ES2747734T3 - Inmunoterapia novedosa contra varios tumores de la sangre, como la leucemia mielógena aguda (LMA) - Google Patents

Inmunoterapia novedosa contra varios tumores de la sangre, como la leucemia mielógena aguda (LMA) Download PDF

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Abstract

Un péptido de entre 9 y 30 aminoácidos de longitud, el cual comprende una secuencia de aminoácidos KLQEQLAQL acorde con la SEQ ID N.º 266, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

Description

DESCRIPCIÓN
Inmunoterapia novedosa contra varios tumores de la sangre, como la leucemia mielógena aguda (LMA)
La presente invención se refiere a péptidos, ácidos nucleicos y células destinados a la utilización en métodos inmunoterapéuticos. En particular, la presente invención se refiere a la inmunoterapia contra el cáncer. La presente invención se refiere asimismo a epítopos peptídicos para linfocitos T citotóxicos (c Tl ) asociados a tumores, solos o en combinación con otros péptidos asociados a tumores que pueden servir como principios activos farmacéuticos en composiciones vacunales destinadas a estimular respuestas inmunitarias antitumorales. La presente invención se refiere a varias secuencias peptídicas nuevas y sus variantes derivadas de moléculas HLA de clase I de células tumorales humanas que pueden ser utilizadas en composiciones vacunales para desencadenar respuestas inmunitarias antitumorales.
Antecedentes de la invención
La leucemia mielógena aguda (LMA), llamada también leucemia mieloide aguda o leucemia no linfocítica aguda (LNLA), es un cáncer de la estirpe mieloide de células sanguíneas que se caracteriza por el rápido crecimiento y acumulación en la médula ósea de leucocitos anómalos que interfieren con la producción de células sanguíneas normales. La LMA es la leucemia aguda más frecuente en los adultos y su incidencia aumenta con la edad. A pesar de ser una enfermedad relativamente rara, pues supone alrededor del 1,2% de las muertes por cáncer en los Estados Unidos, se prevé que su incidencia aumente a causa del envejecimiento de la población.
Los síntomas de la LMA surgen a raíz de la sustitución de la médula ósea normal por células leucémicas, que causa un descenso acusado de los hematíes, los trombocitos y los leucocitos normales. Entre los síntomas descritos figuran fatiga, disnea, propensión a sufrir hematomas y hemorragias y mayor riesgo de infección. Se conocen diversos factores de riesgo y anomalías cromosómicas, pero la causa concreta no está clara. Como leucemia aguda que es, la LMA evoluciona con rapidez y suele provocar la muerte en el plazo de semanas o meses si no es tratada.
La LMA se divide en varios subtipos, con diversos tratamientos y pronósticos. La supervivencia a cinco años está situada entre el 15% y el 70%, y la tasa de recidiva entre el 33% y el 78%, dependiendo del subtipo. La LMA se trata inicialmente con quimioterapia con objeto de inducir la remisión; los pacientes pueden recibir quimioterapia complementaria o ser sometidos a un trasplante de hemocitoblastos.
La patente de EE.UU. 2005/0261190 A1 da a conocer fragmentos polipeptídicos del Factor 1 asociado a Fas, que se une a Hsc70/Hsp70, proteínas ubiquitinizadas o proteínas portadoras de valosina. Algunos de los fragmentos incluyen la SEQ ID N.° 5 tal y como se revela en la presente memoria.
De forma similar, KR100692416 revela un fragmento de FAF-1 (Factor 1 asociado a Fas) que ejerce efectos inhibidores sobre la angiogénesis y la proliferación celular. Por lo que se lo propone como agente anticanceroso, p. ej. como inhibidor de metástasis tumorales. La fracción poseedora del efecto inhibitorio de las metástasis tumorales está compuesta por los aminoácidos 290-345 de FAF1.
Hassan et al. (The human leukocyte antigen-presented ligandome of B lymphocytes. Mol Cell Proteomics. 2013 Jul;12(7):1829-43) dan a conocer la identificación y la cuantificación relativa de 14.500 ligandos peptídicos que constituyen el ligandoma HLA de los linfocitos B como punto de partida para resolver un gran número de preguntas inmunológicas concretas.
Kowalewski et al. (Mapping The HLA Ligandome Of Chronic Lymphocytic Leukemia - Towards Peptide Based Immunotherapy, Blood 2013; 122(21):4123) describen un método para analizar los peptidomas HLA de clase I de 25 pacientes con leucemia linfocítica crónica (LLC) y 35 controles sanos.
La patente de EE.UU. 2011/287442 A1 identifica péptidos derivados de Top2aC que podrían unirse a H-2K<b> y que fueron examinados mediante un sistema de análisis predictivo de motivos peptídicos (BIMAS). No obstante, no se identificó el presente péptido, y solo uno de los cinco péptidos que figuran en la patente de EE.UU. 2011/287442 A1 resultó inmunogénico en última instancia (Figura 9).
Veeraraghavan, S. (Mapping of the immunodominant T cell epitopes of the protein topoisomerase I, Annals of the Rheumatic Diseases, vol. 63, n.° 8, 2004, páginas 982-987) también predice epítopos con medios informáticos, y además concierne a autoanticuerpos en enfermedades autoinmunitarias. Además de estar mediados por MHC de clase II, Veeraraghavan no pudo establecer ATA con péptidos específicos (discusión), por lo que no motiva a las personas versadas en la materia a buscar péptidos de MHC de clase I que estén vinculados con el cáncer.
A pesar de lo dicho, sigue existiendo la necesidad de nuevas opciones de tratamiento eficaces y seguras para cánceres como los sanguíneos, en particular para la leucemia mielógena aguda (LMA) y otros tipos de cáncer sanguíneo de diferentes fenotipos que mejoren el bienestar de los pacientes al prescindir del uso excesivo de quimioterapéuticos o de otros agentes que pueden causar efectos secundarios graves.
La presente invención emplea péptidos que estimulan el sistema inmunitario del paciente y actúan como agentes antitumorales no invasivos.
Resumen de la invención
En un primer aspecto de la presente invención, la presente invención concierne a un péptido de entre 9 y 30 aminoácidos de longitud, el cual comprende una secuencia de aminoácidos KLQEQLAQL acorde con la SEQ ID N.° 266, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
Las tablas siguientes muestran los péptidos dados a conocer, sus respectivas SEQ ID N.°, y las presuntas proteínas originarias de tales péptidos. Todos los péptidos de la Tabla 1 se unen a los alelos HLA A, HLA B o HLAC; los péptidos de la Tabla 2 se han identificado como derivados de antígenos relacionados con la LMA, y los péptidos de la Tabla 3 se unen a alelos HLA-DR (MHC de clase II). Los péptidos de clase II de la Tabla 3, además, son útiles para el diagnóstico y/o el tratamiento de la LMA, la leucemia linfocítica crónica (LLC) y otros tipos de neoplasias malignas hematológicas que sobreexpresan o presentan en exceso el correspondiente polipéptido subyacente.
La presente invención se refiere en concreto al péptido de la presente invención consistente en la secuencia conforme a las SEQ ID N.° 266.
Tabla 1: Péptidos conformes a la presente invención, con los polipéptidos subyacentes resaltados en negrita. La SEQ ID N.° 266 es acorde con la invención.
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continuación
Figure imgf000004_0001
continuación
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continuación
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continuación
Figure imgf000011_0001
La tabla muestra los antígenos asociados a tumor derivados del ligandoma HLA de clase I (LiTAA) cuyas frecuencias de representación son >20% en pacientes con LMA (n=15) y representa los ligandos HLA (LiTAP) anotados con su restricción de HLA respectiva. Abreviaturas: rep., representación; n.a., no asignado
Tabla 2 : Péptidos adicionales según la presente invención que están relacionados con antígenos subyacentes descritos como relacionados con la LMA
Figure imgf000011_0002
continuación
Figure imgf000012_0001
continuación
Figure imgf000013_0001
WT1 Tumor de Wilms 1 10[33,3] / 0[0,0] 3[20,0]
AFTVHFSGQF 0/0 2 A*23
GVFRGIQDV 0/0 1 A*02:01
QRNMTKLQL 1/0 0 n.a. RmFPNAPYL 9/0 1 A*02:01, E MAGED1 Familia de antígenos 15[50,0] / 3[60,0] 6[40,0]
del melanoma D, 1
EAAAEAKAR 1/0 1 A*66
IIKEYTDVY 1/0 0 B*15:01
KEIDKNDHL 1/0 0 B*40:01
KVSKASGVSK 2/0 1 A*03
MPATETKKV 1/0 0 B*07
NADPQAVTm 5/0 0 A*02 RSDmLKDII 0/0 1 n.a.
SESGAGLTRF 0/0 1 B*44:25
SMMQTLLTV 1/0 0 A*02
TEVSKTPEA 4/2 3 B*49:01
VEVPETPKA 2/1 1 B*50
DVYPEIIER 6/1 2 A*66, A*68 AURKA Aurora cinasa A 0[0,0] / 0[0,0] 1[6,7]
REVEIQSHL 0/0 1 B*49:01
CCNA1 Ciclina D1 0[0,0] / 0[0,0] 2[13,3]
EPPAVLLL 0/0 1 B*51:01
LEADPFLKY 0/0 1 B*18:01
MUC1 Mucina 1, asociada a 1[3,3] / 0[0,0] 0 [0,0]
superficie celular
TTQGQDVTLA 1/0 0 n.a. MPO Mieloperoxidasa 0[0,0] / 3[60,0] 6[40,0]
AEYEDGFSIP 0/1 0 B*50
AQISLPRI 0/1 0 B*13
DFTPEPAAR 0/0 2 A*66
DNTGITTVSK 0/1 0 A*68
EEAKQLVDKAY 0/0 1 B*44
ERRESIKQ 0/0 1 n.a. ETVGQLGTVLR 0/1 1 A*66, A*68
FEQVMRIGL 0/0 1 B*40
FSMQQRQAL 0/0 1 C*03
GVPFFSSLR 0/1 1 A*66, A*68 continuación
Figure imgf000014_0001
La tabla expone los ligandos HLA presentados que derivan de los antígenos confirmados como asociados a la LMA anotados con la muestra originaria, las frecuencias de representación en diversos tejidos (15 muestras de LMA, 30 muestras de PBMC, 5 muestras de BMNC) y la correspondiente restricción de HLA. Abreviaturas: rep., representación; n.a., no asignado.
Los péptidos de la siguiente Tabla 3 son útiles para el diagnóstico y/o el tratamiento de las neoplasias malignas hematológicas, la LMA y/o la leucemia linfocítica crónica (LLC), pero preferiblemente para la LMA.
Tabla 3: Péptidos MHC de clase II dados a conocer
Figure imgf000015_0001
(continuación)
Figure imgf000016_0001
(continuación)
Figure imgf000017_0001
(continuación)
Figure imgf000018_0001
La tabla muestra los antígenos asociados a tumor derivados del ligandoma HLA de clase II (LiTAA) cuyas frecuencias de representación son >20% en pacientes con LMA (n=12) y representa los ligandos HLA (LiTAP). Abreviaturas:rep., representación.
Los péptidos mostrados a continuación en la Tabla 4 son útiles para el diagnóstico y/o el tratamiento de la LMA o la LLC, pero preferiblemente de la LMA.
Tabla 4 : Péptidos conforme a la presente invención que pueden ser usados para el tratamiento de la LMA y de la
LLC
SEQ ID N°: Secuencia
448 APVELILSDETLPAPE
520 DDNIKTYSDHPEK
471 EKGVRTLTAAAVSGAQ
472 EKGVRTLTAAAVSGAQP
439 ELTLGEFLK
353 FLDPRPLTV
522 GDKVYVHLKNLASRPY
318 GLDPNKPPEL
178 HEIDRYTAI
68 IGVEHVVVY
201 IPVVHASI
474 KGVRTLTAAAVSGAQ
381 KLDNQVSKV
323 KLYELHVFTF
46 KLYPTLVIR
241 KTIAFLLPMF
450 LAPLEGARFALVRED
357 LEKQLIEL
491 LNSLTYQVLDVQRYP
492 LPQLVGVSTPLQG
493 LPQLVGVSTPLQGG
494 LPQLVGVSTPLQGGS
441 LTLGEFLK
(continuación)
SEQ ID N°: Secuencia
442 LTLGEFLKL
498 RKSRQGSLAMEELK
495 RLPQLVGVSTPLQGGS
354 SAFADRPAF
45 SEETFRFEL
382 SENVKLFSA
445 SQLTTLSFY
443 TLGEFLKL
202 TVADQVLVGSY
179 VFTLKPLEF
296 VIYNEQMASK
383 VQKLQNII
525 VYVHLKNLASRPY
325 YLNKEIEEA
180 YWVPRNAL
Así pues, se prefiere particularmente como mínimo un péptido conforme a la presente invención seleccionado del grupo consistente en las SEQ ID N.° 448, 520, 471, 472, 439, 353, 522, 318, 178, 68, 201, 474, 381, 323, 46, 241, 450, 357, 491,492, 493, 494, 441, 442, 498, 495, 354, 45, 382, 445, 443, 202, 179, 296, 383, 525, 325 y 180, y el uso del mismo en el tratamiento de la LMA y/o de la LLC tal y como se describe en la presente memoria.
La presente invención se refiere, además, a los péptidos acordes con la presente invención para el uso en el tratamiento de otras enfermedades proliferativas distintas de la LMA, como, por ejemplo, la LLC. No obstante, tal y como muestra a continuación la tabla 5, muchos de los péptidos acordes con la presente invención pueden ser utilizados también en otras indicaciones.
Tabla 5 : Péptidos dados a conocer y usos específicos de los mismos en otras enfermedades proliferativas, opcionalmente en otros órganos. La SEQ ID N.° 266 es acorde con la invención.
Seq. Secuencia Enfermedad proliferativa y localización de la misma ID
1 AEQFRLEQI colon o recto, pulmón, carcinoma microcítico
2 FTAEFSSRY colon o recto, pulmón, carcinoma microcítico
3 HHDESVLTNVF colon o recto, pulmón, carcinoma microcítico
4 REQDEAYRL colon o recto, pulmón, carcinoma microcítico
5 RPVMPSRQI colon o recto, pulmón, carcinoma microcítico
6 VQREYNLNF colon o recto, pulmón, carcinoma microcítico
7 GQLPITIQV riñón, carcinoma renal de células claras, hueso, fibroma no osificante
8 RAYADEVAV riñón, carcinoma renal de células claras, hueso, fibroma no osificante
9 REDKPPLAV riñón, carcinoma renal de células claras, hueso, fibroma no osificante
10 RVKDLDTEKY riñón, carcinoma renal de células claras, hueso, fibroma no osificante
11 SEQEMNAHL riñón, carcinoma renal de células claras, hueso, fibroma no osificante
12 YVLPLVHSL riñón, carcinoma renal de células claras, hueso, fibroma no osificante
13 LPLRFWVNI hígado, carcinoma hepatocelular, cáncer, páncreas,
adenocarcinoma
14 EVAEHVQYM colon o recto, próstata, hiperplasia nodular benigna
(continuación)
Seq. Secuencia Enfermedad proliferativa y localización de la misma ID
15 YMAELIERL colon o recto, próstata, hiperplasia nodular benigna 16 ALASLIRSV glándula tiroides, hiperplasia nodular
17 TVAEITGSKY glándula tiroides, hiperplasia nodular
18 ENGKRGIIGY colon o recto, riñón, carcinoma
19 NLVEKTPAL colon o recto, riñón, carcinoma
20 IEDKAQILL histiocitoma fibroso maligno
21 SIYDDSYLGY histiocitoma fibroso maligno
22 TTNHPINPK histiocitoma fibroso maligno
23 NAAILKKV encéfalo, glioblastoma, glándula tiroides, hiperplasia nodular
24 NYLDIKGLL encéfalo, glioblastoma, glándula tiroides, hiperplasia nodular
25 YLDIKGLLDV encéfalo, glioblastoma, glándula tiroides, hiperplasia nodular
26 EEVGDFIQRY pulmón, carcinoma de pulmón amicrocítico,
27 EVGDFIQRY pulmón, carcinoma de pulmón amicrocítico,
28 MKDLSLGGVL pulmón, carcinoma de pulmón amicrocítico,
29 DEFITVHSM estómago, piel, carcinoma basocelular
30 EFITVHSML estómago, piel, carcinoma basocelular
31 GQLDVRELI estómago, piel, carcinoma basocelular
32 TQYIIHNY estómago, piel, carcinoma basocelular
33 EVVDVTWRY colon o recto, ganglios linfáticos, linfoma no hodgkiniano 34 KEALLRDTI colon o recto, ganglios linfáticos, linfoma no hodgkiniano 35 HGYENPTYK pulmón, carcinoma de pulmón amicrocítico, riñón, carcinoma
36 SLLYKVPYV pulmón, carcinoma de pulmón amicrocítico, riñón, carcinoma
37 AEIPLRMV estómago, metastásico, adenocarcinoma
38 EVVYRFTAR estómago, metastásico, adenocarcinoma
39 FPGLAIKI estómago, metastásico, adenocarcinoma
40 IYNGKLFDL estómago, metastásico, adenocarcinoma
41 IYNGKLFDLL estómago, metastásico, adenocarcinoma
42 KEIDVISI estómago, metastásico, adenocarcinoma
43 LEEQASRQI estómago, metastásico, adenocarcinoma
44 TRMSTVSEL estómago, metastásico, adenocarcinoma
45 SEETFRFEL estómago, adenocarcinoma, endometrio, adenocarcinoma
46 KLYPTLVIR estómago, adenocarcinoma, endometrio, adenocarcinoma
47 ALRNQATMVQK estómago, adenocarcinoma, linfoma no hodgkiniano, micosis fungoide
48 LLDHAPPEI estómago, adenocarcinoma, linfoma no hodgkiniano, micosis fungoide
49 GVLGTVVHGK colon o recto, hígado, hiperplasia nodular focal 50 VQFIGRESKY colon o recto, hígado, hiperplasia nodular focal 51 GQSLIHVI glándula paratiroides, adenoma
52 VHSPAGMAL glándula paratiroides, adenoma
53 VLYEGIKVGK glándula paratiroides, adenoma
54 AVIEAEKIAQV ovario, tumor de células granulares,
55 DRIEVVNML ovario, tumor de células granulares,
(continuación)
Seq. Secuencia Enfermedad proliferativa y localización de la misma ID
56 IEAEKIAQV ovario, tumor de células granulares,
57 IEDLKAQIL cuello uterino, carcinoma escamoso,
58 YLLESVNKL cuello uterino, carcinoma escamoso,
59 HRIYVPLML estómago, adenocarcinoma difuso, páncreas, adenocarcinoma
60 KEYIPPLIW estómago, adenocarcinoma, páncreas, adenocarcinoma 61 MDKLVVEY estómago, adenocarcinoma, páncreas, adenocarcinoma 62 ALLGHILLH riñón, carcinoma renal, células no claras,
63 ALLPHLYTL riñón, carcinoma renal, células no claras,
64 HVAGETVAR riñón, carcinoma renal, células no claras,
65 KVWPGSTAF riñón, carcinoma renal, células no claras,
66 ETAVAILRF carcinoma lobular de mama infiltrante y metastásico 67 RVYNTDPLKEK endometrio, adenocarcinoma,
68 IGVEHVVVY encéfalo, cáncer, riñón, oncocitoma
69 RQIGVEHVV encéfalo, cáncer, riñón, oncocitoma
70 DVFERPSAKK riñón, carcinoma renal de células claras, sarcoma sinovial
71 EEFQFIKKA riñón, carcinoma renal de células claras, sarcoma sinovial
72 THLVDQDTTSF riñón, carcinoma renal de células claras, sarcoma sinovial
73 ESADLIQHY páncreas, adenocarcinoma, riñón, carcinoma de células renales
74 EIIKEISIM páncreas, adenocarcinoma, ganglios linfáticos, enfermedad de Hodgkin
75 SVSDIIRLR páncreas, adenocarcinoma, ganglios linfáticos, enfermedad de Hodgkin
76 AVSLIREEW estómago, adenocarcinoma, leucocitos, leucemia linfocítica crónica
77 GEKSESISV estómago, adenocarcinoma, leucocitos, leucemia linfocítica crónica
78 FLTILPEEL páncreas, adenocarcinoma, pulmón, adenocarcinoma 79 ILWETVPSM colon o recto, carcinoma de células renales metastásico 80 LPVRTLSI colon o recto, carcinoma de células renales metastásico 81 RESEYKQVY colon o recto, carcinoma de células renales metastásico 82 SESLPVRTL colon o recto, carcinoma de células renales metastásico 83 RLLESVVVL pulmón, carcinoma de pulmón amicrocítico, bazo, leucemia mielógena crónica
84 RPEEGKESL pulmón, carcinoma de pulmón amicrocítico, bazo, leucemia mielógena crónica
85 THGKLVILF pulmón, carcinoma de pulmón amicrocítico, bazo, leucemia mielógena crónica
86 KELEHLSHI estómago, adenocarcinoma,
87 REMENYEKI estómago, adenocarcinoma,
88 VLLSTIHEL estómago, adenocarcinoma,
89 KTYTKSSHLK estómago, adenocarcinoma, encéfalo, meningioma, 90 EIIEKNFDY estómago, adenocarcinoma,
91 GTEEAPKVFK estómago, adenocarcinoma,
92 KLMAIPLVF estómago, adenocarcinoma
93 DIKRGIPN estómago, adenocarcinoma, pulmón, carcinoma microcítico
94 DIKRGIPNY estómago, adenocarcinoma, pulmón, carcinoma (continuación)
Seq. Secuencia Enfermedad proliferativa y localización de la misma ID
microcítico
95 FLDITNPKA estómago, adenocarcinoma diferenciado, pulmón, carcinoma microcítico
96 ALYSVYRQK riñón, angiomiolipoma
97 KVLALVFGF riñón, angiomiolipoma
98 SFTDVIGHY riñón, angiomiolipoma
99 ASAAASGGLLK colon o recto, bazo, hematopoyesis extramedular 100 ALLGVTGAPK colon o recto, bazo, hematopoyesis extramedular 101 DEIKTLQRY estómago, adenocarcinoma, hígado, tumor carcinoide, metastásico
102 EAYVQKMV estómago, adenocarcinoma, hígado, tumor carcinoide, metastásico
103 VLHQDSGLGY estómago, adenocarcinoma, hígado, tumor carcinoide, metastásico
104 YLQNHFVGL estómago, adenocarcinoma, hígado, tumor carcinoide, metastásico
105 AEIEDIRVL estómago, metastásico, duodeno, adenocarcinoma 106 GQSRLIFTY estómago, metastásico, duodeno, adenocarcinoma 107 READFKETL estómago, metastásico, duodeno, adenocarcinoma 108 DTMGPSQHVY pulmón, carcinoma de pulmón amicrocítico, bazo, hematopoyesis extramedular
109 ESRGPALTR pulmón, carcinoma de pulmón amicrocítico, bazo, hematopoyesis extramedular
110 FQLPGLGTPPIT pulmón, carcinoma de pulmón amicrocítico, bazo, hematopoyesis extramedular
111 RIQGYVVSW pulmón, carcinoma de pulmón amicrocítico, bazo, hematopoyesis extramedular
112 LLDPSVFHV estómago, adenocarcinoma, testículo, seminoma 113 RFFHLADLF estómago, adenocarcinoma, testículo, seminoma 114 DSISGNLQR estómago, metastásico, hueso, fibroma no osificante 115 ETEQTIQKL estómago, metastásico, hueso, fibroma no osificante 116 FLYPFLSHL estómago, metastásico, hueso, fibroma no osificante 117 TLDQKIERV estómago, metastásico, hueso, fibroma no osificante 118 DADSRAATV hígado, carcinoma hepatocelular, riñón, carcinoma de células renales
119 DHEGFGFVL hígado, carcinoma hepatocelular, riñón, carcinoma de células renales
120 GEAVKVLSI hígado, carcinoma hepatocelular, riñón, carcinoma de células renales
121 NATDLLKVL hígado, carcinoma hepatocelular, riñón, carcinoma de células renales
122 KEITEGKTV estómago, metastásico, recto, adenocarcinoma 123 YRQKQVVIL estómago, metastásico, recto, adenocarcinoma 124 VAINLIVQH estómago, metastásico, recto, adenocarcinoma 127 DAIKVFVRI estómago, adenocarcinoma, riñón, tumor de Wilm 128 LEKAFSEI estómago, adenocarcinoma, riñón, tumor de Wilm 129 MEKSDKNQ estómago, adenocarcinoma, riñón, tumor de Wilm 130 GQTGSGKTF estómago, adenocarcinoma, recto, adenocarcinoma 131 DTSPDLSSR pulmón, carcinoma de pulmón amicrocítico, testículo, seminoma
132 KLNEVIVNK pulmón, carcinoma de pulmón amicrocítico, testículo, seminoma
133 FAQIISVALI estómago, adenocarcinoma, glándula paratiroides, adenoma
(continuación)
Seq. Secuencia Enfermedad proliferativa y localización de la misma ID
134 IIFDRPLLY estómago, adenocarcinoma, glándula paratiroides, adenoma
135 DAVNQNTKLL ovario, adenocarcinoma, de células claras
136 HHILADVSL ovario, adenocarcinoma, de células claras
137 YPSEKRGEL ovario, adenocarcinoma, de células claras
138 SVVDLINHY encéfalo, glioblastoma, hueso, fibroma no osificante 139 EIIEKDTKY estómago, metastásico, pulmón, carcinoma macrocelular
140 ENEEKLKEL estómago, metastásico, pulmón, carcinoma macrocelular
141 ILGGPGTVQGV hígado, carcinoma hepatocelular, cáncer, vulva, carcinoma escamoso
142 ESAALIHHY hígado, carcinoma hepatocelular, fibromatosis 143 YQRETPQV hígado, carcinoma hepatocelular, fibromatosis 144 ARIEIGLHY hígado, hiperplasia nodular focal
145 IPYPRPIHL hígado, hiperplasia nodular focal
146 DVSGKTALNQ riñón, carcinoma renal de células claras, estómago, tumor estromal gastrointestinal (GIST)
147 TEFRSLVI riñón, carcinoma renal de células claras, estómago, tumor estromal gastrointestinal (GIST)
148 TLKSGDGITF riñón, carcinoma renal de células claras, estómago, tumor estromal gastrointestinal (GIST)
149 HEADKTYML estómago, adenocarcinoma
150 KFFEEVLLF estómago, adenocarcinoma
151 RVMPSSFFL estómago, adenocarcinoma
152 YELDLREPAL pulmón, carcinoma de pulmón amicrocítico, pulmón, adenocarcinoma
153 GAYGKVFLV hígado, carcinoma hepatocelular, riñón, angiomiolipoma 154 DHDLLKNF riñón, carcinoma renal de células claras, riñón, nefropatía poliquística
155 EELQLIRQA riñón, carcinoma renal de células claras, riñón, nefropatía poliquística
156 AAELLKHPF próstata, adenocarcinoma
157 GRVKLSDFGF próstata, adenocarcinoma
158 KSNSIIVSPR encéfalo, glioblastoma, encéfalo, meningioma
159 ETLERLQEL hígado, carcinoma hepatocelular, cáncer, glándula parótida, adenoma pleomórfico
160 KDDELSRQ hígado, carcinoma hepatocelular, cáncer, glándula parótida, adenoma pleomórfico
161 LQQTNSEKI riñón, carcinoma renal de células claras, glándula parótida, adenoma pleomórfico
162 GEFGKPYFI colon o recto, testículo, seminoma
163 KDVKVVIL colon o recto, testículo, seminoma
164 RPVPPPPSL colon o recto, testículo, seminoma
165 KEDIPGRHSY estómago, adenocarcinoma, bazo, leucemia mielógena crónica
166 KETKAVTNF estómago, adenocarcinoma, bazo, leucemia mielógena crónica
167 YEILIHDL estómago, adenocarcinoma, bazo, leucemia mielógena crónica
168 FPRFVNVTV bazo, leucemia mielógena crónica
169 QVAGWGSQR bazo, leucemia mielógena crónica
170 WIDGVLNNPGPG bazo, leucemia mielógena crónica
171 SFMTHPEF estómago, adenocarcinoma, miometrio, leiomioma (continuación)
Seq. Secuencia Enfermedad proliferativa y localización de la misma ID
172 HYTIVFNTF colon o recto, miometrio, leiomioma
173 GTNDGPALKK colon o recto, hígado, carcinoma hepatocelular 174 IEDPVRPEV colon o recto, hígado, carcinoma hepatocelular 175 NTASGGMTR encéfalo, glioblastoma, piel, carcinoma espinocelular 176 EVIETEKTLY colon o recto, mama, carcinoma mucinoso
177 MKILNHPNI colon o recto, pulmón, carcinoma escamoso
178 HEIDRYTAI riñón, carcinoma renal de células claras, linfoma no hodgkiniano
179 VFTLKPLEF riñón, carcinoma renal de células claras, linfoma no hodgkiniano
180 YWVPRNAL riñón, carcinoma renal de células claras, linfoma no hodgkiniano
181 EVSPNLVRY estómago, metastásico, páncreas, adenocarcinoma 182 LSEIAGMTLP estómago, metastásico, páncreas, adenocarcinoma 183 FLSFMNTEL pulmón, carcinoma de pulmón amicrocítico, estómago, adenocarcinoma
184 KAVPSQKRT pulmón, carcinoma de pulmón amicrocítico, estómago, adenocarcinoma
185 LKAVPSQKRT pulmón, carcinoma de pulmón amicrocítico, estómago, adenocarcinoma
186 SLIAVFQKY pulmón, carcinoma de pulmón amicrocítico, estómago, adenocarcinoma
187 IIKEKTVVY hígado, carcinoma hepatocelular, cáncer, hígado, carcinoma hepatocelular
188 LLEQKVWEV hígado, carcinoma hepatocelular, cáncer, hígado, carcinoma hepatocelular
189 SEIAESHRF hígado, carcinoma hepatocelular, cáncer, hígado, carcinoma hepatocelular
190 YLAIGIHEL hígado, carcinoma hepatocelular, cáncer, hígado, carcinoma hepatocelular
191 IHDELQQSF colon o recto, bazo, leucemia mielógena crónica 192 AHVIDKFLL riñón, carcinoma renal
193 KAGGEFLLRY riñón, carcinoma renal
194 FEVKDLLSL riñón, carcinoma renal de células claras, encéfalo, meningioma
195 FSKAKPSVL hígado, carcinoma hepatocelular, mama, carcinoma lobular infiltrante
196 EAIKALEV estómago, metastásico, pulmón, carcinoma neuroendocrino
197 EVASAKQSVKY estómago, metastásico, pulmón, carcinoma neuroendocrino
198 IEFTYTAKL estómago, metastásico, pulmón, carcinoma neuroendocrino
199 LLADITSKY estómago, metastásico, pulmón, carcinoma neuroendocrino
200 VLVDRTIYI hígado, carcinoma hepatocelular, hígado, hiperplasia nodular focal
201 IPVVHASI estómago, adenocarcinoma, colon, adenocarcinoma 202 TVADQVLVGSY estómago, adenocarcinoma, colon, adenocarcinoma 203 VALVHPDL estómago, adenocarcinoma, colon, adenocarcinoma 204 LPDDKVTAL estómago, metastásico, estómago, adenocarcinoma 205 KIAKQIVQK pulmón, carcinoma de pulmón amicrocítico, pulmón, carcinoma neuroendocrino
206 VEKILLSVV pulmón, carcinoma de pulmón amicrocítico, pulmón, carcinoma neuroendocrino
(continuación)
Seq. Secuencia Enfermedad proliferativa y localización de la misma ID
207 APAGARGGPA colon o recto, recto, adenocarcinoma
208 EHLRKLEAE colon o recto, recto, adenocarcinoma
209 RFIPELINF colon o recto, recto, adenocarcinoma
210 TEKIAQLF estómago, adenocarcinoma, ovario, adenocarcinoma 211 KLHDETLTY estómago, adenocarcinoma, ovario, adenocarcinoma 212 LHDETLTYL estómago, adenocarcinoma, ovario, adenocarcinoma 213 GPQEGNGPSLF colon o recto, sarcoma sinovial
214 YLLQRAVEV colon o recto, sarcoma sinovial
215 FAALHGPAL carcinoma escamoso
216 RMANLMGIEF carcinoma escamoso
217 DTFPGPYAVL liposarcoma
218 DTMPQTYKR liposarcoma
219 IEHVFVTDV colon o recto, ganglio linfático, carcinoma ductal de mama infíltrante
220 KESPTSVGF colon o recto, ganglio linfático, carcinoma ductal de mama infíltrante
221 EAITAIMKY riñón, carcinoma renal de células claras, bazo, linfoma no hodgkiniano
222 KEKPAENTL riñón, carcinoma renal de células claras, bazo, linfoma no hodgkiniano
223 NEFQSQQNI riñón, carcinoma renal de células claras, bazo, linfoma no hodgkiniano
224 NVIDYGHASKY riñón, carcinoma renal de células claras, bazo, linfoma no hodgkiniano
225 FAKSQSKTF lipoma atípico
226 LPFSLAHL lipoma atípico
227 APNYRLKSL estómago, adenocarcinoma, carcinoma renal metastásico
228 ILKDMGITEY estómago, adenocarcinoma, carcinoma renal metastásico
229 AHDDGRWSL estómago, metastásico, pulmón, carcinoma escamoso 230 KYLTAEAFGF estómago, metastásico, pulmón, carcinoma escamoso 231 ESAALIHHY hígado, carcinoma hepatocelular, fibromatosis 232 YQRETPQV hígado, carcinoma hepatocelular, fibromatosis 233 EELQRNISL riñón, carcinoma renal de células claras, ovario, adenocarcinoma
234 RPAALFLTL riñón, carcinoma renal de células claras, ovario, adenocarcinoma
235 SEELQRNISL riñón, carcinoma renal de células claras, ovario, adenocarcinoma
236 ETIDSRVQEY colon o recto, ovario, teratoma
237 EVSEQILHM estómago, metastásico, ganglios linfáticos, linfoma no hodgkiniano
238 GTLSGGILSSGK estómago, adenocarcinoma diferenciado, cuello uterino, carcinoma escamoso
239 GVPIMLAY encéfalo, glioblastoma, cuello uterino, carcinoma escamoso
240 EEVKEEVKKF pulmón, carcinoma de pulmón amicrocítico, timo, timoma 241 KTIAFLLPMF pulmón, carcinoma de pulmón amicrocítico, timo, timoma 242 EVTTNIPKM hígado, carcinoma hepatocelular, cáncer, carcinoma quístico adenoide
243 IHGDTVQNQL colon o recto, glándulas suprarrenales, carcinoma cortical suprarrenal
244 RTMVKTLEY colon o recto, glándulas suprarrenales, carcinoma (continuación)
Seq. Secuencia Enfermedad proliferativa y localización de la misma ID
cortical suprarrenal
245 ETVRTLNNLY encéfalo, glioblastoma, epiplón, leiomiosarcoma, metastásico
246 HSIDKVTSR colon o recto, glándula paratiroides, adenoma
247 VSNPKSFEY colon o recto, glándula paratiroides, adenoma
248 GLGPTFKL pulmón, carcinoma de pulmón amicrocítico, estómago, adenocarcinoma
249 NKGISDIIKV pulmón, carcinoma de pulmón amicrocítico, estómago, adenocarcinoma
250 TSTTRPVL pulmón, carcinoma de pulmón amicrocítico, estómago, adenocarcinoma
251 VLGGKAFLEHL estómago, endometrio, adenocarcinoma
252 YEFERTTSI estómago, endometrio, adenocarcinoma
253 YLDFTNPKV hígado, carcinoma hepatocelular, cuello uterino, carcinoma escamoso
254 IPAVARTTTL páncreas, adenocarcinoma, miometrio, leiomioma 255 KQQLELDSI páncreas, adenocarcinoma, miometrio, leiomioma 256 KTTDTVSSF páncreas, adenocarcinoma, miometrio, leiomioma 257 DYLDGVHTVF colon o recto, fibromatosis
258 YLDGVHTVF colon o recto, fibromatosis
259 TYVSGMLRF encéfalo, glioblastoma, mama, carcinoma
260 DAIDGKQAR encéfalo, glioblastoma, hígado, hiperplasia nodular focal 261 DPMAPGVQGSLL pulmón, carcinoma de pulmón amicrocítico, cuello uterino, carcinoma escamoso
262 GLDPSQRPK pulmón, carcinoma de pulmón amicrocítico, cuello uterino, carcinoma escamoso
