ES2342506T3 - Novedosas formulaciones para vacunas de peptidos asociados a tumores, unidos a moleculas del antigeno de leucocito humano (hla) de clase i o ii. - Google Patents

Novedosas formulaciones para vacunas de peptidos asociados a tumores, unidos a moleculas del antigeno de leucocito humano (hla) de clase i o ii. Download PDF

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Abstract

La composición farmacéutica que comprende, al menos, dos péptidos, donde los péptidos comprenden un aminoácido seleccionado del grupo constituido por las secuencias SEQ ID n.º 1 a SEQ ID n.º 11, siempre que la composición comprenda, al menos, un péptido que comprenda las secuencias SEQ ID n.º 1 o SEQ ID n.º 2 o una variante de las mismas y siempre que el péptido no sea el polipéptido humano completo asociado a tumor, y que comprende, además, manitol y Poloxámero 188, donde el ratio por peso de los péptidos, el manitol y el Poloxámero 188 se encuentra en un rango de entre 1:5:1,5 y 1:8:2,2.

Description

Novedosas formulaciones para vacunas de péptidos asociados a tumores, unidos a moléculas del antígeno de leucocito humano (HLA) de clase I o II.
La presente invención se refiere a novedosas formulaciones de péptidos asociados a tumores unidos a moléculas del antígeno de leucocito humano (HLA) de clase I o II, como vacunas para su uso con procedimientos inmunoterapéuticos. En concreto, la presente invención se refiere a formulaciones para la inmunoterapia del cáncer y, en particular, del cáncer renal. Además, la presente invención se refiere a compuestos de vacunas que provocan respuestas inmunológicas antitumorales.
Para cumplir con los objetivos de la presente invención, todas las referencias aquí citadas se incorporan íntegramente.
Antecedentes de la invención
En el documento WO 2007/028573 se describe una composición, constituida por péptidos en forma de polvo para ser inyectado, y un diluyente, constituido por hidrogenocarbonato de sodio. Pero esta formulación tiene varias desventajas. La mayor desventaja consiste en su escasa solubilidad, lo que hace que su aplicación sea muy difícil para cualquier uso, como el uso clínico.
Con el fin de disolver el polvo de la composición, el vial y el diluyente deben agitarse enérgicamente durante tres minutos, someterse a una homogeneización ultrasónica durante un minuto y agitarse de nuevo durante un minuto más. No todos los médicos del mundo pueden aplicar este tratamiento, ya que es posible que carezcan del equipo necesario, y es posible que la mezcla archivada no sea homogénea.
Otro problema relacionado con esta composición es el hecho de que, teniendo en cuenta la velocidad de disolución de los ingredientes activos con hidrogenocarbonato de sodio en determinadas concentraciones, la solución resultante sólo puede ser utilizada durante unos 30 minutos.
Además, algunas características de la formulación mencionada cambian con el paso del tiempo, lo que hace casi imposible un uso seguro de la misma. Tras almacenar la formulación descrita durante 12 meses a temperaturas de entre -20ºC y +25ºC, no se pudo obtener una solución clara, incluso después de utilizar un homogeneizador ultrasónicos durante varios minutos.
Por lo tanto, todavía existe la necesidad de una formulación novedosa con solubilidad mejorada y humidificación mejorada del liofilizado. La presente invención cubre dicha necesidad.
Resumen de la invención
La presente invención proporciona una composición farmacéutica que comprende, al menos, dos péptidos, donde los péptidos comprenden un aminoácido seleccionado del grupo constituido por las secuencias SEQ ID n.º 1 a SEQ ID n.º 11, siempre que la composición comprenda, al menos, un péptido que comprenda las secuencias SEQ ID n.º 1 o SEQ ID nº 2 o una variante de las mismas y siempre que el mencionado péptido no sea el correspondiente polipéptido humano completo asociado a tumor; y que comprende, además, manitol y Poloxámero 188, donde el ratio por peso de los péptidos, el manitol y el Poloxámero 188 se encuentra entre 1:5:1,5 y 1:8:2,2.
En una forma de realización preferida de la composición farmacéutica conforme a la presente invención, el ratio por peso de los péptidos, el manitol y el Poloxámero 188 se encuentra entre 1:0:2 y 1:0:2,2.
Otra forma de realización de la presente invención proporciona una composición farmacéutica que comprende, al menos, dos péptidos, donde los mencionados péptidos comprenden un aminoácido seleccionado del grupo constituido por las secuencias SEQ ID n.º 1 a SEQ ID n.º 11, siempre que la composición comprenda, al menos, un péptido que comprenda las secuencias SEQ ID n.º 1 o SEQ ID n.º 2 o una variante de la misma y siempre que el mencionado péptido no sea el correspondiente polipéptido humano completo asociado a tumor; y que comprende, además, manitol y Tween 80®, donde el ratio por peso de los péptidos, el manitol y el Tween 80® se encuentra entre 1:2:1,5 y 1:8:2,2.
Preferentemente, los péptidos de la presente invención tienen una longitud total de entre 9 y 16 aminoácidos. Los péptidos pueden incluir enlaces no peptídicos.
En otras formas de realización preferidas, las composiciones farmacéuticas comprenden péptidos consistentes en las secuencias de aminoácidos expuestas en la secuencia SEQ ID n.º 1 y/o la secuencia SEQ ID n.º 2 y, además, comprenden al menos un péptido constituido por la secuencia de aminoácidos expuesta en cualquiera de las SEQ ID n.º 3 a SEQ ID n.º 10.
En determinadas formas de realización preferidas, es posible que la composición farmacéutica comprenda, además, un péptido que comprenda la secuencia de aminoácidos expuesta en la secuencia SEQ ID n.º 11.
En otras formas de realización, es posible que la composición farmacéutica comprenda, además, un péptido constituido por la secuencia de aminoácidos expuesta en la secuencia SEQ ID n.º 11.
En determinadas formas de realización, los péptidos que aparecen en la composición son seleccionados a partir de péptidos específicos de tejido, cáncer y/o pacientes.
En otras formas de realización preferidas, la composición farmacéutica puede comprender, además, al menos un adyuvante apropiado, como un factor estimulante de colonias como el factor estimulante de colonias granulocito-macrófago (GM-CSF).
Las composiciones farmacéuticas de la invención pueden ser utilizadas como vacuna contra el cáncer. La presente descripción también abarca un kit que comprende al menos uno de los péptidos mencionados anteriormente y/o la composición farmacéutica mencionada anteriormente, bien preparados con anterioridad o bien en viales o contenedores separados para la adición en el sitio.
Breve descripción de las figuras
Figura 1: cromatograma HPLC analítica de péptidos (secuencias SEQ ID n.º 1-11) que contiene beta-naftilalanina (NAL) como estándar interno.
Figura 2: estabilidad de la formulación n.º 1 sin excipientes a +25ºC.
Figura 3: estabilidad de la formulación n.º 2 con manito y Lutrol F68® (Poloxámero 188) a +25ºC.
Figura 4: estabilidad de la formulación n.º 3 con manitol y Tween 80® a +25ºC.
Figura 5: estabilidad de la formulación n.º 4 con manitol y Tween 80® a +25ºC.
Figura 6: Estabilidad de la formulación 1 sin excipientes a +40ºC.
Figura 7: estabilidad de la formulación n.º 2 con manitol y Lutrol F68® (Poloxámero 188) a +40ºC.
Figura 8: estabilidad de la formulación n.º 3 con manitol y Tween 80® a +40ºC.
Figura 9: estabilidad de la formulación n.º 4 con manitol y Tween 80® a +40ºC.
Figura 10: efectos de los excipientes Poloxámero 188 (Lutrol F68®) y manitol en la sensibilización in vivo de linfocitos T CD8+ T. Se sacrificaron ratones inmunizados 9 días después de su inmunización, se recolectaron células del bazo, se tiñeron con tetrámero y se analizaron por citometría de flujo. El porcentaje de células positivas de tetrámeros entre todos los linfocitos T CD8+ se muestra con barras de error que muestran la desviación estándar de los promedios. Los tres grupos inmunizados mediante péptidos son significativamente distintos de los controles negativos analizados por una prueba T de Student impar de dos colas (p < 0,05). Los grupos con y sin Poloxámero (Lutrol F68®)/manitol no difieren de forma significativa (P = 0,49).
Figura 11: proceso de manufactura descrito en el ejemplo 2.
El listado de secuencias muestra péptidos (secuencias SEQ ID n.9 1 a 11) usados en formulaciones conforme a la presente invención.
Descripción detallada de la invención
La presente invención proporciona una composición farmacéutica útil como vacuna, en donde dicha composición farmacéutica comprende diversos péptidos asociados a tumores (TUMAP), además de una mezcla de manitol y Tween 80® o una mezcla de manitol y Poloxámero 188, las cuales proporcionan estabilidad y solubilidad a la mencionada composición.
El término "composición farmacéutica" al que se hace referencia aquí puede ser una formulación liofilizada que comprende péptidos, manitol y Tween 80® o los péptidos, manitol y Poloxámero 188 o puede ser una composición de líquido reconstituido. Como tal, el término "composiciones farmacéuticas" utilizados aquí también puede hacer referencia a la formulación liofilizada para indicar que la composición está presente en una forma liofilizada.
