CN106589106A

CN106589106A - Hla‑a24限制性ecm1特异性的ctl表位肽及其应用

Info

Publication number: CN106589106A
Application number: CN201710050503.3A
Authority: CN
Inventors: 魏敏杰; 孙明立; 于兆进; 刘雯思; 韩强; 赵兰; 李亚楠; 线云开
Original assignee: China Medical University
Current assignee: China Medical University
Priority date: 2017-01-23
Filing date: 2017-01-23
Publication date: 2017-04-26
Anticipated expiration: 2037-01-23
Also published as: CN106589106B

Abstract

本发明涉及肿瘤的免疫治疗领域，尤其涉及HLA‑A24限制性ECM1特异性的CTL表位肽及其应用，具体为通过肿瘤疫苗特异性诱导、刺激活化生物体肿瘤特异性T淋巴细胞，激发、增强生物体抗肿瘤免疫功能及其在特异性抗肿瘤免疫治疗中的应用。其氨基酸序列具体为：SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：3。所述的HLA‑A24限制性ECM1特异性CTL表位肽可通过人工合成，或通过原核细胞或真核细胞表达纯化获得。

Description

HLA-A24限制性ECM1特异性的CTL表位肽及其应用

技术领域

本发明涉及肿瘤的免疫治疗领域，尤其涉及HLA-A24限制性ECM1特异性的CTL表位肽及其应用，具体为通过肿瘤疫苗特异性诱导、刺激活化生物体肿瘤特异性T淋巴细胞，激发、增强生物体抗肿瘤免疫功能及其在特异性抗肿瘤免疫治疗中的应用。

背景技术

细胞外基质蛋白-1（ECM1）是1994年Mathieu等从鼠的成骨基质细胞株MN7中分离出来的一种分泌型糖蛋白，相对分子质量为85KD。ECM1蛋白质参与细胞增殖，血管生成，胚胎软骨的形成，皮肤分化等多种生物学过程。近来研究表明，ECM1在乳腺癌、甲状腺癌、喉癌、肝癌、胆管癌、胃癌、结直肠癌、肺癌等多种上皮样恶性肿瘤中异常高表达，因此，ECM1可作为肿瘤相关抗原成为肿瘤免疫治疗靶点。

随着对免疫应答分子机制研究的深入，现已逐渐认识到机体的免疫细胞识别的不是病原体或天然抗原的整体分子，而是各种抗原分子的抗原表位，即蛋白质抗原是通过其表位来体现其免疫特异性。目前，研究表明，靶抗原需经抗原提呈细胞处理以“抗原肽-MHC-I类分子”复合物的形式呈现至抗原提呈细胞或靶细胞表面后可被CD8+T细胞识别，相应的与MHC-I类分子结合的抗原肽即为CTL表位。CTL表位肽能够激活诱导产生特异性细胞毒性T淋巴细胞（CTL细胞），对人类白细胞抗原（HLA）配型匹配且靶抗原高表达的肿瘤细胞有杀伤作用；HLA-A24是常见MHC-I类分子基因型。因此，筛选HLA-A24限定性且可识别ECM1的CTL表位，可实现针对ECM1高表达且HLA配型为HLA-A24的恶性上皮肿瘤的靶向免疫治疗。

合成肽疫苗是近年来出现的新型疫苗研究方向，合成肽能够直接与MHC分子结合，而不需要APC的加工处理，它与天然的内源性肽在激活免疫系统方面具有相同的效果，因此合成肽疫苗广泛应用于抗病毒免疫治疗。目前已有多种基于多肽表位的合成肽疫苗进入临床研究阶段或已上市。建立在CTL表位鉴定基础之上的CTL表位肽疫苗，由于人工合成多肽不包含病原生物的无关成分，只诱导特异性CTL应答，因此安全、稳定、毒副作用少，且研制周期大大缩短。更重要的是，基于CTL表位研发的多个CTL表位组合，还可设计针对一种或多种病原体的多价CTL表位肽疫苗。因此，CTL表位合成肽疫苗已成为治疗肿瘤研究的一个新策略，而对HLA-A24限制性ECM1特异的CTL表位肽即成为研究的关键。

发明内容

针对上述问题，本发明在于提供一种HLA-A24限制性ECM1特异性的CTL表位肽，该发明是对与人HLA-A24分子结合且可激活ECM1特异性CTL细胞的多肽分子进行预测、筛选和鉴定，提供能与人HLA-A24分子结合位点结合、进而激活ECM1特异性CTL细胞的CTL表位肽。本发明提供的HLA-A24限制性ECM1特异CTL表位肽可用于研制靶向抗原ECM1的治疗性肽疫苗，为上皮样恶性肿瘤精准免疫治疗提供理论基础。

