EA032437B1

EA032437B1 - Композиция опухолеассоциированных пептидов и относящаяся к ним противораковая вакцина для лечения глиобластомы (gbm) и других видов рака

Info

Publication number: EA032437B1
Application number: EA201401104A
Authority: EA
Inventors: Оливер Шоор; Норберт Хильф; Тони Вайншенк; Клаудия Траутвайн; Штеффен Вальтер; Харприт Сингх
Original assignee: Имматикс Байотекнолоджиз Гмбх
Priority date: 2008-10-01
Filing date: 2009-09-28
Publication date: 2019-05-31
Also published as: PT2341927T; PT3132801T; HRP20182151T1; HRP20200722T1; PT2172211E; UA110599C2; ES2788129T8; US10047124B2; SI2341927T1; UA125277C2; CY1121258T1; HUE030296T2; US8961985B2; RS53782B1; CA2936887C; EP2172211A1; JP6150859B2; ES2770090T3; US20100158931A1; EP3120869B1

Abstract

Настоящее изобретение относится к иммунотерапевтическим пептидам и их применению в иммунотерапии, в частности иммунотерапии рака. Настоящее изобретение раскрывает опухолеассоциированные пептидные эпитопы Т-хелперных клеток, в отдельности или в комбинации с другими опухолеассоциированными пептидами, которые служат как активные фармацевтические ингредиенты для композиций вакцины, которая стимулирует противоопухолевые иммунные ответы. В частности, композиция пептидов настоящего изобретения может быть использована в вакцинных композициях для инициации противоопухолевых иммунных ответов против глиомы.

Description

В соответствии с целями настоящего изобретения все цитаты описания включены в их целостности путем ссылки.

Уровень техники

Глиомы являются опухолями головного мозга, возникающими из глиальных клеток нервной системы. Глиальные клетки, называемые обычно нейроглия или просто глия, являются не нейрональными клетками, которые обеспечивают поддержку и питание, поддерживают гомеостаз, формируют миелин и участвуют в передаче сигналов в нервной системе. Две наиболее важные подгруппы глиом - это астроцитомы и олигодендроглиомы, называемые в соответствии с видами нормальных глиальных клеток, из которых они образуются (астроциты или олигодендроциты соответственно). Относящаяся к подгруппе астроцитом мультиформная глиобластома (называемая далее глиобластомой) является наиболее распространенной злокачественной опухолью головного мозга взрослых людей и на ее счет приходится прибл. 40% всех злокачественных опухолей головного мозга и прибл. 50% глиом. Она агрессивно поражает центральную нервную систему и имеет наивысший уровень злокачественности (степень IV) среди всех глиом. Хотя наблюдается постоянный прогресс в их лечении благодаря усовершенствованию нейровизуализации, микрохирургии, различным возможностям лечения, таким как темозоломид или облучение, глиобластомы остаются неизлечимыми. Процент летальных исходов при этой опухоли головного мозга очень высок: средняя ожидаемая продолжительность жизни после постановки первого диагноза составляет 9-12 месяцев. 5-летний срок выживаемости в течение периода наблюдения с 1986 по 1990 г. составил 8,0%. На данный момент пятилетний срок выживаемости вследствие агрессивной терапии, включая макроскопическое удаление опухоли, все еще ниже 10%. Соответственно, существует высокая потребность медицины в альтернативном и эффективном методе лечения.

Опухолевые клетки глиобластомы являются наиболее недифференцированными среди опухолей головного мозга, так что опухолевые клетки имеют высокий потенциал для миграции и пролиферации и являются высокоинвазивными, приводя к очень неутешительному прогнозу. Глиобластомы приводят к смерти из-за быстрого, агрессивного и инфильтрирующего роста в головном мозге. Паттерны инфильтрирующего роста являются причиной нерезектабельности этих опухолей. Глиобластомы также относительно резистентны к облучению и химиотерапии, и поэтому высок процент рецидивов после лечения. Кроме того, иммунный ответ на неопластические клетки довольно неэффективен для полного устранения всех неопластических клеток после резекции и лучевой терапии.

Глиобластома подразделяется на первичную глиобластому (бе ηονο) и вторичную глиобластому в зависимости от различий в генном механизме во время злокачественной трансформации недифференцированных астроцитов или глиальных клеток-предшественников. Вторичная глиобластома возникает в более молодом возрасте, до 45 лет. В течение 4-5 лет, в среднем, вторичная глиобластома развивается из астроцитомы низкой степени, проходя стадию недифференцированной астроцитомы. Первичная глиобластома, напротив, возникает в более пожилом возрасте, в среднем это 55 лет. В целом, первичная глиобластома возникает как молниеносная глиобластома, характеризуясь прогрессированием опухоли в течение 3 месяцев, начиная с состояния без клинических или патологических отклонений.

Глиобластома мигрирует вдоль миелинизированных нервов и широко распространяется по центральной нервной системе. В большинстве случаев хирургическое вмешательство приводит лишь к ограниченно устойчивому терапевтическому эффекту.

Злокачественные клетки глиомы ускользают от обнаружения иммунной системой хозяина за счет выработки иммуноподавляющих веществ, которые наносят вред пролиферации Т-клеток и выработке иммуностимулирующего цитокина ИЛ-2.

Внутричерепные неоплазмы могут возникнуть из любых структур или видов клеток, присутствующих в ЦНС, включая головной мозг, мягкие мозговые оболочки, мозговой придаток, череп и даже остаточную эмбриональную ткань. Общая ежегодная частота заболеваемости первичными опухолями головного мозга в Соединенных Штатах составляет 14 случаев на 100.000. Наиболее распространенные первичные опухоли головного мозга - менингиомы, составляющие 27% всех первичных опухолей головного мозга, и глиобластомы, составляющие 23% всех первичных опухолей головного мозга (причем на счет глиобластомы приходятся 40% всех случаев злокачественных опухолей головного мозга взрослого населения). Многие из этих опухолей агрессивны и имеют высокую степень злокачественности. Первичные опухоли головного мозга являются наиболее распространенными солидными опухолями у детей и второй по частоте причиной смерти от рака после лейкемии у детей.

Поиск методов эффективного лечения пациентов от глиобластом продолжается и сейчас. Была изучена иммунотерапия или лечение посредством стимуляции иммунной системы, в целях борьбы с данны- 1 032437 ми неопластическими клетками. Первые обнадеживающие результаты были получены Νογ11ι\\ό81 Тйегареийск с использованием препарата ЭСУах Вташ для лечения глиобластомы в рамках иммунотерапевтических исследований с человеческими пациентами, в которых могли быть индуцированы антигенспецифические ответы ЦТЛ, приводившие к увеличению средних сроков выживаемости в сравнении с теми, что были получены с применением стандартных методов лечения, сопровождаемых минимальной токсичностью (НетЬетдет е! а1., 2006).

Колоректальная карцинома.

По данным Американского общества по борьбе с раком колоректальный рак (КРР) занимает третье место по частоте распространения в США, это заболевание поражает ежегодно более 175.000 новых пациентов. В США, Японии, Франции, Германии, Италии, Испании и Великобритании оно поражает более 480.000 пациентов. Это одна из наиболее частых причин смертности от рака в развитых странах. Исследователи предполагают, что возникновение колоректального рака является результатом взаимодействия между наследственными факторами и факторами окружающей среды. В большинстве случаев появляются аденоматозные полипы, становясь предшественниками колоректальных опухолей, хотя процесс их перехода в опухоль может занять множество лет. Первостепенный фактор риска для заболевания колоректальным раком - это возраст, в 90% случаев диагноз был поставлен в возрасте более 50 лет. Другие факторы риска заболевания колоректальным раком по данным Американского общества по борьбе с раком включают употребление алкоголя, питание с высоким содержанием жиров и/или сырого мяса и неадекватное потребление фруктов и овощей. Число новых случаев продолжает расти, в особенности на территории таких стран, как Япония, где виновником может быть внедрение западных образцов питания с избыточным потреблением жира и мяса и снижение потребления волокнистой пищи. Несмотря на это частота заболеваемости растет не так быстро, как раньше, что может быть связано с увеличением количества скринингов и удалением полипов, предотвращая, таким образом, прогрессирование заболевания и переход полипов в рак.

Как и при большинстве солидных опухолей, терапия первого ряда - операция, однако только пациенты на ранней стадии могут получить от этого пользу, значительной же доле пациентов диагноз ставится лишь на поздних стадиях заболевания. В химиотерапии колоректального рака на поздних стадиях стандартом лечения являются лечебные схемы, основанные на фторурациле. Большинство данных лечебных схем представляют собой т.н. курсы лечения ЕОЬЕОХ (вливание 5-Ри/лейковорин плюс оксалиплатин) и ЕОЬЕГКГ (иринотекан, лейковорин, болюсное и продолжительное вливание 5-ЕИ).

Внедрение цитотоксических препаратов третьего поколения, таких как иринотекан и оксалиплатин, увеличило надежду на значительное улучшение эффективности, однако прогнозы до сих пор относительно безнадежные. Срок выживаемости при метастатической болезни, как правило, составляет приблизительно 20 месяцев и, в результате этого, остается высокой беспомощность медицины при данном заболевании.

Недавно стало доступным новое поколение медикаментов, действующих на молекулярные мишени, таких как Авастин (Ауакйи) (бевацизумаб) и Эрбитукс (ЕтЬйих) (цетуксимаб), а около 40 соединений находятся на поздней стадии клинических исследований по лечению различных стадий колоректального рака. Комбинации из нескольких таких соединений повышают число потенциальных возможностей лечения, ожидаемых в будущем. Подавляющее большинство веществ находятся на 2 фазе исследований, при этом данные соединения более часто, чем другие разрабатываемые медикаменты против колоректального рака, адресованы против ЕСЕК, (рецептор эпидермального фактора роста), что связано с тем фактом, что у ~80% пациентов с колоректальным раком наблюдается повышенная экспрессия ЕСЕК.

На данный момент проводятся клинические исследования с пациентами II стадии с комбинацией химиотерапии с одобренными недавно моноклональными антителами (шАЬк) (цетуксимаб + иринотекан или ЕОБЕОХ4; бевацизумаб в качестве монотерапии или вместе с ЕОБЕОХ4). Для получения статистически достоверных результатов по данным исследованиям необходимы трех-четырехгодичные периоды наблюдения.

Моноклональные антитела (шАЬк), используемые в настоящее время в онкологии, в целом имеют превосходные шансы на то, что они не будут создавать помех активной иммунотерапии. Действительно, имеются доклинические данные, предполагающие, что элиминация фактора роста эндотелия сосудов УЕСЕ (в случае бевацизумаба) вносит положительный вклад в опосредованную ДК (дендритные клетки) активацию Т-клеток.

Рак предстательной железы и другие опухоли.

Число смертей от рака предстательной железы в 2007 г. составит 27.050, что делает его наиболее частой причиной смерти от рака у мужчин. Несмотря на то, что процент смертности среди белого и афроамериканского населения снижается с начала 1990-х гг., до сих пор число афроамериканских мужчин более чем в два раза превышает число белых мужчин. Рак предстательной железы является наиболее часто диагностируемым видом рака у мужчин. По неизвестным причинам частота заболеваемости значительно выше среди афроамериканцев, чем среди белых мужчин. Частота заболеваемости раком предстательной железы постоянно менялась на протяжении последних 20 лет: быстрый рост с 1988 по 1992 г., резкое снижение с 1992 по 1995 г. и умеренный рост с 1995 г. Данные тенденции отражают большей ча

- 2 032437 стью увеличение числа обследований на рак предстательной железы с помощью анализа крови на простатспецифический антиген (Р8А). Умеренный рост частоты заболеваемости за последнее десятилетие связан, скорее всего, с распространенным скринингом Р8Л среди мужчин моложе 65 лет. Частота заболеваемости раком предстательной железы стабилизируется у мужчин 65 лет и старше. Число случаев достигло своего пика для белых мужчин в 1992 г. (237,6 случаев на 100.000 человек) и для афроамериканцев - в 1993 г. (342,8 случаев на 100.000 человек).

Лечение рака предстательной железы может включать внимательное наблюдение, операцию, лучевую терапию, высокоинтенсивный фокусированный ультразвук (ШЕИ), химиотерапию, криохирургию, гормональное лечение или какую-либо комбинацию. Какая из возможностей является наилучшей зависит от стадии заболевания, оценки по шкале Глисона и уровня Р8Л. Другие важные факторы - это возраст мужчины, общее состояние его здоровья и его отношение к возможным способам лечения и побочным эффектам от них. Так как все способы лечения могут иметь побочные эффекты, такие как эректильная дисфункция и недержание мочи, то в центре внимания при дискуссиях о способе лечения часто стоит возможность нахождения баланса между целью лечения и рисками, связанными с изменением стиля жизни.

Если рак распространился за пределы простаты, то возможности для лечения значительно изменяются, так что большинство врачей, лечащих рак предстательной железы, используют множество номограмм для предсказания вероятности распространения. Лечение с использованием внимательного наблюдения, высокоинтенсивного фокусированного ультразвука (ΗΙΕυ), лучевой терапии, криохирургии и операции предлагаются обычно мужчинам, рак которых остается в пределах предстательной железы. Гормональная терапия и химиотерапия часто предусматриваются для лечения заболевания, которое распространилось за пределы простаты. Однако возможны исключения: лучевая терапия может использоваться для некоторых опухолей на поздних стадиях, а гормональная терапия - для опухолей на ранней стадии. Криотерапия, гормональная терапия и химиотерапия могут быть также предложены, если первоначальное лечение было неудачным, и рак прогрессирует.

У значительного числа пациентов с раком предстательной железы, которые подвергаются простатэктомии из-за клинического подозрения на рост внутри органа, окончательное гистологическое обследование операционного материала показывает локально экстенсивное распространение опухоли за пределы органа. Для этих пациентов существует высокий риск быстрого локального рецидива, обнаруживаемого обычно как повышение уровня Р8Л с точки зрения биохимического рецидивирования заболевания. Терапевтические возможности в данной ситуации включают наружную лучевую терапию и гормональную абляцию; однако значимость данных терапевтических подходов, в особенности в отношении продления жизни пациента в долгосрочной перспективе, не подтверждена. Кроме того, необходимо учитывать возможность связанных с лечением осложнений, таких как появление стриктуры уретры (лучевая терапия), потеря полового влечения и импотенция, риск снижения содержания солей кальция в костях в связи с остеопорозом и существенно возросший риск патологической хрупкости костей (гормональная абляция).

Более 90% всех случаев заболевания раком предстательной железы обнаруживаются на локальной и региональной стадиях; 5-летняя относительная выживаемость для пациентов, опухоли которых были диагностированы на этих стадиях, достигает 100%. В течение последних 25 лет 5-летняя выживаемость для всех стадий в целом увеличилась с 69 до примерно 90%. В соответствии с последними данными относительная 10-летняя выживаемость составляет 93%, а 15-летняя - 77%. Разительное увеличение выживаемости, в особенности 5-летней, отчасти связано с ранней постановкой диагноза и улучшениями в лечении. Несмотря на это, сроки выживаемости значительно сокращаются после распространения на другие ткани и органы.

Рак легких.

В 2007 г. ожидаются приблизительно 210.000 новых случаев в США, что составляет около 15% всех диагнозов рака. Частота заболеваемости значительно снижается среди мужчин, с 102 случаев на 100.000 человек в 1984 г. до 78,5 в 2003 г. Среди женщин частота заболеваемости стабилизировалась после долгого периода роста. В целях лечения рак легких классифицируется клинически на мелкоклеточный (13%) или не мелкоклеточный (87%).

Рак легких является наиболее частой причиной смертности от рака как среди мужчин, так и среди женщин. Около 160.390 смертей, составляющих приблизительно 29% всех летальных исходов от рака, произошли в 2007 г. Начиная с 1987 г. от рака легких ежегодно умирало больше женщин, чем от рака молочной железы. Число смертей среди мужчин значительно снижалось в период с 1991 по 2003 гг., примерно на 1,9% ежегодно. Смертность от рака легких среди женщин сохраняется на неизменном уровне после продолжительного роста на протяжении нескольких десятилетий. Данные тенденции по смертности от рака легких отражают снижение числа курящих на протяжении последних 30 лет.

Вид лечения определяется типом (мелкоклеточный или немелкоклеточный) и стадией ракового заболевания и включают хирургическое вмешательство, лучевую терапию, химиотерапию, а также нацеленные биологические терапии, такие как бевацизумаб (Ауакйп®) и эрлотиниб (Татсеуа®). Для локализованного рака в качестве терапии обычно выбирается операция. Последние исследования указывают на

- 3 032437 то, что выживаемость с немелкоклеточным раком легких ранней стадии улучшается, если за операцией следует химиотерапия. Так как на момент своего обнаружения заболевание обычно распространилось, часто используются лучевая терапия и химиотерапия, иногда в сочетании с операцией. Химиотерапия в отдельности или в сочетании с лучевой терапией является стандартным лечением, выбираемым для мелкоклеточного рака легких; при данной схеме лечения большой процент пациентов испытывает ремиссию, которая в некоторых случаях бывает продолжительной.

Одногодичная относительная выживаемость для рака легких слегка возросла с 37% в 1975-1979 гг. до 42% в 2002 г. во многом благодаря усовершенствованиям в хирургической технике и комбинированным способам лечения. Однако 5-летний срок выживаемости для всех стадий в целом составил лишь 16%. Процент выживаемости для всех случаев, обнаруживаемых, когда заболевание все еще локализовано, составляет 49%; однако только 16% всех случаев рака легких диагностируются на этой ранней стадии.

Таблица 1 Предполагаемое количество случаев заболевания раком и смертей в зависимости от пола для США в 2007 г. (данные Ашепсап Сапсег 8ос1е1у - Американское общество по борьбе с раком. Сапсег Тас18 & Т1§иге8 2007. А11ап1а: Ашепсап Сапсег 8ос1е!у; 2007)

М[есто	Предполагаемое число новых случаев	Предполагаемое число смертей
Оба пола	муж.	жен.	Оба пола	муж.	жен.
Глиома и головной	20.500	11.170	9.330	12.740	7.150	5.590
мозг
Молочная железа	180.510	2.030	178.480	40.910	450	40.460
Предстательная	218.890	218.890		27.050	27.050
железа
Пищевод	15.560	12.130	3.430	13.940	10.900	3.040
Толстый кишечник	112.340	55.290	57.050	52.180	26.000	26.180
Почки	51.190	31.590	19.600	12.890	8.080	4.810
Поджелудочная	37.170	18.830	18.340	33.370	16.840	16.530
железа
Плоскоклеточная	1.000.000	η. ά.	η. ά.	п. б.	п. б.	п. б.
карцинома; неоплазмы кожи с участием кератиноцитов Лейкемия	44.240	24.800	19.440	21.790	12.320	9.470
Легкие	213.380	114.760	98.620	160.390	89.510	70.880
Лимфома неХоджкина	63.190	34.210	28.990	18.660	9.600	9.060
Яичник	22.430		22.430	15.280		15.280
Меланома	59.940	33.910	26.030	8.110	5.220	2.890

п.б. = данные отсутствуют.

Таким образом, до сих пор существует потребность в новом, эффективном и безопасном способе лечения глиобластомы, опухоли предстательной железы, рака молочной железы, рака пищевода, рака толстого кишечника, светлоклеточной почечно-клеточной карциномы, рака легких, ЦНС, яичника, меланомы, рака поджелудочной железы, плоскоклеточной карциномы, лейкемии и медуллобластомы, а также других видов опухолей, демонстрирующих гиперэкспрессию сурвивина, который улучшал бы самочувствие пациентов без применения химиотерапевтических средств или других веществ, которые могут вызывать серьезные побочные эффекты.

Детальное описание изобретения

Все термины, используемые здесь, если не указано иное, имеют значения, данные ниже. Термин пептид используется здесь для обозначения серий аминокислотных остатков, связанных друг с другом типично пептидными связями между α-аминными и карбонильными группами смежных аминокислот. Пептиды предпочтительно имеют длину в 9 аминокислот, но могут быть короче - 8 аминокислот в длину, и длиннее - 11 или 13, 14, 15, 16, 17 или 18 аминокислот в длину.

Термин олигопептид используется здесь для обозначения серий аминокислотных остатков, связанных один с другим типично пептидными связями между α-аминными и карбонильными группами смежных аминокислот. Длина олигопептида не особенно важна для изобретения до тех пор, пока в нём сохраняются надлежащие эпитоп или эпитопы. Олигопептиды типично бывают менее чем около 30 аминокислотных остатков в длину и более чем около 14 аминокислот в длину.

Термин полипептид обозначает серии аминокислотных остатков, связанных один с другим типично пептидными связями между α-аминными и карбонильными группами смежных аминокислот. Длина полипептида не особенно важна для изобретения до тех пор, пока сохраняются надлежащие эпитопы. В отличие от терминов пептид или олигопептид, термин полипептид введён для обозначения

- 4 032437 молекул, содержащих более приблизительно 30 аминокислотных остатков.

Пептид, олигопептид, белок или полинуклеотид, кодирующий для такой молекулы, является иммуногенным (и, таким образом, иммуногеном в рамках настоящего изобретения), если он способен индуцировать иммунный ответ. В случае настоящего изобретения иммуногенность получает более специфическое определение как способность индуцировать Т-клеточный ответ. Таким образом, иммуноген будет представлять собой молекулу, которая способна индуцировать иммунный ответ, и, в случае настоящего изобретения, молекулу, способную индуцировать ответ Т-клетки.

Для Т-клеточного эпитопа необходим короткий пептид, который связан с рецептором МНС I или II класса, образующий трехчленный комплекс (а-цепь МНС класса I, β-2-микроглобулин и пептид), который может быть распознан Т-клеткой, несущей подходящий Т-клеточный рецептор, связывающийся с комплексом МНС/пептид с подходящей аффинностью. Пептиды, связывающиеся с молекулами МНС I класса, типично имеют длину в 8-14 аминокислот и особенно типично длину в 9 аминокислот. Тклеточные эпитопы, которые связываются с молекулами МНС II класса, типично имеют длину в 12-30 аминокислот. В случае пептидов, которые связываются с молекулами МНС II класса, один и тот же пептид и соответствующий Т-клеточный эпитоп могут иметь общий центральный сегмент, но различаться по общей длине из-за примыкающих последовательностей с различными длинами, расположенными перед аминным концом центральной последовательности и после ее карбоксильного конца соответственно. Рецепторы МНС II класса имеют более открытую структуру, пептиды, связанные с рецепторами МНС II класса, соответствующим образом, не полностью углублены в структуру пептидсвязывающей бороздки молекулы МНС II класса, как то имеет место быть с пептидсвязывающей бороздкой молекулы МНС I класса. Как ни удивительно, это не применимо к пептиду в соответствии с 8Ε^ ГО № 1, так как небольшие изменения в длине пептида ведут к экстремальному снижению активности (см. ниже).

У человека имеется три различных генетических локуса, которые кодируют для молекул МНС I класса (молекулы МНС человека называются также человеческими лейкоцитарными антигенами (НЬЛ)): НЬЛ-Л, НЬА-В и НЬА-С. НЬЛ-Л*01, НЬЛ-Л*02 и НЬЛ-Л*11 являются примерами различных аллелей МНС I класса, которые могут экспрессироваться из этих локусов.

Человеческий геном имеет 3 различных локуса для генов МНС II класса: НЬА-ОК, Н^А-^^ и НЬЛΏΡ. Рецепторы МНС II класса являются гетеродимерами, состоящими из а- и β-цепи, которые обе фиксируются на клеточной мембране с помощью трансмембранного региона. НЬА-НКВ1*04 и НЬЛΏΚΒ1*07 - это два примера различных β-аллелей МНС II класса, о которых известно, что они кодируются в данных локусах. Аллели II класса сильно полиморфичны, к примеру, было описано несколько сотен различных аллелей НЬА-НКВ1. Для НЬА-А*02 и наиболее частых серологических видов НЬА-ОК частоты экспрессии в различных популяциях представлены в табл. 2.

Таблица 2

Частоты экспрессии Р НЬАхА02 и наиболее частых серологических видов НЬА-ОК. Частоты выведены из частот гаплотипа Сц· среди американцев, приводимых Μοτί е! а1. (Μοτί е! а1., 1997), с использованием формулы Харди-Вейнберга Р=1-(1-Ср². Комбинации А*02 с определенными аллелями НЬА-ОК могут быть обогащенными или менее частыми, чем ожидается от их одиночных частот в связи с неравномерным распределением связей. Более подробная информация представлена в работе Сйапоек е! а1. (Сйапоек е! а1., 2004).________________________________________________________________________

	Частоты экспрессии серологических видов НЬА*02 и НЬА-ϋΚ. в подгруппах Северо-Американского населения
Аллель НЬА	Европеоидное американское население	Афроамериканцы	Американцы азиатского происхождения	Латиноамериканцы
А*02	49,1%	34,1%	43,2%	48,3%
ϋΚΙ	19,4%	13,2%	6,8%	15,3%
ϋΚ2	28,2%	29,8%	33,8%	21,2%
ϋΚ3	20,6%	24,8%	9,2%	15,2%
ϋΚ4	30,7%	11,1%	28,6%	36,8%
ϋΚ5	23,3%	31,1%	30,0%	20,0%
ϋΚ6	26,7%	33,7%	25,1%	31,1%
ΏΚ7	24,8%	19,2%	13,4%	20,2%
ϋΚ8	5,7%	12,1%	12,7%	18,6%
ϋΚ9	2,1%	5,8%	18,6%	2,1%

Поэтому для терапевтических и диагностических целей крайне желателен пептид, который связывается с подходящей аффинностью с несколькими различными рецепторами НЬА II класса. Пептид, связывающийся с несколькими различными молекулами НЬА II класса, называется беспорядочно связывающимся пептидом.

Используемая здесь ссылка на последовательность ДНК включает как однонитевую, так и двуните

- 5 032437 вую ДНК. Таким образом, специфическая последовательность, если в контексте не указано иное, относится к однонитевой ДНК такой последовательности, дуплексу такой последовательности с его комплементом (двунитевая ДНК) и комплементу такой последовательности. Термин кодирующая область относится к тому участку гена, который естественно или обычно кодирует для экспрессионного продукта того гена в его естественном геномном окружении, т.е. участку, кодирующему ίη νίνο для нативного продукта экспрессии гена.

Кодирующая область может быть из нормального, мутировавшего или измененного гена или может даже быть из последовательности ДНК, или же гена, целиком синтезированного в лаборатории с использованием методов, хорошо известных специалистам из области синтеза ДНК.

Термин нуклеотидная последовательность относится к гетерополимеру дезоксирибонуклеотидов.

Нуклеотидная последовательность, кодирующая для конкретного пептида, олигопептида или полипептида, может быть встречающейся в природе или может быть получена синтетически. В целом, фрагменты ДНК, кодирующие пептиды, полипептиды и белки данного изобретения, собраны из фрагментов кДНК и коротких олигонуклеотидных линкеров или же из серий олигонуклеотидов для обеспечения синтетического гена, который способен экспрессироваться в рекомбинантной транскрипционной единице, включающей регуляторные элементы, образованные из микробиального или вирусного оперона.

Термин продукт экспрессии означает полипептид или белок, являющийся естественным продуктом трансляции гена и кодирующих эквивалентов любой последовательности нуклеиновой кислоты, образующихся в результате вырожденности генетического кода и, таким образом, кодирующих для той/тех же самой(ых) нуклеиновой(ых) кислот(ы).

Термин фрагмент, если относится к кодирующей последовательности, означает участок ДНК, включающий меньше, чем полную кодирующую область, продукт экспрессии которого обязательно сохраняет ту же самую биологическую функцию или активность, что и продукт экспрессии целой кодирующей области.

Термин фрагмент ДНК относится к полимеру ДНК в виде отдельного фрагмента или в качестве компонента более крупной конструкции ДНК, которая была образована из ДНК, изолированной по крайней мере один раз в существенно чистой форме, т. е. без контаминирующих эндогенных материалов и в количестве или с концентрацией, позволяющей идентификацию, манипуляцию и получение фрагмента и его составных нуклеотидных последовательностей стандартными биохимическими методами, например, с использованием вектора для клонирования. Такие фрагменты обеспечиваются в форме открытой рамки считывания, не прерываемой внутренними нетранслированными последовательностями или нитронами, которые типично присутствуют в эукариотических генах. Последовательности нетранслированной ДНК могут быть представлены по ходу транскрипции из открытой рамки считывания, где она не интерферирует с манипуляцией или экспрессией кодирующих областей.

Термин праймер означает короткую последовательность нуклеиновой кислоты, которая может быть спарена с одной нитью ДНК и обеспечивает свободный конец 3'ОН, на котором ДНК-полимераза начинает синтезировать дезоксирибонуклеотидную цепь.

Термин промотор означает участок ДНК, задействованный в связывании РНК-полимеразы для инициации транскрипции.

Термин открытая рамка считывания (ОРС) означает серии триплетов, кодирующих для аминокислот без каких-либо терминирующих кодонов, и является последовательностью (потенциально), способной транслироваться в белок.

Понятие изолированный означает, что материал удален из его исходного окружения (к примеру, естественное окружение, если он встречается в природе). Например, встречающийся в природе полинуклеотид или полипептид, представленный в живых организмах, не является изолированным, но тот же самый полинуклеотид или полипептид, выделенный из некоторых или всех сосуществующих материалов природной системы, является изолированным. Такие полинуклеотиды могли быть частью вектора и/или такие полинуклеотиды или полипептиды могли быть частью композиции и все-таки могли быть изолированы, так что такой вектор или композиция не является частью своего естественного окружения.

Полинуклеотиды и рекомбинантные или иммуногенные полипептиды, раскрытые в соответствии с настоящим изобретением, могут также быть в очищенной форме. Термин очищенный не требует абсолютной чистоты; скорее он предназначен для дачи относительного определения и может включать препараты с высокой очисткой или препараты только с частичной очисткой, в соответствии с тем, как эти термины понимаются специалистами соответствующей области. Например, отдельные клоны, изолированные из библиотеки кДНК, обычно очищались до электрофоретической чистоты. Очистка исходного материала или природного материала до по крайней мере одного порядка величины, предпочтительно двух или трех порядков и более предпочтительно четырех или пяти порядков величины определенно рассматривается. Более того, определенно рассматривается заявленный полипептид, чистота которого составляет предпочтительным образом 99,999% или по крайней мере 99,99 или 99,9% и еще более желательно 99 вес.% или более.

Нуклеиновые кислоты и продукты экспрессии полипептида, раскрываемые в соответствии с настоящим изобретением, в равной степени, как и векторы экспрессии, содержащие такие нуклеиновые

- 6 032437 кислоты и/или такие полипептиды, могут быть в обогащенной форме. Используемый здесь термин обогащенный означает, что концентрация материала по крайней мере в приблизительно 2, 5, 10, 100 или 1000 раз выше его естественной концентрации (например), преимущественно 0,01 вес.%, предпочтительно по крайней мере около 0,1 вес.%. Рассматриваются также препараты с около 0,5, 1, 5, 10 и 20 вес.%. Последовательности, конструкции, векторы, клоны и другие материалы, включенные в настоящее изобретение, могут предпочтительно быть в обогащенной или изолированной форме.

Термин активный фрагмент означает фрагмент, который дает иммунный ответ (т.е. обладает иммуногенной активностью), если он введен отдельно или опционально с подходящим адъювантом животному, такому как млекопитающее, например кролику или мыши, также включая человека; таковой иммунный ответ, принимающий форму стимуляции ответа Т-клетки, у животного-реципиента, такого как человек. Альтернативно активный фрагмент может также быть использован для инициации ответа Тклетки ίη νίίτο.

Используемые здесь термины участок, сегмент и фрагмент, если они использованы по отношению к полипептидам, относятся к непрерывной последовательности остатков, таких как аминокислотные остатки, последовательность которых формирует подкласс более крупной последовательности. Например, если полипептид был подвергнут обработке любой из известных эндопептидаз, таких как трипсин или химотрипсин, то полученные в результате такой обработки олигопептиды будут представлять участки, сегменты или фрагменты исходного полипептида. Это означает, что любой таковой фрагмент будет обязательно содержать как часть его аминокислотной последовательности сегмент, фрагмент или участок, который в значительной степени идентичен, если не в точности идентичен последовательности 8Еф ΙΌ № 1 по 20, которая соответствует встречающимся в природе или материнским белкам последовательностей с 8Еф ΙΌ № 1 по 20. При использовании по отношению к полинуклеотидам такие термины относятся к продуктам, полученным при обработке указанных полинуклеотидов любой из известных эндонуклеаз.

В соответствии с настоящим изобретением термин процентная доля идентичности или идентичный с процентной долей, если он относится к последовательности, означает, что последовательность сравнивается с заявленной или описанной последовательностью после противопоставления сравниваемой последовательности (сравниваемая последовательность), описанной или заявленной последовательностью (контрольная последовательность). Процентная доля идентичности определяется затем по следующей формуле:

Процентная доля идентичности = 100 [I - (С/В)], где С является числом различий между контрольной последовательностью и сравниваемой последовательностью по длине противопоставления между контрольной последовательностью и сравниваемой последовательностью, где (ί) каждое основание или аминокислота в контрольной последовательности, которые не имеют соответствующего противопоставленного основания или аминокислоты в сравниваемой последовательности, (ίί) каждая брешь в контрольной последовательности и (ίίί) каждое противопоставленное основание или аминокислота в контрольной последовательности, которые отличаются от противопоставленного основания или аминокислоты в сравниваемой последовательности, представляют собой различие;

В - число оснований или аминокислот в контрольной последовательности по длине противопоставления сравниваемой последовательности с любой брешью, образующейся в контрольной последовательности, считающейся также за основание или аминокислоту.

Если существует противопоставление между сравниваемой последовательностью и контрольной последовательностью, для которых процентная доля идентичности, по расчётам выше, имеет значение приблизительного равенства или более чем установленной минимальной процентной доли идентичности, тогда сравниваемая последовательность имеет установленную минимальную процентную долю идентичности с контрольной последовательностью, если даже могут существовать противопоставления, в которых подсчитанная здесь выше процентная доля идентичности меньше, чем установленная процентная доля идентичности.

Исходные пептиды, раскрываемые здесь, могут быть модифицированы путём замещения одного или нескольких остатков в различных по возможности отобранных местах по длине пептидной цепи, если не заявлено иное. Такие замещения могут носить консервативный характер, например, где одна аминокислота заменяется аминокислотой с похожей структурой и характеристиками, так же как при замене гидрофобной аминокислоты на другую гидрофобную аминокислоту. Ещё более консервативным будет замещение аминокислот одинакового или похожего размера и химического характера, такое как при замене лейцина на изолейцин. В исследованиях вариаций последовательностей внутри семейств встречающихся в природе гомологичных белков определённые замещения аминокислот переносятся гораздо чаще, чем другие, и они часто проявляют взаимосвязь со сходствами по размеру, заряду, полярности и гидрофобности между исходной аминокислотой и её заменой; и таковой является основа определения консервативных замещений.

- 7 032437

Консервативные замещения определены здесь как обмены внутри одной из последующих пяти групп: группа 1 - малые, алифатические, неполярные или слабо полярные остатки (А1а, 8ет, Тйт, Рго, С1у); группа 2 - полярные, отрицательно заряженные остатки и их амиды (Акр, Акп, С1и, С1п); группа 3 полярные, положительно заряженные остатки (Ηίκ. Агд, йук); группа 4 - крупные, алифатические, неполярные остатки (Ме1, Беи, Не, Уа1, Сук); и группа 5 - крупные, ароматические остатки (Рйе, Туг, Тгр).

Менее консервативные замещения могут охватывать замещение одной аминокислоты другой, имеющей похожие характеристики, но отличающейся в какой-то степени по размеру, как в случае замещения аланина остатком изолейцина. Высоко неконсервативные замещения могут охватывать замещение кислой аминокислоты другой, которая имеет полярность, или даже такой, которая имеет щелочной характер. Такие радикальные замещения не могут, однако, быть отвергнуты как потенциально неэффективные из-за того, что химические эффекты не полностью предсказуемы, и радикальные замещения могут привести к увеличению случайных эффектов, в противном случае не предсказуемых, исходя из обычных химических принципов.

Разумеется, в таких замещениях могут участвовать другие структуры, отличающиеся от обычных й-аминокислот. Таким образом, Ό-аминокислоты могут быть замещены ^-аминокислотами, обычно встречающимися в антигенных пептидах по изобретению и также охватываемые настоящим раскрытием сущности изобретения. Кроме того, аминокислоты, содержащие нестандартные Я-группы (т.е. Я-группы, отличающиеся от обнаруженных в распространённых 20 аминокислотах природных белков) могут быть также использованы в целях замещения для получения иммуногена и иммуногенных полипептидов в соответствии с настоящим изобретением.

Если были произведены замещения на более чем одной позиции для получения пептида с практически эквивалентной или большей антигенной активностью, чем та, что определена ниже, то комбинации таких замещений будут проанализированы для определения того, приведут ли эти комбинации замещений к дополнительным или синергетическим эффектам по отношению к антигенности пептида. По большей части не более 4 позиций внутри пептида должны замещаться одновременно.

Термин Т-клеточный ответ означает специфическую пролиферацию и активацию эффекторных функций, индуцированных пептидом ίη νίΐτο или ίη νίνο. Для ЦТЛ, рестриктированных по МНС класса I, эффекторными функциями может быть лизис клеток-мишеней с введенным импульсным способом пептидом, с введенным импульсным способом предшественником пептида или клеток-мишеней, естественно презентирующих пептид, секреция цитокинов, предпочтительно интерферона-γ, ΤΝΕ-α или ИЛ-2, индуцированная пептидом, секреция эффекторных молекул, предпочтительно гранзимов или перфоринов, индуцированная пептидом, или дегрануляция. Для Т-хелперных клеток, рестриктированных по МНС класса II, эффекторными функциями может быть индуцированная пептидом секреция цитокинов, предпочтительно ΙΕΝ-γ, ΤΝΡ-α, ИЛ-4, ИЛ-5, ИЛ-10 или ИЛ-2, или индуцированная пептидом дегрануляция. Возможные эффекторные функции ЦТЛ и Т-хелперных клеток не ограничиваются данным списком.

Иммунотерапевтические подходы в лечении

Стимуляция иммунных ответов зависит от присутствия антигенов, распознающихся иммунной системой хозяина как чужеродные. Открытие существования опухолеассоциированных антигенов повысило сейчас возможность использования иммунной системы хозяина для вмешательства в рост опухоли. Различные механизмы объединения обеих ветвей иммунной системы, как гуморальной, так и клеточной, исследуются в настоящее время для иммунотерапии рака.

Специфические элементы клеточных иммунных ответов способны к специфическому распознаванию и уничтожению опухолевых клеток. Изоляция цитотоксических Т-клеток (ЦТЛ) из популяций опухольинфильтрирующих клеток или из периферической крови предполагает, что такие клетки играют важную роль в естественной иммунной защите против рака. В частности, СЭ8-положнтельные Т-клетки, которые распознают молекулы I класса главного комплекса гистосовместимости (МНС) с пептидами, имеющими обычно 8-10 остатков, образованными из белков или дефектных рибосомных продуктов (ОШР8) (8ейиЬей и., АШоп ^.С., СЛЬк 1., ШгЬигу С.С., Уе\\йе11 ТА., Веппшк ТЯ.;Яар1д дедтадайоп о£ а 1агде йтаейоп о£ пе\\'1у куп1йек1/ед рго1етк Ьу рго1еакошек; №11иге 2000; 404(6779):770-774), находящихся в цитозоли, играют важную роль в этом ответе. Молекулы МНС человека называются также человеческими лейкоцитарными антигенами (НЙА).

Существуют два класса молекул МНС: молекулы МНС I класса, которые могут встречаться на большинстве клеток, имеющих ядро, которые презентируют пептиды, образующиеся после протеолитического расщепления преимущественно эндогенных, цитозольных или ядерных белков, ПЯЙР8, и более крупных пептидов. Тем не менее, пептиды, образованные из эндосомальных компартментов или экзогенных источников, также часто встречаются на молекулах МНС класса I. Данный не традиционный способ презентации класса I описывается в литературе как кросс-презентация. Молекулы МНС II класса могут встречаться преимущественно на профессиональных антигенпрезентирующих клетках (АПК) и презентировать пептиды экзогенных белков, которые поглощаются АПК в период эндоцитоза и впоследствии процессируются. Что касается класса I, то описываются альтернативные способы процессинга антигена, которые позволяют пептидам из эндогенных источников презентироваться молекулами МНС

- 8 032437 класса II (например, аутофагоцитоз). Комплексы из пептида и молекулы МНС класса I распознаются СО8-положительными цитотоксическими Т-лимфоцитами с соответствующим ТКР (Т-клеточный рецептор), комплексы из пептида и молекулы МНС класса II распознаются СО4-положительными хелперными Т-клетками с соответствующим ТКР.

СО4-положительные хелперные Т-клетки играют важную роль в управлении эффекторными функциями противоопухолевых Т-клеточных ответов, и поэтому идентификация СО4-положительных Тклеточных эпитопов, образованных из опухолеассоциированных антигенов (ТАА), может быть чрезвычайно важна для разработки фармацевтических препаратов для инициации противоопухолевых иммунных ответов (Си)айс, 8., Ό. А1апаскоу1с, Е. 1адет, М. Ма!кио, А. 8е1уакитат, Ν.Κ. АИоткц В.С. Мак1, В. ЭиропР С. В1йет, Υ.Τ. С1еп, А. Кпи1й, апб Ь.1. Θ16. 8итуеу ок па!ига11у осситпд СЭ4+ Т-се11 гекропкек адатк! ΝΥ-Ε8Ο-1 ш сапсег райепк: Сотте1айоп тейй апйЬобу гекропкек. Ргос. ИаЙ. Асаб. 8ск И.8.А. 2003, 100 (15): 8862-7); СЭ4+ Т-клетки могут приводить к локальному повышению уровня !ΕΝ-γ.

На моделях млекопитающих животных, например мышах, было показано, что даже при отсутствии эффекторных клеток ЦТЛ (т.е. СО8-положительных Т-лимфоцитов), СО4-положительных Т-клеток достаточно для ингибирующего проявления опухолей посредством ингибирования ангиогенеза при секреции интерферон-гамма ₆ΕΝγ) (фш, Ζ. апб Т. В1апкепк1еш. СЭ4+ Т-се11-теб1а1еб 1итоит ге)есйоп туо1уек тЫЫйоп ок апдюдепекк 1йа1 к берепбеп! оп ШИ датта гесер1ог ехртеккюп Ьу попйета1оро1ейс се11к. Оптиийу. 2000, 12:677-686). К тому же было показано, что СО4-положительные Т-клетки, распознающие пептиды из опухолеассоциированных антигенов, презентированные молекулами НЬА класса II, могут препятствовать опухолевой прогрессии посредством индукции ответов антител (АЬ) (Кеппебу, В.С., М.Н. 8йеатет, А.М. Уайк, апб В.К. ВпдЫ. 2003. СЭ4+ Т 1утрйосу1ек р1ау а спйса1 го1е ш апйЬобу ргобисйоп апб (итог 1ттиш1у адатк! к1т1ап уник 40 1агде (итог апйдеп. Сапсег Век. 2003, 63:1040-1045). В отличие от опухолеассоциированных пептидов, связывающихся с молекулами НЬА класса I, до сих пор было описано лишь небольшое число опухолеассоциированных лигандов класса II (те^^.сапсепттипНу.огд, те^^.кукрейЫ.бе).