263 IEDSRVYEL estómago, metastásico, linfoma no hodgkiniano 264 YVHSFLSSGY intestino delgado, tumor estromal gastrointestinal 265 HEYTTKEVF hígado, carcinoma hepatocelular, cáncer, colon, adenocarcinoma
266 KLQEQLAQL hígado, carcinoma hepatocelular, cáncer, colon, adenocarcinoma
267 SIAAKILSY hígado, carcinoma hepatocelular, cáncer, colon, adenocarcinoma
268 KELLAVKL páncreas, adenocarcinoma, pulmón, adenocarcinoma 269 KLKQTTSALEK páncreas, adenocarcinoma, pulmón, adenocarcinoma 270 EVGPREAGLR riñón, carcinoma renal de células claras, riñón, carcinoma de células transicionales
271 SEAQEGLQKF riñón, carcinoma renal de células claras, riñón, carcinoma de células transicionales
272 DEAVLFVQV páncreas, adenocarcinoma, ovario, cistoadenocarcinoma mucinoso
273 EVAKFLSFY riñón, carcinoma renal de células claras, riñón, angiomiolipoma
274 KLDQKLPEL riñón, carcinoma renal de células claras, riñón, angiomiolipoma
275 SVFEKSVGY riñón, carcinoma renal de células claras, riñón, angiomiolipoma
276 NEGQTALHY colon o recto, endometrio, tumor mixto mulleriano 277 VEFPHSPEI colon o recto, endometrio, tumor mixto mulleriano 278 RLQGELQAV riñón, carcinoma renal de células claras, riñón, carcinoma de células renales
279 KELRELLSI colon o recto, fibromatosis
280 SLVDQSAAL colon o recto, fibromatosis
(continuación)
Seq. Secuencia Enfermedad proliferativa y localización de la misma ID
281 LELIMSKY colon o recto, ovario, tecoma-fibroma
282 DIKPYIAEY páncreas, adenocarcinoma, timo, timoma
283 KLMAMFLEY pulmón, adenocarcinoma,
284 YTVEKREGY pulmón, adenocarcinoma,
285 FEFDIHQVI estómago, metastásico, mama, carcinoma
286 SENPSKHDSF estómago, metastásico, mama, carcinoma
287 NFLRINTI colon o recto, estómago, adenocarcinoma
288 YSGPTSVSR colon o recto, estómago, adenocarcinoma
289 DIYGGDYERF colon o recto, glándulas suprarrenales, carcinoma cortical suprarrenal
290 SARLEKLGY estómago, metastásico, próstata, hiperplasia nodular benigna
291 YVFPGVTRL estómago, metastásico, próstata, hiperplasia nodular benigna
292 YYLNEIQSF estómago, metastásico, próstata, hiperplasia nodular benigna
293 YHSQDRYEF estómago, metastásico, linfoma no hodgkiniano 294 FPPGRQVVM encéfalo, cáncer, ganglios linfáticos, melanoma maligno 295 ILDEAHERTI encéfalo, cáncer, ganglios linfáticos, melanoma maligno 296 VIYNEQMASK hígado, carcinoma hepatocelular, cáncer, hígado, hiperplasia nodular focal
297 EATSIKRVR colon o recto, adenocarcinoma
298 LPEDKPRLI colon o recto, adenocarcinoma
299 KYPLNLYLL riñón, carcinoma renal de células claras, lipoma 300 VHESPALILLF riñón, carcinoma renal de células claras, lipoma 301 EVTGHSKGY estómago, adenocarcinoma, recto, adenocarcinoma 302 RDSEELLQI estómago, adenocarcinoma, recto, adenocarcinoma 303 SPASKTTL estómago, adenocarcinoma, recto, adenocarcinoma 304 DAKTVNVI colon o recto, testículo, seminoma
305 DSNATAAKM colon o recto, testículo, seminoma
306 RTLNPQMLQK colon o recto, testículo, seminoma
307 RTLNPQMLQKK colon o recto, testículo, seminoma
308 LMAEMGVHSV estómago, metastásico, mama, carcinoma
309 RLLPPVGTGR estómago, metastásico, mama, carcinoma
310 VRIGTILIQTNQ estómago, metastásico, mama, carcinoma
311 KELSVLSLI estómago, metastásico, pulmón, carcinoma neuroendocrino
312 TQPHPNTVY estómago, metastásico, pulmón, carcinoma neuroendocrino
313 ALEEQLLKY estómago, adenocarcinoma, histiocitoma fibroso maligno
314 DHFTGAIEKL estómago, metastásico, mama, carcinoma
315 KILDLETEL estómago, metastásico, mama, carcinoma
316 AEDIPSLKL mama, carcinoma
317 DIPSLKLAL mama, carcinoma
318 GLDPNKPPEL mama, carcinoma
319 FLRDPAEAL mama, carcinoma
320 GYGSQGYKY mama, carcinoma
321 KLLAEVTLK mama, carcinoma
(continuación)
Seq. Secuencia Enfermedad proliferativa y localización de la misma ID
322 SAADGPRVF mama, carcinoma
323 KLYELHVFTF colon, adenoma
324 YELHVFTF colon, adenoma
325 YLNKEIEEA colon, adenoma
326 DENEHQLSL estómago, adenocarcinoma, colon, linfoma no hodgkiniano
327 EITPPVVLR estómago, adenocarcinoma, colon, linfoma no hodgkiniano
328 GFEITPPVVLR estómago, adenocarcinoma, colon, linfoma no hodgkiniano
329 HQLSLRTV estómago, adenocarcinoma, colon, linfoma no hodgkiniano
330 MSVQPTVSL estómago, adenocarcinoma, ganglio linfático, linfoma no hodgkiniano
331 SIRDTPAKN estómago, adenocarcinoma, ganglio linfático, linfoma no hodgkiniano
332 SIRDTPAKNAQK estómago, adenocarcinoma, ganglio linfático, linfoma no hodgkiniano
333 SPIKVTLATL estómago, adenocarcinoma, ganglio linfático, linfoma no hodgkiniano
334 TPPVVLRL estómago, adenocarcinoma, colon, linfoma no hodgkiniano
335 VEAKFINY estómago, adenocarcinoma, colon, linfoma no hodgkiniano
336 YEGSPIKV estómago, adenocarcinoma, colon, linfoma no hodgkiniano
337 YEGSPIKVTL estómago, adenocarcinoma, colon, linfoma no hodgkiniano
338 SELKMMTQL ganglio linfático, linfoma no hodgkiniano
339 EKDPQPQQL pulmón, carcinoma de pulmón amicrocítico, schwannoma
340 GYVPRTAL pulmón, carcinoma de pulmón amicrocítico, schwannoma
341 KEKDPQPQQL pulmón, carcinoma de pulmón amicrocítico, schwannoma
342 LPKKPSKLEL pulmón, carcinoma de pulmón amicrocítico, schwannoma
343 RPSAASIDL pulmón, carcinoma de pulmón amicrocítico, schwannoma
344 SRHPLSPGF pulmón, carcinoma de pulmón amicrocítico, schwannoma
345 TPRSPQPEL pulmón, carcinoma de pulmón amicrocítico, schwannoma
346 GRIVAFFEF riñón, carcinoma renal de células claras, glándula tiroides, hiperplasia nodular
347 HTPHPAASR riñón, carcinoma renal de células claras, glándula tiroides, hiperplasia nodular
348 NPDELKTTV pulmón, carcinoma de pulmón amicrocítico, testículo, seminoma
349 PSKQLPDQI pulmón, carcinoma de pulmón amicrocítico, testículo, seminoma
350 VYVERAEVL pulmón, carcinoma de pulmón amicrocítico, testículo, seminoma
351 DPFIIIHSI colon o recto, cuello uterino, carcinoma escamoso 352 EHSIATLLL colon o recto, cuello uterino, carcinoma escamoso 353 FLDPRPLTV páncreas, adenocarcinoma, miometrio, leiomioma 354 SAFADRPAF páncreas, adenocarcinoma, miometrio, leiomioma 355 DTTLPASAR estómago, adenocarcinoma, recto, adenocarcinoma (continuación)
Seq. Secuencia Enfermedad proliferativa y localización de la misma ID
356 KLLEYIEEI estómago, adenocarcinoma, recto, adenocarcinoma 357 LEKQLIEL estómago, adenocarcinoma, recto, adenocarcinoma 358 LMSVYVVEL hígado, carcinoma hepatocelular, cáncer
359 ESITDVLVR páncreas, adenocarcinoma, estómago, adenocarcinoma 360 ETAFQGMLR páncreas, adenocarcinoma, estómago, adenocarcinoma 361 EVPDVTATPARL páncreas, adenocarcinoma, estómago, adenocarcinoma 362 GRIVTLISF páncreas, adenocarcinoma, estómago, adenocarcinoma 363 HVFSDGVTNW páncreas, adenocarcinoma, estómago, adenocarcinoma 364 REIGGGEAGAVI páncreas, adenocarcinoma, estómago, adenocarcinoma 365 RGWDGFVEF páncreas, adenocarcinoma, estómago, adenocarcinoma 366 RPAVLPLL páncreas, adenocarcinoma, estómago, adenocarcinoma 367 VEFFHVEDL páncreas, adenocarcinoma, estómago, adenocarcinoma 368 VQRNHETAF páncreas, adenocarcinoma, estómago, adenocarcinoma 369 AELEAARL pulmón, carcinoma de pulmón amicrocítico, testículo, seminoma
370 ATQTPVSNK colon o recto, recto, adenocarcinoma
371 ESIDQYIER colon o recto, recto, adenocarcinoma
372 FEEHNSMNEL colon o recto, recto, adenocarcinoma
373 SVASTPISQR colon o recto, recto, adenocarcinoma
374 VASTPISQR colon o recto, recto, adenocarcinoma
375 AEIVGGHEA bazo, hematopoyesis extramedular
376 RPPSPALASV bazo, hematopoyesis extramedular
377 SVAQVFLNNY bazo, hematopoyesis extramedular
378 TQEPTQQHF bazo, hematopoyesis extramedular
379 KDITMKNLV riñón, carcinoma renal de células claras, colon, linfoma no hodgkiniano
380 MAEKAKQIY riñón, carcinoma renal de células claras, colon, linfoma no hodgkiniano
381 KLDNQVSKV colon o recto, próstata, hiperplasia nodular benigna 382 SENVKLFSA colon o recto, próstata, hiperplasia nodular benigna 383 VQKLQNII colon o recto, próstata, hiperplasia nodular benigna 384 AFTVHFSGQF epiplón, adenocarcinoma
385 GVFRGIQDV epiplón, adenocarcinoma
386 QRNMTKLQL epiplón, adenocarcinoma
387 RmFPNAPYL epiplón, adenocarcinoma
388 EAAAEAKAR ganglio linfático, carcinoma de mama
389 IIKEYTDVY ganglio linfático, carcinoma de mama
390 KEIDKNDHL ganglio linfático, carcinoma de mama
391 KVSKASGVSK ganglio linfático, carcinoma de mama
392 MPATETKKV ganglio linfático, carcinoma de mama
393 NADPQAVTm ganglio linfático, carcinoma de mama
394 RSDmLKDII ganglio linfático, carcinoma de mama
395 SESGAGLTRF ganglio linfático, carcinoma de mama
396 SMMQTLLTV ganglio linfático, carcinoma de mama
397 TEVSKTPEA ganglio linfático, carcinoma de mama
398 VEVPETPKA ganglio linfático, carcinoma de mama
(continuación)
Seq. Secuencia Enfermedad proliferativa y localización de la misma ID
399 DVYPEIIER encéfalo, glioblastoma, ganglio linfático, carcinoma de mama
400 REVEIQSHL estómago, adenocarcinoma, estómago, adenocarcinoma
401 EPPAVLLL pulmón, carcinoma de pulmón amicrocítico, epiplón, adenocarcinoma
402 LEADPFLKY pulmón, carcinoma de pulmón amicrocítico, epiplón, adenocarcinoma
403 TTQGQDVTLA estómago, adenocarcinoma, pulmón, adenocarcinoma 404 AEYEDGFSIP páncreas, adenocarcinoma, hueso, osteosarcoma 405 AQISLPRI bazo, leucemia mielógena crónica
406 DFTPEPAAR bazo, leucemia mielógena crónica
407 DNTGITTVSK bazo, leucemia mielógena crónica
408 EEAKQLVDKAY bazo, leucemia mielógena crónica
409 ERRESIKQ bazo, leucemia mielógena crónica
410 ETVGQLGTVLR bazo, leucemia mielógena crónica
411 FEQVMRIGL bazo, leucemia mielógena crónica
412 FSMQQRQAL bazo, leucemia mielógena crónica
413 GVPFFSSLR bazo, leucemia mielógena crónica
414 IVRFPTDQL bazo, leucemia mielógena crónica
415 KQPVAATRTAV bazo, leucemia mielógena crónica
416 LGASNRAFV bazo, leucemia mielógena crónica
417 NPRWDGERL bazo, leucemia mielógena crónica
418 NVFTNAFRY bazo, leucemia mielógena crónica
419 QPMEPNPRVPL bazo, leucemia mielógena crónica
420 QPVAATRTAV bazo, leucemia mielógena crónica
421 RLFEQVMRI bazo, leucemia mielógena crónica
422 SEEPLARNL bazo, leucemia mielógena crónica
423 TIRNQINAL bazo, leucemia mielógena crónica
424 VLGPTAMRK bazo, leucemia mielógena crónica
425 AELRNATAA páncreas, adenocarcinoma, mama, carcinoma 426 DVPDGTLVTVm páncreas, adenocarcinoma, mama, carcinoma 427 LPIAFKVV páncreas, adenocarcinoma, mama, carcinoma 428 SAMGSATRY páncreas, adenocarcinoma, mama, carcinoma 429 AEKQGHQW estómago, metastásico, ovario, tumor de células granulares
430 GEQKPTGTF estómago, metastásico, ovario, tumor de células granulares
431 GQFSKPFSF estómago, metastásico, ovario, tumor de células granulares
432 IAFFDVRTF estómago, metastásico, ovario, tumor de células granulares
433 LSAGKTSFSF estómago, metastásico, ovario, tumor de células granulares
434 VSNKYGLVF estómago, metastásico, ovario, tumor de células granulares
435 GEVDVEQHTL colon o recto, colon, adenocarcinoma
436 VDVEQHTL colon o recto, colon, adenocarcinoma
437 DAADELSVGRY riñón, carcinoma renal de células claras, colon, adenoma 438 LSEADVRA estómago, adenocarcinoma, pulmón, adenocarcinoma (continuación)
Seq. Secuencia Enfermedad proliferativa y localización de la misma ID
439 ELTLGEFLK estómago, metastásico, ovario, tumor mixto mulleriano 440 ELTLGEFLKL estómago, metastásico, ovario, tumor mixto mulleriano 441 LTLGEFLK estómago, metastásico, ovario, tumor mixto mulleriano 442 LTLGEFLKL estómago, metastásico, ovario, tumor mixto mulleriano 443 TLGEFLKL estómago, metastásico, ovario, tumor mixto mulleriano 444 KTYTKSSHLK estómago, adenocarcinoma, encéfalo, meningioma 445 SQLTTLSFY pulmón, carcinoma de pulmón amicrocítico, epiplón, adenocarcinoma
446 KMQEKKKLQ hígado, carcinoma hepatocelular, pulmón, carcinoma macrocelular
447 LLGHLPAEI hígado, carcinoma hepatocelular, pulmón, carcinoma macrocelular
448 APVELILSDETLPAPE hígado, carcinoma hepatocelular, cáncer
449 ETPDFQLFKNGVAQEPV hígado, carcinoma hepatocelular, cáncer
450 LAPLEGARFALVRED hígado, carcinoma hepatocelular, cáncer
451 SPDRIFFHLNAVALGD hígado, carcinoma hepatocelular, cáncer
452 SPDRIFFHLNAVALGDG hígado, carcinoma hepatocelular, cáncer
453 EEMRKLQATVQELQKR ganglio linfático, linfoma no hodgkiniano
454 EEPLSLQELDTSSG ganglio linfático, linfoma no hodgkiniano
455 EMRKLQATVQELQKR ganglio linfático, linfoma no hodgkiniano
456 HLEEPLSLQELDTSSG ganglio linfático, linfoma no hodgkiniano
457 LEEPLSLQELDTSSG ganglio linfático, linfoma no hodgkiniano
462 GVVHSFSHNVGPGDK hígado, carcinoma hepatocelular, cáncer, pulmón, adenocarcinoma
463 GVVHSFSHNVGPGDKY hígado, carcinoma hepatocelular, cáncer, pulmón, adenocarcinoma
464 GVVHSFSHNVGPGDKYT hígado, carcinoma hepatocelular, cáncer, pulmón, adenocarcinoma
465 KTEEFEVTKTAVAHRP hígado, carcinoma hepatocelular, cáncer, pulmón, adenocarcinoma
466 KTEEFEVTKTAVAHRPG hígado, carcinoma hepatocelular, cáncer, pulmón, adenocarcinoma
467 VRPGGVVHSFSHNVGPGDK hígado, carcinoma hepatocelular, cáncer, pulmón, adenocarcinoma
468 VRPGGVVHSFSHNVGPGDKYT hígado, carcinoma hepatocelular, cáncer, pulmón, adenocarcinoma
469 AEKGVRTLTAAAVSGAQ páncreas, adenocarcinoma, hueso, tumor óseo de células gigantes
470 AQPILSKLEPQIASASE páncreas, adenocarcinoma, hueso, tumor óseo de células gigantes
471 EKGVRTLTAAAVSGAQ páncreas, adenocarcinoma, hueso, tumor óseo de células gigantes
472 EKGVRTLTAAAVSGAQP páncreas, adenocarcinoma, hueso, tumor óseo de células gigantes
473 GVRTLTAAAVSGAQ páncreas, adenocarcinoma, hueso, tumor óseo de células gigantes
474 KGVRTLTAAAVSGAQ páncreas, adenocarcinoma, hueso, tumor óseo de células gigantes
475 DVNEYAPVFKEKSYK encéfalo, glioblastoma, glándula parótida, adenoma pleomórfico
476 HRSFVDLSGHNLA encéfalo, glioblastoma, glándula parótida, adenoma pleomórfico
477 HRSFVDLSGHNLANPH encéfalo, glioblastoma, glándula parótida, adenoma pleomórfico
478 HRSFVDLSGHNLANPHP encéfalo, glioblastoma, glándula parótida, adenoma pleomórfico
(continuación)
Seq. Secuencia Enfermedad proliferativa y localización de la misma ID
479 ALPEFDGKRFQNVAKEG hígado, carcinoma hepatocelular, cáncer, glándula tiroides, hiperplasia nodular
480 DSNEFSVIADPRG hígado, carcinoma hepatocelular, cáncer, glándula tiroides, hiperplasia nodular
481 DSNEFSVIADPRGN hígado, carcinoma hepatocelular, cáncer, glándula tiroides, hiperplasia nodular
482 DSNEFSVIADPRGNT hígado, carcinoma hepatocelular, cáncer, glándula tiroides, hiperplasia nodular
483 DSNEFSVIADPRGNTL hígado, carcinoma hepatocelular, cáncer, glándula tiroides, hiperplasia nodular
484 DSNEFSVIADPRGNTLG hígado, carcinoma hepatocelular, cáncer, glándula tiroides, hiperplasia nodular
485 PEFDGKRFQNVAK hígado, carcinoma hepatocelular, cáncer, glándula tiroides, hiperplasia nodular
486 SDSNEFSVIADPRGNTLG hígado, carcinoma hepatocelular, cáncer, glándula tiroides, hiperplasia nodular
487 SQKKTFEINPRHPLIR hígado, carcinoma hepatocelular, cáncer, glándula tiroides, hiperplasia nodular
488 ALPEFDGKRFQNVAKEG hígado, carcinoma hepatocelular, cáncer, glándula tiroides, hiperplasia nodular
489 PEFDGKRFQNVAK hígado, carcinoma hepatocelular, cáncer, glándula tiroides, hiperplasia nodular
490 PEFDGKRFQNVAKE hígado, carcinoma hepatocelular, cáncer, glándula tiroides, hiperplasia nodular
491 LNSLTYQVLDVQRYP riñón, carcinoma renal de células claras, endometrio, adenocarcinoma
492 LPQLVGVSTPLQG riñón, carcinoma renal de células claras, endometrio, adenocarcinoma
493 LPQLVGVSTPLQGG riñón, carcinoma renal de células claras, endometrio, adenocarcinoma
494 LPQLVGVSTPLQGGS riñón, carcinoma renal de células claras, endometrio, adenocarcinoma
495 RLPQLVGVSTPLQGGS riñón, carcinoma renal de células claras, endometrio, adenocarcinoma
496 SDVDLIPMNDHNAYR riñón, carcinoma renal de células claras, endometrio, adenocarcinoma
497 GRRKSRQGSLAMEELK recto, adenocarcinoma
498 RKSRQGSLAMEELK recto, adenocarcinoma
499 SGPSLKGEEEPLVASEDGAVD recto, adenocarcinoma
500 SGSGPSLKGEEEPLVASEDGAVD recto, adenocarcinoma
501 IKPGVTTEEIDHAVH endometrio, adenocarcinoma
502 KPGVTTEEIDHAVH endometrio, adenocarcinoma
503 DGVLRIQNLDQS páncreas, adenocarcinoma, miometrio, leiomioma 504 GAYFHDDGFLAFPG páncreas, adenocarcinoma, miometrio, leiomioma 505 TPYSFLPLPTIKDAYR páncreas, adenocarcinoma, miometrio, leiomioma 506 YPTPDISWSKLDGSLPP páncreas, adenocarcinoma, miometrio, leiomioma 507 YPTPDISWSKLDGSLPPD páncreas, adenocarcinoma, miometrio, leiomioma 508 ASHFEQMAAASMHR carcinoma de células renales metastásico
509 GGQVIVAIPKLQTQQ glándula paratiroides, adenoma
510 GQVIVAIPKLQTQ glándula paratiroides, adenoma
511 GQVIVAIPKLQTQQ glándula paratiroides, adenoma
512 IESTFDVVSSKPVG glándula paratiroides, adenoma
513 DWGALATISTLEAVRG pulmón, carcinoma de pulmón amicrocítico, hígado, carcinoma hepatocelular
514 GRPFADVLSLSDGPPG pulmón, carcinoma de pulmón amicrocítico, hígado, carcinoma hepatocelular
(continuación)
Seq. Secuencia Enfermedad proliferativa y localización de la misma ID
515 WGALATISTLEAVR pulmón, carcinoma de pulmón amicrocítico, hígado carcinoma hepatocelular
516 WGALATISTLEAVRG pulmón, carcinoma de pulmón amicrocítico, hígado carcinoma hepatocelular
517 ADELALVDVIEDK riñón, carcinoma renal de células claras, riñón carcinoma de células renales
518 GVSLKTLHPDLGTDK riñón, carcinoma renal de células claras, riñón carcinoma de células renales
519 IVSGKDYNVTANSKL riñón, carcinoma renal de células claras, riñón carcinoma de células renales
520 DDNIKTYSDHPEK riñón, carcinoma renal de células claras, hígado carcinoma hepatocelular
521 DKVYVHLKNLASRPY riñón, carcinoma renal de células claras, hígado carcinoma hepatocelular
522 GDKVYVHLKNLASRPY riñón, carcinoma renal de células claras, hígado carcinoma hepatocelular
523 LDDNIKTYSDHPEK riñón, carcinoma renal de células claras, hígado carcinoma hepatocelular
524 TGDKVYVHLKNLASRPY riñón, carcinoma renal de células claras, hígado carcinoma hepatocelular
525 VYVHLKNLASRPY riñón, carcinoma renal de células claras, hígado carcinoma hepatocelular
526 KTSRLPIIDVAPLDVGAPD páncreas, adenocarcinoma, condrosarcoma
527 KTSRLPIIDVAPLDVGAPDQE páncreas, adenocarcinoma, condrosarcoma
528 LPIIDVAPLDVGAPD páncreas, adenocarcinoma, condrosarcoma
529 RLPIIDVAPLDVGAPD páncreas, adenocarcinoma, condrosarcoma
530 RLPIIDVAPLDVGAPDQE páncreas, adenocarcinoma, condrosarcoma
531 SRLPIIDVAPLDVGAPD páncreas, adenocarcinoma, condrosarcoma
532 SRLPIIDVAPLDVGAPDQE páncreas, adenocarcinoma, condrosarcoma
533 TSRLPIIDVAPLDVGAPD páncreas, adenocarcinoma, condrosarcoma
534 TSRLPIIDVAPLDVGAPDQE páncreas, adenocarcinoma, condrosarcoma
535 DTSYVSLKAPLT hígado, carcinoma hepatocelular, cáncer
536 DTSYVSLKAPLTKP hígado, carcinoma hepatocelular, cáncer
537 DTSYVSLKAPLTKPL hígado, carcinoma hepatocelular, cáncer
538 ESDTSYVSLKAPLT hígado, carcinoma hepatocelular, cáncer
539 ESDTSYVSLKAPLTKPL hígado, carcinoma hepatocelular, cáncer
540 SDTSYVSLKAPLT hígado, carcinoma hepatocelular, cáncer
541 SDTSYVSLKAPLTKP hígado, carcinoma hepatocelular, cáncer
542 SDTSYVSLKAPLTKPL hígado, carcinoma hepatocelular, cáncer
543 DPASFRAAIGLLARH riñón, carcinoma renal de células claras, colon adenocarcinoma
544 TEGQFVDLTGNRLTYT hígado, carcinoma hepatocelular, cáncer, hígado hiperplasia nodular focal
545 ALDFFGNGPPVNYK pulmón, carcinoma de pulmón amicrocítico
546 ALDFFGNGPPVNYKTG pulmón, carcinoma de pulmón amicrocítico, hueso fibroma no osificante
547 DFFGNGPPVNYKTG pulmón, carcinoma de pulmón amicrocítico, hueso fibroma no osificante
548 LDFFGNGPPVNYK pulmón, carcinoma de pulmón amicrocítico, hueso fibroma no osificante
549 LDFFGNGPPVNYKTG pulmón, carcinoma de pulmón amicrocítico, hueso fibroma no osificante
550 QALDFFGNGPPVNYKTG pulmón, carcinoma de pulmón amicrocítico, hueso fibroma no osificante
551 AISDYVFNTASLVYH hígado, carcinoma hepatocelular, cáncer
(continuación)
Seq. Secuencia Enfermedad proliferativa y localización de la misma ID
552 AISDYVFNTASLVYHEE hígado, carcinoma hepatocelular, cáncer
553 ISDYVFNTASLVYH hígado, carcinoma hepatocelular, cáncer
554 ISDYVFNTASLVYHEE hígado, carcinoma hepatocelular, cáncer
555 YVFNTASLVYHEE hígado, carcinoma hepatocelular, cáncer
556 IVIALSGNKADLA encéfalo, glioblastoma, endometrio, adenocarcinoma 557 SPNIVIALSGNKADL encéfalo, glioblastoma, endometrio, adenocarcinoma 558 SPNIVIALSGNKADLA encéfalo, glioblastoma, endometrio, adenocarcinoma 559 TPPRLVAPRFLEVE estómago, metastásico, linfoma no hodgkiniano 560 TPPRLVAPRFLEVET estómago, metastásico, linfoma no hodgkiniano 561 TPPRLVAPRFLEVETS estómago, metastásico, linfoma no hodgkiniano 562 EIQRDILLEKKKVAQDQ estómago, metastásico, hígado, adenoma hepático 563 FGAIFFLPDSSK estómago, metastásico, hígado, adenoma hepático 564 IQRDILLEKKKVAQ estómago, metastásico, hígado, adenoma hepático 565 IQRDILLEKKKVAQD estómago, metastásico, hígado, adenoma hepático 566 IQRDILLEKKKVAQDQ estómago, metastásico, hígado, adenoma hepático 567 LSGVLFHSSPALQPA estómago, metastásico, hígado, adenoma hepático 568 RDILLEKKKVAQDQ estómago, metastásico, hígado, adenoma hepático 569 SSKLLSGVLFHSSPA estómago, metastásico, hígado, adenoma hepático 570 SSPALQPAADHKPGPG estómago, metastásico, hígado, adenoma hepático 571 APPTRGPPPSYGGS colon o recto, timo, timoma,
572 GNSRSAPPTRGPPPSYGGSSRY colon o recto, timo, timoma,
573 RDYGHSSSRDDYPS colon o recto, timo, timoma,
574 SPRDDGYSTKDSY colon o recto, timo, timoma,
575 GGSAAAAAAAAASGG hígado, carcinoma hepatocelular, miometrio, leiomioma 576 DNMLLAEGVSGPEK hígado, carcinoma hepatocelular, glándula suprarrenal, adenoma suprarrenal cortical
577 ADSLYVEKIDVGEAEPR esófago, adenocarcinoma
578 RIQLVEEELDRAQER páncreas, adenocarcinoma, lipoma intramuscular 579 RRIQLVEEELDRAQER páncreas, adenocarcinoma, lipoma intramuscular 580 HQPHKVTQYKKGKDSLY liposarcoma
581 RKKAKTTKKIVL liposarcoma
582 DVFRQYASLTGTQALPP hígado, carcinoma hepatocelular, cáncer, intestino delgado, tumor estromal gastrointestinal
583 GTAQGELFLDDGHT hígado, carcinoma hepatocelular, cáncer, intestino delgado, tumor estromal gastrointestinal
584 VFRQYASLTGTQALPP hígado, carcinoma hepatocelular, cáncer, intestino delgado, tumor estromal gastrointestinal
585 PEFDGKRFQNVAK hígado, carcinoma hepatocelular, cáncer, glándula tiroides, hiperplasia nodular
586 PEFDGKRFQNVAKE hígado, carcinoma hepatocelular, cáncer, glándula tiroides, hiperplasia nodular
587 ALPEFDGKRFQNVAKEG hígado, carcinoma hepatocelular, cáncer, glándula tiroides, hiperplasia nodular
588 ASPSESEARFRIDSVSEGNAGPY páncreas, adenocarcinoma, lipoma
589 EARFRIDSVSEGNAGP páncreas, adenocarcinoma, lipoma
590 ESEARFRIDSVSEGNAGP páncreas, adenocarcinoma, lipoma
591 ESEARFRIDSVSEGNAGPY páncreas, adenocarcinoma, lipoma
592 FRIDSVSEGNAGP páncreas, adenocarcinoma, lipoma
(continuación)
Seq. Secuencia Enfermedad proliferativa y localización de la misma ID
593 FRIDSVSEGNAGPY páncreas, adenocarcinoma, lipoma
594 SEARFRIDSVSEGNAGPY páncreas, adenocarcinoma, lipoma
595 SPSESEARFRIDSVSEGNAGPY páncreas, adenocarcinoma, lipoma
596 GNQLFRINEANQL estómago, adenocarcinoma, próstata, adenocarcinoma 597 GNQLFRINEANQLMQ estómago, adenocarcinoma, próstata, adenocarcinoma 598 SPAMAGGLFAIERE estómago, adenocarcinoma, próstata, adenocarcinoma 599 FIGNIAVNHAPVSPR estómago, adenocarcinoma, carcinoma de mama metastásico
600 FIGNIAVNHAPVSPRPG estómago, adenocarcinoma, carcinoma de mama metastásico
601 IGNIAVNHAPVSPRP estómago, adenocarcinoma, carcinoma de mama metastásico
602 IGNIAVNHAPVSPRPG estómago, adenocarcinoma, carcinoma de mama metastásico
603 FEGQFSINKVPGNFH riñón, carcinoma renal de células claras, próstata,
adenocarcinoma
604 FEGQFSINKVPGNFHVS riñón, carcinoma renal de células claras, próstata,
adenocarcinoma
605 RFEGQFSINKVPGNFH riñón, carcinoma renal de células claras, próstata,
adenocarcinoma
Así pues, otro aspecto de la presente invención se refiere al uso de los péptidos acordes a la presente invención para el tratamiento -preferentemente combinado- de una enfermedad proliferativa seleccionada del grupo siguiente: lipoma atípico;
cáncer cerebral y una enfermedad proliferativa seleccionada entre oncocitoma renal y melanoma maligno con afectación ganglionar; glioblastoma, y una enfermedad proliferativa seleccionada entre fibroma óseo no osificante, meningioma, carcinoma de mama, adenocarcinoma endometrial, leiomiosarcoma epiploico, adenoma pleomórfico de la glándula parótida, carcinoma espinocelular, hiperplasia nodular de la glándula tiroides, y carcinoma escamoso de cuello uterino;
carcinoma lobular de mama;
carcinoma intraductal de mama;
cáncer de colon o recto, y una enfermedad proliferativa seleccionada entre adenocarcinoma, carcinoma suprarrenal cortical, carcinoma de mama mucinoso, adenocarcinoma, tumor mixto mulleriano de endometrio, fibromatosis, carcinoma renal, hiperplasia nodular focal de hígado, carcinoma hepatocelular, carcinoma de pulmón microcítico, carcinoma escamoso de pulmón, carcinoma de mama, linfoma no hodgkiniano ganglionar, carcinoma de células renales metastásico, leiomioma de miometrio, teratoma ovárico, tecoma-fibroma ovárico, adenoma paratiroideo, hiperplasia nodular benigna de próstata, adenocarcinoma de recto, leucemia mielógena crónica de bazo, hematopoyesis extramedular esplénica, adenocarcinoma gástrico, sarcoma sinovial, seminoma testicular, timoma del timo, y carcinoma escamoso de cuello uterino;
adenoma de colon;
adenocarcinoma de endometrio;
adenocarcinoma de esófago;
angiomiolipoma renal;
carcinoma renal de células claras y una enfermedad proliferativa seleccionada entre fibroma no osificante, meningioma cerebral, adenocarcinoma de colon, adenoma de colon, linfoma no hodgkiniano de colon;
carcinoma renal de células claras y una enfermedad proliferativa seleccionada entre adenocarcinoma de endometrio, angiomiolipoma renal, nefropatía poliquística, carcinoma renal de células transicionales, lipoma, linfoma no hodgkiniano, adenocarcinoma ovárico, adenoma pleomórfico de la glándula parótida, adenocarcinoma prostático, linfoma no hodgkiniano esplénico, tumor estromal gastrointestinal de estómago (GIST), sarcoma sinovial, e hiperplasia nodular de la glándula tiroides;
carcinoma de células renales; p. ej., de células no claras;
liposarcoma;
hiperplasia nodular focal de hígado;
carcinoma hepatocelular y una enfermedad proliferativa seleccionada entre adenoma suprarrenal cortical, carcinoma de mama, carcinoma quístico adenoide, adenocarcinoma de colon, hiperplasia nodular focal de hígado, carcinoma hepatocelular, adenocarcinoma pulmonar, adenocarcinoma pancreático, adenoma pleomórfico de glándula parótida, tumor estromal gastrointestinal del intestino delgado, hiperplasia nodular de la glándula tiroides, fibromatosis, angiomiolipoma renal, carcinoma de células renales, hiperplasia nodular focal de hígado, carcinoma macrocelular de pulmón, leiomioma de miometrio, y carcinoma escamoso de cuello uterino; adenocarcinoma de pulmón; carcinoma amicrocítico de pulmón y una enfermedad proliferativa seleccionada entre fibroma óseo no osificante, carcinoma renal, carcinoma hepatocelular, adenocarcinoma pulmonar, carcinoma neuroendocrino de pulmón, adenocarcinoma epiploico, schwannoma, leucemia mielógena crónica esplénica, hematopoyesis extramedular esplénica, adenocarcinoma gástrico, seminoma testicular, timoma de timo, y carcinoma escamoso de cuello uterino; carcinoma de mama infiltrante con afectación ganglionar;
linfoma no hodgkiniano ganglionar;
histiocitoma fibroso maligno;
carcinoma de mama infiltrante y metastásico;
carcinoma de células renales metastásico;
adenocarcinoma epiploico;
adenocarcinoma ovárico de células claras;
tumor ovárico de células granulares;
adenocarcinoma pancreático y una enfermedad proliferativa seleccionada entre tumor óseo de células gigantes, osteosarcoma, carcinoma de mama, condrosarcoma, lipoma intramuscular, lipoma, adenocarcinoma de pulmón, enfermedad de Hodgkin ganglionar, leiomioma de miometrio, cistoadenocarcinoma mucinoso de ovario, adenocarcinoma gástrico, y timoma de timo;
adenoma de la glándula paratiroides;
adenocarcinoma de próstata;
adenocarcinoma de recto;
tumor estromal gastrointestinal de intestino delgado;
leucemia mielógena crónica esplénica;
hematopoyesis extramedular esplénica;
carcinoma escamoso;
adenocarcinoma gástrico y una enfermedad proliferativa seleccionada entre meningioma cerebral, tumor carcinoide hepático metastásico, adenocarcinoma de próstata, leucemia mielógena crónica esplénica;
adenocarcinoma gástrico diferenciado y una enfermedad proliferativa seleccionada entre adenocarcinoma de colon, linfoma no hodgkiniano de colon, adenocarcinoma de endometrio, tumor de Wilm renal, adenocarcinoma de pulmón, carcinoma microcítico de pulmón, linfoma no hodgkiniano ganglionar, histiocitoma fibroso maligno, carcinoma lobular de mama infiltrante y metastásico, adenoma de glándula paratiroides, adenocarcinoma de recto, adenocarcinoma gástrico, seminoma testicular, carcinoma escamoso de cuello uterino;
adenocarcinoma gástrico, y una enfermedad proliferativa seleccionada entre adenocarcinoma de pulmón, carcinoma de células renales metastásico, leiomioma de miometrio, linfoma no hodgkiniano, micosis fungoide, adenocarcinoma ovárico, adenocarcinoma de páncreas, y leucemia linfocítica crónica;
adenocarcinoma gástrico, de endometrio;
cáncer gástrico metastásico, y una enfermedad proliferativa seleccionada entre adenocarcinoma, fibroma óseo no osificante, carcinoma de mama, adenocarcinoma duodenal, adenoma hepático, carcinoma macrocelular de pulmón, carcinoma neuroendocrino de pulmón, carcinoma escamoso de pulmón, linfoma no hodgkiniano ganglionar, tumor ovárico de células granulares, tumor mixto mulleriano de ovario, adenocarcinoma de páncreas, hiperplasia nodular benigna de próstata, adenocarcinoma de recto, y carcinoma basocelular;
hiperplasia nodular de la glándula tiroides;
y carcinoma escamoso de cuello uterino.
