PÉPTIDOS ANTIGÉNICOS DE RECHAZO DE TUMOR DERIVADOS DE SPARC Y MEDICAMENTOS QUE COMPRENDEN LOS MISMOS
CAMPO TÉCNICO La presente invención se relaciona a péptidos novedosos que son efectivos como una vacuna para cánceres que expresan altamente SPARC, tal como cáncer de estómago, cáncer pancreático o melanoma maligno (melanoma) , y medicamentos que comprenden los péptidos referidos utilizados para el tratamiento y/o la prevención de tumores. TÉCNICA ANTECEDENTE Cuando se compara con países occidentales, la morbidez del cáncer de estómago es alta en países asiáticos tales como Japón y China. Como un resultado de la difusión de chequeos médicos, el uso difundido de endoscopios digestivos, y el desarrollo de técnicas de inspección, ha llegado a ser posible detectar el cáncer del estómago en una etapa temprana, y así el número de pacientes que sufren de este cáncer ha estado disminuyendo. No obstante, el cáncer de estómago es todavía la segunda causa de muerte debido al neoplasma maligno en la población Japonesa. Así, el cáncer de estómago es todavía una causa principal de muerte. Entre varios tipos de cánceres de estómago, el cáncer de estómago difuso (cirroso) ocurre en personas jóvenes cuando se comparan con otro tipo de cáncer de estómago (adenocarcinomas) . Tal cáncer de estómago difuso (cirroso)
tiende a hacer rápido progreso, y la metástasis distante o metástasis peritoneal frecuentemente ocurre, dando por resultado de esta manera pobre prognosis. En muchos casos de cáncer de estómago cirroso, ya se ha vuelto imposible llevar a cabo la extirpación quirúrgica en el tiempo de la diagnosis. Aun si es todavía posible extirpar el tumor, el cáncer frecuentemente recurre después del tratamiento. Por consiguiente, es altamente deseado establecer un método de tratamiento novedoso. El número de muertes del cáncer pancreático tiende a incrementarse en el Japón. 21,148 personas murieron debido al cáncer pancreático en el 2003. Actualmente, tal cáncer pancreático constituye 6.8% de los cánceres que causan muerte en Japón. Esto es, el cáncer pancreático se clasifica como la quinta causa de muerte después del cáncer de pulmón, cáncer de estómago, cáncer de colon y cáncer de hígado. Los datos demográficos mundiales se analizaron, y la proporción de mortalidad ajustada a la edad, que se utiliza para la comparación entre las proporciones de mortalidad de poblaciones con diferentes estructuras de edad, se calculó. Como resultado, en el 2000, en el caso de 100,000 hombres, 8.6 personas murieron debido al cáncer pancreático en Japón, mientras que 7.3 personas murieron en los Estados Unidos y 6.3 a 7.0 personas murieron en Reino Unido debido al mismo tipo de cáncer. En el caso de 100,000 mujeres, 4.9 personas
murieron debido al cáncer pancreático en Japón, mientras que 5.3 personas murieron en los Estados Unidos y 4.8 a 5.1 personas murieron en el Reino Unido debido al mismo tipo de cáncer. Así, la proporción de mortalidad debido al cáncer pancreático en Japón ha llegado a ser del mismo nivel como aquellos de los países occidentales. Tomando en consideración la proporción ajustada con la edad en el 2000 (100,000 personas de la población mundial) en el caso de hombres, 8.6 personas murieron debido al cáncer pancreático en Japón, mientras que 7.3 personas murieron en los Estados Unidos y 6.3 a 7.0 personas murieron en el Reino Unido debido al mismo tipo de cáncer. Además, en el caso de mujeres, 4.9 personas murieron debido al cáncer pancreático en Japón, mientras que 5.3 personas murieron en los Estados Unidos y 4.8 a 5.1 personas murieron en el Reino Unido debido al mismo tipo de cáncer. Así, la proporción de mortalidad debido al cáncer pancreático en Japón ha llegado a ser del mismo nivel como aquellos de los países occidentales. A pesar del desarrollo de la formación de imagen de diagnóstico, actualmente, aproximadamente 40% de los pacientes Japoneses totales con cáncer pancreático sufren de cáncer pancreático progresivo que involucra metástasis distante, y además, también hay muchos casos donde el cáncer es descubierto después de que ha alcanzado una etapa de cáncer localmente avanzada, en la cual el tumor no puede ser extirpado. La
proporción de supervivencia relativa de 5 años de pacientes totales con cáncer pancreático es 4.3% en los casos de diagnosis en 1996. Aunque esta proporción tiende a ser más alta que la proporción de supervivencia convencional (2% a 3%), es todavía baja. Considerando los factores de desarrollo de cáncer pancreático, se ha sugerido que varios factores incluyendo los hábitos de vida tal como la acción de fumar, adiposis, comidas, beber alcohol, y el uso de café, así como la pancreatitis crónica, diabetes, factor genético, etc. están involucrados en el inicio del cáncer pancreático. El cáncer pancreático no tiene síntomas específicos, y así, en muchos casos, el cáncer ya ha progresado cuando aparecen ciertos síntomas. Como resultado, la proporción de supervivencia de 5 años de pacientes totales es 5% menos, y la prognosis después de la diagnosis es extremadamente baja. Debido a la dificultad en la diagnosis del cáncer pancreático, la proporción de este cáncer como una enfermedad causativa de muerte de cáncer es gradualmente incrementada particularmente en países desarrollados. Actualmente, la terapia multidisciplinaría que incluye una extirpación quirúrgica como un tratamiento principal, una radioterapia y una quimioterapia, se han llevado a cabo. Sin embargo, ninguna mejora drástica de los efectos terapéuticos se puede obtener, y así, el establecimiento de una estrategia terapéutica novedosa es urgentemente necesaria.
