PT2111867E - Formulações novas de peptídeos associados a tumores que se ligam a moléculas de classe i ou ii do antígeno leucocitário humano (hla) para vacinas - Google Patents

Description

-1- DESCR1CÃO “Formulações novas de peptídeos associados a tumores que se ligam a moléculas de classe I ou II do antígeno leucocitário humano (HLA) para vacinas” A presente invenção refere-se a novas formulações novas de peptídeos associados a tumores que se ligam a moléculas de classe I ou II do antígeno leucocitário humano (HLA) como vacinas para serem usadas em métodos imunoterápicos. Em particular, a presente invenção refere-se especificamente a formulações para a imunoterapia do câncer, em especial do câncer renal. A presente invenção refere-se, ainda, a composições de vacinas para provocar respostas imunes antitumorais.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Uma composição para injeção, constituída por peptídeos sob a forma de pó e um solvente constituído por bicarbonato de sódio foi divulgado em WO 2007/028573 para a vacinação de carcinoma de células renais. No entanto, esta formulação tem vários inconvenientes. A principal desvantagem é a baixa solubilidade, que toma o seu manuseio muito difícil durante qualquer tipo de aplicação, como p. ex., na utilização clínica.

No intuito de dissolver o pó na composição, o frasco contendo os peptídeos a serem dissolvidos e o diluente tem de ser agitados vigorosamente durante três minutos e, em seguida, devem ser submetidos a uma ultra-sonografia para homogeneização por um minuto e, em seguida, devem voltar a ser agitados. Este tratamento não pode ser aplicado por todos os médicos em seus consultórios, já que muitas vezes têm falta dos equipamentos necessários, e a mistura arquivada lá pode ser não tão homogénea, conforme o necessário para uma utilização eficaz.

Um problema adicional com a composição refere-se ao fato de que, dada a velocidade de dissolução dos ingredientes ativos usando-se o hidrogeno carbonato de sódio em determinada concentração, a solução resultante pode ser utilizada apenas durante aproximadamente 30 minutos. -2-

Além disso, as características da formulação acima mudam ao longo do tempo, o que torna quase impossível uma utilização segura. Depois de divulgada a formulação de armazenamento por 12 meses utilizando-se diferentes temperaturas de -20 0 C a +25 0 C, nenhuma solução clara pôde ser produzida, mesmo após o uso de um ultra-som homogeneizador por vários minutos. US-A-6 897 288 proporciona peptídeos antigênicos derivados dos chamados polipeptídeos MAGE-A12 e apresentados por moléculas HLA. A patente é, no entanto, omissa em uma composição compreendendo ainda manitol e poloxamer 188, onde a proporção de peso de peptídeos para manitol ao poloxamer 188 varia entre a 1:5:1.5 1:8:2.2. WO-A-2004/016643 relaciona com peptídeos de antígenos associados a tumor de cólon e próstata e ao seu uso na terapia de câncer de cólon e de próstata. As composições de vacina representadas no referido documento não incluem manitol e poloxamer 188, onde a proporção de peso de peptídeos para o manitol e para o poloxamer 188 varia entre a 1:5:1.5 1:8:2.2. EP-A-1 717 245 refere-se a métodos imunoterápicos no tratamento do câncer envolvendo epítopos peptídicos de célula T auxiliar associados a tumor em conjugação com outros peptídeos associados a tumor, derivados de moléculas HLA de classe I ou II do receptor laminina imaturo de antígeno oncofetal humano (OFA / LR). Embora a administração com/sem adjuvante e em portadores aceitáveis, excipientes ou tampões tenha sido mencionada, o documento não revela ou sugere a presença de manitol e poloxamer 188, onde a proporção de peso de peptídeos para o manitol e para o poloxamer 188 varia entre a 1:5:1.5 1:8:2.2.

De forma semelhante à EP-A-1 717 245, a EP-A-1 760 088 também divulga o uso de epítopos peptídicos de célula T auxiliar associados a tumor em combinação com peptídeos associados a tumor em composições de vacina para imunoterapia de câncer. No entanto, apesar da dissolução de tais peptídeos em portadores/excipientes/tampões aceitáveis ter sido referida, o dito documento não revela ou sugere em nenhuma parte a presença de manitol e poloxamer 188, onde a proporção de peso de peptídeos para o manitol e para o poloxamer 188 varia entre a 1:5:1.5 1:8:2.2. -3 -

Assim, continua a haver uma necessidade de novas formulações de peptídeos com solubilidade aprimorada e umidificação melhorada do liofilizado, a fim de proporcionar uma preparação segura e eficaz, especialmente no caso de uma vacina anti-câncer. A presente invenção atende a essa necessidade.

RESUMO DA INVENÇÃO A presente invenção, em um de seus aspectos preferidos, fornece uma composição farmacêutica compreendendo entre 2 e 18 peptídeos associados a tumor; onde cada peptídeo tem um comprimento entre 8 e 22 aminoácidos; onde pôde ser observado que peptídeos mostram uma solubilidade de pelo menos 2.7 mg/mL em 90% de ácido acético, mannitol e poloxamer 188, no qual a razão do peso do dito peptídeo(s) de mannitol para poloxamer 188 está incluído no intervalo entre 1:5:1.5 e 1:8:2.2.; ou mannitol e Tween® 80, onde a razão do peso de peptídeos de mannitol para Tween® 80 está incluído no intervalo 1:2:1.5 e 1:8:2.2.

Preferido é uma composição farmacêutica compreendendo entre 2 e 18, de preferência inferior a 15, mais preferencialmente menos de 13, ainda mais preferencialmente 2 a 12 peptídeos e ainda mais preferencialmente 3 a 12 peptídeos associados a tumor; sendo que cada peptídeo tem um comprimento de 8 e 22 aminoácidos, de preferência entre 9 e 16 aminoácidos; onde pôde ser observado que peptídeos mostram uma solubilidade de pelo menos 2.7 mg/mL em 90% de ácido acético, mannitol e poloxamer 188, no qual a razão do peso do dito peptídeo(s) de mannitol para poloxamer 188 está incluído no intervalo entre 1:5:1.5 e 1:8:2.2.; ou mannitol e Tween® 80, onde a razão do peso de peptídeos de mannitol para Tween® 80 está incluído no intervalo 1:2:1.5 e 1:8:2.2.

Em outro preferido dos seus aspectos, a presente invenção fornece uma composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 1, compreendendo pelo menos dois peptídeos, onde os ditos peptídeos compreendem uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo constituído por SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 10, ou SEQ ID NO: 12 a SEQ ID NO: 23, desde que a composição compreenda pelo menos um peptídeo compreendendo SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 12, ou SEQ ID NO: 13 ou uma variante ou sal desse fato, e ainda inclui mannitol e poloxamer 188, onde a relação do peso de peptídeos de mannitol para poloxamer 188 está incluída no intervalo entre 1:5:1.5 e 1:8:2.2. -4-

Em ainda outro preferido dos seus aspectos, a presente invenção fornece uma composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 1, compreendendo pelo menos dois peptídeos, onde os ditos peptídeos compreendem uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo constituído por SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 10, ou SEQ ID NO: 12 a SEQ ID NO: 23, desde que a composição compreenda pelo menos um peptídeo compreendendo SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 12, ou SEQ ID NO: 13 ou uma variante ou sal desse fato, e ainda incluindo mannitol e Tween® 80, onde a relação do peso de peptídeos de mannitol para Tween® 80 está incluída no intervalo entre 1:2:1.5 e 1:8:2.2.

Vantajosamente, a formulação de acordo com a invenção é adequada para formulações estáveis contendo peptídeos muito hidrofóbicos (por exemplo, IMA-CHI-001; SEQ ID NO: 23). Este peptídeo especial, por exemplo, é muito insolúvel na água e apenas ligeiramente solúvel em 90% de ácido acético (solubilidade de aprox. 2,9 mg / mL). Surpreendentemente, é agora possível formular o peptídeo de acordo com SEQ ID NO: 23 com qualquer outro peptídeo em outra formulação que possa ser utilizada para a aplicação em um ser vivo.

Por conseguinte, a aplicação divulga de mão uma formulação para formular entre 2 e 18 peptídeos, de preferência menos de 15, mais preferido menos de 13, ainda mais preferido 2 a 12 peptídeos e, ainda mais preferido, 3 a 12 peptídeos, com um peptídeo com um comprimento entre 8 e 22 aminoácidos, de preferência entre 9 e 16 aminoácidos, desde que os peptídeos mostrem pelo menos uma solubilidade em 90% de ácido acético de 2.7 mg / ml, de preferência 2,9 mg / ml, e ainda inclui mannitol e poloxamer 188, no qual a razão por peso de peptídeos de mannitol para poloxamer 188 está incluída no intervalo entre 1:5:1.5 a 1:8:2.2.

Em uma variante preferida desta composição farmacêutica de acordo com a presente invenção, a relação do peso de peptídeos de mannitol para poloxamer 188 está incluída no intervalo entre 1:0:2 e 1:0:2.2.

Outra variante preferida da presente invenção fornece uma composição farmacêutica conforme o descrito acima, compreendendo pelo menos dois peptídeos, onde os ditos peptídeos compreendem uma sequência selecionada de aminoácidos do grupo constituído por SEQ ID NO: 12 a SEQ ID NO: 23, desde que a composição compreenda pelo menos um peptídeo compreendendo SEQ ID NO: 12, ou SEQ ID NO: 13 ou uma variante desse fato, e -5 - ainda incluindo mannitol e Tween 80®, onde a relação do peso de peptídeos de mannitol para Tween 80® está incluída no intervalo entre 1:5:0.5 e 1:5:2.

Preferencialmente os peptídeos da presente invenção têm um comprimento total entre 9 e 16 aminoácidos. Os peptídeos podem incluir ligações não-peptídicas.

Em outra variante preferida, as composições farmacêuticas compreendem peptídeos constituídos por sequências de aminoácidos estabelecidas em SEQ ID NO: 1 e/ou SEQ ID NO: 2 e outras ainda incluem pelo menos um peptídeo constituído por sequência de aminoácidos estabelecida em qualquer um dos SEQ ID NO: 3 a SEQ ID NO: 10.

Em determinadas variantes preferidas, a composição farmacêutica pode ainda incluir um peptídeo composto pela sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO: 11, contanto que o peptídeo citado não seja o respectivo polipeptídeo de comprimento integral associado ao tumor. Em outras variantes preferidas, a composição farmacêutica pode ainda incluir um peptídeo composto pela sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO: 11.

Em outra variante preferida, as composições farmacêuticas compreendem peptídeos constituídos por sequências de aminoácidos estabelecidas em SEQ ID NO: 12 e/ou SEQ ID NO: 13 e ainda inclui pelo menos um peptídeo constituído por sequência de aminoácidos estabelecida em qualquer um dos SEQ ID NO: 14 a SEQ ID NO: 23. Em determinadas variantes preferidas, esta composição farmacêutica pode ainda incluir um peptídeo composto pela sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO: 11, contanto que o peptídeo citado não seja o respectivo polipeptídeo de comprimento integral associado ao tumor. Em outras variantes preferidas, a composição farmacêutica pode ainda incluir um peptídeo composto pela sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO: 11.

Em certas variantes, como os peptídeos presentes na composição são selecionados a partir de peptídeos específicos de tecidos, câncer e/ou peptídeos de cada paciente.

Em outras variantes preferidas, a composição farmacêutica ainda pode incluir pelo menos um adjuvante adequado.

Adjuvantes são substâncias que não reforçam ou potencializam especificamente a resposta imune (por exemplo, respostas imunes mediadas por CTLs e células T auxiliares (TH)) para -6- um antígeno, e terão, portanto, de ser considerados úteis para o medicamento da presente invenção. Adjuvantes adequados incluem 1018 ISS, sais de alumínio, Amplivax, AS 15, BCG, CP-870893, CpG7909, CyaA, dSLIM, flagelina ou ligantes TLR5 derivados de flagelina, ligante FLT3, GM-CSF, IC30, IC31 , Imiquimod (Aldara), resimiquimodo, ImuFact IMP321, interleucinas como IL-2, IL-13, IL-21, interferon-alfa-ou beta, ou pegylated, seus derivados, IS Patch, ISS, ISCOMATRIX, ISCOMs, Juvlmmune, LipoVac, MALP2, MF59, monofosforil lipídico A, Montanide IMS 1312, Montanide ISA 206, Montanide ISA 50V, Montanide ISA-51, emulsões água em óleo e óleo em água, OK-432, OM-174, OM-197 - MP-CE, ONTAK, OspA, PepTel ® sistema vetor, PLG e micropartículas dextram, resiquimod, SRL172, Virosomes e outros vírus, como partículas, YF-17D, armadilha VEGF, R848, beta-glucano, Pam3Cys, Aquila da QS21 stimulon, que é obtido a partir de saponina, micobacterianos extratos bacteriano e síntese da parede celular mímica, e de outros adjuvantes proprietários, como Ribi's Detox, Quil, ou Superfos. Adjuvantes, tais como Freund's ou GM-CSF, são preferidos. Vários adjuvantes imunológicos (por exemplo, MF59) específicos para células dendríticas e suas preparações foram descritos anteriormente (Dupuis M et al 1998; Allison 1998). Também é possível utilizar citocinas. Várias citocinas foram diretamente suspeitas em influenciar a migração dendrítica para os tecidos linfóides (por exemplo, TNF-α), acelerando assim a maturação de células dendríticas em células eficientes que contêm antígeno para linfócitos T (por exemplo, a GM-CSF, IL-1 e IL -4) (U.S. Pat. No. 5,849,589), e atuando como imunoadjuvantes (por exemplo, IL-12, IL-15, IL-23, IL-7, IFN-alfa. IFN-beta) (Gabrilovich et al 1996).

Oligonucleótidos imunoestimulatórios CPG também foram relatados para melhorar os efeitos de adjuvantes na elaboração de uma vacina. Sem a intenção de estar vinculado por teoria, CPG oligonucleótidos atuam através da ativação do sistema imunitário do inata (não-adaptativo), através de receptores do tipo “toll” (TLR), principalmente TLR9. Ativação TLR9 de CPG disparado aumenta as respostas humorais e celulares específicas do antígeno para uma ampla variedade de antígenos, incluindo antígenos de peptídeo ou proteína, vírus vivos ou mortos, vacinas de células dendríticas, vacinas celulares autólogas e polissacarídeos conjugados em ambas as vacinas, profiláticas e terapêuticas. Mais importante é o fato que ela reforça a maturação e diferenciação de células dendríticas, resultando em uma maior ativação de células THi e em uma forte geração de linfócitos T citotóxicos (CTL), mesmo na ausência da ajuda de células T CD4. O viés de TH1 induzida por estimulação de TLR9 é mantida mesmo na presença de adjuvantes de vacina, tais como alumínio ou adjuvante incompleto de -7-

Freund (IFA) que, normalmente, promove um viés de TH2. Oligonucleótidos CPG mostram uma atividade ainda maior de adjuvante quando formulado ou co-administrado com outros adjuvantes ou em formulações como as micropartículas, nanopartículas, emulsões lipídicas ou formulações similares, que são especialmente necessárias para induzir uma resposta forte quando o antígeno é relativamente fraco. Eles também aceleram a resposta imune e permitem as doses de antígeno a serem reduzidas por aproximadamente duas ordens de magnitude, com respostas comparáveis de anticorpo para a vacina de dose integral sem CPG em algumas experiências (Krieg et al 2006). US Pat. No. 6,406,705 BI descreve o uso combinado de CPG oligonucleotídeos, adjuvantes de ácido não nucleico e um antigénio para induzir uma resposta imune específica do antígeno. Uma CPG TLR9 antagonista é o dSLIM (double Stem Loop Immunomodulator) por Mologen (Berlim, Alemanha), que é um componente preferido da composição farmacêutica da presente invenção. Outras moléculas que se ligam a TLR, como a TLR 7, TLR 8 e / ou TLR 9 que se ligam ao RNA também podem ser utilizadas.

