CN109988748A

CN109988748A - 一种从til筛选肿瘤特异性t细胞的方法

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Publication number: CN109988748A
Application number: CN201711471941.3A
Authority: CN
Inventors: 唐云霞; 李波; 张秀清
Original assignee: Shenzhen BGI Life Science Research Institute
Current assignee: Shenzhen BGI Life Science Research Institute
Priority date: 2017-12-29
Filing date: 2017-12-29
Publication date: 2019-07-09

Abstract

本发明公开了一种从TIL筛选肿瘤特异性T细胞的方法。该方法包括如下步骤：筛选待测肿瘤患者的肿瘤特异性抗原肽；构建MHC和所述肿瘤特异性抗原肽的复合物，该MHC抗原肽复合物可以与针对该肿瘤特异性抗原的T细胞的TCR结合；取待测肿瘤患者的IFN‑r阳性的TIL，加入所述MHC抗原肽复合物，孵育，分选肿瘤特异性T细胞。本发明同时提供了利用上述方法筛选的一种肿瘤特异性多肽，以及将筛选的肿瘤特异性T细胞及多肽在癌症治疗相关产品中的应用。利用本发明提供的方法可以高效的筛选出肿瘤特异性T细胞及筛选出肿瘤特异性多肽，这为肿瘤的免疫治疗提供了一种有效的选择。

Description

一种从TIL筛选肿瘤特异性T细胞的方法

技术领域

本发明涉及生物医学领域，具体涉及一种从TIL筛选肿瘤特异性T细胞的方法。

背景技术

肿瘤浸润淋巴细胞(tumor infiltrating lymphocytes，TIL)，是分布在肿瘤组织内部及周围的淋巴细胞。20世纪80年代，科学家们发现手术切除的肿瘤组织，大部分是肿瘤细胞，也有少部分淋巴细胞。进一步研究发现，这部分细胞中，某些淋巴细胞是能够杀伤肿瘤细胞的，即肿瘤浸润淋巴细胞中的某些T细胞能够识别肿瘤细胞表面提呈的肿瘤抗原，包括肿瘤特异性抗原也就是新抗原，但是由于一些原因功能受到了抑制(比如TIL表面的PD-1与肿瘤细胞表面的PD-L1结合，杀瘤功能被屏蔽)，所以不能在肿瘤组织中有效的杀伤肿瘤细胞。如果把这些淋巴细胞富集起来，大量回输给患者，或许就能对患者有利。TIL中含有三分之二的CD3+T细胞，三分之一的巨噬细胞和NK。CD3+T细胞中两个亚群CD4+T和CD8+T的比例个体间差异很大，CD4+T的比例变化范围为10％-80％，CD8+T的比例变化范围为30％-90％。研究表明，TIL作为一种新型免疫活性细胞，在过继免疫治疗进展期肿瘤中取得了令人鼓舞的结果，在治疗转移复发性黑色素的客观反应率最高达到了72％。同时，黑色素瘤复发转移至肺部或者肝脏与胃肠道癌症复发转移至肺部或者肝脏比较，前者肺部或者肝脏部位TIL中 CD3+T细胞比例更高，体外扩增培养后前者CD3+CD8+T细胞的比例为63.6％±2.4％，后者 CD3+CD8+T细胞的比例为22.6％±1.4％；大约80％黑色素瘤病人的TIL能扩增，大约70％胃肠癌病人的TIL能扩增，在TIL体外扩增能力方面，胃肠癌和黑色素瘤相当，但是胃肠道癌症 TIL中含有的肿瘤特异性T细胞的比例很低(只有1％-3％)。由此可见，TIL治疗胃肠道癌症效果不理想，原因很可能是TIL中对肿瘤细胞有杀伤效力的T细胞比例较低。肝癌组织中分离的TIL中包含了高比例的CD4+CD25+T细胞，即Treg细胞，扩增后对肝癌的治疗帮助较小。因此，应该筛选出TIL中肿瘤特异性T淋巴细胞并扩增后再用于肿瘤治疗。有研究者将TIL 中CD8+的T细胞筛选出来，用于肿瘤病人的治疗。但是CD8+T细胞中仍然含有大量非特异性 T细胞。

TIL中有各种类型的T细胞，针对肿瘤特异性抗原的T细胞能够靶向识别并杀伤肿瘤细胞。研究表明，肿瘤发生是基因突变的结果，表达的突变蛋白，在细胞内质网被加工成短肽，递呈于肿瘤细胞表面，即为肿瘤特异性抗原。突变负荷越高，产生的肿瘤特异性抗原越多，淋巴细胞浸润越丰富。这些肿瘤特异性抗原能够被免疫系统识别，但是免疫细胞受到肿瘤微环境中诸多因素的制约，无法大量扩增，比例太低，数量有限，不能很好的发挥杀瘤功能。传统的TIL培养方法也做筛选，但只是将肿瘤组织分在不同培养孔中，有的培养孔的细胞含有肿瘤特异性T细胞，但是比例不高；而且传统培养方法将该培养孔的肿瘤特异性T细胞和非特异性T细胞一起扩增，给病人回输的TIL中的肿瘤特异性T细胞的比例依然很低，这可能是TIL治疗效果不尽如人意的一个重要原因。将TIL中的肿瘤特异性T淋巴细胞筛选出来在体外富集并扩增，再将大量能够识别新抗原的T细胞回输到病人体内，就可以打破体内免疫抑制的肿瘤微环境，不仅杀灭表达新抗原的肿瘤细胞，还可以通过旁观者效应，消灭其它肿瘤细胞。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何治疗癌症。