La presente invención se refiere, además, a los péptidos acordes con la presente invención que tienen la capacidad de unirse a una molécula del complejo mayor de histocompatibilidad humano (MHC) de clase I.
La presente invención se refiere, además, a los péptidos acordes con la presente invención en que dichos péptidos consisten en la secuencia de aminoácidos acorde con la SEQ ID N.° 266.
La presente invención se refiere, además, a los péptidos conforme a la presente invención, en que dichos péptidos están modificados y/o incluyen enlaces no peptídicos.
La presente invención se refiere, además, a una proteína de fusión, que comprende una secuencia de aminoácidos acorde con la reivindicación 1 fusionada con los aminoácidos N-terminales 1-80 de la cadena invariable asociada al antígeno HLA-DR (li) o fusionada con o integrada en la secuencia de un anticuerpo, como por ejemplo, un anticuerpo que es específico de células dendríticas.
La presente invención se refiere, además, a un ácido nucleico, que codifica los péptidos acordes con la presente invención.
La presente invención se refiere, además, al ácido nucleico acorde con la presente invención que es ADN, ADNc, APN, ARN o combinaciones de los anteriores.
La presente invención se refiere, además, a un vector de expresión que expresa un ácido nucleico conforme a la presente invención.
La presente invención se refiere, además, a un péptido acorde con la presente invención, un ácido nucleico acorde con la presente invención o un vector de expresión acorde con la presente invención para el uso en medicina.
La presente invención se refiere, además, a anticuerpos acordes con la presente invención y métodos para sintetizarlos.
La presente invención se refiere, además, a receptores de linfocitos T (TCR), en particular TCR solubles (sTCR), acordes con la presente invención y métodos para sintetizarlos.
La presente invención se refiere, además, a una célula hospedadora que contiene un ácido nucleico acorde con la presente invención o a un vector de expresión tal y como se ha descrito antes.
La presente invención se refiere, además, a una célula hospedadora acorde con la presente invención que es una célula presentadora de antígeno.
La presente invención se refiere, además, a la célula hospedadora acorde con la presente invención en que la célula presentadora de antígeno es una célula dendrítica.
La presente invención se refiere, además, a un método para producir un péptido acorde con la presente invención que comprende el cultivo de la célula hospedadora acorde con la presente invención y el aislamiento del péptido de la célula hospedadora o de su medio de cultivo.
La presente invención se refiere a un método in v itro para producir linfocitos T citotóxicos (CTL) activados, el cual comprende la puesta en contacto en condiciones in v itro de CTL con moléculas MHC de clase I humanas cargadas con antígeno expresadas en la superficie de una célula presentadora de antígeno durante un periodo de tiempo suficiente para activar dichos CTL de una manera específica de antígeno, siendo dicho antígeno cualquier péptido conforme a la presente invención.
La presente invención se refiere, además, al método acorde con la presente invención en que el antígeno es cargado en moléculas de MHC de clase I expresadas en la superficie de una célula presentadora de antígeno mediante la puesta en contacto de una cantidad suficiente de antígeno con la célula presentadora de antígeno.
La presente invención se refiere, además, al método acorde con la presente invención, en que la célula presentadora de antígeno comprende un vector de expresión que expresa dicho péptido que contiene la SEQ ID N.° 266.
La presente invención se refiere, además, a linfocitos T citotóxicos (CTL) activados, producidos con el método acorde con la presente invención, que reconocen selectivamente una célula que expresa de forma aberrante un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos conforme a la presente invención.
La presente invención da a conocer, además, un método para destruir células diana en un paciente cuyas células diana expresan de forma aberrante un polipéptido que comprende cualquiera de las secuencias de aminoácidos conformes a la presente invención, comprendiendo el método de administración al paciente un número eficaz de linfocitos T citotóxicos (CTL) conforme a la presente invención.
La presente invención se refiere, además, al uso en el tratamiento del cáncer del péptido descrito, de un ácido nucleico conforme a la presente invención, de un vector de expresión conforme a la presente invención, de una célula conforme a la presente invención, o de un linfocito T citotóxico activado conforme a la presente invención.
La presente invención se refiere, además, a un uso conforme a la presente invención en el que dicho medicamento es una vacuna.
La presente invención se refiere, además, a un uso conforme a la presente invención en el que dicho cáncer es la leucemia mielógena aguda y/o la leucemia linfática crónica, cáncer hepático o cáncer de colon.
La estimulación de una respuesta inmunitaria depende de la presencia de antígenos que sean reconocidos como extraños por el sistema inmunitario del hospedador. El descubrimiento de la existencia de antígenos asociados a tumores ha suscitado la posibilidad de utilizar el sistema inmunitario del hospedador para intervenir sobre el crecimiento de los tumores. Actualmente se están explorando diversos mecanismos para aprovechar las defensas humorales y celulares del sistema inmunitario en la inmunoterapia contra el cáncer.
Ciertos elementos de la respuesta inmunitaria celular son capaces de reconocer específicamente y destruir las células tumorales. El aislamiento de linfocitos T citotóxicos (CTL) entre las células infiltradas en los tumores o en la sangre periférica hace pensar en que tales células desempeñan un papel importante en las defensas inmunitarias naturales contra el cáncer. Los linfocitos T CD8-positivos en particular, los cuales reconocen las moléculas de clase I del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) portadoras de péptidos que suelen tener de 8 a 10 residuos de aminoácidos derivados de proteínas o de productos ribosómicos defectuosos (DRIPS) localizados en el citosol, desempeñan un importante papel en dicha respuesta. Las moléculas MHC del ser humano también se denominan antígenos leucocitarios humanos (HLA).
Existen dos clases de moléculas MHC: moléculas del MHC de clase I, que se encuentran en la mayoría de las células nucleadas. Las moléculas MHC están compuestas por una cadena pesada alfa y beta-2-microglobulina (receptores MHC de clase I) o por una cadena alfa y una cadena beta (receptores MHC de clase II). La conformación tridimensional da como resultado una hendidura de unión que interviene en la interacción no covalente con los péptidos. Las moléculas MHC de clase I presentan péptidos procedentes de la proteólisis de proteínas endógenas, DRiP y péptidos grandes. Las moléculas MHC de clase II, presentes mayoritariamente en las células presentadoras de antígeno (APC) especializadas, presentan predominantemente péptidos de proteínas exógenas o transmembrana que son captadas por las APC mediante endocitosis y después procesadas por las mismas. Los complejos constituidos por péptidos y moléculas MHC de clase I son reconocidos por los linfocitos T CD8-positivos portadores del receptor de linfocito T (TCR) adecuado, mientras que los complejos formados por péptidos y moléculas MHC de clase II son reconocidos por los linfocitos T cooperadores CD4-positivos portadores del TCR apropiado. Es bien sabido que el TCR, el péptido y el MHC están presentes en una relación estequiométrica de 1:1:1.
Los linfocitos T cooperadores CD4-positivos desempeñan un papel importante en la inducción y en el mantenimiento de respuestas eficaces por parte de los linfocitos T citotóxicos CD8-positivos. La identificación de los epítopos reconocidos por los linfocitos T CD4-positivos derivados de los antígenos asociados a tumor (TAA) reviste gran importancia para el desarrollo de productos farmacéuticos que desencadenen respuestas inmunitarias antitumorales; Gnjatic S, et al. Survey of naturally occurring CD4+ T cell responses against NY-ESO-1 in cancer patients: correlation with antibody responses. Proc Natl Acad Sci USA. 2003 Jul 22;100(15):8862-7). Los linfocitos T cooperadores generan en el seno del tumor un entorno de citocinas que es propicio para los CTL (Mortara L, et al. CIITA-induced MHC class II expression in mammary adenocarcinoma leads to a Th1 polarization of the tumor microenvironment, tumor rejection, and specific antitumor memory. Clin Cancer Res. 2006 Jun 1;12(11 Pt 1):3435-43) y que atrae a las células efectoras, como por ejemplo los propios CTL, células NK, macrófagos o granulocitos (Hwang ML, et al. Cognate memory CD4+ T cells generated with dendritic cell priming influencethe expansion, trafficking, and differentiation of secondary CD8+ T cells and enhance tumor control. J Immunol. 2007 Nov 1;179(9):5829-38).
En ausencia de inflamación, la expresión de las moléculas MHC de clase II se circunscribe principalmente a las células del sistema inmunitario, en concreto a las células presentadoras de antígeno (APC) especializadas, como por ejemplo monocitos, células derivadas de monocitos, macrófagos y células dendríticas. En pacientes con cáncer se ha descubierto con sorpresa que las células tumorales expresan moléculas MHC de clase II (Dengjel J, et al. Unexpected abundance of HLA class II presented peptides in primary renal cell carcinomas. Clin Cancer Res. 2006 Jul 15;12(14 Pt 1):4163-70).
En modelos de mamífero como el ratón se ha demostrado que los linfocitos T CD4-positivos pueden inhibir la manifestación de los tumores sin el concurso de las células efectoras CTL (los linfocitos T CD8-positivos) a través de la inhibición de la angiogénesis mediante la secreción de interferón gamma (IFN-y).
Además, se ha demostrado que los linfocitos T CD4-positivos pueden contrarrestar la progresión tumoral mediante la inducción de respuestas de anticuerpos al reconocer péptidos de antígenos asociados a tumor presentados por moléculas HLA de clase II.
A diferencia de lo que sucede con los péptidos asociados a tumor reconocidos por moléculas HLA de clase I, hasta la fecha el número descrito de ligandos de clase II derivados de antígenos asociados a tumor (TAA) es pequeño.
Dado que la expresión constitutiva de las moléculas HLA de clase II suele ser exclusiva de las células del sistema inmunitario, la posibilidad de aislar péptidos de clase II directamente de tumores primarios no se consideraba factible. Pero Dengjel et al. descubrieron varios epítopos de MHC de clase II en tumores (WO 2007/028574, EP 1760088 B1; (Dengjel et al., 2006).
Los antígenos que son reconocidos por los linfocitos T citotóxicos específicos del tumor, esto es, los epítopos, pueden ser moléculas derivadas de todo tipo de proteínas, tales como enzimas, receptores, factores de transcripción, etc. que son expresados y que, en comparación con células inalteradas del mismo origen, están regulados al alza en las células del tumor correspondiente.
Dado que ambos tipos de respuesta, la dependiente de CD8 y la de CD4, contribuyen conjunta y sinérgicamente al efecto antitumoral, la identificación y caracterización de los antígenos asociados a tumor reconocidos por los CTL CD8+ (ligando: moléculas MHC de clase I epítopo peptídico) o por los linfocitos T cooperadores c D4 positivos (ligando: moléculas MHC de clase II epítopo peptídico) es importante para el desarrollo de vacunas antitumorales.
Las variantes de longitud son, en general, péptidos alargados por los extremos N- y/o C-terminal (entre 1 y 5, preferiblemente 1 a 10 aminoácidos) o acortados por los extremos N- y/o C-terminales (entre 1 y 5 aminoácidos), que pueden unirse a MHC y desencadenar una respuesta inmunitaria celular como se describe en la presente memoria. Es conocido en la técnica que los péptidos que se unen a proteínas de clase II no tienen limitaciones de tamaño y su longitud puede variar entre 11 y 30 aminoácidos. La hendidura de unión al péptido de las moléculas MHC de clase II está abierta por ambos extremos, lo cual permite la unión de péptidos relativamente largos. Aunque el segmento "central" de nueve residuos de longitud es primordial para el reconocimiento del péptido, las regiones situadas en los lados también son importantes para definir la especificidad del péptido con respecto al alelo de clase II (véase, por ejemplo, Meydan C, et al., Prediction of peptides binding to MHC class I and II alleles by temporal motif mining. BMC Bioinformatics. 2013;14 Suppl 2:S13). Por medio de las numerosas herramientas informáticas disponibles, como las susodichas, la persona versada en la técnica podrá identificar el motivo de unión y determinar así las posibilidades de extensión y/o deleción de los péptidos MHC de clase II conforme a la Tabla 3, con el fin de crear variantes de longitud.
Para desencadenarla respuesta inmunitaria celular el péptido ha de unirse a una molécula de MHC. Este proceso depende del alelo de la molécula MHC y de los polimorfismos específicos de la secuencia de aminoácidos del péptido. Los péptidos que se unen a las MHC de clase I suelen tener una longitud de 8 a 12 residuos de aminoácidos y suelen contener dos residuos conservados («anclaje») en su secuencia que interactúan con la hendidura de unión correspondiente de la molécula de MHC. De este modo cada alelo MHC posee un «motivo de unión» que determina qué péptidos se pueden unir específicamente a la hendidura de unión.
En la reacción inmunitaria dependiente de las MHC de clase I, los péptidos no solo tienen que ser capaces de unirse a ciertas moléculas MHC de clase I expresadas por las células tumorales, también tienen que ser reconocidos por linfocitos T portadores de receptores TCR específicos.
Los antígenos que son reconocidos por los linfocitos T citotóxicos específicos del tumor, esto es, los epítopos, pueden ser moléculas derivadas de todo tipo de proteínas, tales como enzimas, receptores, factores de transcripción, etc. que son expresados y que, en comparación con células inalteradas del mismo origen, están regulados al alza en las células del tumor correspondiente.
La clasificación actual de los antígenos asociados a tumores comprende los siguientes grupos principales:
a) Antígenos cáncer-testículo: Los primeros antígenos asociados a tumores (TAA) descubiertos que pueden ser reconocidos por linfocitos T pertenecen a esta clase, que inicialmente se denominó antígenos cáncer-testículo (CT) porque sus miembros se expresan en tumores humanos histológicamente diferentes y en los tejidos normales solo se encuentran en los espermatocitos/espermatogonias del testículo y ocasionalmente en la placenta. Como las células del testículo no expresan moléculas HLA de clase I y II, estos antígenos no pueden ser reconocidos por los linfocitos T de los tejidos normales y por tanto se consideran como específicos de tumor desde el punto de vista inmunológico. Ejemplos conocidos de antígenos CT son los miembros de la familia MAGE y el NY-ESO-1. b) Antígenos de diferenciación: Estos TAA están presentes tanto en los tumores como en el tejido normal del que deriva el tumor; la mayoría se encuentran en melanomas y en melanocitos normales. Muchas de esas proteínas relacionadas con el linaje melanocítico participan en la biosíntesis de la melanina y no son específicas de tumor, lo que no impide que sean muy utilizadas en la inmunoterapia contra el cáncer. Algunos ejemplos son la tirosinasa y Melan-A/MART-1 en el melanoma y el PSA en el cáncer de próstata.
c) TAA sobreexpresados: Se han detectado genes que codifican TAA de amplia expresión en tumores histológicamente distintos y en numerosos tejidos normales, en general con niveles de expresión más bajos. Es posible que muchos de los epítopos procesados y posiblemente presentados por los tejidos normales lo sean por debajo del límite necesario para ser reconocidos por los linfocitos T, pero que la sobreexpresión por parte de las células tumorales rompa la tolerancia vigente hasta ese momento y desencadene la respuesta antitumoral. Ejemplos destacados de esta clase de TAA son Her-2/neu, survivina, telomerasa o WT1.
d) Antígenos específicos de tumor: Estos TAA únicos son fruto de mutaciones de genes normales (como pcatenina, CDK4, etc.). Algunos de esos cambios moleculares están relacionados con la transformación neoplásica y/o su progresión. Los antígenos específicos de tumor generalmente son capaces de inducir potentes respuestas inmunitarias sin riesgo de reacciones autoinmunitarias contra los tejidos normales. Por otro lado, casi siempre estos TAA solo son relevantes para el mismo tumor exacto en el que fueron identificados y normalmente no se encuentran en muchos otros tumores de su tipo.
e) TAA resultantes de modificaciones postraduccionales anormales: Estos TAA pueden surgir a partir de proteínas que no son específicas ni se sobreexpresan en los tumores, pese a lo cual aparecen asociados a tumores por procesos postraduccionales que se activan principalmente en los tumores. Ejemplos de este tipo surgen a raíz de patrones de glucosilación alterados que generan epítopos nuevos en tumores como MUC1 o fenómenos como el ayuste de proteínas durante la degradación que en algunos casos pueden ser específicos de tumor.
f) Proteínas de oncovirus: Estos TAA son proteínas virales que podrían desempeñar un papel crítico en el proceso oncogénico y que, como extrañas a causa de su origen no humano, pueden desencadenar una respuesta de los linfocitos T. Ejemplos de tales proteínas son las proteínas E6 y E7 del virus del papiloma humano de tipo 16, que se expresan en el carcinoma cervical.
Para que las proteínas sean reconocidas por los linfocitos T citotóxicos como antígenos específicos o asociados a tumor y puedan ser empleadas como tratamiento, deben cumplir ciertos prerrequisitos. El antígeno ha de expresarse principalmente en células tumorales y no en tejidos normales sanos o, de no ser así, ha de hacerlo en cantidades comparativamente pequeñas; en otra forma de realización preferida el péptido debe ser presentado en exceso por células tumorales en comparación con los tejidos normales sanos. Y no sólo es conveniente que el antígeno de interés esté presente únicamente en un tipo de tumor, sino que lo esté también en altas concentraciones (número de copias del péptido por célula). Los antígenos específicos de tumor y asociados a tumor proceden a menudo de proteínas que intervienen directamente en la transformación de una célula normal en una célula tumoral a causa de su función, por ejemplo, porque intervienen en el control del ciclo celular o en la supresión de la apoptosis. Además, también las dianas ulteriores de las proteínas que son las causantes directas de la transformación pueden estar reguladas al alza y, por tanto, estar asociadas indirectamente al tumor. Tales antígenos asociados indirectamente a tumores también pueden ser dianas en una estrategia de vacunación (Singh-Jasuja et al. The Tübingen approach: identification, selection, and validation of tumor-associated HLA peptides for cancer therapy. Cancer Immunol Immunother. 2004 Mar;53(3):187-95). En ambos casos es esencial que la secuencia de aminoácidos del antígeno contenga epítopos, puesto que el péptido («péptido inmunogénico») derivado de un antígeno asociado a tumor debe desencadenar una respuesta de los linfocitos T en condiciones in v itro o in vivo.
Básicamente, cualquier péptido capaz de unirse a una molécula de MHC puede actuar como un epítopo de linfocito T. Un prerrequisito para la inducción de una respuesta de linfocitos T in v itro o in v ivo es la presencia de un linfocito T dotado del correspondiente TCR y la ausencia de tolerancia inmunitaria hacia ese epítopo en particular.
Por consiguiente, los TAA son el punto de partida para el desarrollo de una vacuna antitumoral. Los métodos para identificar y caracterizar los TAA están basados en el uso de CTL que pueden aislarse de pacientes o de individuos sanos, o en la generación de perfiles de transcripción diferenciales o patrones de expresión peptídica diferenciales entre los tumores y los tejidos normales.
No obstante, la identificación de genes sobreexpresados o expresados selectivamente en tejidos tumorales o en estirpes de células tumorales humanas no aporta información precisa acerca del uso de los antígenos transcritos de esos genes en la inmunoterapia. Ello se explica porque solo una subpoblación individual de epítopos de esos antígenos resulta adecuada para aplicaciones de ese tipo, puesto que ha de haber un linfocito T con el TCR correspondiente y la inmunotolerancia hacia ese epítopo concreto ha de ser mínima o nula. Por tanto, en una forma de realización muy preferida de la invención es importante seleccionar únicamente aquellos péptidos que sean presentados en exceso o de forma selectiva contra los cuales se encuentre un linfocito T funcional y/o proliferativo. Un linfocito T funcional se define como un linfocito T que tras la estimulación con un antígeno específico puede sufrir una expansión clonal y ser capaz de ejecutar funciones efectoras («linfocito T efector»).
En el caso de los TCR y de los anticuerpos conformes a la invención, la inmunogenicidad de los péptidos subyacentes es secundaria. En los TCR y en los anticuerpos de la invención la presentación es el factor determinante.
Los linfocitos T cooperadores desempeñan un papel importante en la coordinación de la función efectora de los CTL en la inmunidad antitumoral. Los epítopos reconocidos por los linfocitos T cooperadores que desencadenan una respuesta de los linfocitos T cooperadores del tipo Th1 apoyan las funciones efectoras de los linfocitos T citotóxicos CD8+, que incluyen funciones citotóxicas dirigidas contra las células tumorales que muestran en su superficie complejos de MHC/péptido asociado a tumor. De esta forma, los epítopos de los péptidos asociados a tumores que son reconocidos por los linfocitos T colaboradores, solos o en combinación con otros péptidos asociados a tumores, pueden servir como principios activos farmacéuticos en composiciones vacunales destinadas a estimular respuestas inmunitarias antitumorales.
En la siguiente descripción detallada de los péptidos conforme a la invención se dan a conocer diversos usos contra otros tipos de cáncer.
Descripción detallada de la invención
En la presente memoria todos los términos corresponden a la definición indicada a continuación, salvo en los casos en que se indique otra cosa.
El término «péptido» designa aquí una serie de residuos de aminoácidos conectados entre sí típicamente mediante enlaces peptídicos entre los grupos amino-alfa y carbonilo de los aminoácidos adyacentes. Los péptidos tienen preferiblemente 9 aminoácidos de longitud, pero pueden tener solo 8 aminoácidos de longitud, pero también hasta 10, 11, 12, 13 o 14, y en el caso de los péptidos de Mh C de clase II pueden tener 15, 16, 17, 18, 19 o 20 aminoácidos de longitud.
Además, el término «péptido» incluye sales de una serie de residuos de aminoácidos conectados entre sí típicamente por enlaces peptídicos entre los grupos amino-alfa y carbonilo de los aminoácidos adyacentes. Preferentemente las sales son sales farmacéuticamente aceptables de los péptidos, como por ejemplo, sales de cloruro o acetato (trifluoroacetato).
El término «péptido» incluye «oligopéptido». El término «oligopéptido» designa aquí una serie de residuos de aminoácidos conectados entre sí típicamente mediante enlaces peptídicos entre los grupos amino-alfa y carbonilo de los aminoácidos adyacentes. La longitud del oligopéptido no es crucial en la invención, siempre que se mantenga el epítopo o epítopos adecuados. Los oligopéptidos suelen tener una longitud inferior a unos 30 aminoácidos y mayor de 15, aproximadamente.
El término «los péptidos de la presente invención» incluirá los péptidos de los que consiste o comprende un péptido tal y como se ha definido antes según la SEQ ID N.° 266.
El término «polipéptido» designa una serie de residuos de aminoácidos conectados entre sí típicamente por enlaces peptídicos entre los grupos amino-alfa y carbonilo de los aminoácidos adyacentes. La longitud del polipéptido no es crucial en la invención, siempre que se mantengan los epítopos adecuados. En contraste con los términos «péptido» y «oligopéptido», el término «polipéptido» se refiere a las moléculas de más de unos 30 residuos de aminoácidos de longitud.
Un péptido, oligopéptido, proteína o polinucleótido que codifica dicha molécula es «inmunogénico» (y, por lo tanto, un «inmunógeno» en la presente invención), si es capaz de inducir una respuesta inmunitaria. En el caso de la presente invención, la inmunogenicidad se define más específicamente como la capacidad para desatar una respuesta por parte de los linfocitos T. Por lo tanto, un inmunógeno sería una molécula que es capaz de inducir una respuesta inmunitaria y, en el caso de la presente invención, una molécula capaz de inducir una respuesta de los linfocitos T. En otro aspecto, el inmunógeno puede ser el péptido, el complejo del péptido con MHC, el oligopéptido y/o la proteína que es utilizado para generar anticuerpos o TCR específicos contra él.
Un «epítopo» de linfocito T de clase I requiere un péptido corto que esté unido a un receptor MHC de clase I, formando un complejo ternario (cadena alfa de m Hc de clase I, beta-2-microglobulina y péptido) que puede ser reconocido por un linfocito T que lleve un receptor de linfocito T que coincida y que se una al complejo MHC/péptido con la afinidad adecuada. Los péptidos que se unen a moléculas MHC de clase I suelen tener una longitud de entre 8 y 14 aminoácidos, y más habitualmente de 9 aminoácidos.
En el ser humano hay tres lo c u s genéticos diferentes que codifican las moléculas MHC de clase I (las moléculas MHC del ser humano también se denominan antígenos leucocitarios humanos [HLA]): HLA-A, HLA-B y HLA-C. HLA-A*01, HLA-A*02 y HLA-B*07 son ejemplos de distintos alelos MHC de clase I que se pueden expresar a partir de estos locus.
Tabla 6: Frecuencias de expresión F del alelo HLA*A02 y de los serotipos más frecuentes de1HLA-DR. Las frecuencias se infieren de las frecuencias haplotípicas Gf en la población norteamericana adaptadas de Mori y cols. empleando la fórmula de Hardy-Weinberg F=1-(1-Gf)2 (Mori M, et al. HLA gene and haplotype frequencies in the North American population: the National Marrow Donor Program Donor Registry. Transplantation. 1997 Oct 15;64(7):1017-27). Las combinaciones de A*02 con determinados alelos HLA-Dr podrían ser más o menos abundantes de lo esperado a partir de sus frecuencias aisladas debido al desequilibrio de ligamiento. Para más detalles véase Chanock y cols. .(S.J. Chanock, et al (2004) HLA-A, -B, -Cw, -Dq A 1 and DRB1 in an African American population from Bethesda, USA Human Immunology, 65: 1223-1235).
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Por tanto, a efectos terapéuticos y de diagnóstico sería muy deseable contar con un péptido que se uniese, con la afinidad adecuada, a varios receptores HLA de clase II distintos. Un péptido que se une a varias moléculas HLA de clase II distintas recibe el nombre de ligando promiscuo.
En la presente memoria, la referencia a una secuencia de ADN incluye tanto ADN monocatenario como bicatenario. Por lo tanto, la secuencia específica, a menos que el contexto indique otra cosa, se refiere al ADN monocatenario de dicha secuencia, a la doble cadena formada por dicha secuencia con su complementaria (ADN bicatenario) y a la cadena complementaria de dicha secuencia. El término «región codificante» hace referencia a la porción de un gen que, o bien de forma natural o normal, codifica el producto de expresión de dicho gen en su ambiente genómico natural, por ejemplo, la región que codifica in v ivo el producto de expresión natural del gen.
La región codificante puede formar parte de un gen no mutado («normal»), mutado o alterado, o incluso puede provenir de una secuencia de ADN, o gen, sintetizada íntegramente en el laboratorio con métodos bien conocidos por los expertos en la síntesis de ADN.
El término «secuencia nucleotídica» hace referencia a un heteropolímero de desoxirribonucleótidos.
La secuencia nucleotídica que codifica un péptido, oligopéptido o polipéptido en particular puede ser natural o estar construida de forma sintética. Generalmente, los segmentos de ADN que codifican los péptidos, polipéptidos y proteínas de la presente invención se ensamblan a partir de fragmentos de ADNc y de oligonucleótidos cortos de enlace, o a partir de una serie de oligonucleótidos, con el fin de proporcionar un gen sintético capaz de ser expresado en una unidad transcripcional recombinante que comprenda elementos reguladores derivados de un operón microbiano o vírico.
Tal y como se utiliza en la presente memoria el término «un nucleótido que codifica un péptido» se refiere a una secuencia de nucleótidos que codifica el péptido y que incluye codones artificiales (sintetizados por el hombre) de inicio y de terminación compatibles con el sistema biológico en el que la secuencia va a expresarse.
El término «producto de expresión» se refiere al polipéptido o a la proteína que es el producto natural de la traducción del gen y cualquier secuencia de ácidos nucleicos que codifiquen los equivalentes resultantes de la degeneración del código genético y, por tanto, que codifican el mismo aminoácido o aminoácidos.
El término «fragmento», cuando se refiere a una secuencia codificante, define una porción de ADN que no comprende la región codificante entera, cuyo producto de expresión conserva esencialmente la misma actividad o función biológica que el producto de expresión de la región codificante entera.
El término «segmento de ADN» hace referencia a un polímero de ADN, en forma de un fragmento separado o como componente de un constructo de ADN mayor, que deriva de ADN aislado por lo menos una vez en una forma sustancialmente pura, es decir, exento de materiales endógenos contaminantes y en una cantidad o concentración que permite la identificación, la manipulación y la recuperación del segmento y de sus secuencias nucleotídicas constituyentes mediante métodos bioquímicos estándar como, por ejemplo, mediante un vector de clonación. Dichos segmentos se suministran en forma de un marco de lectura abierto sin interrupciones por secuencias internas no traducidas, o intrones, que suelen estar presentes en los genes eucariotas. Las secuencias de ADN no traducidas pueden estar presentes en dirección 3' (d o w n s tre a m ) desde el marco de lectura abierto, donde no interfieren con la manipulación o la expresión de las regiones codificantes.
El término «cebador» define una secuencia corta de ácidos nucleicos que puede aparearse con una cadena de ADN y que proporciona un extremo 3'-OH libre en el que una polimerasa de ADN puede comenzar la síntesis de una cadena de desoxirribonucleótidos.
El término «promotor» define una región de ADN implicada en la unión de la polimerasa de ARN para iniciar la transcripción.
El término «aislado» define el material que se extrae de su entorno original (por ejemplo, el entorno natural si ocurre de forma natural). Por ejemplo, un polinucleótido o un polipéptido natural presente en un animal vivo no está aislado, pero ese mismo polinucleótido o polipéptido lo estará si es separado de parte o de todos los materiales coexistentes en el sistema natural. Tales polinucleótidos podrán formar parte de un vector y/o tales polinucleótidos o polipéptidos podrán formar parte de una composición, y seguir estando aislados en dicho vector o composición puesto que estos no forman parte de su entorno natural.
Los polinucleótidos, y los polipéptidos recombinantes o inmunógenos, descritos de acuerdo con la presente invención también pueden presentarse en forma «purificada». El término «purificado» no implica pureza absoluta; más bien, se utiliza como definición relativa y puede incluir preparaciones altamente purificadas o preparaciones tan sólo parcialmente purificadas, tal y como los expertos en la materia entienden dichos términos. Por ejemplo, los clones individuales aislados de una genoteca de ADNc se han purificado de manera convencional hasta obtener una homogeneidad electroforética. Se contempla expresamente la purificación del material de partida o del material natural hasta, al menos, un orden de magnitud; preferiblemente, dos o tres órdenes de magnitud; y, con mayor preferencia, cuatro o cinco órdenes de magnitud. Además, se contempla expresamente el polipéptido reivindicado que tiene una pureza de, preferiblemente, el 99,999%, o, al menos, del 99,99% o el 99,9%; y, más convenientemente, del 99% por peso o mayor.
Los productos de expresión de los polipéptidos y los ácidos nucleicos descritos conforme a la presente invención, así como los vectores de expresión que contienen dichos ácidos nucleicos y/o dichos polipéptidos, pueden utilizarse en «forma enriquecida». Tal y como se usa aquí, el término «enriquecido» significa que la concentración del material es, al menos, unas 2, 5, 10, 100 o 1000 veces su concentración natural (por ejemplo), más ventajosamente 0,01% por peso, y, preferiblemente, aproximadamente de 0,1% al menos, por peso. También se contemplan preparaciones enriquecidas de alrededor del 0,5%, 1%, 5%, 10% y 20% por peso. Las secuencias, constructos, vectores, clones y otros materiales que comprenden la presente invención pueden utilizarse, según convenga, en su forma enriquecida o aislada.
El término «fragmento activo» define un fragmento que genera una respuesta inmunitaria(es decir, que posee actividad inmunógena) cuando se administra - solo u, opcionalmente, con un adyuvante adecuado - a un animal, que puede ser un mamífero como, por ejemplo, un conejo o un ratón, sin excluir a un ser humano; dicha respuesta inmunitaria adopta la forma de estimulación de una respuesta de linfocitos T en el animal receptor como, por ejemplo, el ser humano. De forma alternativa, el «fragmento activo» también se puede usar para inducir una respuesta de linfocitos T in vitro.