Preferentemente, los péptidos de las composiciones farmacéuticas comprenden al menos uno de los péptidos expuestos en las secuencias SEQ ID n.º 1 a 10, que se localizan y han sido identificadas en células primarias de cáncer renal. Este grupo de péptidos incluye péptidos HLA de clase I y II. Preferentemente, una composición farmacéutica de la presente invención comprende un péptido como el expuesto en las secuencias SEQ ID n.º 1 y/o SEQ ID n.º 2 y/o al menos otro péptido que comprenda las secuencias SEQ ID n.º 3-10.
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Las composiciones farmacéuticas comprenden los péptidos tanto en forma libre como en forma de sal farmacéuticamente aceptable.
Tal y como se utiliza aquí, una "sal farmacéuticamente aceptable" hace referencia a un derivado de los péptidos descritos, en donde el péptido es modificado mediante la realización de sales ácidas o básicas del agente. Por ejemplo, las sales ácidas se preparan a partir de la base libre (en las que, normalmente, la forma neutral del fármaco tiene un grupo -NH2 neutral), lo que implica una reacción con un ácido adecuado. Los ácidos adecuados para preparar sales ácidas incluyen tanto ácidos orgánicos como, por ejemplo, ácido acético, ácido propiónico, ácido glicólico, ácido pirúvico, ácido oxálico, ácido málico, ácido malónico, ácido succínico, ácido maleico, ácido fumárico, ácido tartárico, ácido cítrico, ácido benzoico, ácido cinámico, ácido mandélico, ácido mentansulfónico, p-toluensulfónico, ácido salicílico, y otros similares, así como ácidos inorgánicos como, por ejemplo, ácido clorhídrico, ácido bromhídrico, ácido sulfúrico, ácido nítrico, ácido fosfórico y otros similares. De forma inversa, las sales básicas de regiones ácidas que pueden estar presentes en un péptido se preparan usando una base farmacéuticamente aceptable como hidróxido de sodio, hidróxido de potasio, hidróxido de amonio, hidróxido de calcio, trimetilamina o similares.
En una modalidad especialmente preferida, las composiciones farmacéuticas comprenden los péptidos como sales de ácido acético (acetatos) o ácido clorhídrico (cloruros).
En una modalidad aún más preferida, las composiciones farmacéuticas comprenden la secuencia SEQ ID n.º 5 como un cloruro y todos los demás péptidos como acetatos.
Las composiciones farmacéuticas de la presente invención también pueden contener, al menos, un péptido que sirva como control positivo como marcador inmunitario para probar la eficacia de la administración intradérmica. Tal péptido ejemplar deriva del antígeno del núcleo del virus de la hepatitis B.
En una formas de realización en particular, la composición farmacéutica comprende 11 péptidos distintos, consistente cada uno de ellos en las secuencias de aminoácidos expuestas en las secuencias SEQ ID n.º 1 a 11 (véase tabla 1). Preferiblemente, cada péptido de la composición farmacéutica está presente en una cantidad de entre unos 1500 \mug a cerca de 75 \mug, preferiblemente entre unos 1000 \mug a cerca de 750 \mug y, más preferiblemente, entre unos 500 \mug a cerca de 600 \mug y, aún más preferiblemente, unos 578 \mug. Preferiblemente cada péptido es purificado mediante HPLC y cromatografía de intercambio de iones, y aparece como polvo blanco o blanco hueso.
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TABLA 1 Péptidos preferidos en las composiciones farmacéuticas de la presente invención
1
El término "péptido" es usado aquí para designar una serie de residuos de aminoácidos, conectados uno con otro, normalmente, mediante enlaces peptídicos entre los grupos alfa-amino y carbonilo de los aminoácidos adyacentes. Normalmente, los péptidos tienen una longitud de 9 aminoácidos, pero puede llegar a tener entre 8 y 16 aminoácidos de longitud.
El término "oligopéptido" es usado aquí para designar una serie de residuos de aminoácidos, conectados uno con otro, normalmente, mediante enlaces peptídicos entre los grupos alfa-amino y carbonilo de los aminoácidos adyacentes. La longitud del oligopéptido no es crítica para la presente invención, siempre que se mantengan en la misma el/los epítopo(s) adecuados. Los oligopéptidos suelen ser de longitud menor de unos 30 residuos de aminoácidos, y mayor de unos 14 aminoácidos.
El término "polipéptido" designa una serie de residuos de aminoácidos, conectados uno con otro, normalmente, mediante enlaces peptídicos entre los grupos alfa-amino y carbonilo de los aminoácidos adyacentes. La longitud del polipéptido no es crítica para la presente invención, siempre que se mantengan en la misma los epítopos adecuados. En comparación con los términos "péptido" y "oligopéptido", el término polipéptido hace referencia a moléculas de proteínas de longitud mayor a unos 30 residuos.
Un péptido, oligopéptido, proteína o polinucleótido que codifica dicha molécula es "inmunógeno" (y, por tanto, un "inmunogen" en la presente invención) si es capaz de inducir una respuesta inmune. En el caso de la presente invención, la inmunogenicidad se define más específicamente como la habilidad para inducir una repuesta mediada por CTL. Por lo tanto, un "inmunogen" sería una molécula capaz de inducir una respuesta inmune y, en el caso de la presente invención, una molécula capaz de inducir una respuesta de CTL.
Un epítopo de linfocito T es una molécula corta de péptidos que se une a una molécula MHC de clase I o II y que es posteriormente reconocida por un linfocito T citotóxico. Los epítopos de linfocitos T que se unen a moléculas MHC de clase I suelen tener una longitud de 8 a 14 aminoácidos y, con mayor frecuencia, de 9 aminoácidos. Los epítopos de linfocitos T que se unen a moléculas MHC de clase II suelen tener una longitud de 12 a 30 aminoácidos. En el caso de los epítopos que se unen a moléculas MHC de clase II, el mismo epítopo de linfocito T puede compartir un segmento central común pero diferir en la longitud de las secuencias laterales carboxi- y aminoterminal, debido al hecho de que los extremos de la molécula peptídica no se alojan en la estructura de la hendidura de unión peptídica de la molécula MHC de clase II, ya que se encuentran en la hendidura de unión peptídica de la molécula MHC de clase I.
Existen tres locus genéticos diferentes que codifican moléculas MHC de clase I: HLA-A, HLA-B y HLA-C. HLA-AI, HLA-A2 y HLA-AII son ejemplos de distintas moléculas MHC de clase I que se pueden expresar desde estos locus.
Tal y como se utilizan aquí, los términos "porción", "segmento" y "fragmento", cuando son utilizados en relación a los polipéptidos, hacen referencia a una secuencia continua de residuos, como residuos de aminoácidos, que forma un subconjunto de una secuencia más larga. Por ejemplo, si un polipéptido fuera tratado con cualquiera de las endopeptidasas habituales, como tripsina o quimiotripsina, los oligopéptidos resultantes de dicho tratamiento representarían porciones, segmentos o fragmentos del polipéptido inicial. Esto significa que cualquier fragmento de ese tipo contendrá necesariamente, como parte de su secuencia de aminoácidos, un segmento, fragmento o porción substancialmente idéntico, si no exactamente idéntica, a una secuencia de SEQ ID n.º 1 a 10, que corresponde a las proteínas naturales, o "madre", de las secuencias SEQ ID n.º 1 a 10. Cuando son utilizados en relación a los polinucleótidos, dichos términos hacen referencia a los productos generados por tratamiento de los mencionados polinucleótidos con cualquiera de las endonucleasas habituales.
En conformidad con la presente invención, el término "identidad porcentual" o "idéntico porcentualmente", cuando hace referencia a una secuencia, significa que una secuencia es comparada con una secuencia reivindicada o descrita tras la alineación de la secuencia que se desea comparar ("secuencia comparada") con la secuencia descrita o reivindicada ("secuencia de referencia"). La identidad porcentual se determina entonces conforme a la siguiente
fórmula:
Identidad porcentual 100 [I -(C/R)]
donde C es el número de diferencias entre la secuencia de referencia y la secuencia comparada a lo largo de la alineación entre la secuencia de referencia y la secuencia comparada, en donde
(i) cada base o aminoácido de la secuencia de referencia que no tiene su base o aminoácido alineado correspondiente en la secuencia comparada, y
(ii) cada gap en la secuencia de referencia, y
(iii) cada base o aminoácido alineado de la secuencia de referencia que es distinto a la base o aminoácido alineado correspondiente de la secuencia comparada, supone una diferencia;
y R es el número de bases o aminoácidos en la secuencia de referencia a lo largo del alineamiento con la secuencia comparada, en donde cualquier gap creado en la secuencia de referencia es considerado una base o aminoácido.
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Si existe un alineamiento entre la secuencia comparada y la secuencia de referencia para el que la identidad porcentual calculada como se ha descrito es prácticamente igual o mayor que una identidad porcentual mínima especificada, entonces la secuencia comparada tiene la identidad porcentual mínima especificada con respecto a la secuencia de referencia aunque existan alineamientos en los que la identidad porcentual calculada sea menor que la identidad porcentual especificada.