为解决上述技术问题，本发明首先提供了一种从TIL中筛选肿瘤特异性T细胞的方法，可包括如下步骤：

(1)筛选待测肿瘤患者的肿瘤特异性抗原肽；

(2)构建MHC和所述肿瘤特异性抗原肽的复合物，获得MHC抗原肽复合物；

(3)取待测肿瘤患者的TIL，加入所述MHC抗原肽复合物，孵育，分选肿瘤特异性T细胞。

上述方法中，所述步骤(1)还可包括如下步骤：

(1-a)获得待测组织的外显子组序列信息；待测组织为待测肿瘤患者的肿瘤组织；

(1-b)获得待测组织的总mRNA测序序列信息；

(1-c)获得待测肿瘤患者的HLA型别；

(1-d)根据步骤(1-a)、(1-b)和(1-c)的结果，获得具有免疫原性的抗原肽；

(1-e)检测步骤(1-d)获得的抗原肽和所述HLA型别的亲和力，获得具有亲和力的抗原肽；

(1-f)采用ELISPOT方法检测步骤(1-e)获得的抗原肽，获得肿瘤特异性抗原肽。

所述步骤(1-a)中，所述“获得待测组织的外显子组序列信息”的方法可为：提取待测组织的基因组DNA，然后使用BGIseq500测序仪进行外显子组测序(WES，>200x)，获取测序序列。

所述步骤(1-b)中，所述“获得待测组织的总mRNA测序序列信息”的方法可为：提取待测组织的总RNA，然后反转录成cDNA，用BGIseq500测序仪测序，获得测序序列。

所述步骤(1-c)中，所述“获得待测肿瘤患者的HLA型别”的步骤可如下：

①将国际免疫基因HLA数据库中的型别对应的序列进行数据转换，将原来每个型别由序列来代表转换成每个型别由其与标准参考序列的差异位点来代表，建立一个型别—差异位点数据库；

②利用高通量测序仪对待测组织的Exon区进行测序，将测序数据与参考序列进行比对，得到待测组织的一致性序列，此一致性序列代表的为基因组二倍体的信息，之后进一步将二倍体信息解码为两个单体型信息；

③基于与参考序列的差异，确定待测组织的两个单体型信息，与之前建立好的型别—差异数据库进行100％匹配搜索，最后确定单体型对应的HLA基因型别，得到HLA亚型和区域突变位点信息。

所述步骤(1-c)中，所述“获得待测肿瘤患者的HLA型别”还可采用Sanger测序法。

所述步骤(1-d)中，所述“根据步骤(1-a)、(1-b)和(1-c)的结果，获得具有免疫原性的抗原肽”的方法可为：根据步骤(1-a)、(1-b)和(1-c)的结果，使用PSSMHCpan软件进行肿瘤抗原多肽亲和力分析，预测具有免疫原性的抗原肽。

所述步骤(1-d)中，具有免疫原性的抗原肽可由8至13个氨基酸残基组成。

所述步骤(1-e)中，所述“检测步骤(1-d)获得的抗原肽和所述HLA型别的亲和力”的方法可为：采用流式细胞仪分别检测步骤(1-d)获得的抗原肽与T2细胞的结合情况，进而验证亲和力。所述T2细胞可为ATCC的产品，编号为CRL-1992。

所述步骤(1-f)中，所述“采用ELISPOT方法检测步骤(1-e)获得的抗原肽”的方法可为：分别将步骤(1-e)获得的抗原肽导入DC细胞，然后与各个组的TIL细胞共孵育，进行ELISPOT检测。出现斑点的组别的TIL细胞即含有对该抗原肽有反应的肿瘤特异性T细胞。所述DC细胞可为采集所述待测肿瘤患者的外周血，通过传统贴壁法获得单核细胞，然后培养获得。

上述方法中，所述步骤(2)还可包括如下步骤：

(2-a)将HLA-A 0201-BSP融合蛋白、β2M蛋白和所述肿瘤特异性抗原肽在氧化-还原谷胱甘肽系统中复性；

(2-b)完成步骤(2-a)后，纯化，获得HLA A0201/肽复合物单体；

(2-c)完成步骤(2-b)后，生物素化；

(2-d)完成步骤(2-c)后，纯化，得到生物素化的HLA A0201/肽复合物单体；

(2-e)完成步骤(2-d)后，将生物素化的HLA A0201/肽复合物单体和藻红蛋白标记的链霉亲和素混合，获得MHC抗原肽复合物。

所述步骤(2-a)中，HLA-A 0201-BSP融合蛋白的氨基酸序列可如SEQ ID NO.3所示。β2M蛋白的氨基酸序列可如SEQ ID NO.5所示。

所述步骤(2-a)中，HLA-A 0201-BSP融合蛋白、β2M蛋白和所述肿瘤特异性抗原肽的摩尔比可为1：1：1。

所述步骤(2-b)和(2-d)中，所述纯化为用Sephacyl-300层析柱纯化。

所述步骤(2-c)中，所述生物素化可通过加入BirA酶实现(BirA酶作用于HLA-A0201-BSP 融合蛋白BSP片段中的赖氨酸残基)。

所述步骤(2-e)中，生物素化的HLA A0201/肽复合物单体和藻红蛋白标记的链霉亲和素的摩尔比可为4:1。

上述方法中，所述步骤(3)中，所述“待测肿瘤患者的TIL”可为待测肿瘤患者的IFN-r 阳性的TIL。所述待测肿瘤患者的IFN-r阳性的TIL可通过TIL细胞与原代肿瘤细胞共孵育的方法获得。