Outros exemplos de adjuvantes úteis incluem as CpGs quimicamente modificadas (por exemplo, CPR, Idera), dsRNA análogos, como a Poly(I:C) e AmpliGen, não-CPG bacteriana DNA ou RNA, bem como pequenas moléculas e anticorpos imunoativos tais como a ciclofosfamida, sunitiniba, Bevacizumab, Celebrex, NCX-4016, o sildenafil, tadalafil, vardenafil, Sorafenib, temozolomide, temsirolimus, XL-999, CP-547632, pazopanib, VEGF Trap, ZD2171, AZD2171, anti-CTLA4 e SC58175, que podem agir terapeuticamente e/ou como um adjuvante. As quantidades e concentrações de adjuvantes e aditivos úteis no contexto da presente invenção podem ser facilmente determinadas pelo artesão qualificado sem experimentação. Adjuvantes preferidos são dSLIM, interferon-alfa, interferon-beta, CpG7909, IC31, imiquimod, resimiquimod, PeviTer, RNA, tadalafil, temozolomide, e Juvlmmune.

Adjuvantes preferidos são dSLIM, BCG, OK432, imiquimod, resimiquimod, GMCSF, interferon-alfa, PeviTer e Juvlmmune ou combinações dos mesmos.

Em uma variante preferida, a composição farmacêutica de acordo com a invenção, o adjuvante é selecionado dentre o grupo de fatores estimulantes de colónias, tais como o fator estimulante de colónias de granulócitos e macrófagos (GM-CSF, Sargramostim), imiquimod, resiquimod, e interferon-alpha. -8-

Em uma variante preferida, a composição farmacêutica de acordo com a invenção, o adjuvante é selecionado dentre o grupo de fatores estimulantes de colónias, tais como o fator estimulante de colónias de granulócitos e macrófagos (GM-CSF, Sargramostim), imiquimod e resiquimod.

Em uma variante preferida, a composição farmacêutica de acordo com a invenção, o adjuvante é imiquimod ou resimiquimod. A composição pode ser usada para administração parenteral como, por exemplo, por via subcutânea, intradérmica ou intramuscular ou para administração oral. Os peptídeos também podem ser administrados juntamente com substâncias imunoestimulantes tais como as citocinas.

As composições farmacêuticas da invenção podem ser usadas como uma vacina anticancerígena. A presente invenção também inclui um kit composto de pelo menos um dos peptídeos acima, e/ou o da composição farmacêutica acima, quer pré-preparados ou em recipientes separados ou frascos para misturas no local.

Isso é preferencialmente um kit contendo: (a) um recipiente contendo uma composição farmacêutica, de acordo com a invenção, em solução ou em forma liofilizada (b) opcionalmente, um segundo recipiente contendo um diluente ou uma solução para a reconstituição para tal formulação liofilizada e/ou pelo menos um adjuvante, e (c ) opcionalmente, as instruções para (i) o uso da solução, ou (ii) reconstituição e/ou uso da formulação liofilizada citada.

De acordo com a invenção, também é preferível o kit ainda contem um ou mais tampões (i), um diluente (ii), um filtro (iii), uma agulha (iv), e uma seringa (v).

DESCRIÇÃO CURTA DAS FIGURAS

Figura 1 Espectrômetro analítico HPLC dos peptídeos (SEQ ID No.: 1 a SEQ ID No.: 11) que contêm beta-naftilalanina (NAL) como padrão interno. -9-

Figura 2: Estabilidade de formulação 1 (controle), sem quaisquer excipientes a +25°C.

Figura 3: Estabilidade de formulação 2, de acordo com a invenção com mannitol e Lutrol® F68 (poloxamer 188) a +25°C.

Figura 4: Estabilidade de formulação 3, de acordo com a invenção com mannitol e Tween® 80 a +25°C.

Figura 5: Estabilidade de formulação 4, de acordo com a invenção com mannitol e Tween® 80 a +25°C.

Figura 6: Estabilidade de formulação 1 (controle), sem quaisquer excipientes a +40°C.

Figura 7: Estabilidade de formulação 2, de acordo com a invenção com mannitol e Lutrol® F68 (Poloxamer 188) a+40°C.

Figura 8: Estabilidade de formulação 3, de acordo com a invenção com mannitol e Tween® 80 a +40°C.

Figura 9: Estabilidade de formulação 4, de acordo com a invenção com mannitol e Tween® 80 a +40°C.

Figura 10: Efeitos dos excipientes poloxamer 188 (Lutrol® F68 disponível da BASF Ludwigshafen, Alemanha) e mannitol na célula CD8+ T in vivo. Camundongos foram sacrificados 9 dias após a imunização, células baço foram coletadas, tingidas com tetrâmero e analisadas por citometria de fluxo. Percentagem de células tetrâmeras positivas entre todas as células T CD8 + é mostrada com barras de erro apresentando o desvio padrão das médias. Todos os três grupos imunizados de peptídeo são significativamente diferentes dos controles negativos conforme o analisado por teste T tipo bicaudal, desirmanado e realizado por estudantes (p < 0,05). Os grupos com e sem poloxamer 188 (Lutrol® F68) / mannitol não diferem significativamente (p = 0.49).

Figura 11: Processo de fabricação descrito no exemplo 2. - 10-

Figura 12: Espectrômetro analítico HPLC dos peptídeos (SEQ ID No.: 11a 23) que contêm beta-naftilalanina (NAL) como padrão interno.

Figura 13: Estabilidade "em uso" de peptídeos de SEQ ID NO 11 a 23 com mannitol / Lutrol® F68.

Figura 14: Estabilidade "em uso" de peptídeos de SEQ ID NO 11 a 23 sem excipientes.

Figura 15: Estabilidade de peptídeos de SEQ ID NO 11 a 22 com mannitol / Lutrol® F68 a +25°C.

Figura 16: Estabilidade de peptídeos de SEQ ID NO 11 a 22 com mannitol / Lutrol® F68 a +5°C.

Figura 17: Estabilidade de peptídeos de SEQ ID NO 11 a 22 com mannitol / Lutrol® F68 a - 20°C.

Figura 18: 24 meses de dados estabilidade a -20 0 C para a formulação mostrada no Exemplo 2.

Figura 19: 24 meses de dados de estabilidade a +5°C para a formulação mostrada no Exemplo 2.

Figura 20: 24 meses de dados de estabilidade a +25°C para a formulação mostrada no Exemplo 2. A sequência na lista mostra peptídeos (SEQ ID No. 1 a SEQ ID No. 23) que são utilizados nas formulações de acordo com a presente invenção.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO A presente invenção fornece composições farmacêuticas úteis como uma vacina, onde disse composição farmacêutica compreende vários peptídeos associados a tumor (TUMAPs), para - 11 - (r) além de uma mistura de mannitol e Tween 80, ou uma mistura de mannitol e poloxamer 188, da qual as misturas proporcionam estabilidade e solubilidade para tal composição. "Composição farmacêutica" conforme usada aqui é preferencialmente uma formulação liofilizada compreendendo peptídeos, mannitol, e Tween 80 ou os peptídeos, mannitol e poloxamer 188 ou, de preferência, é uma composição de líquido reconstituído. Como tal, o termo "composições farmacêuticas", conforme aqui utilizado também pode se referir à formulação liofilizada, para indicar que a composição está presente em uma forma liofilizada.

De preferência, os peptídeos nas composições farmacêuticas compreendem no mínimo um dos peptídeos estabelecidos em SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 10, que foram localizados e têm sido identificados em células primárias de câncer renal ou, pelo menos, um dos peptídeos estabelecidos em SEQ ID NO: 22 e 11 a SEQ ID NO: 23, que foram localizados e têm sido identificados em células de câncer glioma primárias.

Em outra variante preferida, as composições farmacêuticas compreendem peptídeos constituídos por sequências de aminoácidos estabelecidas em SEQ ID NO: 12 e/ou SEQ ID NO: 13 e ainda inclui pelo menos um peptídeo constituído por sequência de aminoácidos estabelecida em qualquer um dos SEQ ID NO: 14 a SEQ ID NO: 23.

Esse conjunto inclui peptídeos HLA da classe I e classe Π. Uma composição farmacêutica de acordo com a presente invenção contém, de preferência, um peptídeo tal como estabelecido em SEQ ID NO:l e/ou SEQ ID NO:2 e/ou, pelo menos, um outro peptídeo compreendendo SEQ ID NO: 3 a SEQ ID NO: 10 ou um peptídeo tal como estabelecido em SEQ ID NO: 12 e/ou SEQ ID NO: 13 e/ou, pelo menos, um outro peptídeo compreendendo SEQ ID NO: 11 e SEQ ID NO: 14 a SEQ ID NO: 23.

As composições farmacêuticas incluem os peptídeos, tanto na forma livre ou na a forma de um sal farmaceuticamente aceitável.

Conforme utilizado aqui, "um sal farmaceuticamente aceitável" refere-se a um derivado do peptídeo revelado onde o peptídeo é alterado por formação de ácido ou por sais básicos do agente. Por exemplo, sais ácidos são preparados a partir da base livre (normalmente onde a forma neutra da droga tem um grupo NH2 neutro), envolvendo uma reação com ácido - 12- adequado. Ácidos adequados para a preparação de sais de ácidos incluem tanto os ácidos orgânicos, por exemplo, ácido acético, ácido propiônico, ácido glicólico, ácido pirúvico, ácido oxálico, ácido málico, ácido malônico, succínico, ácido maleico, ácido fumárico, ácido tartárico, ácido cítrico, ácido benzóico, ácido cinâmico, ácido mandélico, ácido metanossulfônico, etanosulfônico, ácido p-toluenosulfônico, ácido salicílico e similares, bem como ácidos inorgânicos, por exemplo, ácido hidroclorídrico, ácido hidrobrômico, ácido sulfúrico, ácido fosfórico, ácido nítrico e similares. Inversamente, preparações de sais de base provenientes de moléculas ácidas, que podem estar presentes em um peptídeo, são efetuadas utilizando-se uma base farmaceuticamente aceitável como o hidróxido de sódio, hidróxido de potássio, hidróxido de amónio, hidróxido de cálcio, trimetilamino ou algo do gênero.

Em uma variante especialmente preferida, as composições farmacêuticas compreendem peptídeos como sais de ácido acético (acetatos) ou ácido hidroclorídrico (cloretos).

Em uma variante ainda mais preferida, as composições farmacêuticas de acordo com a invenção compreendem SEQ ID NO: 5 como cloreto de um e de todos os outros peptídeos como acetatos.

Composições farmacêuticas da presente invenção também podem conter pelo menos um peptídeo para servir como peptídeo de controle positivo e, atuando como marcador imunológico, para testar a eficiência da administração intradérmica. Um desses peptídeos exemplares é proveniente do antígeno do ceme do VHB (SEQ ID NO: 11).

Em uma variante em particular, a composição farmacêutica compreende 11 peptídeos diferentes, cada um constituído por sequências de aminoácidos estabelecidas em SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 11. (ver a tabela 1). Preferencialmente, cada peptídeo na composição farmacêutica está presente em uma quantidade entre cerca de 1500 pg a cerca de 75 pg, de preferência entre cerca de 1000 pg a cerca de 750 pg e mais de preferência entre cerca de 500 pg a cerca de 600 pg, e mais de preferência cerca de 578 pg. Preferencialmente, cada peptídeo é purificado por HPLC e cromatografia de troca iônica, e aparece como um pó branco até claro.

Em uma outra variante em particular, a composição farmacêutica compreende 12 peptídeos diferentes, cada um constituído por sequências de aminoácidos estabelecidas em SEQ ID NO: - 13 - 11a SEQ ID NO: 22 e uma das sequências estabelecidas em SEQ ID NO: 11a SEQ ID NO: 23. (ver a tabela 11). Preferencialmente, cada peptídeo na composição farmacêutica está presente em uma quantidade entre cerca de 1500 pg a cerca de 75 pg, de preferência entre cerca de 1000 pg a cerca de 750 pg e, mais de preferência entre cerca de 500 pg a cerca de 600 pg, e mais de preferência cerca de 578 pg. Preferencialmente, cada peptídeo é purificado por HPLC e cromatografia de troca iônica, e aparece como um pó branco até claro.

Tabela 1: Peptídeos preferidos em composições farmacêuticas da presente invenção

Sequência ID interna Antígeno Seqtiência SEQ ID NO: IMA-MMP-001 Metaloproteinase matricial 7 S QDDIKGIQKLY GKRS 1 IMA-ADF-002 Adipofilina VMAGDIYSV 2 IMA-ADF-001 Adipofilina SVASTITGV 3 IMA-APO-001 Apolipoproteína LI ALADGVQKV 4 IMA-CCN-001 Ciclina Dl LLGATCMFV 5 IMA-GUC-001 GUCY1A3 SVFAGVVGV 6 IMA-K67-001 KIAA0367 ALFDGDPHL 7 IMA-MET-001 protooncogene c-Met YVDPVITSI 8 IMA-MUC-001 MUC1 STAPPVHNV 9 IMA-RGS-001 RGS-5 LAALPHSCL 10 IMA-HBV-001 HBV FLPSDFFPSV 11 IMA-BCA-002 Brevican (NP_068767, 478-486) ALWAWPSEL 12 IMA-BIR-002 Baculoviral IAP repetição de conteúdo 5 (NPJ301159, 97-111) TLGEFLKLDRERAKN 13 IMA-CSP-001 Proteoglicano de sulfato de condroitina 4 (NP_001888, 21-29) TMLARLASA 14 IMA-FABP7- 001 Proteína graxa ligadora de ácidos 7, cérebro (NP_001437, 118-126) LTFGDVVAV 15 - 14- IMA-IGF2BP3- 001 Proteínas similares à insulina do fator de crescimento 2 que se liga ao mRNA 3 (NPJ306538, 552-560) KIQEILTQV 16 IMA-MET-005 protooncogene Met (NP_000236, 651-667) TFS YVDPVITSISPKY G 17 IMA-NLGN4X- 001 Neuroligina 4, ligada a X (NP_065793, 131-139) NLDTLMTYV 18 IMA-NRCAM- 001 Molécula de adesão celular neuronal (NP_001032209, 692-700) GLWHHQTEV 19 IMA-PTP-003 Proteína tirosina fosfatase, do tipo receptor, Z polipeptídeo 1 (NP_002842, 195-203) AIIDGVESV 20 IMA-PTP-005 Proteína tirosina fosfatase, do tipo receptor, Z polipeptídeo 1 (NP_002842, 1347-1355) KVFAGIPTV 21 IMA-TNC-001 Tenascina C (NP_002151, 3-11) AMTQLLAGV 22 IMA-CHI-001 SLWAGVVVL 23 O termo "peptídeo" é utilizado aqui para designar uma série de resíduos de aminoácidos, ligados um ao outro pelo tipicamente por conexões de peptídeo entre os grupos alfa-amino e carbonilo e dos aminoácidos adjacentes. Os peptídeos são tipicamente 9 aminoácidos de comprimento para a MHC classe I e mais longos (15 ou 16 aminoácidos) para MHC classe II, mas também podem ser tão curtos quanto 8 aminoácidos de comprimento ou tão longos quanto 16 aminoácidos de comprimento. O termo "oligopeptídeo" é utilizado aqui para designar uma série de resíduos de aminoácidos, ligados um ao outro pelo tipicamente por conexões de peptídeo entre os grupos alfa-amino e - 15- carbonilo e dos aminoácidos adjacentes. O comprimento do oligopeptídeo não é decisivo para a invenção, enquanto o epitopo correto ou os epitopos são mantidos nele. Os oligopeptídeos são geralmente inferiores a aproximadamente 30 resíduos de aminoácidos em comprimento e superior a aproximadamente 14 aminoácidos em comprimento. O termo "polipeptídeo" designa uma série de resíduos de aminoácidos, ligados um ao outro pelo tipicamente por conexões de peptídeo entre os grupos alfa-amino e carbonilo e dos aminoácidos adjacentes. O comprimento do polipeptídeo não é decisivo para a invenção, enquanto os epitopos corretos são mantidos. Em contraste com os termos peptídeo ou oligotídeos, o termo polipéptido é usado para referir-se a moléculas de proteínas com comprimentos acima de 30 resíduos de comprimento.

Um peptídeo, oligopeptídeo, proteína, ou código de polinucleotídeo para uma tal molécula é "imunogênico" (e, portanto, um "imunógeno" dentro da atual invenção), se ele é capaz de induzir uma resposta imune. No caso da presente invenção, imunogenicidade é definida mais especificamente como a capacidade de induzir uma resposta de CTL mediada. Assim, um "imunógeno" seria uma molécula que seja capaz de induzir uma resposta imune e, no caso da presente invenção, uma molécula capaz de induzir uma resposta CTL.

