CN101472943B - 来自sparc的癌排斥抗原肽以及含有该肽的药物 - Google Patents
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Abstract
本发明的目的在于鉴定可诱导对肿瘤显示反应性的人细胞毒性(杀伤)T细胞和辅助T细胞的、来自SPARC蛋白质的肽，以高表达SPARC的多种癌症患者为对象，提供可以进行肿瘤的免疫疗法的方法。根据本发明可以提供以下任意一种肽。(A)SEQ ID NO.1-3中任一项所示的氨基酸序列的肽；(B)具有杀伤T细胞的诱导能力的、在由选自SEQ ID NO.1-3中任一项所示的氨基酸序列形成的肽中有1或多个氨基酸取代或附加得到的氨基酸序列组成的肽。
Description
技术领域
本发明涉及作为胃癌、胰腺癌和恶性黑素瘤(メラノ—マ)等高表达SPARC的癌的癌症疫苗有效的新型肽、以及含有该肽的肿瘤的治疗和/或预防药物。
背景技术
与欧美相比，胃癌在日本或中国等亚洲各国罹患率高。由于健康诊断的普及以及消化器官内窥镜器材或检查技术的进步，胃癌可以早期发现，患者人数正逐渐减少。但是，仍然占日本人恶性新生物死亡原因的第二位，在死亡原因中所占比例仍高。胃癌中，弥漫性(アキルス)胃癌与其它胃癌(腺癌)相比，在年轻人中发生，癌症的进展、转移、腹膜转移倾向强，预后不良。弥漫性胃癌在诊断时大多已经无法外科切除，即使可以切除，治疗后的复发率高，因此，确立新的治疗方法是当务之急。
在日本，胰腺癌的死亡患者人数有增加倾向，2003年有21,148人因胰腺癌死亡。胰腺癌占目前日本癌症死亡原因的6.8％，是仅次于肺癌、胃癌、结肠直肠癌、肝癌的第五位。分析世界人口统计数据，如果对年龄构成不同的人群死亡率进行比较时所使用的年龄调整死亡率进行计算，2000年，100,000人中，男性中日本为8.6人，而美国为7.3人，英国为6.3-7.0人；女性中，日本为4.9人，而美国为5.3人，英国为4.8-5.1人，与欧美相比具有相同的水平。
由2000年的年龄调整率(根据世界人口每100,000人中)来看，男性中，日本为8.6，美国为7.3，英国为6.3-7.0；而女性中，日本为4.9，美国为5.3，英国为4.8-5.1，与欧美相比具有相同的水平。即使在图像诊断得到发展的今天，整体日本患者的约四成是具有远距离转移性的进行性病例，并且发现为无法切除的局部进行病例的状态的患者较多。1996年的诊断率中，胰腺癌患者整体的五年相对存活率为4.3％，比以往的2-3％有增加倾向，但是依然较低。关于胰腺癌的发生原因，显示除吸烟、肥胖、饮食、饮酒、咖啡等生活习惯之外，慢性胰腺炎或糖尿病、遗传因素等各种因素与其相关。
胰腺癌没有特异性的症状，但有症状出现时大多已经在发展。因此，患者整体的五年存活率为5％以下，诊断后的预后极为不良。由于诊断困难，特别是在发达国家，作为癌症死亡原因疾病的频率正在日益增加。目前是以外科切除为中心，采取了放射线治疗、化学疗法等协同治疗，但是仍没有明显的治疗效果的改善，亟待建立新型的治疗策略。
黑素瘤是被称为恶性黑素瘤的皮肤癌的一种，其浸润和转移倾向非常强，作为恶性程度非常高的癌症令人恐惧。构成皮肤的细胞中有产生黑色素的细胞，将其称为色素细胞(黑素细胞)，该细胞癌化则形成黑素瘤。由于环境破坏导致大气中臭气层的减少，从而暴露于紫外线的时间增加，特别是在白人中发生黑素瘤的频率正在增加。
日本的黑素瘤发病人数是每10万人口有1.5-2人左右，推测每年有大约1500人-2000人发病。而在欧美，每10万人口有10多人以上发病，在澳大利亚，每10万人口有20多人以上发病，被称为世界第一高的发病数。仅此，在欧美或澳大利亚的人们对黑素瘤非常关心，十分注意黑素瘤的发生。另外，另人吃惊的是，不管在外国、在日本，黑素瘤的发生可见逐年增加的倾向。最近的调查中，日本由于该病导致的年死亡人数有450人左右。黑素瘤在任何年龄均可发病，特别是40岁以上发病较多，60岁-70岁左右最多。儿童发病非常少见，但不是没有，最近在20-30岁左右的年轻人中间发病有增加倾向。性别区分中，没有特别倾向于哪方较多，在男女中均有发病。日本人容易发生黑素瘤的部位是足底(脚底面)最多，约占三成左右。在足或手指的指甲部分也较多发生，这是日本人的特征。除此之外与欧美人同样，在身体、手、足、面部、头等任何皮肤处均有发生。