上述方法中，所述步骤(3)中，所述分选可为磁珠分选或流式细胞仪分选。

上述任一所述方法中，所述癌症或肿瘤可为b1)或b2)：b1)肺癌；b2)结肠癌。所述肺癌具体可为非小细胞肺癌。

上述任一所述方法中，所述肿瘤特异性抗原肽的氨基酸序列可为SEQ ID NO.1所示的序列。

采用上述任一所述的方法获得的肿瘤特异性T细胞也属于本发明的保护范围。

采用上述任一所述的方法获得的肿瘤特异性抗原肽也属于本发明的保护范围。

上述任一所述肿瘤特异性抗原肽的氨基酸序列可为SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.6所示的序列。

上述任一所述肿瘤特异性T细胞或上述任一所述肿瘤特异性抗原肽在治疗癌症、预防癌症、抑制肿瘤的生长或制备杀伤肿瘤细胞的产品中的应用也属于本发明的保护范围。

上述应用中，所述产品可为药物。

上述应用中，所述制备杀伤肿瘤细胞的产品中，还可包括免疫检查点抑制剂。所述免疫检查点抑制剂具体可为PD-1抗体。

上述应用中，所述癌症或肿瘤为b1)或b2)：b1)肺癌；b2)结肠癌。所述肺癌具体可为非小细胞肺癌。

体内免疫细胞有多种，针对肿瘤特异性多肽的具有肿瘤杀伤作用的T细胞含量少，不易分离。利用本发明提供的TIL中筛选肿瘤特异性T细胞的方法，可以高效的筛选出肿瘤特异的T 细胞及肿瘤特异性的抗原肽。利用筛选的肿瘤特异的T细胞经过培养扩增后及肿瘤特异性的抗原肽可以特异性的作用于肿瘤细胞。筛选的肿瘤特异的T细胞及多肽同时可与免疫检查点抑制剂(如PD-1抗体)联合起来，可以有效的抑制肿瘤的生长。

本发明筛选出的多肽序列SEQ ID NO.1为肺癌尤其是非小细胞肺癌特异性的多肽序列，可应用于含有相应突变的肿瘤患者的治疗或预防的产品中。

本发明筛选出的肿瘤特异性T细胞可用于肿瘤患者的治疗或预防的产品中。

本发明提供的方法及利用此方法筛选的多肽和肿瘤特异性T细胞，可为肿瘤的免疫治疗提供一种有效的选择。

附图说明

图1为TIL的分离与培养结果。

图2为TIL的大量增殖结果。

图3为T2亲和力实验验证突变多肽与HLA分子的亲和力实验结果。

图4为分选肿瘤特异T细胞结果图；左图为磁珠分选，横坐标为四聚体-PE，纵坐标为 IFN-gamma-APC；右图为流式细胞仪分选，横坐标为四聚体-FITC，纵坐标为CD8-APC；表示阳性细胞数，Q4/Q8是双阴性率，Q2/Q6是双阳性率。

图5为肿瘤特异性T细胞对抗原识别后分泌IFN-gamma的对比实验结果。

图6为肿瘤特异性T细胞在原代肿瘤细胞的刺激下4-1BB表达上调结果。

图7为不同效靶比条件下T细胞对肿瘤细胞的杀伤能力检测结果；其中横坐标为效靶比 (effect cell:target cell即E:T)。

图8为注射TIL后荷瘤小鼠肿瘤体积的变化；其中横坐标为时间。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

非小细胞肺癌患者肿瘤组织(以下简称人肿瘤组织)和该患者的正常组织(以下简称人正常组织)由北大深圳医院提供，且患者知情同意。

EP管的规格均为1.5mL。anti-IgG microbeads、boric acid溶液、MACS buffer和MS 柱子均为Miltenyi公司的产品。Bead Wash buffer为Miltenyi公司的产品。DPBS为Gibco 公司的产品。无血清的RPMI-1640培养基和RPMI-1640培养基均为Gibco公司的产品。X-VIVO 为Lonza公司的产品。IL2为peprotech公司的产品。RNeasy plus mini kit为Qiagen公司的产品。Sephacyl-300层析柱为GE公司的产品。⁵¹Cr为perkin Elmer公司的产品。小鼠结肠癌细胞系CT26为ATCC公司的产品。BALB/c小鼠为广东省实验动物中心的产品。

T2细胞是HLA-A2阳性的T、B淋巴细胞杂交瘤细胞，其细胞表面可表达HLA-A0201，但因其内源性抗原呈递途径中必需的抗原多肽转运蛋白(TAP)缺陷，故不能转运内源性抗原。本发明中的T2细胞购自ATCC，货号为CRL-1992。

实施例1、人肿瘤组织中TIL的分离与培养

TIL培养基：向X-VIVO中加入IL2，得到TIL培养基；TIL培养基中，IL2的浓度为1000U/mL。

1、取新鲜的人肿瘤组织，剪碎，得到约1mm³的人肿瘤组织块。

2、完成步骤1后，将人肿瘤组织块置于24孔板，然后加入TIL培养基，37℃、5％CO₂培养 5d。

完成步骤2后，将人肿瘤组织块置于显微镜下观察。

实验结果见图1：视野中单个细胞和成团的细胞都是TIL细胞。结果表明，培养基中有大量的TIL分布。

3、完成步骤2后，取所述24孔板，先倒掉一半的培养液，然后加入等量的新鲜的TIL培养基(即半量换液)，37℃、5％CO₂培养12d(培养期间，每隔一天半量换液)。

完成步骤3后，将人肿瘤组织块置于显微镜下观察。

实验结果见图2：视野中TIL成团细胞变大，细胞密度变大。结果表明，TIL大量增殖。

实施例2、筛选实验

一、人肿瘤特异性抗原肽的筛选

人待测组织为人肿瘤组织或人正常组织。

1、外显子组测序

提取人待测组织的基因组DNA，然后使用BGIseq500测序仪进行外显子组测序(WES，>200x)，获取测序序列。

2、RNA seq

提取人待测组织的总RNA，然后反转录成cDNA，用BGIseq500测序仪测序，获得测序序列。

3、HLA分型检测

目标测序区域包括HLA I类和II类外显子区域，包含HLA-A基因、HLA-B基因、HLA-C基因、HLA-DQB1基因和HLA-DRB1基因。HLA分型检测方法不仅可以精确检测亚型，还可以检测目标测序区域的突变位点。具体步骤如下：

