EA017492B1

EA017492B1 - Новые композиции опухолеассоциированных пептидов, связывающихся с молекулами человеческого лейкоцитарного антигена (hla) i или ii класса, для вакцин

Info

Publication number: EA017492B1
Application number: EA200900487A
Authority: EA
Inventors: Петер Левандровский; Кристиан Флор
Original assignee: Имматикс Байотекнолоджиз Гмбх
Priority date: 2008-04-24
Filing date: 2009-04-23
Publication date: 2012-12-28
Also published as: BRPI0900798A2; NZ576423A; DK2111867T3; CA2665510C; EP2113253A1; CA2665510A1; AU2009201589C1; PT2111867E; JP5717268B2; PL2113253T3; BRPI0900798A8; HRP20100354T1; CY1110178T1; JP2009292810A; HRP20110965T1; EP2111867A1; AU2009201589A1; AU2009201589B2; ATE526979T1; US20120107337A1

Abstract

Изобретение относится к новым композициям опухолеассоциированных пептидов, связывающихся с молекулами человеческого лейкоцитарного антигена (HLA) I или II класса, в качестве вакцин для применения в иммунотерапевтических способах. В частности, настоящее изобретение относится к композициям для иммунотерапии рака, в частности рака почек и головного мозга, в частности глиомы, предпочтительно глиобластомы. Настоящее изобретение относится, кроме того, к вакцинным композициям для индуцирования противоопухолевых иммунных ответов.

Description

(57) Изобретение относится к новым композициям опухолеассоциированных пептидов, связывающихся с молекулами человеческого лейкоцитарного антигена (НЬА) I или II класса, в качестве вакцин для применения в иммунотерапевтических способах. В частности, настоящее изобретение относится к композициям для иммунотерапии рака, в частности рака почек и головного мозга, в частности глиомы, предпочтительно глиобластомы. Настоящее изобретение относится, кроме того, к вакцинным композициям для индуцирования противоопухолевых иммунных ответов.

017492 Β1

Изобретение относится к новым композициям опухолеассоциированных пептидов, связывающихся с молекулами человеческого лейкоцитарного антигена (НЕЛ) I или II класса, в качестве вакцин для применения в иммунотерапевтических способах. В частности, настоящее изобретение относится к композициям для иммунотерапии рака, в частности рака почек. Настоящее изобретение относится, кроме того, к вакцинным композициям для индуцирования противоопухолевого иммунного ответа.

В соответствии с целями настоящего изобретения все цитированные источники включены в полном объеме путем ссылки.

Уровень техники

Композиция для инъекции, состоящая из пептидов в форме порошка и разбавителя, состоящего из гидрокарбоната натрия, раскрыта в патенте \¥0 2007/028573 для вакцинации против почечно-клеточной карциномы. Однако эта композиция имеет различные недостатки. Основным недостатком является слабая растворимость, сильно осложняющая ее введение во время любого применения, такого как при клиническом использовании.

В целях растворения порошка для получения композиции ампулу с подлежащими растворению пептидами и разбавитель следует тщательно встряхивать в течение трех минут, затем подвергнуть ультразвуковой гомогенизации в течение одной минуты и снова встряхивать в течение одной минуты. Данная процедура не может быть осуществлена всеми врачами в месте приема пациентов по причине частого отсутствия необходимого оборудования, так что полученная смесь может быть негомогенной, как это необходимо для эффективного применения.

Дополнительная проблема с композицией связана с тем фактом, что при заданной скорости растворения активных ингредиентов с применением гидрокарбоната натрия в заданных концентрациях полученный раствор может быть использован только в течение примерно 30 мин.

Дополнительно характеристики приведенной выше композиции со временем изменяются, что делает безопасное применение практически невозможным. После хранения описанной композиции в течение 12 месяцев при различных температурах в диапазоне от -20 до +25°С было невозможно получить прозрачный раствор даже после применения ультразвукового гомогенизатора в течение нескольких минут.

Таким образом, существует потребность в новых пептидных композициях с улучшенной растворимостью и улучшенными свойствами смачиваемости лиофилизата в целях обеспечения безопасности и эффективности препарата, в особенности в случае противораковой вакцины. Настоящее изобретение соответствует данному требованию.

Краткое изложение сущности изобретения

Изобретение в одном из своих предпочтительных аспектов обеспечивает фармацевтические композиции, включающие 2-18, предпочтительно менее 15, более предпочтительно менее 13, еще более предпочтительно от 2 до 12 пептидов и еще более предпочтительно от 3 до 12 опухолеассоциированных пептидов; причем каждый пептид имеет длину от 8 до 22 аминокислот, предпочтительно от 9 до 16 аминокислот; причем указанные пептиды проявляют растворимость в 90%-й уксусной кислоте, составляющую по меньшей мере 2,7 мг/мл, наряду с маннитолом и полоксамером 188, причем весовое соотношение указанного(ых) пептида(ов), маннитола и полоксамера 188 находится в пределах значений от 1:5:1,5 до 1:8:2,2, включительно; или маннитолом и Твин (Т\гссп) 80®, причем весовое соотношение пептидов, маннитола и Твин 80® находится в пределах значений от 1:2:1,5 до 1:8:2,2, включительно.

В другом предпочтительном аспекте настоящее изобретение обеспечивает фармацевтическую композицию по п.1 формулы изобретения, включающую по меньшей мере два пептида, причем указанные пептиды включают аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из 8ЕО ΙΌ N0: 1-10 или 8ЕО ΙΌ N0: 12-23; при условии, что композиция включает по меньшей мере один пептид, включающий последовательность 8Е0 ΙΌ N0: 1, 8Е0 ΙΌ N0: 2, 8Е0 ΙΌ N0: 12 или 8Е0 ΙΌ N0: 13 или их вариант или соль; и дополнительно включающую маннитол и полоксамер 188, причем весовое соотношение пептидов, маннитола и полоксамера 188 находится в пределах значений от 1:5:1,5 до 1:8:2,2, включительно.

В еще одном предпочтительном аспекте настоящее изобретение обеспечивает фармацевтическую композицию по п.1 формулы изобретения, включающую по меньшей мере два пептида, причем указанные пептиды включают аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из 8Е0 ΙΌ N0: 1-10 или 8Е0 ΙΌ N0: 12-23; при условии, что композиция включает по меньшей мере один пептид, включающий последовательность 8Е0 ΙΌ N0: 1, 8Е0 ΙΌ N0: 2, 8Е0 ΙΌ N0: 12 или 8Е0 ΙΌ N0: 13 или их вариант или соль; и дополнительно включающую маннитол и Твин (Т\гссп) 80®, причем весовое соотношение пептидов, маннитола и Твин 80® находится в пределах значений от 1:2:1,5 до 1:8:2,2, включительно.

Обладая преимуществами, композиция в соответствии с изобретением подходит для устойчивых препаратов, содержащих высокогидрофобные пептиды (например, ΙΜΑ-0ΗΙ-001; 8Е0 ΙΌ N0: 23). Этот конкретный пептид, например, практически не растворим в воде и лишь немного растворим в 90%-й уксусной кислоте (растворимость около 2,9 мг/мл). Неожиданным образом сейчас стало возможным приготовить смесь пептида в соответствии с 8Е0 ΙΌ N0: 23 с любым другим пептидом в другой композиции,

- 1 017492 которая может быть использована для введения живому существу.

Поэтому представленная патентная заявка раскрывает композицию смеси из 2-18 пептидов, предпочтительно менее 15, более предпочтительно менее 13, еще более предпочтительно 2-12 пептидов и еще более предпочтительно 3-12 пептидов, при длине пептидов 8-22 аминокислоты, предпочтительно 9-16 аминокислот, при условии, что пептиды обладают растворимостью по меньшей мере в 90%-й уксусной кислоте, составляющей 2,7 мг/мл, предпочтительно 2,9 мг/мл, дополнительно включающую маннитол и полоксамер 188, причем весовое соотношение пептидов, маннитола и полоксамера 188 находится в пределах от 1:5:1,5 до 1:8:2,2, включительно.

В предпочтительном воплощении фармацевтической композиции в соответствии с настоящим изобретением весовое соотношение пептидов, маннитола и полоксамера 188 находится в пределах от 1:0:2 до 1:0:2,2, включительно.

Другое предпочтительное воплощение настоящего изобретения обеспечивает фармацевтическую композицию, как показано выше, включающую по меньшей мере два пептида, причем указанные пептиды включают аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из 8ЕО ГО N0: 12-23; при условии, что композиция включает по меньшей мере один пептид, включающий 8Е0 ГО N0: 12 или 8Е0 ГО N0: 13 или их вариант; и дополнительно включающую маннитол и Твин (Тетееп) 80®, причем предпочтительное весовое соотношение пептидов, маннитола и Твин 80® находится в пределах значений от 1:5:0,5 до 1:5:2, включительно.

Предпочтительно пептиды настоящего изобретения обладают общей длиной 9-16 аминокислот. Пептиды могут содержать непептидные связи.

В других предпочтительных воплощениях фармацевтические композиции включают пептиды, состоящие из аминокислотных последовательностей, представленных в 8Е0 ГО N0: 1 и/или 8Е0 ГО N0: 2, и дополнительно включают по меньшей мере один пептид, состоящий из аминокислотной последовательности, представленной в любой из 8Е0 ГО N0: 3-10.

В определенных предпочтительных воплощениях фармацевтическая композиция может дополнительно включать пептид, включающий аминокислотную последовательность, представленную в 8Е0 ГО N0: 11 при условии, что указанный пептид не является соответствующим опухолеассоциированным полипептидом полной длины. В других воплощениях фармацевтическая композиция может дополнительно содержать пептид, который состоит из аминокислотной последовательности, представленной в 8Е0 ГО N0: 11.

В других предпочтительных воплощениях фармацевтические композиции включают пептиды, состоящие из аминокислотных последовательностей, представленных в 8Е0 ГО N0: 12 и/или 8Е0 ГО N0: 13, и дополнительно включают по меньшей мере один пептид, состоящий из аминокислотной последовательности, представленной в любой из 8Е0 ГО N0: 14-23. В некоторых предпочтительных воплощениях данная фармацевтическая композиция может дополнительно включать пептид, включающий аминокислотную последовательность, представленную в 8Е0 ГО N0: 11 при условии, что указанный пептид не является соответствующим опухолеассоциированным полипептидом полной длины. В других воплощениях фармацевтическая композиция может дополнительно содержать пептид, который состоит из аминокислотной последовательности, представленной в 8Е0 ГО N0: 11.

В некоторых воплощениях пептиды, присутствующие в композиции, выбраны из пептидов, специфических для ткани, рака и/или пациента.

В дальнейших предпочтительных воплощениях фармацевтическая композиция может дополнительно содержать по меньшей мере один подходящий адъювант. Адъюванты - это вещества, которые неспецифически усиливают или потенцируют иммунный ответ (например, иммунные ответы, опосредованные ЦТЛ или хелперными Т-клетками (Т_н) на антиген), и могут, таким образом, рассматриваться как полезные в лекарственных средствах настоящего изобретения. Подходящие адъюванты включают, но не ограничиваются такими, как 1018 Ι88, соли алюминия, Атрйуах, А815, ВСС, СР-870,893, СрС7909, СуаА, άδΚΜ, флагеллин или лиганды ТЬК.5, полученные из флагеллина, лиганд ЕЬТ3, ГМ-КСФ, ГО₃₀, КУ, Имиквимод (АЕЭАКА), резимиквимод, ΙιηιιΕαοΙ ΙΜΡ321, интерлейкины, такие как ГО-2, ΙΗ-13, ГО-21, интерферон-альфа или -бета или их пегилированные производные, Ι8 Ра!ей, Ι88, ΚС0ΜАТΚ.IX, ΙδΕΌΜ^ 1иу1ттипе, ЫроУае, МАЬР2, ΜΕ59, монофосфорил липид А, Монтанид ΙΜδ 13Ь2, Монтанид КА 206, Монтанид КА 50У, Монтанид КА-51, эмульсии вода-в-масле и масло-в-воде, 0К-432, ОМ-174, ОМ-197МР-ЕС, 0NТАК, 0крА, векторная система РерТе1®, микрочастицы РЬС и декстрана, резиквимод, 8КЬ172, вирусомы и другие вирусоподобные частицы, ΎΕ-17Ό, УЕСЕ !гар, К.848, бета-глюкан, Рат3Сук, стимулон Ас.|ш1а 0821. который получают из сапонина, микобактериальные экстракты и синтетические имитации бактериальных клеточных стенок и другие запатентованные адъюванты, такие как КтЫ'к Эе!ох, Οιιίΐ или 8ирегГок. Предпочтительными адъювантами являются такие, как адъювант Фрейнда или ГМКСФ. Несколько иммунологических адъювантов (например, ΜΕ59), специфических для дендритных клеток и их приготовление были описаны ранее (Эиршк Μ. е! а1. 1998; АШкоп, 1998). Также могут использоваться цитокины. Несколько цитокинов были присоединены напрямую для оказания влияния на миграцию дендритных клеток к лимфоидным тканям (например, Т№Е-а), ускоряя созревание дендритных кле

- 2 017492 ток до эффективных клеток, презентирующих антиген Т-лимфоцитам (например, ГМ-КСФ, 1Ь-1 и 1Ь-4) (патент США № 5849589, включенный сюда путем ссылки) и действующих как иммуноадъюванты (например, Ш-12, Ш-15, Ш-23, Ш-7, ΙΡΝ-α, ΙΡΝ-β) (ОаЬгПоуюй е! а1. 1996).

Об иммуностимулирующих олигонуклеотидах СрО также сообщалось, что они усиливают эффекты адъювантов в составе вакцин. Теоретически не связанные, СрО-олигонуклеотиды при активации врожденной (неадаптивной) иммунной системы действуют с помощью То11-подобных рецепторов (ТЬК), в основном ТЬК.9. Вызванная СрО активация ТЬК.9 усиливает антигенспецифические гуморальные и клеточные ответы на широкий спектр антигенов, включая пептидные или белковые антигены, живые или убитые вирусы, вакцины из дендритных клеток, аутологичные клеточные вакцины и полисахаридные конъюгаты как в профилактических, так и терапевтических вакцинах. Более важно то, что улучшается созревание и дифференциация дендритных клеток, приводя к улучшенной активации Т_Н1-клеток и интенсивной генерации цитотоксических Т-лимфоцитов (ЦТЛ) даже при отсутствии помощи СЬ4 Тклеток. Ответ в направлении Т_Н1, вызванный стимуляцией ТЬК.9, сохраняется даже в присутствии вакцинных адъювантов, таких как квасцы или неполный адъювант Фрейнда (ΙΡΑ), который обычно способствует ответу в направлении Т_Н2. СрО-олигонуклеотиды проявляют даже большую адъювантную активность, если они входят в составы или вводятся вместе с другими адъювантами или в таких составах, как микрочастицы, наночастицы, липидные эмульсии или составах, которые в особенности необходимы для индукции сильного ответа, если антиген относительно слаб. Они также ускоряют иммунную реакцию и позволяют снизить дозы антигена на приблизительно два порядка величины с ответами антитела, сравнимыми с полной дозой вакцины без СрО в некоторых экспериментах (Кпед е! а1. 2006). В патенте США № 6406705 В1 описывается комбинированное применение СрО-олигонуклеотидов, адъювантов, не включающих нуклеиновые кислоты, и антигена для вызывания антигенспецифического иммунного ответа. Антагонистом СрО ТЬК.9 является 68ЫМ (контурный иммуномодулятор двойного действия) компании Мо1одеп (Берлин, Германия), который является предпочтительным компонентом фармацевтической композиции настоящего изобретения. Также могут быть использованы другие молекулы, связывающиеся с ТЬК, такие как РНК, связывающаяся с ТЬК 7, ТЬК 8 и/или ТЬК 9.

Другие примеры полезных адъювантов включают, но не ограничиваются химически модифицированными СрО (например, СрК, Иега), аналогами бкРНК, такими как Ро1у(1:С) и АтрйОеп, не-СрО бактериальной ДНК или РНК, а также иммуноактивными малыми молекулами и антителами, такими как циклофосфамид, сунитиниб, бевацизумаб, целебрекс, Νί’Χ-4016. силденафил, тадалафил, варденафил, сорафениб, темозоломид, темсиролимус, ХЬ-999, СР-547632, пазопаниб, УБОР Тгар, ΖΌ2171, ΑΖΌ2171, анти-СТЬА4 и 8С58175, которые могут действовать терапевтически и/или как адъювант. Количества и концентрации адъювантов и вспомогательных веществ, полезных в контексте настоящего изобретения, могут быть легко определены опытным специалистом без проведения излишних экспериментов. Предпочтительными адъювантами являются 68Ь1М, интерферон-альфа, -бета, СрО7909, 1С₃₁ имиквимод, резиквимод, Реу1Тег, РНК, тадалафил, темозоломид и 1иуттипе.

Предпочтительными адъювантами являются 68Ь1М, БЦЖ, ОК432, имиквимод, резиквимод, ГМКСФ, интерферон-альфа, Реу1Тег и 1иу1ттипе или их комбинации.

В предпочтительном воплощении фармацевтической композиции в соответствии с изобретением адъювант выбран из группы, состоящей из колониестимулирующих факторов, таких как гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (ГМ-КСФ, сарграмостим), имиквимод, резиквимод и интерферон-альфа.