Los péptidos de las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden ser modificados mediante la sustitución de uno o más residuos en sitios distintos, posiblemente selectivos, en la cadena peptídica. Tales sustituciones pueden ser de naturaleza conservadora como, por ejemplo, si un aminoácido es sustituido por un aminoácido de estructura y características similares, como en el caso en el que un aminoácido hidrofóbico es sustituido por otro aminoácido hidrofóbico. La sustitución es aún más conservadora si se hace con aminoácidos de igual o similar tamaño y naturaleza química, como, por ejemplo, si se sustituye la leucina por isoleucina. En estudios sobre variaciones de secuencias en familias de proteínas homólogas naturales, determinadas sustituciones de aminoácidos son toleradas con más frecuencia que otras, y suelen mostrar una correlación con similitudes en el tamaño, la carga, la polaridad y la hidrofobicidad entre los aminoácidos originales y sus sustitutos, lo cual constituye la base para definir las "sustituciones conservadoras".
Las sustituciones conservadoras se definen aquí como intercambios que forman parte de uno de estos cinco grupos: Grupo 1 - - residuos, pequeños, alifáticos, no polares o ligeramente polares (Ala, Ser, Thr, Pro, Gly); Grupo 2 - - residuos polares, cargados negativamente y sus amidas (Asp, Asn, Glu, Gln); Grupo 3 - - residuos polares, cargados positivamente (His, Arg, Lys); Grupo 4 - - residuos grandes, alifáticos, no polares (Met, Leu, lie, Val, Cys); y Grupo
5 - - residuos grandes, aromáticos (Phe, Tyr, Trp).
Las sustituciones menos conservadoras pueden implicar la sustitución de un aminoácido por otro que tiene características similares pero que, de alguna manera, es distinto en tamaño, como, por ejemplo, la sustitución de alanina por un residuo de isoleucina. Las sustituciones altamente no conservadoras pueden implicar la sustitución de un aminoácido acídico por uno polar o, incluso, por uno de carácter básico. Estas sustituciones "radicales" no pueden descartarse, sin embargo, como potencialmente inefectivas, ya que los efectos químicos no son completamente predecibles y las sustituciones radicales podrían dar lugar a efectos desconocidos, imposibles de predecir a partir de principios químicos simples.
Tales sustituciones pueden implicar, evidentemente, otras estructuras además de los habituales aminoácidos L. Por lo tanto, los aminoácidos D podrían ser sustituidos por aminoácidos L, que a menudo se encuentran en los péptidos antigénicos de la invención, y seguir englobados por la descripción aquí contenida. Además, los aminoácidos que procesan grupos R no estándar (es decir, grupos R distintos de los que se encuentran en los 20 aminoácidos habituales de las proteínas naturales) también pueden ser utilizados para sustituciones, con el fin de generar inmunogenes y polipéptidos inmunógenos conformes a la presente invención.
Si las sustituciones en más de una posición ocurren en un péptido con una actividad antigénica sustancialmente equivalente o mayor que la definida más abajo, entonces se probarán las combinaciones de dichas sustituciones para determinar si las sustituciones combinadas dan como resultado efectos aditivos o sinérgicos en la antigenicidad del péptido. Como máximo, se sustituirán simultáneamente cuatro posiciones en el péptido.
Preferentemente, cuando los CTL específicos de un péptido de las secuencias SEQ ID n.º 1 a 10 se analizan en comparación con los péptidos sustituidos, la concentración de péptidos en la que los péptidos sustituidos alcanzan la mitad del aumento máximo en lisis en relación con el fondo no es mayor de 1 mM; preferentemente, no mayor de alrededor de 1 \muM; más preferentemente, no mayor de alrededor de 1 nM; y, aún más preferentemente, no mayor de alrededor de 100 pM; y, con mayor preferencia, no mayor de alrededor de 10 pM. También se prefiere que el péptido sustituido sea reconocido por CTL de más de un individuo, al menos dos y, de preferencia, tres individuos.
La mucina-1 (MUC1) es una glucoproteína transmembrana de tipo I altamente glicosilada que está abundantemente sobreexpresada en la superficie celular de numerosos adenocarcinomas humanos como los cánceres de mama y de ovario. La deglicosilación aberrante en malignidades es común y desenmascara epítopos en células tumorales que podrían no presentarse en células normales. Además, la expresión de la MUC1 se ha demostrado en el mieloma múltiple y en algunos linfomas no hodgkinianos de linfocitos B. Diversos informes recientes (Apostolopoulos V and McKenzie IF. Cellular mucins: targets for immunotherapy. Crit Rev. Immunol. 14:293-309 (1994); Finn OJ, Jerome KR, Henderson RA, PecherG, Domenech N, Magarian-Blander J, and Barratt-Boyes SM. MUC-1 epithelial tumor mucin-based immunity and cáncer vaccines. Immunol. Rev. 145:61-89 (1995); Barnd 1989; Takahashi 1994; Noto 1997) han demostrado que los linfocitos T MHC no restringidos de MHC citotóxicos de tumores ováricos, mamarios, pancreáticos y mielomas múltiples pueden reconocer epítopos del centro proteico MUC1 localizado en la repetición en tándem. Dos epítopos de linfocitos T restringidos de HLA-A2 derivados de la proteína MUC1 se han identificado (Brossart 1999, EP 1484397). Un péptido deriva de la región de la repetición en tándem de la proteína MUC1. El segundo péptido se localiza dentro de la secuencia de señal de MUC1. La inducción de respuestas de linfocitos T citotóxicos in vivo tras realizar vacunaciones con células dendríticas sensibilizadas de forma reiterada con el péptido en pacientes con cáncer avanzado de mama y ovario mediante esos péptidos se ha realizado con éxito (Brossart 2000) (Wierecky 2005). Con respecto al carcinoma de células renales, la expresión de MUC1 es común en tumores convencionales y se ha informado que están asociados con el grado y etapa. Con MUC1, la sobreexpresión proteínica no está relacionada con la sobreexpresión de ARNm.
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La adipofilina es un marcador para las células diferenciadas especializadas que contengan gotas de lípidos y para enfermedades asociadas a células que acumulen grasa (Heid 1998). La adipofilina tiene lugar en una amplia gama de líneas celulares cultivadas, incluyendo fibroblastos y células epiteliales y endoteliales. En los tejidos, sin embargo, la expresión de la adipofilina está restringida a determinados tipos de células, como a las células epiteliales mamarias lactantes, células Sertoli y Leydig del sistema reproductor masculino y esteatosis o hepatocitos de modificación grasa en cirrosis alcohólica de hígado (Heid 1998). Se ha informado que la adipofilina está sobreexpresada en el cáncer colorectal (Saha 2001), el carcinoma hepatocelular (Kurokawa 2004) y en el carcinoma de células renales (RCC) (Young 2001).
c-Met codifica un receptor transmembranoso heterodimérico con actividad de tirosina-quinasa que está compuesta de una cadena alfa unida por disulfuro a una subunidad beta (Bottaro 1991; Rubin 1993). Ambas subunidades se expresan en la superficie, la subunidad beta pesada es responsable de la unión del ligando, la subunidad beta pesada es responsable de la unión del ligando, factor de crecimiento de hepatocito (HGF), la subunidad alfa contiene un dominio intracelular que media en la activación de distintas vías de transducción de señal. La señalización de c-Met participa en la regeneración de órganos, como se ha demostrado con el hígado y el hígado, la embriogénesis, la hematopoyesis, el desarrollo muscular y en la regulación de la migración y adhesión de monocitos y linfocitos B activados normalmente (Zarnegar 1995; Naldini 1991; Montesano 1998; Schmidt 1995; Uehara 1995; Bladt 1995; Takayama 1996; Mizuno 1993; van, V 1997; Beilmann 2000) Además, numerosos estudios han indicado la participación de la sobreexpresión de c-Met en la transformación maligna y en la capacidad de invasión de las células malignas.
c-Met media en las actividades potencialmente oncogénicas y multifuncionales del HGF/factor esparcido, incluyendo la promoción del crecimiento celular, motilidad, supervivencia, disolución de matriz extracelular y angiogénesis (Bottaro 1991; Rubin 1993; Zarnegar 1995). La unión del HGF al receptor induce la autofosforilación de c-Met y activa los eventos de señalización en dirección 3', incluyendo las vías relacionadas con proteínas quinasas mitógeno activadas, fosfolipasas Cy, fosfatidilinositol 3-quinasa y ras. El gen c-Met se expresa predominantemente en células epiteliales y se encuentra sobreexpresado en varias líneas celulares y tejidos malignos. Un número cada vez mayor de informes ha mostrado que las células no epiteliales como las esqueléticas, neurales y hematopoyéticas responden a malignidades hematológicas y HGF como el mieloma múltiple, la enfermedad de Hodgkin, la leucemia y el linfoma expresa la proteína c-Met. El control desregulado del fenotipo de crecimiento invasivo por c-Met activado oncógenamente provocado por mutaciones de activación de c-Met, amplificación/sobreexpresión de c-Met, y adquisición de asas autocrinas de c-Met/HGF confiere propiedades invasivas y metastáticas a las células malignas. Cabe destacar que la activación constitutiva del c-Met en ratones transgénicos con sobreexpresión de HGF promueve la génesis de tumores (Wang 2001; Takayama 1997).