Uma célula T "epítopa" é uma pequena molécula de peptídeo que se liga a uma molécula MHC classe I ou II, e que é posteriormente reconhecida por uma célula T. Epitopos de células T que se ligam às moléculas MHC classe I têm tipicamente 8-14 aminoácidos de comprimento e, mais tipicamente 9 aminoácidos de comprimento. Epitopos de células T que se ligam às moléculas MHC classe II têm tipicamente 12-30 aminoácidos de comprimento. No caso dos epitopos que se ligam a moléculas MHC classe II, as mesmas células T epítopas podem compartilhar um segmento de núcleo comum, mas diferem no comprimento das sequências nos flancos de carboxiterminais e aminoterminais devido ao fato de que as extremidades da molécula do peptídeo não são enterradas na estrutura da fissura dos peptídeos que se ligam às molécula MHC classe II, pois elas se encontram estão na a fissura dos peptídeos que se ligam às molécula MHC classe I.

Existem três diferentes locos genéticos que codificam para moléculas MHC classe I: HLA-A, HLA-B, e HLA-C. HLA-A1, HLA-A2, e HLA-A11 são exemplos de diferentes moléculas MHC classe I que podem ser expressas a partir destes loci. - 16-

Confonne utilizado aqui, os termos "porção", "segmento", e "fragmento", quando utilizados em relação ao polipeptídeos, referem-se a uma sequência contínua de resíduos, tais como resíduos de aminoácidos, do qual cada sequência forma um subconjunto de uma sequência maior. Por exemplo, se um polipeptídeo foi submetido ao tratamento com qualquer dos endopeptidases comuns, tais como tripsina ou quimotripsina, os oligopeptídeos resultantes de tal tratamento representariam porções, segmentos ou fragmentos do polipeptídeo de partida. Isto significa que qualquer fragmento irá conter necessariamente - como parte de sua sequência de aminoácidos - um segmento, fragmento ou porção, que é substancialmente idêntico, caso não seja completamente idêntico, a uma sequência de SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 23, que correspondem às proteínas que surgem naturalmente, ou proteínas "mãe", de SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 23. Quando usado em relação aos polinucleotídeos, esses termos referem-se aos produtos produzidos por tratamento dos ditos polinucleotídeos com qualquer um dos endonucleases comuns.

De acordo com a presente invenção, o termo "identidade por cento" ou "idêntico por cento", quando se refere a uma sequência, significa que uma sequência é comparada com uma sequência já reivindicada ou descrita após o alinhamento da sequência a ser comparada (a "Sequência Comparada") com a sequência reivindicada ou descrita (a "Sequência de Referência"). O Percentual de Identidade é então determinado de acordo com a seguinte fórmula:

Percentual de Identidade = 100 [I -(C/R)] onde C é o número de divergências entre a Sequência de Referência e a Sequência Comparada ao longo do comprimento do alinhamento entre a Sequência de Referência e a Sequência Comparada, onde (i) cada base ou aminoácido na Sequência de Referência que não tem uma base alinhada correspondente ou o aminoácido na Sequência Comparada, e (ii) cada lacuna na Sequência de Referência, e (iii) cada base ou aminoácido na Sequência de Referência que seja diferente de uma base alinhada ou o aminoácido na Sequência Comparada, constitui uma diferença; e R é o número de bases ou aminoácidos na Sequência de Referência ao longo do comprimento do alinhamento com a Sequência Comparada com qualquer lacuna criada na Sequência de Referência também a ser contada como uma base ou de aminoácido. - 17-

Se existe um alinhamento entre a Sequência Comparada e a Sequência de Referência para as quais o Percentual de Identidade conforme calculado acima é de aproximadamente ou superior a um determinado Percentual de Identidade mínimo, então a Sequência Comparada tem o mínimo especificado pela Percentual de Identidade para a Sequência de Referência, embora possam existir alinhamentos, nos quais o percentual calculado acima é menor do que o valor especificado na Percentual de Identidade.

Os peptídeos nas composições farmacêuticas da presente invenção podem ser modificados pela substituição de um ou mais resíduos em diferentes áreas, possivelmente seletivas, no interior da cadeia peptídica. Estas substituições podem ser de uma natureza conservadora, por exemplo, quando um aminoácido é substituído por um outro aminoácido de estrutura e características similares, tais como quando um aminoácido hidrofóbico é substituído por outro aminoácido hidrofóbico. Ainda mais conservadora seria a substituição de aminoácidos do mesmo tipo ou tamanho e natureza química semelhantes, tais como a leucina é substituído por isoleucina. Em estudos de variações de sequência na família de proteínas homólogas, que ocorrem naturalmente, algumas substituições de aminoácidos foram mais freqiientemente toleradas do que outras, e estas muitas vezes demonstram correlação com semelhanças em tamanho, carga, polaridade, hidrofobicidade entre o aminoácido original e a sua substituição, e essa é a base para a definição de "substituições conservadoras".

Substituições conservadoras são definidas aqui como intercâmbios no âmbito de um dos seguintes cinco grupos: Grupo 1 - alifático pequeno, resíduos não polares ou ligeiramente polares (Ala, Ser, Thr, Pro, Gly), Grupo 2 - resíduos polares, carregados negativamente e suas amidas (Asp, Asn, Glu, Gin); Grupo 3 — resíduos polares, carregados positivamente ((His, Arg, Lys); Grupo 4 - resíduos grandes, alifáticos, não polares (Met, Leu, Ile, Vai, Cis) e Grupo 5 - resíduos grandes, aromáticos (Phe, Tyr, Trp ).

Substituições menos conservadoras podem envolver a substituição de um aminoácido por outro que tem características semelhantes, mas é um pouco diferente em tamanho, como a substituição de uma alanina por um resíduo de isoleucina. Substituições altamente não-conservadoras podem envolver substituição de um aminoácido acídico para um que é polar, ou mesmo para um de caráter básico. Tais substituições “radicais” não podem, contudo, ser julgadas potencialmente ineficazes, pois efeitos químicos não são totalmente previsíveis e - 18- substituições radicais poderiam muito bem dar lugar a efeitos mais propícios não previsíveis a partir dos princípios simples da química.

Evidentemente, essas substituições podem envolver estrutura diferente dos aminoácidos comuns L. Assim, D-aminoácidos podem ser substituídos para o L-aminoácidos comumente encontrados nos peptídeos antigênicos da invenção e ainda podem ser englobados pela divulgação tratada aqui. Além disso, aminoácidos possuindo grupos R não-padrão (ou seja, grupos R diferentes daqueles encontrados nos 20 aminoácidos das proteínas naturais), podem também ser utilizados por motivos de substituição a fim de produzir polipeptídeos imunógenos e imunogênicos de acordo com a presente invenção.

Se substituições forem encontradas em mais de uma posição para resultar em um peptídeo com atividade antigênica substancialmente equivalente ou maior como definido abaixo, combinações dessas substituições serão testadas para determinar se as substituições resultam em efeitos aditivos ou sinérgicos sobre a antigenicidade do peptídeo. Na melhor das hipóteses, não mais do que quatro posições dentro do peptídeo podem ser substituídas simultaneamente.

De preferência, quando os CTLs específicos para um peptídeo de SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 23 são testados contra os substituídos peptídeos, a concentração de peptídeo na qual os peptídeos substituídos atingem a metade do aumento máximo da lise relativa ao fundo não é mais do que aprox. 1 mM, de preferência não mais de aprox. 1 μΜ, mais preferivelmente não mais de aprox. 1 nM, e ainda mais de preferência não mais de aprox. 100 pM, e mais preferivelmente não mais de aprox. 10 pM. Também é preferível que o peptídeo substituído seja reconhecido por CTLs de mais de um indivíduo, pelo menos dois, e de preferência mais três indivíduos. A mucina-1 (MUC1) é uma glicoproteína transmembrana do tipo 1 altamente glicosilada, abundantemente sobreexpressa na superfície celular de vários adenocarcinomas humanos, tais como os cânceres de mama e de ovário. A desglicosilação anormal em tumores malignos é comum e desmascara epitopos em células tumorais que podem não estar presentes em células normais. Além disso, foi demonstrada a expressão de MUC1 em mieloma múltipla e alguns linfomas não-Hodgkin de células B. Diversos relatórios recentes (Apostolopoulos V and McKenzie IF. Cellular mucins: targets for immunotherapy. Crit Rev. Immunol. 14:293-309 (1994); Finn OJ, Jerome KR, Henderson RA, Pecher G, Domenech N, Magarian-Blander J, - 19- and Barratt-Boyes SM. MUC-1 epithelial tumor mucin-based immunity and câncer vaccines. Immunol. Rev. 145:61-89 (1995); Bamd 1989; Takahashi 1994; Noto 1997) demonstraram que células T citotóxicas MHC não restritas de tumores de ovário, mama, pâncreas e mieloma múltiplo podem reconhecer epitopos do cerne de proteína MUC1 localizado na repetição em tandem. Foram identificados dois epitopos de célula T restritas a HLA-A2 derivados da proteína MUC1 (Brossart 1999, EP 1484397). Um peptídeo é derivado da região de repetição em tandem da proteína MUC1. 0 segundo peptídeo localiza-se dentro da sequência de sinais de MUC1. Tem-se obtido êxito na indução de respostas in vivo de linfócitos T citotóxicos após a vacinação com células dendríticas pulsadas com peptídeos em câncer avançado de mama ou de ovário usando esses peptídeos (Brossart 2000) (Wierecky 2005). Com relação ao carcinoma de células renais, a expressão de MUC1 é usual em tumores convencionais e foi relatado que ela está associada ao grau e ao estágio do tumor . No caso da MUC1, a sobreexpressão de proteína não está correlacionada à sobreexpressão do mRNA. A adipofilina é um marcador de células diferenciadas especializadas contendo gotículas lipídicas e de doenças associadas a células acumuladoras de gordura (Heid 1998). A adipofilina ocorre numa grande variedade de linhagens de células cultivadas, incluindo os fibroblastos, bem como em células endoteliais e epiteliais. No entanto, nos tecidos, a expressão da adipofilina restringe-se a certos tipos de células, tais como as células epiteliais mamárias lactantes, células do córtex adrenal, células de Sertoli e Leydig do sistema reprodutor masculino e na esteatose ou hepatócitos de degeneração graxa na cirrose hepática alcoólica (Heid 1998). Há relatos de adipofilina sobreexpressa em câncer colorretal (Saha 2001), carcinoma hepatocelular (Kurokawa 2004), e em carcinoma de células renais (Young 2001). O c-Met codifica um receptor transmembrana heterodimérico com atividade de tirosina quinase composta de uma cadeia α ligada por dissulfito a uma subunidade β (Bottaro 1991; Rubin 1993). Ambas as subunidades são expressas na superfície, sendo a subunidade β pesada responsável por ligar o ligante, o fator de crescimento dos hepatócitos (HGF), enquanto que a subunidade α contém um domínio intracelular que media a ativação de diferentes vias de transdução de sinais. A sinalização de c-Met está implicada na regeneração de órgãos, como foi constatado no fígado e rim, na embriogênese, hematopoiese, desenvolvimento muscular e na regulação da migração e adesão de células B normalmente ativadas e monócitos (Zarnegar 1995; Naldini 1991; Montesano 1998; Schmidt 1995; Uehara 1995; Bladt 1995; Takayama -20- 1996; Mizuno 1993; van, V 1997; Beilmann 2000). Além disso, diversos estudos apontaram para o envolvimento da sobreexpressão de c-Met na transformação maligna e na invasividade de células malignas. O c-Met media as atividades multifuncionais e de potencial oncogênico do fator HGF/SF incluindo a promoção do crescimento, motilidade e sobrevivência das células, na dissolução da matriz extracelular e na angiogênese (Bottaro 1991; Rubin 1993; Zamegar 1995). A ligação do HGF ao receptor induz a autofosforilação de c-Met e ativa eventos de sinalização a jusante, incluindo ras, fosfatidilinositol 3’-quinase, fosfolipase Cy e vias relacionadas com proteína quinase ativadas por mitógeno . O gene c-Met é expresso predominantemente em células epiteliais e é superexpresso em diversos tecidos e linhagens de células malignas. Um crescente número de relatórios mostrou que células não epiteliais, tais como células hematopoiéticas, neurais e do esqueleto respondem ao HGF e que malignidades hematológicas tais como o mieloma múltiplo, doença de Hodgkin, leucemia e linfoma expressam a proteína c-Met. O controle desregulado do fenótipo de crescimento invasivo por c-Met ativado oncogenicamente provocado por mutações ativadoras de c-Met, amplificação ou superexpressão de c-Met e aquisição de loops autócrinos de HGF/c-Met confere propriedades metastáticas e invasivas às células malignas. Notadamente, a ativação constitutiva de c-Met em camundongos transgênicos que superexpressam o HGF promove ampla génese tumoral. O regulador de sinalização 5 da proteína G (RGS5) é um regulador negativo de vias sinalizadoras da proteína G heterotrimérica, embora sua função in vivo ainda seja desconhecida. As proteínas RGS compreendem uma família de moléculas com função catalítica unificadora, mas de distribuição tecidual variada. Elas estimulam a atividade intrínseca da guanosina trifosfatase (GTPase) de subunidades Ga ativadas e, desse modo, aceleram a inativação da proteína G. Assim, as moléculas RGS inibem a sinalização a jusante dos receptores acoplados à proteína G (De 2000). Recentemente, demonstrou-se que a indução do regulador de sinalização 5 da proteína G em perfeitos coincide com a remodelagem vascular ativa durante a neovascularização tumoral. Em um modelo de carcinogênese das ilhotas pancreáticas em camundongos, bem como em astrocitomas altamente angiogênicos, demonstrou-se a sobreexpressão de RGS5 em pericitos no retomo angiogênico (“angiogenic switch”) que acompanha a remodelagem vascular ativa. A sobreexpressão restringiu-se aos vasos tumorais quando comparada a uma ilhota de -21 -

Langerhans normal. No entanto, a RGS5 também é regulada na cicatrização de feridas e na ovulação (Berger 2005). A expressão da RGS5 é aumentada no CCR (Rae 2000). Em outro estudo, a RT-PCR mostrou forte expressão de RGS5 em todos CCRs examinados, e a expressão foi muito fraca ou não detectável em rins normais (6.6:1 em PCR em tempo real). No CCR, o RGS5 foi encontrado principalmente nas células endoteliais dos tumores (Furuya 2004). Além disso, foi relatado que a RGS5 é um marcador de células endoteliais dos sinusoides em carcinoma hepatocelular (Chen 2004). A apolipoproteína LI (APOL1) é uma lipoproteína secretada, de alta densidade, que se liga à apolipoproteína A-I. A apolipoproteína A-I é uma proteína plasmática relativamente abundante e é a principal apoproteína do HDL. Ela se envolve na formação da maioria dos ésteres de colesterol no plasma e também promove a saída do colesterol das células. A apolipoproteína LI pode ter função na troca e transporte lipídicos no corpo, bem como no transporte reverso de colesterol das células periféricas para o fígado. A proteína plasmática é um polipeptídeo de cadeia simples com massa molecular aparente de cerca de 40 kDa (Duchateau 1997; Duchateau 2001). O cDNA da APOL1 foi isolado a partir de uma banco de cDNA de células endoteliais ativadas e foi constatado ser regulado pela TNF-α, que é uma potente citocina pró-inflamatória. (Monajemi 2002). Ο KIAA0367 foi identificado no Projeto cDNA Kazusa que busca identificar longos transcritos humanos desconhecidos que codificam supostas proteínas (Ohara 1997). Embora a função da suposta sequência peptídica de 820 aminoácidos correspondente ao produto do gene KIAA0367 seja desconhecida, ela contém um domínio de ligação a lipídio do tipo CRAL-TRIO próximo à região c-terminal que se liga a pequenas moléculas hidrofóbicas e que está presente em vários fatores de troca de nucleotídeos e na proteína 2 de interação com proteína (BNIP-2) presente em BCL2/adenovirus E1B 19-kDa. O BNIP-2 está envolvido no controle de diversas funções celulares incluindo a morfologia, migração, endocitose celular e progressão do ciclo celular (Zhou 2005). Ο KIAA0367 está situado na região cromossômica 9q21. Essa região é descrita como alvo comum de deleção homozigótica em diversos tumores (Gursky 2001; Weber 2001) ou perda de heterozigosidade (Louhelainen 2000; Tripathi 2003). -22- A guanilato ciclase solúvel (GCs) é uma proteína heterodimérica que consiste em uma subunidade alfa e uma subunidade beta (1 grupo heme) e cataliza a conversão da GTP para o segundo cGMP mensageiro, funcionando como o principal receptor de óxido nítrico e nitrovasodilatadores (Zabel 1998). GUCYa3 e b3 estão sobreexpressos em gliomas humanos. A transfecção de GUCY1A3 ou GUCY1B3 antisenso reduziu a vascularização e o crescimento de tumores em camundongos glabros. Isso pode se dever ao fato de que VEGF é induzido por cGMP (Saino 2004). GUCY1A3 promove a migração das células tumorais numa linhagem de células de tumor de mama em camundongos (Jadeski 2003). A ciclina Dl pertence à família altamente conservada de ciclinas, mais especificamente à subfamília de ciclina D (Xiong 1991; Lew 1991). As ciclinas funcionam como reguladores de CDKs (quinases ciclina-dependentes). As diferentes ciclinas apresentam diferentes padrões de expressão e degradação que contribuem para a coordenação temporal de cada evento mitótico (Deshpande 2005). A ciclina Dl forma um complexo com, e age como, uma subunidade reguladora de CDK4 ou CDK6 cuja atividade é necessária para a transição Gl/S de ciclo celular. CCND1 forma com CDK4 e CDK6 um complexo de holoenzimas serina/treonina quinase conferindo especificidade de substrato ao complexo (Bates 1994). Foi demonstrado que a proteína interage com a proteína Rb supressora de tumor (Loden 2002) e a expressão desse gene é regulada de forma positiva pela Rb (Halaban 1999).