El melanoma es un tipo de cáncer de la piel, que es frecuentemente llamado melanoma maligno. Entre varios tipos de cáncer de la piel, el melanoma es altamente probable que llegue a ser infiltrativo y metastático y tiene el grado más alto de malignidad, y asi es grandemente preocupante. Entre las células que constituyen la piel, varias células generan pigmento de melanina. Tales células son llamadas melanocitos. Cuando tales melanocitos llegan hacer cancerosos, ocurre el melanoma. Además, la frecuencia de ocurrencia del melanoma se ha incrementado, particularmente entre la población caucásica, como un resultado de un incremento en la exposición a los rayos ultra violeta debido a la reducción en la capa de ozono en la atmósfera causada por la destrucción ambiental . En Japón, la incidencia de melanoma varia de 1.5 a 2 personas en 100,000 en la población general. Asi, se estima que aproximadamente 1,500 a 2,000 gentes desarrollan melanoma por año. Por otra parte, los países occidentales, más de una docena de personas desarrollan melanoma en 100,000 en la población general. En particular, en Australia, veinte o más personas desarrollan tal melanoma en 100,000 en la población general, y así es conocido que la incidencia de melanoma en Australia es el más alto en el mundo. Bajo tales circunstancias, las personas quienes viven en Europa, los Estados Unidos y Australia están interesadas en el melanoma,
y ellas ponen atención a la ocurrencia del melanoma. Además, sorprendentemente, la ocurrencia del melanoma tiende a ser incrementado año tras año en el Japón asi como en países extranjeros. De acuerdo con estudios recientes, en número de muertes anual de melanoma es de aproximadamente 450 en el Japón. El melanoma se desarrolla sin considerar la edad. Sin embargo, la incidencia de esta enfermedad se incrementa para aquellos de arriba de 40 años, y es el más alto para aquellos en los años 60 y año 70. El inicio de esta enfermedad en la niñez es extremadamente raro, pero esto no significa que la enfermedad nunca se desarrolle en la niñez. Recientemente, la ocurrencia de melanoma tiende a ser incrementada en pacientes jóvenes en la edad de los años 20 y de los años 30. El melanoma se desarrolla sin considerar el sexo, y pacientes tanto hombres como mujeres sufren de esta enfermedad. En el caso de pacientes Japoneses, el sitio en el cual el melanoma es más probable que se desarrolle es la planta (la planta del pie) y tiene en cuenta 30% de todos los casos de melanoma. Como características de los pacientes Japoneses, el melanoma también se desarrolla en el pie y las porciones de uñas de los dedos. Además, como en el caso de pacientes occidentales, el melanoma se desarrolla en todas las partes de la piel, tal como el cuerpo, manos, pies, cara y cabeza. Actualmente, los métodos que pueden ser aplicados para tratar el melanoma incluyen una terapia quirúrgica, una
quimioterapia y una radioterapia. Sin embargo, como una terapia para aliviar los síntomas del cáncer metastático o el cáncer intratable, la cual la terapia referida no puede ser aplicada, una inmunoterapia para aumentar la inmunidad de un paciente canceroso al cáncer para suprimir el crecimiento del cáncer ha llegado a ser un foco de atención. Tal inmunoterapia es actualmente efectiva para algunos pacientes. Por otra parte, con el desarrollo de la biología molecular y la inmunología de tumor en recientes años, se ha revelado que las células T citotóxicas ( exterminadoras ) y las células T ayudantes reconocen péptidos generados por la degradación de proteínas altamente y específicamente expresadas en células de cáncer, que se presentan sobre las superficies de las células cancerosas o células que presentan antígeno por la vía de moléculas HLA, y que exhiben una reacción inmune para destruir tales células cancerosas. Por otra parte, un número grande de proteínas antigénicas de tumor y péptidos derivados de éstas, que estimulan tal reacción inmune para atacar los cánceres, se han identificado, y la aplicación clínica de una inmunoterapia de tumor específica de antígeno ha sido desarrollada. Las moléculas HLA clase I se expresan sobre las superficies de todas las células nucleadas en un cuerpo. Las proteínas generadas en los citoplasmas y los núcleos proporcionan péptidos generados como un resultado de que son
degradados en las células, y se expresan sobre la superficie de tales células. En la superficie de células normales, los péptidos derivados de proteínas autólogas normales enlazan a moléculas HLA clase I, y las células T del sistema inmune no reconocen ni destruyen tales péptidos enlazados a las moléculas HLA clase I. Por otra parte, en un proceso en el cual las células cancerosas se convierten a un cáncer, tales células cancerosas pueden expresar cantidades grandes de proteínas, que son difícilmente expresadas o son solamente expresadas en pequeñas cantidades sobre células normales. Si un péptido generado por la degradación en el citoplasma de tal proteína que es altamente expresada específicamente en una célula cancerosa enlaza una molécula HLA clase I y se expresa sobre la superficie de tal célula cancerosa, una célula T exterminadora reconoce el péptido y destruye solamente la célula cancerosa. Además, al inmunizar tal antígeno o péptido específico de cáncer a un cuerpo individual, es posible destruir las células cancerosas y suprimir el crecimiento de un cáncer, sin deteriorar las células normales. Esto es referido como inmunoterapia de cáncer utilizando un antígeno específico de cáncer, por otra parte, una molécula HLA clase II es principalmente expresada sobre la superficie de una célula que presenta antígeno. Tal molécula HLA clase II enlaza péptidos derivados de un antígeno específico de cáncer generado al incorporar el
antígeno especifico de cáncer desde afuera de la célula y al degradarlo en la célula, y se expresa sobre la superficie de la célula. Una célula T ayudante, que ha reconocido los péptidos enlazados a la molécula HLA clase II, se activa para generar varias citoquinas que activan otras células inmunocompetentes , para inducir o reforzar una reacción inmune contra un tumor. Así, si se puede desarrollar una inmunoterapia que se dirige a un antígeno que se expresa específicamente en un alto nivel en tal cáncer, esta puede proporcionar un método terapéutico que elimina de manera efectiva el cáncer únicamente, sin deteriorar los órganos autólogos normales. Por otra parte, se anticipa que tal inmunoterapia puede proporcionar un método terapéutico aplicable a pacientes que sufren de un cáncer de etapa terminal, para los cuales no se pueden implementar otros tratamientos. Además, si un antígeno y péptido específico de cáncer se administra en la forma de una vacuna a un humano que tiene un alto riesgo de desarrollar tal cáncer, hay una posibilidad de que el inicio del cáncer pueda ser prevenido. Primero, los presentes inventores han realizado un análisis de expresión génica de genoma amplio. Ellos han analizado 23,040 tipos de genes en tejidos de cáncer de estómago y tejidos normales utilizando un microarreglo de cDNA. Como resultado, en 11 de entre 20 casos de pacientes
