WO2007145318A1 - Sparc由来の癌拒絶抗原ペプチド及びこれを含む医薬 - Google Patents

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Yasuharu Nishimura
Yoshiaki Ikuta
Shuichi Nakatsuru
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Kumamoto University
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Definitions

  • the present invention relates to a novel peptide effective as a cancer vaccine for cancers that highly express SPARC such as gastric cancer, spleen cancer and malignant melanoma (melanoma), and treatment and Z or prevention of tumors containing the peptide. It is related with the medicine for.
  • Gastric cancer has a higher prevalence in Asian countries such as Japan and China than in Europe and the United States. Gastric cancer can be detected at an early stage due to the spread of medical examinations, gastrointestinal endoscopy equipment, and advances in examination technology, and the number of patients is decreasing. However, it still accounts for the second largest cause of death of Japanese malignant neoplasms and still accounts for a high percentage of deaths.
  • diffuse (skills) gastric cancer occurs in younger people than other gastric cancers (adenocarcinoma) and has a poor prognosis due to the tendency of cancer progression, metastasis, and peritoneal dissemination. It is urgent to establish a new treatment for Skills gastric cancer because it is often impossible to perform surgical resection at the time of diagnosis, and even if it can be removed, there are many recurrences after treatment.
  • Melanoma is a type of skin cancer called malignant melanoma, and is very feared as a highly malignant cancer with a very strong tendency to infiltrate and metastasize.
  • malignant melanoma a type of skin cancer
  • melanin pigment a cell that produce melanin pigment
  • melanocytes the ability to call these cells pigment cells (melanocytes).
  • Melanoma is also increasing in frequency, particularly in whites, due to increased exposure to ultraviolet radiation due to the depletion of the ozone layer in the atmosphere due to environmental destruction.
  • the incidence of melanoma in Japan is said to be about 1.5 to 2 per 100,000 population, and it is estimated that it will occur from 1500 to 2000 per year. In Europe and the United States, it is said that there are more than 10 outbreaks per 100,000 population, and in Australia, it is said that there are over 20 outbreaks per 100,000 population, the highest number in the world! For that reason, Westerners and Australians are interested in melanoma and paying attention to the occurrence of melanoma. Surprisingly, the incidence of melanoma has been increasing year by year both in foreign countries and in Japan. A recent survey shows that there are around 450 deaths per year from this disease in Japan.
  • Melanoma occurs in people of all ages, but it occurs more often when people are over 40 years old, with the highest number in the 60s to 70s. Although the incidence of children is very small, it does not mean that they do not occur, and there is a tendency that young people in the 20s to 30s have been increasing recently. Gender tends to occur in both men and women, especially those who are more likely to be in either. The area where Japanese melanoma is likely to occur accounts for about 30%, where the sole of the foot (the back of the foot) is the most common. A feature of the Japanese is that they can do a lot on the toes and fingernails. In addition, like Westerners, body, hands, feet, face, It occurs on any skin, such as the head.
  • cytotoxic (killer) T cells and helper T cell power are presented on the surface of cancer cells or antigen-presenting cells via HLA molecules. It was clarified that it recognizes a peptide formed by degrading a protein that is highly expressed specifically in cancer cells and shows an immune reaction that destroys cancer cells. In addition, many tumor antigen proteins and peptides derived from them that stimulate the immune response that attacks such cancers have been identified, and clinical application of antigen-specific tumor immunotherapy is underway. .
  • HLA class I molecules are expressed on the surface of all nucleated cells of the body. Proteins produced in the cytoplasm and nucleus are bound to peptides produced by degradation in the cell, and the cell surface Expressed in On the surface of normal cells, peptides derived from normal self proteins are bound to HLA class I molecules, which are not identified and destroyed by T cells of the immune system. On the other hand, cancer cells are in the process of becoming cancerous and may be expressed in a large amount of protein with little or no expression in normal cells. Peptides produced by degrading proteins specifically expressed in cancer cells in the cytoplasm bound to HLA class I molecules and expressed on the surface of cancer cells are recognized by killer T cells. Only destroy cancer cells.
  • cancer immunotherapy using a cancer-specific antigen.
  • HLA class II molecules are mainly expressed on the surface of antigen-presenting cells, and bind to peptides derived from cancer-specific antigens that are formed by antigen-presenting cells taken from outside the cells and degraded in the cells. Expressed in Recognizing this, helper T-cells are activated and produce various site forces that activate other immunocompetent cells, thereby inducing or enhancing an immune response against the tumor.
  • the present inventors previously analyzed the expression of 23,040 genes of genome-wide in gastric cancer tissue and normal tissue using a cDNA microarray. As a result, 11 out of 20 patients with diffuse invasive gastric cancer were more than 5 times (average ⁇ 10 million) in gastric cancer tissue compared to normal gastric mucosa, and the same as fc An acidic and ncn in cysteine (SPA RC) was identified.
  • Figure 1 The SPARC gene showed mild expression in normal adipose tissue, mammary gland, ovary, spinal cord, testis, uterus, placenta, etc., but all were less than 5 times lower than normal gastric mucosa. ! It was expressed (Fig. 2).
  • SPARC is highly expressed not only in diffuse invasive gastric cancer but also in spleen cancer and melanoma. Furthermore, the inventors have found that SPARC is secreted in the serum of melanoma patients and can be a useful tumor marker particularly for early detection of melanoma (Japanese Patent Application No. 2004-303688; and Clini cal Cancer). Research 11: 8079-8088, 2005).
  • SPARC is a 43 KD acidic secreted protein consisting of 286 amino acids, rich in cysteine, and translocated to the nucleus during cell division. SPARC is also a protein involved in regulating cell growth by regulating the interaction between extracellular matrix proteins and cells. Since it is expressed in osteoblasts, platelets, and wound sites, it is thought to be involved in tissue repair and reconstruction. Furthermore, it has been reported that high expression in cancers such as melanoma and osteosarcoma, and tumor stromal cells, and that SPARC expression correlates with tumor prognosis, invasion or metastasis.
  • Non-Patent Document 1 Ikuta Y et al., Clinical Cancer Research 11: 8079-8088, 2005.
  • Patent Document 1 Japanese Patent Application 2004-303688
  • the present invention has been implemented as a treatment method for tumors that highly express SPARC, such as diffuse invasive gastric cancer, spleen cancer, and melanoma! Metastatic cancer, which is difficult to treat with surgical therapy, chemotherapy, and radiation therapy.
  • SPARC such as diffuse invasive gastric cancer, spleen cancer, and melanoma! Metastatic cancer
  • the development of a means for immunotherapy that suppresses cancer growth by strengthening the immunity of cancer patients to cancer is an issue to be solved. That is, the present invention identifies a peptide derived from a S PARC protein that is highly expressed specifically for cancer and can induce a strong immune response to the above cancer without causing adverse events in cancer patients.
  • the problem to be solved is to apply this to tumor immunotherapy.
  • the present invention identifies human killer T cells that are reactive to tumors, and SPARC protein-derived peptides that can induce helper T cells, and targets tumors of various cancers that highly express SPARC. It is an issue to be solved to provide a means to enable immunotherapy.
  • the present inventors have identified a gene SPARC that is highly expressed in diffuse invasive gastric cancer by cDNA microarray analysis of diffuse invasive gastric cancer. SPARC expression is also observed in some normal tissues, but is significantly lower than in cancerous areas.
  • SPARC-specific killer T cells characterized for amino acid sequence of the peptide binding is identical to the most frequent HLA-A24 in Japanese mouse K d BALB / c mice expressing molecules were used.
  • a peptide with a common amino acid sequence in both was synthesized with a binding motif common to human HLA-A 24 and mouse Kd . .
  • mice Kd expression
  • mice pretreated by the same immunization method it was examined whether the growth of transplanted mouse SPARC-expressing cancer cells was suppressed and the survival period was prolonged.
  • mice pretreated by the same immunization method it was examined whether the growth of transplanted mouse SPARC-expressing cancer cells was suppressed and the survival period was prolonged.
  • the possibility of adverse events appearing in the mice immunized with the peptides as observed in the autoimmune phenomenon As a result, the peptide consisting of the amino acid sequence shown in any of SEQ ID NOs: 1 to 3 destroyed SPARC-expressing cancer cells. It was confirmed that in mice immunized with these peptides, the proliferation of transplanted mouse SPARC-expressing cancer cells was suppressed and the survival period was prolonged.
  • the present invention has been completed based on these findings.
  • (B) A peptide having an amino acid sequence ability in which one or several amino acids are substituted or added to the peptide having an amino acid sequence ability shown in any one of SEQ ID NOs: 1 to 3, and having an ability to induce killer T cells.
  • An immunity-inducing agent for cancer comprising at least one peptide according to (1).
  • a pharmaceutical for tumor treatment and Z or prevention comprising at least one peptide according to (1).
  • An agent for inducing an antigen-presenting cell having a tumor-reactive T cell-inducing ability comprising at least one peptide according to (1).
  • An agent for inducing tumor-reactive T cells comprising at least one peptide according to (1).