El regulador de la proteína G señalizadora 5 (RGS5) es un regulador negativo de las vías de señalización de la proteína G heterotrimérica, aunque su función in vivo todavía no se conoce. Las proteínas RGS comprenden una familia de moléculas con una misma función catalítica pero con una distribución del tejido que varía. Estimulan la actividad intrínseca de guanosina trifosfatasa (GTPase) de subunidades G\alpha activadas y, así, aceleran la inactivación de la proteína G. De esta forma, las moléculas RGS inhiben la dirección 3' de señalización de receptores acoplados a la proteína G (De 2000). Recientemente, se ha demostrado que la inducción del regulador de proteína G señalizadora 5 en pericitos coincide con la remodelación activa de los vasos durante la neovascularización del tumor. En un modelo de ratón de carcinogénesis de células del islote pancreático, así como en astrocitomas altamente angiogénicos, se ha demostrado la sobreexpresión del RGS5 en pericitos durante el cambio angiogénico que acompaña la remodelación activa de los vasos. La sobreexpresión estaba restringida a la vasculatura del tumor, en comparación con un islote de Langerhans normal. Sin embargo, también se da una regulación hacia arriba del RGS5 durante la curación de heridas y la ovulación (Berger 2005).
La expresión del RGS5 también aumenta en el RCC (Rae 2000). En otro estudio, el RT-PCR mostró una fuerte expresión del RGS5 en todos los RCC examinados, mientras que era muy débil o inexistente en los riñones normales (6.6:1 por PCR en tiempo real). Las células endoteliales del tumor fueron la ubicación principal del RGS5 en el RCC (Furuya 2004). Además, se ha informado que el RGS5 es una marcador celular endotelial sinusoidal en el carcinoma hepatocelular (Chen 2004).
La apolipoproteína L1 (APOL1) es una lipoproteína de alta densidad que se une a la apolipoproteína A-I. La apolipoproteína A-I es una proteína de plasma relativamente abundante y la principal apoproteína de las HDL. Participa en la formación de la mayoría de los ésteres de colesterol en el plasma y promueve la salida del colesterol de las células. Es posible que la apolipoproteína L1 tenga una función en el transporte e intercambio de lípidos en el organismo, así como en el transporte de colesterol inverso desde las células periféricas al hígado. La proteína de plasma es un polipéptido de cadena única con una masa molecular aparente de unos 40 kDa (Duchateau 1997; Duchateau 2001). El ADNc de la APOL1 se aisló de la genoteca de ADNc de la célula endotelial activada, mostrando una regulación hacia arriba por el TNF-\alpha, que es una potente citoquina inflamatoria. (Monajemi 2002).
KIAA0367 se identificó en el proyecto de ADNc Kazusa, creado para identificar largos transcritos humanos desconocidos que codifican supuestas proteínas (Ohara 1997). Aunque la función del producto proteico largo del supuesto aminoácido 820 de KIAA0367 se desconoce, contiene un lípido CRAL-TRIO que une el dominio en el C-terminal que une pequeñas moléculas hidrofóbicas y que está presente en varios factores de intercambio de nucleótidos y en el BCL2/adenovirus E1B 19 kDa proteína-proteína de interacción 2 (BNIP-2). BNIP-2 participa en el control de diversas funciones celulares incluyendo la morfología, migración y endocitosis celular y la evolución del ciclo celular (Zhou 2005). KIAA0367 se encuentra en la región cromosómica 9q21. Esta región se describe en muchos tumores como una diana común en la deleción homoclgótica (Gursky 2001; Weber 2001) o pérdida heterocigótica (Louhelainen 2000; Tripathi 2003).
La guanilato ciclasa soluble (sGC), proteína heterodimérica constituida por una subunidad alfa y otra beta (1 grupo hemo), cataliza la conversión de GTP al segundo mensajero cGMP y actúa como el receptor principal de medicamentos nitrovasodilatadores y de óxido nítrico. GUCYa3 y b3 están sobreexpresados en los gliomas humanos. La transfección de GUCY1A3 o GUCY1B3 antisentido redujo la vascularización y el crecimiento del tumor en ratones desnudos. Esto podría deberse a que VEGF es inducido por cGMP (Saino 2004). GUCY1A3 promueve la migración de células de tumor en líneas celulares de tumor mamario del ratón (Jadeski 2003).
La ciclina D1 pertenece a la familia de ciclinas de alta conservación; más específicamente, a la subfamilia de ciclina D (Xiong 1991; Lew 1991). Las ciclinas actúan como reguladores de CDK (quinasas ciclina-dependientes). Cada ciclina exhibe un modelo diferenciado de degradación y expresión que contribuye a la coordinación temporal de cada mitosis (Deshpande 2005). La ciclina D1 forma un complejo que actúa como subunidad de regulación de CDK4 o CDK6, cuya actividad es necesaria para la transición G1/S del ciclo celular. CCND1 forma, con CDK4 y CDK6, un complejo de holoenzima de serina/treonina quinasa que aporta especificidad de sustrato al complejo (Bates 1994). Se ha demostrado que la proteína interactúa con la proteína Rb supresora de tumor (Loden 2002); la expresión de este gen es regulada positivamente por Rb (Halaban 1999). Las mutaciones, la amplificación y la sobreexpresión de este gen, que altera la progresión del ciclo celular, se observan con frecuencia en una variedad de tumores y es posible que contribuyan a la génesis de tumores (Hedberg 1999; Vasef 1999; Troussard 2000).
Las proteínas de la familia de la metaloproteinasa de la matriz (MMP) participan en la ruptura de la matriz extracelular en procesos fisiológicos normales, como el desarrollo embrionario, la reproducción y la remodelación de tejido, así como en procesos patológicos como la artritis y la metástasis (Mott 2004). La metaloproteinasa 7 de la matriz (MMP7) es secretada como pro-proteína inactiva de 29,6 kDa, que se activa cuando es hendida por proteinasas extracelulares. La enzima activa tiene un peso molecular de 19,1 kDa y une dos iones de zinc y dos iones de calcio por subunidad (Miyazaki 1990; Browner 1995). MMP7 degrada gelatinas, fibronectina y caseína (Miyazaki 1990; Quantin 1989) y se diferencia de la mayoría de los miembros de la familia MMP en que carece de dominio C-terminal conservado (Gaire 1994). MMP7 se encuentra a menudo sobreexpresado en tejido maligno (Lin 2004; Bramhall 1997; Denys 2004) y se ha sugerido que facilita la invasión in vivo de células tumorales (Wang 2005).
Estas proteínas pueden ser el blanco de una respuesta inmune específica de tumor en muchos tipos de cáncer.
El péptido del antígeno del núcleo del virus de la hepatitis B HBV-001 no deriva de un antígeno humano endógeno asociado a tumor, sino del antígeno de núcleo del virus de la hepatitis B. En primer lugar, permite la comparación cuantitativa de la magnitud de las respuestas de los linfocitos T inducidos por péptidos asociados a tumores (TUMAP) utilizados en las composiciones farmacéuticas de la presente invención, y, por lo tanto, permite estudiar su habilidad para provocar respuestas anti-tumorales. En segundo lugar, actúa como importante control positivo en caso de carencia de respuestas de linfocitos T en el paciente. En tercer lugar, también permite controlar la inmunocompetencia del paciente.
La infección del virus de hepatitis B (HBV) es una de las principales causas de enfermedad de hígado, que afecta a, aproximadamente, 350 millones de personas en todo el mundo (Rehermann 2005). Debido a la facilidad de transmisión tanto horizontal como vertical y al potencial de enfermedad crónica que puede resultar en cirrosis de hígado y carcinoma hepatocelular, el HBV supone un impacto en los sistemas de salud públicos de muchos países. El genoma del HBV (Previsani 2002) comprende ADN circular parcialmente bicatenario. En viriones de HBV, aparece junto con la proteína nuclear HBc y otras proteínas para formar la nucleocápsida, rodeada de una envoltura exterior que contiene lípidos y la familia de proteínas de superficie HBs (también llamadas proteínas de envoltura). Los determinantes antigénicos asociados con HBc y HBs se indican con las siglas HVcAg y HBsAg, respectivamente. Estos antígenos están asociados a respuestas serológicas -es decir, de anticuerpos- encontradas en la sangre del paciente y se encuentran entre los sistemas antígeno-anticuerpo clínicamente más útiles para el diagnóstico de la infección por HBV. HBc representará un novedoso antígeno para los individuos sin historia previa de infección de HBV. Debido a que los péptidos inmunógenos para este antígeno se conocen bien (Bertoletti 1993; Livingston 1997), se seleccionó un péptido de diez aminoácidos de HBcAg como antígeno de control positivo dentro de IMA: La inducción de linfocitos T citotóxicos (CTL) específicos de péptidos HBc se utilizará entonces como marcador de la inmunocompetencia del paciente y para la vacunación correcta.