目前，黑素瘤的治疗是实施外科疗法、化学疗法和放射线疗法。但是，作为适合这些治疗方法以外的转移癌症或难治性癌症的姑息性的治疗方法，通过提高癌症患者对癌的免疫力来抑制癌症的增殖的免疫疗法受到关注，实际上已经在部分患者中取得功效。
另一方面，由于近年来分子生物学和肿瘤免疫学的发展，已经了解到细胞毒性(杀伤)T细胞和辅助T细胞识别下述蛋白质分解得到的肽，显示破坏癌细胞的免疫反应，其中，所述蛋白质经由HLA分子介导，呈递于癌细胞或抗原呈递细胞的表面呈递，在癌细胞中特异性高表达。并且已经鉴定了多种刺激攻击上述癌的免疫反应的的肿瘤抗原蛋白、以及由其衍生的肽，抗原特异性肿瘤免疫疗法的临床应用得到进展。
HLA-I类分子在身体的所有有核细胞的表面表达，在细胞质或核中产生的蛋白质在细胞内分解得到的肽与所述的HLA-I类分子结合，在细胞表面表达。正常的细胞表面上，来自正常的自身蛋白质的肽与HLA-I类分子结合，免疫系统的T细胞并不识别、破坏该结合分子。另一方面，癌细胞在形成癌症的过程中大量表达在正常细胞中几乎不表达，或者很少表达的蛋白质。上述在癌细胞中特异性高表达的蛋白质在细胞质内分解形成肽，该肽与HLA-I类分子结合、在癌细胞表面表达时，则杀伤T细胞识别该细胞，只破坏癌细胞。另外，通过将上述癌特异性抗原或肽给予个体，不会对正常细胞施加危害，而可破坏癌细胞并抑制癌症的增殖。这被称为使用癌特异性抗原的癌免疫疗法。另外，HLA-II类分子主要在抗原呈递细胞的表面表达，其结合抗原呈递细胞由细胞外摄取、在细胞内分解形成的、来自癌特异性抗原的肽，在细胞表面表达。识别该结合肽的辅助T细胞被活化，通过生成活化其它免疫系统细胞的各种细胞因子，可以诱导或增强对肿瘤的免疫反应。
因此，如果可以开发以这些在癌中特异性高表达的抗原作为靶的免疫疗法，则不会对自身正常器官产生有害影响，可以形成只有效排除癌的治疗法。还有望获得无需其它治疗方法、对于任何晚期癌症患者均可使用的治疗方法。另外，将癌特异性抗原和肽制成疫苗给予发生上述癌症的风险较高的人群，可以预防癌症的发生。
本发明人首先使用cDNA微阵列对胃癌组织和正常组织中的基因组范围的23,040种基因的表达进行分析。结果，在20例弥漫性浸润性胃癌患者中有11例鉴定出，与正常胃粘膜比较、在胃癌组织中以5倍以上(平均13万倍)高表达的基因——富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白(Secreted protein acidic and rich in cysteine；SPARC)。(图1)SPARC基因在正常的脂肪组织、乳腺、卵巢、脊髓、睾丸、子宫、胎盘等中可见轻度表达，与正常胃粘膜比较，均为5倍以下的低表达(图2)。
SPARC不仅是在弥漫性浸润性胃癌中高表达，在胰腺癌或黑素瘤中也高表达，这些已经有其它研究人员的报道。并且发明人发现：在黑素瘤患者的血清中有SPARC分泌，特别可作为对黑素瘤早期发现有用的肿瘤标志(日本特愿2004-303688；以及Clinical Cancer Research11：8079-8088，2005)。
SPARC是含有286个氨基酸的43 KD酸性分泌蛋白，富含半胱氨酸，在细胞分裂期向核转移。SPARC是通过调节胞外基质蛋白与细胞的相互作用，来参与调节细胞增殖的蛋白质。在成骨细胞或血小板、创伤部位等中表达，由此认为可能与组织的修复和重构有关。还有报道称：在黑素瘤或骨肉瘤等癌症、以及肿瘤的间质细胞中高表达，并且SPARC的表达与肿瘤的预后、浸润或转移有关。
非专利文献1：Ikuta Y等人.，Clinical Cancer Research 11：8079-8088，2005.