  • a drug for inducing an antigen-presenting cell having a tumor-reactive T cell-inducing ability comprising a gene encoding any of the following peptides.
  • (B) A peptide having an amino acid sequence ability in which one or several amino acids are substituted or added to the peptide having an amino acid sequence ability shown in any one of SEQ ID NOs: 1 to 3, and having an ability to induce killer T cells.
  • the peptide of the present invention is any of the following peptides.
  • the peptide having the ability to induce cytotoxic T cells in the present specification means a peptide having T cell-inducing activity for stimulating killer T cells.
  • the method for obtaining the peptide of the present invention 'production method is not particularly limited, and either a chemically synthesized peptide or a recombinant peptide prepared by a gene recombination technique may be used.
  • the peptide of the present invention can be synthesized. Moreover, the peptide of this invention can also be synthesize
  • DNA having a base sequence encoding the peptide, or a mutant or homologue thereof is obtained and introduced into a suitable expression system. Can be produced.
  • the expression vector preferably has a force capable of autonomous replication in a host cell, or a position capable of expressing a gene encoding a peptide as long as it can be inserted into the host cell chromosome.
  • the one containing a promoter is used.
  • a transformant having a gene encoding the peptide of the present invention can be prepared by introducing the above expression vector into a host.
  • the host may be any of bacteria, yeast, animal cells, and insect cells, and the introduction of the expression vector into the host may be performed by a known method according to each host.
  • the transformant produced as described above is cultured, the peptide of the present invention is produced and accumulated in the culture, and the peptide of the present invention is collected from the culture, Recombinant peptides can be isolated.
  • the medium for cultivating the product may be a natural medium or a synthetic medium as long as it contains a carbon source, a nitrogen source, inorganic salts, etc. that can be assimilated by the microorganism and can efficiently culture the transformant! / ⁇ .
  • the culture conditions may be the same as those usually used for culturing the microorganism.
  • ordinary methods for peptide isolation and purification may be used.
  • one or several amino acids generally refers to 1 to: LO amino acids, preferably 1 to 8 amino acids, more preferably 1 to 5 amino acids, especially Preferably it means 1 to 3 amino acids (for example 1, 2 or 3 amino acids).
  • the peptide consisting of the amino acid sequence shown in any one of SEQ ID NOS: 1 to 3 is any one of SEQ ID NOS: 1 to 3.
  • a person skilled in the art can appropriately produce or obtain the amino acid sequence based on the amino acid sequence information described in. That is, in the amino acid sequence shown in any one of SEQ ID NOs: 1 to 3, a peptide having an amino acid sequence in which one or several amino acids are substituted or added, and having the ability to induce cytotoxic T cells is the above-mentioned chemical synthesis. It can also be produced by any method known to those skilled in the art, such as genetic engineering techniques or mutagenesis.
  • site-directed mutagenesis which is one of genetic engineering techniques, is useful because it can introduce a specific mutation at a specific position.
  • Molecular Cloning A laboratory Mannual, 2 Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY., 1989, hereinafter abbreviated as Molecular Cloning 2nd Edition), Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1-38, John Wiley & Sons (1987-1997) Current 'protocols' in 'molecular' (abbreviated as biology), etc.
  • the peptide of the present invention described above can induce immunity against cancer, as shown in Examples below. Therefore, according to this invention, the immunity induction agent with respect to cancer containing the peptide of this invention is provided.
  • the immunity-inducing agent for cancer of the present invention can induce killer T cells, helper T cells, or an immune cell population containing these by using in vitro, etha vivo or in vivo, preferably etha vivo. Can immunize against cancer wear.
  • the present invention also relates to an antibody that recognizes part or all of the above-described peptide of the present invention as an epitope (antigen), and killer T cells induced using the peptide by etha vivo or in vitro stimulation.
  • killer T cells are known to exhibit stronger antitumor activity than antibodies.
  • the antibody of the present invention may be a polyclonal antibody or a monoclonal antibody, and can be produced by a conventional method.
  • a polyclonal antibody is obtained by immunizing a mammal or a bird using the peptide of the present invention as an antigen, collecting blood from the mammal or bird, and separating and purifying the antibody from the collected blood.
  • mammals such as mice, mice, mussels, guinea pigs, chickens, rats, rabbits, dogs, goats, hidges, horses, horses, etc., or birds can be immunized. Methods for immunization are known to those skilled in the art.
  • an antigen may be administered 2 to 3 times, for example, at intervals of 7 to 30 days. The dose can be about 0.05 to 2 mg of antigen per dose, for example.
  • the administration route is not particularly limited, and subcutaneous administration, intradermal administration, intraperitoneal administration, intravenous administration, intramuscular administration, and the like can be appropriately selected.
  • the antigen can be used by dissolving in a buffer containing a suitable adjuvant, for example, a complete buffer containing a commonly used adjuvant such as Freund's complete adjuvant or hydroxyaluminum hydroxide.
  • booster immunization can be performed using, for example, 100 g to 1000 g of antigen.
  • the immunized mammal or avian animal is also blood collected, and the blood (polyclonal antiserum) is centrifuged, precipitated using, for example, ammonium sulfate or polyethylene glycol.
  • the polyclonal antibody that recognizes the peptide of the present invention can be obtained by separation and purification by conventional methods such as chromatography, gel filtration chromatography, ion exchange chromatography, affinity chromatography and the like.
  • a monoclonal antibody can be obtained by preparing a hybridoma.
  • hypridoma can be obtained by cell fusion between an antibody-producing cell and a myeloma cell line.
  • the A hyperidoma producing the monoclonal antibody of the present invention can be obtained by the following cell fusion method.
  • spleen cells As antibody-producing cells, spleen cells, lymph node cells, B lymphocytes and the like from immunized animals are used.
  • the peptide of the present invention is used as the antigen.
  • Mice, rats, and the like can be used as immunized animals, and antigens are administered to these animals by conventional methods.
  • an animal is administered by injecting a suspension or emulsion of an adjuvant such as complete Freund's adjuvant or incomplete Freund's adjuvant and the peptide of the present invention as an antigen several times subcutaneously, intradermally, intraperitoneally, etc. Immunize.
  • spleen cells are obtained from the immunized animal as antibody-producing cells, and these and myeloma cells are fused by a known method (G. Kohler et al., Nature, 25 6 495 (1975)) to prepare hyperidoma. Can be produced.
  • Examples of myeloma cell lines used for cell fusion include P3X63Ag8, P3U1 strain, and Sp2Z0 strain in mice.
  • a fusion promoter such as polyethylene glycol or Sendai virus is used, and hypoxanthine 'aminopterin' thymidine (HAT) medium is used in accordance with a conventional method for selection of the hyperidoma after cell fusion.
  • HAT hypoxanthine 'aminopterin' thymidine
  • Hypridoma obtained by cell fusion is cloned by a limiting dilution method or the like.
  • cell lines producing monoclonal antibodies that specifically recognize the peptide of the present invention can be obtained by performing screening by an enzyme immunoassay using the peptide of the present invention.
  • the hybridoma is cultured by a normal cell culture method or ascites formation method, and the monoclonal antibody is then cultured from the culture supernatant or ascites. If you refine it. Purification of the monoclonal antibody from the culture supernatant or ascites can be performed by a conventional method. For example, ammonium sulfate fractionation, gel filtration, ion exchange chromatography, and affinity chromatography can be used in appropriate combinations.
  • antibody fragments are also within the scope of the present invention.
  • antibody fragments include F (ab ′) 2 fragments, Fab ′ fragments, and the like.
  • the present invention also provides killer T induced by in vitro stimulation using the peptides of the present invention.
  • Cells, helper T cells, or immune cell populations containing them For example, when peripheral blood lymphocytes and tumor-infiltrating lymphocytes are stimulated in vitro with the peptide of the present invention, activated sputum cells showing tumor reactivity are induced, and the activated sputum cells are adopted as cancer adoptive immunotherapy. Can be used effectively.
  • the peptide of the present invention can be expressed in vivo or in vitro in cells that are strong antigen-presenting cells, and the antigen peptide-expressing cells can be administered to induce an immune response against the tumor. .
  • killer sputum cells, helper sputum cells, or immune cell populations containing these can be induced by ethaso-vivo or in vitro stimulation using the peptide of the present invention and an immunostimulant.
  • immunostimulant include cell growth factor and cytokin.
  • the tumor By transferring the killer sputum cells, helper sputum cells, or immune cell population containing these cells obtained as described above into the body, the tumor can be suppressed, and cancer can be prevented and / or treated or treated. It is possible.
  • killer sputum cells, helper sputum cells, or immune cell populations containing these can be prepared that can suppress tumor growth. Therefore, according to the present invention, there is provided a cell culture medium containing tumor-reactive mouse cells and the peptide of the present invention. By using this cell culture solution, it is possible to produce killer sputum cells, helper sputum cells, or immune cell populations containing these that can suppress tumors. Furthermore, according to the present invention, there is also provided a cell culture kit for producing a killer sputum cell, a helper sputum cell, or an immune cell population containing these, comprising the above cell culture medium and a cell culture container.
