcionado por el gen resistente a la neomicina, confiere resistencia a los antibióticos 2-deoxiestreptamina (análogos de gentamicina). Se conocen diversos tipos de células de mieloma que son adecuadas para la fusión celular.

Por ejemplo, se pueden usar preferentemente células de mieloma que incluyen las siguientes células: P3(P3x63Ag8.653) (J. Immunol. (1979) 123 (4), 1548-1550); P3x63Ag8U.1 (Current Topics in Microbiology and Immunology (1978)81, 1-7); NS-1 (C. Eur. J. Immunol. (1976)6 (7), 511-519); MPC-11 (Cell (1976) 8 (3), 405-415); SP2/0 (Nature (1978) 276 (5685), 269-270); FO (J. Immunol. Methods (1980) 35 (1-2), 1-21); S194/5.XX0.BU.1 (J. Exp. Med. (1978) 148 (1), 313-323); R210 (Nature (1979) 277 (5692), 131-133), etc.

Las fusiones celulares entre los inmunocitos y células de mieloma se llevan esencialmente a cabo usando métodos conocidos, por ejemplo, un método de Kohler y MMstein et al. (Methods Enzymol. (1981) 73: 3-46).

Más específicamente, la fusión celular puede llevarse a cabo, por ejemplo, en un medio de cultivo convencional en presencia de un agente que promueva la fusión celular. Los agentes que promueven la fusión incluyen, por ejemplo, polietilenglicol (PEG) y virus Sendai (HVJ). Si es necesario para mejorar la eficacia de la fusión también se agrega una sustancia auxiliar, como sulfóxido de dimetilo.

La relación de células inmunes a células de mieloma puede ser determinada de acuerdo a la discreción personal, preferentemente, por ejemplo, una célula de mieloma por cada uno a diez inmunocitos. Los medios de cultivo a ser usados para la fusión celular incluyen, por ejemplo, medios que son apropiados para el crecimiento de líneas celulares de mieloma, como medio RPMI1640 y medio MEM, y otros medios de cultivo convencionales usados para este tipo de cultivo celular. Además, se pueden añadir preferentemente al medio de cultivo suplementos de suero como suero de ternera fetal (FCS).

Para la fusión celular, se mezclan bien en el medio de cultivo anterior cantidades predeterminadas de las células inmunes anteriores y células de mieloma. Después, se añade a la misma una solución de PEG (por ejemplo, el peso molecular promedio es aproximadamente 1,000 a 6,000) precalentada a aproximadamente 37°C a una concentración de generalmente 30% a 60% (p/v). Ésta se mezcla suavemente para producir células de fusión deseadas (hibridomas). Después, se añade gradualmente a las células un medio de cultivo apropiado, antes mencionado, y esta mezcla se centrifuga varias veces para eliminar el sobrenadante. De esta manera, pueden ser eliminados los agentes de fusión celular y agentes similares que son desfavorables para el crecimiento del hibridoma.

Los hibridomas así obtenidos pueden ser seleccionados mediante cultivo usando un medio selectivo convencional, por ejemplo, medio HAT (un medio de cultivo que contiene hipoxantina, aminopterina, y timidina). Las células distintas a los hibridomas deseados (células no fusionadas) pueden ser matadas mediante cultivo continuo en el medio HAT antes mencionado, el que se mantiene durante un período de tiempo suficiente. Típicamente, el período es de varios días a varias semanas. Después, los hibridomas que producen el anticuerpo deseado son cribados y clonados por separado por métodos de dilución limitante convencionales.

Los hibridomas así obtenidos pueden ser seleccionados usando un medio de selección basado en el marcador de selección que posee el mieloma usado para la fusión celular. Por ejemplo, las células deficientes en HGPRT o TK pueden ser seleccionadas mediante cultivo usando el medio HAT (un medio de cultivo que contiene hipoxantina, aminopterina, y timidina). Específicamente, cuando para la fusión celular se usan células de mieloma sensibles a HAT, las células fusionadas con éxito con células normales pueden proliferar selectivamente en el medio HAT. Las células distintas a los hibridomas deseados (células no fusionadas) pueden ser matadas mediante cultivo continuo en el medio HAT antes mencionado, el que se mantiene durante un período de tiempo suficiente. Específicamente, los hibridomas deseados se pueden seleccionar mediante cultivo, el que se mantiene durante, en general, varios días a varias semanas. Entonces, los hibridomas que producen el anticuerpo deseado son cribados y clonados por separado por métodos de dilución limitante convencionales.

Los anticuerpos deseados pueden ser preferentemente seleccionados y clonados por separado mediante métodos de cribado basados en reacciones antígeno/anticuerpo conocidas. Por ejemplo, un anticuerpo monoclonal de unión a Epirregulina puede unirse a la Epirregulina expresada en la superficie celular. Tal anticuerpo monoclonal puede ser cribado mediante clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS). La FACS es un sistema que evalúa la unión de un anticuerpo a la superficie celular mediante el análisis de células puestas en contacto con un anticuerpo fluorescente usando un haz láser, y la medición de la fluorescencia emitida desde las células individuales.

Para la detección de hibridomas que producen un anticuerpo monoclonal de la presente invención mediante FACS, primero se preparan las células que expresan Epirregulina. Las células preferentemente usadas para el cribado son células de mamífero en donde la Epirregulina se expresa de manera forzada. Como control, se puede detectar selectivamente la actividad de un anticuerpo al unirse a la Epirregulina de superficie celular, usando como células huésped células de mamífero no transformadas. Específicamente, los hibridomas que producen un anticuerpo monoclonal anti-Epirregulina se pueden aislar mediante la selección de hibridomas que producen un anticuerpo que se une a las células forzadas a expresar Epirregulina, pero no a las células huésped.

De manera alternativa, la actividad de un anticuerpo para unirse a células inmovilizadas que expresan Epirregulina se puede evaluar basándose en el principio de ELISA. Por ejemplo, se inmovilizan células que expresan Epirregulina en los pocilios de una placa de ELISA. Los sobrenadantes del cultivo de hibridomas se ponen en contacto con las células inmovilizadas en los pocilios, y se detectan los anticuerpos que se unen a las células inmovilizadas. Cuando los anticuerpos monoclonales se derivan de ratón, los anticuerpos unidos a las células se pueden detectar usando un anticuerpo anti-inmunoglobulina de ratón. Los hibridomas que producen un anticuerpo deseado que tiene la capacidad de unión a antígeno se seleccionan mediante el método de cribado anterior, y se pueden clonar mediante un método de dilución limitante o método similar.

Los hibridomas productores de anticuerpos monoclonales preparados de esta manera pueden ser traspasados a un medio de cultivo convencional, y almacenados en nitrógeno líquido durante un largo período.

Los hibridomas anteriores son cultivados mediante un método convencional, y los anticuerpos monoclonales deseados pueden ser preparados a partir de los sobrenadantes de los cultivos. De manera alternativa, los hibridomas son administrados a y cultivados en mamíferos compatibles, y los anticuerpos monoclonales son preparados a partir de las ascitis. El método anterior es adecuado para la preparación de anticuerpos con alta pureza.

Los anticuerpos codificados por genes de anticuerpos que son clonados a partir de células productoras de anticuerpos, como los hibridomas anteriores, también pueden ser usados preferentemente. Un gen de anticuerpo clonado es insertado en un vector apropiado, y este se introduce en un hospedero para expresar el anticuerpo codificado por el gen. Los métodos para aislar genes de anticuerpo, la inserción de genes en vectores, y la transformación de células huésped ya han sido establecidos, por ejemplo, por Vandamme et al. (Eur. J. Biochem. (1990) 192(3), 767-775). Los métodos para producir anticuerpos recombinantes también son conocidos como se describe a continuación.

Por ejemplo, un ADNc que codifica la región variable (región V) de un anticuerpo anti-Epirregulina fue preparado a partir de células de hibridoma que expresan el anticuerpo anti-Epirregulina. Con este propósito, el ARN total fue extraído primero desde hibridomas. Los métodos usados para la extracción de ARNm a partir de células incluyen, por ejemplo: el método de ultracentrifugación con guanidina (Biochemistry (1979) 18(24), 5294-5299), y - el método AGPC (Anal. Biochem. (1987) 162(1), 156-159) Los ARNm extraídos puede ser purificados usando el kit de purificación de ARNm mRNA Purification Kit (GE Healthcare Bioscience) o similares. De manera alternativa, los kits para la extracción de ARNm total directamente desde las células, como el kit de purificación de ARNm QuickPrep mRNA Purification Kit (GE Healthcare Bioscience), también están disponibles comercialmente. Los ARNm se pueden preparar desde hibridomas usando dichos kits. Los ADNc que codifican la región V del anticuerpo se pueden sintetizar desde los ARNm preparados usando una transcriptasa inversa. Los ADNc se pueden sintetizar usando el AMV Reverse Transcriptase First-strand cDNA Synthesis Kit (Seikagaku Co.) o similares. Además, se puede usar adecuadamente el kit de amplificación de ADNc SMART RACE cDNA amplificación kit (Clontech) y el método 5'-RACE basado en PCR (Proc. Nati. Acad. Sci. USA (1988) 85(23), 8998-9002; Nucleic Acids Res. (1989) 17(8), 2919-2932) para sintetizar y amplificar ADNc. En tal proceso de síntesis de ADNc, sitios de enzimas de restricción apropiados, que se describen a continuación, pueden ser introducidos en ambos extremos de un ADNc.

El fragmento de ADNc de interés se purifica a partir del producto de PCR resultante, y después éste es ligado a un Vector de ADN. De este modo se construye un vector recombinante, y se introduce en E. coli o un organismo similar. Después de la selección de colonias, el vector recombinante deseado se puede preparar a partir de E. coli formadora de colonias. Después, se prueba si el vector recombinante tiene la secuencia de nucleótidos del ADNc de interés mediante un método conocido como el método didesoxi de terminación de cadena de nucleótido.

El método 5'-RACE que usa cebadores para amplificar el gen de la región variable es convenientemente usado para aislar el gen que codifica la región variable. En primer lugar, una biblioteca de ADNc 5'-RACE se construye mediante síntesis de ADNc usando como una plantilla ARN extraídos de células de hibridoma. Un kit comercialmente disponible como el kit de amplificación SMART RACE cDNA amplificación kit se usa adecuadamente para sintetizar la biblioteca de ADNc 5'-RACE.

El gen del anticuerpo es amplificado mediante PCR usando como una plantilla la biblioteca de ADNc 5'-RACE preparada. Los cebadores para amplificar el gen de anticuerpo de ratón pueden ser diseñados sobre la base de secuencias génicas de anticuerpos conocidas. Las secuencias de nucleótidos de los cebadores varían dependiendo de la subclase de inmunoglobulina. Por lo tanto, es preferible que la subclase sea determinada de antemano usando un kit comercialmente disponible como el Iso Strip mouse monoclonal antibody isotyping kit (Roche Diagnostics).

Específicamente, por ejemplo, cebadores que permiten la amplificación de los genes que codifican las cadenas pesadas ?1, y2a, y2b, y ?3 y las cadenas ligeras ? y ? se usan para aislar los genes que codifican IgG de ratón. En general, se usa como cebador del lado 3' para amplificar un gen de la región variable de la IgG un cebador que híbrida con un sitio de la región constante cerca de la región variable. Mientras que, se usa un cebador unido a un kit de construcción de la biblioteca de ADNc 5 'RACE como un cebador del lado 5'.

Los productos de PCR así amplificados se usan para remodelar las inmunoglobulinas compuestas de una combinación de cadenas pesadas y ligeras. Se puede seleccionar un anticuerpo deseado usando la actividad de unión a Epirregulina de una inmunoglobulina remodelada como un indicador. Cuando el objetivo es aislar un anticuerpo contra Epirregulina, se prefiere que la unión del anticuerpo a Epirregulina sea específica. Se puede cribar un anticuerpo de unión a Epirregulina, por ejemplo, mediante las siguientes etapas: (1) poner en contacto una célula que expresa Epirregulina con un anticuerpo que comprende la región V codificada por un ADNc aislado a partir de un hibridoma; (2) detectar la unión del anticuerpo a la célula que expresa Epirregulina; y (3) seleccionar un anticuerpo que se une a la célula que expresa Epirregulina.

Se conocen métodos para la detección de la unión de un anticuerpo a las células que expresan Epirregulina. Específicamente, la unión de un anticuerpo a células que expresan Epirregulina puede ser detectada mediante las técnicas descritas anteriormente, como FACS. Muestras inmovilizadas de células que expresan Epirregulina se usan apropiadamente para evaluar la actividad de unión de un anticuerpo.

Los métodos de cribado de anticuerpos preferidos que usan la actividad de unión como un indicador también incluyen métodos de panning usando vectores fagos. Los métodos de cribado usando vectores fagos son ventajosos cuando los genes de anticuerpos son aislados desde bibliotecas de subclases de cadenas pesadas y cadenas ligeras a partir de una población celular que expresa anticuerpos policlonales. Los genes que codifican las regiones variables de cadena pesada y de cadena ligera pueden estar unidos por una secuencia enlazante apropiada para formar un Fv de cadena sencilla (scFv). Los fagos presentadores de scFv en su superficie pueden ser producidos mediante la inserción de un gen que codifica el scFv en un vector fago. Los fagos se ponen en contacto con un antígeno de interés. Después, puede ser aislado un ADN que codifica scFv que presenta la actividad de unión de interés mediante la recolección de los fagos unidos al antígeno. Este proceso se puede repetir de acuerdo con sea necesario para enriquecer en scFv que tiene la actividad de unión de interés.

Después del aislamiento del ADNc que codifica la región V del anticuerpo anti-Epirregulina de interés, el ADNc es digerido con enzimas de restricción que reconocen los sitios de restricción introducidos en ambos extremos del ADNc. Las enzimas de restricción preferidas reconocen y escinden una secuencia de nucleótidos que se produce en la secuencia de nucleótidos del gen del anticuerpo con baja frecuencia. Además, un sitio de restricción de una enzima que produce un extremo pegajoso se introduce preferentemente en un vector para insertar un fragmento digerido de una sola copia en la orientación correcta. El ADNc que codifica la región V del anticuerpo anti-IL-6R es digerido como se describe anteriormente, y éste es insertado en un vector de expresión apropiado para construir un vector de expresión del anticuerpo. En este caso, si un gen que codifica la región constante del anticuerpo (región C) y un gen que codifica la región V anterior se fusionan en marco, se obtiene un anticuerpo quimérico. En el presente documento, "anticuerpo quimérico" significa que el origen de la región constante es diferente al de la región variable. Es así como, además de los anticuerpos heteroquiméricos ratón/humano, se incluyen entre los anticuerpos quiméricos de la presente invención anticuerpos aloquiméricos humanos/humano. Un vector de expresión de anticuerpo quimérico puede ser construido mediante la inserción del gen de la región V anterior en un vector de expresión que ya tiene la región constante. Específicamente, por ejemplo, una secuencia de reconocimiento para una enzima de restricción que escinde el gen de la región V anterior puede ser colocada apropiadamente en el lado 5' de un vector de expresión que porta un ADN que codifica una región constante de anticuerpo deseado (región C). Un vector de expresión de anticuerpo quimérico se construye mediante la fusión en marco de los dos genes digeridos con la misma combinación de enzimas de restricción.

Para producir un anticuerpo monoclonal que se una a Epirregulina, se insertan genes de anticuerpos en un vector de expresión de manera que los genes sean expresados bajo el control de una región reguladora de la expresión. La región reguladora de la expresión para la expresión de anticuerpo incluye, por ejemplo, potenciadores y promotores. Además, se puede unir al extremo amino terminal una secuencia señal apropiada de forma que el anticuerpo expresado sea secretado hacia el exterior de las células. En los ejemplos descritos más adelante, un péptido que tiene la secuencia de aminoácidos MGWSCIILFLVATATGVHS (SEC ID No.: 168) se usa como una secuencia señal. Por otra parte, se pueden unir otras secuencias señales apropiadas. El polipéptido expresado es escindido en el extremo carboxilo de la secuencia anterior, y el polipéptido resultante es secretado al exterior de las células como un polipéptido maduro. Después, las células huésped apropiadas son transformadas con el vector de expresión, y se obtienen células recombinantes que expresan el ADN codificante del anticuerpo anti-Epirregulina.

Los ADN que codifican la cadena pesada (cadena H) y la cadena ligera (cadena L) del anticuerpo se insertan por separado en diferentes vectores de expresión para expresar el gen del anticuerpo. Una molécula de anticuerpo que tiene las cadenas H y L se puede expresar mediante la co-transfección de la misma célula huésped con vectores dentro de los cuales los genes de las cadena H y la cadena L han sido respectivamente insertados. De manera alternativa, las células huésped pueden ser transformadas con un vector de expresión único dentro del cual se insertan los ADN que codifican las cadenas H y L (ver WO 1994/011523).

Hay diversas combinaciones conocidas de vectores de expresión/célula huésped para la preparación de anticuerpos mediante la introducción de genes de anticuerpos aislados en huéspedes apropiados. Todos estos sistemas de expresión son aplicables al aislamiento de los dominios de unión a antígeno de la presente invención. Células eucariotas apropiadas usadas como células huésped incluyen células animales, células vegetales, y células fúngicas. Específicamente, las células animales incluyen, por ejemplo, las siguientes células s. (1) células de mamíferos: CHO, COS, mieloma, riñón de hámster recién nacido (BHK), HeLa, Vero, riñón embrionario humano (HEK) 293, o similares; (2) células de anfibio: oocitos de Xenopus, o similares; y (3) células de insecto: sf9, sf21, Tn5, o similares.

Además, en el caso de las células se conoce un sistema de expresión de genes de anticuerpos que usa células derivadas del género Nicotiana como Nicotiana tabacum. Células cultivadas de callus se pueden usar apropiadamente para transformar células vegetales.

Además, las siguientes células pueden usarse como células fúngicas: levaduras: las del género Saccharomyces como Saccharomyces Cerevisiae, y del género Pichia como Pichia pastoris ;y hongos filamentosos: los del género Aspergillus como Aspergillus niger.

Además, también se conocen sistemas de expresión de genes de anticuerpos que usan células procariotas. Por ejemplo, cuando en la presente invención se usan células bacterianas se pueden usar apropiadamente células de E. coli, células de Bacillus subtilis, y similares. Los vectores de expresión que llevan los genes de anticuerpo de interés se introducen en estas células mediante transfección. Las células transfectadas se cultivan in vitro, y el anticuerpo deseado se puede preparar a partir del cultivo de células transformadas.

Además de las células huésped descritas anteriormente, también se pueden usar animales transgénicos para producir un anticuerpo recombinante. Es decir, el anticuerpo se puede obtener de un animal en donde se ha introducido el gen que codifica el anticuerpo de interés. Por ejemplo, el gen de anticuerpo puede ser construido como un gen de fusión mediante la inserción en marco en un gen que codifica una proteína producida específicamente en la leche. Se puede usar como la proteína secretada en la leche, por ejemplo, ß-caseína de cabra o similares. Los fragmentos de ADN que contienen el gen fusionado insertado con el gen del anticuerpo se inyecta en un embrión de cabra, y después este embrión es introducido en una cabra hembra. Los anticuerpos deseados se pueden obtener como una proteína fusionada con la proteína de la leche de la leche producida por la cabra transgénica nacida de la cabra receptora del embrión (o progenie de la misma). Además, para aumentar el volumen de leche que contiene el anticuerpo deseado producido por la cabra transgénica, se pueden administrar a la cabra transgénica hormonas de acuerdo con sea necesario (Ebert, K. . et al., Bio/Technology (1994) 12 (7), 699-702).

Cuando un anticuerpo anti-Epirregulina descrito en el presente documento se administra al humano, se puede usar apropiadamente como el dominio de unión a antígeno del anticuerpo un dominio de unión a antígeno derivado de un anticuerpo genéticamente recombinante que ha sido modificado artificialmente para reducir la antigenicidad heteróloga contra humano y similares. Tales anticuerpos genéticamente recombinantes incluyen, por ejemplo, anticuerpos humanizados. Estos anticuerpos modificados apropiadamente producidos mediante métodos conocidos.

En el presente documento se describe una región variable de anticuerpo usada para producir el dominio de unión a antígeno de un anticuerpo anti-Epirregulina el que generalmente está formado por tres regiones determinantes de la complementariedad (CDRs) que están separadas por cuatro regiones marco (FRs). La CDR es una región que determina sustancialmente la especificidad de unión de un anticuerpo. Las secuencias de aminoácidos de las CDRs son muy diversas. Por otro lado, las secuencias de aminoácidos que forman las FR, a menudo presentan una alta identidad incluso entre los anticuerpos con diferentes especificidades de unión. Por lo tanto, en general, la especificidad de unión de un determinado anticuerpo puede ser introducida en otro anticuerpo mediante injerto de CDR.

Un anticuerpo humanizado también se denomina un anticuerpo humano remodelado. Específicamente, son conocidos los anticuerpos humanizados preparados mediante el injerto de la CDR de un anticuerpo animal no humano, como un anticuerpo de ratón, a un anticuerpo humano y similar. También son conocidas las técnicas comunes de ingeniería genética para la obtención de anticuerpos humanizados. Específicamente, por ejemplo, la PCR de extensión por solapamiento se conoce como un método que permite injertar una CDR de anticuerpo de ratón en una FR humana. En la PCR de extensión por solapamiento, una secuencia de nucleótidos que codifica una CDR de anticuerpo de ratón a ser injertada se añade a cebadores para la síntesis de una FR de anticuerpo humano. Se preparan cebadores para cada una de los cuatro FR. Se considera generalmente que cuando se realiza un injerto de CDR de ratón a una FR humana, es ventajoso para mantener la función de la CDR, el seleccionar una FR humana que tenga una alta identidad con una FR de ratón. Es decir, en general se prefiere usar una FR humana que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una alta identidad con la secuencia de aminoácidos de la FR adyacente a la CDR de ratón a ser injertada.

Las secuencias de nucleótidos a ser ligadas están diseñadas para que puedan ser conectadas entre sí en el marco. Las FR humanas se sintetizan individualmente usando los respectivos cebadores. Como resultado, se obtienen productos en los que se une el ADN que codifica para la CDR de ratón a los ADN que codifican FR individuales. Las secuencias de nucleótidos que codifican la CDR de ratón de cada producto están diseñadas para que se solapen entre sí. Entonces, se lleva a cabo la reacción de síntesis de la cadena complementaria para hibridar las regiones CDR que se solapan de los productos sintetizados usando un gen de anticuerpo humano como molde. Mediante esta reacción las FR humanas se ligan a través de las secuencias de CDR de ratón.

El gen de la región V de longitud completa, en el cual están finalmente ligados tres CDR y cuatro FR, es amplificado usando cebadores que se hibridan con su extremo 5' o extremo 3', que se añaden con secuencias de reconocimiento de enzimas de restricción apropiadas. Un vector de expresión para el anticuerpo humanizado puede ser producido insertando el ADN, obtenido como se describe anteriormente, y un ADN que codifica una región C de un anticuerpo humano en un vector de expresión para que se puedan ligar en el marco. Después de que el vector recombinante es transfectado en un huésped para establecer células recombinantes, las células recombinantes se cultivan, y el ADN que codifica el anticuerpo humanizado es expresado para producir el anticuerpo en el cultivo celular (ver, la Publicación de Patente Europea No. EP 239400 y la Publicación de Patente Internacional No. WO 1996/002576).

Al medir y evaluar cualitativamente o cuantitativamente la actividad de unión a antígeno del anticuerpo humanizado producido como se describió anteriormente, se puede seleccionar adecuadamente las FR de anticuerpo humano que permiten que las CDR formen un sitio de unión a antígeno favorable cuando se enlazan a través de las CDR. Los residuos de aminoácidos en las FR se pueden sustituir cuando sea necesario, de manera que las CDR de un anticuerpo humano remodelado formen un apropiado sitio de unión a antígeno. Por ejemplo, se pueden introducir mutaciones en la secuencia de aminoácidos en las FR aplicando el método de PCR usado para el injerto de una CDR de ratón en un FR humana. Más específicamente, se pueden introducir mutaciones de secuencias de nucleótidos parciales en los cebadores que hibridan a la FR. Las mutaciones en la secuencia de nucleótidos son introducidas en las FR sintetizadas usando tales cebadores. Las secuencias de FR mutante que tiene las características deseadas se pueden seleccionar mediante la medición y evaluación de la actividad de unión a antlgeno del anticuerpo mutante con sustituciones de aminoácidos mediante el método anteriormente mencionado (Cáncer Res. (1993) 53: 851-856).

De manera alternativa, los anticuerpos humanos deseados se pueden obtener mediante la inmunización de animales transgénicos que tiene todo el repertorio de genes del anticuerpo humano (ver el documento WO 1993/012227; WO 1992/003918; WO 1994/002602; WO 1994/025585; WO 1996/034096; WO 1996/033735) a través inmunización con ADN.

Además, también son conocidas las técnicas para preparar anticuerpos humanos mediante panning usando bibliotecas de anticuerpos humanos. Por ejemplo, la región V de un anticuerpo humano se expresa como un anticuerpo de cadena sencilla (scFv) en la superficie del fago mediante el método de presentación en fagos. Se pueden seleccionar los fagos que expresan un scFv que se une al antlgeno. La secuencia de ADN que codifica la región V del anticuerpo humano que se une al antlgeno puede determinarse mediante el análisis de los genes de los fagos seleccionados. Se determina la secuencia de ADN del scFv que se une al antígeno. Se prepara un vector de expresión mediante la fusión de la secuencia de la región V en marco con la secuencia de la región C de un anticuerpo humano deseado, y se inserta éste en un vector de expresión apropiado. El vector de expresión se introduce en las células apropiadas para la expresión, como las descritas anteriormente. El anticuerpo humano se puede producir mediante la expresión del gen codificante del anticuerpo humano en las células. Estos métodos son ya conocidos (ver WO 1992/001047; WO 1992/020791; WO 1993/006213; WO 1993/011236; WO 1993/019172; WO 1995/001438; WO 1995/015388).

Además de las técnicas descritas anteriormente, las técnicas de clonación de células B (identificación de cada secuencia codificante del anticuerpo, clonación y aislamiento; uso en la construcción de vector de expresión con el fin de preparar cada anticuerpo ( I g G 1 , lgG2, lgG3, o lgG4 en particular); y similares) como se describe en Bernasconi et al. (Science (2002) 298: 2199-2202) o en WO 2008/081008 se pueden usar de forma apropiada para aislar genes de anticuerpos.

Numeración EU v numeración de Kabat De acuerdo con los métodos usados en la presente invención, las posiciones de aminoácidos asignados a las ODR y FR de anticuerpo se especifican de acuerdo con la numeración de Kabat (Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institute of Health, Bethesda, Md., 1987 y 1991)). En el presente documento, los aminoácidos de las regiones variables de un anticuerpo anti-Epirregulina se indican de acuerdo con la numeración de Kabat, mientras que los aminoácidos de las regiones constantes indican de acuerdo con la numeración Estadounidense en base a las posiciones de aminoácidos de acuerdo con Kabat.

Alteración de Aminoácidos Con el fin de modificar aminoácidos en secuencias de aminoácidos de anticuerpos se pueden usar apropiadamente métodos conocidos, como mutagénesis sitio dirigida (Kunkel et al., (Proc. Nati. Acad. Sci. USA (1985) 82, 488-492)) y extensión de solapamiento por PCR. Además, también se pueden usar diversos métodos conocidos como métodos de alteración para sustituir aminoácidos con aminoácidos diferentes a los naturales (Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. (2006) 35, 225-249; Proc. Nati. Acad. Sci. U.S. A. (2003) 100 (11), 6353-6357). Por ejemplo, se puede apropiadamente usar un sistema de traducción libre de células (Clover Direct (Protein Express)) que contiene ARNt enlazados a un aminoácido no natural en ARNt supresores ámbar, que son complementarios al codón UAG (codón ámbar) que es un codón de parada.

Tal como se usa en el presente documento, cundo se describe la posición de alteración de un aminoácido, el significado de la expresión "y/o" incluye todas las combinaciones donde "y" y "o" se combinan apropiadamente. Específicamente, por ejemplo, "están sustituidos los aminoácidos en las posiciones 33, 55 y/o 96" incluye las siguientes variaciones de alteraciones de aminoácidos: aminoácidos en (a) la posición 33, (b) la posición 55, (c) la posición 96, (d) las posiciones 33 y 55, (e) las posiciones 33 y 96, (f) las posiciones 55 y 96, y (g) las posiciones 33, 55 y 96.

Reducción en la Inmunogenicidad Preferentemente, la inmunogenicidad predicha del anticuerpo de la presente invención en un huésped humano está reducida.

"Baja inmunogenicidad" significa que con un tiempo suficiente para conseguir eficacia terapéutica, un anticuerpo no induce una respuesta de anticuerpos en al menos la mayoría de los individuos que reciben una cantidad suficiente del anticuerpo lo que reduce la eficacia de la administración continuada del anticuerpo.

El nivel de inmunogenicidad en los humanos puede predecirse usando el programa de predicción de unión de MHC clase II Propred (http://www.imtech.res.in/raghava/propred) el que usa un análisis de valor umbral de 1% de todos los alelos. Otros programas que se pueden usar incluyen: - Rankpep (http://bio.dfci.harvard.edu/Tools/rankpep.html); y Epibase (software de propiedad de Algonomics: algonomics.com).

En comparación con la molécula donante de inicio, las moléculas con inmunogenicidad reducida no contienen o contienen un número reducido de péptidos predichos que se unen a los alelos MHC clase II que están altamente expresados en la población objetivo (Flower et al., Drug Discov. Today (2004) 9(2), 82-90).

Análisis funcional de unión al MHC clase II puede realizarse mediante la generación de péptidos solapantes correspondientes a la proteína de interés, y probar su capacidad para evocar la activación de células T (ensayo de proliferación celular de células T) o reemplazando un péptido de unión a MHC clase II conocido, el que es un péptido reportero (Hammer J et al., J. Exp. Med. (1994) 180, 2353-2358).

Se pueden usar varios métodos para reducir la inmunogenicidad de los anticuerpos anti-Epirregulina de la presente invención. El primer método es humanizar los anticuerpos antes mencionados. Más específicamente, las CDR de un anticuerpo anti-Epirregulina aislado de un animal no humano, como un ratón, se injertan en un anticuerpo humano. Para mantener o mejorar la unión a Epirregulina, el residuo de aminoácidos de las FR(s) puede estar adicionalmente sustituido de manera que las CDR de un anticuerpo anti-Epirregulina humanizado formen sitios de unión a antígeno apropiados.

Una modalidad no limitante de las CDR de un anticuerpo anti-Epirregulina aislado desde ratones de la presente invención incluye una CDR1 de cadena pesada (HCDR1) de SEC ID No.: 9, CDR2 de cadena pesada (HCDR2) de SEC ID No.: 10, y CDR3 de cadena pesada (HCDR3) de SEC ID No.: 11. Además, una modalidad no limitante de las CDR de un anticuerpo anti-Epirregulina aislado desde los ratones de la presente invención incluye una CDR1 de cadena ligera (LCDR1) de SEC ID No.: 12, CDR2 de cadena ligera (LCDR2) de SEC ID No.: 13, y CDR3 de cadena ligera (LCDR3) de SEC ID No.: 14.

Una modalidad no limitante de las FR de un anticuerpo humano de la presente invención incluye una FR1 de la cadena pesada (HFR1) de SEC ID No.: 1, FR2 de la cadena pesada (HFR2) de SEC ID No.: 2, FR3 de la cadena pesada (HFR3) de SEC ID No.: 3 y FR4 de la cadena pesada (HFR4) de SEC ID No.: 4. Además, una modalidad no limitante de las FR de un anticuerpo humano de la presente invención incluye una FR1 de cadena ligera (LFR1) de SEC ID No.: 5, FR2 de cadena ligera (LFR2) de SEC ID No.: 6, FR3 de cadena ligera (LFR3) de SEC ID No.: 7, y FR4 de cadena ligera (LFR4) de SEC ID No.: 8.