con cáncer de estómago infiltrativo difuso, los inventores han identificado la proteina secretada acidica y rica en cisteina (SPARC), que es un gen altamente expresado en tejidos de cáncer de estómago, y el nivel de expresión del cual es 5 o más veces más alto que aquel de los tejidos normales (130,000 veces más alto en promedio) (Figura 1). El gen SPARC se expresa a un bajo nivel también en tejidos adiposos normales, glándula mamaria, ovario, médula espinal, testículos, útero, placenta, etc. sin embargo, el nivel de expresión del gen SPARC en cualquiera de los órganos referidos es menor que aquel de la membrana de mucosa gástrica normal por un factor de 5 veces o menor (Figura 2) . Otros investigadores ya han reportado que SPARC no es solamente altamente expresada en el cáncer de estómago infiltrativo difuso sino que también es expresada en el cáncer pancreático y el melanoma. Por otra parte, los presentes inventores han encontrado que SPARC es secretado en el suero de pacientes de melanoma, y que SPARC puede ser un marcador de tumor útil particularmente para la detección temprana de melanoma (Solicitud de Patente Japonesa No. 2004-303688; y Clinical Cáncer Research 11:8079-8088, 2005). SPARC es una proteína secretoria acidica de 43-KD que consiste de 286 aminoácidos. Esta proteína es rica en cisteina, y se mueve al núcleo durante la fase de división celular. Además, SPARC controla la interacción entre una
proteína de matriz extracelular y una célula, de modo que también puede ser asociada con el control del crecimiento celular. Puesto que SPARC es expresada en osteoblastos , trombocitos, y áreas lesionadas, se considera que esta proteína esta asociada con la reparación y reconstrucción de tejidos. Además, también se ha reportado que SPARC es altamente expresada también en cánceres tales como melanoma u osteosarcoma y en las células intersticiales de tumores, y que la expresión de SPARC se correlaciona con la prognosis, infiltración o metástasis de tumores. [Documento No de Patente 1] Ikuta Y y colaboradores, Clinical Cáncer Research 11:8079-8088, 2005. [Documento de Patente 1] Solicitud de Patente Japonesa No. 2004-303688 DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Problemas a ser Resueltos por la Invención Es un objetivo de la presente invención desarrollar un método para aumentar la inmunidad de un paciente que sufre de cáncer metastático o cáncer intratable, al cual la terapia quirúrgica, quimioterapia y radioterapia que se usan como tratamiento para tumores que expresan altamente SPARC, tal como el cáncer de estómago infiltrativo difuso, cáncer pancreático o melanoma, difícilmente pueden ser aplicados, para aliviar los síntomas de tales cánceres y para llevar a cabo un inmunoterapia que suprime el crecimiento de tales
cánceres. Es decir, es un objetivo de la presente invención identificar un péptido derivado de una proteina SPARC que es sobre expresado en el tejido de cáncer, que es capaz de inducir una fuerte respuesta inmune a los cánceres referidos sin causar fenómeno perjudicial a los pacientes de cáncer, y para aplicar el péptido identificado a una inmunoterapia de tumor. Esto es, es un objetivo de la presente invención identificar un péptido derivado de proteina SPARC que es capaz de inducir células T exterminadoras humanas y células T ayudantes que tienen reactividad a tumores, y para proporcionar un medio para llevar a cabo una inmunoterapia de tumor sobre pacientes con varios tipos de cánceres que expresan altamente SPARC. Medios para Resolver los Problemas Los presentes inventores han identificado un gen, SPARC, que es altamente expresado en el cáncer de estómago infiltrativo difuso, al realizar el análisis de microarreglo de cDNA del cáncer de estómago referido y varios tejidos normales. La expresión de SPARC se observa también en varios tipos de tejidos normales. Sin embargo, el nivel de expresión de SPARC en tejidos normales es significativamente menor que en tejidos cancerosos. Con el fin de examinar la presencia o ausencia de la inducción de la inmunidad de antitumor por las células T exterminadoras especificas de SPARC, se utilizaron ratones BALB/c que expresan moléculas Kd de ratón, las
características de la secuencia de aminoácidos del péptido enlazado del cual son idénticas a aquellas de HLA-A24 que es alelo HLA clase I más frecuente en la población Japonesa. SPARC humano tiene 95% de secuencias de aminoácidos homologa en comparación al SPARC de ratón. De esta manera se sintetizaron péptidos que consisten de secuencias de aminoácidos compartidas entre los humanos y los ratones, y que tienen una porción de enlace compartida por HLA-24 humano y Kd de ratón. Después, los ratones BALB/c (que expresaron Kd) se inmunizaron con células dendríticas derivadas de médula ósea, sobre las cuales se ha cargado tal mezcla de péptido, y los inventores investigaron si las células T exterminadoras reactivas con células de cáncer que expresan SPARC son inducidas o no inducidas. Por otra parte, con respecto a ratones que se han pre-tratado mediante el mismo método de inmunización como es descrito en lo anterior, los inventores investigaron si el crecimiento de las células de cáncer transplantadas que expresan SPARC de ratón es suprimido y el tiempo de supervivencia de los ratones es prolongado o no prolongado. Además, si o no un fenómeno perjudicial aparece junto con la ocurrencia de un fenómeno autoinmune en los ratones inmunizados con péptido también se examinó. Como resultado, se encontró que el péptido que tienen una secuencia de aminoácidos como se muestra en cualquiera de la SEQ ID NOS: 1 a 3 es capaz de inducir células T
exterminadoras que destruyen células cancerosas que expresan SPARC. Además, el crecimiento de las células cancerosas de ratón transplantadas que expresan SPARC es suprimido en ratones inmunizados con el péptido referido y de esta manera el tiempo de supervivencia de los ratones es prolongado. La presente invención se ha completado basada en estos descubrimientos . La presente invención proporciona la siguiente invención . (1) Un péptido de cualquier de los siguientes: (A) un péptido que consiste de la secuencia de aminoácidos como es mostrada en cualquiera de las SEQ ID NOS: 1 a 3; (B) un péptido que consiste de una secuencia de aminoácidos que comprende una sustitución o adición de uno o varios aminoácidos con respecto al péptido que consiste de la secuencia de aminoácidos como se muestra en cualquiera de las SEQ ID NOS: 1 a 3, y que tiene habilidad para inducir células T citotóxicas (exterminadoras). (2) Un agente de inmunoinducción para cánceres, que comprende por lo menos un tipo de péptido de (1) . (3) Un medicamento para tratar y/o prevenir tumores, que comprende por lo menos un tipo de péptido de (1) . (4) Un agente para inducir células que presentan anfigeno que tiene alta habilidad para inducir células T reactivas de tumor, que comprenden por lo menos un tipo de
péptido de ( 1 ) . (5) Un agente para inducir células T reactivas de tumor, que comprende por lo menos un tipo de péptido de (1) .