Так как конститутивная экспрессия молекул НЬА класса II обычно ограничена клетками иммунной системы, то возможность изоляции пептидов класса II напрямую из первичных опухолей считалась невозможной. Тем не менее, изобретателям недавно удалось идентифицировать ряд эпитопов МНС класса II напрямую из опухолей (ЕР 1642905, ЕР 1760088; Эепд|е1 1., Иак!ке М.Э., Соийекапдеак С., Сйкюибк С., 8с1оог Ο., А1!епЬегепб Е., Ми11ег М., Кгатег В., Мккюи А., 8аи!ег М., Неппеп1ойет 1., \Уегпе1 Ό., 81епх1 А., Ваттепкее Н.С., К1тде1 К., 81еуапоую 8.; Ипехрес1еб аЬипбапсе ок НЬА с1акк II ргекеп!еб рерйбек ш рптагу гепа1 се11 сагстотак; С1т Сапсег Век. 2006; 12:4163-4170).При отсутствии воспаления экспрессия молекул МНС II класса преимущественно рестриктирована по клеткам иммунной системы, в особенности АПК, например моноцитам, образованным из моноцитов клеткам, макрофагам, дендритным клеткам. Неожиданным образом у пациентов с опухолевыми заболеваниями было обнаружено, что клетки опухолей экспрессируют молекулы МНС II класса (Эепд|е1 1., Иак!ке М.Э., Соийекапдеак С., Сйкюибк С., 8с1оог Ο., А1!епЬегепб Е., Ми11ег М., Кгатег В., Мккюи А., 8аи!ег М., Неппеп1ойет 1., \Уегпе1 Ό., 81епх1 А., Ваттепкее Н.С., К1шде1 К., 81еуапоую 8.; Ипехрес1еб аЬипбапсе ок НЬА с1акк II ргекеп!еб рерйбек ш рптагу гепа1 се11 сагстотак; С1ш Сапсег Век. 2006; 12:4163-4170).

Для того чтобы пептид инициировал (вызывал) клеточный иммунный ответ, он должен связываться с молекулой МНС. Этот процесс зависит от аллеля молекулы МНС и специфических полиморфизмов аминокислотной последовательности пептида. Пептиды, связывающиеся с МНС класса I, имеют обычно 8-10 аминокислотных остатков в длину и обычно содержат два консервативных остатка (якорь) в их последовательности, которые взаимодействуют с соответствующей связывающей бороздкой молекулы МНС. Таким образом, каждый аллель МНС имеет соединительный элемент определяющий, какие пептиды могут специфически связываться со связывающей бороздкой (Ваттепкее Н.С., Васйтапп 1., 8!еуапоую 8. МНС йдапбк апб рерйбе тойкк, Ьапбек Вюкаепсе, И8А, 1997).

В зависящей от МНС иммунной реакции пептиды не только должны быть в состоянии связываться с конкретными молекулами МНС, экспрессируемыми опухолевыми клетками, но они также должны распознаваться Т-клетками, несущими Т-клеточные рецепторы (ТКР).

Антигены, которые распознаются опухолеспецифическими Т-лимфоцитами, то есть их эпитопами, могут быть молекулами, образованными из любого класса белков, таких как ферменты, рецепторы, факторы транскрипции и т.д. Кроме того, опухолеассоциированные антигены, могут, например, также присутствовать только в опухолевых клетках, например, в качестве продуктов мутировавших генов. Другой важный класс опухолеассоциированных антигенов представлен тканеспецифическими антигенами, такими как антигены СТ (раковый тестикул), которые экспрессированы в различных видах опухолей и здоровой ткани семенника.

Были идентифицированы различные опухолеассоциированные антигены. Затем много усилий было потрачено на исследования по идентификации дополнительных опухолеассоциированных антигенов. Некоторые группы опухолеассоциированных антигенов, также именуемые в области техники как опухолеспецифические антигены, являются тканеспецифическими. Примеры включают, но не ограничиваются

- 9 032437 тирозиназой для меланомы, Р8Л (простатспецифический антиген) и Р8МЛ (простатспецифический мембранный антиген) для рака простаты и хромосомными кроссоверами (транслокации), такими как Ьст/аЫ в лимфоме. Тем не менее, многие опухолеассоциированные антигены, которые были идентифицированы, встречаются во множестве видов опухолей, и некоторые, такие как онкогенные белки и/или генысупрессоры опухоли (обзор генов-супрессоров опухоли для почечного рака дается, например, в работе Ыиейаи ВД.М., ВДаЙйет М.М., 2Ьат В. Тйе депейс Ьав15 о£ сапсег о£ 1йе ктбиеу. I Ито1. 2003 Оес; 170 (6Р11):2163-72), которые фактически вызывают трансформационное явление, встречаются практически во всех видах опухолей. Например, нормальные клеточные белки, контролирующие рост и дифференциацию клетки, такие как р53 (который является примером гена-супрессора опухоли), гае, с-шеГ тус, рВВ, УНЬ и ΗΕΒ-2/пеи, могут аккумулировать мутации, приводящие к повышению уровня экспрессии продуктов этих генов, делая их тем самым онкогенными (МсСайеу е1 а1. Сапсег Вевеатсй 1998 15:58 26015; Όίβίβ е1 а1. С1Ьа Еоипб. 8утр. 1994 187:198-211). Эти мутантные белки также могут быть мишенью опухолеспецифического иммунного ответа при многих видах рака.

Иммунотерапия больных раком направлена особенно на активацию клеток иммунной системы, в особенности т.н. цитотоксических Т-клеток (ЦТЛ, также известные как киллерные клетки, известные также как СЭ8-положительные Т-клетки) против опухолевых клеток, но не против здоровой ткани. Опухолевые клетки отличаются от здоровых клеток экспрессией опухолеассоциированных белков. Молекулы НЬЛ презентируют наружу на клеточной поверхности клеточное содержимое, таким образом, давая возможность цитотоксическим Т-клеткам отличать здоровую клетку от опухолевой. Это происходит путем расщепления всех белков внутри клетки на короткие пептиды, которые присоединяются затем к молекулам НЬЛ и презентируются на клеточной поверхности (Ваттеивее 1993). Пептиды, представленные на опухолевых клетках, а не или в намного меньшей степени на здоровых клетках организма, называются опухолеассоциированными пептидами (ТИМЛРв).

Для того чтобы белки были распознаны цитотоксическими Т-лимфоцитами в качестве опухолеспецифического или -ассоциированного антигена, и чтобы они могли использоваться в терапии, должны выполняться особые предварительные требования. Антиген должен быть экспрессирован преимущественно опухолевыми клетками, а не здоровыми тканями или в сравнительно малом объеме. В дальнейшем желательно, чтобы соответствующий антиген не только присутствовал в каком-либо виде опухоли, но и также имел высокую концентрацию (т.е. число копий соответствующего пептида на клетку). Опухолеспецифические и опухолеассоциированные антигены часто образованы из белков, напрямую задействованных в трансформации нормальной клетки в опухолевую, в связи с функцией, например, при контроле клеточного цикла или в апоптозе. В дополнение также мишени белков по ходу транскрипции, напрямую являющихся причиной трансформации, могут быть представлены в повышенном количестве и, таким образом, косвенно опухолеассоциированными. Такие косвенно опухолеассоциированные антигены могут также быть мишенями вакцинационного подхода. В обоих случаях необходимо присутствие эпитопов в аминокислотной последовательности антигена, поскольку такой пептид (иммуногенный пептид), который образован из опухолеассоциированного антигена, должен вести ίη уДго или ίη у1уо к Т-клеточному ответу.

В основном, любой пептид, способный связываться с молекулой МНС может выполнять функцию Т-клеточного эпитопа. Предварительным условием для индукции Т-клеточного ответа ίη νίίΐΌ или ίη у1уо является присутствие Т-клетки с соответствующим ТКР и отсутствие толерантности к данному конкретному эпитопу. Т-хелперные клетки играют важную роль в управлении эффекторной функцией ЦТЛ в противоопухолевом иммунитете. Эпитопы Т-хелперных клеток, инициирующие ответы Т-хелперных клеток типа ТН1, поддерживают эффекторные функции СЭ8-положительных киллерных Т-клеток, которые включают цитотоксические функции, направленные против опухолевых клеток, проявляющих опухолеассоциированные пептиды/МНС-комплексы на их клеточной поверхности. Таким образом, опухолеассоциированные пептидные эпитопы Т-хелперных клеток, одни или в комбинации с другими опухолеассоциированными пептидами, могут служить в качестве активных фармацевтических ингредиентов вакцинных композиций, которые стимулируют противоопухолевые иммунные ответы.

Так как оба вида ответов, зависящие от СЭ8 и от СЭ4, вносят свой вклад в противоопухолевый эффект сообща и усиливая друг друга, то идентификация и характеристика опухолеассоциированных антигенов, распознаваемых как СЭ8+ ЦТЛ (молекула МНС I класса), так и С'Э4-положительными ЦТЛ (молекула МНС II класса) являются важными при разработке противоопухолевых вакцин. Поэтому целью настоящего изобретения является обеспечение композиций пептидов, которые содержат пептиды, связывающиеся с комплексами МНС любого класса.

Первые клинические испытания с использованием опухолеассоциированных пептидов были начаты в середине 1990 гг. Буном (Вооп) и коллегами, в основном, для показания меланомы. Клинические ответы в лучших попытках достигали от 10 до 30%. О серьезных побочных эффектах или сильной аутоиммунности не сообщалось ни в одном клиническом исследовании с использованием основанной на пептидах вакцинной монотерапии. Сообщалось о слабых формах витилиго у некоторых пациентов, проходивших лечение меланома-ассоциированными пептидами.

Тем не менее, прайминга одного вида ЦТЛ обычно не достаточно для устранения всех опухолевых

- 10 032437 клеток. Опухоли обладают сильной мутагенностью и, таким образом, способны быстро реагировать на атаки ЦТЛ изменением своей белковой структуры для избегания узнавания ЦТЛ. Для контратаки по механизмам уклонения опухоли от ударов для вакцинации использовались различные специфические пептиды. Таким способом по опухоли могла быть произведена одновременная атака несколькими клонами ЦТЛ, действовавшим синхронно. Так могут быть снижены шансы опухоли на ускользание от иммунного ответа. Эта гипотеза недавно получила подтверждение в клиническом исследовании по лечению пациентов с меланомой на поздней стадии. С всего лишь несколькими исключениями пациенты, имевшие по крайней мере три различных Т-клеточных ответа, демонстрировали объективные клинические ответы или стабильность заболевания (Вапсйетеаи 2001), а также увеличение выживаемости (личные беседы с 1. Вапсйетеаи), в то время как подавляющему большинству пациентов, имевшему менее трех Т-клеточных ответов, был поставлен диагноз прогрессирование заболевания.

Исследование кандидатов демонстрировало похожий эффект, если пациенты, страдавшие от почечно-клеточной карциномы, проходили курс лечения с вакциной, составленной из 13 различных пептидов (Н. 8шдй-1ави)а, 8. \Ма11ег. Т. Аетвсйепк. А. Мауег, Ρ.Υ. Э|е1пс11. М. 81ае111ег. А. 81епх1. 8. 81еуапо\зс. Н. Ваттепвее, 1. Рпвсй; Согге1айои оГ Т-се11 гевропве, сйшса1 асйуйу апЕ геди1а1огу Т-се11 1еуе1в ίη гепа1 се11 сатстота ра11еп!в 1геа1еЕ \νί11ι 1МА901, а поуе1 тиЫ-рерЕЕе уассте; А8СО Меейпд 2007 Ров1ег # 3017; М. 81ае111ег. А. 81епх1. Ρ.Υ. Э|е1пс11. Т. Е1веп, А. НаГегкатр, 1. Веск, А. Мауег, 8. \Ма11ег. Н. 8тдй, 1. Рпвск С. О. 8ИеГ; Ап ореп 1аЬе1 вШЕу 1о еуа1иа1е Ше ваГе1у апЕ пптиподешску оГ Ше рерИЕе ЬавеЕ сапсег уассте 1МА901, А8СО тееИпу 2007; Ров1ег # 3017).

Основной задачей в разработке вакцины против опухолей является поэтому не только идентификация и характеристика новых опухолеассоциированных антигенов и полученных из них иммуногенных Тхелперных эпитопов, но и комбинирование различных эпитопов для увеличения вероятности ответа на более чем один эпитоп для каждого пациента. Поэтому целью настоящего изобретения является обеспечение комбинаций аминокислотных последовательностей таких пептидов, которые обладают способностью связываться с молекулой главного комплекса гистосовместимости человека (МНС) класса I (НЬА класса I) или II (НЬА класса II). Дальнейшей целью настоящего изобретения является обеспечение эффективной противораковой вакцины, которая основана на комбинации этих пептидов.

В настоящем изобретении изобретатели изолировали и охарактеризовали пептиды, связывающиеся с молекулами НЬА класса I или II, напрямую из опухолей млекопитающих, т.е. первичных проб пациентов, страдающих преимущественно от глиобластомы, но и также из первичных образцов тканей колоректального рака, почечно-клеточной карциномы, рака легкого, рака поджелудочной железы, злокачественной меланомы и рака желудка.

Настоящее изобретение обеспечивает пептиды, которые образованы из антигенов, ассоциированных с генезом опухоли, и имеют способность связываться в достаточной мере с молекулами МНС (НЬА) II класса для инициации иммунного ответа человеческих лейкоцитов, в особенности лимфоцитов, в особенности Т-лимфоцитов, в особенности СЭ4-положительных Т-лимфоцитов, в особенности СЭ4положительных Т-лимфоцитов, опосредующих иммунные ответы типа ТН1. Настоящее изобретение обеспечивает также пептиды, которые образованы из антигенов, ассоциированных с генезом опухоли, и имеют способность связываться в достаточной мере с молекулами МНС (НЬА) I класса для инициации иммунного ответа человеческих лейкоцитов, в особенности лимфоцитов, в особенности Т-лимфоцитов, в особенности СЭ8-положительных цитотоксических Т-лимфоцитов, в равной степени как и комбинации обоих, которые особенно полезны для вакцинации пациентов, страдающих от рака.

В соответствии с настоящим изобретением поставленная задача решена обеспечением фармацевтической композиции, включающей по крайней мере два пептида, содержащих аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из 8ЕО Ш № 1 по 8ЕО Ш № 8, и/или содержащих вариантную аминокислотную последовательность, которая по крайней мере на 80% гомологична последовательностям с 8ЕО Ш № 1 по 8ЕО Ш № 8, и/или полинуклеотид, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую 8ЕО Ш № 1 по 8ЕО Ш № 8 или вариантную аминокислотную последовательность, и фармацевтически приемлемый носитель. Фармацевтические композиции по настоящему изобретению в дальнейшем могут включать по крайней мере один дополнительный пептид, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из 8ЕО Ш № 9 по 8ЕО Ш № 20, или содержащий вариантную аминокислотную последовательность, которая по крайней мере на 80% идентична последовательностям с 8ЕО Ш № 9 по 8ЕО Ш № 20, или полинуклеотид, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую 8ЕО Ш № 9 по 8ЕО Ш № 20 или вариантную аминокислотную последовательность. Пептиды могут иметь общую длину между 8 и 100, предпочтительно между 8 и 30 и, особенно предпочтительно между 8 и 17 аминокислотами. Пептиды могут также иметь непептидные связи.

Как будет описано далее, пептиды, за исключением МЕТ-005, формирующие основу настоящего изобретения, были все идентифицированы как презентируемые клетками, несущими МНС I или II класса. Таким образом, эти конкретные пептиды так же, как и другие пептиды, содержащие данную последовательность (т.е. дериваты пептидов), все вызывают специфический Т-клеточный ответ, хотя уровень, до которого такой ответ будет простимулирован, может варьироваться между отдельными пептидами и отдельными пациентами. Различия, например, могут быть вызваны мутациями в пептидах. Специалист

- 11 032437 данной области полностью осведомлен о способах, которые могут использоваться для определения силы, с которой был индуцирован ответ каждым отдельным пептидом, в частности, благодаря ссылкам на приведенные здесь примеры и соответствующую литературу.

Предпочтительным образом, варианты по изобретению будут индуцировать Т-клеточную перекрестную реакцию с соответствующим пептидом по изобретению.

Пептиды образованы из опухолеассоциированных антигенов, в особенности опухолеассоциированных антигенов с функциями, например, в протеолизе, ангиогенезе, росте клеток, регуляции клеточного цикла, делении клеток, регуляции транскрипции, регуляции трансляции, инвазии ткани и т.д. В табл. 3 представлены пептиды и функция белка, из которого они образованы.

Таблица 3

Пептиды настоящего изобретения и функция материнского белка

№ послти	Номер пептида	Последовательность	Символ гена	Функция	Связывается с МНС
1	С8Р-001	ТМЬАКЬАЗА	С8Р64	Трансмембранный протеогликан, задействованный в неоваскуляризации	НЕА-А*02
2	РАВР7- 001	ЬТРООУУАУ	РАВР7	ЦНС-специфический белок, связывающий жирную кислоту	НЬА-А*02
3	ΝΕΟΝ4Χ- 001	ΝΕϋΤΕΜΤΥν	ΝΕΟΝ4Χ	Молекула клеточной адгезии	НЕА-А*02
4	ΤΝΟΟΟΙ	АМТСЩЬАСУ	тле	Внеклеточный матричный белок	НЬА-А*02
5	ΝΚΟΑΜ- 001	бЬ^ЮЮТЕУ	ΝΚ-САМ	Нейрональная молекула клеточной адгезии	НЕА-А*02
6	ΙΟΡ2ΒΡ3- 001	ΚΙζ)ΕΙΕΤ(2ν	1СР2ВРЗ	мРНК-связывающий белок	НЕА-А*02
7	ВСА-002	ΑΕ4ΑΨΡ8ΕΕ	ВСАЯ	Протеогликан	НЕА-А*02
8	МЕТ-005	τρδγνϋρνιτδίδρκγο	МЕТ	Рецептор фактора роста	удлиненный тимлр ΗΕΑΙ класса

Хондроитин сульфат протеогликан 4 (С8РО4).

С8РО4 (хондроитин сульфат протеогликан) представляет интегральный мембранный хондроитин сульфат протеогликан. Он известен как ранний маркер прогрессии меланомы, присутствующий на клеточной поверхности и вовлеченный в стимуляцию пролиферации, миграции и инвазии опухолевой клетки. С8РО4 сильно экспрессирован в >90% случаях человеческой меланомы. Хотя С8РО4 не является строго опухолеспецифическим, опухолереактивные ответы СЭ4+ Т-клеток у пациентов с меланомой и здоровых индивидов распознают С8РО4693-709 на НЕА-ЭК11-экспрессирующих клетках меланомы при отсутствии аутоиммунности (1тГиП е! а1., 2007).

Экспрессия С8РО4 улучшает интегрин-опосредованное распространение клеток, фосфориляцию РАК (киназа фокальной адгезии) и активацию ЕКК1/2 (киназа, регулирующая внеклеточные сигналы) (Уапд е! а1., 2004). Кроме того, накоплены доказательства на основе данных ίη νίΐΐΌ о том, что С8РО4 играет важную роль в ангиогенезе опухоли. Таким образом, С8РО4-положительные опухоли, как было обнаружено, имеют значительно повышенную степень неоваскуляризации и объем сосудистой массы, и, как было продемонстрировано, С8РО4 отделяет ангиостатин, который в нормальных условиях ингибирует пролиферацию и ангиогенез эндотелиальных клеток. Незрелые сосуды также содержат С8РО4положительные перициты, позволяя предположить, что эта клеточная популяция играет роль в модулировании пролиферации эндотелиальных клеток, блокируя ингибирующее действие ангиостатина во время развития сосудов (СРекепуа е! а1., 2002Ь).

Кроме активированных перицитов экспрессия С8РО4 была также описана для некоторых нормальных тканей, таких как эндотелиальные клетки, хондроциты, гладкомышечные клетки, определенные виды базальных кератиноцитов внутри эпидермиса, в равной степени как и внутри волосяного фолликула (СатроИ е! а1., 2004).

Во время ангиогенеза и в ответ на патологии СЫ8 высокоподвижные клетки С8РО4 подвергаются быстрым морфологическим изменениям и мобилизуются в места, где происходит рост и восстановление сосудов. С8РО4 гиперэкспрессированы и в опухолевых клетках, и в перицитах кровяных сосудов злокачественных опухолей головного мозга (СРекепуа апб Р11ктд!оп, 2002). Вживлением клеток из С8РО4положительной клеточной линии человеческой глиомы в головной мозг иммунодефицитных голых крыс было продемонстрировано, что данные опухоли имеют более высокую капиллярную плотность по сравнению с контрольными пробами; это предполагает, что экспрессией С8РО4 регулируются как функ

- 12 032437 ции, так и структура полученной от хозяина сосудистой сети опухоли (Вгекке е! а1., 2006). В эксперименте с ксенотрансплантатом по вживлению сфероидов мультиформной глиобластомы (СВМ), полученных биопсией, в голых крыс было установлено, что С8РС4 в основном ассоциируется с кровеносными сосудами как перицитов, так и компонентов основания мембраны сосудистой сети опухоли, и экспрессия ассоциирована с участками высокой клеточной пролиферации (Сбекепуа е! а1., 2002а). Кроме того, экспрессия С8РС4 сравнима с прогрессией опухоли в модели с имплантированной глиомой (\Убапо\\ъка е! а1., 2006). Прогрессия злокачественного характера сохраняется при перекрестных помехах между опухолью и ее стромой, где активированная строма питает пролиферативные и инвазивные клетки новообразования, обеспечивая образование новых сосудов, внеклеточных матричных компонентов и стимулирующих факторов роста. В данном контексте С8РС4 играет ведущую роль в активации опухолевой стромы посредством изменений в клеточной адгезии, миграции, пролиферации и морфогенезе сосудов (Сбекепуа апб 1штегуо11, 2007).

С8РС4 дифференциально экспрессирован в человеческих глиомах с более высокой экспрессией в глиомах высокой степени злокачественности по сравнению с глиомами низкой степени злокачественности (Сбекепуа е! а1., 1999). Высокая экспрессия С8РС4 соотносится с мультилекарственной резистентностью, опосредованной возросшей активацией сигнальных процессов с участием α3β1 интегрин/Р13К и их мишеней по ходу транскрипции, способствуя выживанию клеток (Сбекепуа е! а1., 2008).

Белок, связывающий жирную кислоту 7, головной мозг (1МА-ЕАВР7-001).

Белки, связывающие жирную кислоту (ЕАВРк), являются цитозольными белками 14-15 кДа, которые, как предполагается, задействованы в поглощении, транспортировке и нацеливании жирной кислоты (ЖК). Как считается, они увеличивают растворимость ЖК в цитоплазме во время транспортировки ЖК между мембранными компартментами и доставляют ЖК к их ядерным мишеням (С1а1х е! а1., 2002). ЕАВР могут модулировать концентрацию ЖК и, таким образом, оказывать влияние на различные клеточные функции, такие как ферментативная активность, экспрессия генов, клеточный рост и дифференциация (С1а1х апб 8ЮгсН. 2001).

Нервная ткань содержит четыре из девяти известных видов ЕАВР с различным пространственновременным распространением (Уеегкатр апб 21ттегтап, 2001). ЕАВР7 высоко экспрессирован в клетках радиальной глии во время развития центральной нервной системы и постепенно снижается у взрослых (Еепд апб Неких, 1995; 81ιίιηίζι.ι е! а1., 1997). Это необходимо для нейрон-индуцированной глиальной дифференциации и последующей миграции нейронов вдоль глиальных процессов, но не имеет влияния на клеточную пролиферацию и адгезию (Еепд е! а1., 1994; Кирх е! а1., 1994). В швановских клетках экспрессия ЕАВР7 является нисходящим каскадом Вак-независимых сигналов ЕСЕК, и он регулирует взаимодействия между швановскими клетками и аксонами в нормальных периферийных нервах и опухолях периферийных нервов (МШег е! а1., 2003).

ЕАВР7 мРНК экспрессирован в тканях нейроэпителиального происхождения в равной степени, как и в злокачественных глиомах (степени III и IV по ВОЗ). Ген был картирован на хромосомной полосе 6с.|22-23 - регионе, который также содержит протоонкоген с-тус и часто подвергается потере гетерозиготности при злокачественной глиоме. Анализ клеточных линий злокачественной глиомы показал, что ЕАВР7 часто коэкспрессирован с глиальным фибриллярным кислым белком (СЕАР); предполагается, что клетка, в которой возникает злокачественная глиома, может быть астроцитной клеткойпредшественником, которая обладает потенциалом для экспрессии обоих белков в нормальных условиях или в результате образования опухоли (СобЬои! е! а1., 1998). Белок ЕАВР7 проявляет от умеренной до сильной ядерной и цитоплазмической экспрессии в мультиформной глиобластоме (СВМ). Трансфицированные ЕАВР7 клетки глиомы проявляют в 5 раз большую миграционную активность, чем контрольные клетки. Таким образом, более короткая общая выживаемость, ассоциированная с гиперэкспрессией ЕАВР7, в особенности в глиобластоме, может быть обусловлена повышенной миграцией и инвазией опухолевых клеток в окружающую мозговую паренхиму (Ыапд е! а1., 2005). Дальнейший анализ распределения ЕАВР7 в астроцитомах указывает на повышенные уровни ЕАВР7 в регионах инфильтрации опухолей, предполагая что ЕАВР7 играет важную роль в направлении инфильтрации злокачественных клеток в смежные мозговые ткани (Мба е! а1., 2007). ЕАВР7 демонстрирует вариабельные уровни экспрессии и субклеточную локализацию в глиальных тканях и всех степенях астроцитомы. Тем не менее, в особенности ядерная локализация ЕАВР7, по-видимому, ассоциирована с инфильтративным фенотипом клеток глиомы и каскадами реакций ЕСЕК, так как его ядерная транслокация была обнаружена после активации ЕСЕК и ассоциируется с плохим прогнозом в случае ЕСЕВ-положительной мультиформной глиобластомы (СВМ). Более того, ядерная иммунореактивность ЕАВР7 не может наблюдаться в астроцитоме I степени (Ыапд е! а1., 2006; Ка1окЫ е! а1., 2007).

Нейролигин 4, Х-связь (МА-^С^Х^^.

Нейролигин 4, экспрессируемый сцепленным с Х-хромосомой геном, является членом семейства белков клеточной адгезии, который, по-видимому, выполняет определенную роль при созревании и работе нейронных синапсов. Члены семейства нейролигинов обладают сходной структурной организацией: содержат Ν-концевой сигнальный пептид, эстеразоподобный домен с двумя местами альтернативного сплайсинга, короткий линкерный регион с низким сходством последовательностей перед трансмембран

- 13 032437 ным доменом и короткую цитозольную часть с высококонсервативной С-концевой последовательностью. Относительно самые высокие уровни содержания нейролигина 4 мРНК были обнаружены в сердце. Более низкая экспрессия была установлена в печени, скелетных мышцах и поджелудочной железе, тогда как в головном мозге, плаценте, легких и почке нейролигин 4 мРНК было трудно обнаружить (Во1Идег е! а1., 2001).

Мутации Х-сцепленного гена ЫБСЫ4 являются потенциальной причиной спектра нарушений аутистического характера, и о мутациях сообщалось у нескольких пациентов с аутизмом, синдромом Аспергера и умственной отсталостью (Затаю е! а1., 2003; Ьаитоптег е! а1., 2004; Ьа^коп-Уиеп е! а1., 2008).

Были описаны немногие случаи ассоциации ЫБСЫ4Х с раком: при желудочно-кишечных стромальных опухолях гиперэкспрессия ЫБСЫ4Х была установлена в детском и юношеском возрасте в отличие от случаев со взрослыми (РтакакБ е! а1., 2005).

Тенасцин С (гексабрахион) (1МА-ТЫС-001).

Внеклеточный матрикс, окружающий опухолевые клетки, отличается от внеклеточного матрикса нормальных тканей. Тенасцин-С (ТЫС) - белок внеклеточного матрикса, который представлен в высокоповышенном количестве в процессах, тесно ассоциированных с повышенной миграционной активностью, такой как эмбриональное развитие (ВайксБ е! а1., 1992), заживление ран (Маск1е е! а1., 1988) и неопластические процессы (С11к|ие!-Е11П8тапп. 1993; С11к.|ие!-Е11П8тапп апб СЫдие!, 2003). Кроме того, ТЫС гиперэкспрессируется в сосудах опухоли, которые имеют высокий пролиферативный индекс, указывающий на то, что ТЫС задействован в неопластическом ангиогенезе (К1т е! а1., 2000). В нормальном человеческом головном мозге экспрессия ТЫС была установлена только в редких случаях, тогда как в злокачественных глиомах он экспрессирован в высокой степени (Воигбоп е! а1., 1983). Экспрессия ТЫС может быть вызвана гипоксией (Ьа1 е! а1., 2001), ТСЕ-β 1, обеспечивая механизм для инвазии глиом высокой степени злокачественности в здоровую паренхиму (Наи е! а1., 2006), или гастрином, который существенно модулирует миграцию человеческих СВМ-клеток (КисНагсхак е! а1., 2001). ТЫС снижает количество тропомиозина-1 и, таким образом, дестабилизирует стрессовые волокна актина. Это вызывает снижение количества ингибитора сигнального ^п!-каскада, ОюккорГ'. Так как снижение экспрессии тропомиозина-1 и возрастание \Уп!-сигналинга тесно связаны с трансформацией и онкогенезом, то ТЫС специфически модулирует данные сигнальные пути, усиливая пролиферацию клеток глиомы (Κιιίζ е! а1., 2004).

Периваскулярное окрашивание ТЫС вокруг кровеносных сосудов, снабжающих опухоль, наблюдалось в тканях мультиформной глиобластомы (СВМ), и менее часто в глиомах II и III степени по ВОЗ, указывая на то, что интенсивность окрашивания ТЫС соотносится со степенью опухоли, причем наиболее сильное окрашивание указывает на плохой прогноз (Него1б-Мепбе е! а1., 2002). ТЫС также вносит свой вклад в генерацию ниши стволовых клеток внутри субвентрикулярной зоны (δνΖ), принимая участие в управлении сигналами фактора роста для ускорения развития нервных стволовых клеток. Доминирующим эффектом ТЫС на клетках δνΖ-зоны является регуляция процессов, связанных с прогрессией (Сагсюп е! а1., 2004). ТЫС является сильнейшим инициатором направленной миграции нервных стволовых клеток человека (ЫЗС). Вырабатываемый опухолью ЕСМ, таким образом, обеспечивает терпимое окружение для тропизма ЫЗС к рассеянным опухолевым клеткам (Ζίιι е! а1., 2006).

Нейрональная молекула клеточной адгезии (IМА-ЫКСАМ-001).

ЫКСАМ (адгезивная молекула нервных клеток) - это нейронная адгезивная молекула трансмембранных клеток со множественными иммуноглобулинподобными типа С2 и фибронектиновыми доменами типа III. Она задействована в управлении, разрастании и фасцикуляции нейронов (Стите! е! а1., 1991; Мота1ек е! а1., 1993; 8!оеск11 апб Ьапбтеккет, 1995; Ретп е! а1., 2001; 8акита1 е! а1., 2001) при формировании гомофильных, в равной степени как и гетерофильных взаимодействий с ЦСАМк (Уо1ктег е! а1., 1996; Закипи е! а1., 1997; Ζасйа^^аκ е! а1., 1999). Связывающаяся с анкирином ЫКСАМ (Όηνίκ апб Веппе!!, 1994) представлена в повышенном количестве в образующих трубки эндотелиальных клетках, позволяя предположить ее возможную роль в образовании трубок и ангиогенезе (АПкепНеаб е! а1., 2002).

ЫКСАМ является геном-мишенью β-катенина и комплекса плакоглобин-ЬЕЕ/ТСЕ, который содействует онкогенезу (Сопаса-ЗоттеП е! а1., 2002). Эктодомен ЫКСАМ может быть сброшен с клеточной поверхности металлопротеазоподобными активностями. Этот сброшенный домен способен активировать разнообразные сигнальные пути, он повышает клеточную подвижность и ведет к онкогенезу у мышей (Сопасс1-8отте11 е! а1., 2005).

ЫКСАМ присутствует в повышенном количестве в анапластичных астроцитомах и опухолевых тканях мультиформной глиобластомы (СВМ) по сравнению с нормальным головным мозгом, и повышенные уровни соотносятся с инвазивным поведением (ЗеНда1 е! а1., 1998). Антисмысловая РНК, в отличие от ЫКСАМ, снижает онкогенную способность СВМ-клеток человека (ЗеНда1 е! а1., 1999).

Инсулиноподобный фактор роста, 2 мРНК-связывающий белок 3 (IМА-IСЕ2ВР3-001).

ЮЕ2ВР3 является членом белкового семейства инсулиноподобных факторов роста II, связывающих мРНК, вовлеченным в локализацию, оборот и трансляционный контроль мРНК. Этот белок содержит несколько КН-доменов (К-гомологических), которые важны в связывании РНК, и о которых известно,

- 14 032437 что они вовлечены в синтез и метаболизм РНК. Экспрессия проявляется, главным образом, во время эмбрионального развития и была описана для некоторых опухолей. Таким образом, 1СЕ2ВР3 рассматривается как онкофетальный белок (Ыао е! а1., 2005). Высокий уровень транскрипции ЮР2ВР3 в многочисленных раковых тканях по сравнению с контрольными тканями указывает на то, что белок ЮР2ВР3 может играть функциональную роль в пролиферации трансформированных клеток. В пользу данной гипотезы говорит и то, что единственной незлокачественной тканью человека, экспрессирующей транскрипт ЮР2ВР3, является человеческая плацента, ткань, характеризующаяся клеточным ростом и пролиферацией (Мие11ег-Р111а8сй е! а1., 1997).

В научной литературе нет специальной информации об экспрессии ЮР2ВР3 в глиобластоме, но описывалось, что ЮР2ВР3 гиперэкспрессирован в нескольких других злокачественных заболеваниях.

Например, ЮР2ВР3 экспрессирован в образце светло-клеточной почечно-клеточной карциномы (ЯСС), и его экспрессия ассоциирована с распространенной стадией и степенью первичных опухолей. Кроме того, положительная экспрессия ЮР2ВР3 ассоциирована с повышенным в 5-10 раз риском отдалённых метастазов и с повышенным на 42-50% риском летального исхода от ЯСС (НоГГтапп е! а1., 2008; Лапд е! а1., 2006; Лапд е! а1., 2008). Экспрессия ЮР2ВР3 обнаруживалась также в злокачественной меланоме в сравнении с доброкачественными невусами, где не было явной экспрессии, даже если присутствовали диспластические черты (Ргуог е! а1., 2008). У пациентов, страдающих плоскоклеточной карциномой пищевода, Т-клетки, специфические для НЕА-А*2402-рестриктированного пептидного эпитопа из ЮР2ВР3, могли наблюдаться в инфильтрирующих опухоль лимфоцитах (ТГЪ), лимфоцитах региональных лимфатических узлов и лимфоцитах периферической крови в 40% всех случаев (М12цкаш1 е! а1., 2008).

ЮР2ВР3 также высоко экспрессирован в карциномах поджелудочной железы. В 2 исследованиях >90% проб тканей опухолей поджелудочной железы проявляли экспрессию ЮР2ВР3 после иммуноокрашивания, в то время как не неопластические ткани поджелудочной железы были негативными для ЮР2ВР3. Кроме того, экспрессия прогрессивно возрастала вместе со стадией опухоли (Уапйкк е! а1., 2005; ΥηηΙίδδ е! а1., 2008). Экспрессия ЮР2ВР3 была таклсе обнаружена в существенно повышенном состоянии в уротелиальных опухолях высокой степени, в то время как он обычно не экспрессирован в доброкачественном уротелии или уротелиальных опухолях низкой степени. Более того, пациенты с ЮР2ВР3-положительными опухолями имеют намного более низкий процент выживаемости без прогрессирования и выживаемости без болезни, чем те, что имеют ЮР2ВР3-негативные опухоли (Ь1 е! а1., 2008; Бйшкоуа е! а1., 2008; 2йепд е! а1., 2008).

ВСАЫ - Бревикан (1МА-ВСА-002).

Бревикан (ВСАЫ) является специфическим для головного мозга членом лектинового семейства хондроитинсульфатпротеогликанов. Сообщалось о двух изоформах ВСАЫ: изоформе с полной длиной цепи, секретируемой во внеклеточный матрикс, и более короткой изоформе с последовательностью, которая предсказывает наличие гликофосфатидилинозитольного (СР1) якоря. Секретируемая изоформа высоко экспрессирована от рождения в течение первых 8 лет жизни, а к 20 годам ее активность снижается до низких уровней, которые сохраняются в нормальном взрослом корковом веществе. Изоформа СР1 экспрессирована на постоянно низких уровнях во время развития (Сагу е! а1., 2000). ВСАЫ принадлежит к семейству протеогликанов, описываемых обычно как барьерные молекулы, которые препятствуют клеточной и нейритной подвижности во взрослой нервной системе (У1ар1апо апб МаЯйете, 2006). Ιη νίνο, ВСАЫ экспрессирован вокруг границ рострального миграционного потока (ба\\'ог5к| апб Радег, 2000) и является основным компонентом с повышенным количеством глиального рубца после травмы нервной системы (ба\\'ог5к| е! а1., 1999).

ВСАЫ имеет разительно высокое повышение количества в глиомах, где может быть установлено приблизительно 7-кратное повышение экспрессии по сравнению с нормальными уровнями (Сагу е! а1., 2000; Сагу е! а1., 1998). Экспрессия детектируется на границах инвазии экспериментально индуцированных опухолей (С1а§8 е! а1., 2005) и повышена в опухолях с инфильтрирующими профилями (РЫШрк е! а1., 2006). В клинических случаях повышение количества ВСАЫ соотносится с низкой выживаемостью пациентов с глиомами высокой степени злокачественности (Ь1апд е! а1., 2005). В дополнение к увеличению уровня ВСАЫ в глиоме протеолитический процессинг белка полной длины может также вносить свой вклад в инвазию (Сагу е! а1., 1998; ΝιιΙΙ е! а1., 2001). Расщепление ВСАЫ металлопротеазами семейства АЭАМТ8 является необходимым этапом в опосредовании его проинвазивного эффекта в глиоме. При генерации сайт-специфической мутантной формы, которая устойчива к расщеплению АЭМАТ8, было показано, что эта не расщепляемая форма ВСАN не способна усиливать инвазивность глиомных клеток ш νίίτο и прогрессию опухоли ш νίνο (2йапд е! а1., 1998; У1ар1апо е! а1., 2008). На молекулярном уровне ВСАN способствует активации ЕСЕЯ, увеличивает экспрессию молекул клеточной адгезии и способствует секреции фибронектина (Ни е! а1., 2008).

ВСАN мРНК не был обнаружен в пробах коркового вещества взрослых людей у индивидов, которые умерли без нейрологических осложнений. Как яркое отличие ВСАN мРНК был обнаружен в каждой из 27 хирургических проб человеческой глиомы, таким образом, вызывая предположение, что ВСАN может быть единственным селективным маркером в глиоме (ба\\'ог5к| е! а1., 1996).

- 15 032437

Повышенное количество Βί'ΆΝ в глиоме не только ведет к общему повышению экспрессии, но и также к специфической для глиомы экспрессии дифференциально гликозилированных изоформ. Таким образом, В/Ь_Дд является продуктом ΒСΑN мРНК полной длины, который возникает из неполного или сокращенного гликозилирования центрального белка. В/Ь_Дд экпрессирован на очень низком уровне во время второй половины пренатального и в первые дни постнатального развития, исчезает к одному году и отсутствует в нормальном взрослом головном мозге, но обнаруживается в пробах глиомы высокой степени злокачественности. В одном исследовании могло быть показано, что В/Ь_Дд присутствовал в каждой пробе глиомы высокой степени злокачественности, степени 3 и 4, являясь причиной половины полной гиперэкспрессии, превышающей контрольные уровни, для не расщепленного Βί'ΆΝ. Пробы, которые были негативными для В/Ь_Дд, принадлежали пациентам с диагнозом опухоли низкой степени злокачественности (У1ар1апо е! а1., 2005). Данная специфическая для глиомы высокой степени злокачественности экспрессия могла, таким образом, представлять реактивацию ранних программ развития, механизма, который задействован в прогрессии глиомы (БеуйтеР, 2001). 1МА-ВСА-002 содержит потенциальный сайт гликозилирования внутри своей последовательности. Было показано, что он является сильно иммуногенным в сравнении с другими пептидами, образованными из Βί'ΆΝ (1МА-ВСА-001), не имеющими сайта гликозилирования. Кроме того, Βί'ΆΝ описывали как селективно гиперэкспрессированный в одном виде образованных из глиобластомы опухолевых клеток, которые проявляют наиболее высокую плюрипотентность и онкогенность (Оип!йег е! а1., 2008).

Ме!-протоонкоген (рецептор фактора роста гепатоцитов) (1МА-МЕТ-005).

Протоонкоген МЕТ, с-Ме!, кодирует рецептор трансмембранной тирозинкиназы, который способен модулировать клеточную пролиферацию, дифференциацию, подвижность, адгезию и инвазию. Он активируется фактором роста гепатоцитов (НОР) (ОютРапо е! а1., 1989; Тти8о1шо апб Сотодйо, 2002).

Сигнальные реакции с-Ме! задействованы в регенерации органов, как было продемонстрировано, для печени и почек, эмбриогенеза, кроветворения, развития мышц и при регуляции миграции и адгезии нормально активированных β-клеток и моноцитов (Νηΐάίηί е! а1., 1991; М|/ипо е! а1., 1993; В1аР! е! а1., 1995; 8сйт1Р! е! а1., 1995; 2атпедат апР М1сйа1орои1о8, 1995; νаη Ре г Уоой е! а1., 1997; Вейтапп е! а1., 2000).

В исследованиях различных видов опухолей было продемонстрировано несколько механизмов для активации с-Ме!, включая аутокринную петлю НСР/с-Ме!, активацию точечных мутаций, белок слияния ТРВ-Ме! и неспособность расщепления с-Ме! на а- и β-цепи (Рагк е! а1., 1986; МопРшо е! а1., 1991; ЕЬей е! а1., 1994; 8сйт1Р! е! а1., 1997; ОКтего е! а1., 1999; Рагк е! а1., 1999; Όί Репхо е! а1., 2000). Конститутивная активация с-Ме! посредством фосфорилирования также описывалась в качестве важного механизма онкогенеза при светлоклеточной ВСС (почечно-клеточная карцинома) у человека (№1ка1да\та е! а1., 2006).