Frequentemente são observadas mutações, amplificação e sobreexpressão desse gene, que altera o avanço do ciclo celular, numa série de diferentes tumores, podendo contribuir para a génese tumoral (Hedberg 1999; Vasef 1999; Troussard 2000). CSPG4 (condroitinas sulfato proteoglicano) representa uma membrana integral de sulfato proteoglicano de condroitina. É conhecida como uma progressão da superfície celular melanoma marcadora prematura, implicada na estimulação tumoral da proliferação celular, migração e invasão. CSPG4 é fortemente expresso em > 90% das lesões de melanoma humano. Embora não seja estritamente CSPG4 específico de tumor, respostas de célula tumor reativa CD4 + T em indivíduos saudáveis e pacientes com melanoma CSPG4693-709 em células de melanoma expressando HLA-DR11 na ausência de autoimunidade (Erfurt et al., 2007).

Expressão de CSPG4 também tem sido descrita em alguns tecidos normais além de pericito ativado tais como células endoteliais, condrócitos, células musculares lisas, alguns -23- queratinócitos basais dentro da epiderme, bem como as células dentro do folículo piloso (Campoli et al., 2004).

Durante a angiogênese e, em resposta às patologias CNS, as células altamente CSPG4 móvel sofrem rápidas mudanças morfológicas e são recrutadas para locais onde ocorrem o crescimento e a reparação do vaso. CSPG4 é sobreexpressa por ambas as células e pericitos tumorais sobre os vasos sanguíneos de tumores malignos do cérebro (Chekenya and Pilkington, 2002). Ao implantar as células a partir de uma linha celular humana glioma CSPG4 positiva em cérebros imunodeficientes de ratos nus. Foi demonstrado que estes tumores tinham uma maior densidade microvascular em comparação com os controles implicando que a expressão CSPG4 regula tanto a função como a estrutura do tumor derivado hospedeiro de vasculatura (Brekke et al., 2006). Em uma experiência xenoenxerto de implantação do material de GBM biópsia em ratos nus, CSPG4 foi identificado por ser principalmente associado com os vasos sanguíneos, tanto sobre o pericito como nos componentes da membrana basal da vascularização de tumor e a expressão foi também associada com áreas de alta proliferação celular (Chekenya et al., 2002a). Além disso, a progressão paralela da expressão CSPG4 do tumor em um modelo de implante de glioma (Wiranowska et al., 2006). CSPG4 é expressa diferencialmente em gliomas humanos com maior expressão em comparação elevada com gliomas de baixo grau (Chekenya et al., 1999). Alta expressão da CSPG4 correlaciona com resistência multidroga mediada pelo aumento da ativação de sinalização integrin/PI3K α3β1 e seus objetivos jusantes, promovendo a sobrevivência celular (Chekenya et al., 2008). FABP7: Proteína graxa ligadora de ácidos (FABPs) são proteínas citosólicas 14-15 kDa, que são supostas em ser envolvidas em ácidos graxos (FA) captação, transporte e destino. Eles estão pensados para aumentar a solubilidade dos FAs no citoplasma quando eles transportam FAs entre compartimentos de membrana, e trazem FAs para os seus objetivos nucleares (Glatz et al., 2002). FABPs podem modular concentração FA e, desta forma, influenciar diversas funções celulares, tais como atividade enzimática, expressão gênica, o crescimento e diferenciação celular (Glatz and Storch, 2001). -24- FABP7 mRNA é expresso em tecidos de origem neuroepitelial assim como em tumores gliais malignos (WHO graus III e IV). O gene foi mapeado na faixa de cromossomos 6q22-23, uma região que também contem os protooncogenes c-myc e freqiientemente é submetida a uma perda de heterozigosidade em gliomas malignos. Análises de linhas de células de glioma maligno demonstraram que FABP7 é frequentemente co-expressa com a proteína glial fibrilar ácida (GFAP) sugerindo que a célula de origem glioma maligna possa ser uma precursora astrocítica que possui o potencial de expressar normalmente ambas as proteínas ou o resultado da formação do tumor (Godbout et al., 1998). A proteína FABP7 mostra expressões nucleares e citoplásmicas de nível moderado a forte no GBM. Células glioma FABP7 transfectadas apresentam uma migração 5 vezes maior do que células de controle. Desta forma, o grau curto de sobrevivência geral associado com sobreexpressão de FABP7 especialmente no GBM deve ter sido causado pelo aumento de migração e invasão de células tumorais para o parênquima ao redor do cérebro (Liang et al., 2005). Outras análises da distribuição de FABP7 em tumores do tipo astrocitoma indicam um nível elevado de FABP7 em regiões de infiltrações dos tumores, propondo um papel importante para FABP7 em conduzir a infiltração de células malignas para tecidos adjacentes do cérebro (Mita et al., 2007). FABP7 demonstra níveis de expressão variáveis e localização subcelular em tecidos gliais e todos os níveis de astrocitoma. Não obstante, especialmente a localização nuclear de FABP7 parece ser associada com o fenótipo infiltrativo de células de glioma e vias EGFR, pois sua translocação nuclear é detectada após a ativação EGFR e está associada com o mau prognóstico em GBM de EGFR positivo. Além disso, imunoreatividade FABP7 não nuclear pode ser observada em astrocitoma de grau I (Liang et al., 2006; Kaloshi et al., 2007).

Neuroligina 4, ligada a X é um membro de uma família de proteína de adesão celular que parece desempenhar um papel na maturação e na função das sinapses neuronais. Os membros da família neuroligina têm uma organização estrutural relacionada, com um peptídeo sinal N terminal, o domínio similar ao esterase com duas áreas de conexão alternativa, uma pequena região elo de baixa identidade sequencial na frente do domínio transmembrana e uma parte citosólica curta com um C-Terminus altamente conservado. Os níveis relativos mais altos de neuroligina 4 mRNA foram detectados de coração. Baixa expressão foi detectada no fígado, pâncreas e no músculo esquelético, enquanto no cérebro, placenta, pulmão e rim, neuroligina 4 mRNA foi dificilmente detectável (Bolliger et al., 2001). -25-

Mutações no gene NLGN4 ligado a X são uma causa potencial de transtornos espectrais autistas, e mutações têm sido relatadas em alguns pacientes com autismo, síndrome de Asperger e retardo mental (Jamain et al., 2003; Laumonnier et al., 2004; Lawson -Yuen et al., 2008).

Poucas associações de NLGN4X com câncer foram descobertas: Nos tumores estromais gastrointestinais, foi encontrado sobre-expressão de NLGN4X em casos de adultos pediátricos e jovens versus adultos mais velhos (Prakash et al., 2005).

Tenascina C: A matriz extracelular que circula as células tumorais é diferente da matriz extracelular em tecidos normais. Tenascina C (TNC) é uma proteína de matriz extracelular que é altamente sobreregulada em processos que estão intimamente associados com atividades migratórias elevadas, tais como desenvolvimento embrionário (Bartsch et al., 1992), cicatrização de feridas (Mackie et al., 1988) e processos neoplásticos (Chiquet-Ehrismann, 1993; Chiquet-Ehrismann and Chiquet, 2003). Além disso, TNC é sobre-expresso em vasos tumorais que têm um alto índice proliferativo, que indica que a TNC está envolvida na angiogênese neoplástica (Kim et al., 2000). Em cérebros humanos normais, a expressão da TNC é detectada apenas raramente onde ela é expressa em níveis elevados em gliomas malignos (Bourdon et al., 1983). A expressão TNC pode ser induzida por hipóxia (Lai et al., 2001), por betai TGF, proporcionando um mecanismo para a invasão dos gliomas de alto grau em parênquima saudável (Hau et al., 2006), ou por gastrina, que modula significativamente a migração de células humanas GBM (Kucharczak et al., 2001). TNC subregula tropomiosina-1 e, assim, desestabiliza fibras estresse de actina. Ela também provoca subregulação do inibidor Wnt Dickkopfl. Como expressão reduzida de tropomiosina-1 e sinalização elevada de Wnt estão diretamente ligadas à transformação e génese tumoral. TNC, especificamente, modula estas vias de sinalização para melhorar a proliferação de células de glioma (Ruiz et al., 2004).

Coloração perivascular da TNC em tomo de vasos sanguíneos que abastecem o tumor é observada em tecidos GBM, que é menos frequente nos gliomas de grau II e III da OMS, indicando que a intensidade da coloração TNC se correlaciona com o grau de tumor e a coloração mais forte indica um mau prognóstico (Herold-Mende et al., 2002). TNC também contribui para a geração de um nicho de células-tronco dentro da zona subventricular (SVZ), exercendo a função de orquestrar o fator de crescimento sinalizando uma aceleração do -26- desenvolvimento de células-tronco neurais. O efeito predominante da TNC em células no SVZ é a regulamentação da progressão desenvolvimental (Garcion et al., 2004). TNC é o indutor mais forte de migração de células-tronco humanas neurais dirigidas (NSC). A ECM produzida por tumor oferece, assim, um ambiente permissivo para um tropismo NSC para células tumorais disseminadas (Ziu et al., 2006). NRCAM (neuronal cell adhesion molecule) é uma molécula de adesão celular neuronal transmembranal com múltiplos domínios semelhantes à imunoglobulina do tipo C2 e à fibronectina do tipo III. Ela está envolvida na orientação, excrescência e fasciculação de células neuronais (Grumet et al., 1991; Morales et al., 1993; Stoeckli and Landmesser, 1995; Perrin et al., 2001; Sakurai et al., 2001) por formar interações hemofílicas, bem como heterofílicas com outros IgCAMs (Volkmer et al., 1996; Sakurai et al., 1997; Zacharias et al., 1999). A NRCAM que se liga à anquirina (Davis and Bennett, 1994) é sobreregulada no tubo formando células endoteliais, sugerindo assim um possível papel na formação de tubos e angiogênese (Aitkenhead et al., 2002). NRCAM é um gene alvo do complexo catenina β e placoglobina LEF/TCF que contribui para oncogênese (Conacci-Sorrell et al., 2002). A ectodomínio NRCAM pode ser removida da superfície da célula por atividades semelhantes à metaloprotease. Este domínio de derramamento é apto a ativar várias vias sinalizadoras, aprimorar a motilidade da célula e conferenciar génese tumoral em ratos (Conacci-Sorrell et al., 2005). NRCAM é regulada em astrocitomas anaplásticos e tecidos tumorais GBM em comparação com um cérebro normal, e níveis elevados são correlacionados com comportamentos invasivos (Sehgal et al., 1998). RNA antisenso contra NRCAM diminui a capacidade tumorigênica do GBM humano (Sehgal et al., 1999). IGF2BP3 é um membro da família de proteínas similares à insulina do fator de crescimento II que se liga ao mRNA, implicada na localização, movimentação e controle translacional de mRNA. A proteína contém vários KH (homólogos K) domínios, que são importantes na união de RNA e conhecidos por serem envolvidos na síntese de RNA e metabolismo. A expressão ocorre principalmente durante o desenvolvimento embrionário e foi descrita para alguns tumores. Assim, IGF2BP3 é considerada uma proteína oncofetal (Liao et al., 2005). A presença de altos níveis de transcrição IGF2BP3 em inúmeros tecidos de câncer, em -27- comparação com tecidos de controle indica que a proteína IGF2BP3 poderá desempenhar um papel funcional na proliferação de células transformadas. Esta hipótese é apoiada pela constatação de que o único tecido humano não-maligno que expressa IGF2BP3 transcritos é a placenta humana, um tecido caracterizado por crescimento e proliferação celular (Mueller-Pillasch et al., 1997).

Por exemplo, IGF2BP3 é expressa em modelos de células claras RCC e sua expressão está associada à fase avançada e grau de tumores primários. Além disso, expressão IGF2BP3 positiva está associada a um risco de metástases distantes aumentado 5-10 vezes e a um aumento do risco de morte de 42% -50% pelo RCC (Hoffmann et al., 2008, Jiang et al., 2006; Jiang et al., 2008). IGF2BP3 também é altamente expresso em carcinomas pancreáticos. Em 2 estudos > 90% das amostras de tecido com tumor pancreático apresentaram expressão IGF2BP3 após imunocoloração, enquanto que tecidos pancreáticos não neoplásticos foram negativos para IGF2BP3. Além disso, a expressão aumentou progressivamente com estádio tumoral (Yantiss et al., 2005; Yantiss et al., 2008).

Expressão de IGF2BP3 também foi encontrada por ser significativamente aumentada nos tumores de alto grau urotelial enquanto não é geralmente expressa em urotélio benigna ou tumores de baixo grau urotelial. Além disso, os pacientes com tumores IGF2BP3 positivos têm uma taxa de sobrevivência livre de progressão e livre de doença muito menor do que aquelas com tumores IGF2BP3 negativos (Li et al., 2008; Sitnikova et al., 2008; Zheng et al., 2008).

Brevican (BCAN) é um membro específico do cérebro da família de lecticano de proteoglicanos de sulfato de condroitina. Foram registrados dois BCAN isoformes: Um isoforme de comprimento integral que é secretado para matriz extracelular e um isoforme menor com uma sequência que prevê uma âncora de glicofosfatidilinositol (GPI). O isoforme secretado é altamente expresso a partir do nascimento e até 8 anos de idade e é subregulado aos 20 anos de idade para os níveis baixos que são mantidos no córtex adulto normal. O GPI isoforme é expresso em baixos níveis uniformes durante todo o desenvolvimento (Gary et al., 2000). BCAN pertence a uma família de proteoglicanos geralmente descritos como moléculas de barreira que impedem motilidade neurite celular no sistema nervoso adulto (Viapiano e -28-

Matthews, 2006). In vivo, BCAN é expresso em tomo do perímetro do fluxo migratório rostral (Jaworski e Fager, 2000) e é um importante componente sobreregulado da cicatriz glial após uma lesão neural (Jaworski et al., 1999). BCAN mostra uma sobreregulação dramática em gliomas, onde pode ser detectado um aumento de expressão aproximadamente sete vezes acima dos níveis normais. BCAN mRNA não foi detectada em amostras de córtex de adultos humanos de indivíduos que morreram sem complicações neurológicas. Em contraste com isso, BCAN mRNA foi detectado em cada uma das 27 amostras cirúrgicas de glioma humano, propondo desta maneira, que BCAN poderia ser um marcador único e seletivo no glioma (Jaworski et al., 1996). A proteína tirosina fosfatase, do tipo receptor, Zetal (PTPRZ1, ΡΤΡ-ξ) - PTPRZ1 é um membro da família de proteínas tirosina fosfatase do tipo receptor que codifica uma proteína membrana de passe simples do tipo I com dois domínios de proteína tirosina citoplasmática fosfatase, um domínio de alfa anidrase carbónica e um domínio de fibronectina tipo III. A expressão desse gene é induzida em células de câncer gástrico (Wu et al., 2006), em câncer de mama (Perez-Pinera et al., 2007), nos oligodendrócitos remielinizantes de lesões da esclerose múltipla (Harroch et al., 2002), e em células embrionárias do rim humano sob condições hipóxicas (Wang et al., 2005).