(1)将国际免疫基因HLA数据库(IMGT/HLA)中的型别对应的序列进行数据转换，将原来每个型别由序列来代表转换成每个型别由其与标准参考序列的差异位点来代表，建立一个型别—差异位点数据库。

(2)利用高通量测序仪对人待测组织的Exon区进行测序，将测序数据与参考序列进行比对，得到人待测组织的一致性序列，此一致性序列代表的为基因组二倍体的信息，之后进一步将二倍体信息解码为两个单体型信息。

(3)基于与参考序列的差异，确定人待测组织的两个单体型信息，与之前建立好的型别—差异数据库进行100％匹配搜索，最后确定单体型对应的HLA基因型别，得到HLA亚型和区域突变位点信息。

采用Sanger测序法对HLA分型检测结果进行质控。Sanger测序法是HLA型别鉴定的“金标准”，具有分辨率高，可大规模进行，能直接发现新的等位基因等优点。Sanger测序法分型流程包括：提取样品DNA、PCR扩增及产物纯化、测序反应、测序仪测序、软件分型。本次研究使用3730XL测序仪，HLA型别分析软件为uTYPE^TM software。

结果表明，该非小细胞肺癌患者的HLA分型为HLA A0210。

4、人肿瘤特异性抗原肽的获得

(1)根据外显子组测序数据、RNA seq测序数据和HLA分型检测结果，使用PSSMHCpan 软件(Liu G，Li D，et al.PSSMHCpan:a novel PSSM-based software forpredicting class I peptide-HLA binding affinity.Gigascience.2017May 1；6(5):1-11.)进行肿瘤抗原多肽亲和力分析，预测出30个具有免疫原性且高亲和力的抗原肽，这些抗原肽均由8至13个氨基酸残基组成。对预测的人肿瘤特异性抗原肽进行初步筛选，具体方法为：采用软件 PSSMHCpan和国际主流软件(如软件NetMHC)相结合的方法，取两者交集作为人肿瘤特异性抗原肽的初步筛选结果，共筛选出30个抗原肽。

(2)人工合成步骤(1)初步筛选的30个抗原肽。

(3)完成步骤(2)后，采用流式细胞仪分别检测30个抗原肽与T2细胞的结合情况，进一步验证亲和力。

亲和力验证实验的具体步骤如下：

①取2×10⁵个T2细胞，加入500μL含人类β2微球蛋白的IMDM无血清培养基重悬，得到重悬液；该重悬液中人类β2微球蛋白的浓度为3μg/mL。

②取24孔板，加入步骤①得到的重悬液，再加入抗原肽，得到体系1(体系1中抗原肽的浓度为100μM)。取24孔板，加入步骤①得到的重悬液，再加入对照多肽(氨基酸序列为SEQ ID NO.7所示)，得到体系2(体系2中对照多肽的浓度为100μM)，作为阳性对照。取 24孔板，加入步骤①得到的重悬液，得到体系3，作为背景对照。

③将步骤②得到的体系1、体系2和体系3均置于培养箱，37℃、5％CO₂培养过夜。每个体系2个复孔。

④完成步骤③后，取各个体系，分别200g离心5min，收集细胞。

⑤完成步骤④后，取细胞，用pH7.2、0.01mol/L PBS缓冲液清洗两次。

⑥完成步骤⑤后，取细胞，先用抗HLA-A*0201的FITC单克隆抗体(ATCC公司的产品) 孵育，4℃维持30min，然后用流式细胞仪(BD FACSJazz^TM)及其软件检测并分析其平均荧光强度，最后计算荧光指数(FI)，并进行如下判断：

如果某抗原肽的FI≥1.5，则该抗原肽对HLA-A*0201分子具有高亲和力；如果某抗原肽的FI为1.0≤FI<1.5，则该抗原肽对HLA-A*0201分子具有中等亲和力；如果某抗原肽的FI为1.0≤FI<1.5，则该抗原肽对HLA-A*0201分子具有低亲和力。

荧光指数(FI)＝(抗原肽的平均荧光强度-对照多肽的平均荧光强度)/对照多肽的平均荧光强度。

部分实验结果见表1和图3(突变多肽为抗原肽中的一个，其氨基酸序列如SEQ IDNO： 1所示；Blank为背景对照；CMV为阳性对照)。经实验验证，背景对照的FI为0，阳性对照的FI为1.87，两个均正常，突变多肽的FI大于1.5，证明突变多肽对HLA-A*0201分子具有高亲和力。

经过此轮筛选，共筛选到20个抗原肽与HLA-A*0201具有亲和力。

表1.SEQ ID NO：1所示抗原肽与HLA-A*0201分子亲和力的检测结果

(4)将步骤(3)筛选的20个抗原肽分别导入DC细胞(采集该非小细胞肺癌患者的外周血，通过传统贴壁法获得单核细胞，然后培养获得)，与各个组的TIL细胞共孵育，然后进行ELISPOT检测。出现斑点的组别的TIL细胞即含有对该多肽有反应的肿瘤特异性T细胞。通过这一轮筛选，筛选到一个可与TIL产生免疫反应的抗原肽及其对应的TIL细胞分组，该非小细胞肺癌患者的人肿瘤特异性抗原肽的具体序列为SEQ ID NO.1所示的序列。

