TWI533882B - 用於治療胃癌和其他癌症的抗腫瘤相關肽及相關抗癌疫苗組合物 - Google Patents

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Description

用於治療胃癌和其他癌症的抗腫瘤相關肽及相關抗癌疫苗組合物
本發明涉及免疫治療肽及其在免疫療法，特別是癌症免疫療法中的用途。本發明披露了單獨形式的或與其他腫瘤相關肽(刺激抗腫瘤免疫反應疫苗組合物的活性藥物成分)組合形式的腫瘤相關T輔助細胞肽表位。特別是本發明的肽組合物可用於引發胃癌(GC)和其他癌症抗腫瘤免疫反應的疫苗化合物。
為了本發明之目的，所有參考文獻均以完整引用的形式併入本文。
胃癌是惡性細胞在胃壁形成的一種疾病。胃癌可發展於胃部的任何一部分，可能擴散到整個胃部以及其他器官；尤其是食道、肺和肝臟。胃癌是全球第四最常見的癌症，2002年有93萬確診病例。胃癌具有高死亡率(每年~80萬)，使之成為全球僅次於肺癌導致癌症死亡的第二大最常見原因。此病較常見於男性，更常見於亞洲國家和發展中國家。(可從WHO獲取資訊。)
在美國，胃癌約占每年所有新發癌症病例的2%(25500例)，但在其他國家更常見。在韓國，胃癌是位於第一位的癌種，占惡性腫瘤的20.8%。在日本，胃癌仍是男性最常見的癌症。在美國，每年約有8000名男性和13000女性被診斷患有胃癌。大部分為70歲以上。
胃癌是全球第四大常見癌症，僅次於肺癌、乳腺癌、結 腸癌和直腸癌。此外，胃癌仍是第二大最常見癌症死因。據美國癌症協會估計，2007年有一百萬新發病例，其中近70%發生在發展中國家，大約80萬例死亡(參見美國癌症協會的出版物)。javascript：showcontent('active','references')；此疾病的全球發病率中存在巨大的地域差異。該疾病的發病率在亞洲和南美洲部分地區最高，在北美最低。javascript：showcontent('active','references')；根據記錄，該疾病的死亡率在智利、日本、南美和前蘇聯最高。
除了日本通常進行早期檢測外(在韓國以有限的方式進行)，世界大部分地區均不進行篩查，因此，胃癌在得到確診時通常已為晚期。因而，胃癌仍然對醫療保健專業人士帶來重大挑戰。胃癌的危險因素為幽門螺桿菌(H.pylori)感染、吸煙、攝入高量鹽分、以及其他飲食因素。少數胃癌(1%至3%)與胃癌遺傳易感性症候群相關。在彌漫型胃癌常染色體顯性遺傳易感性家族中，大約25%發生E-cadherin基因突變。這一亞群胃癌被稱為遺傳性彌漫性胃癌。12這可能有益於提供遺傳諮詢，並考慮在種系截斷的年輕無症狀攜帶者中進行預防性胃切除術
胃壁由3層組織組成：粘膜(最內)層、肌(中間)層和漿膜(最外)層。胃癌首先發生於粘膜層內壁，隨著生長而擴散至外層。有四種標準治療方法可治療胃癌。胃癌治療方法包括手術、化療、放療或放化療。手術是胃癌的主要治療方法。手術的目的是進行完全切除，並使切緣為陰性(R0切除)。但是，大約有50%局部胃癌不能進行R0切除。R1 切除表示在顯微鏡下可發現殘留癌細胞(切緣陽性)，R2切除表示有肉眼可見的殘留癌細胞，但疾病未有遠處轉移。患者結果取決於診斷時發現的最初期別。(NCCN腫瘤學臨床實踐指南TM)
對於II期疾病的患者，治療性手術切除後的5年生存率為30-50%，III期患者為10-25%。這些患者有局部及全身復發的可能性極高。80-90%的胃癌患者均會發生轉移，在較早期別得到確診的患者中6個月生存率為65%，而在較晚期確診的患者中不到15%。
因此，仍然需要對以下癌症患者實施安全有效的新型治療方案：胃癌、攝護腺(上皮)癌、口腔癌、口腔鱗狀細胞癌(OSCC)、急性髓性白血病(AML)(Qian et al.,2009)、幽門螺旋桿菌引起的MALT淋巴瘤(Banerjee et al.,2000)、結腸(上皮)癌/結直腸癌、膠質母細胞瘤、非小細胞肺癌(NSCLC)、宮頸(上皮)癌、人乳腺癌、攝護腺癌、結腸癌、胰腺癌、胰腺導管腺癌、卵巢癌、肝細胞癌、肝癌、不同表型的腦腫瘤、急性淋巴細胞白血病(ALL)等白血病、肺癌、尤因氏肉瘤、子宮內膜癌、頭頸部鱗狀細胞癌、喉上皮癌、食管癌、口腔(上皮)癌、膀胱癌、卵巢(上皮)癌、腎細胞癌、非典型腦膜瘤、乳頭狀甲狀腺癌、腦腫瘤、涎腺導管癌、宮頸癌、結外型T/NK細胞淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、肺癌和乳腺癌等惡性實體瘤、以及其他腫瘤。還需要在不使用化療藥物或可能導致嚴重副作用的其他藥物的前提下即可提升患者福祉的治療方案。