Tanto a proteína como o transcrito são sobreexpressas nas células glioblastoma, promovendo assim sua migração hatotatica (Lu et al., 2005) e a amplificação de DNA genômico no glioblastoma (Mulholland et al., 2006).

Como Chitinase 3 2 (CHI3L2) - CHI3L2 foi inicialmente identificada a partir de condrócitos e é sobreregulada como, por exemplo, na osteoartrite (Steck et al., 2002). Apesar da proteína não estar bem caracterizada ainda, é mais provável que ela seja secretada no espaço extracelular. Ela tem sido freqúentemente descrita como um antígeno alvo na artrite reumatóide. Indução anti-angiogênese experimental por transfecção siRNA (VEGF-A) de uma linha celular do glioma humano causou sobreregulamentação de CHI3L2.

Survivina (BIRC5) - Expressão de BIRC5 (survivin), um membro do inibidor da família de proteínas apoptose (IAP), é elevado em tecidos fetais e em diversos tumores humanos. Survivina parece ser capaz de regular tanto a proliferação celular como a morte celular -29- apoptótica. Especialmente no glioblastoma foram detectáveis níveis muito altos de expressão survivina (Angileri et al., 2008). É sugerido que a sobreexpressão de survivina em gliomas cerebrais pode desempenhar um papel importante na proliferação maligna, na anti-apoptose e na angiogênese (Zhen et al., 2005; Liu et al., 2006). Especialmente para glioblastoma, mas também para outras entidades tumorais, expressão de survivina foi significativamente associada com o grau de malignidade (survivina com a maior expressão no glioblastoma) e com o tempo de sobrevivência global menor em comparação com pacientes que tiveram tumores de survivina negativa (Kajiwara et al., 2003; Saito et al., 2007; Uematsu et al., 2005; Mellai et al., 2008; Grunda et al., 2006; Xie et al., 2006; Sasaki et al., 2002; Chakravarti et al., 2002).

As proteínas da família da metaloproteinase matricial (MMP) estão envolvidas na quebra da matriz extracelular em processos fisiológicos normais, tais como desenvolvimento embrionário, reprodução e remodelagem tecidual, bem como em processos mórbidos, como artrite e metástase (Mott 2004). A matriz metaloproteinase 7 (MMP7) é secretada como pró-proteína inativa de 29.6 kDa, que é ativada quando clivada por proteinases extracelulares. A enzima ativa tem peso molecular 19.1 kDa e se liga a dois íons de zinco e dois íons de cálcio por subunidade (Miyazaki 1990; Browner 1995). A MMP7 decompõe gelatinas, fibronectinas e caseína (Miyazaki 1990; Quantin 1989) e difere da maioria dos membros da família de MMP por não ter um domínio de proteína terminal C conservada (Gaire 1994). A MMP7 está freqiientemente superexpressa em tecido maligno (Lin 2004; Bramhall 1997; Denys 2004) e supõe-se que ela facilite a invasão de células tumorais in vivo (Wang 2005).

Essas proteínas podem ser alvo de uma resposta imune específica do tumor em diversos tipos de câncer. O peptídeo HBV-001 antígeno do núcleo do vírus da hepatite B não é derivado de um antígeno associado à um tumor endógena humano, mas é derivado do antígeno do núcleo do vírus da hepatite B. Primeiro, ele permite a comparação quantitativa da magnitude das respostas de células T induzida por peptídeos associados a tumor (TUMAPs) utilizados nas composições farmacêuticas da presente invenção e, portanto, permite um estudo de sua capacidade de obter respostas anti-tumorais. Segundo, ela age como um importante controle positivo no caso de ausência de respostas das células T no paciente. Terceiro, ela também permite a monitoração da imunocompetência do paciente. -30- A infecção com o vírus da hepatite B (VHB) é uma das principais causas das doenças hepáticas, atingindo cerca de 350 milhões de pessoas ao redor do mundo (Rehermann 2005). Devido à facilidade da transmissão horizontal e vertical e o potencial da doença se tornar crónica, que pode levar à cirrose hepática e ao carcinoma hepatocelular, o VHB representa um grande impacto no sistema público de saúde de inúmeros países. O genoma do VHB (Previsani 2002) é formado de DNA circular parcialmente de fita dupla. Nos vírions de VHB, ele é conjugado com a proteína essencial do capsídeo HBc e outras proteínas para formar o nucleocapsídeo, que é cercado por um envelope externo contendo lipídios e a família HBs de proteínas de superfície (também chamada de proteína do envelope). A notação dos determinantes antigênicos associados a HBc e HBs é HBcAg e HBsAg, respectivamente. Esses antígenos são associados a respostas sorológicas, ou seja, de anticorpos encontrados no sangue do paciente e estão entre os sistemas antígeno-anticorpo mais úteis para o diagnóstico de infecção com VHB. O HBc irá representar um novo antígeno estranho, para todos aqueles que não tenham um histórico de infecção com VHB. Como os peptídeos imunogênicos para esse antígeno são bem conhecidos (Bertoletti 1993; Livingston 1997), selecionou-se um peptídeo de 10 aminoácidos do HBcAg como antígeno de controle positivo dentro do IMA. A indução de Células T citotóxicas específicos do peptídeo HBc será então utilizada como marcador da imunocompetência e vacinação bem sucedida.

As composições farmacêuticas da presente invenção podem ser usadas para administração parenteral como, por exemplo, por via subcutânea, intradérmica, intravenosa, intramuscular ou administração oral. Para isso, os peptídeos são dissolvidos ou suspensos em veículo em forma farmacêutica aceitável, de preferência em forma aquosa. Além disso, o composto pode conter excipientes como antioxidantes, ligantes, agentes preservantes, tampões, ligantes, agentes desintegrantes, diluentes e flavorizantes. Os peptídeos também podem ser administrados juntamente com substâncias imunoestimulantes tais como as citocinas. Uma relação completa de excipientes utilizáveis nessa composição pode ser obtida, por exemplo, de A. Kibbe, Handbook of Pharmaceutical Excipients, 3a ed., 2000, da American Pharmaceutical Association e da imprensa farmacêutica. As composições da presente invenção podem ser usadas para a prevenção, profilaxia e/ou terapia de doenças adenomatosas ou cancerígenas. -31 -

Composições farmacêuticas da presente invenção podem ser administradas a um paciente que sofra de uma doença adenomatosa ou cancerosa que esteja associada com os respectivos peptídeos ou antígeno de SEQ ID NO:l a SEQ ID NO: 10 ou um paciente que sofre de câncer cerebral, em especial glioma, especialmente doença cancerosa glioblastoma que esteja associada com o respectivo peptídeo ou antigénio de SEQ ID NO: 11a SEQ ID NO: 22 ou SEQ ID NO: 11a SEQ ID NO: 23. Os peptídeos na composição dos produtos farmacêuticos são capazes de desencadear uma resposta imune mediada por célula T. no paciente. Tal como referido acima, no caso de um câncer de células renais, uma composição farmacêutica de acordo com a presente invenção contém de preferência um peptídeo composto pela sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO: 1 e / ou SEQ ID NO:2 e inclui pelo menos um peptídeo associado a tumor contendo a sequência de aminoácidos estabelecida em no SEQ ID NO: 3 a SEQ ID NO: 10. No caso de um câncer cerebral, em particular glioma, especialmente doença cancerosa glioblastoma, a composição farmacêutica contém de preferência uma sequência de estabelecida em SEQ ID NO: 12 e / ou SEQ ID NO: 13 e inclui pelo menos um peptídeo associado a tumor contendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO: 11 e SEQ ID NO: 14 a SEQ ID NO: 22 e/ou SEQ ID NO: 23.

Assim, um peptídeo preferencial da presente invenção exibe um comprimento total entre 9 e 100 aminoácidos, de preferência entre 9 e 30 aminoácidos e de preferência ainda maior entre 9 e 16 aminoácidos. Além disso, pelo menos um peptídeo de acordo com qualquer uma das SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 23 pode incluir ligações não-peptídicas.

Uma composição farmacêutica da presente invenção (de preferência para a vacina contra câncer de células renais) contém um peptídeo composto pela sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO: 1 e/ou SEQ ID NO: 2 e em outras variantes ainda incluem pelo menos um peptídeo constituído por sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO: 3 a SEQ ID NO: 11.

Uma composição farmacêutica preferida da invenção (câncer cerebral, em particular glioma, especialmente vacina contra doença cancerosa glioblastoma) contém um peptídeo composto pela sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO: 12 e/ou SEQ ID NO: 13 e em outras variantes ainda incluem pelo menos um peptídeo constituído por sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO: 11a SEQ ID NO: 22 e/ou SEQ ID NO: 23. -32- O peptídeo pode também ser marcado, ser uma proteína de fusão ou uma molécula híbrida. Espera-se que os peptídeos cujas sequências são dadas na presente invenção estimulem os linfócitos T citotóxicos CD8+. No entanto, a estimulação é mais eficiente quando houver ajuda por parte das células T CD4+. Assim, o parceiro de fusão ou as secções de uma molécula híbrida apropriada produzem epitopos que estimulam as células T CD4+. Os epitopos que estimulam as CD4+ são bem conhecidos no estado da técnica, e incluem aqueles identificados no toxóide tetânico. Em uma variante preferida, o peptídeo é uma proteína de fusão, em particular compreendendo aminoácidos de terminal N da cadeia invariante HLA-DR associada ao antígeno (Π). Em uma outra variante da invenção, o peptídeo é uma proteína humana truncada ou uma proteína de fusão de um fragmento de proteína e outra parte polipeptídica, desde que a parte humana inclua uma ou mais sequências de aminoácidos conforme a invenção.

Peptídeos úteis na composição farmacêutica podem ser substancialmente puros, ou combinados com um adjuvante imunoestimulante, ou usados em combinação com as citocinas imunoestimulantes, ou ser administrados com um sistema de administração adequado, por exemplo, lipossomas, micropartículas, nanopartículas, micelas, emulsões e géis. A vacinação com peptídeo em geral precisa de adjuvantes e, portanto, utiliza-se preferencialmente o GM-CSF (O GM-CSF humano é comercializado sob o nome Sargramostim® e Leukine®, e é disponível pela Berlex, agora chamada Bayer Health Care Pharmaceuticals). Outros adjuvantes adequados são o QS21 stimulon (Aquila Biotech, Worcester, MA, EUA), derivado da saponina, extratos micobacterianos e imitadores sintéticos da parede celular bacteriana, e adjuvantes de marca como, por exemplo, o Detox da Ribi. Também se pode utilizar o Quil A, outro adjuvante derivado da saponina (Superfos, Denmark). Outros adjuvantes, como por exemplo, o da empresa Freund, também podem ser úteis. Também pode ser conveniente administrar o peptídeo conjugado a um veículo adequado, tal como a hemocianina de molusco (KLH) ou manana (vide WO 95/18145 e Longenecker et al (1993) Ann. NY Acad. Sei. 690,276-291). Uma vez que a definição de adjuvante no dicionário médico (MedlinePlus® Medicai Dictionary, NIH) é toda substância que aumenta a resposta imune do antígeno, outras substâncias com essa função também podem ser usadas, incluindo substâncias agonistas de receptores do tipo “toll” (agonistas TLR), preferencialmente substâncias que interagem de forma antagonista com o TLR 3, 7, 8 e 9, como por exemplo o RNA estabilizador de protamina, oligonucleotídeos CpG, oligonucleotídeos CpR, DNA de bactérias, imidazoquinolinas, etc. -33-

Outras substâncias conhecidas no estado da técnica de serem capazes de aumentar a resposta imune incluem os inibidores de sintase do óxido nítrico induzível (iNOS), arginase (ARG1), indoleamina-2,3-dioxigenase (IDO), receptor 1 de fator de crescimento endotelial vascular (VEGFR-1), fator de crescimento endotelial vascular (VEGF), ciclooxigenase-2 (COX-2), receptor I TGF-beta (TGF-beta-RI). Esses inibidores podem, por exemplo, ser anticorpos monoclonais contra as tais moléculas ou pequenas moléculas. As pequenas moléculas e anticorpos monoclonais conhecidos do estado atual da técnica por exercerem uma função inibidora em relação aos fatores antes mencionados e, portanto, um efeito de aumento de resposta imune é, por exemplo: 1-MT, NCX-4016, rofecoxib, celebrex, BEC, ABH, nor-NOHA, SB-505124, SD-208, LY580276, AMD3100, axitinib, bevacizumab, JSI-124, CPA-7, XL-999, ZD2171, pazopanib, CP-547632, e VEGF Trap.

Da mesma forma, substâncias que reduzem a quantidade de células T reguladoras (CD4+, CD25+, FoxP3+) também são adequadas como adjuvantes. Aqui se incluem, por exemplo, as seguintes substâncias: ciclofosfamida (Cytoxan), ONTAK (denileucina diftitox), Sunitinib, anti-CTLA-4 (MDX-010, CP-675206), anti-CD25, anti-CCL22 e anti-GITR.

Quantidades preferenciais de peptídeos da composição farmacêutica - de acordo com a presente invenção - podem variar entre aproximadamente 0,1 e 100 mg, de preferência entre aproximadamente 0,1 e 1 mg, e com maior preferência ainda entre aproximadamente 300 pg e 800 pg por 500 pl de solução. O termo “aproximadamente” significa +/- 10 por cento do referido valor, exceto onde mencionado de forma diferente. O profissional habilitado saberá ajustar a quantidade efetiva de peptídeo a ser usada com base em diversos fatores tais como, por exemplo, a situação imunológica do paciente individual e/ou a quantidade de TUMAP presente em um tipo de câncer em particular.

Composições farmacêuticas da presente invenção fornecem uma formulação com uma solubilidade extremamente reforçada e uma umidificação do liofilizado para níveis acima das composições anteriormente conhecidas. Isto foi obtido com uma composição especial de excipientes. Desta forma, composições farmacêuticas da presente invenção compreendem peptídeos da SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 11 e variantes das mesmas foram desenvolvidas, que demonstram uma excelente estabilidade de armazenamento (-20°C, +5°C, +25°C) e podem ser facilmente redis solvidas. -34- O termo "estabilidade de armazenamento" significa que a percentagem de subprodutos residuais não ultrapassa 5% em dois anos. Além disso, a termo "estabilidade" significa que as propriedades específicas, tais como a solubilidade, a clareza óptica da solução e o número de partículas na solução não mudam perceptivelmente durante esse período. O termo "facilmente redissolvido" significa que o liofilizado pode ser completamente dissolvido através da utilização de um tampão ou outro excipiente dentro de alguns segundos até dois minutos, sem a utilização de um homogenizador ultra-sônico. Além disso, a composição pode ser facilmente aplicada a um paciente com necessidade de tratamento de forma intradérmica, e menos preferencialmente de forma subcutânea. O valor de pH da solução resultante deve se encontrar entre pH 2.7 e pH 9.

Em outra variante, uma composição farmacêutica da presente invenção pode incluir açúcares, alcoóis de açúcar, aminoácidos tal como a glicina, a arginina, o ácido glutâmico e outros como formador de quadro. Os açúcares podem ser monossacarídeo, dissacarídeo ou trissacarídeo. Esses açúcares podem ser utilizados isoladamente, assim como em combinação com os alcoóis de açúcar. Exemplos de açúcares incluem glicose, manose, galactose, frutose ou sorbose como monossacarídeos; sacarose, sucrose, lactose, maltose ou trealose como dissacarídeos e rafinose como um trissacarídeo. Um álcool de açúcar pode ser, por exemplo, a manitose. Ingredientes preferidos são a sacarose, sucrose, lactose, maltose, trealose, mannita e / ou sorbita e, mais preferencialmente, a mannitol.