(6) Un agente para inducir células que presentan antigeno que tiene alta habilidad para inducir células T reactivas de tumor, que comprende un gen que codifica para un péptido de cualquiera de los siguientes: (A) un péptido que consiste de la secuencia de aminoácidos como se muestra en cualquiera de las SEQ ID NOS: 1 a 3, o
(B) un péptido que consiste de una secuencia de aminoácidos que comprende una sustitución o adición de uno o varios aminoácidos con respecto al péptido que consiste de la secuencia de aminoácidos como se muestra en cualquiera de las SEQ ID NOS: 1 a 3, y que tiene la habilidad para inducir células T exterminadoras . (7) Un anticuerpo contra el péptido de (1). (8) Una célula T exterminadora , una célula T ayudante, o una población de inmunocitos que comprende tales células, que es inducido utilizando el péptido de (1) . (9) Una célula que presenta antigeno, que presenta un complejo de una molécula HLA y el péptido de (1) . (10) La célula que presenta antigeno de (9) que es inducida utilizando el agente de (4) o (6). MEJOR MODO PARA LLEVAR A CABO LA INVENCIÓN (1) Péptido de la presente invención, y agente de
inmunoinducción para cánceres que comprenden el mismo El péptido de la presente invención es descrito en lo siguiente: (A) un péptido que consiste de la secuencia de aminoácidos como se muestra en cualquiera de las SEQ ID NOS: 1 a 3; o
(B) un péptido que consiste una secuencia de aminoácidos que comprende una sustitución o adición de uno o varios aminoácidos con respecto a la secuencia de aminoácidos como se muestra en cualquiera de las SEQ ID NOS: 1 a 3, y que tiene la habilidad para inducir células T exterminadoras . El término "péptido que tiene habilidad para inducir células T citotóxicas" se utiliza en la presente especificación para dar entender un péptido que tiene un actividad para estimular las células exterminadoras reactivas de tumor. Un método para obtener/producir en péptido de la presente invención no es particularmente limitado. Cualquiera de un péptido químicamente sintetizado, o un péptido recombinante producido por recombinación genética, puede ser utilizado. Cuando se obtiene un péptido químicamente sintetizado, el péptido de la presente invención puede ser sintetizado mediante un método de síntesis química tal como un método de fmoc (método de fluorenilmetiloxicarboxilo) o un método de tBoc (método de t-butiloxicarbonilo) , por ejemplo.
Además, el péptido de la presente invención también se puede sintetizar utilizando varios tipos de sintetizadores de péptido comercialmente disponibles. Cuando el péptido de la presente invención se produce en la forma de una proteina recombinante , el DNA que tiene una secuencia de nucleótidos que codifica el péptido referido como un mutante del mismo, o un homólogo del mismo es obtenido, y luego es introducido en un sistema de expresión preferido, para producir el péptido de la presente invención . Como un vector de expresión, un vector capaz de replicarse autónomamente en una célula hospedera o capaz de ser incorporada en el cromosoma de una célula hospedera de preferencia puede ser utilizado. Un vector de expresión que comprende un promotor en una posición capaz de expresar un gen que codifica para el péptido es utilizado. Además, un transformante que tiene un gen que codifica para el péptido de la presente invención se puede producir al introducir el vector de expresión referido en un hospedero. Como un hospedero, se puede utilizar cualquiera de una bacteria, levadura, una célula de animal y una célula de insecto. Un vector de expresión se puede introducir en un hospedero de acuerdo con un método conocido, dependiendo del tipo de tal hospedero . En la presente invención, se cultiva el
transformante como es producido en lo anterior, y el péptido de la presente invención luego se genera y se acumula en un cultivo. Después, el péptido de la presente invención se recolecta del cultivo, para aislar un péptido recombinante . Cuando tal transformante es una procariota tal como Escherichia coli o una eucariota tal como levadura, un medio utilizado para cultivar tales microorganismos puede ser ya sea un medio natural o un medio sintético, mientras que este contenga una fuente de carbono, una fuente de nitrógeno, sales inorgánicas y los similares que pueden ser asimilados por los microorganismos referidos, y ser capaz de llevar a cabo eficientemente el cultivo del transformante. Por otra parte, tal cultivo se puede llevar a cabo bajo condiciones que son comúnmente aplicadas para cultivar los microorganismos referidos. Después de la completación del cultivo, el péptido de la presente invención se puede aislar y purificar del cultivo del transformante de acuerdo con un método conocido de aislamiento y purificación de un péptido. El término "uno o varios aminoácidos" se utiliza en la presente especificación para dar entender generalmente 1 a 10 aminoácidos, de preferencia 1 a 8 aminoácidos, más de preferencia 1 a 5 aminoácidos, y particularmente de preferencia de 1 a 3 aminoácidos (por ejemplo, 1, 2 o 3 aminoácidos ) . Un péptido que consiste de una secuencia de
aminoácidos que comprende una suscripción o adición de uno o varios aminoácidos con respecto al péptido que consiste de la secuencia de aminoácidos como se muestra en cualquiera de las SEQ ID NOS: 1 a 3 puede se producido apropiadamente o adquirido por personas expertas en la técnica basado en la información que considera la secuencia de aminoácidos como se muestra en cualquiera de las SEQ ID NOS: 1 a 3. Es decir, un péptido que consiste de una secuencia de aminoácidos que comprende una sustitución o adición de uno o varios aminoácidos son respecto a la secuencias de aminoácidos como se muestra en cualquiera de las SEQ ID NOS: 1 a 3 y que tiene estabilidad para inducir células T citotóxicas, se puede producir mediante cualquier método dado conocido para personas expertas en la técnica, tal como la síntesis química referida, medios de ingeniería genética, o mutagénesis. Por ejemplo, la mutagénesis dirigida al sitio que es un medio de ingeniería genética es útil debido a que es un medio para introducir una mutación específica en una posición específica. Tal mutagénesis dirigida al sitio se puede llevar a cabo por un método descrito en Molecular Cloning: A laboratory Manual, 2- Edición, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY. 1989 (después en la presente abreviado como Molecular Cloning 2- Edición) , Current Protocols in Molecualr Biology, Supplement 1 to 38, John Wiley & Sons (1987-1997) (después en la presente abreviado
