BRPI0900798A2 - formulaÇÕes novas de peptÍdeos associados a tumores que se ligam a molÉculas de classe i ou ii do antÍgeno lecocitÁrio humano (hla) para vacinas - Google Patents

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Abstract

FORMULAÇÕES NOVAS DE PEPTÍDEOS ASSOCIADOS A TUMORES QUE SE LIGAM A MOLÉCULAS DE CLASSE I OU II DO ANTÍGENO LEUCOCITÁRIO HUMANO (HLA) PARA VACINAS. A presente invenção refere-se a formulações novas de peptideos associados a tumores que se ligam a moléculas da classe I ou II do antígeno leucocitário humano (HLA) como vacinas para serem utilizadas em métodos imunoterápicos. Em particular, a presente invenção refere-se especificamente a formulações para a imunoterapia do câncer, em especial do câncer renal e câncer cerebral, em particular o glioma, especialmente o câncer tipo glioblastoma. Além disso, a presente invenção refere-se a composições de vacinas para provocar respostas imunes antitumorais.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "FORMULAÇÕESNOVAS DE PEPTÍDEOS ASSOCIADOS A TUMORES QUE SE LIGAM AMOLÉCULAS DE CLASSE I OU II DO ANTÍGENO LEUCOCITÁRIO HUMANO(HLA) PARA VACINAS".
A presente invenção refere-se a novas formulações novas de
peptídeos associados a tumores que se ligam a moléculas de classe I ou IIdo antígeno leucocitário humano (HLA) como vacinas para serem usadasem métodos imunoterápicos. Em particular, a presente invenção refere-seespecificamente a formulações para a imunoterapia do câncer, em especial do câncer renal. A presente invenção refere-se, ainda, a composições devacinas para provocar respostas imunes antitumorais.
Para os fins da presente invenção, todas as referências aqui ci-tadas passam a fazer parte integral deste documento por referência.ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
Uma composição para injeção, constituída por peptídeos sob a
forma de pó e um solvente constituído por bicarbonato de sódio foi divulgadoem WO 2007/028573 para a vacinação de carcinoma de células renais. Noentanto, esta formulação tem vários inconvenientes. A principal desvanta-gem é a baixa solubilidade, que torna o seu manuseio muito difícil durante qualquer tipo de aplicação, como p. ex., na utilização clínica.
No intuito de dissolver o pó na composição, o frasco contendo ospeptídeos a serem dissolvidos e o diluente têm de ser agitados vigorosa-mente durante três minutos e, em seguida, devem ser submetidos a umaultra-sonografia para homogeneização por um minuto e, em seguida, devem voltar a ser agitados. Este tratamento não pode ser aplicado por todos osmédicos em seus consultórios, já que muitas vezes têm falta dos equipa-mentos necessários, e a mistura arquivada lá pode ser não tão homogênea,conforme o necessário para uma utilização eficaz.
Um problema adicional com a composição refere-se ao fato de que, dada a velocidade de dissolução dos ingredientes ativos usando-se ohidrogeno carbonato de sódio em determinada concentração, a solução re-sultante pode ser utilizada apenas durante aproximadamente 30 minutos.Além disso, as características da formulação acima mudam aolongo do tempo, o que torna quase impossível uma utilização segura. Depoisde divulgada a formulação de armazenamento por 12 meses utilizando-sediferentes temperaturas de -20°C a 25°C, nenhuma solução clara pôde serproduzida, mesmo após o uso de um ultra-som homogeneizador por váriosminutos.
Assim, continua a haver uma necessidade de novas formulaçõesde peptídeos com solubilidade aprimorada e umidificação melhorada do liofi-lizado, a fim de proporcionar uma preparação segura e eficaz, especialmente no caso de uma vacina anti-câncer. A presente invenção atende a essa ne-cessidade.
RESUMO DA INVENÇÃO
A presente invenção, em um de seus aspectos preferidos, forne-ce composições farmacêuticas compreendendo entre 2 e 18, de preferênciamenos de 15, mais preferido menos de 13, ainda mais preferido 2 a 12 pep-tídeos e, ainda mais preferido, 3 a 12 peptídeos associados a tumor; ondecada peptídeo tem um comprimento entre 8 e 22 aminoácidos, de preferên-cia entre 9 e 16 aminoácidos; onde pôde ser observado que peptídeos mos-tram uma solubilidade de pelo menos 2,7 mg / ml em 90% de ácido acético,mannitol e poloxamer 188, no qual a razão do peso do dito peptídeo(s) demannitol para poloxamer 188 está incluído no intervalo entre 1:5:1.5 e1:8:2.2.; ou mannitol e Tween 80®, onde a razão do peso de peptídeos demannitol para Tween 80 ® incluindo mo intervalo entre 1:2:1.5 e 1:8:2.2..
Em outro preferido dos seus aspectos, a presente invenção for- nece uma composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 1, com-preendendo pelo menos dois peptídeos, onde os ditos peptídeos compreen-dem uma seqüência de aminoácidos selecionada do grupo constituído porSEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 10, ou SEQ ID NO: 12 a SEQ ID NO: 23, desdeque a composição compreenda pelo menos um peptídeo compreendendo SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 12, ou SEQ ID NO: 13 ou umavariante ou sal desse fato, e ainda inclui mannitol e poloxamer 188, onde arelação do peso de peptídeos de mannitol para poloxamer 188 está incluídano intervalo entre 1:5:1.5 e 1:8:2.2.
Em ainda outro preferido dos seus aspectos, a presente inven-ção fornece uma composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 1,compreendendo pelo menos dois peptídeos, onde os ditos peptídeos com- preendem uma seqüência de aminoácidos selecionada do grupo constituídopor SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 10, ou SEQ ID NO: 12 a SEQ ID NO: 23,desde que a composição compreenda pelo menos um peptídeo compreen-dendo SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 12, ou SEQ ID NO: 13 ouuma variante ou sal desse fato, e ainda incluindo mannitol e Tween 80®, on- de a relação do peso de peptídeos de mannitol para Tween 80® está incluídano intervalo entre 1:2:1.5 e 1:8:2.2.
Vantajosamente, a formulação de acordo com a invenção é ade-quada para formulações estáveis contendo peptídeos muito hidrofóbicos (porexemplo, IMA-CHI-001; SEQ ID NO: 23). Este peptídeo especial, por exem- pio, é muito insolúvel na água e apenas ligeiramente solúvel em 90% de áci-do acético (solubilidade de aprox. 2,9 mg / ml_). Surpreendentemente, é ago-ra possível formular o peptídeo de acordo com SEQ ID NO: 23 com qualqueroutro peptídeo em outra formulação que possa ser utilizada para a aplicaçãoem um ser vivo.
Por conseguinte, a aplicação divulga de mão uma formulação
para formular entre 2 e 18 peptídeos, de preferência menos de 15, mais pre-ferido menos de 13, ainda mais preferido 2 a 12 peptídeos e, ainda mais pre-ferido, 3 a 12 peptídeos, com um peptídeo com um comprimento entre 8 e22 aminoácidos, de preferência entre 9 e 16 aminoácidos, desde que os peptídeos mostrem pelo menos uma solubilidade em 90% de ácido acéticode 2.7 mg / ml, de preferência 2,9 mg / ml, e ainda inclui mannitol e poloxa-mer 188, no qual a razão por peso de peptídeos de mannitol para poloxamer188 está incluída no intervalo entre 1:5:1.5 a 1:8:2.2.
Em uma variante preferida desta composição farmacêutica de acordo com a presente invenção, a relação do peso de peptídeos de manni-tol para poloxamer 188 está incluída no intervalo entre 1:0:2 e 1:0:2.2.
Outra variante preferida da presente invenção fornece umacomposição farmacêutica conforme o descrito acima, compreendendo pelomenos dois peptídeos, onde os ditos peptídeos compreendem uma seqüên-cia selecionada de aminoácidos do grupo constituído por SEQ ID NO: 12 aSEQ ID NO: 23, desde que a composição compreenda pelo menos um pep-tídeo compreendendo SEQ ID NO: 12, ou SEQ ID NO: 13 ou uma variantedesse fato, e ainda incluindo mannitol e Tween 80®, onde a relação do pesode peptídeos de mannitol para Tween 80® está incluída no intervalo entre1:5:0.5 e 1:5:2.
Preferencialmente os peptídeos da presente invenção têm um comprimento total entre 9 e 16 aminoácidos. Os peptídeos podem incluir li-gações não-peptídicas.
Em outra variante preferida, as composições farmacêuticascompreendem peptídeos constituídos por seqüências de aminoácidos esta-belecidas em SEQ ID NO: 1 e/ou SEQ ID NO: 2 e outras ainda incluem pelomenos um peptídeo constituído por seqüência de aminoácidos estabelecidaem qualquer um dos SEQ ID NO: 3 a SEQ ID NO: 10.
Em determinadas variantes preferidas, a composição farmacêu-tica pode ainda incluir um peptídeo composto pela seqüência de aminoáci-dos estabelecida em SEQ ID NO: 11, contanto que o peptídeo citado nãoseja o respectivo polipeptídeo de comprimento integral associado ao tumor.Em outras variantes preferidas, a composição farmacêutica pode ainda inclu-ir um peptídeo composto pela seqüência de aminoácidos estabelecida emSEQ ID NO: 11.
Em outra variante preferida, as composições farmacêuticascompreendem peptídeos constituídos por seqüências de aminoácidos esta-belecidas em SEQ ID NO: 12 e/ou SEQ ID NO: 13 e ainda inclui pelo menosum peptídeo constituído por seqüência de aminoácidos estabelecida emqualquer um dos SEQ ID NO: 14 a SEQ ID NO: 23. Em determinadas varian-tes preferidas, esta composição farmacêutica pode ainda incluir um peptídeocomposto pela seqüência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO: 11,contanto que o peptídeo citado não seja o respectivo polipeptídeo de com-primento integral associado ao tumor. Em outras variantes preferidas, acomposição farmacêutica pode ainda incluir um peptídeo composto pela se-qüência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO: 11.
Em certas variantes, como os peptídeos presentes na composi-ção são selecionados a partir de peptídeos específicos de tecidos, câncer e/ou peptídeos de cada paciente.
Em outras variantes preferidas, a composição farmacêutica ain-da pode incluir pelo menos um adjuvante adequado.
Adjuvantes são substâncias que não reforçam ou potencializamespecificamente a resposta imune (por exemplo, respostas imunes media- das por CTLs e células T auxiliares (TH)) para um antígeno, e terão, portan-to, de ser considerados úteis para o medicamento da presente invenção.Adjuvantes adequados incluem, mas não estão limitados a, 1018 ISS, saisde alumínio, Amplivax, AS15, BCG, CP-870893, CpG7909, CyaA, dSLIM,flagelina ou TLR5 ligantes derivados de flagelina, FLT3 ligante, GM-CSF,
IC30, IC31 , Imiquimod (Aldara), resimiquimodo, ImuFact IMP321, Interleuci-nas como IL-2, IL-13, IL-21, interferon-alfa-ou beta, ou pegylated, seus deri-vados, IS Patch, ISS, ISCOMATRIX, ISCOMs, Juvlmmune, LipoVac,MALP2, MF59, monofosforil lipídico A, Montanide IMS 1312, Montanide ISA206, Montanide ISA 50V, Montanide ISA-51, emulsões água em óleo e óleo em água, OK-432, OM-174, OM-197 - MP-CE, ONTAK, OspA, PepTel ® sis-tema vetor, PLG e micropartículas dextram, resiquimod, SRL172, Virosomese outros vírus, como partículas, YF-17D, armadilha VEGF, R848, beta-glucano, Pam3Cys, Aquila da QS21 stimulon, que é obtido a partir de sapo-nina, micobacterianos extratos bacteriano e síntese da parede celular mími- ca, e de outros adjuvantes proprietários, como Ribi's Detox, Quil, ou Super-fos. Adjuvantes, tais como Freund's ou GM-CSF, são preferidos. Vários ad-juvantes imunológicos (por exemplo, MF59) específicos para células dendrí-ticas e suas preparações foram descritos anteriormente (Dupuis M et al1998; Allison 1998). Também é possível utilizar citocinas. Várias citocinas foram diretamente suspeitas em influenciar a migração dendrítica para ostecidos linfóides (por exemplo, TNF-D), acelerando assim a maturação decélulas dendríticas em células eficientes que contêm antígeno para linfócitosT (por exemplo, a GM-CSF, IL-1 e IL -4) (U.S. Pat. No. 5,849,589, especifi-camente incorporadas aqui por referência na sua totalidade), e atuando co-mo imunoadjuvantes (por exemplo, IL-12, IL-15, IL-23, IL-7, IFN-alfa. IFN-beta) (Gabrilovich et al 1996).
Oligonucleótidos imunoestimulatórios CPG também foram rela-tados para melhorar os efeitos de adjuvantes na elaboração de uma vacina.Sem estar vinculada por teoria, CPG oligonucleótidos atuam através da ati-vação do sistema imunitário do inata (não-adaptativo), através de receptoresdo tipo "toll" (TLR), principalmente TLR9. Ativação TLR9 de CPG disparadoaumenta as respostas humorais e celulares específicas do antígeno parauma ampla variedade de antígenos, incluindo antígenos de peptídeo ou pro-teína, vírus vivos ou mortos, vacinas de células dendríticas, vacinas celula-res autólogas e polissacarídeos conjugados em ambas as vacinas, profiláti-cas e terapêuticas. Mais importante é o fato que ela reforça a maturação ediferenciação de células dendríticas, resultando em uma maior ativação decélulas THi e em uma forte geração de linfócitos T citotóxicos (CTL), mesmona ausência da ajuda de células T CD4. O viés de TH1 induzida por estimu-lação de TLR9 é mantida mesmo na presença de adjuvantes de vacina, taiscomo alumínio ou adjuvante incompleto de Freund (IFA) que, normalmente,promove um viés de TH2. Oligonucleótidos CPG mostram uma atividadeainda maior de adjuvante quando formulado ou co-administrado com outrosadjuvantes ou em formulações como as micropartículas, nanopartículas,emulsões lipídicas ou formulações similares, que são especialmente neces-sárias para induzir uma resposta forte quando o antígeno é relativamentefraco. Eles também aceleram a resposta imune e permitem as doses de an-tígeno a serem reduzidas por aproximadamente duas ordens de magnitude,com respostas comparáveis de anticorpo para a vacina de dose integral semCPG em algumas experiências (Krieg et al 2006). US Pat. No. 6,406,705 B1descreve o uso combinado de CPG oligonucleotídeos, adjuvantes de ácidonão nucleico e um antigénio para induzir uma resposta imune específica doantígeno. Uma CPG TLR9 antagonista é o dSLIM (double Stem Loop Immu-nomodulator) por Mologen (Berlim, Alemanha), que é um componente prefe-rido da composição farmacêutica da presente invenção. Outras moléculasque se ligam a TLR, como a TLR 7, TLR 8 e / ou TLR 9 que se ligam aoRNA também podem ser utilizadas.