  • the peptide of the present invention can induce cancer cell-specific killer cells, it can be expected as an agent for treating or preventing cancer.
  • a BCG bacterium transformed with this recombinant DNA containing the gene encoding the peptide of the present invention into an appropriate vector, or a vaccinia virus integrated with the DNA encoding the peptide of the present invention in the genome Such viruses can be effectively used as a live vaccine for the treatment and prevention of human cancer.
  • the dose and method of administration of cancer vaccine are the same as those for normal vaccination and BCG vaccine.
  • the DNA encoding the peptide of the present invention (as it is or in the form of plasmid DNA incorporated into an expression vector), the recombinant virus or recombinant bacteria containing the DNA as it is or dispersed in an adjuvant
  • the peptide of the present invention can be administered as a cancer vaccine in a state dispersed with adjuvant.
  • adjuvants examples include Freund's incomplete adjuvant, BCG, trehalose dimycolate (TDM), lipopolysaccharide (LPS), myoban adjuvant, silica adjuvant, and the like. It is preferable to use Freund's incomplete adjuvant (IFA) because of its induction ability.
  • IFA Freund's incomplete adjuvant
  • the type of cancer referred to in the present specification is not particularly limited, and specific examples include stomach cancer, colon cancer, esophageal cancer, spleen cancer, liver cancer, gallbladder cancer, bile duct cancer, lung cancer, breast cancer, thyroid cancer, melanoma ( Malignant melanoma), skin cancer, osteosarcoma, pheochromocytoma, head and neck cancer, brain tumor, chronic myelogenous leukemia, acute myelogenous leukemia, malignant lymphoma, kidney cancer, bladder cancer, prostate cancer, testicular cancer, uterine cancer, Examples include ovarian cancer or soft tissue sarcoma. Among these, cancers that highly express SPARC such as gastric cancer (particularly diffuse invasive gastric cancer), spleen cancer, or melanoma (malignant melanoma) are listed. I can make it.
  • the peptide of the present invention can induce killer T cells or helper T cells specific to cancer cells as T cell epitopes, it is useful as a prophylactic / therapeutic agent for human cancer.
  • the antibody of the present invention is also useful as a prophylactic / therapeutic agent for human cancer if it can inhibit the activity of SPARC, which is a cancer antigen.
  • the peptide or antibody of the present invention may be administered as an injection as it is, or together with a pharmaceutically acceptable carrier and Z or diluent, with the following adjuvant as necessary. Alternatively, it may be administered by percutaneous absorption from the mucous membrane by a method such as spraying.
  • the carrier referred to here is, for example, human serum albumin, and examples of the diluent include PBS, distilled water and the like.
  • the dosage is not limited to this range, but can be administered so that the dose of the peptide or antibody of the present invention per adult is, for example, in the range of 0.0 lmg to 100 mg per dose.
  • the form of the preparation is not particularly limited, either lyophilized or sugar or other excipients. In addition, it can be granulated.
  • MDP muramyl dipeptide
  • other bacterial cell components such as BCG bacteria, Nature, vol. ISCOM described in J. Immunol. vol. 148, pl438 (1992), ribosomes, aluminum hydroxide, and the like.
  • immunostimulants such as lentinan, schizophyllan, and picibanil can be used as adjuvants.
  • IL-2, IL-4, IL12, IL-1, IL-6, TNF and other T cell proliferation, cyto force-in to enhance sorting, etc., and ⁇ -galactosyl that activates NKT cells Ceramid can be used as an adjuvant such as CpG or lipopolysaccharide (LPS), which binds to ToU-like receptors and activates the innate immune system.
  • LPS lipopolysaccharide
  • the antigen peptide is added to the cells collected from HLA-A24-positive patients or cells derived from other HLA-A24-positive cells in a test tube, and the antigen is presented.
  • killer T cells can be induced in a test tube and then returned to the patient's blood vessel by adding the peptide to patient peripheral blood lymphocytes and culturing in vitro.
  • Such treatment by cell transfer has already been carried out as a cancer treatment method, which is well known among those skilled in the art.
  • tumor-reactive T cells are induced, and as a result, an antitumor effect can be expected.
  • lymphocytes are stimulated with the peptide of the present invention in vivo or in vitro, activated T cells are induced, and can be effectively used for adoptive immunotherapy by injecting the activated T cells into the affected area.
  • the extracted cancerous and non-cancerous tissues of patients with diffuse invasive gastric cancer were separated by laser capture microdissection and extracted from each tissue. Reverse transcription from these RNAs
  • the cancer region cDNA was fluorescently labeled with Cy5 and the non-cancerous region cDNA was fluorescently labeled with Cy3 and mixed to obtain the target DNA.
  • non-specific binding is washed away and the fluorescence image after hybridization is captured using a CCD camera or fluorescence scanner.
  • the ratio (R / G) of each fluorescence intensity was calculated and shown as a gene expression profile. Furthermore, by comparing the expression of 23,040 genes in 20 cancerous and noncancerous patients with diffuse invasive gastric cancer, in many cases the expression ratio of cancerous / noncancerous is 5 15 types of the above genes were selected (Fig. 1).
  • the following peptides were selected from peptide parts having the same amino acid sequence in human and mouse SPARC having 95% homology. Based on known information about commonly observed amino acid sequences of peptides that bind strongly to both human HLA-A24 and mouse Kd molecules, we searched for the entire amino acid sequence of SPARC molecules and found binding affinity for both molecules. A repertoire of peptides presumed to be high was selected using a computer program. As a result, four types of candidate peptides were determined (Table 1).
  • SPARC Kd-1 SEQ ID NO: 1
  • SPARC Kd-3 SEQ ID NO: 2
  • SPARC Kd-4 SEQ ID NO: 3
  • Bone marrow cell power derived from BALB / c bone marrow GM-CSF was used to induce bone marrow cell derived rod cells (BM-DC).
  • BM-DC bone marrow cell derived rod cells
  • the BM-DC obtained in this way was cultured for 2 hours at a concentration of 10 ⁇ 4 with the mixture of the four peptides determined above, and then 5 x 10 5 per animal was administered intraperitoneally. did.
  • the mice were immunized twice in the same manner at intervals of 1 week, and the spleen cells of the mice were collected and used for detection of killer sputum cells.
  • the spleen cell force was removed from the CD4 + T cells using the MACS beads after the spleen was collected.
  • BM-DC bone marrow-derived rod-shaped cells
  • T2K d cells were set as target tumor cells to be injured by killer T cells.
  • T2K d cells are cell lines in which a Kd gene is introduced into a mouse T2 cell line that lacks TAP gene expression. Peptide force added from outside due to TAP deficiency Only when it has the property of binding to SMHC class I molecule, the complex of MHC class I molecule and peptide is expressed on the cell surface.
  • the RL male 1 cell line is a T cell leukemia cell derived from BALB / c mice. Neither cell expresses SPARC.
  • the Meth A and BALB / 3T3 cell lines express SPARC in fibrosarcoma and fibroblast cell lines derived from BALB / c mice.
  • mice After culturing BM-DC with 10 ⁇ SPARC K d- 1,3,4 mixed peptide for 2 hours, 5 ⁇ 10 5 cells were administered intraperitoneally. Seven days after immunizing mice a total of two times in the same manner with peptide-loaded BM-DC at one week intervals, the mouse fibrosarcoma cell line Meth A (l X 10 6 ) that highly expresses mouse SPARC was obtained. Implanted subcutaneously, tumor growth and mouse survival It was investigated.
  • HLA-A24 (A * 2402) is the most frequent HLA class I allele owned by about 60% of Japanese.
  • the amino acid sequence of the peptide that binds to the BALB / c mouse Kd molecule, corresponding to the HLA class I molecule, is very similar to that of the peptide that binds to human HLA-A24. Therefore, when BALB / c mice are immunized with a peptide, the peptide binds to the Kd molecule and induces killer T cells, which destroy cancer cells that express the complex of the peptide and Kd molecule. Has shown that the peptide can bind to HLA-A24 and induce human 'killer T cells, which also destroy cancer cells.
  • the peptides presented in the present invention can be applied to immunotherapy of diffuse invasive gastric cancer, spleen cancer and melanoma patients who possess HLA-A24. Suppressing progress is expected to improve patient quality of life.
  • FIG. 1 shows the best 15 genes highly expressed in gastric cancer tissues compared to normal gastric mucosa, as determined by cDNA microarray analysis of 20 patients with diffuse invasive gastric cancer. The degree of expression in individual cases is shown. Among these, considering the results of cDNA microarray analysis of normal tissues shown below, Secreted protein acidic and rich in cysteine (SPARC), which is highly expressed specifically in the cancerous part, is the most common in diffuse invasive gastric cancer. Selected as an ideal cancer-specific antigen.
  • SPARC secreted protein acidic and rich in cysteine
  • Figure 2 shows the analysis of SPARC expression in 25 adult major organs and 4 embryonic organs using cDNA microarrays. The expression of the SPARC gene is also observed in some normal tissues, but the level of expression was significantly lower than that in the cancerous part.o
  • Fig. 3 shows the results of SPARC induced by CTL induced with mouse Kd- restricted SPARC Kd- 1, Kd- 3, or Kd- 4 epitope peptide in BALB / c mice. Positive tumor cell wound Indicates harm.