como Current Protocols in Molecular Biology) , etc. Como es descrito después en los ejemplos, el péptido referido de la presente invención es capaz de inducir inmunidad contra cáncer. Asi, la presente invención proporciona un agente de inmunoinducción para cánceres, que comprende el péptido de la presente invención. El agente de inmunoinducción de la presente invención utilizado para cánceres se utiliza in vitro, ex vivo, o in vivo, y de preferencia ex vivo, de modo que puede inducir células T exterminadoras , células T ayudantes, o un población de inmunocitos que comprenden tales células, para de esta manera impartir inmunidad contra cánceres. (2) Anticuerpo de la presente invención La presente invención también se relaciona a un anticuerpo que reconoce una parte o el total del péptido referido de la presente invención como un epitope (antigeno) y una célula T exterminadora inducida mediante la estimulación ex vivo o in vitro utilizando el péptido referido. En general, se ha conocido que tal célula T exterminadora exhibe una actividad antitumoral que es más fuerte que aquella de un anticuerpo. El anticuerpo de la presente invención puede ser ya sea un anticuerpo policlonal o un anticuerpo monoclonal. Tal anticuerpo se puede producir mediante un método común. Por ejemplo, un anticuerpo policlonal se puede
producir al inmunizar un mamífero o aves con el péptido de la presente invención utilizado como antígeno, luego a recolectar sangre del mamífero o aves, y luego separar y purificar un anticuerpo de la sangre recolectada. Por ejemplo, los mamíferos o aves, tales como un ratón, un hámster, un conejillo de indias, un pollo, una rata, un conejo, un canino, una cabra, una oveja, un bovino o un caballo, pueden ser inmunizados. Tal método de inmunización es conocido para las personas expertas en la técnica. Por ejemplo, un antígeno se puede administrar de 2 a 3 veces en intervalos de 7 a 30 días. Como una dosificación, aproximadamente 0.05 a 2 mg de antígeno se puede administrar una vez, por ejemplo. Una ruta de administración es particularmente limitada, y la administración subcutánea, administración intracutánea, administración intraperitoneal , administración intravenosa, administración intramuscular, etc., se puede seleccionar, como sea apropiado. Por otra parte, un antígeno se puede disolver en una solución reguladora adecuada que contiene una adyuvante, por ejemplo, en una solución reguladora adecuada que contiene un adyuvante comúnmente utilizado tal como un adyuvante de Freund completo o hidróxido de aluminio, y este puede ser utilizado. Así el mamífero o aves inmunizadas se reproduce durante un cierto período de tiempo. Después, si el título de anticuerpos se incrementa, un refuerzo se puede llevar a cabo
utilizando 100 a 1,000 µ? de antigeno, por ejemplo. Uno o dos meses después de la inmunización final la sangre se recolecta del mamífero o aves inmunizadas. La sangre así recolectada (antisuero policlonal) luego se separa y se purifica mediante un método ordinario que incluye la centrifugación, precipitación utilizando sulfato de amonio polietilenglicol , cromatografía tal como la . cromatografía de filtración en gel, cromatografía de intercambio iónico, o cromatografía de afinidad, etc. (para obtener un anticuerpo policlonal que reconoce el péptido de la presente invención. Por otra parte, un anticuerpo monoclonal se puede obtener al preparar un hibridoma. Por ejemplo, tal hibridoma se puede obtener mediante la fusión celular de una célula que genera antígeno y una célula de mieloma. Un hibridoma que genera el anticuerpo monoclonal de la presente invención se puede obtener mediante el siguiente método de fusión celular. Como una célula que genera anticuerpo como una célula del bazo, una célula del ganglio linfático, un linfocito B, y los similares obtenidos del animal inmunizado es utilizada. Como un antígeno, el péptido de la presente invención es utilizado. Como un animal a ser inmunizado, se puede utilizar un ratón, una rata o los similares. Un antígeno se administra a tal animal de acuerdo con un método ordinario. Por ejemplo, una suspensión o líquido emulsificado que comprende un adyuvante tal como un adyuvante de Freund
completo o adyuvante de Freund incompleto y el péptido de la presente invención utilizado como un antigeno se administra a un animal por la vía de la administración intravenosa, administ ación subcutánea, administración intracutánea, administración intraperitoneal, etc. varias veces, para inmunizar el animal. Después, una célula que genera anticuerpo tal como una célula del bazo se obtiene del animal inmunizado, y la célula del bazo asi obtenida luego se fusiona con una célula de mieloma de acuerdo con un método conocido (G Kohler y colaboradores, Nature, 256495 (1975)), para de esta manera producir un hibridoma. Ejemplo de una cepa de células de mieloma utilizada en la fusión celular incluyen una cepa P3X63Ag8, una capa P3U1 y un. acepa Sp2/0, en el caso de un ratón. Cuando tal fusión celular se lleva a cabo, un promotor de fusión tal como polietilenglicol o virus Sendai es utilizado. Para la selección de un hibridoma después de la completación de la fusión celular, se utiliza un medio de hipoxantina aminopterina timidina (HAT) de acuerdo con un método ordinario. El hibridoma obtenido como un resultado de la fusión celular se clona mediante un método de dilución limitante. Además, como sea necesario, la clasificación se lleva a cabo mediante un inmunoensayo de enzima utilizando el péptido de la presente invención, para obtener una cepa de células que genera un anticuerpo monoclonal reconoce
específicamente el péptido de la presente invención. Con el fin de producir un anticuerpo monoclonal de interés del hibridoma así obtenido, el hibridoma puede ser cultivado mediante un método de cultivo de células común o método de formación de ascitis, y el anticuerpo monoclonal de interés luego puede ser purificado del sobre nadante de cultivo o ascitis. El anticuerpo monoclonal puede ser purificado del sobrenadante de cultivo o ascitis de acuerdo con un método ordinario. Por ejemplo, el fraccionamiento de sulfato de amonio, filtración en gel, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de afinidad, y otros métodos pueden ser combinados como sea apropiado y utilizado. Por otra parte, los fragmentos del anticuerpo referido también se incluyen en el alcance de la presente invención. Ejemplos de tal fragmento de anticuerpo incluyen un fragmento F(ab')2 y un fragmento Fab' . (3) Célula T exterminadora , célula T ayudante o población de inmunocitos que comprenden tales células La presente invención también se relaciona a una célula T exterminadora, una célula T ayudante o una población de inmunocitos que comprende tales células, que es inducida por la estimulación in vitro utilizando el péptido de la presente invención. Por ejemplo, cuando el linfocito de la sangre periférica o linfocitos de infiltración de tumor se estimulan in vitro con el péptido de la presente invención,