本发明提供HLA-A24限制性ECM1特异性的CTL表位肽能与人HLA-A24分子的结合位点进行结合，可诱导产生ECM1特异性的细胞毒性T淋巴细胞，发挥HLA-A24限制性ECM1靶向性肿瘤杀伤作用的CTL表位肽，其氨基酸序列选自。

SEQ ID NO ：1 EEP-1：Val Trp Glu Glu Ala Met Ser Arg Phe。

SEQ ID NO ：2 EEP-2：Asn Tyr Leu Arg Asn Val Ala Leu Val。

SEQ ID NO ：3 EEP-3：Asn Tyr Asp Arg Asp Ile Leu Thr Ile。

所述的HLA-A24限制性ECM1特异性CTL表位肽，为通过添加，缺失或替换一个或多个氨基酸而衍生自EEP-1、EEP-2或EEP-3的氨基酸序列组成的突变肽。

所述的HLA-A24限制性ECM1特异性CTL表位肽，为具有EEP-1、EEP-2、EEP-3或突变肽氨基酸序列中的一条或多条的游离型多肽、融合型多肽或嵌合型多肽，也可以是以上述多肽之一为单体的各种形式的聚合体。

所述的HLA-A24限制性ECM1特异性CTL表位肽可通过人工合成，或通过原核细胞或真核细胞表达纯化获得。

所述的HLA-A24限制性ECM1特异性CTL表位肽是根据CTL表位肽与HLA-A24分子相互作用的机理预测获得，并根据其能有效与HLA-A24分子结合并能激活特异性T淋巴细胞的特性鉴定为有效的CTL表位肽，该CTL表位肽体外容易合成，方便临床应用。

本发明的有益效果。

本发明提供能与人HLA-A24分子结合、可激活ECM1抗原特异性CTL细胞的CTL表位肽。本发明通过生物信息学手段、计算机软件模拟技术及分子免疫学实验方法相结合的策略，提高了CTL表位肽筛选的准确性；CTL表位肽为系列短肽，体外容易合成，且能够诱导产生显著特异性抗肿瘤免疫反应，可广泛应用于肿瘤靶向免疫治疗技术领域中。

附图说明

图1为EEP-1的质谱分析图。

图2为EEP-1的高效液相色谱法分析图。

图3为EEP-2的质谱分析图。

图4为EEP-2的的高效液相色谱法分析图。

图5为EEP-3的质谱分析图。

图6为EEP-3的高效液相色谱法分析图。

图7为表位肽诱导ECM1致敏的HLA-A24阳性健康志愿者PBMC释放IFN-γ水平平ELISPOT检测实测图。

图8为各组IFN-γ分泌水平的统计学结果。

图9为HLA-A24限制性ECM1 蛋白CTL表位肽诱导的效应细胞对乳腺癌MCF-7细胞（HLA-A24阳性）的作用。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明。以下实施例将有助于对本发明的了解，但这些实施例仅为了对本发明加以说明，本发明并不限于这些内容。在实施例中未作特殊说明的操作方法均为本技术领域常规操作方法。

实施例1。

HLA-A24限制性ECM1特异性的CTL表位肽预测。

（1）应用国际公认的表位肽预测网站http://tools.iedb.org/mhci/提供的分析软件（IEDB分析软件），对ECM1蛋白氨基酸序列进行分析，获得理论存在的HLA-A24限制性CTL表位；IEDB分析软件预测ECM1氨基酸序列中理论存在的HLA-A24限制性表位肽，见表1；表2 氨基酸缩写表，见表2。

表1 IEDB分析软件预测ECM1氨基酸序列中理论存在的HLA-A24限制性表位肽。

由此可见：3条CTL表位肽EEP-1、EEP-2、EEP-3与HLA-A24分子具有很好的结合能力，其中IC50<50 nM的CTL表位肽具有高亲和力，IC50<500 nM的CTL表位肽具有中亲和力，IC50<5000 nM的CTL表位肽具有低亲和力。