Outros exemplos de adjuvantes úteis incluem, mas não estãolimitados a CpGs quimicamente modificados (por exemplo, CPR, Idera), ds-RNA análogos, como a Poly(l:C) e AmpliGen, não-CPG bacteriana DNA ouRNA, bem como pequenas moléculas e anticorpos imunoativos tais como aciclofosfamida, sunitiniba, Bevacizumab, Celebrex, NCX-4016, o sildenafil,tadalafil, vardenafil, Sorafenib, temozolomide, temsirolimus, XL-999, CP-547632, pazopanib, VEGF Trap, ZD2171, AZD2171, anti-CTLA4 e SC58175,que podem agir terapeuticamente e/ou como um adjuvante. As quantidadese concentrações de adjuvantes e aditivos úteis no contexto da presente in-venção podem ser facilmente determinadas pelo artesão qualificado semexperimentação. Adjuvantes preferidos são dSLIM, interferon-alfa, interferon-beta, CpG7909, IC31, Imiquimod, resimiquimod, PeviTer, RNA, tadalafil, te-mozolomide, e Juvlmmune.
Adjuvantes preferidos são dSLIM, BCG, OK432, imiquimod, re-simiquimod, GMCSF, interferon-alfa, PeviTer e Juvlmmune ou combinaçõesdos mesmos.
Em uma variante preferida, a composição farmacêutica de acor-do com a invenção, o adjuvante é selecionado dentre o grupo de fatores es-timulantes de colônias, tais como o fator estimulante de colônias de granuló-citos e macrófagos (GM-CSF, Sargramostim), imiquimod, resiquimod, e in-terferon-alpha.
Em uma variante preferida, a composição farmacêutica de acor-do com a invenção, o adjuvante é selecionado dentre o grupo de fatores es-timulantes de colônias, tais como o fator estimulante de colônias de granuló-citos e macrófagos (GM-CSF, Sargramostim), imiquimod e resiquimod.
Em uma variante preferida, a composição farmacêutica de acor-do com a invenção, o adjuvante é imiquimod ou resimiquimod.
A composição pode ser usada para administração parenteralcomo, por exemplo, por via subcutânea, intradérmica ou intramuscular oupara administração oral. Os peptídeos também podem ser administradosjuntamente com substâncias imunoestimulantes tais como as citocinas.
As composições farmacêuticas da invenção podem ser usadascomo uma vacina anticancerígena.A presente invenção também inclui um kit composto de pelo me-
nos um dos peptídeos acima, e/ou o da composição farmacêutica acima,quer pré-preparados ou em recipientes separados ou frascos para misturasno local.
Isso é preferencialmente um kit contendo: (a) um recipiente contendo uma composição farmacêutica, de acordo com a invenção, em solu-ção ou em forma liofilizada (b) opcionalmente, um segundo recipiente con-tendo um diluente ou uma solução para a reconstituição para tal formulaçãoliofilizada e / ou pelo menos um adjuvante, e (c ) opcionalmente, as instru-ções para (i) o uso da solução, ou (ii) reconstituição e / ou uso da formulação liofilizada citada.
De acordo com a invenção, também é preferível o kit ainda con-tem um ou mais tampões (i), um diluente (ii), um filtro (iii), uma agulha (iv), euma seringa (v).
DESCRIÇÃO CURTA DAS FIGURASFigura 1: Espectrômetro analítico HPLC dos peptídeos (SEQ ID
No.: 1 -11) que contêm beta-naftilalanina (NAL) como padrão interno.
Figura 2: Estabilidade de formulação 1 (controle), sem quaisquerexcipientes a +25°C.
Figura 3: Estabilidade de formulação 2, de acordo com a invenção com mannitol e Lutrol F68® (Poloxamer 188) a +25°C.
Figura 4: Estabilidade de formulação 3, de acordo com a invenção com mannitol e Tween 80® a +25°C.
Figura 5: Estabilidade de formulação 4, de acordo com a inven-ção com mannitol e Tween 80® a +25°C.Figura 6: Estabilidade de formulação 1 (controle), sem quaisquer
excipientes a +40°C.
Figura 7: Estabilidade de formulação 2, de acordo com a inven-ção com mannitol e Lutrol F68® (Poloxamer 188) a +40°C.
Figura 8: Estabilidade de formulação 3, de acordo com a inven-ção com mannitol e Tween 80® a +40°C.
Figura 9: Estabilidade de formulação 4, de acordo com a inven- ção com mannitol e Tween 80® a +40°C.
Figura 10: Efeitos dos excipientes Poloxamer 188 (Lutrol F68®disponível da BASF Ludwigshafen, Alemanha) e mannitol na célula CD8+ Tin vivo. Camundongos foram sacrificados 9 dias após a imunização, célulasbaço foram coletadas, tingidas com tetrâmero e analisadas por citometria de fluxo. Percentagem de células tetrâmeras positivas entre todas as células TCD8 .+ é mostrada com barras de erro apresentando o desvio padrão dasmédias. Todos os três grupos imunizados de peptídeo são significativamentediferentes dos controles negativos conforme o analisado por teste T tipo bi-caudal, desirmanado e realizado por estudantes (p < 0,05). Os grupos com e sem Poloxamer 188 (Lutrol F68 ®) / mannitol não diferem significativamente(p = 0.49).
Figura 11: Processo de fabricação descrito no exemplo 2.
Figura 12: Espectrômetro analítico HPLC dos peptídeos (SEQ IDNo.: 11 - 23) que contêm beta-naftilalanina (NAL) como padrão interno. Figura 13: Estabilidade "em uso" de peptídeos de SEQ ID NO 11
a 23 com Mannitol / Lutrol F68®.
Figura 14: Estabilidade "em uso" de peptídeos de SEQ ID NO 11a 23 sem excipientes.
Figura 15: Estabilidade de peptídeos de SEQ ID NO 11 a 22 com Mannitol / Lutrol F68® a+25°C.
Figura 16: Estabilidade de peptídeos de SEQ ID NO 11 a 22 comMannitol / Lutrol F68® a +5°C.
Figura 17: Estabilidade de peptídeos de SEQ ID NO 11 a 22 comMannitol / Lutrol F68® a -20°C. Figura 18: 24 meses de dados estabilidade a -20°C para a for-
mulação mostrada no Exemplo 2.
Figura 19: 24 meses de dados de estabilidade a +5°C para aformulação mostrada no Exemplo 2.
Figura 20: 24 meses de dados de estabilidade a +25°C para aformulação mostrada no Exemplo 2.
A seqüência na lista mostra peptídeos (SEQ ID No. 1 a 23) quesão utilizados nas formulações de acordo com a presente invenção.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
A presente invenção fornece composições farmacêuticas úteiscomo uma vacina, onde disse composição farmacêutica compreende váriospeptídeos associados a tumor (TUMAPs), para além de uma mistura demannitol e Tween 80 ®, ou uma mistura de mannitol e Poloxamer 188, daqual as misturas proporcionam estabilidade e solubilidade para tal composi-ção.
"Composição farmacêutica" conforme usada aqui é preferenci-almente uma formulação liofilizada compreendendo peptídeos, mannitol, eTween 80® ou os peptídeos, mannitol e Poloxamer 188 ou, de preferência, éuma composição de líquido reconstituído. Como tal, o termo "composiçõesfarmacêuticas", conforme aqui utilizado referem-se também à formulaçãoliofilizada, para indicar que a composição está presente em uma forma liofili-zada.
De preferência, os peptídeos nas composições farmacêuticascompreendem no mínimo um dos peptídeos estabelecidos em SEQ ID NO: 1a 10, que foram localizados e têm sido identificados em células primárias decâncer renal ou, pelo menos, um dos peptídeos estabelecidos em SEQ IDNO 11 a 22 e 11 a 23, que foram localizados e têm sido identificados emcélulas de câncer glioma primárias.
Em outra variante preferida, as composições farmacêuticascompreendem peptídeos constituídos por seqüências de aminoácidos esta-belecidas em SEQ ID NO: 12 e/ou SEQ ID NO: 13 e ainda inclui pelo menosum peptídeo constituído por seqüência de aminoácidos estabelecida emqualquer um dos SEQ ID NO: 14 a SEQ ID NO: 23.
Esse conjunto inclui peptídeos HLA da classe I e classe II. Umacomposição farmacêutica de acordo com a presente invenção contém, depreferência, um peptídeo tal como estabelecido em SEQ ID NO:1 e/ou SEQID NO:2 e/ou, pelo menos, um outro peptídeo compreendendo SEQ ID NO:3-10 ou um peptídeo tal como estabelecido em SEQ ID NO: 12 e/ou SEQ IDNO:13 e/ou, pelo menos, um outro peptídeo compreendendo SEQ ID NO: 11e 14-23.
As composições farmacêuticas incluem os peptídeos, tanto naforma livre ou na a forma de um sal farmaceuticamente aceitável.
Conforme utilizado aqui, "um sal farmaceuticamente aceitável"refere-se a um derivado do peptídeo revelado onde o peptídeo é alterado porformação de ácido ou por sais básicos do agente. Por exemplo, sais ácidossão preparados a partir da base livre (normalmente onde a forma neutra dadroga tem um grupo NH2 neutro), envolvendo uma reação com ácido ade-quado. Ácidos adequados para a preparação de sais de ácidos incluem tantoos ácidos orgânicos, por exemplo, ácido acético, ácido propiônico, ácido gli-cólico, ácido pirúvico, ácido oxálico, ácido málico, ácido malônico, succínico,ácido maleico, ácido fumárico, ácido tartárico, ácido cítrico, ácido benzóico,ácido cinâmico, ácido mandélico, ácido metanossulfônico, etanosulfônico,ácido p-toluenosulfônico, ácido salicílico e similares, bem como ácidos inor-gânicos, por exemplo, ácido hidroclorídrico, ácido hidrobrômico, ácido sulfú-rico, ácido fosfórico, ácido nítrico e similares. Inversamente, a preparação desais de base provenientes de moléculas ácidas, que podem estar presentesem um peptídeo, é efetuada utilizando-se uma base farmaceuticamente a-ceitável como o hidróxido de sódio, hidróxido de potássio, hidróxido de amô-nio, hidróxido de cálcio, trimetilamino ou algo do gênero.
Em uma variante especialmente preferida, as composições far-macêuticas compreendem peptídeos como sais de ácido acético (acetatos)ou ácido hidroclorídrico (cloretos).
Em uma variante ainda mais preferida, as composições farma-cêuticas de acordo com a invenção compreendem SEQ ID NO: 5 como clo-reto de um e de todos os outros peptídeos como acetatos.
Composições farmacêuticas da presente invenção também po-dem conter pelo menos um peptídeo para servir como peptídeo de controlepositivo e, atuando como marcador imunológico, para testar a eficiência daadministração intradérmica. Um desses peptídeos exemplares é provenientedo antígeno do cerne do VHB (SEQ ID NO:11).
Em uma variante em particular, a composição farmacêuticacompreende 11 peptídeos diferentes, cada um constituído por seqüências deaminoácidos estabelecidas em SEQ ID NO: 1a 11. (ver a tabela 1). Prefe-rencialmente, cada peptídeo na composição farmacêutica está presente emuma quantidade entre cerca de 1500 ug a cerca de 75 ug, de preferênciaentre cerca de 1000 ug a cerca de 750 ug e mais de preferência entre cercade 500 ug a cerca de 600 ug, e mais de preferência cerca de 578 ug. Prefe-rencialmente, cada peptídeo é purificado por HPLC e cromatografia de trocaiônica, e aparece como um pó branco até claro.
Em uma outra variante em particular, a composição farmacêuticacompreende 12 peptídeos diferentes, cada um constituído por seqüências deaminoácidos estabelecidas em SEQ ID NO: 11 a 22 e uma das seqüênciasestabelecidas em SEQ ID NO: 1 a 11. (ver a tabela 11). Preferencialmente,cada peptídeo na composição farmacêutica está presente em uma quantida-de entre cerca de 1500 ug a cerca de 75 ug, de preferência entre cerca de1000 ug a cerca de 750 ug e, mais de preferência entre cerca de 500 ug acerca de 600 ug, e mais de preferência cerca de 578 ug- Preferencialmente,cada peptídeo é purificado por HPLC e cromatografia de troca iônica, e apa-rece como um pó branco até claro.
Tabela 1: Peptídeos preferidos em composições farmacêuticas da presenteinvenção
<table>table see original document page 13</column></row><table><table>table see original document page 14</column></row><table>O termo "peptídeo" é utilizado aqui para designar uma série deresíduos de aminoácidos, ligados um ao outro pelo tipicamente por cone-xões de peptídeo entre os grupos alfa-amino e carbonilo e dos aminoácidosadjacentes. Os peptídeos são tipicamente 9 aminoácidos de comprimentopara a MHC classe I e mais longos (15 ou 16 aminoácidos) para MHC classeII, mas também podem sertão curtos quanto 8 aminoácidos de comprimentoou tão longos quanto 16 aminoácidos de comprimento.
O termo "oligopeptídeo" é utilizado aqui para designar uma sériede resíduos de aminoácidos, ligados um ao outro pelo tipicamente por cone-xões de peptídeo entre os grupos alfa-amino e carbonilo e dos aminoácidosadjacentes. O comprimento do oligopeptídeo não é decisivo para a invenção,enquanto o epitopo correto ou os epitopos são mantidos nele. Os oligopeptí-deos são geralmente inferiores a aproximadamente 30 resíduos de aminoá-cidos em comprimento e superior a aproximadamente 14 aminoácidos emcomprimento.
O termo "polipeptídeo" designa uma série de resíduos de ami-noácidos, ligados um ao outro pelo tipicamente por conexões de peptídeoentre os grupos alfa-amino e carbonilo e dos aminoácidos adjacentes. Ocomprimento do polipeptídeo hão é decisivo para a invenção, enquanto osepitopos corretos são mantidos. Em contraste com os termos peptídeo ouoligotídeos, o termo polipéptido é usado para referir-se a moléculas de prote-ínas com comprimentos acima de 30 resíduos de comprimento.
Um peptídeo, oligopeptídeo, proteína, ou código de polinucleotí-deo para uma tal molécula é "imunogênieo" (e, portanto, um "imunógeno"dentro da atual invenção), se ele é capaz de induzir uma resposta imune. Nocaso da presente invenção, imunogenicidade é definida mais especificamen-te como a capacidade de induzir uma resposta de CTL mediada. Assim, um"imunógeno" seria uma molécula que seja capaz de induzir uma respostaimune e, no caso da presente invenção, uma molécula capaz de induzir umaresposta CTL.
Uma célula T "epítopa" é uma pequena molécula de peptídeoque se liga a uma molécula MHC classe I ou II, e que é posteriormente reco-nhecida por uma célula T. Epitopos de células T que se ligam às moléculasMHC classe I têm tipicamente 8-14 aminoácidos de comprimento e, maistipicamente 9 aminoácidos de comprimento. Epitopos de células T que seligam às moléculas MHC classe II têm tipicamente 12-30 aminoácidos decomprimento. No caso dos epitopos que se ligam a moléculas MHC classeII, as mesmas células T epítopas podem compartilhar um segmento de nú-cleo comum, mas diferem no comprimento das seqüências nos flancos decarboxiterminais e aminoterminais devido ao fato de que as extremidades damolécula do peptídeo não são enterradas na estrutura da fissura dos peptí-deos que se ligam às molécula MHC classe II, pois elas se encontram estãona a fissura dos peptídeos que se ligam às molécula MHC classe I.