Além disso, composições farmacêuticas da presente invenção ainda podem incluir excipientes fisiologicamente bem tolerados (ver o Handbook of Pharmaceutical Excipients, 5th ed., edited by Raymond Rowe, Paul Sheskey and Sian Owen, Pharmaceutical Press (2006)), tais como antioxidantes como o ácido ascórbico ou a glutationa , agentes conservantes como fenol, m-cresol, metilparabeno ou propilparabeno, clorobutanol, tiomersal ou cloreto benzalcônio, estabilizador, formador de quadro, como sacarose, sucrose, lactose, maltose, trealose, mannitose, mannit e / ou sorbit, mannit e / ou lactose e solvente tais como polietilenoglicol (PEG), ou seja, PEG 3000, 3350, 4000 ou 6000, ou ciclodextrinas, ou seja, hidroxipropilos-B-ciclodextrina, sulfobutylethyl-B-ciclodextrina ou γ ciclodextrina, ou dextranes ou poloxomers, ou seja, poloxamer 407®, poloxamer 188, ou Tween® 20, Tween® 80. Em uma outra variante preferida de composição farmacêutica da presente invenção inclui um ou mais excipientes -35- bem tolerados, selecionados a partir de um grupo composto de antioxidantes, formadores de quadro e estabilizadores. A presente invenção refere-se à conclusão de que as formulações, incluindo, pelo menos, dois conjuntos de peptídeos segundo a SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 11, mannitol e poloxamer 188 em uma determinada relação podem levar a composições que demonstram uma estabilidade altamente reforçada e podem ser dissolvidos sem a utilização de tratamentos ultra-sónicos. Além disso, a dissolução exige apenas alguns segundos. Como uma especificação do liofilizado, uma solução clara até opalescente deve ser observada por inspeção visual após a reconstituição com 4.2% de solução de bicarbonato de sódio. Estas características de resolubilização das composições farmacêuticas da presente invenção são reprodutíveis, mesmo após o armazenamento do medicamento a -20°C, +5°C e +25°C por 2 anos.

Além disso, a presente invenção refere-se a formulações incluindo, pelo menos, quatro conjuntos de peptídeos de acordo com a SEQ ID NO: 11a SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 11a SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 12 a SEQ ID NO: 22 ou SEQ ID NO: 12 a SEQ ID NO: 23, onde mannitol e poloxamer 188 em uma determinada relação resulta em composições que podem ser facilmente dissolvidas. Como uma especificação do liofilizado, uma solução clara até opalescente deve ser observada por inspeção visual após a reconstituição com 4.2% de solução de bicarbonato de sódio. Os peptídeos individuais descritos na formulação são estáveis durante pelo menos 3 meses após o armazenamento a -20°C, +5°C e +25°.

Em uma outra variante preferida, composições farmacêuticas da presente invenção compreendem uma determinada relação peptídeos:mannitol:Tween® 80 (por peso), inclusive na faixa de entre 1:2:1.5 a 1:8:2.2 . Veja o gráfico abaixo para outras relações preferenciais, que são incluídas na presente invenção. Uma razão é especialmente preferida é 1:5:2. Outra razão especialmente preferida é 1:8:2.

Em uma outra variante preferida, composições farmacêuticas da presente invenção compreendem uma determinada relação de peptídeos:mannitol:poloxamer 188 (por peso), inclusive na faixa de entre 1:5:1.5 a 1:8:2.2. Veja o gráfico abaixo para outras relações preferenciais, que são incluídas na presente invenção. Uma razão preferida é 1:5:1. -36-

Outra razão de peptídeos especialmente preferida: mannitol:poloxamer 188 por peso é a 1:8:2. Uma composição mais preferida inclui uma mistura de peptídeos: mannitol:poloxamer 188® em uma razão de 1:5:2 por peso (ver exemplo 2). Outra razão inclui peptídeos:mannitol:poloxamer 188 na razão de 1:0:2 a 1:2:2.2 por peso.

Outras variantes da presente invenção incluem as seguintes razões por peso:

As composições farmacêuticas da presente invenção podem ser liofilizadas. O liofilizado obtido pode ser reconstituído em uma composição hidratada através da adição de uma solvente hidroso. A composição hidrosa deveria ser preferencialmente capaz de ser diretamente administrada de forma paternal a um paciente. Por conseguinte, uma nova variante da presente invenção é uma composição farmacêutica hidratada das formulações divulgadas acima, disponíveis através da reconstituição do liofilizado descrito acima com um solvente hidratado. O intervalo de pH aceitável é -pH2 -12 para a administração intravenosa e intramuscular, subcutânea, mas o intervalo é reduzido para 2.7 - 9.0 pois a taxa de diluição in vivo é reduzida, resultando em um potencial maior para irratação no local da injeção. Strickley Robert G., Pharm. Res., 21, NO:2, 201 - 230 (2004).

Uma composição farmacêutica preferencialmente hidrosa da invenção tem um valor de pH entre 7 a 9, ainda mais preferencialmente, um valor de pH de 8 a 9 e, ainda mais preferencialmente, um valor de pH entre 8.3 e 8.7.

Composições farmacêuticas da presente invenção são fisiologicamente bem tolerada, facilmente produzível, exatamente dosável, e demonstram uma excelente estabilidade de armazenamento relativa à concentração, produtos da decomposição e agregados para o tempo de armazenamento. As preparações podem ser armazenadas de forma estável por 2 anos em um congelador a -20 0 C, em uma geladeira (+2-8°C) e até mesmo sob temperatura ambiente (+25 0 C), com 60% de umidade relativa.

Composições farmacêuticas da presente invenção são preferencialmente estéreis e formuladas para administração in vivo. -37- A presente invenção também descreve um método para gerar uma resposta imune em um determinado objeto, ou seja, o referido método compreendendo a administração relativa ao objeto em uma mesma necessidade de composição farmacêutica da presente invenção, onde os ditos peptídeos, suas variantes ou sais são administrados em uma quantidade eficaz, de preferência uma quantidade suficiente para gerar a resposta imune em questão. A invenção ainda prevê a utilização de uma composição farmacêutica da invenção de um medicamento para a administração de um objeto, a fim de gerar uma resposta imune contra o câncer. Ela também descreve o uso de uma composição farmacêutica da presente invenção para o tratamento do câncer, de preferência câncer renal, bem como a utilização na fabricação de um medicamento para administração a um objeto com a finalidade de gerar uma resposta imune contra o câncer e, sendo assim, para tratar o câncer.

Peptídeos utilizados na composição farmacêutica são preferencialmente puros, ou essencialmente puros e, de preferência, essencialmente homogéneos (isto é, isentos de peptídeos ou proteínas contaminantes, etc.). "Essencialmente puro" significa uma preparação de peptídeo por HPLC com pureza de pelo menos 90%, e de preferência pelo menos 95%. Uma preparação "essencialmente homogénea" significa uma preparação de peptídeo contendo pelo menos 99% do peptídeo, com base no peso total do peptídeo na preparação.

Além disso, a presente invenção ainda inclui um kit composto por: (a) um recipiente que contém uma composição farmacêutica, conforme o descrito acima, em solução ou em forma liofilizada; (b) opcionalmente, um segundo recipiente contendo um diluente ou solução reconstituinte para a formulação liofilizada; e (b) opcionalmente, instruções para o (i) uso da solução ou (ii) reconstituição e / ou a utilização da formulação liofilizada. O kit pode ainda incluir um ou mais tampões (i), um diluente (ii), um filtro (iii), uma agulha (iv), ou uma seringa (v). O recipiente deve ser de preferência uma garrafa, um frasco, uma seringa ou um tubo de ensaio, e ele pode ser um recipiente multiuso. A composição farmacêutica é, de preferência, liofilizada.

Kits da presente invenção contêm, de preferência, uma formulação liofilizada da presente invenção em um recipiente adequado assim como as instruções para a sua reconstituição e / ou -38- utilização. Recipientes adequados incluem, por exemplo, garrafas, frascos (por exemplo, frascos de câmara dupla), seringas (por exemplo, seringas de câmara dupla) e tubos de ensaio. O recipiente pode ser formado a partir de uma variedade de materiais como vidro ou plástico. Preferencialmente, o kit e / ou o recipiente contêm instruções sobre o recipiente ou similares que apresentem as indicações para a reconstituição e / ou utilização. Por exemplo, o rótulo poderá indicar que a formulação liofilizada deverá ser reconstituída a concentrações de peptídeos, tal como descrito acima. O rótulo ainda pode indicar que a formulação é destinada ou apropriada para administração subcutânea. O recipiente que detém a formulação pode ser um frasco multiuso, que permite a repetição de administrações (por exemplo, 2-6 administrações), da formulação reconstituída. O kit ainda pode incluir um segundo recipiente, contendo um diluente adequado (por exemplo, solução de bicarbonato de sódio).

Após a mistura do diluente e da formulação liofilizada, a concentração no final de peptídeo na formulação reconstituída é, de preferência, pelo menos, 0,15 mg/mL/peptídeo (= 75 μg) e preferencialmente não superior a 3 mg/mL/peptídeo (= 1500 pg). O kit ainda pode incluir outros materiais, conforme desejado a partir de uma perspectiva comercial ou do usuário, incluindo outros tampões, diluentes, filtros, agulhas, seringas, e suplementos de embalagem com instruções de utilização.

Kits da presente invenção podem ter um único recipiente que contém a formulação das composições farmacêuticas, segundo a presente invenção, com ou sem outros componentes (por exemplo, outros compostos ou composições farmacêuticas desses outros compostos), ou podem ter recipientes distintos para cada componente.

Preferencialmente, kits da invenção incluem uma formulação da invenção embalada para uso em combinação com a co-administração de um segundo composto (como adjuvantes (por ex. GM-CSF, um agente quimioterápico, um produto natural, um hormônio ou antagonista, um agente ou inibidor de anti-angiogênese, um agente indutor de apoptose ou um quelante) ou uma composição farmacêutica dos mesmos. Os componentes do kit pode ser pré-complexado ou cada componente pode ser depositado separadamente em recipientes distintos antes da administração a um paciente. Os componentes do kit podem ser fornecidos em uma ou mais soluções líquidas, de preferência, uma solução aquosa, ainda mais preferencialmente, uma -39- solução aquosa estéril. Os componentes do kit também podem ser fornecidos como sólidos, que podem ser convertidos em líquidos através da adição de solventes adequados, que devem ser fornecidos preferencialmente em um recipiente distinto. O recipiente de um kit terapêutico pode ser um frasco, tubo de ensaio, Container, garrafa, seringa, ou quaisquer outros meios de armazenamento de sólidos ou líquidos. Normalmente, quando há mais de um componente, o kit deverá conter um segundo frasco ou outro recipiente, que permita separar a dosagem. O kit também pode conter um outro recipiente para um líquido farmaceuticamente aceitável. De preferência, o kit terapêutico deverá conter um aparelho (por exemplo, uma ou mais agulhas, seringas, conta-gotas, pipetas, etc.), que permita a administração correta dos agentes da invenção que são componentes do presente kit. A presente formulação é adequada para a administração dos peptídeos por qualquer via aceitável, tal como a oral (entérica), nasal, oftálmica, subcutânea, intradérmica, intramuscular, intravenosa ou transdérmica. De preferência a administração deve ser subcutânea e, ainda mais preferencialmente, intradérmica, que pode ser efetuada por bomba de infusão.

Procedimento do ensaio analítico: A identidade, a pureza e o conteúdo do peptídeo são determinados por cromatografia analítica RP-HPLC. A onda de detecção foi de 220 nm.

Teste de Estabilidade (estabilidade dos testes de formulações): a) Vacina contra câncer de células renais:

Diversos liofilizados foram testados com relação à estabilidade de cada peptídeo a +25°C e +40°C utilizando um ensaio HPLC analítico. Os testes de estresse a +25°C e +40°C foram realizados para determinar em quais tendências a formulação é mais estável, sob altas temperaturas e sob temperatura ambiente.

Os peptídeos de acordo com as SEQ ID NOs: 1 a 10 foram liofilizados sem excipientes e através da adição de mannitol e poloxamer 188 (Lutrol® F68) ou Tween® 80.

As seguintes formulações teste foram produzidas e as estabilidades foram avaliadas a +25 °C e +40°C por ensaio HPLC analítico:

Formulação 1: Peptídeos sem excipientes; -40-

Formulação 2: Peptídeos: mannitol: Lutrol® F68 (poloxamer 188) (1:5:2 por peso); Formulação 3: Peptídeos: mannitol: Tween® 80 (1:5:2 por peso); e Formulação 4: Peptídeos: mannitol: Tween® 80 (1:5:1 por peso).

Medições HPLC iniciais foram realizadas para cada formulação antes do armazenamento em uma câmara climática. Para este efeito, o conteúdo de dois frascos foi completamente dissolvido em 30% de ácido acético e medido por RP-HPLC por repetição de determinação. Para garantir a comparabilidade entre as medições individuais, β-naftil-alanina foi utilizado como padrão interno e liofilizado juntamente com os peptídeos.

Após 7, 14, 21 e 28 dias, outros dois frascos foram retirados da câmara climática para avaliar a estabilidade.

Avaliação de dados foi realizada por repetição de determinação de um frasco. Para um ponto tempo e temperatura, dois frascos independentes foram utilizados para obter quatro pontos de dados no total. Estes valores têm sido utilizados para calcular o desvio padrão, mostrado como barras de erro no respectivo esquema.

Como resultado dos experimentos, a estabilidade de cada peptídeo individual da formulação com mannitol e Lutrol® F68 é comparável com os resultados obtidos pela formulação sem quaisquer excipientes. Formulações contendo Tween® 80 mostram degradação reforçada do IMA-RGS-001 em especial a +40°C e um aumento do sinal, especialmente para o peptídeo IMA-FDA-001. Este aumento pode ter sido gerado devido ao processo de co-eluição de impurezas causadas pela degradação dos peptídeos. b) Vacina contra câncer glioblastoma:

Diversos liofilizados foram testados com relação à solubilidade e estabilidade dos peptídeos formulados na mistura.

Os peptídeos de acordo com a SEQ ID NO: 11a SEQ ID NO: 23 foram liofilizados sem excipientes e através da adição de mannitol/poloxamer 188 (Lutrol® F68) e mannitol/Tween® 80. -41 -

As seguintes formulações teste foram produzidas e suas solubilidades em diferentes soluções assim como suas estabilidades a +25°C e +40°C foram testadas.

Formulação 1: Peptídeos sem excipientes;

Formulação 2: Peptídeos: mannitol: Lutrol® F68 (poloxamer 188) (1:5:2 por peso); Formulação 3: Peptídeos: mannitol: Tween® 80 (1:5:2 por peso) A estabilidade de ambas as formulações foi igualmente boa. A solubilidade foi melhor utilizando-se a formulação 2, que deu uma mistura clara e incolor, enquanto a formulação três, em alguns casos, apresentou uma ligeira precipitação sob concentrações mais elevadas. Usando a formulação 1 não foi possível obter uma dissolução.

Como resultado dos experimentos, a estabilidade de cada peptídeo individual da formulação com mannitol/Lutrol® F68 e mannitol/Tween® 80 é comparável com os resultados obtidos pela formulação sem quaisquer excipientes. Sem excipiente, a formulação não é solúvel em soluções adequadas como, por exemplo, hidrogenocarbonato de sódio (4.2 %). Cálculo da potência para preparação IMA901:

Foram testados o efeito dos excipientes poloxamer 188 e mannitol na eficácia de células T. Excipientes não ativos na formulação IMA901 são poloxamer 188 (Lutrol® F68) e mannitol. Estes dois excipientes não estão contidos na formulação IMA901 da fase 1 de testes, mas foram incluídos na formulação da fase 2 de testes para aumentar a solubilidade e estabilidade em uso de IMA901. Neste estudo, a influência dessas substâncias na eficácia de células T em um rato modelo foi testada após a imunização de peptídeo com um peptídeo de murino modelo. Não foram observados nenhum efeito tóxico do poloxamer 188 (Lutrol® F68) e mannitol. A aparência de célula T foi analisada por citometria de fluxo ex vivo e coloração tetrâmera por nove dias após a imunização. A adição de poloxamer (Lutrol® F68) / mannitol à solução de imunização não altera a eficácia de células T CD8+.