  • Fig. 4 shows the results of pre-administration of bone marrow dendritic cells (BM-DC) to BALB / c mice loaded with SPARC Kd- 1, Kd- 3 and Kd- 4 peptides. Inhibition of growth and survival of Meth A cancer cells implanted subcutaneously.
  • BM-DC bone marrow dendritic cells

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Abstract

　本発明の目的は、腫瘍に反応性を示すヒト細胞傷害性（キラー）T細胞およびヘルパーT細胞を誘導することができるSPARC蛋白質由来のペプチドを同定し、SPARCを高発現する多様な癌の患者を対象として、腫瘍の免疫療法を可能にする手段を提供することである。本発明によれば、以下の何れかのペプチドが提供される。 （Ａ）配列番号１から３の何れかに示すアミノ酸配列からなるペプチド。 （Ｂ）配列番号１から３の何れかに示すアミノ酸配列からなるペプチドにおいて、１又は数個のアミノ酸が置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、キラーT細胞の誘導能を有するペプチド。

Description

明 細 書
SPARC由来の癌拒絶抗原ペプチド及びこれを含む医薬
技術分野
[0001] 本発明は、胃癌、脾臓癌および悪性黒色腫 (メラノーマ)などの SPARCを高発現す る癌の癌ワクチンとして有効な新規ペプチド、並びに当該ペプチドを含む腫瘍の治 療及び Zまたは予防のための医薬に関する。
背景技術
[0002] 胃癌は、欧米と比較して、 日本や中国などのアジア諸国で罹患率が高い。胃癌は、 健康診断の普及や消化器内視鏡器具や、検査技術の進歩により、早期発見が可能 となり、患者数は減少しつつある。し力しながら、依然として日本人の悪性新生物の 死亡原因の第 2位を占めており、未だ死亡原因に占める割合は高い。胃癌の中でも び漫性 (スキルス）胃癌は、他の胃癌 (腺癌）と比較して、若年者に発生し、癌の進展 、転移、腹膜播種の傾向が強ぐ予後が不良である。スキルス胃癌は、診断時にすで に外科的切除が不能であることが多ぐたとえ切除可能であっても、治療後の再発例 が多いため、新たな治療法を確立することが急務である。
[0003] 我国における脾癌の死亡者数は増加する傾向にあり、 2003年には 21, 148人が脾癌 で死亡している。脾癌は現在、我国の癌による死因の 6.8%を占めており、肺癌、胃 癌、大腸癌、肝癌に次いで第 5位である。世界人口統計データを解析して、年齢構成 の異なる集団の死亡率を比較する際に用いられる年齢調整死亡率を算出してみると 、 2000年には 100,000人あたり、男性では日本 8.6人に対し米国 7.3人、英国 6.3〜7. 0人、女性では日本 4.9人に対し米国 5.3人、英国 4.8〜5.1人と欧米と同水準になつ ている。
2000年の年齢調整率 (世界人口による、 100,000人あたり）でみると、男性では日本 8.6に対して、米国 7.3、英国 6.3〜7.0、女性では日本 4.9に対して、米国 5.3、英国 4.8 〜5.1と欧米と同水準になっている。画像診断が進歩した現在においても、日本人の 患者全体の約 4割が、遠隔転移を有する進行例であり、さらに切除不能な局所進行 例の状態で発見される患者も多い。 1996年診断例における、脾癌患者全体の 5年相 対生存率は 4.3%で、従来の 2〜3%より増加傾向にはあるものの、依然として低い。 膝癌の発生要因に関しては、喫煙、肥満、食事、飲酒、コーヒーなどの生活習慣のほ カゝ、慢性脾炎ゃ糖尿病、遺伝要因など、さまざまな因子の関与が示唆されている。
[0004] 脾臓癌に特異的な症状はなぐ症状が出た場合はすでに進行していることが多い。
そのため、患者全体の 5年生存率は 5%以下と、診断後の予後が極めて不良である。 診断の困難さによって特に先進国では、次第に癌死亡の原因疾患としての頻度が増 カロしつつある。現在、外科的切除を中心として、放射線治療、化学療法などによる集 学的治療が行われているが、劇的な治療効果の改善はなぐ新たな治療戦略の確立 は急務である。
[0005] メラノーマとは悪性黒色腫と呼ばれる皮膚がんの一種であり、浸潤および転移傾向 が非常に強ぐ悪性度の高い癌として非常に恐れられている。皮膚を構成している細 胞のなかに、メラニン色素を産生する細胞があり、これを色素細胞 (メラノサイト）と呼 ぶ力 この細胞ががん化したものカ^ラノーマである。またメラノーマは、環境破壊に よる大気中のオゾン層の減少による、紫外線への暴露の増加により、特に白人にお V、て発生頻度が増加しつつある。
日本におけるメラノーマの発生数は人口 10万人あたり 1.5〜2人くらいと言われ、年 間 1500人〜 2000人くら 、発生して 、ると推測されて 、る。欧米では人口 10万人あたり 10数人以上の発生と言われ、オーストラリアでは人口 10万人あたり 20数人以上の発 生で世界一発生数が高!、と言われて 、る。それだけに欧米やオーストラリアの人々 はメラノーマに関心を持ち、メラノーマの発生に注意をしている。また、驚くことに外国 でも日本でもメラノーマの発生は年々増加傾向が認められている。最近の調査では、 日本におけるこの病気による年間死亡者数は 450人前後も 、る。メラノーマは何歳の 人でも発生しているが、特に 40歳以上になると発生が多くなり、 60歳〜 70歳台が最も 多くなつている。小児の発生は非常に少ないが、発生しないということはなぐ最近 20 〜30歳台の若年者の発生が多くなつている傾向がある。性別では特にどちらかに多 いという傾向はなぐ男女どちらにも発生する。 日本人のメラノーマが発生しやすい部 位は、足底 (足のうら）が最も多ぐ約 3割ぐらいを占めている。足や指の爪の部分にも 多くできることが、 日本人の特徴である。そのほか、欧米人と同様に体、手、足、顔、 頭など、どこの皮膚にも発生する。
[0006] 現在、メラノーマの治療法として外科療法、化学療法および放射線療法が実施され ている。しかし、これらの治療法の適応外の転移癌や難治性癌に対する緩和的な治 療法として、癌患者の癌に対する免疫力を強めることにより癌の増殖を抑制する免疫 療法が注目され、実際に一部の患者では功を奏している。
[0007] 一方、近年の分子生物学及び腫瘍免疫学の発展により、細胞傷害性 (キラー) T細 胞およびヘルパー T細胞力 癌細胞あるいは抗原提示細胞の表面に HLA分子を介 して提示される、癌細胞に特異的に高発現する蛋白質が分解されてできたペプチド を認識して、癌細胞を破壊する免疫反応を示すことが明らかとなった。さらに、このよ うな癌を攻撃する免疫反応を刺激する、腫瘍抗原蛋白質及び、それらに由来するべ プチドが多数同定されてきており、抗原特異的な腫瘍免疫療法の臨床応用が進めら れている。
[0008] HLAクラス I分子は、身体のすべての有核細胞の表面に発現しており、細胞質や核 で産生される蛋白質が、細胞内で分解されて出来たペプチドを結合して、細胞表面 に発現する。正常な細胞の表面には、正常な自己の蛋白質に由来するペプチドが H LAクラス I分子に結合しており、これを免疫系の T細胞が識別して破壊することはない 。一方、癌細胞は癌になる過程で、正常細胞には、ほとんど発現していないか、ある いはごく僅かしか発現して 、な 、蛋白質を大量に発現することがある。このような癌細 胞に特異的に高発現する蛋白質が細胞質内で分解されて出来たペプチドが、 HLA クラス I分子に結合して癌細胞の表面に発現すると、キラー T細胞がこれを認識して癌 細胞のみを破壊する。また、このような癌特異抗原やペプチドを個体に投与すること により、正常細胞には危害を加えることなぐ癌細胞を破壊して癌の増殖を抑制する ことができる。これを、癌特異抗原を用いた癌免疫療法と呼ぶ。また HLAクラス II分子 は、主に抗原提示細胞の表面に発現しており、抗原提示細胞が細胞外から取り込ん で、細胞内で分解されて出来た癌特異抗原由来のペプチドを結合して細胞表面に 発現する。これを認識したヘルパー T細胞は、活性化され他の免疫担当細胞を活性 化する種々のサイト力インを産生することにより、腫瘍に対する免疫反応を誘導あるい は増強する。 [0009] そこで、これらの癌に特異的に高発現している抗原を標的にした免疫療法を開発 できれば、自己の正常臓器に有害事象を及ぼすことなぐ癌だけを有効に排除する 治療法になる可能性がある。また、他の治療が行えない、どんな末期の癌患者にでも 使用できる治療法になりうると期待される。また、あらかじめ、このような癌を発生する リスクが高いヒトに対して、癌特異抗原およびペプチドをワクチンとして投与することに より、癌の発生を予防できる可能性がある。
[0010] 本発明者らは先に、胃癌組織および正常組織における、ゲノムワイドの 23,040種の 遺伝子の発現を cDNAマイクロアレイを用いて解析した。その結果、びまん性浸潤性 胃癌の患者 20例中 11例で、正常胃粘膜と比較して胃癌組織において 5倍以上 (平均 丄 ύ万 1咅)尚発 する遺 fcナとし一し、 Secreted protein acidic and ncn in cysteine (SPA RC)を同定した。（図 1) SPARC遺伝子は、正常な脂肪組織、乳腺、卵巣、脊髄、精巣 、子宮、胎盤などに軽度の発現を認めたが、正常胃粘膜と比較して、いずれも 5倍以 下の低!、発現であつた（図 2)。
[0011] SPARCは、びまん性浸潤性胃癌に高発現しているだけでなぐ脾臓癌やメラノーマ にも高発現していることが、他の研究者により既に報告されている。さらに発明者らは 、メラノーマ患者の血清中には、 SPARCが分泌されており、特にメラノーマの早期発 見に有用な腫瘍マーカーとなりうることを見出している（特願 2004-303688 ;及び Clini cal Cancer Research 11: 8079—8088, 2005)。
[0012] SPARCは 286個のアミノ酸からなる 43KDの酸性の分泌蛋白質で、システィンに富み 、細胞分裂期には核に移行する。また SPARCは、細胞外基質蛋白と細胞との相互作 用を調節することにより、細胞の増殖を調節することにも関与する蛋白質である。骨 芽細胞や血小板、創傷部位などに発現していることより、組織の修復と再構築に関与 していると考えられている。さらに、メラノーマや骨肉腫などの癌、および腫瘍の間質 細胞にも高発現すること、ならびに SPARCの発現が腫瘍の予後、浸潤あるいは転移 と相関することが報告されている。
[0013] 非特許文献 1 : Ikuta Yら、 Clinical Cancer Research 11: 8079-8088, 2005.
