CN103012561B - 一种肿瘤靶向诊断用小肽 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种肿瘤靶向诊断用小肽，所述小肽是通过对噬菌体展示环七肽库进行多轮筛选得到，其序列为SCDSWHYWC。本发明将该小肽用FITC标记，并检测标记后的小肽与FAP结合的活性，结果显示本发明的小肽能特异性结合FAP。本发明小肽可以用于制备针对肿瘤基质的广谱探针，可以满足肿瘤分子成像和肿瘤靶向治疗等方面的应用。
Description
技术领域
本发明涉及一种多肽，具体而言涉及一种结合FAP的多肽。
背景技术
目前，恶性肿瘤已经逐渐取代心脑血管疾病，成为人类的头号杀手。最近统计资料表明，我国每年新发现癌症患者约2000万人，近150万人死于癌症。癌症的死亡人数占总死亡数的1/5。肿瘤的早期诊断与治疗是提高其治愈率及改善病人生存质量的关键。
肿瘤的基本特征是细胞的失控性生长，肿瘤细胞自身基因结构及基因表达的改变导致肿瘤的发生发展已被大家广泛接受是。然而随着研究的深入，传统观念正被改变，肿瘤的发生发展并非由上皮或间质单方面决定，而是由两者相互作用所构成的肿瘤-宿主界面微环境的平衡状态所决定[Tlsty TD，Coussens LM.Tumor stroma and regulation of cancer development.Annu Rev Pathol 2006；1(1)：119-50]。肿瘤微环境调控着肿瘤的多种生物学行为，为肿瘤的发生、发展、侵袭、转移等提供了必要的物质基础。肿瘤相关成纤维细胞(Tumor-associatedfibroblasts)是上述微生态环境中最主要的宿主细胞之一，它通过直接的细胞-细胞接触、可溶性因子的分泌和对细胞外基质的修饰而对该体系的平衡起着重要的调控作用。肿瘤相关的成纤维细胞占肿瘤组织的50％～90％，主要分布于肿瘤基质内、靠近肿瘤血管内皮细胞并包绕着癌巢[Loeffler M，Krüger JA，Niethammer AG，Reisfeld RA..R.Targeting tumor-associated fibroblasts improvescancer chemotherapy by increasing intratumoral drug uptake J.Clin.Invest，2006(7)，116：1955-1962]。肿瘤相关成纤维细胞是非转化细胞且基因组非常稳定，与正常组织成纤维细胞差异显著，并且在各种肿瘤中的差异较小，因而有可能成为肿瘤早期诊断和抗肿瘤治疗的新的切入点。
成纤维细胞活化蛋白(Fibroblast Activation Protein，FAP)是肿瘤相关成纤维细胞的核心标志物，属II型膜结合糖蛋白属于丝氨酸蛋白水解酶家族，在脊椎动物的进化过程中高度保守。且FAP仅选择性表达于胚胎，间叶组织、上皮组织来源的肿瘤中与肿瘤分级、转移及预后密切相关。
FAP是肿瘤基质成纤维活化细胞稳定表达的标志分子，是肿瘤靶向诊断的理想靶点，针对FAP设计的小肽分子探针能够避开肿瘤细胞本身的异质性，从而提高肿瘤诊断灵敏度和特异性，有可能成为肿瘤靶向诊断有前途的通用型探针，为肿瘤的分子成像提供新的思路。本发明拟以FAP为靶点，采用噬菌体肽库技术筛选FAP高亲和力配体小肽，为肿瘤靶向诊断提供一种新的方法。
发明内容
为提高肿瘤诊断灵敏度和特异性问题，本发明提供一种多肽，所述多肽能够特异性结合FAP，所述多肽其氨基酸序列为SCDSWHYWC。
本发明通过筛选噬菌体展示环七肽库(Ph.D.-C7CTMPhage display peptidelibrary)，筛选得到对FAP具有高特异性和高亲和力的多肽M1，具体筛选方法如下：
以FAP包被免疫试管并封闭，TBST洗涤后加入噬菌体肽库，振荡孵育一定时间后，TBST洗涤去除非特异结合的噬菌体，加噬菌体洗脱液振荡洗脱特异结合的噬菌体，加中和液，取部分洗脱产物计数噬菌体的滴度，其余洗脱产物感染大肠杆菌ER2738扩增并纯化噬菌体，得到次级库。逐步降低FAP包被浓度，再进行两轮筛选。从第三轮计数平板上随机挑到若干个菌落，培养、纯化得到噬菌体后，通过噬菌体ELISA测定各株噬菌体对FAP的结合。