las células T activadas que exhiben reactividad con tumor son inducidas. Asi las células T activadas pueden ser utilizadas de manera efectiva para una inmunoterapia adoptiva de cáncer. Además, el péptido de la presente invención se deja que sea expresado en células dendriticas que son fuertes células que presentan antigeno in vivo o in vitro, y células dendriticas que expresan el péptido antigénico luego se administran para inducir una respuesta inmune a los tumores. De preferencia, una célula T exterminadora , una célula T ayudante una población de inmunocitos que comprende tales células se puede inducir mediante la estimulación ex vivo o in vivo utilizando el péptido en la presente invención y un inmunoestimulador . Ejemplos de tal inmunoestimulador utilizado en la presente incluye un factor de crecimiento celular y una citoquina. La célula T exterminadora, célula T ayudante o población de inmunocitos que comprenden tales células asi obtenida se transfiere a un cuerpo, de modo que el tumor puede ser suprimido y ese cáncer puede ser prevenido y/o tratado . Además, utilizando el péptido de la presente invención, una célula T exterminadora, una célula T ayudante o una población de inmunocitos que comprende tales células, que es capaz de suprimir el crecimiento del tumor como es descrito en lo anterior, puede ser producido. Por
consiguiente, la presente invención proporciona una solución de cultivo de células que comprende células T reactivas con tumor y el péptido de la presente invención. Utilizando tal solución de cultivo de células, una célula T exterminadora , una célula ayudante o una población de inmunocitos que comprende tales células, que es capaz de suprimir el crecimiento del tumor, puede ser producida. Todavía adicionalmente , la presente invención también proporciona un equipo de cultivo de células para producir una célula T exterminadora, una célula T ayudante y una población de inmunocitos que comprende tales células, que comprende la solución de cultivo de células referida y un recipiente de cultivo de células. (4) Medicamento de la presente invención para tratar y /o prevenir tumor (vacuna para cáncer) Puesto que el péptido de la presente invención es capaz de inducir las células T exterminadora específicas de célula cancerosa, éste se puede esperar como un agente para tratar y/o prevenir cáncer. Por ejemplo, la bacteria tal como BCG (Bqcillus Calmette-GruErin) que se transformo con el DNA recombinante producido al incorporar un gen que codifica para el péptido de la presente invención en un vector adecuado, o virus tal como el virus de vaccínea, en el genoma del cual el DNA que codifica para el péptido de la presente invención sea incorporado, se puede utilizar de manera efectiva como una
vacuna viva para tratar y/o prevenir cánceres humanos. Se va a observar que la dosificación y método de administración de una vacuna para cáncer son los mismos como aquellos en el caso de una vacunación ordinaria para viruela o vacunación de BCG. Es decir, el DNA que codifica para el péptido de la presente invención (que se utiliza como se encuentra, o está en la forma de DNA de plásmido incorporado en un vector de expresión) , o un virus recombinante o bacteria recombinante que cpmprende el DNA referido, puede ser administrado como una vacuna para cáncer a mamíferos incluyendo un humano, directamente o en un estado donde es dispersado en un adyuvante. Del mismo modo, el péptido de la presente invención también se puede administrar como una vacuna para cáncer en un estado donde es dispersado en un adyuvante. Ejemplos de un adyuvante utilizado en la presente invención incluyen un adyuvante de Freund incompleto, BCG, trehalosa dimeticolato (TDM) lipopolisacárido (LPS) , un adyuvante de alumbre y un adyuvante de sílice. Desde el punto de vista de la habilidad para inducir el anticuerpo, de preferencia se utiliza un adyuvante de Freund incompleto (IFA) . El tipo de un cáncer no es particularmente en la presente especificación. Ejemplos específicos de un cáncer incluyen cáncer de estómago, cáncer de colon, cáncer
esofágico, cáncer pancreático, cáncer hepático, cáncer de vesícula biliar, colangiocarcinoma , cáncer de pulmón, cáncer de seno, cáncer de tiroides, melanoma (melanoma maligno), cáncer de la piel, osteosarcoma, feocromocitoma , cáncer de cabeza y cuello, tumor cerebral, leucemia mielógena crónica, leucemia mielógena aguda, linfoma maligno, cáncer de riñon, cáncer de vejiga, cáncer prostético, cáncer testicular, cáncer uterino, cáncer ovárico y sarcoma de tejido blando. De estos, los cánceres que altamente expresan SPARC, tal como cáncer de estómago (en particular, cáncer de estómago infiltrativo difuso) , cáncer pancreático y melanoma (melanoma maligno) son ejemplos típicos. El péptido de la presente invención actúa como un epítope de célula T para inducir una célula T exterminadora, o célula T ayudante específica de célula cancerosa. Así, el péptido de la presente invención es útil como un agente para prevenir y/o tratar cánceres humanos. Además, si el anticuerpo de la presente invención es capaz de inhibir la actividad de SPARC como un antígeno de cáncer, este también es útil como un agente para prevenir y/o tratar cánceres humanos. Como una utilización actual, el péptido o péptido de la presente invención se puede administrar como un producto de inyección, directamente o conjuntamente con un portador y/o diluyente farmacéuticamente aceptable, y como sea necesario, también junto con las sustancias auxiliares
mencionadas enseguida. Por otra parte, el péptido de anticuerpo de la presente invención también se puede administrar mediante un método tal como rociado, por la vía de la adsorción transdérmica a través de la mucosa. El término "portador" se utiliza en la presente para dar a entender albúmina de suero humano, por ejemplo. Además, como un diluyente, se puede utilizar PBC, agua destilada o los similares . Como una dosificación, el péptido anticuerpo de la presente invención se puede administrar dentro del intervalo de entre 0.01 y 100 mg por adulto por administración. Sin embargo, la dosificación no está limitada al intervalo referido. La forma de dosificación no esta particularmente limitada, cualquiera que sea. Un producto deshidratado por congelación, o un gránulo producido al adicionar un excipiente tal como azúcar también puede ser disponible. Ejemplos de una sustancia auxiliar, que se puede adicionar al agente de la presente invención para aumentar la actividad de inducción de célula T reactiva con tumor, incluye: muramil-dipéptido (MDP) ; componentes bacterianos tal como las bacterias BCG; ISCOM descrito en Nature, Volumen. 344, página 873 (1990); saponina QS-21 descrita en J. Immunol. Volumen 148, página 1439 (1992); liposoma; y óxido de aluminio. Además, inmunuestimuladores tal como lentinan, esquisofilan o Picibanil también se pueden utilizar como