Una modalidad no limitante de la región variable de un anticuerpo anti-Epirregulina humanizado de la presente invención incluye la región variable de cadena pesada de SEC ID No.: 15. Además, una modalidad no limitante de la región variable de un anticuerpo anti-Epirregulina humanizado de la presente invención incluye la región variable de cadena ligera de SEC ID No.: 16.

Además, una modalidad no limitante de las FR de un anticuerpo humano de la presente invención incluye la FR1 de cadena pesada (HFR1) de SEC ID No.: 17, FR3 de cadena pesada de SEC ID No.: 18. Además, una modalidad no limitante de las FR de un anticuerpo humano de la presente invención incluye FR2 de cadena ligera (LFR2) de SEC ID No.: 20, FR3 de cadena ligera (LFR3) de SEC ID No.: 21, y FR3 de cadena ligera (LFR3) de SEC ID No.: 23.

Una modalidad no limitante de la región variable de un anticuerpo anti-Epirregulina humanizado de la presente invención incluye la región variable de cadena pesada de SEC ID No.: 19. Además, una modalidad no limitante de la región variable de un anticuerpo anti- Epirregulina anticuerpo de la presente invención incluye la región variable de cadena ligera de SEC ID No.: 22 o 24.

Además, una modalidad no limitante de las FR de un anticuerpo humanizado de la presente invención incluye la FR3 de cadena pesada (HFR3) de SEC ID No.: 35 y FR3 de cadena pesada (HFR3) de SEC ID No.: 36. Una modalidad no limitante de la región variable de un anticuerpo anti-Epirregulina humanizado de la presente invención incluye la región variable de cadena pesada de SEC ID No.: 37 o 38.

El segundo método es un método de diseño de una secuencia alterada con inmunogenicidad reducida mediante el análisis de una secuencia alterada con alteraciones de aminoácidos en la secuencia de aminoácidos de un anticuerpo anti-Epirregulina usando el programa de predicción de unión a MHC clase II antes mencionado. Ejemplos apropiados no limitantes de los sitios de alteración de aminoácidos para reducir la inmunogenicidad de los anticuerpos anti-Epirregulina de la presente invención incluyen la (las) posiciones de aminoácidos 87 y/o 101, indicadas de acuerdo con numeración de Kabat, en la secuencia de cadena pesada del anticuerpo anti-Epirregulina de SEC ID No.: 38. Además, los ejemplos no limitantes preferidos del sitio de alteración de aminoácidos para reducir la inmunogenicidad de los anticuerpos anti-Epirregulina incluyen el aminoácido en la posición 24, indicado de acuerdo con la numeración de Kabat, en la secuencia de cadena ligera del anticuerpo anti-Epirregulina de SEC ID No.: 29.

Un ejemplo preferido de una modalidad no limitante de la sustitución de aminoácidos antes mencionada incluye la sustitución de Ser (S) por el aminoácido en la posición 87 y/o la sustitución de Tyr(Y) o Phe(F) por el aminoácido en la position101, indicados de acuerdo con la numeración de Kabat, en la secuencia de cadena pesada del anticuerpo anti-Epirregulina de SEC ID No.: 38. Por otra parte, un ejemplo preferente de una modalidad no limitante de la sustitución de aminoácidos antes mencionada incluye la sustitución de Arg(R) por el aminoácido en la posición 24, indicado de acuerdo con la numeración de Kabat, en la secuencia de cadena ligera del anticuerpo anti-Epirregulina de SEC ID No.: 29.

El tercer método es un método para seleccionar apropiadamente una región constante de un alotipo de lgG1 seleccionado de entre el tipo G1m3 (una secuencia producida por la adición de GK al extremo C terminal de la secuencia de SEC ID No.: 31), G1m17, tipo 1 (SEC ID No.: 26), y el tipo G1m17 (una secuencia producida por la adición de GK en el extremo C terminal de la secuencia de SEC ID No.: 30), cuando se diseña un anticuerpo anti-Epirregulina que comprende una región constante de un anticuerpo lgG1. Se conoce que La compatibilidad entre el alotipo de la especie de animal humano al cual se administra el producto farmacéutico de anticuerpo y el alotipo de este producto farmacéutico de anticuerpo afecta las respuestas inmunes en las especies animales (Genes and Immunity (2011) 12, 213-221).

Una modalidad no limitante de una cadena pesada de un anticuerpo anti-Epirregulina humanizado de la presente invención con inmunogenicidad reducida incluye cadenas pesadas seleccionadas del grupo que consiste de SEC ID Nos.: 37, 38, 49-56, 72-79, 92-98, 115-127, 131-135, 137-140, y 142-150. Además, una modalidad no limitante de una cadena ligera de un anticuerpo anti-Epirregulina humanizado de la presente invención incluye cadenas ligeras seleccionadas del grupo que consiste de SEC ID No.: 29, 57, 58, 80-85, 99, 128-130, 136, y 141.

Una modalidad no limitante de un anticuerpo anti-Epirregulina humanizado de la presente invención con inmunogenicidad reducida incluye anticuerpos anti-Epirregulina humanizados que comprenden cadenas pesadas seleccionadas del grupo que consiste de SEC ID Nos.: 37, 38, 49-56, 72-79, 92-98, 115-127, 131-135, 137-140, y 142-150, y las cadenas ligeras seleccionados del grupo que consiste de SEC ID Nos.: 29, 57, 58, 80-85, 99, 128-130, 136, y 141.

La supresión de Desamidación. Isomerización. e Hidrólisis Se prefiere que la desamidación, isomerización, e hidrólisis estén suprimidas en los anticuerpos anti-Epirregulina de la presente invención.

Es muy importante cuando se considera el control de calidad y las influencias sobre la eficacia del fármaco y la inmunogenicidad el controlar la cantidad de agregado en una proteína farmacéutica (Curr. Opin. Biotechnol. (2009) 20 (6), 708-714). Generalmente, la formación de agregado se ve afectada tanto por la estabilidad coloidal resultante del ambiente de la solución de proteína como por la estabilidad conformacional que resulta de la estructura de la proteína (J. Pharm Sci. (2010) 100 (4), 1306-1315). Se pueden obtener condiciones efectivas para que se dé la estabilidad coloidal mediante la selección de la concentración de anticuerpo o pH, el tipo de solución amortiguador, fuerza iónica, aditivos, y similares, mediante el examen de la prescripción de una formulación de anticuerpo. Por otro lado, la estabilidad conformacional depende en parte de la secuencia de aminoácidos, y en el caso de los anticuerpos, se considera importante mantener estructuras características como la estructura canónica de las CDR, las secuencias de consenso de FR, y la interfaz VH/ VL y similares (Jung et al., J. Mol. Biol. (2001) 309 (3), 701-716; Xiang et al., J. Mol. Biol. (1995) 253 (3), 385-390; Ewert et al., Methods. (2004) 34 (2), 184-199; Vargas-Madrazo et al., J. Mol. Recognit. (2003) 16 (3) 113-120; y Morea et al., J. Mol. Biol. (1998) 275, 269-294).

La reacción de desamidación se refiere a las reacciones que tienen lugar de forma no enzimática en las cadenas laterales de asparagina y glutamina, y cambia las amidas en las cadenas laterales de glutamina y asparagina a ácidos carboxílicos. La isomerización resulta de la formación de una imida cíclica intermediaria inestable producida por la desamidación de la asparagina o la deshidratación de ácido aspártico, como resultado del ataque del grupo carbonilo presente en la cadena lateral de la asparagina o ácido aspártico por un par de electrones de nitrógeno en un residuo localizado en el extremo C terminal. Este intermediario es principalmente cambiado a ácido isoaspártico por escisión, y el resto se convierte en ácido aspártico. En el caso de la glutamina, la tasa de desamidación es generalmente un décimo que la de la asparagina, pero el mecanismo es esencialmente el mismo, y sólo necesita moléculas de agua para que progrese la reacción. Dado que estas reacciones de desamidación e isomerización que tienen lugar durante el almacenamiento de proteínas, como anticuerpos, se convierten en causas de la heterogeneidad anteriormente descrita, son convenientemente suprimidas en la medida de lo posible. Además, se ha informado que las reacciones de desamidación se producen fácilmente, especialmente en sitios en donde la asparagina y glicina son adyacentes entre sí (Asn-Gly) (Geiger et al., J. Biol. Chem. (1987) 262, 785-794). Además, se ha reportado que en el ácido aspártico que se produce la escisión de la cadena de péptido por la reacción de hidrólisis, y se dice que la hidrólisis se produce fácilmente en condiciones ácidas en particular en una secuencia donde la prolina está presente en el lado C-terminal (Asp-Pro) (Segalas er a/., FEBS Letters (1995) 371, 171-175).

Para suprimir la desamidación, isomerización, e hidrólisis, se pueden realizar, cuando sea apropiado, alteraciones de aminoácidos y similares para eliminar los residuos glutaminilo y asparaginilo que son sitios que experimentan desamidación. Una modalidad no limitante preferida de un sitio de desamidación cuya eliminación es particularmente efectiva incluye sitios donde se promueve la reacción de desamidación, o más específicamente residuo de glicina, residuo de asparagina, o residuo de glutamina en motivos indicados como las secuencias NG y QG. La sustitución de cualquiera de estos residuos de aminoácidos (N, Q, o G) puede suprimir notablemente las reacciones de desamidación (WO 2003/057881, WO 2005/067620, o similares). Además, también se pueden usar métodos para producir anticuerpos con reacción de desamidación suprimida mediante el control del método de cultivo de las células productoras de anticuerpos, cuando sea apropiado. Los anticuerpos anti-Epirregulina proporcionados por la presente invención también incluyen anticuerpos anti-Epirregulina a los que se ha aplicado la técnica anteriormente mencionada para suprimir la reacción de desamidación.

Los ejemplos no limitantes de sitios que experimentan desamidación incluyen preferentemente aminoácidos en la (las) posiciones 31, 52, 54, 56, y/o 101, indicados de acuerdo con la numeración de Kabat, de la secuencia de cadena pesada del anticuerpo anti-Epirregulina de SEC ID No.: 38. Además, los ejemplos no limitantes de sitios que experimentan desamidación incluyen preferentemente aminoácidos en las posiciones 28, 92, y/o 93, indicados de acuerdo con la numeración de Kabat, en la secuencia de cadena ligera del anticuerpo anti-Epirregulina de SEC ID No.: 29.

Una modalidad no limitante de la sustitución de aminoácidos antes mencionada incluye, preferentemente, la (las) sustitución(es) de Ala (A) por el aminoácido en la posición 31 y/o sustitución de Thr (T), Lys (K), Phe (F), Val (V), Arg (R), o Leu (L) por el aminoácido en la posición 55, indicados de acuerdo con la numeración de Kabat, en la secuencia de cadena pesada del anticuerpo anti-Epirregulina de SEC ID No.: 38. Además, una modalidad no limitante de la sustitución de aminoácidos antes mencionada incluye, preferentemente, las sustituciones de Glu (E) por el aminoácido en la posición 92 y/o Arg (R) o GIn (Q) por el aminoácido en la posición 93, indicados de acuerdo con la numeración de Kabat, en la secuencia de cadena ligera del anticuerpo anti-Epirregulina de SEC ID No.: 29.

Modalidad no limitante de una cadena pesada de un anticuerpo anti-Epirregulina humanizado de la presente invención con desamidación, isomerización, e hidrólisis suprimidas incluyen cadenas pesadas seleccionadas del grupo que consiste de SEC ID Nos.: 49-56, 98, 115-127, 131-135, 137-140, y 142-150. Además, modalidades de una cadena ligera de un anticuerpo anti-Epirregulina humanizado de la presente invención con desamidación, isomerización, e hidrólisis suprimidas incluyen cadenas ligeras seleccionadas del grupo que consiste de SEC ID Nos.: 57, 58, 128, y 141.

La modalidad no limitante de un anticuerpo anti-Epirregulina humanizado de la presente invención con desamidación, isomerización, e hidrólisis suprimidas incluyen anticuerpos humanizados anti-Epirregulina que comprenden cadenas pesadas seleccionadas del grupo que consiste de SEC ID Nos.: 49-56, 98, 115-127, 131-135, 137-140, y 142-150, y cadenas ligeras seleccionados del grupo que consiste de SEC ID Nos.: 57, 58, 128, y 141.

Modulación de punto isoeléctrico Preferentemente, los puntos isoeléctricos de los anticuerpos anti-Epirregulina de la presente invención son modulados.

Métodos de control de la carga de la superficie de una molécula de anticuerpo mediante la alteración de los residuos de aminoácidos expuestos en la superficie de la molécula de anticuerpo son conocidos como uno de los métodos para controlar la vida media de anticuerpos en plasma (WO 2007/114319 y WO 2009/041543). Específicamente, se conoce que la reducción del valor del punto isoeléctrico de un anticuerpo es capaz de prolongar la vida media plasmática del anticuerpo. Por el contrario, se ha demostrado que la elevación del punto isoeléctrico de un anticuerpo acorta su vida media en plasma, y mejora las propiedades de migración en tejido del anticuerpo (Vaisitti et al., J. Biol. Regul. Homeost. Agents. (2005) 19 (3-4), 105-112; Pardridge et al., J. Pharmacol. Exp. Ther. (1998) 286 (1), 548-554). Por otra parte, se conoce que el efecto antitumoral de un anticuerpo cuyo punto isoeléctrico ha sido reducido está aumentado en comparación con el del anticuerpo antes de la alteración (WO 2009/041062).

El pl de una proteína como, por ejemplo, un anticuerpo se define como el pH al cual el polipéptido tiene una carga efectiva. En este campo, típicamente, se conoce que la solubilidad de las proteínas es más baja cuando el pH de la solución es equivalente al punto isoeléctrico (pl) de la proteína. Por lo tanto, en base al pl se puede evaluar la solubilidad de la proteína a un pH dado, por ejemplo pH 6. El pl de una proteína es también un buen indicador de la viscosidad de una proteína en una preparación líquida. Un alto pl muestra alta solubilidad y baja viscosidad (lo cual es particularmente importante para una preparación altamente concentrada). En una modalidad no limitante de la presente invención, se seleccionan los dominios candidatos que tienen un pl superior a un umbral predeterminado. El pl del anticuerpo también juega un papel específico en la eficacia del fármaco y la distribución biológica del anticuerpo. Por ejemplo, cuando el pl del anticuerpo aumenta, se conoce que la localización en las células y/o fuera del contenedor aumenta. Se deben determinar las propiedades de pl más deseables de un anticuerpo en particular para lograr el objetivo deseado. En varias modalidades, se pueden obtener anticuerpos con un valor de pl de aproximadamente 5.0; 5.5; 6.0; 6.5; 7.0; 7.5; 8.0; 8.5; 9.0 o superior. En otra modalidad no limitante, se pueden seleccionar anticuerpos con un valor de pl de aproximadamente 9.0; 8.5; 8.0; 7.5; 7.0; 6.5; 6.0; 5.5; 5.0 o inferior. Un experto en la técnica entenderá que una sola proteína puede tener una pluralidad de formas cargadas. Sin querer verse restringido a una teoría en particular, la carga de una proteína puede ser modulada por una serie de diferentes mecanismos de acción; y sin limitación, los ejemplos de tales mecanismos incluyen la sustitución de aminoácidos, formación de cationes, desaminación, heterogeneidad de aminoácido carboxi-terminal, fosforilación, glicosilación, y similares. El pl como se usa en el presente documento se define como el pl de la forma cargada principal.

Un pl de proteína se puede determinar mediante diversos métodos, y sin limitación, una modalidad no limitante de tales métodos incluye el isoelectroenfoque, y varios algoritmos informáticos (ver, por ejemplo, Bjellqvist et al., Electrophoresis (1993) 14, 1023). En una modalidad no limitante, el pl se determina usando un sistema de electroforesis Pharmacia Biotech Multiphor 2 equipado con una unidad baño de enfriamiento con recirculación a múltiples temperaturas multi-temp III y una fuente de alimentación EPS 3501 XL. Un gel prefabricado (Pre-cast Ampholine Gel, Amersham Biosciences, intervalo pl: 2.5 a 10) es cargado junto con 5 mg de la proteina. El pl relativo de un anticuerpo se determina usando un estándar marcador de pl de amplio intervalo (Amersham, intervalo pl: 3-10, 8 µ?_). La electroforesis se lleva a cabo bajo condiciones de 1.500 V y 50 itiA durante 105 minutos. A continuación, el gel se fija mediante una solución fijación de Sigma (5x) diluida a 1x con agua purificada. El gel se tiñe usando Simply Blue Stain (Invitrogen) durante toda la noche a temperatura ambiente. Después el gel es desteñido usando una solución que consiste en etanol al 25%, ácido acético al 8% y agua purificada al 67%. El punto isoeléctrico se determina en base a una curva de calibración estándar usando un densitómetro Bio-Rad.

Para modular el punto isoeléctrico de un anticuerpo anti-Epirregulina de la presente invención, se llevan a cabo, cuándo es apropiado, alteraciones de aminoácidos y similares que involucran la eliminación de aminoácidos cargados en la secuencia de aminoácidos de un anticuerpo anti-Epirregulina, o la adición o inserción de aminoácidos cargados en la secuencia de aminoácidos de un anticuerpo anti-Epirregulina. Se conoce que entre los aminoácidos están presentes aminoácidos cargados. En general, se conoce que la Usina (K), arginina (R), e histidina (H) son aminoácidos que tienen una carga positiva (aminoácidos cargados positivamente). Se conoce que el ácido aspártico (D), ácido glutámico (E), y similares tienen una carga negativa (aminoácidos cargados negativamente). Se conoce que el resto de los aminoácidos son aminoácidos no cargados.

El "residuo de aminoácido alterado" antes mencionado es preferentemente un residuo de aminoácido apropiadamente seleccionado de entre aminoácidos en cualquiera del grupo (a) o grupo (b), que son sometidos a adición, inserción, o eliminación, pero no están particularmente limitados a estos aminoácidos. (a) ácido glutámico (E), ácido aspártico (D) (b) sina (K), arginina (R), histidina (H) Cuando el residuo de aminoácido original (antes de la alteración) ya está cargado, el alterarlo a un residuo de aminoácido no cargado es también una modalidad preferida de la presente invención. Más específicamente, las alteraciones en la presente invención incluyen (1) sustituir de un aminoácido cargado con un aminoácido no cargado, (2) sustituir un aminoácido cargado con un aminoácido con carga opuesta en comparación con el aminoácido original, y (3) sustituir un aminoácido no cargado con un aminoácido cargado.

Ejemplos no limitantes de posiciones en las que los aminoácidos son alterados para modular el punto isoeléctrico de un anticuerpo anti-Epirregulina de la presente invención incluyen preferentemente aminoácidos en la (las) posiciones 13, 61, 62, 64, 65, 97, y/o 98, indicadas de acuerdo con numeración de Kabat, en la secuencia de cadena pesada del anticuerpo anti-Epirregulina de SEC ID No.: 38. Además, los ejemplos no limitantes de posiciones en las que los aminoácidos están alterados para modular el punto isoeléctrico de un anticuerpo anti-Epirregulina incluyen preferentemente aminoácidos en la (las) posiciones 24, 55, 56, y/o 107, indicadas de acuerdo con numeración de Kabat, en la secuencia de cadena ligera del anticuerpo anti-Epirregulina de SEC ID No.: 29.

Una modalidad no limitante de la (las) sustitución(es) de aminoácidos antes mencionada(s) incluye, preferentemente, la (las) sustitución(es) de Asn (N) o Lys (K) para el aminoácido en la posición 14, la sustitución de Asp (D) o Glu (E) para el aminoácido en la posición 61, la sustitución de Ser (S) o Gln (Q) para el aminoácido en la posición 62, la sustitución de Asp (D) o Glu (E) para el aminoácido en la posición 64, la sustitución de Asp (D) o Glu (E) para el aminoácido en la posición 65, la sustitución de Arg (R) para el aminoácido en la posición 97 y/o la sustitución de Glu (E) para el aminoácido en la posición 98, indicados de acuerdo con la numeración de Kabat, en la secuencia de cadena pesada del anticuerpo anti-Epirregulina de SEC ID No.: 38. Además, una modalidad no limitante de las sustituciones de aminoácidos antes mencionadas incluye, preferentemente, las sustituciones de Gln (Q) o Ser (S) para el aminoácido en la posición 24, la sustitución de Glu (E) f para el aminoácido en la posición 55, la sustitución de Glu (E) para el aminoácido en la posición 56, y/o la sustitución de Glu (E) para el aminoácido en la posición 106a, indicadas de acuerdo con numeración de Kabat, en la secuencia de cadena ligera del anticuerpo anti-Epirregulina de SEC ID No.: 29.

Una modalidad no limitante de una cadena pesada de un anticuerpo anti-Epirregulina de la presente invención con punto isoeléctrico modulado incluye cadenas pesadas seleccionadas del grupo que consiste de SEC ID Nos.: 72-79, 98, 115-127, 131-135, 137-140, y 142-150. Además, una modalidad no limitante de una cadena ligera de un anticuerpo anti-Epirregulina humanizado de la presente invención con punto isoeléctrico modulado incluye cadenas ligeras seleccionadas del grupo que consiste de SEC ID Nos.: 80-85, y 99.

Una modalidad no limitante de un anticuerpo anti-Epirregulina de la presente invención con punto isoeléctrico modulado incluye anticuerpos anti-Epirregulina que comprenden cadenas pesadas seleccionadas del grupo que consiste de SEC ID Nos.: 72-79, 98, 115-127, 131-135, 137-140, y 142-150 y cadenas ligeras seleccionadas del grupo que consiste de SEC ID Nos.: 80-85, y 99.

Mejora de la estabilidad Preferentemente, la estabilidad de los anticuerpos anti-Epirregulina de la presente invención está mejorada. Uno o más parámetros que describen la estabilidad de un anticuerpo incluyen el valor de la temperatura de fusión térmica (Tm) de un dominio. El valor de Tm de un anticuerpo es un excelente indicador de la estabilidad térmica del anticuerpo, y también puede ser un indicador de período de almacenamiento del anticuerpo. Un valor más bajo de Tm indica formación de agregado/menor estabilidad, mientras que un valor más alto de Tm indica la no formación de agregado /alta estabilidad. Por lo tanto, se prefiere que se proporcionen anticuerpos con altos valores de Tm. En una modalidad no limitante de la presente invención, se seleccionan anticuerpos con valores más altos de Tm que el umbral predeterminado. En algunas modalidad, se seleccionan anticuerpos que tienen un valor de Tm de al menos 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, o 100°C o mayores.

La temperatura de fusión térmica (Tm) de un anticuerpo se puede medir por diversos métodos estándares bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, Vermeer et al., estudiaron el desplegamiento y desnaturalización térmica de un anticuerpo monoclonal anti-lgG de rata de ratón de isotipo 2b por calorimetría diferencial de barrido (DSC) y espectroscopia de dicroísmo circular (CD) (Biophys. J. (2000) 78, 394-404; Colloids Surfaces A: Physicochem. Eng. Aspects. (2000) 161, 139-150; J. Colloid Interface Sci. (2000) 225, 394-397; y 2000, Biophys. J. (2000) 79, 2150-2154). Como resultado, se considera que el plegamiento y desplegamiento de la IgG se pueden caracterizar por dos transiciones principales que son en si mismas superposición de varios pasos. La distribución bimodal observado tanto en los experimentos de CAD como de CD no dependía de la velocidad de barrido en los experimentos. Las dos transiciones parecían ser independientes, y el desplegamiento fue irreversible. La estructura secundaria, así como la estabilidad termodinámica de Fab y Fe, los cuales fueron digeridos desde la IgG, fueron comparados con las de la inmunoglobulina intacta (Vermeer et al., Biophys. J. (2000) 79, 2150-2154). Se demostró que los dos picos observados para la IgG intacta se podían asignar al fragmento Fab y al fragmento Fe, respectivamente. Vermeer et al. también mostraron que, además de la inducción por calor, la perturbación estructural de la IgG en general también podía ser provocada por cambio del pH (Biophys. J. (2000) 78, 394-404) o por interacción con un medioambiente hidrofóbico, por ejemplo, adsorción sobre superficies de teflón o interacción con agentes tensioactivos (Vermeer et al., 1998, Biochim. Biophys. Acta. (1988) 1425, 1-12; Colloids Surfaces A: Physicochem. Eng. Aspects. (2000) 161, 139-150; J. Colloid Interface Sci. 225 (2000) 394-397).

En una modalidad no limitante de la presente invención, la Tm de un anticuerpo se mide usando una muestra que contiene anticuerpos aislados. En una modalidad, la Tm de un anticuerpo se mide usando un VP-DSC (MicroCal, LLC) en condiciones de una velocidad de barrido de 1.0°C/minuto y un intervalo de temperatura de 25 a 120°C. Se puede usar un período de filtrado de ocho segundos junto con un termostato de barrido previo de cinco minutos. En un ejemplo específico, se prepararon muestras mediante diálisis en histidina-HCI 25 mM usando tazas de diálisis Pierce (3.5 kD). La concentración promedio de anticuerpos es 50 pg/ml determinada por absorción a 280 nm. Las temperaturas de fusión se determinan siguiendo los procedimientos del fabricante, usando el software Origin suministrado junto con el sistema. En breve, se cargan varias líneas de base con amortiguador tanto en las celdas de muestra como de referencia para establecer el equilibrio térmico. Después de que la línea de base es restada del termograma de la muestra, los datos de concentración son normalizados y ajustados usando la función de desconvolución. En otra modalidad, la estabilidad de los anticuerpos se evaluó usando un método que se describe a continuación. Uno o más indicadores pueden incluir además indicadores que caracterizan la estabilidad de los anticuerpos de acuerdo con una o más condiciones diferentes seleccionadas del grupo que consiste de diferentes valores de pH, diferentes temperaturas, diferentes tensiones de cizallamiento, y diferentes ciclos de congelación/descongelación.

En una modalidad no limitante de la presente invención, las mediciones de DSC se pueden realizar usando el Setaram Micro-DSC III (Setaram, Caluire, France). Las muestras fueron colocadas en el calorímetro en una celda de muestra de 1 mi contra una celda de referencia de 1 mi que contenía una solución blanco apropiada. Las células se estabilizaron durante cuatro horas a 25°C en el interior del calorímetro antes de calentar las células hasta la temperatura final a una velocidad de calentamiento seleccionada. La temperatura y entalpia de transición se pueden determinar usando el software Setaram (Setaram, Versión 1.3).

En una modalidad no limitante de la presente invención, la curva de desnaturalización térmica/renaturalización térmica se puede obtener usando espectroscopia de dicroísmo circular (CD). Los cambios en la estructura secundaria de la IgG como una función de la temperatura y/o, por ejemplo, pH, pueden ser estudiados por espectroscopia de CD (Fasman et al., (Circular Dichroism and the Confonnational Analysis of Biomolecules. (1996) Plenum Press)). De acuerdo con de Jongh et al., las ventajas de esta técnica son que la señal espectroscópica no se ve afectada por la presencia de la solución circundante y que están disponibles procedimientos bien definidos para elucidar la estructura secundaria sobre la base de espectros de referencia de los diferentes elementos de la estructura (Biochemistry (1994) 33, 14521-14528). Las fracciones de los elementos estructurales secundarios se pueden obtener a partir de los espectros de CD.

En una modalidad no limitante de la presente invención, se pueden hacer mediciones en un espectropolarímetro JASCO, modelo J-715 (JASCO International Co.). Se puede usar una cubeta de cuarzo de 0.1 cm de paso de luz. La regulación de la temperatura se puede llevar a cabo usando una termocupla JASCO PTC-348WI (JASCO International). Los barridos de temperatura se registran usando la termocupla Peltier con una resolución de 0.2°C y una constante de tiempo de 16 segundos. Los barridos de longitud de onda en la región del ultravioleta lejano (0.2 nm de resolución) se pueden obtener por la acumulación de una pluralidad de barridos con una velocidad de barrido adecuada.

La curva de desnaturalización /renaturalización térmica también se puede medir mediante un método espectroscópico. Cuando una proteína en una solución es desnaturalizada en respuesta al calentamiento, las moléculas se agregan y la solución dispersa la luz más fuertemente. La agregación conduce a cambios en la transparencia óptica de la muestra, y se puede medir mediante la monitorización del cambio en la absorbancia de la luz visible o ultravioleta de una longitud de onda definida.

En una modalidad no limitante de la presente invención, se usa espectroscopia de fluorescencia para obtener la curva de desnaturalización térmica/renaturalización térmica. En una modalidad, se monitorea la fluorescencia intrínseca de proteínas, por ejemplo, la fluorescencia intrínseca del triptófano. En otra modalidad, se monitorean moléculas sondas de fluorescencia. Los métodos para realizar experimentos de espectroscopia de fluorescencia son bien conocidos por los expertos en la técnica. Ver, por ejemplo, Bashford et al. (Spectrophotometry and Spectrofluorometry: A Practical Approach (1987) 91-114, IRL Press Ltd.), Bell, J. E. (Spectroscopy in Biocheinistry (1981) Vol. I, 155-194, CRC Press), o Brand et al., (Ann. Rev. Biochem. (1972) 41 , 843).

Al igual que en el caso de las actividades biológicas de las composiciones de anticuerpos, se pueden usar varios métodos para evaluar su estabilidad en base a las estructuras físicas y químicas de los anticuerpos. Por ejemplo, para estudiar la desnaturalización térmica de los anticuerpos, están disponibles métodos como absorción de transferencia de carga, espectroscopia de fluorescencia, RMN, electroforesis capilar en gel en condiciones reductoras (rCGE, por sus siglas en inglés reducing capillary gel electrophoresis), y/o cromatografía de exclusión por tamaño de alto rendimiento (HPSEC, por sus siglas en inglés hjgh performance size exclusión chromatography) , (por ejemplo, Wang et al. (J. Parenteral Science & Technology 42 (Suppl.), S4-S26)) además de los métodos de análisis mencionados anteriormente.

La electroforesis capilar en gel bajo condiciones reductoras y la cromatografía de exclusión por tamaño de alto rendimiento son los métodos más comunes y sencillos para evaluar la formación de agregados de proteínas, productos de degradación de proteínas, y fragmentos de proteínas. De acuerdo con ello, la estabilidad de la composición que comprende un anticuerpo anti-Epirregulina proporcionada por la presente invención también puede ser evaluada mediante estos métodos.

Para modificar la estabilidad de los anticuerpos anti-Epirregulina de la presente invención, se pueden llevar a cabo alteraciones de aminoácidos apropiadas en la secuencia de aminoácidos de los anticuerpos anti-Epirregulina y similares.

Como una modalidad no limitante para modificar la estabilidad de un anticuerpo anti-Epirregulina de la presente invención, cuando el anticuerpo anti-Epirregulina es un anticuerpo lgG1, la amidación del grupo amino C-terminal debido a la eliminación del residuo de lisina del aminoácido C-terminal y la deleción de dos aminoácidos C-terminales, glicina y lisina, es reportada como heterogeneidad derivada de la secuencia C-terminal de cadena pesada del anticuerpo IgG humana (G1, SEC ID No.: 25) (Anal. Biochem. (2007) 360 (1), 75-83). Un método preferido para reducir tal heterogeneidad incluye la alteración de la deleción de los dos aminoácidos C-terminales de cadena pesada, a conocer, la deleción de glicina en la posición 446 y de lisina en la posición 447, de acuerdo con la numeración Estadounidense (WO 2009/041613). Puesto que es deseable que no esté presente la heterogeneidad derivada de la secuencia C- terminal de cadena pesada en los anticuerpos anti-Epirregulina de la presente invención, la secuencia de la lgG1 en la cual la glicina en la posición 446 y la Usina en la posición 447, de acuerdo con la numeración Estadounidense, están deleccionadas en la lgG1 humana (G1d, SEC ID No.: 26) se puede usar como la secuencia de la región constante.