特許文献 1：特願 2004-303688
発明の開示 発明が解決しょうとする課題
[0014] 本発明は、びまん性浸潤性胃癌、脾臓癌およびメラノーマなどの SPARCを高発現 する腫瘍の治療法として実施されて!ヽる外科療法、化学療法および放射線療法では 治療が難しい、転移癌や難治性癌に対する緩和的な治療法として、癌患者の癌に対 する免疫力を強めることにより癌の増殖を抑制する免疫療法を行うための手段を開発 することを解決すべき課題とする。即ち、本発明は、癌患者に有害事象を伴うことなく 、上記の癌に対する強い免疫反応を誘導することができる、癌特異的に高発現する S PARC蛋白質由来のペプチドを同定して、当該ペプチドを腫瘍の免疫療法に応用す ることを解決すべき課題とする。本発明は、腫瘍に反応性を示すヒト 'キラー T細胞、 およびヘルパー T細胞を誘導することができる SPARC蛋白質由来のペプチドを同定 し、 SPARCを高発現する多様な癌の患者を対象として、腫瘍の免疫療法を可能にす る手段を提供することを解決すべき課題とする。
課題を解決するための手段
[0015] 本発明者らは、びまん性浸潤性胃癌の cDNAマイクロアレイ解析により、びまん性 浸潤性胃癌に高発現する遺伝子 SPARCを同定した。 SPARCの発現は、一部の正常 組織にも観察されるが、癌部と比較すると著しく低い。 SPARC特異的なキラー T細胞 による抗腫瘍免疫の誘導の有無を検討するために、結合するペプチドのアミノ酸配 列に関する特徴が、日本人で最も頻度が高い HLA-A24と同一である、マウス Kd分子 を発現する BALB/cマウスを利用した。つまり、 95%の相同性を有するヒトとマウスの S PARCについて、両者においてアミノ酸配列が共通しているペプチドで、ヒトの HLA-A 24およびマウス Kdに共通した結合モチーフを持つものを合成した。それらのペプチド の混合物を負荷した骨髄由来榭状細胞を、 BALB/cマウス (Kd発現)に免疫することに より、ペプチド特異的かつ SPARC発現癌細胞を破壊するキラー T細胞が誘導される か否かを検討した。さらに、同様の免疫方法による前処置を受けたマウスにおいて、 移植したマウス SPARC発現癌細胞の増殖が抑制され、生存期間が延長するか否か 検討した。なお、ペプチドを免疫したマウスに、自己免疫現象の発生にともなって観 察されるような有害事象が、出現するカゝ否についても検討した。その結果、配列番号 1から 3の何れかに示すアミノ酸配列からなるペプチドは、 SPARC発現癌細胞を破壊 するキラー T細胞を誘導することができ、さらに、これらのペプチドを免疫したマウスに おいては、移植したマウス SPARC発現癌細胞の増殖が抑制され、生存期間が延長さ れることを確認した。本発明は、これらの知見に基づいて完成したものである。
[0016] 即ち、本発明によれば以下の発明が提供される。
(1) 以下の何れかのペプチド。
(A)配列番号 1から 3の何れかに示すアミノ酸配列力 なるペプチド。
(B)配列番号 1から 3の何れかに示すアミノ酸配列力 なるペプチドにお 、て、 1又は 数個のアミノ酸が置換又は付加されたアミノ酸配列力もなり、キラー T細胞の誘導能を 有するペプチド。
[0017] (2) (1)に記載のペプチドを少なくとも 1種類以上を含む、癌に対する免疫誘導剤。
(3) (1)に記載のペプチドを少なくとも 1種類以上を含む、腫瘍の治療及び Zまた は予防のための医薬。
(4) (1)に記載のペプチドを少なくとも 1種類以上を含む、腫瘍反応性 T細胞の誘 導能が高 ヽ抗原提示細胞を誘導するための薬剤。
(5) (1)に記載のペプチドを少なくとも 1種類以上を含む、腫瘍反応性 T細胞を誘導 するための薬剤。
[0018] (6) 以下の何れかのペプチドをコードする遺伝子を含む、腫瘍反応性 T細胞の誘 導能が高 ヽ抗原提示細胞を誘導するための薬剤。
(A)配列番号 1から 3の何れかに示すアミノ酸配列力 なるペプチド。
(B)配列番号 1から 3の何れかに示すアミノ酸配列力 なるペプチドにお 、て、 1又は 数個のアミノ酸が置換又は付加されたアミノ酸配列力もなり、キラー T細胞の誘導能を 有するペプチド。
[0019] (7) (1)に記載のペプチドに対する抗体。
(8) (1)に記載のペプチドを用いて誘導される、キラー T細胞、ヘルパー T細胞、又 はこれらを含む免疫細胞集団。
[0020] (9) HLA分子と（1)に記載のペプチドとの複合体を提示する抗原提示細胞。
(10) (4)又は（6)に記載の薬剤によって誘導される、（9)に記載の抗原提示細胞。 発明を実施するための最良の形態 [0021] (1)本発明のペプチド及びそれを含む癌に対する免疫誘導剤
本発明のペプチドは、以下の何れかのペプチドである。
(A)配列番号 1から 3の何れかに示すアミノ酸配列力 なるペプチド。
(B)配列番号 1から 3の何れかに示すアミノ酸配列力 なるペプチドにお 、て、 1又は 数個のアミノ酸が置換又は付加されたアミノ酸配列力もなり、キラー T細胞、の誘導能 を有するペプチド。
[0022] 本明細書で言う細胞傷害性 T細胞の誘導能を有するペプチドとは、キラー T細胞を 刺激する T細胞誘導活性を有するペプチドを意味する。
[0023] 本発明のペプチドの入手'製造方法は特に限定されず、化学合成したペプチドで も、遺伝子組み換え技術により作製した、組み換えペプチドの何れでもよい。
[0024] 化学合成ペプチドを入手する場合には、例えば、 Fmoc法 (フルォレニルメチルォキ シカルボ-ル法)、 tBoc法 (t ブチルォキシカルボ-ル法)等の化学合成法に従って
、本発明のペプチドを合成することができる。また、各種の市販のペプチド合成機を 利用して、本発明のペプチドを合成することもできる。
[0025] 本発明のペプチドを組み換え蛋白質として産生するには、該ペプチドをコードする 塩基配列を有する DNA又はその変異体又は相同体を入手し、これを好適な発現系 に導入することにより本発明のペプチドを製造することができる。
[0026] 発現ベクターとしては、好ましくは宿主細胞において自立複製可能である力、ある いは宿主細胞の染色体中へ糸且込み可能であるものであればよぐペプチドをコード する遺伝子を発現できる位置にプロモーターを含有しているものが使用される。また 、本発明のペプチドをコードする遺伝子を有する形質転換体は、上記の発現べクタ 一を宿主に導入することにより作製することができる。宿主は、細菌、酵母、動物細胞 、昆虫細胞のいずれでもよぐまた宿主への発現ベクターの導入は、各宿主に応じた 公知の手法により行えばよい。
[0027] 本発明においては、上記のようにして作製した形質転換体を培養し、培養物中に 本発明のペプチドを生成蓄積させ、該培養物より本発明のペプチドを採取することに より、組み換えペプチドを単離することができる。
[0028] 形質転換体が大腸菌等の原核生物、酵母菌等の真核生物である場合、これら微生 物を培養する培地は、該微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し 、形質転換体の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地のいずれ でもよ!/ヽ。また培養条件も該微生物を培養するのに通常用いられる条件にて行えば よい。培養後、形質転換体の培養物から本発明のペプチドを単離精製するには、通 常のペプチドの単離、精製法を用いればよい。
[0029] 本明細書における「1又は数個のアミノ酸」とは、一般的には 1〜： LO個のアミノ酸、 好ましくは 1〜8個のアミノ酸、より好ましくは 1〜5個のアミノ酸、特に好ましくは 1〜3 個のアミノ酸 (例えば、 1個、 2個又は 3個のアミノ酸)を意味する。