Princípio do teste

Imunização: Para o chamado "priming" de células CD8+ T simples, o peptídeo Ova257_264 (SIINFEKL) que se liga a H2-K imunogênicos, em combinação com um adjuvante comumente utilizado em imunização de ratos (CPG deoxioligonucleotídeo) em 4.2% de tampão bicarbônico, foi injetado intradermicamente por 8-12 semanas em camundongos -42- fêmeas (linhagem C57BL/6, H2,3 camundongos por grupo). Soluções de injeção com e sem Poloxamer 188 (Lutrol® F68 (16,5 mg / ml)) e mannitol (41.3 mg / ml) foram comparadas. As concentrações dos excipientes são as mesmas previstas para a solução de injeção IMA901. Os controles positivos foram imunizados por via subcutânea com solução de peptídeo contendo CpG emulsionados em Titermax ® clássico (Sigma-Aldrich).

Coloração de tetrâmeros: Após 9 dias, camundongos foram sacrificados e as células T específicas de Ova257-264 no baço foram analisadas ex vivo com coloração de tetrâmero e citometria de fluxo. A tecnologia de tetrâmero permite a detecção específica e sensível das células T que ostentam a compatibilidade de células T do receptor.

Resultados: Não foi observados nenhum efeito tóxico do poloxamer 188 (Lutrol® F68 BASF, Ludwigshafen, Alemanha)/mannitol localmente na área da injeção ou sistemicamente. Grupo de controle positivo, grupo CpG e CpG/poloxamer 188 / grupo mannitol mostraram frequências significativamente maiores de peptídeos específicos de células T, em comparação com os controles negativos (p<0.05). Não houve diferença significativa entre o CpG sozinho e o grupo CpG/poloxamer 188/mannitol. A possibilidade de populações positivas observadas artificialmente foi excluída pela coloração de tetrâmero das células proliferadas específicas do peptídeo após uma estimulação de cinco dias in vitro com o peptídeo (dados não mostrados).

Em conclusão, a presença de poloxamer 188 (Lutrol® F68) / mannitol no coquetel de imunização não altera respostas imunes desencadeadas pelos peptídeos em ratos e, portanto, influências adversas ou desfavoráveis do poloxamer 188 (Lutrol® F68) e mannitol sobre a eficácia e segurança dos métodos imunoterápicos - baseados nos peptídeos em geral - não são esperadas.

Materiais e Métodos

Peptídeos utilizados para a fabricação de diferentes formulações foram sintetizados e fornecidos pela Bachem AG, Suíça. -43-

EXEMPLOS

Exemplo 1:

As soluções de reserva de cada peptídeo individual foram preparadas pela dissolução dos peptídeos em solventes adequados, de acordo com suas características de solubilização (ver Tabela 2). 1.47 mL das soluções peptídicas de maior concentração (peptídeo 5 a 10) e 7.34 ml. das soluções peptídicas 1 a 4 foram combinadas após a adição de 1.47 mL de ácido acético 10%. A mistura foi vortexada durante 2 minutos e tratada por banho ultra-sônico por 1 minuto. Aproximadamente 1 mL da solução límpida resultante foi transferido para frascos de vidro, seguidos pela adição de 19.2 mg de mannitol e 50 pL de uma solução Tween® 80 de reserva (77 mg de Tween® 80 dissolvidos em solução de ácido acético 30%). Dentro de alguns minutos, a solução foi congelada a -40 ° C e liofilizada por 14 horas a 0.06 mbar, seguido por 6 horas de período pós-secagem a 0.003 mbar (ver a Tabela 3)

Tabela 2: Pept ídeos usados para o exemplo 1. Peptídeo SEQ ID NO: Peptídeo Conteúdo de peptídeo (%) Quantidade [mg] Solvente [ml] 4 IMA-CCN- 001 95.5 16.65 7.57 (50% HAc) 6 IMA-GUC- 001 88.8 17.72 7.50 (90% HAc) 3 IMA-ADF- 001 91.7 17.35 7.58 (10% HAc) 2 IMA-ADF- 002 94.0 16.95 7.58 (10% HAc) 10 IMA-RGS- 001 89.4 17.66 1.50 (10% HAc) 8 IMA-MET- 001 91.8 17.68 1.55 (50% HAc) 9 LVLA-MUC- 001 90.6 17.84 1.54 (10% HAc) 1 IMA-MMP- 001 89.6 17.92 1.53 (WFI) 4 LVLA-APO- 001 92.1 17.76 1.56 (WFI) 7 LVLA-K67- 001 92.4 17.22 1.52 (WFI)

Tabela 3: Parâmetros de liofilização para o exemplo 1.

Tratamento Tempo Vácuo Temperatura Congelamento 3:00 atm -40 °C Secagem primária 0:10 0.06 mbar -39 °C Secagem primária 3:00 0.06 mbar -20 °C -44-

Secagem primária 10:00 0.06 mbar + 0°C Secagem primária 6:00 0.06 mbar + 20 °C Secagem secundária 3:00 0.003 mbar + 20 °C Secagem secundária 6:00 0.003 mbar + 25 °C

Exemplo 2:

Um lote GMP foi produzido contendo 2.000 frascos com 578 pg por cada peptídeo individual por frasco mais mannitol e poloxamer 188. A formulação inclui os peptídeos, mannitol e poloxamer 188 em uma proporção de 1:5:2 [w:w.w].

Cada peptídeo liofilizado individual foi pesado, de acordo com os montantes indicados na Tabela 4, em vasos de vidro separados. Após a pesagem, todos os peptídeos foram diluídos em um determinado solvente.

Tabela 4: Peptídeos usados para o exemplo 2.

Peptíde oSEQ ID NO Peptídeo Quantidade líquida [mg] Conteúdo de peptídeo [%] Quantidade bruta [mg] Solvente [ml] 4 IMA-CCN-001 1156.00 91.6% 1262.01 550 (50% HAc) 6 IMA-RGS-001 1156.00 83.2% 1389.42 110(10% HAc) 3 IMA-GUC-001 1156.00 92.9% 1244.35 550 (90% HAc) 2 IMA-MET-001 1156.00 92.6% 1248.38 110 (50% HAc) 10 IMA-ADF-001 1156.00 93.3% 1239.01 540(10% HAc) 8 IMA-ADF-002 1156.00 95.5% 1210.47 540(10% HAc) 9 IMA-MUC-001 1156.00 87.2% 1325.69 110 (10% HAc) 1 IMA-MMP-001 1156.00 88.6% 1304.74 110 (WFI) 4 IMA-APO-001 1156.00 95.0% 1216.84 110 (WFI) 7 IMA-K67-001 1156.00 88.3% 1309.17 110 (WFI)

Devido às diferentes solubilidades dos peptídeos, eles têm de ser dissolvidos de acordo com a ordem prevista na Tabela 4 começando com o peptídeo 1. Diferentes quantidades e concentrações de solução de ácido acético e água para injeção (WFI), foram utilizadas para dissolver os peptídeos, devido a diferenças na solubilidade dos peptídeos e no que diz respeito ao volume de enchimento final da solução do granel. Para melhorar a solubilidade, cada frasco foi tratado por agitação vigorosa durante um período máximo de cinco minutos e, se -45- necessário, por sonificação durante um período máximo de cinco minutos. As quantidades e concentrações a serem utilizadas também são apresentadas na Tabela 4.

Uma vez que os peptídeos foram prontamente dissolvidos, as soluções têm de ser misturadas na forma apresentada na Tabela 4, que começa com o peptídeo número 1. As soluções são colectadas em um recipiente de vidro esterilizado. Os frascos individuais de peptídeo são lavados com uma solução de 105 ml de ácido acético (30%). Finalmente, esta solução é adicionada à mistura da solução peptídica e agitada durante cinco minutos. 23.1 g poloxamer 188 (Lutrol® F68) e 57.8 g mannitol foram adicionados à mistura de peptídeo e toda a solução foi agitada por cinco minutos. A solução de granel contendo os 10 peptídeos e os excipientes foram estéril-filtradas através de filtro com poros de 0.22 pm. 1.485 ml da solução foram depositados em frascos de vidro esterilizado 2R sob condições estéreis e sob uma atmosfera inerte de nitrogénio, pré-selados e transportados para o secador por congelamento para liofdização. O processo de liofilização (ver Tabela 5) inclui o congelamento dos frascos a uma temperatura de -45 0 C, um aumento progressivo da temperatura até +20°C (fase principal de secagem) e uma etapa final secagem a +25°C. Quando a secagem foi concluída, o secador por congelamento foi trazido de volta à pressão atmosférica usando-se nitrogénio seco que foi filtrado de modo estéril.

Tabela 5: Parâmetro de liofilização usado para o exemplo 2.

No. Passo Tempo [min] T[°C] Vácuo [mbar] 1 Carregar 3 -45 2 Congelar 180 -45 3 Secagem principal 15 -45 1.50E-01 4 Secagem principal 300 -20 1.50E-01 5 Secagem principal 480 0 1.50E-01 6 Secagem principal 360 20 1.50E-01 7 Secagem principal 60 20 1.50E-01 8 Pós-secagem 15 2 5.00E-03 9 Pós-secagem 180 20 5.00E-03 10 Pós-secagem 120 25 5.00E-03 11 Pós-secagem 240 25 5.00E-03 12 Pré-ventilação 1 25 8.00E+02 13 Vedação 5 25 8.00E+02 14 Ventilação com N2 1 25 1.00E+03 15 Armazenamento 3 5 1.00E+03 -46-

Procedimento de resolubilização: Para os ensaios clínicos descritos acima, a formulação é dissolvida em 700 μ1 de hidrogeno carbonato de sódio (4.2 %). Remover a tampa de plástico de um frasco. Desembalar e remover o hidrogeno carbonato de sódio (4.2%) do refrigerador por pelo menos 30 minutos antes da resolubilização para trazê-los até a temperatura ambiente antes da injeção. Preparar seringa e a agulha para a reconstituição. Utilizar técnica asséptica para despejar 700 pL de diluente para reconstituição do liofilizado. Para dissolver o liofilizado, o frasco do diluente e deve ser agitado vigorosamente durante 1 minuto, verifique se a solução é clara, caso contrário, continuar agitando por mais um minuto até que a solução se torne clara. 10 a 30 minutos após a injeção de GM-CSF, usar uma nova seringa para administrar 500 pL de formulação reconstituída i.d. na mesma área. Administração tem de ocorrer dentro de 1 h após a reconstituição. Liofilizado dissolvido pode ser armazenado assepticamente sob temperatura ambiente por até 1 hora após a reconstituição.

Testes de estabilidade após a reconstituição demonstraram que a maioria dos peptídeos permaneceu suficientemente estável após a reconstituição. No entanto, houve um decréscimo de dois peptídeos específicos, ou seja, IMA-CCN-001 e IMA-RGS-001. (ver a Tabela 6). Como estes peptídeos contem um resíduo de cisteína, ocorre uma dimerização em função do tempo.

Tabela 6: Resultados do ensaio HPLC para estabilidade em uso após a reconstituição com solução de 4.2 % de hidrogeno carbonato de sódio. Comparação entre a formulação com e sem excipientes.

Peptíde 0 Formulação Inicial * lh 2 h 3 h 4 h 5 h 6 h ADF- 001 sem excipientes 100.0 -U-102. 4 102.4 100.0 n.d. n.d. n.d. (B) + mannitol/Lutrol 100.0 99.6 99.6 100.7 100.8 99.9 101.8 ADF- sem excipientes 100.0 100.9 100.0 97.2 n.d. n.d. n.d. 002 (B) + mannitol/Lutrol 100.0 99.9 100.0 101.1 101.2 99.9 101.9 APO- sem excipientes 100.0 100.0 97.4 97.4 n.d.. n.d. n.d. 001 (B) + mannitol/Lutrol 100.0 99.8 99.8 100.7 100.9 99.6 101.5 CCN- sem excipientes 100.0 82.8 72.1 63.3 n.d. n.d. n.d 001 (B) + mannitol/Lutrol 100.0 95.6 92.2 91.3 89.2 86.1 85.9 GUC- sem excipientes 100.0 100.0 100.0 98.6 n.d. n.d. n.d. 001 (B) + mannitol/Lutrol 100.0 99.7 99.5 100.6 100.8 99.7 101.6 K67-001 sem excipientes 100.0 100.8 99.2 97.5 n.d. n.d. n.d. -47- + mannitol/Lutrol 100.0 99.8 100.4 101.6 101.8 100.6 102.5 MET- sem excipientes 100.0 100.0 99.2 96.7 n.d. n.d. n.d. 001 (B) + mannitol/Lutrol 100.0 99.8 99.8 101.0 101.1 99.8 101.7 MMP- sem excipientes 100.0 98.6 97.1 95.7 n.d. n.d. n.d. 001 (B) + mannitol/Lutrol 100.0 99.5 99.3 100.2 100.4 98.9 100.9 MUC- sem excipientes 100.0 100.8 99.2 96.6 n.d. n.d. n.d. 001 (B) + mannitol/Lutrol 100.0 99.8 99.6 100.6 100.6 99.5 101.3 RGS- sem excipientes 100.0 90.9 77.8 64.6 n.d. n.d. n.d. 001 (B) + mannitol/Lutrol 100.0 97.9 95.5 94.2 91.6 88.0 86.8 * Valor inicial fixado em 100 %. Primeira HPLC executada após a resolubi ização. A influência de diferentes valores de pH (em torno de pH 8.5) e o tampão carbonato de alta capacidade sobre o sucesso das imunizações de peptídeo foi avaliada em um modelo de rato. Usando um modelo de peptídeo imunogênico padrão em diferentes soluções de injeção, a eficiência foi testada por ensaio padrão de liberação 51Cr. Os resultados foram confirmados por análise de citometria de fluxo após a coloração de tetrâmero. Resumindo, não houve diferença significativa detectável na eficiência preliminar entre as imunizações intradérmicas em pH 7.5, 8.5 (pH do diluente IMA901) e o pH 9.5.

Além disso, a força iônica elevada não reduziu a resposta imune observada em comparação com o tampão isotônico de injeção. Não foram observados efeitos colaterais tóxicos para imunizações com soluções de injeção a pH 7.5, 8.5, e com o diluente IMA901, mas se tomou evidente com a solução injetável pH 9.5 (lesões locais necróticas da pele no local da injeção). Estes resultados suportam a adequação do tampão escolhido como diluente adequado para IMA901.

Exemplo 3:

As soluções de reserva de cada peptídeo individual foram preparadas pela dissolução dos peptídeos em solventes adequados, de acordo com suas características de solubilização (ver Tabela 7).

Tabela 7: Peptídeos usados para o exemplo 3.__

Peptídeo NO: Peptídeo Pureza de peptídeo (%) Quantidade [mg] Solvente [ml] 23 IMA-CHI-001 99.7 23.19 11.560 (90%HAc) -48- 15 IMA-FABP7- 001 92.0 25.13 4.624 (90%HAc) 17 IMA-MET-005 93.1 24.83 3.853 (50%HAc) 18 IMA- NLGN4X-001 90.3 25.60 5.780 (50%HAc) 22 EVLA-TNC-001 94.0 24.60 5.780 (30%HAc) 20 IMA-PTP-003 96.3 24.01 2.890 (20%HAc) 12 EVLA-BCA-002 97.7 23.66 3.303 (10%HAc) 13 EVLA-BIR-002 96.0 24.08 2.312 (10%HAc) 14 IMA-CSP-001 98.1 23.57 5.780 (10%HAc) 16 IMA- IGF2BP3-001 94.6 24.44 2.890 (10%HAc) 19 IMA-NRCAM- 001 96.0 24.08 2.312 (10%HAc) 21 IMA-PTP-005 97.0 23.84 2.312 (10%HAc) 11 IMA-HBV-001 99.0 23.35 4.624 (WFI) Volume de lavagem 1.800 (30%HAc) Volume de enchimento 0.180 (WFI)

Devido às diferentes solubilidades dos peptídeos, eles têm de ser dissolvidos de acordo com a ordem prevista na Tabela 4 começando com o peptídeo 1. Diferentes quantidades e concentrações de solução de ácido acético e água para injeção (WFI) foram utilizadas para dissolver os peptídeos, devido a diferenças na solubilidade dos peptídeos e no que diz respeito ao volume de enchimento final da solução do granel. Para melhorar a solubilidade, cada frasco foi tratado por agitação vigorosa durante um período máximo de cinco minutos e, se necessário, por sonificação durante um período máximo de cinco minutos. As quantidades e concentrações a serem utilizadas também são apresentadas na Tabela 7.