Tal y como se usan en la presente memoria, los términos «porción», «segmento» y «fragmento», cuando se utilizan en relación a los polipéptidos, hacen referencia a una secuencia continua de residuos, como residuos de aminoácidos, secuencia que es un subconjunto de una secuencia mayor. Por ejemplo, si un polipéptido se somete a un tratamiento con cualquiera de las endopeptidasas habituales, como la tripsina o la quimotripsina, los oligopéptidos resultantes de dicho tratamiento representarán porciones, segmentos o fragmentos del polipéptido inicial. Utilizados en relación con los polinucleótidos, estos términos se refieren a los productos producidos por el tratamiento de dichos polinucleótidos con cualquiera de las endonucleasas.
Conforme a la presente invención, el término «identidad porcentual» o «porcentaje de identidad», al referirse a una secuencia, significa que una secuencia se compara con una secuencia reivindicada o descrita después de alinear la secuencia que se va a comparar (la «secuencia comparada») con la secuencia descrita o reivindicada (la «secuencia de referencia»). La identidad porcentual se determina entonces con la siguiente fórmula:
Identidad porcentual = 100 [1 -(C/R)]
donde C es el número de diferencias entre la secuencia de referencia y la secuencia comparada a lo largo de la alineación entre la secuencia de referencia y la secuencia comparada, donde
(i) cada base o aminoácido de la secuencia de referencia que no tiene una base o aminoácido alineados en la secuencia comparada y
(ii) cada hueco (ga p ) de la secuencia de referencia y
(iii) cada base o aminoácido alineado de la secuencia de referencia que difiere de una base o aminoácido alineado de la secuencia comparada, constituye una diferencia; y
(iiii) la alineación tiene que comenzar en la posición 1 de las secuencias alineadas;
y R es el número de bases o aminoácidos de la secuencia de referencia a lo largo de la alineación con la secuencia comparada con cualquier hueco creado en la secuencia de referencia, también contabilizado como una base o un aminoácido.
Si existe una alineación entre la secuencia comparada y la secuencia de referencia para la que la identidad porcentual, calculada como se ha especificado arriba, es aproximadamente igual o mayor que una identidad porcentual mínima especificada, entonces la secuencia comparada guarda la identidad porcentual mínima especificada con la secuencia de referencia, aunque puedan existir alineaciones en las que la identidad porcentual calculada arriba resulte menor que la identidad porcentual especificada.
Los péptidos originales (sin modificar) descritos aquí se pueden modificar mediante la sustitución de uno o más residuos en sitios diferentes, posiblemente selectivos, dentro de la cadena peptídica, si no se especifica de otra manera. Preferentemente tales sustituciones estarían situadas al final de la cadena de aminoácidos. Dichas sustituciones pueden ser de naturaleza conservadora como, por ejemplo, si un aminoácido es reemplazado por un aminoácido de estructura y características similares, como en el caso de un aminoácido hidrofóbico que es sustituido por otro aminoácido hidrofóbico. Aún más conservador sería el reemplazo de aminoácidos de tamaño y naturaleza química igual o similar como, por ejemplo, si una leucina se reemplaza por isoleucina. En diversos estudios de variaciones de secuencias en familias de proteínas homólogas naturales, determinadas sustituciones de aminoácidos se toleran con más frecuencia que otras, y éstas muestran a menudo una correlación con similitudes de tamaño, carga, polaridad e hidrofobicidad entre el aminoácido original y su reemplazo, siendo ésta la base para la definición de las «sustituciones conservadoras».
Las sustituciones conservadoras se definen como intercambios dentro de uno de los cinco grupos siguientes: Grupo 1: residuos alifáticos pequeños, no polares o ligeramente polares (Ala, Ser, Thr, Pro y Gly); Grupo 2: residuos polares cargados negativamente y sus amidas (Asp, Asn, Glu y Gln); Grupo 3: residuos polares cargados positivamente (His, Arg y Lys); Grupo 4: residuos alifáticos grandes no polares (Met, Leu, Ile, Val y Cys); y Grupo 5: residuos grandes aromáticos (Phe, Tyr y Trp).
Las sustituciones menos conservadoras pueden implicar el reemplazo de un aminoácido por otro con características similares pero diferenciado de alguna manera en el tamaño, como en el reemplazo de un residuo de isoleucina por alanina. Los reemplazos muy poco o nada conservadores pueden implicar la sustitución de un aminoácido ácido por otro polar, o incluso por uno de carácter básico. Estas sustituciones «radicales» no se pueden descartar, sin embargo, como potencialmente inefectivas, ya que los efectos químicos no son totalmente predecibles y las sustituciones radicales bien pueden provocar efectos inesperados imposibles de predecir de otra forma a partir de principios químicos simples.
Naturalmente, dichas sustituciones pueden implicar otras estructuras distintas de los aminoácidos L habituales. De esta forma, aminoácidos D podrían sustituir a los aminoácidos L que habitualmente se encuentran en los péptidos antigénicos de la invención y, aún así, quedar englobados en la descripción del presente documento. Además, los aminoácidos que poseen grupos R no estándar (es decir, grupos R distintos de los presentes en los 20 aminoácidos comunes de las proteínas naturales) también pueden ser utilizados como sustitutos para producir polipéptidos inmunógenos e inmunogénicos de acuerdo con la presente descripción.
Si se descubre que las sustituciones en más de una posición resultan en un péptido con actividad antigénica sustancialmente equivalente o mayor, como se define más abajo, entonces las combinaciones de dichas sustituciones se probarán para determinar si las sustituciones combinadas provocan efectos aditivos o sinérgicos en la antigenicidad del péptido. Como máximo, se sustituirán hasta 4 posiciones simultáneamente dentro del péptido.
Los péptidos de la invención se pueden alargar hasta cuatro aminoácidos, es decir, se pueden añadir 1, 2, 3 o 4 aminoácidos en cualquier combinación entre 4:0 y 0:4.
A continuación en la Tabla 7 se exponen combinaciones de las elongaciones conformes a la invención:
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Los aminoácidos para la elongación pueden ser los péptidos de la secuencia original de la proteína o cualquier otro aminoácido. La elongación tiene por finalidad mejorar la estabilidad o la solubilidad de los péptidos.
El término «respuesta de linfocitos T» define la proliferación y la activación específicas de las funciones efectoras inducidas por un péptido in v itro o in vivo. En el caso de los linfocitos T citotóxicos (CTL) restringidos a MHC de clase I, las funciones efectoras pueden consistir en la lisis de células diana presentadoras naturales de péptido o bien sensibilizadas de manera repetida con un péptido o con un precursor del mismo; la secreción de citocinas, preferiblemente de interferón gamma, TNF-alfa o IL-2 inducida por péptido; la secreción de moléculas efectoras, preferiblemente granzimas o perforinas inducidas por péptido; o la desgranulación.
Preferiblemente, cuando los CTL específicos para un péptido acorde con la presente invención se prueben contra los péptidos sustituidos, la concentración de péptido a la cual los péptidos sustituidos consiguen la mitad del aumento máximo de la lisis respecto al valor de fondo es como máximo de alrededor de 1 mM, preferiblemente como máximo de alrededor de 1 pM, más preferiblemente como máximo de alrededor de 1 nM, y aún más preferentemente como máximo de alrededor de 100 pM, y más preferentemente como máximo de alrededor de 10 pM. También se prefiere que el péptido sustituido sea reconocido por los CTL de más de un individuo, de al menos dos, y más preferiblemente de tres individuos.
La estimulación de una respuesta inmunitaria depende de la presencia de antígenos que sean reconocidos como extraños por el sistema inmunitario del hospedador. El descubrimiento de la existencia de antígenos asociados a tumores ha suscitado la posibilidad de utilizar el sistema inmunitario del hospedador para intervenir sobre el crecimiento de los tumores. Actualmente se están explorando diversos mecanismos para aprovechar los mecanismos de defensa humorales y celulares del sistema inmunitario en la inmunoterapia contra el cáncer.
Ciertos elementos de la respuesta inmunitaria celular son capaces de reconocer específicamente y destruir las células tumorales. El aislamiento de linfocitos T citotóxicos (CTL) entre las células infiltradas en los tumores o en la sangre periférica hace pensar en que tales células desempeñan un papel importante en las defensas inmunitarias naturales contra el cáncer. Los linfocitos T CD8-positivos en particular, que reconocen las moléculas de clase I del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) portadoras de péptidos que suelen tener de 8 a 12 residuos derivados de proteínas o de productos ribosómicos defectuosos (DRIPS) localizados en el citosol, desempeñan un importante papel en esta respuesta. Las moléculas MHC del ser humano también se denominan antígenos leucocitarios humanos (HLA).
Las moléculas MHC de clase I se encuentran en la mayoría de las células nucleadas y presentan péptidos derivados de la escisión proteolítica, principalmente de proteínas endógenas, citosólicas o nucleares, DRIPS y péptidos más grandes. No obstante, los péptidos derivados de compartimentos endosómicos o de fuentes exógenas también se encuentran con frecuencia ligados a moléculas de MHC de clase I. Esta vía no clásica de presentación por la clase I se denomina presentación cruzada en la bibliografía.
Dado que ambos tipos de respuesta, la dependiente de CD8 y la de CD4, contribuyen conjunta y sinérgicamente al efecto antitumoral, la identificación y caracterización de los antígenos asociados a tumor reconocidos por los CTL CD8-positivos (moléculas de MHC de clase I) o por los CTL CD4-positivos (moléculas de MHC de clase II) es importante para el desarrollo de vacunas antitumorales. Por consiguiente uno de los fines de la presente invención consiste en proveer composiciones de péptidos que contengan péptidos de unión a complejos m Hc de cualquier de las clases.
A la luz de los efectos secundarios graves y los gastos que supone el tratamiento contra el cáncer es evidente la urgente necesidad de mejora de los métodos pronósticos y diagnósticos. Así pues, existe la necesidad de descubrir otros factores que puedan servir como biomarcadores para el cáncer en general y el cáncer de pulmón en particular. Existe igualmente la necesidad de identificar factores que puedan ser utilizados en el tratamiento contra el cáncer en general y contra la LMA en particular.
La presente invención proporciona péptidos que son útiles para el tratamiento de cánceres/tumores, preferentemente de pulmón, más preferentemente de LMA y otros tipos de cáncer (véase la tabla 5) que sobrepresentan o presentan exclusivamente los péptidos de la invención. Con técnicas de espectrometría de masas se ha demostrado la presentación natural por moléculas HLA de estos péptidos en muestras humanas de LMA.
Se ha demostrado que el gen o proteína originarios (también denominados «proteína entera» o «proteína subyacente») de la que derivan los péptidos están altamente sobreexpresados en tejido tumoral en comparación con tejidos normales (véase ejemplo 1, y Figura 2 para la LMA) lo que demuestra el alto grado de asociación con el tumor de los genes originarios. Además, los propios péptidos están fuertemente sobrepresentados en el tejido tumoral, pero no en los tejidos normales (véanse ejemplo 1 y Figura 3).
Los péptidos de unión a HLA pueden ser reconocidos por el sistema inmunitario, específicamente por los linfocitos T. Los linfocitos T destruyen las células que presentan el complejo HLA/péptido reconocido, p. ej., células de cáncer de pulmón que presentan los péptidos derivados.
Los péptidos de la presente invención han demostrado su capacidad para estimular las respuestas de los linfocitos T y/o están sobrepresentados y, por tanto, pueden ser utilizados para la producción de anticuerpos y/o TCR, en concreto TCR solubles, conforme a la presente invención (véanse ejemplo 1 y Figura 4). Asimismo, cuando los péptidos están formando un complejo con el MHC correspondiente pueden ser utilizados para la producción de anticuerpos y/o de TCR, en concreto t Cr solubles, conforme a la presente invención también. Los métodos pertinentes son conocidos por los expertos y también se pueden hallaren la bibliografía pertinente. Así pues, los péptidos de la presente invención son útiles para generar en un paciente una respuesta inmunitaria con la que destruir células tumorales. La respuesta inmunitaria se puede inducir en el paciente con la administración directa de los péptidos descritos o de sustancias precursoras adecuadas (p. ej., péptidos alargados, proteínas o ácido nucleicos que codifiquen dichos péptidos), idealmente en combinación con un agente que potencie la inmunogenicidad (un adyuvante).Cabe esperar que la respuesta inmunitaria generada por esa vacunación terapéutica sea muy específica contra las células tumorales porque los tejidos normales no contienen los péptidos diana de la presente invención en un número comparable de copias, lo cual evita el riesgo de reacciones autoinmunitarias perjudiciales contra las células normales del paciente.
Las composiciones farmacéuticas comprenden los péptidos en forma libre o en forma de una sal farmacéuticamente aceptable (véase también más arriba).Tal y como se utiliza en la presente memoria, «sal farmacéuticamente aceptable» se refiere a un derivado de los péptidos descritos en el que el péptido es modificado para obtener sales ácidas o básicas del agente. Por ejemplo, las sales ácidas se preparan a partir de la base libre (normalmente la forma neutra del fármaco posee un grupo -N H 2 neutro) haciéndola reaccionar con un ácido adecuado. Ácidos adecuados para la preparación de sales ácidas incluyen tanto ácidos orgánicos, p. ej., ácido acético, ácido propiónico, ácido glicólico, ácido pirúvico, ácido oxálico, ácido málico, ácido malónico, ácido succínico, ácido maleico, ácido fumárico, ácido tartárico, ácido cítrico, ácido benzoico, ácido cinámico, ácido mandélico, ácido metanosulfónico, ácido etanosulfónico, ácido p-toluensulfónico, ácido salicílico y similares, como ácidos inorgánicos, como, por ejemplo, ácido, clorhídrico, ácido bromhídrico, ácido sulfúrico, ácido nítrico, ácido fosfórico y similares. A la inversa, la preparación de sales básicas a partir de grupos ácidos que pueden estar presentes en un péptido se preparan empleando una base farmacéuticamente aceptable como hidróxido de sodio, hidróxido de potasio, hidróxido de amonio, hidróxido de calcio, trimetilamina o similares.
En una forma de realización especialmente preferida, las composiciones farmacéuticas comprenden los péptidos en forma de sales de ácido acético (acetatos), trifluoroacetatos o ácido clorhídrico (cloruros).
Los péptidos de la presente invención pueden ser usados para generar y desarrollar anticuerpos específicos contra complejos MHC/péptido. Estos pueden ser usados como terapia, dirigiendo toxinas o sustancias radiactivas contra el tejido enfermo. Otra aplicación de estos anticuerpos consistiría en dirigir radionúclidos contra el tejido enfermo en aplicaciones de diagnóstico por la imagen como la TEP. Este uso puede ayudar a detectar metástasis pequeñas o determinar el tamaño y la ubicación precisa de los tejidos enfermos.
Se da a conocer un método para producir un anticuerpo recombinante que se une específicamente a un complejo mayor de histocompatibilidad humano (MHC) de clase I que forma un complejo con un antígeno restringido a HLA, comprendiendo dicho método: inmunizar un mamífero no humano genéticamente modificado que comprenda células que expresen dicho complejo mayor de histocompatibilidad humano (MHC) de clase I con una forma soluble de una molécula MHC de clase I unida a dicho antígeno restringido a HLA; aislamiento de moléculas de ARNm a partir de células productoras de anticuerpos de dicho mamífero no humano; producción de una fagoteca que contenga moléculas proteicas codificadas por dichas moléculas de ARNm; y aislamiento de al menos un fago de dicha fagoteca, en que al menos ese fago contenga dicho anticuerpo que se une específicamente al citado complejo mayor de histocompatibilidad humano (MHC) de clase I unido con dicho antígeno restringido a HLA.
Existe otro aspecto más de la invención que proporciona un anticuerpo que se une específicamente a un complejo mayor de histocompatibilidad humano (MHC) de clase I que forma un complejo con el péptido acorde con la presente invención, en el que el anticuerpo es preferentemente un anticuerpo policlonal, anticuerpo monoclonal, anticuerpo biespecífico y/o un anticuerpo quimérico.
Se da a conocer un método para producir dicho anticuerpo que se une específicamente a un complejo mayor de histocompatibilidad humano (MHC) de clase I que forma un complejo con un antígeno restringido a HLA, comprendiendo dicho método: inmunizar un mamífero no humano genéticamente modificado que comprenda células que expresen dicho complejo mayor de histocompatibilidad humano (MHC) de clase I con una forma soluble de una molécula MHC de clase I unida a dicho antígeno restringido a HLA; aislamiento de moléculas de ARNm a partir de células productoras de anticuerpos de dicho mamífero no humano; producción de una fagoteca que contenga moléculas proteicas codificadas por dichas moléculas de ARNm; y aislamiento de al menos un fago de dicha fagoteca, en que al menos ese fago contenga dicho anticuerpo capaz de unirse específicamente al citado complejo mayor de histocompatibilidad humano (MHC) de clase I o II unido con dicho antígeno restringido a HLA. Métodos pertinentes para la producción de tales anticuerpos y de complejos mayores de histocompatibilidad de clase I monocatenarios, así como de otras herramientas para la producción estos anticuerpos se revelan en WO 03/068201, WO 2004/084798,WO 01/72768, WO 03/070752, y en Cohen CJ, et al. Recombinant antibodies with MHC-restricted, peptide-specific, T-cell receptor-like specificity: new tools to study antigen presentation and TCR-peptide-MHC interactions. J Mol Recognit.
2003 Sep-Oct;16(5):324-32.; Denkberg G, et al. Selective targeting of melanoma and APCs using a recombinant antibody with TCR-like specificity directed toward a melanoma differentiation antigen. J Immunol. 2003 Sep 1;171(5):2197-207; y en Cohen CJ, et al. Direct phenotypic analysis of human MHC class I antigen presentation: visualization, quantitation, and in situ detection of human viral epitopes using peptide-specific, MHC-restricted human recombinant antibodies. J Immunol. 2003 Apr 15; 170(8):4349-61.
Preferiblemente el anticuerpo se une al complejo con una afinidad de unión inferior a 20 nanomolar, preferentemente inferior a 10 nanomolar, lo cual se considera «específico» en el contexto de la presente invención.
Se da conocer un método para producir un receptor de linfocito T soluble que reconoce un complejo de péptido-MHC específico. Dichos receptores de linfocitos T solubles se pueden generar a partir de clones de linfocitos T específicos, cuya afinidad se puede incrementar por mutagénesis dirigida a las regiones determinantes de complementariedad. Para la selección del receptor de linfocito T se puede utilizar un fagoteca (US 2010/0113300, Liddy N, Bossi G, Adams KJ, LissinaA, MahonTM, Hassan NJ, etal. MonoclonalTCR-redirected tumorcell killing. N a tM e d 2012 Jun;18(6):980-987). A fin de estabilizar los receptores de linfocito T en la fagoteca y en caso de uso práctico como fármaco, las cadenas alfa y beta se pueden enlazar, por ejemplo, mediante enlaces disulfuro no nativos, otros enlaces covalentes (receptor de linfocito T monocatenario), o mediante dominios de dimerización (véanse Boulter JM, et al. Stable, soluble T-cell receptor molecules for crystallization and therapeutics. Protein Eng 2003 Sep;16(9):707-711.; Card KF, et al. A soluble single-chain T-cell receptor IL-2 fusion protein retains MHC-restricted peptide specificity and IL-2 bioactivity. Cancer Immunol Immunother 2004 Apr;53(4):345-357; y Willcox BE, et al. Production of soluble alphabeta T-cell receptor heterodimers suitable for biophysical analysis of ligand binding. Protein Sci 1999 Nov; 8 (11):2418-2423). El receptor de linfocito T se puede enlazar con toxinas, fármacos, citocinas (véase US 2013/0115191), dominios que recluten células efectoras como un dominio anti-CD3, etc., con el fin de ejecutar funciones particulares en células diana. Asimismo, se puede expresar en linfocitos T destinados a la transferencia a un receptor.
Se puede encontrar más información en WO 2004/033685A1 y WO 2004/074322A1.Otros métodos de producción se revelan en WO 2013/057586A1.
Además, se pueden utilizar para verificar el diagnóstico histopatológico de cáncer basado en una muestra de biopsia.
Para seleccionar los péptidos sobrepresentados se calcula un perfil de presentación que muestra la presentación mediana de la muestra, así como la variación de los duplicados. El perfil yuxtapone muestras de la entidad tumoral de interés con muestras de tejido normal de referencia. Cada uno de esos perfiles se puede consolidar después en una puntuación de sobrepresentación calculando el valor p de un modelo lineal de efectos mixtos (J. Pinheiro, et al. The nlme Package: Linear and Nonlinear Mixed Effects Models. 2007) y con ajuste para pruebas múltiples mediante la tasa de descubrimientos falsos (Y. Benjamini and Y. Hochberg. Controlling the False Discovery Rate: A Practical and Powerful Approach to Multiple Testing. Journal of the Royal Statistical Society. Series B (Methodological), Vol.57 (No.1):289-300, 1995).
Para la identificación y la cuantificación relativa de los ligandos HLA mediante espectrometría de masas se purificaron moléculas HLA de muestras de tejido criogenizadas y se aislaron los péptidos asociados a HLA. Los péptidos aislados se separaron y se identificaron sus secuencias mediante cromatografía de líquidos-espectrometría de masas con ionización por nano-electronebulización (nanoESI) en línea. Las secuencias peptídicas resultantes se verificaron comparando el patrón de fragmentación de los TUMAP naturales registrados a partir de muestras de LMA con los patrones de fragmentación de péptidos sintéticos de referencia de secuencia idéntica. Como los péptidos se identificaron directamente como ligandos de moléculas HLA de tumores primarios, estos resultados aportan pruebas directas del procesamiento y de la presentación natural de los péptidos identificados en el tejido tumoral primario obtenido de pacientes con LMA.
La plataforma para el descubrimiento de fármacos patentada XPRESIDENT® v2.1 (véase, por ejemplo, US 2013­ 0096016) permite la identificación y la selección de candidatos a vacuna peptídica que están sobrepresentados en función de la cuantificación relativa de los niveles de péptidos restringidos a HLA en tejidos cancerosos respecto a diversos tejidos y órganos normales. Ello se consiguió mediante el desarrollo de la cuantificación diferencial sin marcaje usando los datos adquiridos de CL-EM procesados con una plataforma de análisis de datos patentada que combina algoritmos para la identificación de secuencias, agrupamiento de espectros, recuento iónico, alineamiento del tiempo de retención, deconvolución del estado de carga y normalización.
Se calcularon los niveles de presentación incluyendo estimaciones de error para cada péptido y cada muestra. Se identificaron los péptidos presentados exclusivamente en tejido tumoral y los péptidos sobrepresentados en tejido tumoral respecto a los tejidos y órganos no cancerosos.
En el contexto de la presente invención, se purificaron los complejos HLA-péptido procedentes de 50 muestras de tejido tumoral de LMA criogenizadas, se aislaron los péptidos asociados a HlA y se analizaron con CL-EM (véanse ejemplos). Todos los TUMAP contenidos en la presente solicitud se identificaron con esta estrategia en muestras de tumores primarios de LMA para confirmar su presentación en la LMA primaria.
Los TUMAP identificados en múltiples tejidos tumorales de LMA y normales se cuantificaron con recuento iónico de los datos de CL-EM sin marcaje. El método supone que las áreas de señal de CL-EM de un péptido están correlacionadas con su abundancia en la muestra. Todas las señales cuantitativas producidas por cada péptido en varios experimentos de CL-EM se normalizaron con medidas de tendencia central, se promediaron por muestra y se combinaron en un diagrama de barras, llamado perfil de presentación. El perfil de presentación combina diversos métodos de análisis como la búsqueda en bases de datos de proteínas, agrupación de espectros, deconvolución del estado de carga (descarga) y alineamiento del tiempo de retención y normalización.
En un primer aspecto de la presente invención, la presente invención concierne a un péptido de entre 9 y 30 aminoácidos de longitud, el cual comprende una secuencia de aminoácidos KLQEQLAQL acorde con la SEQ iD N.° 266, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
La presente invención se refiere, además, a los péptidos conforme a la presente invención que tienen la capacidad de unirse a una molécula del complejo mayor de histocompatibilidad humano (MHC) de clase I.
La presente invención se refiere, además, a los péptidos acordes con la presente invención en que el péptido consiste en una secuencia de aminoácidos conforme a la SEQ ID N.° 266.
La presente invención se refiere, además, a los péptidos conformes a la presente invención, en que dichos péptidos están modificados (químicamente) y/o incluyen enlaces no peptídicos.
La presente invención se refiere, además, a los péptidos conformes a la invención, en que el péptido es una proteína de fusión, que comprende una secuencia de aminoácidos acorde con la reivindicación 1 fusionada con los aminoácidos N-terminales 1-80 de la cadena invariable asociada al antígeno HLA-DR (li) o fusionada con o integrado en la secuencia de un anticuerpo, como por ejemplo, un anticuerpo que es específico de células dendríticas.
La presente invención se refiere, además, a un ácido nucleico, que codifica los péptidos acordes con la presente invención.
La presente invención se refiere, además, al ácido nucleico acorde con la presente invención que es ADN, ADNc, APN, ARN o combinaciones de los anteriores.
La presente invención se refiere, además, a un vector de expresión que expresa un ácido nucleico conforme a la invención.
La presente invención se refiere, además, a un péptido acorde con la invención, un ácido nucleico acorde con la invención o un vector de expresión acorde con la invención para el uso en medicina.
La presente invención se refiere, además, a una célula hospedadora que comprende un ácido nucleico acorde con la presente invención o un vector de expresión acorde con la invención.
La presente invención se refiere, además, a una célula hospedadora acorde con la invención que es una célula presentadora de antígeno.
La presente invención se refiere, además, a la célula hospedadora acorde con la invención, en que la célula presentadora de antígeno es una célula dendrítica.
La presente invención se refiere, además, a un método para producir un péptido acorde con la presente invención, método que comprende el cultivo de la célula hospedadora descrita y el aislamiento del péptido de la célula hospedadora o de su medio de cultivo.
La presente invención se refiere a un método in v itro para producir linfocitos T citotóxicos (CTL) activados, comprendiendo el método la puesta en contacto en condiciones in v itro de CTL con moléculas MHC de clase I humanas cargadas con antígeno expresadas en la superficie de una célula presentadora de antígeno por un tiempo suficiente para activar dichos CTL de una manera específica de antígeno, siendo dicho antígeno cualquier péptido conforme a la invención.
La presente invención se refiere, además, al método tal y como se describe, en que dicho antígeno es cargado en moléculas de MHC de clase I expresadas en la superficie de una célula presentadora de antígeno mediante la puesta en contacto de una cantidad suficiente de antígeno con la célula presentadora de antígeno.
La presente invención se refiere, además, al método acorde con la invención, en que la célula presentadora de antígeno comprende un vector de expresión que expresa dicho péptido que contiene la SEQ ID N.° 266.
La presente invención se refiere, además, a los linfocitos T citotóxicos (CTL) activados, producidos con el método acorde con la invención, que reconocen selectivamente una célula que expresa de forma aberrante un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos descrita.
Se da a conocer un método para destruir células diana en un paciente cuyas células diana expresan de forma aberrante un polipéptido que comprende cualquiera de las secuencias de aminoácidos conformes a la presente invención, comprendiendo el método la administración al paciente de un número eficaz de linfocitos T citotóxicos (CTL) conformes a la invención.
La presente invención se refiere, además, al péptido conforme a la invención, un ácido nucleico conforme a la invención, un vector de expresión conforme a la invención, una célula conforme a la invención, o un linfocito T citotóxico activado conforme a la invención para el uso en el tratamiento del cáncer.
La presente invención se refiere, además, a un uso conforme a la presente invención en el que dicho medicamento es una vacuna.
La presente invención se refiere, además, a un uso conforme a la invención, en que dicho cáncer
La presente invención se refiere, además, a unas proteínas marcadoras y biomarcadores particulares que pueden ser utilizados para el pronóstico del cáncer de pulmón.
es leucemia mielógena aguda y/o leucemia linfática crónica, cáncer hepático o cáncer de colon.
El término «anticuerpo» o «anticuerpos» se utiliza en la presente memoria en sentido amplio e incluye tanto anticuerpos policlonales como monoclonales. Además de las moléculas de inmunoglobulina intactas o «enteras», el término «anticuerpos» también incluye fragmentos o polímeros de esas moléculas de inmunoglobulina y versiones humanizadas de moléculas de inmunoglobulina, siempre que exhiban cualquiera de las propiedades deseadas (p. ej., la unión específica de un polipéptido marcador de cáncer de pulmón, liberación de una toxina en una célula de cáncer de pulmón que exprese en un nivel elevado un gen marcador del cáncer de pulmón, y/o inhibición de la actividad de un polipéptido marcador del cáncer de pulmón) conforme a la invención.
Si es posible los anticuerpos de la invención se podrán adquirir de fuentes comerciales. Los anticuerpos de la invención también se pueden fabricar con métodos consabidos. La persona versada en la técnica entiende que para fabricar los anticuerpos de la invención se pueden emplear tanto los polipéptidos marcadores del cáncer de pulmón enteros como fragmentos de los mismos. El polipéptido necesario para generar un anticuerpo de la invención se puede purificar parcial o completamente de una fuente natural o se puede producir con técnicas de ADN recombinante.
Por ejemplo, un ADNc que codifique un péptido acorde con la presente invención, como un péptido acorde con las SEQ ID N.° 266, o una variante o fragmento de los mismos, se puede expresar en células procariotas (p. ej., bacterias) o eucariotas (p. ej., células de levadura, insecto o mamífero), a partir de las cuales se purificará la proteína recombinante con la que se generará una preparación de anticuerpo monoclonal o policlonal que se una específicamente al polipéptido marcador del cáncer de pulmón utilizado para generar el anticuerpo conforme a la invención.
Una persona versada en la técnica sabrá que la generación de dos o más conjuntos diferentes de anticuerpos monoclonales o policlonales maximiza la probabilidad de obtener un anticuerpo dotado de la especificidad y la afinidad necesarias para el uso previsto (p. ej., ELISA, inmunohistoquímica, técnicas de imagen in vivo, tratamiento con inmunotoxinas). Los anticuerpos son analizados para buscar la actividad deseada con métodos conocidos, de acuerdo con el fin previsto para los anticuerpos (p. ej., ELISA, inmunohistoquímica, inmunoterapia, etc.; para más detalles sobre la generación y el análisis de anticuerpos, véase por ejemplo, Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1988, new 2nd edition 2013).Por ejemplo, los anticuerpos pueden ser analizados con pruebas ELISA, inmunoelectrotransferencia (W e s te rn b lo t), tinción inmunohistoquímica de cortes de tejido de cáncer de pulmón congelados o fijados en formol. Después de la caracterización in v itro inicial, los anticuerpos destinados a uso terapéutico o diagnóstico in v ivo se analizan con métodos de ensayo clínico conocidos.
El término "anticuerpo monoclonal" tal y como se utiliza en la presente memoria se refiere a un anticuerpo obtenido a partir de una población notablemente homogénea de anticuerpos, es decir, que los anticuerpos que comprenden la población son idénticos excepto por mutaciones posiblemente naturales que pueden estar presentes en pequeño número. Los anticuerpos monoclonales de la presente memoria incluyen específicamente anticuerpos "quiméricos" en los que una parte de la cadena pesada y/o liviana es idéntica u homóloga a secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de una especie concreta o pertenecientes a una clase o subclase concreta de anticuerpos, mientras que el resto de la cadena o cadenas es idéntica u homóloga a secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de otras especies o pertenecientes a otra clase o subclase de anticuerpos, así como a fragmentos de tales anticuerpos, en tanto exhiban la actividad antagonista deseada (N.° pat. de EE. UU. 4.816.567).
Los anticuerpos monoclonales de la invención se pueden preparar con métodos basados en hibridomas. En el método del hibridoma, un ratón u otro animal hospedador adecuado es vacunado con un agente inmunizante que estimula a los linfocitos para que produzcan o sean capaces de producir anticuerpos que se unan específicamente al agente inmunizante. Otra alternativa consiste en inmunizar los linfocitos in vitro.
Los anticuerpos monoclonales también se pueden fabricar con métodos de ADN recombinante, como los descritos en la Pat. de EE. UU. N.° 4.816.567. El ADN que codifica los anticuerpos monoclonales de la invención puede ser fácilmente aislado y secuenciado con procedimientos convencionales (p. ej., con sondas oligonucleotídicas capaces de unirse específicamente a los genes que codifican las cadenas pesadas y livianas de anticuerpos de ratón).
Los métodos in v itro también son adecuados para la preparación de anticuerpos monovalentes. La digestión de anticuerpos para producir fragmentos de los mismos, en particular fragmentos Fab, se puede llevara cabo con técnicas ordinarias conocidas por los expertos en la materia. Por ejemplo, la digestión se puede realizar con papaína. Ejemplos de la digestión de papaína aparecen descritos en WO 94/29348 y en la Pat. de EE. UU. N.° 4.342.566. La digestión de anticuerpos con papaína normalmente produce dos fragmentos de unión a antígeno idénticos llamados fragmentos Fab, cada uno dotado de un sitio de unión al antígeno, así como un fragmento residual Fc. El tratamiento con pepsina da como resultado un fragmento F(ab')2 y un fragmento pFc'.
Los fragmentos de anticuerpo, estén unidos a otras secuencias o no, también pueden incluir inserciones, deleciones, sustituciones y otras modificaciones seleccionadas de regiones particulares o de residuos de aminoácidos específicos, siempre que la actividad de los fragmentos no se vea significativamente alterada o afectada respecto al anticuerpo o el fragmento de anticuerpo intactos. Estas modificaciones pueden ofrecer alguna propiedad adicional, como eliminar o añadir aminoácidos capaces de establecer puentes disulfuro para aumentar la biolongevidad, alterar las características de secreción, etc. En cualquier caso el fragmento de anticuerpo debe poseer una propiedad bioactiva, como actividad de unión, regulación de unión al dominio de unión, etc. Las regiones activas o funcionales del anticuerpo pueden ser identificadas por mutagénesis de una región específica de la proteína, seguida por la expresión y el análisis del polipéptido expresado. Tales métodos son obvios para toda persona versada en la técnica y pueden incluir la mutagénesis dirigida del ácido nucleico que codifica el fragmento de anticuerpo.
Los anticuerpos de la invención también pueden comprender anticuerpos humanizados o anticuerpos humanos. Las formas humanizadas de anticuerpos no humanos (p. ej., de ratón) son inmunoglobulinas quiméricas, cadenas de inmunoglobulina o fragmentos quiméricos de las mismas (como Fv, Fab, Fab' u otras secuencias de unión a antígeno de los anticuerpos) que contienen una pequeña secuencia derivada de inmunoglobulinas no humanas. Los anticuerpos humanizados incluyen inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) en que los residuos de una región determinante de complementariedad (CDR) del receptor son sustituidos por residuos de una CDR de una especie no humana (anticuerpo donante) como ratón, rata o conejo que está dotada de la especificidad, la afinidad y la capacidad deseadas. En algunos casos, los residuos estructurales (FR) del fragmento Fv de la inmunoglobulina humana son sustituidos por residuos no humanos correspondientes. Los anticuerpos humanizados también pueden comprender residuos que no están presentes ni en el anticuerpo receptor ni en la CDR importada o en las secuencias estructurales. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá casi todas de al menos uno, y normalmente de dos dominios variables, en los que todas o casi todas las regiones CDR corresponderán a las de la inmunoglobulina no humana y todas o casi todas las regiones FR serán las de una secuencia consenso de la inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado idealmente también comprenderá al menos una porción de una región constante de la inmunoglobulina (Fc), normalmente de una inmunoglobulina humana.