В предпочтительном воплощении фармацевтической композиции в соответствии с изобретением адъювант выбран из группы, состоящей из колониестимулирующих факторов, таких как гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (ГМ-КСФ, сарграмостим), имиквимод и резиквимод.

В предпочтительном воплощении фармацевтической композиции в соответствии с изобретением адъювантом является имиквимод или резиквимод.

Эта композиция может быть применена для парентерального введения, такого как подкожное, внутрикожное, внутримышечное или оральное введение. Пептиды могут быть также введены вместе с иммуностимулирующими веществами, такими как цитокины.

Фармацевтические композиции по изобретению могут быть применены в качестве противораковой вакцины.

Настоящее изобретение охватывает также набор, включающий по меньшей мере один из приведенных выше пептидов и/или приведенную выше фармацевтическую композицию, либо приготовленные ранее, либо в отдельных емкостях или ампулах для смешивания на месте.

Предпочтительно набор включает (а) контейнер, содержащий фармацевтическую композицию в соответствии с изобретением, в виде раствора или в лиофилизованной форме; (Ь) необязательно - второй контейнер, содержащий разбавитель или восстанавливающий раствор для указанной лиофилизованной композиции и/или по меньшей мере один адъювант; и (с) необязательно - инструкции по (ί) использованию раствора или (ίί) восстановителя, и/или по использованию указанной лиофилизованной композиции.

Также предпочтителен набор в соответствии с изобретением, дополнительно включающий один

- 3 017492 или более (ί) буфер, (ίί) разбавитель, (ίίί) фильтр, (ίν) иглу и (ν) шприц.

Краткое описание фигур

Фиг. 1 - аналитическая хроматограмма ВЭЖХ пептидов (8ЕЦ ГО N0: 1-11), содержащих бетанафтилаланин (ΝΑΕ) в качестве внутреннего стандарта;

фиг. 2 - стабильность композиции 1 (контроль) без эксципиентов при +25°С;

фиг. 3 - стабильность композиции 2 в соответствии с изобретением с маннитолом и Лутролом (Ьи1то1) Е68® (полоксамер/Ро1охатег 188)® при +25°С;

фиг. 4 - стабильность композиции 3 в соответствии с изобретением с маннитолом и Твин (Тетееп) 80® при +25°С;

фиг. 5 - стабильность композиции 4 в соответствии с изобретением с маннитолом и Твин (Тетееи) 80® при +25°С;

фиг. 6 - стабильность композиции 1 (контроль) без эксципиентов при +40°С;

фиг. 7 - стабильность композиции 2 в соответствии с изобретением с маннитолом и Лутролом (Ьи1го1) Е68® (Полоксамер/Ро1охатег 188)® при +40°С;

фиг. 8 - стабильность композиции 3 в соответствии с изобретением с маннитолом и Твин (Тетееи) 80® при +40°С;

фиг. 9 - стабильность композиции 4 в соответствии с изобретением с маннитолом и Твин (Тетееи) 80® при +40°С;

фиг. 10 - эффекты от эксципиентов полоксамера (Ро1охатег) 188 (Лутрол/Ьи1го1 Е68® ассортимент компании ΒΑ8Ε ЬибМдЛаГеп Германия) и маннитола на прайминге СГО8+ Т-клеток ίη νί\Ό. Мышей умерщвляли по истечении 9 дней после иммунизации, собирали клетки селезенки, окрашенные тетрамером, и анализировали поточной цитометрией. Процентная доля тетрамер-позитивных клеток среди всех СГО8+ Т-клеток показана планками погрешностей, отображающими стандартное отклонение средней величины. Все три иммунизированные пептидом группы, по данным двустороннего анализа с применением непарного ΐ-критерия Стьюдента (р<0,05), существенно отличаются от негативных контролей. Группы с и без полоксамера/Ро1охатег® 188 (Лутрола/Еи1то1 Е68®)/маннитола не имеют существенных различий (р=0,49);

фиг. 11 - процесс получения, описанный в примере 2;

фиг. 12 - аналитическая хроматограмма ВЭЖХ пептидов (8ЕЦ ГО N0: 11-23), содержащих бетанафтилаланин (ΝΑΕ) в качестве внутреннего стандарта;

фиг. 13 - стабильность пептидов 8ЕЦ ГО N0: 11-23 при использовании с маннитолом/Лутролом Е68®;

фиг. 14 - стабильность пептидов 8ЕЦ ГО N0: 11-23 без эксципиентов;

фиг. 15 - стабильность пептидов 8ЕЦ ГО N0: 11-22 с маннитолом/Лутролом Е68® при +25°С;

фиг. 16 - стабильность пептидов 8ЕЦ ГО N0: 11-22 с маннитолом/Лутролом Е68® при +5°С;

фиг. 17 - стабильность пептидов 8ЕЦ ГО N0: 11-22 с маннитолом/Лутролом Е68® при -20°С;

фиг. 18 - данные по стабильности за 24 месяца при -20°С для композиции по примеру 2;

фиг. 19 - данные по стабильности за 24 месяца при +5°С для композиции по примеру 2;

фиг. 20 - данные по стабильности за 24 месяца при +25°С для композиции по примеру 2.

В списке последовательностей представлены пептиды (8ЕЦ ГО N0: 1-23), которые использованы в композициях в соответствии с настоящим изобретением.

Детальное описание изобретения

Настоящее изобретение обеспечивает фармацевтическую композицию, полезную в качестве вакцины, причем указанная фармацевтическая композиция включает различные опухолеассоциированные пептиды (ТиМАР) и дополнительно либо смеси маннитола и Твин 80®, либо смеси маннитола и полоксамера 188, смеси которых обеспечивают стабильность и растворимость для указанной композиции.

Фармацевтические композиции, используемые здесь, предпочтительно являются лиофилизованным составом, включающим пептиды, маннитол и Твин 80® или же пептиды, маннитол и полоксамер 188, или предпочтительно являются восстановленной жидкой композицией. Как таковой, используемый здесь термин фармацевтические композиции может относиться к лиофилизованному составу для указания на то, что композиция представлена в лиофилизованной форме.

Предпочтительно, чтобы пептиды в фармацевтических композициях включали по меньшей мере один из пептидов, представленных в 8ЕЦ ГО N0: 1-10, которые находятся и были идентифицированы на первичных клетках рака почки, или по меньшей мере один из пептидов, представленных в 8ЕЦ ГО N0: 11-22 и 11-23, которые находятся и были идентифицированы в первичных раковых клетках глиомы.

В других предпочтительных воплощениях фармацевтические композиции включают пептиды, состоящие из аминокислотных последовательностей, представленных в 8ЕЦ ГО N0: 12 и/или 8ЕЦ ГО N0: 13, и дополнительно включают по меньшей мере один пептид, состоящий из аминокислотной последовательности, представленной в любой из 8ЕЦ ГО N0: 14-23.

Данные композиции пептидов включают пептиды НЬА класса I и II. Предпочтительно, чтобы фар

- 4 017492 мацевтическая композиция настоящего изобретения включала пептид, представленный в 8ЕЭ ΙΌ N0: 1 и/или 8ЕЦ ΙΌ N0: 2, и/или по меньшей мере один иной пептид, включающий 8ЕЦ ΙΌ N0: 3-10 или пептид, представленный в 8ЕЭ ΙΌ N0: 12 и/или 8ЕЦ ΙΌ N0: 13, и/или по меньшей мере один иной пептид, включающий 8ЕЭ ΙΌ N0: 11 и 14-23.

Фармацевтические композиции включают пептиды как в свободной форме, так и в форме фармацевтически приемлемой соли.

Используемое здесь понятие фармацевтически приемлемая соль относится к производным раскрытых пептидов, причем пептид модифицирован путем получения кислотных или щелочных солей агента. Например, кислотные соли получают из свободного основания (обычно, где нейтральная форма лекарственного средства имеет нейтральную группу -ИН₂) с применением реакции с подходящей кислотой. Подходящие кислоты для получения кислотных солей включают как органические кислоты, например, уксусную кислоту, пропионовую кислоту, гликолевую кислоту, пировиноградную кислоту, щавелевую кислоту, оксиянтарную кислоту, малоновую кислоту, янтарную кислоту, малеиновую кислоту, фумаровую кислоту, винную кислоту, лимонную кислоту, бензойную кислоту, коричную кислоту, миндальную кислоту, метансульфоновую кислоту, этансульфоновую кислоту, паратолуолсульфокислоту, салициловую кислоту и подобные, так и неорганические кислоты, например, хлористо-водородную кислоту, бромисто-водородную кислоту, серную кислоту, азотную кислоту, фосфорную кислоту и подобные. И наоборот, приготовление щелочных солей кислотных составляющих, которые могут присутствовать на пептиде, получают при использовании фармацевтически приемлемого основания, такого как гидроксид натрия, гидроксид калия, гидроксид аммония, гидроксид кальция, триметиламин или подобные.

В одном особенно предпочтительном воплощении фармацевтические композиции включают пептиды в виде солей уксусной кислоты (ацетаты) или хлористо-водородной кислоты (хлориды).

В еще более предпочтительном воплощении фармацевтические композиции в соответствии с изобретением включают 8ЕЭ ΙΌ N0: 5 в виде хлорида и все остальные пептиды в виде ацетатов.

Фармацевтические композиции настоящего изобретения могут также содержать по меньшей мере один пептид, служащий в качестве пептида положительного контроля, иммунного маркера для проверки эффективности внутрикожного введения. Один такой отдельный пептид получен из корового антигена НВУ (8ЕО ΙΌ N0: 11).

В одном конкретном воплощении фармацевтическая композиция включает 11 различных пептидов, каждый из которых состоит из аминокислотных последовательностей, представленных в 8Е0 ΙΌ N0: 111 (см. табл. 1). Предпочтительно, чтобы каждый пептид в фармацевтической композиции присутствовал с количеством, составляющим от около 1500 мкг до около 75 мкг, предпочтительно от около 1000 мкг до около 750 мкг и более предпочтительно от около 500 мкг до около 600 мкг и наиболее предпочтительно около 578 мкг. Предпочтительно, чтобы каждый пептид был очищен ВЭЖХ и ионообменной хроматографией и имел вид от белого до серовато-белого порошка.

В другом конкретном воплощении фармацевтическая композиция включает 12 различных пептидов, каждый из которых состоит из аминокислотных последовательностей, представленных в 8Е0 ΙΌ N0: 11-22, и последовательностей, представленных в 8Е0 ΙΌ N0: 11-23 (см. табл. 1). Предпочтительно, чтобы каждый пептид в фармацевтической композиции присутствовал в количестве, составляющем от около 1500 мкг до около 75 мкг, предпочтительно от около 1000 мкг до около 750 мкг и более предпочтительно от около 500 мкг до около 600 мкг и наиболее предпочтительно около 578 мкг. Предпочтительно, чтобы каждый пептид был очищен ВЭЖХ и ионообменной хроматографией и имел вид от белого до серовато-белого порошка.

Таблица 1. Предпочтительные пептиды в фармацевтических композициях настоящего изобретения

Внутреннее обозначение последовательности	Антиген	Последовательность	№ последовательности
ΙΜΑ-ΜΜΡ-001	Матричная металлопротеиназа 7	δΟϋΟΙΚΘίαΚΙ-ΥΘΚΡδ	1
ΙΜΑ-ΑϋΕ-002	Адипофилин	νΜΑΟΟΙΥδν	2
ΙΜΑ-ΑϋΕ-001	Адипофилин	δνΑδτιτον	3
ΙΜΑ-ΑΡΟ-001	Аполипопротеин 11	А1_А00У0КУ	4
1МА-ССЫ-001	Циклин 01	ИСАТСМРУ	5
1МА-еис-оо1	еисУ1дз	δνΕΑΟννον	6
ΙΜΑ-Κ67-001	ΚΙΑΑ0367	ΑΙ_ΡΟΟΟΡΗΙ_	7
ΙΜΑ-ΜΕΤ-001	с-те1 протоонкоген	γνορνιτδΐ	8
1МА-мис-оо1	мис1	δΤΑΡΡνΗΝν	9
ΙΜΑ-ΡΘδ-001	РОЗ-5	Ι_ΑΑΙ_ΡΗδΟΙ_	10
1МА-НВУ-001	НВУ	ηΡδΟΕΡΡδν	11
1МА-ВСА-002	Вгеу\|сап (ΝΡ_068767, 478-486)	ΑΙ_ν\/ΑννΡδΙΞΙ.	12
ΙΜΑ-ΒΙΡ-002	Бакуловирусный ингибитор апоптозных белков (1АР), содержащий повтор 5 (ΝΡ_001159, 97-111)	ТЮЕПКЮКЕКАКЫ	13

- 5 017492

1МА-С5Р-001	Хондроитин сульфат протеогликан 4 (ΝΡ.001888, 21-29)	ΤΜΙΑΚΙ-ΑδΑ	14
ΙΜΑ-ΡΑΒΡ7-001	Белок, связывающий жирную кислоту 7, мозг (ΝΡ.001437, 118-126)	ΙΤΡΟϋννΑν	15
1МА-1СГ2ВРЗ-001	Инсулиноподобный фактор роста 2, мРНКсвязывающий белок 3 (ΝΡ_006538, 552-560)	ΚΙΟΕΚΤΟν	16
ΙΜΑ-ΜΕΤ-005	Ме1 протоонкоген (ΝΡ_000236, 651-667)	ΤΕδΥνϋΡνίΤδΙδΡΚΥΘ	17
ΙΜΑ-ΝΙ.ΘΝ4Χ-001	Нейролигин 4, Х-связь (ΝΡ_065793, 131-139)	ΝίΟΤίΜΤΥν	18
ΙΜΑ-ΝΡΟΑΜ-001	Нейрональная молекула клеточной адгезии (ΝΡ_001032209, 692- 700)	ΟίννΗΗΟΤΕν	19
ΙΜΑ-ΡΤΡ-003	Белковая тирозинфосфатаза, рецепторный тип, Ζ полипептид 1 (ΝΡ__002842, 195-203)	ΑΙΌΟνΕδν	20
ΙΜΑ-ΡΤΡ-005	Белковая тирозинфосфатаза, рецепторный тип, Ζ полипептид 1 (ΝΡ_002842, 1347- 1355)	ΚνΡΑΘΙΡΤν	21
ΙΜΑ-ΤΝΟ-001	Тенасцин С (ΝΡ_002151, 3-11)	АМТОИ-ΑΘν	22
1МА-СН1-001		δίΑΛ/ΑΟνννί.	23

Термин пептид используется здесь для обозначения серий аминокислотных остатков, связанных друг с другом обычно пептидными связями между α-аминными и карбонильными группами смежных аминокислот. Пептиды обычно обладают длиной в 9 аминокислот в случае МНС класса I и бывают длиннее (15 или 16 аминокислот) в случае МНС класса II, но могут быть и короче, имея 8 аминокислот в длину, и длиннее, имея 16 аминокислот в длину.

Термин олигопептид используется здесь для обозначения серий аминокислотных остатков, связанных один с другим обычно пептидными связями между альфа-аминными и карбонильными группами смежных аминокислот. Длина олигопептида не особенно важна для изобретения до тех пор, пока в нем сохраняются надлежащие эпитоп или эпитопы. Олигопептиды обычно бывают длиной в менее чем около 30 аминокислотных остатков и более чем около 14 аминокислот в длину.

Термин полипептид обозначает серии аминокислотных остатков, связанных один с другим обычными пептидными связями между альфа-аминными и карбонильными группами смежных аминокислот. Длина полипептида не особенно важна для изобретения до тех пор, пока сохраняются надлежащие эпитопы. В отличие от терминов пептид или олигопептид, термин полипептид введен для обозначения белковых молекул, имеющих в длину более приблизительно 30 остатков.

Пептид, олигопептид, белок или полинуклеотид, кодирующий для такой молекулы, является иммуногенным (и, таким образом, иммуногеном в рамках настоящего изобретения), если он способен индуцировать иммунный ответ. В случае настоящего изобретения иммуногенность получает более специфическое определение как способность индуцировать опосредованную ЦТЛ реакцию. Таким образом, иммуноген должен представлять собой молекулу, которая способна индуцировать иммунный ответ, и, в случае настоящего изобретения, молекулу, способную индуцировать реакцию ЦТЛ.

Т-клеточный эпитоп - это короткая пептидная молекула, которая связывается с молекулой МНС I или II класса и которая впоследствии распознается Т-клеткой. Т-клеточные эпитопы, которые связываются с молекулами МНС I класса, обычно имеют длину в 8-14 аминокислот и предпочтительно обычно длину в 9 аминокислот. Т-клеточные эпитопы, которые связываются с молекулами МНС II класса, обычно имеют длину в 12-30 аминокислот. В случае эпитопов, которые связываются с молекулами МНС II класса, одинаковые Т-клеточные эпитопы могут иметь общий центральный сегмент, но различаться по длине карбокси- и аминоконцевых примыкающих последовательностей вследствие того факта, что концы пептидной молекулы не углублены в структуру пептидсвязывающей бороздки молекулы МНС II класса, как то имеет место быть с пептидсвязывающей бороздкой молекулы МНС I класса.

Существуют три различных генетических локуса, которые кодируют для молекул МНС I класса: НБА-А, НБА-Б и НБА-С. НБА-А1, НБА-А2 и НБА-А11 являются примерами различных молекул МНС I класса, которые могут экспрессироваться из этих локусов.