Existem três diferentes locos genéticos que codificam para mo-léculas MHC classe I: HLA-A, HLA-B, e HLA-C. HLA-AI, HLA-A2, e HLA-AIIsão exemplos de diferentes moléculas MHC classe I que podem ser expres-sas a partir destes loci.
Conforme utilizado aqui, os termos "porção", "segmento", e"fragmento", quando utilizados em relação ao polipeptídeos, referem-se auma seqüência contínua de resíduos, tais como resíduos de aminoácidos,do qual cada seqüência forma um subconjunto de uma seqüência maior. Porexemplo, se um polipeptídeo foi submetido ao tratamento com qualquer dosendopeptidases comuns, tais como tripsina ou quimotripsina, os oligopeptí-deos resultantes de tal tratamento representariam porções, segmentos oufragmentos do polipeptídeo de partida. Isto significa que qualquer fragmentoirá conter necessariamente - como parte de sua seqüência de aminoácidos -um segmento, fragmento ou porção, que é substancialmente idêntico, casonão seja completamente idêntico, a uma seqüência de SEQ ID NO: 1 a 23,que correspondem às proteínas que surgem naturalmente, ou proteínas"mãe", de SEQ ID NO: 1 a 23. Quando usado em relação aos polinucleotí-deos, esses termos referem-se aos produtos produzidos por tratamento dosditos polinucleotídeos com qualquer um dos endonucleases comuns.
De acordo com a presente invenção, o termo "identidade porcento" ou "idêntico por cento", quando se refere a uma seqüência, significaque uma seqüência é comparada com uma seqüência já reivindicada oudescrita após o alinhamento da seqüência a ser comparada (a "SeqüênciaComparada") com a seqüência reivindicada ou descrita (a "Seqüência deReferência"). O Percentual de Identidade é então determinado de acordocom a seguinte fórmula:
Percentual de Identidade = 100 [I-(C/R)]onde C é o número de divergências entre a Seqüência de Referência e aSeqüência Comparada ao longo do comprimento do alinhamento entre aSeqüência de Referência e a Seqüência Comparada, onde
(i) cada base ou aminoácido na Seqüência de Referência quenão tem uma base alinhada correspondente ou o aminoácido na SeqüênciaComparada, e
(ii) cada lacuna na Seqüência de Referência, e
(iii) cada base ou aminoácido na Seqüência de Referência queseja diferente de uma base alinhada ou o aminoácido na Seqüência Compa-rada, constitui uma diferença;
e R é o número de bases ou aminoácidos na Seqüência de Re-ferência ao longo do comprimento do alinhamento com a Seqüência Compa-rada com qualquer lacuna criada na Seqüência de Referência também a sercontada como uma base ou de aminoácido.
Se existe um alinhamento entre a Seqüência Comparada e aSeqüência de Referência para as quais o Percentual de Identidade conformecalculado acima é de aproximadamente ou superior a um determinado Per-centual de Identidade mínimo, então a Seqüência Comparada tem o mínimoespecificado pela Percentual de Identidade para a Seqüência de Referência,embora possam existir alinhamentos, nos quais o percentual calculado aci-ma é menor do que o valor especificado na Percentual de Identidade.
Os peptídeos nas composições farmacêuticas da presente in-venção podem ser modificados pela substituição de um ou mais resíduos emdiferentes áreas, possivelmente seletivas, no interior da cadeia peptídica.Estas substituições podem ser de uma natureza conservadora, por exemplo,quando um aminoácido é substituído por um outro aminoácido de estrutura ecaracterísticas similares, tais como quando um aminoácido hidrofóbico ésubstituído por outro aminoácido hidrofóbico. Ainda mais conservadora seriaa substituição de aminoácidos do mesmo tipo ou tamanho e natureza quími-ca semelhantes, tais como a leucina é substituído por isoleucina. Em estu-dos de variações de seqüência na família de proteínas homólogas, que ocor-rem naturalmente, algumas substituições de aminoácidos foram mais fre-qüentemente toleradas do que outras, e estas muitas vezes demonstramcorrelação com semelhanças em tamanho, carga, polaridade, hidrofobicida-de entre o aminoácido original e a sua substituição, e essa é a base para adefinição de "substituições conservadoras".
Substituições conservadoras são definidas aqui como intercâm-bios no âmbito de um dos seguintes cinco grupos: Grupo 1 - alifático peque-no, resíduos não polares ou ligeiramente polares (Ala, Ser, Thr, Pro, Gly),Grupo 2 - resíduos polares, carregados negativamente e suas amidas (Asp,Asn, Glu, Gln); Grupo 3 - resíduos polares, carregados positivamente ((His,Arg, Lys); Grupo 4 - resíduos grandes, alifáticos, não polares (Met, Leu, Ne,Vai, Cis) e Grupo 5 - resíduos grandes, aromáticos (Phe, Tyr, Trp ).
Substituições menos conservadoras podem envolver a substitui-ção de um aminoácido por outro que tem características semelhantes, mas éum pouco diferente em tamanho, como a substituição de uma alanina porum resíduo de isoleucina. Substituições altamente não-conservadoras po-dem envolver substituição de um aminoácido acídico para um que é polar,ou mesmo para um de caráter básico. Tais substituições "radicais" não po-dem, contudo, ser julgadas potencialmente ineficazes, pois efeitos químicosnão são totalmente previsíveis e substituições radicais poderiam muito bemdar lugar a efeitos mais propícios não previsíveis a partir dos princípios sim-ples da química.
Evidentemente, essas substituições podem envolver estruturadiferente dos aminoácidos comuns L. Assim, D-aminoácidos podem sersubstituídos para o L-aminoácidos comumente encontrados nos peptídeosantigênicos da invenção e ainda podem ser englobados pela divulgação tra-tada aqui. Além disso, aminoácidos possuindo grupos R não-padrão (ou se-ja, grupos R diferentes daqueles encontrados nos 20 aminoácidos das prote-ínas naturais), podem também ser utilizados por motivos de substituição afim de produzir polipeptídeos imunógenos e imunogênicos de acordo com apresente invenção.
Se substituições forem encontradas em mais de uma posiçãopara resultar em um peptídeo com atividade antigênica substancialmenteequivalente ou maior como definido abaixo, combinações dessas substitui-ções serão testadas para determinar se as substituições resultam em efeitosaditivos ou sinérgicos sobre a antigenicidade do peptídeo. Na melhor dashipóteses, não mais do que quatro posições dentro do peptídeo podem sersubstituídas simultaneamente.
De preferência, quando os CTLs específicos para um peptídeode SEQ ID NO: I a 23 são testados contra os substituídos peptídeos, a con-centração de peptídeo na qual os peptídeos substituídos atingem a metadedo aumento máximo da lise relativa ao fundo não é mais do que aprox. 1mM, de preferência não mais de aprox. 1 uM, mais preferivelmente não maisde aprox. 1 nM, e ainda mais de preferência não mais de aprox. 100 pM, emais preferivelmente não mais de aprox. 10 pM. Também é preferível que opeptídeo substituído seja reconhecido por CTLs de mais de um indivíduo,pelo menos dois, e de preferência mais três indivíduos.
A mucina-1 (MUC1) é uma glicoproteína transmembrana do tipo 1altamente glicosilada, abundantemente sobreexpressa na superfície celularde vários adenocarcinomas humanos, tais como os cânceres de mama e deovário. A desglicosilação anormal em tumores malignos é comum e desmas-cara epitopos em células tumorais que podem não estar presentes em célu-las normais. Além disso, foi demonstrada a expressão de MUC1 em mielomamúltipla e alguns linfomas não-Hodgkin de células B. Diversos relatórios re-centes (Apostolopoulos V and McKenzie IF. Cellular mucins: targets for im-munotherapy. Crit Rev. Immunol. 14:293-309 (1994); Finn OJ, Jerome KR,Henderson RA, Pecher G, Domenech N, Magarian-Blander J, and Barratt-Boyes SM. MUC-1 epithelial tumor mucin-based immunity and câncervaccines. Immunol. Rev. 145:61-89 (1995); Barnd 1989; Takahashi 1994;nes. Immunol. Rev. 145:61-89 (1995); Barnd 1989; Takahashi 1994; Noto1997) demonstraram que células T citotóxicas MHC não restritas de tumoresde ovário, mama, pâncreas e mieloma múltiplo podem reconhecer epitoposdo cerne de proteína MUC1 localizado na repetição em tandem. Foram iden-tificados dois epitopos de célula T restritas a HLA-A2 derivados da proteínaMUC1 (Brossart 1999, EP 1484397). Um peptídeo é derivado da região derepetição em tandem da proteína MUC1. O segundo peptídeo localiza-sedentro da seqüência de sinais de MUC1. Tem-se obtido êxito na indução derespostas in vivo de linfócitos T citotóxicos após a vacinação com célulasdendríticas pulsadas com peptídeos em câncer avançado de mama ou deovário usando esses peptídeos (Brossart 2000) (Wierecky 2005), Com rela-ção ao carcinoma de células renais, a expressão de MUC1 é usual em tumo-res convencionais e foi relatado que ela está associada ao grau e ao estágiodo tumor. No caso da MUC1, a sobreexpressão de proteína não está corre-lacionada à sobreexpressão do mRNA.
A adipofilina é um marcador de células diferenciadas especializadascontendo gotículas lipídicas e de doenças associadas a células acumulado-ras de gordura (Heid 1998). A adipofilina ocorre numa grande variedade delinhagens de células cultivadas, incluindo os fibroblastos, bem como em cé-lulas endoteliais e epiteliais. No entanto, nos tecidos, a expressão da adipofi-lina restringe-se a certos tipos de células, tais como as células epiteliaismamárias lactantes, células do córtex adrenal, células de Sertoli e Leydig dosistema reprodutor masculino e na esteatose ou hepatócitos de degeneraçãograxa na cirrose hepática alcoólica (Heid 1998). Há relatos de adipofilina so-breexpressa em câncer colorretal (Saha 2001), carcinoma hepatocelular(Kurokawa 2004) e em carcinoma de células renais (Young 2001).
O c-Met codifica um receptor transmembrana heterodimérico comatividade de tirosina quinase composta de uma cadeia a ligada por dissulfitoa uma subunidade (3 (Bottaro 1991; Rubin 1993). Ambas as subunidadessão expressas na superfície, sendo a subunidade (3 pesada responsável porligar o ligante, o fator de crescimento dos hepatócitos (HGF), enquanto que asubunidade a contém um domínio intracelular que media a ativação de dife-rentes vias de transdução de sinais. A sinalização de c-Met está implicadana regeneração de órgãos, como foi constatado no fígado e rim, na embrio-gênese, hematopoiese, desenvolvimento muscular e na regulação da migra-ção e adesão de células B normalmente ativadas e monócitos (Zarnegar1995; Naldini 1991; Montesano 1998; Schmidt 1995; Uehara 1995; Bladt1995; Takayama 1996; Mizuno 1993; van, V 1997; Beilmann 2000). Alémdisso, diversos estudos apontaram para o envolvimento da sobreexpressãode c-Met na transformação maligna e na invasividade de células malignas.
O c-Met media as atividades multifuncionais e de potencial on-cogênico do fator HGF/SF incluindo a promoção do crescimento, motilidadee sobrevivência das células, na dissolução da matriz extracelular e na angio-gênese (Bottaro 1991; Rubin 1993; Zarnegar 1995). A ligação do HGF aoreceptor induz a autofosforilação de c-Met e ativa eventos de sinalização ajusante, incluindo ras, fosfatidilinositol 3'-quinase, fosfolipase Cv e vias rela-cionadas com proteína quinase ativadas por mitógeno. O gene c-Met é ex-presso predominantemente em células epiteliais e é superexpresso em di-versos tecidos e linhagens de células malignas. Um crescente número derelatórios mostrou que células não epiteliais, tais como células hematopoiéti-cas, neurais e do esqueleto respondem ao HGF e que malignidades hemato-lógicas tais como o mieloma múltiplo, doença de Hodgkin, leucemia e linfo-ma expressam a proteína c-Met. O controle desregulado do fenótipo decrescimento invasivo por c-Met ativado oncogenicamente provocado por mu-tações ativadoras de c-Met, amplificação ou superexpressão de c-Met e a-quisição de loops autócrinos de HGF/c-Met confere propriedades metastáti-cas e invasivas às células malignas. Notadamente, a ativação constitutiva dec-Met em camundongos transgênicos que superexpressam o HGF promoveampla gênese tumoral.
O regulador de sinalização 5 da proteína G (RGS5) é um reguladornegativo de vias sinalizadoras da proteína G heterotrimérica, embora suafunção in vivo ainda seja desconhecida. As proteínas RGS compreendemuma família de moléculas com função catalítica unificadora, mas de distribui-ção tecidual variada. Elas estimulam a atividade intrínseca da guanosinatrifosfatase (GTPase) de subunidades Ga ativadas e, desse modo, acelerama inativação da proteína G. Assim, as moléculas RGS inibem a sinalização ajusante dos receptores acoplados à proteína G (De 2000). Recentemente,demonstrou-se que a indução do regulador de sinalização da proteína Gem perícitos coincide com a remodelagem vascular ativa durante a neovas-cularização tumoral. Em um modelo de carcinogênese das ilhotas pancreáti-cas em camundongos, bem como em astrocitomas altamente angiogênicos,demonstrou-se a sobreexpressão de RGS5 em pericitos no retorno angiogê-nico ("angiogenic switch") que acompanha a remodelagem vascular ativa. Asobreexpressão restringiu-se aos vasos tumorais quando comparada a umailhota de Langerhans normal. No entanto, a RGS5 também é regulada nacicatrização de feridas e na ovulação (Berger 2005).
A expressão da RGS5 é aumentada no CCR (Rae 2000). Em outroestudo, a RT-PCR mostrou forte expressão de RGS5 em todos CCRs exa-minados, e a expressão foi muito fraca ou não detectável em rins normais(6.6:1 em PCR em tempo real). No CCR, o RGS5 foi encontrado principal-mente nas células endoteliais dos tumores (Furuya 2004). Além disso, foirelatado que a RGS5 é um marcador de células endoteliais dos sinusóidesem carcinoma hepatocelular (Chen 2004).
A apolipoproteína L1 (APOL1) é uma lipoproteína secretada, dealta densidade, que se liga à apolipoproteína A-l. A apolipoproteína A-l éuma proteína plasmatica relativamente abundante e é a principal apoproteí-na do HDL. Ela se envolve na formação da maioria dos ésteres de colesterolno plasma e também promove a saída do colesterol das células. A apolipo-proteína L1 pode ter função na troca e transporte lipídicos no corpo, bemcomo no transporte reverso de colesterol das células periféricas para o fíga-do. A proteína plasmatica é um polipeptídeo de cadeia simples com massamolecular aparente de cerca de 40 kDa (Duchateau 1997; Duchateau 2001).O cDNA da APOL1 foi isolado a partir de uma banco de cDNA de célulasendoteliais ativadas e foi constatado ser regulado pela TNF-a, uma potentecitocina pró-inflamatória. (Monajemi 2002).