[0030] なお、配列番号 1から 3の何れかに示すアミノ酸配列からなるペプチドにおいて、 1 又は数個のアミノ酸が置換又は付加されたアミノ酸配列からなるペプチドは、配列番 号 1から 3の何れかに記載のアミノ酸配列の情報に基づいて、当業者であれば適宜 製造又は入手することができる。即ち、配列番号 1から 3の何れかに示すアミノ酸配列 において、 1または数個のアミノ酸が置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、細胞 傷害性 T細胞の誘導能を有するペプチドは、上記の化学合成、遺伝子工学的手法 又は突然変異誘発などの当業者に既知の任意の方法で作製することもできる。例え ば、遺伝子工学的手法の一つである部位特異的変異誘発法は、特定の位置に特定 の変異を導入できる手法であることから有用であり、 Molecular Cloning: A laboratory Mannual, 2 Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY., 1989、 以下、モレキュラークロー-ング第 2版と略す）、 Current Protocols in Molecular Biolo gy, Supplement 1〜38, John Wiley & Sons (1987- 1997) (以下、カレント'プロトコール ズ'イン'モレキュラー 'バイオロジーと略す)等に記載の方法に準じて行うことができる
[0031] 上記した本発明のペプチドは、後記実施例にも示す通り、癌に対する免疫を誘導 することができる。従って、本発明によれば、本発明のペプチドを含む、癌に対する 免疫誘導剤が提供される。
[0032] 本発明の癌に対する免疫誘導剤は、インビトロ、エタソビボ又はインビボ、好ましく はエタソビボで用いることにより、キラー T細胞、ヘルパー T細胞、又はこれらを含む 免疫細胞集団を誘導することができ、これにより癌に対する免疫を付与することがで きる。
[0033] (2)本発明の抗体
本発明は、上記した本発明のペプチドの一部もしくは全部をェピトープ (抗原）とし て認識する抗体、並びに当該ペプチドを用いて、エタソビボあるいはインビトロ刺激に より誘導されたキラー T細胞にも関する。一般的には、キラー T細胞の方が抗体よりも 強 ヽ抗腫瘍活性を示すことが知られて 、る。
[0034] 本発明の抗体はポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体でもよぐその作製は 定法により行なうことができる。
[0035] 例えば、ポリクローナル抗体は、本発明のペプチドを抗原として哺乳動物又は鳥類 を免疫感作し、該哺乳動物又は鳥類力 血液を採取し、採取した血液から抗体を分 離'精製することにより得ることができる。例えば、マウス、ノ、ムスター、モルモット、 -ヮ トリ、ラット、ゥサギ、ィヌ、ャギ、ヒッジ、ゥシ、ゥマ等の哺乳動物又は鳥類を免疫する ことができる。免疫感作の方法は当業者に公知であり、例えば抗原を、例えば 7〜30 日間隔で 2〜3回投与すればよい。投与量は 1回につき、例えば抗原約 0. 05〜2m g程度とすることができる。投与経路も特に限定されず、皮下投与、皮内投与、腹膜 腔内投与、静脈内投与、筋肉内投与等を適宜選択することができる。また、抗原は適 当なアジュバントを含む緩衝液、例えば完全フロイントアジュバント又は水酸ィ匕アルミ -ゥム等の、通常用いられるアジュバントを含有する適当な緩衝液に溶解して用いる ことができる。
[0036] 免疫感作した哺乳動物又は鳥類を一定期間飼育した後、抗体価が上昇してきたら 、例えば 100 g〜1000 gの抗原を用いて追加免疫を行なうことができる。最後の 投与から 1〜2ヶ月後に免疫感作した哺乳動物又は鳥類力も血液を採取して、該血 液 (ポリクローナル抗血清）を、例えば遠心分離、硫酸アンモ-ゥム又はポリエチレン グリコールを用いた沈滅、ゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、 ァフィユティークロマトグラフィー等のクロマトグラフィー等の常法によって分離.精製 することにより、本発明のペプチドを認識するポリクローナル抗体を得ることができる。
[0037] 一方、モノクローナル抗体はノ、イブリドーマを調製して得ることができる。例えば、抗 体産生細胞とミエローマ細胞株との細胞融合により、ハイプリドーマを得ることができ る。本発明のモノクローナル抗体を産生するハイプリドーマは、以下のような細胞融 合法によって得ることができる。
[0038] 抗体産生細胞としては、免疫された動物からの脾細胞、リンパ節細胞、 Bリンパ球等 を使用する。抗原としては、本発明のペプチドを使用する。免疫動物としてはマウス、 ラット等を使用でき、これらの動物への抗原の投与は常法により行う。例えば完全フロ インドアジュバント、不完全フロインドアジュバントなどのアジュバントと抗原である本 発明のペプチドとの懸濁液もしくは乳化液を動物の皮下、皮内、腹腔内等に数回投 与することによって動物を免疫化する。免疫化した動物から抗体産生細胞として例え ば脾細胞を取得し、これとミエローマ細胞とを公知の方法（G.Kohler et al .,Nature,25 6 495(1975))により融合してハイプリドーマを作製することができる。
[0039] 細胞融合に使用するミエローマ細胞株としては、例えばマウスでは P3X63Ag8、 P 3U1株、 Sp2Z0株などが挙げられる。細胞融合を行なうに際しては、ポリエチレング リコール、センダイウィルスなどの融合促進剤を用い、細胞融合後のハイプリドーマの 選択にはヒポキサンチン'アミノプテリン'チミジン (HAT)培地を常法に従って使用す る。細胞融合により得られるハイプリドーマは限界希釈法等によりクローユングする。 さらに必要に応じて、本発明のペプチドを用いた酵素免疫測定法によりスクリーニン グを行うことにより、本発明のペプチドを特異的に認識するモノクローナル抗体を産 生する細胞株を得ることができる。
[0040] このようにして得られたノヽイブリドーマから目的とするモノクローナル抗体を製造す るには、通常の細胞培養法や腹水形成法により該ハイブリドーマを培養し、培養上清 あるいは腹水から該モノクローナル抗体を精製すればょ 、。培養上清もしくは腹水か らのモノクローナル抗体の精製は、常法により行なうことができる。例えば、硫安分画 、ゲルろ過、イオン交換クロマトグラフィー、ァフィ-ティークロマトグラフィーなどを適 宜組み合わせて使用できる。
[0041] また、上記した抗体の断片も本発明の範囲内である。抗体の断片としては、 F (ab' ) 2フラグメント、 Fab'フラグメント等が挙げられる。
[0042] (3)キラー T細胞、ヘルパー T細胞、又はこれらを含む免疫細胞集団
本発明はまた、本発明のペプチドを用いてインビトロ刺激により誘導されたキラー T 細胞、ヘルパー T細胞、又はこれらを含む免疫細胞集団に関する。例えば、末梢血リ ンパ球や腫瘍浸潤リンパ球を、本発明のペプチドでインビトロ刺激すると、腫瘍反応 性を示す活性化 Τ細胞が誘導され、この活性化された Τ細胞は、癌の養子免疫療法 に有効に用いることができる。また本発明のペプチドを強力な抗原提示細胞である榭 状細胞に、インビボあるいはインビトロで発現させて、その抗原ペプチド発現榭状細 胞を投与することにより、腫瘍に対する免疫反応を誘導することができる。
[0043] 好ましくは、本発明のペプチドと、免疫賦活剤とを用いてエタソビボあるいはインビト 口刺激により、キラー Τ細胞、ヘルパー Τ細胞、又はこれらを含む免疫細胞集団を誘 導することができる。ここで用いる免疫賦活剤としては、細胞増殖因子又はサイトカイ ンなどが挙げられる。
[0044] 上記のようにして得られたキラー Τ細胞、ヘルパー Τ細胞、又はこれらを含む免疫 細胞集団を体内に移入することにより、腫瘍を抑制することができ、癌を予防及び Ζ 又は治療することが可能である。
[0045] また、本発明のペプチドを用いることにより、上記した通り腫瘍の増殖を抑制するこ とができるキラー Τ細胞、ヘルパー Τ細胞、又はこれらを含む免疫細胞集団を作製す ることができる。従って、本発明によれば、腫瘍反応性 Τ細胞と本発明のペプチドを含 む細胞培養液が提供される。この細胞培養液を用いることにより、腫瘍を抑制するこ とができるキラー Τ細胞、ヘルパー Τ細胞、又はこれらを含む免疫細胞集団を作製す ることができる。さらに、本発明によれば、上記の細胞培養液、及び細胞培養容器を 含む、キラー Τ細胞、ヘルパー Τ細胞、又はこれらを含む免疫細胞集団を作製するた めの細胞培養キットも提供される。
[0046] (4)本発明の腫瘍の治療及び Ζまたは予防のための医薬 (癌ワクチン）