Una modalidad no limitante de una cadena pesada de un anticuerpo anti-Epirregulina de la presente invención con estabilidad mejorada incluye cadenas pesadas seleccionadas del grupo que consiste de SEC ID Nos.: 37, 38, 49-56, 72-79, 92-98, 115-127, 131-135, 137-140, y 142-150. Además, una modalidad no limitante de una cadena ligera de un anticuerpo anti-Epirregulina humanizado de la presente invención con estabilidad mejorada incluye cadenas ligeras seleccionadas del grupo que consiste de SEC ID Nos.: 99, 128-130, 136, y 141.

Una modalidad no limitante de un anticuerpo anti-Epirregulina de la presente invención con estabilidad mejorada incluye anticuerpos anti-Epirregulina que comprenden cadenas pesadas seleccionadas del grupo que consiste de SEC ID Nos.: 37, 38, 49-56, 72-79, 92-98, 115-127, 131-135, 137-140, y 142-150, y cadenas ligeras seleccionados del grupo que consiste de SEC ID Nos.: 99, 128-130, 136, y 141.

Reducción de la cantidad de agregado La cantidad de agregado de anticuerpos anti-Epirregulina de la presente invención está preferentemente reducida. El control de la cantidad de agregado en una proteína farmacéutica es muy importante cuando se considera el control de calidad y las influencias sobre la eficacia del fármaco y la inmunogenicidad (Curr. Opin. Biotechnol. (2009) 20 (6), 708-714). Generalmente, la formación de agregado se ve afectada tanto por la estabilidad coloidal resultante del medioambiente solución de proteína como por la estabilidad conformacional resultante de la estructura de la proteína (J. Pharm Sci. (2010) 100 (4), 1306-1315). Se pueden lograr condiciones efectivas de estabilidad coloidal deseables mediante la selección de la concentración de anticuerpo, pH, tipo de solución amortiguador, fuerza iónica, aditivos, y similares mediante el examen de la prescripción de una formulación de anticuerpo. Por otro lado, la estabilidad conformacional depende en parte de la secuencia de aminoácidos, y en el caso de los anticuerpos, se considera importante mantener estructuras características como la estructura canónica de las CDR, y las secuencias de consenso de las FR, y la interfaz VH/VL y similares (Jung et al., J. Mol. Biol. (2001) 309 (3), 701-716; Xiang et al., J. Mol. Biol. (1995) 253 (3), 385-390; Ewert et al., Methods. (2004) 34 (2), 184-199; Vargas-Madrazo et al., J. Mol. Recognit. (2003) 16 (3) 113-120; Morea et a/., J. Mol. Biol. (1998) 275, 269-294; and Vargas-Madrazo er al., J. Mol. Recognit. (2003) 16 (3) 113-120).

Se pueden usar varios métodos para evaluar la estabilidad de formulaciones de proteínas que contienen formulaciones de anticuerpos, en base a las estructuras físicas y químicas de las proteínas, así como en base a sus actividades biológicas. Por ejemplo, para estudiar la desnaturalización térmica de proteínas están disponibles métodos como la absorción por transferencia de carga, análisis térmico, espectroscopia de fluorescencia, dicroísmo circular (CD), RMN, así como también HPSEC, filtración de flujo tangencial (TFF, por sus siglas en inglés tangential flow filtration), dispersión de luz estática (SLS, por sus siglas en inglés static j I ght scattering), espectroscopia infrarroja con transformada de Fourier (FTIR, por sus siglas en inglés Fpurier Iransform mfrared spectroscopy), tecnología de desplegamiento de proteínas inducida por urea, fluorescencia intrínseca del triptófano, calorimetría diferencial de barrido, y tecnología de unión de proteínas a 1 -anilino-8-naftaleno sulfonato (ANS). Por ejemplo, se puede usar apropiadamente un método seleccionado de los descritos en Wang et al. (J. Parenteral Science & Technology (1988) 42 (Suppl), S4-S26).

La rCGE y HPSEC son los métodos más comunes y sencillos para evaluar la formación de agregaciones de proteínas, degradación de proteínas, y fragmentación de proteínas. En consecuencia, mediante estos métodos se puede evaluar la estabilidad de las formulaciones líquidas de la presente invención.

Por ejemplo, la estabilidad de los anticuerpos anti-Epirregulina de la presente invención puede ser evaluada por HPSEC o rCGE, en donde el porcentaje de área del pico representa el anticuerpo no degradado o fragmento de anticuerpo no degradado. En una modalidad no limitante, se inyectan aproximadamente 250 pg del anticuerpo (aproximadamente 25 pide una formulación líquida que contiene 10 mg/ml del anticuerpo mencionado anteriormente) en una columna TosoH Biosep TSK G3000SWXL (7.8 mm x 30 cm) equipada con una columna protectora TSK SW x1 (6.0 mm x 4.0 cm). El anticuerpo (incluyendo sus fragmentos de anticuerpo) es eluido ¡socráticamente con fosfato disódico 0.1M que contiene sulfato sódico 0.1 y azida sodio al 0.05%, a una velocidad de flujo de 0.8 a 1.0 ml/minutos. La proteína eluida se detecta usando absorbancia UV a 280 nm. Un patrón de referencia se hace correr en el ensayo como control, y los resultados se presentan como el porcentaje de área del pico del monómero del producto comparado con los otros picos excluyendo el pico de volumen retenido observado a aproximadamente los 12 a 14 minutos. Los picos que eluyen antes que el pico del monómero se registran como porcentaje de agregado.

Para reducir la cantidad de agregado de un anticuerpo anti-Epirregulina de la presente invención, se reduce la interacción hidrofóbica entre las moléculas que contienen la cadena pesada y la cadena ligera del anticuerpo anti-Epirregulina. Específicamente, se realizan de manera apropiada alteraciones de aminoácidos que sustituyen residuos hidrofílicos por residuos hidrofóbicos en la secuencia de aminoácidos de cadena pesada o cadena ligera de un anticuerpo anti-Epirregulina y similares. En una modalidad no limitante preferida, se realizan de forma apropiada alteraciones de aminoácidos que sustituyen residuos hidrofílicos por residuos hidrofóbicos en las CDR de un anticuerpo anti-Epirregulina y similares. Se conoce que los aminoácidos incluyen aminoácidos hidrofílicos y aminoácidos hidrofóbicos, Generalmente, Asp (D), Glu (E), Arg (R), Lys (K), His (H), Gly (G), Ser (S), Thr (T), Cys (C), Asn (N), Gln (Q), y Tyr (Y) son conocidos como los aminoácidos hidrofílicos. Ala (A), Val (V), Leu (L), lie (I), Met (M), Trp (W), Phe (F), y Pro (P) son conocidos como los aminoácidos hidrofóbicos. Preferentemente, la alteración de aminoácidos antes mencionada se selecciona apropiadamente de sustituciones de uno o más aminoácidos seleccionados de entre los residuos hidrofóbicos antes mencionados con aminoácidos seleccionados de entre los residuos hidrofílicos antes mencionados, pero no se limitan particularmente a aminoácidos específicos.

Ejemplos no limitantes de posiciones que se someten a alteraciones de aminoácidos para reducir la cantidad de agregado del anticuerpo anti-Epirregulina de la presente invención incluyen preferentemente aminoácidos en la (las) posiciones 60 y/o 98, indicados de acuerdo con la numeración de Kabat, en la secuencia de cadena pesada del anticuerpo anti-Epirregulina de SEC ID No.: 38.

Una modalidad no limitante de la sustitución de aminoácidos antes mencionada incluye preferentemente la sustitución de His (H), Lys (K), Thr (T), Ser (S), o Arg (R) por el aminoácido en la posición 60 y/o la sustitución Ser (S) o Glu (E) por el aminoácido en la posición 98, indicados de acuerdo con la numeración de Kabat, en la secuencia de cadena pesada del anticuerpo anti-Epirregulina de SEC ID No.: 38.

Una modalidad no limitante de una cadena pesada de un anticuerpo anti-Epirregulina de la presente invención con cantidad de agregado reducida incluye cadenas pesadas seleccionadas del grupo que consiste de SEC ID Nos.: 92-98, 115-127, 131-135, 137-140, y 142-150.

Una modalidad no limitante de un anticuerpo anti-Epirregulina de la presente invención con cantidad de agregado reducida incluye anticuerpos anti-Epirregulina que comprenden cadenas pesadas seleccionadas del grupo que consiste de SEC ID Nos.: 92-98, 115-127, 131-135, 137-140, y 142-150, y cadenas ligeras seleccionados del grupo que consiste de SEC ID Nos.: 99, 128-130, 136, y 141.

Conferir reactividad cruzada entre especies para la unión a Epirregulina de animal no humano y a Epirrequlina humana Los anticuerpos anti-Epirregulina de la presente invención son preferentemente anticuerpos anti-Epirregulina que muestran reactividad cruzada entre animales no humanos y humanos. Más específicamente, la presente invención proporciona un anticuerpo anti-Epirregulina al que se une un epítopo unido a un anticuerpo anti-Epirregulina que comprende las CDR de región variable de cadena pesada de SEC ID Nos.: 9, 10, y 11 y las CDR de región variable de cadena ligera de SEC ID No.: 12, 13, y 14, en donde el anticuerpo se caracteriza por que su razón de valor KD para Epirregulina de mono de SEC ID No.: 170 (KD de cEREG) al valor KD para Epirregulina humana de SEC ID No.: 34 (KD de hEREG) (KD de cEREG / KD de hEREG) es más pequeña que la razón KD de cEREG / KD de hEREG del anticuerpo anti-Epirregulina que comprende las CDR de región variable de cadena pesada de SEC ID Nos.: 9, 10, y 11 y las CDR de región variable de cadena ligera de SEC ID No.: 12, 13, y 14.

Más específicamente, en la presente invención, las secuencias de aminoácidos de las CDR de región variable de cadena pesada de SEC ID Nos.: 9, 10, y 11 y las CDR de región variable de cadena ligera de SEC ID No.: 12, 13, y 14 fueron alteradas para modificar la actividad de unión a Epirregulina de mono del anticuerpo anti-Epirregulina que comprende las CDR antes mencionadas. Dado que no se han dilucidado las diferencias estructurales entre Epirregulina de mono y Epirregulina humana, no habla habido ninguna orientación con respecto a qué residuos de aminoácidos del anticuerpo anti-Epirregulina deben ser alterados para mejorar la actividad de unión a Epirregulina de mono. En la presente invención, se diseñaron múltiples secuencias de anticuerpos con sustitución(es) de residuo de aminoácidos en un (unos) sitio(s) arbitrario(s) en las CDR. Específicamente, se produjeron anticuerpos anti-Epirregulina con la sustitución de un residuo de Arg (R) por un aminoácido en las secuencias de CDR antes mencionadas.

Los anticuerpos anti-Epirregulina con la sustitución de un residuo de Arg (R) por un aminoácido en las secuencias de CDR sorprendentemente mostraron tener una actividad de unión mejorada a Epirregulina de mono. Es decir, la sustitución de un resto de Arg (R) por un aminoácido en las secuencias de CDR de un anticuerpo anti-Epirregulina fue capaz de conferir reactividad cruzada de unión a una Epirregulina de animal no humano y a una Epirregulina humana.

El valor KD para la Epirregulina de mono de SEC ID No.: 170 (KD de cEREG) puede ser calculado por el método descrito en la sección "actividad de unión" antes mencionada. La actividad de unión a Epirregulina de un anticuerpo anti-Epirregulina se puede medir mediante métodos conocidos por los expertos en la técnica, y las condiciones de medición pueden ser apropiadamente determinadas por los expertos en la técnica. La actividad de unión a Epirregulina de un anticuerpo anti-Epirregulina se puede evaluar como KD (constante de disociación), KD aparente (constante de disociación aparente), kd que es la tasa de disociación (constante de velocidad de disociación), kd aparente (constante de disociación aparente), o similares. Ellas se pueden medir mediante métodos conocidos por los expertos en la técnica, y por ejemplo, se pueden usar Biacore (GE healthcare), gráfico de Scatchard, FACS, y similares. La razón del valor KD para la Epirregulina de mono (KD de cEREG) al valor KD para Epirregulina humana (KD de hEREG) (KD de cEREG/KD de hEREG) se puede determinar dividiendo este valor KD por el valor KD de la Epirregulina humana de SEC ID No.: 34.

En la presente invención, KD de cEREG/KD de hEREG es preferentemente menor de 40. Además, en una modalidad no limitante, KD de cEREG/KD de hEREG es preferentemente menor de 10. En otra modalidad no limitante, KD de cEREG/KD de hEREG es preferentemente menor de 6, y en una modalidad diferente no limitante, KD de cEREG/KD de hEREG es preferentemente menor de 4.

Ejemplos no limitantes de posiciones donde los aminoácidos están alterados para conferir reactividad cruzada para la unión a una Epirregulina de animal no humano y Epirregulina humana proporcionadas por la presente invención incluyen preferentemente aminoácidos en las posiciones 33, 51, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 62, 65, 96, 97, y/o 98, indicados de acuerdo con la numeración de Kabat, en la secuencia de cadena pesada del anticuerpo anti-Epirregulina de SEC ID No.: 38. Además, ejemplos no limitantes de posiciones donde los aminoácidos están alterados para conferir reactividad cruzada para la unión a una Epirregulina de animal no humano y Epirregulina humana proporcionadas por la presente invención incluyen preferentemente aminoácidos en las posiciones 24, 93, y/o 94, indicados de acuerdo con la numeración de Kabat, en la secuencia de la cadena ligera del anticuerpo anti-Epirregulina de SEC ID No.: 29. Un ejemplo preferido de la alteración de aminoácidos incluye la sustitución de Arg (R) por uno o más de los aminoácidos mencionados anteriormente.

Ejemplos de una modalidad no limitante de cadena pesada de un anticuerpo anti-Epirregulina de la presente invención al que se le ha conferido reactividad cruzada incluyen cadenas pesadas seleccionadas del grupo que consiste de SEC ID Nos.: 115-127, 131-135, 137-140, y 142-150. Ejemplos de una modalidad no limitante de cadena ligera de un anticuerpo anti-Epirregulina humanizado de la presente invención con punto isoeléctrico modificado incluyen cadenas ligeras seleccionadas del grupo que consiste de SEC ID Nos.: 128-130, 136, y 141.

Ejemplos de una modalidad no limitante de un anticuerpo anti-Epirregulina de la presente invención al que se ha conferido reactividad cruzada incluyen anticuerpos anti-Epirregulina que comprenden cadenas pesadas seleccionadas del grupo que consiste de SEC ID Nos.: 98, 115-127, 131-135, 137-140, y 142-150, y cadenas ligeras seleccionados del grupo que consiste de SEC ID Nos.: 29, 128-130, 136, y 141.

Actividad Neutralizante Un anticuerpo anti-Epirregulina de la presente invención es preferentemente un anticuerpo que tiene actividad neutralizante.

Generalmente, "actividad neutralizante" se refiere a la actividad para inhibir la actividad biológica de un ligando, como virus o toxinas, sobre células. Más específicamente, el término "sustancias que tienen actividad neutralizante" se refiere a sustancias que se unen al ligando o a un receptor de unión al ligando, e inhiben la unión entre el ligando y el receptor. Cuando la unión de un receptor a un ligando es bloqueada mediante una actividad neutralizante, no se puede ejercer la actividad biológica mediada por el receptor. Los anticuerpos que tienen ese tipo de actividad neutralizante se conocen en general como anticuerpos neutralizantes. La actividad neutralizante se puede medir mediante la comparación de las actividades biológicas en presencia y ausencia de una sustancia de prueba cuya actividad neutralizante se va a evaluar en presencia del ligando de interés.

En la presente invención, la unión al ligando del receptor de EGF, el cual se considera como el receptor principal de la Epirregulina, da como resultado la dimerización del receptor, y la activación del dominio de tirosina quinasa intracelular del receptor. La tirosina quinasa activadas formas péptidas que contienen tirosina fosforilada por autofosforilación, y los péptidos se asocian con diversas moléculas accesorias de transducción de señales. Se trata principalmente de PLCy (fosfolipasa Cy), Shc, Grb2, y similares. De estas moléculas accesorias, las dos primeras son además fosforiladas por la tirosina quinasa del receptor de EGF. La principal vía de transducción de señal del receptor de EGF es la vía en que la fosforilación es transducida en el orden de Shc, Grb2, Sos, Ras, Raf/MAPK quinasa/MAP quinasa. Además, se considera que existe una vía alternativa que es desde PLCv a PKC.

Puesto que tales cascadas de señales intracelulares varían dependiendo del tipo de células, se pueden dirigir moléculas apropiadas en la célula objetivo de interés, y las moléculas objetivo no están limitadas a los factores antes mencionados. Se pueden usar de forma apropiada kits comercialmente disponibles para medir in vivo la activación de la señal (por ejemplo, el sistema de ensayo de actividad de la proteína C quinasa (GE Healthcare Bio-Sciences)).

Además, puede detectarse la activación de señalización in vivo usando como un índice el efecto de inducción de transcripción en un gen objetivo presente aguas abajo de la cascada de señalización in vivo. Los cambios en la actividad transcripcional se pueden detectar sobre la base del principio del ensayo reportero. Más específicamente, un gen reportero como la proteína verde fluorescente (GFP) o luciferasa se coloca aguas abajo del factor transcripcional o región promotora del gen objetivo, y se mide la actividad del reportero. El cambio en la actividad transcripcional se puede medir en base a la actividad del reportero.

Además, dado que el receptor de EGF por lo general funciona promoviendo la proliferación celular, la activación de la señalización in vivo puede ser evaluada mediante la medición de la actividad de proliferación de las células objetivo. En la presente invención, la actividad neutralizante de un anticuerpo neutralizante de la presente invención se evaluó mediante la evaluación de la actividad de proliferación celular. Sin embargo, la presente invención no está limitada a este método, y la actividad neutralizante se puede evaluar mediante la aplicación adecuada de los métodos mencionados anteriormente para las células objetivos seleccionados.

Específicamente, por ejemplo, mediante la medición de la actividad de proliferación celular que se menciona a continuación, se puede evaluar o medir la actividad neutralizante de un anticuerpo anti-Epirregulina. Por ejemplo, es usado un método que mide la incorporación de timidina etiquetada con [3H] añadida al medio por las células vivas como un índice de la capacidad de la replicación del ADN. Como un método más conveniente, se usa un método de exclusión por colorante que mide bajo un microscopio la capacidad de una célula de liberar un colorante, como azul tripán, hacia el exterior de la célula, o se usa el método MTT. Este último hace uso de la capacidad de las células vivas para convertir bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil tetrazolio (MTT), que es una sal de tetrazolio, en un producto de formazán azul. Más específicamente, a la solución de cultivo de una célula de prueba se añadió un anticuerpo de prueba, y después de un cierto período de tiempo, se añadió a la solución de cultivo la solución de MTT, y se dejó reposar durante un cierto tiempo para que el MTT feúra incorporado en la célula. Como resultado, el MTT que es un compuesto de color amarillo se convierte en un compuesto azul por la acción de la succinato deshidrogenasa en la mitocondria de la célula. Después de disolver este producto azul para la coloración, se mide la absorbancia y se usa como un indicador del número de células viables.

Además de MTT, están disponibles comercialmente reactivos como MTS, XTT, WST-1, y WST-8 (Nacalai Tesque, y similares) los que pueden ser apropiadamente usados. Además, se conocen métodos que evalúan la actividad de proliferación celular que usan como indicador ATP celular o la impedancia de un cultivo celular. Para mediciones de actividad, se puede usar como un anticuerpo de control, de la misma manera que se usa el anticuerpo anti-Epirregulina, un anticuerpo de unión que tiene el mismo isotipo que el anticuerpo anti-Epirregulina pero que no tiene actividad neutralizante, y se puede determinar que la actividad está presente cuando el anticuerpo anti-Epirregulina tiene una actividad de neutralización más fuerte que el anticuerpo de control.

Citotoxicidad Un anticuerpo usado en la presente invención es preferentemente un anticuerpo que tiene la citotoxicidad.

En la presente invención, la citotoxicidad incluye, por ejemplo, la actividad de citotoxicidad mediada por células (ADCC) y la actividad de citotoxicidad dependiente del complemento (CDC). En la presente invención, la actividad CDC se refiere a la actividad de citotoxicidad mediada por el sistema del complemento. Mientras tanto, la actividad ADCC se refiere a la actividad de daño a una célula objetivo cuando un anticuerpo específico se une a su antígeno de superficie celular. Una célula retenedora de receptor Fcy (inmunocitos o similares) se une a la porción Fe del anticuerpo a través del receptor Fcy y la célula objetivo es dañada. Un anticuerpo usado en la presente invención puede ser un anticuerpo que tiene actividad CDC o actividad ADCC, o puede ser un anticuerpo que tiene tanto actividad CDC como actividad ADCC.

El que un anticuerpo anti-Epirregulina tenga actividad ADCC o actividad CDC se pueden determinar mediante métodos conocidos (por ejemplo, Current protocols in Immunology, Chapter 7. Immunologic studies in humans, Editor, John E, Coligan et al., John Wiley & Sons, Inc., (1993), etcétera).

En primer lugar, específicamente, se preparan células efectoras, solución de complemento, y células objetivo. (1) Preparación de células efectoras Se extrajo el bazo de un ratón CBA/N o similar, y las células del bazo fueron aisladas en medio RPMI1640 (Invitrogen). Después de lavar las células con el mismo medio que contiene suero bovino fetal al 10% (FBS, HyClone), la concentración de las células de bazo lavadas se puede ajustar a 5 x 106 /mi para preparar células efectoras. (2) Preparación de solución de complemento Complemento de conejo bebé (CEDARLANE) es diluido 10 veces en un medio de cultivo (Invitrogen) que contiene FBS al 10% para preparar una solución de complemento. (3) Preparación de células objetivo Las células objetivo pueden ser marcadas radiactivamente mediante el cultivo de células que expresan una proteína Epirregulina con 51Cr cromato de sodio - 0.2 mCi (GE Healthcare Bio-Sciences) en un medio DMEM que contiene FBS al 10% durante una hora a 37°C. Para las células que expresan la proteína Epirregulina se pueden usar las células transformadas con un gen que codifica la proteína Epirregulina, células de cáncer de colon primario, células de cáncer de colon metastásico, células de adenocarcinoma de pulmón, células de cáncer pancreático, células de cáncer de estómago, células de cáncer de riñón, células de cáncer de colon, células de cáncer de esófago, o similares. Después del mareaje radiactivo, las células se lavaron tres veces con medio RP I1640 que contenía FBS al 10%, y las células objetivo se pueden preparar mediante el ajuste de la concentración de células 2 x 105 células/ml.

La actividad ADCC y la actividad CDC se pueden medir mediante el método que se describe a continuación. En el caso de la medición de la actividad ADCC, 50 µ? de la célula objetivo y 50 µ?_ de un anticuerpo anti-Epirregulina se añadieron a cada pocilio de una placa de fondo en U de 96 pocilios (Becton Dickinson), y se dejó reposar en hielo durante 15 minutos. Entonces, se añadió a cada pocilio de la placa 100 µ?_ de la célula efectora, y la placa se incubó en una incubadora de dióxido de carbono durante cuatro horas. La concentración final del anticuerpo se puede ajustar a 0 o 10 pg/ml. Después de la incubación, se recolectaron 100 µ?_ de sobrenadante, y se midió la radiactividad con un contador gamma (COBRAN AUTO-GAMMA, MODEL D5005, Packard Instrument Company). El valor medido se usó para calcular la actividad citotóxica (%) de acuerdo con: Fórmula 2 (A - C) / (B - C) x 100 A representa la radiactividad (cpm) en cada muestra, B representa la radiactividad (cpm) en una muestra a la que se ha añadido NP-40 al 1% (Nacalai Tesque), y C representa la radioactividad (cpm) de una muestra que contiene solamente las células objetivo.

Por otro lado, en el caso de medición de la actividad CDC, 50 µ?_ de la célula objetivo y 50 µ?_ de un anticuerpo anti-Epirregulina se añadieron a cada pocilio de una placa de fondo en U de 96 pocilios (Becton Dickinson), y se dejó reposar en hielo durante 15 minutos. Después, se añadió a cada pocilio de la placa 100 µ?_ de la solución de complemento, y la placa se incubó en una incubadora de dióxido de carbono durante cuatro horas.

La concentración final del anticuerpo se puede ajustar a 0 o 3 pg/ml. Después de la incubación, se recolectaron 100 µ?_ de sobrenadante, y se midió la radiactividad con un contador gamma. La citotoxicidad se puede calcular de la misma manera como en el caso de la determinación de la actividad ADCC.

Anticuerpos anti-Epirregulina con actividad ADCC aumentada Los anticuerpos anti-Epirregulina con una actividad ADCC aumentada también se pueden usar preferentemente como anticuerpos anti-Epirregulina de la presente invención. Como se describió anteriormente, la actividad ADCC se refiere a la actividad de dañar una célula objetivo cuando un anticuerpo específico se adhiere a su antígeno de superficie celular, y una célula retenedora de receptor Fcy (inmunocitos o similares) se une a la porción Fe del anticuerpo a través del receptor Fcy. Por lo tanto, la actividad ADCC mediada por anticuerpos anti-Epirregulina puede ser aumentada aumentando la actividad de unión a receptor Fcy de las células que expresan el receptor Fcy como células inmunes. Como métodos para aumentar la actividad de unión a receptor Fcy de las células que expresan el receptor Fcy, como células inmunes, al menos se pueden usar los siguientes tres métodos conocidos. (1) Anticuerpos anti-Epirregulina con alteración de aminoácidos de la región Fe Los anticuerpos anti-Epirregulina con actividad de unión a receptor Fcy aumentada se pueden obtener mediante la alteración de aminoácidos de la región Fe comprendida en los anticuerpos anti-Epirregulina de la presente invención. Ejemplos de regiones Fe preferidas de inmunoglobulinas IgG para su alteración incluyen regiones Fe de IgG humanas (lgG1, lgG2, lgG3, o lgG4, y variantes de las mismas).

Los aminoácidos en cualquier posición pueden ser alterados para cambiarlos por otros aminoácidos siempre y cuando la actividad de unión a receptor Fcy de un anticuerpo pueda ser aumentada. Cuando un anticuerpo anti-Epirregulina de la presente invención contiene la región Fe de la lgG1 humana como una región Fe, se prefiere incluir alteraciones que den como resultado el aumento de la unión a receptor Fcy en comparación con la actividad de unión de la región Fe derivada de lgG1 humana. Alteraciones de aminoácidos para aumentar la actividad de unión a receptor Fcy se han reportado, por ejemplo, en WO 2007/024249, WO 2007/021841, WO 2006/031370, WO 2000/042072, WO 2004/029207, WO 2004/099249, WO 2006/105338, WO 2007/041635, WO 2008/092117, WO 2005/070963, WO 2006/020114, WO 2006/116260, y WO 2006/023403.

Ejemplos de tales aminoácidos que pueden ser alterados incluyen al menos uno o más aminoácidos seleccionados del grupo que consiste de aquellos en las posiciones 221, 222, 223, 224, 225, 227, 228, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 243, 244, 245, 246, 247, 249, 250, 251, 254, 255, 256, 258, 260, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 288, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 311, 313, 315, 317, 318, 320, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 339, 376, 377, 378, 379, 380, 382, 385, 392, 396, 421, 427, 428, 429, 434, 436, y 440, de acuerdo con la numeración Estadounidense. La alteración de estos aminoácidos puede aumentar la actividad de unión a receptor Fcy de una región Fe de un anticuerpo anti-Epirregulina. Estas alteraciones de aminoácidos pueden aumentar la actividad de unión a receptor Fcy de una región Fe de un anticuerpo anti-Epirregulina de la presente invención. Un anticuerpo anti-Epirregulina de la presente invención puede comprender al menos una sustitución de aminoácido, por ejemplo, en una posición seleccionada del grupo que consiste de 230, 240, 244, 245, 247, 262, 263, 266, 273, 275, 299, 302, 313, 323, 325, 328, y 332, de acuerdo con la numeración Estadounidense, en la región constante de cadena pesada de SEC ID No.: 26.

