CN111518165B

CN111518165B - 一种特异性结合结核分枝杆菌的多肽、其编码基因及应用

Info

Publication number: CN111518165B
Application number: CN202010383274.9A
Authority: CN
Inventors: 薛頔; 林雪; 魏萌萌; 王玉炯
Original assignee: Ningxia University
Current assignee: Ningxia University
Priority date: 2020-05-08
Filing date: 2020-05-08
Publication date: 2021-10-01
Anticipated expiration: 2040-05-08
Also published as: CN111518165A

Abstract

本发明公开了一种特异性结合结核分枝杆菌的多肽及其编码基因，属于生物医学领域。所述多肽包括SEQ ID No.2所示氨基酸序列，所述编码基因包括SEQ ID No.1所示核苷酸序列。本发明还公开了所述多肽在制备用于检测结核分枝杆菌感染的试剂盒或靶向结核分枝杆菌的药物中的应用。本发明的多肽，能够用于诊断结核病，并具有较高的诊断灵敏度和特异性，为结核病靶向诊断提供一种新的方法，具有较大的应用前景。

Description

一种特异性结合结核分枝杆菌的多肽、其编码基因及应用

技术领域

本发明属于生物医学领域，具体地，涉及一种特异性结合结核分枝杆菌的多肽、其编码基因及应用。

背景技术

结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis，M.tb）感染引起的结核病（Tuberculosis，TB）是一种严重威胁公共卫生安全的世界性传染病。结核分枝杆菌产生的独特的细胞包膜脂质在这些细菌的致病性中起着至关重要的作用。分枝杆菌的细胞膜由脂质和蛋白质的组成，周围是由碳水化合物和脂质组成的复杂细胞壁。结核分枝杆菌和其他分枝杆菌的细胞壁具有不同寻常的结构，包含多层且极为疏水的包膜，这对于生物体在巨噬细胞中的生存至关重要。

早期诊断是治疗和终止结核病的首要环节，但是传统的生物学技术例如镜鉴法，培养法存在假阳性，易污染，耗时长，无法定量等缺点，难以在基层实验室开展；随着分子诊断技术的不断发展，衍生出全自动实时荧光核酸扩增等技术，又存在成本高，技术难度大等缺陷，不能普遍使用。

分枝杆菌酸（Mycobacterial acid，MA）和它的前体2-烷基,3-羟基长链脂肪酸（FAs）是结核分枝杆菌的细胞包膜的标志。MA在细胞壁通透性屏障的形成中具有重要作用。MA具有的特征对于维持结核分枝杆菌细胞壁结构的生理作用也至关重要。分枝杆菌对包括抗生素和营养成分（例如葡萄糖和甘油）的亲水分子不易渗透。这种低渗透性与高度疏水的表面结构有关，结核分枝杆菌细胞壁中存在大量的MA。宿主发生原发性感染后，巨噬细胞内脂滴的积累使这些巨噬细胞呈现出泡沫状。在肺泡FMs中，细菌主要存在于脂滴中。这些细胞聚限制细菌扩散，使宿主不能杀死所有寄生菌，导致结核分枝杆菌可以在体内持续存在许多年。尽管MA与结核分枝杆菌的致病机理有密切关系，并且可以成为理想的诊断抗原，但MA检测方法通常需要高度复杂的仪器和训练有素的人员，对于资源匮乏的环境中的诊断分析而言并不理想。

总的来说，现有实验室诊断方法还存在很多的局限性，找到一种快速、准确、经济、方便的诊断方法十分必要。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明的目的是提供一种能够快速、准确检测结核分枝杆菌的试剂和应用。

为了完成上述目的，本发明一方面提供一种特异性结合结核分枝杆菌的多肽，所述多肽包括SEQ ID No. 2所示氨基酸序列。

在发明的一些实施方案中，所述多肽由SEQ ID No. 2所示氨基酸序列组成。

在本发明中，所述多肽能够特异性识别结核分枝杆菌上的MA。

本发明的第二方面提供编码本发明第一方面所述多肽的基因，所述基因包括SEQID No. 1所示核苷酸序列。

在本发明的一些实施方案中，所述基因由SEQ ID No. 1所示核苷酸序列组成。

本发明的第三方面提供一种噬菌体，所述噬菌体本发明第一方面所述多肽序列，或具有本发明第二方面所述基因。

在本发明的一些实施方案中，所述多肽以融合蛋白的形式融合表达在噬菌体外壳蛋白PⅧ或PⅢ的N端，展示在噬菌体颗粒的表面，其保持相对独立的空间结构和生物活性，可以与结核分枝杆菌特异结合而不影响噬菌体的包装和复制。