本発明のペプチドは、癌細胞特異的キラー Τ細胞を誘導することができるので、癌 の治療、予防剤として期待できる。例えば、本発明のペプチドをコードする遺伝子を 適当なベクターに組み込み、この組換え DNAで形質転換された BCG菌の細菌、ま たは本発明のペプチドをコードする DNAをゲノムに組み込まれたワクシニアウィルス 等のウィルスは、ヒト癌の治療 ·予防用生ワクチンとして有効に利用できる。なお、癌ヮ クチンの投与量及び投与法は通常の種痘や BCGワクチンと同様である。 [0047] 即ち、本発明のペプチドをコードする DNA (そのまま、あるいは発現ベクターに組 み込んだプラスミド DNAの形）、当該 DNAを含む組換えウィルス若しくは組換え細 菌はそのままあるいはアジュバントに分散した状態で、癌ワクチンとしてヒトを含む哺 乳動物に投与することができる。本発明のペプチドも同様に、アジュバンドと分散した 状態で癌ワクチンとして投与することができる。
[0048] 本発明で用いることができるアジュバントとしては、フロイントの不完全アジュバント、 BCG、トレハロースダイマイコレート（TDM)、リポ多糖 (LPS)、ミヨウバンアジュバント 、シリカアジュバント等が挙げられるが、抗体の誘導能等の関係から、フロイントの不 完全アジュバント (IFA)を使用することが好ま 、。
[0049] 本明細書で言う癌の種類は特に限定されず、具体例としては、胃癌、大腸癌、食道 癌、脾臓癌、肝癌、胆嚢癌、胆管癌、肺癌、乳癌、甲状腺癌、メラノーマ (悪性黒色腫 )、皮膚癌、骨肉腫、褐色細胞腫、頭頸部癌、脳腫瘍、慢性骨髄性白血病、急性骨 髄性白血病、悪性リンパ腫、腎臓癌、膀胱癌、前立腺癌、精巣癌、子宮癌、卵巣癌、 又は軟部組織肉腫などが挙げられ、上記の中でも、胃癌 (特に、びまん性浸潤性胃 癌）、脾臓癌、又はメラノーマ (悪性黒色腫)などのような SPARCを高発現する癌を挙 げることができる。
[0050] 本発明のペプチドは、 T細胞ェピトープとして癌細胞に特異的なキラー T細胞、ある いはヘルパー T細胞を誘導することができるので、ヒト癌の予防'治療剤として有用で ある。また、本発明の抗体も、癌抗原である SPARCの活性を阻害することができるも のであれば、ヒト癌の予防 ·治療剤として有用である。実際の使用法としては、本発明 のペプチドあるいは抗体をそのまま、又は医薬的に許容される担体及び Z又は希釈 剤ととともに、必要に応じて下記の補助剤も加えて、注射剤として投与することもでき るし、噴霧などの方法で粘膜からの経皮吸収などで投与してもよい。尚、ここで言う担 体とは例えば、ヒト血清アルブミンであり、また希釈剤としては、例えば PBS、蒸留水 等を挙げることができる。
[0051] 投与量は成人 1人当たり、本発明のペプチドあるいは抗体を例えば、 1回当たり 0.0 lmg〜100mgの範囲になるように投与することができる力 この範囲に限定されるもの ではない。製剤の形態も特に限定されず、凍結乾燥したものや、糖などの賦形剤を 加えて顆粒にしたものでもよ 、。
[0052] 本発明の薬剤に添加することができる腫瘍反応性 T細胞誘導活性を高めるための 補助剤としては、ムラミルジペプチド (MDP)ほかの BCG菌などの菌体成分、 Nature, vol. 344, p873 (1990)に記載される ISCOM、 J.Immunol. vol. 148, pl438(1992)に記載 されるサポニン系の QS-21、リボソーム、水酸化アルミニウムなどが挙げられる。また、 レンチナン、シゾフィラン、ピシバーニールなどの免疫賦活剤を補助剤として用いるこ ともできる。また、 IL— 2、 IL— 4、 IL 12、 IL— 1、 IL— 6、 TNFなどの T細胞の増殖 、分ィ匕を増強するサイト力イン等、ならびに NKT細胞を活性ィ匕する αガラクトシルセラ ミドゃ ToU様レセプターに結合して自然免疫系を活性化する CpG、リポ多糖 (LPS)な ども補助剤として用いることができる。
[0053] また、 HLA-A24陽性患者力 採取した細胞または、 HLA-A24陽性の他人（ァ口）由 来の細胞に試験管内で当該抗原ペプチドを加え、抗原提示させた後、患者の血管 内に投与し、患者の体内で効果的にキラー T細胞を誘導することもできる。また、患者 末梢血リンパ球に当該ペプチドを加えて試験管内で培養することにより、試験管内で キラー T細胞を誘導した後に患者血管内に戻すこともできる。このような細胞移入によ る治療は既に癌治療法として実施されており、当業者間ではよく知られた方法である
[0054] 本発明のペプチドを体内に注入することにより、腫瘍反応性 T細胞を誘導し、その 結果、抗腫瘍効果が期待できる。また、リンパ球をエタソビボあるいはインビトロで本 発明のペプチドで刺激すると活性化 T細胞が誘導され、この活性化された T細胞を 患部に注入することによる養子免疫療法に有効に用いることができる。
[0055] 以下の実施例により本発明を更に説明するが、本発明はこれら実施例に限定され るものではない。
実施例
[0056] [実施例 1]
(l) cDNAマイクロアレイ解析
摘出した、び漫性浸潤性胃癌患者の癌部と非癌部組織を Laser capture microdisse ctionにより分別して切り出し、各組織より RNAを抽出した。これらの RNAより、逆転写 反応により cDNAを合成する際に、癌部 cDNAを Cy5で非癌部 cDNAを Cy3で蛍光標 識した後に混合し、ターゲット DNAとした。プローブ cDNAをアレイしたスライドガラス上 でノ、イブリダィゼーシヨンを行った後、非特異的な結合を洗浄し取り除き、 CCDカメラ あるいは蛍光スキャナーを用いてハイブリダィゼーシヨン後の蛍光画像を取込み、疑 似カラー (Cy5:赤、 Cy3:緑)をつけて表示するとともに、それぞれの蛍光強度の比 (R/ G)を計算し、遺伝子発現プロファイルとして示した。さらに、び漫性浸潤性胃癌患者 2 0例の癌部と非癌部における 23,040種類の遺伝子の発現を比較検討することにより、 多くの症例で、癌部/非癌部の発現の比が 5以上の遺伝子を 15種類選び出した（図 1
) o
[0057] 次に各遺伝子について 29臓器 (胎生期の 4臓器を含む）の正常組織における 23,04 0種類の遺伝子の発現プロファイルを解析して、正常臓器では発現が低 ヽ遺伝子を 選び出した。今回われわれが腫瘍抗原として選定した SPARCは、び漫性浸潤性胃癌 患者 20例中 11例で癌部/非癌部の発現の比が 5以上（平均 133,359倍)で、一部の正 常組織にも発現して 、るが、癌部と比較するとその発現は著しく低力つた（図 2)。
[0058] [実施例 2]
(2)ヒト HLA-A24およびマウス Kd拘束性 SPARCペプチドレパートリーの選択
95%の相同性を有するヒトとマウスの SPARCにおいて、アミノ酸配列が共通している ペプチド部分の中から以下のペプチドを選んだ。ヒト HLA-A24およびマウス Kd分子に 共に強く結合するペプチドに、共通して観察されるアミノ酸配列に関する既知の情報 をもとに、 SPARC分子の全アミノ酸配列について探索し、両分子に結合親和性が高 いと推定されるペプチドのレパートリーを、コンピュータープログラムを利用して選択し た。その結果、候補ペプチドとして 4種類を決定した (表 1)。
[0059] [表 1] ヒト HLA-A24およびマウス Kd分子に共通して結合性を
示すと推定される SPARC由来のぺプチド
Peptide Sequence Start Binding score
position A24 Kd
SPARC- Kd-1 DYIGPCKYI 143 75 400
SPARC- Kd-2 HFFATKCTL 123 20 1382
SPARC- Kd- 3 EFPLRMRDWL 161 30 960
SPARC- Kd-4 MYIFPVHWQF 225 210 120
Predicted by http://bimas.dcii.nih. pv/cqi-bin/moEbio/ken parker comboform
[0060] SPARC Kd-1：配列番号 1
SPARC Kd-3 :配列番号 2
SPARC Kd-4:配列番号 3
[0061] (3)榭状細胞（DC)ワクチン