Используемые здесь термины участок, сегмент и фрагмент, если они использованы по отношению к полипептидам, относятся к непрерывной последовательности остатков, таких как аминокислотные остатки, последовательность которых формирует подкласс более крупной последовательности. На

- 6 017492 пример, если полипептид был подвергнут обработке любой из известных эндопептидаз, таких как трипсин или химотрипсин, то полученные в результате такой обработки олигопептиды будут представлять участки, сегменты или фрагменты исходного полипептида. Это означает, что любой такой фрагмент будет обязательно содержать как часть его аминокислотной последовательности сегмент, фрагмент или участок, который в значительной степени идентичен, если не в точности идентичен, последовательности 8ЕЦ Ш N0: 1-23, которая соответствует встречающимся в природе или материнским белкам последовательностей 8ЕЦ Ш N0: 1-23. При использовании по отношению к полинуклеотидам, такие термины относятся к продуктам, полученным при обработке указанных полинуклеотидов любой из известных эндонуклеаз.

В соответствии с настоящим изобретением термин процентная доля идентичности или идентичный с процентной долей, если он относится к последовательности, означает, что последовательность сравнивается с заявленной или описанной последовательностью после противопоставления сравниваемой последовательности (Сравниваемая последовательность) с описанной или заявленной последовательностью (Контрольная последовательность). Процентная доля идентичности определяется затем по следующей формуле:

Процентная доля идентичности = 100 [1-(С/К)], где С является числом различий между контрольной последовательностью и сравниваемой последовательностью по длине противопоставления между контрольной последовательностью и сравниваемой последовательностью, где (ί) каждое основание или аминокислота в контрольной последовательности, которые не имеют соответствующее противопоставленное основание или аминокислоту в сравниваемой последовательности; и (й) каждая брешь в контрольной последовательности; и (ш) каждое противопоставленное основание или аминокислота в контрольной последовательности, которые отличаются от противопоставленного основания или аминокислоты в сравниваемой последовательности, представляют собой различие;

и К. - это число оснований или аминокислот в контрольной последовательности по длине противопоставления сравниваемой последовательности с любым пропуском, образующимся в контрольной последовательности, считая также за основание или аминокислоту.

Если существует противопоставление между сравниваемой последовательностью и контрольной последовательностью, для которых процентная доля идентичности по расчетам выше имеет значение приблизительного равенства или более чем установленной минимальной процентной доли идентичности, тогда сравниваемая последовательность имеет установленную минимальную процентную долю идентичности с контрольной последовательностью, если даже могут существовать противопоставления, в которых подсчитанная здесь выше процентная доля идентичности меньше, чем установленная процентная доля идентичности.

Пептиды в фармацевтических композициях настоящего изобретения могут быть модифицированы путем замещения одного или нескольких остатков в различных, по возможности отобранных, местах по длине пептидной цепи. Такие замещения могут носить консервативный характер, например, где одна аминокислота заменяется аминокислотой с одинаковой структурой и характеристиками, такими как при замене гидрофобной аминокислоты на другую гидрофобную аминокислоту. Еще более консервативным будет замещение аминокислот одинакового или похожего размера и химического характера, такое как при замене лейцина на изолейцин. В исследованиях вариаций последовательностей внутри семейств встречающихся в природе гомологичных белков определенные замещения аминокислот переносятся гораздо чаще, чем другие, и они часто проявляют взаимосвязь в сходствах по размеру, заряду, полярности и гидрофобности между исходной аминокислотой и ее заменой; и таковой является основа определения консервативных замещений.

Консервативные замещения определены здесь как обмены внутри одной из пяти последующих групп: группа 1 - малые, алифатические, неполярные или слабо полярные остатки (А1а, 8ег, Тйг, Рго, С1у); группа 2 - полярные, отрицательно заряженные остатки и их амиды (Акр, Аки, С1ц, С1и); группа 3 полярные, положительно заряженные остатки (Ηίκ, Агд, Ьук); группа 4 - крупные, алифатические, неполярные остатки (МеЕ Ьеи, 11е, Уа1, Сук) и группа 5 - крупные, ароматические остатки (Рйе, Туг, Тгр).

Менее консервативные замещения могут охватывать замещение одной аминокислоты другой, имеющей похожие характеристики, но отличающейся в какой-то степени по размеру молекулы, как в случае замещения аланина остатком изолейцина. Высоко неконсервативные замещения могут охватывать замещение кислой аминокислоты другой, которая имеет полярность, или даже такой, которая имеет щелочной характер. Такие радикальные замещения не могут, однако, быть отвергнуты как потенциально неэффективные из-за того, что химические эффекты не полностью предсказуемы, и радикальные замещения могут привести к увеличению случайных эффектов, в противном случае не предсказуемых, исходя из обычных химических принципов.

Разумеется, в таких замещениях могут участвовать другие структуры, отличающиеся от обычных Ь-аминокислот. Таким образом, Ό-аминокислоты могут быть замещены Ь-аминокислотами, обычно встречающимися в антигенных пептидах по изобретению и также охватываемыми настоящим раскрыти

- 7 017492 ем сущности изобретения. Кроме того, аминокислоты, содержащие нестандартные К-группы (т.е. Кгруппы, отличающиеся от обнаруженных в распространенных 20 аминокислотах природных белков), могут быть также использованы в целях замещения для получения иммуногена и иммуногенных полипептидов в соответствии с настоящим изобретением.

Если были произведены замещения на более чем одной позиции для получения пептида с практически эквивалентной или большей антигенной активностью, чем та, что определена ниже, то комбинации таких замещений будут проанализированы для определения того, приведут ли эти комбинации замещений к дополнительным или синергетическим эффектам по отношению к антигенности пептида. По большей части не более четырех позиций внутри пептида должны замещаться одновременно.

Предпочтительно, если ЦТЛ, специфичные для пептида с 8ЕО Ш N0: 1-23, протестированы на замещенные пептиды; концентрация пептида, при которой замещенные пептиды достигают половины максимального роста лизиса относительно фона, составляет не более чем около 1 мМ, предпочтительно не более чем около 1 мкМ, более предпочтительно не более чем около 1 нМ, и еще более предпочтительно не более чем около 100 пМ, и наиболее предпочтительно не более чем около 10 пМ. Также предпочтительно, чтобы замещенный пептид распознавался ЦТЛ более чем одного индивида, по меньшей мере двух и более предпочтительно трех индивидов.

Муцин-1 (МиС1) является высокогликолизированным трансмембранным гликопротеином I типа, который с избытком гиперэкспрессирован на клеточной поверхности многих аденокарцином человека, таких как рак груди и яичников. Аберрантная дегликозиляция свойственна злокачественным опухолям и обнаруживает эпитопы в опухолевых клетках, которые не должны быть представлены на нормальных клетках. Более того, экспрессия МиС1 была продемонстрирована во множественной миеломе и некоторых В-клеточных лимфомах не-Ходжкина. Некоторые последние сообщения (Αροδίοίοροιιΐοδ V. апб МсКсп/1с Ι.Ρ. Се11и1аг тисшк: 1агдс(8 ίοτ ^ттиηοΐке^аρу. Сгк. Кеу. Iттиηο1. 14: 293-309 (1994); Ρίπη 0.1., 1еготе К.К., Неηбе^кοη К.А., Рескег 6., ^οтеηеск Ν., Мадапап-В1апбег 1., апб Ва^^аΐΐ-Вοуек 8.М. МНС-1 срб11е11а1 ίитο^ тисш-Ьакеб 1ттипйу апб сапсег уассшех Iттиηο1. Кеу. 145: 61-89 (1995); Вагпб 1989; Такакакк1 1994; Νοΐο 1997) показывают, что цитотоксические нерестриктированные по МНС Т-клетки из опухолей яичника, груди, поджелудочной железы и множественной миеломы могут распознавать эпитопы центральной части белка МИС1, находящейся в тандемном повторе. Были идентифицированы два рестриктированных по НБА-А2 Т-клеточных эпитопа, образованных из белка МНС1 (Вгоккай 1999, ЕР 1484397). Один пептид образован из участка тандемного повтора белка МИС1. Второй пептид локализован внутри сигнальной последовательности МИС1. Индукция ответов цитотоксических Т-лимфоцитов ίη νίνο после вакцинаций пациентов с распространенным раком груди или яичника дендритными клетками с введенным импульсным способом пептидом, используя такие пептиды, была успешной (ВгоккаП 2000) (^1етеску, 2005). С учетом почечно-клеточной карциномы экспрессия МИС1 свойственна стандартным опухолям, и сообщалось, что она ассоциирована со степенью и стадией опухоли. Для МИС1 белковая гиперэкспрессия не соотносится с гиперэкспрессией мРНК.

Адипофилин является маркером для специализированных дифференцированных клеток, содержащих липидные капельки, и для заболеваний, ассоциированных с жироаккумулирующими клетками (Не1б, 1998). Адипофилин содержится во многих культивируемых клеточных линиях, включающих фибробласты и эндотелиальные и эпителиальные клетки. Тем не менее, экспрессия адипофилина в тканях рестриктирована по определенным видам клеток, таким как вырабатывающие молоко эпителиальные клетки молочной железы, клетки коркового вещества надпочечника, клетки Сертоли и Лейдига мужской половой системы, а также по стеатозу или жировому перерождению гепатоцитов при алкогольном циррозе печени (Не1б, 1998). Сообщалось, что адипофилин гиперэкспрессирован при колоректальном раке (8апа 2001), гепатоклеточной карциноме (ΚυΓοΕη^η 2004) и при почечно-клеточной карциноме (Υοιπίβ 2001).

с-Ме1 кодирует гетеродимерный трансмембранный рецептор с тирозинкиназной активностью, который состоит из α-цепи, связанной дисульфидной связью с β-субъединицей (ΒοΙΙηΐΌ 1991; КиЬш 1993). Обе субъединицы экспрессированы на поверхности, тяжелая β-субъединица отвечает за связывание лигандов, фактор роста гепатоцитов (НОР), α-субъединица содержит внутриклеточный домен, который способствует активации различных сигнальных путей трансдукции. Каскады реакций с с-Ме1 задействованы в регенерации органов, как было продемонстрировано для печени и почек, эмбриогенеза, кроветворения, развития мышц и при регуляции миграции и адгезии нормально активированных В-клеток и моноцитов (2атедат, 1995; №1бтт 1991; Мοηΐекаηο, 1998; 8скт1б1, 1995; Иеката, 1995; В1аб1 1995; Такауата, 1996; Μίζιιπο. 1993; νаη, V. 1997; Вебтапп. 2000). Далее, многочисленные исследования показали, что гиперэкспрессия с-Ме1 задействована в злокачественной трансформации и инвазивности злокачественных клеток.

с-Ме1 опосредует мультифункциональные и потенциально онкогенные активности фактора роста гепатоцитов НОР/ксакет, включая содействие клеточному росту, подвижности, выживаемости, растворению внеклеточных матриц и ангиогенезу (Вскато, 1991; КиЬш, 1993; 2агпедат, 1995). Связывание Н6Р с рецептором вызывает автофосфорилирование с-Ме1 и активирует сигнальные процессы по ходу транскрипции, включая гак, фосфатидилиноситол 3'-киназу, фосфолипазу Су и активированные митогеном

- 8 017492 белковые каскады реакций, связанные с киназой. Ген с-Ме! экспрессирован преимущественно в эпителиальных клетках и гиперэкспрессирован в нескольких злокачественных тканях и клеточных линиях. Возрастающее число сообщений показало, что неэпителиальные клетки, такие как кроветворные, нервные клетки и клетки скелета, реагируют на НОР, а злокачественные заболевания кроветворной системы, как, например, множественная миелома, болезнь Ходжкина, лейкемия и лимфома, экспрессируют белок сМе! Ослабленный контроль инвазивного фенотипа роста в онкогенно активированном с-Ме!, спровоцированном с-Ме!-активационными мутациями, с-Ме! амплификацией/гиперэкспрессией и приобретением НОР/с-Ме! аутокринных петель, снабжает злокачественные клетки инвазивными и метастатическими свойствами. Примечательно, что конститутивная активация с-Ме! у трансгенных мышей с НОРгиперэкспрессией способствует обширному онкогенезу.

Регулятор сигналов О-белка 5 (К.О85) является негативным регулятором сигнальных путей гетеротримерного О-белка, хотя его функция ίη νίνο остается неясной. К.О8-белки представляют собой семейство молекул с объединяющей каталитической функцией, но с различным тканевым распределением. Они стимулируют истинную активность гуанозин-трифосфатазы (ОТРаке) активированных субъединиц Оа и, таким образом, ускоряют инактивацию О-белка. Таким образом, молекулы К.О8 ингибируют сигналы по ходу транскрипции связанных с О-белком рецепторов (Ие, 2000). Недавно было показано, что регулятор индукции сигнала-5 О-белка в перицитах совпадает с активным ремоделированием сосудов во время опухолевой неоваскуляризации. В модели панкреатического канцерогенеза островковых клеток мыши, а также в высокоангиогенных астроцитомах наблюдалась гиперэкспрессия К.О85 в перицитах во время ангиогенного переключения, сопровождающего активное ремоделирование сосудов. Гиперэкспрессия рестриктировалась по сосудистой сети опухоли в сравнении с нормальными островками Лангерганса. Тем не менее, повышение количества К.О85 также происходит во время заживления ран и овуляции (Вегдег 2005).

Экспрессия К.О85 увеличена в ЯСС (Кае 2000). В другом исследовании ПЦР с обратной транскрипцией показала сильную экспрессию К.О85 во всех исследованных ЯСС, тогда как в нормальных почках экспрессия была очень слаба или не выявлялась (6,6:1 с ПЦР в реальном времени). Основным местоположением К.О85 в ЯСС были эндотелиальные клетки опухоли (Ригиуа 2004). Далее, сообщалось, что К.О85 является эндотелиальным клеточным маркером синусоидного типа гепатоклеточной карциномы (СЬеп, 2004).

Аполипопротеин Ь1 (АРОЬ1) является секретируемым высокоплотным липопротеином, который связывается с аполипопротеином А-Ι. Аполипопротеин А-1 - это относительно широко распространенный плазменный белок и основной апопротеин НОЬ (липопротеины высокой плотности). Он задействован в формировании большинства холестериловых сложных эфиров в плазме и также способствует оттоку холестерина из клеток. Аполипопротеин Ь1 может играть роль в липидном обмене и переносе по организму, а также в обратном переносе холестерина из периферических клеток в печень. Плазменный белок является одноцепочечным полипептидом с кажущейся молекулярной массой около 40 кДа (ИисЬа!еаи, 1997; ИисЬа!еаи, 2001). АРОЬ1 кДНК была изолирована из активированных эндотелиальных клеток библиотеки кДНК, и было показано, что повышение ее содержания регулируется ΤΝΡ-α, который является сильным провоспалительным цитокином (Мопа_)ет1, 2002).

К1АА0367 был идентифицирован в рамках проекта Кахика с^NА, цель которого - обнаружение неизвестных длинных человеческих транскриптов, кодирующих предполагаемые белки (ОЬага, 1997). Хотя функция продукта предполагаемого белка К1АА0367 из 820 аминокислот неизвестна, он содержит на С-конце липидсвязывающий домен СЯАЬ-ТШО, который связывает малые гидрофобные молекулы и присутствует в нескольких факторах обмена нуклеотидов и в белок-взаимодействующем белке 2 (ΒΝΙΡ2) с массой 19 кДа ВСЬ2/аденовируса Е1В. ΒΝΙΡ-2 задействован в контроле различных клеточных функций, включая клеточную морфологию, миграцию, эндоцитоз и прогрессию клеточного цикла (Ζΐιοιι ,2005). К1АА0367 расположен на хромосомном участке 9с.|21. Этот участок описывается как обычная мишень гомозиготной делеции во многих опухолях (Оигкку, 2001; ХУеЬег. 2001) или как лишенный гетерозиготности (ЬоиЬе1атеп 2000; Τπρηΐΐιί 2003).

Растворимая гуанилатциклаза (кОС), гетеродимерный белок, состоящий из а- и β-субъединиц (1 гем-группа), катализирует конверсию ОТР во вторичный мессенджер сОМР и функционирует как главный рецептор для оксида азота и азотосодержащих сосудорасширяющих средств (УаЬе1 1998). ОИСУа3 и Ь3 гиперэкспрессированы в глиомах человека. Трансфекция антисмысловой ОИСУ1А3 или СиСУ1В3 снижает васкуляризацию и рост опухоли голой мыши. Это может быть связано с тем фактом, что УБОР индуцируется сОМР (8ашо 2004). ОИСУ1А3 способствует миграции опухолевых клеток опухолевой клеточной линии молочной железы мыши (1айекк1 2003).

Циклин Ό1 относится к высококонсервативному семейству циклинов, более точно к подсемейству циклинов Ό (Хюпд, 1991; Ьете, 1991). Циклины выполняют функцию регуляторов СЭК (циклинзависимые киназы). Различным циклинам свойственна разная степень экспрессии и способы деградации, что вносит вклад в координацию стадий митоза во времени (ЭекЬрапйе, 2005). Циклин Ό1 формирует комплекс с и функционирует как регуляторная субъединица СЭК4 или СЭК6, активность которых требуется

- 9 017492 для клеточного цикла перехода О1/8. ССИИ1 формирует с СИК4 и СИК6 голоэнзимный комплекс серин/треонинкиназа, обеспечивающий субстратную специфичность комплекса (Ва!е8 1994). Было показано, что этот белок взаимодействует с белком-супрессором опухоли КБ (Ьойеп 2002), и экспрессия этого гена положительно регулируется КЬ (На1аБаи, 1999). Мутации, амплификация и гиперэкспрессия этого гена, который изменяет прогрессию клеточного цикла, часто наблюдались в различных опухолях и могут благоприятствовать онкогенезу (НейЬетд, 1999; Уа^еГ. 1999; Ттоиккатй, 2000).