专利文献1：特愿2004-303688
发明内容
本发明的要解决的课题在于：在作为弥漫性浸润性胃癌、胰腺癌和黑素瘤等高表达SPARC的肿瘤的治疗方法实施的外科疗法、化学疗法和放射线疗法中，作为对治疗困难的转移癌或难治性癌的姑息治疗方法，开发通过增强癌症患者对癌的免疫力来抑制癌的增殖的免疫疗法的方法。即，本发明要解决的课题在于：鉴定不会伴有对癌症患者有害的情况、可诱导对上述癌症的强的免疫反应的、来自癌症特异性高表达的SPARC蛋白质的肽，将该肽应用于肿瘤的免疫疗法。本发明要解决的课题在于：鉴定可诱导对肿瘤显示反应性的人杀伤T细胞、和辅助T细胞的来自SPARC蛋白质的肽，以高表达SPARC的各种癌症的患者为对象，提供可进行肿瘤的免疫疗法的方法。
本发明人通过弥漫性浸润性胃癌的cDNA微阵列分析，鉴定了在弥漫性浸润性胃癌中高表达的基因SPARC。SPARC的表达在部分正常组织中也可观察到，但是与癌症部位相比，其表达显著低。为了研究SPARC特异性的杀伤T细胞是否诱导抗肿瘤免疫，利用结合肽的氨基酸序列相关特征与日本人中频率最高的HLA-A24相同的、表达小鼠Kd分子的BLAB/c小鼠。即，对于具有95％同源性的人和小鼠的SPARC，通过在两者中氨基酸序列共通的肽，合成具有人的HLA-A24和小鼠Kd共通的结合基序的复合物。通过将负载了这些肽的混合物的、来自骨髓的树突状细胞免疫BALB/c小鼠(表达Kd)，研究是否诱导了肽特异性的、且破坏表达SPARC的癌细胞的杀伤T细胞。并且，在接受了按照同样的免疫方法进行预处理的小鼠中，对移植的小鼠中表达SPARC的癌细胞的增殖是否受到抑制、存活期间是否延长进行了研究。对于肽免疫的小鼠中，对随着自身免疫现象的发生而观察到的有害现象是否出现也进行了研究。结果确认：含有SEQ ID NO.1-3中任一项所示氨基酸序列的肽可诱导破坏表达SPARC的癌细胞的杀伤T细胞，并且这些肽免疫的小鼠中，移植的小鼠中表达SPARC的癌细胞的增殖受到抑制，存活期间延长，本发明根据这些认识完成。
即，本发明提供以下的发明。
(1)以下任意的肽：
(A)SEQ ID NO.1-3中任一项所示氨基酸序列的肽；
(B)具有杀伤T细胞的诱导能力的、在由SEQ ID NO.1-3所示氨基酸序列形成的肽中有1或多个氨基酸取代或附加而成的氨基酸序列组成的肽。
(2)癌症的免疫诱导剂，该癌症免疫诱导剂含有至少一种以上(1)所述的肽。
(3)肿瘤的治疗和/或预防用的药物，该药物含有至少一种以上(1)所述的肽。
(4)用于诱导抗原呈递细胞的药物，该药物含有至少一种以上(1)所述的肽，其中，所述的抗原呈递细胞诱导肿瘤反应性T细胞的能力高。
(5)用于诱导肿瘤反应性T细胞的药物，该药物含有至少一种以上(1)所述的肽。
(6)用于诱导抗原呈递细胞的药物，该药物含有编码以下任何的肽的基因，其中，所述的抗原呈递细胞诱导肿瘤反应性T细胞的能力高。
(A)SEQ ID NO.1-3中任一项所示氨基酸序列的肽；
(B)具有杀伤T细胞的诱导能力的、在由SEQ ID NO.1-3所示氨基酸序列形成的肽中有1或多个氨基酸取代或附加而成的氨基酸序列组成的肽。
(7)针对(1)所述的肽的抗体。
(8)杀伤T细胞、辅助T细胞或含有它们的免疫细胞集团，这些细胞用(1)所示的肽诱导。
(9)抗原呈递细胞，该抗原呈递细胞呈递HLA分子与(1)所述肽的复合体。
(10)(9)所述的抗原呈递细胞，该抗原呈递细胞由(4)或(6)所示药物诱导。
实施发明的最佳方式
(1)本发明的肽以及含有该肽的、癌症的免疫诱导剂
本发明的肽是以下任意的肽。
(A)SEQ ID NO.1-3中任一项所示氨基酸序列的肽；
(B)具有杀伤T细胞的诱导能力的、在由SEQ ID NO.1-3所示氨基酸序列形成的肽中有1或多个氨基酸取代或附加而成的氨基酸序列组成的肽。