BALB/c骨髄由来の骨髄細胞力 GM-CSFを用いて、骨髄細胞由来の榭状細胞（ BM- DC)を誘導した。誘導法に関しては、先に報告した方法 (Nakatsura,Tら Clin Cane er Res 10, 8630-8640, 2004)を用いた。このようにして得られた BM- DCに、上記で決 定したペプチド 4種類の混合物と 10 μ Μの濃度で 2時間培養した後、一匹あたり 5 X 1 05の個数を腹腔内に投与した。 1週間の間隔をおいて 2回同様に投与しマウスを免疫 した後、マウスの脾細胞を回収してキラー Τ細胞の検出に用いた。 CD8+T細胞由来の キラー Τ細胞の誘導を厳密に検討するために、脾臓の採取後に脾細胞力も MACSビ ーズを用いて CD4+T細胞を取り除 、たものを用いた。
[0062] キラー T細胞が認識する SPARCペプチドの決定に用いたプロトコールを以下に示 す。 （免疫マウスからの脾細胞回収日を Day 0とする）
Day -21 (1) BALB/cマウスの骨髄細胞に GM-CSFを加え、骨髄由来の榭状細胞（ 以下 BM-DC)の誘導を開始する。
Day -14 (2)誘導した BM- DCに 4種類の SPARCペプチドの混合物を添カ卩し、 2時間 後に 1匹あたり 5 X 105個を腹腔内に投与する。
(1X2)を 1週毎 2回繰り返す。 Day 0 免疫した BALB/cマウスの脾細胞を回収し、再び BM- DCに、それぞれの SPA RCペプチドを添加して 2時間たつたものと共培養した後に 6日間培養した。
Day 6 SPARCペプチドを特異的に認識するキラー T細胞を検出するために、 Cr放出 試験を行った。キラー T細胞により傷害されるターゲット腫瘍細胞として T2Kd細胞、 RL male 1細胞株、 Meth A細胞株および BALB/3T3細胞株を設定した。
[0063] (4) Cr放出試験による SPARC特異的キラー T細胞による腫瘍細胞傷害の検討
誘導した SPARC特異的キラー T細胞の腫瘍細胞に対する細胞傷害活性を、以下の ようにして検討した。 T2Kd細胞は TAP遺伝子の発現を欠損するマウス T2細胞株に、 K d遺伝子を導入した細胞株である。 TAP欠損により外部から添加したペプチド力 SMHC クラス I分子に結合する性質を持つ場合にのみ、当該 MHCクラス I分子とペプチドの複 合体が細胞表面に発現する。 RL male 1細胞株は、 BALB/cマウス由来の T細胞性白 血病細胞である。両細胞ともに SPARCを発現していない。いっぽう、 Meth Aと BALB/ 3T3細胞株は、 BALB/cマウス由来の繊維肉腫細胞株および繊維芽細胞細胞株で S PARCを発現している。これらの細胞株を放射性クロミゥム (Cr)で標識した後に、上記 のキラー T細胞と 4時間培養した後に培養上清を回収して、死細胞力も放出された放 射性 Crの量を定量して細胞傷害活性を検出した。
[0064] その結果、 SPARCを発現して!/、な!/、T2Kd細胞および RL male 1に対する細胞傷害 は観察されな力つた力 SPARC Kdペプチド 1、 3および 4を負荷することにより、細胞表 面に当該 SPARC Kdペプチドと Kd分子の複合体を発現した T2Kd細胞、 SPARCを自然 発現している Meth Aおよび BALB/3T3に対して、特異的に細胞傷害活性が観察され た (図 3)。
[0065] [実施例 3]
(5) SPARCペプチドの免疫による BALB/cマウスにおける抗腫瘍免疫の誘導
(方法）
BM- DCを 10 μ Μの SPARC Kd -1,3,4混合ペプチドと 2時間培養した後に、一匹あ たり 5 X 105個を腹腔内に投与した。 1週間の間隔をおいて、同様にペプチド負荷 BM- DCを投与してマウスを合計 2回免疫した 7日後に、マウス SPARCを高発現するマウス 繊維肉腫細胞株 Meth A(l X 106)を皮下に移植し、腫瘍の増殖とマウスの生存期間 を検討した。
[0066] (結果）
結果を図 4に示す。 SPARCペプチドパルス BM-DCの予防的投与は、皮下移植した Meth Aに対する増殖抑制効果、およびマウスの生存期間の延長を誘導できた。 産業上の利用可能性
[0067] HLA-A24 (A * 2402)は日本人の約 60%が所有する、最も頻度が高!ヽ HLAクラス I 対立遺伝子である。 HLAクラス I分子に対応する、 BALB/cマウスの Kd分子に結合す るペプチドのアミノ酸配列は、ヒトの HLA-A24に結合するペプチドのそれと非常に良 く類似している。したがって、 BALB/cマウスにペプチドを免疫した際に、ペプチドが K d分子に結合して、キラー T細胞を誘導し、これが当該ペプチドと Kd分子の複合体を 発現する癌細胞を破壊する場合には、当該ペプチドは HLA-A24に結合して、同様 に癌細胞を破壊するヒト 'キラー T細胞、を誘導できることが明らかになつている。従つ て、本発明で提示するペプチドは、 HLA-A24を所有する、びまん性浸潤性胃癌、脾 臓癌およびメラノーマ患者の免疫療法に応用することが可能であり、これらの癌の増 殖や進展を抑制することにより、患者の QOLを改善することができると期待される。 図面の簡単な説明
[0068] [図 1]図 1は、びまん性浸潤性胃癌の患者 20例の cDNAマイクロアレイ解析により同 定した、正常胃粘膜と比較して胃癌組織において高発現する、ベスト 15の遺伝子に ついて、個々の症例における発現の程度を示したものである。この中より、以下に示 す正常組織の cDNAマイクロアレイ解析結果を含めて考慮し、癌部に特異的に高発 現する Secreted protein acidic and rich in cysteine (SPARC)を、びまん性浸潤性胃癌 における最も理想的な癌特異抗原として選定した。
[図 2]図 2は、 cDNAマイクロアレイを用いて、 25種類の成人の主要臓器および 4種類 の胎生期の臓器における SPARCの発現を解析したものである。 SPARC遺伝子の発 現は、一部の正常組織にも観察されるが、癌部と比較すると発現の程度は著しく低か つた o
[図 3]図 3は、 BALB/cマウスにおいて、マウス Kd拘束性 SPARC Kd -1, Kd -3,あるい は Kd -4ェピトープペプチドを用いて誘導した CTLによる、 SPARC陽性腫瘍細胞の傷 害を示す。
[図 4]図 4は、 SPARC Kd -1, Kd -3および Kd -4ペプチドを混合して負荷した、骨髄樹 状細胞（BM- DC)の BALB/cマウスへの前投与による、皮下移植された Meth A癌細 胞の増殖抑制と生存期間の延長を示す。

Claims

請求の範囲
[1] 以下の何れかのペプチド。
(A)配列番号 1から 3の何れかに示すアミノ酸配列力 なるペプチド。
(B)配列番号 1から 3の何れかに示すアミノ酸配列力 なるペプチドにお 、て、 1又は 数個のアミノ酸が置換又は付加されたアミノ酸配列力もなり、細胞傷害性 (キラー) T 細胞の誘導能を有するペプチド。
[2] 請求項 1に記載のペプチドを少なくとも 1種類以上を含む、癌に対する免疫誘導剤。
[3] 請求項 1に記載のペプチドを少なくとも 1種類以上を含む、腫瘍の治療及び Zまたは 予防のための医薬。
[4] 請求項 1に記載のペプチドを少なくとも 1種類以上を含む、腫瘍反応性 T細胞の誘導 能が高！ヽ抗原提示細胞を誘導するための薬剤。
[5] 請求項 1に記載のペプチドを少なくとも 1種類以上を含む、腫瘍反応性 T細胞を誘導 するための薬剤。
[6] 以下の何れかのペプチドをコードする遺伝子を含む、腫瘍反応性 T細胞の誘導能が 高 ヽ抗原提示細胞を誘導するための薬剤。
(A)配列番号 1から 3の何れかに示すアミノ酸配列力 なるペプチド。
(B)配列番号 1から 3の何れかに示すアミノ酸配列力 なるペプチドにお 、て、 1又は 数個のアミノ酸が置換又は付加されたアミノ酸配列力もなり、キラー T細胞の誘導能を 有するペプチド。
[7] 請求項 1に記載のペプチドに対する抗体。
[8] 請求項 1に記載のペプチドを用いて誘導される、キラー T細胞、ヘルパー T細胞、又 はこれらを含む免疫細胞集団。
[9] HLA分子と請求項 1に記載のペプチドとの複合体を提示する抗原提示細胞。
[10] 請求項 4又は 6に記載の薬剤によって誘導される、請求項 9に記載の抗原提示細胞
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