人工合成SEQ ID NO.1所示的人肿瘤特异性抗原肽。

二、四聚体的制备

1、HLA-A 0201-BSP融合蛋白的获得

(1)重组质粒pET28a-HLA-A 0201-BSP的构建

将HLA A0201α链胞外区的基因和可生物素化的BSP片段序列进行拼接，然后插入载体 pET28a，得到重组质粒pET28a-HLA-A 0201-BSP。

将重组质粒pET28a-HLA-A 0201-BSP进行测序。根据测序结果，对重组质粒pET28a-HLA-A 0201-BSP进行结构描述如下：将载体pET28a的限制性内切酶EcoRI和BamHI识别序列间的小片段替换为SEQ ID NO.2所示的DNA分子。重组质粒pET28a-HLA-A 0201-BSP表达SEQ ID NO.3 所示的HLA-A 0201-BSP融合蛋白。

(2)重组大肠杆菌的获得

将重组质粒pET28a-HLA-A 0201-BSP导入大肠杆菌DH5α，得到重组大肠杆菌，命名为 DH5α/pET28a-HLA-A 0201-BSP。

(3)HLA-A 0201-BSP融合蛋白的表达

a)将DH5α/pET28a-HLA-A 0201-BSP单菌落接种于5mL LB培养基(将10g胰蛋白胨、5g酵母提取物和10g NaCl氯化钠溶于1L蒸馏水得到)，37℃、180rpm振荡培养4h，得到培养菌液。

b)向步骤a)得到的培养菌液中加入IPTG，使IPTG在体系中的浓度为1mM，然后37℃、 180rpm振荡培养4h，以3000g离心力离心15min，弃上清，收集菌体。

c)取步骤b)收集的菌体，用pH7.2、0.01mol/L PBS缓冲液重悬，然后超声破碎，得到菌体破碎液。将该菌体破碎液8000rpm离心10min，得到菌体破碎上清液和菌体破碎沉淀。

将步骤c)得到的菌体破碎上清液和菌体破碎沉淀进行SDS-PAGE。结果表明，HLA-A0201-BSP融合蛋白主要存在于包涵体。

(4)HLA-A 0201-BSP融合蛋白的纯化

a)取步骤(2)中c)得到的菌体破碎上清液，4℃、12000rpm离心15min，收集上清。

b)取步骤a)收集的上清，用滤纸过滤，收集滤液，然后采用谷胱甘肽—琼脂糖亲和层析法进行纯化，得到HLA-A 0201-BSP融合蛋白。

2、β2M蛋白的获得

按照上述步骤1的方法，将“重组质粒pET28a-HLA-A 0201-BSP”替换为“重组质粒pET28a-β2M”，其它步骤均不变，得到β2M蛋白。

将重组质粒pET28a-β2M进行测序。根据测序结果，对重组质粒pET28a-β2M进行结构描述如下：将载体pET28a的限制性内切酶EcoRI和BamHI识别序列间的小片段替换为SEQID NO.4所示的DNA分子。重组质粒pET28a-β2M表达序列SEQ ID NO.5所示的β2M蛋白。

3、HLA A0201/肽复合物单体的获得

将HLA-A 0201-BSP融合蛋白、β2M蛋白和人肿瘤特异性抗原肽(摩尔比为1：1：1)在氧化-还原谷胱甘肽系统中复性，然后用Sephacyl-300层析柱纯化，获得HLA A0201/肽复合物单体。

4、生物素化的HLA A0201/肽复合物单体的获得

取HLA A0201/肽复合物单体，先加入BirA酶进行生物素化(BirA酶作用于HLA-A0201-BSP 融合蛋白BSP片段中的赖氨酸残基)，然后用Sephacyl-300层析柱纯化，得到生物素化的HLA A0201/肽复合物单体。

5、四聚体的获得

将生物素化的HLA A0201/肽复合物单体和藻红蛋白标记的链霉亲和素(摩尔比为4:1) 混合，获得四聚体。

三、人肿瘤组织中TIL的获得

1、无菌切取组织(人肿瘤组织或人肿瘤组织浸润的局部淋巴结)，然后置于含100U/mL 青霉素和100U/mL链霉素的RPMI-1640培养基中；将组织机械法剪碎，用RPMI-1640培养基调整体积至10～20mL。

2、完成步骤1后，加入I型胶原酶、Ⅳ型胶原酶、透明质酸酶和DNA酶，得到体系(该体系中，I型胶原酶的浓度为0.05％(v/v)、Ⅳ型胶原酶的浓度为0.05％(v/v)、透明质酸酶的浓度为0.001％(v/v)，DNA酶的浓度为1％(v/v))，室温搅拌4～6h。

3、取完成步骤2的体系，先用80目的不锈钢网过滤，得到滤液1；取滤液1，用200目的不锈钢网过滤，得到滤液2。

4、取滤液2，清洗2次。每次清洗的步骤为：加入无血清的RPMI-1640培养基，混匀，然后1500rmin离心5-10min，弃上清。

5、完成步骤4后，取沉淀，加入含5％(v/v)FCS的RPMI-1640培养基重悬，然后清洗2次。每次清洗的步骤为：加入RPMI-1640培养基，混匀，然后1500rmin离心5-10min，弃上清。

6、完成步骤5后，取沉淀，加入含20％(v/v)FCS的RPMI-1640培养基重悬，得到浓度为0.5×10⁶/mL的TIL重悬液。

7、完成步骤6后，将TIL重悬液接种于24孔培养板(1mL/孔)，然后加入IL-2并使其浓度为1000U/mL，37℃、5％CO₂培养7d，获得TIL(培养的第3～5d需更换新鲜配制的含1000U/mL IL-2的RPMI-1640培养基)。