Los métodos para humanizar anticuerpos no humanos son bien conocidos en la técnica. En general, a un anticuerpo humanizado se le introducen uno o varios residuos de aminoácidos de origen no humano. Estos residuos de aminoácidos no humanos con frecuencia son denominados residuos "importados", que normalmente se extraen del dominio variable "importado". La humanización se puede llevar a cabo básicamente sustituyendo la o las secuencias CDR de roedor por las secuencias correspondientes de un anticuerpo humano. Por tanto, tales anticuerpos «humanizados» son anticuerpos quiméricos (Pat. EE. UU. N.° 4.816.567), en los que una parte notablemente más pequeña que un dominio variable humano intacto ha sido sustituida por la secuencia correspondiente de una especie no humana. En la práctica, los anticuerpos humanizados normalmente son anticuerpos humanos en los que se han sustituido algunos residuos CDR y posiblemente algunos residuos FR por residuos de sitios análogos de anticuerpos de roedor.
Se pueden emplear animales transgénicos (p. ej., ratones) que tras la inmunización sean capaces de producir un repertorio completo de anticuerpos humanos sin producir inmunoglobulinas endógenas. Por ejemplo, se ha descrito que la deleción homocigota del gen de la región de unión de la cadena pesada del anticuerpo en ratones quiméricos y mutantes germinales provoca la inhibición completa de la producción endógena de anticuerpos. La transferencia de la matriz génica de la inmunoglobulina de la línea germinal humana a dichos ratones mutantes de la línea germinal dará como resultado la producción de anticuerpos humanos tras la exposición al antígeno. También se pueden producir anticuerpos humanos en fagotecas.
Los anticuerpos de la invención se administran preferiblemente a un sujeto incorporándolos en un vehículo farmacéuticamente aceptable. Normalmente a la formulación se le añade una cantidad apropiada de una sal farmacéuticamente aceptable para que sea isotónica. Ejemplos de vehículos farmacéuticamente aceptables son solución salina, solución de Ringer y solución de dextrosa. Es preferible que el pH de la solución sea aproximadamente entre 5 y 8, y más preferiblemente entre 7 y 7,5 aproximadamente. Otros vehículos incluyen preparaciones de liberación prolongada como matrices semipermeables de polímeros hidrofóbicos sólidos que contengan el anticuerpo, en matrices con forma modelada, p. ej., películas, liposomas o micropartículas. Para las personas versadas en la técnica será evidente que son preferibles ciertos vehículos dependiendo, por ejemplo, de la vía de administración y de la concentración del anticuerpo que se va a administrar.
Los anticuerpos se pueden administrar al sujeto, al paciente o a las células mediante inyección (intravenosa, intraperitoneal, subcutánea, intramuscular, etc.), o con otros métodos como la infusión que aseguren su liberación efectiva en el torrente sanguíneo. Los anticuerpos también se pueden administrar por vía intratumoral o peritumoral para ejercer un efecto terapéutico a la par sistémico y local. Se prefiere la inyección local o intravenosa.
Las dosis y pautas de administración más adecuadas se pueden determinar empíricamente; la toma de decisiones a este respecto forma parte de los conocimientos de la materia. Las personas versadas en la materia saben que la dosis de anticuerpos que se debe administrar depende, entre otros factores, del sujeto que va a recibir al anticuerpo, la vía de administración, el tipo concreto de anticuerpo y de otros fármacos que se le estén administrando. La dosis diaria típica de anticuerpo cuando se utiliza solo puede estar situada entre 1 pg/kg hasta 100 mg/kg de peso corporal o más por día, dependiendo de los susodichos factores. Tras la administración del anticuerpo como tratamiento contra el cáncer de pulmón, su eficacia se puede evaluar de varios modos bien conocidos por el médico especialista. Por ejemplo, se puede controlar el tamaño, el número y/o la distribución del cáncer de pulmón en el sujeto receptor del tratamiento utilizando técnicas de imagen oncológicas estándar. Todo anticuerpo administrado con fines terapéuticos que detenga el crecimiento del tumor, reduzca su extensión y/o impida la aparición de nuevos tumores en contraste con la evolución de la enfermedad si no se produjera la administración del anticuerpo, es un anticuerpo eficaz para el tratamiento del cáncer de pulmón.
Como los péptidos citados en las Tablas 2 y 5 (en concreto los asociados con la LMA) de la invención y por tanto sus polipéptidos subyacentes se expresan mucho en la LMA, y se expresan muy poco en las células normales, la inhibición de la expresión de ABCA13 y MMP12 o de la actividad de sus polipéptidos se puede integrar preferiblemente en una estrategia terapéutica para el tratamiento o la prevención de la LMA.
El principio de la terapia antisentido se basa en la hipótesis de que es posible suprimir la expresión génica de secuencias específicas (ya sea por vía transcripcional otraduccional) mediante la hibridación en el interior de la célula del ADN genómico o del ARNm con una molécula antisentido complementaria a ellos. La formación de ese ácido nucleico bicatenario híbrido trastoca la transcripción del ADN genómico que codifica el antígeno tumoral que constituye la diana, o altera el procesamiento/transporte/traducción y/o la estabilidad del ARNm del antígeno tumoral diana.
Los ácidos nucleicos antisentido se pueden hacer llegar a las células con diversas estrategias. Por ejemplo, a un sujeto se le pueden administrar directamente oligonucleótidos antisentido o ARN antisentido (p. ej., por inyección intravenosa) de tal forma que puedan ser absorbidos por las células tumorales. Otra alternativa consiste en la introducción en células in v ivo de vectores virales o plasmídicos que codifiquen ARN antisentido (o fragmentos de ARN). Los efectos antisentido también se pueden inducir con secuencias codificantes, pero la magnitud de los cambios fenotípicos es muy variable. Los cambios fenotípicos inducidos por la terapia antisentido se valoran en función de los cambios en, p. ej., las concentraciones del ARNm diana, concentraciones de la proteína diana y/o niveles de actividad de dicha proteína.
En un ejemplo concreto, la inhibición de la función del marcador tumoral pulmonar con terapia génica antisentido se puede lograr con la administración directa de ARN antisentido del marcador tumoral pulmonar a un sujeto. El ARN antisentido del marcador tumoral se puede producir y aislar con una técnica estándar, pero se produce más fácilmente con la transcripción in v itro utilizando un ADNc antisentido del marcador tumoral controlado con un promotor eficiente (p. ej., el promotor de T7). La administración a células del ARN antisentido del marcador tumoral se puede efectuar con cualquiera de los métodos de administración directa de ácidos nucleicos descritos a continuación.
Una estrategia alternativa para inhibir la función del ABCA13 y de la MMP12 con terapia génica consiste en utilizar la expresión intracelular de un anticuerpo anti-ABCA13, anti-MMP12 o una porción de un anticuerpo anti-ABCA13, anti-MMP12.Por ejemplo, el gen (o fragmento de gen) que codifica un anticuerpo monoclonal que se une específicamente a un polipéptido de ABCA13, MMP12 y que inhibe su actividad biológica se sitúa bajo el control transcripcional de una secuencia reguladora específica (p. ej., específica de tejido o de tumor), dentro de un vector de expresión de ácidos nucleicos. El vector se administra a continuación al sujeto de tal modo que es asimilado por las células de cáncer de pulmón u otras células, que segregarán los anticuerpos anti-ABCA13, anti-MMP12 y bloquearán la actividad biológica de los polipéptidos ABCA13 y MMP12.Preferentemente, los polipéptidos ABCA13 y MMP12 están presentes en la superficie extracelular de células cancerosas de LMA.
En los métodos susodichos, que incluyen la administración y la absorción de ADN exógeno por las células del sujeto (transducción o transfección génica), los ácidos nucleicos de la presente invención pueden estar en forma de ADN desnudo o bien pueden estar incorporados en un vector para suministrar los ácidos nucleicos a las células con el fin de inhibir la expresión de la proteína tumoral marcadora de la LMA. El vector puede estar disponible en una preparación comercial, como un vector adenovírico (Quantum Biotechnologies Inc., Laval, Quebec, Canadá). La liberación del ácido nucleico o del vector en las células se puede realizar a través de varios mecanismos. Como ejemplo, puede ser a través de liposomas con preparaciones comerciales de liposomas como LIPOFECTIN, LIPOFECTAMINE (GIBCO-25 BRL, Inc., Gaithersburg, Maryland, EE. UU.), SUPERFECT (Qiagen, Inc. Hilden, Alemania) y TRANSFECTAM (Promega Biotec, Inc., Madison, Wisconsin, EE. UU.), así como otros liposomas desarrollados según los procedimientos habituales en la técnica. Asimismo, el ácido nucleico o el vector de esta invención se pueden suministrar in v ivo mediante electroporación, una tecnología que ofrece Genetronics, Inc. (San Diego, California, EE. UU.) o mediante un aparato SONOPORATION (ImaRx Pharmaceutical Corp., Tucson, Arizona, EE. UU.).
Como ejemplo, el vector puede ser un sistema viral, como un sistema de vector retrovírico capaz de encapsular un genoma retrovírico recombinante. El retrovirus recombinante es utilizado entonces para infectar las células y con ello inocula un ácido nucleico antisentido que inhibe la expresión de ABCA13 y/o MMP12. El método exacto para introducir el ácido nucleico alterado en células de mamífero no se limita al uso de vectores retrovíricos. Existen otras técnicas comunes para llevar a cabo este procedimiento, tales como vectores adenovíricos, vectores víricos adenoasociados (AAV), vectores lentivíricos, vectores retrovíricos seudotipados. También se pueden utilizar técnicas de transducción física, como liposomas y a través de receptores y otros mecanismos de endocitosis. La presente invención se puede utilizar en conjunción con cualquiera de estos y de otros métodos usuales de transferencia génica.
Los anticuerpos también se pueden utilizar para ensayos diagnósticos in vivo. En general, el anticuerpo se marca con un radionucleótido (como 111In, 99Tc, 14C, 131I, 3H, 32P o 35S) de modo que el tumor puede ser localizado con inmunogammagrafía. En una forma de realización, anticuerpos o fragmentos de los mismos se unen a los dominios extracelulares de dos o más dianas ABCA13 y MMP12 y el valor de afinidad (Kd) es inferior a 1 x 10 pM.
Los anticuerpos para uso diagnóstico pueden ser marcados con sondas adecuadas para posibilitar la detección con diferentes métodos ópticos. Los métodos para la detección de sondas incluyen, entre otros, microscopía de fluorescencia, óptica, confocal y electrónica; resonancia magnética y espectroscopía; radioscopia, tomografía computadorizada y tomografía por emisión de positrones. Las sondas adecuadas incluyen, entre otras, fluoresceína, rodamina, eosina y otros fluoróforos, radioisótopos, oro, gadolinio y otros lantánidos, hierro paramagnético, flúor-18 y otros radionúclidos emisores de positrones. Además, las sondas pueden ser bi o multifuncionales y ser detectables por más de uno de los métodos enumerados. Los anticuerpos pueden marcarse directa o indirectamente con dichas sondas. La fijación de sondas a los anticuerpos incluye la unión covalente de la sonda, la incorporación de la sonda en el anticuerpo, y la unión covalente de un compuesto quelante para unir la sonda, entre otros métodos consabidos en la técnica. Para las técnicas de inmunohistoquímica, la muestra de tejido patológico puede ser fresca o congelada o puede estar incluida en parafina y fijada con un conservante como formol. El corte fijado o incluido que contiene la muestra se pone en contacto con un anticuerpo primario marcado y un anticuerpo secundario, de modo que el anticuerpo se emplea para detectar la expresión in s itu de las proteínas ABCA13 y/o MMP12
La presente invención se refiere por tanto a un péptido que comprende una secuencia seleccionada del grupo consistente en la SEQ ID N.° 266 que induce la reacción cruzada de linfocitos T con dicho péptido.
Los péptidos de la invención tienen la capacidad de unirse a una molécula del complejo mayor de histocompatibilidad humana (MHC) de clase I.
En la presente invención el término «homólogo» se refiere al grado de identidad (véase antes Identidad porcentual) entre las secuencias de dos secuencias de aminoácidos, es decir secuencias peptídicas o polipeptídicas. La susodicha «homología» se determina comparando las dos secuencias alineadas en condiciones óptimas con las secuencias a comparar. La homología de secuencia se puede calcular creando una alineación con el algoritmo ClustalW, por ejemplo. Habitualmente las bases de datos públicas proporcionan software para el análisis de secuencias, en concreto, Vector NTI, GENETYXy otras herramientas de análisis.
Una persona versada en la materia será capaz de valorar si los linfocitos T inducidos por una variante del péptido específico serán capaces de reaccionar con el propio péptido.
Los CTL pueden después reaccionar con células y matar las que expresen un polipéptido que contenga la secuencia de aminoácidos natural del péptido afín definido en los aspectos de la invención. Como se puede deducir de la bibliografía (Godkin A, et al. Use of eluted peptide sequence data to identify the binding characteristics of peptides to the insulin-dependent diabetes susceptibility allele HLA-DQ8 (DQ 3.2). Int Immunol. 1997 Jun;9(6):905-11) y de las bases de datos científicas (Rammensee H. et al. SYFPEITHI: database for MHC ligands and peptide motifs. Immunogenetics. 1999 Nov;50(3-4):213-9), ciertas posiciones de los péptidos de unión a HLA son normalmente residuos de anclaje que forman una secuencia central que encaja en el motivo de unión del receptor HLA, que está definida por las propiedades polares, electrofísicas, hidrofóbicas y espaciales de las cadenas polipeptídicas que constituyen la hendidura de unión.
Aquellos residuos de aminoácidos que no contribuyan sustancialmente a las interacciones con el receptor del linfocito T pueden ser modificados sustituyéndolos por otros aminoácidos cuya incorporación no afecte sustancialmente a la reactividad de los linfocitos T y no suprima la unión al MHC pertinente. Así pues, aparte de la condición indicada, el péptido de la invención puede ser cualquier péptido (en cuyo término los inventores incluyen oligopéptidos o polipéptidos), que incluya las secuencias de aminoácidos tal y como se indican.
También pueden ser adecuados péptidos más largos. También es posible que los epítopos de MHC de clase I, aunque suelen tener entre 8 y 11 aminoácidos de longitud, sean generados por el procesamiento de péptidos más largos o de proteínas que incluyan el epítopo real. Se prefiere que los residuos que flanquean el epítopo de interés sean residuos que no afecten sustancialmente a la digestión proteolítica necesaria para exponer el epítopo durante el procesamiento.
Por supuesto, el péptido conforme a la presente invención tendrá la capacidad para unirse a una molécula del complejo mayor de histocompatibilidad humano (MHC) de clase I. La unión de un péptido o una variante a un complejo MHC se puede analizar con métodos conocidos en la técnica.
En una forma de realización preferida de la invención el péptido consiste en una secuencia de aminoácidos conforme a las SEQ ID N.° 266.
En una forma de realización de la presente invención, el péptido es una proteína de fusión que comprende los 80 aminoácidos N-terminales de la cadena invariable asociada al antígeno HLA-DR (p33, en lo sucesivo “ Ii”) tal y como aparece en el NCBI, número de acceso de GenBankX00497. En otras fusiones, los péptidos de la presente invención se pueden fusionar con un anticuerpo tal y como se describe en la presente memoria, o con una parte funcional del mismo, en particular integrándolo en la secuencia del anticuerpo, para que vayan dirigidos específicamente por dicho anticuerpo, o por ejemplo, con un anticuerpo que es específico para las células dendríticas.
Además, el péptido puede ser modificado aún más para mejorar la estabilidad y/o la unión a las moléculas de MHC con el fin de desencadenar una respuesta inmunitaria más potente. Los métodos para conseguir esa optimización de una secuencia peptídica son bien conocidos en la técnica e incluyen, por ejemplo, la introducción de enlaces peptídicos inversos o enlaces no peptídicos.
En un enlace peptídico inverso los residuos de aminoácido no están unidos por enlaces peptídicos (-CO-NH-) sino que el enlace peptídico está invertido. Estos peptidomiméticos retro-inversos pueden sintetizarse con métodos conocidos en la técnica, como, por ejemplo, los descritos por Meziere et al. (1997) J. Immunol. 159, 3230-3237. Esta estrategia implica la síntesis de seudopéptidos que contengan cambios en la estructura principal, pero no en la orientación de las cadenas laterales. Meziere et al. (1997) demuestran que estos seudopéptidos resultan útiles para la unión al MHC y las respuestas de los linfocitos T colaboradores. Los péptidos retro-inversos, que contienen enlaces NH-CO en lugar de enlaces peptídicos CO-NH, son mucho más resistentes a la proteolisis.
Enlaces no peptídicos son, por ejemplo: -CH2-NH, -CH2 S-, -CH2 CH2-, -CH=CH-, -COCH2-, -CH(OH)CH2- y -CH2 SO-. La patente de Estados Unidos 4.897.445 proporciona un método para la síntesis en fase sólida de enlaces no peptídicos (-CH2-NH) en cadenas polipeptídicas que implica la obtención de polipéptidos con procedimientos estándar y la síntesis del enlace no peptídico mediante la reacción de un aminoaldehído y un aminoácido en presencia de NaCNBHa.
Péptidos que comprenden las secuencias descritas arriba pueden ser sintetizados con otros grupos químicos añadidos en los extremos amino y/o carboxi, con el fin de mejorar la estabilidad, la biodisponibilidad y/o la afinidad de los péptidos. Por ejemplo, grupos hidrofóbicos como los grupos carbobenzoxilo, dansilo, o t-butiloxicarbonilo pueden añadirse a los extremos amino de los péptidos. De manera similar, se puede colocar un grupo acetilo o un grupo 9-fluorenilmetoxi-carbonilo en los extremos amino de los péptidos. Asimismo, p. ej., el grupo hidrofóbico tbutiloxicarbonilo, o un grupo amido pueden ser añadidos en los extremos carboxi de los péptidos.
De manera similar, un péptido de la invención puede ser modificado químicamente mediante la reacción con aminoácidos específicos antes o después de la síntesis del péptido. Ejemplos de tales modificaciones son bien conocidos en la técnica y aparecen resumidos, por ejemplo, en R. Lundblad, Chemical Reagents for Protein Modification, 3rd ed. CRC Press, 2005. La modificación química de aminoácidos incluye, sin ánimo limitativo, la modificación por acilación, amidación, piridoxilación de lisina, alquilación reductora, trinitrobencilación de grupos amino con ácido 2,4,6-trinitrobencenosulfónico (TNBS), transformación de grupos carboxilo en grupos amida y oxidación del grupo sulfhidrilo con ácido perfórmico para convertir la cisteína en ácido cisteico, formación de derivados mercuriales, formación de disulfuros mixtos con otros compuestos tiol, reacción con maleimida, carboximetilación con ácido yodoacético o yodoacetamida y carbamoilación con cianato a pH alcalino, aunque sin limitación a ello. A este respecto, se remite a las personas versadas en la técnica al Capítulo 15 de Current Protocols In Protein Science, Eds. Coligan et al. (John Wiley and Sons NY 1995-2000), donde hallarán una metodología más extensa relacionada con la modificación química de proteínas.
En resumen, la modificación de p. ej., los residuos arginilos de las proteínas se basa a menudo en la reacción de compuestos dicarbonilo adyacentes como fenilglioxal, 2,3-butanodiona y 1,2-ciclohexanodiona para formar un aducto. Otro ejemplo es la reacción de metilglioxal con residuos de arginina. La cisteína se puede modificar sin la modificación simultánea de otros sitios nucleofílicos como sucede con la lisina y la histidina. Así pues, para la modificación de la cisteína hay disponible un gran número de reactivos. Las páginas web de empresas como Sigma-Aldrich (http://www.sigma-aldrich.com) ofrecen información sobre reactivos concretos.
La reducción selectiva de los puentes disulfuro de las proteínas también es habitual. El tratamiento térmico al cual se someten los productos biofarmacéuticos a veces genera y oxida puentes disulfuro.
El reactivo K de Woodward se puede utilizar para modificar residuos de ácido glutámico concretos. Se puede emplear N-(3-(dimetilamino)propil)-N'-etilcarbodiimida para formar enlaces cruzados intramoleculares entre un residuo de lisina y un residuo de ácido glutámico.
Por ejemplo, el dietilpirocarbonato es un reactivo empleado para la modificación de residuos histidilo en proteínas. La histidina también puede ser modificada con 4-hidroxi-2-nonenal.
La reacción de los residuos de lisina y otros grupos a-amino es útil, por ejemplo, para la unión de péptidos a superficies o para la formación de enlaces cruzados entre proteínas/péptidos. La lisina es el sitio de fijación del poli(etilen)glicol y el principal sitio de modificación en la glucosilación de proteínas.
Los residuos de metionina de las proteínas se pueden modificar, por ejemplo, con yodoacetamida, bromoetilamina y cloramina T.
Los residuos tirosilo se pueden modificar con tetranitrometano y N-acetilimidazol. La formación de enlaces cruzados por medio de la formación de ditirosina se puede consumar con peróxido de hidrógeno/iones de cobre.
En estudios recientes sobre la modificación del triptófano se han empleado N-bromosuccinimida, 2-hidroxi-5-nitrobencilbromuro o 3-bromo-3-metil-2-(2-nitrofenilmercapto)-3H-indol (BPNS-escatol).
La modificación de proteínas terapéuticas y péptidos con PEG se asocia a menudo con una prolongación de la semivida en circulación, mientras que la unión por entrecruzamiento de proteínas con glutaraldehído, diacrilato de polietilenglicol y formaldehído se emplea en la preparación de hidrogeles. La modificación química de alérgenos con fines de inmunoterapia se consigue a menudo mediante la carbamilación con cianato potásico.
Un péptido que está modificado o que incluye enlaces no peptídicos es una forma de realización preferida de la invención. En general, péptidos (al menos aquellas que contiene enlaces peptídicos entre los residuos de aminoácidos) pueden ser sintetizados utilizando la síntesis de péptidos en fase sólida por el método de Fmoc-poliamida, como muestran Lukas et al. (Solid-phase peptide synthesis under continuous-flow conditions. Proc Natl Acad Sci USA. May 1981; 78(5): 2791-2795)y las referencias que aparecen en el mismo. La protección provisional del grupo N-amino se consigue con el grupo 9-fluorenilmetiloxicarbonilo (Fmoc). La escisión repetida de este grupo protector muy sensible al pH básico se lleva a cabo con piperidina al 20% en N,N-dimetilformamida. Los grupos funcionales de las cadenas laterales se podrían proteger si se transformaran en éteres de butilo (en el caso de la serina, treonina y tirosina), ésteres de butilo (en el caso del ácido glutámico y aspártico), derivados butiloxicarbonílicos (en la lisina y la histidina), derivados tritilados (en la cisteína) y derivados 4-metoxi-2,3,6-trimetilbencenosulfonílicos (en la arginina).Cuando los residuos C-terminales son glutamina o asparragina se utiliza el grupo 4,4'-dimetoxibencidrilo para proteger los grupos funcionales amido de la cadena lateral. El soporte en fase sólida se basa en un polímero de polidimetil-acrilamida constituido por los tres monómeros dimetilacrilamida (monómero estructural), bisacriloiletilendiamina (entrelazante) y acriloilsarcosina metiléster (funcionalizador). El agente escindible que mantiene unido el péptido a la resina es un derivado del ácido 4-hidroximetilfenoxiacético, sensible a pH ácido. Todos los derivados de aminoácidos se añaden en forma de derivados anhídridos simétricos preformados salvo la asparragina y la glutamina, que se añaden utilizando un procedimiento de acoplamiento inverso con N,N-diciclohexil-carbodiimida/1-hidroxibenzotriazol.Todas las reacciones de acoplamiento y desprotección se controlan con procedimientos de ensayo con ninhidrina, ácido trinitrobencenosulfónico o isotina. Una vez completada la síntesis, los péptidos se separan del soporte de resina y al mismo tiempo se eliminan los grupos protectores de las cadenas laterales mediante el tratamiento con ácido trifluoroacético al 95% con una mezcla de capturadores (sca ve n g e rs ) al 50%. Los capturadores utilizados normalmente son etanditiol, fenol, anisol y agua, dependiendo de la elección exacta de los aminoácidos constituyentes del péptido que se está sintetizando. La síntesis de péptidos también es posible combinando metodologías de fase sólida y de fase en solución (véase, por ejemplo, Bruckdorfer T, et al. From production of peptides in milligram amounts for research to multi-tons quantities for drugs of the future. Curr Pharm Biotechnol. 2004 Feb;5(1):29-43. Review, y las referencias citadas en la misma).
El ácido trifluoroacético se elimina por evaporación en vacío y se procede a la trituración con dietiléter para obtener el péptido bruto. Todos los capturadores (sca ve n g e rs ) se eliminan con un procedimiento de extracción simple que con la liofilización de la fase acuosa proporciona el péptido bruto exento de ellos. Los reactivos para la síntesis de péptidos se pueden conseguir en general, por ejemplo, de Calbiochem-Novabiochem (UK) Ltd, Nottingham NG7 2QJ, Reino Unido.
La purificación puede llevarse a cabo mediante una sola o una combinación de técnicas como la recristalización, cromatografía por exclusión de tamaño, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía por interacción hidrofóbica, y (normalmente) cromatografía de líquidos de alto rendimiento con fase inversa utilizando p. ej., la separación con gradiente de acetonitrilo/agua.
El análisis de los péptidos puede efectuarse utilizando cromatografía de capa fina, electroforesis, en particular electroforesis capilar, extracción en fase sólida (CSPE), cromatografía de líquidos de alto rendimiento con fase inversa, análisis de aminoácidos tras hidrólisis ácida y análisis con espectrometría de masas por bombardeo con átomos rápidos (FAB), así como análisis con espectrometría de masas MALDI y ESI-Q-TOF.
Otro aspecto de la invención proporciona un ácido nucleico (por ejemplo, un polinucleótido) que codifica un péptido de la invención. El polinucleótido puede ser, por ejemplo, ADN, ADNc, APN, ARN o combinaciones de los mismos, monocatenarios y/o bicatenarios, o formas nativas o estabilizadas de polinucleótidos, como por ejemplo, polinucleótidos con un esqueleto de fosforotioato y que pueden contener intrones siempre que codifique el péptido. Por supuesto, sólo los péptidos que contengan residuos de aminoácidos naturales unidos por enlaces peptídicos naturales pueden ser codificados por un polinucleótido. Otro aspecto más de la invención proporciona un vector de expresión que expresa un polipéptido conforme a la invención.
Se han desarrollado diversos métodos para unir polinucleótidos, especialmente ADN, a vectores, por ejemplo, a través de extremos cohesivos complementarios. Por ejemplo, al segmento de ADN se le pueden añadir prolongaciones de homopolímeros complementarios para insertarlo en el vector de ADN. El vector y el segmento de ADN se unen a continuación por medio de puentes de hidrógeno entre las colas homopoliméricas complementarias para formar moléculas de ADN recombinante.
Otro método alternativo para unir el segmento de ADN a los vectores son los ligadores sintéticos que contienen uno o más sitios de restricción. Existen ligadores sintéticos comerciales que contienen diversas dianas para las endonucleasas de restricción que facilitan varios proveedores como International Biotechnologies Inc. New Haven, Connecticut, EE. UU.
Un método deseable para modificar el ADN que codifica el polipéptido de la invención emplea la reacción en cadena de la polimerasa tal y como exponen Saiki RK, et al. (Diagnosis of sickle cell anemia and beta-thalassemia with enzymatically amplified DNA and nonradioactive allele-specific oligonucleotide probes.N Engl J Med. 1988 Sep 1;319(9):537-41). Este método puede ser utilizado para introducir el ADN en un vector adecuado, por ejemplo, diseñando las dianas de restricción adecuadas, o puede ser empleado para modificar el ADN de otros modos útiles conocidos en la técnica. Si se opta por vectores virales, son preferibles los vectores poxvíricos o adenovíricos.
El ADN (o ARN en el caso de los vectores retrovíricos) se puede expresar en un hospedador adecuado para producir un polipéptido que comprenda el péptido o variante de la invención. Así pues, el ADN que codifica el péptido de la invención puede ser utilizado conforme a técnicas conocidas, modificado adecuadamente siguiendo las enseñanzas contenidas en la presente memoria para construir un vector de expresión que se emplee para transformar una célula hospedadora a fin de que exprese y produzca el polipéptido de la invención. Tales técnicas incluyen las reveladas en las patentes de EE. UU. N.° 4.440.859, 4.530.901, 4.582.800, 4.677.063, 4.678.751,4.704.362, 4.710.463, 4.757.006, 4.766.075 y 4.810.648.
El ADN (o ARN en el caso de los vectores retrovíricos) que codifica el polipéptido que constituye el compuesto de la invención se puede unir con una amplia variedad de secuencias de ADN distintas para introducirlo en un hospedador adecuado. El ADN acompañante dependerá de la naturaleza del hospedador, el modo de introducir el ADN en su interior y de si se pretende que se integre o que se mantenga como un episoma.
En general, el ADN se inserta en un vector de expresión, como un plásmido, con la orientación apropiada y el marco de lectura correcto para asegurar la expresión. Si es necesario, el ADN se puede enlazar con secuencias nucleotídicas de control que regulan la transcripción o la traducción y que son reconocidas por el hospedador deseado, aunque en general tales controles ya suelen estar incluidos en el propio vector de expresión. A continuación, el vector se introduce en el hospedador mediante técnicas estándar. En general, el vector no consigue transformar todos los hospedadores, lo que hará necesario seleccionar las células hospedadoras que hayan quedado transformadas. Una técnica de selección consiste en incorporar en el vector de expresión una secuencia de ADN con los elementos de control necesarios que codifique un rasgo seleccionable en la célula transformada, como, por ejemplo, de resistencia a antibióticos.
Otra alternativa consiste en incorporar el gen de ese rasgo seleccionable en otro vector con el que se cotransforma la célula hospedadora.
Las células hospedadoras que hayan sido transformadas con el ADN recombinante de la invención se cultivarán durante el tiempo suficiente y en las condiciones apropiadas que las personas versadas en la técnica conocen a la vista de las enseñanzas reveladas en la presente memoria para que el polipéptido pueda expresarse y, finalmente, ser recuperado.
Son muchos los sistemas de expresión conocidos, como bacterias (E. coli, Bacillus subtilis, etc.), levaduras (Saccharomyces cerevisiae, etc.), hongos filamentosos (género Aspergillus, etc.), células vegetales, animales o de insectos. Preferiblemente el sistema consistirá en células de mamífero, como las células CHO disponibles de la ATCC Cell Biology Collection.
Un típico vector plasmídico de expresión constitutiva para células de mamífero comprende el promotor del CMV o del SV40 con una cola poli-A adecuada y un marcador de resistencia como la neomicina. Un ejemplo es el pSVL que ofrece Pharmacia, Piscataway, NJ, e E. UU. Un ejemplo de vector de expresión inducible para mamífero es el pMSG, también suministrado por Pharmacia. Otros vectores plasmídicos de levadura son pRS403-406 y pRS413-416, en general proveídos por Stratagene Cloning Systems, La Jolla, California 92037, e E. UU. Los plásmidos pRS403, pRS404, pRS405 y pRS406 son plásmidos integrativos de levadura (YIp) que incorporan los marcadores seleccionables de levadura HIS3, TRP1, LEU2 y URA3. Los plásmidos pRS413-416 son plásmidos centroméricos de levadura (Ycp). Los vectores dotados del promotor del CMV (por ejemplo, de Sigma-Aldrich) proporcionan una expresión transitoria o estable, expresión en el citoplasma o secreción, y marcaje de los extremos N-terminal o C-terminal en varias combinaciones de FLAG, 3xFLAG, c-myc o MAT. Estas proteínas de fusión permiten la detección, la purificación y el análisis de la proteína recombinante. Las fusiones con doble etiqueta aportan flexibilidad a la detección.
La potente región reguladora promotora del citomegalovirus (CMV) humano ofrece niveles de expresión constitutiva de la proteína muy elevados, de hasta 1 mg/l en células COS. En estirpes celulares menos potentes los niveles de proteínas suelen rondar ~0,1 mg/l. La presencia del origen de replicación del SV40 genera niveles elevados de replicación del ADN en células COS que toleran la replicación del SV40. Los vectores de CMV, por ejemplo, pueden contener el origen pMB1 (derivado del pBR322) para la replicación en células bacterianas, el gen de la b-lactamasa para la selección por resistencia a la ampicilina, poliA de la hGH, y el origen f1. Los vectores que contienen la secuencia líder de la preprotripsina (PPT) pueden canalizar la secreción de las proteínas de fusión FLAG hacia el medio de cultivo, donde se pueden purificar por medio de anticuerpos ANTI-FLAG, resinas y placas. En la técnica se conocen otros vectores y sistemas de expresión aptos para el uso con una variedad de células hospedadoras.
En otra forma de realización dos o más péptidos de la invención se codifican y se expresan en orden sucesivo (similar a constructos de «collar de cuentas»). Al hacerlo, los péptidos o los variantes peptídicas se pueden enlazar o fusionar juntas mediante segmentos de aminoácidos enlazantes, como, por ejemplo, LLLLLL, o se pueden unir sin ningún otro péptido adicional entre ellos.
La presente invención también se refiere a una célula hospedadora transformada con un vector polinucleotídico de la presente invención. La célula hospedadora puede ser procariota o eucariota. Las células bacterianas pueden ser las células hospedadoras procariotas más adecuadas en determinadas circunstancias; normalmente son cepas de E. coli, como, por ejemplo, las cepas DH5 disponibles de Bethesda Research Laboratories Inc., Bethesda, Maryland, EE. UU., y RR1 disponibles de la American Type Culture Collection (ATCC) de Rockville, Maryland, EE. UU. (N.° ATCC 31343). Las células hospedadoras eucariotas preferidas son células de levadura, de insecto y de mamífero, preferiblemente células de vertebrado como estirpes celulares de colon y de fibroblastos de ratón, rata, mono o ser humano. Las células hospedadoras de levadura incluyen YPH499, YPH500 y YPH501, que en general están disponibles de Stratagene Cloning Systems, La Jolla, California 92037, EE. UU. Las células hospedadoras de mamífero preferidas incluyen las células de ovario de hámster chino (CHO) disponibles de la ATCC como CCL61, las células embrionarias de ratón suizo NIH/3T3 disponibles de la ATCC como CRL 1658, las células COS-1 de riñón de mono disponibles de la ATCC como CRL 1650 y las células 293 que son células renales embrionarias humanas. Las células de insecto preferidas son las células Sf9 que se pueden transfectar con vectores de expresión baculovíricos. Se puede encontrar una revisión general referente a la elección de las células hospedadoras más adecuadas, por ejemplo, en el manual de Paulina Balbás y Argelia Lorence “Methods in Molecular Biology Recombinant Gene Expression, Reviews and Protocols,” PartOne, Second Edition, ISBN 978-1-58829-262-9, y otra bibliografía conocida por las personas versadas en la materia.
La transformación de las células hospedadoras adecuadas con el constructo de ADN de la presente invención se consuma con métodos consabidos que normalmente dependen del tipo de vector utilizado. En lo referente a la transformación de células hospedadoras procariotas, véanse, por ejemplo, Cohen et al (1972) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69, 2110, y Sambrook et al (1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, EE. UU. La transformación de células de levadura aparece descrita en Sherman et al. (1986) Methods In Yeast Genetics, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY, EE. UU. El método de Beggs (1978) Nature 275,104-109 también resulta útil. En lo que concierne a los reactivos adecuados para transfectar las células de vertebrados, por ejemplo, el fosfato de calcio y el DEAE-dextrano o las formulaciones con liposomas, se pueden adquirir de Stratagene Cloning Systems, o Life Technologies Inc., Gaithersburg, Maryland 20877, EE. UU. La electroporación también es útil para la transformación y/o transfección de las células y es perfectamente conocida su aplicación en la transformación de células de levadura, bacteria, insecto y vertebrado.