本说明书中所述的具有诱导细胞毒性T细胞的能力的肽是指具有刺激杀伤T细胞的T细胞诱导活性的肽。
本发明肽的获得、制备方法没有特别限定，可以是化学合成的肽、通过基因重组技术制备的重组肽的任意一种。
获得化学合成肽时，例如可按照Fmoc法(芴甲氧羰基法)，tBoc法(叔丁氧羰基法)等化学合成方法合成本发明的肽。还可以利用各种市售的肽合成仪合成本发明的肽。
生产本发明的肽作为重组蛋白质时，可获得具有编码该肽的碱基序列的DNA或其突变体或同源体，将其导入到适当的表达系统中，制备本发明的肽。
表达载体优选可在宿主细胞中自主复制，或者可以整合到宿主细胞的染色体中，可以使用在可表达编码肽的基因的位置含有启动子的载体。另外，可以通过将上述表达载体导入宿主中制备具有编码本发明的肽的基因的转化体。宿主可以是细菌、酵母、动物细胞、昆虫细胞的任意一种，可以根据适合各宿主的公知的方法向宿主中导入表达载体。
本发明中，培养上述制备的转化体，在培养物中生成并积蓄本发明的肽，由该培养物中收集本发明的肽，由此可以分离重组肽。
转化体为大肠杆菌等原核生物、酵母菌等真核生物时，培养这些微生物的培养基可以含有该微生物可利用的碳源、氮源、无机盐类等，只要是可高效地进行转化体的培养的培养基即可，可以是天然培养基、合成培养基的任意一种。另外，培养条件也可按照培养该微生物时通常所使用的条件进行。培养后，在从转化体的培养物中分离纯化本发明的肽时，可以使用通常的肽的分离、纯化方法。
本说明书中的“1或多个氨基酸”通常是指1-10个氨基酸，优选1-8个氨基酸，更优选1-5个氨基酸，特别优选1-3个氨基酸(例如1个、2个或3个氨基酸)。
对于在由SEQ ID NO.1-3中任一项所示氨基酸序列形成的肽中有1或多个氨基酸取代或附加得到的氨基酸序列组成的肽，本领域技术人员可根据SEQ ID NO.1-3中任一项所述的氨基酸序列的信息适当制备或获得。即，在SEQ ID NO.1-3中任一项所示的氨基酸序列中有1或多个氨基酸取代或附加得到的氨基酸序列、具有细胞毒性T细胞诱导能力的肽可通过上述化学合成、基因工程方法或诱变等本领域已知的任意方法制备。例如，作为基因工程的方法之一的位点专一性诱变法是可以向特定位置导入特定突变的方法，因此有用，可按照Molecular Cloning：A laboratory Mannual，2ndEd.，Cold Spring HarborLaboratory，Cold Spring Harbor，NY.，1989(以下简称分子克隆第2版)、Current Protocols in Molecular Biology，Supplement 1-38，John Wiley &Songs(1987-1997)等所述方法进行。
上述本发明的肽，如后述实施例所示，可以诱导对癌症的免疫。因此，本发明可以提供含有本发明的肽的癌症的免疫诱导剂。
本发明的癌症的免疫诱导剂可以在体内、先体外后体内或在体外、优选先体外后体内使用，可以诱导杀伤T细胞、辅助T细胞或含有它们的免疫细胞集团，由此可以赋予对癌的免疫功能。
(2)本发明的抗体
本发明涉及识别以上述本发明的肽的一部分或全部作为表位(抗原)的抗体、以及该肽进行先体外后体内或体外刺激而诱导的杀伤T细胞。通常已知，与抗体相比，杀伤T细胞显示强的抗肿瘤活性。
本发明的抗体可以是多克隆抗体也可以是单克隆抗体，其制备可按照规定方法进行。
例如，多克隆抗体可以用本发明的肽作为抗原，免疫致敏哺乳动物或鸟类，由该哺乳动物或鸟类采集血液，由采集的血液分离并纯化抗体获得。例如可以免疫小鼠、仓鼠、豚鼠、鸡、大鼠、兔、狗、山羊、绵羊、牛、马等哺乳动物或鸟类。免疫致敏的方法在本领域是公知的，例如可以将抗原例如以7-30天的间隔给予2-3次。给予量可以是每次例如给予抗原约0.05-2mg左右。给予途径没有特别限定，可以适当选择皮下给予、皮内给予、腹膜腔内给予、静脉内给予、肌内给予等。抗原可以溶解于含有适当的佐剂的缓冲液，例如完全弗氏佐剂或氢氧化铝等通常所使用的佐剂的适当的缓冲液中使用。