Далее многочисленные исследования показали, что гиперэкспрессия с-Ме! задействована в злокачественной трансформации и инвазивности злокачественных клеток. с-Ме! опосредует мультифункциональные и потенциально онкогенные активности фактора роста гепатоцитов НСР (Во!!аго е! а1., 1991; ВиЫп е! а1., 1993; 2атпедат апР М1сйа1орои1о8, 1995). При связывании с рецептором НСР вызывает автофосфорилирование с-Ме! и активирует сигнальные процессы по ходу транскрипции, включая так, фосфатидилиноситол 3'-киназу, фосфолипазу С и активированные митогеном белковые каскады реакций, связанные с киназой (№1Рйи е! а1., 1991; РопхеНо е! а1., 1993; Моп!екапо е! а1., 1998; Ригде е! а1., 2000; Оопд е! а1., 2001; Ригде е! а1., 2001). Ген с-Ме! экспрессирован преимущественно в эпителиальных клетках и гиперэкспрессирован в нескольких злокачественных тканях и клеточных линиях (Όί Репхо е! а1., 1995; Регтааш е! а1., 1995; Тиск е! а1., 1996; Коосйекроит е! а1., 1997; Рщсйет е! а1., 1998; Ратче/ е! а1., 2000; Ы е! а1., 2001; Маийк е! а1., 2002; ф1ап е! а1., 2002).

Гиперэкспрессия с-Ме!, зачастую вызванная опухолевой гипоксией, ведёт к конститутивной активации рецептора и соотносится с плохим прогнозом. Выключение эндогенного гена с-МЕТ приводит к сбоям в выполнении полной программы инвазивного роста ш т11го, отсутствию роста опухоли и снижению образования экспериментальных метастазов ш тйо (Согко е! а1., 2008).

Гиперэкспрессия с-МЕТ описывалась для СВМ (Тко е! а1., 2006). с-Ме! соотносится с гистологической степенью опухоли, позволяя предположить, что образование аутокринной петли НСР/с-МЕТ появляется вместе с прогрессией астроцитных опухолей головного мозга. Поэтому считается, что НСР демонстрирует активность, индуцирующую миграцию/инвазию для клеток СВМ, несущих рецептор с-Ме! (Мопуата е! а1., 1999). Промотор с-Ме! содержит индуцируемые при гипоксии фактор-1-связывающие сайты, таким образом, было показано, что гипоксия активирует промотор с-Ме! и приводит к высоким уровням его экспрессии. Приблизительно половина всех человеческих глиобластом (СВМ), как считается, отвечает на гипоксию индукцией с-Ме!, который может усиливать стимулирующий эффект НСР на миграцию опухолевых клеток (Ескепсй е! а1., 2007) и может привлекать стволовые клетки нервной системы к опухоли (КепРа11 е! а1., 2008). с-Ме! и ЕСРВ часто коэкспрессированы при злокачественной астроцитоме (Рехшк е! а1., 2008). Как было продемонстрировано, активирующий сайт фосфориляции на рецепторе с-Ме! сильно чувствителен к уровням ЕОРКаШ, что предполагает перекрестную связь между ЕСРРт111 и рецептором с-Ме! в глиобластоме (Ниапд е! а1., 2007а; Ниапд е! а1., 2007Ь). МЕТ предлагался

- 16 032437 в качестве маркера для стволовых раковых клеток в глиобластоме (Каш е! а1., 2008). Другое исследование показало, что МЕТ был селективно гиперэкспрессирован в другом подтипе образованных из ОВМ раковых стволовых клеток (Оип!йег е! а1., 2008).

Промежуточные результаты второй фазы исследования с пациентами с рецидивирующей ОВМ с использованием АМО102, человеческого нейтрализующего антитела против НОР, позволяют предположить, что у некоторых пациентов заболевание может зависеть от сигнальных путей с-МЕТ-НОР, так как из участвовавших 18 пациентов у 1 наблюдался частичный ответ, у 1 - меньший ответ и у 2 - стабильное протекание болезни (Кеагбоп е! а1., 2008).

Интересно, что существует некоторая очевидность для взаимодействия сигнальных реакций МЕТ с каскадом реакций Жп!β-катенина, зачастую представленного в повышенном количестве при раке толстой кишки. МЕТ может активироваться простагландином Е2 (РОЕ2), и РОЕ2-активированный с-Ме! ассоциируется с β-катенином, увеличивая его тирозиновое фосфорилирование, тем самым индуцируя инвазивность раковых клеток при раке толстой кишки (Ра1 е! а1., 2003). Недавно была описана совместная активация МЕТ и β-катенина, приводящая к положительному контуру обратной связи между этими двумя ключевыми игроками при колоректальном онкогенезе (Казо1а е! а1., 2007).

Уровень экспрессии с-Ме! мРНК в первичных опухолях КРР (п = 36) является важным предсказывающим маркером для инвазии на ранних стадиях и региональных метастазов заболевания, таким образом, находясь в прямом соотношении со стадией рака толстой кишки (ТакеисЫ е! а1., 2003). Другой анализ экспрессии с-Ме! в 130 пробах КРР показал гиперэкспрессию (Т/Ν >2,0) с-Ме! в 69% случаев первичного КРР и значительно повышенные уровни с-Ме! при КРР с поражением кровеносных сосудов (Р = 0,04) и на поздней стадии (Р = 0,04), подтверждая роль с-Ме! в прогрессировании и распространении метастазов при КРР человека (2еп§ е! а1., 2004). В другом исследовании в 69% и 48% из 60 аденокарцином толстой кишки было установлено повышение с-Ме! мРНК в более чем 2 и более чем 10 раз, соответственно, по сравнению со смежной нормальной слизистой оболочкой (Катти1а е! а1., 2007). Таким образом, увеличение передачи сигналов с-Ме! является широко распространенным явлением на ранней стадии КРР, но и проявляющееся даже с еще большей экспрессией на поздних стадиях и при метастатической болезни.

Таблица 4 Дополнительные иммуногенные пептиды, полезные для композиции по . изобретению

№ последти	Ю пептида	Последовательность	Символ гена	Функция	связывается с МНС
9	РТР-003	ΑΙΙϋθνΕδν	ΡΤΡΚΖ1		НЬА-А*02
10	РТР-005	ΚνΓΑΟΙΡΤν	ΡΤΡΚΖ1		НЬА-А*02
11	СН1-001	ЗЬУ/АСУУУЬ	СН13Ъ2		НЬА-А*02
12	ΒΙΚ-002	ТЬСЕГЕКЬОКЕКАКН	В1К.С5		НЬА-ϋΚ и НЕА-А*02
13	(НВУ- 001)	ЕЬР8ОРГР8У		контрольный пептид
14	СОС42- 001	ΏΏΡ8ΤΙΕΚΕΑΚΝΚΡΚΡ	СОС42		НЬА-ϋΕ
15	СЭС42- 002	ΝΚρΚΡΙΤΡΕΤΑΕΚΕΑΚϋ	СЭС42		НЬА-ϋΚ.
16	8РР1-001	ΝΟΑΥΚΑΙΡνΑΟΟΣΝΑΡδ	8РР1		НЬА-ОК
17	В1К-002а	ТЬСЕРЕКЕОКЕКАКО	Сурвивин		НЬА-ϋΚ. и НЬА-А*02
18	В1К.-002Ъ	ГТЕЬТЕОЕГ	Сурвивин		НЬА-А1
19	В1К-002с	ЬМЕОЕГЕКЬ	Сурвивин		НЕА-А2
20	ΒΙΚ-0026	ЕРОЬАОСГУ	Сурвивин		НЬА-В35

8ЕС) ГО № 14, 8ЕС) ГО № 15 и 8ЕС) ГО № 16 раскрыты в патенте ЖО 2007/028574, СНС42 (цикл клеточного деления 42) является белком, вовлеченным в регуляцию клеточного цикла. Белок является малой ОТР-азой подсемейства Кйо, которая регулирует сигнальные пути, которые контролируют различные клеточные функции, включая клеточную морфологию, миграцию, эндоцитоз и прохождение клеточного цикла. Как было установлено, СОС42 высокогиперэкспрессирован при глиобластоме.

В патенте ЖО 2004/067023 описываются пептиды, рестриктированные по МНС класса I, образованные из опухолеассоциированного антигена сурвивина, пептиды из которого способны связываться с молекулами I класса НЕЛ с высокой аффинностью.

Секретированный фосфопротеин 1 (8РР1), также известный как костный сиалопротеин I (В8Р-1), ранняя активация Т-лимфоцитов (ЕТА-1) и под наиболее известным названием остеопонтин (ОРК), является человеческим генным продуктом, который также сохраняется и у других видов. Остеопонтин участвует в качестве важного фактора при ремоделировании костей. В особенности исследования предполагают, что он играет роль в фиксации остеокластов к минеральной матрице костей. Органическая часть кости составляет около 20% сухого веса и включает другие, чем остеопонтин, составные, - коллаген типа I, остеокальцин, остеонектин, костный сиалопротеин и щелочную фосфатазу. На коллаген типа I прихо

- 17 032437 дится 90% белковой массы.

ΟΡΝ связывается с несколькими рецепторами интегрина, включая α4β1, α9β1 и α9β4, экспрессируемыми лейкоцитами. Для этих рецепторов была хорошо обоснована функция в клеточной адгезии, миграции и выживаемости этих клеток. Поэтому последние исследования были сфокусированы на роли ΟΡΝ в опосредовании таковых ответов.

Остеопонтин экспрессирован в диапазоне иммунных клеток, включая макрофаги, нейтрофилы, дендритные клетки и Т- и В-клетки с разнообразной кинетикой. Об ΟΡΝ сообщалось, что он выступает в качестве иммунного модулятора с разнообразием способов действия. Во-первых, он имеет хемотактические свойства, которые способствуют рекрутингу клеток к местам воспаления. Он также действует как белок адгезии, участвуя в присоединении клеток и заживлении ран. Помимо этого, ΟΡΝ опосредует клеточную активацию и выработку цитокинов, а также способствует выживаемости клеток при регуляции апоптоза.

Активированные Т-клетки поддерживаются ИЛ-12 для дифференциации до типа ТЫ с выработкой цитокинов, включая ИЛ-12 и ΙΕΝγ. ΟΡΝ ингибирует выработку Т112 цитокина ИЛ-10, который приводит к усиленному ответу ТЫ. ΟΡΝ влияет на опосредованную клетками иммунность и имеет функции цитокина ТЫ. Он усиливает выработку В-клеточного иммуноглобулина и пролиферацию. В последних исследованиях 2008 г. делается предположение, что ΟΡΝ также вызывает дегрануляцию тучных клеток. Щадакака А., Ма!кие Н., Ма!кикЫта Н., е1 а1. (РеЬгиагу 2008). Όδ^οροπίιπ ίκ ргобисеб Ьу так! се11к апб аГГес!к 1дЕ-теб1а!еб бедгапи1а!1оп апб т1дгабоп оГ так! се11к. Еиг. 1. 1ттипо1. 38 (2): 489-99]. Исследователи заметили, что 1дЕ-опосредованная анафилаксия была значительно снижена у ΟΡΝ-нокаутных мышей по сравнению с мышами дикого вида. Роль ΟΡΝ в активации макрофагов рассматривалась также в исследовании рака, когда исследователи обнаружили, что ΟΡΝ-вырабатывающие опухоли были способны индуцировать активацию макрофагов по сравнению с опухолями с недостатком ΟΡΝ [21].

ΟΡΝ является важным антиапоптическим фактором при многих обстоятельствах. ΟΡΝ блокирует вызванную активацией клеточную смерть макрофагов и Т-клеток в равной степени, как и фибробластов и эндотелиальных клеток, не защищенных от опасных стимулов. ΟΡΝ предупреждает не запрограммированную смерть клетки при воспалительном колите.

Тот факт, что ΟΡΝ взаимодействует со множеством рецепторов на поверхности клетки, которые повсеместно экспрессированы, делает его активным участником многих физиологических и патологических процессов, включая заживление ран, ремоделирование кости, онкогенез, воспаление, ишемию и иммунные реакции. Поэтому манипуляция плазменных уровней ΟΡΝ может быть полезна при лечении аутоиммунных заболеваний, раковых метастазов, остеопороза и некоторых форм стресса.

Было показано, что ΟΡΝ возбуждает выработку ИЛ-17; ΟΡΝ гиперэкспрессирован в различных видах рака, включая рак легких, рак молочной железы, колоректальных рак, рак желудка, рак яичника, меланому и мезотелиому; ΟΡΝ содействует гломерулонефриту и тубулоинтерстициальному нефриту; и ΟΡΝ был обнаружен в атеросклеротических бляшках внутри артерий. Таким образом, манипуляция плазменных уровней ΟΡΝ может быть полезна при лечении аутоиммунных заболеваний, раковых метастазов, остеопороза и некоторых форм стресса.

Белковая тирозин-фосфатаза, рецепторного типа, 2е!а1 (ΡΈΡΚΖ1, РТР-ξ).

ΡТΡΚΖ1 является членом семейства белковых тирозинфосфатаз рецепторного типа и кодирует проходящий через мембрану только один раз мембранный белок Ι типа с двумя цитоплазматическими тирозин-белковыми фосфатазными доменами, одним α-углеродным ангидразным доменом и фибронектиновым доменом III типа. Экспрессия этого гена индуцирована в раковых клетках желудка (Аи е! а1., 2006), при раке молочной железы ^κζ-Ρί^ιπ е! а1., 2007), при повторной миелинизации олигодендроцитов при поражении множественным склерозом (НаггосЬ е! а1., 2002) и в эмбриональных клетках почек человека в условиях гипоксии (Аапд е! а1., 2005).

Как белок, так и транскрипт гиперэкспрессированы в клетках глиобластомы, способствуя их гаптотактической миграции (Ьи е! а1., 2005) и геномной амплификации ДНК в глиобластоме (МиШойапб е! а1., 2006).

Хитиназа-3-подобный белок 2 (СН13Б2).

СН13Б2 был первоначально идентифицирован из хондроцитов, и он представлен в повышенном количестве, например, при остеоартрите (8!еск е! а1., 2002). Хотя этот белок еще не достаточно хорошо охарактеризован, он, скорее всего, секретируется во внеклеточное пространство. Его часто описывали как антиген-мишень при ревматическом артрите. Экспериментальная индукция антиангиогенеза при трансфекции κίΡΒΚ (УЕ6Е-А) человеческой глиомной клеточной линии вызвала повышение количества СН13Б2.

Сурвивин (В1К.С5).

Экспрессия В1К.С5 (сурвивин), члена семейства белков-ингибиторов апоптоза (ΙΑΡ), содержится в повышенном количестве в фетальных тканях и различных видах рака человека. Предполагается, что сурвивин способен к регуляции как клеточной пролиферации, так и отмирания апоптических клеток. В особенности, в глиобластоме обнаруживаются очень высокие уровни экспрессии сурвивина (Апдбеп е! а1.,

- 18 032437

2008). Предполагается, что гиперэкспрессия сурвивина в глиомах головного мозга может играть важную роль в злокачественной пролиферации, антиапоптозе и ангиогенезе (Уйеп е! а1., 2005; йш е! а1., 2006). В особенности для глиобластомы, но и также для других видов опухолей, экспрессия сурвивина была существенно ассоциирована со степенью злокачественности (с наибольшей экспрессией сурвивина в глиобластоме) и более короткими общими сроками выживаемости по сравнению с пациентами, у которых были сурвивин-негативные опухоли (1<ар\уага е! а1., 2003; 8айо е! а1., 2007; Иета!ки е! а1., 2005; Ме11а1 е! а1., 2008; Сгипда е! а1., 2006; Х|е е! а1., 2006; 8акак| е! а1., 2002; Сйакгауагй е! а1., 2002).

Коровый антиген вируса гепатита В.

Для корового белка НВс вируса гепатита В (НВУ) иммуногенные пептиды хорошо известны (Вейо1еШ е! а1., 1993; Ыттдйоп е! а1., 1997). Пептид из НВс, состоящий из десяти аминокислот, может быть включен в качестве положительного контроля в противораковые вакцины, основанные на настоящем изобретении, для контроля иммунокомпетентности и успешной иммунизации пациентов. В предпочтительном воплощении изобретения фармацевтическая композиция включает по крайней мере два пептида, содержащих аминокислотную последовательность в соответствии с 8ЕО ГО № 1 и аминокислотную последовательность в соответствии с 8ЕО ГО № 12 или 8ЕО ГО № 17.

В предпочтительном воплощении изобретения фармацевтическая композиция включает по крайней мере два пептида, содержащих аминокислотную последовательность в соответствии с 8ЕО ГО № 1 и аминокислотную последовательность в соответствии с 8ЕО ГО № 2 и/или 8ЕО ГО №17.

В предпочтительном воплощении изобретения фармацевтическая композиция включает по крайней мере два пептида, содержащих аминокислотную последовательность в соответствии с 8ЕО ГО № 3 и аминокислотную последовательность в соответствии с 8ЕО ГО № 2 и/или 8ЕО ГО № 17.

В предпочтительном воплощении изобретения фармацевтическая композиция включает по крайней мере два пептида, содержащих аминокислотную последовательность в соответствии с 8ЕО ГО № 1 и аминокислотную последовательность в соответствии с 8ЕО ГО № 7 и опционально 8ЕО ГО № 17.

В предпочтительном воплощении изобретения фармацевтическая композиция включает по крайней мере два пептида, содержащих аминокислотную последовательность в соответствии с 8ЕО ГО № 2 и аминокислотную последовательность в соответствии с 8ЕО ГО № 7 и опционально 8ЕО ГО № 17.

В предпочтительном воплощении изобретения фармацевтическая композиция включает по крайней мере два пептида, содержащих аминокислотную последовательность в соответствии с 8ЕО ГО № 3 и аминокислотную последовательность в соответствии с 8ЕО ГО № 7 и опционально 8ЕО ГО № 17.

В еще более предпочтительном воплощении фармацевтическая композиция включает по крайней мере один дальнейший пептид, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из 8ЕО ГО № 2 по 8ЕО ГО № 11 и 8ЕО ГО № 14 по 8ЕО ГО № 20, и/или аминокислотную последовательность, которая по крайней мере на 80% идентична 8ЕО ГО № 2 по 8ЕО ГО № 11 или 8ЕО ГО № 14 по 8ЕО ГО № 20, и/или полинуклеотид, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую 8ЕО ГО № 2 по 8ЕО ГО № 11 или 8ЕО ГО № 14 по 8ЕО ГО № 20, или вариантную аминокислотную последовательность и фармацевтически приемлемый носитель.

Дальнейшие предпочтительные воплощения изобретения включают по крайней мере 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 12, 13, 14, 15, 16, 17 или18 пептидов, содержащих аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из 8ЕО ГО № 1 по 8ЕО ГО № 12 и 8ЕО ГО № 14 по 8ЕО ГО № 20, и/или аминокислотную последовательность, которая по крайней мере на 80% идентична 8ЕО ГО № 1 по 8ЕО ГО № 12, и/или полинуклеотид, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую 8ЕО ГО № 1 по 8ЕО ГО № 12 и 8ЕО ГО № 14 по 8ЕО ГО № 20, или вариантную аминокислотную последовательность и фармацевтически приемлемый носитель.

Фармацевтическая композиция в дальнейшем может содержать дополнительные пептиды и/или наполнители для большей эффективности, как это будет пояснено ниже.

Вариантной аминокислотной последовательностью данной аминокислотной последовательности изобретатели обозначают, что боковые цепи, например, одного или двух аминокислотных остатков изменены (например, при их замещении боковой цепью другого встречающегося в природе аминокислотного остатка или какой-либо другой боковой цепью), так что пептид по-прежнему способен связываться с молекулой НЙА, по существу, таким же путем, как и пептид, состоящий из данной аминокислотной последовательности. Например, пептид может быть модифицирован таким образом, что он, по крайней мере, сохранит, если не улучшит, способность взаимодействовать и связываться с подходящей молекулой МНС, такой как НЙА-А или -ЭЯ, и так что он, по крайней мере, сохранит, если не улучшит, способность генерировать активированные ЦТЛ, которые могут распознавать и уничтожать клетки, которые экспрессируют полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, как определено в аспектах данного изобретения. Как может быть извлечено из банка данных, определенные позиции связывающихся с НЙА-А пептидов являются типичными якорными остатками, образующими центральную последовательность, подходящую к соединительному элементу НйА-связывающей бороздки.

Те аминокислотные остатки, которые не обязательны для взаимодействия с Т-клеточным рецептором, могут быть модифицированы при замещении другой аминокислотой, чье включение, по существу, не влияет на реактивность Т-клетки и не устраняет связь с релевантным МНС. Таким образом, помимо

- 19 032437 данного условия, пептид по изобретению может быть любым пептидом (в обозначение которого изобретатели включают олигопептиды или полипептиды), который включает аминокислотные последовательности или их участок или их вариант, как дано.

В дальнейшем известно, что пептиды, презентированные МНС класса II, образованы коровой последовательностью, имеющей конкретный НЬЛ-специфический аминокислотный фрагмент и, факультативно, Ν- и/или С-терминальные удлиняющие сегменты, которые не препятствуют функции коровой последовательности (т.е. считаются нерелевантными для взаимодействия пептида и Т-клетки). Ν- и/или С-терминальные удлиняющие сегменты могут иметь длину, например, от 1 до 10 аминокислот соответственно. Эти пептиды могут быть использованы как непосредственно для погрузки на молекулы МНС класса II, так и последовательность может быть клонирована на векторы в соответствии с описанным ниже. Так как эти пептиды образуют конечный продукт процессинга более длинных пептидов внутри клетки, то более длинные пептиды могут использоваться в равной степени. Пептиды по изобретению могут быть любого размера, но типично они могут иметь молекулярный вес менее чем 100000, предпочтительно менее чем 50000, более предпочтительно менее чем 10000, более предпочтительно менее чем 5000, более предпочтительно менее чем 2500 и типично около 1000 и до 2000. В отношении числа аминокислотных остатков пептиды по изобретению могут иметь менее чем 1000 остатков, предпочтительно менее чем 500 остатков, более предпочтительно менее чем 100 остатков. Соответственно, настоящее изобретение обеспечивает также композиции из пептидов и их вариантов, в которых пептид или вариант имеет общую длину между 8 и 100, предпочтительно между 8 и 30 и наиболее предпочтительно между 8 и 17, а именно 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 или 16 аминокислот. Предпочтительными являются пептиды с коровой последовательностью, выбранной из группы, состоящей из 8ΕΟ Ю № 8, 8ΕΟ Ю № 12 и 8ΕΟ Ю № 14 по 8ΕΟ Ш № 20 с удлиняющими сегментами из 1 до 10 аминокислот на С-терминальном и/или Νтерминальном конце, более предпочтительно, если общее число данных примыкающих аминокислот составляет от 1 до 12, более предпочтительно от 1 до 10, более предпочтительно от 1 до 8, более предпочтительно от 1 до 6, где примыкающие аминокислоты могут быть распределены в любом соотношении к С-концу и Ν-концу (например, все примыкающие аминокислоты могут быть добавлены к одному концу, или же аминокислоты могут быть добавлены в равном количестве к обоим концам или в любой другой пропорции), при условии, что пептид по-прежнему способен связываться с молекулой НЬЛ таким же путем, как и указанный пептид в соответствии с любой из 8ΕΟ Ю № 8, 8ΕΟ Ю № 12 и 8ΕΟ Ю № 14 по 8ΕΟ ГО № 20.

В соответствии с этим варианты, которые индуцируют Т-клеточную перекрестную реакцию с пептидом по изобретению, часто являются вариантами по длине.

Если пептид, который длиннее чем около 12 аминокислотных остатков, непосредственно используется для связывания с молекулой МНС II класса, предпочтительно, чтобы остатки, которые примыкают к центральному НЬЛ-связывающему региону, по существу, не влияли на способность пептида специфически связываться со связывающей бороздкой молекулы МНС II класса или презентировать пептид ЦТЛ. Тем не менее, как уже было указано выше, следует понимать, что могут быть использованы более крупные пептиды, в особенности, если они закодированы полинуклеотидом, потому что такие крупные пептиды могут быть разделены на фрагменты подходящими антигенпрезентирующими клетками. Кроме того, примыкающие аминокислоты могут также снижать скорость деградации пептидов ш у1уо, так что количество фактического пептида, находящегося в распоряжении ЦТЛ, выше по сравнению с пептидом без примыкающих аминокислот.

Также возможно, чтобы эпитопы МНС I класса, хотя они обычно имеют длину между 8-10 аминокислотами, генерировались при процессинге пептидов из более длинных пептидов или белков, включающих истинный эпитоп. Так же как и в случае с эпитопами МНС II класса, предпочтительно, чтобы примыкающие остатки удлиненных пептидов-предшественников против и/или по ходу транскрипции Νи С-конца истинного эпитопа существенно не влияли на презентацию пептида ЦТЛ и не маскировали сайты для протеолитического расщепления, необходимые для получения истинного эпитопа, опосредованного процессингом удлиненного пептида.

Предпочтительными являются пептиды с коровой последовательностью, состоящие из 8ΕΟ Ш № 1 по 8ΕΟ Ю № 7 и 8ΕΟ Ю № 9 по 8ΕΟ Ю № 11 с удлиняющими сегментами из 1 до 10 аминокислот на Стерминальном и/или Ν-терминальном конце, более предпочтительно, если общее число данных примыкающих аминокислот составляет от 1 до 12, более предпочтительно от 1 до 10, более предпочтительно от 1 до 8, более предпочтительно от 1 до 6, где примыкающие аминокислоты могут быть распределены в любом соотношении к С-концу и Ν-концу (например, все примыкающие аминокислоты могут быть добавлены к одному концу, или же аминокислоты могут быть добавлены в равном количестве к обоим концам или в любой другой пропорции), при условии, что пептид по-прежнему способен связываться с молекулой НЬЛ таким же путем, как и указанный пептид в соответствии с любой из 8ΕΟ Ш № 1 по 8ΕΟ ГО № 7 и 8ΕΟ ГО № 9 по 8ΕΟ ГО № 11.

Соответственно, настоящее изобретение обеспечивает также пептиды и варианты эпитопов МНС I класса, имеющие общую длину между 8 и 100, предпочтительно между 8 и 30 и наиболее предпочтительно между 8 и 18, а именно 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 или 17 аминокислот.

- 20 032437

Разумеется, пептид или вариант в соответствии с настоящим изобретением будет обладать способностью связываться с молекулой главного комплекса гистосовместимости человека МНС I или II класса. Связывание пептида или варианта с комплексом МНС может быть проверено методами, известными из уровня техники, например теми, что описываются в литературе для различных аллелей МНС II класса (например, Уод1 АВ, КгорвЛоГег Н., Ка1ЬасЛег Н., Ка1Ьив М., Ваттепвее Н.О.. СоНдап ТЕ.. Магйп В.; ЫдапЕ токГв оГ НЬА-ПВВ5*0101 апЕ ОВВ1*1501 то1еси1ев Еекпеа1еЕ Ггот ве1Г-рерБЕев; 1 Iттиηо1. 1994; 153(4):1665-1673; Ма1сЛегек О., Спаи V., 81еуапоук 8., Ваттепвее Н.О., Лтд О., Ме1тв А.; Апа1ув1в оГ а11е1е-вресйк соШаШ вЛев оГ па1ига1 НЬА-ОВ17 кдапЕв; 1 Iттиηо1. 1994; 153(3):1141-1149; Мата 8, 8Шгшо1о Т, киго МА, Наттег 1. 81шдад11а Р, Борреп С, 8радпо11 С, Ма/ζί В, Ве11опе М, ЭекаЬопа Р, РгоШ МР; Ме1апота се11в ргевеШ а МАОЕ-3 ерЛоре Ю СЭ4(+) су1о1охк Т се11в т аввоаакоп ^ЛЛ ЫвШсотраЕЬПЛу 1епкосу1е апкдеп ОВ11; 1 Ехр МеЕ. 1999; 189(5): 871-876; Наттег 1, Оа11аζζ^ Р, Вопо Е, Кагг В^, Оиепо11. Vа1вавη^η^ Р, Баду ΖΆ, 81шдад11а Р; РерЕЕе ЬтЕтд вресЛкЛу оГ НЬА-ОВ4 то1еси1ев: согге1акоп ^ЛЛ гЛеита1о1Е аг1ЛгЛ1в аввоаакоп; 1 Ехр МеЕ. 1995 181(5):1847-1855; Тотрктв 8М, Во1а РА, Мооге 1С. кпвеп РЕ; А еигортт £1иого1ттипоаввау Гог теавштд ЬтЕтд оГ апкдеп 1о с1авв II МНС д1усорго1етв; 1 Iттиηо1 Ме11юЕв. 1993;163(2): 209-216; Воу1оп В1, ЬоЛтапп Т, ЬопЕе1 М, Ка1ЬасЛег Н, На1Еег Т, Рга1ег А1, Эопек ОС, Левке ΌΟ, Р1ауе11 ВА, АЛтапп ОМ; О1и1атк ас1Е ЕесагЬоху1аве 1 1утр1юсу1е гевропвев аввотакЕ ^ЛЛ вивсерЕЬЛЛу ог гев1в!апсе Ю 1уре I Е1аЬе1ев: апа1ув1в т Е1веаве Е1всогЕап1 Литап 1\утв. поп-оЬеве Е1аЬекс тке апЕ НЬА-ОО Еапвдешс тке; Ш: Iттиηо1. 1998 (12): 1765-1776).

Дополнительные фрагменты аминокислот, находящиеся на Ν- и/или С-конце, не являющиеся обязательно формирующими часть пептида, которая функционирует как истинный эпитоп для молекул МНС, могут, тем не менее, быть важны для обеспечения эффективного введения пептида в соответствии с настоящим изобретением в клетки (см. выше). В одном воплощении настоящего изобретения пептид настоящего изобретения является белком слияния, который включает, например, 80 Ν-терминальных аминокислот НЬА-ЭВ антигенассоциированной инвариантной цепи (р33, в дальнейшем Л), как взятая из банка данных БСВЕ инвентарный номер ОепВапк Ассеввюп-питЬег Х00497 (81гиЬт, М., МасЛ, В. апЕ Ьопд, Е.О. ТЛе сотр1е1е вециепсе оГ Не тВБА Гог Не НЬА-ПВ-аввос1акЕ туапагИ сЛат геуеа1в а ро1уреркЕе ^ЛЛ ап ипивиа1 ЛапвтетЬгапе ро1агЛу ЕМВО 1. 3(4), 869-872(1984)).

Предпочтительными являются фармацевтические композиции, где пептиды имеют общую длину между 8 и 100, предпочтительно между 8 и 30 и особенно предпочтительно между 8 и 17 или 9, 10. 11, 12, 13, 14, 15 или 16 аминокислот.

Кроме того, пептид или вариант может быть модифицирован в дальнейшем для улучшения стабильности и/или связывания с молекулами МНС в целях получения более сильного иммунного ответа. Методы для такой оптимизации пептидной последовательности хорошо известны из уровня техники и включают, например, введение обратных пептидных или непептидных связей.

Таким образом, в соответствии с другим аспектом изобретение обеспечивает фармацевтическую композицию, в которой по крайней мере один пептид или вариант включает непептидные связи.

В пептидах с обратной связью аминокислотные остатки присоединены не пептидными связями (-СО-ΝΉ-), но пептидная связь является обратной. Такие ретро-обратные пептидомиметики могут быть получены методами, известными из уровня техники, например такими, как описано в работе Меζ^е^е и соавторов (1997) 1. Iттиηо1. 159, 3230-3237, включенной сюда путем ссылки. Этот принцип охватывает получение псевдопептидов, содержащих изменения, которые охватывают остов, но не ориентацию боковых цепей. Меζ^е^е и соавт. (1997) показывают, что эти псевдопептиды пригодны для ответов МНС и Тхелперных клеток. Ретро-обратные пептиды, содержащие связи БН-СО вместо пептидных связей СОΝΉ, намного более устойчивы к протеолизу.

Непептидной связью является, например, -СН₂-БН, -СН₂8-, -СН₂СН₂-, -СН=СН-, -СОСН₂-, -СН(ОН)СН₂- и -СН₂8О-. Патент США № 4897445 обеспечивает метод твердофазного синтеза непептидных связей (-СН₂-БН) в полипептидных цепях, что включает полипептиды, синтезированные с использованием стандартной методики, и непептйдную связь, синтезированную при реакции аминоальдегида и аминокислоты в присутствии БаСБВН₃.

Пептиды, включающие последовательности по изобретению, описанные выше, могут быть синтезированы с дополнительными химическими группами, находящимися на их аминном и/или карбоксильном концах, для увеличения, например, стабильности, биологической доступности и/или аффинности пептидов. Например, гидрофобные группы, такие как карбобензоксильные, данзильные или третбутилоксикарбонильные группы, могут быть добавлены к аминным окончаниям пептидов. Подобным образом, ацетильная группа или 9-фторенилметоксикарбонильная группа может быть введена в аминные окончания пептидов. Кроме того, гидрофобная группа, трет-бутилоксикарбонильная или амидная группа может быть, например, добавлена к карбоксильным окончаниям пептидов.

Далее все пептиды по изобретению могут быть синтезированы в целях изменения их пространственной конфигурации. Например, Ό-изомер одного или более аминокислотных остатков пептида может быть использован скорее, чем обычный Ь-изомер. Более того, по крайней мере один из аминокислотных остатков пептидов по изобретению может быть замещен одним из хорошо известных не встречающихся в природе аминокислотных остатков. Изменения, такие как данные, могут служить для повышения ста

- 21 032437 бильности, биологической доступности и/или связывающих свойств пептидов по изобретению.

Подобным образом, пептид или вариант по изобретению может быть модифицирован химическим способом посредством реакции специфических аминокислот как до, так и после синтеза пептида. Примеры таких модификаций хорошо известны из уровня техники и обобщаются, например, в работе Я. ЬцпбЫаб, СЬетюа1 ЯеадеШз £ог Рго1ет МобШсаЕоп, 3гб еб. СЯС Ргезз, 2005, которая включена сюда путем ссылки. Химическая модификация аминокислот включает, но не ограничивается, модификацией с помощью ацилирования, амидирования, пиридоксилирования лизина, восстановительного алкилирования, тринитробензилирования аминных групп 2,4,6-тринитробензолсульфоновой кислотой (ΤΝΒ8), амидной модификацией карбоксильных групп и сульфгидрильной модификацией с помощью окисления надмуравьиной кислотой цистеина до цистеиновой кислоты, образованием ртутных производных, образованием смешанных дисульфидов с другими тиоловыми соединениями, реакцией с малеимидом, карбоксиметилированием йодоуксусной кислотой или йодацетамидом и карбамоилированием цианатом при щелочном уровне рН, хотя не ограничиваясь ими. В этой связи специалист данной области может проконсультироваться с гл. 15 раздела Сиггеп! РгоЮсоР в журнале Рго1ет 8аепсе, Ебз. СоИдап е! а1. (1оРп 411еу & 8опз ΝΥ 1995-2000) для получения более обширной информации о методах, связанных с химической модификацией белков.

Успешная модификация терапевтических белков и пептидов с РЕС-полиэтиленгликолем часто ассоциируется с увеличением циркуляторного полураспада, в то время как кросс-линкинг белков с глутаральдегидом, полиэтиленгликоль-диакрилатом и формальдегидом используется для приготовления гидрогелей. Химическая модификация аллергенов для иммунотерапии часто достигается при карбамоилировании цианатом калия.

В целом, пептиды и варианты (по крайней мере, те, что содержат пептидные связи между аминокислотными остатками) могут быть синтезированы, к примеру, Ртос-полиамидным способом твердофазного пептидного синтеза, как раскрыто у Ьи и соавт. (1981) 1. Огд. СРет. 46, 3433-3436 и в прилагающихся ссылках.

Очистка может быть произведена любой техникой или комбинацией таких техник как рекристаллизация, эксклюзивная хроматография, ионообменная хроматография, хроматография гидрофобного взаимодействия и (обычно) обратнофазная высокоэффективная жидкостная хроматография с использованием, к примеру, градиентного разделения ацетонитрил/вода.

Анализ пептидов может быть произведен при использовании тонкослойной хроматографии, электрофореза, в частности капиллярного электрофореза, твердофазной экстракции (ТФЭ), обратнофазной высокоэффективной жидкостной хроматографии, аминокислотного анализа после кислотного гидролиза и масс-спектрометрического анализа при быстрой бомбардировке атомами (РАВ), а также массспектрометрический анализ ΜΑΕΌΙ и Е81-0-ТОЕ.

Дальнейший аспект изобретения обеспечивает нуклеиновую кислоту (например, полинуклеотид), кодирующую пептид или вариант по изобретению. Полинуклеотид может быть, к примеру, ДНК, кДНК, ПНК, ЦНК, РНК, как одно-, так и/или двухнитевыми; натуральными или стабилизированными формами полинуклеотидов, таких как, к примеру, полинуклеотиды с фосфоротиоатным остовом или их комбинациями и может или не может содержать интроны в период времени кодирования для пептида. Разумеется, только пептиды, содержащие встречающиеся в природе аминокислотные остатки, присоединенные природными пептидными связями, могут кодироваться полинуклеотидом. Еще один дальнейший аспект изобретения обеспечивает вектор экспрессии, способный экспрессировать полипептид в соответствии с изобретением. Векторы экспрессии для различных видов клеток хорошо известны из уровня техники и могут быть выбраны без проведения излишних экспериментов.

Как правило, ДНК вводится в вектор-экспрессии, такой как плазмида, с правильной ориентацией и корректной рамкой считывания экспрессии. Если необходимо, то ДНК может быть сцеплена с адекватными транскрипционными и трансляционными регулирующими контрольными нуклеотидными последовательностями, распознающимися желательным хозяином, хотя такой контроль обычно имеется в векторе экспрессии. Вектор вводится затем хозяину стандартными способами. С руководством можно ознакомиться, к примеру, в работе 8атЬгоок и соавт. (1989) Мо1еси1аг С1ошпд, А ЬаЬогаФгу Мапиа1, Со1б 8рппд НагЬог ЬаЬогаФгу, Со1б 8рппд НагЬог, ΝΥ.

В особенно предпочтительном воплощении изобретения, однако, фармацевтическая композиция включает по крайней мере два пептида, состоящих из аминокислотных последовательностей в соответствии с 8Еф ΙΌ № 1 по 8Еф ΙΌ № 12.

Оптимальное количество каждого пептида, включаемого в вакцину, и оптимальная схема дозировки может быть определена специалистом данной области без проведения излишних экспериментов. Например, пептид или его вариант может приготавливаться для внутривенной (ί.ν.) инъекции, подкожной (8. с.) инъекции, внутрикожной (ί.ά.) инъекции, внутрибрюшной (Ер.) инъекции, внутримышечной (Ет.) инъекции. Предпочтительные пути введения пептидной инъекции - 8.с, ί.ά., Ер., Ет. и ί.ν. Предпочтительными путями введения инъекции ДНК являются ί.ά., Ет., 8.с, Ер. и ί.ν. Вводиться могут дозы, к примеру, между 1 и 500 мг, 50 мкг и 1,5 мг, предпочтительно от 125 до 500 мкг пептида или ДНК и будут зависеть от соответствующего пептида или ДНК. Дозы в данных пределах успешно использовались в предыду

- 22 032437 щих клинических исследованиях (Вгип8Т1д Р.Е., Аатба1 8., С)ег18еп М.К., Куа1бе1т С., Магко\укк|Спткгиб С.Т, 8уе I., Оугкаид М., Тгаскке1 8., Мо11ег М., Епккеп ТА., Саибетаск С.; Те1отегаке реркбе уасстакоп: а ркаке Ш Чибу т ракейк \\'кк поп-кта11 се11 1ипд сапсег; Сапсег Iттипо1 ИптипоФег. 2006; 55(12):1553-1564; М. 81аек1ег, А. 81епх1, Р.У. П1екгск, Т. Е1кеп, А. НаГегкатр, 1. Веск, А. Мауег, 8. ХУаНек Н. 8тдк, 1. Епкск, С.С. 8НеГ; Ап ореп 1аЬе1 81ибу !о еуа1иа1е !ке каГе1у апб кптиподешску оГ !ке реркбе Ьакеб сапсег уассте ША901, А8СО теекпд 2007; АЬк1гас1 № 3017).

Фармацевтическая композиция по изобретению может быть составлена так, что выбор, номер и/или количество пептидов, присутствующих в композиции является/являются ткане-, раково- и/или пациентспецифической/ими. Например, руководством для точного отбора пептидов могут служить образцы экспрессии родительских белков в данной ткани во избежание побочных эффектов. Выбор может зависеть от специфического типа рака, от которого страдает пациент, которому предназначено лечение, в равной степени, как и от статуса заболевания, ранних схем лечения, иммунного статуса пациента и, естественно, от НЬА-гаплотипа пациента. В дальнейшем вакцина в соответствии с изобретением может содержать индивидуализированные компоненты, соответствующие личным потребностям отдельного пациента. Примерами являются различные количества пептидов в соответствии с экспрессией связанных с ними ТАА у конкретного пациента, нежелательными побочными эффектами в связи с аллергиями или другими лечениями и согласованием для вторичного лечения, следующего за первым циклом или схемой лечения.

Для композиции, предназначенной для использования в качестве вакцины против КРР, например, будут избегаться пептиды, родительские белки которых экспрессированы в больших количествах в нормальных тканях, или они будут присутствовать в малых количествах в композиции по изобретению. С другой стороны, если известно, что опухоль пациента экспрессирует большие количества конкретного белка, то соответствующая фармацевтическая композиция для лечения данного вида рака может быть представлена в больших количествах и/или может включать более одного пептида, специфического для данного конкретного белка или сигнального пути данного белка. Специалист данной области будет способен выбрать предпочтительные комбинации иммуногенных пептидов при проверке, например, поколения Т-клеток ш νίΐΐΌ в равной степени, как их эффективность и общее присутствие, пролиферацию, аффинности и размножение конкретных Т-клеток для конкретных пептидов, и функциональные свойства Т-клеток, например, при анализе выработки ΓΡΝ-γ (см. также примеры ниже). Обычно наиболее эффективные пептиды комбинируются затем в качестве вакцины в соответствии с целями, описанными выше.

Подходящая вакцина будет предпочтительно содержать между 1 и 20 пептидами, более предпочтительно 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 различных пептидов, в дальнейшем предпочтительно 6, 7, 8, 9, 10 11, 12, 13, или 14 различных пептидов и наиболее предпочтительно 10, 11, 12, 13 или 14 различных пептидов. Длина пептида для применения в вакцине против рака может быть любым подходящим пептидом. В особенности, он может быть подходящим 9-мерным пептидом или подходящим 8- или 9- или 10- или 11-мерным пептидом или 12-, 13-, 14- или 15-мером. Более длинные пептиды могут быть также подходящими; 9-мерные или 10-мерные пептиды, как описано в приложенных табл. 1 и 2, являются предпочтительными для пептидов МНС класса I, в то время как 12-15-меры предпочтительны для пептидов МНС класса II.

Пептид(ы) формирует(ют) вакцину против опухоли или рака. Она может вводиться непосредственно пациенту в пораженный орган или систематично или вноситься ех νί\Ό в клетки, полученные от пациента, или в человеческую клеточную линию, которые затем могут вводиться пациенту или использоваться ш ν 11го для селекции субпопуляции из иммунных клеток, полученных от пациента, которые после этого вновь вводятся пациенту.