Las células transformadas con éxito, es decir, las que contengan un constructo de ADN de la presente invención, se pueden identificar con técnicas bien conocidas, como la PCR. Otra alternativa consiste en detectar la presencia de la proteína en el sobrenadante por medio de anticuerpos.
Se apreciará que ciertas células hospedadoras de la invención son útiles para la preparación de péptidos de la invención, por ejemplo, las células bacterianas, de levadura e insecto. Con todo, para ciertos métodos terapéuticos pueden ser útiles otras células hospedadoras. Por ejemplo, se pueden utilizar células presentadoras de antígeno como las células dendríticas para expresar los péptidos de la invención de tal forma que puedan ser cargados en las moléculas MHC oportunas. Así pues, la presente invención proporciona una célula hospedadora que comprende un ácido nucleico o un vector de expresión conforme a la invención.
En una forma de realización preferida la célula hospedadora es una célula presentadora de antígeno, en particular una célula dendrítica o célula presentadora de antígeno. Las APC cargadas con una proteína de fusión recombinante que contiene fosfatasa ácida prostática (PAP) fueron aprobadas por la Food and Drug Administraron (FDA) de EE. UU. el 29 de abril de 2010 para el tratamiento del cáncer de próstata hormonorrefractario metastásico asintomático o mínimamente sintomático (Sipuleucel-T) (Small EJ, et al. Placebo-controlled phase III trial of immunologictherapy with sipuleucel-T (APC8015) in patients with metastatic, asymptomatic hormone refractory prostate cancer. J Clin Oncol.
2006 Jul 1;24(19):3089-94. Rini et al. Combination immunotherapy with prostatic acid phosphatase pulsed antigenpresenting cells (provenge) plus bevacizumab in patients with serologic progression of prostate cancer after definitive local therapy.Cancer. 2006 Jul 1;107(1):67-74).
Otro aspecto de la invención proporciona un método para la producción de un péptido, comprendiendo dicho método el cultivo de una célula hospedadora y el aislamiento del péptido a partir de dicha célula o de su medio de cultivo.
En otra forma de realización el péptido, el ácido nucleico o el vector expresión de la invención se emplean en medicina. Por ejemplo, el péptido puede ser preparado para la inyección por vía intravenosa (i.v.), subcutánea (s.c.), intradérmica (i.d.), intraperitoneal (i.p.) o intramuscular (i.m.). Los métodos preferidos para la inyección del péptido incluyen s.c., i.d., i.p., i.m. e i.v. Los métodos preferidos para la inyección del ADN incluyen i.d., i.m., s.c., i.p. e i.v. Según el péptido o ADN de que se trate se pueden administrar dosis de, por ejemplo, entre 50 jg y 1,5 mg, preferiblemente de 125 |jg a 500 jg de péptido o a Dn . Dosis en esos intervalos se han empleado con éxito en varios ensayos (Walter et al., Nature Medicine 18, 1254-1261 (2012)).
Otro aspecto de la presente invención incluye un método in vitro para producir linfocitos T activados, comprendiendo dicho método la puesta en contacto en condiciones in vitro de linfocitos T con moléculas MHC humanas cargadas con antígeno expresadas en la superficie de una célula presentadora de antígeno adecuada por tiempo suficiente para activar los linfocitos T de una manera específica de antígeno, siendo el antígeno un péptido conforme a la invención. Preferentemente se emplea una cantidad suficiente del antígeno con una célula presentadora de antígeno.
Preferiblemente, la célula de mamífero carece del transportador de péptidos TAP o bien este se presenta en un nivel reducido o funciona defectuosamente. Las células adecuadas que carecen del transportador de péptidos TAP incluyen las células T2, RMA-S y de Drosophila.TAP es el transportador relacionado con el procesamiento de los antígenos.
La estirpe celular humana deficiente en carga de péptidos T2 está disponible en la American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, Ee . UU. con el N.° de catálogo CRL 1992; la estirpe de células de Drosophila Schneider line 2 está disponible en la ATCC con el N.° de catálogo CRL 19863; la estirpe de células de ratón RMA-S está descrita en Karre et al 1985. (Ljunggren, H.-G., and K. Karre. 1985. J. Exp. Med. 162:1745).
Preferentemente, la célula hospedadora no expresa sustancialmente moléculas MHC de clase I antes de la transfección. También es preferible que la célula estimuladora exprese una molécula importante que proporcione una señal coestimuladora para los linfocitos T, como B7.1, B7.2, ICAM-1 y LFA 3. Las secuencias de ácidos nucleicos de numerosas moléculas MHC de clase I y de las moléculas co-estimuladoras están disponibles públicamente en las bases de datos GenBank y EMBL.
De forma similar, si se utiliza como antígeno un epítopo de MHC de clase I, los linfocitos T serán CTL CD8-positivos.
Si una célula presentadora de antígeno es transfectada para expresar un epítopo de ese tipo, la célula comprenderá preferentemente un vector de expresión que expresa un péptido que contenga la SEQ ID N.° 266.
Existen otros métodos para generar CTL in vitro. Por ejemplo, emplear linfocitos autólogos infiltrados en el tumor para generar los CTL. Plebanski et al. (1995) (Induction of peptide-specific primary cytotoxic T lymphocyte responses from human peripheral blood. Eur J Immunol. 1995 Jun;25(6):1783-7) recurren a linfocitos autólogos de sangre periférica (PLB) para la preparación de los CTL. Asimismo, es posible la producción de CTL autólogos estimulando células dendríticas con el péptido o el polipéptido, o a través de la infección con virus recombinantes. También se pueden usar linfocitos B para la producción de CTL autólogos. Asimismo, para la preparación de CTL autólogos se pueden usar macrófagos estimulados con péptido o polipéptido o infectados con virus recombinantes.S. Walter et al. 2003 (Cutting edge: predetermined avidity of human CD8 T cells expanded on calibrated MHC/anti-CD28-coated microspheres.J Immunol. 2003 Nov 15;171(10):4974-8) describen la sensibilización in v itro de linfocitos T mediante células presentadoras de antígeno artificiales (aAPC), que es otro modo adecuado para generar linfocitos T contra el péptido de elección. En la presente invención, las aAPC se generaron adhiriendo complejos MHC:péptido preformados a la superficie de partículas de poliestireno (microperlas) con biotina:estreptavidina. Este sistema permite controlar con exactitud la densidad de MHC en las aAPC, lo que permite desencadenar respuestas de linfocitos T específicas de antígeno con una avidez alta o baja a partir de muestras de sangre, de una forma selectiva y altamente eficaz. Además de los complejos MHC:péptido, las aAPC deben incorporar acopladas en su superficie otras proteínas con actividad co-estimuladora como anticuerpos anti-CD28.Tales sistemas de aAPC también precisan a menudo el concurso de factores solubles adecuados, por ejemplo, citocinas, como la interleucina-12.
Para la preparación de linfocitos T también se pueden utilizar células alogénicas; en WO 97/26328 se describe detalladamente un método. Por ejemplo, además de células de D ro so p h ila y células T2, para presentar antígenos se pueden usar otras tales como células CHO, células de insecto infectadas con baculovirus, bacterias, levaduras, células diana infectadas con virus vacunal. Asimismo se pueden utilizar virus vegetales (véase, por ejemplo, Porta et al (1994) Development of cowpea mosaic virus as a high-yielding system for the presentation of foreign peptides. Virology. 1994 Aug 1;202(2):949-55, los cuales describen el desarrollo del virus del mosaico del caupí como sistema de alto rendimiento para la presentación de péptidos extraños).
Los linfocitos T activados que están dirigidos contra los péptidos de la invención son útiles como tratamiento. Así pues, otro aspecto de la invención proporciona linfocitos T activados obtenibles por los susodichos métodos de la invención.
Los linfocitos T activados producidos con el susodicho método reconocerán selectivamente una célula que expresa de forma aberrante un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID N.° 266.
Preferiblemente el linfocito T reconoce la célula interaccionando a través de su TCR con el complejo HLA/péptido, por ejemplo, uniéndosele. Los linfocitos T son útiles como método para destruir las células diana de un paciente que expresen de forma aberrante un polipéptido que comprenda una secuencia de aminoácidos de la invención mediante la administración de un número eficaz de linfocitos T activados. Los linfocitos T que le se administren pueden proceder del mismo paciente y ser activados del modo antes descrito, es decir, ser linfocitos T autólogos. Otra alternativa consiste en que los linfocitos T no sean del paciente y procedan de otro individuo. Por supuesto, es preferible que dicho individuo esté sano. Por «individuo sano» los inventores entienden un individuo que goce de buen estado de salud general, preferentemente con un sistema inmunitario competente y, más preferentemente, no sufra ninguna enfermedad que pueda detectarse mediante análisis.
En condiciones in vivo, las células diana de los linfocitos T CD8-positivos conformes a la presente invención pueden ser células del tumor (que a veces expresan MHC de clase II) y/o células estromales circundantes al tumor (células tumorales) (que en ocasiones también expresan MHC de clase II; (Dengjel et al., 2006)).
Los linfocitos T de la presente invención se pueden usar como principios activos de una composición terapéutica. Por tanto, la invención también proporciona un método para destruir las células diana de un paciente que expresan de forma aberrante un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos de la invención, comprendiendo dicho método la administración al paciente de un número eficaz de linfocitos T como los definidos arriba.
Por «expresado de forma aberrante» los inventores también quieren decir que el polipéptido está sobreexpresado en comparación con los niveles normales de expresión o que el gen está reprimido en el tejido del que deriva el tumor pero en cambio se expresa en éste. Por «sobreexpresado» los inventores quieren decir que el nivel del polipéptido es como mínimo 1,2 veces mayor que el nivel en el tejido normal; preferiblemente como mínimo 2 veces mayor, y más preferiblemente como mínimo 5 o 10 veces mayor que en el tejido normal.
Los linfocitos T se pueden obtener por métodos conocidos en la materia, como, por ejemplo, los antes descritos.
Los protocolos para la llamada transferencia de linfocitos T a un receptor son perfectamente conocidos y se pueden encontrar revisiones en: Gattinoni L, et al. Adoptive immunotherapy for cancer: building on success. Nat Rev Immunol.
2006 May;6(5):383-93. Review. y Morgan RA, et al. Cancer regression in patients after transfer of genetically engineered lymphocytes. Science. 2006 Oct 6;314(5796):126-9).
Cualquier molécula de la invención, ya sea péptido, ácido nucleico, anticuerpo, vector de expresión, célula, CTL activado, receptor de linfocito T o el ácido nucleico que lo codifique es útil para el tratamiento de trastornos caracterizados por células que eluden la respuesta inmunitaria. Por consiguiente, cualquier molécula de la presente invención puede ser utilizada como medicamento o en la fabricación de un medicamento. La molécula puede ser utilizada sola o combinada con otra molécula o moléculas de la invención o con cualquier o cualesquier moléculas conocidas.
Preferiblemente, el medicamento de la presente invención es una vacuna. La vacuna puede administrarse directamente al paciente, en el órgano afectado o por vía sistémica de forma i.d., i.m, s.c., i.p. e i.v., o aplicarse e x vivo a células derivadas del paciente o a una línea celular humana que después se administra al paciente, o utilizarse in v itro para seleccionar una subpoblación de células inmunitarias derivadas del paciente que después se le vuelven a administrar. Si el ácido nucleico se administra a células in vitro, puede ser útil que estas células sean transfectadas para que expresen simultáneamente citocinas inmunoestimuladoras, como la interleucina-2. El péptido puede ser sustancialmente puro, o combinarse con un adyuvante inmunoestimulador (véase abajo) o utilizarse en combinación con citocinas inmunoestimuladoras, o bien administrarse mediante otro sistema de liberación adecuado, como, por ejemplo, liposomas. El péptido también se puede conjugar con un portador adecuado como la hemocianina de lapa californiana (KLH) o el manano (véanse WO 95/18145 y Longenecker, 1993). El péptido también se puede etiquetar, o formar proteínas de fusión o moléculas híbridas, entre otros. Se espera que los péptidos cuya secuencia se ofrece en la presente invención estimulen a los linfocitos T CD4 o CD8.No obstante, la estimulación de los CTL CD8 es más eficiente si cuentan con la ayuda de los linfocitos T cooperadores CD4. Así pues, los epítopos de MHC de clase I que estimulan a los CTL CD8, el compañero de fusión o las secciones de una molécula híbrida adecuada proporcionan epítopos que estimulan a los linfocitos T CD4-positivos. Los epítopos estimuladores de los CD4 y CD8 son bien conocidos en la técnica e incluyen los identificados en la presente invención.
En un aspecto, la vacuna comprende al menos un péptido dotado de la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID N.° 266 y al menos otro péptido adicional, preferiblemente dos a 50, más preferiblemente dos a 25, incluso más preferiblemente dos a 20 y más preferiblemente dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce, trece, catorce, quince, dieciséis, diecisiete o dieciocho péptidos. Los péptidos pueden derivar de uno o más TAA específicos y se pueden unir a moléculas MHC de clase I.
En otro aspecto, la vacuna comprende al menos un péptido dotado de la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID N.° 266, y al menos otro péptido adicional, preferiblemente dos a 50, más preferiblemente dos a 25, incluso más preferiblemente dos a 20 y más preferiblemente dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce, trece, catorce, quince, dieciséis, diecisiete o dieciocho péptidos. Los péptidos pueden derivar de uno o más TAA específicos y se pueden unir a moléculas MHC de clase I.
El polinucleótido puede ser sustancialmente puro, o estar contenido en un vector o un sistema de liberación adecuado. El ácido nucleico puede ser ADN, ADNc, a Pn , ARN o una combinación de los mismos. Los métodos para diseñar e introducir ese ácido nucleico son bien conocidos por los expertos en la materia. Se puede consultar una revisión general, por ejemplo, (Pascolo et al., 2005 Human peripheral blood mononuclear cells transfected with messenger RNA stimulate antigen-specific cytotoxic T-lymphocytes in vitro. Cell Mol Life Sci. 2005 Aug;62(15):1755-62). Las vacunas polinucleotídicas son fáciles de preparar, pero el mecanismo por el cual tales vectores inducen la respuesta inmunitaria no se conoce con exactitud. Los vectores y sistemas de liberación adecuados incluyen los de a Dn y/o ARN viral, como los sistemas basados en adenovirus, virus vacunal, retrovirus, herpesvirus, virus adeno-asociados o híbridos que contienen elementos de varios virus. Los sistemas de liberación no virales incluyen lípidos catiónicos y polímeros catiónicos que son bien conocidos como técnicas para la introducción de ADN. También pueden utilizarse métodos de introducción físicos, como la «pistola génica». El péptido o péptidos codificados por el ácido nucleico pueden ser una proteína de fusión, por ejemplo, con un epítopo que estimule los linfocitos T para el respectivo CDR opuesto tal y como se ha indicado antes.
El medicamento de la invención también puede incluir uno o varios adyuvantes. Los adyuvantes son sustancias que potencian o estimulan de forma inespecífica la respuesta inmunitaria (p. ej., respuestas inmunitarias mediadas por CTL y linfocitos T cooperadores (Th) contra un antígeno, y podrían ser considerados útiles en el medicamento de la presente invención. Entre los adyuvantes adecuados se incluyen, entre otros: 1018 ISS, sales de aluminio, AMPLIVAX®, AS15, BCG, CP-870.893, CpG7909, CyaA, dSLIM, flagelina o ligandos de TLR5 derivados de flagelina, ligando de FLT3, GM-CSF, IC30, IC31, imiquimod (ALDARA®), resiquimod, ImuFact IMP321, interleucinas como IL-2, IL-13, IL-21, interferón alfa o beta o derivados pegilados de los mismos, IS Patch, ISS, ISCOMATRIX, ISCOMs, JuvImmune®, LipoVac, MALP2, MF59, lípido monofosforilo A, Montanide IMS 1312, Montanide ISA 206, Montanide ISA 50V, Montanide ISA-51, emulsiones de agua en aceite y de aceite en agua, OK-432, OM-174, OM-197-MP-EC, ONTAK, OspA, sistema de vectores PepTel®, micropartículas de dextrano y poli(láctido-co-glicólido) [PLG], talactoferrina SRL172, virosomas y otras partículas similares a virus, YF-17D, v Eg F trap, R848, beta-glucano, Pam3Cys, estimulón QS21 de Aquila, que deriva de la saponina, extractos de micobacterias y miméticos sintéticos de la pared bacteriana, y otros adyuvantes patentados como Detox de Ribi, Quil o Superfos. Se prefieren los adyuvantes como el adyuvante de Freund o el GM-CSF. Con anterioridad se han descrito varios adyuvantes inmunológicos (p. ej., MF59) específicos para las células dendríticas, así como la preparación de los mismos (Allison and Krummel, 1995 The Yin and Yang ofT cell costimulation. Science. 1995 Nov 10;270(5238):932-3. Review). También pueden utilizarse citocinas. A varias citocinas se las ha atribuido una influencia directa en la migración de las células dendríticas hacia los tejidos linfoides (p. ej., el TNF-), como parte de un proceso que acelera su maduración hasta convertirlas en células presentadoras de antígeno de los linfocitos T (p. ej., Gm -CSF, IL-1 e IL-4) (Patente de EE. UU. N.° 5.849.589) y en el que actúan como inmunoadyuvantes (p. ej., la IL-12, IL-15, IL-23, iL-7, IFN-alfa, IFN-beta) (Gabrilovich, 1996 Production of vascular endothelial growth factor by human tumors inhibits the functional maturation of dendritic cells Nat Med. 1996 Oct;2(10):1096-103).
También se ha descrito que los oligonucleótidos de CpG inmunoestimuladores potencian los efectos de los adyuvantes en vacunas. Sin limitarse a la teoría, los oligonucleótidos de CpG actúan activando el sistema inmunitario innato (no adaptativo) a través de los receptores de tipo Toll (TLR), principalmente el TLR9. La activación del TLR9 desencadenada por los CpG potencia las respuestas humorales y celulares específicas de antígeno contra una amplia gama de antígenos, incluidos antígenos peptídicos o proteicos, virus vivos o muertos, vacunas de células dendríticas, vacunas de células autólogas y conjugados de polisacáridos, tanto en vacunas profilácticas como terapéuticas. Más importante aún, potencian la maduración y la diferenciación de las células dendríticas, lo cual resulta en una mayor activación de los linfocitos Th1 y una generación más potente de linfocitos T citotóxicos (CTL), incluso sin la ayuda de los linfocitos T CD4. La tendencia hacia la respuesta Th1 provocada por la estimulación del TLR9 se mantiene incluso en presencia de adyuvantes vacunales como el aluminio o el adyuvante de Freund incompleto (IFA) que normalmente promueven un sesgo hacia la respuesta Th2. Los oligonucleótidos de CpG muestran incluso una mayor actividad adyuvante cuando se formulan o administran conjuntamente con otros adyuvantes o en formulaciones como micropartículas, nanopartículas, emulsiones de lípidos o formulaciones similares, que son especialmente necesarias para inducir una respuesta potente cuando el antígeno es relativamente débil. También aceleran la respuesta inmunitaria y permiten reducir las dosis de antígeno aproximadamente en dos órdenes de magnitud, habiendo obtenido en algunos experimentos respuestas de anticuerpos comparables a las conseguidas con la dosis plena de vacuna sin CpG (Krieg, 2006). La patente de EE. UU. N.° 6.406.705 B1 describe el uso combinado de oligonucleótidos de CpG, adyuvantes sin ácidos nucleicos y un antígeno para inducir una respuesta inmunitaria específica de antígeno. Un componente preferido de la composición farmacéutica de la presente invención es un antagonista CpG del TLR9 conocido como dSLIM (inmunomodulador en horquilla doble), fabricado por Mologen (Berlín, Alemania). También se pueden utilizar otras moléculas que se unen a los TLR como ARN que se unen a TLR 7, TLR 8 y/o TLR 9.
Entre los ejemplos de adyuvantes útiles también se incluyen CpG modificados químicamente (p. ej., CpR, Idera), análogos de ARNdc como poli(I:C) y derivados de los mismos (p. ej., AmpliGen®, Hiltonol®, poli-(ICLC), poli(IC-R), poli(I:C12U), ARN o ADN bacteriano sin CpG, así como anticuerpos y moléculas pequeñas inmunoactivas como ciclofosfamida, sunitinib, Bevacizumab®, celebrex, NCX-4016, sildenafilo, tadalafilo, vardenafilo, sorafenib, temozolomida, temsirolimus, XL-999, CP-547632, pazopanib, VEGF Trap, ZD2171, AZD2171, anti-CTLA4, otros anticuerpos que reconocen estructuras clave del sistema inmunitario (p. ej., anti-CD40, anti-TGF-beta, anti-receptor TNF-alfa) y SC58175, que pueden actuar de forma terapéutica y/o como adyuvantes. Las cantidades y concentraciones de adyuvantes y de aditivos útiles en el contexto de la presente invención pueden ser determinadas fácilmente por las personas versadas en la técnica sin demasiada experimentación.
Los adyuvantes preferidos son imiquimod, resiquimod, GM-CSF, ciclofosfamida, sunitinib, bevacizumab, interferónalfa, oligonucleótidos CpG y derivados, poli-(I:C) y derivados, ARN, sildenafilo, y formulaciones de partículas con PLG o virosomas.
En una forma de realización preferida la composición farmacéutica conforme a la invención el adyuvante es seleccionado del grupo consistente en factores estimuladores de colonias, como el factor estimulador de las colonias de granulocitos-macrófagos (GM-CSF, sargramostim), ciclofosfamida, imiquimod, resimiquimod e interferón-alfa.
En una forma de realización preferida la composición farmacéutica conforme a la invención el adyuvante es seleccionado del grupo consistente en factores estimuladores de colonias, como el factor estimulador de las colonias de granulocitos-macrófagos (GM-CSF, sargramostim), ciclofosfamida, imiquimod y resiquimod.
En otra forma de realización preferida de la composición farmacéutica conforme a la invención, el adyuvante es ciclofosfamida, imiquimod o resiquimod.
Los adyuvantes más preferidos son: Montanide IMS 1312, Montanide ISA 206, Montanide ISA 50V, Montanide ISA-51, poli-ICLC (Hiltonol®) y AcM anti-CD40 o combinaciones de los anteriores.
Esta composición está destinada a la administración parenteral, como por vía subcutánea, intradérmica o intramuscular, o bien para la administración oral. Para ello, los péptidos y opcionalmente otras moléculas se disuelven o se suspenden en un vehículo farmacéuticamente aceptable, preferiblemente acuoso. Además, la composición puede contener excipientes, tales como tampones, aglutinantes, disgregantes, diluyentes, saborizantes, lubricantes, etc. Los péptidos también se pueden administrar junto con sustancias inmunoestimuladoras, como citocinas. En una composición tal se puede usar una amplia lista de excipientes, como por ejemplo, los tomados de A. Kibbe, Handbook of Pharmaceutical Excipients, 3rd Ed., 2000, American Pharmaceutical Association y Pharmaceutical Press. La composición se puede utilizar para la prevención, profilaxis y/o tratamiento de enfermedades adenomatosas o cancerosas. Las formulaciones preferidas se pueden encontrar en EP2113253, por ejemplo.
No obstante, dependiendo del número y de las características fisicoquímicas de los péptidos de la invención se precisa más investigación para ofrecer formulaciones con ciertas combinaciones de péptidos, en especial combinaciones con más de 20 péptidos que sean estables durante más de 12 a 18 meses.
La presente invención proporciona un medicamento que es útil para el tratamiento del cáncer, en particular la LMA, la leucemia linfática crónica (LLC) y otras neoplasias hematológicas malignas.
Se da a conocer un equipo que comprende:
(a) un envase con una composición farmacéutica como la descrita más arriba, en forma de solución o liofilizada; (b) opcionalmente, un segundo envase que contiene un diluyente o una solución de reconstitución para la formulación liofilizada; y
(c) opcionalmente, (i) instrucciones de uso de la solución o (ii) de la reconstitución y/o del uso de la formulación liofilizada.
El equipo puede comprender, además, uno o más de los siguientes componentes: (iii) un tampón, (iv) un diluyente, (v) un filtro, (vi) una aguja, o (vii) una jeringa. El envase es preferiblemente un frasco, un vial, una jeringa o un tubo de ensayo; puede ser un envase multiusos. Se prefiere que la composición farmacéutica esté liofilizada.
Los equipos que se dan a conocer comprenden, preferiblemente, una formulación liofilizada de la presente invención en un contenedor adecuado e instrucciones para su reconstitución y/o uso. Los envase adecuados incluyen, por ejemplo, frascos, viales (p. ej., viales con doble cámara), jeringas (como jeringas con doble cámara) y tubos de ensayo. El envase puede estar formado por diversos materiales como vidrio o plástico. Preferiblemente el kit y/o envase contienen o van acompañados de instrucciones de reconstitución y/o uso. Por ejemplo, el prospecto puede indicar que la formulación liofilizada debe reconstituirse para obtener ciertas concentraciones de péptidos como las descritas en páginas precedentes. La etiqueta puede indicar, además, que la formulación puede administrarse o está destinada a la administración subcutánea.
El envase que contiene la formulación puede ser un vial multiuso que permita varias administraciones (p. ej., de 2 a 6 administraciones) de la formulación reconstituida. El equipo puede comprender, además, un segundo envase que contenga un diluyente adecuado (p. ej., una solución de bicarbonato sódico).
Después de mezclar el diluyente y la formulación liofilizada, la concentración final del péptido en la formulación reconstituida es preferiblemente como mínimo de 0,15 mg/ml/péptido (=75 |jg) y preferiblemente como máximo de 3 mg/ml/péptido (=1500 jg). El equipo puede incluir, además, otros materiales deseables desde el punto de vista comercial y del usuario, tales como otros tampones, diluyentes, filtros, agujas, jeringas y prospectos con instrucciones de uso.
Los equipos que se dan a conocer pueden tener un solo envase que contenga la formulación de las composiciones farmacéuticas acordes con la presente invención, acompañado o no de otros componentes (p. ej., otros compuestos o composiciones farmacéuticas de estos otros compuestos), o pueden contar con un envase distinto para cada componente.
Preferiblemente, los equipos que se dan a conocer incluyen una formulación de la invención acondicionada para ser utilizada y administrada conjuntamente con un segundo compuesto (como adyuvantes (p. ej., GM-CSF), un agente de quimioterapia, un producto natural, una hormona o un antagonista, un inhibidor o agente anti-angiogénesis, un inductor de la apoptosis o un quelante) o una composición farmacéutica de los mismos. Los componentes del equipo pueden estar preagrupados o cada componente puede estar en un envase separado antes de la administración al paciente. Los componentes del equipo pueden proporcionarse en una o varias soluciones líquidas, preferiblemente en una solución acuosa y, con mayor preferencia, en una solución acuosa estéril. Los componentes del equipo también pueden facilitarse en forma de sólidos, y pueden convertirse en líquidos añadiendo los disolventes adecuados, que preferiblemente se proporcionan en otro envase distinto.
El envase de un equipo terapéutico puede ser un vial, tubo de ensayo, matraz, frasco, jeringa, o cualquier otro medio para contener un sólido o líquido. Si hay más de un componente, normalmente el equipo contendrá un segundo vial u otro envase para permitir la dosificación por separado. El equipo también puede contener otro envase para un líquido farmacéuticamente aceptable. Preferiblemente el equipo terapéutico contendrá un aparato (p. ej., una o varias agujas, jeringas, cuentagotas, pipeta, etc.) para permitir la administración de los agentes de la invención que son componentes del presente equipo.
La presente formulación puede ser toda aquella que sea adecuada para la administración de los péptidos a través de cualquier vía aceptable como la oral (enteral), nasal, oftálmica, subcutánea, intradérmica, intramuscular, intravenosa o transdérmica. Se prefiere la administración subcutánea y, con mayor preferencia, la intradérmica. Se puede utilizar una bomba de infusión para la administración.
Puesto que los péptidos de la invención proceden de tejido tumoral relacionado con la LMA, el medicamento de la invención debe utilizarse preferentemente para tratar la LMA.
En un aspecto, los péptidos son seleccionados para la vacuna en función de su idoneidad para cada paciente según un método dado a conocer y que se expone a continuación.
Se recopilan los datos del fenotipo del HLA, transcriptómicos y peptidómicos del material tumoral y de muestras de sangre del paciente para identificar los péptidos más adecuados que contengan TUMAP del archivo y exclusivos del pacientes (mutados). Se escogerán los péptidos que se expresen de forma selectiva o que se sobreexpresen en el tumor del paciente y, si es posible, que presenten una potente inmunogenicidad in v itro si se prueban con los PBMC del paciente.
Preferentemente, los péptidos incluidos en la vacuna se identificarán con el método consistente en: (a) identificación de los péptidos asociados a tumor (TUMAP) presentes en una muestra tumoral del paciente en cuestión; (b) comparación de los péptidos identificados con (a) un archivo (base de datos) de péptidos como el descrito antes; y (c) selección de al menos un péptido del archivo (base de datos) que presente correlación con un péptido asociado a tumor identificado en el paciente. Por ejemplo, los TUMAP presentados por la muestra del tumor se identifican mediante: (a1) comparación de los datos de expresión de la muestra tumoral con los datos de expresión de una muestra de tejido normal del mismo tipo de tejido que la muestra tumoral para identificar proteínas que se sobreexpresen o se expresen de modo aberrante en la muestra tumoral; y (a2) correlación de los datos de expresión con secuencias de ligandos MHC unidos a moléculas MHC de clase I y/o clase II en la muestra tumoral para identificar ligandos MHC derivados de proteínas que son sobreexpresadas o expresadas de modo aberrante por el tumor. Preferentemente, las secuencias de los ligandos MHC se identifican eluyendo los péptidos unidos de las moléculas MHC aisladas de la muestra tumoral y secuenciando los ligandos eluidos. Preferentemente, la muestra tumoral y el tejido normal se obtienen del mismo paciente.
Además, o como alternativa, a la selección de péptidos con el modelo de la base de datos, los TUMAP también se pueden identificar en el paciente de n o vo e incluirse después en la vacuna. A modo de ejemplo, los TUMAP candidatos se pueden identificar en el paciente mediante (a1) comparación de los datos de expresión de la muestra tumoral con los datos de expresión de una muestra de tejido normal que corresponde al tipo de tejido de la muestra del tumor para identificar proteínas que se sobreexpresan o se expresan de modo aberrante en la muestra tumoral; y (a2) correlación de los datos de expresión con secuencias de ligandos MHC unidos a moléculas MHC de clase I y/o clase II en la muestra tumoral para identificar ligandos MHC derivados de proteínas que son sobreexpresadas o expresadas de modo aberrante por el tumor. Como otro ejemplo, se pueden identificar proteínas portadoras de mutaciones que sean exclusivas de la muestra tumoral en comparación con el correspondiente tejido normal del paciente, así como encontrar TUMAP que permitan reconocer específicamente la mutación. Por ejemplo, el genoma del tumor y el del correspondiente tejido normal se pueden secuenciar mediante secuenciación hologenómica: Para descubrir mutaciones que no sean sinónimas en las regiones codificadoras de proteínas de los genes, se extraen el ADN y el ARN genómicos de tejidos tumorales y el ADN genómico germinal normal y no mutado se extrae de células mononucleares de sangre periférica (PBMC). La estrategia de secuenciación de nueva generación (NGS) aplicada queda limitada a la re-secuenciación de las regiones codificantes de proteínas (re-secuenciación del exoma). Con este objeto, se captura el ADN exónico de muestras humanas con equipos de enriquecimiento dirigido suministrados por el proveedor y se procede a la secuenciación con, p. ej., un secuenciador HiSeq2000 (Illumina). Además, se secuencia el ARNm del tumor para determinar la cuantificación directa de la expresión génica y comprobar que los genes mutados se expresan en los tumores del paciente. Los millones de lecturas de secuencia resultantes se procesan con algoritmos informáticos. La lista de resultados contiene mutaciones y la expresión génica. Las mutaciones somáticas específicas del tumor se determinan mediante la comparación con las variaciones germinales derivadas de las PBMC y se priorizan. Los péptidos identificados de n o v o pueden ser analizados para determinar su inmunogenicidad según lo descrito antes con el archivo (base de datos), y los TUMAP candidatos que posean la inmunogenicidad adecuada se seleccionan para la inclusión en la vacuna.
En una forma de realización indicada a título de ejemplo, los péptidos incluidos en la vacuna se identifican mediante: (a) identificación de los péptidos asociados a tumor (TUMAP) presentes en una muestra tumoral del paciente mediante los métodos antes descritos; (b) comparación de los péptidos identificados en a) el archivo (base de datos) de péptidos que han sido preseleccionados por su inmunogenicidad y su sobrepresentación en tumores respecto al correspondiente tejido normal; (c) selección de al menos un péptido del archivo (base de datos) que presente correlación con un péptido asociado a tumor identificado en el paciente; y (d) opcionalmente, selección de al menos un péptido identificado de n o vo en el paso (a) para confirmar su inmunogenicidad.
En una forma de realización indicada a título de ejemplo, los péptidos incluidos en la vacuna se identifican mediante: (a) identificación de los péptidos asociados a tumor (TUMAP) presentes en una muestra tumoral del paciente en cuestión; y (b) opcionalmente, selección de al menos un péptido identificado de n o vo en el paso (a) para confirmar su inmunogenicidad.
Una vez seleccionados los péptidos, se fabrica la vacuna.
La vacuna preferentemente es una formulación líquida que contiene los péptidos disueltos en DMSO al 33%.
Cada péptido se disuelve en DMSO antes de formar parte en el producto. La concentración de cada solución de péptido se escoge dependiendo del número de péptidos que formarán parte del producto. Cada solución de péptido y DMSO se mezcla en partes iguales para obtener una solución que contenga todos los péptidos del producto con una concentración de ~2,5 mg/ml por péptido. La solución mezclada se diluye a 1:3 con agua para inyectables hasta alcanzar una concentración de 0,826 mg/ml por péptido en DMSO al 33%. La solución diluida se filtra con un filtro estéril de 0,22 pm. Se obtiene la solución final a granel.
La solución final a granel se envasa en viales y se conserva a -20°C hasta su uso. Un vial contiene 700 pl de solución que contiene 0,578 mg de cada péptido. De los cuales 500 j l (aprox. 400 |jg por péptido) se aplicarán con la inyección intradérmica.
A continuación se describirá la presente invención con los ejemplos siguientes con alusión a las figuras adjuntas que describen las formas de realización preferidas de los mismos, sin que con ello se pretenda limitar la invención.