通过噬菌体ELISA方法，筛选得到25株对FAP结合的噬菌体。对所述25株噬菌体测序，分析测序结果得到有7株多肽序列，将所述多肽序列分别为命名P1-P7。呈现频率最高的三种多肽共有SCD(xx)H(xx)WC序列；其中多肽序列P1的出现频率为4/25，其氨基酸序列为SCDSWHYWC，所表达的多肽命名为M1。
将多肽M1合成并用荧光标记，检测荧光标记的多肽M1与FAP的结合，结果显示所得荧光标记的多肽M1能够与FAP特异性结合。所述M1的合成可以为生物方法的表达，也可以是化学方法的合成，所述化学方法优选固相合成方法；所述荧光标记优选FITC(fluorescein isothiocyanate)标记。
本发明多肽M1能特异性结合FAP，将有望用于解决具有广谱适用性的肿瘤靶向分子成像技术难题，为肿瘤的早期诊断提供重要手段；该多肽M1还可用于肿瘤靶向治疗药物的制备。
本发明所用的缓冲液、培养基等说明如下：
PBS：磷酸缓盐冲溶液(Na2HPO410mmol/L，KH2PO42mmol/L，NaCl 137mmol/L，KCl 2.7mmol/L，pH7.4，Solarbio，China)；
PBST：(PBS，0.05％Tween 20(sigma)，1％BSA(ablum bovine fraction V，WAKO)；
TBS：Tris缓冲盐溶液(50mmol/L，pH 7.5，sigma)；
TBST：50mmol/L TBS+0.05％Tween 20(sigma)；
甘氨酸-HCl：0.2mol/L Glycine-HCl(pH 2.2，solarbio，China)；
PEG/NaCl溶液：含20％(W/V)聚乙二醇-8000，2.5mol/LNaCl，sigma；
封闭缓冲液：PBS+5mg/mL BSA(WAKO)
LB液体培养基：10g/L细菌培养用胰蛋白胨(Oxford)，5g/L细菌培养用酵母提取物(Oxford)，5g/L NaCl(sigma)；
顶层琼脂糖培养基：LB培养基+7g/L琼脂糖(sigma)；
LB/IPTG/Xgal琼脂平板：(0.05g/L isopropyl-β-D-thiogalactoside(IPTG)，0.04g/L 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactoside(Xgal)，15g/L琼脂粉(agar)，sigma)
附图说明
图1特异性噬菌体富集第一轮至第三轮噬菌体回收率；
图2ELISA测定P1与FAP的结合；
图3标记FITC的M1与FAP结合活性测定。
具体实施方式
通过参阅下述实施例可以更容易地了解本发明的内容，这些实施例只是为进一步说明本发明，并不意味着限定本发明的范围。
本发明(包括以下实施例)中涉及的噬菌体滴度测定均采用下述方法(参见Ph.D.TMPhage Display Library操作手册)：
接种E.coli ER2738单菌落于5-10ml LB液体培养基中，37℃，250rpm摇床孵育至对数中期(OD600：～0.5)；微波炉加热融化顶层琼脂糖培养基，分成3mL/份分装到灭菌试管中，每个噬菌体稀释度用一管，保存于45℃备用；37℃预温LB/IPTG/Xgal琼脂平板，每个噬菌体稀释梯度取一个平板备用；用LB培养液对噬菌体进行10倍比系列稀释(建议稀释范围：扩增的噬菌体培养物上清：108-1011；未扩增的淘选洗脱物：101-104)；每个稀释度换一新鲜吸头，建议使用带滤芯吸头以避免交叉污染；当大肠杆菌菌液达对数中期时，将菌液分成200μL等份于微量离心管中，每个噬菌体稀释度用一管；每管大肠杆菌菌液中分别加入10μL不同稀释倍数的噬菌体，快速震荡混匀，室温温育1-5min；将噬菌体感染的大肠杆菌菌液加入45℃预温的顶层琼脂糖培养基管中，每次一管，快速混匀，立即倾注于37℃预温的LB/IPTG/Xgal琼脂平板上。适当倾斜平板将上层琼脂均匀铺开；待平板冷却5min后，倒置于37℃孵箱，培养过夜；检查平板，计数有～102个噬菌斑的平板上的斑数，然后，用此数目乘以稀释因子即得到每10μL噬菌体的空斑形成单位(pifu)滴度。
实施例FAP特异性多肽的筛选和鉴定
1.材料
噬菌体环七肽库(Ph.D.-C7CTM Phage display peptide library)：购自NEB公司，2×1013pfu/mL，多样性2.7×109，于M13噬菌体cpIII蛋白的Kpn-I、Eag-I位点之间插入外源序列，随机七肽两端的半胱氨酸形成二硫键，使呈现的随机七肽形成相对稳定的环状结构；HRP标记鼠抗M13噬菌体抗体：Abcam公司产品；HRP标记鼠抗FITC抗体：美国Fitzgerald公司产品；FAP：sigma公司产品；其余试剂库市购。