Пептид может быть, по существу, чистым или комбинированным с иммуностимулирующим адъювантом (см. ниже) или использоваться в комбинации с иммуностимулирующими цитокинами или вводиться с подходящей системой доставки, например липосомами. Пептид может быть также конъюгирован в подходящий носитель, такой как гемоцианин лимфы улитки (КЕН) или маннан (см. \УО 95/18145 и Ьопдепескег е! а1. (1993) Апп. ΝΥ Асаб. 8ск 690, 276-291). Пептид может быть также меченым или являться белком слияния или гибридной молекулой. Пептиды, последовательность которых дана в настоящем изобретении, как ожидается, стимулируют Т-клетки СЭ4 или ЦТЛ СЭ8. Тем не менее, стимуляция более эффективна в присутствии помощи, производимой Т-клетками, положительными для противоположного СО. Таким образом, для эпитопов МНС II класса, которые стимулируют Т-клетки СЭ4, партнеры слияния или секции гибридной молекулы адекватно обеспечивают эпитопы, которые стимулируют СО8-положительные Т-клетки. С другой стороны, для эпитопов МНС I класса, которые стимулируют СЭ8 ЦТЛ, партнеры слияния или секции гибридной молекулы адекватно обеспечивают эпитопы, которые стимулируют СО4-положительные Т-клетки. СЭ4- и СЭ8-стимулирующие эпитопы хорошо известны из уровня техники и включают те, что были идентифицированы в настоящем изобретении.

Фармацевтически приемлемые носители хорошо известны и обычно представляют собой жидкости, в которых приготавливается активное терапевтическое вещество. Носитель обычно не обеспечивает состав никакой фармакологической активностью, хотя он может обеспечивать химическую и/или биологическую стабильность, характеристики высвобождения и т. п. Примеры составов рассматриваются, например, в работе А1Гопко В. Сеппаго. КепкпдЮп: Тке 8с1епсе апб Ргасксе оГ Ркагтасу, 20(к Еб1коп. Ва1ктоге,

- 23 032437

МО: Ырртсо!! У1Шатк & Уйктк, 2000 и включают, но не ограничиваются, раствором натрия хлорида, водой, буферной водой, 0,3% глицином, гиалуроновой кислотой, декстрозой и т.п. Недавно было обнаружено, что определенные жировые эмульсии, которые в течение многих лет использовались для внутривенного питания пациентов (людей), могут также выступать в роли наполнителя для пептидов. Два примера таких эмульсий представляют собой имеющиеся в продаже жировые эмульсии, известные как Интралипид (I п!гаНр1б) и Липофундин (ЫроГипбт). !п!гаПр|б является зарегистрированной торговой маркой фирмы КаЬ1 РБагтас1а, Швеция, для жировой эмульсии для внутривенного питания и описывается в патенте США и.З. Ра!. № 3169094. ЫроГипбт - это зарегистрированная торговая марка фирмы В. Вгаип Мекипдеп, Германия. Обе эмульсии в качестве жира содержат масло соевых бобов (100 или 200 г на 1000 мл дистиллированной воды: 10 или 20% соответственно). Фосфолипиды яичного желтка используются в качестве эмульгатора в Интралипиде (12 г/л дистиллированной воды) и лецитин яичного желтка в Липофундине (12 г/л дистиллированной воды). Изотоничность является результатом добавления глицерола (25 г/л) как в Интралипиде, так и в Липофундине.

Чтобы вызвать иммунный ответ, обычно необходимо включить адъюванты, что приводит к большей иммуногенности композиции. Таким образом, в предпочтительном воплощении изобретения фармацевтическая композиция включает далее, по крайней мере, один подходящий адъювант.

Адъюванты - это вещества, которые неспецифически усиливают или потенцируют иммунный ответ (например, иммунные ответы, опосредованные ЦТЛ или хелперными Т-клетками (ТН) на антиген, и могут, таким образом, рассматриваться как полезные в медикаменте по настоящему изобретению. Подходящие адъюванты включают, но не ограничиваются, 1018 ЦЗ, соли алюминия, АтрБуах, АЗ 15, ВСС, СР-870,893, СрС7909, СуаА, Мо1одеп'к бЗЫМ, СМ-СЗЕ, ГС30, ΣΟ31, имиквимод, ^иЕас! ПИР321, интерферон-α или -β, !З Ра!сН, ^З, [ЗСОМк, ЫроУас, МЕ59, монофосфорил липид А, и другие нетоксические производные ЬРЗ, Монтанид ГМЗ 1312, монтанид ЦА 206, монтанид ЦА 50У, монтанид ТЗА-51, ОК-432, ОМ-174, ОМ-197-МР-ЕС, ОЫТАК, векторная система РерТе1®, микрочастицы РЬС, резиквимод, ЗКЫ72, вирусомы и другие вирусоподобные частицы, ΥΕ-17Ό, УЕСЕ !гар, К848, β-глюкан, Рат3Сук, АциПа'к ОЗ21 стимулон (Адш1а Вю!есБ, Уогсек!ег, МА, США), который получают из сапонина, микобактериальные экстракты и синтетические имитации бактериальных клеточных стенок и другие запатентованные адъюванты, такие как К1Ь1'к Эе!ох. Οιιί1 или ЗирегГок.

Предпочтительными адъювантами являются такие как Имиквимод, Резимиквимод, неполный адъювант Фрейнда, интерферон-α или ГМ-КСФ. Несколько иммунологических адъювантов (например, МЕ59), специфических для дендритных клеток, и их приготовление были описаны ранее (Эиршк М. МигрБу Т1, Н|ддй18 Ό, ^οζζο1ί М, уап Ыек! С, О!! С, МсЭопа1б ОМ; ОепбгШс се11к т!егпаЫе уассше аб)иуап! айег т!гатикси1аг идесйоп; Се11 Iттипо1. 1998; 186(1):18-27; АШкоп АС; ТНе тобе оГ ас!юп оГ 1ттипо1одюа1 аб)иуап!к; Эеу Вю1 З!апб. 1998; 92:3-11). Также могут использоваться цитокины. Несколько цитокинов были присоединены напрямую для оказания влияния на миграцию дендритных клеток к лимфоидным тканям (например, ТЫЕ-α), ускоряя созревание дендритных клеток до эффективных, презентирующих антиген Т-лимфоцитам, клеток (например, ГМ-КСФ, ИЛ-1 и ИЛ-4) (амер. патент № 5849589, специфически включённый сюда в его целостности путём ссылки) и действуя как иммуноадъюванты (например, ИЛ-12) (СаЬгПоуюБ Ό.Ε, СипшпдНат Н.Т., СагЬопе Э.Р.; №-12 апб ти!ап! Р53 рерйбе-ри1кеб бепбпйс се11к Гог !Не кресШс 1ттипо!йегару оГ сапсег; I. [ттипо!Не^ ЕтрНак1к Титог Iттипо1. 1996 (6):414-418).

Об иммуностимулирующих олигонуклеотидах СрС также сообщалось, что они усиливают эффекты адъювантов в составе вакцин. Теоретически не связанные СрС-олигонуклеотиды при активации врождённой (неадаптивной) иммунной системы действуют с помощью То11-подобных рецепторов (ТЬК), в основном ТЕК9. Вызванная СрС активация ТЬК9 усиливает антиген-специфические гуморальные и клеточные ответы на широкий спектр антигенов, включая пептидные или белковые антигены, живые или убитые вирусы, вакцины из дендритных клеток, аутологичные клеточные вакцины и полисахаридные конъюгаты как в профилактических, так и терапевтических вакцинах. Более важно то, что улучшается созревание и дифференциация дендритных клеток, приводя к улучшенной активации ТН1-клеток и интенсивной генерации цитотоксических Т-лимфоцитов (ЦТЛ) даже при отсутствии помощи СЭ4 Тклеток. Отклонение в сторону ТН1, вызванное стимуляцией ТЬК9, сохраняется даже в присутствии вакцинных адъювантов, таких как квасцы или неполный адъювант Фрейнда (ГЕА), которые обычно способствуют отклонению в сторону ТН2. СрС-олигонуклеотиды проявляют даже большую адъювантную активность, если они входят в состав или вводятся вместе с другими адъювантами или в таких составах как микрочастицы, наночастицы, липидные эмульсии или подобных составах, которые в особенности необходимы для инициации сильного ответа, если антиген относительно слаб. Они также ускоряют иммунную реакцию и позволяли снизить дозы антигена на приблизительно два порядка величины с ответами антитела, сравнимыми с полной дозой вакцины без СрС в некоторых экспериментах (Аг!1шг М. Кпед, ТБегареийс ро!епйа1 оГ То11-11ке гесер!ог 9 асйуайоп, Ыа!иге Кеу1е^к, Эгид О1ксоуегу, 2006, 5, 471-484). В патенте США № 6406705 В1 описывается комбинированное применение СрС-олигонуклеотидов, адъювантов, не включающих нуклеиновые кислоты, и антигена для вызывания антиген-специфического им

- 24 032437 мунного ответа. Имеющимся в продаже антагонистом СрС ТЪЯ9 является 68ЫМ (контурный иммуномодулятор двойного действия) компании Мо1одеп (Берлин, Германия), который является предпочтительным компонентом фармацевтической композиции настоящего изобретения. Также могут быть использованы другие молекулы, связывающиеся с ТЬЯ такие как РНК, связывающаяся с ТЬЯ 7, ТЪЯ 8 и/или ТЯЯ 9.

Другие примеры полезных адъювантов включают, но не ограничиваются химически модифицированными СрС (например, СрЯ, 1бега), Ро1у(1:С) (например, ро1у1:С12И), не-СрС бактериальной ДНК или РНК, а также иммуноактивными малыми молекулами и антителами, такими как имидазохинолины, циклофосфамид, сунитиниб, бевацизумаб, целебрекс, Νί.’Χ-4016. силденафил, тадалафил, варденафил, сорафениб, ХЬ-999, СР-547632, пазопаниб, ΖΌ2171, ΆΖΌ2171, ипилимумаб, тремелимумаб и 8С58175, которые могут действовать терапевтически и/или как адъювант. Количества и концентрации адъювантов и вспомогательных веществ, полезных в контексте настоящего изобретения, могут быть легко определены опытным специалистом без проведения излишних экспериментов.

Предпочтительными адъювантами являются б8^IМ, БЦЖ, ОК432, имиквимод, резимиквимод, ГМКСФ, интерферон-а, РеЛТег и Лп'Яптипе или их комбинации.

В предпочтительном воплощении фармацевтической композиции в соответствии с изобретением адъювант выбран из группы, состоящей из колониестимулирующих факторов, таких как гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (ГМ-КСФ, сарграмостим), имиквимод, резиквимод и интерферон-а.

В предпочтительном воплощении фармацевтической композиции в соответствии с изобретением адъювантом является имиквимод и резиквимод. В предпочтительном воплощении фармацевтической композиции в соответствии с изобретением адъювантом является комбинация из ГМ-КСФ и имиквимода.

Эта композиция используется для парентерального введения, такого как подкожное, внутрикожное, внутримышечное, внутрибрюшинное или оральное введение. Для этого пептиды и факультативно другие молекулы растворяются или суспендируются в фармацевтически приемлемом, предпочтительно водном носителе. Помимо этого, композиция может содержать наполнители, такие как буферы, связующие агенты, разрушающие агенты, разбавители, вкусоароматические добавки, смазочные вещества и т. д. Пептиды могут быть также введены вместе с иммуностимулирующими веществами, такими как цитокины. Пространный список наполнителей, которые могут быть использованы в такой композиции, может быть взят, например, из работы А. К1ЬЬе, НапбЬоок оГ Рйагшасеи!1са1 Ехс1р1еп!8, 3. Еб., 2000, изд. Атепсап Рйагтасеи!1са1 А^оааЯоп апб рйагтасеи!юа1 ргекк. Композиция может применяться для предупреждения, профилактики и/или лечения аденоматозных или раковых заболеваний, предпочтительно КРР.

Цитотоксические Т-клетки (ЦТЛ) распознают антиген в форме пептида, связанного с молекулой МНС скорее, чем интактный чужеродный антиген сам по себе. Сама молекула МНС находится на клеточной поверхности антигенпрезентирующей клетки. Так, активация ЦТЛ возможна, только если имеется в наличии тримерный комплекс из пептидного антигена, молекулы МНС и АПК. Соответственно, иммунный ответ может быть усилен, если для активации ЦТЛ использован не только пептид, а если, кроме того, добавлены АПК с соответствующей молекулой МНС.

Поэтому в предпочтительном воплощении фармацевтическая композиция в соответствии с настоящим изобретением дополнительно содержит по крайней мере одну антигенпрезентирующую клетку.

Антигенпрезентирующая клетка (или клетка-стимулятор) типично имеет молекулу МНС I или II класса на своей поверхности и в одном воплощении является, по существу, не способной самостоятельно нагружать на молекулу МНС I или II класса выбранный антиген. Как более детально описано ниже, молекула МНС I или II класса может быть легко нагружена выбранным антигеном ш νί!το.

Предпочтительно, если в клетке млекопитающих не хватает или имеется пониженный уровень или пониженная функция пептидного транспортера ТАР. Подходящие клетки, в которых не хватает пептидного транспортера ТАР, включают Т2-нагружающую пептидом дефектную клеточную линию человека, которая имеется в наличии в Атепсап Туре Си1!иге Со11ес!юп, 12301 Рагк1а\уп □гке, Яос^Ше, Магу1апб 20852, США под каталоговым № СЯЬ 1992; клеточные линии, в которых не хватает ТАР, могут быть использованы в качестве АПК, и из-за недостатка ТАР практически все пептиды, презентируемые МНС I класса, будут пептидами при тщательной проверке, использованными для загрузки извне пустых молекул МНС I класса этих клеточных линий, следовательно, все эффекты будут определенно приписываться использованным пептидам.

Предпочтительно, чтобы антигенпрезентирующие клетки являлись дендритными клетками. Подходящим образом дендритные клетки являются аутологичными дендритными клетками, в которые импульсным методом введен антигенный пептид. Антигенный пептид может быть любым подходящим антигенным пептидом, который вызывает адекватный Т-клеточный ответ. Т-клеточная терапия с использованием аутологичных дендритных клеток с введенными импульсным методом пептидами из опухолеассоциированного антигена раскрывается в работе Мигрйу и соавторов (1996) Тйе РгоЯа!е 29, 371-380 и Т)иа е! а1. (1997) Тйе РгоЯа!е 32, 272-278.

- 25 032437

Так, в предпочтительном воплощении настоящего изобретения в фармацевтическую композицию, содержащую по крайней мере одну антигенпрезентирующую клетку, введен импульсным методом или погружен пептид, к примеру методом примера 4.

В качестве альтернативы антигенпрезентирующая клетка включает экспрессионную конструкцию, кодирующую пептид. Полинуклеотид может быть любым подходящим полинуклеотидом, и предпочтительно, чтобы он был способен к трансдукции дендритной клетки, таким образом, приводя к презентации пептида и индукции иммунитета.

Как правило, нуклеиновая кислота по изобретению может быть включена в вирусный полинуклеотид или вирус. Например, аденовирус-трансдуцированные дендритные клетки проявляли способность индуцировать антиген-специфический противоопухолевый иммунитет по отношению к МИС1 (см. Сопд е( а1. (1997) Сепе Т1ег. 4, 1023-1028). Подобным образом могут быть использованы системы, основанные на аденовирусе (см., например, Уап е( а1. (1997) Нит. Сепе Т1ег. 8, 1355-1363); могут быть использованы ретровирусные системы (8рес1! е! а1. (1997) 1. Ехр. Меб. 186, 1213-1221 и 8хаЬо1ск е! а1. (1997), также может быть использован опосредованный частицами крови перенос в дендритные клетки (Тийпд е! а1. (1997) Еиг. 1. Iттипο1. 27, 2702-2707); а также может быть использована РНК (АкЫеу е! а1. (1997) 1. Ехр. Меб. 186, 1177-1182).

В целом, фармацевтическая композиция по изобретению, содержащая (а) нуклеиновую(ые) кислоту(ы) по изобретению, может вводиться подобным образом, как и те, что содержат пептид(ы) по изобретению, например, внутривенно, внутриартериально, внутрибрюшно, внутримышечно, внутрикожно, внутрь опухоли, орально, дермально, назально, буккально, ректально, вагинально, с помощью ингаляции или посредством местного введения.

По причине действия механизмов уклонения опухоль часто вырабатывает резистентность к медикаменту, которым она лечится. Резистентность к медикаменту может появиться во время лечения, и она проявляется в метастазах и рецидивировании опухоли. Во избежание таковой медикаментозной резистентности опухоль обычно лечат комбинацией медикаментов, и для лечения метастазов и опухоли, возвращающейся повторно после периода ремиссии, часто требуется комбинация, отличающаяся от первой. Поэтому в одном аспекте изобретения фармацевтическая композиция вводится в соединении со вторым противораковым веществом. Второе противораковое вещество может вводиться до, после или одновременно с фармацевтической композицией по изобретению. Одновременное введение может быть достигнуто, например, при смешивании фармацевтической композиции по изобретению со вторым противораковым веществом при условии совместимости их химических свойств. Другая возможность для одновременного введения - это введение композиции и противоракового вещества в один и тот же день, независимо от способа введения, так что фармацевтическая композиция по изобретению может быть, например, инъецирована, в то время как второе противораковое вещество вводится, например, орально. Фармацевтическая композиция и второе противораковое вещество могут также вводиться в рамках одного и того же курса лечения, но в разные дни и/или в рамках отдельных курсов лечения.

В другом аспекте настоящее изобретение обеспечивает метод для лечения или предупреждения рака у пациента, включающий введение пациенту терапевтически эффективного количества любой из фармацевтических композиций по изобретению.

Терапевтически эффективным количеством будет количество, достаточное для вызывания иммунного ответа, в частности активации субпопуляции ЦТЛ. Специалист данной области может легко определить, будет то или иное количество эффективным при использовании стандартных иммунологических методов, таких как те, что приводятся в примерах к настоящей спецификации. Другим способом мониторинга эффекта от конкретного количества фармацевтической композиции является наблюдение роста обработанной опухоли и/или ее рецидива.

В особенно предпочтительном воплощении настоящего изобретения фармацевическая композиция применяется в качестве противораковой вакцины.

Композиция, содержащая пептиды или кодирующие пептиды нуклеиновые кислоты, может также формировать вакцину против опухоли или рака. Она может вводиться непосредственно пациенту, в пораженный орган или систематично, или вноситься ех у1уо в клетки, полученные от пациента, или в человеческую клеточную линию, которые затем могут вводиться пациенту или использоваться ш νίΙΐΌ для селекции субпопуляции из иммунных клеток, полученных от пациента, которые после этого вновь вводятся пациенту.

Композиция по изобретению может использоваться в методе лечения или в качестве вакцины против рака. Рак может быть раком ротовой полости и глотки, раком пищеварительного тракта, раком толстой кишки, прямой кишки и анального отверстия, раком дыхательных путей, раком груди, раком шейки матки, влагалища и наружных половых органов, раком тела матки и яичника, раком мужских половых путей, раком мочевыводящих путей, раком костной и мягкой ткани и саркомой Калоши, меланомой кожи, меланомой глаза и немеланомным раком глаза, раком головного мозга и центральной нервной системы, раком щитовидной железы и других эндокринных желез, лимфомой Ходжкина, лимфомой неХоджкина и миеломой, предпочтительно раком почки, колоректальным раком, раком легкого, раком молочной железы, раком поджелудочной железы, раком простаты, раком желудка, раком головного мозга,

- 26 032437 гастроинтестинальной стромальной опухолью (618Т) или глиобластомой, предпочтительно опухолями головного мозга и еще более предпочтительно глиобластомами.

В наиболее предпочтительном воплощении метода лечения или вакцины в соответствии с изобретением вакцина является комплексной пептидной противоопухолевой вакциной для лечения глиобластомы. Предпочтительно, чтобы вакцина включала комплекс опухолеассоциированных пептидов, выбранных из 8Е0 ΙΌ № 1 по 8Е0 ΙΌ № 12, которые локализованы и были идентифицированы на первичных клетках глиобластомы. Этот комплекс включает пептиды НЬА класса I и II. Пептидный комплекс может также содержать по крайней мере один пептид, например, из корового антигена НВУ, используемый в качестве пептида положительного контроля, служащего как антигенный маркер для проверки эффективности внутрикожного введения. В одном конкретном воплощении вакцина состоит из 14 отдельных пептидов (в соответствии с 8Е0 Ш № 1 по 12) с весом каждого пептида от около 1500 до около 75 мкг, предпочтительно от около 1000 до около 175 мкг и более предпочтительно от около 500 до около 600 мкг, наиболее предпочтительно около 578 мкг, которые все могут быть очищены на ВЭЖХ и ионообменной хроматографии и получены в виде белого до серовато-белого порошка. Лиофилизат предпочтительно растворяют в гидрокарбонате натрия и используют для внутрикожной инъекции в течение 30 мин после восстановления при комнатной температуре. В соответствии с настоящим изобретением предпочтительные количества пептидов могут варьироваться между около 0,1 и 100 мг, предпочтительно между около 0,1 до 1 мг и наиболее предпочтительно между около 300 и 800 мкг на 500 мкл раствора. Термин около подразумевает здесь ±10% заданного объема, если не указано другое. Специалист данной области будет способен установить фактическое количество пептида для использования, исходя из нескольких факторов, таких как, например, иммунный статус отдельного пациента и/или количество ТИΜΛΡ (опухолеассоциированный пептид), который презентируется в конкретном виде рака. Пептиды настоящего изобретения могут обеспечиваться в других подходящих формах (стерильные растворы и т.д.) вместо лиофилизата.

Фармацевтические композиции включают пептиды как в свободной форме, так и в форме фармацевтически приемлемой соли.

Используемое здесь понятие фармацевтически приемлемая соль относится к производным раскрытых пептидов, причём пептид модифицирован путём получения кислотных или щелочных солей агента. Например, кислотные соли получают из свободного основания (типично, где нейтральная форма лекарственного средства имеет нейтральную группу -ΝΉ₂) с применением реакции с подходящей кислотой. Подходящие кислоты для получения кислотных солей включают как органические кислоты, например, уксусную кислоту, пропионовую кислоту, гликолевую кислоту, пировиноградную кислоту, щавелевую кислоту, оксиянтарную кислоту, малоновую кислоту, янтарную кислоту, малеиновую кислоту, фумаровую кислоту, винную кислоту, лимонную кислоту, бензойную кислоту, коричную кислоту, миндальную кислоту, метансульфоновую кислоту, этансульфоновую кислоту, р-толуолсульфокислоту, салициловую кислоту и подобные, так и неорганические кислоты, например хлористоводородную кислоту, бромистоводородную кислоту, серную кислоту, азотную кислоту, фосфорную кислоту и подобные. И наоборот, приготовление щелочных солей кислотных составляющих, которые могут присутствовать на пептиде, приготовляются при использовании фармацевтически приемлемого основания, такого как гидроксид натрия, гидроксид калия, гидроксид аммония, гидроксид кальция, триметиламин или подобные.

В одном особенно предпочтительном воплощении фармацевтические композиции включают пептиды в виде солей уксусной кислоты (ацетаты), аммония или хлористоводородной кислоты (хлориды).

В другом воплощении фармацевтическая композиция настоящего изобретения может включать сахара, сахарные спирты, аминокислоты, такие как глицин, аргинин, глютаминовую кислоту и другие в качестве образователей структуры. Сахара могут быть моно-, ди- или трисахаридами. Эти сахара могут быть использованы в отдельности, в равной степени как и в комбинации с сахарными спиртами. Примеры сахаров включают глюкозу, маннозу, галактозу, фруктозу или сорбозу в качестве моносахаридов; сахарозу, лактозу, мальтозу или трегалозу в качестве дисахаридов и раффинозу в качестве трисахарида. Сахарный спирт может быть, например, маннитозой. Предпочтительными ингредиентами являются сахароза, лактоза, мальтоза, трегалоза, маннит и/или сорбит и более предпочтительно маннитол.

Кроме того, фармацевтические композиции настоящего изобретения могут включать хорошо переносимые физиологические наполнители (см. НапбЬоок оГ ΡЬа^тасеи!^са1 Ехс1р1еп!к, 5-е изд., авторы Еаутопб Ро\\'е. Ρ;·ιιι1 8Ьеккеу апб 81ап Ο\\Όΐ'ΐ. ΡЬа^тасеи!^са1 Ριυ^ (2006)), такие как антиоксиданты, подобные аскорбиновой кислоте или глютатиону; консерванты, такие как фенол, т-крезол, метил- или пропилпарабен, хлорбутанол, тиомерсал или бензальконий хлорид; стабилизаторы, структуроформирующие средства, такие как сахароза, лактоза, мальтоза, трегалоза, миннитоза, маннит и/или сорбит, маннит и/или лактоза, и растворители, такие как полиэтиленгликоли (ЕЕС), например ΡΞΟ 3000, 3350, 4000 или 6000; или циклодекстрины, например гидроксипропил-Р-циклодекстрин, сульфобутилэтил-βциклодекстрин или γ-циклодекстрин; или декстраны или полоксамеры, например полоксамер 407®, полоксамер 188 или Твин 20®, Твин 80®. В предпочтительном воплощении фармацевтические композиции настоящего изобретения включают один или более хорошо переносимых наполнителей, выбранных из

- 27 032437 группы, состоящей из антиоксидантов, структороформирующих средств и стабилизаторов.

Приемлемым диапазоном значений рН является рН 2-12 для внутривенного и внутримышечного введения, но для подкожного введения диапазон снижается до 2,7-9,0, так как степень растворения т νί\Ό понижена, приводя к увеличению потенциала для возникновения раздражения на месте инъекции. 81пск1еу ЯоЬей 6., Рйагт. Рек., 21, N0:2, 201-230(2004).

Фармацевтический препарат по настоящему изобретению, содержащий пептиды и/или нуклеиновую(ые) кислоту(ы) в соответствии с изобретением, водится пациенту, страдающему аденоматозным или раковым заболеванием, ассоциированным с соответствующим пептидом или антигеном. Тем самым может быть инициирован иммунный ответ, опосредованный Т-клетками.

Предпочтительна фармацевтическая композиция в соответствии с изобретением, в которой количество (в особенности опухолеассоциированного(ых)) пептида(ов), нуклеиновых(ой) кислот(ы) в соответствии с изобретением или вектора(ов) экспрессии в соответствии с изобретением, как представленные в указанной композиции, являе(ю)тся ткане-, раково- и/или пациент-специфическим.

В другом предпочтительном воплощении изобретения вакцина является вакциной из нуклеиновой кислоты. Известно, что инокуляция вакциной из нуклеиновой кислоты, такой как ДНК-вакцина, кодирующей полипептид, приводит к Т-клеточному ответу. Она может вводиться непосредственно пациенту в пораженный орган или систематично, или вноситься ех νί\Ό в клетки, полученные от пациента, или в человеческую клеточную линию, которые затем могут вводиться пациенту или использоваться ш ν 11го для селекции субпопуляции из иммунных клеток, полученных от пациента, которые после этого вновь вводятся пациенту. Если нуклеиновая кислота введена в клетки ίΐ'ΐ М11го, то может быть полезно, чтобы клетки были трансфецированными, чтобы коэкспрессировать иммуностимулирующие цитокины, такие как интерлейкин^ или ГМ-КСФ. Нуклеиновая(ые) кислота(ы) может/могут быть, по существу, чистым или комбинированным с иммуностимулирующим адъювантом или использоваться в комбинации с иммуностимулирующими цитокинами или вводиться с подходящей системой доставки, например, липосомами. Вакцина из нуклеиновой кислоты может также вводиться с адъювантом, таким как те, что описывались выше для пептидных вакцин. Предпочтительно, если вакцина из нуклеиновой кислоты вводится без адъюванта.

Полинуклеотид может быть, по существу, чистым или содержаться в подходящем векторе или системе доставки. Подходящие векторы и системы доставки включают вирусные системы, такие как те, что основаны на аденовирусе, вирусе осповакцины, ретровирусах, вирусе герпеса, аденоассоциированном вирусе или гибридах, содержащих элементы более чем одного вируса. Невирусные системы доставки включают катионные липиды и катионные полимеры, хорошо известные из уровня техники в области доставки ДНК. Также может быть использована физическая доставка, такая как посредством генпистолета. Пептид или закодированный нуклеиновой кислотой пептид может быть белком слияния, например, с эпитопом из столбнячного токсина, который стимулирует СП4-положпгельные Т-клетки.

Соответственно, любая нуклеиновая кислота, вводимая пациенту, является стерильной и свободной от пирогенов. Обнаженная ДНК может вводиться внутримышечно или внутрикожно или подкожно. Обычно вакцина из нуклеиновой кислоты может включать любое подходящее средство доставки нуклеиновой кислоты. Нуклеиновая кислота, предпочтительно ДНК, может быть также доставлена в липосоме или как часть системы доставки вирусного вектора. Предпочтительно, если вакцина из нуклеиновой кислоты, такая как ДНК-вакцина, вводится в мышцу, тогда как пептидные вакцины предпочтительно вводятся к.с. или ί.ά. Предпочтительно также, если вакцина вводится в кожу.

Полагают, что поглощение нуклеиновой кислоты и экспрессия закодированного полипептида профессиональными антигенпрезентирующими клетками, такими как дендритные клетки, может быть механизмом прайминга иммунного ответа; тем не менее, дендритные клетки могут быть нетрансфецированными, однако они по-прежнему важны, так как они могут поглощать экспрессированный пептид из трансфецированных клеток в ткани (кросс-прайминг, например, Тйотак А.М., 8ап1агк1его Й.М., Йн1х Е.Я., Агтк!гопд Т.Э., Сйеп У.С., Ниапд Й.О., йайет Э.А., Ооддтк М., НгиЬап Я.Н., 1аГГее Е.М. Меко!йе1шкресШс СЭ8(+) Т-се11 гекропкек ргсладе еукепсе оГ т νί\Ό сгокк-рпттд Ьу апйдеп-ргекепйпд се11к т уассй па!ед рапсгеайс сапсег райеп!к. 1. Ехр. Мед. 2004 Аид 2; 200(3):297-306).

Полинуклеотид-опосредованная иммунизационная терапия против рака описывается у Сопгу и соавторов (1996) 8етшагк т 0псо1оду 23, 135-147; Сопдоп е! а1. (1996) №11иге Медкше 2, 1122-1127; 6опд е! а1. (1997) №11иге Медкте 3, 558-561; 2йа1 е! а1. (1996) 1. Iттиηο1. 156, 700-710; Огайат е! а1. (1996) Ш

1. Сапсег 65, 664-670; и Вигсйе11 е! а1. (1996) стр. 309-313, В Вгеак! Сапсег, Адνаηсек т Ью1оду апд !йегареийск, Сайо е! а1. (едк), 1ойп ЫЬЬеу Еиго!ех!, которые все включены в описание путем ссылки.

Можно также с пользой направлять вакцину в специфические популяции клеток, например, в антигенпрезентирующие клетки либо на месте инъекции с использованием нацеленных векторов и систем доставки, либо при селективной очистке такой клеточной популяции у пациента с введением ех νί\Ό пептида или нуклеиновой кислоты (например, дендритные клетки могут быть отсортированы, как описывается у 2йои и соавторов (1995) В1оод 86, 3295-3301; Яо!й е! а1. (1996) 8сапд. 1. !ттипо1оду 43, 646651). Например, нацеленные векторы могут включать ткане- или опухолеспецифический промотор, который направляет экспрессию антигена в подходящее место.

- 28 032437

Наконец, вакцина в соответствии с изобретением может зависеть от специфического типа рака, от которого страдает пациент, которому предназначено лечение, в равной степени, как и от статуса заболевания, ранних схем лечения, иммунного статуса пациента и, естественно, от НЬА-гаплотипа пациента. В дальнейшем вакцина в соответствии с изобретением может содержать индивидуализированные компоненты, соответствующие личным потребностям отдельного пациента. Примерами являются различные количества пептидов в соответствии с экспрессией связанных с ними ТАА у конкретного пациента, нежелательными побочными эффектами в связи с аллергиями или другими лечениями и согласованием для вторичного лечения, следующего за первым циклом или схемой лечения.

Кроме того, пептиды настоящего изобретения полезны не только для лечения рака, но и также в качестве диагностических средств. Так как пептиды были получены из глиобластомы, и так как было определено, что данные пептиды не присутствуют в нормальных тканях, то эти пептиды могут быть использованы для постановки диагноза о наличии рака.

Присутствие пептидов настоящего изобретения на тканевых биоптатах может помочь патологу в постановке диагноза рака. Детекция конкретных пептидов настоящего изобретения с помощью антител, масс-спектрометрии или других методов, известных из уровня техники, может дать знать патологу, что ткань поражена злокачественным или воспалительным или же заболеванием общего порядка. Присутствие групп пептидов настоящего изобретения может сделать возможной классификацию или субклассификацию пораженных заболеванием тканей.

Детекция пептидов настоящего изобретения на образцах пораженной заболеванием ткани может позволить принять решение о преимуществах от терапии, воздействующей на иммунную систему, в особенности, если Т-лимфоциты, как известно или ожидается, задействованы в механизме действия. Отсутствие экспрессии МНС является хорошо описанным механизмом, при котором инфицированные или злокачественные клетки уклоняются от иммунного надзора. Так, присутствие пептидов настоящего изобретения показывает, что данный механизм не используется проанализированными клетками.

Пептиды настоящего изобретения могут использоваться для анализа ответов лимфоцитов на пептиды настоящего изобретения, таких как ответы Т-клеток или ответы антител на пептиды настоящего изобретения или пептиды настоящего изобретения в комплексе с молекулами МНС. Данные иммунные ответы лимфоцитов могут использоваться в качестве прогностических маркеров для принятия решения о дальнейших этапах терапии. Данные иммунные ответы могут также использоваться в качестве суррогатных маркеров в иммунотерапевтических подходах, направленных на индуцирование ответов лимфоцитов с помощью различных средств, как, например, вакцинации белком, нуклеиновыми кислотами, аутологичными материалами, адоптивного переноса лимфоцитов. При генной терапии ответы лимфоцитов на пептиды настоящего изобретения могут быть рассмотрены в рамках оценки побочных эффектов. Мониторинг ответов лимфоцитов может также быть ценным инструментом для последующих обследований в случае трансплантации, к примеру для детекции реакций хозяин против трансплантата и трансплантат против хозяина.

В другом его аспекте настоящее изобретение относится к комплекту, включающему: (а) контейнер, содержащий фармацевтическую композицию, описанную выше, в виде раствора или в лиофилизованной форме; (Ь) опционально - второй контейнер, содержащий разбавитель или восстанавливающий раствор для лиофилизованного состава; и (с) опционально - инструкции по (ί) применению раствора или (ίί) восстановителя, и/или по применению лиофилизованного состава. В дальнейшем оборудование может включать один или более (ίίί) буфер, (ίν) разбавитель, (ν) фильтр, (νί) иглу или (νίί) шприц. Контейнер является предпочтительно флаконом, ампулой, шприцем или пробиркой; и он также может быть контейнером многоразового использования. Фармацевтическая композиция предпочтительно лиофилизована.

Вспомогательное оборудование настоящего изобретения предпочтительно включает лиофилизованный состав настоящего изобретения в подходящем контейнере и инструкции для ее восстановления и/или по ее применению. Подходящие контейнеры включают, например, флаконы, ампулы (например, двухкамерные ампулы), шприцы (такие как двухкамерные шприцы) и пробирки. Контейнер может быть сделан из разнообразных материалов, таких как стекло или пластик. Предпочтительным образом вспомогательное оборудование и/или контейнер содержит инструкции для, или связанные с контейнером, которые дают указания для восстановления и/или применения. Например, на этикетке может быть указано, что лиофилизованный состав должен восстанавливаться до пептидных концентраций, как те, что описаны выше. На этикетке в дальнейшем может быть указано, что состав применяется или предназначается для подкожного введения.

Контейнер с составом может быть ампулой многоразового использования, которая позволяет повторное введение (например, от 2-6 введений) восстановленного состава. Вспомогательное оборудование может включать в дальнейшем второй контейнер, включающий подходящий разбавитель (например, раствор бикарбоната натрия).

При смешивании разбавителя и лиофилизованного состава окончательная концентрация пептида в восстановленном составе составляет предпочтительно по крайней мере 0,15 мг/мл/пептид (=75 мкг) и предпочтительно не более чем 3 мг/мл/пептид (=1500 мкг). Вспомогательное оборудование может в дальнейшем включать другие материалы, желательные с коммерческой и с точки зрения пользователя,

- 29 032437 включая другие буферы, разбавители, фильтры, иглы, шприцы и упаковочные вкладыши с инструкциями по применению.

Вспомогательное оборудование настоящего изобретения может иметь один контейнер, который содержит состав фармацевтических композиций в соответствии с настоящим изобретением с или без других компонентов (например, других соединений или фармацевтических композиций этих других соединений) или может иметь отдельные контейнеры для каждого компонента.

Вспомогательное оборудование по изобретению предпочтительно включает состав по изобретению, укомплектованный для применения в комбинации с ковведением второго соединения (такого как адъюванты (например, ГМ-КСФ), химиотерацевтического средства, натурального продукта, гормона или антагониста, средства против ангиогенеза или ингибитора; апоптоз-индуцирующего средства или хелатора) или их фармацевтической композиции. Компоненты вспомогательного оборудования до введения пациенту могут предварительно быть организованы в комплекс, или же каждый компонент может находиться в отдельном отличном контейнере. Компоненты вспомогательного оборудования могут обеспечиваться одним или несколькими жидкостными растворами, предпочтительно водным раствором, более предпочтительно стерильным водным раствором. Компоненты вспомогательного оборудования могут также обеспечиваться твердой формой, которая может быть превращена в жидкости при добавлении подходящих растворителей, которые предпочтительным образом предоставляются в другом, отличном контейнере.

Контейнер терапевтического оборудования может быть ампулой, пробиркой, колбой, флаконом, шприцем или любыми другими средствами, заключающими в себе твердое вещество или жидкость. Обычно, если имеются более одного компонента, оборудование содержит вторую ампулу или другой контейнер, который позволяет отдельную дозировку. Оборудование может также содержать другой контейнер для фармацевтически приемлемой жидкости. Терапевтическое оборудование будет предпочтительно содержать приспособление (например, одну или более иглу, шприцы, пипетки для глаз, пипетки и т.д.), которое позволяет введение веществ по изобретению, которые являются компонентами настоящего оборудования.

Фармацевтический состав настоящего изобретения подходит для введения пептидов любым приемлемым способом, таким как оральный (энтеральный), назальный, офтальный, подкожный, внутрикожный, внутримышечный, внутривенный или трансдермальный. Предпочтительно, чтобы введение было в.с. и наиболее предпочтительно 1.б. Введение может производиться инфузионным насосом.

Должно быть понятно, что отличительные черты изобретения, раскрываемые и описываемые здесь, могут быть использованы не только в соответственной комбинации, как было показано, но и также по отдельности без выхода из рамок, обозначенных настоящим изобретением. В соответствии с целями настоящего изобретения все цитаты описания включены в их целостности путем ссылки.

Теперь изобретение будет описано более детально посредством ссылок на последующие чертежи, список последовательностей и примеры. Следующие примеры приведены исключительно для иллюстрационных целей и не направлены на ограничение изобретения.

Краткое описание чертежей

Фиг. 1 - тетрамерный анализ стимулированной микросферой пролиферации С8Р-001 и ΝΕ6Ν4Χ001-специфических СЭ8+ лимфоцитов из периферической крови здорового донора. ПК, обогащенные на лунку 1х10⁶ СЭ8+ здорового донора стимулировались еженедельно микросферами, связанными с антиСЭ28 плюс опухолевый антиген высокой плотности Л*0201/С8Р-001 (верхняя секция) или анти-СЭ28 плюс опухолевый антиген высокой плотности Ά*0201/ΝΣ0Ν4Χ-001 (нижняя секция). После трех стимуляций ш νίΙΐΌ клетки были окрашены антителом СЭ8 РГГС и тетрамерами с флуоресцентными метками Л*0201/С8Р-001 РЕ и Ά*0201/ΝΣ6Ν4Χ-001. Клетки высаживаются на СЭ8+ лимфоциты; цифрами обозначена процентная доля клеток в указанном квадранте среди СЭ8+ лимфоцитов.

Фиг. 2 - афинность пептидов НЬЛ I класса по изобретению к молекуле МНС, закодированной аллелем НЬЛ-Л*0201. Константы диссоциации (К_с) пептидов ГМЛ950 НЬЛ класса I, контрольных пептидов ПМА-МиС-001 (средняя сила связывания) и вирусного пептида-маркера НВУ-001 (сильная сила связывания) были измерены основанным на методике ΕΟδΆ анализом рефолдинга МНС. Анализ проводили три раза с похожими результатами.

Фиг. 3 - относительное связывание образованных из [МА-В[В-002 и IМΑ-МΕТ-005 15-меров с наиболее частыми аллелями НЬА-ЭВ. В технологии Ргойптипе ΒΕνΕΑΕ™ используются анализы сборки ш уйго НЬА-ЭВ для определения скорости ассоциации комплекса МНС-пептид, являющейся одним из основных определяющих фактов для констант связывания отдельных пептидов. Анализ проводили с помощью РпЯттипе (ОхТогб, Великобритания). В установленный момент времени измеряется количество интактного комплекса МНС-пептид и сравнивается с количеством для контроля годен/не годен (относительно слабая сила связывания). Пептид беспорядочного, сильного связывания НЬА-ЭВ включен в качестве положительного контроля. Значения указывают на силу связывания для отдельных пептидов и молекул НЬА-ЭВ относительно контроля годен/не годен. Так как технология ΚΕVΕΑ^™ ограничивается 15-мерами, то протестированы были два 15-мера с перекрывающимися участками (положение 2-16;

- 30 032437

6-20) вместо МЕТ-005 полной длины.

На фиг. 4а и 4Ъ показаны присутствие Р8МА и сурвивин-специфические секретирующие II'Νγ СЭ4+ Т-клетки в моноцитах периферической крови (МПК) в различные точки времени вакцинированного пациента, которые были определены с использованием метода ИКу-Е118ро!. Точки времени: до вакцинации (а) и после 3-й (Ъ), 6-й (с), 7-й (б), 8-й (е), 9-й (ί), 10-й (д), 11-й (И) вакцинации.

На фиг. 5 показано присутствие сурвивин-специфических ΣΡΝγ-, ИЛ-5, ИЛ-10, ТКРасекретирующих С1)4 Т-клеток в МПК в три различные точки времени у вакцинированного пациента, которые определялись посредством анализа внутриклеточного окрашивания К'’8. Точки времени: после 1-й (а), 3-й (Ъ), 7-й (с) вакцинации.

Примеры

1. Синтез.

Пептиды были синтезированы стандартным и общепринятым методом твердофазного синтеза с использованием способа Ртос. После очистки на препаративной ВЭЖХ проводилась ионообменная процедура для внедрения физиологически совместимых противоионов (например, ацетат, аммоний или хлорид). Наконец, после лиофилизации были получены белые или серовато-белые твердые вещества. Все пептиды ТиМАР предпочтительно вводят в виде солей ацетата, возможны также другие солевые формы.