O KIAA0367 foi identificado no Projeto cDNA Kazusa que buscaidentificar longos transcritos humanos desconhecidos que codificam supostasproteínas (Ohara 1997). Embora a função da suposta seqüência peptídica de820 aminoácidos correspondente ao produto do gene KIAA0367 seja desco-nhecida, ela contém um domínio de ligação a lipídio do tipo CRAL-TRIO pró-ximo à região c-terminal que se liga a pequenas moléculas hidrofóbicas eque está presente em vários fatores de troca de nucleotídeos e na proteína2 de interação com proteína (BNIP-2) presente em BCL2/adenovirus E1B19-kDa. O BNIP-2 está envolvido no controle de diversas funções celularesincluindo a morfologia, migração, endocitose celular e progressão do ciclocelular (Zhou 2005). O KIAA0367 está situado na região cromossômica9q21. Essa região é descrita como alvo comum de deleção homozigótica emdiversos tumores (Gursky 2001; Weber 2001) ou perda de heterozigosidade(Louhelainen 2000; Tripathi 2003).
A guanilato ciclase solúvel (GCs) é uma proteína heterodiméricaque consiste em uma subunidade alfa e uma subunidade beta (1 grupo he-me) e cataliza a conversão da GTP para o segundo cGMP mensageiro, fun-cionando como o principal receptor de oxido nítrico e nitrovasodilatadores(Zabel 1998). GUCYa3 e b3 estão sobreexpressos em gliomas humanos. Atransfecção de GUCY1A3 ou GUCY1B3 antisenso reduziu a vascularizaçãoe o crescimento de tumores em camundongos glabros. Isso pode se deverao fato de que VEGF é induzido por cGMP (Saino 2004). GUCY1A3 promo-ve a migração das células tumorais numa linhagem de células de tumor demama em camundongos (Jadeski 2003).
A ciclina D1 pertence à família altamente conservada de ciclinas,mas especificamente à subfamília de ciclina D (Xiong 1991; Lew 1991). Asciclinas funcionam como reguladores de CDKs (quinases ciclina-dependentes). As diferentes ciclinas apresentam diferentes padrões de ex-pressão e degradação que contribuem para a coordenação temporal de ca-da evento mitótico (Deshpande 2005). A ciclina D1 forma um complexo com,e age como, uma subunidade reguladora de CDK4 ou CDK6 cuja atividade énecessária para a transição G1/S de ciclo celular. CCND1 forma com CDK4e CDK6 um complexo de holoenzimas serina/treonina quinase conferindoespecificidade de substrato ao complexo (Bates 1994). Foi demonstrado quea proteína interage com a proteína Rb supressora de tumor (Loden 2002) e aexpressão desse gene é regulada de forma positiva pela Rb (Halaban 1999).Freqüentemente são observadas mutações, amplificação e sobreexpressãodesse gene, que altera o avanço do ciclo celular, numa série de diferentestumores, podendo contribuir para a gênese tumoral (Hedberg 1999; Vasef1999; Troussard 2000).
CSPG4 (condroitinas sulfato proteoglicano) representa umamembrana integral de sulfato proteoglicano de condroitina. É conhecida co-mo uma progressão da superfície celular melanoma marcadora prematura,implicada na estimulação tumoral da proliferação celular, migração e inva-são. CSPG4 é fortemente expresso em > 90% das lesões de melanoma hu-mano. Embora não seja estritamente CSPG4 específico de tumor, respostasde célula tumor reativa CD4 + T em indivíduos saudáveis e pacientes commelanoma CSPG4693-709 em células de melanoma expressando HLA-DR11na ausência de autoimunidade (Erfurt et al., 2007).
Expressão de CSPG4 também tem sido descrita em alguns teci-dos normais além de pericito ativado tais como células endoteliais, condróci-tos, células musculares lisas, alguns queratinócitos basais dentro da epider-me, bem como as células dentro do folículo piloso (Campoli et al., 2004).
Durante a angiogênese e, em resposta às patologias CNS, ascélulas altamente CSPG4 móvel sofrem rápidas mudanças morfológicas esão recrutadas para locais onde ocorrem o crescimento e a reparação dovaso. CSPG4 é sobreexpressá por ambas as células e pericitos tumoraissobre os vasos sangüíneos de tumores malignos do cérebro (Chekenya andPilkington, 2002). Ao implantar as células a partir de uma linha celular hu-mana glioma CSPG4 positiva em cérebros imunodeficientes de ratos nus.Foi demonstrado que estes tumores tinham uma maior densidade microvas-cular em comparação com os controles implicando que a expressão CSPG4regula tanto a função como a estrutura do tumor derivado hospedeiro devasculatura (Brekke et al., 2006). Em uma experiência xenoenxerto de im-plantação do material de GBM biópsia em ratos nus, CSPG4 foi identificadopor ser principalmente associado com os vasos sangüíneos, tanto sobre opericito como nos componentes da membrana basal da vascularização detumor e a expressão foi também associada com áreas de alta proliferaçãocelular (Chekenya et al., 2002a). Além disso, a progressão paralela da ex-pressão CSPG4 do tumor em um modelo de implante de glioma (Wiranows-ka etal., 2006).
CSPG4 é expressa diferencialmente em gliomas humanos commaior expressão em comparação elevada com gliomas de baixo grau(Chekenya et al., 1999). Alta expressão da CSPG4 correlaciona com resis-tência multidroga mediada pelo aumento da ativação de sinalização inte-grin/PI3K a3p1 e seus objetivos jusantes, promovendo a sobrevivência celu-lar (Chekenya et al., 2008).
FABP7: Proteína graxa ligadora de ácidos (FABPs) são proteí-nas citosólicas 14-15 kDa, que são supostas em ser envolvidas em ácidosgraxos (FA) captação, transporte e destino. Eles estão pensados para au-mentar a solubilidade dos FAs no citoplasma quando eles transportam FAsentre compartimentos de membrana, e trazem FAs para os seus objetivosnucleares (Glatz et al., 2002). FABPs podem modular concentração FA e,desta forma, influenciar diversas funções celulares, tais como atividade en-zimática, expressão gênica, o crescimento e diferenciação celular (Glatz andStorch, 2001).
FABP7 mRNA é expresso em tecidos de origem neuroepitelialassim como em tumores gliais malignos (WHO graus III e IV). O gene foimapeado na faixa de cromossomos 6q22-23, uma região que também con-tem os protooncogenes c-myc e freqüentemente é submetida a uma perdade heterozigosidade em gliomas malignos. Análises de linhas de células deglioma maligno demonstraram que FABP7 é freqüentemente co-expressacom a proteína glial fibrilar ácida (GFAP) sugerindo que a célula de origemglioma maligna possa ser uma precursora astrocitica que possui o potencialde expressar normalmente ambas as proteínas ou o resultado da formaçãodo tumor (Godbout et al., 1998). A proteína FABP7 mostra expressões nu-cleares e citoplásmicas de nível moderado a forte no GBM. Células gliomaFABP7 transfectadas apresentam uma migração 5 vezes maior do que célu-las de controle. Desta forma, o grau curto de sobrevivência geral associadocom sobreexpressão de FABP7 especialmente no GBM deve ter sido cau-sado pelo aumento de migração e invasão de células tumorais para o parên-quima ao redor do cérebro (Liang et ai., 2005). Outras análises da distribui-ção de FABP7 em tumores do tipo astrocitoma indicam um nível elevado deFABP7 em regiões de infiltrações dos tumores, propondo um papel impor-tante para FABP7 em conduzir a infiltração de células malignas para tecidosadjacentes do cérebro (Mita et al., 2007). FABP7 demonstra níveis de ex-pressão variáveis e localização subcelular em tecidos gliais e todos os níveisde astrocitoma. Não obstante, especialmente a localização nuclear deFABP7 parece ser associada com o fenótipo infiltrativo de células de gliomae vias EGFR, pois sua translocação nuclear é detectada após a ativaçãoEGFR e está associada com o mau prognóstico em GBM de EGFR positivo.Além disso, imunoreatividade FABP7 não nuclear pode ser observada emastrocitoma de grau I (Liang et al., 2006; Kaloshi et al., 2007).
Neuroligina 4, ligada a X é um membro de uma família de prote-ína de adesão celular que parece desempenhar um papel na maturação e nafunção das sinapses neuronais. Os membros da família neuroligina têm umaorganização estrutural relacionada, com um peptídeo sinal N terminal, o do-mínio similar ao esterase com duas áreas de conexão alternativa, uma pe-quena região elo de baixa identidade seqüencial na frente do domínio trans-membrana e uma parte citosólica curta com um C-Terminus altamente con-servado. Os níveis relativos mais altos de neuroligina 4 mRNA foram detec-tados de coração. Baixa expressão foi detectada no fígado, pâncreas e nomúsculo esquelético, enquanto no cérebro, placenta, pulmão e rim, neuroli-gina 4 mRNA foi dificilmente detectável (Bolliger et al., 2001).
Mutações no gene NLGN4 ligado a X são uma causa potencialde transtornos espectrais autistas, e mutações têm sido relatadas em algunspacientes com autismo, síndrome de Asperger e retardo mental (Jamain etal., 2003; Laumonnier et al., 2004; Lawson -Yuen et al., 2008).
Poucas associações de NLGN4X com câncer foram descober-tas: Nos tumores estromais gastrointestinais, foi encontrado sobre-expressão de NLGN4X em casos de adultos pediátricos e jovens versus a-dultos mais velhos (Prakash et al., 2005).
Tenascina C: A matriz extracelular que circula as células tumo-rais é diferente da matriz extracelular em tecidos normais. Tenascina C(TNC) é uma proteína de matriz extracelular que é altamente sobrereguladaem processos que estão intimamente associados com atividades migratóriaselevadas, tais como desenvolvimento embrionário (Bartsch et al., 1992), ci-catrização de feridas (Mackie et al., 1988) e processos neoplásticos (Chi-quet-Ehrismann, 1993; Chiquet-Ehrismann and Chiquet, 2003). Além disso,TNC é sobre-expresso em vasos tumorais que têm um alto índice proliferati-vo, que indica que a TNC está envolvida na angiogênese neoplastica (Kim etal., 2000). Em cérebros humanos normais, a expressão da TNC é detectadaapenas raramente onde ela é expressa em níveis elevados em gliomas ma-lignos (Bourdon et al., 1983). A expressão TNC pode ser induzida por hipó-xia (Lal et al., 2001), por betai TGF, proporcionando um mecanismo para ainvasão dos gliomas de alto grau em parênquima saudável (Hau et al.,2006), ou por gastrina, que modula significativamente a migração de célulashumanas GBM (Kucharczak et al., 2001). TNC subregula tropomiosina-1 e,assim, desestabiliza fibras estresse de actina. Ela também provoca subregu-lação do inibidor Wnt Dickkopfl. Como expressão reduzida de tropomiosina-1 e sinalização elevada de Wnt estão diretamente ligadas à transformação egênese tumoral. TNC, especificamente, modula estas vias de sinalizaçãopara melhorar a proliferação de células de glioma (Ruiz et al., 2004).
Coloração perivascular da TNC em torno de vasos sangüíneosque abastecem o tumor é observada em tecidos GBM, que é menos fre-qüente nos gliomas de grau II e III da OMS, indicando que a intensidade dacoloração TNC se correlaciona com o grau de tumor e a coloração mais forteindica um mau prognóstico (Herold-Mende et al., 2002). TNC também contri-bui para a geração de um nicho de células-tronco dentro da zona subventri-cular (SVZ), exercendo a função de orquestrar o fator de crescimento sinali-zando uma aceleração do desenvolvimento de células-tronco neurais. O e-feito predominante da TNC em células no SVZ é a regulamentação da pro-gressão desenvolvimental (Garcion et al., 2004). TNC é o indutor mais fortede migração de células-tronco humanas neurais dirigidas (NSC). A ECMproduzida por tumor oferece, assim, um ambiente permissivo para um tro-pismo NSC para células tumorais disseminadas (Ziu et al., 2006).
NRCAM (neuronal cell adhesion molecule) é uma molécula deadesão celular neuronal transmembranal com múltiplos domínios semelhan-tes à imunoglobulina do tipo C2 e à fibronectina do tipo III. Ela está envolvidana orientação, excrescência e fasciculação de células neuronais (Grumet etal., 1991; Morales et al., 1993; Stoeckli and Landmesser, 199 ; Perrin et al.,2001; Sakurai et al., 2001) por formar interações hemofílicas, bem como he-terofílicas com outros IgCAMs (Volkmer et al., 1996; Sakurai et al., 1997;Zacharias et al., 1999). A NRCAM que se liga à anquirina (Davis and Ben-nett, 1994) é sobreregulada no tubo formando células endoteliais, sugerindoassim um possível papel na formação de tubos e angiogênese (Aitkenheadet al., 2002).
NRCAM é um gene alvo do complexo catenina íi e placoglobinaLEF/TCF que contribui para oncogênese (Conacci-Sorrell et al., 2002). Aectodomínio NRCAM pode ser removida da superfície da célula por ativida-des semelhantes à metaloprotease. Este domínio de derramamento é apto aativar várias vias sinalizadoras, aprimorar a motilidade da célula e conferen-ciar gênese tumoral em ratos (Conacci-Sorrell et al., 2005).
NRCAM é regulada em astrocitomas anaplásticos e tecidos tu-morais GBM em comparação com um cérebro normal, e níveis elevados sãocorrelacionados com comportamentos invasivos (Sehgal et al., 1998). RNAantisenso contra NRCAM diminui a capacidade tumorigênica do GBM huma-no (Sehgal etal., 1999).
IGF2BP3 é um membro da família de proteínas similares à insu-lina do fator de crescimento II que se liga ao mRNA, implicada na localiza-ção, movimentação e controle translacional de mRNA. A proteína contémvários KH (homólogos K) domínios, que são importantes na união de RNA econhecidos por serem envolvidos na síntese de RNA e metabolismo. A ex-pressão ocorre principalmente durante o desenvolvimento embrionário e foidescrita para alguns tumores. Assim, IGF2BP3 é considerada uma proteínaoncofetal (Liao et al., 2005). A presença de altos níveis de transcriçãoIGF2BP3 em inúmeros tecidos de câncer, em comparação com tecidos decontrole indica que a proteína IGF2BP3 poderá desempenhar um papel fun-cional na proliferação de células transformadas. Esta hipótese é apoiadapela constatação de que o único tecido humano não-maligno que expressaIGF2BP3 transcritos é a placenta humana, um tecido caracterizado por cres-cimento e proliferação celular (Mueller-Pillasch et al., 1997).
Por exemplo, IGF2BP3 é expressa em modelos de células clarasRCC e sua expressão está associada à fase avançada e grau de tumoresprimários. Além disso, expressão IGF2BP3 positiva está associada a umrisco de metástases distantes aumentado 5-10 vezes e a um aumento dorisco de morte de 42% -50% pelo RCC (Hoffmann et al., 2008, Jiang et al.,2006; Jiang et al., 2008).