本发明的第四方面提供本发明第一方面所述的多肽或本发明第三方面所述的噬菌体在制备用于检测结核分枝杆菌感染的试剂盒中的应用。

本发明的第五方面提供一种检测结核分枝杆菌感染的试剂盒，包括本发明第一方面所述的多肽或本发明第三方面所述的噬菌体。

利用本发明的试剂盒，可以准确、特异地检测结核分枝杆菌感染。检测样本是否具有结核分枝杆菌感染的方法包括以下步骤：

（1）获得生物样本；

（2）利用本发明的试剂盒对所述生物样本进行检测。

如果检测结果为阳性，表明为结核分枝杆菌感染样本。

在本发明的一些实施方案中，所述检测为异源竞争ELASA检测。在本发明的一些具体实施方案中，所述生物样本选自咽拭子、鼻拭子、鼻咽提取物、深咳痰液、肺泡灌洗液。

在本发明的另一些实施方案中，所述检测为免疫组化检测。在本发明的一些具体实施方案中，所述生物样本为肺组织切片。

在本发明的一些实施方案中，所述结核分枝杆菌感染者具有结核病或者具有患结核病的风险。

本发明的第六方面提供本发明第一方面所述的多肽在制备用于治疗结核病的药物中的应用。

本发明的第七方面提供一种治疗结核病的药物，所述药物结合有本发明第一方面所述的多肽。

在本发明的一些实施方案中，所述药物能够靶向结核分枝杆菌。

MA是许多当前的一线和二线抗结核药物的有效作用部位，作为开发新型抗分枝杆菌药物的靶标具有巨大潜力。本发明的多肽，能够特异性结合MA，因此可以作为结核病治疗的靶向肽，为结核病药物的入膜、递送起到主动靶向的作用，通过特异性结合细菌表面MA以达到靶向输送药物的目的。在本发明的一些实施方案中，治疗结核的药物通过物理的或化学的方法与所述多肽结核，从而直接靶向结核分枝杆菌，起到定向清除的目的。

本发明的有益效果

相对于现有技术，本发明具有以下优点：

1.本发明提供一种特异结合结核分枝杆菌的多肽，由于其氨基酸长度很小，所以本身低毒，对周边的正常细胞组织无明显损害作用，在非靶点位置能快速被清除，不会给机体带来负担。

2.本发明提供的这种特异结合结核分枝杆菌的多肽可以根据临床需求进行优化，也可以调整结构增加对蛋白酶降解的稳定性、控制在体内中的半衰期，以替换抗体作为检测元件检测结核分枝杆菌，更好的结合靶标。

3.本发明提供的特异结合结核分枝杆菌的多肽稳定性高，易于储存运输

4.本发明提供的特异结合结核分枝杆菌的多肽体外合成方便，制备过程简单，成本低。

附图说明

图1示出了挑选的15个现出对MA的结合的噬菌体克隆的P-ELISA检测结果。横坐标为噬菌体克隆，纵坐标为OD₄₅₀值，MA浓度为50μg/mL。

图2示出了竞争ELISA检测MA，OD₄₅₀值与MA浓度曲线。横坐标为MA的浓度，纵坐标为OD₄₅₀。

图3示出了特异性噬菌体检测结核病小鼠模型肺部组织的结果。A图为对照组，B图为M.tb组。

具体实施方式

为了使本发明所解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。

实施例

以下例子在此用于示范本发明的优选实施方案。本领域内的技术人员会明白，下述例子中披露的技术代表发明人发现的可以用于实施本发明的技术，因此可以视为实施本发明的优选方案。但是本领域内的技术人员根据本说明书应该明白，这里所公开的特定实施例可以做很多修改，仍然能得到相同的或者类似的结果，而非背离本发明的精神或范围。

除非另有定义，所有在此使用的技术和科学的术语，和本发明所属领域内的技术人员所通常理解的意思相同，在此公开引用及他们引用的材料都将以引用的方式被并入。

那些本领域内的技术人员将意识到或者通过常规试验就能了解许多这里所描述的发明的特定实施方案的许多等同技术。这些等同将被包含在权利要求书中。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的仪器设备，如无特殊说明，均为实验室常规仪器设备；下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。