2.方法和结果
受体菌E.coli ER2738的复苏及培养，以无菌技术从E.coli ER2738的甘油冻存物中挑取一接菌环，涂布于LB-Tet平板上，37C颠倒培养过夜后，挑取单一菌落，置于3ml含有1ug/ml Tet的LB培养液中，37℃振荡培养过夜，使OD600值达0.6左右。LB-Tet平板及细菌扩增液置于4℃保存，备用。
FAP特异性噬菌体的富集：以10μg/mL浓度的FAP包被免疫试管并于4℃封闭过夜，TBST洗涤6次后加入噬菌体肽库，37℃振荡孵育1h，TBST洗涤10次去除未结合的噬菌体，加0.2mol/L Glycine-HCl(pH 2.2)1mL振荡10min洗脱特异结合的噬菌体，加150μL1mol/L Tris-HCl(pH 9.1)中和，取10μL洗脱产物计数噬菌体的滴度，其余洗脱产物感染大肠杆菌ER2738扩增并纯化噬菌体，得到次级库，对次级库滴度进行测定后进入下一轮筛选程序。按上述步骤再进行两轮筛选，其中第二轮FAP包被浓度为5μg/mL，第三轮FAP包被浓度为2μg/mL。筛选结果如图1所示，随着筛选轮数的增加，FAP包被浓度逐渐降低，噬菌体滴度逐渐增加。
FAP特异性噬菌体的鉴定：随机挑取第三轮筛选后滴度测定平板上的分离良好的单菌落100个，经过分别培养纯化后，用噬菌体ELISA检测各株噬菌体对FAP的结合活性。具体步骤如下为：分别以1μg/mL浓度FAP、BSA和IgG1Fc包被酶标板并于4℃封闭过夜，TBST洗涤6次后加入纯化后的噬菌体100μL，37℃振荡孵育1h，TBST洗涤10次去除未结合的噬菌体，加入HRP标记的鼠抗M13单克隆抗体100μL，37℃振荡孵育1h，TBST洗涤10次，加TMB底物室温避光反应5～10min，2mol/L硫酸终止反应，于450nm波长测定OD值，以P/N≥2.1为阳性。检测结果显示，有25株噬菌体表现出对FAP的结合。提取这25株噬菌体ssDNA，送Invitrogen公司测序，得到7株不同序列，分别为命名P1-P7。呈现频率最高的三种多肽共有序列结构：SCD(xx)H(xx)WC；其中P1的出现频率为4/25，其序列为SCDSWHYWC。
序列P1的结合活性测定：分别以1μg/mL浓度FAP、BSA和IgG1Fc包被酶标板并于4℃封闭过夜，TBST洗涤6次，加入展示有P1序列的噬菌体100μL(以相同滴度的无关噬菌体为对照)，TBST洗涤10次去除未结合的噬菌体，加入HRP标记的鼠抗M13单克隆抗体100μL，37℃振荡孵育1h，TBST洗涤10次；加OPD底物室温避光反应5～10min，2mol/L硫酸终止反应，于490nm波长测定OD值。结果如图2所示，展示有P1序列的噬菌体表现出对FAP的特异性结合。
FITC标记的M1结合活性测定：荧光标记多肽FITC-Ahx-SCDSWHYWC(Ahx为正己氨酸)由北京中科亚光生物技术公司合成。以灭菌蒸馏水将多肽粉末(M1FITC)溶解至终浓度为25μmol/L分装后存避光存放于-20℃。分别以1μg/mL浓度FAP、BSA包被酶标板，并于4℃封闭过夜，TBST洗涤6次，加入终浓度为25umol/L的M1FITC，37℃孵育1h，用TBST洗涤5次，HRP标记的鼠抗FITC抗体，37℃孵育1h，用TBST洗涤5次，加OPD底物室温避光反应5～10min，2mol/L硫酸终止反应，于490nm波长测定OD值。结果如图3所示，标记了FITC的多肽M1能特异性结合FAP。
Claims (6)
1.一种多肽，其特征在于，所述多肽的氨基酸序列为：SCDSWHYWC。
2.编码权利要求1所述多肽的核苷酸序列。
3.权利要求1中所述多肽在制备肿瘤分子成像试剂中的应用。
4.一种检测FAP的荧光探针，其特征在于，所述荧光探针的多肽部分为权利要求1所述的多肽。
5.根据权利要求4所述的荧光探针，其特征在于，所述的荧光探针还包括荧光基团。
6.根据权利要求5所述的荧光探针，其特征在于，所述的荧光基团为FITC。
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