С8РС4 (хондроитин сульфат протеогликан) представляет интегральный мембранный хондроитин сульфат протеогликан. Он известен как ранний маркер прогрессии меланомы, присутствующий на клеточной поверхности и вовлеченный в стимуляцию пролиферации, миграции и инвазии опухолевой клетки. С8РО4 сильно экспрессирован в >90% случаев человеческой меланомы. Хотя С8РО4 не является строго опухолеспецифическим, опухолереактивные ответы СИ4+ Т-клеток у пациентов с меланомой и здоровых индивидов распознают С8РО4693-709 на НЬЛ-ОКИ-экспрессирующих клетках меланомы при отсутствии аутоиммунности (ЕгГий е! а1., 2007).

Экспрессия С8РО4 была также описана, кроме активированных перицитов, в некоторых нормальных тканях, таких как эндотелиальные клетки, хондроциты, гладкомышечные клетки, определенные виды базальных кератиноцитов внутри эпидермиса, в равной степени как и внутри волосяного фолликула (СашроБ е! а1., 2004).

Во время ангиогенеза и в ответ на патологии €.'N8 высокоподвижные клетки С8РО4 подвергаются быстрым морфологическим изменениям и мобилизуются в места, где происходит рост и восстановление сосудов. С8РО4 гиперэкспрессированы и в опухолевых клетках, и в перицитах кровяных сосудов злокачественных опухолей головного мозга (СБекепуа аиб Р11кшд1оп, 2002). Вживлением клеток из С8РО4положительной клеточной линии человеческой глиомы в головной мозг иммунодефицитных голых крыс было продемонстрировано, что данные опухоли имеют более высокую капиллярную плотность по сравнению с контрольными пробами; это предполагает, что экспрессией С8РО4 регулируются как функции, так и структура полученной от хозяина сосудистой сети опухоли (Вгекке е! а1., 2006). В эксперименте с ксенотрансплантатом по вживлению материала мультиформной глиобластомы (ОВМ), полученного биопсией, в голых крыс было установлено, что С8РО4 в основном ассоциируется с кровеносными сосудами как перицитов, так и компонентов основания мембраны сосудистой сети опухоли, и экспрессия ассоциирована с областями высокой клеточной пролиферации (СБекеиуа е! а1., 2002а). Кроме того, экспрессия С8РО4 происходила параллельно с прогрессией опухоли в модели с имплантацией глиомы (ЛУшнкшъка е! а1., 2006).

С8РО4 дифференциально экспрессирован в человеческих глиомах с более высокой экспрессией в глиомах высокой по сравнению с глиомами низкой степени злокачественности (СБекеиуа е! а1., 1999). Высокая экспрессия С8РО4 соотносится с мультилекарственной резистентностью, опосредованной возросшей активацией сигнальных процессов с участием α3β1 интегрин/Р13К и их мишеней по ходу транскрипции, способствуя выживанию клеток (СБекеиуа е! а1., 2008).

БЛВР7: белки, связывающие жирную кислоту (БЛВР), являются цитозольными белками 14-15 кДа, которые, как предполагается, задействованы в поглощении, транспортировке и нацеливании жирной кислоты (ЖК). Как считается, они увеличивают растворимость ЖК в цитоплазме во время транспортировки ЖК между мембранными компартментами и доставляют ЖК к их ядерным мишеням (С1а!х е! а1., 2002). БЛВР могут модулировать концентрацию ЖК и таким образом оказывать влияние на различные клеточные функции, такие как ферментативная активность, экспрессия генов, клеточный рост и дифференциация (С1а!х апб 81отсБ, 2001).

БАВР7 мРНК экспрессирован в тканях нейроэпителиального происхождения в равной степени, как и в злокачественных глиомах (степени III и 1У по ВОЗ). Ген был картирован на хромосомной полосе 6с.|22-23 - регионе, который также содержит протоонкоген с-тус и часто подвергается потере гетерозиготности при злокачественной глиоме. Анализ клеточных линий злокачественной глиомы показал, что БАВР7 часто ко-экспрессирован с глиальным фибриллярным кислым белком (ОБАР); предполагается, что клетка, в которой возникает злокачественная глиома, может быть астроцитной клеткойпредшественником, которая обладает потенциалом для экспрессии белков как в нормальных условиях, так и в результате образования опухоли (ОобЬои! е! а1., 1998). Белок БАВР7 проявляет от умеренной до сильной ядерной и цитоплазмической экспрессии в мультиформной глиобластоме (ОВМ). Трансфицированные БАВР7 клетки глиомы проявляют в 5 раз большую миграционную активность, чем контрольные клетки. Таким образом, более короткая общая выживаемость, ассоциированная с гиперэкспрессией БАВР7, в особенности в мультиформной глиобластоме (ОВМ), может быть обусловлена повышенной миграцией и инвазией опухолевых клеток в окружающую мозговую паренхиму (Ыапд е! а1., 2005). Дальнейший анализ распределения БАВР7 в астроцитомах указывает на повышенные уровни БАВР7 в регионах инфильтрации опухолей, предполагая что БАВР7 играет важную роль в направлении инфильтрации злокачественных клеток в смежные мозговые ткани (Мйа е! а1., 2007). БАВР7 демонстрирует вариабельные уровни экспрессии и субклеточную локализацию в глиальных тканях и всех степенях астроцитомы. Тем не менее, в особенности ядерная локализация БАВР7, по-видимому, ассоциирована с инфильтративным фенотипом клеток глиомы и каскадами реакций ЕОБК, так как его ядерная транслокация была об- 10 017492 наружена после активации ЕСЕК и ассоциируется с плохим прогнозом в случае ЕСЕВ-положительной мультиформной глиобластомы (СВМ). Более того, ядерная иммунореактивность ЕАВР7 не может быть зафиксирована в астроцитоме I степени (Ыапд с1 а1., 2006; Ка1о§Ы с1 а1., 2007).

Нейролигин 4, экспрессируемый сцепленным с Х-хромосомой геном, является членом семейства белков клеточной адгезии, который, по-видимому, выполняет определенную роль при созревании и работе нейронных синапсов. Члены семейства нейролигинов обладают сходной структурной организацией: содержат Ν-концевой сигнальный пептид, эстеразоподобный домен с двумя местами альтернативного сплайсинга, короткий линкерный регион с низким сходством последовательностей перед трансмембранным доменом и короткую цитозольную часть с высококонсервативной С-концевой последовательностью.

Относительно самые высокие уровни содержания нейролигина 4 мРНК были обнаружены в сердце. Более низкая экспрессия была установлена в печени, скелетных мышцах и поджелудочной железе, тогда как в головном мозге, плаценте, легких и почке нейролигин 4 мРНК было трудно обнаружить (ВоШдет с1 а1., 2001).

Мутации Х-сцепленного гена ΝΕ6Ν4 являются потенциальной причиной спектра нарушений аутистического характера, и о мутациях сообщалось у нескольких пациентов с аутизмом, синдромом Аспергера и умственной отсталостью (1атат е1 а1., 2003; Ьаитопшег е1 а1., 2004; Ьа^оп-Уиеп е1 а1., 2008).

Были описаны немногие случаи ассоциации ΝΕ6Ν4Χ с раком: при желудочно-кишечных стромальных опухолях гиперэкспрессия ΝΕ6Ν4Χ была установлена в детском и юношеском возрасте в отличие от случаев со взрослыми (Ртакакй е1 а1., 2005).

Тенасцин С: внеклеточная матрица, окружающая опухолевые клетки, отличается от внеклеточной матрицы нормальных тканей. Тенасцин-С (ΤΝΟ) - белок внеклеточного матрикса с сильным повышением количества в процессах, которые тесно ассоциированы с повышенной миграционной активностью, такой как эмбриональное развитие (ВагйсН е1 а1., 1992), заживление ран (Маск1е е1 а1., 1988) и неопластические процессы (С11к.|ие1-Е11П51папп. 1993; С1ис.|ие1-Е11П5тапп апй С1ис.|ие1. 2003). Кроме того, ΤΝΕ гиперэкспрессирован в опухолевых сосудах, которые имеют высокий пролиферационный индекс, указывающий на то, что ΤΝΕ задействован в неопластическом ангиогенезе (К1т е1 а1., 2000). В нормальном человеческом головном мозге экспрессия ΤNС была установлена только в редких случаях, тогда как в злокачественных глиомах он экспрессирован в высокой степени (Воигйоп е1 а1., 1983). Экспрессия ΤNС может быть вызвана гипоксией (Ьа1 е1 а1., 2001), ТСЕ-бета 1, обеспечивая механизм для инвазии глиом высокой степени злокачественности в здоровую паренхиму (Наи е1 а1., 2006), или гастрином, который существенно модулирует миграцию человеческих СВМ-клеток (Кисйагсхак е1 а1., 2001). ΤΝί.' снижает количество тропомиозина-1 и таким образом дестабилизирует стрессовые волокна актина. Это вызывает снижение количества ингибитора сигнального ХУт-каскада, ЭюккорЕ Так как снижение экспрессии тропомиозина1 и возрастание сигнала \Уп1-каскада тесно связаны с трансформацией и онкогенезом, то ΤΝΠ специфически модулирует данные сигнальные каскады реакций, усиливая пролиферацию клеток глиомы (Βπίζ е1 а1., 2004).

Периваскулярное окрашивание ΤΝΕ вокруг кровеносных сосудов, снабжающих опухоль, наблюдалось в тканях мультиформной глиобластомы (СВМ), и менее часто в глиомах II и III степени по ВОЗ, указывая на то, что интенсивность окрашивания ΤΝί.' соотносится со степенью опухоли, причем наиболее сильное окрашивание указывает на плохой прогноз (Него1й-Мепйе е1 а1., 2002). ΤΝί также вносит свой вклад в генерацию ниши стволовых клеток внутри субвентрикулярной зоны (8νΖ), принимая участие в управлении сигналами фактора роста для ускорения развития нервных стволовых клеток. Доминирующим эффектом ΤΝί на клетках δνΖ-зоны является регуляция процессов, связанных с развитием (Сатсюп е1 а1., 2004). ΤΝί является сильнейшим инициатором направленной миграции нервных стволовых клеток человека (Νδί). Вырабатываемый опухолью ЕСМ таким образом обеспечивает терпимое окружение для тропизма Νδί к рассеянным опухолевым клеткам (Ζίιι е1 а1., 2006).

ХВСАМ (адгезивная молекула нервных клеток) - это нейронная адгезивная молекула трансмембранных клеток со множественными иммуноглобулинподобными типа С2 и фибронектиновыми доменами типа III. Она задействована в управлении, разрастании и фасцикуляции нейрональных клеток (Стите! е! а1., 1991; Мога1е§ е! а1., 1993; 8!оеск11 апй Еапйтеккет, 1995; Ретп е! а1., 2001; 8акига1 е! а1., 2001) при формировании гомофильных, в равной степени как и гетерофильных взаимодействий с !§САМ (Уо1ктег е! а1., 1996; 8акита1 е! а1., 1997; Ζ;κ1ι;·ιπ;·ΐ5 е! а1., 1999). Связывающаяся с анкирином NΒСАМ (Όηνίδ апй Веппе!!, 1994) представлена в повышенном количестве в образующих трубки эндотелиальных клетках, предполагается ее возможная роль в образовании трубок и ангиогенезе (Айкепйеай е! а1., 2002).

ХВСАМ является геном-мишенью β-катенина и комплекса плакоглобин-ЕЕЕ/ТСЕ, который содействует онкогенезу (Сопасс1-8отте11 е! а1., 2002). Эктодомен ХВС’АМ может быть сброшен с клеточной поверхности металлопротеазоподобными активностями. Этот сброшенный домен способен активировать разнообразные сигнальные пути, он повышает клеточную подвижность и ведет к онкогенезу у мышей (Сопасс1-8отте11 е! а1., 2005).

ХВСАМ присутствует в повышенном количестве в анапластичных астроцитомах и опухолевых тканях мультиформной глиобластомы (СВМ) по сравнению с нормальным головным мозгом, и повы

- 11 017492 шенные уровни соотносятся с инвазивным поведением (8ейда1 е! а1., 1998). Антисмысловая РНК, в отличие от ЦЯСАМ, снижает онкогенную способность СВМ-клеток человека (8ейда1 е! а1., 1999).

ЮР2ВР3 является членом белкового семейства инсулиноподобных факторов роста II, связывающих мРНК, вовлеченным в локализацию, оборот и трансляционный контроль мРНК. Этот белок содержит несколько КН-доменов (К-гомологичных), которые важны в связывании РНК и о которых известно, что они вовлечены в синтез и метаболизм РНК. Экспрессия проявляется, главным образом, во время эмбрионального развития и была описана для некоторых опухолей. Таким образом, ЮР2ВР3 рассматривается как онкофетальный белок (Ыао е! а1., 2005). Высокий уровень транскрипции ЮР2ВР3 в многочисленных раковых тканях по сравнению с контрольными тканями указывает на то, что белок ЮР2ВР3 может играть функциональную роль в пролиферации трансформированных клеток. В пользу данной гипотезы говорит и то, что единственной незлокачественной тканью человека, экспрессирующей транскрипт ЮР2ВР3, является человеческая плацента, ткань, характеризующаяся клеточным ростом и пролиферацией (Мие11ег-РШа8СЙ е! а1., 1997).

Например, ЮР2ВР3 экспрессирован в образце светлоклеточной почечно-клеточной карциномы (ЯСС), и его экспрессия ассоциирована с распространенной стадией и степенью первичных опухолей. Кроме того, положительная экспрессия ЮР2ВР3 ассоциирована с повышенным в 5-10 раз риском отдаленных метастазов и с повышенным на 42-50% риском летального исхода от (Нойтаии е! а1., 2008; Лайд е! а1., 2006; Лайд е! а1., 2008).

ЮР2ВР3 также высокоэкспрессирован в карциномах поджелудочной железы. В 2 исследованиях >90% проб тканей опухолей поджелудочной железы проявляли экспрессию ЮР2ВР3 после иммуноокрашивания, в то время как не неопластические ткани поджелудочной железы были негативными для ЮР2ВР3. Кроме того, экспрессия прогрессивно возрастала вместе со стадией опухоли (УаиШк е! а1., 2005; УапЦ55 е! а1., 2008).

Экспрессия ЮР2ВР3 была также обнаружена в существенно повышенном состоянии в уротелиальных опухолях высокой степени, в то время как он обычно не экспрессирован в доброкачественном уротелии или уротелиальных опухолях низкой степени. Более того, пациенты с ЮР2ВР3-положительными опухолями имеют намного более низкий процент выживаемости без прогрессирования и выживаемости без болезни, чем те, что имеют ЮР2ВР3-негативные опухоли (Ы е! а1., 2008; 8йшкота е! а1., 2008; 2йеид е! а1., 2008).

Бревикан (ВСАЦ) является специфическим для головного мозга членом лектинового семейства хондроитинсульфатпротеогликанов.

Сообщалось о двух изоформах ВСАЦ: изоформе с полной длиной цепи, секретируемой во внеклеточный матрикс, и более короткой изоформе с последовательностью, которая предсказывает наличие гликофосфатидилинозитольного (СР1) якоря. Секретируемая изоформа высоко экспрессирована от рождения в течение первых 8 лет жизни, а к 20 годам ее активность снижается до низких уровней, которые сохраняются в нормальном взрослом корковом веществе. Изоформа СР1 экспрессирована на постоянно низких уровнях во время развития (Сагу е! а1., 2000). ВСАЦ принадлежит к семейству протеогликанов, описываемых обычно как барьерные молекулы, которые препятствуют клеточной и нейритной подвижности в нервной системе взрослых (У1ар1аио аиб Маййете, 2006). 1и νίνο, ВСАЦ экспрессирован вокруг границ рострального миграционного потока (1аетот8к1 аиб Радет, 2000) и является главным компонентом в повышенном количестве глиального рубца после травмы нервной системы (1аетот8к1 е! а1., 1999).

ВСАЦ имеет разительно высокое повышение количества в глиомах, где может быть установлено приблизительно 7-кратное повышение экспрессии по сравнению с нормальными уровнями. ВСАЦ мРНК не был обнаружен в пробах коркового вещества взрослых людей у индивидов, которые умерли без нейрологических осложнений. Как яркое отличие, ВСАЦ мРНК был обнаружен в каждой из 27 хирургических проб человеческой глиомы, таким образом, вызывая предположение, что ВСАЦ может быть единственным селективным маркером в глиоме (1аетот8к1 е! а1., 1996).

Белковая тирозинфосфатаза, рецепторного типа, 2е!а1 (РТРК21, РТР-ξ) - РТРК21 является членом семейства белковых тирозинфосфатаз рецепторного типа и кодирует проходящий через мембрану только один раз мембранный белок I типа с двумя цитоплазматическими тирозинбелковыми фосфатазными доменами, одним альфа-углеродным ангидразным доменом и фибронектиновым доменом III типа. Экспрессия этого гена индуцирована в раковых клетках желудка (^и е! а1., 2006), при раке груди (РегехРшета е! а1., 2007), при повторной миелинизации олигодендроцитов при поражении множественным склерозом (Наттосй е! а1., 2002) и в эмбриональных клетках почек человека в условиях гипоксии (^аид е! а1., 2005).