表2 氨基酸缩写表。

实施例2。

CTL表位肽的合成、纯化及分子量测定。

采用标准Fmoc方案，应用美国PE公司生产的ABI43IA型多肽合成仪进行多肽的合成，简述如下：按照多肽序列使肽链从羧基端向氨基端延伸，合成后，选用TFA/DCM进行切割，表位肽收集液在常温下减压干燥至1-2 mL，然后用至少50 mL预冷乙醚沉淀，然后抽滤，得到的多肽粗产品；将获得的表位肽粗品10mg用200μl DMSO溶解后，用水稀释至所需体积，浓度为10 mg/mL，经0.22μm纤维膜过滤后，在美国Waters公司产品Delta600型HPLC上纯化并进行纯度分析。流动相选用含0.1%TFA水溶液和含0.1%TFA乙氰溶液。各肽的纯化选用C18制备柱（美国Waters公司，7.0μm，100A，7.8mm×150mm），各肽的纯度分析选用C18分析柱（美国Waters公司，5.0μm，100A，3.9mm×150mm）。各纯化后CTL表位肽的相对分子质量测定在API 2000型（美国Waters公司）质谱仪上安常规方法进行。其质谱分析图参见图1、图3和图5，HPLC分析图参见图2、图4和图6，可以看出3条CTL表位肽的分子量理论值（EEP-1：1154.292；EEP-2：1061.232；EEP-3：1122.232；）均与实测值相近，在允许误差范围之内，且纯度均在95%以上，说明合成效果好，可用于下一步实验。上述多肽经冻干处理后，放于-70℃保存、备用。

实施例3。

ELISPOT实验检测IFN-γ分泌水平筛选ECM1蛋白HLA-A24限制性CTL表位肽。

1、PBMC的制备。

抽取HLA-A24阳性健康志愿者外周静脉血10ml肝素抗凝，用PBS按1:1 稀释，将稀释的血样缓缓的加入盛有淋巴细胞分离液的离心管中，形成明显的分层（稀释血样与淋巴细胞分离液比例为 2:1 )，经1800 rpm，室温水平离心15min；在超净台内吸取试管中间层的单个核细胞（PBMC）于另一无菌的离心管中，用PBS清洗 2次，计数PBMC，于AIM-Ⅴ培养基中培养。

2、ECM1对PBMC致敏。

6孔板中，按照1×10⁶个/ml的密度，应用AIM-Ⅴ培养基培养PBMC，加入5μg人 ECM1重组蛋白致敏PBMC，每周一次，共2次，培养至第14天收集细胞。

3、ELISPOT检测。

（1）常温下往预包被的96孔ELISPOT检测板各个孔中加入200 µl RPMI-1640培养基，静置10 min以活化预包被板。

（2）将致敏的PBMC加入ELISPOT检测板各孔，每孔200µl，含1×10⁵个细胞。

（3）分别加入相应的CTL表位肽及阴性肽，终浓度为50μg/ml，并设立阳性对照（PHA刺激）和阴性对照（仅加培养基）；将ELISPOT检测板置于37℃，5% CO₂，饱和湿度细胞培养箱内孵育16h。

（4）孵育后倾倒培养基，于检测板各孔中加入200 µl 冰冷的去离子水，于4℃放置10 min，然后倾弃培养板中的去离子水。

（5）每个孔用200 µl 1×Washing buffer洗涤6次，洗涤完成后将检测板在灭菌吸水纸上扣干。

（6）将生物素标记的抗体工作液加入到检测板，每孔加入100µl，加入抗体工作液之后将板置于37℃孵育1小时。

（7）将酶标亲和素工作液加入检测板各孔，每孔加入100 µl，将检测板置于37℃孵育1小时；孵育后，1×Washing buffer清洗检测板7次。

（8）将AEC显色工作液加入检测板各孔，每孔加入100µl，室温孵育，每隔5分钟观察一次，见到检测板有清晰的红色斑点形成的时候倾倒孔内显色工作液，揭开板底座，用大量自来水洗涤终止显色，自然晾干检测板后合上底座。

（9）将检测板交达科为公司进行斑点计数，并作统计分析。

4、结果分析。

计数ELISPOT检测板空地的斑点数目，比较各CTL表位肽诱发PBMC分泌IFN-γ的水平，绘制各组IFN-γ分泌水平的柱状图。

图7所示为表位肽诱导ECM1致敏的HLA-A24阳性健康志愿者PBMC释放IFN-γ水平ELISPOT检测实测图；图8所示为各组IFN-γ分泌水平的统计学结果。结果表明，HLA-A24限制性ECM1特异CTL表位肽EEP-1、EEP-2及EEP-3均可明显诱导HLA-A2阳性健康志愿者PBMC释放IFN-γ。