将各组的TIL细胞分别与原代肿瘤细胞共孵育，然后检测培养上清中的IFN-r。阳性组中含有肿瘤特异性T细胞，将阳性组的TIL细胞作为流式细胞仪分选或者磁珠分选的细胞来源。

四、筛选目标T细胞

完成步骤三后，通过磁珠分选或流式细胞仪分选从IFN-r阳性的TIL分组中筛选出目标T 细胞。

(一)磁珠分选

1、吸取100μL的anti-IgG microbeads置于无菌EP管，将EP管置于磁力架中静置1min，然后用移液器吸弃上清液。

2、完成步骤1后，取所述EP管，加入100μL的boric acid溶液清洗磁珠，将EP管置于磁力架中静置1min，然后用移液器吸弃上清液。

3、完成步骤2后，取所述EP管，加入100μL的boric acid溶液重悬磁珠，然后加入HLA-Ig dimer和多肽并使多肽在体系中的浓度为20μg/mL。

4、完成步骤3后，将所述EP管置于rotator上，4℃、10rpm振荡24h。

5、完成步骤4后，将EP管置于磁力架中静置1min，用移液器吸弃上清液，然后用100μL 的Bead Wash buffer清洗两次。

6、完成步骤5后，取所述EP管，加入500μL的Bead Wash buffer重悬磁珠，然后置于rotator上，4℃、10rpm振荡24h。

7、完成步骤6后，将EP管置于磁力架中静置1min，用移液器吸弃上清液，然后用1000μL 的DPBS清洗两次。

8、完成步骤7后，取所述EP管，加入1000μL的DPBS重悬磁珠，然后加入四聚体且四聚体的浓度为10μg/mL，充分重悬，然后4℃静置3d以上。

9、完成步骤8后，取所述EP管，将EP管置于磁力架中静置1min，用移液器吸弃上清液。

10、完成步骤9后，取所述EP管，加入步骤三获得的TIL，4℃孵育15min(期间，每隔5min混匀一次)。

11、完成步骤10后，取所述EP管，加入2-5mL MACS buffer洗涤，300g离心10min。弃上清，加入500μL buffer重悬，得到细胞悬液。

12、将MS柱子置于架子上，并用MACS Buffer进行平衡(MS：500μl，LS：3mL)。

13、完成步骤12后，向所述柱子的正中央加入细胞悬液，并收集过柱后溶液；再次用buffer 洗涤柱子三次(MS：500μL，LS：3mL)。

14、完成步骤13后，将所述柱子取下，加入buffer(MS：1mL，LS：5mL)后猛推柱子活塞，将TIL迅速推入收集管中，收集管中即为筛选出来的肿瘤特异性T细胞。

用IFN-gamma-APC(购自BD公司)和四聚体-PE(购自Miltenyi公司)两种流式抗体对磁珠分选后的细胞进行染色，上机检测。结果显示(图4中左图)，IFN-gamma及突变多肽四聚体双阳性的细胞比例为25.9％，也就是说用IFN-gamma磁珠筛选出来的IFN-gamma阳性的细胞中有25.9％是识别肿瘤特异性突变多肽的。

(二)流式细胞仪分选

取步骤三获得获得的含肿瘤特异性的T细胞的TIL分组与四聚体共孵育30min，然后上机，通过流式细胞仪筛选CD8T,四聚体-T双阳性细胞细胞，即肿瘤特异性T细胞。

用CD8-APC(购自BD公司)和四聚体-FITC(购自Miltenyi公司)对细胞进行染色，然后上机检测。结果显示(图4中右图)，CD8T,四聚体-T双阳性细胞的比例为18.3％，将CD8T,四聚体-T双阳性细胞通过流式分选出来。

五、扩增培养特异性T细胞

取步骤四中(一)或(二)筛选的肿瘤特异性的T细胞，用gamma射线照射健康志愿者的PBMC后作为饲养细胞，用IL2和anti-CD3大量扩增培养特异性T细胞。

六、TCR对肿瘤抗原的识别

A、TCR对肿瘤抗原的识别：

当TCR能够识别肿瘤细胞表面表达的肿瘤抗原时，T细胞就会被激活，从而分泌IFN-r。因此，通过检测T细胞IFN-r的分泌量可以判断TCR是否可以识别肿瘤抗原。

1、取步骤四(二)筛选的CD8+tetramer+的T细胞，用pH7.2、0.01mol/L PBS缓冲液清洗两次，然后加入96孔板中(每孔50000个)，每个样品三个复孔。

2、完成步骤1后，加入原代肿瘤细胞(每孔5000个)，37℃培养12h。

3、完成步骤2后，收集每个孔的上清液，然后用ELISA方法检测IFN-r的分泌量。

按照上述方法，将原代肿瘤细胞替换为T2细胞，其它步骤均不变，作为空白对照。

按照上述方法，将“加入原代肿瘤细胞”替换为“加入用HLA A0201抗体封闭的原代肿瘤细胞”，其它步骤均不变，作为对照。

实验结果见图5(+TC为原代肿瘤细胞，No target为空白对照，+other tumor为用HLA A0201抗体封闭的原代肿瘤细胞)。结果表明，筛选出来的肿瘤特异性T细胞可以识别原代肿瘤细胞表面提呈的突变抗原，被激活了，分泌的IFN-gamma(80pg/mL)是对照组(10pg/mL) 的8倍。当肿瘤细胞表面的HLA-A*0201分子被封闭时，提呈突变抗原的能力减弱，肿瘤特异性T细胞不能识别这些肿瘤细胞，其受到的刺激也减弱了，所以分泌的IFN-gamma减少了 (30pg/mL)。上述实验结果表明，该肿瘤特异性T细胞的TCR可以识别肿瘤抗原。