Особенно важно, что принадлежность и чистота пептидов могут быть легко определены, причем с высокой точностью с помощью масс-спектрометрии, аминокислотного анализа и аналитической ВЭЖХ. Как показали аналитические результаты, все пептиды, использованные для вакцины РМА950, обладают правильной структурой с чистотой >95%.

Пептиды РТЕЕТЬОЕР (11РА-А1; Ро1уРер!1бе ЬаЪога!опе8, Жо1РепЪи!!е1, Германия), РМРОЕРРКР (НРА-А2; С1ша1Ра, 8188асИ, Швейцария) и 1:Р1)1,АС)(Т¥ (НБА-В35; Ро1уРер!1бе ЬаЪога!опе8) были получены с фармацевтическим качеством.

Таблица 5

Физическая форма №

ГО пептида

Форма соли

Г игроскопичность

Физико-химические характеристики пептидов в ^А950

Длина пептида (число аминокислот)

1	С8Р-001	9	ацетат	Белый до	Хранится как
2	РАВР7-001	9	ацетат	серовато-	замороженный
3	ΝΕ6Ν4Χ-001	9	ацетат	белого	сухой порошок.
4	ΤΝ0001	9	ацетат	лиофилизат	Лиофилизованные
5	ΝΚσΑΜ-ΟΟΙ	9	ацетат		пептиды, в
6	ЮР2ВРЗ-001	9	ацетат		основном, имеют
7	ВСА-002	9	ацетат		гигроскопичные
8	МЕТ-005	17	ацетат		свойства.
9	РТР-003	9	ацетат/аммоний
10	РТР-005	9	ацетат
И	СН1-001	9	ацетат
12	ΒΙΚ-002	15	ацетат
13	(НВУ-001)	10	ацетат

2. Компоненты на примере фармацевтической композиции ^А950.

^А950 составлена из коктейля синтетических опухолеассоциированных пептидов (ТЛМАРз), большинство из которых было выявлено на первичных клетках колоректального рака. Пептиды ТиМАР включают 10 пептидов, связывающихся с НЬА I класса, со способностью активировать цитотоксические Т-клетки (С1)8 Т-клетки) и 1 пептид, связывающийся с НРА II класса, со способностью активировать хелперные Т-клетки (СЭ4+ Т-клетки) и 1 удлиненный пептид, связывающийся с НРА I класса, с обеими способностями. Хелперные Т-клетки играют центральную роль при поддержке функции цитотоксических Т-клеток при высвобождении цитокинов, которые усиливают киллерную функцию СЭ8+ Т-клеток и могут также напрямую выступать против опухолевых клеток (Кпи!8оп апб Ώΐδΐδ, 2005). В дополнение к этому данные 12 ТиМАР-пептидов ^А950 содержат один вирусный контрольный пептид.

Пробы хирургически удаленной злокачественной и нормальной ткани пациентов с глиобластомой и кровь здоровых доноров были проанализированы поэтапно.

Сначала для определения гиперэкспрессированных генов в злокачественной ткани по сравнению с диапазонами показателей для нормальных органов и тканей применялся анализ экспрессии мРНК всего генома с помощью микрочипов. На втором этапе лиганды НЬА злокачественного материала идентифицировались с помощью масс-спектрометрии. Затем идентифицированные лиганды НЬА сравнивали с данными по генной экспрессии. Пептиды, кодируемые выборочно экспрессированными или гиперэкспрессироваными генами, выявленными на этапе 1, считались подходящими ТиМАР-кандидатами для мультипептидной вакцины.

Наконец, периферические С1)8- Т-клетки здоровых индивидов тестировали на реактивность по от- 31 032437 ношению к опухолеассоциированным лигандам НЬА посредством нескольких иммунных анализов (т уйго Т-клеточные анализы).

Таблица 6. ТМА950: композиция ТиМАР.

К примеру, ША950 содержит 10 связывающихся с НЕА-А*02 пептидов (класс I), 1 связывающийся НЬА-ЭВ пептид (класс II) и 1 удлиненный пептид НЬА-А*02. Кроме того, будет включен вирусный пептид-маркер НВУ-001, которого нет в списке.

Таблица 6

Функции белков, из которых образованы пептиды ТиМАР

ТИМАР ГО [Название функция / комментарии
НЬА-А*02 ТиМАРз
ВСА-002	Бревикан	Специфическая для головного мозга молекула внеклеточного матрикса (ЕСМ), участвующая в инвазии; гиперэкспрессирована и специфически дегликозилирована при глиоме; ассоциирована с нишами стволовых клеток.
СН1-001	Хитиназа-3-подобный белок 2	Внеклеточный белок с неясной функцией; высоко гиперэкпрессирован при глиобластоме.
С8Р-001	Хондроитин сульфат протеогликан 4	Трансмембранный протеогликан, играет роль в неоваскуляризации; гиперэкспрессирован опухолевыми клетками и перицитами на кровеносных сосудах злокачественных опухолей головного мозга.
РАВР7-001	Белок, связывающий жирную кислоту 7, головной мозг	Цитоплазменный белок, задействованный в метаболизме жирных кислот; ассоциирован с повышенной подвижностью клеток глиобластомы в окружающие ткани и с короткой выживаемостью; высоко
ΙΟΡ2ΒΡ3001 ΝΕΟΝ4Χ001 ΝΚ-САМ001 РТР-003 РТР-005 ΤΝ0001 ньа-цк ти ΒΙΚ-002	Инсулиноподобный фактор роста, 2 мРНК-связывающий белок 3 Нейролигин 4, Х-связь Нейрональная молекула клеточной адгезии Белковая тирозин-фосфатаза, рецепторный тип, Ζ полипептид 1 Тенасцин С МАР Сурвивин	гиперэкпрессирован при глиобластоме. Имеет функцию в обороте мРНК и трансляционном контроле; онкофетальный белок; описывается как гиперэкспрессированный при нескольких видах рака, где он ассоциируется с плохой выживаемостью. Молекула клеточной адгезии; мало литературы; высокая иммуногенность; высоко гиперэкпрессирован при глиобластоме и гастроинтестинальной стромальной опухоли (О18Т); играет роль в инвазии и онкогенезе. Участвует в сигнальных реакциях бетакатенина; играет основную роль в инвазии, росте опухоли и онкогенезе; высокие уровни экспрессии соотносятся с плохой выживаемостью. Трансмембранный белок типа I; высоко гиперэкпрессирован при глиобластоме, олигодендроглиоме и других опухолях; играет функциональную роль при онкогенезе; амплификация генов часто возникает при глиобластоме и других видах опухолей. Играет роль при ангиогенезе; ведущий участник в нескольких сигнальных реакциях, вовлеченных в трансформацию и пролиферацию опухоли; гиперэкспрессирован в кровеносных сосудах, снабжающих опухоль; ассоциирован с нишами стволовых клеток. Опухолевый антиген выживаемости, задействованный в регуляции апоптоза и пролиферации; гиперэкспрессирован при глиомах и других видах опухолей, соотносится с плохим прогнозом.
удлиненный НЬА-А* 02 ΤΙΙΜΑΡ
МЕТ-005	Протоонкоген Ме1	Рецептор фактора роста гепатоцитов; участвует в злокачественной трансформации, инвазивности и ангиогенезе; как сообщалось, ассоциирован со стволовыми клетками глиобластомы.

3. Презентация опухолеассоциированных пептидов (ТиМАР), содержащихся в ША950, на опухолевых пробах.

Пробы тканей.

Опухолевые ткани пациентов были предоставлены клиниками Нор1!а1 Сап!опа1 ишуегкйайе бе

- 32 032437

Сспстс, г. Женева (МеР1са1 Опсо1оду ЬаЬога!огу о£ Титог 1ттипо1оду) и №игосЫгигд18сРе ишуегеИайКРпгк г. Гейдельберг, Германия (молекулярно-биологическая лаборатория). Перед проведением хирургического вмешательства было получено информированное согласие всех пациентов в письменной форме. Сразу же после операции ткани были подвергнуты шоковой заморозке в жидком азоте и хранились до изоляции ТИМАРк при -80°С.

Изоляция пептидов НЬА из проб тканей.

Пептидные пулы НЬА из подвергнутых шоковой заморозке проб тканей были получены методом иммунопреципитации из плотных тканей в соответствии с незначительно измененным протоколом (Ра1к, К. е! а1. 1991; 8еедег, Р.Н. е! а1. Т. 1999) при использовании НЬА-А*02-специфического антитела ВВ7.2 или НЬА-А, -В, -С-специфического антитела \У6/32, СМВг-активированной сефарозы, кислотной обработки и ультрафильтрации.

Детекция пептидов ТИМАР масс-спектрометрическим анализом с Е81-жидкостной хроматографией (Е81-ЬСМ8).

Метод первый.

Полученные пулы пептидов НЬА были разделены в соответствии с гидрофобностью обратнофазной хроматографией (СарЬС, ^а!егк), и элюированные пептиды анализировали на гибридном квадрупольном время-пролётном тандемном масс-спектрометре с ортогональным ускорением ионов (ф-ТОР ИШта, \¥а!егк), снабженном источником Е81. Пептидные пулы наносили на предколонку С18 для концентрирования и опреснения. После нанесения предколонку помещали в линию для разделения с помощью микрокапиллярной колонки из плавленого кварца (75 мкм ί.Ρ.χ250 мм) с обратно-фазным материалом С18 в 5 мкм (Оюпех). Растворителем А был ацетат аммония/вода, 4 мМ. Растворителем В были 2 мМ ацетата аммония в 80% ацетонитрил/вода. В обоих растворителях был установлен уровень рН в 3,0 муравьиной кислотой. Был сформирован бинарный градиент от 15 до 60% В в течение 90 мин, с применением скорости потока в 5 мкл/мин, сниженного до приблизительно 200 нл/мин с помощью распределительной системы. Позолоченный стеклянный капилляр (Р1соТ1р, №\ν 0Ь)сс11ус) использовали для введения в источник микро-Е81. Временем интеграции для ТОР-анализатора было 1,9 с с временем задержки между измерениями в 0,1 с. Затем определяли последовательности пептидов анализом индуцированного столкновением (СШ) масс-спектра (Е81-ЬСМ8/М8). Идентифицированную последовательность пептида ТИМАР подтверждали сравнением генерированного фрагментационного образца естественного пептида ТИМАР с фрагментационным образцом синтетического контрольного пептида с идентичной последовательностью.

Метод второй.

Полученные пулы пептидов НЬА были разделены в соответствии с их гидрофобностью обратнофазной хроматографией (АсциРу ИРЬС 8ук!ет, \Уа1ег8) и элюированные пептиды анализировали на гибридном масс-спектрометре ЬТф-ОгРИгар (ТРегтоЕ1ес1гоп), снабженном источником Е81. Пулы пептидов наносили непосредственно на аналитическую микрокапиллярную колонку из плавленого кварца (75 мкм 1.Р.Х250 мм) с обратно-фазным материалом 1,7 мкм С18 (\Уа1ег8) с применением скорости потока в 400 нл в минуту. Затем пептиды разделяли с использованием двухэтапного 180-минутного бинарного градиента от 10 до 33% В при скорости потока в 300 нл/мин. Градиент был составлен из растворителя А (0,1% муравьиной кислоты в воде) и растворителя В (0,1% муравьиной кислоты в ацетонитриле). Позолоченный стеклянный капилляр (Р1соТ1р, №\ν 0Ь)сс11ус) использовали для введения в источник микро-Е81. Масс-спектрометр ЬТр-ОгЪйгар работал в зависимом от данных режиме с применением стратегии ТОР5. Вкратце, цикл сканирования начинался с полного сканирования с высокой точностью масс на спектрометре ОгЬйгар (В = 30,000), затем следовало сканирование М8/М8, также на ОгЬйгар (В = 7,500), 5 особенно многочисленных ионов-предшественников с динамическим исключением отобранных ранее ионов. Тандемные масс-спектры интерпретировали на 8ЕфИЕ8Т с дополнительным ручным управлением. Идентифицированную последовательность пептида ТИМАР подтверждали сравнением генерированного фрагментационного образца естественного пептида ТИМАР с фрагментационным образцом синтетического контрольного пептида с идентичной последовательностью. На фиг. 1а и Ь представлены отдельные масс-спектры, полученные для опухолевой ткани для ассоциированных с МНС класса I пептидов ТИМАР.

В табл. 7 представлены результаты анализа проб глиобластомы, в основном из первичных опухолей СВМ. Все НЬА-А*02 пептиды ТИМАР были обнаружены на трех из 18 проанализированных проб, и 5 из пептидов ТИМАР были детектированы в более чем 50% проанализированных проб СВМ.

- 33 032437

Таблица 7

Детекция пептидов ТиМАР I класса в пробах глиобластомы

№	Проба СВМ	Стадия опухоли (степень)	иМАР 1 класса детектирован (+) или не детектирован (-) при масс-спектрометрическом анализе
1МА-ВСА-002	1МА-СН1-001	1МА-С8Р-001 1	ΙΜΑ-ΙΑΒΡ7-001	1МА-1СГ2ВРЗ-001	о о X Ζ и ζ <	о о έ < и С£ Ζ < г	ΙΜΑ-ΡΤΡ-003	ΙΜΑ-ΡΤΡ-005	© © ύ ζ н 4 2
1	СВ6010Т	первичная СВМ (IV)	4-	4-	+	4-	4-	4-	4-	4-	4-	4-
2	ОВЮ23Т	первичная ОВМ (IV)	4-	4-	+	+	+	+	+	4-	4-	4-
3	СВ1021Т	первичная СВМ (IV)		4-	4-				-	-1-	-	4-
4	СВ6003Т'	первичная ОВМ (IV)		4-	+				-	4-	-	-
5	СВ1020Т	первичная СВМ (IV)		4-	4-				+	4-	-	4-
6	СВ6027Т	первичная СВМ (IV)	+	+	+			+		+	4·	4-
7	СВ1014Т*	вторичная СВМ (IV)		-	4-					+	-	4-
8	ОВЮ12Т	первичная СВМ (IV)		-	-					4-	4-	-
9	СВ6019Т	первичная СВМ (IV)		-	4-					4-	+	-
10	СВ1002Т	первичная СВМ (IV)		+						4-	4-	4-
11	СВ6024Т	первичная СВМ (IV)		+	+					4-	4-	-
12	СВ1006Т	первичная СВМ (IV)		-	-	+				4-	+	-
13	ОВ1004Т	первичная ОВМ (IV)		+	4-					+	-	-
14	ОВЮ08Т	первичная СВМ (IV)		+	4-					4-	-	4·
15	СВ1011Т	первичная ОВМ (IV)		+	+					4-	4-	4-
16	СВ1005Т	первичная СВМ (IV)	+	+	4-				+	4-	4-.	4-
17	ОВ6015Т	первичная СВМ (IV)		-	-				-	4-	-	-
18	ΟΒ6016Τ	первичная ОВМ (IV)		-	4-				-	4-	-	4-

Включены были только опухолевые пробы, проанализированные на лиганды I класса (- = 1МА950 I класса ТИМАР не детектирован; + = 1МА950 I класса ТИМАР детектирован)

4. Иммуногенность ш У1!го для пептидов ША950, презентируемых МНС I класса.

Для получения информации об иммуногенности пептидов, включенных в ^А950, нами были проведены исследования с использованием хорошо известных методов стимуляции ш У1!го, уже описанных в работах (4а1!ег, 8., Неггдеп, Ь., 8сРоог, О., 1ипд, С., \Уете1, Ό., ВиРппд, Н.1, Каттепзее, Н.С., апб 8!еуапоу1с, 8.; 2003, СиШпд ебде: ргебе!егттеб ηνιάιΐν о£ Ритап СЭ8 Т се11з ехрапбеб оп саРЬга!еб МНС/ап!1СЭ28-соа!еб т1сгозрРегез, I. Iттиηο1., 171, 4974-4978). Таким способом мы могли представить положительные данные по иммуногенности для 10 из 10 проанализированных пептидов, рестриктированных по НЬА-А*0201 и содержащихся в вакцине ^А950, демонстрируя, что эти пептиды являются Тклеточными эпитопами, против которых у человека существуют СЭ8+ Т-клетки-предшественники. Иммуногенность МЕТ-005 не могла быть протестирована этим методом, так как в удлиненной форме он не связывается с НЬА-А*02. Поэтому с МЕТ-005 не могут быть получены тетрамеры, которые обязательны для проведения стимуляции ш У1!го. Однако для включенного эпитопа НЬА-А*02 МЕТ-001 (ΥV^РVIΤ8I, см. ЕР 1507795 В1) продемонстрирована иммуногенность ш У1!го. Предполагается, что МЕТ-005 стимулирует МЕТ-001-специфические ЦТЛ после адекватного и естественно происходящего процессинга АПК. Иммуногенность МЕТ-001 указывает на присутствие МЕТ-001-специфических ЦТЛ у здоровых доноров, что является также предпосылкой для эффективности МЕТ-005 в составе противораковой вакцины. Поэтому иммуногенность МЕТ-001 является веским индикатором для иммуногенности МЕТ-005.

Прайминг 1п У1!го СЭ8+ Т-клеток.

Для проведения стимуляций ш У1!го искусственных антигенпрезентирующих клеток (аАРС), нагруженных комплексом пептид-МНС (рМНС) и антителом анти-СЭ28, мы сначала изолировали МПК (моноциты периферической крови) из свежей лейкоцитарной пленки НЬА-А*02+ с использованием стандартной среды для градиентного разделения (РАА, Со1Ье, Германия). Лейкоцитарные пленки были получены либо из банка крови г. Тюбинген, либо из госпиталя КаФаппепРозрИаГ г. Штутгарта. Изолированные МПК инкубировали в течение ночи для прайминга человеческого материала ш У1!го в Тклеточной среде (ТСМ), состоящей из КРМЬС^атах (ШуШодеп, Каг1згиРе, Германия) с добавлением 10% инактивированной нагреванием человеческой сыворотки АВ (РАА, Со1Ье, Германия), 100 ϋ/мл пенициллина/100 мкг/мл стрептомицина (СатЬгех, '%’епбегз, Бельгия), 1 мМ пирувата натрия (СС Рго, №из!аб!, Германия) и 20 мкг/мл гентамицина (СатЬгех). Лимфоциты СЭ8+ были изолированы с использованием СЭ8+ МАС8-оборудования для положительного отбора (М11!епу1, Вегд1зсР С1абЬасР, Германия) в

- 34 032437 соответствии с указаниями производителя. Полученные СЭ8+ Т-клетки инкубировали до использования в ТСМ с добавлением 2,5 нг/мл ИЛ-7 (РготоСе11, Не1бе1Ьегд, Германия) и 10 и/мл ИЛ-2 (СЫгоп, Митей, Германия). Получение покрытых гранул рМНС/анти-СО28, Т-клеточные стимуляции и считывание производили, как описывалось ранее (^УаПег е! а1., 2003), с минимальными модификациями. Вкратце, биотинилированные рекомбинантные молекулы НЬА-А*0201, в которых не хватает трансмембранного домена и которые были биотинилированы на карбоксильном конце тяжелой цепи, были получены в соответствии с методом, описанным в работе (А1!а1ап е! а1., 1996). Очищенный костимулированный мышиный ^С2а к антителам человека СЭ28 АЬ 9,3 (1ипд е! а1., 1987) был химически биотинилирован с использованием сульфо-N-гидроксисукцинимидобиотина. как рекомендуется изготовителем (РегЫо, Вопп, Германия). рМНС, использованные в качестве положительных и отрицательных контролей, были А*0201/МЬА-001 (пептид ЕРАС1С1РТТ из модифицированного Ме1ап-А/МАЯТ-1) и А*0201/0ПХ5-001 (Υ1Л .Р./МУЧ II из ΌΌΧ5) или А*0201/НВУ-001 (ТЬР8ВЕЕР8У) соответственно.

800.000 гранул/200 мкл были покрыты в 96-луночном планшете в присутствии 600 нг биотина антиСЭ28 и 200 нг релевантного биотин-рМНС (высокоплотные гранулы) или 2 нг релевантного и 200 нг нерелевантного (библиотека рМНС) МНС (низкоплотные гранулы). Стимуляции были инициированы в 96-луночных планшетах при коинкубации 1х10⁶ СЭ8+ Т-клеток с 2x105 промытых покрытых гранул в 200 мкл ТСМ с добавлением 5 нг/мл ИЛ-12 (РготоСе11) в течение 3-4 дней при 37°С. Половина среды была заменена на свежую ТСМ с добавлением 80 и/мл ИЛ-2, и инкубация была продолжена в течение 34 дней при 37°С. Данный цикл стимуляций производили в общей сложности три раза. В заключение проводили тетрамерные анализы с флуоресцирующими тетрамерами МНС (полученными, как описывается в работе (А1!а1ап е! а1., 1996)) с антителом СП8-ЕГТС клона 8КЧ (ВО, Не1бе1Ьегд, Германия) на четырехцветном цитометре ЕАС8Са11Ьиг (ВЭ). Пептид-специфические клетки были подсчитаны как процентная доля всех ί'.Ό8+ Т-клеток. Оценку тетрамерного анализа проводили с помощью программы ЕС8 Ехргезз (Ое Νονο ЗоЙшаге). Прайминг 1п νί!ίο специфических лимфоцитов тетрамер+ СЭ8+ детектировался установкой подходящего гейта и при сравнении со стимуляциями негативного контроля. Иммуногенность для заданного антигена была детектирована, если было обнаружено, что по крайней мере в одной подлежащей оценке простимулированной 1п νί!ίο лунке одного здорового донора содержалась специфическая СЭ8+ Т-клеточная линия после стимуляции 1п νί!ίο (т.е. данная лунка содержала по крайней мере 1% специфического тетрамера+ среди СЭ8+ Т-клеток и процентная доля специфических клеток тетрамера+ была по крайней мере в 10 раз выше среднего значения стимуляций с негативным контролем).

Иммуногенность 1п νί!ίο для пептидов ГМА950.

Для проанализированных пептидов НЬА I класса, иммуногенность 1п νί!ίο могла быть продемонстрирована генерированием пептид-специфических Т-клеточных линий. Репрезентативное окрашивание, выявляющее образование Т-клеточных линий, представлено на фиг. 1. Результаты обобщены в табл. 8.

Таблица 8

Иммуногенность 10 пептидов НЬА I класса, включенных в ГМА950

Антиген	Положительн. доноры / проанализированные	Положит, лунки / проанализированные
	доноры	лунки
ВСА-002	75 %	35 %
СН1-001	100%	63%
С8Р-001	100%	57%
ГАВР7-001	100%	27%
ЮР2ВРЗ-001	50%	21 %
ΝΤΤ ΠΝΓ/1V ЛЛ 1	1 лл 0/_	£0 ΟΖ
1иь\л ’ίτ/νυν ΐ	хνν /и	их. / и
ΝΚΟΑΜ-001	86 %	39%
РТР-003	50%	17%
РТР-005	100 %	52%
ΤΝϋ-001	60%	30%
МЕТ-001 (МЕТ-005)	67%	39%
НВУ-001	43 %	12%

Здесь обобщены результаты экспериментов по иммуногенности 1п νί!ίο, проведенных фирмой 'Тттайсз для всех пептидов НЬА I класса, включенных в вакцину ГМА950. Приводимые результаты были получены при стимуляции клеток СЭ8+ высокоплотными гранулами. Так как различные партии человеческой сыворотки могут сильно влиять на результаты по иммуногенности, то вместе оценивались только те анализы, в которых была использована одна и та же партия сыворотки.

В дополнение к этим результатам, полученным от здоровых доноров, пептиды ВСА-002, СНЕ001 и ΝΕΟΝ4Χ-001 были также протестированы на небольшом количестве пациентов с глиобластомой. Все пептиды были подтверждены в качестве иммуногенных в равной степени по сравнению со здоровыми

- 35 032437 донорами, демонстрируя существование предшественников Т-клеток в соответствующей целевой популяции для вакцины.

5. Иммуногенность пептида ГМА950 II класса ТυМАΡ ВГК.-002.

Клиническое исследование проводилось для подтверждения иммуногенности пептида с 8ЕР Ш № 12.

Первоочередной целью было исследование основанного на Ρ8А (простата-специфический антиген) ответа фЗА-К) на подкожное введение набора простата-специфических пептидов (вакцинационная терапия) пациентам с биохимическим рецидивом после радикальной простатэктомии без обнаружения явных метастатических очагов.

Второй целью исследования было изучение переносимости и осуществимости введения вакцины пациентам с раком предстательной железы при особенном учете иммунологических феноменов с точки зрения Т-клеточного ответа.

Исследование было разработано как проспективное рандомизированное исследование фазы VII для показания биохимический рецидив после радикальной простатэктомии без обнаружения явных метастатических очагов.

Испытуемая группа.

Частью данного исследования фазы VII стала попытка вызывания Ρ8А-регрессии в качестве индикатора прекращения роста опухоли посредством вакцинации набором простата-специфических пептидов пациентов с НЬА-А*02+ с биохимическим рецидивом после радикальной простатэктомии. Комбинация простата-специфических пептидов вводилась подкожно с оценкой силы соответствующего иммунного ответа в контексте разнообразных форм введения антигенных структур.

В отличие от предыдущих исследований вакцинаций целью запланированного исследования было лечение пациентов с небольшим бременем опухолевого заболевания, еще не обнаруживаемого с помощью процедур визуализации. Все пациенты были иммунизированы одинаковым способом с использованием известных простата-специфических антигенных структур для усиления иммунного ответа на злокачественные трансформированные клетки. Лечение прошли девятнадцать пациентов.

Таблица 9 Характеристики испытуемой группы

	Всего	%	Среднее	Диапазон
Возраст	19		63	55-77
Предварительное нео- / адъювантное лечение
Нет	И	58
Облучение	3	16
Периодическая гормон, терапия	2	11
Облуч. + Период, горм. терапия	2	11
Облуч. + Химиотерапия	1	5
ΤΝΜ при КРХ
Т2а-с КО	6	32
ТЗа-с КО	6	32
Т2а-с К1	3	16
ТЗа-с К1	3	16
ТЗаХ2 КО	1	5
По шкале Глисона
5-7	10	53
8 - 10	з	16
неизвестно	6	32
КРХ до вакцинации в месяцах			41	9-124
Первый рецидив после операции в месяцах			14	1 -90
Р8Ав начале вакцинации			0,76	0,14-10,8

План лечения.

После исключения явных метастатических очагов с помощью компьютерной томографии и сцинтиграфии скелета пациентам с обнаруженным Ρ8А-рецидивом после предварительной радикальной простатэктомии в соответствии с различными формами введения вводилась подкожно простата-специфическая

- 36 032437 пептидная вакцина (увеличение Р8А на 50% во время двух измерений по истечении по крайней мере 14 дней). Вакцину вводили 8 раз в 0, 7, 14, 28, 42 и 56 день (приблизительно 100 мкг на пептид и инъекцией каждый раз). После каждой вакцинации и снова на 70 день проводилось измерение Р8А для оценки терапевтической реакции.

Если обнаруживалась реакция опухоли (полная ремиссия [Р8А-СВ], частичная ремиссия [Р8А-РВ] или стабильное клиническое состояние [без изменений Р8А^С]), пациенту вводили вакцину один раз в месяц для поддержания терапии в соответствии с выбранной формой введения. Реакции пациента на вакцинацию давали подробную оценку следующим образом.

Полная ремиссия (Р8А-СВ): нормализация первоначально повышенного уровня Р8А, подтвержденная измерениями, проведенными, по крайней мере, по истечении 4 недель. Нормализация дефинируется как самый низкий уровень Р8А, составляющий <0,2 нг/мл, который мог бы ожидаться после радикальной простатэктомии с полным удалением опухоли или простаты.

Частичная ремиссия: а) Р8А-РВ <80% (снижение первоначально повышенного уровня на 80%, подтвержденное измерениями, проведенными, по крайней мере, по истечении 4 недель); и Ь) Р8А-РВ <50% (снижение первоначально повышенного уровня на 50%, подтвержденное измерениями, проведенными, по крайней мере, по истечении 4 недель).

Стабильное состояние (Р8А-8Э): без существенных изменений в течение по крайней мере 4 недель. Это включает стабилизацию и снижение на менее чем 50% и увеличение на менее чем 10%, подтвержденное измерениями, проведенными, по крайней мере, по истечении 4 недель.

Прогрессирование (Р8А-РЭ): увеличение уровня Р8А на более чем 10%. В случае прогрессии Р8А исследование завершалось.

После рекрутирования пациентов для исследования применялась эпитоп-специфическая вакцина; учитывались белки, специфически экспрессируемые в эпителиальных клетках простаты (к примеру, Р8МА/Р8СА). В дополнение к исследованию общей эффективности вводившейся вакцины в отношении мониторинга роста остаточных опухолевых фракций, как это было оценено при Р8А-мониторинге, в данном исследовании изучались эффекты от различных способов вакцинации в отношении эффективной модуляции иммунной системы. В дополнение к простому подкожному введению пептидов в отдельности использовались также различные комбинации с адъювантами. В частности, использовались депо и адъювантная активность для пептидных вакцин из монтанида (состав из классического неполного адъюванта Фрейнда, подходящий для введения человеку), который недавно был описан в очень выгодном свете. В этих целях 500 мкл пептидного раствора смешивали с 500 мкл монтанида и вводили. Тем самым получалась эмульсия вода в масле, которая медленно, в течение нескольких недель, высвобождает антиген, содержащийся в водной фазе. Физическая стойкость эмульсии очень высока, так как при 4°С она может храниться более 3 месяцев без значительного разделения фаз. Функция депо монтанида успешно нашла применение в нескольких исследованиях вакцин (Ока е! а1., 2004).

На одном направлении исследования изучалась эффективность вакцинации во время сопутствующей стимуляции иммунной системы факторами роста, ГМ-КСФ, раствором для инъекций Ьеикше®. ГМКСФ - это адъювант, очень часто используемый в исследованиях пептидных вакцинаций, в некоторых из которых сообщается об усиленных клинических и Т-клеточных ответах. Изначально ГМ-КСФ играет роль в рекрутинге и является фактором дифференциации дендритных клеток, за счет которого, как считается, увеличивается число дендритных клеток в месте введения вакцины. Хотя ГМ-КСФ самостоятельно не активирует антигенпрезентирующие клетки, такие как дендритные клетки и макрофаги, сообщалось о непрямой активации 1п νί\Ό (Мо1епкатр е! а1., 2005).

Другое направление исследования было посвящено изучению эффективности вакцинации во время сопутствующей активации дендритных клеток при накожном использовании имиквимода. Имиквимод применялся в виде 5% мази (А1бага). Она имеет сильное иммуностимулирующее воздействие посредством своего влияния на ТЬВ7-положительные клетки (к примеру, плазмацитоидные ДК, клетки Лангерганса, дермальные ДК), активируя МуИ88-зависимый сигнальный путь. Активированные АПК высвобождают Т-клеточную стимуляцию и воспалительные цитокины, увеличивают костимуляцию и мигрируют к дренирующим лимфатическим узлам. Потенциал имиквимода по усилению пептид-индуцированного ответа ЦТЛ при подмешивании антигенов в мазь или применении А1бага на месте инъекций к.с. или 1.б. для антигенов был продемонстрирован на моделях с животными.

Другое направление исследования было посвящено изучению эффективности вакцинации во время сопутствующей активации дендритных клеток при их смешивании с протамин-стабилизированной мРНК, кодирующей муцин-1 для активации ТЬВ 7/8. мРНК демонстрирует широкую активацию популяций иммунных клеток мыши и человека. Присутствие в составе полиосновного белка протамина повышает полураспад мРНК и вызывает формирование потенциальных депо-формирующих частиц. Этот адьювант может поэтому совмещать депо-формирующие и АПК-формирующие свойства. Вкратце, формы введения вакцины включали следующие подходы:

подкожное введение пептидной вакцины, эмульсифицированной в монтаниде;

подкожное введение пептидной вакцины, эмульсифицированной в 500 мкл монтанида, в комбина- 37 032437 ции с топическим введением 225 мкл ГМ-КСФ с целью получения более сильного иммунного ответа, вызванного сопутствующим введением факторов роста;

подкожное введение пептидной вакцины, эмульсифицированной в 500 мкл монтанида, в комбинации с локальной гипертермией, применяемой после с целью получения термально-индуцированного более сильного иммунного ответа;

подкожное введение пептидной вакцины, эмульсифицированной в 500 мкл монтанида, в комбинации с накожным применением имиквимода в целях активации дендритных клеток посредством ТБВ 7;

подкожное введение пептидной вакцины, эмульсифицированной в 500 мкл монтанида, вместе с 55 мкл муцина-1 мРНК/протамина в целях активации дендритных клеток посредством ТБВ 7/8.

Схема вакцинации.

Общая продолжительность исследования составила 3 года.

Простата-специфические пептидные вакцины вводили пациентам в 0, 7, 14, 28, 42 и 56 дни. Пациентам со стабильным протеканием болезни или объективным ответом опухоли (РЗА-СВ или РЗА-РВ) вакцину вводили раз в месяц 1.б., пока не обнаруживалась явная прогрессия. Исходя из имеющегося опыта, инъекции на основе пептидов переносятся без значительных побочных реакций. Так как реакция на вакцинацию оценивалась только серологически на основе измерений РЗА, то в начале исследования проводился тест для определения, не интерферирует ли введенная вакцина с измерениями РЗА ш νίϋΌ, что могло бы симулировать клинический ответ. В 0, 7, 14, 28, 42, 56 и 70 день брались пробы крови для лабораторных анализов, определения уровней РЗА, лейкоцитарной формулы, анализа ЕАСЗ и цитокинов. Если лечение продолжалось после 70 дня, проводили 6-недельный мониторинг Р8А в целях своевременного обнаружения неудачи лечения.

Лечение прекращали, если документировалось появление прогрессии болезни, выражавшееся в продолжительном повышении уровня Р8А.

Начиная с 84 дня, иммунизационная терапия продолжалась с 4-недельными перерывами до документированной прогрессии вплоть до 420 дня (15 месяцев). Решения в отношении продолжения лечения (в случае успеха) вне данного исследования принимались, исходя из каждого индивидуального случая. Неожиданных побочных реакций в этом исследовании не было.

Лабораторные анализы включали тесты на коагуляцию, электролиты, лактатдегидрогеназу, 32-М, СК, ферменты печени, билирубин, креатинин, мочевую кислоту, общий белок, коагуляцию, Среактивный белок, дифференцированную лейкоцитарную формулу с мазком, уровень Р8А, цитокины, ЕАСЗ, Ийвро!.

Анализ реакции кожи на указанные бактериальные и грибные антигены (48-72 ч после введения, гиперчувствительность замедленного типа (ОТН), опосредованной Т-клетками, будет служить в качестве анализа клеточной иммунной системы пациента до начала исследования).

Пептиды, необходимые для исследования (нонапептиды), были изготовлены в лаборатории РО Όγ. 81еГап 8ΐеνаηоν^с на кафедре РгоГ. Н.-6. Ваттепвее. Эти пептиды очищали на ВЭЖХ и анализировали с помощью масс-спектрометрии. Чистоту пептидов можно также проверить посредством ВЭЖХ, массспектрометрии и секвенирования методом Эдмана. С помощью этих методов может документироваться чистота вплоть до 98% (которая должна рассматриваться как максимально возможная в соответствии с современными методами). Синтезированные пептиды растворяли в ДМСО (Сгуо8иге, ВДАК Сйет1е Меб1са1 СтЬН; 10 мг/мл), разбавляли до соотношения 1:10 в Атриета (Егеветив КаЬ1) и аликвотировали в стерильных условиях.

Клинический ответ.

У двух пациентов с помощью ПЭТ-КТ можно было обнаружить локальные рецидивы, после того как была обнаружена локальная опухоль при длительном цифровом ректальном обследовании. У оставшихся 17 пациентов по окончании исследования не могло быть установлено местонахождение активности заболевания.

Во время повторного лабораторного анализа лейкоцитарной формулы или экстенсивной клинической химии не обнаружилось ни каких-либо отклонений, ни изменений во время исследования.

Из 19 пациентов 16 пациентов реагировали на пептид из сурвивина II (ΓΕΝ-γ БЫЗРОТ, ±Κ'.’8) в соответствии с 8ΕΟ Ш № 12. Среди них были 12 пациентов с индукцией антисурвивинового Т-клеточного ответа при вакцинации, 2 с существовавшими предварительно антисурвивиновыми Т-клетками и 2 пациента, у которых невозможно было установить, были ли существовавшие предварительно Т-клетки в избытке.

Биохимический ответ.

Полный ответ рассматривался как не обнаруживаемый уровень РЗА в соответствии с самым низким уровнем, обнаруживаемым лабораторией, сотрудничающей после изначально повышенного уровня РЗА. Измерения должны были быть подтверждены после периода времени, составляющего по крайней мере 4 недели. РВ >80% и >50% должен пройти повторную оценку после четырех недель соответственно.

Уровень РЗА, находящийся в диапазоне между снижением на менее чем 50% и ростом на менее чем 10%, отражал стабильное состояние заболевания, если был подтвержден по крайней мере после четырех

- 38 032437 недель. Прогрессирующим заболевание считалось, если Р8А возрастал на более чем 10% по сравнению с началом лечения.

Биохимический ответ у пациентов, которые завершили исследование, наблюдался, пока они не начинали последующее лечение местньм облучением или антигормональную терапию.

пациентов дали согласие на участие в исследовании, и данные анализировали с самым долгим последующим наблюдением, составившим около 3,75 года.

Стабильность Р8А и увеличение ЭТ (время удвоения).

Уровень Р8А двух пациентов (10,2%) выражал стабильность в соответствии с упомянутыми выше критериями для биохимического ответа, которые подразумевают, что по окончании исследования не было зафиксировано роста уровня Р8А более чем на 10% по сравнению с началом исследования (фиг. 6, табл. 10, 11 и 12). Последующее наблюдение в этих двух случаях проводилось 14 и 16 месяцев спустя после проведения последней вакцинации. Средняя продолжительность стабильного состояния составила 24 месяца (28 и 31) в момент прекращения сбора данных со средним числом вакцинаций - 18 (14 и 20).

Один пациент из этих двух пациентов имел частичный ответ >50% в течение периода в 9 месяцев с последующим периодом медленного роста Р8А со временем удвоения в 20,5 в сравнении с 9,8 месяцами до вакцинации. Начальный рецидив Р8А начинался 18 месяцев спустя после операции для опухоли рТ2рЖ) по Глисону 5.

Во время анализа данных пациент № 8 имел стабильное протекание болезни с начала программы вакцинации 28 месяцев назад. Он прервал лечение в связи с аллергической реакцией после 10 месяцев и 14-й вакцинации. У него сложилась неблагоприятная ситуация с рТ3Ь по Глисону 3+4 с наиболее низким уровнем Р8А после радикальной простатэктомии не выше 0,6 нг/мл и прогрессией Р8А без запоздания во времени после начального снижения после операции. Время удвоения замедлилось с 6,6 до 148 месяцев.

Данные два пациента лечились имиквимодом, наносившимся при каждой пептидной вакцинации дермально на место введения.

Рост Р8А ОТ без стабильности Р8А.

Р8А ОТ пациента 11 был повышен с 1,5 до 10,1 месяцев в течение шести месяцев исследования. Так как он начал с уровнем Р8А в 10,8 нг/мл и достиг 17,8 нг/мл, он завершил процедуры исследования для прохождения антиандрогенной монотерапии без каких-либо злокачественных поражений, выявленных ПЭТ-КТ. Ему вводили А1дага в качестве адъюванта.

Пациент 16 начал вакцинацию с муцин-1-мРНК/протамином со временем удвоения в 6,1 месяцев. Скорость Р8А снизилась до времени полураспада в 2,7 месяцев для пяти месяцев с последующим статистически подсчитанным ростом Р8А ЭТ в 14,4 месяцев, который продолжается 16 месяцев после начала лечения. Начиная с уровня Р8А в 0,29 нг/мл, он снизился до 0,19 нг/мл во время первых 5 месяцев во время лечения в рамках исследования, вырос до 0,4 нг/мл в течение последующих 8 месяцев и закончил исследование с протокольным значением в 0,41 нг/мл 19 месяцев спустя после начала лечения.

Прогрессия Р8А.

У пациента 5 наблюдалась прогрессия во время исследования в соответствии с предполагавшимся временем удвоения Р8А до вакцинации. Однако у него произошло снижение Р8А со временем полураспада в 20,2 месяца в течение продолжительного периода после завершения лечения, составившего 10 месяцев на момент завершения сбора данных. Он все еще не проходил никакого вторичного лечения после завершения вакцинации.

Таблица 10

Время удвоения РБА в месяцах

	Всего	%	Средн, геометри ч. знач-е	Диапазон ϋΤ
Уровень Р8А ЭТ до вакцинации в месяцах	19		8,3	1,5-44,8
Уровень Р8А ЦТ по завершении исследования или	18*		11,2	2,2 -148
в конце последующих обследований
Без изменений Р8А ϋΤ во время вакцинации	11	58		2,2-44,8
Повышенный уровень Р8А ΏΤ, имеющийся по	4	21
завершении исследования
Без изменений Р8А ϋΤ во время вакц., но со	1	5
снижением после
Временное снижение Р8А или рост ЭТ с	3	16
последующим снижением ϋΤ

* Р8А ЭТ по завершении исследования или в конце последующих обследований не был охвачен для пациента 5 из-за снижения Р8А.

- 39 032437

7. Связывание пептидов по изобретению, рестриктированных по НЬА класса I, с НЬА-А*0201.

Цели и итоги.

Целью данного анализа была оценка аффинности пептидов НЬА класса I по отношению к молекуле МНС, закодированной аллелем НЬА-А*0201, так как это является важным параметром для способа действия ГМА950. Степень аффинности к НЬА-А*0201 была средней до высокой для всех 10 пептидов в ГМА950, рестриктированных по НЬА класса I, и МЕТ-001, константы диссоциации (КО) находились в диапазоне от 0,14 (МЕТ-001) до 2,05 нМ (С8Р-001). Все значения находятся в пределах от 0,1 для сильной силы связывания НВV-001 и 4,4 для средней силы связывания МИС-001. Данные результаты подтверждают сильную аффинность связывания всех пептидов НЬА класса I из вакцины-кандидата ГМА950 и МЕТ-005, образованного из МЕТ-001 к НЬА-А*02.

Принципы теста.

Стабильные комплексы НЬА/пептид состоят из трех молекул: тяжелой цепи НЬА, β-2 микроглобулина (Ь2т) и пептидного лиганда. Активность денатурированных рекомбинантных молекул НЬА-А*0201 с тяжелой цепью сама по себе может быть сохранена, делая их функциональными эквивалентами пустых молекул НЬА-А*0201. Если они растворены в водном буфере, содержащем Ь2т и подходящий пептид, то данные молекулы быстро и эффективно сворачиваются в полной зависимости от пептида. Наличие данных молекул использовалось в анализе, основанном на методике ЕЫ8А, для измерения аффинности взаимодействия между пептидом и молекулой НЬА класса I (8у1уев1ег-Н\зЕ е1 а1., 2002).