Как белок, так и транскрипт гиперэкспрессированы в клетках глиобластомы, способствуя их гаптотактической миграции (Ли е! а1., 2005) и геномной амплификации ДНК в глиобластоме (МцШо11аиб е! а1., 2006).

Хитиназо-3-подобная 2 (СШ3Ь2) - СН!3Л2 была первоначально идентифицирована в хондроцитах и содержится в повышенном количестве, например при остеоартрите (8!еск е! а1., 2002). Хотя этот белок еще недостаточно хорошо охарактеризован, он, скорее всего, секретируется во внеклеточное пространство. Его часто описывали как антиген-мишень при ревматическом артрите. Экспериментальная индукция

- 12 017492 антиангиогенеза при трансфекции 81РНК (УЕСЕ-А) человеческой глиомной клеточной линии вызвала повышение количества СН13Ь2.

Сурвивин (В1КС5)-экспрессия В1ЙС5 (сурвивин), член семейства белков-ингибиторов апоптоза (1АР), содержится в повышенном количестве в фетальных тканях и различных видах рака человека. Предполагается, что сурвивин способен к регуляции как клеточной пролиферации, так и отмирания апоптотических клеток. Предпочтительно в глиобластоме обнаруживаются очень высокие уровни экспрессии сурвивина (Апдйей е! а1., 2008). Предполагается, что гиперэкспрессия сурвивина в глиомах головного мозга может играть важную роль в злокачественной пролиферации, антиапоптозе и ангиогенезе (Ζίκη е! а1., 2005; Ьш е! а1., 2006). Предпочтительно в случае глиобластомы, но также и при других опухолевых формах, экспрессия сурвивина была значительно ассоциирована со степенью злокачественности (с наибольшей экспрессией сурвивина в глиобластоме) и более короткими общими сроками выживаемости по сравнению с пациентами, у которых были сурвивин-негативные опухоли (Кащтага е! а1., 2003; 8айо е! а1., 2007; иеша18и е! а1., 2005; Ме11а1 е! а1., 2008; Сгипйа е! а1., 2006; Х1е е! а1., 2006; 8а§ак1 е! а1., 2002; Сйактауатй е! а1., 2002).

Белки семейства матричной металлопротеиназы (ММР) задействованы в разрушении внеклеточной матрицы при нормальных физиологических процессах, таких как эмбриональное развитие, размножение и ремоделирование тканей в равной степени, как и во время заболеваний, таких как артрит и метастазы (Мо!!, 2004). Матричная металлопротеиназа 7 (ММР7) секретируется как неактивный белокпредшественник с массой 29,6 кДа, который активируется при расщеплении внеклеточными протеиназами. Активный фермент имеет молекулярную массу 19,1 кДа и связывает по два иона цинка и два иона кальция на субъединицу (М|уахак|. 1990; Вгслтпег. 1995). ММР7 расщепляет желатин, фибронектин и казеин (М|уа/акк 1990; ОнагИш 1989) и отличается от большинства членов семейства ММР отсутствием консервативного С-терминального белкового домена (Сайе, 1994). ММР7 часто гиперэкспрессирован в злокачественной ткани (Ьш 2004; Вташйа11 1997; Иепук, 2004), и предполагается, что он способствует инвазии опухолевых клеток ш νίνο (ЭДапд, 2005).

Эти белки могут быть мишенью опухолеспецифического иммунного ответа при многих видах рака.

Пептид корового антигена вируса гепатита В, НВУ-001, получен не из эндогенного опухолеассоциированного антигена человека, а из корового антигена вируса гепатита В. Во-первых, это обеспечивает количественное сравнение силы Т-клеточных ответов, индуцированных опухолеассоциированными пептидами (ТиМАР), использованными в фармацевтических композициях настоящего изобретения, и, следовательно, обеспечивает изучение их способности вызывать противоопухолевые ответы. Во-вторых, он функционирует как важный положительный контроль в случае недостатка каких-либо Т-клеточных ответов у пациента. И, в-третьих, он также обеспечивает проведение мониторинга иммунокомпетентности пациента.

Инфицирование вирусом гепатита В (НВУ) является одной из самых распространенных причин заболевания печени, поражающим примерно 350 млн человек по всему миру (КеЬятапп 2005). В связи с простотой горизонтального и вертикального переноса и наличием потенциала для хронического заболевания это может привести к циррозу печени и гепатоклеточной карциноме, поэтому НВУ наносит сильный удар по системам здравоохранения многих стран мира. Геном НВУ ^κνί^ώ, 2002) включает частично двухцепочечную кольцевую ДНК. В вириснах НВУ она окружена коровым белком НВс и другими белками, формируя нуклеокапсид, который защищен внешней оболочкой, содержащей липиды и поверхностные белки семейства НВ§ (называемые также оболочечными белками). Антигенные детерминанты, ассоциированные с НВс и НВу обозначаются как НВсАд и НВкАд, соответственно. Эти антигены ассоциированы с серологической реакцией, т. е. ответами антител, обнаруженными в крови пациента, и находятся среди клинически наиболее применимых систем антиген-антитело для диагноза инфекции НВУ. НВс будет представлять новый чужеродный антиген у всех индивидов без предшествующей истории инфекции НВУ. Так как для этого антигена хорошо известны иммуногенные пептиды (Вейо1ей1, 1993; ЕМпдйоп, 1997), то в рамках исследований 1МА из НВсАд в качестве антигена для положительного контроля был выбран один пептид из 10 аминокислот. Индукция пептид-специфических ЦТЛ НВс будет затем использоваться как маркер иммунокомпетентности пациента и успешности вакцинации.

Фармацевтические композиции настоящего изобретения могут быть использованы для парентерального введения, такого как подкожное, внутрикожное, внутрибрюшинное, внутривенное, внутримышечное или оральное введение. Для этого пептиды растворяются или суспендируются в фармацевтически приемлемом, предпочтительно водном носителе. Помимо этого, композиция может содержать эксципиенты, такие как антиоксиданты, консерванты, буферы, связующие агенты, разрушающие агенты, разбавители и вкусоароматические добавки. Пептиды могут быть также введены вместе с иммуностимулирующими веществами, такими как цитокины. Пространный список эксципиентов, которые могут быть использованы в такой композиции, может быть взят, например, из А. К1ЬЬе, НапйЬоок о! Ркаттасеи!1са1 Ехс1р1еп!8, 3. Ей., 2000, изд. Атепсап Ркаттасеийса1 А^оаайоп апй ркаттасеийса1 рге55. Композиции по изобретению могут использоваться для предупреждения, профилактики и/или лечения аденоматозных или раковых заболеваний.

Фармацевтические композиции настоящего изобретения могут вводиться пациенту, страдающему

- 13 017492 аденоматозным или раковым заболеванием, ассоциированным с соответствующим пептидом или антигеном с 8ΕΟ ΙΌ N0: 1-10, или пациенту, страдающему от рака головного мозга, в частности глиомы, в особенности раковым заболеванием глиобластомы, которое ассоциировано с соответствующим пептидом или антигеном с 8Ε0 ΙΌ N0: 11-22 или 11-23. Пептиды фармацевтической композиции способны вызывать опосредованный Т-клетками иммунный ответ у пациента. Как отмечалось выше, в случае почечноклеточного рака фармацевтическая композиция в соответствии с настоящим изобретением предпочтительно включает пептид, включающий аминокислотную последовательность, представленную в 8Ε0 ΙΌ N0: 1 и/или 8Ε0 ΙΌ N0: 2, и дополнительно включает по меньшей мере один дополнительный опухолеассоциированный пептид, включающий аминокислотную последовательность, представленную в 8Ε0 ΙΌ N0: 3-10. В случае рака головного мозга, в частности глиомы, в особенности глиобластомы, фармацевтическая композиция предпочтительно включает последовательность, представленную в 8Ε0 ΙΌ N0: 12 и/или 8Ε0 ΙΌ N0: 13, и дополнительно включает по меньшей мере один дополнительный опухолеассоциированный пептид, включающий аминокислотную последовательность, представленную в 8Ε0 ΙΌ N0: 11 и 14-22 и/или 23.

Предпочтительно, чтобы пептиды, которые присутствуют в фармацевтических композициях настоящего изобретения, обладали общей длиной от 9 до 100, предпочтительно от 9 до 30 и, особенно предпочтительно, от 9 до 16 аминокислот. Кроме того, по меньшей мере один пептид в соответствии с любой из последовательностей 8Ε0 ΙΌ N0: 1-23 может включать непептидные связи.

Предпочтительная фармацевтическая композиция по изобретению (предпочтительно для вакцины против почечно-клеточного рака) включает пептид, состоящий из аминокислотной последовательности, представленной в 8Ε0 ΙΌ N0: 1 и/или 8Ε0 ΙΌ N0: 2, и в других воплощениях далее включает по меньшей мере один пептид, состоящий из аминокислотной последовательности, представленной в 8Ε0 ΙΌ N0: 3-11.

Еще одна предпочтительная фармацевтическая композиция по изобретению (вакцина против рака головного мозга, в частности глиомы, предпочтительно глиобластомы) включает пептид, состоящий из аминокислотной последовательности, представленной в 8Ε0 ΙΌ N0: 12 и/или 8Ε0 ΙΌ N0: 13, и в других воплощениях далее включает по меньшей мере один пептид, состоящий из аминокислотной последовательности, представленной в 8Ε0 ΙΌ N0: 11-22 и/или 23.

Пептид может быть также меченым или может быть гибридным белком или гибридной молекулой. Пептиды, последовательность которых дана в настоящем изобретении, как ожидается, стимулируют СЭ8' ЦТЛ. Тем не менее, стимуляция более эффективна в присутствии помощи, производимой СЭ4' Тклетками. Таким образом, рекомбинантные партнеры или части гибридной молекулы адекватно обеспечивают эпитопы, которые стимулируют СЭ4' Т-клетки. Стимулирующие эпитопы СЭ4' хорошо известны из уровня техники и включают те, что были выявлены в столбнячном токсине. Дополнительно в предпочтительном воплощении пептид является рекомбинантным белком, в частности включающим N концевые аминокислоты антиген-ассоциированной инвариантной цепи (Ιί) НЬА-ЭК. В одном воплощении пептид по изобретению является укороченным белком человека или гибридным белком белкового фрагмента и другого сегмента полипептида, при условии, что человеческий сегмент включает одну или более аминокислотных последовательностей изобретения.

Пептиды, полезные в фармацевтической композиции, могут быть в основном чистыми или комбинированными с иммуностимулирующим адъювантом или использоваться в комбинации с иммуностимулирующими цитокинами или могут вводиться с подходящей системой доставки, например, липосомами, микро-, наночастицами, мицеллой, эмульсиями и гелями. При вакцинации пептидом вообще необходим адъювант, и такой как ГМ-КСФ является предпочтительным адъювантом (человеческий ГМ-КСФ имеется в продаже под названием §агдгато811ш®, Ьеикте®, производитель Вег1ех сейчас Вауег НеаНйсаге РйагтасеиИсак). Другие подходящие адъюванты включают стимулон Ас.|ш1а'5 0821 (Ацш1а Вю1ее11. АогсеЧег. МА, США), который получают из сапонина, микобактериальные экстракты и синтетические имитации бактериальных клеточных стенок и собственно адъюванты, такие как ГОЫ'5 ЭеЮ.х. Также может быть использован 0ш1 А, другой полученный из сапонина адъювант (ЗирегГок, Дания). Другие адъюванты, такие как адъювант Фрейнда, могут также быть полезны. Полезно также может быть, если пептид конъюгировать с подходящим носителем, таким как гемоцианин лимфы улитки (КЬН) или маннан (см. А0 95/18145 и Ьопдепескег е! а1. (1993) Апп. КГ Асаб. 8с1. 690, 276-291). Так как адъювант определяется как субстанция, усиливающая иммунный ответ на антиген (Меб1теР1и§® Мебюа1 ОкИопагу, ШН), то могут использоваться и другие субстанции с этой же функцией, включая, но не ограничиваясь, агонисты То11-подобного рецептора (ТЬК. агонисты), предпочтительно субстанции, агонистически взаимодействующие с ТЬК 3, 7, 8 и 9, такие как протамин-стабилизированная РНК, СрО-олигонуклеотиды, СрКолигонуклеотиды, бактериальная ДНК, имидазохинолины и т.д.

Другие вещества, известные из уровня техники, которые подходят для усиления иммунного ответа, включают, но без ограничения, ингибиторы индуцируемой синтазы оксида азота ^08), аргиназы (АК.01), индоламин-2,3-диоксигеназы (ГО0), рецептора васкулярного эндотелиального фактора роста 1 (ΥΕ6ΕΚ-1), васкулярного эндотелиального фактора роста (ΥΕΟΕ), циклооксигеназы-2 (СОХ-2), рецепто

- 14 017492 ра I ТСР-β (ТСР-β-ΒΙ). Такими ингибиторами могут быть, например, моноклональные антитела к молекулам или малым молекулам. О малых молекулах и моноклональных антителах из уровня техники известно, что они имеют ингибиторную функцию по отношению к факторам, указанным выше, и, таким образом, усиливают иммунный ответ; это, например, 1-МТ, ЫСХ-4016, рофекоксиб, целебрекс, ВЕС, АВН, пог-ΝΟΗΑ, 8В-505124, 8Ώ-208, ЬУ580276, ΑΜΏ3100, акситиниб, бевацизумаб, 181-124, СРА-7, ХЬ-999, ΖΌ2171, пазопаниб, СР-547632 и УЕСР Тгар.

И дополнительно, субстанции, снижающие число регуляторных Т-клеток (СО 4+, СО25+, РохР3+), подходят в качестве адъювантов. Они включают, например, но без ограничения, циклофосфамид (Цитоксан), ΟΝΤΑΚ (денилейкин дифтитокс), Сунитиниб, анти-СТЬА-4 (МОХ-010, СР-675206), анти-СО25, анти-ССЬ22 и анти-С1ТВ.

Предпочтительные количества пептидов в фармацевтических композициях настоящего изобретения могут варьировать от около 0,1 до 100 мг, предпочтительно от около 0,1 до 1 мг и наиболее предпочтительно от около 300 мкг до 800 мкг на 500 мкл раствора. Термин около подразумевает +/-10% заданного объема, если не указано другое. Специалист данной области будет способен установить фактическое количество пептида для использования, исходя из нескольких факторов, таких как, например, иммунный статус отдельного пациента и/или количество ТИМАР (опухолеассоциированный пептид), который презентируется в конкретном виде рака.

Фармацевтические композиции настоящего изобретения обеспечивают композицию с чрезвычайно улучшенной растворимостью и свойствами смачиваемости лиофилизата по сравнению с ранее известными композициями. Это было достигнуто при использовании специальной композиции эксципиентов. Таким образом, были разработаны фармацевтические композиции настоящего изобретения, включающие пептиды с 8ЕС ΙΟ ΝΟ: 1-10 или 8ЕС ΙΟ ΝΟ: 1-11 и их варианты, которые показывают превосходную стабильность при хранении при (-20°С, +5°С, +25°С) и могут быть легко растворены.

Под термином стабильность при хранении понимается, что процентная доля побочных продуктов не поднимается выше 5% в течение двух лет. Кроме того, термин стабильность означает, что специфические свойства, такие как растворимость, оптическая прозрачность раствора и число частиц в растворе, не меняются ощутимо в течение данного отрезка времени.

Термин легко растворимые означает, что лиофилизат может быть полностью растворен посредством использования буфера или других эксципиентов за несколько секунд до двух минут без применения ультразвукового гомогенизатора. Кроме того, композиция может быть легко введена пациенту в целях лечения посредством инъекции Ей. и менее предпочтительно 8.е. Значение рН полученного раствора должно находиться между рН 2,7 и рН 9.

В другом воплощении фармацевтическая композиция настоящего изобретения может включать сахара, сахарные спирты, аминокислоты, такие как глицин, аргинин, глютаминовую кислоту и другие в качестве образователей структуры. Сахара могут быть моно-, ди- или трисахаридами. Эти сахара могут быть использованы в отдельности, в равной степени как и в комбинации с сахарными спиртами. Примеры сахаров включают глюкозу, маннозу, галактозу, фруктозу или сорбозу в качестве моносахаридов; сахарозу, лактозу, мальтозу или трегалозу в качестве дисахаридов и рафинозу в качестве трисахарида. Сахарный спирт может быть, например, маннитозой.

Предпочтительными ингредиентами являются сахароза, лактоза, мальтоза, трегалоза, маннит и/или сорбит и более предпочтительно маннитол.

Кроме того, фармацевтические композиции настоящего изобретения могут включать хорошо переносимые физиологические эксципиенты (см. НапйЬоок оГ Рйатшасеийса1 Ехс1р1епк, 5-е изд., авторы Ваутопй Воте, Раи1 8ке§кеу апй 81ап ΟλλΌΠ, Рйатшасеийса1 Рге55 (2006)), такие как антиоксиданты, подобные аскорбиновой кислоте или глютатиону; консерванты, такие как фенол, м-крезол, метил- или пропилпарабен, хлорбутанол, тиомерсал или бензалконийхлорид; стабилизаторы, структуроформирующие средства, такие как сахароза, лактоза, мальтоза, трегалоза, миннитоза, маннит и/или сорбит, маннит и/или лактоза и растворители, такие как полиэтиленгликоли (РЕС), например, РЕС 3000, 3350, 4000 или 6000; или циклодекстрины, например, гидроксипропил^-циклодекстрин, сульфобутилэтил-βциклодекстрин или γ-циклодекстрин; или декстраны или полоксамеры, например, полоксамер 407®, полоксамер 188 или Твин 20®, Твин 80®. В предпочтительном воплощении фармацевтические композиции настоящего изобретения включают один или более хорошо переносимых эксципиентов, выбранных из группы, состоящей из антиоксидантов, структуроформирующих средств и стабилизаторов.