实施例4。

钙黄素（Calcein-AM）释放实验检测CTL表位肽对肿瘤细胞的靶向免疫杀伤效果。

1、效应细胞的制备。

诱导成熟的人DC细胞，以PBS清洗后，无血清RPMI-1640培养基重悬，加50μg/mlCTL表位肽，37℃孵育过夜。DC细胞经PBS清洗、计数，按30μg/ml的浓度加入丝裂霉素C，37℃孵育30min。DC细胞经冰PBS清洗、计数后，与繁殖期T细胞按1:20比例共培养，并加入50U/ml的IL-2，以刺激T细胞。1周刺激1次，共3次，将T细胞诱导成细胞毒性T细胞（CTL），即效应细胞。

2、靶细胞的制备。

复苏乳腺癌细胞MCF7、BT-549，按照常规培养方式进行细胞的正常培养、传代；其中MCF7细胞株为HLA-A24阳性，BT-549细胞株为HLA-A24阴性。

3、钙黄素释放实验。

以10mM浓度的Calcein-AM标记靶细胞，清洗、重悬；效应细胞与标记后的肿瘤细胞按照1:1、10:1、20:1、40:1、80:1的效靶比例，37℃共培养4h；然后收集培养液，1000rpm离心5min，取100μl上清液测定平均荧光强度，以单纯靶细胞作为自发释放量，以单纯靶细胞加去垢剂作为最大释放量。

效应细胞对靶细胞的杀伤率以细胞溶解率表示：细胞溶解率=（实验释放量-自发释放量）/（最大释放量-自发释放量）。

表位肽诱导的效应细胞对肿瘤细胞的靶向杀伤结果，见表3。

表3 CTL表位肽诱导的效应细胞对肿瘤细胞的靶向杀伤率（%）。

注：杀伤作用以杀伤率（%已省略）表示。

HLA-A24限制性ECM1 蛋白CTL表位肽诱导的效应细胞对乳腺癌MCF-7细胞（HLA-A24阳性）的作用，见图9；结果表明：EEP-1、EEP-2及EEP-3诱导的CTL对HLA-A24阳性的人乳腺癌细胞MCF-7均具有显著杀伤作用，而对HLA-A24阴性的人乳腺癌细胞BT-549细胞杀伤作用不明显，其杀伤具有HLA-A24分子的限制性。

序列表

<110> 中国医科大学

<120> HLA-A24限制性ECM1特异性的CTL表位肽及其应用

<160> 3

<210> 1

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 1

Val Trp Glu Glu Ala Met Ser Arg Phe

1 5

<210> 2

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 2

Asn Tyr Leu Arg Asn Val Ala Leu Val

1 5

<210> 3

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 3

Asn Tyr Asp Arg Asp Ile Leu Thr Ile

1 5

Claims

1.HLA-A24限制性ECM1特异性的CTL表位肽，其特征在于：所述的CTL表位肽是一种来源于ECM1蛋白氨基酸序列的HLA-A24限制性CTL表位肽，可诱导产生ECM1特异性的细胞毒性T淋巴细胞、发挥HLA-A24限制性肿瘤杀伤作用的表位肽，其氨基酸序列包括：

EEP-1：Val Trp Glu Glu Ala Met Ser Arg Phe；

EEP-2：Asn Tyr Leu Arg Asn Val Ala Leu Val；

EEP-3：Asn Tyr Asp Arg Asp Ile Leu Thr Ile。

2.根据权利要求1所述的HLA-A24限制性ECM1特异性的CTL表位肽，其特征在于：所述的HLA-A24限制性ECM1特异的CTL表位肽为通过添加，缺失和替换一个或多个氨基酸而衍生自所述氨基酸序列的氨基酸序列组成的突变肽。

3.根据权利要求1和权利要求2所述的HLA-A24限制性ECM1特异性的CTL表位肽，其特征在于：所述的HLA-A24限制性ECM1为具有所述氨基酸序列中的一条或多条的游离型多肽、融合型多肽和嵌合型多肽，以及以上所述多肽之一为单体的各种形式的聚合体。

4.根据权利要求3所述的HLA-A24限制性ECM1特异性的CTL表位肽，其特征在于：所述的HLA-A24限制性ECM特异性的CTL表位肽通过人工合成，或通过核细胞表达纯化获得。

5.根据权利要求3所述的HLA-A24限制性ECM1特异的CTL表位肽，其特征在于：所述的HLA-A24限制性ECM1特异性的CTL表位肽是根据表位肽与HLA-A24分子相互作用的机理预测获得，并根据其能有效与HLA-A24分子结合并能激活特异性T淋巴细胞的特性鉴定为有效的表位肽。

6.如权利要求1-5任一所述的HLA-A24限制性ECM1特异的CTL表位肽，特征在于，用于合成靶向抗原ECM1的治疗性肽疫苗。