Очищенные рекомбинантные молекулы НЬА-А*0201 инкубировали вместе с Ь2т и ступенчатыми дозами интересующего пептида. Вместо МЕТ-005 полной длины, который не имеет способности связываться с НЬА I класса, в анализ был включен проверенный продукт, МЕТ-001, связывающийся с А*0, полученный 1п у1уо из МЕТ-005 при естественно происходящем процессинге антигена. Количество новообразовавшихся комплексов НЬА/пептид определялось количественным методом ЕЫ8А. Константы диссоциации (значения КО) вычислялись с использованием стандартной калибровочной кривой, записанной с титров комплекса калибровки НЬА/пептид.

Результаты.

Результаты представлены на фиг. 2. Более низкое значение КО отражает более высокую аффинность к НЬА-А*0201. Большинство из пептидов ГМА950 имели похожие и сильные аффинности к НЬАА*0201 в диапазоне от 0,1 (№ν-001, сильная сила связывания) до 44,4 нМ (МИС-001, средняя сила связывания). Таким образом, все пептиды ТИМАР I класса имеют сильную аффинность связывания по отношению к молекуле МНС А*02.

8. Связывание пептидов по изобретению, рестриктированных по НЬА класса II, с НЬА-ОВ.

Цели и обобщение.

Пептиды ТИМАР II класса активируют Т-хелперные клетки, которые играют решающую роль в содействии функции ЦТЛ, инициированную пептидами ТИМАР, рестриктированными по I классу. Связывание пептидов ГМА950 II класса с несколькими различными молекулами НЬА II класса (беспорядочное связывание) важно для подтверждения того, что большинство из пациентов, проходящих лечение вакциной-кандидатом ГМА950, способны получить пользу от поддерживающего ответа хелперных Т-клеток. Например, НЬА-ОВ, наиболее доминантно экспрессированная человеческая молекула НЬА II класса, высоко полиморфна с несколькими сотнями известных аллелей. Основываясь на частоте для гаплотипа НЬА-ОВВ1 и широко применяемых алгоритмах связывания, можно предсказать, что оба лиганда НЬА II класса в [МА950 - IМА-ВIВ-002 и IМА-МЕТ-005, являются пептидами, беспорядочно связывающимися с НЬА-ОВ. Конкретнее, вероятность того, что НЕА-А*02-положительный европеоид экспрессирует по крайней мере один подходящий аллель НЬА-ОВ составляет >90% для обоих ТИМАР -пептидов ^А950 II класса. Так как оставшиеся человеческие аллели II класса НЬА-00 и -ОР были опущены в этих расчетах из-за недостатка данных по частоте или алгоритмов предсказания связывания, действительная беспорядочность связывания, скорее всего, еще выше. Подсчитанная беспорядочность двух пептидов ТИМАР ГМА950 II класса находится в том же диапазоне, что и для известного эпитопа рап-ОВ (РАОВЕ, частота генотипа Ррго)ес1еЕ (спроецированная) = 93,1%). В дополнение беспорядочное связывание этих пептидов было подтверждено экспериментально ш У11го анализами связывания. Более того, для IМА-ВIВ-002 могла быть продемонстрирована высокая иммуногенность ш у1уо (см. выше). Обобщая, данные результаты подтверждают, что МЕТ-005 и ВГК.-002 являются пептидами беспорядочного связывания с НЬА-ОВ.

Принцип прогнозирования связывания.

С помощью алгоритма 8ΥΕΡЕIТНI, разработанного в университете г. Тюбинген (ТиЬшдеп) (Ваттепвее е1 а1., 1997; Ваттепвее е1 а1., 1999), был составлен рейтинг связывания пептидов ТИМАР ^А950 II класса с несколькими распространенными аллелями НЬА-ОВ. Этот алгоритм уже успешно применялся для идентификации эпитопов I и II класса из широкого спектра антигенов, например, из человеческих опухолеассоциированных антигенов ТВР2 (класс I) (8ип е1 а1., 2000) и 88X2 (класс II) (Беитапп е1 а1., 2004). Пороговое значение для связывания было задано числом 18, основываясь на анализе опубликованных показателей связывания для известных беспорядочно связывающихся лигандов НЬА-ОВ.

Использовались частоты гаплотипа, опубликованные для гаплотипа НЬА-ОВ, среди НЬА-А*02положительного европеоидного населения (Моп е1 а1., 1997) и частоты гаплотипов высокого разрешения

- 40 032437 (С1апоск е! а1., 2004) (см. табл. 2). Частота гаплотипа - это частота обособленного аллеля на отдельной хромосоме. По причине наличия диплоидного набора хромосом в клетках млекопитающих частота возникновения генотипа этого аллеля может быть подсчитана, используя принцип Харди-Вейнберга (частота гаплотипа СГ ведет к возникновению генотипа Е (Е = 2С{-С_Г ²]).

Сумма частоты гаплотипа ЭКВ1 с известной матрицей ЗΥЕРЕIТНI и известной индивидуальной частотой среди А*02+ европеоидного населения составляет 47,8%. Поэтому предсказанное распределение связывания пептидов II класса ТИМАР с этими аллелями было спроецировано на оставшиеся 52,2% аллелей ЭРВЕ для которых эта информация отсутствует.

В заключение, беспорядочное связывание определяется как связывание пептида с несколькими аллелями НЬА-ЭК с вероятностью, что один из них экспрессирован у европеоидного населения, составляющей, по крайней мере 50%.

Принцип анализа связывания ш νί!Γ0 (РгоИнтипе КЕУЕЛЬ™).

IМА-ВIΒ-002 и IМА-МЕТ-005 были составлены с антигенами НЬА-ΌΒ с широкой специфичностью (НЬА-ЭКЗ по ΌΒ7, которые включают также общие антигены НЬА-ЭКИ по -ΌΒ15 (Мой е! а1., 1997)) и проанализированы с помощью анализа по связыванию МНС-пептид КЕVЕЛ^™ (Р^оIттипе, ОхЕогб, Великобритания) для определения их уровня внедрения в молекулы МНС. В этом анализе связывание сравнивали с показаниями для контрольного пептида на годен/не годен и пептидом положительного контроля для каждого антигена НЬА-ОК

Результаты.

Исходя из прогноза по алгоритму ЗΥΕРЕIТНI, IМА-ВIΒ-002 и IМА-МЕТ-005, скорее всего, связываются с 7/8 и 8/8 аллелей НЬА-ΌΒ, соответственно, с известным участком связывания (табл. 11). Вероятность того, что НЕА-А*02-положительный европеоид экспрессирует по крайней мере один подходящий аллель НЬА-ОКВ1 для IМА-ВIΒ-002 или IМА-МЕТ-005 составляет 92,6 и 100% соответственно. Поэтому оба пептида IМА950 II класса, как было предсказано, беспорядочно связываются с НЬА-ЭК.

Если частота гаплотипа связывания аллелей НЬА-ЭКВ1 была завышена в рамках данного подхода на два порядка, то их генотипическое возникновение все равно составляет >50% для всех пептидов II класса ТИМАР в ЕМА950. Кроме того, экспериментальное подтверждение беспорядочного связывания [МЛ-В[К-002 с НЬА-ОК1, 3, 4 и 11 было получено сбором таких данных ш уйго (фиг. 3). Данные по связыванию двух перекрывающихся 15-меров, покрывающих всю последовательность, для IМА-МЕТ-005 ш уйго позволяют предположить связывание с НЬА-ЭКИ; однако Р^оIттипе КЕУЕАЬ™ применяется в качестве инструмента для грубого скрининга в целях идентификации потенциальных эпитопов НЬА II класса. Хорошо связывающиеся с НЬА-ΌΒ пептиды с медленной скоростью ассоциации в рамках этого анализа потенциально рассматривались как ложно негативные, несвязчики. Таким образом, небеспорядочность связывания с НЬА-ЭК IМА-МЕТ-005 ш νΐνο не может быть выведена из негативных данных 1п νί!Γ0 анализа РгоЕнтипе ^РУРАЙ™. Так, вполне возможно беспорядочное связывание с НЬАΌΒ IМА-МЕТ-005 в рамках основанной на ЕМА950 вакцинации. Так как нет исчерпывающих данных о свойствах связывания и частоте для оставшихся локусов II класса, НЬА-Όρ и -ЭР, то эти молекулы были исключены из расчетов. Тем не менее, эти молекулы являются дальнейшими возможностями для связывания для пептидов ТИМАР IМА950 II класса.

Так как широкая иммуногенность IМА-ВIК-002 была подтверждена в рамках клинического исследования для пациентов с раком предстательной железы с различными аллелями НЬА-ΌΒ, беспорядочность связывания этого пептида II класса была отчетливо подтверждена ш νΐνο.

В заключение, анализ ш кШсо свойств связывания с НЬА-ΌΒ двух пептидов II класса, содержащихся в ЕМА950, и дополнительные экспериментальные свидетельства из анализов ш νΐίΓΟ и клинического исследования с ВЕК-002, дают все основания предполагать, что данные пептиды ТИМАР беспорядочно связываются с человеческими молекулами II класса НЬА.

Таблица 11 Показатели связывания для пептидов ТИМАР IМА950 II класса с аллелями НЬА-ЭК с известным соединительным элементом

Приводятся показатели связывания по ЗΥΕРЕIТНI для наиболее распространенных аллелей НЬАИКВ1 среди европеоидного населения, р показывает частоту гаплотипа среди НЬА-А*02положительного европеоидного населения. Пептид рассматривался как связывающийся с молекулой НЬА, если показатель был равен или выше 18. Результатом накопления значений р для связывания с аллелями ИКВ1 является минимальная частота гаплотипа р_т1п. Распространение этих частот на все аллели ИКВ1, включая те, что имеют неполную прогностическую матрицу по связыванию или данные по частоте, дает спроецированную частоту гаплотипа р_рГд_ес!еб, которая соответствует частоте возникновения гено^{типа Е}рго_]ес!еб.

- 41 032437

ΙΜΑ-ΒΙΚ-002

Аллель ΌΚΒ1 *	0101	0301	0401	0404	0701	1101	1104	1501
Показ-ль 8ΥΓΡΕΙΊΉΙ	28	29	28	24	14	32	24	30
Р	6,6%	5,9%	9,6%	6,0%	13,0%	4,4%	2,3%	п.б.
спрогнозированное связывание	Да	да	да	да	нет	да	да	Да
	Ρηιίη	34,8%
Частота гаплотипа Рр^есиа	72,8%
Частота генотипа Гр^есиа	92,6%

ΙΜΑ-ΜΕΤ-005

Аллель ϋΚΒΙ*	0101	0301	0401	0404	0701	1101	1104	1501
Показ-ль 8ΥΡΡΕΙΤΗΙ	28	20	26	26	28	20	22	22
Р	6,6%	5,9%	9,6%	6,0%	13,0%	4,4%	2,3%	п.б.
спрогнозированное связывание	да	Да	да	да	да	да	да	да
	Ρπιίη	47.8%
Частота гаплотипа Ррпуеаеа	100.0%
Частота генотипа Ерпцесиа	100.0%

п.б. = нет данных.

Список использованной литературы

ЛЬои! I., йаигепйМадшп Ό., Йепбак1 и., МЙ81аб18 Т.А. (2000). №кйп ехргеккюп т етЬгуотс апб абик китап 1ее1к ипбег погта1 апб ра1ко1од1са1 сопбШоп8. Ат I. Ра1ко1. 157, 287-295.

АдЫ М., Саν^ап^ Р., Неп8оп б.^., Ва1ске1ог Т.Т., Йош8 Ό.Ν., Вагкег Е.С. (2005). Мадпекс ге8опапсе 1тадтд скагас1еп8Йс8 ргесйс! ер1бегта1 дго\1к Гас1ог гесер1ог атркксакоп 81а1и8 т д1юЬ1а81ота. Скп Сапсег Ве8. 11, 8600-8605.

Адо8Й В.М., Йеи1ко1б М., СиШск ^.6., Уа8агц|1 М.С., ^1е811ег Ο.Ό. (1992). Ехрге88юп оГ 1ке ер1бегта1 дго\к Гас1ог гесер1ог т а81госу11с 1итоиг8 18 8рес1йса11у а88ос1а1еб \\'кк дкоЬ1а81ота тиШГогте. У|гско\8 Агск А Ра!ко1. Апа!. Н181ора1ко1. 420, 321-325.

АРбоиб! Р.8., Ькапбаг ΖΑ., 1тгап А.К. (2007). 8шуМп ехрге88юп согге1а1е8 \\'кк ип^оигаЫе ргодпо8е8 т т\^;а81\^;е бис1а1 сагстота оГ 1ке Ьгеа81. Меб. б. Ма1ау81а 62, 6-8.

А1-№ба\1 К., Меекап В., М1са11еГ б., Йко1ак V., Мау Й., Сика А., Вак б. (2008). Ш1егсе11и1аг 1гап8Гег оГ 1ке опсодешс гесерЮг ЕСΡВνIII Ьу ппсго\^;е81с1е8 бегШеб Ггот Штоиг се118. №1. Се11 Вю1.

АИШап 6.Ό., Мо88 Р.А., Сои1бег Р.6., Вагоиск Б.Н., Неухег-^11кат8 М.С., Ве11 б.Й, МсМ1скае1 А.6., 1)а\Д8 М.М. (1996). Ркепо1ур1с апа1у818 оГ апкдеп-8рес1кс Т 1утркосу1е8. 8с1епсе 274, 94-96.

Аток Υ., Υапд М., Й1 й., Веупо8о б., Воиуе! М., Моо88а А.В., Ка18иока К., НоГГтап В.М. (2005). Ше8йп-1ткеб дгееп Йиоге8сеп1 рго!е1п 1гап8деп1с пибе тои8е Гог 1тадтд китап Штог апдюдепе818. Сапсег Ве8. 65, 5352-5357.

Апд11ег1 Е.Е., Адиеппоих М., Сопй А., Йа Т.Б., Сагбак 8., Сгир1 В., Тота8е11о С., Сегтапо А., Ука С., Тота8е11о Е. (2008). Шис1еаг Гас1ог-карраВ аскуаиоп апб скГГегепка! ехрге88юп оГ 8шуМп апб Вс1-2 т китап дгабе 2-4 а81госу1ота8. Сапсег.

Аррау V., 8ре18ег Б.Е., ВиГег Ν., Веупагб 8., ВагЬеу С., СегоШт 6.С., ^еуν^аζ 8., РтШа С., Вотего Р. (2006). Бесгеа8еб 8рес1йс СБ8+ Т се11 сго88-геас1М1у оГ апйдеп гесодпШоп ГоНошпд νасс^паΐ^оп \1Гк Ме1ап-А реркбе. Еиг. б. ^типок 36, 1805-1814.

Агпо1б 8.Е., Тго|апо\\'8к1 б.р. (1996). Нитап Ге1а1 к1рросатра1 беνе1ортепΐ: II. Тке пеигопа1 су1о8ке1е1оп. б. Сотр. №иго1. 367, 293-307.

АВО^ОШ 8.М., ЛВΟN8ΟN В.Е. (1965). СЕШТВАЙ NЕВVΟυ8 8Υ8ТЕМ ΡΝ ^IЛВЕТЕ8 МЕЙЙЙ Ти8: ЙО^ЕВЕБ ЕВРОиРКСУ ОЕ СЕВТАШ INТВЛСВЛNIА^ КЕОРЙА8М8. Агск. Шитой 12, 390-398.

А8кеиег М., В1еске I., йаигепбеаи I., Мо8ег А., Натцие В., Ук1аис1 М., АиЬоигд Р. (2005). Бесгеа8еб ехрге88юп оГ АВСО4 апб ВС1 депе8 еаг1у т 1ке ра1кодепе818 оГ Х-кпкеб абгепо1еикобу81горку. Нит. Мо1. Сепе1. 14, 1293-1303.

А8к1ипб Т., Арре18код ЙВ., АттегроЫ О., Ек81гот Т.6., Л1т^ν^8ΐ Р.М. (2004). Н181опе беасе1у1а8е тШЬког 4-ркепу1Ьи1уга1е тоби1а1е8 дйа1 йЬгШагу ас1б1с рго!ет апб соппехт 43 ехрге88юп, апб епкапсе8 дардтскоп соттитсайоп, т китап д1юЬ1а81ота се118. Еиг. б. Сапсег 40, 1073-1081.

Вагкег Е.С., 81ттоп8 М.Й., Скапд 8.М., Ргабо8 М.Б., Йаг8оп НА., 8пееб Р.К., ^ага ^.М., Вегдег М.8., Скеп Р., ^1^1 М.А., А1баре К.Б. (2001). ЕСЕВ оνе^еxр^е88^оп апб гаскакоп ге8роп8е т д11оЬ1а81ота тиШГогте. ШГ б. Ваб1а1. Опсо1. Вю1. Рку8. 51, 410-418.

- 42 032437

ВейеШ Е., ВедоР М., Еопх1 Ь., ОссР1ш В., Мапписа 8., Егш1ш Ь., Той Р. (2007). ЫекРп ехргеккюп т аРи1! апр Реуе1оршд Ритап к1рпеу. 1. Н1к!осРет. Су!осРет. 55, 411-421.

В1ит В., •ГасоЬ-НйксР 1., ВесРау1 С., К1оод Υ. (2006). 8ирргеккюп оГ кигуМп ехргеккюп ш дРоЫак!ота се11к Ьу !Ре Вак 1пЫЬйог ГатекуРРюкаРсуРс аар ргото!ек сакраке-ререпреп! арор!ок1к. Мо1. Сапсег ТРег. 5, 2337-2347.

ВоигРоп М.А., \У1кк(гапН СР., РийРтауг Н., МайРе^к ТР., В1дпег Ό.Ό. (1983). Нитап дРотатекепсРута1 ех!гасе11и1аг та!пх апрдеп РейпеР Ьу топос1опа1 апРЬоРу. Сапсег Век. 43, 2796-2805.

Во\уеп А.В., Напкк Ά.Ν., МигрРу КР., Р1оге11 8.В., Сгокктап Ό. (2004). РгоРГега!юп, арор!ок1к, апр кигугут ехргеккюп ш кегайпосуйс пеор1актк апр Рурегр1ак1ак. Ат 1. Оегта!ора!Ро1. 26, 177-181.

Воу!оп ВР., ЬоРтапп Т., Ьопре1 М., Ка1ЬасРег Н., На1Рег Т., Рга!ег АР., Ьоиек О.С., ЬекРе Ό.6., Р1ауе11 В.А., А1!тапп Э.М. (1998). С1и1атк ас1р РесагЬоху1аке Т 1утрРосу!е гекропкек аккос1а!ер νίΐΗ киксеррЬРРу ог гек1к!апсе !о !уре I р1аЬе1ек: апа1ук1к ш Р1кеаке Р1ксогРап! Ритап Ыпк, поп-оЬеке РхаЬеРс тке апр НьА-Эф йапкдешс тке. 1п!. 1ттипо1. 10, 1765-1776.

Вгекке С., ЬипРегуо1Р А., Епдег Р.О., Вгеккеп С., 8!а1кей Е., РеРегкеп Т.В., Нага1Рке1Р О., Кгидег Р.С., В_)егку1д В., СРекепуа М. (2006). ΝΟ2 ехргеккюп геди1а!ек уакси1аг тогрРо1оду апр Гипс!юп ш Ритап Ьгат !итоигк. №иго1таде. 29, 965-976.

Вгеппег А.У., Ьте! М.8., Рте Н.А., 8Рарйо А.В., 8е1кег В.С., В1аск Р.М., 1пкк1р Р.Ь. (2002). Н1к!огу оГ а11егд1ек апр аи!о1ттипе Р1кеакек апр пкк оГ Ьгат !итогк ш аРи1!к. 1п!. 1. Сапсег 99, 252-259.

Вготте1апр Т., Вокепдгеп Ь., РпР1ипР 8., Нептд В., 1каккеп V. (2007). 8егит 1еуе1к оГ дРа1 йЬгШагу ас1Р1с рго!ет согге1а!е !о !итоиг νο1ите оГ Р1дР-дгаРе дРотак. Ас!аЫеиго1. 8сапр. 776, 380-384.

Вгопдег Н., Кошд 1., Корр1оте К., 8!ешег Н.Н., АРтаР1 В., Него1Р-МепРе С., Керр1ег Ό., №ек А.Т. (2005). АВСС Ргид е£Йих ритрк апр огдашс апюп ир!аке !гапкройегк ш Ритап дРотак апр !Ре Ь1оор-!итог Ьатег. Сапсег Век. 65, 11419-11428.

ВгусРШуа 8., Р1игаккоуа М., Н1оЬ11коуа А., ВгусР!а Т., Н1гпак 1. (2007). №к!т ехргеккюп ш си!апеоик те1апотак апр те1апосу!к пеуг 1. Си!ап. Ра!Ро1. 34, 370-375.

ВисРпег А., Сак!го М., Нептд А., Рорр Т., Акктапп С., НоГк!ейег А., 8!1еГ С., 21ттегтапп ^. (2007). [Тгапкспр!оте апа1укек ш гепа1 се11 сагсшота. СотЫпаРоп оГ 1акег ткгоР1ккес!юп апр ткгоаггаук]. Иго1оде А 46, 1170-1175.

Са1уо А., Са!епа В., ЫоЫе М.8., СагЬо!! Ό., СР-Вахо I., Сопха1ех-Могепо О., НиР И., 8Рагр В., фш Т.Н., Апуег М.В., МегРпо С., Экккоп В.В., 1оРпкоп М.Э., Сгееп ГЕ. (2008). [Реп(1Пса(1оп оГ VЕСРгеди1а!ер депек аккоаа!ер \уНР шсгеакер 1ипд те!ак!аРс ро!еп!1а1: ГипсРопа1 туокетеп! оГ !епакст-С ш !итог дгоМР апр 1ипд те!ак!ак1к. Опсодепе.

СатроР М.В., СРапд С.С., КадекРРа Т., Аапд X., МсСайРу ГВ., Реггопе 8. (2004). Нитап Р1дР то1еси1аг тее1дР!-те1апота-аккос1а!еР апрдеп (НМ^-МАА): а те1апота се11 кигГасе сРопРгоШп ки1Га!е рго!еод1усап (М8СР) \уНР Ыо1одка1 апр сРшса1 Ддшйсапсе. Сп! Веу. Iттиηο1. 24, 267-296.

Сагпето11а В., Сак!е11аш Р., Ропакк1 М., ВогД Ь., ИгЫш 8., №со1о С., ЭогсагаНо А., νίηΕ С., ХУпИег С., кеп Ό., 2агР1 Ь. (1999). [Реп(1Пса(1оп оГ а дРоЫак!ота-аккос1а!еР !епакст-С ЕоГогт Ьу а Р1дР аГйпРу гесотЫпап! апРЬоРу. Ат 1. Ра!Ро1. 154, 1345-1352.

Сатеге С., 8ее1еу Е.8., Сое1хе Т., Ьопдпескег Ό.8., Коте М. (2007). ТРе ЫекРп ргодепРог Рпеаде 1к !Ре сотрайтеп! оГ опдт Гог рапсгеаРс тйаерйРеРа1 пеор1ак1а. Ргос. №111. Асар. 8сг и. 8. А 104, 4437-4442.

Сакай С., ОакгЬа Р., ВгуоШш Ь., СаРшо С., Эско Р., В1ш Р.., Ве1Р Р, Меххапхапка Ό., Сок!а А., Апргео1а 8., Ьео Е., Рагт1аш С., Сак!е1Р С. (2003). ТРе арор!ок1к 1пР1Ьйог рго!еш кигуМп шрисек !итогкресгйс СЭ8+ апр СЭ4+ Т се11к ш со1огес!а1 сапсег ра!кп!к. Сапсег Век. 63, 4507-4515.

Сак!е1Рпо Р., Ниапд ΑΥ., !ап-Воппе! С., 8!о11 8., 8сРетескег С., Сегтат Κ..Ν. (2006). СРетоктек епРапсе 1ттипРу Ьу дшртд паке СЭ8+ Т се11к !о кРек оГ СЭ4+ Т се11-репрпрс се11 т!егас!юп. №Ииге 440, 890-895.

СРакгауагР А., №11 Е., В1аск Р.М., Ртке1к!ет О.Р., Ршке1к!еш О.М., Эукоп ΝΡ., ЬоеГйег 1.8. (2002). ОиапШа1йе1у ре!егттер кигукт ехргеккюп 1ете1к аге оГ ргодпокРс та1ие ш Ритап дРотак. 1. СРп Опсо1.. 20, 1063-1068.

СРееуег М.А., СРеп ^., Эык М.Ь., ТакаРакР1 М., Реасе ΌΡ. (1993). Т-се11 1ттипйу !о опсодешс рго!етк тс1иршд ти!а!ер гак апр сР1тейс Ьсг-аЫ. Апп Ν. Υ. Асар. 8сг 690, 101-112.

СРекепуа М., Епдег Р.О., ТРогкеп Р., Тукпек В.В., А1-8агга_) 8., Веар Т.А., Ригтапек Т., МаРекрагап В., Ьеуте 1.М., Вий А.М., РРктд!оп СР., В_)егку1д В. (2002а). ТРе дРа1 ргесигког рго!еод1усап, ЫС2, 1к ехргеккер оп !итоиг пеоуакси1а!иге Ьу уакси1аг репсу!ек ш Ритап таРдпап! Ьгат !итоигк. Ыеигора1Ро1. Арр1. Nеи^οЪ^ο1. 28, 367-380.

СРекепуа М., Н)е1к!иеп М., Епдег Р.О., ТРогкеп Р., 1асоЬ А.Ь., РгоЬк! В., Нага1Рке!Р О., Р11ктд1оп С., Ви!! А., Ьеуте 1.М., В_)егку1д В. (2002Ь). Ν62 рго!еод1усап ргото!ек апдюдепекк-ререпреп! !итог дгоМР ш СЫ8 Ьу кес.|иек1еппд апдюк!аРп. РА8ЕВ 1. 16, 586-588.

СРекепуа М., [ттегуоН Н. (2007). ЫС2/НМР рго!еод1усап ак а сапсег 1Регареи!к 1агде!. Ме!РоРк Мо1. Вю1. 361, 93-117.

СРекепуа М., Кгакккр С., 8уепркеп А., Ые!1апр ГА., 8!аа1екеп V., Тукпек В.В., 8е1Ре1т Р., Аапд 1., 8акапаккеп Р.О., 8апра1 Т., Ьоппгпд Р..Е., Р1а1тагк Т., Епдег Р.О., В_)егку1д В., 8киР М., 8!а11сир А.В.

- 43 032437 (2008). ТНе ргодеш!ог се11 тагкег ИС2/МРС ргото!ек сНетогек1к!апсе Ьу асЛ'аРоп ок т!едгт-берепбеп!

РКК/Ак! к1дпа1тд. Опсодепе.

СНекепуа М., РйктдЛп С.1. (2002). N02 ргесигког се11к ш пеор1аяа: ЛпсРопак Ык!одепек1к апб Легареийс трНсаНопк ког такдпап! Ьгат !итоигк. 1. Иеигосу!о1. 31, 507-521.

СНекепуа М., Воорга1 Н.К., Эау1ек Ό., Ьеуте 1.М., Ви!! А.М., Р11ктд!оп С.к (1999). ТНе ИС2 сНопбгоЛп ки1ка!е рго!еод1усап: го1е ш таНдпап! ргодгеккюп ок Нитап Ьгат !итоигк. Л!. к Эеу. №игокск 17, 421-435.

С11к|ие1-Е11пктапп В., Тискег В.Р. (2004). Соппесйуе Нккиек: к1дпа11тд Ьу !епакстк. Л!. к ВюсНет. Се11 Вю1. 36, 1085-1089.

СНи С., Ь1 Ι.Υ., Воабо В.к, Рагбпбде У.М. (2008). В1ооб-Ьгат Ьатег депотюк апб с1ошпд ок а поуе1 огдашс атоп !гапкройег. к СегеЬ. В1ооб Е1ом Ме!аЬ. 28, 291-301.

СоНп С., Ваеха Ν., ВайоН С., Еша Е., Еибек Ν., №пт I., Майт Р.М., ОиаПк Ь., Е1даге11а-Вгапдег Ό. (2006). !беп1|Пса11оп ок депек бйкегепйаНу ехргеккеб ш д1юЬ1ак!ота уегкик рйосуйс акйосуЮта иктд 8ирргеккюп 8иЫгасЙуе НуЬпб1хаРоп. Опсодепе 25, 2818-2826.

Со1отЬеЛ 8., Вакко V., Мие11ег О.Б., Мопбшо А. (2006). Рго1опдеб ТСВ/СЭ28 епдадетеп! бпуек [Б2-тберепбеп! Т се11 с1опа1 ехрапкюп ЛгоидН ядпаНпд теб1а!еб Ьу Ле таттаБап 1агде! ок гаратуст. I. ]ттипо1. 176, 2730-2738.

Сопасс1-8огге11 М., Кар1ап А., ВауеН 8., Сауей Ν., 8акшт Т., Веп^е'еу А. (2005). ТНе кНеб ес!оботат ок Νγ-САМ кйти1а!ек се11 ргоНкегайоп апб тоШйу, апб сопкегк се11 1гапккогта!юп. Сапсег Век. 65, 11605-11612.

Сопасс1-8огге11 М.Е., Веп-Уеб|б1а Т., 8Н!и!тап М., Еетк!ет Е., Ета! Р., Веп^е'еу А. (2002). Νγ-САМ 1к а !агде! депе ок !Не Ье!а-са!ешп/БЕЕ-1 ра!Нмау ш те1апота апб со1оп сапсег апб йк ехргеккюп епНапсек тоШйу апб сопкегк Лтопдепемк. Сепек Эеу. 16, 2058-2072.

Соккип и., Уатас Ό., Си1ЬаНаг О., 8апсак В., КагатапК, Охкап 8. (2007). Боса11у абуапсеб Ьгеак! сагстота 1геа!еб мйН пеоаб)иуап1 сНето!Негару: аге Ле сНапдек ш кегит 1еуе1к ок УКБ-40, ММР-2 апб ММР-9 согге1а!еб мйН !итог гекропке? №ор1акта 54, 348-352.

Сгеккме11 Р. (1994). АккетЬ1у, !гапкрой, апб кипсНоп ок МНС с1акк II то1еси1ек. Аппи. Веу. Iттипο1. 12, 259-293.

ЭаЫкйапб к, СоШпк ν.₽., БепбаН1 и. (1992). Ехргеккюп ок Ле с1акк VI ш!егтеб1а!е Шатеп! пекйп ш Нитап сепйа1 пегуоик кук!ет !итогк. Сапсег Век. 52, 5334-534.1.

Эепд|е1 1., №1к1ке М.Э., Сои!!екапдеак С., Сйкюибк С., 8сНоог О., А1!епЬегепб Е., Ми11ег М., Кгатег В., М1ккюи А., 8аи!ег М., Неппеп1о!!ег I., \Уегпе1 Ό., 81епх1 А., Ваттепкее Н.С., К1тде1 К., 8!еуапоую 8. (2006). Ипехрес!еб АЬипбапсе ок НБА С1акк II Ргекеп!еб Рерйбек Л Рптагу Вепа1 Се11 Сагстотак. СНп Сапсег Век. 12, 4163-4170.

Э|хоп Ό.Ν., Ооп Ό.Ι., Оаддег 8., Са11ом М.1., ТарНп В.Н., Кеек и.В., Сгеепе У.К. (2007). ТБХ1/НОХ11 !гапкспр!юп кас!ог шНЬйк бйкегепйайоп апб ргото!ек а поп-Наеторо1еНс рНепойре Л типие Ьопе таггом се11к. Вг. I. Наета!о1. 138, 54-67.

ЭотоЮ Т., М1уата Υ., 8ихик| Н., Тега!ат Т., Агт К., 8ид1уата Т., Такауата Т., Мид1уа 8., Охопо 8., №ха\га В. (2007). Еуа1иа!юп ок 8100А10, аппехт II апб В-ЕАВР ехргеккюп ак тагкегк ког гепа1 се11 сагтпота. Сапсег 8сг 98, 77-82.

Оиб1еу М.Е., ХУипбеЛсН кВ., ВоЬЬЛк Р.Е., Υапд 1.С., Нми Р., 8сН\уаг1хеп1гиЬег Ό.Ι, ТораНап 8.Б., 8Неггу В., ВекШо Ν.₽., НиЬюк1 А.М., ВоЬткоп М.В., Вакке1б М., Эигау Р., 8е1рр С.А., Водегк-Егеехег Б., Мойоп К.Е., Маугоикакй 8.А., УНйе Э.Е., ВокепЬегд 8.А. (2002). Сапсег гедгеккюп апб аи!о1ттипйу Л ра!1еп!к айег с1опа1 герорЛайоп МЛ апЛитог 1утрНосу!ек. 8ыепсе 298, 850-854.

Оиб1еу М.Е., ХУипбеЛсН кВ., Υаид 1.С., 8Неггу В.М., ТораНап 8.Б., ВекШо Ν.₽., Воуа1 В.Е., Катти1а и., \УНйе О.Е., Маугоикакй 8.А., Водегк Б.к, Сгата С.к, 1опек 8.А., Мапд1ате11 О.Р., Ре11ейег М.М., СеаВапас1осНе 1., ВоЬткоп М.В., Вегтап О.М., ЕЛе А.С., АЬаН А., ВокепЬегд 8.А. (2005). Аборйуе се11 1гапккег Легару коИоМпд поп-туе1оаЬ1аЛ'е Ьи! 1утрНобер1еНпд сНетоЛегару ког Ле 1геа!теп! ок райеп!к МЛ гекгасЛгу те!ак!айс те1апота. I. СНп. Опсо1. 23, 2346-2357.

ЕррепЬегдег и., Мие11ег Н. (1994). СгоМН кас!ог гесер!огк апб Лей Ндапбк. I. №игоопсо1. 22, 249-254.

Ейий С., 8ип Ζ., Наепб1е I., 8сНи1ег-ТНитег В., Нейтап С., ТНге1етапк К., уап бег ВР, 8сНи1ег С., 8сНп11х Е.8. (2007). Титог-геасНуе СЭ4+ Т се11 гекропкек !о Ле те1апота-аккота!еб сНопбгойт ки1рНа!е рго!еод1усап т те1апота раНеп!к апб Неа1!Ну тб1У1биа1к т !Не аЬкепсе ок аЛЛттипйу. I. Iттииο1. 775, 7703-7709.

Е1огепек УА., Но1т В., Мук1еЬок! О., БепбаН1 и., Еобк!аб О. (1994). Ехргеккюп ок Ле пеигоес!обегта1 т!егтеб1а!е Шатеп! пекйп т Нитап те1апотак. Сапсег Век. 54, 354-356.

Еопд Б., Нои Υ., В1уак А., Вешке С., Υиеи А., ЛкНег С.А., Этак М.М., Епд1етап Е.С. (2001). А1!егеб рерНбе Ндапб уасстайоп мйН Е1!3 Ндапб ехрапбеб бепбгЛс се11к ког !итог 1ттипоЛегару. Ргос. Ν!1. Асаб. 8ск и.8. А 988809-8814.

СаШ В., Втба Е., ОгкапеШ и., С1ре11еЛ В., СйЛ А., Эе ν.8., Еюссо В., Богат С., Этюсо Е., Vексον^ А. (2004). апб сНагас1епхаРоп ок Лтопдешс, к!ет-11ке пеига1 ргесигкогк кгот Нитап дНоЬ1ак!ота.

Сапсег Век. 64, 7011-7021.

- 44 032437

Са1оп 1., Сок!ек А., 8апсЬех-СаЬо Е., КлгПогкку А., М1есшк В., Еадогсе-Гадек С., ТокоНш М., Сатик

М., Вегдег А., Атб Ρ., 21^тбоЬоие Е., Вгипега1 Ρ., Сидпепс ΡΉ., Тга)апокк| Ζ., Епбтап А.Н., Ρадеκ Е.

(2006). Туре, бепкИу, апб 1осаЬоп оГ 1ттипе се11к текЫп Ьитап со1огес!а1 1итогк ргебк! с1шка1 ои!соте.

8с1епсе 313, 1960-1964.

Сагсюп Е., НаШадк А., Ешккпег А., ЕГгепсЬ-Сопк!ап! С. (2004). Сепега!кп оГ ап епу1гоптеп!а1 шсЬе Гог пеига1 к!ет се11 беге1ортеп! Ьу !Ье ех!гасеПи1аг тайгх то1еси1е !епаксш С. Эеуе1ортеп! 131, 3423-3432.

Сагу 8.С., Ке11у С.М., НоскПе1б 8. (1998). ВЕНАВ/Ьтеукап: а Ьгаш-кресгГк 1есЬсап 1тр11са!еб т д11отак апб д11а1 се11 тоНЫу. Сигг. Οр ш. №игоЬю1. 5, 576-581.

Сагу 8.С., Ζе^^11ο С.А., СЫапд У.Ь., Сате 1.И., Сгау С., Носкйе1б 8. (2000). сЭкА с1ошпд, сЬготокота1 1оса11хаиоп, апб ехргекккп апа1ук1к оГ Ьитап ВЕНАВ/Ьгаукап, а Ьгаш кресШс рго!еод1усап геди1а!еб биппд согИса1 беге1ортеп! апб ш дЕота. Сепе 256, 139-147.

СаШпош Ь., Ροтее11 Ό.Ι., 1г., КокепЬегд 8.А., Кек!1Го Ν.Ρ. (2006). Абор!гуе 1ттипо!Ьегару Гог сапсег: Ьш1бтд оп киссекк. №и. Кеу. Iттипο1. 6, 383-393.

СЬокЬ ЕС., ЭоЫ Т., Капд В.Н., АШеп Ό.6 (2008). Нкр60 геди1аИоп оГ !итог се11 арор!ок1к. 1. В1о1.СЬет. 283, 5188-5194.

С1рр 1., Си С., Сгу1еп С., Какрег 8., ВикЬтап А. (2007). НебдеЬод ра!Ьтеау асЬуНу ш !Ье ЬАОУ ргок!а!е !итог тобе1. Мо1. Сапсег 6, 19.

С1е1Ьегтап А.8., МкЬиппа Т., Епсшак ЕМ., Ко1д ЕЬ., Кгакпоу Ρ., Ва1огб1 Е., Е1кЬе11 С., КокепГе1б М.С., Ешко1орог С. (2008). СепеЬс арргоасЬек 1беп!11у аби1! рИиНагу к!ет се11к. Ьгос №И1. Асаб. 8сЕ и.8.105, 6332-6337.

Сп)а!1с 8., А!апаскоук Ό., 1адег Е., Ма!кио М., 8е1уакитаг А., А1!огк1 Ν.Κ, Мак1 КС., Эироп! В., Κϋкг С., СЬеп У.Т., Кпи!Ь А., Ο16 Ь.Е (2003). 8игуеу оГ па!ига11у осситпд СЭ4+ Т се11 гекропкек адатк! ΝΥЕ8Ο-1 т сапсег раИеп!к: согге1а!кп те1!Ь апЬЬобу гекропкек. Ьгос №11. Асаб. 8сг И.8.А 100, 8862-8867.

СобЬои! Κ., В1кдгоуе О.А., 8Ько1пу Ό., Эау Κ.8., III (1998). Согге1а!кп оГ В-ЕΛВΡ апб СЕАБ ехргекккп ш таЪдпап! д1кта. Οпсοдепе 16, 1955-1962.

Согка В., 8киЫк^едаб1о 1., М1ки1а М., Вагбабш К., Ρа1^сζка Е., Схагпоска В. (2007). №САМ, а пеигопа1 кук!ет се11-абЬеккп то1еси1е, 1к шбисеб т рарШагу !Ьуго1б сагстотак. Вг. 1. Сапсег 97, 531-538.

Со!о Υ., Ма!кихак| Υ., КипЬага 8., 81ιίιηίζι.ι А., ΟΙ^ϋη Т., Υататο!ο К., Мига!а Н., Така!а М., АЬига!ат Н., Нооп Ό.8., 8а1ба Т., Катеакат1 Υ. (2006). А пете те1апота апЬдеп ГаНу ас1б-Ьтбтд рго!ет 7, туо1уеб т ргоЬГегаЬоп апб шуаккп, 1к а ро!еп!1а1 !агде! Гог 1ттипо!Ьегару апб то1еси1аг !агде! Иегару. Сапсег Кек. 66, 4443-4449.

Сгипба ЕМ., №1Ьогк Ь.В., Еа1тег С.А., СЬЫепд О.С., 8!ед А., М1к1се1кеп Т., О1акк К.В., Ζΐκ-πΐβ К., А1ккоп Ό., ΟπζζΚ А.Е., Аапд А., СШекрк С.У., 1оЬпкоп М.К. (2006). Ысгеакеб ехргекккп оГ Ыут1бу1а!е купИекке (Т8), иЫдикт кресШс рго!еаке 10 (υ8Ρ10) апб кигуМп 1к аккос1а!еб теЬЬ роог кигу1уа1 ш дЬоЫак!ота тиШГогте (СВМ). 1. №игоопсо1. 80, 261-274.

Си С., Υиап 1., АШк М., Какрег 8. (2007). Ьюки-Ие сапсег се11к теНЬ к!ет се11 сЬагаскпкИск гесопкЫи!е !11е опдта1 Ьитап !итог ш у|уо. Сапсег Кек. 67, 4807-4815.

СипИег Н.8., 8сЬт1б! Ν.Ο., ГЫШрк Н.8., Кеттшд Ό., КЬагЬапба 8., 8опапо К., Мобгикап Ζ., Ме1ккпег Н., Аек!рЬа1 М., Ьаткхик К. (2008). СНоЫакЮта-бепгеб к!ет се11-еппсЬеб си1!игек Гогт б1кЬпс! киЬдгоирк ассогбшд !о то1еси1аг апб рЬепоКрк сгкепа. Οпсοдепе 27, 2897-2909.

Наттег 1., Са11ахх1 Е., Вопо Е., Кагг К.А., Сиепо! 1., Уа1какшш Ρ., №ду ΖΑ., 81шдад11а Е. (1995). ЬерЦбе Ьшбтд кресШсйу оГ НЬА-ЭК4 то1еси1ек: согге1а!кп те1!Ь гЬеита!о1б аПкпЬк аккотаНоп. 1. Ехр. Меб 181, 1847-1855.

Напаба К., Υетебе11 .1А., Υπί'ΐβ ЕС. (2004). Iттипе гесодпЫоп оГ а Ьитап гепа1 сапсег апЬдеп !ЬгоидЬ рок!-!гапк1а!кпа1 рго!ет крЬстд. №Ииге 427, 252-256.

Наи Ρ., Кипх-8сЬидЬаП Ь.А., Китте1е Ρ., Агк1ап Е., ОогГеВ А., КосЬ Н., ЬоЬтекг А., НкксЬтапп В., Ми11ег А., ВодбаЬп и., ВоккегЬоГГ А.К. (2006). Тепакст-С рго!еш 1к тбисеб Ьу !гапкГогттд дготеИ Гас!огЬе!а1 Ьи! боек по! согге1а!е теЬЬ Ьте !о !итог ргодгекккп ш ЫдЬ-дгабе дЕотак. 1. №игоопсо1. 77, 1-7.