Настоящее изобретение относится к обнаружению, что композиции, включающие по меньшей мере два комплекта пептидов соответствующих 8ЕС ΙΟ ΝΟ: 1-10 или 8ЕС ΙΟ ΝΟ: 1-11, маннитол и полоксамер 188 в специфическом соотношении, ведут к композициям, которые проявляют значительно повышенную стабильность и могут быть растворены без использования ультразвуковой обработки. Кроме того, для растворения требуется лишь несколько секунд. При визуальном контроле после восстановления 4,2% раствором бикарбоната натрия должен наблюдаться раствор от прозрачного до опалесцирующего (для лиофилизата). Данные характеристики растворения фармацевтических композиций настоящего изобретения воспроизводятся даже после хранения лекарственного продукта при -20°С, +5°С и +25°С в те

- 15 017492 чение 2 лет.

Кроме того, настоящее изобретение относится к композициям, включающим по меньшей мере четыре комплекта пептидов в соответствующих 8ЕО ΙΌ N0: 11-22, 8Е0 ΙΌ N0: 11-23, 8Е0 ΙΌ N0: 12-22 или 8Е0 ΙΌ N0: 12-23, причем маннитол и полоксамер 188 в специфическом соотношении приводят к тому, что композиции могут быть легко растворены. При визуальном контроле после восстановления 4,2% раствором бикарбоната натрия должен наблюдаться раствор от прозрачного до опалесцирующего (для лиофилизата). Отдельные пептиды в описанном составе обладают стабильностью в течение по меньшей мере 3 месяцев после хранения при -20°С, +5°С и +25°С.

В предпочтительном воплощении фармацевтические композиции настоящего изобретения включают специфическое соотношение пептидов/маннитола/Твин 80® (по весу), включительно и в диапазоне от 1:2:1,5 до 1:8:2,2. См. приводимую ниже диаграмму для других предпочтительных соотношений, которые включены в настоящее изобретение. Особенно предпочтительным соотношением является 1:5:2. Другим особенно предпочтительным соотношением является 1:8:2.

В другом предпочтительном воплощении фармацевтические композиции настоящего изобретения включают специфическое соотношение пептидов/маннитола/полоксамера 188 (по весу), включительно и в диапазоне от 1:5:1,5 до 1:8:2,2. См. приводимую ниже диаграмму для других предпочтительных соотношений, которые включены в настоящее изобретение. Предпочтительное соотношение: 1:5:1.

Другое особенно предпочтительное соотношение пептидов/маннитола/полоксамера 188 по весу составляет 1:8:2. Более предпочтительная композиция включает смесь пептидов/маннитола/полоксамера 188® в соотношении 1:5:2 по весу (см. пример 2). Другое соотношение включает пептиды/маннитол/полоксамер 188 в соотношении от 1:0:2 до 1:2:2,2 по весу.

Другие воплощения настоящего изобретения включают следующие соотношения по весу.

Пептиды	Маннитол	Полоксамер 188	Пептиды	Маннитол	Полоксамер 188
	5	1.5		8	1,5
	5	1,6		8	1,6
	5	1,7		8	1.7
	5	1,8		8	1.8
	5	1,9		8	1,9
	5	2	1	8	2
	5	2,1		8	2,1
	5	2,2		8	2,2
	6	1.5	1	5.5	1.5
	6	1,6		5.5	1,6
	6	1,7		5,5	1,7
	6	1.8	1	5,5	1,8
	6	1,9		5,5	1,9
	6	2		5,5	2
	6	2,1	1	5,5	2.1
	6	2,2		5,5	2,2
	7	1,5		6,5	1,5
	7	1,6	1	6,5	1.6
	7	1,7		6,5	1,7
	7	1,8	1	6,5	1,8
	7	1,9	1	6,5	1,9
	7	2	1	6,5	2

	7	2.1		6,5	2,1
	7	2,2		6,5	2,2
1	7,5	1,5	1	0	2
1	7,5	1,6		0	2,1
1	7,5	1,7		0	2,2
1	7,5	1,8	Предпочтительно ДЛЯ препарата ΙΜΑ950
1	7,5	1,9	1	5	0,5
1	7.5	2	1	5	0,6
1	7,5	2,1	1	5	0,7
1	7,5	2,2	1	5	0,8
			1	5	0,9
			1	5	1
			1	5	1,1
			1	5	1.2
			1	5	1,3
			1	5	1,4

- 16 017492

Пептиды	Маннитол	Твин 80®	Пептиды	Маннитол	Твин 80®	Пептиды	Маннитол	Твин 80®
1	2	1,5	1	5	1.5		8	1.5
1	2	1.6	1		1,6		8	1.6
1	2	17	1		1.7		8	1,7
1	2	1,6	1	5	1,8		8	1,8
1	2	1,9	1	5	1,9		8	1,9
1	2	2	1	5	2		8	2
1	2	2,1	1	5	2,1		8	2,1
1	2	2,2	1		2,2		8	2,2
1	3	1,5	1	6	1,5		2,1	1,5
1	3	1,6	1	6	1,6		2.1	1,6
1	3	1,7	1	6	1,7		2,1	1,7
1	3	1,6	1	6	1,8		2,1	1.8
1	3	1.9	1	6	1,8		2,1	1.9
1	3	2	1	6	2		2,1	2
1	3	2,1	1	6	2,1		2.1	2,1
1	3	2,2	1	6	2,2		2,1	2,2
1	4	1,5	1	7	1,5
1	4	1,6	1	7	1,6
1	4	1,7	1	7	1,7
1	4	1,6	1	7	1,8
1	4	1,9	1		1,9
1	4	2	1	7	2
1	4	2,1	1	7	2.1

Фармацевтические композиции настоящего изобретения могут быть лиофилизованы. Полученный лиофилизат может быть восстановлен в водную композицию при добавлении водного растворителя. Предпочтительно, чтобы водная композиция могла напрямую вводиться парентерально пациенту. Поэтому дальнейшим воплощением настоящего изобретения является водная фармацевтическая композиция раскрытых выше композиций, получаемая при восстановлении лиофилизата, описанного выше, водным растворителем.

Приемлемым диапазоном значений рН является рН 2-12 для внутривенного и внутримышечного введения, но для подкожного введения диапазон снижается до 2,7-9,0, так как степень растворения ίη νίνο понижена, приводя к увеличению потенциала для возникновения раздражения на месте инъекции. 81пск1еу КоБей 6., РБагт. Кек., 21, N0: 2, 201-230 (2004).

Предпочтительно водная фармацевтическая композиция по изобретению имеет рН-значение, составляющее 7-9, еще более предпочтительно рН-значение от 8 до 9 и еще более предпочтительно рНзначение от 8,3 до 8,7.

Фармацевтические композиции настоящего изобретения хорошо переносятся физиологически, могут быть легко произведены, точно дозированы и проявляют превосходную стабильность при хранении относительно концентрации, продуктов разложения и эксципиентов в течение времени хранения. Препараты могут сохранять стабильность в течение 2 лет в замороженном состоянии при -20°С, в охлажденном виде при (+2-8°С) или даже при комнатной температуре (+25°С), при 60% относительной влажности.

Фармацевтические композиции настоящего изобретения предпочтительно являются стерильными и приготавливаются для введения ίη νίνο.

Настоящее изобретение обеспечивает также способ повышения иммунных ответов у субъекта; указанный способ включает введение субъекту по необходимости фармацевтической композиции настоящего изобретения, причем указанные пептиды, варианты или соли вводятся в эффективном количестве, предпочтительно количестве, эффективном для повышения указанного иммунного ответа. Изобретение дополнительно обеспечивает применение фармацевтической композиции по изобретению в лекарственном средстве для введения субъекту в целях повышения иммунного ответа против рака. Также включается применение фармацевтической композиции настоящего изобретения для лечения рака, предпочтительно почечного рака, и применение для изготовления лекарственного средства для введения пациенту в целях повышения иммунного ответа против рака и, следовательно, для лечения рака.

Пептиды, использованные в фармацевтической композиции, предпочтительно являются чистыми или в основном чистыми и, желательно, в основном гомогенными (т.е. свободными от загрязняющих пептидов или белков и т.д.). В основном чистый означает пептидный препарат с очисткой ВЭЖХ, составляющей по меньшей мере 90% и предпочтительно по меньшей мере 95%. В основном гомогенный препарат означает пептидный препарат, включающий по меньшей мере 99% пептида, исходя из общего веса пептида в препарате.

Настоящее изобретение, кроме того, включает набор, содержащий:

(а) контейнер, который содержит фармацевтическую композицию, как описано выше, в виде раствора или в лиофилизованной форме;

(Б) необязательно - второй контейнер, содержащий разбавитель или восстанавливающий раствор для лиофилизованной композиции; и (с) необязательно - инструкции по (ί) использованию раствора или (ίί) восстановленного раствора и/или по использованию лиофилизованной композиции.

- 17 017492

Кроме того, набор может включать один или более (ί) буфер, (ίί) разбавитель, (ίίί) фильтр, (ίν) иглу или (ν) шприц.

Контейнер является предпочтительно флаконом, ампулой, шприцем или пробиркой; и он также может быть контейнером многоразового использования. Фармацевтическая композиция предпочтительно лиофилизована.

Наборы настоящего изобретения предпочтительно включает лиофилизованную композицию настоящего изобретения в подходящем контейнере и инструкции для ее восстановления и/или по ее использованию. Подходящие контейнеры включают, например, флаконы, ампулы (например, двухкамерные ампулы), шприцы (такие как двухкамерные шприцы) и пробирки. Контейнер может быть сделан из разнообразных материалов, таких как стекло или пластик. Предпочтительно набор и/или контейнер содержат(ит) инструкции, или нанесены на контейнер, которые дают указания для восстановления и/или использования. Например, на этикетке может быть указано, что лиофилизованная композиция должна восстанавливаться до пептидных концентраций, как те, что описаны выше. На этикетке дополнительно может быть указано, что композиция применяется или предназначается для подкожного введения.

Контейнер с композицией может быть ампулой многоразового использования, которая обеспечивает повторное введение (например, от 2-6 введений) восстановленной композиции. Набор может включать дополнительно второй контейнер, включающий подходящий разбавитель (например, раствор бикарбоната натрия).

При смешивании разбавителя и лиофилизованной композиции окончательная концентрация пептида в восстановленной композиции составляет по меньшей мере 0,15 мг/мл/пептид (=75 мкг) и предпочтительно не более чем 3 мг/мл/пептид (=1500 мкг). Набор может дополнительно включать другие материалы, желательные и с коммерческой, и с точки зрения пользователя, включая другие буферы, разбавители, фильтры, иглы, шприцы и упаковочные вкладыши с инструкциями по применению.

Набор настоящего изобретения может включать один контейнер, который содержит фармацевтические композиции в соответствии с настоящим изобретением с или без других компонентов (например, других соединений или фармацевтических композиций этих других соединений) или может иметь отдельные контейнеры для каждого компонента.

Набор по изобретению предпочтительно включает композицию по изобретению, укомплектованную для применения в комбинации для совместного введения второго соединения (такого как адъюванты (например, ГМ-КСФ, химиотерапевтическое средство, натуральный продукт, гормон или антагонист, средство против ангиогенеза или ингибитор; апоптоз-индуцирующее средство или хелатор)) или их фармацевтическую композицию. Компоненты набора до введения пациенту могут предварительно быть собраны в комплекс, или же каждый компонент может быть в отдельном контейнере. Компоненты набора могут быть одним или несколькими жидкостными растворами, предпочтительно водным раствором, более предпочтительно стерильным водным раствором. Компоненты набора могут также быть твердой формой, которые могут быть превращены в жидкости при добавлении подходящих растворителей, которые предпочтительно предоставляются в другом контейнере.

Контейнер для терапевтического набора может быть ампулой, пробиркой, колбой, флаконом, шприцем или любыми другими средствами, заключающими в себе твердое вещество или жидкость. Обычно, если имеются более одного компонента, набор содержит вторую ампулу или другой контейнер, который обеспечивает отдельную дозировку. Набор может также содержать другой контейнер для фармацевтически приемлемой жидкости.

Терапевтический набор будет предпочтительно содержать приспособление (например, одну или более игл, шприцы, пипетки для глаз, пипетки и т. д.), которое обеспечивает введение веществ по изобретению, являющихся компонентами настоящего набора.

Настоящая композиция подходит для введения пептидов любым приемлемым способом, таким как оральный (энтеральный), назальный, глазной, подкожный, внутрикожный, внутримышечный, внутривенный или трансдермальный. Предпочтительно, чтобы введение было 8.с и наиболее предпочтительно ί.ά. Введение может производиться инфузионным насосом.

Методика проведения аналитических тестов.

Идентичность, чистоту и содержание пептида определяли аналитической хроматографией обратнофазной ВЭЖХ. Длина волн при определении была 220 нм.

Анализ стабильности (стабильность испытуемых композиций).

а) Вакцина против почечно-клеточного рака.

Различные лиофилизаты проверяли на стабильность каждого отдельного пептида при +25°С и +40°С, используя способ аналитической ВЭЖХ. Анализ напряжения при +25°С и +40°С производили для определения тенденций в отношении, какая из композиций более устойчива при комнатной и более высоких температурах.

Пептиды в соответствии с 8ЕО ΙΌ N0: № 1-10 были лиофилизованы без каких-либо эксципиентов и при добавлении маннитола и Полоксамера 188 (Лутрол Р68®) или Твин 80®.

Были приготовлены следующие испытуемые композиции и стабильность измеряли при +25°С и

- 18 017492 +40°С способом аналитической ВЭЖХ:

Композиция 1: пептиды без каких-либо эксципиентов;

Композиция 2: пептиды/маннитол/Лутрол Р68® (Полоксамер 188) (1:5:2 по весу);

Композиция 3: пептиды/маннитол/Твин 80® (1:5:2 по весу);

Композиция 4: пептиды/маннитол/Твин 80® (1:5:1 по весу).

Начальные измерения ВЭЖХ производили для каждой композиции до начала хранения в климатической камере. Для этой цели содержимое двух ампул было полностью растворено в 30%-й уксусной кислоте и произведены измерения обратнофазной ВЭЖХ при повторном определении. Для обеспечения сопоставимости между отдельными измерениями в качестве внутреннего стандарта был использован βнафтилаланин, который лиофилизован вместе с пептидами.

По истечении 7, 14, 21 и 28 дней из климатической камеры изымали очередные две ампулы для определения стабильности.

Оценку данных производили при повторном определении показателей для одной ампулы. Для одной точки времени и температуры использовали две независимые ампулы в целях получения в общей сложности четырех показателей. Данные показатели брали для вычисления стандартного отклонения, приведенного в планках погрешностей в соответствующей диаграмме.

Результат экспериментов: стабильность каждого отдельного пептида в композиции с маннитолом и Лутролом Р68® сравнима с результатами, полученными для композиции без каких-либо эксципиентов. Композиции, содержащие Твин 80®, проявляют повышенную деградацию 1МА-КО8-001, предпочтительно при +40°С, и увеличение сигнала, предпочтительно для пептида 1МА-АОР-001. Данное повышение может быть из-за ко-элюирования загрязнения, вызванного деградацией пептидов.

Ь) Вакцина против клеточной глиобластомы.

Различные лиофилизаты были протестированы на растворимость и стабильность смеси пептидов в композиции.

Пептиды в соответствии с 8ЕО ΙΌ N0: 11-23 были лиофилизованы без каких-либо эксципиентов и с добавлением маннитола/Полоксамера 188 (Лутрол Р68®) и маннитола/Твин 80®.

Были приготовлены следующие испытуемые композиции и были протестированы их растворимости в различных растворах и стабильность при +25°С и +40°С.

Композиция 3: пептиды/маннитол/Твин 80® (1:5:2 по весу).

Стабильность обеих композиций была одинаково хорошей. Растворимость была наилучшей при использовании композиции 2, которая образовывала прозрачную и бесцветную смесь, в то время как в композиции 3 в некоторых случаях наблюдался легкий осадок при более высоких концентрациях. При использовании композиции 1 растворение было вообще невозможно.

Результат экспериментов: стабильность каждого отдельного пептида в композиции с маннитолом/Лутролом Р68® и маннитолом/Твин 80® сравнима с результатами, полученными для композиции без каких-либо эксципиентов. Без каких-либо эксципиентов композиция нерастворима в подходящих растворах, например в гидрокарбонате натрия (4,2%).

Вычисление потенции для композиции 1МА901.