IGF2BP3 também é altamente expresso em carcinomas pancre-áticos. Em 2 estudos > 90% das amostras de tecido com tumor pancreáticoapresentaram expressão IGF2BP3 após imunocoloração, enquanto que te-cidos pancreáticos não neoplásticos foram negativos para IGF2BP3. Alémdisso, a expressão aumentou progressivamente com estádio tumoral (Yan-tiss et al., 2005; Yantiss et al., 2008).
Expressão de IGF2BP3 também foi encontrada por ser significa-tivamente aumentada nos tumores de alto grau urotelial enquanto não é ge-ralmente expressa em urotélio benigna ou tumores de baixo grau urotelial.Além disso, os pacientes com tumores IGF2BP3 positivos têm uma taxa desobrevivência livre de progressão e livre de doença muito menor do queaquelas com tumores IGF2BP3 negativos (Li et al., 2008; Sitnikova et al.,2008; Zheng et al., 2008).
Brevican (BCAN) é um membro específico do cérebro da famíliade lecticano de proteoglicanos de sulfato de condroitina. Foram registradosdois BCAN isoformes: Um isoforme de comprimento integral que é secretadopara matriz extracelular e um isoforme menor com uma seqüência que prevêuma âncora de glicofosfatidilinositol (GPI). O isoforme secretado é altamenteexpresso a partir do nascimento e até 8 anos de idade e é subregulado aos20 anos de idade para os níveis baixos que são mantidos no córtex adultonormal. O GPI isoforme é expresso em baixos níveis uniformes durante todoo desenvolvimento (Gary et al., 2000). BCAN pertence a uma família de pro-teoglicanos geralmente descritos como moléculas de barreira que impedemmotilidade neurite celular no sistema nervoso adulto (Viapiano e Matthews,2006). In vivo, BCAN é expresso em torno do perímetro do fluxo migratóriorostral (Jaworski e Fager, 2000) e é um importante componente sobreregu-lado da cicatriz glial após uma lesão neural (Jaworski et al., 1999).
BCAN mostra uma sobreregulação dramática em gliomas, ondepode ser detectado um aumento de expressão aproximadamente sete vezesacima dos níveis normais. BCAN mRNA não foi detectada em amostras decórtex de adultos humanos de indivíduos que morreram sem complicaçõesneurológicas. Em contraste com isso, BCAN mRNA foi detectado em cadauma das 27 amostras cirúrgicas de glioma humano, propondo desta manei-ra, que BCAN poderia ser um marcador único e seletivo no glioma (Jaworskiet al., 1996).
A proteína tirosina fosfatase, do tipo receptor, Zetal (PTPRZ1,PTP-Ç) - PTPRZ1 é um membro da família de proteínas tirosina fosfatase dotipo receptor que codifica uma proteína membrana de passe simples do tipo Icom dois domínios de proteína tirosina citoplasmática fosfatase, um domíniode alfa anidrase carbônica e um domínio de fibronectina tipo III. A expressãodesse gene é induzida em células de câncer gástrico (Wu et al., 2006), emcâncer de mama (Perez-Pinera et al., 2007), nos oligodendrócitos remielini-zantes de lesões da esclerose múltipla (Harroch et al., 2002), e em célulasembrionárias do rim humano sob condições hipóxicas (Wang et al., 2005).
Tanto a proteína como o transcrito são sobreexpressas nas célulasglioblastoma, promovendo assim sua migração hatotatica (Lu et al., 2005) e aamplificação de DNA genômico no glioblastoma (Mulholland et al., 2006).
Como Chitinase 3 2 (CHI3L2) - CHI3L2 foi inicialmente identifi-cada a partir de condrócitos e é sobreregulada como, por exemplo, na oste-oartrite (Steck et al., 2002). Apesar da proteína não estar bem caracterizadaainda, é mais provável que ela seja secretada no espaço extracelular. Elatem sido freqüentemente descrita como um antígeno alvo na artrite reuma-tóide. Indução anti-angiogênese experimental por transfecção siRNA (VEGF-A) de uma linha celular do glioma humano causou sobreregulamentação deCHI3L2.
Survivina (BIRC5) - Expressão de BIRC5 (survivin), um membrodo inibidor da família de proteínas apoptose (IAP), é elevado em tecidos fe-tais e em diversos tumores humanos. Survivina parece ser capaz de regulartanto a proliferação celular como a morte celular apoptótica. Especialmenteno glioblastoma foram detectáveis níveis muito altos de expressão survivina(Angileri et al., 2008). É sugerido que a sobreexpressão de survivina em gli-omas cerebrais pode desempenhar um papel importante na proliferação ma-ligna, na anti-apoptose e na angiogênese (Zhen et al.. 2005; Liu et al., 2006).Especialmente para glioblastoma, mas também para outras entidades tumo-rais, expressão de survivina foi significativamente associada com o grau demalignidade (survivina com a maior expressão no glioblastoma) e com otempo de sobrevivência global menor em comparação com pacientes quetiveram tumores de survivina negativa (Kajiwara et al., 2003; Saito et al.,2007; Uematsu et al., 2005; Mellai et al., 2008; Grunda et al., 2006; Xie et al.,2006; Sasaki et al., 2002; Chakravarti et al., 2002).
As proteínas da família da metaloproteinase matricial (MMP) es-tão envolvidas na quebra da matriz extracelular em processos fisiológicosnormais, tais como desenvolvimento embrionário, reprodução e remodela-gem tecidual, bem como em processos mórbidos, como artrite e metástase(Mott 2004). A matriz metaloproteinase 7 (MMP7) é secretada como pró-proteína inativa de 29.6 kDa, que é ativada quando clivada por proteinasesextracelulares. A enzima ativa tem peso molecular 19.1 kDa e se liga a doisíons de zinco e dois íons de cálcio por subunidade (Miyazaki 1990; Browner1995). A MMP7 decompõe gelatinas, fibronectinas e caseína (Miyazaki1990; Quantin 1989) e difere da maioria dos membros da família de MMPpor não ter um domínio de proteína terminal C conservada (Gaire 1994). AMMP7 está freqüentemente superexpressa em tecido maligno (Lin 2004;Bramhall 1997; Denys 2004) e supõe-se que ela facilite a invasão de célulastumorais in vivo (Wang 2005).
Essas proteínas podem ser alvo de uma resposta imune especí-fica do tumor em diversos tipos de câncer.
O peptídeo HBV-001 antígeno do núcleo do vírus da hepatite Bnão é derivado de um antígeno associado à um tumor endógena humano,mas é derivado do antígeno do núcleo do vírus da hepatite B. Primeiro, elepermite a comparação quantitativa da magnitude das respostas de células Tinduzida por peptídeos associados a tumor (TUMAPs) utilizados nas compo-sições farmacêuticas da presente invenção e, portanto, permite um estudode sua capacidade de obter respostas anti-tumorais. Segundo, ela age comoum importante controle positivo no caso de ausência de respostas das célu-las T no paciente. Terceiro, ela também permite a monitoração da imuno-competência do paciente.
A infecção com o vírus da hepatite B (VHB) é uma das principaiscausas das doenças hepáticas, atingindo cerca de 350 milhões de pessoasao redor do mundo (Rehermann 2005). Devido à facilidade da transmissãohorizontal e vertical e o potencial da doença se tornar crônica, que pode le-var à cirrose hepática e ao carcinoma hepatocelular, o VHB representa umgrande impacto no sistema público de saúde de inúmeros países. O genomado VHB (Previsani 2002) é formado de DNA circular parcialmente de fita du-pla. Nos vírions de VHB, ele é conjugado com a proteína essencial do capsí-deo HBc e outras proteínas para formar o nucleocapsídeo, que é cercadopor um envelope externo contendo lipídios e a família HBs de proteínas desuperfície (também chamada de proteína do envelope). A notação dos de-terminantes antigênicos associados a HBc e HBs é HBcAg e HBsAg, respec-tivamente. Esses antígenos são associados a respostas sorológicas, ou se-ja, de anticorpos encontrados no sangue do paciente e estão entre os siste-mas antígeno-anticorpo mais úteis para o diagnóstico de infecção com VHB.O HBc irá representar um novo antígeno estranho, para todos aqueles quenão tenham um histórico de infecção com VHB. Como os peptídeos imuno-gênicos para esse antígeno são bem conhecidos (Bertoletti 1993; Livingston1997), selecionou-se um peptídeo de 10 aminoácidos do HBcAg como antí-geno de controle positivo dentro do IMA. A indução de Células T citotóxicasespecíficos do peptídeo HBc será então utilizada como marcador da imuno-competência e vacinação bem sucedida.
As composições farmacêuticas da presente invenção podem serusadas para administração parenteral como, por exemplo, por via subcutâ-nea, intradérmica, intravenosa, intramuscular ou administração oral. Paraisso, os peptídeos são dissolvidos ou suspensos em veículo em forma far-macêutica aceitável, de preferência em forma aquosa. Além disso, o com-posto pode conter excipientes como antioxidantes, ligantes, agentes preser-vantes, tampões, ligantes, agentes desintegrantes, diluentes e flavorizantes.Os peptídeos também podem ser administrados juntamente com substân-cias imunoestimulantes tais como as citocinas. Uma relação completa deexcipientes utilizáveis nessa composição pode ser obtida, por exemplo, deA. Kibbe, Handbook of Pharmaceutical Excipients, 3a ed., 2000, da AmericanPharmaceutical Association e da imprensa farmacêutica. As composições dapresente invenção podem ser usadas para a prevenção, profilaxia e/ou tera-pia de doenças adenomatosas ou cancerígenas.
Composições farmacêuticas da presente invenção podem seradministradas a um paciente que sofra de uma doença adenomatosa oucancerosa que esteja associada com os respectivos peptídeos ou antígenode SEQ ID NO :1-10 ou um paciente que sofre de câncer cerebral, em espe-cial glioma, especialmente doença cancerosa glioblastoma que esteja asso-ciada com o respectivo peptídeo ou antigénio de SEQ ID NO: 11 a 22 ou 11a 23. Os peptídeos na composição dos produtos farmacêuticos são capazesde desencadear uma resposta imune mediada por célula T. no paciente. Talcomo referido acima, no caso de um câncer de células renais, uma composi-ção farmacêutica de acordo com a presente invenção contém de preferênciaum peptídeo composto pela seqüência de aminoácidos estabelecida emSEQ ID NO:1 e / ou SEQ ID NO:2 e inclui pelo menos um peptídeo associa-do a tumor contendo a seqüência de aminoácidos estabelecida em no SEQID NO: 3 a SEQ ID NO: 10. No caso de um câncer cerebral, em particularglioma, especialmente doença cancerosa glioblastoma, a composição far-macêutica contém de preferência uma seqüência de estabelecida em SEQID NO: 12 e / ou SEQ ID NO: 13 e inclui pelo menos um peptídeo associado atumor contendo a seqüência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:11 e 14 a 22 e/ou 23..
Assim, um peptídeo preferencial da presente invenção exibe umcomprimento total entre 9 e 100 aminoácidos, de preferência entre 9 e 30aminoácidos e de preferência ainda maior entre 9 e 16 aminoácidos. Alémdisso, pelo menos um peptídeo de acordo com qualquer uma das SEQ IDNO: 1 a SEQ ID NO: 23 pode incluir ligações não-peptídicas.
Uma composição farmacêutica da presente invenção (de prefe-rência para a vacina contra câncer de células renais) contém um peptídeocomposto pela seqüência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO: 1e/ou SEQ ID NO: 2 e em outras variantes ainda incluem pelo menos um pep-tídeo constituído por seqüência de aminoácidos estabelecida em SEQ IDNO: 3 a SEQ ID NO: 11.
Uma composição farmacêutica preferida da invenção (câncercerebral, em particular glioma, especialmente vacina contra doença cance-rosa glioblastoma) contém um peptídeo composto pela seqüência de amino-ácidos estabelecida em SEQ ID NO: 12 e/ou SEQ ID NO: 13 e em outrasvariantes ainda incluem pelo menos um peptídeo constituído por seqüênciade aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO: 11 a SEQ ID NO: 22 e/ou 23.
O peptídeo pode também ser marcado, ser uma proteína de fu-são ou uma molécula híbrida. Espera-se que os peptídeos cujas seqüênciassão dadas na presente invenção estimulem os linfócitos T citotóxicos CD8+.No entanto, a estimulação é mais eficiente quando houver ajuda por partedas células T CD4+. Assim, o parceiro de fusão ou as secções de uma mo-lécula híbrida apropriada produzem epitopos que estimulam as células TCD4+. Os epitopos que estimulam as CD4+ são bem conhecidos no estadoda técnica, e incluem aqueles identificados no toxóide tetânico. Em umavariante preferida, o peptídeo é uma proteína de fusão, em particular com-preendendo aminoácidos de terminal N da cadeia invariante HLA-DR asso-ciada ao antígeno (li). Em uma outra variante da invenção, o peptídeo é umaproteína humana truncada ou uma proteína de fusão de um fragmento deproteína e outra parte polipeptídica, desde que a parte humana inclua umaou mais seqüências de aminoácidos conforme a invenção.
Peptídeos úteis na composição farmacêutica podem ser subs-tancialmente puros, ou combinados com um adjuvante imunoestimulante, ouusados em combinação com as citocinas imunoestimulantes, ou ser adminis-trados com um sistema de administração adequado, por exemplo, liposso-mas, micropartículas, nanopartículas, micelas, emulsões e géis. A vacinaçãocom peptídeo em geral precisa de adjuvantes e, portanto, utiliza-se prefe-rencialmente o GM-CSF (O GM-CSF humano é comercializado sob o nomeSargramostim® e Leukine®, e é disponível pela Berlex, agora chamada BayerHealth Care Pharmaceuticals). Outros adjuvantes adequados são o QS21stimulon (Aquila Biotech, Worcester, MA, EUA), derivado da saponina, extra-tos micobacterianos e imitadores sintéticos da parede celular bacteriana, eadjuvantes de marca como, por exemplo, o Detox da Ribi. Também se podeutilizar o Quil A, outro adjuvante derivado da saponina (Superfos, Denmark).Outros adjuvantes, como por exemplo, o da empresa Freund, também po-dem ser úteis. Também pode ser conveniente administrar o peptídeo conju-gado a um veículo adequado, tal como a hemocianina de molusco (KLH) oumanana (vide WO 95/18145 e Longenecker et al (1993) Ann. NY Acad. Sei.690,276-291). Uma vez que a definição de adjuvante no dicionário médico(MedlinePIus® Medicai Dictionary, NIH) é toda substância que aumenta aresposta imune do antígeno, outras substâncias com essa função tambémpodem ser usadas, inclusive - mas sem se limitar a eles - substâncias ago-nistas de receptores do tipo "toll" (agonistas TLR, toll-like receptors), prefe-rencialmente substâncias que interagem de forma antagonista com o TLR 3,7, 8 e 9, como por exemplo o RNA estabilizador de protamina, oligonucleotí-deos CpG, oligonucleotídeos CpR, DNA de bactérias, imidazoquinolinas, etc.