Las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden ser usadas para su administración parenteral como, por ejemplo, subcutánea, intradérmica, intraperitoneal, intravenosa, intramuscular o por vía oral. Para ello, los péptidos son disueltos o suspendidos en un vehículo farmacéuticamente aceptable y preferiblemente acuoso. Además, la composición también puede contener excipientes como antioxidantes, agentes de mantenimiento, soluciones reguladoras, aglutinantes, agentes blásticos, diluyentes y aromas. Los péptidos también pueden administrase junto con substancias estimulantes de la respuesta inmune, como las citocinas. Una lista completa de excipientes que pueden usarse para esta composición aparece, por ejemplo, en A. Kibbe, "Handbook of Pharmaceutical Excipiente", 3. Ed., 2000, American Pharmaceutical Association and pharmaceutical press. Las composiciones de la invención pueden usarse para la prevención, profilaxis y/o terapia de enfermedades adenomatosas o cancerosas.
Las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden ser administradas a un paciente que sufre una enfermedad adenomatosa o cancerosa asociada con el correspondiente péptido o antígeno de las secuencias SEQ ID n.º 1 a 10. Los péptidos de la composición farmacéutica son capaces de desencadenar en el paciente una respuesta inmune mediada por linfocitos T. Como se ha mencionado más arriba, una composición farmacéutica conforme a la presente invención comprende preferentemente un péptido que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la secuencia SEQ ID n.º 1 y/o SEQ ID n.º 2 y, además, comprende al menos un péptido adicional asociado a tumor que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en las secuencias SEQ ID n.º 3 a SEQ ID n.º 10.
Preferentemente, los péptidos presentes en composiciones farmacéuticas de la presente invención tienen una longitud media de entre 9 y 100 aminoácidos, preferiblemente entre 9 y 30 y, más preferiblemente, entre 9 y 16. Además, al menos un péptido conforme a cualquiera de las secuencias SEQ ID n.º 1 a SEQ ID n.º 11 puede incluir enlaces no peptídicos.
Una composición farmacéutica preferida de la invención comprende un péptido constituido por la secuencia de aminoácidos expuesta en la secuencia SEQ ID n.º 1 y/o la secuencia SEQ ID n.º 2, y, en otras modalidades, comprende, además, al menos un péptido constituido por la secuencia de aminoácidos expuesta en la secuencia SEQ ID n.º 3 a SEQ ID n.º 11.
El péptido también podrá estar etiquetado, o ser una proteína de fusión o ser una molécula híbrida. Los péptidos cuya secuencia se da en la presente invención han de estimular el linfocito T citotóxico CD8^{+}. Sin embargo, la estimulación es más eficiente con la ayuda de linfocitos T CD4^{+}. Así, las secciones de fusión de una molécula híbrida proporcionan epítopos que estimulan a los linfocitos T CD4^{+}. Estos epítopos son conocidos por los expertos en la materia e incluyen a los identificados en el toxoide tetánico. En otra modalidad, el péptido es una proteína de fusión que comprende, en particular, aminoácidos N-terminales de la cadena invariante (li) asociada al antígeno HLA-DR. En una modalidad, el péptido de la invención es una proteína humana truncada o una proteína de fusión de un fragmento proteico y otra porción de polipéptido, siempre que la porción humana incluya una o más secuencias de aminoácidos de invención.
Los péptidos útiles en la composición farmacéutica pueden ser sustancialmente puros o estar combinados con un adyuvante inmunoestimulante, o pueden ser utilizados en combinación con citocinas inmunoestimulantes o administrados con un sistema de liberación adecuado como, por ejemplo, liposomas. La vacunación con péptidos necesita, en general, de adyuvantes y, como tal, se prefiere GM-CSF (GM-CSF humano se puede adquirir como Sargramostim®, Leukine®, Berlex). Otros adyuvantes adecuados son el estimulón QS21 de Aquila (Aquila Biotech, Worcester, MA, EUA), derivado de la saponina; extractos micobacterianos y pared bacteriana mimética sintética y adyuvantes registrados como el Detox. Quil A, otro adyuvante derivado de la saponina, también puede ser usado (Superfos, Dinamarca). Otros adyuvantes, como el adyuvante de Freund, también pueden ser útiles. También puede ser útil administrar el péptido conjugado con un vehículo apropiado como la hemocianina de lapa califomiana (KLH) o el manano (véase el documento WO 95/18145 y Longenecker y col. (1993) "Ann. NY Acad. Sci". 690,276-291). Teniendo en cuenta que un adyuvante es una sustancia que potencia la respuesta inmune ante un antígeno (MedlinePlus® Medical Dictionary, NIH), pueden utilizarse otras sustancias que cumplan esta función, incluyendo agonistas del receptor Toll-Like (agonistas TLR), preferiblemente sustancias que interaccionen de forma agonista con los TLR 3, 7, 8, y 9, más preferiblemente TLR 9, como el ARN estabilizador de protamina, oligonucleótidos CpG, oligonucleótidos CpR, ADN bacteriano, imidazoquinolinas, etc.
Otras sustancias conocidas adecuadas para potenciar una respuesta inmune incluyen inhibidores de óxido nítrico sintasa inducible (iNOS), arginasa (ARG1), indolamina-2,3-dioxigenasa (IDO), receptor 1 del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGFR-1), factor de crecimiento endotelial vascular (VEGFR), ciclooxigenasa-2 (COX-2) o del receptor I del TGF beta (TGF-beta-RI). Dichos inhibidores pueden ser, por ejemplo, anticuerpos monoclonales contra las moléculas o contra moléculas pequeñas. Las moléculas pequeñas y los anticuerpos monoclonales con función inhibidora conocida hacia los factores mencionados anteriormente y, por tanto, con un efecto potenciador de la respuesta inmune, son, por ejemplo: 1-MT, NCX- 4016, rofecoxib, celebrex, BEC, ABH, nor-NOHA, SB-505124, SD-208, LY580276, AMD3100, axitinib, bevacizumab, JSI-124, CPA-7, XL-999, ZD2171, pazopanib, CP-547632 y VEGF Trap.
Además, las sustancias que reducen el número de linfocitos T reguladores (CD 4+, CD25+, FoxP3+) son adecuadas como adyuvantes. Entre estas sustancias se incluyen las siguientes: ciclofosfamida (Cytoxan), ONTAK (denileukin diftitox), Sunitinib, anti-CTLA-4 (MDX-010, CP- 675206), anti-CD25, anti-CCL22 y anti-GITR.
Las cantidades preferidas de péptidos en composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden variar entre unos 0,1 y 100 mg, preferentemente entre unos 0,1 y 1 mg y, con mayor preferencia, entre unos 300 \mug y 800 \mug por 500 \mul de solución. Con el término "unos" implicamos un porcentaje de +/-10 del valor dado, si no se establece de otra forma. El experto en la materia sabrá ajustar la cantidad real de péptido necesaria basándose en diversos factores como, por ejemplo, el estado inmunitario del paciente individual y/o la cantidad de TUMAP presentado en un tipo particular de cáncer.
Las composiciones farmacéuticas de la presente invención proporcionan una formulación con una solubilidad extremadamente mejorada y la humectación del liofilizado en composiciones ya conocidas. Esto se consiguió utilizando una composición especial de excipientes. En este sentido, se desarrollaron composiciones farmacéuticas de la presente invención que comprenden péptidos de las secuencias SEQ ID n.º 1 a 10 o SEQ ID NO: 1 a 11 y variantes de las mismas, que muestran una excelente estabilidad de almacenamiento a (-20ºC, +5ºC, +25ºC) que pueden resolubilizarse fácilmente.
El término "estabilidad de almacenamiento" significa que el porcentaje de subproductos no alcanza más del 5% en dos años. Además, el término "estabilidad" significa que las propiedades específicas como la solubilidad, la claridad óptica de la solución y el número de partículas en la solución no cambian perceptiblemente durante ese espacio de tiempo.
El término "resolubilizarse fácilmente" significa que el liofilisado puede disolverse completamente mediante el uso de un amortiguador u otros excipientes, desde unos segundos hasta dos minutos sin hacer uso de un homogeneizador ultrasónico. Además, la composición puede administrarse fácilmente a un paciente que necesite tratamiento por vía i.d, y con menor preferencia por vía s.c. El valor pH de la solución resultante deberá ser entre pH 2,7 y pH 9.
En otra modalidad, una composición farmacéutica de la presente invención puede incluir azúcares, alcoholes de azúcar, aminoácidos como la glicina, arginina, ácido glutamínico y otros como molde marco. Los azúcares pueden ser mono-, di- o trisacáridos. Estos azúcares pueden utilizarse solo así como en combinación con alcoholes de azúcar. Algunos ejemplos de azúcares incluyen glucosa, mañosa, galactosa, fructosa o sobosa, como monosacáridos; sacarosa, sucrosa, lactosa, maltosa y trehalosa como disacáridos; y rafinosa como trisacárido. Un alcohol de azúcar puede ser, por ejemplo, la manitosa. Los ingredientes preferidos son la sacarosa, la sucrosa, la lactosa, la maltosa, la trehalosa, el mannit y/o sorbit y, con mayor preferencia, el manitol.