将免疫致敏的哺乳动物或鸟类饲养一定期间后，如果抗体效价升高，则使用例如100μg-1000μg的抗原进行追加免疫。自最后的给予1-2个月后，由免疫致敏的哺乳动物或鸟类采集血液，将该血液通过离心、使用硫酸铵或聚乙二醇的沉淀、凝胶过滤层析、离子交换层析、亲和层析等层析等常规方法分离纯化，由此可以获得识别本发明的肽的多克隆抗体。
单克隆抗体可以制备杂交瘤获得。例如，通过抗体生成细胞与骨髓瘤细胞株的细胞融合，可以获得杂交瘤。生成本发明的单克隆抗体的杂交瘤可通过以下的细胞融合法获得。
抗体生成细胞可使用来自被免疫的动物的脾细胞、淋巴结细胞、B淋巴细胞等。抗原可使用本发明的肽。免疫动物可使用小鼠、大鼠等。这些抗原对这些动物的给予可按照常规方法进行。例如将完全弗氏佐剂、不完全弗氏佐剂等佐剂与作为抗原的本发明肽的悬浮液或乳化液分多次给予动物的皮下、皮内、腹腔内，由此免疫动物。由被免疫的动物获得作为抗体生成细胞的例如脾细胞，按照公知方法(G.Kohler等人.，Nature，256 495(1975))使其与骨髓瘤细胞融合，制备杂交瘤。
细胞融合中使用的骨髓瘤细胞株，例如小鼠有P3X63Ag8、P3U1株、Sp2/0株等。进行细胞融合时，可使用聚乙二醇、仙台病毒等融合促进剂，细胞融合后的杂交瘤的选择可按照常规方法，使用次黄嘌呤·氨基蝶呤·胸苷(HAT)培养基。细胞融合得到的杂交瘤通过有限稀释法等克隆。还可进一步根据需要通过使用本发明的肽的酶联免疫测定法进行筛选，可获得生成特异性识别本发明的肽的单克隆抗体的细胞株。
由上述得到的杂交瘤制备目标单克隆抗体时，可通过通常的细胞培养法或腹水形成法培养该杂交瘤，由培养上清或腹水中纯化该单克隆抗体。培养上清或腹水中的单克隆抗体的纯化可按照常规方法进行。例如可将硫酸铵分离法、凝胶过滤、离子交换层析、亲和层析等适当组合使用。
上述抗体的片段也在本发明的范围内。抗体的片段有F(ab’)2片段、Fab′片段等。
(3)杀伤T细胞、辅助T细胞或含有它们的免疫细胞集团
本发明还涉及使用本发明的肽、通过体外刺激诱导的杀伤T细胞、辅助T细胞或含有它们的免疫细胞集团。例如，用本发明的肽体外刺激末梢血淋巴细胞或肿瘤浸润淋巴细胞，则显示肿瘤反应性的活化T细胞被诱导，该活化T细胞可有效用于癌症的过继免疫疗法。将本发明的肽在强力的抗原呈递细胞——树突状细胞、在先体外后体内或者在体外表达，通过给予表达该抗原肽的树突状细胞，可以诱导针对肿瘤的免疫反应。
优选使用本发明的肽和免疫活化剂，通过先体外后体内或在体外进行刺激，由此诱导含有杀伤T细胞、辅助T细胞或含有它们的免疫细胞集团。这里所使用的免疫活化剂有细胞生长因子或细胞因子等。
将上述得到的杀伤T细胞、辅助T细胞、或含有它们的免疫细胞集团转移到体内，由此可抑制肿瘤，可以进行癌症的预防和/或治疗。
通过使用本发明的肽，可以制备能够抑制上述肿瘤生长的杀伤T细胞、辅助T细胞或含有它们的免疫细胞集团。因此，根据本发明，可以提供含有肿瘤反应性T细胞和本发明的肽的细胞培养液。使用该细胞培养液，可以制备能够抑制肿瘤的杀伤T细胞、辅助T细胞或含有它们的免疫细胞集团。根据本发明，可以提供含有上述细胞培养液、细胞培养容器的、用于制备杀伤T细胞、辅助T细胞、或含有它们的免疫细胞集团的细胞培养试剂盒。
(4)本发明的用于肿瘤的治疗和/或预防的药物(癌症疫苗)
本发明的肽可以诱导癌细胞特异性杀伤T细胞，因此有望作为癌症的治疗、预防药。例如，将编码本发明的肽的基因组整合到适当的载体中、用该重组DNA转化的BCG菌的细菌，或者将编码本发明的肽的DNA整合到基因组中得到的痘苗病毒等病毒作为人类癌症的治疗、预防用的活疫苗有效利用。癌症疫苗的给予量和给予方法与通常的种痘或BCG疫苗同样。