Ejemplos particularmente preferidos de alteraciones para uso en la presente invención incluyen al menos una o más alteraciones de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste de: el aminoácido en la posición 221 a, ya sea, Lys o Tyr; el aminoácido en la posición 222 a cualquiera de Phe, Trp, Glu, y Tyr; el aminoácido en la posición 223 a cualquiera de Phe, Trp, Glu, y Lys; el aminoácido en la posición 224 a cualquiera de Phe, Trp, Glu, y Tyr; el aminoácido en la posición 225 a cualquiera de Glu, Lys, y Trp; el aminoácido en la posición 227 a cualquiera de Glu, Gly, Lys, y Tyr; el aminoácido en la posición 228 a cualquiera de Glu, Gly, Lys, y Tyr; el aminoácido en la posición 230 a cualquiera de Ala, Glu, Gly, y Tyr; el aminoácido en la posición 231 a cualquiera de Glu, Gly, Lys, Pro, y Tyr; el aminoácido en la posición 232 a cualquiera de Glu, Gly, Lys, y Tyr; el aminoácido en la posición 233 a cualquiera de Ala, Asp, Phe, Gly, His, Me, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp, y Tyr; el aminoácido en la posición 234 a cualquiera de Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Me, Lys, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp, y Tyr; el aminoácido en la posición 235 a cualquiera de Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Me, Lys, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp, y Tyr; el aminoácido en la posición 236 a cualquiera de Ala, Asp, Glu, Phe, His, lie, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp, y Tyr; el aminoácido en la posición 237 a cualquiera de Asp, Glu, Phe, His, Me, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp, y Tyr; el aminoácido en la posición238 a cualquiera de Asp, Glu, Phe, Gly, His, lie, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp, Y Tyr; el aminoácido en la posición 239 a cualquiera de Asp, Glu, Phe, Gly, His, Me, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Thr, Val, Trp, y Tyr; el aminoácido en la posición 240 a cualquiera de Ala, He, Met, y Thr; el aminoácido en la posición 241 a cualquiera de Asp, Glu, Leu, Arg, Trp, y Tyr; el aminoácido en la posición 243 a cualquiera de Leu, Glu, Leu, Gln, Arg, Trp, y Tyr; el aminoácido en la posición 244 a His; el aminoácido en la posición 245 a Ala; el aminoácido en la posición 246 a cualquiera de Asp, Glu, His, y Tyr; el aminoácido en la posición 247 a cualquiera de Ala, Phe, Gly, His, Me, Leu, Met, Thr, Val, y Tyr; el aminoácido en la posición 249 a cualquiera de Glu, His, Gln, y Tyr; el aminoácido en la posición 250 a, ya sea, Glu o Gln; el aminoácido en la posición 251 a Phe; el aminoácido en la posición 254 a cualquiera de Phe, Met, y Tyr; el aminoácido en la posición 255 a cualquiera de Glu, Leu, y Tyr; el aminoácido en la posición 256 a cualquiera de Ala, Met, y Pro; el aminoácido en la posición 258 a cualquiera de Asp, Glu, His, Ser, y Tyr; el aminoácido en la posición 260 a cualquiera de Asp, Glu, His, y Tyr; el aminoácido en la posición 262 a cualquiera de Ala, Glu, Phe, Me, y Thr; el aminoácido en la posición 263 a cualquiera de Ala, Me, Met, y Thr; el aminoácido en la posición 264 a cualquiera de Asp, Glu, Phe, Gly, His, Me, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Trp, y Tyr; el aminoácido en la posición 265 a cualquiera de Ala, Leu, Phe, Gly, His, lie, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp, y Tyr; el aminoácido en la posición 266 a cualquiera de Ala, Me, Met, y Thr; el aminoácido en la posición 267 a cualquiera de Asp, Glu, Phe, His, Me, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Thr, Val, Trp, y Tyr; el aminoácido en la posición 268 a cualquiera de Asp, Glu, Phe, Gly, Me, Lys, Leu, Met, Pro, Gln, Arg, Thr, Val, y Trp; el aminoácido en la posición 269 a cualquiera de Phe, Gly, His, lie, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp, y Tyr; el aminoácido en la posición 270 a cualquiera de Glu, Phe, Gly, His, Me, Leu, Met, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Trp, y Tyr; el aminoácido en la posición 271 a cualquiera de Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Me, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp, y Tyr; el aminoácido en la posición 272 a cualquiera de Asp, Phe, Gly, His, Me, Lys, Leu, Met, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp, y Tyr; el aminoácido en la posición 273 a, ya sea, Phe o e; el aminoácido en la posición 274 a cualquiera de Asp, Glu, Phe, Gly, His, Me, Leu, Met, Asn, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp, y Tyr; el aminoácido en la posición 275 a, ya sea, Leu o Trp; el aminoácido en la posición 276 a cualquiera de Asp, Glu, Phe, Gly, His, Me, Leu, Met, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp, y Tyr; el aminoácido en la posición 278 a cualquiera de Asp, Glu, Gly, His, Me, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, y Trp; el aminoácido en la posición 279 a Ala; el aminoácido en la posición 280 a cualquiera de Ala, Gly, His, Lys, Leu, Pro, Gln, Trp, y Tyr; el aminoácido en la posición 281 a cualquiera de Asp, Lys, Pro, y Tyr; el aminoácido en la posición 282 a cualquiera de Glu, Gly, Lys, Pro, y Tyr; el aminoácido en la posición 283 a cualquiera de Ala, Gly, His, Me, Lys, Leu, Met, Pro, Arg, y Tyr; el aminoácido en la posición 284 a cualquiera de Asp, Glu, Leu, Asn, Thr, y Tyr; el aminoácido en la posición 285 a cualquiera de Asp, Glu, Lys, Gln, Trp, y Tyr; el aminoácido en la posición 286 a cualquiera de Glu, Gly, Pro, y Tyr; el aminoácido en la posición 288 a cualquiera de Asn, Asp, Glu, y Tyr; el aminoácido en la posición 290 a cualquiera de Asp, Gly, His, Leu, Asn, Ser, Thr, Trp, y Tyr; el aminoácido en la posición 291 a cualquiera de Asp, Glu, Gly, His, Me, Gln, y Thr; el aminoácido en la posición 292 a cualquiera de Ala, Asp, Glu, Pro, Thr, y Tyr; el aminoácido en la posición 293 a cualquiera de Phe, Gly, His, Me, Leu, Met, Asn, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp, y Tyr; el aminoácido en la posición 294 a cualquiera de Phe, Gly, His, Me, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp, y Tyr; el aminoácido en la posición 295 a cualquiera de Asp, Glu, Phe, Gly, His, Me, Lys, Met, Asn, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp, y Tyr; el aminoácido en la posición 296 a cualquiera de Ala, Asp, Glu, Gly, His, Me, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, y Val; el aminoácido en la posición 297 a cualquiera de Asp, Glu, Phe, Gly, His, Me, Lys, Leu, Met, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp, y Tyr; el aminoácido en la posición 298 a cualquiera de Ala, Asp, Glu, Phe, His, Me, Lys, Met, Asn, Gln, Arg, Thr, Val, Trp, y Tyr; el aminoácido en la posición 299 a cualquiera de Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, lie, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Val, Trp, y Tyr; el aminoácido en la posición 300 a cualquiera de Ala, Asp, Glu, Gly, His, Me, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, y Trp; el aminoácido en la posición 301 a cualquiera de Asp, Glu, His, y Tyr; el aminoácido en la posición 302 a Me; el aminoácido en la posición 303 a cualquiera de Asp, Gly, y Tyr; el aminoácido en la posición 304 a cualquiera de Asp, His, Leu, Asn, y Thr; el aminoácido en la posición 305 a cualquiera de Glu, lie, Thr, y Tyr; el aminoácido en la posición 311 a cualquiera de Ala, Asp, Asn, Thr, Val, y Tyr; el aminoácido en la posición 313 a Phe; el aminoácido en la posición 315 a Leu; el aminoácido en la posición 317 a, ya sea, Glu o Gln; el aminoácido en la posición 318 a cualquiera de His, Leu, Asn, Pro, Gln, Arg, Thr, Val, y Tyr; el aminoácido en la posición 320 a cualquiera de Asp, Phe, Gly, His, lie, Leu, Asn, Pro, Ser, Thr, Val, Trp, y Tyr; el aminoácido en la posición 322 a cualquiera de Ala, Asp, Phe, Gly, His, Me, Pro, Ser, Thr, Val, Trp, y Tyr; el aminoácido en la posición 323 a Me; el aminoácido en la posición 324 a cualquiera de Asp, Phe, Gly, His, Me, Leu, Met, Pro, Arg, Thr, Val, Trp, y Tyr; el aminoácido en la posición 325 a cualquiera de Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, lie, Lys, Leu, Met, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp, y Tyr; el aminoácido en la posición 326 a cualquiera de Ala, Asp, Glu, Gly, Me, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Ser, Thr, Val, Trp, y Tyr; el aminoácido en la posición 327 a cualquiera de Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Me, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Arg, Thr, Val, Trp, y Tyr; el aminoácido en la posición 328 a cualquiera de Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, Hls, lie, Lys, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp, y Tyr; el aminoácido en la posición 329 a cualquiera de Asp, Glu, Phe, Gly, His, Me, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp, Y Tyr; el aminoácido en la posición 330 a cualquiera de Cys, Glu, Phe, Gly, His, Me, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp, y Tyr; el aminoácido en la posición 331 a cualquiera de Asp, Phe, His, Me, Leu, Met, Gln, Arg, Thr, Val, Trp, y Tyr; el aminoácido en la posición 332 a cualquiera de Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp, y Tyr; el aminoácido en la posición 333 a cualquiera de Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Me, Leu, Met, Pro, Ser, Thr, Val, y Tyr; el aminoácido en la posición 334 a cualquiera de Ala, Glu, Phe, lie, Leu, Pro, y Thr; el aminoácido en la posición 335 a cualquiera de Asp, Phe, Gly, His, Me, Leu, Met, Asn, Pro, Arg, Ser, Val, Trp, y Tyr; el aminoácido en la posición 336 a cualquiera de Glu, Lys, y Tyr; el aminoácido en la posición 337 a cualquiera de Glu, His, y Asn; el aminoácido en la posición 339 a cualquiera de Asp, Phe, Gly, lie, Lys, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, y Thr; el aminoácido en la posición 376 a, ya sea, Ala o Val; el aminoácido en la posición 377 a, ya sea, Gly o Lys; el aminoácido en la posición 378 a Asp; el aminoácido en la posición 379 a Asn; el aminoácido en la posición 380 a cualquiera de Ala, Asn, y el aminoácido en la posición 382 a, ya sea, Ala o Me; el aminoácido en la posición 385 a Glu; el aminoácido en la posición 392 a Thr; el aminoácido en la posición 396 a Leu; el aminoácido en la posición421 a Lys; el aminoácido en la posición 427 a Asn; el aminoácido en la posición 428 a, ya sea, Phe o Leu; el aminoácido en la posición 429 a Met; el aminoácido en la posición 434 a Trp; el aminoácido en la posición 436 a Me; y el aminoácido en la posición 440 a cualquiera de Gly, His, Me, Leu, y Tyr, de acuerdo con la numeración Estadounidense, en la región Fe de un anticuerpo anti-Epirregulina de la presente invención. El número de aminoácidos que son alterados no está particularmente limitado. Sólo puede ser alterado un aminoácido en una posición, o pueden ser alterados aminoácidos en dos o más posiciones. Ejemplos de combinaciones de alteraciones de aminoácidos en dos o más posiciones incluyen las combinaciones que se muestran en las Tablas 1-1 y 1-2.

Tabla 1-1 Tabla 1-2 es una Tabla de continuación de la Tabla 1-1.

Tabla 1-2 En el presente documento, la "actividad de unión a recepto Fcy de una región Fe de un anticuerpo anti-Epirregulina está aumentada" significa que la actividad de una región Fe de un anticuerpo anti-Epirregulina con las alteraciones de aminoácidos antes mencionadas que se une a cualquiera de los receptores Fcy humanos, FcyRI, FcyRIIa, FcyRIIb, FcyRIIIa, y/o FcyRIIIb, es mayor que la actividad de la región Fe de un anticuerpo anti-Epirregulina para unirse estos receptores Fcy humanos antes de la alteración de aminoácidos. Por ejemplo, en base al método de análisis antes mencionado, esto significa que la actividad de unión del anticuerpo anti-Epirregulina después de la alteración es de 105% o más, preferentemente 110% o más, 120% o más, 125% o más, particularmente preferentemente 130% o más, 135% o más, 140% o más, 145% o más, 150% o más, 155% o más, 160% o más, 165% o más, 170% o más, 175% o más, 180% o más, 185% o más, 190% o más, 195% o más, dos veces o más, 2.5 veces o más, 3 veces o más, 3.5 veces o más, 4 veces o más, 4.5 veces o más, 5 veces o más, 7.5 veces o más, 10 veces o más, 20 veces o más, 30 veces o más, 40 veces o más, 50 veces o más, 60 veces o más, 70 veces o más, 80 veces o más, 90 veces o más, o 100 veces o más en comparación con la actividad de unión del anticuerpo anti-Epirregulina antes de alteración usado como control. (2) Anticuerpos anti-Epirregulina con un contenido reducido de fucosa en las cadenas de azúcar unidos a la región Fe Una modalidad no limitante de anticuerpos anti-Epirregulina de la presente invención incluye, preferentemente, anticuerpos anti-Epirregulina que han sido modificados de manera que la composición de las cadenas de azúcar unidas a las regiones Fe del anticuerpo anti-Epirregulina será alta en cadenas de azúcar deficientes en fucosa. Los expertos en la técnica pueden seleccionar adecuadamente los anticuerpos anti-Epirregulina con una alta proporción de regiones Fe unidas con cadenas de azúcar deficientes en fucosa siguiendo el método para el análisis de estructuras de cadenas de azúcar que se describe a continuación. La proporción de tal región Fe unida con cadenas de azúcar deficientes en fucosa puede ser apropiadamente seleccionada por los expertos en la técnica desde 10 a 100%. En una modalidad no limitante, la proporción se puede seleccionar de entre 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, y 100%. Se conoce que cuando un residuo de fucosa es eliminado desde N -acetil glucosamina en el extremo reductor de la cadena de azúcar tipo- complejo ligado-A/ -glicósido unida a la región Fe del anticuerpo, la afinidad a FcYRIIIa es aumentada (J. Biol. Chem. (2003) 278, 3466-3473). Dado que se conoce que los anticuerpos IgG 1 que contienen tales regiones Fe tienen una actividad de ADCC aumentada, como se describe más adelante, estos anticuerpos anti-Epirregulina que contiene esta región Fe son también útiles como anticuerpos anti-Epirregulina a ser incluidos en las composiciones farmacéuticas de la presente invención.

Una modalidad no limitante de un anticuerpo en el cual el residuo de fucosa es eliminado desde N -acetil glucosamina en el extremo reductor de cadena de azúcar tipo- complejo ligado-A/ -glicósido unida a la región Fe del anticuerpo incluye, preferentemente, un anticuerpo modificado por glicosilación (WO 1999/054342).

Otra modalidad no limitante de un anticuerpo en donde los residuos de fucosa son eliminados desde N -acetil glucosamina en el extremo reductor de la cadena de azúcar tipo- complejo ligado-N -glicósido unida a la región Fe del anticuerpo incluye preferentemente anticuerpos que son deficientes en la fucosa unida a las cadenas de azúcar (por ejemplo, WO 2000/061739, WO 2002/031140, y WO 2006/067913). Para la producción de anticuerpos deficientes en la fucosa unida a las cadenas de azúcar se usan células huésped que tienen poca capacidad para añadir fucosa a las cadenas de azúcar, debido a modificaciones de su actividad, para formar la estructura de la cadena de azúcar para que los polipéptidos sean glicosilados. Mediante la expresión de un gen del anticuerpo deseado en las células huésped, el anticuerpo que en sus cadenas de azúcar es deficiente en fucosa puede ser recolectado del cultivo de células huésped. Ejemplos preferidos no limitantes de la actividad para formar una estructura de cadenas de azúcar de un polipéptido incluyen la actividad de una enzima o transportador seleccionado del grupo que consiste de fucosiltransferasa (EC 2.4.1.152), transportador de fucosa (SLC35C1), GMD (GDP-manosa-4,6-deshidratasa) (EC 4.2.1.47), Fx (GDP-ceto-6-desoximanosa-3,5-epimerasa, 4-reductasa) (EC 1.1.1.271), y GFPP (GDP-p-L-fucosa pirofosforilasa (EC 2.7.7.30). Las estructuras de estas enzimas y transportadores no están necesariamente especificadas siempre y cuando se exhiban sus actividades. En el presente documento, las proteínas que pueden exhibir estas actividades se denominan como proteínas funcionales. Una modalidad no limitante de un método para modificar estas actividades incluye la pérdida de estas actividades. Para producir células huésped deficientes en estas actividades, se pueden emplear apropiadamente métodos conocidos, como métodos para la destrucción de los genes de estas proteínas funcionales para hacerlas disfuncionales (por ejemplo, WO 2000/061739, WO 2002/031140, y WO 2006/067913). Las células huésped deficientes en tales actividades pueden ser producidas, por ejemplo, mediante un método que destruye los genes endógenos de estas proteínas funcionales en células CHO, células BH, células NS0, células SP2/0, células de mieloma YO, células de mieloma de ratón P3X63, células PER, células PER.C6, células HEK293, células de hibridoma, o similares, de modo que sean incapaces de funcionar.

Mediante la recopilación de anticuerpos del sobrenadante de cultivo de las células huésped antes mencionadas transformadas con un vector de expresión que comprende un gen de anticuerpo anti-Epirregulina, se recolectan anticuerpos anti-Epirregulina en los que el residuo de fucosa está eliminado de la /V-acetil glucosamina en el extremo reductor de la cadena de azúcar tipo-complejo ligado-N -glicósido unida a la región Fe del anticuerpo. (3) Anticuerpos anti-Epirregulina comprende regiones Fe unidas con A-acetil glucosamina bisectante Una modalidad no limitante de anticuerpos anti-Epirregulina de la presente invención incluye, preferentemente, anticuerpos anti-Epirregulina que comprenden regiones Fe unidas con N-acetil glucosamina bisectante. Se conocen anticuerpos que tienen una cadena de azúcar que contiene una estructura de GIcNAc bisectante (WO 2002/079255, y similares) Se usan células huésped que tiene una actividad para formar una cadena de azúcar que contiene una estructura GIcNAc bisectante para producir anticuerpos a los que están unidos cadenas de azúcar que contiene la estructura GIcNAc bisectante. En una modalidad preferida no limitante, se producen células huésped que expresan un gen que codifica una proteína funcional que tiene actividad GnTIII (ß-1 ,4-manosil-glicoproteína, 4-ß-?/-acetilglucosaminiltransferasa) (EC2.4.1.144) o actividad GaIT (ß-1 ,4-galactosiltransferasa) (EC 2.4.1.38), actividad Manll humana (manosidasa II) (3.2.1.114), un gen que codifica una proteína funcional que tiene actividad GnTI (ß-1,2-acetilglucosaminitransferasa I) (EC 2.4.1.94), un gen que codifica una proteína funcional que tiene actividad g GnTII (ß-1,2-acetilglucosaminiltransferasa II) (EC 2.4.1.143), un gen que codifica una proteína funcional que tiene actividad Maní (manosidasa) (EC 3.2.1.113) y a-1 ,6-fucosil transferasa (EC 2.4.1.68) además de las proteínas funcionales antes mencionadas (WO 2004/065540). Las células huésped antes mencionadas que tienen la actividad para formar una cadena de azúcar que contiene una estructura GIcNAc bisectante se pueden generar mediante la transfección de un vector de expresión, que contiene un gen para la proteína funcional antes mencionada, en células CHO, células BHK, células NSO, células SP2/0, células de mieloma YO, células de mieloma de ratón P3X63, células PER, células PER.C6, células HEK293, células de hibridoma, o similares.

Los anticuerpos anti-Epirregulina que comprenden regiones Fe unidas con /V-acetil glucosamina bisectante se cosechan mediante la recolección de anticuerpos del sobrenadante de cultivo de las células huésped antes mencionadas transfectadas con un vector de expresión que contiene un gen del anticuerpo anti-Epirregulina. Se pueden usar métodos conocidos para analizar la estructura de la cadena de azúcar unida a los anticuerpos. En una modalidad no limitante, al permitir que la N -glucosidasa F (Roche Diagnostics) actúe sobre un anticuerpo anti-Epirregulina de la presente invención se provoca que la cadena de azúcar unida al anticuerpo anti-Epirregulina se disocie de la proteína (J. Pharm. Sci. (1994) 83(12), 1670-1675). Después de la eliminación de la proteína usando etanol (J. Clin. Invest. (2001), 108(11), 1687-95), la cadena de azúcar libre es concentrada y secada, y después se realiza el etiquetado de fluorescencia usando 2-aminopiridina o 2-aminobenzamida (Anal. Biochem. (1995) 230 (2), 229-238). La cadena de azúcar marcada con 2-AP o la cadena de azúcar marcada con 2-AB obtenida son liberada de los reactivos mediante extracción en fase sólida usando un cartucho de celulosa y después es concentrada mediante centrifugación, y el material obtenido es sometido a análisis posteriores como una cadena de azúcar marcada con 2-AB purificada. En el siguiente paso, se prepara la cadena de azúcar marcada con 2-AB agalactosilada permitiendo que la ß -galactosidasa (Seikagaku Corporation) actúe sobre la cadena de azúcar marcada con 2-AB purificada. Las cadenas de azúcar marcadas con 2-AB agalactosiladas preparadas usando como materiales de partida las cadenas de azúcar disociadas de anticuerpos anti-Epirregulina de la presente invención fueron analizadas mediante HPLC en fase normal usando una columna de amida TSKgel Amide-80 (Tosoh), y sus cromatogramas son comparados.

Además, se ha informado de la fuerza de interacción entre una región FcgR y Fe del anticuerpo depende de la concentración de iones de Zn + (Immunology Letters 143 (2012) 60-69). El anticuerpo muestra una interacción más fuerte entre la región Fe y FcgR cuando la concentración de iones de Zn2+ de la región Fe es mayor. La quelación de Zn2+ por His310 y His435 presentes en CH3 de la región Fe de anticuerpo abre cada dominio CH2 de la región Fe en una posición distal. Esto facilita la interacción entre el dominio CH2 y FcgR, y aumenta la interacción entre la región Fe y FcgR. Una modalidad no limitante de un anticuerpo de la presente invención incluye un anticuerpo en donde His en la posición 310, His en la posición 435, His en la posición 433, y/o Asn en la posición 434 (numeración Estadounidense) están quelados con Zn2+.

Conjugado Anticuerpo-Fármaco Una modalidad no limitante de anticuerpos anti-Epirregulina de la presente invención incluye preferentemente conjugados anticuerpos anti-Epirregulina-fármaco producidos mediante el enlace de un anticuerpo anti-Epirregulina a un fármaco que tiene citotoxicidad. En lo sucesivo, un conjugado anticuerpo-fármaco puede ser denominado como ADC (por sus siglas en inglés antibody-drug conjúgate). Más específicamente, los conjugados anticuerpo anti-Epirregulina-fármaco usado en la presente invención pueden estar enlazados apropiadamente con inhibidores del crecimiento o sustancias citotóxicas como péptidos tóxicos o sustancias químicas radioactivas. El término "sustancias químicas radioactivas" en la presente invención se refiere a sustancias que contienen un radioisótopo. El radioisótopo no está particularmente limitado y ya que cualquier radioisótopo puede ser usado, se pueden usar, por ejemplo, 32P, 14C, 125l, 3H, 13 l, 186Re, 188Re, y similares. Tales conjugados anticuerpos anti-Epirregulina-fármaco pueden obtenerse modificando químicamente los anticuerpos anti- Epirregulina obtenidos. Más específicamente, para permitir que un inhibidor del crecimiento o una sustancia citotóxica se conjugue químicamente (por ejemplo, se enlace covalentemente) con un anticuerpo anti-Epirregulina, se usa una molécula enlazadora para enlazar un inhibidor del crecimiento o una sustancia citotóxica a un anticuerpo a través de enlaces químicos (como los descritos anteriormente).

Preferentemente, el agente de unión (enlazador) es un enlazador escindible. Más preferentemente, el enlazador se escinde en condiciones suaves (es decir, las condiciones dentro de una célula bajo las cuales no se ve afectada la actividad del fármaco). Ejemplos de enlazadores escindibles adecuados incluyen enlazadores de disulfuro, enlazadores lábiles en medio ácido, enlazadores fotolábiles, enlazadores lábiles a peptidasa y enlazadores lábiles a esterasa. Los enlazadores que contiene disulfuro son enlazadores que se pueden escindir a través de intercambio de disulfuro, el que puede ocurrir bajo condiciones fisiológicas. Los enlazadores lábiles en medio ácido son enlazadores escindibles a pH ácido. Por ejemplo, ciertos compartimentos intracelulares como los endosomas y lisosomas tienen un pH acídico (pH 4-5), y proporcionan las condiciones adecuadas para la escisión de los enlazadores lábiles en medio ácido. Los enlazadores fotolábiles son útiles en la superficie del cuerpo y en muchas cavidades del cuerpo que pueden estar expuestas a la luz. Además, la luz infrarroja puede penetrar los tejidos. Los enlazadores lábiles a peptidasa se pueden usar para escindir ciertos péptidos dentro o fuera de las células (ver, por ejemplo, Trouet et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA (1982) 79, 626-629; y Umemoto et al., Int. J. Cáncer (1989) 43, 677-684).

Además de las modificaciones químicas antes mencionadas, tales ADC se pueden obtener en forma de moléculas de anticuerpo biespecíficas diseñadas usando técnicas de ingeniería genética de manera que el anticuerpo puede reconocer inhibidores del crecimiento, o sustancias citotóxicas como péptidos tóxicos, o sustancias químicas radioactivas. Los "anticuerpos anti-Epirregulina" de la presente invención también incluye tales anticuerpos.

Ejemplos de una modalidad no limitante de los conjugados anticuerpo anti-Epirregulina-fármaco proporcionados por la presente invención incluyen anticuerpos anti-Epirregulina que han sido modificados usando un péptido tóxico, como ricina, abrina, ribonucleasa, onconasa, DNasa I, enterotoxina de Staphylococcus, una proteína antiviral Pokeweed, gelonina, toxina de la difteria, exotoxina de Pseudomonas, endotoxina de Pseudomonas, L-asparaginasa, o PEG L-asparaginasa. En otra modalidad, uno, dos o más de un inhibidor de crecimiento y una sustancia citotóxica, como un péptido tóxico, se pueden combinar y usar para modificar el anticuerpo anti-Epirregulina. Como se describió anteriormente, el anticuerpo anti-Epirregulina puede estar enlazado con el inhibidor de crecimiento antes mencionado o una sustancia citotóxica, como un péptido tóxico o una sustancia química radiactiva, a través de un enlace covalente o un enlace no covalente. En la técnica son conocidos los métodos para producir los ADC enlazados con tal inhibidor de crecimiento o tal sustancia citotóxica, como un péptido tóxico o una sustancia radiactiva. Ejemplos de grupos enlazadores cuando un anticuerpo anti-Epirregulina y un inhibidor de crecimiento o una sustancia citotóxica, como un péptido tóxico o una sustancia radiactiva, están directamente enlazados entre sí incluyen un enlace disulfuro que usa grupos SH. Específicamente, el enlace disulfuro intramolecular en la región Fe del anticuerpo anti-Epirregulina es reducido con un agente reductor como ditiotreitol, y el enlace disulfuro dentro de la molécula de inhibidor del crecimiento o la sustancia citotóxica es igualmente reducido para que los dos queden unidos por la enlace disulfuro. Antes del enlace, ya sea el anticuerpo o ya sea uno de el inhibidor de crecimiento o la sustancia citotóxica pueden ser activado por un agente promotor de la activación, como el reactivo de Ellman, de manera que se promueva la formación del enlace disulfuro entre las dos moléculas. Ejemplos preferidos no limitantes de otros métodos para enlazar directamente el anticuerpo anti-Epirregulina y el inhibidor de crecimiento o la sustancia citotóxica, como un péptido tóxico o una sustancia radiactiva, incluyen un método que usa una base de Schiff, método de la carbodiimida, método del éster activo (método de la N -hidroxisueccinímida), método que usa un anhídrido mixto, y método que usa una reacción diazo.

Los siguientes pueden ser ejemplos del péptido tóxico usado en la presente invención: -Cadena A de la toxina diftérica (Langone et al. (Methods in Enzymology (1993) 93, 307-308)) -Exotoxina de Pseudomonas (Pai et al. (Nat. Med. (1996) 2 (3), 350-353)) -Cadena de ricina (Ricin A Chain) (Fulton et al. (J. Biol. Chem. (1986) 261, 5314-5319); Sivam et al. (Cáncer Res. (1987) 47, 3169-3173); Cumber et al. (J. Immunol. Methods (1990) 135, 15-24); Wawrzynczak et al. (Cáncer Res. (1990) 50, 7519-7562); Gheeite er al. (J. Immunol. Methods (1991) 142, 223-230)) -Cadena A de ricina deglicosilada (Thorpe et al. (Cáncer Res. (1987) 47, 5924-5931)) -Cadena de abrina (Wawrzynczak et al. (Br. J. Cáncer (1992) 66, 361-366); Wawrzynczak et al. (Cáncer Res (1990) 50, 7519-7562); Sivam et al. (Cáncer Res. (1987) 47, 3169-3173); Thorpe et al. (Cáncer Res. (1987) 47, 5924-5931)) -Gelonin (Sivam et al. (Cáncer Res. (1987) 47, 3169-3173); Cumber et al. (J. Immunol. Methods (1990) 135, 15-24); Wawrzynczak er al. (Cáncer Res. (1990) 50, 7519-7562); Bolognesi et al. (Clin. Exp. Immunol. (1992) 89, 341-346)) -PAP-s o proteína antiviral Pokeweed de semillas (Bolognesi er a/. (Clin. Exp. Immunol. (1992), 89, 341-346)) -Briodin (Bolognesi er al. (Clin. Exp. Immunol. (1992) 89, 341-346)) -Saporin (Bolognesi et al. (Clin. Exp. Immunol. (1992), 89, 341-346)) -Momordin (Cumber et al. (J. Immunol. Methods (1990) 135, 15-24); Wawrzynczak et al. (Cáncer Res. (1990) 50, 7519-7562); Bolognesi et al. (Clin. Exp. Immunol. (1992) 89, 341-346)) -Momorcochin (Bolognesi et al. (Clin. Exp. Immunol. (1992) 89, 341-346)) -Dianthin 32 (Bolognesi et al. (Clin. Exp. Immunol. (1992) 89, 341-346)) -Dianthin 30 (Stirpe et al. (FEBS Let. (1986) 195, 1-8)) -Modeccin (Stirpe et al. (FEBS Let. (1986) 195, 1-8)) -Viscumin (Stirpe ef al. (FEBS Let. (1986) 195, 1-8)) -Volkesin (Stirpe et al. (FEBS Let. (1986) 195, 1-8)) -Dodecandrin (Stirpe et al. (FEBS Let. (1986) 195, 1-8)) -Tritin (Stirpe et al. (FEBS Let. (1986) 195, 1-8)) -Luffin (Stirpe et al. (FEBS Let. (1986) 195, 1-8)) -Trichokirin (Casellas et al. (Eur. J. Biochem. (1988) 176, 581-588); Bolognesi et al. (Clin. Exp. Immunol. (1992) 89, 341- 346)) Toxinas o agentes farmacéuticos proteicos o peptídicos también se pueden enlazar al anticuerpo anti-Epirregulina mediante técnicas de ingeniería genética. Específicamente, un ADN que codifica el péptido tóxico antes mencionado y un ADN que codifica el anticuerpo anti-Epirregulina de la presente invención se pueden fusionar en marco para producir un ADN recombinante, y después son insertados en un vector de expresión para construir un vector recombinante. Después, este vector es introducido en células huésped apropiadas para generar células transformadas, las que son cultivadas para expresar el ADN insertado en las células. Se puede obtener un conjugado anticuerpo anti-Epirregulina-fármaco al que el péptido tóxico está enlazado mediante aislamiento y purificación a partir de la solución de cultivo. Cuando se obtienen proteínas de fusión del anticuerpo, típicamente los ADN respectivos están enlazados de manera que las toxinas o fármacos proteicos están ubicados en el extremo C terminal del anticuerpo, pero no están limitados al mismo. También es posible interposiciones un enlazador peptídico entre el anticuerpo y la toxina o agente farmacéutico proteínico.

Inhibidores del crecimiento En una modalidad no limitante, los inhibidores del crecimiento pueden preferentemente incluir agentes que dañan el ADN, agentes antimitóticos, y/o antimetabolitos. Los agentes que dañan el ADN pueden ser agentes alquilantes, inhibidores de la topoisomerasa y/o intercaladores de ADN. Los ejemplos preferidos no limitantes de los inhibidores del crecimiento pueden incluir carboplatino (agente alquilante de ADN), etopósido (inhibidor de topoisomerasa II), doxorrubicina (intercalador de ADN), docetaxel (agente antimitótico), y Gemzar (gemcitabina, antimetabolito).

Al menos uno de los siguientes agentes puede ser seleccionado como el agente alquilante. Es decir, al menos un agente alquilante seleccionado entre clorambucilo, ciclofosfamida, ifosfamida, mecloretamina, melfalán, mostaza de uracilo, tiotepa, busulfán, carmustina, lomustina, estreptozocina, carboplatino, cisplatino, satraplatino, oxaliplatino, altretamina, ET-743, XLI19 (becatecarin), dacarbazina, clormetina, bendamustina, trofosfamida, uramustina, fotemustina, nimustina, prednimustina, ranimustina, semustina, nedaplatino, tetranitrato de triplatino, manosulfan, treosulfano, temozolomida, carboquona, triaziquona, trietilenmelamina, y procarbazin se puede usar como el agente alquilante.

Al menos uno de los siguientes agentes puede ser seleccionado como el inhibidor de topoisomerasa. Es decir, al menos un inhibidor de topoisomerasa seleccionado de entre doxorrubicina (Doxil), daunorrubicina, epirrubicina, idarrubicina, antracenodiona (Novantrone), mitoxantrona, mitomicina C, bleomicina, dactinomicina, plicatomicina, ilinotecan (Camptosar), camptotecina, rubitecan, belotecan, etopósido, tenipósido, y topotecan (Hycamptin) se puede usar como el inhibidor de topoisomerasa.

Al menos un inhibidor de topoisomerasa seleccionado de proflavina, doxorrubicina (adriamicina), daunorubicina, dactinomicina, y talidomida se pueden usar como el intercalador de ADN.

Al menos uno de los siguientes agentes puede ser seleccionado como agente antimitótico. Al menos un inhibidor de topoisomerasa seleccionado de entre paclitaxel (Abraxane)/Taxol, docetaxel (Taxotere), BMS-275183, Xyotax, Tocosal, vinorlebine, vincristina, vinblastina, vindesina, vinzolidina, etopósido (VP-16), tenipósido (VM-26), ixabepilona, larotaxel, ortataxel, tesetaxel, y ispinesib se pueden usar como el agente antimitótico.

Al menos uno de los siguientes agentes puede ser seleccionado como el antimetabolito. Al menos un inhibidor de topoisomerasa seleccionado de entre fluorouracilo (5-FU), floxuridina (5-FUdR), metotrexato, Xeloda, Arranon, leucovorina, hidroxiurea, tioguanina (6-TG), mercaptopurina (6-MP), citarabina, pentostatina, fosfato de fludarabina, cladribina (2-CDA), asparaginasa, gemcitabina, pemetrexed, bortezomib, aminopterina, raltitrexed, clofarabina, enocitabina, sapacitabine, azacitidina, y similares se puede usar como el antimetabolito.