Además, las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden incluir excipientes bien tolerados fisiológicamente (véase Handbook oí Pharmaceutical Excipients, 5^{th} ed, editado por Raymond Rowe, Paul Sheskey y Sian Owen, Pharmaceutical Press [2006]), como los antioxidantes como el ácido ascórbico o la glutationa, agentes conservadores como fenol, m-cresol, metil- o propilparabeno, clorobutanol, tiomersal o benzalconiumcloruro, estabilizador, molde marco como sacarosa, sucrosa, lactosa, maltosa, trehalosa, manitosa, mannit y/o sorbit, mannit y/o lactosa y solubilizador como polietileneglicoles (PEG), es decir, PEG 3000, 3350, 4000 o 6000, o ciclodextrinas, es decir, hidroxipropilo-\beta-ciclodextrina, sulfobutiletil-\beta-ciclodextrina o y ciclodextrina, o dextranos o poloxaómeros, es decir, poloxaómer 407®, poloxaómer 188, o Tween 20®, Tween 80®. En una modalidad preferida, las composiciones farmacéuticas de la presente invención incluyen uno o más excipientes bien tolerados, seleccionados del grupo consistente en antioxidantes, moldes marco y estabilizadores.
La presente invención hace referencia al descubrimiento de que esas formulaciones que incluyen, al menos, dos conjuntos de los péptidos conformes a las secuencias SEQ ID n.º 1 a 10 o SEQ ID n.º 1 a 11, manitol y Poloxámero 188 en una tasa determinada, llevan a composiciones que muestran una estabilidad muy mejorada y que pueden disolverse sin tratamiento ultrasónico. Además, la solvatación sólo requiere unos segundos. La característica de resolubilización de las composiciones farmacéuticas de la presente invención son reproducibles también después del almacenamiento de la sustancia farmacéutica a -20ºC, +5ºC y +25ºC durante 2 años.
En una forma de realización preferida, las composiciones farmacéuticas de la presente invención comprenden un determinado ratio de péptido:manitol:Tween 80® (por peso), en un rango de 1:2:1,5 a 1:8:2,2. Véase el gráfico más abajo para otras ratios de ejemplo, incluidas en la presente invención. Una tasa especialmente preferida es 1:5:2. Otra tasa especialmente preferida es 1:8:2.
En otra modalidad preferida, las composiciones farmacéuticas de la presente invención comprenden un determinado ratio de péptido:manitol:Poloxámero 188 (por peso), en un rango de 1:5:1,5 a 1:8:2,2. Véase el gráfico más abajo para otros ratios de ejemplo, incluidas en la presente invención. Una tasa preferida es 1:5:1.
Otro ratio especialmente preferido de péptidos:manitol:Poloxámero 188 por peso es 1:8:2. Una composición de mayor preferencia incluye una mezcla de péptido:manitol:Poloxámero 188 en una tasa de 1:5.2 por peso (véase el ejemplo 2). Otra tasa incluye péptidos:manitol:Poloxámero 188 a una tasa de 1:0:2 a 1:2:2,2 por peso.
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Otras modalidades de la presente invención incluyen las siguientes tasas por peso:
2
4 
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Las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden estar liofilizadas. El liofilizado obtenido puede ser reconstituido en una composición hidratada añadiéndose un solvente hidratado. Preferentemente, la composición hidratada se puede administrar directamente al paciente por vía parenteral. Por lo tanto, otra modalidad de la presente invención es una composición farmacéutica hidratada de las formulaciones descritas anteriormente, que se pueden obtener mediante reconstrucción del liofilizado descrito anteriormente con un solvente hidratado.
El rango de pH aceptable es pH 2-12 para la administración intravenosa e intramuscular, pero, a nivel subcutáneo, el rango se reduce a 2,7-9,0, ya que la tasa de dilución in vivo se reduce, lo que resulta en un mayor potencial de irritación en el sitio de inyección. Strickley Robert G, Pharm. Res, 21, NO:2, 201-230 (2004).
Preferentemente, la composición farmacéutica hidratada de la invención tiene un valor de pH de 7 a 9 y, con mayor preferencia, un valor pH de 8 a 9 y, con preferencia aún mayor, un valor pH de 8,3 a 8,7.
Las composiciones farmacéuticas de la presente invención son bien toleradas fisiológicamente, fáciles de producir, se dosifican con exactitud y muestran una excelente estabilidad de almacenamiento con respecto a la concentración, los productos de descomposición y los agregados del período de almacenamiento. Las preparaciones se pueden almacenar de forma estable durante 2 años en un congelador a -20ºC, en una nevera a (+2-8ºC) e incluso a temperatura ambiente (+25ºC), humedad relativa del 60%.
Preferentemente, las composiciones farmacéuticas de la presente invención son estériles y están formuladas para su administración in vivo.
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La presente descripción también proporciona un método para aumentar la respuesta inmune en un sujeto, método que comprende el uso de una composición farmacéutica de la presente invención en la que los mencionados péptidos, variantes o sales son administrados en una cantidad efectiva, preferentemente una cantidad efectiva para aumentar dicha respuesta inmune. La descripción proporciona, además, el uso de una composición farmacéutica de la invención en un medicamento para su administración a un sujeto, con el fin de provocar una respuesta inmune contra el cáncer. También se incluye el uso de una composición farmacéutica de la presente invención para el tratamiento del cáncer, preferiblemente del cáncer renal, y el uso en la fabricación de un medicamento para su administración a un sujeto, con el fin de provocar una respuesta inmune contra el cáncer y, de esta forma, tratar el cáncer.
Los péptidos utilizados en la composición farmacéutica son preferentemente puros, o esencialmente puros y, preferentemente, esencialmente homogéneos (es decir, libres de proteínas o péptidos contaminantes, etc.) "Esencialmente puros" significa una preparación peptídica con una pureza por HPLC de, al menos, el 90% y, preferiblemente, al menos 95%. Una preparación "esencialmente homogénea" significa una preparación peptídica que comprende, al menos, un 99% del péptido, en base al peso total del péptido en la preparación.
La presente descripción incluye, además, un kit que comprende:
(a)
un contenedor que contiene una composición farmacéutica como la descrita anteriormente, en solución o en forma liofilizada;
(b)
opcionalmente, un segundo contenedor con un diluyente o solución reconstituyente para la formulación liofilizada; y
(c)
opcionalmente, instrucciones para (i) el uso de la solución o (ii) reconstitución y/o uso de la formulación liofilizada.
El kit puede comprender además una unidad o más de (i) un amortiguador, (ii) un diluyente, (iii) un filtro (iv) una aguja y (v) una jeringuilla. El contenedor es, preferentemente, una botella, un vial, una jeringuilla o un tubo de pruebas; y puede ser un contenedor multiusos. Preferentemente, la composición farmacéutica está liofilizada.
Los kits de la presente descripción comprenden preferentemente una formulación liofilizada de la presente invención en un contenedor adecuado e instrucciones para su reconstitución y/o uso. Algunos contenedores adecuados son, por ejemplo, botellas, viales (por ejemplo, viales de doble cámara), jeringuillas (como jeringuillas de doble cámara) y tubos de prueba. El contenedor puede estar formado a partir de una variedad de materiales, como vidrio o plástico. Preferentemente, el kit y/o contenedor contiene(n) instrucciones sobre o asociadas al contenedor, que indican los pasos para la reconstitución y/o el uso. Por ejemplo, la etiqueta puede indicar que la formulación liofilizada debe ser reconstituida con las concentraciones de péptidos descritas más arriba. La etiqueta también puede indicar que la formulación es útil o está pensada para administración subcutánea.
El contenedor que contenga la formulación puede ser un vial multiusos, que permite administraciones repetidas (por ejemplo, 2-6 administraciones) de la formulación reconstituida. El kit puede comprender además un segundo contenedor que comprenda un diluyente adecuado (por ejemplo, solución de bicarbonato sódico).
Al mezclar el diluyente y la formulación liofilizada, la concentración final de péptidos en la formulación reconstituida es preferentemente de, al menos, 0,15 mg/mL/péptido (=75 \mug) y, preferentemente, no mayor de 3 mg/mL/péptido (=1500 \mug). El kit también puede incluir otros materiales deseables desde un punto de vista comercial y de uso, incluyendo otros amortiguadores, diluyentes, filtros, agujas, jeringuillas y prospectos con instrucciones de uso.
Los kits de la presente descripción pueden tener un contenedor único que contenga la formulación de las composiciones farmacéuticas conforme a la presente invención con o sin otros compuestos (por ejemplo, otros compuestos o composiciones farmacéuticas de estos otros compuestos) o pueden tener un contenedor distinto para cada componente.
Preferiblemente, los kits de la descripción incluyen una formulación de la invención embalada para su uso en combinación con la co-administración de un segundo compuesto (como adyuvantes [por ejemplo, GM-CSF, un agente quimioterapéutico, un producto natural, una hormona o un antagonista, un inhibidor o un agente anti-angiogénesis, un agente inductor de apóptosis o un quelante]) o una composición farmacéutica del mismo. Los componentes de kit pueden haber sido combinados previamente, o bien cada componente puede estar en un contenedor distinto antes de la administración al paciente. Los componentes del kit pueden proporcionarse en una o más soluciones líquidas, preferiblemente, en una solución acuosa y, más preferiblemente, en una solución acuosa estéril. Los componentes del kit también se pueden proporcionar como sólidos, que pueden ser convertidos en líquidos por adición de solventes adecuados, que se proporcionan, preferentemente, en otro contenedor distinto.