在下述实施例中，主要试剂配方包括：

（1）LB培养基：每升含10g蛋白胨，5g酵母提取物，5g NaCl，高压灭菌，室温贮存；

（2）LB/IPTG/Xgal平板：LB培养基+15g/L琼脂粉。高压灭菌，冷却至低于70℃时，加入1mL IPTG/Xgal，混匀倒平板。平板4℃避光贮存；

（3）顶层琼脂：每升含10g蛋白胨，5g酵母提取物，5g NaCl，7g琼脂粉。高压灭菌，分成50ml等份，固体培养基室温贮存，用时微波炉融化；

（4）四环素贮液：以20mg/mL的浓度溶于70％乙醇中，-20℃避光贮存，用前摇匀；

（5）LB-Tet平板：LB培养基+15g/L琼脂粉。高压灭菌，冷却至低于70℃时，加入1mL四环素贮液，混匀倒平板，平板4℃避光贮存；

（6）PEG8000/NaCl：20％（w/v）PEG-8000，2.5mol/L NaCl，高压灭菌，室温贮存；

（7）IPTG/Xgal配方：将1.25g IPTG（isopropylβ-D-thiogalactoside）和1g Xgal溶于25mL二甲基甲酰胺中，-20℃避光贮存；

（8）TBS：50mmol/L Tris-HCl（pH 7.5），150mmol/L NaCl。高压灭菌，室温贮存；

（9）PBST溶液：在PBS溶液中加入体积比为0.05％/0.02%的吐温20

（10）碘化物缓冲液：10mmol/L Tris-HCl（pH 8.0），1mmol/L EDTA，4mol/L NaI。室温避光贮存；

（11）0.2mol/L Glycine-HCl（pH 2.2），1mol/L Tris-HCl（pH 9.1），高压灭菌，室温贮存。

实施例1 结合MA的多肽的筛选

1. 噬菌体文库的扩增及纯化

接种E.coli ER2738单菌落于5-10mL LB液体培养基中，37℃、200rpm摇床孵育至对数中期（OD₆₀₀≈0.5）；加入10μL噬菌体，37℃、200rpm摇床震荡4-5h，10000g离心10min，取上清；再次10000g离心10min，取80%上清，加入1/6体积的PEG8000/NaCl，4℃静置过夜。次日取出，白色沉淀即为噬菌体。10000g离心15分钟，倒掉上清，瞬时离心后轻轻吸出残留溶液；加入1mL TBS溶液溶解白色沉淀。

2.噬菌体滴度测定

接种E.coli ER2738单菌落于5-10mL LB液体培养基中，37℃、250rpm摇床孵育至对数中期（OD₆₀₀≈0.5）；微波炉加热融化顶层琼脂糖培养基，分成3mL/份分装到灭菌试管中，每个噬菌体稀释度用一管，保存于45℃备用；37℃预温LB/IPTG/Xgal琼脂平板，每个噬菌体稀释梯度取一个平板备用；用LB培养液对噬菌体进行10倍比系列稀释（稀释范围：扩增的噬菌体培养物上清：10⁸-10¹¹；未扩增的淘选洗脱物：10¹-10⁴）；每个稀释度换一新鲜吸头，使用带滤芯吸头以避免交叉污染；当大肠杆菌菌液达对数中期时，将菌液分成200μL等份于微量离心管中，每个噬菌体稀释度用一管；每管大肠杆菌菌液中分别加入10μL不同稀释倍数的噬菌体，快速震荡混匀，室温温育1-5min；将噬菌体感染的大肠杆菌菌液加入45℃预温的顶层琼脂糖培养基管中，每次一管，快速混匀，立即倾注于37℃预温的LB/IPTG/Xgal琼脂平板上。适当倾斜平板将上层琼脂均匀铺开；待平板冷却5min后，倒置于37℃孵箱，培养过夜；检查平板，计数有～10²个噬菌斑的平板上的斑数，然后，用此数目乘以稀释因子即得到每10μL噬菌体的空斑形成单位（pifu）滴度。

3.MA特异性噬菌体的富集

以50μg/mL浓度的MA包被免疫试管并于4℃封闭过夜，TBST洗涤6次后加入噬菌体肽库，37℃振荡孵育1h，TBST洗涤10次去除未结合的噬菌体，加0.2mol/L Glycine-HCl（pH2.2）1mL振荡10min洗脱特异结合的噬菌体，加150μL 1mol/L Tris-HCl（pH 9.1）中和，取10μL洗脱产物计数噬菌体的滴度，其余洗脱产物感染大肠杆菌ER2738扩增并纯化噬菌体，得到次级库，对次级库滴度进行测定后进入下一轮筛选程序。

4.特异性结合噬菌体的筛选

重复步骤3的方法再进行四轮淘选，每一轮的滴度如表1所示，第1轮洗涤条件是体积比0.1％的Tween20，第2和第3轮Tween-20浓度变为0.3％（v/v），第4轮Tween-20浓度为0.5％（v/v）。