Не1тЬегдег А.В., НиккаЫ 8.Е., А1баре К., 8атеауа К., АгсЬег С.А., Епебтап Н., Кеагбоп Ό., Епебтап А., В1дпег Ό.Ό., 8атркоп 1.Н. Титог-кресШс рерЬбе гасстаЬоп т пете1у-б1адпокеб раЬеп!к теНЬ СВМ. 1оигпа1 оГ С1шка1 Οпсο1οду, 2006 А8ТО Аппиа1 Мее!шд Ьгосееб1пдк Гаг! I Уо1 24, №. 188 кипе 20 8ирр1етеп!), 2006: 2529. 6-20-2006.

Него1б-Мепбе С., Мие11ег М.М., Вопкап!о М.М., 8сЬт1!! НК, Кипхе 8., 8!етег Н.Н. (2002). С11шса1 1трас! апб Гипс!кпа1 акрес!к оГ !епаксш-С ехргекккп биппд дЬота ргодгекккп. кН. 1. Сапсег 98, 362-369.

Неггега М.В., Вгипо 8., ВиШдЬеп 8., Те!!а С., Са!Ъ 8., Оегедкик М.С, Викко1аЬ В., Сатикк1 С. (2006). Iκο1а!^οп апб сЬагасЮпхаиоп оГ а к!ет се11 рорикИкп Ггот аби1! Ьитап Ьуег. 8!ет Се11к 24, 2840-2850.

НоГГтапп КЕ., 8Ьешт Υ., ЬоЬке С.М., Еагкег А.8., ЬекоукЬ В.С., Капд Ζ., Ктеоп Е.О. (2008). Ех!егпа1 уаЕбаЬоп оГ IМΡ3 ехргекккп ак ап тберепбеп! ргодпокЬс тагкег Гог те!ак!аЬс ргодгекккп апб беа!Ь Гог ра!кп!к теНЬ скаг се11 гепа1 се11 сагсшота. Сапсег 112, 1471-1479.

Ногт1до А., Си В., Капт1 8., Ккбе1 Е., Ρаπадеаκ К.8, Ебдаг М.А., Таптеаг М.К., Као Е8., ЕккЬег М., ОеАпдеЬк Ь.М., Но11апб Е.С (2006). ΥΧΕ-40 апб аиПпх те!а11орго!етаке-9 ак ро!епЬа1 кегит Ыотагкегк Гог ра!1еп!к теНЬ ЫдЬ-дгабе дЬотак. С1т Сапсег Кек. 12, 5698-5704.

- 45 032437

Ниапд 1., Ни 1., В1ап X., СИеп К., Оопд Ж., Эип1ор КМ., Ноуагб О.М., Жапд 1.М. (2007). ТгапкасОгаИоп о! !Ие ер1бегта1 дгоу!й !ас!ог гесер!ог Ьу !огту1рер!1бе гесер!ог ехасегЬа!ек !Ие таЛдпап! ЬеПауюг о! Питал дЛоЬ1ак!ота се11к. Сапсег Кек. 67, 5906-5913.

Ниапд Υ., Рап 1., Υπγ 1., ΖΙπ.ι ОХ. (2008). СЛагааепхаОоп о! ОРК56 рго!ет апб йк кирргеккеб ехргеккюп т Иитап рапсгеаПс сапсег се11к. Мо1. Се11 ВюсПет. 308, 133-139.

НипсИагек М., Клре1шск В. (2000). Ер1бегта1 дгоу!й !ас!ог гесер!ог депе атркПсаОоп ак а ргодпокЛс тагкег ίπ д1юЬ1ак!ота тлЙйогте: геки1!к о! а те!а-апа1ук1к. Опсо1. Кек. 12, 107-112.

Нуапд М.Л., Ьлкепк 1.К., Ви11оск ΈΝ. (2007). Содпа!е тетогу СЭ4+ Т се11к депега!еб уйй бепбпОс се11 рпттд шЛлепсе 1йе ехрапкюп. 1гаЕЛсктд, апб бйЕегепЛаПоп о! кесопбагу СЭ8+ Т се11к апб епИапсе !итог соп!го1. 1. Iттипο1. 179, 5829-5838.

кисЫ Т., 8ака!а К., ΥοкИ^ζак^ К., Тадо К., М|хппо Ν., Пок Н. (2008). Огрйап О рго!еш-соир1еб гесер!ог ОРК56 геди1а!ек пеига1 ргодепйог се11 т1дгаПоп У1а а Оа1рИа 12/13 апб КИо ра!Иуау. 1. Вю1. СИет.

ТУа Воог Р.К., бе ОК, Ме.)акк1-Вокп)ак V., Вгеппег С., уап бег Кпаар М.8., 8сИерег О.С., Ргопк ЕС. (2006). Меда1епсерПа1ю 1елкоепсерйа1ора1йу уйй клЬсогйса1 сук!к: ап ирба!е апб ех!епбеб ти!аПоп апа1уяк о! МЬС1. Нит. Ми!а!. 27, 505-512.

ШиисЫ 8, Ткпхпк! К., ΥοкИ^ба Υ., Υатаба Ν., Надппига Ν., Окабо Н., М1уа А., Кшгйага Н., №1кахаЮ Υ., Татига М., 8акак1 Т., Оха\уа 8. (2002). В1оскаде о! Са(2+)-регтеаЬ1е АМРА гесер!огк кирргеккек иидгаПоп апб тблсек арор!ояк ш Иитап д1юЬ1ак!ота се11к. Ка!. Меб. 5, 971-978.

кЫзак! М., ЛИуай Т., АбасИ А., Татига Ν., ОИах1хабеИ М., Кйатлга Н., 8ид1как1 Υ., Υатапака Ν., Кайо Ζ., Рикиба Υ. (2006). Ехргеккюп о! пекПп ш га! апб Иитап д1отеги1аг робосу!ек. 1. 8лЬт1сгокс. Су!о1. Ра!Ио1. 38, 193-200.

1апккеп Е.М., Ьеттепк Е.Е., Жо1!е Т., СИпк!еп и., уоп Негга!И МО, 8сИоепЬегдег 8.Р. (2003). СЭ4+ Т се11к аге гес.|тгеб !ог кесопбагу ехрапкюп апб тетогу т СЭ8+ Т 1утрИосу!ек. Ка!иге 421, 852-856.

1ауогкк1 Ц.М., Ке11у О.М., Р1ерте1ег ЕМ., НоскПе1б 8. (1996). ВЕНАВ (Ьгат еппсИеб Иуа1игопап Ьтбтд) 1к ехргеккеб т клгд1са1 катр1ек о! дИота апб ш т!гасгата1 дга!!к о! туаяуе дЛота се11 1тек. Сапсег Кек. 56, 2293-2298.

Лапд Ζ., СИи Р.О., Жоба В.А., Коск К.Ь., Ыи О., Нк1еИ С.С., Ы С., СИеп Ж., Эпап Н.О., МсЭопда1 8., Жи С.Ь. (2006). Апа1ук1к о! ККА-Ьтбтд рго!ет IΜΡ3 !о ргебю! те!ак!ак1к апб ргодпояк о! гепа1-се11 сагапота: а ге!гокресПуе к!ибу. Ьапсе! Опсо1. 7, 556-564.

Лапд Ζ., ЬоИке С.М., СИи Р.О., Жи С.Ь., Жоба В.А., Коск К.Ь., К\уоп Е.Ц. (2008). Опсо!е!а1 рго!ет IΜΡ3: а поуе1 то1еси1аг тагкег !Иа! ргеб1с!к те!ак!ак1к о! рарШагу апб сИготорИоЬе гепа1 се11 сагстотак. Сапсег 112, 2676-2682.

1оИапкеп 1.8., 1епкеп ВЖ., КокЛпб А., №е1кеп Ό., Рпсе Р.А. (2006). 8егит ΥΧΕ-40, а пе\у ргодпокИс Ыотагкег ш сапсег раПеп!к? Сапсег Ер1бетю1. Вютагкегк Ргеу. 15, 194-202.

1оИапкеп 1.8., 1епкеп В.\^;'., КокЛпб А., Рисе Р.А. (2007). Л ΥΧΕ-40 а пеу !ИегарелИс !агде! ш сапсег? ЕхреЛ. Орт. ТИег. Тагде!к. 11, 219-234.

1лпд С.8., РоегсИ С., 8сИапхег А., Неск А., Р1а!е К.Н., 8ейей V., 81етте1х Н., КааЬе А., 8йхег М. (2007). 8егит ОРАР 1к а б1адпокйс тагкег !ог дЛоЬ1ак!ота тлЙКогте. Вгат 130, 3336-3341.

1лпд О., ЬебЬейег ЕА., Ми11ег-ЕЬегИагб Н.Е (1987). ^би^оп о! су!о!ох1сйу т гекйпд Иитап Т 1утрИосу!ек Ьоипб !о !итог се11к Ьу ап!1Ьобу Ие!егосоп)лда!ек. Ргос Ка!1 Асаб 8а И8А 84, 4611-4615.

1лпкег Ν., 1оИапкеп 1.8., Напкеп Ь.Т., Ьлпб Е.Л., Кпкрапкеп Р.Е (2005). Кедл1аЛоп о! ΥΧΕ-40 ехргеккюп блгтд депо!охю ог т1сгоепуйоптеп!а1 к!гекк ш Иитап д1юЬ1ак!ота се11к. Сапсег 8а. 96, 183-190.

Кафуага Υ., Υатакак^ Р., Ната 8., ΥаИа^а К., ΥοкИ^οка Н., 8лд1уата К., Агйа К., КлпклК. (2003). Ехргеккюп о! кшу1уш ш ак1госу!ю !итогк: согге1а!юп уйЛ таЛдпап! дгабе апб ргодпояк. Сапсег 97, 10771083.

Ка1окИ1 О., МокИ!ап К., СагрепИег С., ТаЛЛЬей 8., Ье.)еипе 1., Мапе Υ., Це1айге Ι.Υ., ОобЬои! К., 8апкоп М. (2007). РАВР7 ехргеккюп т д1юЬ1ак!отак: ге1айоп !о ргодпояк, туакюп апб ЕОРК к!а!ик. 1. №лгоопсо1. 84, 245-248.

Ка!о Υ., Рл)йа Ν., Клш!а А., 8а!о 8., Капеко М., Окауа М., Тклгло Т. (2003). Мо1еси1аг 1бепЛ!1са!юп о! Аддгик/Т1 а1рИа ак а р1а!е1е! аддгедайоп-тблстд !ас!ог ехргеккеб ш со1огес!а1 !итогк. 1. Вю1. СИет. 278, 51599-51605.

Ка!о Υ., Капеко М.К., Клпйа А., Ло Н., Катеуата А., Одакауага 8., Ма!кллга Ν., Накедауа Υ., 8ихикМпоие К., Июне О., Охак| Υ., №1пта1ки Н. (2008). Мо1еси1аг апа1ук1к о! 1Ле ра1Лорйукю1одюа1 Ьтбтд о! !Ие р1а!е1е! аддгедайоп-тблстд !ас!ог робор1атп !о !Ие С-!уре 1есПп-Лке гесер!ог СЬЕС-2. Сапсег 8а. 99, 54-61.

Ка!о Υ., Капеко М.К., Кипо А., ИсШуата Ν., Атапо К., СИ^ЬаΥ., Накедауа Υ., НйаЬауакЫ 1., Каг1та!ки Н., М1кИ1та К., Окауа М. (2006). IлЫЬ^!^οп о! !итог се11-тбисеб р1а!е1е! аддгедаПоп лктд а поуе1 ап0-робор1ашп апПЬобу геасйпд уйЛ йк р1а!е1е!-аддгеда!юп-к!1тл1а!тд ботат. ВюсПет. ВюрПук. Кек. Соттип. 349, 1301-1307.

Ке Ν., 8ипбагат К., Ыи О, СИюшк 1., Рап Ж., Кодегк С., Ауаб Т., Оп!тап М., Υυ Ό., Жопд-8!аа1 Р., Ы О.Х. (2007). ОгрИап О рго!ет-солр1еб гесер!ог ОРК56 р1аук а го1е т се11 !гапк!огта!юп апб !лтопдепек1к туоМпд 1йе се11 абйекюп ра!йуау. Мо1. Сапсег ТИег. 6, 1840-1850.

- 46 032437

Кеппеду Р.С., 8йеагег М.Н., Аа!!к А.М., Впдй! Р.К. (2003). СЭ4+ Т 1утрйосу!ек р1ау а сп11са1 го1е ш апйЬоду ргодисйоп апд !итог 1ттшШу адатк! китам уйик 40 1агде !итог апйдеп. Сапсег Рек. 63, 10401045.

Кат С.Н., Вак К.Н., Кт Υ.8., Кт 1.М, Ко Υ., 0й 8.1., Кт К.М., Нопд Е.К. (2000). Ехргеккюп оГ !епакст-С т акйосуйс !итогк: йк ге1еуапсе !о рго11ГегаИоп апд апдюдепеак. 8игд №иго1. 54, 235-240.

йт 8.Н., Эак К., №гееп 8., СоГГтап Е., Натеед М. (2007). Ргодпокйс трйсайопк оГ штипоЫк!осйет1са11у де!ес!ед УКЕ-40 ехргеккюп т Ьгеак! сапсег. Аог1д 1. 8игд 0псо1. 5, 17.

К1ееЬегдег А., Вονа 6.8., №е1кеп М.Е., Нетто М., Сйиапд Ά.Υ., Ерк!ет II., Вегтап О.М. (2007). Ро1ек Гог !йе к!ет се11 аккоаа!ед т1егтед1а1е й1атеп! №кйп т ргок!а!е сапсег т1дгайоп апд те1ак1ак1к. Сапсег Рек. 67, 9199-9206.

К1ет Т., Ыпд Ζ., НетЬегд Н., Мадкеп 0.Ό., Не11ег Р.8., 8егар Р. (2003). №кйп 1к ехргеккед т уаксп1аг епдоШе11а1 се11к т !йе ади1! йитап рапсгеак. 1. Н|кЮсйет. Су!осйет. 51, 697-706.

К1ет А.М., Аи В.Р., Ζйаο 8., Аи Н., К1ет-8хап!о А.1, Тайап 8.Р. (2007). Шсгеакед ехргеккюп оГ к!ет се11 тагкегк т тайдпап! те1апота. Мод. Ра1йо1. 20, 102-107.

КоЬауакЫ Н., 0т1уа Я., Κωζ М., Ниайе Е., 8агоЬе Р., БакаПе II, Нетпх М., 8апдго В., Рпе!о 1., Воггак-Сиек!а Е., Се11к Е. (2002). [деп(1Пса11оп оГ ап апйдешс ерйоре Гог йе1рег Т 1утрйосу!ек Ггот сагапоетЬгуошс апйдеп. С1т Сапсег Рек. 5, 3219-3225.

Копо Т., 8Ытода М., ТакайакЫ М., Ма!кито!о К., ΥοкЫтο!ο Т., М|хи1ат М., ТаЬа!а С., 0кокЫ К., Аада Н., КиЬо Н. (2007). [ттипоЫкЮсйет1са1 де!есйоп оГ 1йе 1утрйайс тагкег родор1ашп т дйегке !урек оГ йитап сапсег се11к иктд а ηονе1 апйЬоду. Ш!. 1. 0псо1. 31, 501-508.

Кокай Е., Рагкег А.8., КиЬе О.М., Бойке С.М., Ее1Йо\'1сй В.С., В1и!е М.Й., СйегШе !С., Уакта1х1к 6. (2005). С1еаг се11 гепа1 се11 сагстота: депе ехргеккюп апа1укек 1деп11Гу а ро!епйа1 к1§па1пге Гог !итог аддгеккйепекк. С1т Сапсег Рек. 77, 5128-5139.

Кгоек Р.А., Эа^коп 6., Мокка1 !Р. (2007). Еосикед тюгоаггау апа1ук1к оГ д1усо-депе ехргеккюп т йитап дйоЬ1ак!отак. 1. №игосйет. 103 8ирр1. 1, 14-24.

Кгопа А., Атап Р., 0тда1 С., 1океГккоп А. (2007). 0псок!айп М-тдисед депек т йитап ак!госу!отак. Ш!. 1. 0псо1. 31, 1457-1463.

Кисйагсхак 1., Раш1ес.|тп 1., СатЬу I., Эесаейескег С., Какк Р., МаПтех 1. (2001). 6ак!пп тдисек охегехргеккюп оГ депек туокед т йитап И373 дйоЬ1ак!ота се11 т1дга!юп. 0псодепе 20, 7021-7028.

Кисиг М., ктап Е.К., Ва1а С., 0па1 В., НааЬекйод1и М., 0хкап Е., 0хкап А. (2008). 8егит УКЕ-40 ^ек апд сЫ1о1г1ок1даке асйгйу ак ро!епйа1 Ьютагкегк т ргппагу ргок!а!е сапсег апд Ьешдп ргок!айс йурегр1ак1а. Иго1. 0псо1. 26, 47-52.

Кипйага Н., Ζата А., Татига М., Такеда 1., 8акак| Т., ТакеисЫ Т. (2000). 61юта/дйоЬ1ак!ота-креайс адепо\'1га1 депе ехргеккюп иктд !йе пекйп депе геди1а!ог. 6епе Тйег. 7, 686-693.

Бт А., Ре!егк Н., 8! СВ, Нагооп ΖΑ., Ое^Ыгк! М.А., 8йаикЬегд РЪ., Каапдегк !Н., νаη дег Коде1 А.1, Р|ддтк 6.1. (2001). Тгапкспрйопа1 гекропке !о йурох1а ш йитап !итогк. 1. №И. Сапсег Шк!. 93, 13371343.

Бетте1 С., \УеП< 8., ЕЬег1е и., Эепд|е1 1., Кга!! Т., Вескег Н.Э., Раттепкее Н.6., 8!еνаηον^с 8. (2004). 01ГГегеп(1а1 диаЛЛа^е апа1ук1к оГ МНС Ндапдк Ьу такк крес!готе!гу иктд к!аЬ1е 1ко1оре 1аЬе11пд. №1. Вю!есйпо1. 22, 450-454.

ЙепдаЫ и., Ζ^тте^таη Б.В., МсКау Р.Э. (1990). ΟΝ8 к!ет се11к ехргекк а пе\х с1акк оГ Й11егтед1а1е Й1атеп! рго!ет. Се11 60, 585-595.

Ба ΙΥ., Аапд Н., Мау 8., 8опд X., Еиеуо 1., Еи11ег 6.Ν., Аапд Н. (2008а). СопкШиРх'е асйгаиоп оГ с1ип №1егтта1 ктаке согге1а!ек то!й Ык1о1од1с дгаде апд Е6ЕР ехргеккюп т дШике дйотак. 1. №игоопсо1. 88, 11-17.

Ба ^., Хи Н., 8раи1дшд В.0., Сйепд ^., 8паюп Р., Υаο 1.Й., д| 8ап!'адпеке Р.А., Войте Р.А, Ниапд 1. (2008Ь). Ехргеккюп оГ РNА-Ь^ηд^ηд рго!еш IМР3 (КОС) ш Ьешдп иго1йейит апд пго1йейа1 !итогк. Нит. Ра!йо1.

Баапд М.Й., Ма 1., Но М., 8о1отоп ^., ВоиГГе! Е., Ри!ка 1.Т., Наахкиак С. (2008). Тугокше ктаке ехргеккюп па ред1а!г1с Ыдй дгаде ак!госу!ота. 1. №игоопсо1. 87, 247-253.

Й1апд Υ., Во11еп А.А., А1даре К.Э., 6ир!а Ν. (2006). №с1еаг ЕАВР7 штипогеас!М1у 1к ргеГегепйайу ехргеккед па тПИгаИх-'е дйота апд 1к аккоаа!ед то!й роог ргодпок1к па Е6ЕР-ονе^еxр^екк^ηд д1юЬ1ак!ота. ВМС. Сапсег 6, 97.

Баапд Υ., Э|ейп М., Аа!коп Ν., Во11еп А.А., А1даре К.Э., №сйо1ак М.К., Батйога К.Р., Вегдег М.8., Во!к!еш Ό., Вгоахп Р.0., Iк^ае1 М.А. (2005). 6епе ехргеккюп ргоййпд гегеа1к то1еси1аг1у апд с11п1са11у д1кйпс! киЫурек оГ дйоЬ1ак!ота тиШйогте. Ргос. №11. Асад. 8сй И.8.А 702, 5814-5819.

Баао В., Ни Υ., Нетск Ό.Ι, Вгеахег 6. (2005). Тйе РNА-Ь^ηд^ηд рго!ет IМР-3 1к а 1гапк1а!юп^л ас!1ха!ог оГ 1пки11п-11ке дго^1й Гас!ог II 1еадег-3 тРNА дигтд ргойГегайоп оГ йитап К562 1еикет1а се11к. 1. Вю1. Сйет. 280, 18517-18524.

ЙШаиа Р.А., Такеда А., Сгих 1., Ептк Е.А. (1992). Уассииа ν^^ик-крес^Г^с йитап СЭ4+ су1о1охю Т1утрйосу!е с1опек. 1. Уйо1. 66, 2274-2280.

^^и М., Рагкег Р.М., ОагЬу К., Еуге Н.1, Соре1апд Ν.6., Сга\\Тогд 1., 6йЬей Ό.Ι., 8и!йег1апд 6.Р.,

- 47 032437 .Тепктв КА., Негход Н. (1999). СРВ56, а ηоνе1 весгеДп-Дке йитап С-рго!ет-соир1еб гесер!ог депе. Сепот1св 55, 296-305.

Бш 8., С1певДег С., СйагаГе-1аиГГге! Ε., Еосо Н., К1еег С.С., Мегавдег 8.Б., Боп!и С., ВД1сйа М.8. (2008). ВВСА1 геди1а!ев йитап таттагу в!ет/ргодеш!ог се11 Га!е. Ргос №!1. Асаб. 8с1. И.8.А 105, 16801685.

Бт ВД., Ри!пат А.Б., Хи-Уи Ζ., 8хо! С.Б., Бее М.В., 2йи 8., Со!!ДеЬ Р.А., Каргапоу Р., С1пдегав Т.В., бе 8! Сго!й В.Е., С1ауЬегдег С., 8орег Б.М., Ζ^ед1е^ 8.Е., В1иев!опе БА. (2006а). СО 127 ехргеввюп Д1уегве1у согге1а!ев етДй ЕохР3 апб вирргеввВе ГипсДоп оГ йитап СБ4(+) Т гед се11в. Б Ихр. Меб. 203, 1701-1711.

Бш X., Сйеп Ν., ВДапд X., Не Υ., Сйеп X., Ниапд Υ., Ут ВД., Ζ^νι О. (2006Ь). Арор!ов1в апб ргоДГегаДоп тагкегв ш б1ГГиве1у шДШаДпд ав!госу!отав: ргоДДпд оГ 17 то1еси1ев. Б №игора!До1. Ихр. №иго1. 65, 905-913.

Бо М.Б., 8!а1Ьапо 8., Раппопе С., М1дподпа М.Б., Мапддю А., 8а1уа!оге С., СЫеГД Р., Тгатоп!апо Б., Бе В.С., А1Деп Б.С. (2001). Ихргеввюп оГ !йе арор!ов1в 1пй1Ь1!ог вшуМп ш аддгеввке вциатоив се11 сагитта. Ихр. Мо1. Ра!йо1. 70, 249-254.

БиЬепвку БА., Vо^!теуе^ А.О., К1т 8., Бопвег В.В., Рагк Б.М., Верп В., Б1 I., Окато!о Н., ВДа1Ьпбде

8., ВувсДкеетДвсй С., Ма)ог Ε., О1бПе1б И.Н., Ζйиаηд Ζ. (2006). ИепДДсаДоп оГ (итог ргесигвог се11в т Не Ьгатв оГ рпта!ев етДй габ1а!юп-тбисеб бе ηоνо д1юЬ1ав!ота ти1ДГогте. Се11. Сус1е 5, 452-456.

Масй В., 8!е1т1е V., МагДпех-8опа Ε., ВеДй ВД. (1996). Веди1аДоп оГ МНС с1авв II депев: 1еввопв Ггот а б1веаве. Аппи. Веу. Iттиηо1. 14, 301-331.

Мабета Ε., 8а1тадд1 А., Са1а1оххо1о С., Б1т1бо Б., Ро1ю В. (2007). №вДп, РБСЕВЬе!а, СХСБ12 апб νΕ^Ε ш Скота РаДеп!в: БГГегеп! РгоД1ев оГ (Рго-Апдюдешс) Мо1еси1е Ихргеввюп Аге Ве1а!еб етДД Титог Сгабе апб Мау Ргслчбе РгодповДс ДДогтаДоп. Сапсег Вю1. Тйег. 6.

МаЫатакг И.Н., Ваг1ипб М., Таппег М., Согипоуа Б., Нод1ипб М., Кагйи В., Ка1иошет1 А. (2002). Егециеп! атрДДсаДоп оГ 8д24, 11ц, 17ц, апб 20с.|-врес|Пс депев ш рапсгеаДс сапсег. Сепев СДготовотев. Сапсег 35, 353-358.

Ма1сйегек С., Спаи V., 8!еуапоу1с 8., Ваттепвее Н.С., Д.тд С., Ме1тв А. (1994). Апа1ув1в оГ а11е1евресДгс соп!ас! вДев оГ па!ига1 НБА-БВ17 Ндапбв. Б Iттиηо1. 153, 1141-1149.

Матс 8., 8!игшо1о Т., Iт^о М.А., Наттег Б, 81шдадДа Е., №рреп С., 8радпоД С., Ма/χί В., Ве11опе М., Бе11аЬопа Р., Рго!!1 М.Р. (1999). Ме1апота се11в ргевеп! а МАСИ-3 ерДоре (о СБ4(+) су1о1ох!с Т се11в т аввошаДоп етДД Ыв!осотраДЬ11Ду 1еикосу1е апДдеп БВ11. Б Вхр. Меб. 189, 871-876.

Мао Υ., Ζ^νι Б., ΖΪι,ι ВД., ВДапд X., Уапд С., Х1е Б., Мао X., Дп К. (2007). РгоДГегаДуе в!а!ив оГ (итог в!ет се11в тау Ье согге1а!еб етДй таДдпапсу дгабе оГ йитап ав!госу!отав. Егоп! Вювск 12, 2252-2259.

Магхо А.Б., Китеаг В.Е., Баке В.А., ЕгеДпдег ББ, СоШпв Ε.Ε, ВоЫпвоп В.ВД., 8соД В. (2000). ТитогвресДгс СБ4+ Т се11в йауе а та)ог ров!-1юепвтд го1е т СТБ теб1а!еб апДДитог 1ттипДу. Б Iттиηо1. 165, 6047-6055.

Ме11а1 М., Са1бега V., Ра1гиссо А., Аппотахх! Б., 8сЫГГег Б. (2008). 8шуМп ехргеввюп т дДоЫав(отав соггекИев етДй ргоДГегаДоп, Ьи! по! етДД арор!ов1в. АпДсапсег Вев. 28, 109-118.

М1вЫта К., Ка!о Υ., Капеко М.К., КвЫкаета В., Ниове Т., Ма!ви!ап М. (2006). Шсгеавеб ехргеввюп оГ робор1апт т таДдпап! авДосуДс !итогв ав а поуе1 то1еси1аг тагкег оГ таДдпап! ргодгеввюп. Ас!а №игора!йо1. 111, 483-488.

МДа В., Со1ев ΙΕ., С1иЬгесй! Б.Б., 8ипд В., 8ип X., СобЬои! В. (2007). В-ЕАВР-ехргеввтд габ1а1 дДа1 се11в: !йе таДдпап! дДота се11 оГ опдт? №ор1авк1. 9,734-744.

М1уаетак1 Т., Иетига А., Беха\га М., Υυ В.Т., Не С., КвЫкаета 8., Нопба Υ., ТапаЬе Υ., ТапаЬе Т. (2004). Т1х, ап огрйап пис1еаг гесер!ог, геди1а!ев се11 питЬегв апб ав!госу!е беуе1ортеп! т !йе беуе1ортд геДпа. I. №иговск 24, 8124-8134.

М1хикат1 Υ., Копо К., Ба1до Υ., Такапо А., Твипоба Т., КаетадисЫ Υ., Nакати^а Υ., ЕиЩ Н. (2008). Бе!есДоп оГ поуе1 сапсег-!ев!1в апДдеп-вресШс Т-се11 гевропвев т ТВ, гедюпа1 1утрй побев, апб РВБ т раДеп!в етДй еворйадеа1 вциатоив се11 сагстота. Сапсег 8ск

Мокй!ап К., Рапв 8., диДге-Сгих Б., РДуа! Ν., Сптеге Ε., Мапе Υ., Наиет ББ, Кщав М., ВоетДсй Б., Ноапд^иап К., Бе1аДге ΙΥ., 8апвоп М. (2005). ОДд2 ехргеввюп, СЕАР, р53 апб 1р 1овв апа1ув1в соп!пЬи!е !о дДота виЬс1авв1ДсаДоп. Неигорабюк Арр1. №игоЬю1. 31, 62-69.

Мокгу Б, Охкота Б., ЕШр 8., Вй^таηη Б, Ов!еггеюйег Б, Ко1аг Ζ., Вηд1^вй Б. (2004). №вРп ехргеввюп Ьу пеет1у Гогтеб йитап Ь1ооб уевве1в. 8!ет Се11в Беу. 13, 658-664.

Могдап В.А., Биб1еу МК, ВДипбегДсй БВ., Нидйев М.8., Υηπβ БС., 8йеггу В.М., Воуа1 ВЖ., ТораДап 8.Б., Катти1а И.8., ВевДГо КР., Ζйеηд Ζ.., NаЬν^ А., бе ^гев С.В., Водегв-Егеехег Б.Б, Маугоикак1в 8.А., ВовепЬегд 8.А. (2006). Сапсег Ведгеввюп т РаДеп!в АГ!ег ТгапвГег оГ СепеДса11у Вηд^ηее^еб Бутрйосу!ев. 8иепсе.

Мог!ага Б., Сав!е11аш Р., Меахха В., Тов1 С., Бе Бегта В.А., Ргосорю Е.А., Сотев А., Ζηι^ί Б., Еетш

8., Ассо11а В.8. (2006). СПТА-тбисеб МНС с1авв II ехргеввюп т таттагу абепосагстота 1еабв !о а Тй1 ро1апхаДоп оГ !йе !итог т1сгоепу1гоптеп!, !итог ге_)ес!1оп, апб вресДгс ап!1!итог тетогу. СДп Сапсег Вев. 12, 3435-3443.

КоуеШпо Б., Сав!е1Д С., Рагт1аш С. (2005). А ДвДпд оГ йитап !итог апДдепв гесодшхеб Ьу Т се11в:

- 48 032437

Магсй 2004 ирба!е. Сапсег Iттиηο1. ИптипоЙег. 54, 187-207.

ΝιιΙΙ СБ., Ве!еп8ку Я.А., Вгоюег М.А.., Ва!сйе1ог Т.Т., Бош8 Ό.Ν., 8!ешше^-Яасйаш^тον АО (2005).

ΥΚΕ-40 18 а б1ГГегеп!1а1 б1адпо8Йс тагкег Гог й18!о1од1с зиЫурез оГ Ыдй-дгабе дйотаз. Сйп Сапсег Яе8. 11,

2258-2264.

Νυ!! СБ., Ма!!йею8 Я.Т., НоскПе1б 8. (2001). Сйа1 !итог туазюп: а го1е Гог !йе иргеди1айоп апб с1еауаде оГ ВЕНАВ/ЬгеЛсап. №иго8с1епЙ8!. 7, 113-122.

О'Эп8со11 Б., Б-шект Я., С1упе8 М. (2003). 8шуМп: го1е ш погта1 се118 апб т ра!йо1од1са1 сопбШопз. Сигг. Сапсег Эгид Тагде!8. 3, 131-152.

О1ике Ν., 8а!о М., Н18ауик1 Т., Епа1ака Н., 8а!о 8., \Уаба Υ., 8аЯо К., Такайа8й1 М., Та)т Т., Киштига Т., Могойо8Ы Т. (2007). Iшшиηοй^8!οсйет^са1 апа1у818 оГ пе8!ш апб с-кй апб !йе1г 81дшйсапсе ш рапсгеайс !итог8. Ра!йо1. Ы. 57, 589-593.

Окаба Υ., Ойпо С., Иек1 К., Одшо М., КаюатоЮ 8., К1т Р. (2007). Сотрап8оп оГ питепса1 сйапде оГ ер1бегта1 дгою!й Гас!ог гесер!ог депе атопд рге- апб ро8йаб1а!юп дкота, апб β1ίο8ΐ8, апб ί!8 с11шса1 и8е. Вгаш Титог Ра!йо1. 24, 15-18.

Охегбет и. (2006). ТагдеЯпд оГ репсу!е8 б1Ш1Ш8йе8 пеоуа8си1апхакоп апб 1утрйапдюдепе818 т рго8!а!е сапсег. Рго81а!е 66, 294-304.

Ре1 Ζ., Оеу Ν.Α, Ζи^бе^уаай М.М., Ла Ζ., Б| Υ., 8!ешЬегд 8.Г, 8т1!й К.О., \Уа(к1п8 Р.А. (2003). Тйе асу1-СоА 8уп1йе1а8е ЬиЬЬ1едит (11р1бо8ш): ГиЯйег скиасЮпхакоп апб го1е ш пеигопа1 ГаЯу ааб Ье!аох1ба!юп. 1. Вю1. Сйет. 278, 47070-47078.

Ре11о8к1 С.Е., БЯ1 Е., Ζйаηд ^., Υиηд ХУ.К., Со1тап Н., Би.! 1.Б., \Уоо 8.Υ., НешЬегдег А.В., 8ик1 Ό., Ргабо8 М., Сйапд 8., Вагкег Е.С., III, Еи11ег Ο.Ν., А1баре К.Э. (2006). Ргодпо8Йс а88ос1аЯоп8 оГ ас!ка!еб ткодеп-асйуайб рго!еш кта8е апб Ак! ра!йюау8 ш дйоЬ1а8!ота. С1ш Сапсег Яе8. 72, 3935-3941.

Ре11о8к1 С.Е., Мак1)ап А., Маог М., Сйапд Е.Б., \Уоо 8., СйЬеЯ М., Со1тап Н.. Υаηд Н., Бебоих А., В1аЯ Н., Ра88е 8., 1епкш8 Я.В., А1баре К.Э. (2005). ΥΙ<Ε-40 ехрге881оп 18 а88оаа!еб \\Яй роогег ге8ропзе !о габ1аЯоп апб 8йойег огегай 8игуУа1 т д1юЬ1а8!ота. С1ш Сапсег Яе8. 11, 3326-3334.

Репаг Р.Б., Кйо8йуотп 8., Вйи8йап А., Тп!!оп Т.Я. (1997). Iηй^Ьй^οη оГ ер1бегта1 дгою!й Гас!ог гесер!ог-а88оаа!еб 1уго81пе кша8е Ь1оск8 д1юЬ1а8!ота Ялгтоп оГ !йе Ьгаш. №иго8игдегу 40, 141-151.

Реппа А., Ео\\1ег Р., Вег!о1е!й А., Сш1йо! 8., Мо88 В., Магдо18кее Я.Е., СауаШ А., УаШ А., Иассабоп Е., Сй18ап Е.У. (1992). НерайЙ8 В νίπ.ΐ8 (НВУ)-8ресШс су!о!ох1с Т-се11 (СТБ) ге8роп8е т йитап8: сйагас!епхаРоп оГ НБА с1а88 П-ге81пс!еб СТЙ8 !йа! гесодшхе епбодепои81у 8уп1йе81хеб НВУ епуе1оре апйдеп8. 1. У1го1. 66, 1193-1198.

Реп8 ^., Тйегу М., Еаиге 1., 8аоиб1 Υ., БаГапесйеге ^., СйЯ!оп 1.К., Согбоп-\Уеек8 Р., СаЦай Ν., Вотеп8 М., ^огбетап Б., \Уей1апб 1., Апбпеих А., 1оЬ Ό. (2006). ТиЬийп 1уго8шаЯоп 18 а 1па)ог Гас!ог аГГесЯпд !йе гесгийтеп! оГ САР-С1у рго!еш8 а! 1шсго1иЬи1е р1и8 епб8. 1. Се11 Вю1. 174, 839-849.

Репу 1., Но М., У1его 8., Ζйеηд К., 1асоЬ8 Я., Тйогпег Р.8. (2007). Тйе ш!егтеб1а!е Шатеп! пе8Йп 18 й1дй1у ехрге88еб т погта1 йитап робосу!е8 апб робосу!е8 т д1отеги1аг б18еа8е. Реб1а1г. Эеу. Ра!йо1. 70,369382.

Р1е8сйе М., НЯбеЬгапб! Υ., Ζей1 Е., Сйариу В., 8сйтйх М., \Уи1Г С., Тгитрег ^., 8сйгоег8 Я. (2007). ИепЯйсайоп оГ а ргот18сиои8 НБА ОЯ-ге8!пс!еб Т-се11 ерЯоре бегкеб Ггот !йе 1пй1ЬЯог оГ арор!о818 рго!ет 8ШУМп. Нит. ^типок 68, 572-576.

Р|ххада1Н Е., НадепЬисй В., 8Яедег В., К1епк и., Ео1кег8 С., Ме1ег Р.1. (2002). ИепЯйсайоп оГ а ηονе1 йитап огдашс ашоп !гап8ройшд ро1урерйбе а8 а Ыдй айгпйу !йугохше йапзройег. Мо1. Епбосппо1. 16, 2283-2296.

Ргуог 1.С., Воигпе Р.А., Υаηд р., 8раи1бтд В.О., 8со!! С.А., Хи Н. (2008). IМР-3 18 а ηονе1 ргодге881оп тагкег т тайдпап! те1апота. Моб. Ра!йо1. 21, 431-437.

Ригою В., 8ипбаге8ап Т.К., Вигбюк М.к, КеГа8 В., Сотеаи Б., Наюкш8оп М., 8и О., КоШагоу Υ., Бее

1., Ζйаηд ^., Еше Н.А. (2008). №1сй-1 Яеди1а!е8 Тгап8спр!юп оГ !йе Ер1бегта1 Сгою!й Еас!ог Яесер!ог Тйгоидй р53. Сагстодепе818.

От Ζ., В1апкеп8!ет Т. (2000). СЭ4+ Т се11-теб1а!еб !итог ге_)есйоп Εινο1\Ό8 шИЫйоп оГ апдюдепе818 !йа! 18 берепбеп! оп ШИ датта гесер!ог ехрге88юп Ьу попйета!оро1ейс се118. йптипйу. 72, 677-686.

От Ζ., 8сйюаг1хкорГГ 1., Ргабега Е., КаттеПоещ Т., 8ейдег В., Р1гсйег Н., В1апкеп8!ет Т. (2003). А спйса1 гес.|шгетеп1 оГ иНегГегоп дашша-теб^а!еб апд1о81а818 Гог !итог ге.)есйоп Ьу СЭ8+ Т се118. Сапсег Яе8. 63, 4095-4100.

Риагап!а М., Окейа Я., Оаше1е А., Όί Т.8., Уеппеп М.Т., ^ο11^ I., Тгоссой С. (2007). Ер1бегта1 дгою!й Гас!ог гесер!ог 8егит ^ек апб ргодпо8Йс νа1ие ш тайдпап! дйота8. Титоп 93, 275-280.

Яаттепзее Н.С., Васйтапп 1., Еттепсй Ν.₽., Васйог О.А., 8!еνаηον^с 8. (1999). 8ΥΡРЕIТНI: ба!аЬа8е Гог МНС Идапб8 апб рерйбе тойй. ^типодепе!^ 50, 213-219.

Яашшеη8ее,Н.С., Васйтапп 1., апб 8!еνаηον^с, 8. (1997). МНС Ефапб8 апб Рерйбе МойГ8. 8рппдегУег1ад, Не1бе1Ьегд, Сегтапу).

Яаттепзее Н.С., Епебе Т., 8!еνаηον^^с 8. (1995). МНС йдапб8 апб рерйбе тойй: ЙГ8! Й8Йпд. Iшшиподепейс8 41, 178-228.

Яеуах Ν., ТаууаЬ М., Кйап 8.А., 81бб1дие Т. (2005). Согге1айоп оГ дйа1 ГЬЯНагу ас1б1с рго!еш (СЕАР)

- 49 032437 \νίΐΗ дгаЕтд оГ Не пеигодйа1 китоигв. 1. Со11. РЛувадапв 8игд. Рак. 75, 472-475.

ВшдвЛоЛ М., НодЕа11 ЕА, 1оЛапвеп 1.8., Расе Р.А., СЛпвкепвеп Ь.Н. (2007). ΥΕΕ-40 ргокеш ехргеввюп шпогта1 аЕи1к Литап йввиев-ап 1ттипоЫв1осЛет1са1 вкиЕу. 1. Мо1. Н1в1о1. 38, 33-43.

ВовепЬегд 8.А., ^окζе М.Т., Мии1 Ь.М., СЛапд А.Е., Ау1в Р.Р., ЬеЛтап 8., ЬшеЛап XV.М.. ВоЬегквоп С.Б., Лее В.Е., ВиЬш !Т. (1987). А ргодгевв герой оп Не кгеактепк оГ 157 рак1епкв ^ЛЛ аЕуапсеЕ сапсег ивтд 1утрЛокше-асЙуакеЕ к111ег се11в апЕ ткег1еикш-2 ог ЫдЛ-Еове 1п1ег1еик1п-2 а1опе. Ν. Епд1. 1. МеЕ. 316, 889897.

ВовепЬегд 8.А., РаскагЕ В.8., АеЬегво1Е Р.М., 8о1отоп Ό., ТораНап 8.Ь., Тоу 8.Т. 81топ Р, Ьоке М.Т., Υаηд 1.С.. 8е1рр С.А. (1988). Иве оГ китог-1пй1кгайпд 1утрЛосукев апЕ 1п1ег1еик1п-2 т Не 1ттипокЛегару оГ райеШв ^ЛЛ текавкайс те1апота. А ргеНттагу герой. Ν. Епд1. 1. МеЕ 319, 1676-1680.

ВовНпЕ А., 1оЛапвеп 18., СЛпвкепвеп Ей, К1вв К., Ва1в1еу Е., №е1веп О.Ь., Вепкеп 1., Расе Р.А., АпЕегвеп Е. (2008). Н1дЛ вегит 1еуе1в оГ ΥΙ<Ε-40 т райеШв ^ЛЛ вциатоив се11 сагсшота оГ Не ЛеаЕ апЕ песк аге аввоАИеЕ ^ЛЛ вЛой вшУ1уа1. Шк 1. Сапсег 122, 857-863.

Ριιίζ С., Ниапд V., Нед1 М.Е., Ьапде К., Натои М.Р., Р1иг1 Е., Оаке1еу Е.к, СН|цие1-ЕНг1втапп В., ОгепЕ О. (2004). Ого\\И1 рготойпд в1дпа1шд Ьу кепавст-С |соггес1еЕ|. Сапсег Вев. 64, 7377-7385.