B、TCR对肿瘤抗原的识别二

T细胞表面的TCR若能识别肿瘤抗原，则T细胞被激活，T细胞表面的4-1BB的表达会明显上升。

1、取步骤四中(二)筛选的CD8+tetramer+的T细胞，用pH7.2、0.01mol/L PBS缓冲液清洗两次，然后加入96孔板中(每孔50000个)，每个样品三个复孔。

3、完成步骤2后，采用流式细胞仪检测表达4-1BB的T细胞的比例。

按照上述步骤，将原代肿瘤细胞替换为T2细胞，其它步骤均不变，作为空白对照。

按照上述步骤，将原代肿瘤细胞替换为用HLA A0201抗体封闭的原代肿瘤细胞，其它步骤均不变，作为对照。

按照上述步骤，将“原代肿瘤细胞(每孔50000个)”替换为OKT3(抗原CD3的单克隆抗体)并使其浓度为0.1μg/mL，其它步骤均不变，作为阳性对照。

实验结果见图6(+TC为原代肿瘤细胞，No target为空白对照，+other tumor为用HLA A0201抗体封闭的原代肿瘤细胞，OKT3(0.1μg/mL)为阳性对照)。结果表明，筛选出来的肿瘤特异性T细胞可以识别原代肿瘤细胞表面提呈的突变抗原，被激活了，T细胞表达4-1BB的比例上调了(50％)，与未刺激的T细胞比较，比例从10％上升至50％。当肿瘤细胞表面的HLA-A *0201分子被封闭时，提呈突变抗原的能力减弱，肿瘤特异性T细胞不能识别这些肿瘤细胞，其受到的刺激也减弱了，所以4-1BB上调的比例不明显(14％)。上述实验结果表明，该肿瘤特异性T细胞的TCR可以识别肿瘤抗原。

七、体外杀瘤效率

1、取步骤五培养的特异性T细胞，用pH7.2、0.01mol/L PBS缓冲液清洗两次，然后加入96孔板中，每个样品三个复孔。

2、完成步骤1后，按照不同的效靶比加入原代肿瘤细胞，37℃培养12h。

3、完成步骤2后，用⁵¹Cr检测杀瘤效率。

实验结果见图7(+TC为原代肿瘤细胞，No target为空白对照，+other tumor为用HLA A0201抗体封闭的原代肿瘤细胞)。将肿瘤特异性T细胞与各种靶细胞按照不同的效靶比 (effect cell:target cell即E:T)混合，然后检测不同效靶比条件下T细胞对靶细胞的杀伤效果。随着T细胞增多，其对肿瘤细胞的杀伤效率明显提高。而对不表达肿瘤抗原的靶细胞，T细胞始终没有杀伤能力。上述结果表明，肿瘤特异性TIL细胞对原代肿瘤细胞有很强的杀伤效力。

实施例3、小鼠实验

小鼠实验用于验证上述TIL筛选方法的可行性。

一、建模

1、取小鼠结肠癌细胞系CT26，置于含10％(v/v)胎牛血清、100U/mL青霉素和100U/mL 链霉素的DMEM培养基，37℃、5％CO₂培养48h。

2、完成步骤1后，3000rpm离心5min，收集肿瘤细胞。

3、完成步骤2后，取肿瘤细胞，用无菌生理盐水清洗3次。

4、完成步骤3后，取肿瘤细胞，加入pH7.2、0.01mol/L PBS缓冲液稀释，得到浓度为1×10⁸个/mL的肿瘤细胞悬液。

5、取4周龄的BALB/c小鼠，每只小鼠皮下接种肿瘤细胞悬液100μL，然后逐日观察接种部位有无感染，肿瘤生长后有无自然消退，用游标卡尺每隔2-3d测量肿瘤长径a和短径b，并计算肿瘤体积。肿瘤体积＝a×b×b/2。

接种第7d，小鼠皮下可摸到约米粒大小肿瘤，视为建模成功。

二、小鼠肿瘤特异性抗原肽的获得

按照实施例2步骤一的步骤，将“人待测组织”替换为“小鼠待测组织”，其它步骤均不变，得到小鼠肿瘤特异性抗原肽。小鼠待测组织为小鼠肿瘤组织或小鼠正常组织。

小鼠的肿瘤特异性抗原肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.6序列所示。

人工合成SEQ ID NO.6所示的小鼠肿瘤特异性抗原肽。

三、H-2复合物的制备

本发明的发明人将小鼠肿瘤特异性抗原肽提供给北京博尔迈生物技术有限公司，由北京博尔迈生物技术有限公司制备H-2复合物。

四、小鼠TIL的分离和培养

1、完成步骤1中5接种第14d，取小鼠的皮下肿瘤结节(即小鼠肿瘤组织)，剪碎肿瘤组织块，置于0.25％胰酶中消化30min，然后用80目的不锈钢网过滤，得到滤液。

2、采用不连续密度梯度离心分离TIL：将比重为1.088的percoll置于底层，其上为等体积的比重为1.075的percoll，将步骤1得到的滤液置于最上层，1500rpm离心20min；然后取上下两层percoll之间界面上的细胞悬液，即得到TIL悬液。

3、取步骤2得到的TIL悬液，用含500U/mL IL-2和10％(v/v)小牛血清的RPMI1640培养基稀释，得到浓度为1×10⁶/mL的TIL稀释液。

4、取96孔培养板，每孔加入100mL TIL稀释液，37℃、5％CO₂培养10d；之后每隔5d更换新鲜配制的含500U/mL IL-2和10％(v/v)小牛血清的RPMI1640培养基，37℃、5％CO₂培养，得到小鼠TIL。