Uma vez que os peptídeos foram prontamente dissolvidos, as soluções têm de ser misturadas na forma apresentada na Tabela 7, que começa com o peptídeo número 1. As soluções são coletadas em um recipiente equipado com uma barra mexedora. Finalmente, esta solução é adicionada à mistura da solução peptídica e agitada durante no mínimo cinco minutos. -49- 601.1 mg poloxamer 188 (Lutrol® F68) e 1.502,8 mg mannitol foram adicionados à mistura de peptídeo e toda a solução foi agitada por cinco minutos. A solução de granel contendo os 13 peptídeos e os excipientes foram estéril-filtradas através de filtro com poros de 0.22 pm. 1.500 ml da solução foram depositados em frascos de vidro 2R, pré-selados e transportados para o secador por congelamento para liofilização. O processo de liofilização (ver Tabela 7) inclui o congelamento dos frascos a uma temperatura de -45 ° C, um aumento progressivo da temperatura até +20°C (fase principal de secagem) e uma etapa final secagem a +25 °C. Quando a secagem foi concluída, o secador por congelamento foi trazido de volta à pressão atmosférica usando-se nitrogénio.

Tabela 8: Parâmetros de liofilização usados para o exemplo 3.

No. Passo Tempo [min] T[°C] Vácuo [mbar] 1 Carregar 5 -45 2 Secagem primária 10 -45 0.50E-01 3 Secagem primária 360 -20 0.50E-01 4 Secagem primária 480 0 0.50E-01 5 Secagem primária 360 20 0.50E-01 6 Secagem primária 60 20 0.50E-01 7 Secagem secundária 15 20 5.00E-03 8 Secagem secundária 180 20 5.00E-03 9 Secagem secundária 120 25 5.00E-03 10 Secagem secundária 240 25 5.00E-03 11 Ventilação com N2 1 25 1.00E+03 12 Vedação 5 25 1.00E+03

Procedimento de resolubilização:

Para os ensaios clínicos descritos acima, a formulação é dissolvida em 700 μΐ de hidrogenocarbonato de sódio (4.2 %). Para dissolver o liofilizado, o frasco do diluente e deve ser agitado vigorosamente durante 1 minuto, verifique se a solução é clara, caso contrário, continuar agitando por mais um minuto até que a solução se tome clara. Administração de 500μ1 da solução tem de ocorrer dentro de 1 h após a reconstituição. Liofilizado dissolvido pode ser armazenado assepticamente sob temperatura ambiente por até 1 hora após a reconstituição.

Testes de estabilidade após a reconstituição demonstraram que a maioria dos peptídeos permaneceu suficientemente estável após a reconstituição (ver a tabela 9). -50-

Tabela 9: Resultados do ensaio HPLC para estabilidade em uso após a reconstituição com solução de 4.2 % de hidrogeno carbonato de sódio. Comparação entre a formulação com e sem excipientes.

Peptídeo Inicial 2h 4h 6h Peptídeo [%] Peptídeo [%] Peptídeo [%] Peptídeo [%] NRCAM-001 +mannitol/Lutrol 100.0 99.9 100.0 99.5 sem excipientes 100.0 99.8 100.2 95.6 BIR-002 +mannitol/Lutrol 100.0 100.8 101.2 100.9 sem excipientes 100.0 100.6 101.4 96.2 CSP-001 +mannitol/Lutrol 100.0 100.0 100.1 99.6 sem excipientes 100.0 99.2 99.7 95.0 PTP-003 +mannitol/Lutrol 100.0 100.3 100.5 100.1 sem excipientes 100.0 100.4 100.9 96.1 IGF2BP3-001 +mannitol/Lutrol 100.0 100.4 100.6 100.7 sem excipientes 100.0 100.0 101.2 96.0 PTP-005 +mannitol/Lutrol 100.0 100.1 100.3 99.8 sem excipientes 100.0 99.9 100.4 95.8 TNC-001 +mannitol/Lutrol 100.0 100.5 100.6 100.2 sem excipientes 100.0 100.0 100.4 95.7 MET-005 +mannitol/Lutrol 100.0 100.5 100.7 100.4 sem excipientes 100.0 100.3 100.7 96.0 FABP7-001 +mannitol/Lutrol 100.0 100.9 100.7 100.6 sem excipientes 100.0 100.5 100.9 96.3 NLGN4X-001 +mannitol/Lutrol 100.0 100.8 100.9 100.5 sem excipientes 100.0 99.9 100.5 95.7 HBV-001 +mannitol/Lutrol 100.0 100.3 100.6 100.3 sem excipientes 100.0 100.2 100.6 95.8 CHI-001 +mannitol/Lutrol 100.0 100.0 100.7 100.2 sem excipientes 100.0 102.2 101.3 90.6 BCA-002 +mannitol/Lutrol 100.0 99.8 99.6 98.9 sem excipientes 100.0 99.9 100.1 95.4

Exemplo 4:

As soluções de reserva de cada peptídeo individual foram preparadas pela dissolução dos peptídeos em solventes adequados, de acordo com suas características de solubilização (ver Tabela 9).

Tabela 10: Peptídeos usados para o exemplo 4.

Peptídeo SEQID NO: Peptídeo Pureza de peptídeo (%) Quantidade [mg] Solvente [ml] 23 IMA- FABP7-001 92.0 28.27 4.335 (90%HAc) -51 - 15 IMA-MET- 005 94.0 27.67 4.335 (50%HAc) 17 IMA- NLGN4X- 001 91.0 28.58 6.503 (50%HAc) 18 IMA-TNC- 001 94.0 27.67 3.251 (50%HAc) 22 IMA-PTP- 003 97.0 26.81 3.251 (20%HAc) 20 IMA-BCA- 002 98.0 26.54 3.251 (10%HAc) 12 IMA-BIR- 002 96.0 27.09 3.251 (10%HAc) 13 IMA-CSP- 001 91.0 28.58 5.202 (10%HAc) 14 IMA- IGF2BP3- 001 95.0 27.38 5.202 (10%HAc) 16 IMA- NRCAM- 001 96.0 26.54 3.251 (10%HAc) 19 IMA-PTP- 005 97.0 26.81 3.251 (10%HAc) 21 IMA-HBV- 001 99.0 26.27 5.202 (WFI) Volume de lavagem 3.375 (30%HAc) Volume de enchimento 13.839 (WFI)

Devido às diferentes solubilidades dos peptídeos, eles têm de ser dissolvidos de acordo com a ordem prevista na Tabela 4 começando com o peptídeo 1. Diferentes quantidades e concentrações de solução de ácido acético e água para injeção (WFI) foram utilizadas para dissolver os peptídeos, devido a diferenças na solubilidade dos peptídeos e no que diz respeito ao volume de enchimento final da solução do granel. Para melhorar a solubilidade, cada frasco foi tratado por agitação vigorosa durante um período máximo de cinco minutos e, se necessário, por sonificação durante um período máximo de cinco minutos. As quantidades e concentrações a serem utilizadas também são apresentadas na Tabela 10.

Uma vez que os peptídeos foram prontamente dissolvidos, as soluções têm de ser misturadas na forma apresentada na Tabela 10, que começa com o peptídeo SEQ ID NO:23. As soluções são coletadas em um recipiente equipado com uma barra mexedora. Finalmente, esta solução é adicionada à mistura da solução peptídica e agitada durante no mínimo cinco minutos. -52- 624.2 mg poloxamer 188 (Lutrol® F68) e 1.560,6 mg mannitol foram adicionados à mistura de peptídeo e toda a solução foi agitada por cinco minutos. A solução de granel contendo os 12 peptídeos e os excipientes foram estéril-filtradas através de um filtro com poros de 0.22 pm. 1.500 ml da solução foram depositados em frascos de vidro 2R, pré-selados e transportados para o secador por congelamento para liofilização. O processo de liofilização (ver Tabela 11) inclui o congelamento dos frascos a uma temperatura de -45 °C, um aumento progressivo da temperatura até +20°C (fase principal de secagem) e uma etapa final secagem a +25°C. Quando a secagem foi concluída, o secador por congelamento foi trazido de volta à pressão atmosférica usando-se nitrogénio seco.

Tabela 11: Parâmetro de liofilização usado para o exemplo 4.

No. Passo Tempo [min] T[°C] Vácuo [mbar] 1 Carregar 5 -45 2 Secagem primária 10 -45 0.50E-01 3 Secagem primária 360 -20 0.50E-01 4 Secagem primária 480 0 0.50E-01 5 Secagem primária 360 20 0.50E-01 6 Secagem primária 60 20 0.50E-01 7 Secagem secundária 15 20 5.00E-03 8 Secagem secundária 180 20 5.00E-03 9 Secagem secundária 120 25 5.00E-03 10 Secagem secundária 240 25 5.00E-03 11 Ventilação com N2 1 25 1.00E+03 12 Vedação 5 25 1.00E+03

Testes de estabilidade a diferentes temperaturas demonstraram que todos os peptídeos permaneceram suficientemente estáveis, mesmo durante as condições (+25°C) de estresse (ver a Tabela 12).

Tabela 12: Resultados em ensaio HPLC para a estabilidade de peptídeos na formulação a +25°C +/- 2°C por 3 meses

Peptídeo INICIAL [%] 1M [% do inicial] 2M [% do inicial] 3M [% do inicial] NRCAM-001 100.0 97.90 96.73 97.59 BIR-002 100.0 97.49 96.24 98.93 CSP-001 100.0 98.04 96.99 98.71 PTP-003 100.0 98.29 97.11 98.29 IGF2BP3-001 100.0 98.01 96.77 97.34 PTP-005 100.0 98.16 97.10 98.30 TNC-001 100.0 97.86 96.80 97.21 -53- MET-005 100.0 97.49 96.13 97.21 FABP7-001 100.0 98.43 97.71 98.67 NLGN4X-001 100.0 97.90 96.30 96.41 HBV-001 100.0 97.83 96.47 97.50 BCA-002 100.0 98.20 97.05 97.88

Tabela 13: Resultados em ensaio HPLC para a estabilidade de peptídeos na formulação a +5°C +/- 3°C por 3 meses

Peptídeo INICIAL [%] 1M [% do inicial] 2M [% do inicial] 3M [% do inicial] NRCAM-001 100.0 99.13 98.17 98.79 BIR-002 100.0 98.53 97.28 100.01 CSP-001 100.0 98.99 98.05 99.81 PTP-003 100.0 99.07 97.95 98.68 IGF2BP3-001 100.0 99.00 97.92 98.57 PTP-005 100.0 98.93 97.79 98.67 TNC-001 100.0 99.02 98.10 98.72 MET-005 100.0 99.06 97.92 98.59 FABP7-001 100.0 99.08 98.15 98.66 NLGN4X-001 100.0 99.12 98.24 98.84 HBV-001 100.0 98.87 97.76 98.47 BCA-002 100.0 99.13 98.04 98.73

Tabela 14: Resultados em ensaio HPLC para a estabilidade de peptídeos na formulação a -20°C +/- 5°C por 3 meses

Peptídeo INICIAL [%] 1M [% do inicial] 2M [% do inicial] 3M [% do inicial] NRCAM-001 100.0 99.23 97.86 98.91 BIR-002 100.0 98.43 96.98 100.14 CSP-001 100.0 98.99 97.61 99.61 PTP-003 100.0 99.11 97.48 98.57 IGF2BP3-001 100.0 99.10 97.54 98.42 PTP-005 100.0 98.99 97.41 98.34 TNC-001 100.0 99.01 97.61 98.57 MET-005 100.0 99.14 97.54 99.00 FABP7-001 100.0 99.09 97.60 98.39 NLGN4X-001 100.0 99.05 97.60 98.62 HBV-001 100.0 98.93 97.39 98.34 BCA-002 100.0 99.17 97.61 98.61

Claims (11)

1. REIVINDICAÇÕES Uma formulação farmacêutica contendo: Entre 2 e 18 peptídeos associados a tumor; onde cada peptídeo tem um comprimento entre 8 e 22 aminoácidos; onde pôde ser observado que os ditos peptídeos mostram uma solubilidade de pelo menos 2.7 mg/mL em 90% de ácido acético; mannitol e poloxamer 188, de onde a relação do peso do(s) dito(s) peptídeo(s) de mannitol para poloxamer 188 está incluído no intervalo entre 1:5:1.5 e 1:8:2.2.; ou mannitol e Tween® 80, de onde a relação do peso dos peptídeos de mannitol para o Tween® 80 está incluído no intervalo entre 1:2:1.5 e 1:8:2.2. A composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 1, de onde a relação dita do peso de peptídeos de mannitol para o poloxamer 188 está incluída no intervalo entre 1:0:2 e 1:0:2.2. A composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 1, contendo pelo menos dois peptídeos, onde os ditos peptídeos contêm uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo constituído por SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 10, ou SEQ ID NO: 12 a SEQ ID NO: 23, desde que a composição compreenda pelo menos um peptídeo compreendendo SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 12 ou SEQ ID NO: 13 ou um sal de tal, e ainda inclui mannitol e poloxamer 188, onde a relação do peso de peptídeos de mannitol para poloxamer 188 está incluída no intervalo entre 1:5:1.5 e 1:8:2.2. A composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 3, de onde a relação dita do peso de peptídeos de mannitol para o poloxamer 188 está incluída no intervalo entre 1:0:2 e 1:0:2.2. A composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 1, contendo pelo menos dois peptídeos, onde os ditos peptídeos contêm uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo constituído por SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 10, ou SEQ ID NO: 12 a SEQ ID NO: 23, desde que a composição compreenda pelo menos um peptídeo compreendendo SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 12 ou SEQ ID NO: 13 ou -2- um sal de tal, e ainda incluindo mannitol e Tween® 80, de onde a relação do peso de peptídeos de mannitol para Tween® 80 está incluída no intervalo entre 1:2:1.5 e 1:8:2.2.
2. 6. A composição farmacêutica de acordo com as reivindicações 1 a 15, de onde os ditos peptídeos têm um comprimento total entre 9 e 16 aminoácidos.
3. 7. A composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 6, na qual no mínimo um peptídeo inclui ligações não-peptídicas.
4. 8. A composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 7, onde a dita composição possui peptídeos constituídos pelas sequências de aminoácidos estabelecidas em SEQ ID NO: 1 e/ou SEQ ID NO: 2 e outras incluem pelo menos um peptídeo constituído por sequência de aminoácidos estabelecida em qualquer um dos SEQ ID NO: 3 a SEQ ID NO: 10.
5. 9. A composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 8, onde a dita composição possui peptídeos constituídos pelas sequências de aminoácidos estabelecidas em SEQ ID NO: 12 e/ou SEQ ID NO: 13 e outras incluem pelo menos um peptídeo constituído por sequência de aminoácidos estabelecida em qualquer um dos SEQ ID NO: 14 a SEQ ID NO: 23.
6. 10. A composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 9, ainda contém um peptídeo constituído pela sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO: 11, desde que o dito peptídeo não seja o respectivo polipeptídio de comprimento total associados a tumor.
7. 11. A composição farmacêutica de acordo com uma das reivindicações entre 1 e 10, onde as quantidades de peptídeos contidas na composição sejam específicas do tecido, do câncer e/ou do paciente.
8. 12. A composição farmacêutica de acordo com uma das reivindicações entre 1 e 11, compreendendo ainda ao menos um adjuvante apropriado. -3 -
9. 13. O uso de composição farmacêutica de acordo com uma das reivindicações entre 1 e 12 como vacina anticâncer.
10. 14. Um kit contendo: (a) um recipiente que contém uma composição farmacêutica, de acordo com uma das reivindicações entre 1 e 13, em solução ou em forma liofilizada; (b) opcionalmente, um segundo recipiente contendo um diluente ou solução reconstituinte para a formulação liofilizada e/ou no mínimo um adjuvante; e (b) opcionalmente, instruções para o (i) uso da solução ou (ii) reconstituição e / ou a utilização da dita formulação liofilizada.
11. 15. Segundo a reivindicação 14, o kit ainda pode conter um ou mais tampões (i), um diluente (ii), um filtro (iii), uma agulha (iv), e uma seringa (v).