sustancias auxiliares. Otros ejemplos de productos utilizados en la presente como sustancias auxiliares incluyen: citoquinas para aumentar el crecimiento y diferenciación de células T, tales como IL-2, IL,4, IL-12. IL-1, IL-6 o TNF; a galactosilceramida para activar las células NKT; CpG enlaza a un receptor similar a Tol para activar un sistema inmune natural; y lipopolisacáridos (LPS) . Además, el péptido de antigeno referido se adiciona in vitro a células recolectadas de un paciente positivo de HLA-A24 o células halogeneicas aisladas de cualquier gram es positivo de HLA-A24, seguido por la presentación de antigenos de las células. Después, la célula se administra en el vaso sanguíneo del paciente, de modo que las células T exterminadoras pueden ser efectivamente inducidas en el cuerpo del paciente. Además, el presente péptido se adiciona a los linfocitos de sangre periférica de un paciente, y la mezcla obtenida luego se cultiva in vitro. De esta manera, las células T exterminadoras se pueden inducir in Vitro, y luego se pueden regresar al vaso sanguíneo del paciente. Tal terapia que involucra la transferencia de células ya se ha llevado a cabo con un método para tratar cánceres, y de esta manera es un método bien conocido para las personas expertas en la técnica. Al introducir el péptido de la presente invención en un cuerpo, las células T reactivas con tumor son
inducidas, y como un resultado, se puede anticipar un efecto antitumoral. Por otra parte, cuando los linfocitos son estimulados por el péptido de la presente invención ex vivo o in vivo, las células T activadas son inducidas. Las células T activadas se inyectan en un área afectada. Asi, esta técnica se puede utilizar de manera efectiva para una inmunoterapia adoptiva . La presente invención será descrita adicionalmente en los siguientes ejemplos. Sin embargo, estos ejemplos, no se proponen para limitar el alcance de la presente invención. EJEMPLOS [Ejemplo 1] (1) Análisis de microarreglo de cDNA Con respecto al tejido canceroso extirpado de un paciente con cáncer de estómago infiltrativo difuso, un tejido canceroso se distinguió de tejidos no cancerosos mediante la microdisección de captura de láser, y ambas de las porciones cancerosas y no cancerosas luego se recortaron. Después, el RNA se extrajo de cada tejido. Cuando el cDNA se sintetizó de tale RNA mediante una reacción de transcripción inversa, el cDNA generado del tejido canceroso se marcó fluorescentemente con Cy5, y el cDNA generado del tejido no canceroso se marcó fluorescentemente Cy3. Subsecuentemente, las dos preparaciones de cDNA se mezclaron para obtener de DNA objetivo. La hibridación se llevó a cabo sobre una
platina de vidrio sobre la cual se ha arreglado el cDNA de sonda, y los enlaces no específicos luego se eliminaron mediante lavado. Después, las imágenes de fluorescencia obtenidas después de la hibridación se capturaron utilizando una cámara CCD o un escáner de fluorescencia, y luego se visualizaron con colores falsos (Cy5: rojo; Cy3 : verde). Al mismo tiempo, la relación de los dos tipos de intensidad de fluorescencia (R/G) se calculó, y esta fue indicada como un perfil de expresión génica. Por otra parte, la expresión de 23,040 tipos de genes en las porciones cancerosas y no cancerosas de 20 pacientes con cáncer de estómago infiltrativo difuso se sometió a investigación comparativa, y se seleccionaron 15 tipos de genes de los cuales la relación de expresión en el tejido canceroso/tejido no canceroso fue 5 o más grandes (Figura 1). Subsecuentemente, se analizó el perfil de expresión de los 23,040 tipos de genes en los tejidos normales de 29 órganos (incluyendo 4 órganos embrionales) y se seleccionaron de los genes de los cuales el nivel de expresión fue bajo en tales órganos normales. En el caso de SPARC, que los inventores seleccionaron como un antígeno de tumor en este experimento, la relación de expresión de porciones cancerosas/no cancerosas fue 5 o más grande (133,359 veces en promedio) en 11 de entre 20 pacientes con cáncer de estómago infiltrativo difuso. SPARC expreso en algunos tejidos
normales. Pero los niveles de expresión en tales tejidos no cancerosos fueron significativamente menores que aquellos en tejidos cancerosos (Figura 2). [Ejemplo 2] (2) Selección de repertorios de péptidos SPARC restringidos en HLA-A24 de humano y Kd de ratón En el SPARC de humano y de ratón que tiene una homología de 95%, los siguientes péptidos se seleccionaron del fragmento de SPARC del cual las secuencias de aminoácidos fueron compartidas entre humanos y ratones. Las secuencias de aminoácidos totales de las moléculas SPARC se buscaron basado en la información conocida que considera secuencias de aminoácidos comúnmente observadas en péptidos que tienen fuerte afinidad de enlace a ambas moléculas HLA-A24 de humano y Kd de ratón. Los repertorios de péptidos que se supusieron que tienen alta afinidad de enlace para los dos tipos de moléculas se seleccionaron la utilizar un programa de computadora. Como resultado, 4 tipos de péptidos se seleccionaron como péptidos candidatos (Tabla 1) . Tabla 1. Péptido derivados de SPARC que tienen posiblemente afinidad de enlace a ambas moléculas HLA-A24 de humano y Kd de ratón Péptido Secuencia Posición Registro de Enlace de Inicio A2 Kd
SPARC Kd-1 DYIGPC YI 143 75 400
SPARC Kd-2 HFFATKCTL 123 20 1382
SPARC Kd-3 EFPLRMRD L 161 30 960
SPARC Kd-4 MYIFPVH QF 225 210 120
Predicho por htt : //bimas . dcrt . nih . gov/cgi-bin/ken paker comboform SPARC Kd-1:SEQ ID ??:1 SPARC Kd-3:SEQ ID NO: 2 SPARC Kd-4:SEQ ID NO : 3 (3) Vacuna de célula dendrítica (DC) Células dendriticas derivadas de médula ósea (BM-DC) se indujeron de células de médula ósea derivadas de médula ósea de BALBc la utilizar GM-CSF como es descrito previamente por los inventores (Nakatsura, T y colaboradores, Clin Cáncer Res 10, 8630-8640, 2004). Asi las B -DC obtenidas se cultivaron con una mezcla de los 4 tipos de péptidos seleccionados como es descrito en lo anterior a una concentración de 10 µ? durante 2 horas, y las BM-DC pulsadas con péptido (5 x 105 células) luego se administraron intraperitonealmente a cada ratón. Después de un intervalo de una semana, las mismas BM-DC pulsadas con péptidos se administraron al ratón dos veces, de modo que el ratón fue fuertemente inmunizado. Después, las células de bazo del ratón se recuperaron y se evaluó la inducción de células T exterminadoras . Con el fin de analizar estrictamente la inducción de las células T exterminadoras derivadas de las células CD8+T después de la recolección del bazo, las células