Outras substâncias conhecidas no estado da técnica de seremcapazes de aumentar a resposta imune incluem - sem se restringirem a eles- os inibidores de sintase do oxido nítrico induzível (iNOS), arginase (ARG1),indoleamina-2,3-dioxigenase (IDO), receptor 1 de fator de crescimento endo-telial vascular (VEGFR-1), fator de crescimento endotelial vascular (VEGF),ciclooxigenase-2 (COX-2), receptor I TGF-beta (TGF-beta-RI). Esses inibido-res podem, por exemplo, ser anticorpos monoclonais contra as tais molécu-las ou pequenas moléculas. As pequenas moléculas e anticorpos monoclo-nais conhecidos do estado atual da técnica por exercerem uma função inibi-dora em relação aos fatores antes mencionados e, portanto, um efeito deaumento de resposta imune é, por exemplo: 1-MT, NCX-4016, rofecoxib,celebrex, BEC, ABH, nor-NOHA, SB-505124, SD-208, LY580276, AMD3100,axitinib, bevacizumab, JSI-124, CPA-7, XL-999, ZD2171, pazopanib, CP-547632, e VEGF Trap.
Da mesma forma, substâncias que reduzem a quantidade decélulas T reguladoras (CD4+, CD25+, FoxP3+) também são adequadas co-mo adjuvantes. Aqui se incluem, mas não se restringem a elas, as seguintessubstâncias: ciclofosfamida (Cytoxan), ONTAK (denileucina diftitox), Suniti-nib, anti-CTLA-4 (MDX-010, CP-675206), anti-CD25, anti-CCL22 e anti-GITR.
Quantidades preferenciais de peptídeos da composição farma-cêutica - de acordo com a presente invenção - podem variar entre aproxima-damente 0,1 e 100 mg, de preferência entre aproximadamente 0,1 e 1 mg, ecom maior preferência ainda entre aproximadamente 300 ug e 800 ug por500 pi de solução. O termo "aproximadamente" significa +/- 10 por cento doreferido valor, exceto onde mencionado de forma diferente. O profissionalhabilitado saberá ajustar a quantidade efetiva de peptídeo a ser usada combase em diversos fatores tais como, por exemplo, a situação imunológica dopaciente individual e/ou a quantidade de TUMAP presente em um tipo decâncer em particular.
Composições farmacêuticas da presente invenção fornecemuma formulação com uma solubilidade extremamente reforçada e uma umi-dificação do liofilizado para níveis acima das composições anteriormenteconhecidas. Isto foi obtido com uma composição especial de excipientes.Desta forma, composições farmacêuticas da presente invenção compreen-dem peptídeos da SEQ ID NO: 1 a 10 ou SEQ ID NO: 1 a 11 e variantes dasmesmas foram desenvolvidas, que demonstram uma excelente estabilidadede armazenamento (-20°C, +5°C, +25°C) e podem ser facilmente redissolvi-das.
O termo "estabilidade de armazenamento" significa que a per-centagem de subprodutos residuais não ultrapassa 5% em dois anos. Alémdisso, a termo "estabilidade" significa que as propriedades específicas, taiscomo a solubilidade, a clareza óptica da solução e o número de partículas nasolução não mudam perceptivelmente durante esse período.
O termo "facilmente redissolvido" significa que o liofilizado podeser completamente dissolvido através da utilização de um tampão ou outroexcipiente dentro de alguns segundos até dois minutos, sem a utilização deum homogenizador ultra-sônico. Além disso, a composição pode ser facil-mente aplicada a um paciente com necessidade de tratamento de forma in-tradérmica, e menos preferencialmente de forma subcutânea. O valor de pHda solução resultante deve se encontrar entre pH 2.7 e pH 9.
Em outra variante, uma composição farmacêutica da presenteinvenção pode incluir açúcares, alcoóis de açúcar, aminoácidos tal como aglicina, a arginina, o ácido glutâmico e outros como formador de quadro. Osaçúcares podem ser monossacarídeo, dissacarídeo ou trissacarídeo. Essesaçúcares podem ser utilizados isoladamente, assim como em combinaçãocom os alcoóis de açúcar. Exemplos de açúcares incluem glicose, manose,galactose, frutose ou sorbose como monossacarídeos; sacarose, sucrose,lactose, maltose ou trealose como dissacarídeos e rafinose como um trissa-carídeo. Um álcool de açúcar pode ser, por exemplo, a manitose. Ingredien-tes preferidos são a sacarose, sucrose, lactose, maltose, trealose, mannita e/ ou sorbita e, mais preferencialmente, a mannitol.
Além disso, composições farmacêuticas da presente invençãoainda podem incluir excipientes fisiologicamente bem tolerados (ver o Hand-book of Pharmaceutical Excipients, 5th ed., edited by Raymond Rowe, PaulSheskey and Sian Owen, Pharmaceutical Press (2006)), tais como antioxi-dantes como o ácido ascórbico ou a glutationa , agentes conservantes comofenol, m-cresol, metilparabeno ou propilparabeno, clorobutanol, tiomersal oucloreto benzalcônio, estabilizador, formador de quadro, como sacarose, su-crose, lactose, maltose, trealose, mannitose, mannit e / ou sorbit, mannit e /ou lactose e solvente tais como polietilenoglicol (PEG), ou seja, PEG 3000,3350, 4000 ou 6000, ou ciclodextrinas, ou seja, hidroxipropilos-fS-ciclodextrina, sulfobutylethyl-íi-ciclodextrina ou y ciclodextrina, ou dextranesou poloxamers, ou seja, poloxamer 407 ®, Poloxamer 188, ou Tween 20 ®,Tween 80 80®. Em uma outra variante preferida de composição farmacêuticada presente invenção inclui um ou mais excipientes bem tolerados, selecio-nados a partir de um grupo composto de antioxidantes, formadores de qua-dro e estabilizadores.
A presente invenção refere-se à conclusão de que as formula-ções, incluindo, pelo menos, dois conjuntos de peptídeos segundo a SEQ IDNO: 1 a 10 ou SEQ ID NO: 1 a 11, mannitol e poloxamer 188 em uma de-terminada relação podem levar a composições que demonstram uma estabi-lidade altamente reforçada e podem ser dissolvidos sem a utilização de tra-tamentos ultra-sônicos. Além disso, a dissolução exige apenas alguns se-gundos. Como uma especificação do liofilizado, uma solução clara até opa-lescente deve ser observada por inspeção visual após a reconstituição com4.2% de solução de bicarbonato de sódio. Estas características de resolubili-zação das composições farmacêuticas da presente invenção são reprodutí-veis, mesmo após o armazenamento do medicamento a -20°C, +5°C e+25°C por 2 anos.
Além disso, a presente invenção refere-se a formulações inclu-indo, pelo menos, quatro conjuntos de peptídeos de acordo com a SEQ IDNO: 11 a SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 11 a SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 12a SEQ ID NO: 22 ou SEQ ID NO: 12 a SEQ ID NO: 23, onde mannitol e po-loxamer 188 em uma determinada relação resulta em composições que po-dem ser facilmente dissolvidas. Como uma especificação do liofilizado, umasolução clara até opalescente deve ser observada por inspeção visual apósa reconstituição com 4.2% de solução de bicarbonato de sódio. Os peptí-deos individuais descritos na formulação são estáveis durante pelo menos 3meses após o armazenamento a -20°C, +5°C e +25°.
Em uma outra variante preferida, composições farmacêuticas dapresente invenção compreendem uma determinada relação peptídeos: man-nitohTween 80® (por peso), inclusive na faixa de entre 1:2:1.5 a 1:8:2.2. Vejao gráfico abaixo para outras relações preferenciais, que são incluídas napresente invenção. Uma razão é especialmente preferida é 1:5:2. Outra ra-zão especialmente preferida é 1:8:2.
Em uma outra variante preferida, composições farmacêuticas dapresente invenção compreendem uma determinada relação de peptí-deos:mannitol:poloxamer 188 (por peso), inclusive na faixa de entre 1:5:1.5 a1:8:2.2. Veja o gráfico abaixo para outras relações preferenciais, que sãoincluídas na presente invenção. Uma razão preferida é 1:5:1.
Outra razão de peptídeos especialmente preferida: manni-tokpoloxamer 188 por peso é a 1:8:2. Uma composição mais preferida incluiuma mistura de peptídeos: mannitol:Poloxamer 188® em uma razão de 1:5:2por peso (ver exemplo 2). Outra razão inclui peptídeos:mannitol:poloxamer188 na razão de 1:0:2 a 1:2:2.2 por peso.
Outras variantes da presente invenção incluem as seguintes ra-zões por peso:
<table>table see original document page 39</column></row><table><table>table see original document page 40</column></row><table><table>table see original document page 41</column></row><table>
As composições farmacêuticas da presente invenção podem serliofilizadas. O liofilizado obtido pode ser reconstituído em uma composiçãohidratada através da adição de uma solvente hidroso. A composição hidrosadeveria ser preferencialmente capaz de ser diretamente administrada deforma paternal a um paciente. Por conseguinte, uma nova variante da pre-sente invenção é uma composição farmacêutica hidratada das formulaçõesdivulgadas acima, disponíveis através da reconstituição do liofilizado descritoacima com um solvente hidratado.
O intervalo de pH aceitável é -pH 2-12 para a administraçãointravenosa e intramuscular, subcutânea, mas o intervalo é reduzido para 2.7- 9.0 pois a taxa de diluição in vivo é reduzida, resultando em um potencialmaior para irradiação no local da injeção. Strickley Robert G., Pharm. Res.,21, NO:2, 201 -230 (2004).
Uma composição farmacêutica preferencialmente hidrosa dainvenção tem um valor de pH entre 7 a 9, ainda mais preferencialmente, umvalor de pH de 8 a 9 e, ainda mais preferencialmente, um valor de pH entre8.3 e 8.7.
Composições farmacêuticas da presente invenção são fisiologi-camente bem tolerada, facilmente produzível, exatamente dosável, e de-monstram uma excelente estabilidade de armazenamento relativa à concen-tração, produtos da decomposição e agregados para o tempo de armaze-namento. As preparações podem ser armazenadas de forma estável por 2anos em um congelador a -20°C, em uma geladeira (+2-8°C) e até mesmosob temperatura ambiente (+25°C), com 60% de umidade relativa.
Composições farmacêuticas da presente invenção são preferen-cialmente estéreis e formuladas para administração in vivo.
A presente invenção também fornece um método para geraruma resposta imune em um determinado objeto, ou seja, o referido métodocompreendendo a administração relativa ao objeto em uma mesma necessi-dade de composição farmacêutica da presente invenção, onde os ditos pep-tídeos, suas variantes ou sais são administrados em uma quantidade eficaz,de preferência uma quantidade suficiente para gerar a resposta imune emquestão. A invenção ainda prevê a utilização de uma composição farmacêu-tica da invenção de um medicamento para a administração de um objeto, afim de gerar uma resposta imune contra o câncer. Ela também inclui o uso deuma composição farmacêutica da presente invenção para o tratamento do cân-cer, de preferência câncer renal, bem como a utilização na fabricação de ummedicamento para administração a um objeto com a finalidade de gerar umaresposta imune contra o câncer e, sendo assim, para tratar o câncer.
Peptídeos utilizados na composição farmacêutica são preferen-cialmente puros, ou essencialmente puros e, de preferência, essencialmentehomogêneos (isto é, isentos de peptídeos ou proteínas contaminantes, etc)."Essencialmente puro" significa uma preparação de peptídeo por HPLC compureza de pelo menos 90%, e de preferência pelo menos 95%. Uma prepa-ração "essencialmente homogênea" significa uma preparação de peptídeocontendo pelo menos 99% do peptídeo, com base no peso total do peptídeona preparação.
Além disso, a presente invenção ainda inclui um kit composto por:
(a) um recipiente que contém uma composição farmacêutica,conforme o descrito acima, em solução ou em forma liofilizada;
(b) opcionalmente, um segundo recipiente contendo um diluenteou solução reconstituinte para a formulação liofilizada; e
(b) opcionalmente, instruções para o (i) uso da solução ou (ii)reconstituição e / ou a utilização da formulação liofilizada.
O kit pode ainda incluir um ou mais tampões (i), um diluente (ii),um filtro (iii), uma agulha (iv), ou uma seringa (v). O recipiente deve ser depreferência uma garrafa, um frasco, uma seringa ou um tubo de ensaio, eele pode ser um recipiente multiuso. A composição farmacêutica é, de prefe-rência, liofilizada.
Kits da presente invenção contêm, de preferência, uma formula-ção liofilizada da presente invenção em um recipiente adequado assim comoas instruções para a sua reconstituição e / ou utilização. Recipientes ade-quados incluem, por exemplo, garrafas, frascos (por exemplo, frascos decâmara dupla), seringas (por exemplo, seringas de câmara dupla) e tubos deensaio. O recipiente pode ser formado a partir de uma variedade de materi-ais como vidro ou plástico. Preferencialmente, o kit e / ou o recipiente con-têm instruções sobre o recipiente ou similares que apresentem as indicaçõespara a reconstituição e / ou utilização. Por exemplo, o rótulo poderá indicarque a formulação liofilizada deverá ser reconstituída a concentrações depeptídeos, tal como descrito acima. O rótulo ainda pode indicar que a formu-lação é destinada ou apropriada para administração subcutânea.
O recipiente que detém a formulação pode ser um frasco multiu-so, que permite a repetição de administrações (por exemplo, 2-6 administra-ções), da formulação reconstituída. O kit ainda pode incluir um segundo re-cipiente, contendo um diluente adequado (por exemplo, solução de bicarbo-nato de sódio).
Após a mistura do diluente e da formulação liofilizada, a concen-tração no final de peptídeo na formulação reconstituída é, de preferência,pelo menos, 0,15 mg/mL/peptídeo (= 75 ug) e preferencialmente não superi-or a 3 mg/mL/peptídeo (= 1500 ug). O kit ainda pode incluir outros materiais,conforme desejado a partir de uma perspectiva comercial ou do usuário, in-cluindo outros tampões, diluentes, filtros, agulhas, seringas, e suplementosde embalagem com instruções de utilização.
Kits da presente invenção podem ter um único recipiente quecontém a formulação das composições farmacêuticas, segundo a presenteinvenção, com ou sem outros componentes (por exemplo, outros compostosou composições farmacêuticas desses outros compostos), ou podem ter re-cipientes distintos para cada componente.
Preferencialmente, kits da invenção incluem uma formulação dainvenção embalada para uso em combinação com a co-administração de umsegundo composto (como adjuvantes (por ex. GM-CSF, um agente quimiote-rapia), um produto natural, um hormônio ou antagonista, um agente ou inibi-dor de anti-angiogênese, um agente indutor de apoptose ou um quelante) ouuma composição farmacêutica dos mesmos. Os componentes do kit podeser pré-complexado ou cada componente pode ser depositado separada-mente em recipientes distintos antes da administração a um paciente. Oscomponentes do kit podem ser fornecidos em uma ou mais soluções líqui-das, de preferência, uma solução aquosa, ainda mais preferencialmente,uma solução aquosa estéril. Os componentes do kit também podem ser fornecidos como sólidos, que podem ser convertidos em líquidos através da adição de solventes adequados, que devem ser fornecidos preferencialmente em um recipiente distinto.