Эффект от эксципиентов Полоксамера 188 и маннитола был проверен на эффективности Тклеточного прайминга. Неактивными эксципиентами в композиции 1МА901 являются Полоксамер 188 (Лутрол Р68®) и маннитол. Данные два эксципиента не входили в композицию 1МА901 на 1-й фазе испытаний и были включены в композицию на 2-й фазе испытаний для повышения растворимости и стабильности в использовании вакцины 1МА901. В данном исследовании проверяли влияние данных веществ на эффективность Т-клеточного прайминга у мышей после пептидной иммунизации моделью мышиного пептида. Не наблюдалось никаких токсических эффектов от Полоксамера 188 (Лутрол Р68®) и маннитола. Т-клеточный прайминг анализировали окрашиванием тетрамера и проточной цитометрией ех У1уо девять дней спустя после иммунизации. Добавление Полоксамера® (Лутрол Р68®)/маннитола в иммунизационный раствор не меняет эффективность ί.Ό8' Т-клеточного прайминга.

Принципы теста.

Иммунизация: В целях прайминга наивных СЭ8' Т-клеток иммуногенный пептид 0уа_257-264 (8ΙΙΝРЕКЬ), связывающий Н2-К^Ь, в комбинации с адъювантом, обычно используемым при иммунизации мышей (СрО деоксиолигонуклеотид), в 4,2%-м бикарбонатном буфере вводился внутрикожно 8-12недельным женским особям мышей (штамм С57ВБ/6, Н2^Ь, 3 мыши на группу). Сравнивали растворы инъекций с и без Полоксамера 188 (Лутрол Р68® (16,5 мг/мл)) и маннитола (41,3 мг/мл). Концентрации эксципиентов одинаковы, как были запланированы для инъекционного раствора ГМА901. Положительный контроль иммунизировали подкожно пептидным раствором, содержащим СрО, эмульсифицированным в Тйегтах® с1а881с (8щта-А1бпс11).

Тетрамерное окрашивание: спустя 9 дней мышей умерщвляли и анализировали ех у1уо 0уа_257-264

- 19 017492 специфические Т-клетки селезенки с помощью тетрамерного окрашивания и проточной цитометрии. Тетрамерная технология обеспечивает специфическую и чувствительную детекцию Т-клеток, несущих совместимый Т-клеточный рецептор.

Результаты: Локально на местах введения инъекции или систематически не наблюдалось никаких токсических эффектов от Полоксамера 188 (Лутрол Е68® ВА8Е, Ьий^дкйаГеп, Германия)/маннитола. Положительная контрольная группа, СрС-группа и группа СрС/Полоксамер 188/маннитол проявляли значительно более высокую частотность пептидспецифических Т-клеток по сравнению с отрицательными контролями (р<0,05). Не было значительных различий между группами только с СрС и СрС/Полоксамер 188/маннитол.

Возможность положительных популяций, искусственно полученных путем наблюдения, была исключена посредством тетрамерного окрашивания пролиферированных пептидспецифических клеток после пятидневной стимуляции ίη уйго пептидом (данные не приводятся).

В заключение, присутствие Полоксамера 188 (Лутрол Е68®)/маннитола в иммунизационном коктейле не вносит изменений в вызванные пептидом иммунные ответы у мышей, и поэтому, в принципе, не ожидается побочных или неблагоприятных воздействий от Полоксамера 188 (Лутрол Е68®) и маннитола на эффективность и безопасность основанных на пептидах иммунотерапевтических препаратов.

Материалы и методы.

Пептиды, использованные для приготовления различных композиций, были синтезированы и поставлены фирмой Васйет АС, Швейцария.

Примеры

Пример 1.

Исходные растворы каждого отдельного пептида были приготовлены путем растворения пептидов в подходящих растворителях в соответствии с их характеристиками растворимости (см. табл. 2). 1,47 мл пептидных растворов с более высокой концентрацией (пептид 5-10) и 7,34 мл пептидных растворов 1-4 были скомбинированы с последующим добавлением 1,47 мл 10%-й уксусной кислоты. Смесь обрабатывали на вортексе в течение 2 минут и на ультразвуковой бане в течение 1 мин. Приблизительно 1 мл полученного прозрачного раствора переносили в стеклянные ампулы, добавляя затем 19,2 мг маннитола и 50 мкл исходного раствора Твин 80 (77 мг Твин 80®, растворенного в 30%-м растворе уксусной кислоты). Раствор замораживали в течение нескольких минут при -40°С и подвергали лиофилизации в течение 14 ч при давлении 0,06 мбар, затем следовал 6-часовой период после просушки при 0,003 мбар (см. табл. 3).

Таблица 2. Пептиды, использованные для примера 1

№ пептидной последовательности (8ЕО Ю N0:)	Пептид	Содержание пептида (%)	Количество [мг]	Растворитель [мл]
4	1МА-СС1М-001	95,5	16,65	7,57 (50% НАС)
6	1МА-611С-001	88,8	17,72	7,50 (90% НАС)
3	ΙΜΑ-ΑϋΕ-001	91,7	17,35	7,58 (10% НАС)
2	1МА-АЭР-002	94,0	16,95	7,58 (10% НАС)
10	ΙΜΑ-ΚΘ8-001	89,4	17,66	1,50(10% НАС)
8	ΙΜΑ-ΜΕΤ-001	91,8	17,68	1,55 (50% НАС)
9	1МА-М11С-001	90,6	17,84	1,54 (10% НАС)
1	ΙΜΑ-ΜΜΡ-001	89,6	17,92	1,53 0Л/Р1)
4	1МА-АРО-001	92,1	17,76	1,56 (ννΡΙ)
7	ΙΜΑ-Κ67-001	92,4	17,22	1,52 (ννΤΙ)

Таблица 3. Лиофилизационные параметры для примера 1

Обработка	Время	Вакуум	Температура
Заморозка	3:00	атм.	-40°С
Первичная просушка	0:10	0,06 мбар	-39°С
Первичная просушка	3:00	0,06 мбар	-20°С
Первичная просушка	10:00	0,06 мбар	+0°С
Первичная просушка	6:00	0,06 мбар	+20°С
Вторичная просушка	3:00	0,003 мбар	+20°С
Вторичная просушка	6:00	0,003 мбар	+25°С

- 20 017492

Пример 2. Был создан лот СМР (надлежащая практика организации производства), содержащий 2000 ампул с 578 мкг отдельного пептида на ампулу плюс маннитол и Полоксамер 188. Композиция включает пептиды, маннитол и Полоксамер 188 в соотношении 1:5:2 [по весу].

Каждый отдельный пептид был взвешен в соответствии с количествами, приводимыми в табл. 4, в отдельных стеклянных сосудах. После взвешивания все пептиды были растворены в специфицированном растворителе.

Таблица 4. Пептиды, использованные для примера 2

№ пептидной последовательности (8Е0 Ю ΝΟ:)	Пептид	Количество нетто [мг]	Содержание пептида [%]	Количество брутто [мг]	Растворитель [мл]
4	1МА-ССЫ-001	1156,00	91,6%	1262,01	550 (50% НАс)
6	1МА-РСЗ-001	1156,00	83,2%	1389.42	110 (10% НАс)
3	1МА-еис-оо1	1156,00	92,9%	1244,35	550 (90% НАс)
2	ΙΜΑ-ΜΕΤ-001	1156,00	92,6%	1248,38	110 (50% НАС)
10	ΙΜΑ-ΑϋΡ-001	1156,00	93,3%	1239,01	540 (10% НАс)
8	1МА-АЦЕ-СЮ2	1156,00	95,5%	1210,47	540 (10% НАс)
9	1МА-мис-оо1	1156,00	87,2%	1325,69	110(10% НАС)
1	ΙΜΑ-ΜΜΡ-001	1156,00	88,6%	1304,74	110 (УУР1)
4	1МД-АРО-001	1156,00	95,0%	1216,84	110 <ννρι>
7	ΙΜΑ-Κ67-001	1156,00	88,3%	1309,17	110 (УУЕ1)

Из-за различной растворимости пептидов их необходимо растворять в соответствии с порядком, представленным в табл. 4, начиная с пептида 1. Для растворения пептидов были использованы различные количества и концентрации раствора уксусной кислоты и инъекционной воды (^ΡΙ) из-за различий в растворимости пептидов и с учетом окончательного объема наполнения основного объема раствора. Для улучшения растворимости каждую ампулу сильно встряхивали в течение максимум 5 мин и при необходимости обрабатывали ультразвуком в течение максимум 5 мин. Количества и концентрации для использования приводятся также в табл. 4.

После того как пептиды без труда были растворены, растворы необходимо смешать в порядке, приведенном в табл. 4, начиная с пептида номер 1. Растворы помещаются в стерильный стеклянный контейнер. Отдельные ампулы для пептидов промывают раствором 105 мл уксусной кислоты (30%). В заключение этот раствор добавляют в смесь пептидного раствора и перемешивают в течение 5 мин.

В пептидную смесь добавляли 23,1 г Полоксамера 188 (Лутрол Ρ68®) и 57,8 г маннитола и весь раствор перемешивали в течение 5 мин.

Основной объем раствора, содержащий все 10 пептидов и эксципиенты, был стерильно профильтрован через фильтр с размером пор 0,22 мкм. 1,485 мл раствора заливали в стерильные стеклянные ампулы 2Р в стерильных условиях и в инертной азотной атмосфере, укупоривали и переносили в лиофильную сушилку для лиофилизации. Процесс лиофилизации (см. табл. 5) включает замораживание ампул при температуре -45°С, постепенное повышение температуры до +20°С (основная фаза сушки) и заключительную стадию сушки при +25°С. По окончании процесса сушки в лиофильной сушилке снова устанавливали атмосферное давление, используя высушенный азот, который был стерильно профильтрован.

Таблица 5

Лиофилизационные параметры для примера 2
№	Стадия	Время [мин]	Т[°С]	Вакуум [мбар]
1	Загрузка	3	-45
2	Замораживание	180	-45
3	Основная сушка	15	-45	1.50Е-01
4	Основная сушка	300	-20	1.50Е-01
5	Основная сушка	480	0	1.50Е-01
6	Основная сушка	360	20	1.50Е-01
7	Основная сушка	60	20	1.50Е-01
8	После сушки	15	2	5.00Е-03
9	После сушки	180	20	5.00Е-03
10	После сушки	120	25	5.00Е-03
11	После сушки	240	25	5.00Е-03
12	Предварительная аэрация	1	25	8.00Е+02
13	Укупорка	5	25	8.00Е+02
14	Аэрация Ν₂	1	25	1.00Е+03
15	Хранение	3	5	1.00Е+03

- 21 017492

Процедура повторного растворения: Для клинических исследований описанную выше композицию растворяют в 700 мкл гидрокарбоната натрия (4,2%) по следующей инструкции. Снимите пластиковую крышку с одной ампулы. Распакуйте и удалите гидрокарбонат натрия (4,2%) из холодильника по меньшей мере за 30 мин до перерастворения, чтобы довести его до комнатной температуры до начала инъекции. Приготовьте шприц и иглу для восстановления. Применяйте асептическую технику для взятия 700 мкл разбавителя для восстановления лиофилизата. Чтобы растворить лиофилизат, ампулу и разбавитель следует сильно встряхивать в течение 1 мин, проверить, прозрачен ли раствор, в противном случае продолжить встряхивание в течение еще одной минуты, пока раствор не станет прозрачным. 10-30 мин спустя после инъекции ГМ-КСФ используйте новый шприц для введения ί.ά. 500 мкл восстановленной композиции в то же место. Введение раствора должно происходить в течение 1 ч после восстановления. Растворенный лиофилизат может храниться в асептических условиях при комнатной температуре в течение до 1 ч со времени восстановления.

Контроль стабильности после восстановления показал, что большинство пептидов остаются достаточно устойчивыми после восстановления. Однако произошло снижение в случае двух специфических пептидов, т.е. IΜΑ-ССN-001 и ΙΜΑ-Κ68-001 (см. табл. 6). Так как эти пептиды содержат остаток цистеина, то произошла вызванная временем димеризация.

Таблица 6. Результаты анализа на ВЭЖХ для стабильности в использовании после восстановления 4,2% раствором гидрокарбоната натрия. Сравнение композиций с эксципиентами и без них

Пептид	Композиция	Начален,*	1 ч	2ч	Зч	4ч	5 ч	6 ч
АОЕ-001	без эксципиентов	100,0	102,4	102,4	100,0	не спред.	не опред.	ме опред.
	+ маннитол/лутрол	100,0	09,6	99,6	100,7	100,8	99,9	101,8
АОГ-002	без эксципиентов	100,0	100,9	100,0	97,2	не опред.	не опред.	не опред.
	+ маннитол/лутрол	100,0	99,9	100,0	101,1	101,2	99,9	101,9
АРО-001	без эксципиентов	100,0	100,0	97,4	97,4	не опред.	не опред.	не опред.
	+ маннитол/лутрол	100,0	99,8	99,8	100,7	100,9	99,6	101,5
ССЫ-001	без эксципиентов	100,0	82.8	72,1	63,3	не опред.	не опред.	не опред.
	+ маннитол/лутрол	100,0	95,6	92,2	91,3	89,2	86,1	85,9
сис- 001	без эксципиентов	100,0	100,0	100,0	98,6	не опред.	не опред.	не опред..
	+ маннитол/лутрол	100,0	99,7	99,5	100,6	100,8	99,7	101,6
К67-001	без эксципиентов	100,0	100,8	99,2	97,5	не опред.	не опред.	не опред.
	+ маннитол/лутрол	100,0	99.8	100,4	101,6	101,8	100,6	102,5
МЕТ-001	без эксципиентов	100,0	100,0	99,2	96,7	не опред.	ие опред.	не опред.
	+ маннитол/лутроп	100,0	99,8	99,8	101,0	101,1	99,8	101,7

ММР- 001	без эксципиентов	100,0	98.6	97.1	95.7	не опред	не опред	не опред.
	+ маннитол/лутрол	100,0	99,5	99,3	100,2	100,4	98,9	100,9
мис- 001	без эксципиентов	100,0	100,В	99,2	96,6	не опред.	не опред.	не опред.
	+ маннитол/лутрол	100,0	99,8	99,6	100,6	100,6	99,5	101,3
КС5-001	без эксципиентов	100,0	90,9	77,8	64,6	не опред.	не опред.	не опред.
	+ маннитол/лутрол	100,0	97,9	95,5	94,2	91,6	88,0	86,8

* Начальный объем: 100%. Первая ВЭЖХ производится после перерастворения.

Влияние различных факторов рН (около рН 8,5) и высокопроизводительного карбонатного буфера на успех пептидных иммунизации было измерено на модели с мышами. Используя стандартную иммуногенную модель пептида в различных инъекционных растворах, была протестирована эффективность прайминга с помощью стандартного анализа с ⁵¹Сг. Результаты были подтверждены способом проточной цитометрии после окрашивания тетрамера. Итак, не было обнаружено значительных различий в эффективности прайминга среди внутрикожных иммунизаций при рН 7,5; 8,5 (рН разбавителя ΙΜΑ901) и рН 9,5.

И дополнительно, высокая ионная сила не снижала наблюдаемые иммунные ответы в сравнении с изотоническим инъекционным буфером. При иммунизациях инъекционным раствором с рН 7,5 и 8,5 и разбавителем ΙΜΑ901 токсических побочных эффектов не наблюдалось, но они проявлялись в случае инъекционного раствора с рН 9,5 (локальные некротические повреждения кожи на месте введения). Данные результаты подтверждают пригодность выбранного буфера в качестве подходящего разбавителя для ΙΜΑ901.

Пример 3. Исходные растворы каждого отдельного пептида были приготовлены путем растворения пептидов в подходящих растворителях в соответствии с их характеристиками растворимости (см. табл. 6).

- 22 017492

Таблица 6. Пептиды, использованные для примера 3

№ пептида	Пептид	Чистота пептида (%)	Количество [мг]	Растворитель [мл]
23	ΙΜΑ-СН1-001	99,7	23,19	11,560 (90%НАс)
15	ΙΜΑ-ΡΑΒΡ7-001	92,0	25,13	4,624 (90%НАс)

17	ΙΜΑ-ΜΕΤ-005	93,1	24,83	3,853 (50%НАс)
13	ΙΜΑ-ΝΙ_ΘΝ4Χ-001	90,3	25,60	5,780 (50%НАс)
22	ΙΜΑ-ΤΝΟ-001	94,0	24,60	5,780 (30%НАс)
20	ΙΜΑ-ΡΤΡ-003	96,3	24,01	2,890 (20%НАс)
12	1МА-ВСА-002	97,7	23,66	3,303 (10%НАс)
13	ΙΜΑ-ΒΙΚ-002	96,0	24,08	2,312 (10% НАс)
14	1МА-СЗР-001	93,1	23,57	5,780 (10%НАс)
16	ΙΜΑ-ΙΘΕ2ΒΡ3-001	94,6	24,44	2,890 (10%НАс)
19	ΙΜΑ-ΝΡΟΑΜ-ΟΟΙ	96,0	24,08	2,312 (10% НАс)
21	ΙΜΑ-ΡΤΡ-005	97,0	23,84	2,312 (10%НАс)
11	1МА-НВУ-001	99,0	23,35	4,624 (УУЕ1)
	Промывочный объем	-/-	-/-	1,800 (30%НАс)
	Объем наполнения		-/-	0,180 (ννΠ)

Из-за различной растворимости пептидов их необходимо растворять в соответствии с порядком, представленным в табл. 4, начиная с пептида 1. Для растворения пептидов были использованы различные количества и концентрации раствора уксусной кислоты и инъекционной воды (\УБ1) из-за различий в растворимости пептидов и с учетом окончательного объема наполнения основного объема раствора. Для улучшения растворимости каждую ампулу сильно встряхивали в течение максимум 5 минут и при необходимости обрабатывали ультразвуком в течение максимум 5 мин. Количества и концентрации для использования приводятся также в табл. 6.