CD4+T se eliminaron de las células del bazo recolectadas, utilizando cuentas MACS y las células restantes luego se utilizaron para el análisis. Los siguientes protocolos se utilizaron para la generación y caracterización de las células T exterminadoras especificas de SPARC (el dia de recuperación de las células del bazo del ratón inmunizado se definió como dia 0) Dia-21 (1) GM-CSF se adicionó a las células de médula ósea de un ratón BALB/c, para iniciar la inducción de las células dendriticas derivadas de médula ósea (después en la presente referidas como BM-DC) . Dia-14 (2) Una mezcla de los 4 tipos de péptidos SPARC se adicionó a las BM-DC inducidas, y 2 horas después, 5 x 105 células se administraron intraperitonealmente a cada ratón. Las etapas (1) y (2) se repitieron dos veces una semana si y otra no. Dia 0 Las células del bazo del ratón BALB/c inmunizado se recuperaron. Las células co-cultivaron con BM-DC prepulsadas con cada péptido SPARC durante 2 horas. Después, las células resultantes co-cultivaron durante 6 días. Dia 6 Con el fin de detectar las células T exterminadoras que reconocen específicamente los péptidos SPARC, se llevó a cabo un ensayo de liberación de Cr. Las células T2Kd, una línea de células RL macho 1, una línea de células Meth A, y una línea de células BALB/T3 se seleccionaron como células de tumor
objetivo para las células T exterminadora . (4) Análisis de los efectos citotóxicos de las células T exterminadoras especificas de SPARC sobre células de tumor mediante el ensayo de liberación de Cr La actividad citotóxica de las células T exterminadoras especificas de SPARC inducidas sobre células de tumor se analizó como sigue. La célula T2Kd es una linea de células obtenida al introducir un gen Kd en una linea de células T2 de ratón que carece de la expresión de un gen TAP. Solamente en un caso cuando un péptido adicionado desde afuera enlaza a una molécula MHC clase I debido a la deficiencia de TAP, la expresión de un complejo de la molécula MHC clase I y el péptido es establemente expresada sobre la superficie de la célula. Una linea de células RL macho 1 es células leucémicas de célula T derivadas de ratón BALB-c, y no expresa SPARC. Los dos tipos anteriores de células no expresan SPARC. Por otra parte, una linea de células Meth A y una linea de células BALB/3T3 son lineas de células de fibrosarcoma y lineas de células de fibroblasto derivadas de ratón BALB/c, respectivamente. Ambas de estas lineas de células expresan SPARC. Las lineas de células referidas fueron marcadas con cromo radioactivo (Cr) , y luego se cultivaron con las células T exterminadoras referidas durante 4 horas. Después, se recuperó un sobrenadante de cultivo, y la cantidad de Cr radioactivo liberado de las
células muertas se cuantificó, de modo que se detectó la actividad citotóxica . Como resultado, no se observó citotoxicidad de las células T2Kd y las células RL macho 1, que no expresa SPARC. Sin embargo, se observó citotoxicidad específicamente a las células T2Kd, que expresaron péptidos SPARC en el contexto de la molécula Kd sobre la superficie la cargar los péptidos
SPARC Kd 1, 3 y 4, y también a eth A y BALB/3T3, que espontáneamente expresaron SPARC (Figura 3). [Ejemplo 3] (5) Inducción de inmunidad antitumoral en ratones BALB/c mediante la inmunización con el péptido SPARC (Método) BM-DC se cultivó con una mezcla de péptidos SPARC Kd-1, 3 y 4 (10 µ? para cada uno) durante 2 horas. Después, 5 x 105 células se administraron intraperitonealmente a cada ratón. Después de un intervalo de una semana, una BM-DC cargada con péptidos se administró a los ratones de la misma manera, de modo que el ratón se inmunizó dos veces en total. Siete días después, una línea de células de fibrosarcoma de ratón, Meth A (1 x 106 células), que expresa altamente SPARC de ratón, se transplantó subcutáneamente al ratón. Así, se examinaron el crecimiento del tumor y el tiempo de supervivencia del ratón. (Resultados)
Los resultados se muestran en la Figura 4. La administración preventiva de BM-DC pulsada con péptido SPARC indujo la inhibición del crecimiento de la eth A subcutáneamente transplantada e indujo una prolongación del tiempo de supervivencia del ratón. CAMPO DE APLICACIÓN INDUSTRIAL
HLA-A24 (A*2402) es el alelo de HLA clase I más frecuente, poseído por aproximadamente 60% de los Japoneses. Las porciones estructurales de los péptidos enlazados a las moléculas Kd del ratón BALB/c es significativamente similar a aquellas de los péptidos enlazados a las moléculas HLA-A24 de humano. Por consiguiente, se reveló que, cuando un ratón BALB/c es inmunizado con un cierto péptido, si el péptido enlaza a la molécula Kd y de esta manera induce células T exterminadoras , y si las células T exterminadoras destruyen células cancerosas que expresan un complejo del péptido y la molécula Kd, es altamente posible que el péptido también enlace a HLA-A24 e induzca células T exterminadoras de humano que puedan destruir células cancerosas. Por lo tanto, el péptido de la presente invención puede ser aplicable a una inmunoterapia para pacientes con cáncer de estómago infiltrativo difuso, cáncer pancreático y melanoma, quienes poseen HLA-A24. Se anticipa que el QOL de los pacientes se puede mejorar la suprimir el crecimiento a la progresión de tales cánceres mediante la inmunoterapia de cáncer basada en
péptido SPARC. BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La Figura 1 muestra el grado de expresión de los 15 genes superiores que se expresaron en tejidos de cáncer de estómago a un nivel más alto que en la membrana mucosal del estómago normal, que se identificaron al realizar el análisis de microarreglo de cDNA sobre 20 pacientes con cáncer de estómago infiltrativo difuso. Tomando en consideración los resultados obtenidos asi como los resultados del análisis de microarreglo de cDNA de tejidos normales como es descrito enseguida, de los 15 genes referidos, la proteina secretada acidica y rica en cisteina (SPARC) específicamente sobre expresada en un tejido canceroso se seleccionó como el antígeno específico de cáncer mucho más ideal en el cáncer de estómago infiltrativo difuso. La Figura 2 muestra los resultados obtenidos al analizar la expresión de SPARC en 25 tipos de órganos de adultos principales y en 4 tipos de órganos embrionales, utilizando un microarreglo de cDNA. La expresión del gen SPARC se observó aun en algunos tejidos normales, pero el nivel de expresión en tales tejidos normales fue significativamente menor que aquel en un tejido canceroso. La Figura 3 muestra la citotoxicidad de las células de tumor positivas de SPARC mediante CTL que se indujo utilizando un péptido epítope de SPARC Kd-1, kd-3 o Kd-4
restringido en Kd de ratón en ratones BALB/c. La Figura 4 muestra la supresión del crecimiento de las células de cáncer Meth A subcutáneamente transplantadas y la extensión del tiempo de supervivencia de los ratones BALB/c mediante la pre-administración de células dendriticas derivadas de médula ósea (BM-DC) cargadas con una mezcla de péptidos SPARC Kd-1, Kd-3 y Kd-4.