O recipiente de um kit terapêutico pode ser um frasco, tubo de ensaio, container, garrafa, seringa, ou quaisquer outros meios de armazenamento de sólidos ou líquidos. Normalmente, quando há mais de um componente, o kit deverá conter um segundo frasco ou outro recipiente, que permita separar a dosagem. O kit também pode conter um outro recipiente para um líquido farmaceuticamente aceitável. De preferência, o kit terapêutico deverá conter um aparelho (por exemplo, uma ou mais agulhas, seringas, conta-gotas, pipetas, etc), que permita a administração correta dos agentes da invenção que são componentes do presente kit.
A presente formulação é adequada para a administração dos peptídeos por qualquer via aceitável, tal como a oral (entérica), nasal, oftál-mica, subcutânea, intradérmica, intramuscular, intravenosa ou transdérmica. De preferência a administração deve ser subcutânea e, ainda mais preferencialmente, intradérmica, que pode ser efetuada por bomba de infusão. Procedimento do ensaio analítico:
A identidade, a pureza e o conteúdo do peptídeo são determinados por cromatografia analítica RP-HPLC. A onda de detecção foi de 220 nm. Teste de Estabilidade (estabilidade dos testes de formulações):
a) Vacina contra câncer de células renais:
Diversos liofilizados foram testados com relação à estabilidade de cada peptídeo a +25°C e +40°C utilizando um ensaio HPLC analítico. Os testes de estresse a +25°C e +40°C foram realizados para determinar em quais tendências a formulação é mais estável, sob altas temperaturas e sob temperatura ambiente.
Os peptídeos de acordo com as SEQ ID NOs: 1 a 10 foram liofilizados sem excipientes e através da adição de mannitol e poloxamer 188 (Lutrol F68 ®) ou Tween 80 ®.
As seguintes formulações teste foram produzidas e as estabili-dades foram avaliadas a +25°C e +40°C por ensaio HPLC analítico:
Formulação 1: Peptídeos sem excipientes;
Formulação 2: Peptídeos: mannitol : Lutrol F68® (Poloxamer 188) (1:5:2 por peso);
Formulação 3: Peptídeos: mannitol: Tween 80® (1:5:2 por peso); e
Formulação 4: Peptídeos: mannitol: Tween 80® (1:5:1 por peso).
Medições HPLC iniciais foram realizadas para cada formulação antes do armazenamento em uma câmara climática. Para este efeito, o conteúdo de dois frascos foi completamente dissolvido em 30% de ácido acético e medido por RP-HPLC por repetição de determinação. Para garantir a com-parabilidade entre as medições individuais, íi-naftil-alanina foi utilizado como padrão interno e liofilizado juntamente com os peptídeos.
Após 7, 14, 21 e 28 dias, outros dois frascos foram retirados da câmara climática para avaliar a estabilidade.
Avaliação de dados foi realizada por repetição de determinação de um frasco. Para um ponto tempo e temperatura, dois frascos independentes foram utilizados para obter quatro pontos de dados no total. Estes valores têm sido utilizados para calcular o desvio padrão, mostrado como barras de erro no respectivo esquema.
Como resultado dos experimentos, a estabilidade de cada peptí-deo individual da formulação com mannitol e Lutrol F68® é comparável com os resultados obtidos pela formulação sem quaisquer excipientes. Formulações contendo Tween 80 ® mostram degradação reforçada do IMA-RGS-001 em especial a +40°C e um aumento do sinal, especialmente para o pep-tídeo IMA-FDA-001. Este aumento pode ter sido gerado devido ao processo de co-eluição de impurezas causadas pela degradação dos peptídeos. b) Vacina contra câncer glioblastoma:
Diversos liofilizados foram testados com relação à solubilidade e estabilidade dos peptídeos formulados na mistura.
Os peptídeos de acordo com a SEQ ID NOs: 11 a 23 foram liofilizados sem excipientes e através da adição de Mannitol/Poloxamer 188 (Lutrol F68®) e Mannitol/Tween 80®.As seguintes formulações teste foram produzidas e suas solubi-lidades em diferentes soluções assim como suas estabilidades a +25°C e +40°C foram testadas.
Formulação 1: Peptídeos sem excipientes;
Formulação 2: Peptídeos: mannitol : Lutrol F68® (Poloxamer 188) (1:5:2 por peso);
Formulação 3: Peptídeos: mannitol: Tween 80® (1:5:2 por peso)
A estabilidade de ambas as formulações foi igualmente boa. A solubilidade foi melhor utilizando-se a formulação 2, que deu uma mistura clara e incolor, enquanto a formulação três, em alguns casos, apresentou uma ligeira precipitação sob concentrações mais elevadas. Usando a formulação 1 não foi possível obter uma dissolução.
Como resultado dos experimentos, a estabilidade de cada peptí-deo individual da formulação com mannitol/Lutrol F68® e mannitol/Tween 80® é comparável com os resultados obtidos pela formulação sem quaisquer excipientes. Sem excipiente, a formulação não é solúvel em soluções adequadas como, por exemplo, hidrogenocarbonato de sódio (4.2 %).
Cálculo da potência para preparação IMA901:
Foram testados o efeito dos excipientes poloxamer 188 e mannitol na eficácia de células T. Excipientes não ativos na formulação IMA901 são poloxamer 188 (Lutrol F68 ®) e mannitol. Estes dois excipientes não estão contidos na formulação IMA901 da fase 1 de testes, mas foram incluídos na formulação da fase 2 de testes para aumentar a solubilidade e estabilidade em uso de IMA901. Neste estudo, a influência dessas substâncias na eficácia de células T em um rato modelo foi testada após a imunização de peptídeo com um peptídeo de murino modelo. Não foram observados nenhum efeito tóxico do Poloxamer 188 (Lutrol F68 ®) e mannitol. A aparência de célula T foi analisada por citometria de fluxo ex vivo e coloração tetrâme-ra por nove dias após a imunização. A adição de Poloxamer ® (Lutrol F68 ®) / mannitol à solução de imunização não altera a eficácia de células T CD8+.
Princípio do teste
Imunização: Para o chamado "priming" de células CD8+ T sim-pies, o peptídeo Ova257-264 (SIINFEKL) que se liga a H2-Kb imunogênicos, em combinação com um adjuvante comumente utilizado em imunização de ratos (CPG deoxioligonucleotídeo) em 4.2% de tampão bicarbônico, foi injetado intradermicamente por 8-12 semanas em camundongos fêmeas (linhagem C57BL/6, H2b, 3 camundongos por grupo). Soluções de injeção com e sem Poloxamer 188 (Lutrol F68 ® (16,5 mg / ml)) e mannitol (41.3 mg / ml) foram comparadas. As concentrações dos excipientes são as mesmas previstas para a solução de injeção IMA901. Os controles positivos foram imunizados por via subcutânea com solução de peptídeo contendo CpG emulsi-onados em Titermax ® clássico (Sigma-AIdrich).
Coloração de tetrâmeros: Após 9 dias, camundongos foram sacrificados e as células T específicas de Ova257-264 no baço foram analisadas ex vivo com coloração de tetrâmero e citometria de fluxo. A tecnologia de tetrâmero permite a detecção específica e sensível das células T que ostentam a compatibilidade de células T do receptor.
Resultados: Não foi observados nenhum efeito tóxico do Poloxamer 188 (Lutrol F68® BASF, Ludwigshafen, Alemanha)/mannitol localmente na área da injeção ou sistemicamente. Grupo de controle positivo, grupo CpG e CpG/Poloxamer 188 / grupo mannitol mostraram freqüências significativamente maiores de peptídeos específicos de células T, em comparação cornos controles negativos (p<0.05). Não houve diferença significativa entre o CpG sozinho e o grupo CpG/Poloxamer 188/mannitol.
A possibilidade de populações positivas observadas artificialmente foi excluída pela coloração de tetrâmero das células proliferadas específicas do peptídeo após uma estimulação de cinco dias in vitro com o peptídeo (dados não mostrados).
Em conclusão, a presença de Poloxamer 188 (Lutrol F68 ®) / mannitol no coquetel de imunização não altera respostas imunes desencadeadas pelos peptídeos em ratos e, portanto, influências adversas ou desfavoráveis do Poloxamer 188 (Lutrol F68 ®) e mannitol sobre a eficácia e segurança dos métodos imunoterápicos - baseados nos peptídeos em geral -não são esperadas.Materiais e Métodos
Peptídeos utilizados para a fabricação de diferentes formulações foram sintetizados e fornecidos pela Bachem AG, Suíça. EXEMPLOS Exemplo 1:
As soluções de reserva de cada peptídeo individual foram preparadas pela dissolução dos peptídeos em solventes adequados, de acordo com suas características de solubilização (ver Tabela 2). 1.47 ml_ das soluções peptídicas de maior concentração (peptídeo 5 a 10) e 7.34 mL das so- luções peptídicas 1 a 4 foram combinadas após a adição de 1.47 mL de ácido acético 10%. A mistura foi vortexada durante 2 minutos e tratada por banho ultra-sônico por 1 minuto. Aproximadamente 1 mL da solução límpida resultante foi transferido para frascos de vidro, seguidos pela adição de 19.2 mg de mannitol e 50 uL de uma solução Tween 80 de reserva (77 mg de Tween 80 ®dissolvidos em solução de ácido acético 30%). Dentro de alguns minutos, a solução foi congelada a -40°C e liofilizada por 14 horas a 0.06 mbar, seguido por 6 horas de período pós-secagem a 0.003 mbar (ver a Tabela 3)
Tabela 2: Peptídeos usados para o exemplo 1.
<table>table see original document page 49</column></row><table>Tabela 3: Parâmetros de liofilização para o exemplo 1.
<table>table see original document page 50</column></row><table>Exemplo 2:
Um lote GMP foi produzido contendo 2.000 frascos com 578 ug por cada peptídeo individual por frasco mais mannitol e Poloxamer 188. A 5 formulação inclui os peptídeos, mannitol e Poloxamer 188 em uma proporção de 1:5:2 [w:w.w].
Cada peptídeo liofilizado individual foi pesado, de acordo com os montantes indicados na tabela 4, em vasos de vidro separados. Após a pe-sagem, todos os peptídeos foram diluídos em um determinado solvente. 10 Tabela 4: Peptídeos usados para o exemplo 2.
<table>table see original document page 50</column></row><table>Devido às diferentes solubilidades dos peptídeos, eles têm de ser dissolvidos de acordo com a ordem prevista na tabela 4 começando com o peptídeo 1. Diferentes quantidades e concentrações de solução de ácido acético e água para injeção (WFI), foram utilizadas para dissolver os peptídeos, devido a diferenças na solubilidade dos peptídeos e no que diz respeito ao volume de enchimento final da solução do granel. Para melhorar a solubilidade, cada frasco foi tratado por agitação vigorosa durante um período máximo de cinco minutos e, se necessário, por sonificação durante um período máximo de cinco minutos. As quantidades e concentrações a serem utilizadas também são apresentadas na Tabela 4.
Uma vez que os peptídeos foram prontamente dissolvidos, as soluções têm de ser misturadas na forma apresentada na tabela 4, que começa com o peptídeo número 1. As soluções são coletadas em um recipiente de vidro esterilizado. Os frascos individuais de peptídeo são lavados com uma solução de 105 ml de ácido acético (30%). Finalmente, esta solução é adicionada à mistura da solução peptídica e agitada durante cinco minutos.
23.1 g Poloxamer 188 (Lutrol F68®) e 57.8 g mannitol foram adicionados à mistura de peptídeo e toda a solução foi agitada por cinco minutos.
A solução de granel contendo os 10 peptídeos e os excipientes foram estéril-filtradas através de filtro com poros de 0.22 um. 1.485 ml da solução foram depositados em frascos de vidro esterilizado 2R sob condições estéreis e sob uma atmosfera inerte de nitrogênio, pré-selados e transportados para o secador por congelamento para liofilização. O processo de liofilização (ver Tabela 5) inclui o congelamento dos frascos a uma temperatura de -45°C, um aumento progressivo da temperatura até +20°C (fase principal de secagem) e uma etapa final secagem a +25°C. Quando a secagem foi concluída, o secador por congelamento foi trazido de volta à pressão atmosférica usando-se nitrogênio seco que foi filtrado de modo estéril.Tabela 5: Parâmetro de liofilização usado para o exemplo 2.No. Passo Tempo [min] T[°C] Vácuo [mbar]
1 Carregar 3 -45
2 Congelar 180 -45
3 Secagem principal 15 -45 1.50E-01
4 Secagem principal 300 -20 1.50E-01
5 Secagem principal 480 0 1.50E-01
6 Secagem principal 360 20 1,50E-01
7 Secagem principal 60 20 1.50E-01
8 Pós-secagem 15 2 5.00E-03
9 Pós-secagem 180 20 5.00E-03
10 Pós-secagem 120 25 5.00E-03
11 Pós-secagem 240 25 5.00E-03
12 Pré-ventilação 1 25 8.00E+02
13 Vedação 5 25 8.00E+02
14 Ventilação com N2 1 25 1.00E+03
15 Armazenamento 3 5 1.00E+03
Procedimento de resolubilização: Para os ensaios clínicos descritos acima, a formulação é dissolvida em 700 ul de hidrogeno carbonato de sódio (4.2 %). Remover a tampa de plástico de um frasco. Desembalar e 5 remover o hidrogeno carbonato de sódio (4.2%) do refrigerador por pelo menos 30 minutos antes da resolubilização para trazê-los até a temperatura ambiente antes da injeção. Preparar seringa e a agulha para a reconstitui-ção. Utilizar técnica asséptica para despejar 700 ul_ de diluente para recons-tituição do liofilizado. Para dissolver o liofilizado, o frasco do diluente e deve
10 ser agitado vigorosamente durante 1 minuto, verifique se a solução é clara, caso contrário, continuar agitando por mais um minuto até que a solução se torne clara. 10 a 30 minutos após a injeção de GM-CSF, usar uma nova seringa para administrar 500 uL de formulação reconstituída i.d. na mesma área. Administração tem de ocorrer dentro de 1 h após a reconstituição. Lio-
15 filizado dissolvido pode ser armazenado assepticamente sob temperatura ambiente por até 1 hora após a reconstituição.após a reconstituição demonstraram que a maioria dos peptídeos permaneceu suficientemente estável após a reconstituição. No entanto, houve um decréscimo de dois peptídeos específicos, ou seja, IMA-CCN-001 e IMA-RGS-001. (ver a Tabela 6). Como estes peptídeos contem um resíduo de cisteína, ocorre uma dimerização em função do tempo.
Tabela 6: Resultados do ensaio HPLC para estabilidade em uso após a reconstituição com solução de 4.2 % de hidrogeno carbonato de sódio. Comparação entre a formulação com e sem excipientes.<table>table see original document page 53</column></row><table>* Valor inicial fixado em 100 %. Primeira HPLC executada após a resolubili-zação.