После того как пептиды без труда были растворены, растворы необходимо смешать в порядке, приведенном в табл. 6, начиная с пептида № 1. Растворы помещаются в стеклянный контейнер, снабженный магнитной мешалкой. В заключение этот раствор добавляют в смесь пептидного раствора и перемешивают по меньшей мере в течение 5 мин.

В пептидную смесь добавляли 601,1 мг Полоксамера 188 (Лутрол Б68®) и 1502,8 мг маннитола и весь раствор перемешивали в течение 5 мин.

Основной объем раствора, содержащий все 13 пептидов и эксципиенты, был стерильно профильтрован через фильтр с размером пор 0,22 мкм. 1,500 мл раствора заливали в стеклянные ампулы 2К, укупоривали и переносили в лиофильную сушилку для лиофилизации. Процесс лиофилизации (см. табл. 7) включает замораживание ампул при температуре -45°С, постепенное повышение температуры до +20°С (основная фаза сушки) и заключительную стадию сушки при +25°С. Когда сушка была завершена, в лиофильной сушилке снова устанавливали атмосферное давление, используя азот.

Таблица 7. Лиофилизационные параметры для примера 3

№	Стадия	Время [мин]	Т[°С]	Вакуум [мбар]
1	Загрузка	5	-45
2	первичная просушка	10	-45	0.50Е-01
3	первичная просушка	360	-20	0.50Е-01
4	первичная просушка	480	0	0.50Е-01
5	первичная просушка	360	20	0.50Е-01
6	первичная просушка	60	20	0.50Е-01
7	вторичная просушка	15	20	5.00Е-03
3	вторичная просушка	180	20	5.00Е-03
9	вторичная просушка	120	25	5.00Е-03
10	вторичная просушка	240	25	5.00Е-03
11	Аэрация Ν₂	1	25	1.00Е+03
12	Укупорка	5	25	1.00Е+03

- 23 017492

Процедура повторного растворения.

Для клинических исследований описанную выше композицию растворяют в 700 мкл гидрокарбоната натрия (4,2%). Чтобы растворить лиофилизат, ампулу и разбавитель следует сильно встряхивать в течение 1 мин, проверить, прозрачен ли раствор, в противном случае продолжить встряхивание в течение еще одной минуты, пока раствор не станет прозрачным. Введение 500 мкл раствора должно происходить в течение 1 ч после восстановления. Растворенный лиофилизат может храниться в асептических условиях при комнатной температуре в течение до 1 ч со времени восстановления.

Контроль стабильности после восстановления показал, что большинство пептидов оставались достаточно устойчивыми после восстановления (см. табл. 8).

Таблица 8. Результаты анализа на ВЭЖХ для стабильности в использовании после восстановления 4,2% раствором гидрокарбоната натрия. Сравнение композиций с эксципиентами и без них

Пептид		Начальн/	2ч	4ч	6 ч
		Пептид [%]	Пептид [%]	Пептид [%]	Пептид ί%)
ΝΚΟΑΜ-001	+ маннитол/лутрол	100,0	99,9	100,0	99,5
	без эксципиентов	100,0	99,8	100.2	95,6
ΒΙΚ-002	+ маннитол/лутрол	100,0	100,8	101,2	100,9
	без эксципиентов	100,0	100,6	101,4	96,2
СЗР-ОО1	4 маннитол/лутрол	100,0	100,0	100,1	99,6
	без эксципиентов	100,0	99,2	99,7	95,0
РТР-003	+ маннитол/лутрол	100,0	100,3	100,5	100,1
	без эксципиентов	100,0	100,4	100,9	96,1
ЮР2ВРЗ-001	+ маннитол/лутрол	100,0	100,4	100,6	100,7
	без эксципиентов	100,0	100,0	101,2	96,0
РТР-005	4 маннитол/лутрол	100,0	100,1	100,3	99,8
	без эксципиентов	100,0	99,9	100.4	95,8
ΤΝΟ-ΟΟΙ	4 маннитол/лутрол	100,0	100,5	100,6	100,2
	без эксципиентов	100,0	100,0	100,4	95,7
МЕТ-005	4 маннитол/лутрол	100,0	100,5	100,7	100,4
	без эксципиентов	100,0	100,3	1007	96,0
РАВР7-001	4 маннитол/лутрол	100.0	100,9	100,7	100,6
	без эксципиентов	100,0	100,5	100,9	96_Ψ3
ΝΙ-ΘΝ4Χ-001	4 маннитол/лутрол	100,0	100,8	100,9	100,5
	без эксципиентов	100,0	99,9	100,5	95,7
ΗΒν-001	4 маннитол/лутрол	100,0	100,3	100,6	100,3
	без эксципиентов	100,0	100,2	100,6	95,8
СН1-001	4 маннитол/лутрол	100,0	100,0	100,7	100,2
	без эксципиентов	100,0	102,2	101,3	90,6
ВСА-002	4 маннитол/лутрол	100,0	99,8	99,6	98,9
	без эксципиентов	100,0	99,9	100,1	95,4

Пример 4. Исходные растворы каждого отдельного пептида были приготовлены путем растворения пептидов в подходящих растворителях в соответствии с их характеристиками растворимости (см. табл. 9).

- 24 017492

Таблица 9. Пептиды, использованные для примера 4

№ пептидной последовательности (5ЕО Ю ΝΟ)	Пептид	Чистота пептида (%)	Количество [мг]	Растворитель [мл]
23	ΙΜΑ-ΡΑΒΡ7-001	92,0	28,27	4,335 (90%НАс)
15	ΙΜΑ-ΜΕΤ-005	94,0	27,67	4,335 (50%НАс)
17	ΙΜΑ-ΝΙ-ΘΝ4Χ-001	91,0	28,58	6,503 (50%НАс)
18	ΙΜΑ-ΤΝΟ-001	94,0	27,67	3,251 (50%НАс)
22	ΙΜΑ-ΡΤΡ-003	97,0	26,81	3,251 (20%НАс)
20	1МА-ВСА-002	98,0	26,54	3.251 (10%НАс)
12	ΙΜΑ-ΒΙΗ-002	96,0	27,09	3,251 (10%НАс)
13	1МА-С5Р-001	91,0	28,58	5,202 (10%НАс)
14	ΙΜΑ-Ι6Ρ2ΒΡ3-001	95,0	27.38	5,202 (10%НАс)
10	1МА-ЫРСАМ-001	96.0	26,54	3,251 (10%НАс)
19	ΙΜΑ-ΡΤΡ-005	97,0	26,81	3,251 (10%ЦАс)
21	1МА-НВУ-001	99,0	26,27	5,202 0Λ/ΡΙ)
	Промывочный объем			3,375 (30%НАс)
	Объем наполнения			13,839 ΟΛ/ΡΙ)

Из-за различной растворимости пептидов их необходимо растворять в соответствии с порядком, представленным в табл. 4, начиная с пептида 1. Для растворения пептидов были использованы различные количества и концентрации раствора уксусной кислоты и инъекционной воды (^ΡΙ) из-за различий в растворимости пептидов и с учетом окончательного объема наполнения основного объема раствора. Для улучшения растворимости каждую ампулу сильно встряхивали в течение максимум 5 мин и при необходимости обрабатывали ультразвуком в течение максимум 5 мин. Количества и концентрации для использования приводятся также в табл 9.

После того как пептиды без труда были растворены, растворы необходимо смешать в порядке, приведенном в табл. 9, начиная с пептида с 8ЕЦ ΙΌ N0: 23. Растворы помещаются в стеклянный контейнер, снабженный магнитной мешалкой. В заключение этот раствор добавляют в смесь пептидного раствора и перемешивают по меньшей мере в течение 5 мин.

В пептидную смесь добавляли 62 4,2 мг Полоксамера 188 (Лутрол Ρ68®) и 1560,6 мг маннитола, и весь раствор перемешивали в течение 5 мин.

Основной объем раствора, содержащий все 12 пептидов и эксципиенты, был стерильно профильтрован через фильтр с размером пор 0,22 мкм. 1,500 мл раствора заливали в стеклянные ампулы 2В, укупоривали и переносили в лиофильную сушилку для лиофилизации. Процесс лиофилизации (см. табл. 10) включает замораживание ампул при температуре -45°С, постепенное повышение температуры до +20°С (основная фаза сушки) и заключительную стадию сушки при +25°С. Когда сушка была завершена, в лиофильной сушилке снова устанавливали атмосферное давление, используя сухой азот.

Таблица 10. Лиофилизационные параметры для примера 4

№	Стадия	Время [мин]	Т[°С]	Вакуум [мбар]
1	Загрузка	5	-45
2	первичная просушка	10	-45	0.50Е-01
3	первичная просушка	360	-20	0.50Е-01
4	первичная просушка	480	0	0.50Е-01
5	первичная просушка	360	20	0.50Е-01
6	первичная просушка	60	20	0.50Е-01
7	вторичная просушка	15	20	5.00Е-03
8	вторичная просушка	180	20	5,00 Е-03
9	вторичная просушка	120	25	5,00 Е-03
10	вторичная просушка	240	25	5,00 Е-03
11	Аэрация Ν₂	1	25	1.00Е+03
12	Укупорка	5	25	1.00Е+03

Контроль стабильности при различных температурах показал, что все пептиды достаточно устойчивы даже в стрессовых (+25°С) условиях (см. табл. 11).

- 25 017492

Таблица 11. Результаты анализа на ВЭЖХ для стабильности пептидов в композиции при +25°С+/- 2°С в течение 3 месяцев

Пептид	Начален. [%]	1 М [% от начален ]	2 М [% от начален]	3 М [% от начален]
ИКСАМ-001	100,0	97,90	96,73	97,59

ΒΙΚ-002	100,0	97,49	96,24	98,93
С8Р-001	100,0	98,04	96,99	98,71
РТР-003	100,0	98,29	97,11	98,29
ΙΘΕ2ΒΡ3-001	100,0	98,01	96,77	97,34
РТР-005	100,0	98,16	97,10	98,30
ТИС-001	100,0	97,86	96,80	97,21
МЕТ-005	100,0	97,49	96,13	97,21
РАВР7-001	100,0	98,43	97,71	98,67
И1ЛЗИ4Х-001	100,0	97,90	96,30	96,41
НВУ-001	100,0	97,83	96,47	97,50
ВСА-002	100,0	98,20	97,05	97,88

Таблица 12. Результаты анализа на ВЭЖХ для стабильности пептидов в композиции при +5°С+/-3°С в течение 3 месяцев

Пептид	Начален. {%]	1 М [% от начален.)	2 М (% от начален.)	3 М [% от начален.)
ИКСАМ-001	100,0	99,13	98,17	98,79
ΒΙΚ-Ό02	100,0	98,53	97,28	100,01
С8Р-001	100,0	98,99	98,05	99,81
РТР-003	100,0	99,07	97,95	98,68
ЮР2ВРЗ-001	100,0	99,00	97,92	98,57
РТР-005	100,0	98,93	97,79	98,67
ТИС-001	100,0	99,02	98,10	98,72
МЕТ-005	100,0	99,06	97,92	98,59
РАВР7-001	100,0	99,08	98,15	98,66
ΝΙ.6Ν4Χ-001	100,0	99,12	98,24	98,84
ΗΒν-001	100,0	98,87	97,76	98,47
ВСА-002	100,0	99,13	98,04	98,73

Таблица 13. Результаты анализа на ВЭЖХ для стабильности пептидов в композиции при -20°С+/-5°С в течение 3 месяцев

Пептид	Начален. [%]	1 М [% от начален.)	2 М [% от начален.)	3 М [% от начален.)
ИКСАМ-001	100,0	99,23	97,86	98,91
ВИЧ-002	100,0	98,43	96,98	100,14
С5Р-001	100,0	98,99	97,61	99,61
РТР-003	100,0	99,11	97,48	98,57
1СР2ВРЗ-001	100,0	99,10	97,54	98,42
РТР-005	100,0	98,99	97,41	98,34

ТИС-001	100,0	99,01	97,61	98,57
МЕТ-005	100,0	99,14	97,54	99,00
РАВР7-001	100,0	99,09	97,60	98,39
ИЮИ4Х-001	100,0	99,05	97,60	98,62
ΗΒν-001	100,0	98,93	97,39	98,34
ВСА-002	100,0	99,17	97,61	98,61

- 26 017492

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Фармацевтическая композиция, включающая 2-18, предпочтительно 2-15, более предпочтительно 2-13, еще более предпочтительно 2-12 пептидов и еще более предпочтительно 3-12 опухолеассоциированных пептидов;

где каждый пептид имеет длину 8-22 аминокислот, предпочтительно 9-16 аминокислот;

где указанные пептиды проявляют растворимость в 90% уксусной кислоте, составляющую по меньшей мере 2,7 мг/мл;

маннитол и полоксамер 188, где весовое соотношение указанного(ых) пептида(ов), маннитола и полоксамера 188 находится в пределах значений от 1:5:1,5 до 1:8:2,2 включительно; или маннитол и Твин (Тетееп) 80®, где весовое соотношение пептидов, маннитола и Твин (Тетееп) 80® находится в пределах значений от 1:2:1,5 до 1:8:2,2 включительно.
2. Фармацевтическая композиция по п.1, где указанное весовое соотношение пептидов, маннитола и полоксамера 188 находится в пределах значений от 1:0:2 до 1:0:2,2 включительно.
3. Фармацевтическая композиция по п.1, включающая по меньшей мере два пептида, где указанные пептиды включают аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из 8ЕО ΙΌ N0: 1-10 или 8ЕО ΙΌ N0: 12-23; при условии, что композиция включает по меньшей мере один пептид, включающий последовательность 8Е0 ΙΌ N0: 1, 8Е0 ΙΌ N0: 2, 8Е0 ΙΌ N0: 12 или 8Е0 ΙΌ N0: 13 или их вариант или соль; и дополнительно включающая маннитол и полоксамер 188, где весовое соотношение пептидов, маннитола и полоксамера 188 находится в пределах значений от 1:5:1,5 до 1:8:2,2 включительно.
4. Фармацевтическая композиция по п.3, где весовое соотношение пептидов, маннитола и полоксамера 188 находится в пределах значений от 1:0:2 до 1:0:2,2 включительно.
5. Фармацевтическая композиция по п.1, включающая по меньшей мере два пептида, где указанные пептиды включают аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из 8Е0 ΙΌ N0: 1-10 или 8Е0 ΙΌ N0: 12-23; при условии, что композиция включает по меньшей мере один пептид, включающий последовательность 8Е0 ΙΌ N0: 1, 8Е0 ΙΌ N0: 2, 8Е0 ΙΌ N0: 12 или 8Е0 ΙΌ N0: 13, или их вариант или соль; и дополнительно включающая маннитол и Твин (Тетееп) 80®, где весовое соотношение пептидов, маннитола и Твин (Тетееп) 80® находится в пределах значений от 1:2:1,5 до 1:8:2,2 включительно.
6. Фармацевтическая композиция по любому из пп.1-5, где указанные пептиды обладают общей длиной 9-16 аминокислот.
7. Фармацевтическая композиция по любому из пп.1-6, где по меньшей мере один из указанных пептидов содержит непептидные связи.
8. Фармацевтическая композиция по любому из пп.1-7, где указанная композиция включает пептиды, состоящие из аминокислотных последовательностей, представленных в 8Е0 ΙΌ N0: 1 и/или 8Е0 ΙΌ N0: 2, и дополнительно включает по меньшей мере один пептид, состоящий из аминокислотной последовательности, представленной в любой из 8Е0 ΙΌ N0: 3-10.
9. Фармацевтическая композиция по любому из пп.1-8, где указанная композиция включает пептиды, состоящие из аминокислотных последовательностей, представленных в 8Е0 ΙΌ N0: 12 и/или 8Е0 ΙΌ N0: 13, и дополнительно включает по меньшей мере один пептид, состоящий из аминокислотной последовательности, представленной в любой из 8Е0 ΙΌ N0: 14-23.
10. Фармацевтическая композиция по любому из пп.1-9, дополнительно включающая пептид, включающий аминокислотную последовательность, представленную в 8Е0 ΙΌ N0: 11, при условии, что указанный пептид не является соответствующим опухолеассоциированным полипептидом полной длины, предпочтительно дополнительно включающая пептид, состоящий из аминокислотной последовательности, представленной в 8Е0 ΙΌ N0: 11.
11. Фармацевтическая композиция по любому из пп.1-10, где количества пептидов, присутствующих в композиции, являются ткане- и/или раковоспецифическими.
12. Фармацевтическая композиция по любому из пп.1-11, дополнительно включающая по меньшей мере один подходящий адъювант.
13. Применение фармацевтической композиции по любому из пп.1-12 в качестве противораковой вакцины.
14. Набор, включающий:

(a) контейнер, содержащий фармацевтическую композицию по любому из пп.1-13 в виде раствора или в лиофилизованной форме;

(b) необязательно, второй контейнер, содержащий разбавитель или восстанавливающий раствор для указанной лиофилизованной композиции и/или по меньшей мере один адъювант; и (c) инструкцию(и) по (ί) использованию раствора или (ίί) восстановленного раствора и/или по использованию указанной лиофилизованной композиции.
15. Набор по п.14, дополнительно включающий один или более (ί) буфер, (ίί) разбавитель, (ίίί) фильтр, (ίν) иглу и (ν) шприц.