Breve descripción de las figuras
La Figura 1 muestra la expresión superficial de HLA de muestras de LMA primaria y HSC de donantes sanos. La cuantificación se efectuó e x v ivo con QIFIKIT (Dako). (a) Expresión de HLA de clase I (AcM W6/32) en blastos de LMA CD34+ comparada con la de monocitos normales CD15+ autólogos. (b) Expresión de HLA-DR (AcM L243) en blastos de LMA CD34+ comparada con la de monocitos normales CD15+ autólogos. (c) Expresión de HLA de clase I (AcM W6/32) en blastos de LMA CD34+ (n=5) y en hemocitoblastos CD34+CD38'(n=5) procedentes de donantes sanos. (d) Expresión de HLA-DR I (AcM L243) en blastos de LMA CD34+ (n=5) y en hemocitoblastos CD34+CD38' (n=5) procedentes de donantes sanos. * P<0,05, *** P< 0,001, prueba de la t para datos desapareados. Abreviaturas: UPN, número unificado de paciente
La Figura 2 expone el número de identificaciones de los ligandos HLA y de las proteínas originarias logradas a partir de muestras de LMA primaria.ID únicas (secuencias peptídicas y proteínas originarias correspondientes) identificadas mediante CL-EM/EM de los HLA de clase I (AcM W6/32, n=15) y HLA de clase II (AcM Tü39, n=12) en muestras de LMA primaria. En el estudio solo se admitieron las muestras que cumplieron el umbral de identificaciones de ligando únicas > 500 (HLA de clase I) y >100 (HLA de clase II) por muestra. Abreviaturas: ID, identificación; UPN, número unificado de paciente
La Figura 3 muestra la identificación de las dianas de la vacuna peptídica basada en la caracterización de los ligandomas de HLA de clase I/proteomas originarios de LMA (n=15), PBMC (n=30) y BMNC (n=5) (a) Coincidencias de las proteínas originarias de ligandos HLA de clase I de LMA, PBMC y BMNC.(b) Perfil comparativo de las proteínas originarias de ligando HLA de clase I basado en la frecuencia de representación restringida a1HLA en LMA, PBMC y BMNC. Las cifras absolutas de pacientes/donantes positivos para la presentación restringida a1HLA de la proteína originaria pertinente (eje de abscisas (x)) aparecen indicadas en el eje de ordenadas (y). Las rayas discontinuas indican la representación del 100% en cada cohorte. El recuadro situado a la izquierda señala el subgrupo de proteínas originarias que presentan una representación exclusiva en la LMA con frecuencias >20% (LiTAA: antígenos asociados a tumor derivados del ligandoma). (c) Análisis de representación de antígenos asociados a la LMA publicados en ligandomas HLA de clase I. Las barras indican la representación relativa de los respectivos antígenos por ligandos HLA de clase I en la LMA, en PBMC y en BMNC. (d) Análisis específico de subgrupos de los ligandomas HLA de clase I específicos de la LMA del gen FLT3 mutado (FLT3-ITD) (n=8) frente al gen FLT3 natural (FLT3-WT) (n=7). Análisis de coincidencia de las proteínas originarias exclusivas de la LMA (según la definición de (b)) correspondientes a la LMA con FLT3-ITD y con FLT3-WT. (e) Perfil comparativo de las proteínas originarias de los ligandos HLA de clase I exclusivas de la LMA basado en la frecuencia de representación restringida a HLA en la LMA con FLT3-ITD y con FLT3-WT. El recuadro del medio señala el subgrupo compartido de proteínas originarias, que incluye el 91,3% de los LiTAA aquí definidos.
La Figura 4 presenta la caracterización funcional de los LITAP de la LMA de HLA de clase I. (a) Ensayo ELISPOT con IFN-y de PBMC de pacientes con LMA tras la estimulación con dos conjuntos de LiTAP de la LMA restringidos a A*03 (péptido asociado a tumor derivado del ligandoma) (P I1 y PI2 ). Como control positivo se empleó PHA y como control negativo la estimulación con el péptido A*03 GAG18 -26 del VIH. Con PI1 y PI2 se observó una producción significativa de IFN-Y.(b) Tinción intracelular para IFN-y y TNF-a de PBMC de un paciente con LMA estimulados con PI1 yP I2 (el mismo que en (a)). Como control positivo se empleó PMA/ionomicina y como control negativo el péptido A*03 GAG18 -26 del VIH.(c) En comparación, el ensayo ELISPOT con IFN-y realizado a PBMC de donantes sanos estimulados con los conjuntos de LiTAP de la LMA restringidos a A*03 PI1 y PI2 , no reveló ninguna producción significativa de IFN-y.
La Figura 5 muestra otras dianas adicionales/sinérgicas para la vacuna peptídica identificadas a raíz de la caracterización del ligandoma de HLA de clase II de la LMA.(b) Análisis de coincidencia de los proteomas originarios de los ligandos HLA de clase II de LMA (n=12), PBMC (n=13) y BMNC (n=2).(b) Perfil comparativo de las proteínas originarias de los ligandos HLA de clase II basado en la frecuencia de representación restringida a HLA en LMA, PBMC y BMNC. Las cifras absolutas de pacientes/donantes positivos para la presentación restringida a HLA de la proteína originaria pertinente (eje de abscisas (x)) aparecen indicadas en el eje de ordenadas (y). Las rayas discontinuas indican la representación del 100% en cada cohorte. El recuadro situado a la izquierda indica el subgrupo de proteínas originarias que muestran una representación exclusiva en la LMA con frecuencias >20%. (c) Análisis de coincidencia de las proteínas originarias exclusivas de la LMA de HLA de clase I y HLA de clase II.(d) En las 43 proteínas originarias exclusivas de la LMA compartidas se identificó un subgrupo de tres que contenían ligandos de HLA de clase I enteros integrados en péptidos HLA de clase II. Las secuencias integradas se muestran en negrita. (e) Ensayo ELISPOT con IFN-y de PBMc de pacientes con LMA tras la estimulación con diversos LiTAP de la LMA de HLA de clase II(PII1 , PIII2 y PIII3 ). Como control positivo se empleó PHA y como control negativo la estimulación con el péptido de HLA-DR FLNA1669 -1683.Con PII1 , PIII2 y PIII3 se observó un aumento significativo de la producción de IFN-y en muchos pacientes. Abreviaturas: UPN, número unificado de paciente.
La Figura 6 expone los resultados de un experimento destinado a evaluar la heterogeneidad interna de los ligandomas HLA de clase I en el subgrupo del FLT3-ITD (n=8) respecto al del FLT3-WT (n=7). Los inventores llevaron a cabo una indexación de similitud semicuantitativa. Para poder comparar los ligandomas de distintos tipos de HLA, los inventores llevaron a cabo el análisis a nivel de las proteínas originarias de los ligandos HLA. La información semicuantitativa se obtuvo del análisis de recuentos de espectros (PSMs, p e p tid e -to -s p e c tru m m a tch e s ; coincidencias entre péptido y espectro) de los ligandos de HLA representativos. Las distancias euclídeas se analizaron como medida de la similitud/disimilitud de cada pareja de muestras; los valores bajos indican gran similitud y los elevados gran disimilitud. Se calcularon las distancias euclídeas de cada posible par de muestras de cada subgrupo con una secuencia de instrucciones (sc rip t) de confección propia escrita en el lenguaje informático python (Python v3.3.3, Python Software Foundation). En resumen, los recuentos totales de PSM de cada pareja de muestras se normalizaron con respecto a la muestra con el recuento mayor. Para obtener la distancia euclídea se combinaron las listas de proteínas originarias y se sumaron los valores absolutos de las diferencias en los recuentos de PSM que representaban las respectivas proteínas originarias. *** P< 0,001, prueba de la t para datos desapareados.
Ejemplos
Ejemplo 1:
Identificación y cuantificación de los péptidos asociados a tumor presentados en la superficie celular
Muestras de tejido
Las muestras tumorales de pacientes fueron facilitadas por la Universidad de Tubinga, Tubinga, Alemania. Todos los pacientes otorgaron su consentimiento informado por escrito. Las muestras se criogenizaron en nitrógeno líquido inmediatamente después de la operación quirúrgica y se conservaron a -80°C hasta el aislamiento de los TUMAP. Para el análisis del ligandoma se aislaron por centrifugación en gradiente de densidad los PBMC de pacientes con LMA en el momento del diagnóstico o en una recidiva previa al tratamiento (recuento de blastos de LMA >80% en sangre), así como las PBMC y BMNC de donantes sanos.
Aislamiento de los péptidos HLA de las muestras de tejido
Las moléculas HLA de clase I y II se aislaron por purificación por inmunoafinidad, tal y como se ha descrito antes. En resumen, los sedimentos de células congelados instantáneamente se lisaron con una solución CHAPS/PBS 10 mM (AppliChem, St. Louis, Missouri, EE. UU./Gibco, Carlsbad, California, EE. UU.) que contenía inhibidor de proteasas 1x (Complete, Roche, Basilea, Suiza). Las moléculas HLA se purificaron en una sola etapa con el AcM W6/32 específico de HLA de clase I (pan-HLA de clase I) y con el AcM Tü39 específico de HLA de clase II (pan-HLA de clase II), enlazado covalentemente con sefarosa activada con CNBr (GE Healthcare, Chalfont St Giles, Reino Unido). Los complejos HLA:péptido se eluyeron con la adición repetida de ácido trifluoroacético al 0,2% (TFA, Merck, Whitehouse Station, New Jersey, EE. UU.). Las fracciones de elución E1-E8 se agruparon y los ligandos HLA libres se aislaron por ultrafiltración con unidades de filtro para centrífugas (Amicon, Millipore, Billerica, Massachusetts, EE. UU.). Los ligandos HLA se extrajeron y se desalaron del filtrado con puntas de pipeta ZipTip C19 (Millipore). Los péptidos extraídos se eluyeron con 35 pl de acetonitrilo al 80% (ACN, Merck)/TFA 0,2%, se centrifugaron hasta secarlos completamente y se resuspendieron en 25 pl de ACN 1%/TFA 0,05%. Las muestras se conservaron a -20 °C hasta el análisis con CL-EM/EM.
Análisis de los ligandos HLA mediante CL-EM/EM
Las muestras peptídicas se separaron con cromatografía de líquidos de fase inversa (nanoUHPLC, UltiMate 3000 RSLCnano, ThermoFisher, Waltham, Massachusetts, EE. UU.) y después fueron analizadas con un espectrómetro de masas híbrido LTQ Orbitrap XL acoplado en línea (ThermoFisher). Cada muestra se analizó por quintuplicado. Se inyectaron volúmenes de muestra de 5 pl (proporciones del 20% de la muestra) en una columna de retención de 75 pm x 2 cm (Acclaim PepMap RSLC, ThermoFisher) a 4 pl/min durante 5,75 min. A continuación se procedió a la separación de los péptidos a 50°C y un caudal de 175 nl/min en una columna de separación de 50 pm x50 cm (Acclaim PepMap RSLC, ThermoFisher) aplicando un gradiente de 2,4 a 32,0% de ACN a lo largo de 140 min. Los péptidos eluidos se ionizaron mediante ionización por nanonebulización y se analizaron en el espectrómetro de masas con un método CID (disociación provocada por colisión) que generó espectros de fragmentación de los 5 iones precursores más abundantes en los llamados s u rv e y scans. La resolución se fijó en 60.000. En lo que concierne a los ligandos de HLA de clase I, el intervalo de masas se limitó a 400-650 m/z con estados de carga 2 y 3 permitidos para la fragmentación. En lo concerniente a los HLA de clase II, se analizó un intervalo de masas de 300-1500 m/z con estados de carga >2 permitidos para la fragmentación.
En la Figura 3 se muestran perfiles de presentación de péptidos sobrerrepresentados a modo de ejemplo.
Amplificación de linfocitos T específicos de péptido
PBMC de pacientes con LMA y de voluntarios sanos se cultivaron en medio RPMI1640 (Gibco) complementado con suero humano mezclado al 10% (PHS, producido de forma interna), p-mercaptoetanol 100 mM (Roth, Karlsruhe, Alemania) y penicilina/estreptomicina al 1% (GE).Para la estimulación de los linfocitos T CD8+se descongelaron PBMC y se expusieron a pulsos de 1 pg/ml por péptido. Las PBMC expuestas a los péptidos (5-6 x 106células/ml) se cultivaron a 37°C y con CO2al 5% durante 12 días. El día 0 y el día 1 se añadieron al medio de cultivo IL-45 ng/ml (R&D Systems, Minneapolis, Minnesota, EE. UU.) e IL-75 ng/ml (Promokine, Heidelberg, Alemania). Los días 3, 5, 7 y 9 se añadió al medio de cultivo IL-2 2 ng/ml (R&D Systems). Las PBMC estimuladas con los péptidos se caracterizaron funcionalmente con ensayos ELISPOT el día 12 y mediante tinción intracelular de citocinas el día 13. Para la estimulación de los linfocitos T CD4+, el cultivo fue el mismo descrito para los linfocitos T CD8+ pero con dos modificaciones: la pulsación se llevó a cabo con 10 pg/ml de péptido de HLA de clase II y no se añadieron ni IL-4 ni IL-7.
Ensayo ELISPOT con IFN-y
Los ensayos ELISPOT con IFN-y se llevaron a cabo del modo descrito en otro lugar (Widenmeyer M, Griesemann H, Stevanovic S, Feyerabend S, Klein R, Attig S, et al. Promiscuous survivin peptide induces robust CD4+ T-cell responses in the majority of vaccinated cancer patients. Int J Cancer. 2012 Jul 1;131(1):140-9). En resumen, se tapizaron placas de nitrocelulosa de 96 pocillos (Millipore) con AcM IFN-y 1 mg/ml (Mabtech, Cincinnati, Ohio, EE. UU.) y se incubaron hasta el día siguiente a 4 °C. Las placas se bloquearon con PHS al 10% durante 2 h a 37 °C.5 x 105 células/pocillo de PBMC preestimuladas se pulsaron con péptido 1 pg/ml (HLA de clase I) o 2,5 pg/ml (HLA de clase II) y se incubaron durante 24-26 h. La lectura de los resultados se hizo siguiendo las instrucciones del fabricante. Los puntos se contabilizaron con un analizador ImmunoSpot S5 (CTL, Shaker Heights, Ohio, EE. UU.). Las respuestas de los linfocitos T se consideraron positivas si se contabilizaban >15 puntos/pocillo y el número medio de puntos por pocillo era como mínimo 3 veces mayor que la media de puntos en los pocillos del control negativo (según las directrices del C a n c e r Im m u n o g u id in g P ro g ra m (CIP)).
Tinción intracelular de IFN-y y TNF-a
La frecuencia y la funcionalidad de los linfocitos T CD8+ específicos de péptido se analizaron mediante tinción intracelular de IFN-y y TNF-a. Los PBMC se expusieron a pulsos con 1 pg/ml de cada péptido y se incubaron en presencia de brefeldina A 10 pg/ml (Sigma, St. Louis, Missouri, EE. UU.) y GolgiStop (BD) 10 pg/ml durante 6-8 h. Las células se marcaron con Cytofix/Cytoperm (BD), CD8-PECy7 (Beckman Coulter, Fullerton, California, EE. UU.), CD4-APC (BD Bioscience), TNF-a-PE (Beckman Coulter) e IFN-y-FITC (BD). Las muestras se analizaron con un citómetro de flujo FACS Canto II.
Cuantificación de la expresión superficial de HLA
Para permitir la comparación con monocitos sanos, se llevó a cabo una cuantificación de la expresión de HLA en la superficie en muestras de pacientes que contenían blastos de LMA CD15' y al menos un 5% de monocitos CD15+ normales definidos como tales por inmunofenotipado. La expresión en la superficie de los HLA se analizó con el kit de citometría de flujo cuantitativa QIFIKIT® (Dako, Glostrup, Dinamarca) siguiendo las instrucciones del fabricante. En resumen, se tiñeron triplicados de cada muestra con el anticuerpo monoclonal (AcM) W6/32 específico de HLA de clase I (pan-HLA de clase I), con AcM específico de HLA-DR L243 (los dos producidos de modo interno) o con control de isotipo IgG (BioLegend, San Diego, California, EE. UU.). A continuación se procedió a la tinción secundaria con anticuerpos de conejo, conjugados con FITC, contra fragmentos F(ab')2de ratón (Dako), realizada con PBMC, BMNC así como con perlas de cuantificación QIFIKIT®. La tinción de los marcadores superficiales se llevó a cabo con CD34 (BD, Franklin Lakes, New Jersey, EE. UU.), CD15 (BD), CD45 (BD) y CD38 (BD) marcados directamente. Como marcador de viabilidad se añadió 7AAD (BioLegend) justo antes del análisis por citometría de flujo en un analizador celular LSR Fortessa (BD).
Resultados
Las muestras de LMA primaria no manifestaron pérdida o regulación a la baja de la expresión de HLA en comparación con leucocitos benignos autólogos.
Se compararon los niveles de expresión de HLA en los blastos de LMA y en leucocitos benignos. Con ese objeto se cuantificaron por citometría de flujo los niveles de HLA en la superficie en un grupo de 5 pacientes con LMA CD15_y en otro de 5 donantes sanos de BMNC. Los blastos de LMA seleccionados eran células viables CD34+, CD45med, y su expresión de HLA se comparó con la de granulocitos y monocitos normales CD15+autólogos. Los niveles de HLA hallados fueron heterogéneos, con un número total de moléculas de HLA de clase I comprendido entre 45.189 y 261.647 moléculas/célula en los blastos de LMA y entre 75.344 y 239.496 moléculas/célula en las células CD15+. El análisis individualizado de la expresión de HLA en la superficie en las muestras triplicadas reveló una sobreexpresión pequeña pero significativa en 3/5 pacientes (prueba de la t desapareada, P < 0,001). La expresión de1HLA-DR estaba situada entre 1476 y 45.150 moléculas/célula en los blastos de LMA y entre 0 y 3252 en las células CD15+, siendo significativamente mayor en los blastos de LMA en todos los pacientes analizados (P < 0,001). Como referencia se analizó el número de moléculas HLA en la superficie de células madre hematopoyéticas (HSC, CD34+CD38') procedentes de 5 donantes sanos de BMNC. El minucioso análisis estadístico de la expresión superficial de HLA en la LMA y en los monocitos normales no reveló diferencias significativas en la expresión media de HLA de clase I y II. El número medio de HLA de clase I en los HSC normales (248.587 ± 35.351 moléculas/célula) resultó significativamente mayor que en los blastos de LMA (116.445 ± 37.855 moléculas/célula, P=0,034, Fig. 1c). El número medio de HLA de clase II en los HSC normales (38.373 ± 5159 moléculas/célula) no mostró un nivel significativamente mayor que en los blastos de LMA (17.103 ± 7604 moléculas/célula, P=0,053).
La CL-EM/EM identifica una amplia gama de ligandos de HLA de clase I y II presentados de forma natural
E l m a p e o d e lo s l ig a n d o m a s d e H L A d e c la s e I d e 15 p a c ie n te s c o n L M A (T a b la 1) id e n t if ic ó un to ta l d e 13.238 p é p tid o s d is t in to s q u e re p re s e n ta b a n a 6104 p ro te ín a s o r ig in a r ia s . El n ú m e ro d e p é p tid o s ú n ic o s id e n t if ic a d o s (c á n c e r ) p o r p a c ie n te s e s itu a b a e n tre 563 y 2733 (m e d ia : 1299 p é p tid o s ) . E n la c o h o r te s a n a (30 d o n a n te s d e P B M C , 5 d o n a n te s d e B M N C ), s e id e n t if ic ó un to ta l d e 17.940 p é p tid o s ú n ic o s (17.322 p é p tid o s /7207 p ro te ín a s o r ig in a r ia s en P B M C ; 1738 p é p tid o s /1384 p ro te ín a s o r ig in a r ia s en B M N C , c o m p le m e n ta r ia ) . El a n á lis is d e lo s l ig a n d o m a s d e H L A d e c la s e II en 12 p a c ie n te s c o n L M A a rro jó un to ta l d e 2816 p é p tid o s ú n ic o s ( in te rv a lo : 104 -753 p é p tid o s /p a c ie n te , m e d ia : 332 p é p tid o s ) re p re s e n ta n d o 885 p ro te ín a s o r ig in a r ia s . L a c o h o r te d e c o n tro l d e in d iv id u o s s a n o s p a ra H L A d e c la s e II (13 d o n a n te s d e P B M C , 2 d o n a n te s d e B M N C ) a rro jó 2202 p é p tid o s d is t in to s (2046 p é p tid o s /756 p ro te ín a s o r ig in a r ia s en P B M C , 317 p é p t id o s /164 p ro te ín a s o r ig in a r ia s en B M N C ) .N o s e h a lló n in g u n a c o r re la c ió n e n tre e l n ú m e ro d e c é lu la s a n a liz a d a s y e l n ú m e ro d e p é p tid o s id e n t if ic a d o s ni en e l c a s o d e 1H L A d e c la s e I (S p e a rm a n r = 0 ,27 , P = 0 ,33 ) ni en el H L A d e c la s e II ( r= 0 ,31 , P = 0 ,33 ).
La comparación de los ligandomas de HLA de clase I revela multitud de antígenos asociados a la LMA
C o n o b je to d e d e s c u b r ir n u e v a s d ia n a s p a ra la v a c u n a c ió n p e p tíd ic a en la L M A s e m a p e a ro n y s e c o m p a ra ro n la s p ro te ín a s o r ig in a r ia s d e lo s lig a n d o s d e H L A d e la s c o h o r te s d e L M A , P B M C y B M N C . El a n á lis is d e c o in c id e n c ia d e la s p ro te ín a s o r ig in a r ia s d e l H L A re v e ló q u e 1435 p ro te ín a s (23 ,6 % d e l p ro te o m a o r ig in a r io d e la L M A m a p e a d o ) e s ta b a n re p re s e n ta d a s e x c lu s iv a m e n te en lo s lig a n d o m a s H L A d e lo s p a c ie n te s c o n L M A . L a L M A c o m p a r t ía e l 75 ,5 % (4588 p ro te ín a s ) d e s u s p ro te ín a s o r ig in a r ia s H L A c o n la s P B M C y e l 19 ,3 % (1173 p ro te ín a s ) c o n la s B M N C . L a s p ro te ín a s o r ig in a r ia s d e lo s lig a n d o s H L A d e la s B M N C p re s e n ta ro n u n a c o in c id e n c ia d e l 89 ,9 % (1173 p ro te ín a s ) co n e l p ro te o m a o r ig in a r io d e la s P B M C . E n tre e s ta a m p lís im a g a m a d e d ia n a s p o te n c ia le s q u is im o s s e le c c io n a r lo s c a n d id a to s m á s re le v a n te s y m á s v e rs á t i le s p a ra e l d is e ñ o d e la v a c u n a e s tá n d a r . P o r c o n s ig u ie n te , lo s c r ite r io s p r im o rd ia le s p a ra la s e le c c ió n d e lo s a n tíg e n o s d e s t in a d o s a n u e s tra p la ta fo rm a c o n s is t ie ro n en la e x c lu s iv id a d p a ra la L M A y la a lta f re c u e n c ia d e re p re s e n ta c ió n en lo s l ig a n d o m a s d e la L M A . L a c la s if ic a c ió n d e la s p ro te ín a s o r ig in a r ia s d e lo s l ig a n d o s d e H L A c o n fo rm e a ta le s c r ite r io s re v e ló un c o n ju n to d e 132 p ro te ín a s (2 ,2 % d e l p ro te o m a o r ig in a r io d e la L M A ) re p re s e n ta d a s e x c lu s iv a m e n te en > 20 % d e lo s l ig a n d o m a s d e la L M A . E n tre e s o s L iT A A (a n tíg e n o s a s o c ia d o s a tu m o r d e r iv a d o s d e l l ig a n d o m a ) d e f in id o s c o n e s o s d o s c r ite r io s , e l p r im e r lu g a r d e la c la s if ic a c ió n lo o c u p ó e l fa c to r 1 a s o c ia d o a F A S (F A F 1 ), q u e s e d e te c tó en 8 /15 (53 ,3 % ) d e lo s l ig a n d o m a s d e lo s p a c ie n te s y a p a re c ió re p re s e n ta d o p o r 6 lig a n d o s d e H L A d is t in to s (A E Q F R L E Q I (S E Q ID N .° 1) (B *44 ) , F T A E F S S R Y (S E Q ID N .° 2 ) (A *03 ), H H D E S V L T N V F (S E Q ID N .° 3 ) (B *38 :01 ), R E Q D E A Y R L (S E Q ID N .° 4 ) (B *44 :25 ), R P V M P S R Q I (S E Q ID N .° 5 ) (B *07 ) , V Q R E Y N L N F (S E Q ID N .° 6 ) (B *15 ) . L a T a b la 2 c o n t ie n e un re s u m e n d e lo s 15 p r im e ro s L iT A A c u y a re p re s e n ta c ió n en lo s l ig a n d o m a s d e la L M A e ra > 33 % . E n re s u m e n , lo s 132 L iT A A m á s fre c u e n te s p ro p o rc io n a ro n un p a n e l d e 341 l ig a n d o s d is t in to s d e H L A p re s e n ta d o s d e fo rm a n a tu ra l (L iT A P , p é p tid o s a s o c ia d o s a tu m o r d e r iv a d o s d e l l ig a n d o m a ) d e m á s d e 25 re s tr ic c io n e s H L A d is t in ta s , a d e c u a d o s p a ra e l d e s a rro llo d e v a c u n a s p e p tíd ic a s e s p e c íf ic a s p a ra la L M A d e a m p lia v e rs a t il id a d . A d e m á s , la s o tra s 1389 p ro te ín a s o r ig in a r ia s e x c lu s iv a s d e la L M A c u y a s f r e c u e n c ia s d e re p re s e n ta c ió n e ra n < 20 % re p re s e n ta d a s p o r 1727 lig a n d o s H L A d is t in to s p u e d e n s e rv ir c o m o re p o s ito r io s p a ra e l d is e ñ o d e v a c u n a s m á s p e rs o n a liz a d a s .
Identificación de ligandos de HLA de clase I presentados de forma natural que derivan de antígenos asociados a la LMA confirmados
U n a p ro s p e c c ió n d e d a to s s e c u n d a r ia s e c e n tró en la id e n t if ic a c ió n y la c la s if ic a c ió n d e lo s a n tíg e n o s a s o c ia d o s a la L M A c o n f irm a d o s ( re s u m id a en A n g u ille S, V a n T e n d e lo o V F , B e rn e m a n Z N . L e u k e m ia -a s s o c ia te d a n t ig e n s a n d th e ir re le v a n c e to th e im m u n o th e ra p y o f a c u te m y e lo id le u k e m ia . L e u k e m ia . 2012 O c t ;26 (10 ) :2186 -96 ) en e l c o n ju n to d e d a to s d e lo s lig a n d o s d e H L A p re s e n ta d o s d e fo rm a n a tu ra l. L a p ro s p e c c ió n s e s a ld ó c o n la id e n t if ic a c ió n d e 122 l ig a n d o s d e H L A d is t in to s q u e re p re s e n ta b a n 29 d e e s o s a n tíg e n o s p u b lic a d o s . S o rp re n d e n te m e n te s e d e s c u b r ió q u e > 80 % (24 /29 ) d e e s o s a n tíg e n o s ta m b ié n e s ta b a n re p re s e n ta d o s en P B M C o en B M N C b e n ig n o s y q u e , p o r ta n to , no e ra n e s p e c íf ic o s d e la L M A .
L a e x c lu s iv id a d en la L M A en c u a n to a la p re s e n ta c ió n d e l H L A s e h a lló en F L T 3 (S E L K M M T Q L , B *40 ) (S E Q ID N .° 338 ), P A S D 1 (L L G H L P A E I, C * 01 :02 ) (S E Q ID N .° 447 ), H O X A 9 (D A A D E L S V G R Y , A * 26 :01 ) (S E Q ID N .° 437 ), A U R K A (R E V E IQ S H L , B *49 :01 ) (S E Q ID N .° 400 ) y C C N A 1 (L E A D P F L K Y , B *18 :01 (S E Q ID N .° 402 ); E P P A V L L L , B *51 :01 (S E Q ID N .° 401 )) . E n e l c a s o d e la m ie lo p e ro x id a s a (M P O ) se d e s c u b r ió un to ta l d e 19 lig a n d o s d e H L A d is t in to s y se d e te c tó re p re s e n ta c ió n en 6 /15 (40 % ) l ig a n d o m a s d e la L M A y en 0 /30 lig a n d o m a s d e la s P B M C . N o o b s ta n te , el a n á lis is d e la s B M N C n o rm a le s re v e ló re p re s e n ta c ió n en 3 /5 (60 % ) d e lo s l ig a n d o m a s , lo c u a l p o n e d e re lie v e la im p o r ta n c ia d e c o n ta r c o n a m b o s t ip o s d e c é lu la s (P B M C y B M N C ) en la id e n t if ic a c ió n d e la s d ia n a s . E n d e fin it iv a , n u e s tro a n á lis is re v e ló q u e u n a g ra n p ro p o rc ió n d e lo s a n tíg e n o s a s o c ia d o s a la L M A c o n f irm a d o s n o c u m p lía el re q u is ito d e e s ta r re p re s e n ta d o s ú n ic a m e n te en H L A e x c lu s iv o s d e l tu m o r .
El análisis comparativo de subgrupos de los ligandomas de HLA de clase I de la LMA con FLT3-ITD mutado y con FLT3-WT identifica LiTAA comunes a pesar de la notable disimilitud de los ligandomas
P a ra e v a lu a r la a p lic a b il id a d d e n u e s tra s n u e v a s d ia n a s a d ife re n te s s u b t ip o s d e la L M A s e c a ra c te r iz ó la re p re s e n ta c ió n d e L iT A A en s e n d o s s u b g ru p o s d e p a c ie n te s co n d u p lic a c ió n in te rn a en tá n d e m d e l g e n la t ir o s in a -c in a s a 3 s im ila r a F M S (F L T 3 - IT D , n = 8 ) y c o n e s e m is m o g e n F L T 3 en su fo rm a n a tu ra l (F L T 3 -W T , wild type, n = 7 ). La in d e x a c ió n d e s im ilitu d d e lo s lig a n d o m a s d e H L A d e c la s e I re v e ló q u e e l s u b g ru p o c o n F L T 3 -W T p re s e n ta b a u n a h e te ro g e n e id a d in te rn a s ig n if ic a t iv a m e n te m e n o r (m e d ia 916 ,2 ± 70 ,6 , n = 21 ) q u e e l s u b g ru p o c o n F L T 3 -T ID (m e d ia 1687 ,0 ± 156 ,5 , n = 21 , P < 0 ,0001 , F ig u ra 6 ). E l a n á lis is d e c o in c id e n c ia d e la s p ro te ín a s o r ig in a r ia s d e H L A e x c lu s iv o s d e la L M A (F L T 3 -W T : 748 p ro te ín a s , F L T 3 -IT D : 926 p ro te ín a s ) re v e ló c o in c id e n c ia s d e l 32 ,0 % (F L T 3 -W T /F L T 3 - IT D ) y d e l 25 ,6 % (F L T 3 - IT D /F L T 3 -W T ) re s p e c t iv a m e n te (F ig . 3 d ). R e s u lta d e s ta c a b le q u e 42 /46 (91 ,3 % ) d e lo s L iT A A c la s if ic a d o s en lo s p r im e ro s p u e s to s e s tu v ie ra n re p re s e n ta d o s en a m b o s s u b g ru p o s (F ig . 3 e ). L a s tre s p ro te ín a s o r ig in a r ia s d e l ig a n d o s H L A S K P 1 (5 /8 ) , C 16 o r f13 (5 /8 ) y E R L IN 1 (4 /8 ) , q u e s e id e n t if ic a ro n e x c lu s iv a m e n te en el s u b g ru p o c o n F L T 3 -IT D , a lc a n z a ro n f r e c u e n c ia s d e re p re s e n ta c ió n > 50 % . El L iT A A e s p e c íf ic o d e F L T 3 -W T M U L1 e s ta b a re p re s e n ta d o en 4 /7 (57 ,1 % ) l ig a n d o m a s d e F L T 3 -W T .C o n s id e ra d o s en c o n ju n to , e s to s d a to s re s p a ld a n la a d o p c ió n d e l a n á lis is d e c o h o r te s d e lo s l ig a n d o m a s d e H L A p a ra la s e le c c ió n d e la s d ia n a s , a l t ie m p o q u e s e ñ a la n u n a p e q u e ñ a f ra c c ió n d e d ia n a s e s p e c íf ic a s d e s u b g ru p o s , d o ta d a s d e e le v a d a f re c u e n c ia .
La caracterización funcional de los LiTAP revela inmunorreactividad asociada a la LMA
A f in d e e v a lu a r la in m u n o g e n ic id a d y la e s p e c if ic id a d d e n u e s tro s L iT A P d e H L A -A *03 , lo s in v e n to re s lle v a ro n a c a b o e n s a y o s E L IS P O T c o n IF N -y c o n re c u e rd o a lo s 12 d ía s . L a s P B M C o b te n id a s d e 6 p a c ie n te s c o n L M A y d e 8 p e rs o n a s s a n a s fu e ro n e s t im u la d a s c o n d ife re n te s c o n ju n to s (P ^ y P 2 d e L iT A P d e H L A -A * 03 d e lo s p r im e ro s p u e s to s d e la c la s if ic a c ió n . C o n a m b o s c o n ju n to s d e p é p tid o s s e o b s e rv ó u n a s e c re c ió n s ig n if ic a t iv a d e IF N -y en 2 /6 m u e s tra s d e L M A (F ig . 4 a ). C o n e l f in d e c o n f irm a r e s to s re s u lta d o s s e a n a liz a ro n P B M C p re e s t im u la d o s 12 d ía s a n te s c o n t in c ió n in tra c e lu la r d e c ito c in a s y c ito m e tr ía d e f lu jo co n IF N -y y T N F -a (F ig . 4 b ). L a c a ra c te r iz a c ió n fu n c io n a l d e la s re s p u e s ta s d e lo s l in fo c ito s T C D 8 +e s p e c íf ic o s p a ra P I1 y P I2 q u e d ó c o n f irm a d a p o r la s e c re c ió n d e IF N -y (P i1: 1 ,6 % , P 2 1 ,7 % d e l in fo c ito s T C D 8 ) y d e T N F -a (P 1 2 ,6 % , P 2 2 ,4 % d e l in fo c ito s T C D 8 ). L o s e n s a y o s E L IS P O T c o m p a ra t iv o s co n P B M C d e d o n a n te s s a n o s p o s it iv o s p a ra A * 03 q u e h a b ía n s id o e s t im u la d o s c o n P I1 y P I2 n o re v e ló n in g u n a s e c re c ió n s ig n if ic a t iv a d e IF N -y (0 /8 , F ig . 4 c ). E s ta s c a ra c te r iz a c io n e s in ic ia le s d e m u e s tra n q u e lo s L iT A P d e f in id o s p u e d e n a c tu a r c o m o e p íto p o s d e l in fo c ito s T e s p e c íf ic o s d e la L M A .