8аЬайш Р., РекессШа Ь., Тау1ап М., 1оЕоп Е^ V, Вовв1 О.А., Вгоику-Воуе Ό. (2005). Нитап ЬгопсЛ1а1 ПЬгоЬ1ав1в ехЫЬЛ а тевепсЛута1 в1ет се11 рЛепокуре апЕ тиЙЛтеаде ЕЛ'Гегепкайпд рокепк1акк1ев. ЬаЬ Тпуевк 55, 962-971.

8а1Е1 А., 1ауе1Уа1 8., Ве11аЛсепе А., Эе V.!, Ве11о Ь., Савйопоуо V., Эерп^ М., Ьо1веаи Н., В1кка1у1 А., НадеЕогп М. (2007). Ехрептепка1 апй-апдюдепев1в саивев иргеди1айоп оГ депев аввошакеЕ \\ЛН роог вшу1уа1 ш дкоЫавкота. Шк 1. Сапсег.

8аЛо Т., Апйп М.Т., Ната 8., Каната Υ., 8ид1уата К., Υатавак^ Р., Н1Еака Т., АгЛа К., Киави К. (2007). 8шу1уш виЬсе11и1аг 1оса^айоп ш ЫдЛ-дгаЕе авкгосукотав: втиЛапеоив ехргеввюп ш ЬокЛ пис1еив апЕ су1ор1авт 1в педайуе ргодповйс тагкег. 1. Иеигоопсо1. 82, 193-198.

8акигаЕа К., 8ашо М., Моша V., 8а1о А., КЛапака С., Кауата Т. (2007). №вкп ехргеввюп ш сепкга1 пегуоив вувкет дегт се11 китогв. Иеиговигд. Веу.

8аг1ото-В1ка1а М., Твиртига Т., ЬепЕаЫ и., М1ейтеп М. (2002). Райегпв оГ певйп апЕ о1кег ЛиегтеЕ1а1е Й1атепк ехргеввюп Е1вйпдшвЛ Ьейгееп давкготкевйпа1 вкгота1 китогв, 1еютуотав апЕ всШгаппотав. АРМА 110, 499-507.

8авак1 Т., Ьорев М.В., Напкшв О.В., Не1т О.А. (2002). Ехргеввюп оГ вшУ1уш, ап 1пЛ1ЬЛог оГ арор1ов1в рго1ет. т китогв оГ Не пегуоив вувкет. Аска Иеигора1Но1. 104, 105-109.

8ако Р., АЬгаЛат 1.М., Υίιι 1., Кап Т., Йо Т., Моа Υ., НатЛкоп 1.Р., йп Ζ., СЛепд Υ., Раип В., Вегк1 А.Т., Χνηιΐβ 8., 8ЫтаЕа Υ., Ме1Аег 8.1. (2006). Ро1о-йке кшаве апЕ виНут аге еворЛадеа1 китог-вресЛгс ргото1егв. ВюсЛет. ВюрЛув. Вев. Соттип. 342, 465-471.

8сЛасЛк V., ЭаЕгав 8.8., 1оНпвоп Ь.А., 1асквоп ΌΌ., Нопд Υ.Ε.. Оектаг М. (2005). Ир-гедШайоп оГ Не 1утрЛайс тагкег роЕор1атп, а тист-куре кгапвтетЬгапе д1усоргокет, т Литап вциатоив се11 сагстотав апЕ дегт се11 китогв. Ат 1. РакЛо1. 166, 913-921.

8сШГГег Ό., Маηаζζа А., Татадпо I. (2006). №вкп ехргеввюп т пеигоерЛЛе11а1 китогв. №иговск Ьекк. 400, 80-85.

8сЛ1еде1 1., МегЕев А., 8111111111 О., А1Ьей Р.К., Рогвйпд М., Нупев Ν., К1евв1шд М. (1994). Атрййсайоп оГ Не ер1Еегта1-дго^1Л-Гас1ог-гесер1ог депе согге1акев \\ЛН ЕЛГегепк дгоМЛ ЬеЛауюиг т Литап д1юЬ1авкота. Шк 1. Сапсег 56, 72-77.

8сЛ1еЛоГег В., В1еЛпег М., Ргевкоп-Магйп 8., МеЛоГГ Ό., АаНгепЕогГ 1., Агв1ап А., АЫЬот А., СЛо1 ν.Ν., ОЛев О.О., Ноте О.В., Ый1е 1., Меηедоζ Р., Вуап Р. (1999). Во1е оГ теЕ1са1 Ывкогу ш Ьгаш китоиг Ееуе1ортепк Веви1кв Ггот Не ткегпайопа1 аЕиЛ Ьгаш китоиг вкиЕу. Шк 1. Сапсег 82, 155-160.

8сЛт1кк А., Оойеде V., -№еЬег М., Меуег 1., Моввпег В., ЬевсЛ К.Р. (2003). ТЛе Ьгаш-вресЛгс ргокеш МЬС1 трйсакеЕ ш теда1епсерЛакс 1еикоепсерЛа1ораШу ^ЛЛ виЬсогйса1 сув1в 1в ехргеввеЕ т дйа1 се11в т (Не тиапе Ьгаш. Ойа 44, 283-295.

8сЛоепЬегдег 8.Р., Тоев В.Е., уап Е, V, Ойлпда В., МекеГ С.1. (1998). Т-се11 Ле1р Гог сукокохю Т 1утрНосу1ев 1в теЕ1акеЕЬу С040-С040Й шкегасйопв. №11иге 393, 480-483.

8^1^-411^^111111 1., 1опввоп Р., АЛ1Ьот А., Ргевкоп-Магйп 8., Ьопп 8., 8оЕегЬегд К.С., РеусЛйпд М. (2003). СоЛой в1иЕ1ев оГ аввошайоп ЬеЕгееп ве1Г-геройеЕ а11егдк сопЕйюпв, ттипе-геЫеЕ Е1адповев апЕ дкота апЕ тешпдюта пвк. Шк 1. Сапсег 106, 423-428.

8сктайζЬаит 1., 1опввоп Р., АЛ1Ьот А., Ргевкоп-Магйп 8., Ма1тег В., Ьопп 8., 8оЕегЬегд К., РеусЛйпд М. (2005). Рпог ЛоврЛа^айоп Гог ерЛерву, Е1аЬекев, апЕ вкгоке апЕ виЬведиепк дйота апЕ тешпдюта пвк. Сапсег ЕрхЕетюк Вютагкегв Ргеу. 14, 643-650.

8с11\νес1111е^1пе^ К., Ниапд 8., Сауепее У.К. (1995). ЕОРВ депе атркйсайоп-геаггапдетепк т Литап д1юЬ1авкотав. кН. 1. Сапсег, 62, 145-148.

8спЕеН С.А., Саг1окй С.О., 1г., Окатоко О.К., АпЕгаЕе V.8., ΕογΑζ М.А., Мокка Р.к, Ьисю-Екегоую А.К., №Еег Ь., ВоветЬегд 8., ОЬа-8Ып)о 8.М., Майе 8.К., Топе Ь.О. (2008). Оепе ехргеввюп ргой1е апа1ув1в оГ рптагу д1юЬ1авкотав апЕ поп-пеор1авйс Ьгаш йввие: 1Еепййсайоп оГ рокепйа1 кагдек депев Ьу ойдопис1еойЕе писгоаггау апЕ геа1-йте диапйкайуе РСВ. 1. Иеигоопсо1.

- 50 032437

ЗеНда1 А., Воуп!оп А.Б., Уоипд К.Е., Уегтеи1еп З.З., Уопетпга К.З., КоЫег Е.Р., А1баре Н.С., З1тге11

С.К., МигрНу С.Р. (1998). Се11 абНекюп то1еси1е Ыг-САМ ίκ охег-ехргеккеб ш Нитап Ьгат !итогк. Ш! I.

Сапсег 76, 451-458.

ЗеНда1 А., Кккк З., Уатск Б, Воуп!оп А.Ь., МигрНу С.Р. (1999). Апйкепке Нитап пеигодНа ге1а!еб се11 абНекюп то1еси1е НЫг-САМ, гебисек !Не !итопдешс ргорегйек оГ Нитап д1юЬ1ак!ота се11к. Апйсапсег Кек. 19, 4947-4953.

ЗНакЫбНаг З., Ьогеп!е С., Ыадахагари и., Ые1коп А., Кио Б, Ситтшк Б, Ы1ко1кН К., ИгЕег К., ЕоеНг Е.Б. (2005). СРК56 1к а СРСК !На! 1к охегехргеккеб т дНотак апб Гипсйопк т !итог се11 абНекюп. Опсодепе 24, 1673-1682.

ЗНеб1оск БЗ., ЗНеп Н. (2003). Кецшгетеп! Гог СБ4 Т се11 Не1р т депегайпд Гипсйопа1 СБ8 Т се11 тетогу. Зс1епсе 300, 337-339.

ЗЫЬаНага к, Каккта Т., К1кисН1 Υ., Кипйа А., Еикауата М. (2006). Робор1ашп 1к ехргеккеб т киЬке!к оГ !итогк оГ !Не сеп!га1 пегуоик кук!ет. МгсНотек АгсН. 448, 493-499.

ЗН1Н А.Н., Но11апб Е.С. (2006). Ыо!сН кдпаНпд епНапсек пекйп ехргеккюп т дйотак. Ыеор1ак1а. 8, 1072-1082.

ЗЫгак А., СНе!йаг З.Т., ЗНера1 V., Ка.)епбгап С., Ргакаб С.К., ЗНакйу Р. (2007). Зроп!апеоик !гапкГогта!1оп оГ Нитап аби1! поп!итопдешс к!ет се11к !о сапсег к!ет се11к 1к бпхеп Ьу депотк тк!аЬ11йу т а Нитап тобе1 оГ д1юЬ1ак!ота. З!ет Се11к 25, 1478-1489.

ЗНок!ак К., БаЬипккуу V., Бтйгепко V., МаНкНеха Т., ЗНатауеν М., Коζитепко V., Ζοζιι1νη Υ., ΖеНе!пег С., Кахкап V. (2003). НС др-39 депе 1к иргеди1а!еб т д1юЬ1ак!отак. Сапсег Бе!!. 198, 203-210.

ЗтдН З.К., С1агке ББ., Н1бе Т., Бйкк Р.В. (2004а). Сапсег к!ет се11к т пегуоик кук!ет !итогк. Опсодепе 23, 7267-7273.

ЗтдН З.К., С1агке ББ., Тегакак1 М., Вопп МЕ., Натектк С., Зс.|тге Б, Бйкк Р.В. (2003). ^1+1^33011 оГ а сапсег к!ет се11 т Нитап Ьгат !итогк. Сапсег Кек. 63, 5821-5828.

ЗтдН З.К., Натектк С., С1агке ББ., Зс.|тге кА., Вауаш I., Н1бе Т., Непке1тап К.М., Сиктапо М.Б., Бйкк Р.В. (2004Ь). ^1+(+1+011 оГ Нитап Ьгат !итоиг 1пй1айпд се11к. Ыа!иге 432, 396-401.

ЗтдН-.Таки)а Н., ЕттепсН Ы.Р., Каттепкее Н.С. (2004). ТНе ТиЬтдеп арргоасН: 1бепййсайоп, ке1есйоп, апб уайбайоп оГ !итог-аккос1а!еб НБА рерйбек Гог сапсег !Негару. Сапсег Iттипо1. IттипоΐНе^. 53, 187-195.

Зйп1коуа Б., Мепбеке С., Бт ϋ., Уоба В.А., Би Б., Бгеккег К., МоНап!у З., Коск К.Б., Йапд Ζ. (2008). ШР3 ргебк!к аддгеккуе кирегйс1а1 иго!Нейа1 сагстота оГ !Не Ь1аббег. Сйп Сапсег Кек. 14, 1701-1706.

З)о А., Мадпиккоп К.Е., Ре!егкоп К.Н. (2005). Акко+айоп оГ а1рНа-букйоЬгеут тейН ^ео^дап^ζ^пд йдН! щпсЗопк. I. МетЬг. Вю1. 203, 21-30.

Зрап Р.Ы., Зтееер Е.С., Укдеппск Е.Т., Т)ап-Неупеп МС., Мапбегк Р., Веех Б.М, бе Кок кВ. (2004). ЗиМут 1к ап тберепбеп! ргодпокйс тагкег Гог пкк к!гаййсайоп оГ Ьгеак! сапсег райеп!к. Сйп СНет. 50, 1986-1993.

З!апб1Гег Ы.Е., Оиуапд О., Рападю!орои1ок С., Vе^сНе^е С.В., Тап К., СгеепЬаит СЗ., Р1Нокег С., Ыерот С.Т. (2006). Шепййсайоп оГ Ыохе1 НБА-А* 0201-Кекйк!еб ЕрНорек т Кесеп!-Опке! Туре 1 Б1аЬейс ЗиЬ)ес!к апб АпйЬобу-Рок+уе Ке1айуек. Б1аЬе!ек 55, 3061-3067.

З!го)тк Т., Кок1апб СМ., Закапаккеп Р.О., Кауа1аг К., БаН Т. (2007). Ыеига1 к!ет се11 тагкегк, пекйп апб тикакН1 рго!етк, т !Не ргодгеккюп оГ Нитап дйота: согге1а!юп оГ пекйп тейН ргодпокк оГ райеп! кигУ1уа1. ЗигдЫеиго1. 68, 133-143.

Зи У., СНеп I., Υаηд Н., Υου Б., Хи Б., Уапд X., Б1 К., Сао Б., Си Υ., Бт З., Хи Н., Вгеуег М.Б., Нао С.М. (2007). Ехргеккюп оГ пекйп т !Не робосу!ек оГ погта1 апб бйеакеб Нитап к1бпеук. Ат I. РНукю1 Кеди1. ИЗедг. Сотр. РНукю1. 292, К1761-К1767.

Зидатеага К., КипНага Н., ЫедкЫ М., Зайо Ы., Ыакаζа!о Υ., Закак1 Т., ТакеисН1 Т. (2002). Ыекйп ак а тагкег Гог ргоНкегаЙуе епбо!НеНпт т дНотак. БаЬ Шуек! 82, 345-351.

Зип С., Υυ К.Т., Еуапк К.М., ЗН1 Υ. (2007). ОгрНап пис1еаг гесер!ог ТБХ гесгийк Ык!опе беасе!у1акек !о гергекк !гапксйрйоп апб геди1а!е пеига1 к!ет се11 ргойкегайоп. Ргос Ыа!1. Асаб. Зсг и.З.А 104, 15282-15287.

Зип ЕС., Веуап М3. (2003). БеГесйхе СБ8 Т се11 тетогу Го11отетд аси!е т(сс!юп тейНои! СБ4 Т се11 Не1р. Зскпсе 300, 339-342.

З^ик1 Н., Ка!о Υ., Капеко М.К., Окйа Υ., Ыапта!ки Н., Ка!о М. (2008). Ьбисйоп оГ робор1ашп Ьу йапкГогттд дготе!Н Гас!ог-Ье!а т Нитап йЬгокагсота. ЕЕВЗ Бе!!. 582, 341-345.

З^ик1 Т., Магипо М., У аба К., Кадатеа Ы., Еирто!о Υ., НакЫто!о Ы., Бито!о З., УокЫтте Т. (2004). Сепейс апа1ук1к оГ Нитап д1юЬ1ак!отак иктд а депотк ткгоаггау кук!ет. Вгат Титог Ра!Но1. 21, 27-34.

Такапо Т., Вескег Б.Е. (1997). Беуе1ортеп!а1 сНапде оГ !Не пекйпчттипогеасйуе т1б1те гарНе дйа1 к!гис!иге т Нитап Ьгатк!ет апб крта1 согб. Бех. Ыеигокск 19, 202-209.

Тап НМ., Бт Е, Уи З.М., Био Н.З. (2005). Ехргеккюп оГ а поуе1 арор!окк 1пН1Ьйог-кигу1ут т со1огес!а1 сагстота. Уог1б I. Сак!гоеп!его1. 11, 4689-4692.

Таптеаг М.К., СйЬей М.К., Но11апб Е.С. (2002). Сепе ехргеккюп ткгоаггау апа1укк геуеа1к УКБ-40 !о Ье а ро!епйа1 кегит тагкег Гог тайдпап! сНагас!ег т Нитап дйота. Сапсег Кек. 62, 4364-4368.

- 51 032437

ТегашзЫ Ν., Nайο Ζ., Шпагат Т., Тапака Ν., Ригикатеа К., 8еуа Т., 8Ып_)1 8., Тарп Т. (2007). Иепййсайоп оГ пеоуазси1а!иге изтд пезРп шсо1огес!а1 сапсег. Ш!. 1. Опсо1. 30, 593-603.

Тега!аш Т., ЭотоЮ Т., Кипк1 К., Кадеуата Т., Такауата Т., Шпкаага А., Охопо 8., №ха\га Я. (2007). ЭеЮсНоп оГ 1гапксг1р( Гог Ьгатйуре ГаНу Айб-Ъшбшд рго!ет ш (итог апб игте оГ райеп!з Ш!Р гепа1 се11 сагсшота. Иго1оду 69, 236-240.

ТРотрзоп Э.М., С111 С.К (1985). ТРе ЕСР гесерЮг: з!гис!иге, геди1айоп апб ро!епйа1 го1е т таИдпапсу. Сапсег 8шу. 4, 767-788.

ТоРуата Т., Ьее ν^., Яогке Ь.В., Мами М., МсКау Κ.Ό., Тго)апо\\'зк1 кО. (1992). №з!т ехргеззюп ш етЬгуошс Ритап пеигоерйРейит апб т Ритап пеигоерйРейа1 !итог се11з. ЬаЬ. Шуез!з, 303-313.

Тотрктз 8.М., Яо!а Р.А., Мооге 1.С., 1епзеп Р.Е. (1993). А еигоршт Г1иого1ттипоаззау Гог теазиппд Ьтбшд оГ апрдеп !о с1азз II МНС д1усорго!етз. 1. ^типок Ме!Робз 163, 209-216.

ТоР Р., ЯедоР М., №з1 С., ОссЫш Я., Вайо1отте1 8., Ропх1 Ь., ВейеШ Е. (2005). №зйп ехргеззюп ш погта1 абгепа1 д1апб апб абгепосогРса1 !итогз. Н1з!о1. Н1з!ора!Ро1. 20, 1115-1120.

Тзиртига Т., МакизЫ-8ЫтоЬауазЫ С., Ьипдку1з! 1., ЬепбаР1 и., NаказРο К., 8ид1Рага А., Йа-азак Т., Мапо М., Υатаба Ν., УатазРйа К., Тоуозака А., Тегаба Ν. (2001). Ехргеззюп оГ !Ре т!егтеб1а!е П1атеп1 пезРп ш даз1гот!езйпа1 з!гота1 !итогз апб т!егзййа1 се11з оГ Са)а1. Ат 1. Ра!Ро1. 755, 817-823.

Иета!зи М., ОРзатеа I., Аокаде Т., №1итак| К., Ма1зито1о К.., ТакаРазЫ Н., АзоР 8., Тегато!о А., ОР!а 8. (2005). Ргодпозйс з1дпгРсапсе оГ !Ре 1ттипоЫз!осРетюа1 тбех оГ зигуМп т дрота: а сотрагаруе з!ибу ааЛИ !Ре МЕ-1 тбех. 1. №игоопсо1. 72, 231-238.

νаη ВРзеп кН., νаη ОН, Ьагб Ь.Я., νаη б, V, Е1Геппк Э.С., Ваккег А.М., МШепЬигд А.М., Нтхтда Т.У., бе ^1ез Я.Я., Тоез Я.Е. (2004). РипсРопа1 геди1а!огу 1ттипе гезропзез адатз! Ритап сагШаде д1усорго!ет-39 ш Реа1!Р уз. рго тПаттаЮгу гезропзез ш гРеита!о1б аПРпРз. Ргос. Асаб. 8ск И.8.А 101, 17180-17185.

νаη бег Вгиддеп Р., Тгауегзаг1 С., СРотех Р., Ьищиш С., Эе Р.Е., Vаη беп ЕВ, Кпи!Р А., Вооп Т. (1991). А депе епсобтд ап апрдеп гесодшхеб Ьу су!о1у!1с Т 1утрРосу!ез оп а Ритап те1апота. 8аепсе 254, 1643-1647.

Vаηбе^\ν^ηбеη 1.М., СШагб К., Эе Ьае! М.Н., Меззат С.А., 8сРгГГтапп 8.Ν. (2002). П1з!пЬийоп оГ !Ре т!егтеб1а!е П1атеп1 пезРп т !Ре тизси1апз ргорпа оГ !Ре Ритап даз!гот!ез!та1 Рас!. Се11 Т1ззие Яез. 309, 261-268.

Vее^катр кН., Ζ^тте^таη АЛУ. (2001). Райу ас1б-Ьтбтд рго!етз оГ пегуоиз Рззие. 1. Мо1. №игозсг 16, 133-142.

Vезе1зка Я., КидРк Р., Се)рек Р., 8νасРονа Н., №габП 1., Ьо.)а Т., ЯексРоуа 1. (2006). №з!т ехргеззюп ш !Ре се11 1тез бепуеб Ггот д1юЬ1аз!ота тиШГогте. ВМС. Сапсег 6, 32.

^ар1апо М.8., В1 У.Ь., Р1ерте1ег 1., НоскПе1б 8., МайРеаа'з Я.Т. (2005). Nονе1 !итог-зресРю 1зоГогтз оГ ВЕНАВ/Ьгеу1сап 1бепРДеб ш Ритап таРдпап! дкотаз. Сапсег Яез. 65, 6726-6733.

^ар1апо М.8., НоскПе1б 8., МайРеаа'з Я.Т. (2008). ВЕНАВ/Ьгеу1сап гес.|иРез АЭАМТ8-теб1а!еб рго!ео1уйс с1еаνаде Ю ргото!е д1юта туазюп. 1. №игоопсо1.

^дпегоп Ν., 8!гооЬап! V., СРарРо 1., Оотз А., Оедюуапт С., Моге1 8., νаη бег ВР, Вооп Т., Vаη Эеп Еупбе В.к (2004). Ап апрдешс рерРбе ргобисеб Ьу рерРбе зрРстд т!Ре рго!еазоте. 8аепсе 304, 587-590.

^д! А.В., КгорзРоГег Н., Ка1ЬасРег Н., Ка1Ьиз М., Яаттепзее Н.С., СоРдап кЕ., МагРп Я. (1994). Ыдапб тоРГз оГ НЬА-ОЯВ5х0101 апб ОЯВ1Х1501 то1еси1ез бе1теа!еб Ггот зе1к-рер!1без. 1. ^типок 153, 1665-1673.

\Уа1(ег 8., Неггдеп Ь., 8сРоог О., 1ипд С., Уегпе! Ό., ВиРппд Н.к, Яаттепзее Н.С., 8!еуапоу1с 8. (2003). Сийтд ебде: ргебе!егттеб ау1бРу оГ Ритап СЭ8 Т се11з ехрапбеб оп са11Ьга!еб МНС/апР-СО28соа!еб т1сгозрРегез. 1. Iттиηο1. 171, 4974-4978.

Уапд кС., Ьгутдз!опе А.М. (2003). Сийтд ебде: СЭ4+ Т се11 Ре1р сап Ье еззепРа1 Гог рптагу СЭ8+ Т се11 гезропзез ш угуо. 1. Iттиηο1. 171, 6339-6343.

\Уе1 Ь.С., 8Ы М., Сао Я., СРеп Ь.У., СРап Υ.8. (2008). №зРп зта11 т!егГегтд ЯNΑ ШЯ^А) гебисез се11 дгоаа-р ш си1!игеб аз!госу!ота се11з. Вгат Яез. 1196, 103-112.

УетзсРепк Т., СоийеГапдеаз С., 8сЫг1е М., ОЬегтауг Р., \Уа1(ег 8., 8сРоог О., Кигек Я., Ьоезег У., В1сР1ег К.Н., Уете! Ό., 8!еуапоую 8., Яаттепзее Н.С. (2002). РИедиНеб Гипс!юпа1 депотюз арргоасР Гог !Ре без1дп оГ райеп!-тбМбиа1 ап!йитог уасстез. Сапсег Яез. 62, 5818-5827.

У1ск1 А., ЬеРетЬге Р., У1ск Ν., Нап!изсР В., Кег)азсРк1 Ό., СРпз!оГоп С. (2006). Титог туазюп ш !Ре аЬзепсе оГ ерйРейа1-тезепсРута1 йапзйюп: робор1ашп-теб1а!еб гетобеРпд оГ !Ре асРп су!озке1е!оп. Сапсег Се11 9, 261-272.

\Утег 8., Тзш Н., Ьаи А., 8опд А., Ь1 X., СРеипд Я.К., 8атрзоп А., АРРуап Р., Е1Гогб А., 1аско\\'зк| С., Вескег Ό.Ι., 8ап1атапа Р., ОРазЫ Р., ЭозсР Н.М. (2003). Аи!о1ттипе 1з1е! без!гис!юп ш зроп!апеоиз 1уре 1 б1аЬе!ез 1з по! Ье!а-се11 ехс1изгуе. №11. Меб. 9, 198-205.

\Уйапо\\'зка М., Ьабб 8., 8тйР 8.Я., СойзсРа11 Р.Е. (2006). СЭ44 абРезюп то1еси1е апб пеиго-дйа1 рго!еод1усап NС2 аз туазгуе тагкегз оГ д1юта. Вгат Се11 Вю1. 35, 159-172.

Х1е Ό., Ζеηд Υ.Χ., Уапд Н.к, Уеп кМ., Тао Υ., 8Рат к8., Сиап Χ.Υ. (2006). Ехргеззюп оГ су!ор1азтк апб пис1еаг 8игуМп т рптагу апб зесопбагу Ритап д1юЬ1аз!ота. Вг. 1. Сапсег 94-108-114.

- 52 032437

Хи Ь., Ведит 8., Неагп ΕΌ., Нупек К.О. (2006). ОРК56, ап а!урюа1 О рго!ет-соир1еб гесер!ог, Ьтбк Иккие 1гапкд1и!аттаке, ТО2, апб 1пЫЬ1!к те1апота !итог дгоу!И апб те!ак!аяк. Ргос Ка!1. Асаб. 8с1. И.8.А 103, 9023-9028.

Хи Ь., Нупек К.О. (2007). ОРК56 апб ТО2: рокк1Ь1е го1ек т кирргеккюп о! !итог дгоу!И Ьу !Ие писгоепуЛоптеп!. Се11 Сус1е 6, 160-165.

УатакНиа 8., Макиба Υ., Кипхак! Т., Нада Υ., Мигауата Т., Iке^ 8., Кате1 М., Такепо 8., КауаИага К. (2007). 8игу1ут ехргеккюп ргебю!к еаг1у гесиггепсе т еаг1у-к!аде Ьгеак! сапсег. АпЛсапсег Кек. 27, 28032808.

Υαγ 1., Рпсе М.А., Кеибаиег С.Ь., ЖЛкоп С., Реггопе 8., Х1а Н., Лба 1., 81тркоп М.А., МсСаПИу 1.В. (2004). Ме1апота сИопбгоЛт ки1!а!е рго!еод1усап епИапсек РАК апб ЕКК асИуаЛоп Ьу б1кЛпс! тесИашктк. 1. Се11 Вю1. 165, 881-891.

Υα^ί^ К.К., Сокаг Е., ИксИег А.Н. (2008). Ике о! IΜΡ3 ш 1беп!ШсаЛоп о! сагстота т !те пееб1е акрЛаИоп Ьюряек о! рапсгеак. Ас!а Су!о1. 52, 133-138.

Υα^ί^ К.К., Жоба В.А., Рапдег О.К., Ка1ок М., ЖИа1еп О.Р., Таба Н., Апбегкеп Ц.К., Коск К.Ь., Эгеккег К. (2005). КОС (К Иото1оду ботат соп!аштд рго!ет оуегехргеккеб т сапсег): а поуе1 то1еси1аг тагкег !Иа! б1кИпдшкИек Ье!уееп Ьешдп апб таИдпап! 1екюпк о! !Ие рапсгеак. Ат 1 8игд Ра!Ио1. 29, 188-195.

Υее С., ТИотркоп 1.А., Вугб Ό., К1ббе11 8.К., КосИе Р., СеИк Е., ОгеепЬегд Р.Ц. (2002). АборЛуе Т се11 !Иегару иктд апЛдеп-кресШс СЭ8+ Т се11 с1опек !ог !Ие !геа!теп! о! раИеп!к уЛИ те!ак1а!ю те1апота: ш У1уо регк1к!епсе, т1дгаИоп, апб апИ!итог е!!ес! о! 1гапк!еггеб Т се11к. Ргос. Ка!1. Асаб. 8ск И.8.А 99, 1616816173.

уико-8ас1бо А., ОгаИат С., ОгеепЛе1б 1.Р., Вооскуаг ЕА. (2006). ТИе биа1Лу о! ер1бегта1 дгоу!И !ас!ог гесер!ог (ЕОРК) ядпаЛпд апб пеига1 к!ет се11 рИепо!уре: се11 епИапсег ог се11 !гапк!огтег? Сип. 8!ет Се11 Кек. ТИег. 1, 387-394.

Ζалдеп I., КпеИх 8., Мопогапи С.М., Ки!коукк1 8., Ншкек В., Ыпсе О.Н, Ниапд В., Коддепбог! Ж. (2007). Ерепбутота депе ехргеккюп ргоП1ек аккоаа!еб уЛИ Ык!о1одюа1 киЫуре, ргоИ!егаИоп, апб раЛеп! кигу1уа1. Ас!а Кеигора!Ио1. 113, 325-337.

Ζа^етЬа 8., Ватаада Е., ΖΙπ.ι М., 8оагек К., Ткапд КУ, 8сИ1от 1. (1997). Iбеп!Л^саί^οп о! ап епИапсег адошк! су!о!охю Т 1утрИосу!е рерИбе !гот Иитап сагстоетЬгуошс апИдеп. Сапсег Кек. 57, 4570-4577.

Ζ-угоск! А., В1ета! Ж. (2005). Ер1бегта1 дгоу!И !ас!ог гесер!ог т дЛоЬ1ак!ота. РоИа Кеигора!Ио1. 43, 123-132.

ΖеИ Н.1., III, Реггу-Ьа11еу Ό., Циб1еу М.Е., КокепЬегд 8.А., Υ-пд ЕС. (1999). Н1дИ ау1бЛу СТЬк !ог !уо ке1!-ап!1деп8 бетопк!га!е кирепог т уЛго апб ш у1уо ап!1!итог еЛгсасу. 1. Iттипο1. 162, 989-994.

ΖИеп Н.К., Ζΐκ-ιγ X., Ни РХ., Υалд Т.Т., Ре1 Ζ., Ζ^^ ЕК., Ри Л.А., Не Х.8., Ма Р.С., Жапд Х.Ь. (2005). 8шу1ут ехргеккюп апб Лк ге1а!юп уЛИ ргоИЕегаЛоп, арорЮЛк, апб апдюдепекй ш Ьгат дИотак. Сапсег 104, 2775-2783.

ΖΚΐ'ΐβ Ж., Υί Х., Рабаге О., Ь1апд 8.Х., Маг!е1 М., 8сИ\гаг1х Р.Е., Лапд Ζ. (2008). ТИе опсо!е!а1 рго!ет IΜΡ3: а поуе1 Ьютагкег !ог епботе!па1 кегоик сагстота. Ат 1. 8игд Ра!Ио1. 32, 304-315.

ΖИοи К., 8ка1И О. (2000). ТОР-а1рИа бЛЕегеп!1а11у геди1а!ек ОРАР, У1теп!т, апб пек!т депе ехргеккюп 1п и-373 МО дЛоЬ1ак!ота се11к: согге1аИоп уЛИ се11 кИаре апб то!ЛЛу. Ехр. Се11 Кек. 254, 269-278.

Ζ^тте^тап Ь., Рагг В., ЬепбаИ1 и., СипптдИат М., МсКау К., Оаут В., Мапп 1., \аккЛеуа О., МсМаИоп А. (1994). Ыберепбеп! геди1а!огу е1етеп!к т !Ие пек!т депе б1гес! !гапкдепе ехргеккюп !о пеига1 к!ет се11к ог тикс1е ргесигкогк. Кеигоп 12, 11-24.

ΖΗ1 М., 8сИт1б! К.О., СагдюЛ Т.О., АЬообу К.8., В1аск Р.М., Сагго11 К.8. (2006). ОИота-ргобисеб ех1гасе11и1аг та!пх 1пЛиепсек Ьгат !итог !гор1кт о! Иитап пеига1 к!ет се11к. 1. Кеигоопсо1. 79, 125-133.

Ζι.ι1^1 К., Коуак 8., Жукхко Е., Ко11е К., Оаугопкка I., Вагакхе\\'кка МХ., Вагс1кхе\\'кк| 1. (2006). 8ирргеккюп о! Иитап Ьгат !итог уЛИ ЛиеЛсгепсе ККА кресЛгс !ог !епакст-С. Сапсег Вю1. ТИег. 5, 10021007.

Ζи1еукк^ Н., АЬгаИат Е.1., Оег1асИ М.1., Оаше1 Р.В., МогПх Ж., Ми11ег В., \а11е)о М., ТИотак М.К., НаЬепег ЕР. (2001). Ми1!1ро!еп!1а1 пек!т-рокЛ1уе к!ет се11к 1ко1а!еб !гот аби1! рапсгеаЛс 1к1е!к б1!!егепИа!е ех у1уо 1п!о рапсгеаИс епбосгте, ехосгте, апб ИераИс рИепо!урек. О1аЬе!ек 50, 521-533.

- 53 032437

СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ <110> 1штаЬ1сз ЫоЬесйпо1од1ез ОтЬН <120> КОМПОЗИЦИЯ ОПУХОЛЕАССОЦИИРОВАННЫХ ПЕПТИДОВ И ОТНОСЯЩАЯСЯ К НИМ ПРОТИВОРАКОВАЯ ВАКЦИНА ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ГЛИОБЛАСТОМЫ (ОБМ) И ДРУГИХ ВИДОВ РАКА <130> 131773ЕА <150> ЕР08017305.7 <151> 2008-10-01 <150> иБ61/105,928 <151> 2008-10-16 <160> 20 <170> РаЬепЫп -уегз1оп 3.4 <210> 1 <211>9 <212> РКТ <213> Ното зарЧепз <400>1

Тйг МеЬ Беи А1а Агд Беи А1а Бег А1а <210> 2 <211>9 <212> РКТ <213> Ното зарЧепз <400>2

Беи Ткг Рке О1у Азр Уа1 Уа1 А1а Уа1 <210>3 <211>9 <212> РКТ <213> Ното зарЧепз <400>3

Азп Беи Азр Ткг Беи МеЬ Ткг Туг Уа1 <210>4 <211>9 <212> РКТ <213> Ното зарЧепз <400>4

А1а МеЬ Ткг О1п Беи Беи А1а О1у Уа1

- 54 032437 <210>5 <211>9 <212> РНТ <213> Ното зарБепз <400>5

О1у Ьеи Тгр Н1з Н1з О1п Ткг О1и Уа1 <210> 6 <211>9 <212> РНТ <213> Ното зарБепз <400>6

Ьуз 11е О1п О1и 11е Ьеи Ткг О1п Уа1 <210>7 <211>9 <212> РНТ <213> Ното зарБепз <400>7

А1а Ьеи Тгр А1а Тгр Рго 5ег О1и Ьеи <210> 8 <211>17 <212> РНТ <213> Ното зарБепз <400>8

ТЪг Рке 5ег Туг Уа1 Азр Рго Уа1 11е ТЪг 5ег 11е 5ег Рго Ьуз Туг

5 1015

О1у

<210>	9
<211>	9
<212>	РНТ
<213>	Ното	зарБепз
<400>	9
А1а 11е	! 11е	Азр О1у Уа1 О1и 5ег Уа1
1		5

<210>	10
<211>	9
<212>	РНТ

- 55 032437

<213> <400> Ьуз Уа1 1	Ното 10 Рке	зар1епз
А1а О1у 5	11е	Рго	ТЬг	Уа1
<210>	11
<211>	9
<212>	РНТ
<213>	Ното	зар1епз
<400>	11
5ег Ьеи	. Тгр	А1а О1у	Уа1	Уа1	Уа1	Ьеи
1		5
<210>	12
<211>	15
<212>	РНТ
<213>	Ното	зар1епз
<400>	12
ТЪг Ьеи	. О1у	О1и РЬе	Ьеи	Ьуз	Ьеи	Азр
1		5
<210>	13
<211>	10
<212>	РНТ
<213>	Ното	зар1епз
<400>	13
Рке Ьеи	. Рго	5ег Азр	Рке	Рке	Рго	5ег
1		5
<210>	14
<211>	16
<212>	РНТ
<213>	Ното	зар1епз
<400>	14
Азр Азр	, Рго	5ег ТАг	11е	О1и	Ьуз	Ьеи
1		5
<210>	15
<211>	17
<212>	РНТ
<213>	Ното	зар1епз
<400>	15
Азп Ьуз	О1п	Ьуз Рго	11е	ТЬг	Рго	О1и
1		5

О1и Агд А1а Ьуз Азп

Ьуз Азп Ьуз О1п Ьуз Рго

А1а О1и Ьуз Ьеи А1а Агд Азр

- 56 032437

<210>	16
<211>	17
<212>	РКТ
<213>	Ното заргепз

<400> 16

Азп О1у А1а Туг Ьуз А1а 11е Рго Уа1 А1а О1п Азр Ьеи Азп А1а Рго Бег

5 10 15

<210>	17
<211>	15
<212>	РКТ
<213>	Ното	зар1епз
<400>	17
ТЪг Ьеи О1у	О1и Рке Ьеи Ьуз	Ьеи Азр Агд О1и Агд А1а	Ьуз Азр
1		5	10	15

<210>	18
<211>	9
<212>	РКТ
<213>	Ното	зар1епз
<400>	18
Рке ТЪг	О1и	Ьеи ТЪг Ьеи О1у О1и РЪе
1		5

<210>	19
<211>	9
<212>	РКТ
<213>	Ното	зар1епз
<400>	19
Ьеи МеЕ	, Ьеи	О1у О1и РЪе Ьеи Ьуз Ьеи
1		5

<210>	20
<211>	9
<212>	РКТ
<213>	Ното	зар1епз
<400>	20
О1и Ргс	Азр	Ьеи А1а О1п Суз РЪе Туг
1		5

- 57 032437

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Фармацевтическая композиция для лечения или предупреждения рака, характеризующегося присутствием раковых клеток, презентирующих пептид, содержащий аминокислотную последовательность 8Е0 ГО № 1 или 8Е0 ГО № 6, включающая эффективное количество двух пептидов, содержащих аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из 8Е0 ГО № 1 и 8Е0 ГО № 6, и/или двух полинуклеотидов, содержащих нуклеиновую кислоту, кодирующую 8Е0 ГО № 1 и 8Е0 ГО № 6, и фармацевтически приемлемый носитель, где указанный пептид связывается с молекулой главного комплекса гистосовместимости человека (МНС) класса I, где указанный пептид способен стимулировать Тклетки СЭ8.
2. Фармацевтическая композиция по п.1, включающая по меньшей мере один дополнительный опухолеассоциированный пептид, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из 8Е0 ГО № 2 по 8Е0 ГО № 5 и 8Е0 ГО № 7 по 8Е0 ГО № 20, или по меньшей мере один полинуклеотид, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую 8ЕО ГО № 2 по 8ЕО ГО № 5 и 8ЕО ГО № 7 по 8ЕО ГО № 20.
3. Фармацевтическая композиция по п.1 или 2, где пептиды имеют общую длину между 8 и 17 аминокислотами.
4. Фармацевтическая композиция по любому из пп.1-3, где по меньшей мере один пептид включает непептидные связи.
5. Фармацевтическая композиция по любому из пп.1-4, дополнительно включающая по меньшей мере один приемлемый адъювант, выбранный из группы, включающей 1018 ^8, соли алюминия, АтрЕуах, А815, ВСС, СΡ-870,893, СрС7909, СуаА, б8ЫМ, СМ-С8Е, ГО30, ГО31, имиквимод, ^иЕас! IМΡ321, К Ρη!Λ, К^МАТКЕХ, ^иνIттиηе, ЫроУас, МЕ59, монофосфорил липид А, монтанид !М8 1312, монтанид КА 206, монтанид КА 50У, монтанид КА-51, Ο^432, ΟМ-174, ΟМ-197-МΡ-ЕС, ΟΝТАК, векторную систему ΡерТе1, микрочастицы ΡΕΟ, резиквимод, 8КЕ172, вирусомы и другие вирусоподобные частицы, ΥΕ-ΚΟβΕα стимулон Асцнк-Гк 0821, К1Ь1'к Ое!ох, Ошк 8ирегГок, Егеипб'к, холерный токсин, иммунологические адъюванты, МЕ59 и цитокины.
6. Фармацевтическая композиция по п.5, где адъювант выбран из группы, состоящей из колониестимулирующих факторов, таких как гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (СМ-С8Е), или имиквимод или резиквимод.
7. Фармацевтическая композиция по любому из пп.1-6, дополнительно содержащая по меньшей мере одну антигенпрезентирующую клетку.
8. Фармацевтическая композиция по п.7, где антигенпрезентирующая клетка является дендритной клеткой.
9. Фармацевтическая композиция по п.7 или 8, где по меньшей мере одна антигенпрезентирующая клетка:

a) является клеткой с пептидом, введенным импульсным методом, или нагруженная пептидом или

b) включает экспрессионную конструкцию, кодирующую пептид.
10. Фармацевтическая композиция по любому из пп.1-9, где композиция предназначена для внутривенного, внутриартериального, внутрибрюшинного, внутримышечного, внутрикожного, внутриопухолевого, орального, дермального, назального, буккального, ректального, вагинального, ингаляционного или местного введения.
11. Применение фармацевтической композиции по любому из пп.1-10 для лечения или предупреждения рака у пациента.
12. Применение по п.11, где фармацевтическая композиция является противораковой вакциной.
13. Применение по п.12, где рак является раком ротовой полости и глотки, раком пищеварительного тракта, раком толстой кишки, прямой кишки и анального отверстия, раком дыхательных путей, раком груди, раком шейки матки, влагалища и наружных половых органов, раком тела матки и яичника, раком мужских половых путей, раком мочевыводящих путей, раком костной и мягкой ткани и саркомой Капоши, меланомой кожи, меланомой глаза и немеланомным раком глаза, раком головного мозга и центральной нервной системы, раком щитовидной железы и других эндокринных желез, лимфомой Ходжкина, лимфомой не Ходжкина и миеломой, предпочтительно раком почки, колоректальным раком, раком легкого, раком груди, раком поджелудочной железы, раком простаты, раком желудка, гастроинтестинальной стромальной опухолью (СКТ) или глиобластомой.
14. Применение по п.13, где рак является колоректальным раком.

- 58 032437

А*0201/С8Р-001 Α*0201/Ν1_ΘΝ4Χ-001

31.65% 0.02% ц 0.03%

0.06% 0.01% А* 9^ 6.40%

---------------------- Α*0201/ΝΗ3Ν4Χ-001 -----------------------►