El contenedor de un kit terapéutico puede ser un vial, un tubo de pruebas, un matraz, una botella, una jeringuilla o cualquier otro medio para sólido o líquido. Normalmente, cuando hay más de un componente, el kit contendrá un segundo vial u otro contenedor, lo que permite una dosificación por separado. El kit también puede contener otro contenedor para un líquido farmacéuticamente aceptable. Preferentemente, un kit terapéutico contendrá aparatos (por ejemplo, una aguja o más, jeringuillas, goteros de ojos, pipetas, etc.) que permitan la administración de los agentes de la invención que son componentes del kit.
La presente formulación es adecuada para la administración de los péptidos por cualquier ruta aceptable, como la oral (enteral), nasal, oftálmica, subcutánea, intradérmica, intramuscular, intravenosa o transdérmica. Preferentemente, la administración es s.c, y, con mayor preferencia, i.d. La administración puede ser por bomba de infusión.
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Procedimiento de prueba analítico
La identidad, la pureza y el contenido en péptidos se determinan por cromatografía analítica RP-HPLC. La longitud de onda de detección fue de 220 nm.
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Prueba de la estabilidad (estabilidad de las formulaciones de prueba)
Se probaron diversos liofilizados con respecto a la estabilidad de cada péptido individual a 25ºC y 40ºC mediante un ensayo analítico de HPLC. Las pruebas de tensión a +25ºC y +40ºC se efectuaron para determinar la estabilidad de la formulación a temperatura ambiente y a mayores temperaturas.
Los péptidos conforme a las secuencias SEQ ID n.º 1 a 10 se liofilizaron sin excipientes y con adición de manitol y Lutrol F68® o Tween 80®.
Se generaron las siguientes formulaciones de prueba y se evaluó la estabilidad a +25ºC y +40ºC por ensayo analítico de HPLC:
Formulación 1:
péptidos sin excipientes;
Formulación 2:
péptidos: manitol: Lutrol F68® (Poloxámero188) (1:5:2 por peso);
Formulación 3:
péptidos: manitol: Tween 80® (1:5:2 por peso); y
Formulación 4:
péptidos: manitol: Tween 80® (1:5:1 por peso).
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Las mediciones iniciales de HPLC se han efectuado para cada formulación antes del almacenamiento en una cámara climática. Para este propósito, el contenido de dos viales se disolvió completamente en ácido acético al 30% y fue medido por RP-HPLC mediante determinación por repetición. Para asegurar la compatibilidad entre las mediciones individuales, se utilizó \beta-Naftil-alanina como estándar interno, y liofilizada junto con los péptidos.
Tras 7, 14, 21, y 28 días, se eliminaron otros dos viales de la cámara climática para evaluar la estabilidad.
La evaluación de los datos se efectuó por determinación por repetición de un vial. Para un punto temporal y una temperatura, se utilizaron dos viales independientes para obtener, en total, cuatro puntos de datos. Estos valores se han tomado para calcular la desviación estándar mostrada en barras de error en el diagrama correspondiente.
Como variable de resultado de los experimentos, la estabilidad de cada péptido individual de la formulación con manitol y Lutrol F68® es comparable con los resultados obtenidos por la formulación sin excipientes. Las formulaciones con Tween 80® muestran una degradación mejorada de IMA-RGS-001, especialmente a +40ºC, y un aumento de la señal, especialmente para el péptido IMA-ADF-001. Este aumento podría deberse a la elución conjunta de impurezas causadas por degradación de los péptidos.
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Cálculo de la potencia
Se probó el efecto de los excipientes Poloxámero 188 y manitol en la eficiencia de sensibilización de linfocitos T. Los excipientes no activos en la formulación IMA901 son Poloxámero 188 (Lutrol F68®) y manitol. Estos dos excipientes no estaban contenidos en la formulación de IMA901 en el ensayo de fase 1, y se incluyeron en la formulación del ensayo de fase 2 para mejorar la solubilidad y la estabilidad en uso de IMA901. En este estudio, se probó la influencia de estas sustancias en la eficiencia de sensibilización de linfocitos T en un modelo de ratón, tras la inmunización peptídica con un péptido de modelo múrido. No se observaron efectos tóxicos del Poloxámero 188 (Lutrol F68®) ni del manitol. Se analizó la sensibilización de los linfocitos T mediante coloración de los tetrámeros y citometría de flujo ex vivo, nueve días después de la inmunización. La adición de Poloxámero (Lutrol F68®)/manitol a la solución de inmunización no altera la eficiencia de sensibilización de linfocitos T CD8^{+}.
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Principio del test Inmunización
Para la sensibilización de linfocitos T CD8+ vírgenes, el péptido inmunógeno Ova_{257-264} (SIINFEKL) de unión a H2-K^{b}, en combinación con un adyuvante usado comúnmente en la inmunización de ratones (CpG desoxioligonucleótido), en un amortiguador bicarbónico al 4,2%, se inyectó intradérmicamente en ratones hembra de 8-12 semanas de edad (cadena C57BL76, H2^{b}, 3 ratones por grupo). Se compararon las soluciones de la inyección con y sin Poloxámero 188 (Lutrol F68® [16,5 mg/ml]) y manitol (41,3 mg/ml). Las concentraciones de los excipientes son las mismas que las planeadas para la solución de inyección IMA901. Se inmunizaron los controles positivos por vía subcutánea con una solución peptídica con CpG emulsionado en Titermax® classic (Sigma-Aldrich).
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Coloración de los tetrámeros
Después de 9 días, se sacrificó a los ratones y los linfocitos T específicos de Ova_{257-264} del bazo se analizaron ex vivo con coloración de tetrámeros y citometría de flujo. La tecnología de tetrámeros permite una detección específica y sensible de linfocitos T que portan el receptor de linfocitos T compatible.
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Resultados
No se observaron efectos tóxicos del Poloxámero 188 (Lutrol F68® BASF, Ludwigshafen, Alemania)/manitol, ni localmente en los sitios de inyección, ni sistémicamente. El grupo de control positivo, el grupo de CpG y el grupo de CpG/Poloxámero 188/manitol mostraron frecuencias de linfocitos T específicos de péptidos significativamente más elevadas, en comparación con los controles negativos (p < 0,05). No se detectó una diferencia significativa entre el CpG solo y el grupo CpG/Poloxámero 188/manitol.
La posibilidad de poblaciones positivas observadas artificialmente se excluyó mediante la coloración por tetrámeros de las células específicas de péptidos proliferadas, tras cinco días de estimulación in vitro con el péptido (no se muestra).
En conclusión, la presencia de Poloxámero 188 (Lutrol F68®)/manitol en el cóctel de inmunización no altera en los ratones las respuestas inmunes desencadenadas por péptidos y, por lo tanto, no cabe esperar, en general, influencias adversas o desfavorables del Poloxámero 188 (Lutrol F68®) ni del manitol en la eficacia y seguridad de la inmunoterapia basada en péptidos.
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Materiales y métodos
Los péptidos usados para la fabricación de las distintas formulaciones han sido sintetizados y suministrados por Bachem AG, Suiza.
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Ejemplos Ejemplo 1
Se prepararon soluciones madre de cada péptido individual por disolución de los péptidos en los solventes adecuados, conforme a características de solubilización (véase la tabla 2). 1,47 mL de las soluciones altamente concentradas de péptidos (péptidos 5 a 10) y 7,34 mL de las soluciones de péptidos 1 a 4 se combinaron por adición de 1,47 mL de ácido acético al 10%. La mezcla fue sometida a agitación vorticial durante 2 minutos y tratada en baño ultrasónico durante 1 minuto. Aproximadamente 1 mL de la solución clara resultante fue transferida a viales de vidrio, y seguidamente se añadieron 19,2 mg de manitol y 50 \muL de una solución madre de Tween 80® (77 mg de Tween 80® disueltos en una solución de ácido acético al 30%). En unos minutos se congeló la solución a -40ºC y se liofilizó durante 14 horas a 0,06 mbar, a lo que siguieron 6 horas de periodo de secado a 0,003 mbar (véase la Tabla 3).
TABLA 2 Péptidos utilizados para el ejemplo 1
6 
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TABLA 3 Parámetros de liofilización para el ejemplo 1
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Ejemplo 2
Se generó un lote de GMP con 2000 viales con 578 \mug por péptido individual por vial, más manitol y Poloxámero 188. La formulación incluye los péptidos, manitol y Poloxámero 188 en una tasa de 1:5:2 [w:w.w].
Cada péptido individual liofilizado se pesó conforme a las cantidades listadas en la tabla 4 en vasos de vidrio separados. Tras ser pesados, todos los péptidos se disolvieron en un solvente especificado.