Cuando un conjugado anticuerpo anti-Epirregulina-fármaco es incorporado en una célula, la sustancia citotóxica, como un péptido tóxico, o el inhibidor del crecimiento enlazado al conjugado pueden inducir la muerte celular de la célula que incorpora este anticuerpo. Por lo tanto, el anticuerpo al que está enlazado el inhibidor del crecimiento o la sustancia citotóxica, como un péptido tóxico, preferentemente también tiene actividad de internalización. En la presente invención, un "anticuerpo que tiene actividad de internalización" se refiere a un anticuerpo que es transportado en una célula (en el citoplasma, vesículas, otros organelos, y similares) tras la unión a Epirregulina en la superficie celular. El que un anticuerpo tenga o no tenga actividad de internalización puede ser confirmado usando métodos conocidos por los expertos en la técnica. Por ejemplo, la actividad de internalización puede ser confirmada mediante el método de poner en contacto un anticuerpo anti-Epirregulina enlazado a una sustancia marcada con células que expresan Epirregulina y determinar si la sustancia marcada se incorpora en las células, o el método de poner en contacto un anticuerpo anti-Epirregulina enlazado a un inhibidor del crecimiento o a una sustancia citotóxica, como un péptido tóxico, con células que expresan Epirregulina y determinar si se induce muerte celular en las células que expresan Epirregulina. Más específicamente, sí o no un anticuerpo tiene actividad internalización puede ser confirmado, por ejemplo, por el método descrito en los Ejemplos descritos más adelante.

Después de que un anticuerpo que tiene citotoxicidad, como ADCC, se une a un antígeno objetivo expresado en la superficie celular, el anticuerpo permanece en la superficie celular a través de la unión al antígeno, y células efectoras, como células NK, se unen a las regiones Fe del anticuerpo, y este provoca que las células efectoras induzcan citotoxicidad contra células que expresan el antígeno objetivo. En contraste, el anticuerpo que se usa como ADC es preferentemente internalizado en las células después de la unión al antígeno. Como se puede estimar a partir del mecanismo de acción antes mencionado, normalmente se considera que, un anticuerpo que preferentemente daña las células objetivo por citotoxicidad, como ADCC, tiene una baja actividad de internalización, y un anticuerpo que daña las células objetivo en forma de una ADC tiene una alta actividad de internalización (Anticancer Research (1993) 13, 2207-2212). Sorprendentemente, en contraste con esto, los anticuerpo anti-Epirregulina de la presente solicitud no sólo suprimen la proliferación de células que expresan Epirregulina mediante su actividad neutralizante, sino que también inducen daño celular a las células que expresan Epirregulina por citotoxicidades, como ADCC; y por otro lado, también se han encontrado que los conjugados anticuerpo-fármaco que contienen anticuerpos anti-Epirregulina de la presente solicitud inducen citotoxicidad contra las células que expresan Epirregulina.

Anticuerpo de bajo peso molecular En una modalidad no limitante, los anticuerpos anti-Epirregulina incluidos en el conjugado anticuerpo anti-Epirregulina-fármaco de la presente invención pueden ser anticuerpos de bajo peso molecular. Un anticuerpo de bajo peso molecular contiene un fragmento de anticuerpo que carece de una porción de un anticuerpo completo (por ejemplo, la IgG entera). Mientras tenga la actividad para unirse al antígeno Epirregulina, las deleciones parciales de una molécula de anticuerpo son permisibles. Los fragmentos de anticuerpo de la presente invención contienen preferentemente una región variable de cadena pesada (VH) y/o una región variable de la cadena ligera (VL). La secuencia de aminoácidos de VH o VL puede tener sustituciones, deleciones, adiciones, y/o inserciones. Además, mientras tenga la actividad para unirse al antígeno Epirregulina, VH y/o VL pueden estar parcialmente eliminadas. La región variable puede estar quimerizada o humanizada. Ejemplos específicos de los fragmentos de anticuerpos incluyen Fab, Fab', F(ab')2, y Fv. Los ejemplos específicos de los anticuerpos de bajo peso molecular incluyen fragmentos Fab, Fab', F(ab')2, Fv, scFv (Fv de cadena sencilla), diacuerpos, y sc(Fv)2 ((Fv)2 de cadena sencilla). Los multímeros de estos anticuerpos (por ejemplo, dímeros, trímeros, tetrámeros y polímeros) están también incluidos en los anticuerpos de bajo peso molecular de la presente invención.

Los anticuerpos de bajo peso molecular se pueden obtener tratando un anticuerpo con una enzima para producir fragmentos de anticuerpos. Enzimas conocidas que producen fragmentos de anticuerpos son, por ejemplo, papaína, pepsina, y plasmina. De manera alternativa, los genes que codifican estos fragmentos de anticuerpo puede ser insertados en vectores de expresión; unas células huésped apropiadas, introducidas con los vectores de expresión, pueden ser cultivadas para expresar fragmentos de anticuerpo; y a continuación, se puede obtener los fragmentos de anticuerpo aislándolo del medio de cultivo y purificándolos (ver, por ejemplo, Co et al., (J. Immunol. (1994) 152, 2968-2976); Better et al., (Methods in Enzymology (1989) 178, 476-496); Plueckthun et al., (Methods in Enzymology (1989) 178, 476-496); Lamoyi (Methods in Enzymology (1989) 121, 652-663); Rousseaux et al., (Methods in Enzymology (1989) 121, 663-669); Bird er al., (TIBTECH (1991) 9, 132-137).

Un diacuerpo se refiere a un fragmento bivalente de anticuerpo construido por fusión de genes (Hollinger er al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA (1993) 90: 6444-6448; EP 404,097; WO 1993/11161; y similares). Un diacuerpo es un dímero compuesto por dos cadenas polipeptídicas. Generalmente, en cada una de las cadenas polipeptídicas que constituyen el dímero, VL y VH están enlazados por un enlazador dentro de la misma cadena. El enlazador en un diacuerpo generalmente es lo suficientemente corto para evitar la unión entre VL y VH. Específicamente, los residuos de aminoácidos que constituyen el enlazador son, por ejemplo, cinco residuos o menos. Por lo tanto, VL y VH, que son codificadas por la misma cadena polipeptídica, no pueden formar un fragmento de la región variable de la cadena sencilla, y forman un dímero con otro fragmento de la región variable de la cadena sencilla. Como resultado, los diacuerpos tienen dos sitios de unión a antígeno. El scFv puede ser obtenido ligando la región V de la cadena H y la región V de la cadena L de un anticuerpo. Específicamente, el scFv se puede preparar ligando la región V de la cadena H y la región V de ia cadena L a través de un enlazador, preferentemente un enlazador peptídico (Huston et al., Proc. Nati. Acad. Sci. U.S. A., (1988) 85, 5879-5883). La región V de la cadena H y la región V de la cadena L del scFv se pueden derivar de cualquiera de los anticuerpos descritos en el presente documento, como los anticuerpos anti-Epirregulina. La estructura y propiedad del enlazador peptídico de ligar las regiones V no está particularmente limitada. Por ejemplo, cualquier péptido de cadena sencilla que consiste en 3 a 25 residuos o más o menos, se puede usar como el enlazador.

El sc(Fv)2 es un anticuerpo de bajo peso molecular preparado mediante el enlace de dos VHs y VLs con dos enlazadores o similares para formar una sola cadena (Hudson et al., J. Immunol. Methods (1999) 231, 177-189). El sc(Fv)2 se pueden producir, por ejemplo, mediante el enlace de los scFv con un enlazador.

Composiciones farmacéuticas En otro aspecto, la presente invención proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden un anticuerpo anti-Epirregulina de la presente invención como un ingrediente activo. Además, la presente invención se refiere a inhibidores del crecimiento celular, en particular agentes antineoplásicos, o agentes para suprimir la recurrencia o metástasis del cáncer, que comprenden un anticuerpo anti-Epirregulina de la presente invención como un ingrediente activo. Preferentemente, los inhibidores del crecimiento celular y agentes antineoplásicos o agentes para suprimir la recurrencia o metástasis del cáncer de la presente invención se administran a un sujeto que sufre de cáncer o que pueden sufrir de cáncer en el futuro.

En la presente invención, los inhibidores del crecimiento celular que comprenden un anticuerpo anti-Epirregulina como un ingrediente activo también pueden ser expresados como métodos para suprimir el crecimiento celular, los que comprenden la etapa de administrar un anticuerpo anti-Epirregulina a un sujeto; usos de un anticuerpo anti-Epirregulina para producir inhibidores del crecimiento celular; o anticuerpo anti-Epirregulina para uso en la supresión del crecimiento celular.

Además, en la presente invención, los agentes antineoplásicos o agentes para suprimir la recurrencia o metástasis del cáncer que comprenden un anticuerpo anti-Epirregulina como un ingrediente activo, también pueden ser expresados como métodos para prevenir o tratar el cáncer o métodos para suprimir la recurrencia o metástasis del cáncer, el que comprenden la etapa de administrar un anticuerpo anti-Epirregulina a un sujeto; uso de un anticuerpo anti-Epirregulina para producir agentes antineoplásicos o agentes para suprimir la recurrencia o metástasis del cáncer; o anticuerpo anti-Epirregulina para uso en la prevención o el tratamiento del cáncer o la supresión de la recurrencia o metástasis del cáncer.

En la presente invención, "que comprende un anticuerpo anti-Epirregulina como un ingrediente activo" significa que comprende un anticuerpo anti-Epirregulina como el principal ingrediente activo, y no hay ninguna limitación con respecto al contenido del anticuerpo anti-Epirregulina. Los anticuerpos incluidos en las composiciones farmacéuticas de la presente invención (por ejemplo, inhibidores del crecimiento celular y agente antineoplásico de la presente invención, y los similares de aquí en adelante) no están particularmente limitados, siempre y cuando se unan a la proteína Epirregulina, y puedan ejemplificarse por los anticuerpos descritos en el presente documento.

Las composiciones farmacéuticas de la presente invención se pueden administrar a sujetos (pacientes), ya sea por vía oral o parenteral. Se prefiere la administración parenteral. Tales métodos de administración incluyen específicamente la administración por inyección, administración transnasal, administración pulmonar, y administración transdérmica. Para la administración mediante inyección, una composición farmacéutica de la presente invención puede ser administrada sistémica o localmente, por ejemplo, inyección intravenosa, inyección intramuscular, inyección intraperitoneal, e inyección subcutánea. El método de administración se puede seleccionar apropiadamente de acuerdo con la edad y los síntomas del paciente. La dosis se puede seleccionar, por ejemplo, en el intervalo de 0.0001 mg a 1000 mg por kilogramo de peso corporal por administración. De manera alternativa, la dosis se puede seleccionar, por ejemplo, en el intervalo de 0.001 mg/cuerpo a 100.000 mg/cuerpo por paciente. Sin embargo, las composiciones farmacéuticas de la presente invención no se limitan a estas dosis.

Las composiciones farmacéuticas de la presente invención se pueden formular de acuerdo con métodos convencionales (por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Science, última edición, Mark Publishing Company, Easton, U.S. A), y también pueden contener vehículos y aditivos farmacéuticamente aceptables. Ejemplos incluyen agentes tensioactivos, excipientes, agentes colorantes, agentes aromatizantes, conservantes, estabilizantes, tampones, agentes de suspensión, agentes isotonizantes, aglutinantes, disgregantes, lubricantes, agentes que promueven la fluidez, y correctores. Sin limitarse a estos, otros portadores comúnmente usados pueden ser apropiadamente usados. Los ejemplos específicos de portadores incluyen ácido silícico anhidro ligero, lactosa, celulosa cristalina, manitol, almidón, carmelosa de calcio, carmelosa sódica, hidroxipropil celulosa, hidroxipropil metil celulosa, dietilaminoacetato de polivinilacetal, polivinilpirrolidona, gelatina, triglicéridos de ácidos grasos de cadena media, aceite de ricino endurecido con polioxietileno 60, sacarosa, celulosa de carboximetilo, almidón de maíz, sales inorgánicas, y similares.

Los anticuerpos anti-Epirregulina se han descrito anteriormente como anticuerpos de unión a proteínas Epirregulina incluidos en las composiciones farmacéuticas de la presente invención. Las células que están unidas por los anticuerpos anti-Epirregulina no están particularmente limitadas, siempre y cuando las células sean células que expresen Epirregulina. Las células que expresan Epirregulina preferidas de la presente invención son células cancerosas. Más preferentemente, las células son células de cáncer de colon, células de adenocarcinoma de pulmón, células de cáncer de páncreas, células de cáncer de estómago, células de cáncer de esófago, y las células de cáncer renal. Los métodos de la presente invención se pueden aplicar tanto a focos primarios como metastásicos de estos tipos de cáncer. Las células de cáncer más preferidas son células de cáncer de colon primario, células de cáncer de colon metastásico, y células de cáncer de páncreas.

En la presente invención se logra "poner en contacto", por ejemplo, mediante la adición de un anticuerpo a una solución de cultivo de células que expresan Epirregulina cultivadas en un tubo de prueba. En este caso, el anticuerpo se puede añadir en forma de, por ejemplo, una solución o un sólido obtenido mediante secado por congelación o similar. Cuando se añade el anticuerpo como una solución acuosa, la solución acuosa usada puede puramente contener sólo el anticuerpo, o la solución puede incluir, por ejemplo, los tensioactivos antes mencionados, excipientes, agentes colorantes, perfumes, conservantes, estabilizantes, tampones, agentes de suspensión, agentes isotónicos, aglutinantes, disgregantes, lubricantes, agentes promotores de fluidez, o agentes aromatizantes. La concentración para la adición no está particularmente limitada, pero la concentración final en el cultivo que ser apropiadamente usada está preferentemente en el intervalo de 1 pg/ml a 1 g/ml, más preferentemente 1 ng/ml a 1 mg/ml, y aún más preferentemente 1 pg/ml a 1 mg/ml.

Además, en otra modalidad, se logra "poner en contacto" en la presente invención mediante la administración de un anticuerpo a un animal no humano al cual se ha trasplantado en el cuerpo una célula que expresa Epirregulina, o a un animal que porta células cancerosas que expresan endógenamente Epirregulina. El método de administración puede ser administración oral o parenteral. El método de administración especialmente preferente es la administración parenteral, y, específicamente, el método de administración es, por ejemplo, la administración por inyección, administración transnasal, la administración transpulmonar, o transdérmica. Ejemplos de administración por inyección incluyen las administraciones sistémicas y locales de composiciones farmacéuticas, inhibidores de la proliferación celular y agentes antineoplásicos de la presente invención mediante inyección intravenosa, inyección intramuscular, inyección intraperitoneal, inyección subcutánea, o similares. Un método de administración apropiado se puede seleccionar de acuerdo con la edad y los síntomas del animal de prueba. Cuando se administra como una solución acuosa, la solución acuosa usada puede puramente contener sólo el anticuerpo, o la solución puede incluir, por ejemplo, los tensioactivos antes mencionados, excipientes, agentes colorantes, perfumes, conservantes, estabilizantes, tampones, agentes de suspensión, agentes isotonizantes, aglutinantes, disgregantes, lubricantes, agentes para promover la fluidez, o agentes aromatizantes. La dosis puede ser seleccionada, por ejemplo, dentro del intervalo de 0.0001 mg a 1.000 mg por kg de peso corporal en cada administración. De manera alternativa, por ejemplo, la dosificación para cada paciente se puede seleccionar dentro del intervalo de 0.001 a 100.000 mg/cuerpo. Sin embargo, la dosis de anticuerpo de la presente invención no se limita a estas dosis.

Agentes terapéuticos para el cáncer o agentes para suprimir la recurrencia o metástasis del cáncer, los cuales se administran a sujetos que portan células cancerosas que expresan la proteína Epirregulina La presente invención proporciona agentes terapéuticos para el cáncer o agentes para suprimir la recurrencia o metástasis del cáncer, en donde los sujetos a los que se administran los agentes terapéuticos para el cáncer o los agentes para suprimir la recurrencia o metástasis del cáncer son los sujetos que portan células cancerosas que expresan la proteína Epirregulina, los que son detectados usando una muestra de tejido aislada. Además de los métodos descritos en el presente documento, el nivel de expresión de la proteína Epirregulina se puede determinar por métodos conocidos por los expertos en la técnica. Para determinar si a un sujeto se le va a administrar o no agentes terapéuticos para el cáncer o agentes para suprimir la recurrencia o metástasis del cáncer de la presente invención, se puede determinar el nivel de expresión de la proteína Epirregulina en una muestra de tejido aislada de un sujeto candidato. Si se detecta la proteína Epirregulina en la muestra, el sujeto del que se deriva la muestra puede ser objeto a la administración de agentes terapéuticos para el cáncer o agentes para suprimir la recurrencia o metástasis del cáncer de la presente invención. El nivel de expresión de la proteína Epirregulina no está limitado a un valor numérico en particular, pero en una modalidad no limitante, se puede establecer apropiadamente del intervalo de valores numéricos en el orden de 103, 104, 105, 106, 107, y 108. Como una modalidad no limitante, el nivel de expresión de la proteína Epirregulina seleccionado de uno cualquiera de 1 x 103, 2 x 103, 3 x 103, 4 x 103, 5 x 103, 6 x 103, 7 x 103, 8 x 103, 9 x 103, 1 x 104, 2 x 10\ 3 x 1 O4, 4 x 104, 5 x 104, 6 x 104, 7 x 104, 8 x 104, 9 x 104, 1 x 105, 2 x 105, 3 x 105, 4 x 105, 5 x 105, 6 x 105, 7 x 105, 8 x 105, 9 x 105, 1 x 106, 2 x 106, 3 x 106, 4 x 106, 5 x 106, 6 x 106, 7 x 106, 8 x 106, 9 x 10s, 1 x 107, 2 x 107, 3 x 107, 4 x 107, 5 x 107, 6 x 107, 7 x 107, 8 x 107, 9 x 107, 1 x 108, 2 x 10\ 3 x 106, 4 x 108, 5 x 108, 6 x 108, 7 x 108, 8 x 108, y 9 x 108 se puede mostrar como un ejemplo preferido del valor numérico (valor umbral) que se puede establecer como el estándar para la selección de los controles que van a recibir la administración. Los valores numéricos mencionados anteriormente pueden ser los calculados con una cifra significativa; y en este caso, por ejemplo, el nivel de expresión de EREG de 1 x 103 calculada con una cifra significativa puede ser un nivel de expresión de EREG que tiene un valor numérico de uno cualquiera de 0,5 x 103, 0,6 x 103, 0,7 x 103, 0,8 x 103, 0,9 x 103, 1,0 x 103, 1,1 x 103, 1,2 x 103, 1,3 x 103, 1,4 x 103 si se calcula con dos cifras significativas.

Muestras de tejido El término "muestra de tejido" usado en la presente invención se refiere a cualquier muestra biológica que se pueda obtener desde un fluido corporal individual (por ejemplo, sangre, suero, plasma, y fluido espinal), cultivo de tejidos, secciones de tejido, o similares. Las muestras de los sujetos se pueden usar como ejemplos preferidos de muestras biológicas. Las muestras preferidas de los sujetos son tejidos obtenidos de los sujetos, y más preferentemente tejidos de colon de los sujetos. La biopsia, un método conocido, se usa preferentemente como un método para la recolección de tejidos de colon. Medios conocidos pueden ser usados apropiadamente como los medios para biopsia. Tales ejemplos incluyen la obtención de tejidos por biopsia, como biopsia por aspiración, biopsia de agarre, biopsia con esponja, biopsia para citodiagnóstico, biopsia endoscópica, biopsia por aspiración con aguja fina, biopsia con aguja, biopsia pulmonar transbronquial, o la obtención de tejidos durante la cirugía.

En la presente invención, ya que las muestras de tejido se observan con luz transmitida bajo un microscopio, se cortan de tal manera que la luz usada en el microscopio se transmite lo suficiente a través de las muestras de tejido. Antes del corte, las muestras de tejido son fijadas. En concreto, las muestras de tejido son solidificadas por deshidratación o se desnaturalizan las proteínas en los tejidos/células para matar rápidamente las células que constituyen los tejidos. Los tejidos resultantes tienen una estructura estabilizada e insolubilizada. En primer lugar, las muestras de tejido a ser fijadas se cortan en fragmentos que tienen un tamaño y unas formas adecuadas para preparar secciones embebidas en parafina usando un cuchillo de corte, como un bisturí. Posteriormente, los fragmentos se sumergen en una solución de fijación, un reactivo usado para llevar a cabo la fijación. La solución de fijación usada es preferentemente formalina, o más preferentemente formalina amortiguada neutra. La concentración de la formalina amortiguada neutra se selecciona apropiadamente de acuerdo con las características o propiedades físicas de las muestras de tejido. La concentración se puede cambiar apropiadamente y se usa entre 1% y 50%, preferentemente entre 5% y 25%, y más preferentemente entre 10% y 15%. La solución de fijación en la cual se han sumergido las preparaciones de tejido se desairea adecuadamente usando una bomba de vacío. La fijación se lleva a cabo dejando las muestras de tejido en la solución de fijación durante varias horas bajo condiciones de presión normal y temperatura ambiente. El tiempo requerido para la fijación se puede seleccionar apropiadamente dentro del intervalo de 1 hora a 7 días, preferentemente 2 horas a 3 días, o preferentemente 3 horas a 24 horas, y más preferentemente 4 horas a 16 horas. Las muestras fijadas apropiadamente además se sumergen en un amortiguador de fosfato o similar durante varias horas (el tiempo se puede seleccionar apropiadamente dentro del intervalo de 2 horas a 48 horas, preferentemente 3 horas a 24 horas, y más preferentemente 4 horas a 16 horas).

A continuación, de las muestras de tejido fijadas, preferentemente se preparan secciones de corte mediante un método de seccionamiento congelado o un método de seccionamiento con parafina. Los ejemplos preferidos del método de seccionamiento congelado incluyen un método que consiste en congelar los tejidos colocándolos en el compuesto O.C.T. (Miles. Inc.), y cortando los tejidos congelados usando un criostato (aparato para preparar secciones congeladas). En el método de seccionamiento con parafina, las muestras de tejido fijadas se sumergen en un agente de inclusión, el cual a continuación es fijado para así conferir una dureza apropiada e uniforme a las secciones. Como un agente de inclusión se puede usar preferentemente parafina. Las muestras de tejido fijadas se deshidratan usando etanol. Específicamente, las muestras de tejido se deshidrataron mediante la inmersión de las muestras de tejido secuencialmente en etanol al 70%, etanol al 80%, y etanol al 100%. El tiempo y el número de veces necesarias para la inmersión se pueden seleccionar apropiadamente dentro de los intervalos de 1 hora a varios días y una vez a tres veces, respectivamente. Por otra parte, la inmersión se puede llevar a cabo a temperatura ambiente o a 4°C. En el caso de la inmersión a 4°C, es preferible un tiempo de inmersión más largo, por ejemplo durante toda la noche. Posteriormente, la fase líquida se sustituye por xileno, y después las muestras de tejidos se embeben en parafina. El tiempo requerido para la sustitución del xileno de la fase líquida se puede seleccionar adecuadamente dentro del intervalo de una hora a varias horas. En este procedimiento, la sustitución se puede realizar a temperatura ambiente o a 4°C. En el caso del reemplazo a 4°C, se prefiere un tiempo de reemplazo más largo, por ejemplo, durante toda la noche. El tiempo y el número de veces necesarias para la inclusión en parafina se pueden seleccionar apropiadamente dentro de los intervalos de una hora a varias horas y una vez a cuatro veces, respectivamente. En este procedimiento, la inclusión se puede llevar a cabo a temperatura ambiente o a 4°C. Para la inclusión a 4°C, se prefiere un tiempo de inclusión más largo, por ejemplo, durante toda la noche. Por otra parte, las muestras de tejido pueden ser embebidas en parafina preferentemente mediante el uso de un aparato de inclusión en parafina (por ejemplo, EG1160, Leica) que procesa de forma automática la reacción embebida en parafina.

Las muestras de tejido embebidas en parafina, como se describió anteriormente, están unidas a una base para preparar un "bloque" que a continuación se corta, usando un micrótomo, hasta un espesor deseado seleccionado de espesores de 1 pm a 20 µ??. Las secciones de tejido cortadas en secciones finas se dejan reposar en portaobjetos de vidrio que se usa como un soporte transparente para la unión. En este caso, se pueden usar preferentemente portaobjetos de vidrio recubiertos con poli-L-lisina al 0.01% (Sigma) secos para evitar que se despeguen las secciones de tejido. Las secciones de tejido fijadas se secan al aire durante un período adecuado de tiempo seleccionado de entre varios minutos y una hora.

Recuperación de antígenos En el método de la presente invención, la reactividad de un antígeno, del cual la reactividad a anticuerpo ha sido disminuida debido a la fijación con formalina, se recupera. En la presente invención, se aplica un método de recuperación de epítopo inducida por proteasa (método PIER, por sus siglas en inglés) a una de las dos muestras de tejidos, mientras que a la otra muestra se aplica un método de recuperación de epítopo inducida por calor (método HIER, por sus siglas en inglés). Después, la diferencia en el grado de tinción entre ellas después de la reacción anticuerpo es digitalizada.

El método de recuperación de epítopo inducida por calor usa apropiadamente un método de calentamiento por microondas, un método de calentamiento en autoclave, un método de calentamiento por tratamiento de ebullición, o similares. Cuando se realiza el tratamiento de ebullición a una potencia de 780 W para mantener la temperatura de la solución a aproximadamente 98°C, el tiempo requerido para la recuperación incluyendo el tratamiento se selecciona apropiadamente de entre cinco y 60 minutos y es, por ejemplo, diez minutos. El tratamiento de recuperación de antígeno se puede realizar en un amortiguador de citrato de sodio 10 mM, así como también en la Target Retrieval Solution (DakoCytomation) disponible en el mercado o similares. En los ejemplos descritos más adelante, se usa la Target Retrieval Solution. Cualquier amortiguador o solución acuosa se usa preferentemente siempre que como resultado de un tratamiento de recuperación un epítopo en el antígeno reconocido por un anticuerpo Epirregulina se pueda unir al anticuerpo, de tal manera que se puede detectar un complejo antígeno-anticuerpo que se describe más adelante.

El tipo o el origen de la proteasa usada en el método de recuperación de epítopo inducida por proteasa no está particularmente limitado, y generalmente una proteasa disponible pueden ser apropiadamente seleccionada y usada. Los ejemplos preferidos de proteasas para ser usadas incluyen 0.05% de pepsina en ácido clorhídrico 0.01 N, 0.1% de tripsina que además contiene 0.01% de CaCI2 en un amortiguador Tris a pH 7.6, y 1 a 50 pg/ml de proteasa K en un amortiguador Tris -HCI 10 mM a pH 7.8 que contiene EDTA 10 mM y 0.5% de SDS. Además, cuando se usa la proteasa K, el pH de su solución de reacción se selecciona apropiadamente de entre 6.5 y 9.5, y pueden ser usados apropiadamente un reactivo SH, un inhibidor de tripsina, o un inhibidor de quimotripsina. También se incluye en tales ejemplos específicos de la proteasa preferida, una proteasa unida al Histofine HER2 Kit (MONO) (Nichirei Bioscience) descrita en el presente documento. La recuperación del epítopo inducida por proteasa se realiza generalmente a 37°C. Sin embargo, la temperatura de reacción se puede cambiar apropiadamente dentro del intervalo de 25°C a 50°C. Cuando la recuperación del epítopo inducida por la proteasa se lleva a cabo a 37°C, el tiempo de reacción se selecciona apropiadamente de entre, por ejemplo, un minuto y cinco horas, y es, por ejemplo, 15 minutos, 30 minutos, 45 minutos, 1 hora, 2 horas, 3 horas, o 4 horas. Después de completado el tratamiento de recuperación, las muestras de tejido tratadas se lavan con un amortiguador de lavado. Se usa preferentemente como el amortiguador de lavado PBS (solución salina amortiguada con fosfato). Además, se puede usar preferentemente un amortiguador Tris-HCI. Las condiciones de lavado generalmente adoptan un método que implica realizar tres lavados de 5 minutos a temperatura ambiente. Sin embargo, el tiempo de lavado y la temperatura se pueden cambiar apropiadamente.

Las sustancias para detección usadas en la presente invención generalmente incluyen anticuerpos, ácidos nucleicos, y similares. Por ejemplo, es posible (1) detectar la proteína EREG por un método inmunológico usando anticuerpos para EREG que pueden detectar la proteína EREG, y (2) detectar ARNm que codifica para EREG usando una molécula de ácido nucleico (por ejemplo, ADN, ARN, o ARNm) complementario al ARNm que codifica para EREG, el que puede detectar el ARNm, o, de acuerdo con sea apropiado, una molécula de ácido nucleico complementario, en donde la detección hace uso de la hibridación entre las moléculas de ácido nucleico involucradas (por ejemplo el método FISH). En la presente invención, se usan técnicas ¡nmunológicas, en particular, se usa preferentemente tinción inmunohistoquímica.

Reacción de muestras de tejido con un anticuerpo Epirrequlina La muestra de tejido sometida al tratamiento de recuperación de antígeno basado en el método de recuperación de epítopo inducida por calor y la muestra de tejido sometida al tratamiento de recuperación de antígeno basado en el método de recuperación del epítopo inducida por proteasa se hacen reaccionar con un anticuerpo Epirregulina como el anticuerpo primario. Esta reacción se lleva a cabo en condiciones apropiadas para que el anticuerpo Epirregulina reconozca un epítopo en el antígeno y se forme un complejo antígeno-anticuerpo. La reacción se realiza generalmente a 4°C durante toda la noche o a 37°C durante una hora. Sin embargo, las condiciones de reacción se pueden cambiar apropiadamente dentro de un intervalo adecuado para que el anticuerpo reconozca un epítopo en el antígeno y se forme un complejo antígeno-anticuerpo. Por ejemplo, la temperatura de reacción se puede cambiar dentro del intervalo de 4°C a 50°C, y el tiempo de reacción puede cambiar entre un minuto y siete días. Al realizar la reacción a una temperatura baja, es preferible un tiempo de reacción más largo. Después de que se completa la reacción con el anticuerpo primario, las muestras de tejido se lavan con un amortiguador de lavado. Se usa preferentemente como el amortiguador de lavado PBS (solución salina amortiguada con fosfato). Además, se puede usar preferentemente un amortiguador Tris-HCI. Las condiciones de lavado generalmente adoptan un método que implica realizar tres lavados de 5 minutos a temperatura ambiente. Sin embargo, el tiempo de lavado y la temperatura se pueden cambiar apropiadamente.

Posteriormente, las muestras de tejido sometidas a reacción con anticuerpo primario se hacen reaccionar con un anticuerpo secundario que reconoce al anticuerpo primario. Generalmente se usa un anticuerpo secundario marcado de antemano con una sustancia de marcado para visualizar el anticuerpo secundario.

Las sustancias marcadoras preferidas incluyen: tintes fluorescentes como isotiocianato de fluoresceína (FITC), Cy2 (Amersham), y Alexa488 (Molecular Probes); enzimas como peroxidasa y fosfatasa alcalina; y oro coloidal.

La reacción con el anticuerpo secundario se lleva a cabo en condiciones apropiadas para que el anticuerpo Epirregulina y el anticuerpo secundario que reconoce al anticuerpo Epirregulina formen un complejo antígeno-anticuerpo. La reacción se realiza generalmente a temperatura ambiente o 37°C durante 30 minutos a una hora. Sin embargo, las condiciones de reacción se pueden cambiar apropiadamente dentro de un intervalo adecuado para que el anticuerpo Epirregulina y el anticuerpo secundario formen un complejo antígeno-anticuerpo. Por ejemplo, la temperatura de reacción se puede cambiar dentro del intervalo de 4°C a 50°C, y el tiempo de reacción puede cambiar entre un minuto y siete días. Al realizar la reacción a una temperatura baja, es preferible un tiempo de reacción más largo. Después de que la reacción con el anticuerpo primario llega a su término, las muestras de tejido se lavan con un amortiguador de lavado. Se usa preferentemente como amortiguador de lavado PBS (solución salina amortiguada con fosfato). Además, se puede usar preferentemente un amortiguador Tris-HCI. Las condiciones de lavado generalmente adoptan un método que implica realizar tres lavados de 5 minutos a temperatura ambiente. Sin embargo, el tiempo de lavado y la temperatura se pueden cambiar apropiadamente.