即，编码本发明的肽的DNA(直接或者是以整合到表达载体中的质粒DNA的形式)、含有该DNA的重组病毒或重组细菌可直接或者以分散于佐剂中的状态、以癌症疫苗的形式给予包括人的哺乳动物。本发明的肽也同样以与佐剂分散的状态、以癌症疫苗的形式给予。
可在本发明中使用的佐剂有弗氏不完全佐剂、BCG、海藻糖二霉菌酸酯(TDM)、脂多糖(LPS)、明矾佐剂、硅佐剂等，从涉及抗体的诱导能力等考虑，优选使用弗氏不完全佐剂(IFA)。
本说明书中所述的癌症的种类没有特别限定，具体例子有胃癌、直肠结肠癌、食道癌、胰腺癌、肝癌、胆囊癌、胆管癌、肺癌、乳腺癌、甲状腺癌、黑素瘤(恶性黑素瘤)、皮肤癌、骨肉瘤、褐色细胞瘤、头颈癌、脑肿瘤、慢性骨髓性白血病、急性骨髓性白血病、恶性淋巴瘤、肾癌、膀胱癌、前列腺癌、睾丸癌、子宫癌、卵巢癌、或软组织肉瘤等，其中特别是像胃癌(特别是弥漫性浸润性胃癌)、胰腺癌或黑素瘤(恶性黑素瘤)等的高表达SPARC的癌症。
本发明的肽作为T细胞表位，可诱导癌细胞特异性的杀伤T细胞或辅助T细胞，因此可用作人的癌症预防、治疗药物。本发明的抗体只要是可以抑制作为癌症抗原的SPARC活性即可用作人癌症的预防、治疗药。实际的使用方法可以是将本发明的肽或抗体直接或者与药物可接受的载体和/或稀释剂一起、再根据需要加入以下助剂，制成注射剂的形式给予，也可以通过喷雾等方法由粘膜等透皮吸收给予。这里所述的载体例如是人血清白蛋白，稀释剂例如有PBS、蒸馏水等。
给予量是成人每人例如每次以0.01mg-100mg的范围给予本发明的肽或抗体，但并不限于该范围。制剂的形态没有特别限定，可以是冻干制剂，也可以加入糖等赋形剂制成颗粒。
可添加到本发明的药物中的、用于提高肿瘤反应性T细胞诱导活性的助剂有：除胞壁酰二肽(MDP)之外的BCG菌等菌体成分、Nature，vol.344，p873(1990)所述的ISCOM、J.Immunol.vol.148，p1438(1992)文献所述的皂苷类的QS-21、脂质体、氢氧化铝等。还可以使用香菇多糖、裂裥多糖、沙培林等的免疫活化剂作为助剂。另外，IL-2、IL-4、IL-12、IL-1、IL-6、TNF等增强T细胞的增殖、分化增强细胞因子等，以及活化NKT细胞的α半乳糖苷神经酰胺，或与Toll样受体结合、活化自然免疫系统的CpG、脂多糖(LPS)等也可用作助剂。
在试管内，向由HLA-A24阳性患者采集的细胞、或者来自HLA-A24阳性的人(异源的)的细胞中加入该抗原肽，进行抗原呈递，然后给予患者的血管内，可以在患者体内有效地诱导杀伤T细胞。还可以向患者末梢血淋巴细胞中加入该肽，在试管内培养，在试管内诱导杀伤T细胞后返回患者血管内。上述细胞移植的治疗已经作为癌症治疗方法实施，是本领域所熟知的方法。
将本发明的肽注入体内，可以诱导肿瘤反应性T细胞，结果有望获得抗肿瘤效果。先体外后体内或在体外用本发明的肽刺激淋巴细胞、诱导活化T细胞，将该活化的T细胞注入患部，还可有效地用于过继免疫疗法。
通过以下实施例进一步说明本发明，本发明并不受这些实施例的限定。
实施例
[实施例1]
(1)cDNA微阵列分析
将摘取的弥漫性浸润性胃癌患者的癌部位或非癌部位的组织通过激光捕获显微切割分别切出，由各组织中提取RNA。通过反转录反应，由这些RNA合成cDNA，此时将癌部位的cDNA用Cy5、非癌部位的cDNA的用Cy3荧光标记，然后混合，制成靶DNA。在探针cDNA作为阵列的玻片上进行杂交，然后洗涤并除去非特异性结合，使用CCD照相机或荧光扫描仪摄取杂交后的荧光图像，以伪彩色(Cy5：红，Cy3：绿)展示，同时分别计算荧光强度的比(R/G)，以基因表达分布表示。并且，对20例弥漫性浸润性胃癌患者的癌症部位和非癌症部位的23040种基因的表达进行比较研究，在很多的症例中选出15种癌部位/非癌部位表达比为5以上的基因(图1)。