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TABLA 4 Péptidos utilizados para el ejemplo 2
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Debido a las distintas solubilidades de los péptidos, deben ser disueltos conforme al orden proporcionado en la Tabla 4, comenzando con el péptido 1. Se usaron distintas cantidades y concentraciones de solución de ácido acético y agua para la inyección (WFI) para disolver los péptidos, debido a diferencias en la solubilidad de los péptidos y con respecto al volumen final de relleno de la solución madre. Para mejorar la solubilidad, cada vial se trató por agitación vigorosa durante un máximo de cinco minutos y, en caso necesario, por sonicación, durante un máximo de cinco minutos. Las cantidades y concentraciones que se deben usar también se muestran en la tabla 4.
Una vez que los péptidos se han disuelto sin problemas, las soluciones deben mezclarse en el orden dado en la tabla 4, comenzando con el péptido número 1. Las soluciones se reúnen en un contenedor de vidrio esterilizado. Los viales individuales de péptido se aclaran con una solución de 105 mi de ácido acético (30%). Finalmente, esta solución se añade a la mezcla de la solución peptídica y se remueve durante cinco minutos.
Se añadieron 23,1 g de Poloxámero 188 (Lutrol F68®) y 57,8 g de manitol a la mezcla peptídica y se removió toda la solución durante cinco minutos.
La solución madre con los 10 péptidos y los excipientes se filtró por un filtro estéril con un tamaño de los poros de 0,22 \mum. 1,485 ml de solución se depositaron en viales de vidrio 2R esterilizados en condiciones estériles y en una atmósfera de nitrógeno inerte, se pre-sellaron y se transportaron al liofilizador para su liofilización. El proceso de liofilización (véase la tabla 5) incluye la congelación de los viales a una temperatura de -45ºC, un aumento escalonado de la temperatura a +20ºC (fase principal de secado) y un paso final de secado a +25ºC. Cuando el ensayo se completó, el liofilizador se devolvió a la presión atmosférica utilizando nitrógeno seco filtrado por un filtro estéril.
TABLA 5 Parámetro de liofilización usado para el ejemplo 2
11 
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Procedimiento de resolubilización
Para los ensayos clínicos, la formulación descrita anteriormente se disuelve en 700 \mul de hidrogenocarbonato de sodio (4,2%). Quite la tapa de plástico de uno de los viales. Desembale y saque el hidrogenocarbonato de sodio (4,2%) del refrigerador al menos 30 minutos antes de la resolubilización, para que su alcance la temperatura ambiente antes de la inyección. Prepare la jeringuilla y la aguja para la reconstitución. Utilice una técnica aséptica para tomar 700 \muL de diluente para la reconstrucción del liofilizado. Para disolver el liofilizado, el vial y diluyente se deben agitar con energía durante 1 minuto. Compruebe que la solución se ha aclarado; en caso contrario, agítela durante un minuto más, hasta que se haya aclarado. De 10 a 30 minutos después de la inyección de GM-CSF, utilice una nueva jeringuilla para administrar 500 \muL de formulación reconstituida i.d. al mismo tiempo. La administración debe hacerse en durante la hora siguiente después de la reconstitución. El liofilizado disuelto puede almacenarse asépticamente a temperatura ambiente durante una hora después de la reconstitución.
La prueba de estabilidad tras la reconstitución mostró que la mayoría de los péptidos se mantienen suficientemente estables tras la reconstitución. Sin embargo, una tuvo lugar una disminución de dos péptidos específicos: IMA-CCN-001 y IMA-RGS-001. (véase la tabla 6). Debido a que estos péptidos contienen un residuo de cisteína, tiene lugar una dimerización dependiente del tiempo.
TABLA 6 Resultados del ensayo HPLC para la estabilidad en uso tras reconstitución con solución de hidrogenocarbonato de sodio al 4,2%. Comparación de la formulación con y sin excipientes
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En un modelo de ratón se evaluó la influencia de distintos valores de pH (alrededor de pH 8,5) y de un amortiguador de carbonato de alta capacidad en el éxito de las inmunizaciones peptídicas. Utilizando un péptido modelo inmunógeno estándar en distintas soluciones de inyección, se evaluó la eficiencia sensibilizadora mediante un ensayo de liberación de ^{51}Cr. Los resultados fueron confirmados por análisis de citometría de flujo tras la coloración de los tetrámeros. En resumen, no se detectó ninguna diferencia significativa en la eficiencia sensibilizadores entre las inmunizaciones intradérmicas a con un pH de 7,5, 8,5 (pH del diluyente) y pH 9,5.
Adicionalmente, la alta fuerza iónica no redujo la respuesta inmune observada en comparación con el amortiguador de inyección isotónico. No se observaron efectos secundarios tóxicos en inmunizaciones con soluciones de inyección con pH de 7,5, 8,5, y con el diluyente IMA901, pero se hicieron evidentes con la solución de inyección con pH de 9,5 (lesiones necróticas locales de la piel en el sitio de inyección). Estos resultados apoyan el hecho de que el amortiguador elegido es apropiado como diluyente para IMA901.
<110> Immatics biotechnologies GmbH
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<120> Novedosas formulaciones para vacunas de péptidos asociados a tumores, unidos a moléculas del antígeno de leucocito humano (HLA) de clase I o II
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<130> FB20109
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<160> 11
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<170> PatentIn versión 3.5
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<210> 1
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<211> 16
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens 
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<400> 1
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14 
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<210> 2
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<211> 9
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens 
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<400> 2
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15 
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<210> 3
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<211> 9
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens 
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<400> 3
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16 
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<210> 4
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<211> 9
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens 
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<400> 4
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17 
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<210> 5
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<211> 9
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens 
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<400> 5
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<213> Homo sapiens 
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<400> 6
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19 
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<210> 7
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<211> 9
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens 
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20 
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<210> 8
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<211> 9
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens 
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<400> 8
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<213> Homo sapiens 
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<210> 10
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<211> 9
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens 
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<400> 10
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<211> 10
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<213> Homo sapiens 
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<400> 11
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24

Claims (12)

1. La composición farmacéutica que comprende, al menos, dos péptidos, donde los péptidos comprenden un aminoácido seleccionado del grupo constituido por las secuencias SEQ ID n.º 1 a SEQ ID n.º 11, siempre que la composición comprenda, al menos, un péptido que comprenda las secuencias SEQ ID n.º 1 o SEQ ID n.º 2 o una variante de las mismas y siempre que el péptido no sea el polipéptido humano completo asociado a tumor, y que comprende, además, manitol y Poloxámero 188, donde el ratio por peso de los péptidos, el manitol y el Poloxámero 188 se encuentra en un rango de entre 1:5:1,5 y 1:8:2,2.
2. La composición farmacéutica conforme a la reivindicación 1, en donde el ratio por peso de péptidos:manitol:
Poloxámero 188 se encuentra en un rango de entre 1:0:2 y 1:0:2,2, incluyendo los valores extremos.
3. La composición farmacéutica que comprende, al menos, dos péptidos, donde los péptidos comprenden un aminoácido seleccionado del grupo constituido por las secuencias SEQ ID n.º 1 a SEQ ID n.º 11, siempre que la composición comprenda, al menos, un péptido que comprenda las secuencias SEQ ID n.º 1 o SEQ ID n.º 2 o una variante de las mismas y siempre que el péptido no sea el polipéptido humano completo asociado a tumor; y que comprende, además, manitol y Tween 80®, en donde el ratio por peso de péptidos:manitol:Tween 80® se encuentra en un rango de entre 1:2:1,5 y 1:8:2,2.
4. La composición farmacéutica conforme a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde mencionados péptidos tienen una longitud total de entre 9 y 16 aminoácidos.
5. La composición farmacéutica conforme a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde al menos uno de los mencionados péptidos incluye enlaces no peptídicos.
6. La composición farmacéutica conforme a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde la mencionada composición comprende péptidos que consisten en las secuencias de aminoácidos expuestas en las secuencias SEQ ID n.º 1 y/o la secuencia SEQ ID n.º 2 y, además, comprende al menos un péptido constituido por la secuencia de aminoácidos expuesta en cualquiera de las secuencias SEQ ID n.º: 3 a SEQ ID n.º 10.
7. La composición farmacéutica conforme a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 que comprende además un péptido que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la secuencia SEQ ID n.º 11
8. La composición farmacéutica conforme a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 que comprende además un péptido constituido por la secuencia de aminoácido expuesta en la secuencia SEQ ID n.º: 11.
9. La composición farmacéutica conforme a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde las cantidades de los péptidos presentes en la composición son específicos de tejido, cáncer y/o paciente.
10. La composición farmacéutica conforme a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 que además comprende, al menos, un adyuvante adecuado.
11. La composición farmacéutica conforme a la reivindicación 10, en donde el mencionado adyuvante es un factor estimulante de colonias.
12. El uso de la composición farmacéutica conforme a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 como vacuna contra el cáncer.
ES08008292T 2008-04-30 2008-04-30 Novedosas formulaciones para vacunas de peptidos asociados a tumores, unidos a moleculas del antigeno de leucocito humano (hla) de clase i o ii. Active ES2342506T3 (es)

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