A continuación, las muestras de tejido sometidas a reacción con un anticuerpo secundario se hacen reaccionar con una sustancia para la visualización de la sustancia marcadora. Cuando se usa peroxidasa como la sustancia de marcado para el anticuerpo secundario, las muestras de tejido se incuban con una solución de reacción obtenida mediante la mezcla, inmediatamente antes de la incubación, de cantidades iguales de una solución de peróxido de hidrógeno acuoso al 0.02% y una solución de DAB (diaminobenzidina) ajustada a una concentración de 0.1% con un amortiguador Tris-HCI 0.1M (pH 7.2). Además de DAB, se puede seleccionar apropiadamente sustratos cromogénicos como DAB-Ni y AEC+ (todos de DAKO). Durante el curso de la incubación, el grado de desarrollo de color en el tiempo se observa bajo un microscopio. En el punto donde se confirma el desarrollo de color apropiado, la reacción de la visualización se completa mediante la inmersión de las muestras de tejido en PBS.

Cuando se usó fosfatasa alcalina como una sustancia de marcado para el anticuerpo secundario, las muestras de tejido se incubaron con una solución de sustrato BCIP (fosfato de 5-bromo-4-cloro-3-indolilo)/NBT (nitroazul de tetrazolio) (Zymed) (NBT a una concentración de 0.4 mM y BCIP a una concentración de 0.38 mM, se disuelven en un amortiguador de carbonato de sodio 50 mM (pH 9.8) que contiene MgCI2 10 mM y NaCI 28 mM). Por otra parte, además de BCIP y NBT, se pueden usar apropiadamente Permanent Red, Fast Red, o Fuchsin + (todos de DAKO). Antes de la incubación, las muestras de tejido pueden ser pre-incubadas a temperatura ambiente durante un minuto a varias horas con un amortiguador Tris-HCI 0.1 (pH 9.5) que contiene cloruro de sodio 0.1M, cloruro de magnesio 50 mM, y cloruro de levamisol que es un inhibidor de la fosfatasa alcalina endógena (Nacalai Tesque) a una concentración de 1 mM. Durante el curso de la incubación, las muestras de tejido se observan a lo largo del tiempo bajo un microscopio. Cuando se observaron los depósitos de formazán púrpura, un producto final de reacción, la reacción fue terminada mediante el lavado de las muestras de tejido con agua o mediante la adición de TBS que contenía 2% de alcohol de polivinilo. Después, las muestras de tejido fueron lavadas con TBST (TBS que contiene Tween 20 al 0.1%). Cuando se usa oro coloidal como una etiqueta para el anticuerpo secundario, el oro coloidal es visualizado mediante la fijación de plata metálica a las partículas de oro por mejora de plata. El método de mejora de la plata es conocida por los expertos en la técnica.

Cuando cualquiera de los colorantes fluorescentes como FITC (isotiocianato de fluoresceína), Cy2 (Amersham), y Alexa488 (Molecular Probes, Inc.) se usa como una sustancia de marcado para el anticuerpo secundario, es innecesaria una etapa de reacción para visualizar la sustancia. Una luz emitida por la irradiación con una luz en la longitud de onda de excitación de la sustancia fluorescente se puede detectar apropiadamente mediante el uso de un microscopio de fluorescencia.

En la presente invención, se detecta la proteína Epirregulina contenida en las muestras de tejido aisladas de sujetos de prueba como se describe anteriormente. Se puede determinar si la proteína Epirregulina detectada contenida en las muestras de tejido es altamente expresada en los tejidos que contienen células de cáncer mediante puntuaciones de intensidad de tinción que digitalizan los patrones de tinción obtenidos por el método de tinción inmunohistoquímica mencionado arriba. Los siguientes criterios pueden ejemplificarse como una modalidad no limitante de la digitalización de los patrones de tinción: - Puntuación de intensidad de tinción de 0: ninguna o menos del 10% de las células tumorales en el tejido de prueba son células positivas para Epirregulina; - Puntuación de intensidad de tinción de 1: las células positivas para Epirregulina representan el 10% o más de las células tumorales en el tejido de prueba, pero tienen una intensidad de tinción débil localizada en una porción de la membrana de las células tumorales; - Puntuación de intensidad de tinción de 2: las células positivas para Epirregulina representan el 30% o más de las células tumorales en el tejido de prueba, o las células positivas para Epirregulina representan el 10% o más de las células tumorales en el tejido de prueba y tienen una intensidad de tinción moderada localizada en la membrana de las células tumorales; y - Puntuación de intensidad de tinción de 3: las células positivas para Epirregulina representan el 60% o más de las células tumorales en el tejido de prueba, o las células positivas para Epirregulina representan el 10% o más de las células tumorales en el tejido de prueba y tienen una intensidad de tinción fuerte localizada en la membrana de las células tumorales.

Además, en la presente invención, al determinar el nivel de expresión de Epirregulina en muestras de tejido aisladas de sujetos de prueba sobre la base de las puntuaciones de intensidad de tinción que digitalizan los patrones de tinción obtenidos por el método de tinción inmunohistoquímica descrito anteriormente, éste se puede comparar con las imágenes de tinción patrones para los niveles de expresión predeterminados de la proteína Epirregulina preparados para la corrección de la detección. Para determinar el nivel de expresión de la proteína Epirregulina, se puede usar apropiadamente un método conocido que usa perlas marcadas por fluorescencia usadas para preparar una curva de calibración para la cuantificación de antígeno (por ejemplo, BD Quantibrite PE™).

El sí la Epirregulina contenida en una muestra de tejido aislado de un sujeto de prueba está altamente expresada se puede determinar por el método antes mencionado. Ejemplos de "altamente expresado" se pueden seleccionar apropiadamente del intervalo de 1 x 104, 2 x 104, 3 x 104, 4 x 104, 5 x 104, 6 x 104, 7 x 104, 8 x 104, 9 x 10\ 1 x 105, 2 x 105, 3 x 105, 4 x 105, 5 x 105, 6 x 105, 7 x 10s, 8 x 105, 9 x 10s, 1 x 106, 2 x 106, 3 x 106, 4 x 106, 5 x 106, 6 x 106, 7 x 106, 8 x 106, 9 x 105, 1 x 107, 2 x 107, 3 x 107, 4 x 107, 5 x 107, 6 x 107, 7 x 107, 8 x 107, y 9 x 107 en términos del número de moléculas de Epirregulina expresadas por célula.

Todas las referencias de la técnica anterior citadas en la presente memoria descriptiva se incorporan aquí para su referencia.

Ejemplos A continuación, la presente invención se describirá más específicamente por medio de los Ejemplos, pero no está limitada a los mismos.

Ejemplo 1 Humanización del anticuerpo EP27 quimérico 1-1. Selección de secuencias de marco para la humanización Se humanizó el anticuerpo EP27 quimérico (descrito en el documento WO 2008/047723) que comprende regiones variables de ratón y regiones constantes de lgG1 humana. Las CDR y FR se determinaron de acuerdo con la definición de Kabat (numeración de Kabat).

En primer lugar, usando bases de datos se compararon las secuencias de la región variable de anticuerpos humanos y las secuencias de la región variable de EP27 de ratón, para seleccionar las secuencias de FR humanas bajo que se pueden usar como una plantilla de humanización. Se usaron como bases de datos la base de datos de IMGT (http://www.imgt.org/) y NCBI GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/). Las secuencias de FR seleccionadas se muestran en la Tabla 2.

Tabla 2 Posteriormente, las secuencias de la región variable del anticuerpo humanizado fueron diseñadas mediante el enlace de las secuencias de CDR (Tabla 3, SEC ID Nos.: 9 a 14) de las cadenas H y L de la región variable EP27 a la FR humana seleccionada más arriba. Ellas fueron designadas como la secuencia HA de la región variable de la cadena H humanizada (SEC ID No.: 15) y la secuencia LA de la región variable de la cadena L humanizada (SEC ID No.: 16).

Tabla 3 1-2. Diseño de la región variable HJ de EP27 humanizado Se ha informado que en la secuencia de FR1 de la cadena H seleccionada en la Tabla 2, los residuos de aminoácidos en las posiciones 2, 4, 24, 27, y 29, indicados de acuerdo con la numeración de Kabat, contribuyen a la estabilización de la estructura del anticuerpo mediante la formación del núcleo superior (Ewert et al., Methods. 2004 Oct;34(2): 184-99). De acuerdo con la definición de Chothia, los residuos de aminoácidos en las posiciones 26 a 30, indicados de acuerdo con la numeración de Kabat, están incluidos en la CDR1 (Honegger et al., J. Mol. Biol. (2001) 309, 657-670). En base a la información anterior, para preparar un anticuerpo humanizado que tenga actividad de unión a antígeno equivalente a la del anticuerpo EP27 quimérico, los residuos de aminoácidos antes mencionados fueron restaurados a los residuos presentes en la secuencia de la región variable de EP27 de ratón. Así, la FR1 de la cadena H humanizada (Tabla 4, SEC ID No.: 17) fue nuevamente diseñada mediante la restauración de los residuos de aminoácidos en las posiciones 2, 24, 27, 28, 29, y 30, indicados de acuerdo con la numeración de Kabat, en la FR1 de la cadena H humanizada (SEC ID No.: 1) seleccionada en la Tabla 2, a los residuos de aminoácidos presentes en la secuencia de la región variable de EP27 de ratón.

El residuo de aminoácido en la posición 93, indicado de acuerdo con la numeración de Kabat, en la secuencia de FR3 de la cadena H seleccionada en la Tabla 2 es Ala, mientras que el residuo en la secuencia de la región variable de EP27 de ratón es Val. En base a los datos de secuencias de la línea germinal humana y de ratón en la base de datos IMGT (http://www.imgt.org/), se confirmó que sólo un pequeño número de secuencias contienen Val en la posición correspondiente. Se considera que el Val en la posición 93, indicado de acuerdo con la numeración de Kabat, en la secuencia de la región variable de EP27 de ratón está involucrado en la unión a antígeno. Por lo tanto, la FR3 de la cadena H humanizada (Tabla 4, SEC ID No.: 18) fue nuevamente diseñada mediante la restauración del residuo de aminoácido en la posición 93, indicado de acuerdo con la numeración de Kabat, en la FR3 de la cadena H humanizada (SEC ID No.: 3) seleccionada en la Tabla 2, con el residuo presente en la secuencia de la región variable de EP27 de ratón.

A partir de la secuencia HA de región variable de la cadena H humanizada (SEC ID No.: 15), se diseñaron nuevamente la secuencia HJ de región variable de la cadena H humanizada (SEC ID No.: 19) que comprende la FR1 (Tabla 4, SEC ID No.: 17) y FR3 (Tabla 4, SEC ID No.: 18) y se muestra en la Tabla 4, con sus nuevos diseños.

Tabla 4 1-3. Diseño de las regiones variables LB y L18 humanizadas de EP27 El residuo de aminoácido en la posición 49, indicado de acuerdo con la numeración de Kabat, en la secuencia de FR2 de la cadena L seleccionada en la Tabla 2 es Tyr, mientras que el residuo en la secuencia de la región variable de EP27 de ratón es GIn. En base a los datos de secuencias de la línea germinal humana y de ratón en la base de datos IMGT (http://www.imgt.org/), se confirmó que sólo un pequeño número de secuencias contienen GIn en la posición correspondiente. Esto sugirió la posibilidad de que GIn en la posición 49 contenida en la secuencia de la región variable de EP27 de ratón esté involucrada en la unión a antígeno. Basado en esto, la FR2 de la cadena L humanizada (Tabla 5, SEC ID No.: 20) fue nuevamente diseñada mediante la sustitución del residuo de aminoácido en la posición 49, indicado de acuerdo con la numeración de Kabat, en la FR2 de la cadena L humana (SEC ID No.: 6), seleccionada en la Tabla 2, con el residuo de aminoácido presente en la secuencia de la región variable de EP27 de ratón.

Se ha informado que en la secuencia de FR3 de la cadena L seleccionada en la Tabla 2, el residuo de aminoácido en la posición 71, indicado de acuerdo con la numeración de Kabat, contribuye a la estabilización de la estructura del anticuerpo mediante la formación de núcleo superior (Ewert et al., Methods. 2004 Oct; 34(2): 184-99). Para preparar un anticuerpo humanizado que tenga una actividad de unión a antígeno equivalente a la del anticuerpo EP27 quimérico, para sustituir el residuo de aminoácido anterior con el residuo de aminoácido de la secuencia de la región variable de EP27 de ratón, la FR3 de la cadena L humanizada (Tabla 5, SEC ID No.: 21) fue nuevamente diseñada sustituyendo el residuo de aminoácido en la posición 71, indicado de acuerdo con la numeración de Kabat, en la FR3 de la cadena L humana (SEC ID No.: 7), seleccionada en la Tabla 2, con el residuo de aminoácido en la secuencia de la región variable de EP27 de ratón.

A partir de la secuencia LA de región variable de la cadena L humanizada (SEC ID No.: 16), se diseñó la secuencia LB de región variable de la cadena L humanizada (SEC ID No.: 22 que comprende los nuevos diseños de FR2 y FR3 (Tabla 5, SEC ID Nos.: 20 y 21).

También, a partir de la secuencia LA de región variable de la cadena L humanizada (SEC ID No.: 16), se diseñó la secuencia L18 de región variable de la cadena L humanizada (SEC ID No.: 24) que comprende la FR2 (Tabla 5, SEC ID No.: 20) y FR3 de la secuencia de la cadena L de anticuerpo humano (Tabla 5, SEC ID No.: 23) de nuevo diseño que se muestran en el número de acceso No. AB064134 (NCBI GenBank).

Tabla 5 1-4. Preparación de la secuencia del anticuerpo EP27 humanizado En primer lugar, para preparar un ADNc de la región variable de EP27 humanizado, se diseñaron oligo-ADNs sintéticos para las cadenas H (HJ) y L (LB). A continuación, los oligo-ADNs sintéticos se mezclaron para amplificar un fragmento del gen que codifica la región variable del anticuerpo EP27 humanizado por un método conocido para los expertos en la técnica, como PCR de ensamblaje. Por último, el fragmento amplificado se clonó en un vector de expresión de célula animal apropiado, y se enlazó a un gen de región constante de lgG1 humana. La secuencia de nucleótidos del vector de expresión resultante se determinó por un método conocido por los expertos en la técnica.

Para la heterogeneidad derivada de la secuencia C-terminal (G1, SEC ID No.: 25) de la cadena H del anticuerpo IgG humana, se ha informado la eliminación del residuo de lisina en el aminoácido C-terminal, y la amidación del grupo amino C-terminal por deleción de dos aminoácidos C-terminales, glicina y lisina (Anal Biochem. 2007 Jan 1; 360(1): 75-83.). Como un método para reducir la heterogeneidad, se conoce un método que elimina dos aminoácidos en el extremo C terminal de la cadena H, es decir, glicina en la posición 446 y lisina en la posición 447, indicados de acuerdo con la numeración Estadounidense (WO 2009/041613). Deseablemente, la heterogeneidad derivada de la secuencia C-terminal de la cadena H también está ausente en el anticuerpo EP27 humanizado. Así, la secuencia de lgG1 (G1d, SEC ID No.: 26) que carece de glicina en la posición 446 y lisina en la posición 447, indicados de acuerdo con la numeración Estadounidense, en la IgG 1 humana se puede usar como una secuencia de la región constante. Por otro lado, una cadena ? nativa humana (k, SEC ID No.: 27 se puede usar como la secuencia de la región constante de la región constante de la cadena L. Se prepararon HJ-G1d (SEC ID No.: 28) y LB-k (SEC ID No.: 29), respectivamente, como la cadena H y la cadena L de la secuencia del anticuerpo EP27 humanizado obtenido como se describe anteriormente. Se informó de alotipos para la región constante de I gG 1 (Jefferis et al., mAbs 1: 4, 1-7; July/August 2009). Además de la antes mencionada región constante de tipo G1m17,1 (SEC ID No.: 26) de lgG1, los tipos G1m17 (SEC ID No.: 30) y G1m3 (SEC ID No.: 31) se puede usar para la preparación de la anticuerpo EP27 humanizado. 1-5. Evaluación del anticuerpo EP27 humanizado Para evaluar la secuencia del anticuerpo EP27 humanizado diseñado, la cadena H (HJ-G1d, SEC ID No.: 28) y la cadena L (LB-k, SEC ID No.: 29) fueron co-expresadas para obtener el anticuerpo EP27 humanizado HJ-G1d/LB-k. Específicamente, los vectores de expresión de la cadena H y L preparados como se mencionó anteriormente se transfectaron transitoriamente en la cepa HEK293H derivada de células de carcinoma de riñón embrionario humano (Invitrogen) o células FreeStyle293 (Invitrogen) para expresar los anticuerpos. Del sobrenadante de cultivo obtenido se purificaron los anticuerpos mediante un método conocido por los expertos en la técnica usando rProtein A Sepharose™ Fast Flow (GE Healthcare) o similar. La absorbancia de una solución que contiene anticuerpo se midió a la longitud de onda de 280 nm usando un espectrofotómetro, y la concentración de anticuerpo se calculó usando la absorbancia medida y el coeficiente de absorbancia determinado por el método de PACE (Protein Science 1995; 4: 2411-2423). Por otro lado, se preparó como un control cH-G1 /cL-k, que es el anticuerpo EP27 quimérico, mediante el mismo método usando las cadenas H (cH-G1, SEC ID No.: 32) y L (cL-k, SEC ID No.: 33).

Se evaluó la capacidad del anticuerpo EP27 humanizado para unirse a epirregulina humana (SEC ID No.: 167) usando un ensayo de evaluación de inhibición de unión a Epirregulina (Ejemplo de Referencia 5) para el anticuerpo EP27 quimérico. Cuando la concentración CI50 del anticuerpo EP27 quimérico (cH-G1/cL-k) se fijó en 100, el valor del anticuerpo EP27 humanizado H J-G1d/LB-k fue 24. 1-6. Preparación de anticuerpos EP27 humanizados con actividad equivalente a la del anticuerpo quimérico Las secuencias fueron diseñadas con la sustitución de algunos residuos de aminoácidos de la secuencia de FR en la secuencia HJ-G1d de la cadena H del anticuerpo EP27 humanizado con residuos de aminoácidos de la secuencia de la región variable de EP27 de ratón. En primer lugar, se diseñó una secuencia (SEC ID No.: 35) con la sustitución de Thr-Asp, que son los residuos de aminoácidos en las posiciones 75 y 76 indicados de acuerdo con la numeración de Kabat, de la secuencia de FR3 humana, con Ser-Asn, que son residuos de aminoácidos contenidos en las secuencias de región variable de EP27 de ratón; y se diseñó una secuencia (SEC ID No.: 36) con la sustitución solamente de Asp en la posición 76 con Asn que es un residuo de aminoácido de la secuencia de la región variable de EP27 ratón (Tabla 6). Después, se preparó HS-G1d (SEC ID No.: 37), la cual es una secuencia de la región variable de la cadena H humanizada que tiene una secuencia de FR3 (SEC ID No.: 35) mostrada en la Tabla 6, mediante la introducción de una mutación en un vector de expresión que comprende la secuencia de la región variable de la cadena H humanizada, HJ-G1d (SEC ID No.: 28). La sustitución de residuos de aminoácidos se introdujo mediante un método conocido por los expertos en la técnica, usando PCR o métodos similares. De manera similar, se preparó HY-G1d (SEC ID No.: 38), la cual es una secuencia de la región variable de la cadena H humanizada que comprende una secuencia de FR3 (SEC ID No.: 36) mostrada en la Tabla 6. Los anticuerpos EP27 humanizados, HS-G 1 d/LB-k, HY-G 1 d/LB-k, y HY-G 1 d/L18-k, fueron obtenidos de la misma manera que en el Ejemplo 1-4. La capacidad de los anticuerpos obtenidos de unirse a epirregulina humana se evaluó mediante la inhibición de la unión del anticuerpo EP27 quimérico a Epirregulina (Ejemplo de Referencia 5). Como resultado, cuando la concentración CI50 del anticuerpo EP27 quimérico (cH-G1/cL-k) se estableció como 100, las concentraciones CI50 de los anticuerpos EP27 humanizados, HS-G 1 d/LB-k, HY-G1 d/LB-k, y HY-G1 d/L18-k, fueron 142, 146, y 100, respectivamente.

Por consiguiente, como resultado de la humanización se encontraron secuencias de anticuerpos EP27 humanizados que tienen una capacidad de unión a antígeno equivalente a la del anticuerpo EP27 quimérico, así como también riesgos de inmunogenicidad reducidos en comparación con el anticuerpo EP27 quimérico.

Tabla 6 Ejemplo 2 Introducción de mutaciones que suprimen las reacciones de desamidación, isomerización, e hidrólisis Los anticuerpos usados para los productos farmacéuticos presentan heterogeneidad, aunque sean anticuerpos monoclonales obtenidos desde clones derivados de una única célula productora de anticuerpos. Se conoce que tal heterogeneidad de los anticuerpos ocurre como resultado de modificaciones como oxidación, desamidación, isomerización, e hidrólisis, y se incrementa cuando las proteínas, incluyendo anticuerpos, se almacenan durante mucho tiempo o son sometidos a condiciones de estrés como el estrés calórico y el estrés lumínico (Heterogeneity of Monoclonal Antibodies: Journal of Pharmaceutical Sciences, vol.97, No.7, 2426-2447). Sin embargo, las propiedades físicas de las proteínas, en particular, la homogeneidad y la estabilidad son muy importantes para el desarrollo de anticuerpos como productos farmacéuticos. Deseablemente, la heterogeneidad de una sustancia de interés debería ser reducida para así obtener, hasta donde sea posible, un único material.

La reacción de desamidación se produce de manera no enzimática en las cadenas laterales de asparagina y glutamina, y es una reacción que cambia la amida presentes en las cadenas laterales de asparagina y glutamina en ácido carboxílico. La isomerización es causada por la formación de una imida cíclica intermediaria inestable debida a la desamidación de la asparagina o la deshidratación del ácido aspártico como resultado del ataque del par de electrones del átomo de nitrógeno en el residuo del lado C-terminal a los grupos carbonilo en las cadenas laterales de asparagina y ácido aspártico. Este intermediario se cambia principalmente a ácido isoaspártico por escisión, mientras que el resto se cambia a ácido aspártico. Deseablemente, las reacciones de desamidación e isomerización que se producen durante el almacenamiento de las proteínas, como anticuerpos, deben ser suprimidas lo más posible, debido a que causan la heterogeneidad antes mencionada. Se ha informado que la reacción de desamidación tiende a ocurrir, en particular, en un sitio donde la glicina y asparagina son adyacentes entre sí (Asn-Gly) (Geiger et al., J. Biol. Chem. 1987; 262: 785-794). Además, se ha informado que la cadena peptídica de ácido aspártico es escindida mediante la reacción de hidrólisis; y, en particular, es probable que una secuencia (Asp-Pro) donde la prolina está presente en el lado C-terminal se degrade en condiciones ácidas (Segalas et al., FEBS Letters 1995; 371: 171-175).

En la secuencia de CDR de la secuencia HY de la región variable de la cadena H humanizada, los residuos de asparagina y ácido aspártico están presentes en las posiciones 31 (Asp), 52 (Asp), 54 (Asn), 56 (Asn), y 101 (Asp), indicados de acuerdo con la numeración de Kabat. En la secuencia de CDR de la secuencia LB de la región variable de la cadena L humanizada, están presentes en las posiciones 28 (Asp), 92 (Asp), y 93 (Asn), indicados de acuerdo con la numeración de Kabat. Se estudió sí las variantes que suprimen las reacciones de desamidación, isomerización, e hidrólisis se pueden obtener como resultado de la sustitución de residuos de aminoácidos en estos sitios.

Para suprimir las reacciones de degradación anteriores mediante la sustitución de residuos de aminoácidos, los residuos de aminoácidos fueron sustituidos en diferentes residuos. Específicamente, se prepararon H71-G1d (SEC ID No.: 49), H57-G1d (SEC ID No.: 50), H61-G1d (SEC ID No.: 51), H65-G1d (SEC ID No.: 52), H66-G1d (SEC ID No.: 53), H67-G1d (SEC ID No.: 54), H23-G1d (SEC ID No.. 55), y H40-G1d (SEC ID No.: 56) como genes de la cadena H que comprenden secuencias de CDR (SEC ID Nos.: 39 a 46) mostradas en la Tabla 7. De manera similar, se diseñaron L30-k (SEC ID No.: 57) y L32-k (SEC ID No.: 58) como genes de cadena L que comprenden las secuencias de CDR (SEC ID Nos.: 47 y 48) mostradas en la Tabla 7. Usando la técnica del Ejemplo 1, un vector gen de la cadena H introducido con un residuo sustituido fue co-expresado junto con el vector LB-k para obtener los anticuerpos EP27 humanizados, H71-G1d/LB-k, H57-G1 d/LB-k, H61-G1d/LB-k, H65-G1 d/LB-k, H66-G1 d/LB-k, H67-G1 d/LB-k, H23-G1d/LB-k, y H40-G 1 d/LB-k. De manera similar, un vector gen de la cadena L introducido con un residuo sustituido fue co-expresado junto con el vector HY-G1d el anticuerpos EP27 humanizado HY-G1d /L32-k. La capacidad de los anticuerpos obtenidos de unirse a epirregulina humana se evaluó como la inhibición de la unión a Epirregulina del anticuerpo EP27 quimérico (Ejemplo de Referencia 5), y el resultado se muestra en la Tabla 8. Esto demostró que los anticuerpos que comprenden las secuencias mostradas en la Tabla 7 tienen una actividad de unión equivalente a la del anticuerpo EP27 quimérico. Por lo tanto, se encontraron secuencias de anticuerpo humanizados EP27con degradación química, como desamidación e isomerización suprimidas.

Tabla 7 Tabla 8 Concentración CI50: concentración CI50 de cada anticuerpo cuando la concentración CI50 del anticuerpo EP27 quimérico (cH-G1/cL-k) se ajusta para que sea 100.

Ejemplo 3 Introducción de mutaciones que alteran el punto isoeléctrico Como un método para controlar la vida media en plasma de un anticuerpo, se conoce un método que modifica los residuos de aminoácidos expuestos en la superficie de la molécula de anticuerpo para controlar la carga superficial de la molécula (WO2007/114319 y WO2009/041543) Específicamente, se conoce que la vida media en plasma de un anticuerpo puede ser extendida mediante la reducción del valor del punto isoeléctrico (pl) del anticuerpo. Por otro lado, se conoce que la vida media en plasma de un anticuerpo se puede acortar mediante el aumento del punto isoeléctrico del anticuerpo para mejorar la transición del anticuerpo al tejido (Vaisitti ef al., J. Biol. Regul. Homeost. Agents. (2005) 19 (3-4), 105-112; Pardridge ef al., J. Pharmacol. Exp. Ther. (1998) 286 (1), 548-554).

De lo anterior, se espera que un anticuerpo EP27 humanizado cuyo punto isoeléctrico ha sido alterado tenga una actividad antitumoral más fuerte debido a que su vida media en plasma ha sido prolongada y su transición al tejido mejorada. Por lo tanto, los presentes inventores se enfocaron en identificar los residuos de aminoácidos que permiten el control de la farmacocinética de un anticuerpo mediante el ajuste de la carga superficial de la molécula de anticuerpo sin afectar a la actividad de unión a antígeno ni la conformación del anticuerpo EP27 humanizado. Específicamente, la búsqueda se llevó a cabo para los sitios de mutación que pueden bajar el punto isoeléctrico del anticuerpo EP27 humanizado HY-G1d/LB-k (cadena H, HY-G1d, SEC ID No.: 38; y cadena L, LB-k, SEC ID No.: 29) sin reducir mucho su actividad inhibidora de unión a antígeno.

Para la detección y selección de los residuos que pueden alterar el punto isoeléctrico de la región variable sin reducir significativamente la unión a Epirregulina se usó el modelo tridimensional del anticuerpo EP27 humanizado HY-G1d/LB-k. Específicamente, H3-G1d (SEC ID No.: 72), H5-G1d (SEC ID No.: 73), H6-G1d (SEC ID No.: 74), H7-G1d (SEC ID No.: 75), H8-G1d (SEC ID No.: 76), H9-G1d (SEC ID No.: 77), H10-G1d (SEC ID No.: 78), y H31-G1d (SEC ID No.: 79) fueron diseñados como los genes de la cadena H que comprenden uno o más de las secuencias de CDR (SEC ID Nos.: 59 a 71) mostradas en la Tabla 9. De forma similar, L1-k (SEC ID No.: 80), L2-k (SEC ID No.: 81), L12-k (SEC ID No.: 82), L20-k (SEC ID No.: 83), L21-k (SEC ID No.: 84), y L23-k (SEC ID No.: 85) fueron diseñados como genes de cadena L que comprenden las secuencias de CDR mostradas en la Tabla 9. Usando la técnica del Ejemplo 1, un vector gen de la cadena H introducido con residuos sustituidos fue coexpresado junto con el vector LB-k para obtener los anticuerpos EP27 humanizados, H3-G 1 d/LB-k, H5-G1 d/LB-k, H6-G1 d/LB-k, H7-G1d/LB-k, H8-G1 d/LB-k, H9-G1 d/LB-k, H10-G1d/LB-k, y H31-G1d/LB-k. De forma similar, un vector gen de la cadena L introducido con residuos sustituidos fue co-expresado junto con el vector HY-G1d para obtener los anticuerpos EP27 humanizados, HY-G1 d/L1 -k, HY-G1 d/L2-k, HY-G 1 d/L12-k, y HY-G 1 d/L63-k. La capacidad de los anticuerpos obtenidos de unirse a epirregulina humana se evaluó como la inhibición de la unión de Epirregulina al anticuerpo EP27 quimérico (Ejemplo de Referencia 5). Como resultado, como se muestra en la Tabla 10, las capacidades de unión a antígeno de los anticuerpos EP27 humanizados fueron equivalentes a la del anticuerpo EP27 quimérico. De la investigación anterior, se encontraron secuencias de anticuerpos EP27 humanizados cuyos puntos isoeléctricos pueden ser alterados.

Tabla 9 Tabla 10 Concentración CI50: concentración CI50 de cada anticuerpo cuando la concentración CI50 del anticuerpo EP27 quimérico (cH-G1/cL-k) se ajusta para que sea 100.

Ejemplo 4 Introducción de mutaciones que reducen la cantidad de agregado El controlar la cantidad de agregado en los productos farmacéuticos de proteínas es muy importante teniendo en cuenta el control de calidad y su influencia en la eficacia e inmunogenicidad (Curr. Opin. Biotechnol. (2009) 20 (6), 708-714). En general, la agregación está influenciada tanto por la estabilidad coloidal, debida al medioambiente que rodea a la solución de proteína, como por la estabilidad conformacional debida a la estructura de la proteína (J. Pharm. Sci. (2010) 100 (4), 1306-1315). De acuerdo con investigaciones referidas a formulaciones de preparaciones de anticuerpos, es posible obtener condiciones deseables que son efectivas para la estabilidad coloidal mediante la selección de la concentración de anticuerpo, pH, tipo de amortiguador, fuerza iónica, aditiva y similar. Por otro lado, la estabilidad conformacional depende en parte de las secuencias de aminoácidos; y por lo tanto, en el caso de los anticuerpos, se considera importante mantener las estructuras características como la estructura canónica de CDR, la secuencia de consenso de FR, y la interfaz VH/VL (Jung et al., J. Mol. Biol. (2001) 309 (3), 701-716; Xiang et al., J. Mol. Biol. (1995) 253 (3), 385-390; Ewert et al., Methods. (2004) 34 (2), 184-199; Vargas-Madrazo ef al., J. Mol. Recognit. (2003) 16 (3), 113-120; Morea et al., J. Mol. Biol. (1998) 275, 269-294; Vargas-Madrazo et al., J. Mol. Recognit. (2003) 16 (3), 113-120).