五、流式细胞仪分选

取步骤四获得的小鼠TIL，加入H-2复合物，孵育；然后通过流式细胞仪筛选肿瘤特异性 T细胞。

六、扩增培养肿瘤特异性T细胞

取步骤五种筛选的肿瘤特异性的T细胞，用IL2和小鼠外周血单核细胞作为饲养细胞扩增培养特异性T细胞。

七、肿瘤治疗

1、取步骤一中生长至8周龄的建模小鼠(各小鼠肿瘤体积无显著差异)，随机分成TIL 组、TIL+PD-1抗体组和生理盐水组(每组10只)，分别进行如下处理：

TIL组：背部皮下注射步骤六培养的特异性T细胞。注射特异性T细胞的剂量为1.0×10⁸个特异性T细胞/只。

TIL+PD-1抗体组：背部皮下注射PD-1抗体和步骤六培养的特异性T细胞。

注射特异性T细胞的剂量为1.0×10⁸个特异性T细胞/只。

注射PD-1抗体的剂量为150μL PD-1抗体稀释液/只。

PD-1抗体稀释液为含2mg/mL PD-1抗体的pH7.0、0.1mM的PBS缓冲液。PD-1抗体为默克公司的产品。

生理盐水组：背部皮下注射与生理盐水。注射体积同TIL组注射特异性T细胞的体积相同。

2、完成步骤1后，每隔2天用游标卡尺测量肿瘤最长径(a)和最短径(b)，然后计算肿瘤体积。肿瘤体积＝a×b×b/2。

实验结果见图8。结果表明，生理盐水组小鼠的肿瘤体积不断增大，TIL组小鼠的肿瘤体积缓慢增大，TIL+PD-1抗体组小鼠的肿瘤体积则得到了有效的抑制。因此，步骤六培养的特异性T细胞和PD-1抗体联合使用，可以有效的抑制肿瘤的生长。

<110> 深圳华大生命科学研究院

<120> 一种从TIL筛选肿瘤特异性T细胞的方法

<160> 7

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 1

Leu Leu Thr Phe Trp Asn Pro Pro Val

1 5

<210> 2

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

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<223>

<400> 2

ctgcatcata ttctggatgc acagaaaatg gtgtggaatc atcgt 45

<210> 3

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 3

Leu His His Ile Leu Asp Ala Gln Lys Met Val Trp Asn His Arg

1 5 10 15

<210> 4

<211> 360

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 4

atgtctcgct ccgtggcctt agctgtgctc gcgctactct ctctttctgg cctggaggct 60

atccagcgta ctccaaagat tcaggtttac tcacgtcatc cagcagagaa tggaaagtca 120

aatttcctga attgctatgt gtctgggttt catccatccg acattgaagt tgacttactg 180

aagaatggag agagaattga aaaagtggag cattcagact tgtctttcag caaggactgg 240

tctttctatc tcttgtacta cactgaattc acccccactg aaaaagatga gtatgcctgc 300

cgtgtgaacc atgtgacttt gtcacagccc aagatagtta agtgggatcg agacatgtaa 360

<210> 5

<211> 119

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 5

Met Ser Arg Ser Val Ala Leu Ala Val Leu Ala Leu Leu Ser Leu Ser

1 5 10 15

Gly Leu Glu Ala Ile Gln Arg Thr Pro Lys Ile Gln Val Tyr Ser Arg

20 25 30

His Pro Ala Glu Asn Gly Lys Ser Asn Phe Leu Asn Cys Tyr Val Ser

35 40 45

Gly Phe His Pro Ser Asp Ile Glu Val Asp Leu Leu Lys Asn Gly Glu

50 55 60

Arg Ile Glu Lys Val Glu His Ser Asp Leu Ser Phe Ser Lys Asp Trp

65 70 75 80

Ser Phe Tyr Leu Leu Tyr Tyr Thr Glu Phe Thr Pro Thr Glu Lys Asp

85 90 95

Glu Tyr Ala Cys Arg Val Asn His Val Thr Leu Ser Gln Pro Lys Ile

100 105 110

Val Lys Trp Asp Arg Asp Met

115

<210> 6

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 6

Lys Val Ala Glu Ile Val His Phe Leu

1 5

<210> 7

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 7

Asn Leu Val Pro Met Val Ala Thr Val

1 5

Claims

1.一种从TIL中筛选肿瘤特异性T细胞的方法，包括如下步骤：

(1)筛选待测肿瘤患者的肿瘤特异性抗原肽；

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(1)包括如下步骤：

(1-b)获得待测组织的总mRNA测序序列信息；

(1-c)获得待测肿瘤患者的HLA型别；

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(3)中，所述“待测肿瘤患者的TIL”为待测肿瘤患者的IFN-r阳性的TIL。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述待测肿瘤患者的IFN-r阳性的TIL通过TIL细胞与原代肿瘤细胞共孵育的方法获得。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(3)中，所述分选为磁珠分选或流式细胞仪分选。

6.采用权利要求1至5任一权利要求所述的方法获得的肿瘤特异性T细胞。

7.采用权利要求1至5任一权利要求所述的方法获得的肿瘤特异性抗原肽。

8.如权利要求7所述的肿瘤特异性抗原肽，其特征在于：所述肿瘤特异性抗原肽的氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示的序列。

9.权利要求6所述的肿瘤特异性T细胞、或、权利要求7或8所述的肿瘤特异性抗原肽在治疗癌症、预防癌症、抑制肿瘤的生长或制备杀伤肿瘤细胞的产品中的应用。

10.根据权利要求1至5任一权利要求所述的方法或权利要求9所述的应用，其特征在于：所述癌症或肿瘤为b1)或b2)：b1)肺癌；b2)结肠癌。