El análisis del ligandoma de HLA de clase II proporciona dianas adicionales y señala ligandos integrados potencialmente sinérgicos
E l a n á lis is d e c o in c id e n c ia d e lo s p ro te o m a s o r ig in a r io s d e H L A d e c la s e II id e n t if ic ó 396 p ro te ín a s (44 ,7 % ) re p re s e n ta d o s p o r 1079 l ig a n d o s d e H L A d is t in to s q u e e s ta b a n re p re s e n ta d o s e x c lu s iv a m e n te en e l lig a n d o m a H L A d e la L M A . S e d e s c u b r ió q u e la L M A c o m p a r t ía e l 53 ,3 % (472 p ro te ín a s ) d e su p ro te o m a o r ig in a r io c o n la s P B M C y el 15 ,1 % (134 p ro te ín a s ) c o n la s B M N C . L a s B M N C p re s e n ta ro n u n a c o in c id e n c ia d e l 88 ,2 % (127 p ro te ín a s ) d e su p ro te o m a o r ig in a r io co n e l d e la s P B M C . C o n la s u s o d ic h a c o m p a ra c ió n d e l p ro te o m a o r ig in a r io d e H L A d e s c r ita p a ra e l H L A d e c la s e I, lo s in v e n to re s p u d ie ro n id e n t if ic a r 36 L iT A A ( re p re s e n ta d o s p o r 152 l ig a n d o s d e H L A d e c la s e II d is t in to s )c u y a s f r e c u e n c ia s d e re p re s e n ta c ió n e ra n > 20 % . E l L iT A A d e c la s e II q u e o c u p ó e l p r im e r lu g a r en la c la s if ic a c ió n (A 1 B G ) s e id e n t if ic ó en 6 /12 (50 % ) p a c ie n te s , re p re s e n ta d o p o r 5 lig a n d o s d is t in to s . C o n o b je to d e id e n t if ic a r lo s L IT A A p re s e n ta d o s en a m b o s l ig a n d o m a s H L A d e c la s e I y d e c la s e II, lo s in v e n to re s c o m p a ra ro n lo s re s p e c t iv o s p ro te o m a s o r ig in a r io s e x c lu s iv o s d e la L M A . D e e s e m o d o d e s c u b r ie ro n un p e q u e ñ o g ru p o d e 43 p ro te ín a s o r ig in a r ia s c o m p a r t id a s (3 ,0 % d e l p ro te o m a o r ig in a r io d e H L A d e c la s e I /10 ,4 % d e l p ro te o m a o r ig in a r io d e H L A d e c la s e II). El m a p e o c o m p a ra t iv o d e lo s re s p e c t iv o s l ig a n d o s d e c la s e I y d e c la s e II id e n t if ic ó 3 p é p tid o s H L A d e c la s e II q u e c o n te n ía n in te g ra d o s l ig a n d o s H L A d e c la s e I e n te ro s .
P a ra c a ra c te r iz a r fu n c io n a lm e n te lo s L iT A P d e H L A d e c la s e II, lo s in v e n to re s lle v a ro n a c a b o e n s a y o s E L IS P O T co n IF N -y c o n re c u e rd o a lo s 12 d ía s . C o n 3 /7 d e lo s p r im e ro s L iT A P d e la c la s if ic a c ió n s e d e te c tó u n a s e c re c ió n s ig n if ic a t iv a d e IF N -y en lo s p a c ie n te s c o n L M A . S e d e te c ta ro n re s p u e s ta s d e lin fo c ito s T f re n te a l p é p tid o P II1 (C L S T N 1836 -852 ) en 4 /15 p a c ie n te s c o n L M A (26 ,7 % ), en c o m p a ra c ió n c o n P II2( L A B 5 A 123-13s) en 3 /15 p a c ie n te s (20 ,0 % ) y c o n P II3 (M B L 2191 -206 ) en 2 /15 p a c ie n te s (13 ,3 % ). L a F ig . 5 e p re s e n ta un e je m p lo d e la f re c u e n c ia d e lin fo c ito s T e s p e c íf ic o s f re n te a lo s p é p tid o s P II1 , P II2 y P II3 en un p a c ie n te c o n L M A . L o s e n s a y o s E L IS P O T c o m p a ra t iv o s co n P B M C d e d o n a n te s s a n o s q u e h a b ía n s id o e s t im u la d o s c o n P II1 , P II2 y P ^ n o re v e ló n in g u n a s e c re c ió n s ig n if ic a t iv a d e IF N -y (0 /8 ). A s í p u e s , lo s e p íto p o s H L A d e c la s e II e s p e c íf ic o s d e la L M A a q u í d e f in id o s t ie n e n e l p o te n c ia l d e c o m p le m e n ta r u n a v a c u n a p e p tíd ic a d e H L A d e c la s e I.
Ejemplo 2
Perfiles de expresión de genes que codifican los péptidos de la invención
N o to d o s lo s p é p tid o s id e n t if ic a d o s d e la A M L c o m o p re s e n te s en la s u p e r f ic ie d e la s c é lu la s tu m o ra le s a t ra v é s d e la s m o lé c u la s M H C so n a d e c u a d o s p a ra la in m u n o te ra p ia , p o rq u e la m a y o r ía d e e llo s p ro c e d e n d e p ro te ín a s c e lu la re s n o rm a le s q u e s e e x p re s a n en m u lt i tu d d e t ip o s d e c é lu la s . M u y p o c o s d e e s o s p é p tid o s e s tá n a s o c ia d o s a tu m o re s y p ro b a b le m e n te s e a n c a p a c e s d e e s t im u la r lo s l in fo c ito s T c o n u n a a lta e s p e c if ic id a d d e re c o n o c im ie n to c o n tra e l tu m o r d e l c u a l d e r iv a n . A f in d e d e s c u b r ir lo s y d e m in im iz a r e l r ie s g o d e q u e la v a c u n a g e n e re a u to in m u n id a d lo s in v e n to re s s e c e n tra ro n en lo s p é p tid o s d e r iv a d o s d e p ro te ín a s q u e a p a re c e n s o b re e x p re s a d a s en la s c é lu la s tu m o ra le s en c o m p a ra c ió n c o n la m a y o r ía d e lo s te j id o s n o rm a le s .
E l p é p tid o id e a l s e r ía e l d e r iv a d o d e u n a p ro te ín a q u e s e a e x c lu s iv a d e l tu m o r y no e s té p re s e n te en n in g ú n o tro te jid o . P a ra id e n t if ic a r lo s p é p tid o s q u e d e r iv a b a n d e g e n e s d o ta d o s c o n un p e rfil d e e x p re s ió n s im ila r a l id e a l lo s p é p tid o s id e n t if ic a d o s s e a s ig n a ro n a la s p ro te ín a s y d e s p u é s a lo s g e n e s o r ig in a r io s y s e g e n e ra ro n lo s p e r f ile s d e e x p re s ió n d e d ic h o s g e n e s .
Fuentes de ARN y preparación
L a s m u e s tra s d e te j id o e x t irp a d o fu e ro n fa c il ita d a s p o r la U n iv e rs id a d d e H e id e lb e rg , H e id e lb e rg , A le m a n ia (v é a s e E je m p lo 1); to d o s lo s p a c ie n te s o to rg a ro n su c o n s e n t im ie n to in fo rm a d o p o r e s c r ito . L a s m u e s tra s d e te j id o tu m o ra l se c r io g e n iz a ro n en n it ró g e n o líq u id o in m e d ia ta m e n te d e s p u é s d e la o p e ra c ió n y s e h o m o g e n e iz a ro n a m a n o en un m o r te ro c o n n itró g e n o líq u id o . E l A R N to ta l s e p re p a ró a p a r t ir d e e s ta s m u e s tra s c o n T R I R e a g e n t (A m b io n , D a rm s ta d t, A le m a n ia ) y d e s p u é s s e p u r if ic a ro n c o n R N e a s y (Q IA G E N , H ild e n , A le m a n ia ) ; a m b o s m é to d o s s e e fe c tu a ro n s ig u ie n d o la s in s tru c c io n e s d e l fa b r ic a n te .
E l A R N to ta l p ro c e d e n te d e te j id o s h u m a n o s s a n o s s e o b tu v o p o r c a n a le s c o m e rc ia le s (A m b io n , H u n tin g d o n , R e in o U n id o ; C lo n te c h , H e id e lb e rg , A le m a n ia ; S tra ta g e n e , A m s te rd a m , H o la n d a ; B io C h a in , H a y w a rd , C A , E E . U U .). El A R N d e v a r io s in d iv id u o s (d e 2 a 123 in d iv id u o s ) s e m e z c ló d e ta l m o d o q u e e l A R N d e c a d a u n o d e e llo s e s tu v ie ra re p re s e n ta d o en la m is m a p ro p o rc ió n .
L a c a lid a d y la c a n t id a d d e la s m u e s tra s d e A R N s e v a lo ró c o n A g ile n t 2100 B io a n a ly z e r (A g ile n t, W a ld b ro n n , A le m a n ia ) y e l R N A 6000 P ic o L a b C h ip K it (A g ile n t)
Experimentos con micromatrices
E l a n á lis is d e la e x p re s ió n g é n ic a d e to d a s la s m u e s tra s d e A R N d e te j id o tu m o ra l y n o rm a l s e e fe c tu ó co n m ic ro m a tr ic e s o l ig o n u c le o t íd ic a s A f fy m e tr ix H u m a n G e n o m e (H G ) U 133 A o H G -U 133 P lu s 2.0 (A ffy m e tr ix , S a n ta C la ra , C A , EE . U U .). T o d o s lo s p a s o s s e lle v a ro n a c a b o s ig u ie n d o e l m a n u a l d e A f fy m e tr ix . E n re s u m e n , a p a r t ir d e - 8 |jg d e A R N to ta l s e s in te t iz ó A D N c b ic a te n a r io c o n S u p e rS c r ip t R T II ( In v it ro g e n ) y e l c e b a d o r o lig o -d T -T 7 (M W G B io te c h , E b e rs b e rg , A le m a n ia ) s ig u ie n d o la s in d ic a c io n e s d e l m a n u a l. L a tra n s c r ip c ió n in vitro s e lle v ó a c a b o c o n el B io A rra y H ig h Y ie ld R N A T ra n s c r ip t L a b e llin g K it (E N Z O D ia g n o s t ic s , Inc ., F a rm in g d a le , N e w Y o rk , E E . U U .) en el c a s o d e la s m a tr ic e s U 133 A y c o n e l G e n e C h ip IV T L a b e llin g K it (A f fy m e tr ix ) en e l d e la s m a tr ic e s U 133 P lu s 2.0 , y d e s p u é s s e p ro c e d ió a la f ra g m e n ta c ió n d e l A R N c , a su h ib r id a c ió n y t in c ió n co n e s tre p ta v id in a - f ic o e r it r in a y un a n t ic u e rp o a n t i-e s t re p ta v id in a b io t in ila d o (M o le c u la r P ro b e s , L e id e n , H o la n d a ). L a s im á g e n e s s e a n a liz a ro n c o n el A g ile n t 2500 A G e n e A rra y S c a n n e r (U 133 A ) o c o n e l A f fy m e tr ix G e n e -C h ip S c a n n e r 3000 (U 133 P lu s 2.0 ), y lo s d a to s s e a n a liz a ro n co n e l s o f tw a re G C O S (A ffy m e tr ix ) , a p lic a n d o lo s a ju s te s p re p ro g ra m a d o s en to d o s lo s p a rá m e tro s . P a ra la n o rm a liz a c ió n s e u t il iz a ro n 100 g e n e s c o n s t itu t iv o s (housekeeping) s u m in is tra d o s p o r A ffy m e tr ix . L o s v a lo re s d e e x p re s ió n re la t iv a s e c a lc u la ro n a p a r t ir d e lo s ra t io s lo g a r í tm ic o s d e s e ñ a l d a d o s p o r e l s o f tw a re y la m u e s tra n o rm a l d e r iñ ó n s e a ju s tó d e fo rm a a rb it ra r ia en 1 ,0.
E n la F ig . 3 s e e x p o n e n e je m p lo s d e p e rf ile s d e e x p re s ió n d e g e n e s o r ig in a r io s d e la p re s e n te in v e n c ió n q u e a p a re c e n m u y s o b re e x p re s a d o s o s e e x p re s a n e x c lu s iv a m e n te en la L M A .
Ejemplo 3
Inmunogenicidad in vitro de los péptidos presentados por MHC de clase I de la LMA
A fin d e re c a b a r in fo rm a c ió n s o b re la in m u n o g e n ic id a d d e lo s T U M A P d e la p re s e n te in v e n c ió n , lo s in v e n to re s lle v a ro n a c a b o e s tu d io s c o n un e n s a y o d e s e n s ib il iz a c ió n in vitro d e l in fo c ito s T b a s a d o en e s t im u la c io n e s re ite ra d a s d e l in fo c ito s T C D 8 c o n c é lu la s p re s e n ta d o ra s d e a n tíg e n o a r t if ic ia le s (a A P C ) c a rg a d a s c o n c o m p le jo s p é p tid o /M H C y a n t ic u e rp o a n t i-C D 28.D e e s e m o d o , lo s in v e n to re s h a n p o d id o d e m o s tra r h a s ta e l m o m e n to la in m u n o g e n ic id a d d e 9 T U M A P re s tr in g id o s a l H L A -A *0201 d e la in v e n c ió n , lo c u a l p ru e b a q u e e s to s p é p tid o s s o n e p íto p o s d e lin fo c ito s T c o n tra lo s c u a le s e x is te n l in fo c ito s T p re c u rs o re s C D 8 en e l s e r h u m a n o .
Sensibilización in vitro de los linfocitos T CD8+
P a ra l le v a r a c a b o e s t im u la c io n e s in vitro c o n c é lu la s p re s e n ta d o ra s d e a n tíg e n o a r t if ic ia le s c a rg a d a s c o n c o m p le jo p é p tid o -M H C (p M H C ) y a n t ic u e rp o a n ti-C D 28 , lo s in v e n to re s p r im e ro a is la ro n l in fo c ito s T C D 8 d e p ro d u c to s d e le u c o fé re s is H L A -A * 02 p o r s e le c c ió n p o s it iv a co n m ic ro p e r la s d e C D 8 (M ilte n y i B io te c , B e rg is c h -G la d b a c h , A le m a n ia ) d e d o n a n te s s a n o s o b te n id a s d e T ra n s fu s io n M e d ic in e T u e b in g e n , A le m a n ia , t ra s e l p re c e p t iv o c o n s e n t im ie n to in fo rm a d o .
L o s l in fo c ito s C D 8 o P B M C a is la d o s s e in c u b a ro n h a s ta su u t il iz a c ió n en m e d io p a ra lin fo c ito s T (T C M ) c o n s is te n te en R P M I-G lu ta m a x ( In v it ro g e n , K a r ls ru h e , A le m a n ia ) c o m p le m e n ta d o c o n s u e ro Ab h u m a n o te rm o in a c t iv a d o a l 10 % (P A N -B io te c h , A id e n b a c h , A le m a n ia ) , p e n ic il in a 100 U /m l / e s t re p to m ic in a 100 jg / m l (C a m b re x , C o lo n ia , A le m a n ia ) , p iru v a to s ó d ic o 1 m M (C C P ro , O b e rd o r la , A le m a n ia ) , g e n ta m ic in a 20 jg / m l (C a m b re x ) . E n e s te p a s o ta m b ié n se a ñ a d ie ro n a l m e d io T C M IL -7 2 ,5 n g /m l (P ro m o C e ll, H e id e lb e rg , A le m a n ia ) e IL -2 10 U /m l (N o v a r t is P h a rm a , N ú re m b e rg , A le m a n ia ) .
L a fa b r ic a c ió n d e la s m ic ro p e r la s ta p iz a d a s c o n p M H C /a n t i-C D 28 , la e s t im u la c io n e s d e lo s l in fo c ito s T y la le c tu ra se lle v a ro n a c a b o en un s is te m a in vitro m u y d e fin id o co n c u a tro m o lé c u la s p M H C d is t in ta s en c a d a c o n d ic ió n d e estimulación y 8 moléculas pMHC distintas en cada condición de lectura.
Todos los complejos pMHC utilizados para cargar las aAPC y en la lectura en el citómetro se fabricaron con el método de intercambio de ligandos del MHC por inducción con UV (Rodenko B, et al. Generation of peptide-MHC class I complexes through UV-mediated ligand exchange. Nat Protoc. 2006;1(3):1120-32) con pequeñas modificaciones.Para determinar la cantidad de monómero pMHC obtenida con el intercambio realizamos ensayos ELISA en sándwich con estreptavidina según Rodenko B, et al., 2006.
El Ab 9.3, una IgG2a de ratón anti-CD28 humano co-estimuladora purificada (Jung G, et al. Induction of cytotoxicity in resting human T lymphocytes bound to tumor cells by antibody heteroconjugates. Proc Natl Acad Sci USA. 1987 Jul;84(13):4611-5) se biotiniló químicamente con sulfo-N-hidroxisuccinimidobiotina siguiendo las recomendaciones del fabricante (Perbio, Bonn, Alemania). Las microperlas utilizadas consistían en partículas de poliestireno de 5,6 pm de diámetro recubiertas de estreptavidina (Bangs Laboratories, Illinois, EE. UU.).
Los pMHC usados en las estimulaciones de control positivo y negativo fueron A*0201/MLA-001 (péptido ELAGIGILTV (SEQ ID N.° 606) de Melan-A modificado/MART-1) y A*0201/DDX5-001 (YLLPAIVHI de DDX5) (SEQ ID N.° 607)), respectivamente.
Placas de 96 pocillos se tapizaron con 800.000 microperlas / 200 pl en presencia de 4 x 12,5 ng de diferentes pMHC biotinilados, se lavaron y después se les añadió 600 ng de anti-CD28 biotinilado en un volumen de 200 pl. Las estimulaciones se iniciaron en placas de 96 pocillos en las que se incubaron simultáneamente 1x106 linfocitos T CD8+ con 2x105 microperlas recubiertas y lavadas en 200 pl de TCM suplementado con IL-125 ng/ml (PromoCell) durante 3-4 días a 37°C. La mitad del medio se renovó con TCM fresco suplementado con IL-280 U/ml y la incubación continuó otros 3-4 días a 37°C. Este ciclo de estimulación se efectuó en total tres veces. Para la lectura de los multímeros pMHC con 8 moléculas pMHC distintas por condición se empleó una estrategia de codificación combinatoria bidimensional según lo descrito en otro lugar (Andersen et al., 2012 Parallel detection of antigen-specific T cell responses by combinatorial encoding of MHC multimers. Nat Protoc. 2012 Apr 12;7(5):891-902.), con pequeñas modificaciones que comprenden el acoplamiento con 5 fluorocromos distintos. Por último, los análisis de los multímeros se llevaron a cabo tiñendo las células con el colorante para el IR cercano Live/dead®(Invitrogen, Karlsruhe, Alemania), con anticuerpo anti-CD8-FITC clon SK1 (BD, Heidelberg, Alemania) y multímeros pMHC fluorescentes. Para el análisis se equipó un citómetro BD LSRII SORP con los filtros y láseres adecuados. Las células específicas de péptido se calcularon en forma de porcentaje respecto al total de linfocitos T CD8+. La evaluación del análisis multimérico se efectuó con el software FlowJo (Tree Star, Oregón, EE. UU.). La sensibilización in v itro de los linfocitos CD8+ multímero+ específicos se detectó comparando los resultados con las estimulaciones del control negativo. La inmunogenicidad para un antígeno dado quedaba confirmada si al menos un pocillo estimulado in v itro y evaluable de un donante sano contenía una línea de linfocitos T CD8+ específica después de la estimulación in v itro (esto es, el pocillo contenía al menos un 1% de multímero+ específico entre los linfocitos T CD8+ y el porcentaje de células multímero+ específicas era al menos 10x de la mediana de las estimulaciones del control negativo).
Inmunogenicidad in vitro de los péptidos de la LMA
En el caso de los péptidos de HLA de clase I analizados, la inmunogenicidad in v itro se puede demostrar con la generación de líneas de linfocitos T específicos de ese péptido. En la Figura 4 se muestran a modo de ejemplo los resultados de la citometría de flujo de dos péptidos de la invención tras la tinción de multímeros específicos de TUMAP junto con la de los controles negativos correspondientes.
Ejemplo 4
Síntesis de péptidos
Todos los péptidos se sintetizaron mediante síntesis en fase sólida estándar y contrastada con el método de Fmoc. Después de la purificación con RP-HPLC preparativa, se llevó a cabo un procedimiento de intercambio iónico para incorporar contraiones que fueran fisiológicamente compatibles (por ejemplo, trifluoroacetato, acetato, amonio o cloruro).
La identidad y la pureza de cada péptido se determinaron con espectrometría de masas y RP-HPLC analítica. Tras el procedimiento de intercambio iónico se obtuvieron los péptidos en forma de liofilizado blanco o blancuzco con una pureza de entre el 90% y el 99,7%.
Todos los TUMAP se administraron preferiblemente como sales de trifluoroacetato o de acetato, aunque también es factible con otros tipos de sales. En las mediciones del ejemplo 3 se utilizaron sales trifluoroacéticas de los péptidos.
Ejemplo 5
Ensayos de unión a MHC - MHC de clase I
Los péptidos candidatos para los tratamientos con linfocitos B conformes a la presente invención se siguieron analizando para comprobar su capacidad de unión a las moléculas del MHC (afinidad). Los diferentes complejos de p é p tid o -M H C s e p ro d u je ro n c o n in te rc a m b io c o n e l p é p tid o d e in te ré s q u e s e p re te n d e a n a liz a r . S ó lo lo s c a n d id a to s p e p tíd ic o s q u e p u e d e n u n irs e y e s ta b i l iz a r la s m o lé c u la s d e M H C re c e p to ra s d e l p é p tid o e v ita n la d is o c ia c ió n d e lo s c o m p le jo s M H C . P a ra d e te rm in a r e l re n d im ie n to d e la re a c c ió n d e in te rc a m b io s e lle v ó a c a b o un E L IS A b a s a d o en la d e te c c ió n d e la c a d e n a liv ia n a (p 2 m ) d e lo s c o m p le jo s M H C e s ta b il iz a d o s . E l e n s a y o s e e fe c tu ó s ig u ie n d o en lín e a s g e n e ra le s e l m o d o d e s c r ito p o r R o d e n k o e t a l. (R o d e n k o B e t a l. N a t P ro to c . 1 2006 ; 1120 -1132 ).
P la c a s M A X IS o rp d e 96 p o c il lo s (N U N C ) s e in c u b a ro n to d a la n o c h e co n e s tre p ta v id in a 2 p g /m l en P B S a te m p e ra tu ra a m b ie n te , s e la v a ro n 4 x y s e b lo q u e a ro n d u ra n te 1 h a 37 °C c o n un ta m p ó n d e b lo q u e o q u e c o n te n ía B S A al 2% . C o m o p a tro n e s s e e m p le a ro n m o n ó m e ro s H L A -A * 0201 /M L A -001 re p le g a d o s , en e l in te rv a lo d e 15 a 500 n g /m l. L o s m o n ó m e ro s d e p é p tid o -M H C re s u lta n te s d e la re a c c ió n d e in te rc a m b io p o r U V s e d ilu y e ro n 100 x co n ta m p ó n d e b lo q u e o . L a s m u e s tra s s e in c u b a ro n d u ra n te 1 h a 37 °C , s e la v a ro n c u a tro v e c e s , s e in c u b a ro n c o n a n t ic u e rp o a n t ip 2 m c o n ju g a d o c o n H R P 2 p g /m l d u ra n te 1 h a 37 °C , s e la v a ro n d e n u e v o y s e re v e la ro n c o n s o lu c ió n d e T M B q u e se d e tu v o co n N H 2S O 4. L a a b s o rc ió n s e m id ió a 450 nm .
L o s p é p tid o s c a n d id a to s q u e p re s e n ta n un re n d im ie n to d e in te rc a m b io e le v a d o (p re fe r ib le m e n te s u p e r io r a l 50 % y m á s p re fe r ib le m e n te s u p e r io r a l 75 % ) s e p re f ie re n en g e n e ra l p a ra la g e n e ra c ió n y la p ro d u c c ió n d e a n t ic u e rp o s o d e fra g m e n to s d e lo s m is m o s , y /o re c e p to re s d e lin fo c ito s T o d e f ra g m e n to s fu n c io n a le s d e lo s m is m o s , y a q u e m u e s tra n la s u f ic ie n te a v id e z h a c ia la s m o lé c u la s M H C y e v ita n la d is o c ia c ió n d e lo s c o m p le jo s M H C .
L a s p u n tu a c io n e s d e u n ió n a M H C d e c la s e d e lo s p é p tid o s a n a liz a d o s fu e ro n : < 20 % = ; 20 % a l 49 % = + ; 50 % al 75 % = ; > 75 % =
Figure imgf000069_0002
Ejemplo 6
E n s a y o s d e u n ió n a M H C - M H C d e c la s e II
L a s p ro te ín a s H L A d e c la s e II s e d iv id e n en tre s is o t ip o s p r in c ip a le s , H L A -D R , D P y D Q , lo s c u a le s s o n c o d if ic a d o s p o r n u m e ro s o s h a p lo tip o s . La c o m b in a c ió n d e v a r ia s c a d e n a s a y p in c re m e n ta la d iv e rs id a d d e la s p ro te ín a s H L A d e c la s e II q u e s e h a lla en u n a p o b la c ió n a rb itra r ia . A s í p u e s , lo s T U M A P re s tr in g id o s a H L A d e c la s e II e le g id o s t ie n e n q u e s e r c a p a c e s d e u n irs e a v a r ia s m o lé c u la s H L A -D R d is t in ta s (e s d e c ir , m o s tra r u n a c a p a c id a d d e u n ió n p ro m is c u a ) c o n e l f in d e c o n tr ib u ir a g e n e ra r u n a re s p u e s ta d e lo s lin fo c ito s T e fe c t iv a en un p o rc e n ta je s u s ta n c ia l d e p a c ie n te s .
L a u n ió n p ro m is c u a d e G A L N T 7 -001 y d e E R G IC 1 -001 a d iv e rs o s h a p lo t ip o s H L A -D R y la e s ta b il id a d d e lo s c o m p le jo s fo rm a d o s s e e v a lu ó en un e n s a y o d e u n ió n in vitro.
L o s p é p tid o s a n a liz a d o s fu e ro n :
Figure imgf000069_0001
L o s s ie te h a p lo t ip o s H L A -D R in v e s t ig a d o s s e h a n s e le c c io n a d o en v ir tu d d e s u s fre c u e n c ia s en p o b la c io n e s n o r te a m e r ic a n a s q u e s o n H L A -A * 02 - y H L A -A * 24 - p o s it iv a s . L o s d a to s d e r iv a n d e l a n á lis is d e 1 ,35 m illo n e s d e v o lu n ta r io s c u y o h La s e h a b ía t ip a d o y q u e e s ta b a n re g is tra d o s en e l P ro g ra m a n a c io n a l d e d o n a n te s d e m é d u la (M o r i M , B e a tty P G , G ra v e s M , B o u c h e r K M , M ilfo rd E L (1997 ). H L A g e n e a n d h a p lo ty p e fre q u e n c ie s in th e N o rth A m e r ic a n p o p u la t io n : th e N a tio n a l M a r ro w D o n o r P ro g ra m D o n o r R e g is try . T ra n s p la n ta t io n 64 , 1017 -1027 ). L a p o b la c ió n a n a liz a d a s e d iv id ía en lo s s ig u ie n te s g ru p o s é tn ic o s : n o r te a m e r ic a n o s d e a s c e n d e n c ia e u ro p e a (N = 997.193 ), a f ro a m e r ic a n o s (N = 110.057 ) , n o r te a m e r ic a n o s d e a s c e n d e n c ia a s iá t ic a (N = 81.139 ) , la t in o a m e r ic a n o s (N = 100.128 ) y a m e r in d io s (N = 19.203 ).
C o n el e n s a y o d e u n ió n M H C -p é p t id o s e d e te rm in ó la c a p a c id a d d e c a d a p é p tid o c a n d id a to p a ra u n irs e a l h a p lo tip o H L A d e c la s e II e s c o g id o y d e e s ta b i l iz a r e l c o m p le jo H L A -p é p tid o . C o n e s e p ro p ó s ito , lo s p é p tid o s c a n d id a to s se e n s a m b la ro n in vitro a u n a p ro te ín a H L A d e c la s e II c o n c re ta .

Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. U n p é p tid o d e e n tre 9 y 30 a m in o á c id o s d e lo n g itu d , e l c u a l c o m p re n d e u n a s e c u e n c ia d e a m in o á c id o s K L Q E Q L A Q L a c o rd e c o n la S E Q ID N .° 266 , o u n a sa l fa rm a c é u t ic a m e n te a c e p ta b le d e l m is m o .
2. El p é p tid o a c o rd e c o n la re iv in d ic a c ió n 1, en q u e d ic h o p é p tid o e s m o d if ic a d o y /o in c lu y e e n la c e s n o p e p tíd ic o s .
3. R e c e p to r d e lin fo c ito T q u e re a c c io n a co n un lig a n d o H L A p ro v is to d e u n a id e n t id a d d e a l m e n o s e l 80 % c o n u n a s e c u e n c ia d e a m in o á c id o s a c o rd e c o n la S E Q ID N .° 266.
4. P ro te ín a d e fu s ió n , q u e c o m p re n d e u n a s e c u e n c ia d e a m in o á c id o s a c o rd e c o n la re iv in d ic a c ió n 1 fu s io n a d a c o n lo s a m in o á c id o s 1 -80 d e l e x tre m o N - te rm in a l d e la c a d e n a in v a r ia b le a s o c ia d a a l a n tíg e n o H L A -D R ( li) o fu s io n a d a o in te g ra d a en la s e c u e n c ia d e un a n t ic u e rp o , c o m o , p o r e je m p lo , un a n t ic u e rp o q u e s e a e s p e c íf ic o p a ra la s c é lu la s d e n d r í t ic a s .
5. A n t ic u e rp o q u e s e u n e e s p e c íf ic a m e n te a u n a m o lé c u la d e l c o m p le jo m a y o r d e h is to c o m p a t ib il id a d (M H C ) h u m a n o d e c la s e I q u e e s tá fo rm a n d o un c o m p le jo c o n e l p é p tid o a c o rd e c o n la re iv in d ic a c ió n 1 o 2.
6. Á c id o n u c le ic o , q u e c o d if ic a e l p é p tid o a c o rd e c o n la re iv in d ic a c ió n 1 o 2, e l re c e p to r d e lin fo c ito T c o n fo rm e a la re iv in d ic a c ió n 3, la p ro te ín a d e fu s ió n a c o rd e c o n la re iv in d ic a c ió n 4, o e l a n t ic u e rp o a c o rd e c o n la re iv in d ic a c ió n 5.
7. V e c to r d e e x p re s ió n q u e e x p re s a un á c id o n u c le ic o a c o rd e c o n la re iv in d ic a c ió n 6.
8. C é lu la h o s p e d a d o ra q u e c o m p re n d e el á c id o n u c le ic o a c o rd e c o n la re iv in d ic a c ió n 6 o e l v e c to r d e e x p re s ió n a c o rd e c o n la re iv in d ic a c ió n 7, en q u e d ic h a c é lu la h o s p e d a d o ra p re fe r ib le m e n te e s u n a c é lu la p re s e n ta d o ra d e a n tíg e n o , p o r e je m p lo u n a c é lu la d e n d r ít ic a .
9. M é to d o p a ra p ro d u c ir e l p é p tid o a c o rd e c o n la re iv in d ic a c ió n 1 o 2, e l re c e p to r d e lin fo c ito T a c o rd e c o n la re iv in d ic a c ió n 3, la p ro te ín a d e fu s ió n a c o rd e c o n la re iv in d ic a c ió n 4, o e l a n t ic u e rp o a c o rd e c o n la re iv in d ic a c ió n 5, en q u e d ic h o m é to d o c o m p re n d e el c u lt iv o d e la c é lu la h o s p e d a d o ra a c o rd e co n la re iv in d ic a c ió n 8, y e l a is la m ie n to d e d ic h o p é p tid o , d ic h o re c e p to r d e lin fo c ito T, o d ic h a p ro te ín a d e fu s ió n o d ic h o a n t ic u e rp o a p a r t ir d e d ic h a c é lu la h o s p e d a d o ra y /o d e su m e d io d e c u lt iv o .
10. M é to d o in v itro p a ra p ro d u c ir l in fo c ito s T c ito tó x ic o s (C T L ) a c t iv a d o s , c o m p re n d ie n d o e l m é to d o la p u e s ta en c o n ta c to en c o n d ic io n e s in v itro d e C T L co n m o lé c u la s M H C d e c la s e I h u m a n a s c a rg a d a s c o n a n tíg e n o e x p re s a d a s en la s u p e r f ic ie d e u n a c é lu la p re s e n ta d o ra d e a n tíg e n o a d e c u a d a d u ra n te e l t ie m p o s u f ic ie n te p a ra a c t iv a r d ic h o s C T L d e u n a m a n e ra e s p e c íf ic a d e a n tíg e n o , s ie n d o d ic h o a n tíg e n o un p é p tid o a c o rd e c o n la re iv in d ic a c ió n 1 o 2.
11. L in fo c ito T c ito tó x ic o (C T L ) a c t iv a d o , p ro d u c id o m e d ia n te e l m é to d o a c o rd e c o n la re iv in d ic a c ió n 10, y e s p e c íf ic o p a ra e l p é p tid o d e la re iv in d ic a c ió n 1 o 2.
12. C o m p o s ic ió n fa rm a c é u tic a , q u e c o m p re n d e el p é p tid o a c o rd e c o n la re iv in d ic a c ió n 1 o 2, e l re c e p to r d e lin fo c ito T a c o rd e c o n la re iv in d ic a c ió n 3, la p ro te ín a d e fu s ió n a c o rd e c o n la re iv in d ic a c ió n 4, e l a n t ic u e rp o a c o rd e co n la re iv in d ic a c ió n 5, e l á c id o n u c le ic o a c o rd e c o n la re iv in d ic a c ió n 6, o e l v e c to r d e e x p re s ió n a c o rd e c o n la re iv in d ic a c ió n 7, la c é lu la h o s p e d a d o ra a c o rd e c o n la re iv in d ic a c ió n 8, o e l lin fo c ito T c ito tó x ic o a c t iv a d o a c o rd e c o n la re iv in d ic a c ió n 11, y un v e h íc u lo fa rm a c é u t ic a m e n te a c e p ta b le , en q u e d ic h a c o m p o s ic ió n fa rm a c é u tic a e s p re fe re n te m e n te u n a v a c u n a .
13. E l p é p tid o a c o rd e c o n la re iv in d ic a c ió n 1 o 2, e l re c e p to r d e lin fo c ito T a c o rd e c o n la re iv in d ic a c ió n 3, la p ro te ín a d e fu s ió n a c o rd e c o n la re iv in d ic a c ió n 4 , e l a n t ic u e rp o a c o rd e c o n la re iv in d ic a c ió n 5, e l á c id o n u c le ic o a c o rd e c o n la re iv in d ic a c ió n 6 , e l v e c to r d e e x p re s ió n a c o rd e c o n la re iv in d ic a c ió n 7, la c é lu la h o s p e d a d o ra a c o rd e c o n la re iv in d ic a c ió n 8, e l lin fo c ito T c ito tó x ic o a c t iv a d o a c o rd e c o n la re iv in d ic a c ió n 11 o la c o m p o s ic ió n fa rm a c é u t ic a a c o rd e c o n la re iv in d ic a c ió n 12 d e s t in a d o s a l u s o en m e d ic in a .
14. E l p é p tid o a c o rd e c o n la re iv in d ic a c ió n 1 o 2, e l re c e p to r d e lin fo c ito T a c o rd e c o n la re iv in d ic a c ió n 3, la p ro te ín a d e fu s ió n a c o rd e c o n la re iv in d ic a c ió n 4 , e l a n t ic u e rp o a c o rd e c o n la re iv in d ic a c ió n 5, e l á c id o n u c le ic o a c o rd e c o n la re iv in d ic a c ió n 6 , e l v e c to r d e e x p re s ió n a c o rd e c o n la re iv in d ic a c ió n 7, la c é lu la h o s p e d a d o ra a c o rd e c o n la re iv in d ic a c ió n 8, e l lin fo c ito T c ito tó x ic o a c t iv a d o a c o rd e c o n la re iv in d ic a c ió n 11 o la c o m p o s ic ió n fa rm a c é u t ic a a c o rd e c o n la re iv in d ic a c ió n 12 d e s t in a d o s a l u s o en e l t ra ta m ie n to de l c á n c e r.
15. E l u so a c o rd e c o n la re iv in d ic a c ió n 14, en q u e d ic h o c á n c e r e s le u c e m ia m ie ló g e n a a g u d a y /o le u c e m ia lin fá t ic a c ró n ic a , c á n c e r h e p á t ic o o c á n c e r d e co lo n .
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