En base a los puntos de vista anteriores, en la presente invención, el diseño fue un esfuerzo para preparar anticuerpos humanizados que sean estructuralmente más estables. Como resultado, fue encontrado el anticuerpo EP27 humanizado HY-G1d/LB-k. Con el fin de reducir aún más la cantidad de agregado contenida en HY-G1d/LB-k, se sustituyeron los residuos hidrofóbicos contenidos en la CDR de HY-G1d/LB-k con residuos hidrofílicos, y se examinó el efecto inhibidor sobre la gregación mediante la atenuación de las interacciones hidrofóbicas entre moléculas.

Específicamente, H25-G1d (SEC ID No.: 92), H41-G1d (SEC ID No.: 93), H42-G1d (SEC ID No.: 94), H43-G1d (SEC ID No.: 95), H44-G1d (SEC ID No.: 96), y H45-G1d (SEC ID No.: 97) fueron diseñados como genes de la cadena H en los que cualquiera de las secuencias de CDR (SEC ID Nos.: 86 a 91) mostradas en la Tabla 11 se han introducido en el anticuerpo EP27 humanizado HY-G 1 d/LB-k (cadena H HY-G1d/SEC ID No.: 38; cadena L LB-k/SEC ID No.: 29). Usando la técnica del Ejemplo 1, un vector gen de la cadena H introducido con residuos sustituidos fue co-expresado junto con el vector LB-k para obtener los anticuerpos EP27 humanizados, H25-G1d/LB-k, H41-G1 d/LB-k, H42-G1d/LB-k, H43-G 1 d/LB-k, H44-G1 d/LB-k, y H45-G1d/LB-k. La cantidad de agregados contenidos en los anticuerpos EP27 humanizados se determinó por cromatografía de filtración en gel (Ejemplo de Referencia 9), y el resultado se muestra en la Tabla 12. Mediante éste procedimiento, se encontraron secuencias de los anticuerpos EP27 humanizados con una cantidad significativamente reducida de agregados en comparación con el anticuerpo EP27 quimérico (cH-G1d/cL-k).

Tabla 11 Tabla 12 La capacidad de los anticuerpos obtenidos de unirse a epirregulina humana se evaluó como la inhibición de la unión de epirregulina al anticuerpo EP27 quimérico (Ejemplo de Referencia 5). Como se muestra en la Tabla 13, las capacidades de unión a antígeno de los anticuerpos EP27 humanizados fueron equivalentes a la del anticuerpo EP27 quimérico. De la investigación anterior, se encontraron secuencias de anticuerpo EP27 humanizado con una cantidad de agregados reducida y una capacidad de unión a antígeno equivalente a la del anticuerpo EP27 quimérico.

Tabla 13 Concentración CI50: concentración CI50 de cada anticuerpo cuando la concentración CI50 del anticuerpo EP27 quimérico (cH-G1/cL-k) se ajusta para que sea 100.

Además, usando el método del Ejemplo 1se prepararon los siguientes anticuerpos que fueron diseñados como anticuerpos EP27 humanizados mediante la combinación arbitraria de secuencias que comprenden las sustituciones de residuos de aminoácidos que se encuentran en los Ejemplos 1 a 4: H87-G1d/LB-k (cadena H: SEC ID No.: 98; cadena L: SEC ID No.: 29), H87-G1d/L21-k (cadena H: SEC ID No.: 98; cadena L: SEC ID No.: 84), H87-G1d/L37-k (cadena H: SEC ID No.: 98; cadena L: SEC ID No.: 99).

Su capacidad de unirse a epirregulina humana fue evaluada como la inhibición de la unión de Epirregulina al anticuerpo EP27 quimérico (Ejemplo de Referencia 5). Como resultado, como se muestra en la Tabla 14, todos los anticuerpos tuvieron una capacidad de unión equivalente a la del anticuerpo EP27 quimérico (cH-G1 /cL-k). Además, la cantidad de agregados contenida en los anticuerpos EP27 humanizados se midió por cromatografía de filtración en gel (Ejemplo de Referencia 9), la temperatura intermedia de desnaturalización térmica (Tm) de Fab se midió con un calorímetro diferencial de barrido (Ejemplo de Referencia 10), y el punto isoeléctrico (pl) se midió mediante isoelectroenfoque (Ejemplo de Referencia 11). Como se muestra en la Tabla 14, se confirmó que las cantidades de agregados disminuyeron significativamente y se incrementaron los valores de Tm, en comparación con el anticuerpo EP27 quimérico (cH-G1d/cL-k). Por lo tanto, como se muestra en los Ejemplos 1 a 4, como resultado de la humanización se encontraron secuencias de anticuerpo EP27 humanizado con las que se logran riesgos inmunogenicidad reducidos, degradación química suprimida, puntos isoeléctricos inferiores, y cantidades de agregados reducida.

[Tabla 14 Concentración CI50: concentración CI50 de cada anticuerpo cuando la concentración CI50 del anticuerpo EP27 quimérico (cH-G1/cL-k) se ajusta para que sea 100.

Ejemplo 5 Introducción de mutaciones que mejoran la capacidad de unirse al antígeno de mono y reducir la inmunogenicidad Durante el desarrollo de fármacos, en general, las evaluaciones de toxicidad y seguridad en los estudios preclínicos se consideran importantes para la determinación de la dosificación y la evaluación de los diversos riesgos en los estudios clínicos. En el caso de los productos farmacéuticos de anticuerpos, su especificidad de unión al antígeno podría limitar la selección de especies animales usadas para los estudios preclínicos. En muchos casos, se seleccionan primates que son genéticamente cercanos a los humanos. Sin embargo, a veces, la evaluación usando primates no se juzga apropiada si el anticuerpo de interés no se une a un antígeno de primates, o si la capacidad de unión es significativamente diferente a su capacidad para unirse a un antígeno humano. Para hacer frente a estos casos, en los estudios preclínicos se hacen intentos para evaluar la toxicidad y seguridad mediante el uso de un anticuerpo sustituto que se une a un antígeno de la especies animal a ser usada, o se usan animales transgénicos que expresan antígenos humanos (Chapman et al., Nat. Rev. Drug Discov. (2007) 6, 120-126).

Las sustituciones de residuos de aminoácidos por métodos conocidos por los expertos en la técnica, por ejemplo, la maduración de afinidad usando bibliotecas de presentación en fagos o presentación en ribosomas, se cree que son efectivas para alterar la capacidad de unión a antígeno de un anticuerpo de interés. Además, en base a las estructuras tridimensionales de los sitios de unión de las regiones variables de antígenos y anticuerpos, se pueden usar técnicas computacionales para mejorar la reactividad cruzada entre especies (Farady et al., Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 19 (2009) 3744-3747). Sin embargo, no se ha publicado ningún informe sobre la alteración de la capacidad de unión a antígeno de un anticuerpo anti-epirregulina humana sin el uso de las técnicas computacionales y el cribado a gran escala. Además, no se ha revelado ninguna diferencia estructural entre la epirregulina mono y la epirregulina humana, y por lo tanto, no se ha mostrado ninguna orientación sobre que residuos de aminoácidos de un anticuerpo anti- epirregulina humana deben ser modificados para mejorar su actividad de unión a epirregulina de mono. En la presente invención, se diseñaron múltiples secuencias de anticuerpos mediante la sustitución de residuos de aminoácidos en sitios arbitrarios de las CDR. Usando la técnica del Ejemplo 1, se prepararon genes de anticuerpos con estos residuos sustituidos y los anticuerpos fueron expresados. Específicamente, fueron diseñadas secuencias en las cuales la sustitución con un residuo de Arg se realiza en CDR2 y CDR3 de la cadena H y CDR3 de la cadena L, mostradas en la Tabla 15, y se prepararon los anticuerpos que se muestran en la Tabla 16. Se evaluaron afinidades a epirregulina humana y de mono usando un dispositivo (Biacore) que emplea la resonancia de plasmones superficiales (Ejemplo de Referencia 6).

Como resultado, en comparación con el anticuerpo EP27 quimérico, las secuencias del anticuerpo EP27 humanizado sin afinidad reducida a epirregulina humana, aumentaron su afinidad a epirregulina de mono, y se encontraron bajas razones de afinidad (KD = valor KD para epirregulina mono/valor KD para epirregulina humana), que es un indicador que muestra la reactividad cruzada entre epirregulina mono y epirregulina humana (Figuras 1 y 2).

Tabla 15 Tabla 16 En el desarrollo de productos farmacéuticos médicos, la aparición de anticuerpos contra un fármaco después de su administración plantea problemas sobre la eficacia y la seguridad. Por lo tanto, es importante reducir la inmunogenicidad de un fármaco de interés. Están disponibles técnicas in vivo, in vitro, e in siHco para predecir la inmunogenicidad de los productos biológicos, y se han publicado informes sobre la correlación con la incidencia de anticuerpos contra fármacos en la práctica clínica (Baker et al., Curr. Drug Saf. (2010) 5 (4), 308-313; Bryson et al., BioDrugs. (2010) 24 (1), 1-8; Groot et al., Curr. Opin. Pharmacol. (2008) 8 (5), 620-626). En la presente invención, se pueden predecir las secuencias de anticuerpos humanizados EP27 que reducen los riesgos de inmunogenicidad sin perjudicar la capacidad de unión a antígeno de un anticuerpo de interés mediante la predicción de los epítopos de células T usando la técnica descrita en el Ejemplo de Referencia 13.

Para las secuencias que comprenden las alteraciones encontradas en los Ejemplos 1 a 4, se diseñaron secuencias con una combinación arbitraria de mutaciones que mejoran la afinidad por epirregulina mono y/o reducen la inmunogenicidad. Los anticuerpos EP27 humanizados así diseñados y enumerados en la Tabla 17 (SEC ID Nos.: 115 a 150) se prepararon usando el método del Ejemplo 1. Las secuencias de CDR mutadas de los anticuerpos EP27 humanizados enumerados en la Tabla 17 se muestran en la Tabla 18. Las afinidades a epirregulina humana y de mono fueron evaluadas usando un dispositivo (Biacore) que emplea resonancia de plasmones superficiales (Ejemplo de Referencia 6). Como se muestra en la Figura 3, la afinidad de cada uno de los anticuerpos EP27 humanizados por epirregulina humana fue equivalente a la afinidad del anticuerpo EP27 quimérico (cH-G1/cl_-k). Las razones de afinidad (= valor KD para epirregulina de mono/ valor KD para epirregulina humana) se compararon como un indicador de la diferencia en las afinidades por antígenos de mono y humano. Se confirmó que la diferencia en las afinidades de cada anticuerpo EP27 humanizado por los dos antfgenos se redujo significativamente en comparación con la del anticuerpo quimérico (Figura 4). Por lo tanto, se encontraron secuencias de anticuerpo EP27 humanizado que tienen una afinidad mejorada por epirregulina de mono sin reducir la afinidad por epirregulina humana.

Tabla 17 Tabla 18 Además, la cantidad de agregado contenido en los anticuerpos EP27 humanizados se midió por cromatografía de filtración en gel (Ejemplo de Referencia 9), y la temperatura intermedia de desnaturalización térmica (Tm) de los Fab preparados a partir de los anticuerpos EP27 humanizados se midió mediante calorímetro de barrido diferencial (Ejemplo de Referencia 10). Como se muestra en la Tabla 19, se confirmó que las cantidades de agregados se redujeron significativamente, y se incrementaron los valores de Tm, en comparación con los del anticuerpo EP27 quimérico (cH-G1 d/cL-k). Por lo tanto, como se muestra en los Ejemplos 1 a 5, como resultado de la humanización se encontraron secuencias de anticuerpo EP27 humanizado que comprenden riesgos inmunogenicidad reducidos, degradación química suprimida, puntos isoeléctricos inferiores, cantidades de agregados reducida, y capacidades de unión a antígeno mono mejorada.

Tabla 19 la razón de KD representa una razón relativa cuando el valor para cH-G1/cl_-k = 1.

Ejemplo 7 Actividad ADCC de cada anticuerpo de prueba usando células mononucleares de sangre periférica humana como células efectoras Se usaron células mononucleares de sangre periférica humana (en lo sucesivo denominadas como PBMC humanas, por sus siglas en inglés) como células efectoras para medir la actividad ADCC de cada anticuerpo de prueba como se describe en lo siguiente. Una fracción de células mononucleares recolectadas de sangre periférica humana se usó como células efectoras de origen humano. Como resultado, se encontró que todos los anticuerpos EP27 humanizados usados en la prueba inducían ADCC contra células MIA PaCa-2 (Ejemplo de Referencia) (Figura 5).

Ejemplo 8 Medición de la actividad de anticuerpos monoclonales anti-Epirregulina para neutralizar la estimulación del crecimiento celular provocado por Epirregulina humana o de mono.

Secuencias de anticuerpos EP27 humanizados con afinidad aumentada a Epirregulina de mono fueron reveladas en el Ejemplo 5. Para evaluar sus actividades en células, se midieron las actividades neutralizantes de anticuerpos EP27 humanizados sobre la estimulación del crecimiento celular de Epirregulina de mono y Epirregulina humana. Para las células se usó BAF_EGFR. A todos los anticuerpos EP27 humanizados evaluados en esta oportunidad se les examinó para detectar sus actividades neutralizantes que inhiben el crecimiento de células EGFR_BAF dependiente Epirregulina humana y de mono (Ejemplo de Referencia 8), y todos los anticuerpos EP27 humanizados mostraron una mayor actividad neutralizante contra Epirregulina de mono que el anticuerpo quimérico (Figuras. 6 y 7).

Ejemplo 9 Prueba de eficacia de fármaco para los anticuerpos EP27 humanizados usando un modelo in vivo Se evaluó la actividad antitumoral in vivo de los anticuerpos EP27 humanizados, de los cuales su actividad intracelular ha sido confirmada en los Ejemplos 7 y 8, usando un modelo de tumor humano injertado en ratón (Ejemplo de Referencia 14). Los efectos antitumorales de cada anticuerpo de prueba fueron evaluados en modelos en ratón trasplantados con células DLD-1 y MIA PaCa-2 de cáncer humano y se evaluaron midiendo el volumen del tumor en el día 7 después del el último día de la administración de muestra. Como resultado, como se muestra en la Figura. 8, cuando el anticuerpo cH-G1/cL-k, anticuerpo H206-G1d/L73-k, y anticuerpo H240-G 1 d/L73-k se administraron de forma individual a 10 mg/kg, en los modelos animales también se observó la excelente eficacia de los fármacos debido a los anticuerpos EP27 humanizados alterados.

Ejemplo 10 Tinción inmunohistoquímica usando un anticuerpo anti-Epirregulina Se estableció un método de tinción inmunohistoquímica, que refleja el nivel de expresión del antígeno, usando un anticuerpo EP27. La tinción inmunohistoquímica se llevó a cabo usando bloques de tejido embebidos en parafina preparados con tejidos de ratones SCID trasplantados con líneas celulares forzadas a expresar EREG en diferentes niveles de expresión, las cuales eran SKE-18 (la cantidad estimada de antígeno fue de 7,7 x 103), SKE-23 (la cantidad estimada de antígeno fue de 6,1 x 10 ), y SKE-4B2 (la cantidad estimada de antígeno fue de 2,9 x 10 5), y la célula huésped SK-HEP-1 (la cantidad de antígeno fue de 8,4 x 10 2). La expresión de EREG en estas finas secciones de tejido preparadas a partir de estos bloques de parafina se visualizó por incubación con un anticuerpo EP27 como el anticuerpo primario, seguido por la reacción con un anticuerpo policlonal anti-lgG de ratón en conejo (Jackson Immunoresearch Laboratories) como anticuerpo secundario, y un anticuerpo anti-lgG de ratón en cabra unido a HRP-polímero (Dako Cytomation) como anticuerpo terciario, y usando diaminobenzidina como sustrato. Como se muestra en la Figura 10, la gradación de la tinción observada en las células/tejidos teñidos depende de la cantidad de expresión de EREG. Además, se confirmó que la actividad ADCC in vitro del anticuerpo H240-G 1 d/L73-k dependía del nivel de expresión en estas células (Figura 11). En la investigación antes mencionada, se usó un anticuerpo bajo en fucosa por el anticuerpo H240-G1d/L73-k. El anticuerpo bajo en fucosa fue producido mediante el método descrito en WO2004/065540. En lo sucesivo en el presente documento, el anticuerpo bajo en fucosa también se conocerá como el anticuerpo EP27 humanizado Glycomab. La actividad ADCC in vitro del anticuerpo H240-G1 d/L73-k, (anticuerpo EP27 humanizado Glycomab), además de confirmarse en las antes mencionadas cuatro líneas celulares de expresión forzada de EREG, se confirmó en SKE-15 y SKE-10 que tienen un nivel de antígeno estimado de 2,8 x 104. De manera similar a la Figura 11, se confirmó la actividad ADCC in vitro del anticuerpo H240-G1 d/L73-k de acuerdo con el nivel de expresión de EREG en estas células (Tabla 20). Además, se confirmó la actividad de inhibición del crecimiento tumoral in vivo del anticuerpo H240-G1d/L73-k (anticuerpo EP27 humanizado Glycomab) de acuerdo con el nivel de expresión en estas células (Figura 12). Es decir, la evaluación del nivel de expresión de EREG por tinción inmunohistoquímica confirmó una correlación entre el nivel de expresión y la eficacia del fármaco.

Tabla 20 Ejemplo 11 Expresión de EREG en casos clínicos de cáncer de colon pobremente diferenciado Para examinar la expresión de EREG en nueve casos clínicos de cáncer de colon pobremente diferenciado, muestras de secciones finas embebidas en parafina de los mismos casos fueron teñidas mediante el método de tinción descrito en el Ejemplo 10. Como resultado, se confirmaron imágenes claramente positivas en 7/9 casos (Figura 13).

Ejemplo 12 Eficacia del fármaco del anticuerpo EP27 humanizado Glycomab contra la tumorigénesis de células madre de cáncer de colon Células madre de cáncer de colon (1 x 106 células) aisladas a partir de un modelo de tumor de cáncer de colon humano PLR123 (WO02012/046797) fueron trasplantadas en la región inguinal de ratones SCID. Desde el día siguiente a la administración de las células madre a los ratones SCID, el anticuerpo EP27 humanizado Glycomab se administró una vez a la semana a 10 mg/kg. Como resultado, la prueba de intervalos con signos de Wilcoxon (sistema SAS 8.02 TS nivel 02M0 y paquete preclínico SAS Versión 5.00.010720) confirmó que en el día 29 post-trasplante, la tumorigenicidad fue significativamente suprimida en el grupo al que se administró anticuerpo en comparación con el grupo de control como se muestra en la Figura 14.

Ejemplo 13 Eficacia del fármaco del anticuerpo EP27 humanizado Glycomab contra la metástasis de las células madre del cáncer de colon Células madre de cáncer de colon (2 x 106 células) células) aisladas a partir de un modelo de tumor de cáncer de colon humano PLR123 fueron trasplantadas en ratones SCID de color beige desde la vena de la cola. Tres días después de la administración de las células madre a los ratones, el anticuerpo EP27 humanizado Glycomab se administró una vez a la semana a 10 mg/kg. Como resultado, en el día 52 post-trasplante, se confirmó que el número de nódulos tumorales en los pulmones del ratón (número de lesiones metastásicas) y el tamaño del nodulo tumoral (diámetro de la lesión metastásica) se vieron suprimidos de forma significativa en el grupo al que se administró anticuerpo en comparación con el grupo de control como se muestra en la Figura 15.

Ejemplo 14 Eficacia del fármaco del anticuerpo EP27 humanizado Glycomab contra el cáncer de colon pobremente diferenciado Una sección de tejido de un tumor de cáncer de colon humano pobremente diferenciado COL-53-JCK (Instituto Central de Animales Experimentales) fue trasplantada en ratones SCID. Desde el día 14 después del trasplante de la sección de tejido tumoral, se administró el anticuerpo EP27 humanizado Glycomab una vez a la semana a 10 mg/kg. Como resultado de ello, la evaluación del volumen del tumor en el día 14 después de comenzar la administración de anticuerpo confirmó que el crecimiento tumoral se suprimió de forma significativa en el grupo al que se administró anticuerpo en comparación con el grupo de control (Figura 16).

Ejemplo 15 Eficacia del fármaco del anticuerpo EP27 humanizado Glycomab contra el cáncer de colon pobremente diferenciado Los tumores en el modelo PLR379 de tumor de cáncer de colon humano moderadamente diferenciado (PCT/JP20 2/072852) tienen una característica de yemas tumorales morfológicamente observables, pero la expresión de epirregulina se detectó independientemente de la localización de las yemas tumorales. Secciones de tejido tumoral de este PLR379 fueron trasplantadas en ratones SCID, y desde el día 21 después del trasplante de la sección de tejido tumoral, se administró el anticuerpo EP27 humanizado Glycomab una vez a la semana a 10 mg/kg. La evaluación del volumen del tumor en el día 18 después del comienzo de la administración de anticuerpo confirmó que el crecimiento tumoral se suprimió de forma significativa en el grupo al que se administró anticuerpo en comparación con el grupo de control (Figura 17).

Ejemplo 16 Expresión de EREG en el adenocarcinoma pulmonar clínico Para examinar la expresión EREG en siete casos clínicos de adenocarcinoma de pulmón, muestras en secciones finas embebidas en parafina de los casos fueron teñidas usando el método de tinción descrito en el Ejemplo 10. Como resultado, imágenes claramente positivas fueron confirmados en cuatro de los siete casos (Figura 18).

Ejemplo 17 Actividad ADCC del anticuerpo EP27 humanizado Glycomab usando células mononucleares de sangre periférica humana como células efectoras La actividad ADCC se evaluó para la línea Calu-3 de adenocarcinoma de pulmón humano usando PBMC humanas como células efectoras. Como resultado, se confirmó que el anticuerpo EP27 humanizado Glycomab inducía ADCC contra células Calu-3 (Figura 19).

Ejemplo 18 Eficacia del fármaco del anticuerpo EP27 humanizado Glycomab contra adenocarcinoma de pulmón El anticuerpo EP27 humanizado Glycomab se administró a ratones SCID con un fragmento de tejido de tumor implantado del modelo Calu-3 de adenocarcinoma de pulmón humano, una vez a la semana a 10 mg/kg desde el día 13 después del trasplante del fragmento de tejido tumoral. El volumen del tumor se midió en el día 28 después del comienzo de la administración del anticuerpo. Se confirmó que el crecimiento tumoral se suprimió significativamente en el grupo al que se administró el anticuerpo en comparación con el grupo de control (Figura 20).

Ejemplo 19 Internalización celular del anticuerpo EP27 humanizado Se evaluó la internalización celular del anticuerpo EP27 humanizado mediante el siguiente método. Cuando un anticuerpo primario se internaliza, la saporina, la cual es una proteína inactivadora de ribosomas transportada por el anticuerpo secundario, es transportada dentro la célula a través de la unión del anticuerpo secundario al anticuerpo primario. Una vez que se internaliza, la saporina se disocia desde el conjugado de IgG, inhibe la síntesis de proteínas, y después causa la muerte celular. Una línea celular DLD-1 que expresa EREG o línea celular SK-HEP1 de control fueron sembradas a una densidad celular de 1 x 103 células en cada pocilio de microplacas de 96 pocilios, y al día siguiente, el anticuerpo EP27 humanizado Glycomab fue añadido como anticuerpo primario, y la IgG de cabra que reconoce el anticuerpo monoclonal humano unido a la proteína inactivadora de ribosomas Hum-ZAP (Advanced Targeting Systems) fue añadida como anticuerpo secundario. Cuatro días después de la adición, se evaluó la viabilidad celular por WST8 (Donjindo).

Como se muestra en la Figura 21, el anticuerpo EP27 humanizado Glycomab indujo la muerte celular sólo contra línea celular DLD-1 que expresa EREG. Por otro lado, no indujo la muerte celular contra la línea celular SK-HEP1 que se usó como el control.

Ejemplo de Referencia 1: Aislamiento de genes Epirregulina humana v de mono cvnomolgus El ADNc de EREG humana de longitud completa (CR541887, SEC ID No.: 169) se aisló mediante un método estándar, y un plásmido producido mediante la clonación de este fragmento del gen en un vector para la expresión en células de mamífero (pMCN) fue nombrado hEREG/pMCN . pMCN puede inducir la expresión de un gen extraño bajo el promotor CMV de ratón (ACCESSION No. U 68299), y es un vector insertado con un gen de resistencia a neomicina. El ADNc de longitud completa EREG de mono cynomolgus se aisló mediante un método estándar a partir de una biblioteca de ADNc de mono cynomolgus basado en la información de la secuencia de ADNc de EREG de mono rhesus (XM_001102069), y un plásmido producido mediante la clonación de este fragmento del gen (un fragmento del gen que codifica la secuencia de SEC ID No.: 165) en un vector para la expresión en células de mamífero (pMCN) fue nombrado cyEREG/pMCN. hEREG/pMCN y cyEREG/p CÑ fueron introducidos en la cepa CHO DG44 (Invitrogen) por electroporación, y la selección con 500 Mg/ml de Geneticina estableció células CHO que expresan de forma constante EREG humana de longitud completa y células CHO que expresan de forma constante EREG humana de longitud completa de mono cynomolgus, que fueron nombradas respectivamente hEREG_DG y cyEREG_DG.

Ejemplo de Referencia 2: Establecimiento de métodos para expresar formas maduras de Epirregulina de humano y mono cynomolgus Se usó un método de PCR para amplificar los ADNc para la expresión de la secuencia de seis-histidinas-repetidas en los extremos C-terminal de las regiones extracelulares de EREG humanas maduras de los genes de Epirregulina humano y de mono cynomolgus (polipéptidos en los que la secuencia de SEC ID No.: 171 ha sido fusionada a los extremos N-terminal de los polipéptidos de SEC ID Nos.: 170 y 34, respectivamente). Los vectores de expresión para uso en células de mamíferos en las que estos ADNc han sido insertados individualmente fueron linearizados mediante enzimas de restricción; y después mediante la introducción de aquellos en células Freestyle 293 usando 293fectin, se expresaron transitoriamente Epirregulina maduras humanas y de mono cynomolgus.

Ejemplo de Referencia 3; Preparación de Epirrequlina El gen de la Epirregulina humana madura y el gen de la Epirregulina de mono cynomolgus madura se insertaron individualmente en un vector de expresión para células de mamífero. Proteínas de fusión EREG-6HIS humanas maduras y EREG-6HIS de mono cynomolgus maduras fueron aisladas desde las soluciones de cultivo de células animales realizados para expresar cada uno de los genes y se purificaron por el siguiente método.

La región extracelular de la EREG humana madura (un polipéptido en donde la secuencia de SEC ID No.: 171 se fusiona con el extremo N-terminal de SEC ID No.: 34) fusionada en marco con una región de seis histidinas se insertó en un vector de expresión para animales de mamíferos para construir el vector de expresión hsEREG-6His (de aquí en adelante el polipéptido de fusión expresado es llamado hsEREG-His). La región extracelular de la EREG de mono cynomolgus madura (un polipéptido en donde la secuencia de SEC ID No.: 171 se fusiona con el extremo N-terminal de SEC ID No.: 170) fusionada en marco con una región de seis histidinas se insertó en un vector de expresión para animales mamíferos para construir el vector de expresión csEREG-6His (de aquí en adelante, la EREG expresada es llamada cysEREG-His). El vector de expresión hs EREG-6His y el vector de expresión csEREG-6His fueron introducidos en células FreeStyle 293 (Invitrogen) usando 293fectin (Invitrogen), y las líneas celulares transducidas se cultivaron bajo selección de Zeocin (500 pg/ml) durante seis días a 37°C en una incubadora con 8% de C02.

A continuación, hsEREG-His y cysEREG-His se purificaron desde el sobrenadante del cultivo. Se añadió imidazol 4 M al sobrenadante de cultivo a una concentración final de imidazol 10 mM, y esta mezcla líquida se mezcló con la resina de Ni en el sistema de purificación His MicroSpin Purification System (Amersham). La resina se lavó con imidazol 20 mM e imidazol 50 mM, y después hsEREG-His o cysEREG-His se eluyó con imidazol 200 mM (fracción de elución 1), y después hsEREG-His o cysEREG-His se eluyó usando imidazol 400 mM (fracción de elución 2). A continuación, el amortiguador que contenía hsEREG-His o cysEREG-His eluida se intercambió por diálisis con PBS usando una copa de diálisis Bio-tech MWCO8000. La proteína purificada se cuantificó usando el método de PACE a una longitud de onda de 280 nm, y este valor se convirtió a contenido de proteína.

Los patrones electroforéticos de las proteínas purificadas se muestran en la Figura 9.

Ejemplo de Referencia 4: Establecimiento de un sistema ELISA para Epirregulina Un fragmento de EREG humana soluble que tiene una estructura de dominio de EGF madura (el polipéptido de SEC ID No.: 34 que corresponde a 63Val to 08Leu) se adquirió en R&D Systems (cat. no. 1195-EP/CF). El fragmento de EREG humana soluble se usó para recubrir inmunoplacas Nunc, y después de bloquear con una solución de que contenía BSA, se analizó la reactividad de unión de los anticuerpos anti-Ereg purificados. La adición de los anticuerpos anti-EREG purificados fue seguida por una hora de incubación, las placas se lavaron, y después se añadió a cada pocilio de las placas lavadas un anticuerpo anti-IgG humana marcado con fosfatasa alcalina (Zymed) y después se dejaron reaccionar. Cada pocilio se lavó, y a continuación, la cantidad de anticuerpo unido se determinó por adición de un reactivo de prueba, Comprimidos de p-nitrofenil fosfato de Sigma.

Ejemplo de Referencia 5; Establecimiento de un sistema para inhibir la unión a Epirregulina mediante ELISA competitivo El fragmento de EREG humana soluble que tiene una estructura de dominio de EGF madura (el polipéptido de SEC ID No.: 34 que corresponde a 63Val to 08Leu) se adquirió en R&D Systems (cat. no. 1195-EP/CF). El fragmento de EREG humana soluble se usó para recubrir inmunoplacas Nunc, y después de bloquear con una solución de que contenía BSA, se analizó la reactividad de unión competitiva entre el EP27 derivado de hibridoma de ratón y el anticuerpo humanizado anti-EREG purificado. Se añadieron a las placas EP27 derivado de hibridoma de ratón y un anticuerpo humanizado anti-EREG purificado, y después de dos horas de incubación las placas fueron lavadas y se añadió en cada pocilio de las placas un anticuerpo anti- IgG humana marcado con fosfatasa alcalina (Zymed) y después se dejó reaccionar. Cada pocilio fue lavado, y a continuación, la cantidad de anticuerpo unido (valor de detección A405/655) se determinó por adición de un reactivo de prueba, Comprimidos de p -nitrofenil fosfato Sigma.

Ejemplo de Referencia 6; Establecimiento de la actividad de unión a antígeno (un método para medir la afinidad) La constante de velocidad de asociación y afinidad de un anticuerpo anti-EREG por un antígeno se midieron mediante el método de cinética de un solo ciclo del ensayo de resonancia de plasmones superficiales usando Biacore™-T100 (GE Healthcare Japón). HBS-EP+ (GE Healthcare Japan) se usó como el amortiguador de corrida, y se usó un kit de acoplamiento con amina (GE Healthcare Japón) para unir covalentemente la Proteína A al chip CM5 (chip recubierto con carboximetil dextrano). HBS-EP+ (GE Healthcare Japan) se usó como el amortiguador de corrida, y se usó un kit de acoplamiento con amina (GE Healthcare Japón) para unir covalentemente la Proteína A al chip CM5 (chip recubierto con carboximetil dextrano). Cada anticuerpo anti-EREG se preparó de manera tal que aproximadamente 350 RU fueran capturadas por la Proteína A. La EREG humana o la EREG de cynomolgus usada como el analito se preparó a 0; 0.7: 1.4; 2.8; 5.6; y 11.2 n usando HBS-EP +. La medición se llevó a cabo primero dejando que la proteína A capturara la solución de anticuerpo, y después a una velocidad de flujo de 30 pL/minutos, se inyectó sucesivamente cada uno de los 0; 0.7: 1.4; 2.8; 5.6; y 11.2 nM de soluciones de EREG humana o de EREG de cynomolgus durante tres minutos para permitir que se desarrolle la reacción. Después, la solución se cambió a HBS-EP+, y la fase de disociación se midió durante 15 minutos. Después de terminada la medición de la fase de disociación, el chip sensor se lavó con NaOH 25 mM y fue regenerado. La medición a concentración cero se llevó a cabo de manera similar permitiendo que la Proteína A capturara la solución de anticuerpo, y realizando inyecciones de HBS-EP+ de tres minutos cinco veces sucesivamente para permitir que se desarrolle la reacción, y después se cambió a HBS-EP + para medir la fase de disociación durante 15 minutos. Después de terminada la medición de la fase de disociación, el chip sensor se lavó con NaOH 25 mM y fue regenerado. Se usó un software de análisis de datos exclusivo para Biacore, Biacore T100 Evaluation Software Versión 2.0.1, para realizar los análisis cinéticos para calcular la constante de velocidad de asociación (ka), constante de velocidad de disociación (kd), y la razón entre las constantes de velocidad de los sensogramas obtenidos. Los resultados se muestran en la Tabla 21. Para corregir las diferencias día a día en los valores de medición, las Figs. 1 a 4 y las Tablas 16 y 19 muestran razones basadas en considerar como 1 el valor de la muestra de control (cH-G1/cL-k) medida en el mismo día.