下面，对于各基因，分析29种器官(包括胚胎期的4种器官)的正常组织中23,040种基因的表达分布，选出在正常器官中表达低的基因。本次，我们作为肿瘤抗原选定的SPARC，在20例弥漫性浸润性胃癌患者中的11例中癌部位/非癌部位的表达比为5以上(平均133,359倍)。SPARC也在一部分正常组织中表达，但与癌症部位相比其表达显著低(图2)。
[实施例2]
(2)人HLA-A24和小鼠Kd约束性SPARC肽的所有组成成分的选择
在具有95％同源性的人和小鼠的SPARC中选择了以下的肽，并且所选择的肽是从具有在人和小鼠中共同的氨基酸序列的SPARC肽部分中选择的。根据与人HLA-A24和小鼠Kd分子均强烈结合的肽中均可观察到的氨基酸序列的已知信息，对SPARC分子的全部氨基酸序列进行分析，利用计算机程序选择了推定与两分子结合亲和性高的肽的所有组成成分。结果确定了四种作为候选肽(表1)。
[表1]
推定在人HLA-A24和小鼠Kd分子中均显示结合性的、来自SPARC的肽
根据http://bimas.dcrt.nih.gov/cgi-bin/molbio/ken_parker_comboform
SPARC Kd-1：SEQ ID NO.1
SPARC Kd-3：SEQ ID NO.2
SPARC Kd-4：SEQ ID NO.3
(3)树突状细胞(DC)疫苗
用GM-CSF，由来自BALB/c骨髓的骨髓细胞诱导来自骨髓细胞的树突状细胞(BM-DC)。诱导方法采用之前报道的方法(Nakatsura，T等人.，Clin Cancer Res 10，8630-8640，2004)。上述得到的BM-DC与上述确定的四种肽的混合物一起，以10μM的浓度培养2小时，然后每只腹腔内给予5×105个。间隔一周，同样给予两次，免疫小鼠，然后回收小鼠的脾细胞，用于杀伤T细胞的检测。为了严格探讨诱导来自CD8+T细胞的杀伤T细胞，采集脾后使用MACS珠，由脾细胞中除去CD4+T细胞，备用。
在确定杀伤T细胞所识别的SPARC肽中使用的程序如下所示(以从免疫小鼠回收脾细胞的日期为第0天)。
第21天(1)向BALB/c小鼠的骨髓细胞中加入GM-CSF，开始诱导来自骨髓的树突状细胞(以下称为BM-DC)。
第14天(2)向经诱导的BM-DC中添加4种SPARC肽的混合物，2小时后每只腹腔内给予5×105个。
将(1)(2)每周重复两次。
回收第0天免疫的BALB/c小鼠的脾细胞，向BM-DC中分别添加SPARC肽，2小时后与脾细胞共培养，培养6天。
第6天，为了检测特异性识别SPARC肽的杀伤T细胞，进行Cr释放试验。被杀伤T细胞伤害的靶肿瘤细胞设定为T2Kd细胞、RL male1细胞株、Meth A细胞株和BALB/3T3细胞株。
(4)通过Cr释放试验研究SPARC特异性杀伤T细胞的肿瘤细胞毒性
如下研究经诱导的SPARC特异性杀伤T细胞对肿瘤细胞的细胞毒活性。T2Kd细胞是向TAP基因表达缺失的小鼠T2细胞株中导入Kd基因的细胞株。由于缺失TAP，只在由外部添加的肽具有与MHC-I类分子结合的性质的情况下，该MHC-I类分子与肽的复合体才在细胞表面表达。RL male 1细胞株是来自BALB/c小鼠的T细胞性白血病细胞。两种细胞均不表达SPARC。首先，Meth A和BALB/3T3细胞株是来自BALB/c小鼠的纤维肉瘤细胞株和成纤维细胞细胞株，表达SPARC。用放射性各(Cr)将这些细胞株标记后，与上述杀伤T细胞培养4小时，然后回收培养上清，对由死亡细胞释放的放射性Cr的量进行定量，检测细胞毒活性。