A influência de diferentes valores de pH (em torno de pH 8.5) e o tampão carbonato de alta capacidade sobre o sucesso das imunizações de peptídeo foi avaliada em um modelo de rato. Usando um modelo de peptídeo imunogênico padrão em diferentes soluções de injeção, a eficiência foi testada por ensaio padrão de liberação 51Cr. Os resultados foram confirmados por análise de citometria de fluxo após a coloração de tetrâmero. Resumindo, não houve diferença significativa detectavel na eficiência preliminar entre as imunizações intradérmicas em pH 7.5, 8.5 (pH do diluente IMA901) eopH9.5.
Além disso, a força iônica elevada não reduziu a resposta imune observada em comparação com o tampão isotônico de injeção. Não foram observados efeitos colaterais tóxicos para imunizações com soluções de injeção a pH 7.5, 8.5, e com o diluente IMA901, mas se tornou evidente com a solução injetável pH 9.5 (lesões locais necróticas da pele no local da injeção). Estes resultados suportam a adequação do tampão escolhido como diluente adequado para IMA901. Exemplo 3:
As soluções de reserva de cada peptídeo individual foram preparadas pela dissolução dos peptídeos em solventes adequados, de acordo com suas características de solubilização (ver Tabela 6).
Tabela 6: Peptídeos usados para o exemplo 3.
<table>table see original document page 54</column></row><table><table>table see original document page 55</column></row><table>Devido às diferentes solubilidades dos peptídeos, eles têm de
ser dissolvidos de acordo com a ordem prevista na tabela 4 começando com o peptídeo 1. Diferentes quantidades e concentrações de solução de ácido acético e água para injeção (WFI) foram utilizadas para dissolver os peptídeos, devido a diferenças na solubilidade dos peptídeos e no que diz respeito ao volume de enchimento final da solução do granel. Para melhorar a solubilidade, cada frasco foi tratado por agitação vigorosa durante um período máximo de cinco minutos e, se necessário, por sonificação durante um período máximo de cinco minutos. As quantidades e concentrações a serem utilizadas também são apresentadas na Tabela 6.
Uma vez que os peptídeos foram prontamente dissolvidos, as soluções têm de ser misturadas na forma apresentada na tabela 6, que começa com o peptídeo número 1. As soluções são coletadas em um recipiente equipado com uma barra mexedora. Finalmente, esta solução é adicionada à mistura da solução peptídica e agitada durante no mínimo cinco minutos.
601.1 mg Poloxamer 188 (Lutrol F68®) e 1.502,8 mg Mannitol foram adicionados à mistura de peptídeo e toda a solução foi agitada por cinco minutos.
A solução de granel contendo os 13 peptídeos e os excipientes foram estéril-filtradas através de filtro com poros de 0.22 um. 1.500 ml da solução foram depositados em frascos de vidro 2R, pré-selados e transportados para o secador por congelamento para liofilização. O processo de liofi-lização (ver Tabela 7) inclui o congelamento dos frascos a uma temperatura de -45°C, um aumento progressivo da temperatura até +20°C (fase principal de secagem) e uma etapa final secagem a +25°C. Quando a secagem foi concluída, o secador por congelamento foi trazido de volta à pressão atmos- férica usando-se nitrogênio.
Tabela 7: Parâmetros de liofilização usados para o exemplo 3.
<table>table see original document page 56</column></row><table>Procedimento de resolubilização:
Para os ensaios clínicos descritos acima, a formulação é dissolvida em 700 ul de hidrogenocarbonato de sódio (4.2 %). Para dissolver o liofilizado, o frasco do diluente e deve ser agitado vigorosamente durante 1 minuto, verifique se a solução é clara, caso contrário, continuar agitando por mais um minuto até que a solução se torne clara. Administração de 500uL da solução tem de ocorrer dentro de 1 h após a reconstituição. Liofilizado dissolvido pode ser armazenado assepticamente sob temperatura ambiente por até 1 hora após a reconstituição.
Testes de estabilidade após a reconstituição demonstraram que a maioria dos peptídeos permaneceu suficientemente estável após a reconstituição (ver a tabela 8).Tabela 8: Resultados do ensaio HPLC para estabilidade em uso após a re-constituição com solução de 4.2 % de hidrogeno carbonato de sódio. Comparação entre a formulação com e sem excipientes.
<table>table see original document page 57</column></row><table>Exemplo 4:
As soluções de reserva de cada peptídeo individual foram prepa-radas pela dissolução dos peptídeos em solventes adequados, de acordo com suas características de solubilização (ver Tabela 9). Tabela 9: Peptídeos usados para o exemplo 4.
<table>table see original document page 58</column></row><table>
Devido às diferentes solubilidades dos peptídeos, eles têm de ser dissolvidos de acordo com a ordem prevista na tabela 4 começando com o peptídeo 1. Diferentes quantidades e concentrações de solução de ácido acético e água para injeção (WFI) foram utilizadas para dissolver os peptídeos, devido a diferenças na solubilidade dos peptídeos e no que diz respeito ao volume de enchimento final da solução do granel. Para melhorar a so- lubilidade, cada frasco foi tratado por agitação vigorosa durante um período máximo de cinco minutos e, se necessário, por sonificação durante um período máximo de cinco minutos. As quantidades e concentrações a serem utilizadas também são apresentadas na Tabela 9.
Uma vez que os peptídeos foram prontamente dissolvidos, as soluções têm de ser misturadas na forma apresentada na tabela 9, que co-meça com o peptídeo SEQ ID NO:23. As soluções são coletadas em um recipiente equipado com uma barra mexedora. Finalmente, esta solução é adicionada à mistura da solução peptídica e agitada durante no mínimo cinco minutos.
5 624.2 mg Poloxamer 188 (Lutrol F68®) e 1.560,6 mg Mannitol
foram adicionados à mistura de peptídeo e toda a solução foi agitada por cinco minutos.
A solução de granel contendo os 12 peptídeos e os excipientes foram estéril-filtradas através de um filtro com poros de 0.22 um. 1.500 ml da
solução foram depositados em frascos de vidro 2R, pré-selados e transportados para o secador por congelamento para liofilização. O processo de liofi-lização (ver Tabela 10) inclui o congelamento dos frascos a uma temperatura de -45 °C, um aumento progressivo da temperatura até +20°C (fase principal de secagem) e uma etapa final secagem a +25°C. Quando a secagem foi
concluída, o secador por congelamento foi trazido de volta à pressão atmosférica usando-se nitrogênio seco.
Tabela 10: Parâmetro de liofilização usado para o exemplo 4.
<table>table see original document page 59</column></row><table>
Testes de estabilidade a diferentes temperaturas demonstraram
que todos os peptídeos permaneceram suficientemente estáveis, mesmodurante as condições (+25°C) de estresse (ver a tabela 11).
Tabela 11: Resultados em ensaio HPLC para a estabilidade de peptídeos na
formulação a +25°C +/- 2°C por 3 meses
<table>table see original document page 60</column></row><table>Tabela 12: Resultados em ensaio HPLC para a estabilidade de peptídeos na formulação a +5°C +/- 3°C por 3 meses
<table>table see original document page 60</column></row><table>Tabela 13: Resultados em ensaio HPLC para a estabilidade de peptídeos na formulação a -20°C +/- 5°C por 3 meses
<table>table see original document page 61</column></row><table>LISTAGEM DE SEQÜÊNCIA
<110> immatics biotechnologies GmbH
<120> "FORMULAÇÕES NOVAS DE PEPTÍDEOS ASSOCIADOS A TUMORES QUE SE LIGAM A MOLÉCULAS DE CLASSE I OU II DO ANTÍGENO LEUCOCITÁ-RIO HUMANO (HLA) PARA VACINAS".
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<160> 23
<170> Patentln version 3.4
<210> 1
<211> 16
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 1
Ser Gln Asp Asp lie Lys Gly lie Gln Lys Leu Tyr Gly Lys Arg Ser 1 5 10 15
<210> 2
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens.
<400> 2
Vai Met Ala Gly Asp lie Tyr Ser Vai 1 5
<210> 3
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 3
Ser Vai Ala Ser Thr lie Thr Gly Vai 1 5
<210> 4
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 4
Ala Leu Ala Asp Gly Vai Gln Lys Vai
1 5
<210> 5<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 5
Leu Leu Gly Ala Thr Cys Met Phe Vai 1 5
<210> 6
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 6
Ser Vai Phe Ala Gly Vai Vai Gly Vai 1 5
<210> 7
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 7
Ala Leu Phe Asp Gly Asp Pro His Leu 1 5
<210> 8
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 8
Tyr Vai Asp Pro Vai lie Thr Ser lie 1-5
<210> 9
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 9
Ser Thr Ala Pro Pro Vai His Asn Vai 1 5
<210> 10
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 10
Leu Ala Ala Leu Pro His Ser Cys Leu 1 5
<210> 11 <211> 10<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400>
11
Phe Leu 1
Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Vai 5 10
<210> 12
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 12
Ala Leu Trp Ala Trp Pro Ser Glu Leu 1 5
<210> 13
<211> 15
<212> PRT
<213> Homo
<400> 13
sapiens
Thr Leu Gly Glu Phe Leu Lys Leu Asp Arg Glu Arg Ala Lys Asn 1 5 10 15
<210> 14
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 14
Thr Met Leu Ala Arg Leu Ala Ser Ala
1 5
<210> 15
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 15
Leu Thr Phe Gly Asp Vai Vai Ala Vai 1 5
<210> 16
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 16
Lys lie Gln Glu lie Leu Thr Gln Vai 1 5
<210> 17 <211> 17 <212> PRT<213> Homo sapiens <400> 17
Thr Phe Ser Tyr Vai Asp Pro Vai 1 5
lie Thr Ser lie Ser Pro Lys Tyr 10 15
Gly
<210> 18
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 18
Asn Leu Asp Thr Leu Met Thr Tyr Vai 1 5
<210> 19
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<4 00> 19
Gly Leu Trp His His Gln Thr Glu Vai 1 5
<210>- 20
<211> 9
<212> . PRT
<213> Homo sapiens
<400> 20
Ala lie lie Asp Gly Vai Glu Ser Vai 1 5
<210> 21
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 21
Lys Vai Phe Ala Gly lie Pro Thr Vai 15
<210> 22
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 22
Ala Met Thr Gln Leu Leu Ala Gly Vai<210> 23
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 23
Ser Leu Trp Ala Gly Vai Vai Vai Leu 1 5

Claims (15)

1. Uma formulação farmacêutica contendo:Entre 2 e 18, preferencialmente entre 2 e 15, mais preferencialmente entre 2 e 13, ainda mais preferencialmente 2 a 12 peptídeos e, ainda mais preferencialmente, preferiu 3 a 12 peptídeos associados a tumor; onde cada peptídeo tem um comprimento entre 8 e 22 aminoácidos, de preferência entre 9 e 16 aminoácidos; onde pôde ser observado que os ditos peptídeos mostram uma solubilidade de pelo menos 2.7 mg/ml em 90% de ácido acético; mannitol e poloxamer 188, de onde a relação do peso do(s) dito(s) peptídeo(s) de mannitol para poloxamer 188 está incluído no intervalo entre 1:5:1.5 e 1:8:2.2.; ou mannitol e Tween 80®, de onde a relação do peso dos peptídeos de mannitol para o Tween 80® está incluído no intervalo entre 1:2:1.5 e 1:8:2.2.
2. A composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 1, de onde a relação dita do peso de peptídeos de mannitol para o poloxamer 188 está incluída no intervalo entre 1:0:2 e 1:0:2.2.
3. A composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 1, contendo pelo menos dois peptídeos, onde os ditos peptídeos contêm uma seqüência de aminoácidos selecionada do grupo constituído por SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 10, ou SEQ ID NO: 12 a SEQ ID NO: 23, desde que a composição compreenda pelo menos um peptídeo compreendendo SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 12 ou SEQ ID NO: 13 ou uma variante ou sal desse fato, e ainda inclui mannitol e poloxamer 188, onde a relação do peso de peptídeos de mannitol para poloxamer 188 está incluída no intervalo entre 1:5:1.5 e 1:8:2.2.
4. A composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 3, de onde a relação dita do peso de peptídeos de mannitol para o poloxamer 188 está incluída no intervalo entre 1:0:2 e 1:0:2.2.
5. A composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 1, contendo pelo menos dois peptídeos, onde os ditos peptídeos contêm uma seqüência de aminoácidos selecionada do grupo constituído por SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 10, ou SEQ ID NO: 12 a SEQ ID NO: 23, desde que a com-posição compreenda pelo menos um peptídeo compreendendo SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 12 ou SEQ ID NO: 13 ou uma variante ou sal desse fato, e ainda incluindo mannitol e Tween 80®, de onde a relação do peso de peptídeos de mannitol para Tween 80® está incluída no intervalo entre 1:2:1.5 e 1:8:2.2.
6. A composição farmacêutica de acordo com as reivindicações 1 a 15, de onde os ditos peptídeos têm um comprimento total entre 9 e 16 aminoácidos.
7. A composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 6, na qual no mínimo um peptídeo inclui ligações não-peptídicas.
8. A composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 7, onde a dita composição possui peptídeos constituídos pelas seqüências de aminoácidos estabelecidas em SEQ ID NO: 1 e/ouSEQ ID NO: 2 e outras incluem pelo menos um peptídeo constituído por seqüência de aminoácidos estabelecida em qualquer um dos SEQ ID NO: 3 a SEQ ID NO: 10.
9. A composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 8, onde a dita composição possui peptídeos constituídos pelas seqüências de aminoácidos estabelecidas em SEQ ID NO: 12 e/ou SEQ ID NO: 13 e outras incluem pelo menos um peptídeo constituído por seqüência de aminoácidos estabelecida em qualquer um dos SEQ ID NO: 14 a SEQ ID NO: 23.
10. A composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 9, ainda contém um peptídeo constituído pela seqüência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO: 11, desde que o dito peptídeo não seja o respectivo polipeptídio de comprimento total associados a tumor, de preferência ele ainda inclui um peptídeo constituído pela seqüência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO: 11.
11. A composição farmacêutica de acordo com uma das reivindi-cações entre 1 e 10, onde as quantidades de peptídeos contidas na composição sejam específicas do tecido, do câncer e/ou do paciente.
12. A composição farmacêutica de acordo com uma das reivindicações entre 1 e 11, compreendendo ainda ao menos um adjuvante apropriado.
13. O uso de composição farmacêutica de acordo com uma das reivindicações entre 1 e 12 como vacina anticâncer.
14. Um kit contendo:(a) um recipiente que contém uma composição farmacêutica, de acordo com uma das reivindicações entre 1 e 13, em solução ou em forma liofilizada; (b) opcionalmente, um segundo recipiente contendo um diluenteou solução reconstituinte para a formulação liofilizada e/ou no mínimo um adjuvante; e(b) opcionalmente, instruções para o (i) uso da solução ou (ii) reconstituição e / ou a utilização da dita formulação liofilizada.
15. Segundo a reivindicação 14, o kit ainda pode conter um oumais tampões (i), um diluente (ii), um filtro (iii), uma agulha (iv), e uma seringa (v).
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