Tabla 21] Ejemplo de Referencia 7: Establecimiento de un método para medir la actividad ADCC Una fracción de células mononucleares recolectadas de sangre periférica humana se usó como células efectoras derivadas humano. Desde un voluntario sano (varón adulto), se tomaron 50 mi de sangre periférica usando una jeringa precargada con 200 µ?_ de una solución de 1000 unidades/ml de heparina (Novo-Heparin Injection 5000 units, Novo Nordisk). La sangre periférica se diluyó dos veces con PBS(-), y se inyectó de antemano Ficoll-Paque PLUS para realizar la centrifugación. Esto se añadió en un tubo de separación de linfocitos Leucosep (Greiner Bio-one), y se centrifugó (a 2150 rpm durante diez minutos a temperatura ambiente), a lo que siguió la recolección de la capa de fracción de células mononucleares. Las células se lavaron una vez con FBS/D-MEM al 10% y se suspendieron con FBS/D-MEM al 10% a una densidad celular de 5 x 106/ml para preparar una solución de suspensión de células efectoras. La suspensión de células sirvió como una solución de PBMC humanas en el posterior experimento.

La solución de suspensión de células objetivo se preparó para la prueba en el momento de uso. La línea celular de cáncer pancreático humano MIA PaCa-2 se mantuvo mediante subcultivo en medio Eagle modificado de Dulbecco (Invitrogen) que contenía FBS al 10%, suero de caballo al 2,5%, L-glutamina 4 mmoles/L (Invitrogen), glucosa 4.5 g/L (Invitrogen), y bicarbonato de sodio 1.5 g/L (Invitrogen) (en lo sucesivo, el medio de subcultivo). Para el reactivo de etiquetado, se añadió 228 µ?_ de FBS/D-MEM al 10% a un tubo que contiene 12 µ?_ de una solución stock de Calceina-AM/DMSO (Nacalai) preparada a 4 mg/ml para producir una solución de Calceína-AM mediante suspensión suave. A 1 x 106 células de la línea celular MIA PaCa-2 sometida a centrifugación (a 1200 rpm durante cinco minutos a 4°C), se añadió la solución Calceína-AM preparada como se describió anteriormente a 200 µ?_ por pellet de células de 1 x 106 células para preparar una suspensión de células. La cantidad total de esta solución suspensión se transfirió a un tubo de recolección de sangre de plástico (Nihon Pharmaceutical), y esto se incubó en una incubadora de C02 a 37°C durante dos horas. Las células se lavaron tres veces con FBS/D-MEM al 10%, y la solución de suspensión de células objetivo se preparó mediante la suspensión de las células lavadas en FBS/D-MEM al 10% para dar 20 x 104 células/ml (1 x 10 /50 µ?).

Para la solución de suspensión de células objetivo, se añadió 100 µ? del medio a una placa de 96 pocilios de fondo plano. A continuación, los anticuerpos monoclonales anti-Epirregulina (H206-G1d/L73-k (SEC ID No.: 142/141), H240-G1d/L73-k (SEC ID No.: 150/141), y EP27 quimérico (SEC ID No.: 32/33)) fueron diluidos en un medio y después se añadieron a la placa a 50 ML por pocilio. Los anticuerpos se añadieron a concentraciones finales de 0.0001 µ?/??? a 10 µg/ml. A continuación, se añadió una solución de PBMC (1 x 107 células/ml) a 50 µ?_ por pocilio, la placa se dejó en reposo en una incubadora de gas CO2 al 5% a 37°C durante cuatro horas, y se determinó tasa de liberación específica de Calceína-A . La placa se sometió a centrifugación (a 1200 rpm durante cinco minutos a temperatura ambiente), y usando un fluorofotómetro se midió la intensidad de fluorescencia (Ae = 490 nm y Aem = 515 nm) de 100 µ?_ del sobrenadante recolectado de cada pocilio de la placa. La tasa de liberación específica de calceína se determinó a partir de la siguiente fórmula (Fórmula 3).

Fórmula 3 Tasa de liberación específica de calceína (%) = (A - C) x 100 / (B - C) A representa la intensidad de fluorescencia en cada pocilio; B representa la intensidad media de fluorescencia de los pocilios a los cuales se había añadido 50 pL de FBS/D-MEM al 10%, 50 pL de la solución de suspensión de células objetivo, y 100 pL de una solución de NP-40; y C representa la intensidad media de fluorescencia de los pocilios a los que se había añadido 50 pL de FBS/D-MEM al 10%, 50 pL de la solución de suspensión de células objetivo, y 100 pL de FBS/D-MEM al 10%. La prueba se realizó a N = 3, y la tasa de liberación específica de calceína para cada concentración de anticuerpo se determinó usando Microsoft Office Excel 2007.

Ejemplo de Referencia 8: Método para medir la actividad neutralizante (1) Establecimiento de una línea celular Ba/F3 que expresa un receptor quimérico de EGFR humano (EGFR BAF) Usando métodos estándar, se aisló un receptor de EGF humano que tiene la secuencia mostrada en SEC ID No.: 166 (GenBank Acc. No. NM_005228) (denominado en lo sucesivo como "hEGFR"), y después se preparó un vector que puede expresar un receptor de EGF humano (pCXZD1/EGFR#3).

Quince microgramos del vector de expresión linearizado (pCXZD1/EGFR#3) obtenido por digestión Pvul se transfecta en células Ba/F3 por electroporación (Gene Pulser; BioRad) en condiciones de 0.33 kV y 950 pFD. La células transfectadas se seleccionaron en un medio RPMI1640 que contenía FBS al 10%, 300 pg/ml de Zeocin, y Epirregulina humana recombinante (R&D Systems, Cat: 1195-EP/CF, 200 ng/ml); y se aisló la línea celular EGFR_BAF. (2) Actividad de los anticuerpos anti-Epirregulina para neutralizar la proliferación celular de la línea celular EGFR BAF dependiente de Epirrequiina humana o Epirrequiina de mono Se realizaron experimentos para medir la actividad de anticuerpos anti-Epirregulina para neutralizar la proliferación celular dependiente de Epirregulina humana o Epirregulina de mono usando la línea celular EGFR_BAF aislada mediante el método descrito en (1). Las células se lavaron para eliminar la Epirregulina humana presente en el momento del cultivo. A continuación, las células se resuspendieron en un medio RPMI1640 que contenía FBS al 10%, así como también hsEREG-His o cysEREG-His (concentración final de 2,5 ng/ml), y las células se sembraron en una placa de 96 pocilios a una densidad de 2 x 104 células / 100 µ?_/ pocilio. Un anticuerpo anti-Epirregulina diluido por el medio se añadió a las células a varias concentraciones (0.014 g/ml a 30 pg/ml), y a continuación, las células se cultivaron en una incubadora de C02 al 5% durante tres días a 37°C. Después del cultivo, se añadió el reactivo de medición del Cell Counting Kit (Dojindo) y el desarrollo de color se llevó a cabo durante dos horas. Después se midió la absorbancia de la solución de reacción (450/655 nm) usando Benchmark Plus (Bio-Rad). El valor de 0 pg/ml de concentración de anticuerpo se usó como el valor de control para calcular la tasa de supresión del crecimiento celular (valor DO a cada valor de la concentración de anticuerpo/valor DO del control x 100 (%)).

Ejemplo de Referencia 9; La medición de la cantidad de agregado por cromatografía de filtración en gel Usando G3000SWXL (tamaño de partícula de 5 µ?t?, 78 mm D.l. x 30 cm, fabricada por TOSOH) para la columna, y usando amortiguador de fosfato de sodio 50 mM (pH 7.0) que contenía NaCI 300 mM como fase móvil, se midió la cantidad de agregado mediante cromatografía de filtración en gel. Una columna conectada a un sistema Alliance (fabricado por Waters) se equilibró a una velocidad de flujo de 0.5 ml/minutos, y después se inyectó en la columna 5-10 ig de solución de anticuerpo. La elución del anticuerpo se detectó usando un detector de absorción ultravioleta (215 o 280 nm). Del cromatograma obtenido, se calculó la proporción de área de pico de agregado en el área total del pico.

Ejemplo de Referencia 10; Medición de la temperatura de punto medio de desnaturalización térmica (Tm) mediante un calorímetro de barrido diferencial Se preparó un amortiguador de acetato de sodio 20 moles/L (pH 6.0) que contiene 150 mmoles/L de cloruro de sodio como la solución externa para la diálisis, y la diálisis se llevó a cabo durante un día completo mediante la inmersión en esta solución externa de una membrana de diálisis que encierra una solución de anticuerpo de una cantidad equivalente a 50 a 100 g de anticuerpo. Se usó como la solución de la muestra para las mediciones del valor de Tm, una solución de anticuerpo preparada a 50 pg/ml hasta 100 pg/ml de concentración de anticuerpo usando la solución externa para la diálisis.

Se puede usar para este experimento un equipo de DSC adecuado, por ejemplo, DSC-II (fabricado por Calorimetry Sciences Corporation) o MicroCal VP-DSC (fabricado por GE healthcare). Una solución de muestra y una solución de referencia (solución externa para la diálisis) suficientemente desgasificadas se encerraron individualmente en las células del calorímetro, y se sometieron a un equilibrio térmico suficiente a 40°C. A continuación, se ejecutó un barrido de DSC desde 40°C a 100°C con una velocidad de barrido de aproximadamente 1K a 2,5 K/min. Los resultados de esta medición se entregan como la parte superior del pico de desnaturalización térmica como una función de la temperatura. La temperatura de punto medio de desnaturalización térmica de la muestra se calculó asignando el pico del dominio Fab de acuerdo a un documento no patente (Rodolfo et al., Immunology Letters (1999), p47-52).

Ejemplo de Referencia 11; Mediciones de pl mediante isoelectroenfoque Usando un Phastsystem Cassette (Amersham Bioscience), un gel Phast-Gel Dry IEF (Amersham Bioscience) fue hinchado durante unos 30 minutos en una solución de hinchamiento que tiene la composición descrita a continuación.

Tabla 22 El gel hinchado se usó para llevar a cabo la electroforesis usando el PhastSystem (Amersham Bioscience) controlado mediante el programa que se describe a continuación. La muestra se añadió al gel en el Etapa 2. Se usó para los marcadores de pl un kit de calibración para pl (Amersham Bioscience).

Tabla 23 Después de la electroforesis, el gel se fijó con TCA al 20% y se llevó a cabo tinción con plata usando Silver Staining Kit, Protein (Amersham Bioscience) de acuerdo con las instrucciones proporcionadas con el kit. Después de la tinción, se calculó el punto isoeléctrico de la muestra en base a los puntos isoeléctricos conocidos de los marcadores de pl.

Ejemplo de Referencia 121 Construcción de una cepa que expresa anticuerpos fucosílado En una célula donde se inhibe artificialmente la expresión tanto de los genes transportadores de fucosa como de los cromosomas homólogos, la función transportadora de fucosa se encuentra inhibida. Mediante el uso de esta célula, se puede obtener un anticuerpo deficiente en fucosa (WO2006/067913, y similares). Además, los anticuerpos deficientes en fucosa también se podrían obtener cuando los anticuerpos son producidos en células con expresión forzada de beta 1,4-N-acetilglucosaminiltransferasa III y Golgi alfa-manosidasa II (Ferrara et al., Biotechnol. Bioeng. (2006) 93 (5), 851-861). Para la investigación se usaron anticuerpos EREG fucosilado preparados por estos métodos que son conocidos por los expertos en la técnica.

Ejemplo de Referencia 13] Evaluación del riesgo de inmunogenicidad usando la herramienta de predicción de inmunogenicidad in silico, Epibase La eficacia y utilidad clínica de los productos farmacéuticos de anticuerpos están limitadas por los anticuerpos antifármacos (ADA, por sus siglas en inglés). Los ADA afectan a la eficacia del fármaco y la cinética de los productos farmacéuticos de anticuerpos y, a veces, causan efectos secundarios graves. Se han reportado muchos factores que influyen en la inmunogenicidad, y, en particular, se cree que es importante que los epítopos de células T se encuentren contenidos en los antígenos. Las herramientas in silico disponibles para predecir tales epítopos de células T incluyen Epibase (Lonza), ¡Tope/TCED (Antitope), y Epi atrix (EpiVax). Se ha reportado de que las secuencias que contienen epítopos de células T presentes en las proteínas de interés podrían ser predichas mediante el uso de las herramientas descritas anteriormente (Expert Opin Biol Ther. 2007 Mar; 7(3): 405-18).

Epibase Light (Lonza) es una herramienta in silico para calcular la capacidad de unión entre el péptido 9-mer y el alelo DRB1 principal usando algoritmo FASTER (Expert Opin Biol Ther. 2007 Mar; 7(3): 405-18). Esta herramienta permite la identificación de epítopos de células T que se unen fuerte o moderadamente a MHC clase II.

Se puede determinar una puntuación de inmunogenicidad in silico para cada anticuerpo modificado de acuerdo con la siguiente fórmula (Fórmula 4) en el sistema de Epibase Light (Lonza).

Fórmula 4 Puntuación inmunogenicidad = Suma (frecuencia poblacional de cada alotipo DRB1 X número de epítopos críticos) El cálculo refleja la proporción de abundancia de alotipos DRB1. Con este propósito, es posible usar la siguiente proporción de abundancia en caucásicos.

DRB1*1501(24.5%), DRB1 *0301 (23.7%), DRB1 *0701 (23.3%), DRB1*0101(15.0%), DRB1 *1101 (11.6%), DRB1 *1302(8.2%), DRB1*1401/1454(4.9%), DRB1 *0901 (2.3%), DRB1 *1502(0.5%), DRB1*1202(0.1%) Todos los epítopos contenidos en cada secuencia de anticuerpo modificado que exhiben unión fuerte o moderada se identifican mediante el algoritmo FASTER, y después los epítopos, después de excluir las secuencias de la línea germinal humana y las secuencias de unión entre la región variable y una región constante, se usa como epítopos críticos en el cálculo d la puntuación de inmunogenicidad. Cuando la puntuación es más pequeña, significa que una secuencia tiene un riesgo menor inmunogenicidad.

Ejemplo de Referencia 141 Pruebas de la eficacia del fármaco en los anticuerpos anti-Epirregulina usando modelos in vivo (1) Mantenimiento de líneas celulares usadas para trasplante en modelos in vivo Para los modelos in vivo se usaron células MIA PaCa-2 (ATCC) y DLD-1 (ATCC). Las células MIA PaCa-2 se mantuvieron mediante subcultivo en medio Eagle modificado de Dulbecco (Invitrogen) que contenía FBS al 10%, suero de caballo al 2.5%, L-glutamina 4 mmoles/L (Invitrogen), glucosa 4.5 g/L (Invitrogen), y bicarbonato de sodio 1.5 g/L (Invitrogen) (en lo sucesivo denominado como el medio de subcultivo). Las células DLD-1 se mantuvieron mediante subcultivo en medio RPMI1640 (SIGMA) que contenía FBS al 10%, HEPES 10 mmoles/L (Invitrogen), glucosa 4.5 g/L (Invitrogen), Piruvato de Sodio 1 mmoles/L (Invitrogen) (en lo sucesivo denominado como el medio de subcultivo). (2) Producción de modelos de ratón trasplantado con células MIA PaCa-2 y células DLD-1 Usando una solución que contiene un medio de subcultivo y una Matriz MATRIGEL (BD Bioscience) a una relación 1:1, se prepararon suspensiones de células MIA PaCa-2 y células_DLD-1 a 5 x 107 células/ml. 100 pL de la suspensión de células (5 x 106 células/ratón) se trasplantaron de forma subcutánea en la región abdominal de ratones SCID (hembras, 5 semanas de edad, CLEA Japan, Inc.) a los cuales se administraron 100 pL por via intraperitoneal. El volumen del tumor se calculó usando la fórmula 5, y cuando el volumen promedio del tumor alcanzó 130- 330 mm3, se determinó el establecimiento del modelo de ratón.

Fórmula 5 Volumen del tumor = diámetro largo x diámetro corto x diámetro corto / 2 (3) Preparación de muestras de administración que contienen cada anticuerpo de prueba Se prepararon muestras de administración que contienen cada una el anticuerpo cH-G1/cL-k, anticuerpo H206-G 1 d/L7-3k, o anticuerpo H240-G1 d/L73-k a 0.04 mg/ml (grupo de administración de 0.4 mg/kg) o 0.2 mg/ml (grupo de administración de 2 mg/kg) con solución salina fisiológica en el día de la administración. (4) Administración de muestras de administración que contienen el anticuerpo Las muestras de administración preparadas en (3) fueron administradas a una dosis de 10 ml/kg a través de la vena de la cola a los modelos de ratón preparados en (2) una vez por semana durante 17 días a partir del día 13 post- trasplante de células MIA PaCa-2, y una vez por semana durante 14 días a partir de día 12 post- trasplante de células DLD. Como control negativo, se administró de manera similar una solución salina fisiológica a una dosis de 10 ml/kg a través de la vena de la cola una vez por semana de durante las duraciones respectivas. Todos los grupos tenían cinco animales en cada grupo, y a cada grupo se administró la muestra de administración que contenía el anticuerpo de prueba respectivo. (5) Evaluación del efecto antítumoral de cada anticuerpo de prueba El efecto antítumoral de cada anticuerpo de prueba se evaluó en el modelo de ratón trasplantado con células de cáncer humano. El volumen del tumor se midió en el día 3 o el día 7 después del último día de administración de la muestra.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un anticuerpo anti-Epirregulina que es un anticuerpo que se une a un epítopo unido por un anticuerpo anti-Epirregulina que comprende CDRs de región variable de cadena pesada de SEC ID Nos.: 9, 10, y 11 y CDRs de región variable de cadena ligera de SEC ID No.: 12, 13, y 14, en donde el anticuerpo se caracteriza en que tiene una razón del valor KD para la Epirregulina de mono SEC ID No.: 170 (KD de cEREG) al valor KD para Epirregulina humana de SEC ID No.: 34 (KD de hEREG) (KD de cEREG / KD de hEREG) más pequeña que la razón KD de cEREG/ KD de hEREG del anticuerpo anti-Epirregulina que comprende CDRs de región variable de cadena pesada de SEC ID Nos.: 9, 10, y 11 y CDRs de región variable de cadena ligera de SEC ID No.: 12, 13, y 14.

2. El anticuerpo de la reivindicación 1, en donde KD de cEREG / KD de hEREG es inferior a 40.

3. El anticuerpo de la reivindicación 1, en donde KD de cEREG / KD de hEREG es inferior a 10.

4. El anticuerpo de la reivindicación 1, en donde KD de cEREG / KD de hEREG es inferior a 6.

5. El anticuerpo de la reivindicación 1, en donde KD de cEREG / KD de hEREG es inferior a 4.

6. El anticuerpo de cualquiera de la reivindicaciones 1 a 5, el cual comprende una región variable de cadena pesada que comprende una CDR1 de cadena pesada de SEC ID No.: 9, una CDR2 de cadena pesada seleccionada del grupo que consiste de SEC ID Nos.: 161, 160, 159, 157, 156, 155, 153,108,107, 106, 105, 104, 103, 102, 101, y 100, una CDR3 de cadena pesada seleccionada del grupo que consiste de SEC ID Nos.: 158, 154, 152, 151, 112, 111, 110, y 11; y una región variable de cadena ligera que comprende una CDR1 de cadena ligera seleccionada del grupo que consiste de SEC ID Nos.: 163, 68, 67, y 12, una CDR2 de cadena ligera seleccionada del grupo que consiste de SEC ID Nos.: 71, 69, y 13, y una CDR3 de cadena ligera seleccionada del grupo que consiste de SEC ID Nos.: 164, 48, 47, y 14.

7. El anticuerpo de cualquiera de la reivindicaciones 1 a 5, el cual comprende una región variable de cadena pesada seleccionada del grupo que consiste de SEC ID Nos.: 150, 149, 148, 147, 146, 145, 144, 143, 142, 140, 139, 138, 137, 135, 134, 133, 132, 131, 127, 126, 125, 124, 123, 122, 121, 120, 119, 118, 117, 116, y 115, una región variable de cadena ligera seleccionada del grupo que consiste de SEC ID Nos.: 141, 136, 130, 129, 128, 99, 85, 84, 83, 82, 81, 80, 58, 57, y 29.

8. Un anticuerpo anti-Epirregulina seleccionado de uno una cualquiera de los siguientes: (1) un anticuerpo anti-Epirregulina que comprende una región variable de cadena pesada seleccionada del grupo que consiste de SEC ID Nos.: 150, 149, 148, 147, 146, 145, 144, 143, 142, 140, 139, 138, 137, 135, 134, 133, 132, 131, 127, 126, 125, 124, 123, 122, 121, 120, 119, 118, 117, 116, 115, 98, 97, 96, 95, 94, 93, 92, 79, 78, 77, 76, 75, 74, 73, 72, 56, 55, 54, 53, 52, 51, 50, 49, y 38; (2) un anticuerpo anti-Epirregulina que comprende una región variable de cadena ligera seleccionada del grupo que consiste de SEC ID Nos.: 141, 136, 130, 129, 128, 99, 85, 84, 83, 82, 81, 80, 58, 57, y 29; y (3) un anticuerpo anti-Epirregulina que comprende una región variable de cadena pesada seleccionada del grupo que consiste de SEC ID Nos.: 150, 149, 148, 147, 146, 145, 144, 143, 142, 140, 139, 138, 137, 135, 134, 133, 132, 131, 127, 126, 125, 124, 123, 122, 121, 120, 119, 118, 117, 116, 115, 98, 97, 96, 95, 94, 93, 92, 79, 78, 77, 76, 75, 74, 73, 72, 56, 55, 54, 53, 52, 51, 50, 49, y 38, y una región variable de cadena ligera seleccionada del grupo que consiste de SEC ID Nos.: 141, 136, 130, 129, 128, 99, 85, 84, 83, 82, 81, 80, 58, 57, y 29.

9. El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8, el cual comprende la región constante de cadena pesada de SEC ID No.: 26.

10. El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 6 a 9, el cual comprende la región constante de cadena ligera de SEC ID No.: 27.

11. El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, el cual tiene una actividad neutralizante.

12. El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, el cual tiene citotoxicidad.

13. El anticuerpo de la reivindicación 12, en donde la citotoxicidad es CDC y/o ADCC.

14. El anticuerpo de cualquiera de la reivindicaciones 1 a 12, en donde un inhibidor del crecimiento o una sustancia citotóxica está enlazada al anticuerpo.

15. El anticuerpo de la reivindicación 14, en donde el anticuerpo es un anticuerpo de bajo peso molecular.

16. El anticuerpo de cualquiera de la reivindicaciones 12 a 15, en donde la región constante de cadena pesada de SEC ID No.: 26 comprende al menos una sustitución de aminoácido en una posición seleccionada del grupo que consiste de 230, 240, 244, 245, 247, 262, 263, 266, 273, 275, 299, 302, 313, 323, 325, 328, y 332, como se indica de acuerdo con la numeración Estadounidense.

17. Un vector que comprende un polinucleótido que codifica una región variable de cadena pesada que comprende una CDR1 de cadena pesada de SEC ID No.: 9, una CDR2 de cadena pesada seleccionada del grupo que consiste de SEC ID Nos.: 161, 160, 159, 157, 156, 155, 153, 108, 107, 106, 105, 104, 103, 102, 101, y 100, y una CDR3 de cadena pesada seleccionada del grupo que consiste de SEC ID Nos.: 158, 154, 152, 151, 112, 111, 110, y 11.

18. El vector de la reivindicación 17, el cual comprende un polinucleótido que codifica la región constante de cadena pesada de SEC ID No.: 26.

19. Un vector que comprende un polinucleótido que codifica una región variable de cadena ligera que comprende una CDR1 de cadena ligera seleccionada del grupo que consiste de SEC ID Nos.: 163, 68, 67, y 12, una CDR2 de cadena ligera seleccionada del grupo que consiste de SEC ID Nos.: 71, 69, y 13, y una CDR3 de cadena ligera seleccionada del grupo que consiste de SEC ID Nos.: 164, 48, 47, y 14.

20. El vector de la reivindicación 19, el cual comprende un polinucleótido que codifica la región constante de cadena ligera de SEC ID No.: 27.

21. Un vector que comprende: (1) un polinucleótido que codifica una región variable de cadena pesada que comprende una CDR1 de cadena pesada de SEC ID No.: 9, una CDR2 de cadena pesada seleccionada del grupo que consiste de SEC ID Nos.: 161, 160, 159, 157, 156, 155, 153, 108, 107, 106, 105, 104, 103, 102, 101, y 100 una CDR3 de cadena pesada seleccionada del grupo que consiste de SEC ID Nos.: 158, 154, 152, 151, 112, 111, 110, y 11; y (2) un polinucleótido que codifica una región variable de cadena ligera que comprende una CDR1 de cadena ligera seleccionada del grupo que consiste de SEC ID Nos.: 163, 68, 67, y 12, una CDR2 de cadena ligera seleccionada del grupo que consiste de SEC ID Nos.: 71, 69, y 13, y una CDR3 de cadena ligera seleccionada del grupo que consiste de SEC ID Nos.: 164, 48, 47, y14.

22. Un vector que comprende: (1) un polinucleótido que codifica una región variable de cadena pesada que comprende una CDR1 de cadena pesada de SEC ID No.: 9, una CDR2 de cadena pesada seleccionada del grupo que consiste de SEC ID Nos.: 161, 160, 159, 157, 156, 155, 153, 108, 107, 106, 105, 104, 103, 102, 101, y 100, y una CDR3 de cadena pesada seleccionada del grupo que consiste de SEC ID Nos.: 158, 154, 152, 151, 112, 111, 110, y 11, y un polinucleótido que codifica la región constante de cadena pesada de SEC ID No.: 26; y (2) un polinucleótido que codifica una región variable de cadena ligera que comprende una CDR1 de cadena ligera seleccionada del grupo que consiste de SEC ID Nos.: 163, 68, 67, y 12, una CDR2 de cadena ligera seleccionada del grupo que consiste de SEC ID Nos.: 71, 69, y 13, y una CDR3 de cadena ligera seleccionada del grupo que consiste de SEC ID Nos.: 164, 48, 47, y 14, y un polinucleótido que codifica la región constante de cadena ligera de SEC ID No.: 27.

23. Un vector que comprende el polinucleótido de la reivindicación 18 o 22, el cual comprende un nucleótido mutado que codifica una región constante de cadena pesada con al menos una sustitución de aminoácidos en una posición seleccionada del grupo que consiste de 221, 222, 223, 224, 225, 227, 228, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 243, 244, 245, 246, 247, 249, 250, 251, 254, 255, 256, 258, 260, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 288, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 311, 313, 315, 317, 318, 320, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 339, 376, 377, 378, 379, 380, 382, 385, 392, 396, 421, 427, 428, 429, 434, 436, y 440 como se indica por la numeración Estadounidense en la región constante de cadena pesada de SEC ID No.: 26.

24. Una célula huésped que comprende los vectores de las reivindicaciones 17 y 19, los vectores de las reivindicaciones 18 y 20, o el vector de la reivindicación 21 o 22.

25. Una célula huésped que comprende el vector de la reivindicación 23.

26. La célula huésped de la reivindicación 25, en donde la capacidad de añadir fucosa a una cadena de azúcar en la célula huésped es baja.

27. La célula huésped de la reivindicación 26, en donde la célula huésped con una baja capacidad para añadir fucosa a una cadena de azúcar es una célula huésped deficiente en una o más proteínas funcionales seleccionadas del grupo que consiste de fucosiltransferasa, transportador de fucosa, GMD (GDP-manosa-4,6-deshidratasa), Fx (GDP-ceto-6-desoximanosa-3,5-epimerasa, 4-reductasa), y GFPP (GDP-ß- L-fucosa- pirofosforilasa).

28. La célula huésped de la reivindicación 25, en donde la célula huésped tiene una capacidad para formar una estructura N-acetilglucosamina bisectante en una cadena de azúcar.

29. La célula huésped de la reivindicación 28, en donde la célula huésped que tiene una capacidad para formar una estructura N -acetilglucosamina bisectante en una cadena de azúcar es una célula huésped que tiene actividad ß(1,4)-galactosiltransferasa y comprende un vector que comprende un polinucleótido que codifica el dominio de localización funcional de Golgi de un polipéptido residente en Golgi.

30. La célula huésped de la reivindicación 29, que comprende un vector que comprende un polinucleótido que codifica un dominio de localización funcional de Golgi seleccionado del grupo que consiste del dominio de localización de la manosidasa II, el dominio de localización de ß(1,2) -N-acetilglucosaminiltransferasa I, el dominio de localización de ß(1,2) - /V-acetilglucosaminiltransferasa II, el dominio de localización de manosidasa I, y el dominio de localización de core a1-6 fucosiltransferasa; y un polinucleótido que codifica un polipéptido de fusión que comprende el dominio catalítico de ß (1 ,4)-galactosiltransferasa.

31. La célula huésped de cualquiera de las reivindicaciones 24 a 30, en donde la célula huésped se selecciona entre el grupo que consiste de una célula CHO, una célula BHK, una célula NSO, una célula SP2/0, una célula de mieloma YO, una célula P3X63 de mieloma de ratón, una célula PER, una célula PER.C6, una célula HEK293, y una célula de hibridoma.

32. Un método para producir el anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, el cual comprende recolectar desde una solución de cultivo la célula huésped de cualquiera de las reivindicaciones 24 a 31.

33. Un anticuerpo producido por el método de la reivindicación 32.

34. El anticuerpo de la reivindicación 33, en donde un inhibidor del crecimiento o una sustancia citotóxica está enlazada al anticuerpo.

35. Una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, o la reivindicación 33 o 34 como un ingrediente activo.

36. Un agente terapéutico para el cáncer o un agente para suprimir la recurrencia o metástasis del cáncer, el cual comprende el anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16 o la reivindicación 33 o 34 como un ingrediente activo.

37. El agente terapéutico para el cáncer o el agente para suprimir la recurrencia o metástasis del cáncer de la reivindicación 36, en donde el cáncer es cualquier tipo de cáncer seleccionado del grupo que consiste de cáncer de colon, adenocarcinoma de pulmón, cáncer de páncreas, cáncer de estómago, y cáncer de riñon.

38. El agente terapéutico para el cáncer o el agente para suprimir la recurrencia o metástasis del cáncer de la reivindicación 37, en donde el cáncer de colon es un cáncer de colon pobremente diferenciado, un cáncer de colon moderadamente diferenciado, o un cáncer de colon bien diferenciado.

39. El agente terapéutico para el cáncer o el agente para suprimir la recurrencia o metástasis del cáncer de cualquiera de las reivindicaciones 36 a 38, en donde un sujeto al que se administra el agente terapéutico para el cáncer es un sujeto que porta células cancerosas que expresan la proteína Epirregulina detectada en una muestra de tejido aislada.