结果，未观察到对不表达SPARC的T2Kd细胞和RL male 1的细胞毒性，但是通过施加SPARC Kd肽1、3和4，则在细胞表面观察到对表达该SPARC Kd肽和Kd分子的复合体的T2Kd细胞、自然表达SPARC的Meth A和BALB/3T3的特异性细胞毒活性(图3)。
[实施例3]
(5)通过SPARC肽免疫诱导BALB/c小鼠的抗肿瘤免疫
(方法)
将BM-DC与10μM SPARCKd-1，3，4混合肽一起培养2小时，然后每只腹腔内给予5×105个。间隔一周，以同样的方式给予负荷了肽的BM-DC，总计对小鼠免疫2次，免疫2次，7天后，皮下移植高表达小鼠SPARC的小鼠纤维肉瘤细胞株Meth A(1×106)，研究肿瘤的增殖和小鼠的存活时间。
(结果)
结果如图4所示。SPARC肽脉冲BM-DC的预防性给予可以诱导针对皮下移植的MethA的增殖抑制效果和小鼠的存活时间的延长。
产业实用性
HLA-A24(A*2402)是约60％日本人具有的、频率最高的HLA-I类等位基因。与HLA-I类分子所对应的BALB/c小鼠的Kd分子结合的肽的氨基酸序列同与人的HLA-A24结合的肽的氨基酸序列非常类似。因此，在对BALB/c小鼠进行肽免疫时，肽与Kd分子结合，诱导杀伤T细胞，这表明表达该肽和Kd分子复合体的癌细胞破坏时，该肽与HLA-A24结合，同样可诱导破坏癌细胞的人杀伤T细胞。因此，本发明中呈递的肽可以应用于具有HLA-A24的弥漫性浸润性胃癌、胰腺癌和黑素瘤患者的免疫疗法，通过抑制这些癌的增殖和进展，有望改善患者的QOL。
附图简述
图1表示通过20例弥漫性浸润性胃癌患者的cDNA微阵列分析鉴定的、与正常胃粘膜比较，在胃癌组织中表达最高的15个基因在各个病症中的表达程度。其中，结合以下所示的正常组织的cDNA微阵列分析结果考虑，可以筛选癌部位特异性高表达的、富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白(SPARC)作为最理想的癌症特异性抗原。
图2是使用cDNA微阵列，分析成人的25种主要器官和四种胚胎期器官中SPARC的表达。SPARC基因的表达在一部分正常组织中也可观察到，但与癌症部位相比其表达程度显著低。
图3表示在BALB/c小鼠中，使用小鼠Kd限制性SPARC Kd-1、Kd-3或Kd-4表位肽诱导的CTL所导致的SPARC阳性肿瘤细胞毒。
图4是将SPARCKd-1、Kd-3和Kd-4混合负荷的骨髓树突状细胞(BM-DC)预先给予BALB/c小鼠，由此导致的抑制皮下移植的Meth A癌细胞的增殖、并使存活期间延长。
序列表
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Met Tyr Ile Phe Pro Val His Trp Gln Phe
1 5 10
Claims (6)
1.由SEQ ID NO.3所示氨基酸序列构成的肽。
2.用于治疗和/或预防具有HLA-A24的弥漫性浸润性胃癌、胰腺癌和黑素瘤的药物，该药物含有权利要求1所述的肽。
3.权利要求1所述的肽在制备用于治疗和/或预防具有HLA-A24的弥漫性浸润性胃癌、胰腺癌和黑素瘤的药物中的应用。
4.权利要求1所述的肽在制备用于诱导对具有HLA-A24的弥漫性浸润性胃癌、胰腺癌和黑素瘤的免疫的药物中的应用。
5.权利要求1所述的肽在制备用于诱导肿瘤反应性T细胞的药物中的应用，其中，所述肿瘤反应性T细胞是可以抑制具有HLA-A24的弥漫性浸润性胃癌、胰腺癌和黑素瘤的增殖的杀伤T细胞。
6.杀伤T细胞，该细胞用权利要求1所示的肽诱导，其中所述杀伤T细胞是可以抑制具有HLA-A24的弥漫性浸润性胃癌、胰腺癌和黑素瘤的增殖的杀伤T细胞。
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