表1 特异性噬菌体富集第一轮至第四轮噬菌体投入产出表

	投入滴度（pfu/mL）	产出滴度（pfu/mL）
			第一轮	2×10<sup>11</sup>	7.7×10<sup>9</sup>
第二轮	2×10<sup>11</sup>	2.8×10<sup>10</sup>
			第三轮	1×10<sup>11</sup>	4.6×10<sup>11</sup>
第四轮	1×10<sup>11</sup>

实施例2 MA特异性噬菌体的鉴定

随机挑取实施例1中第三轮筛选后滴度测定平板上的分离良好的单菌落20个，经过分别培养纯化后，用噬菌体ELISA检测各株噬菌体对MA的结合活性。具体步骤如下为：

分别以MA和Blocking包被酶标板，每组三个平行，并于4℃封闭过夜，TBST洗涤6次后加入纯化后的噬菌体100μL，37℃振荡孵育1h，TBST洗涤10次去除未结合的噬菌体，加入HRP标记的鼠抗M13单克隆抗体100μL，37℃振荡孵育1h，TBST洗涤10次，加TMB底物室温避光反应5～10min，2mol/L硫酸终止反应，于450nm波长测定OD值，以P/N≥2.1为阳性。

检测结果如图1显示，有15株噬菌体表现出对MA的结合。提取这15株噬菌体ssDNA，阳性克隆的菌液DNA测序由上海生工生物技术公司完成。

经测序，涉及的核苷酸序列如下：

GAATGTCCAGTTGCCCGACAA（SEQ ID No. 1）。

使用DNAMAN和Swiss数据库序列进行分析，获得相应的氨基酸序列（命名Thanos1序列）如下：

Leu-Ser-Gly-Asn-Trp-Thr-Phe（LSGNWTF）（SEQ ID No. 2）。

实施例3 多肽序列的结合活性测定

分别以不同浓度MA和Blocking包被平板并于4℃封闭过夜，TBST洗涤6次，加入具有Thanos1序列的噬菌体2×10¹¹（以相同滴度的不含Thanos1序列的噬菌体为对照），TBST洗涤10次去除未结合的噬菌体，加入HRP标记的鼠抗M13单克隆抗体100μL，37℃振荡孵育1h，TBST洗涤10次；加TMB室温避光反应5～10min，2mol/L硫酸终止反应，于450nm波长测定OD值。结果如图2所示，具有Thanos1序列的噬菌体表现出对MA的特异性结合。

实施例4 序列体内结合实验

取ICR小鼠5只，采用滴鼻方法接种M.tb 40μL，浓度为2.5×10⁸CFU/mL，建立结核病小鼠模型，称作M.tb组；另取ICR小鼠5只，采用滴鼻方式接种等量的PBS溶液，作为结核病小鼠模型的对照组。分别选取不同组的ICR小鼠的肺组织切片，进行肺组织石蜡包埋切片，将切片移入湿盒中加入新鲜配制的3%双氧水，以去除内源性过氧化物酶，封闭液室温孵育10分钟，封闭PBS浸洗玻片3次，每次3min，吸水纸吸干PBS，在玻片上滴加山羊血清，室温封闭30min；吸去封闭液，滴加稀释好的一抗(1：1000)，放入湿盒，4℃孵育过夜；吸取一抗，PBS浸洗玻片3次，每次3min，吸水纸吸干PBS，滴加二抗工作液，室温孵育1h，PBS浸洗玻片3次，每次3min，DAB显色5-10分钟；苏木精复染3分钟，PBS冲洗1min脱水、透明、封片、镜检。特异性噬菌体免疫组化检测，如图3所示，可以发现结核病小鼠模型病变部位出现典型阳性结果（黄色或棕色颗粒），和对照组有显著差异。

上述结果表明，可以应用上述七肽，建立结核病的检测新方法。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 宁夏大学

<120> 一种特异性结合结核分枝杆菌的多肽、其编码基因及应用

<130> JIA-2020-1-W-003

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gaatgtccag ttgcccgaca a 21

<210> 2

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Leu Ser Gly Asn Trp Thr Phe

1 5

Claims

1.一种特异性结合结核分枝杆菌的多肽，其特征在于，所述多肽氨基酸序列如SEQ IDNo.2所示。

2.权利要求1所述多肽的编码基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQ IDNo.1所示。

3.一种噬菌体，其特征在于，所述噬菌体具有权利要求1所述多肽序列，或具有权利要求2所述基因。

4.权利要求1所述的多肽在制备用于检测结核分枝杆菌感染的试剂盒中的应用。

5.权利要求3所述的噬菌体在制备用于检测结核分枝杆菌感染的试剂盒中的应用。

6.一种检测结核分枝杆菌感染的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的多肽，或包括权利要求3所述噬菌体。