結直腸癌
根據美國癌症協會的報導，在美國，結直腸癌(CRC)是位於第三位的最常見癌症，每年困擾著超過175,000名新發患者。在美國、日本、法國、德國、義大利、西班牙和英國，每年有超過480,000例患者罹患該疾病。它是發達國家癌症死亡的最常見原因之一。研究表明，結直腸癌的發病是遺傳和環境因素之間相互作用的結果。在大多數病例中，結直腸腫瘤似乎由腺瘤息肉演變而來；但是這個演變過程可能需要很多年。結直腸癌的主要風險因素是年齡，90%的病例在50歲之後診斷患有此病。根據美國癌症協會的報導，結直腸癌的其他風險因素包括飲酒、高脂肪和/或紅色肉類飲食、水果和蔬菜的攝取量不足。結直腸癌的發病率繼續上升，特別是日本等地區，這些地區接受西化飲食，攝入過多的脂肪和肉類而纖維攝入量減少，這些因素可能是罪魁禍首。但是發病率的上升速度比不上以前，這可能是由於進行了更多的篩查和息肉切除從而防止了息肉發展成為癌症。
和大多數實體腫瘤的治療一樣，一線治療為手術治療，然而，手術受益者仍僅限於早期患者，但有很大一部分患者在確診時已是晚期。基於氟尿嘧啶的化療方案是晚期結直腸癌的標準治療。這些治療方案的大多數為所謂的FOLFOX方案(輸注5-FU/亞葉酸+奧沙利鉑)和FOLFIRI(伊立替康、亞葉酸，團注和連續輸注5-FU)方案。
第三代細胞毒素類藥物的引入，如伊立替康和奧沙利 鉑，增加了顯著改善療效的希望，但預後仍較差，轉移癌的存活率一般仍只有大約20個月，因此，治療該疾病的需求仍遠未滿足。
最近出現了新一代藥物，即靶向分子藥物，如阿瓦斯丁(貝伐單抗)和愛必妥(西妥昔單抗)，而且大約有40種針對不同階段結直腸癌的化合物處於後期臨床開發階段。這些化合物中的幾種相結合可增加未來潛在治療選擇的數量。絕大部分藥物都處於開發的第二階段，這些化合物比其他任何藥物都更多地針對促使結直腸癌發展的表皮生長因子受體(EGFR)，這是由於80%以上結直腸癌患者的EGRF表達都上調。
針對II期結直腸患者使用最近批准的單株抗體(mAb)聯合化療(西妥昔單抗+伊立替康或FOLFOX4方案；貝伐單抗單藥或與FOLFOX4方案聯合)的臨床試驗目前正在進行。經過三至四年的觀察，預計這些試驗會得出有統計學意義的結果。
目前腫瘤科所用的單株抗體(mAb)一般都很可能不會干擾積極免疫治療。事實上，有臨床前證據表明，用貝伐單抗去除VEGF是DC-介導的T細胞啟動的積極結果。
攝護腺癌和其他典型腫瘤
據估計，2007年有27050人死於攝護腺癌，它是男性癌症死亡的首要原因。雖然自20世紀90年代初以來，其死亡率在白人和非裔美國男性中一直下降，但是，非裔美國男性的死亡率仍然比白人男性高兩倍以上。攝護腺癌是男性 中最常見的癌症。非裔美國男性的發病率顯著高於白人男性，其原因不明。在過去20年裏，攝護腺癌的發病率發生了很大的變化：在1988-1992年期間迅速上升、1992-1995年期間急劇下降、自1995年以來略有增加。這些趨勢在很大程度上反映了採用攝護腺特異抗原(PSA)血液檢查進行攝護腺癌篩查的增加。過去10年中發病率增加趨緩最有可能是由於在65歲以上的男性中普遍開展PSA篩查。在65歲以上的男性中，攝護腺癌的發病率趨於穩定。在白人男性中，發病率於1992年達到高峰(每100000人男性中有237.6人)，而在非裔美國男性中，於1993年達到高峰(每100000人男性中有342.8人)。
攝護腺癌的治療包括觀察等待、手術、放射治療、高強度聚焦超聲(HIFU)、化療、冷凍手術、激素治療、或以上方法的某些組合療法。哪種方案最佳取決於疾病的階段、Gleason評分和PSA水準。其他重要因素包括男性的年齡、一般健康狀況、以及對潛在治療及其可能副作用的感覺。由於所有的治療均可能有一定的副作用，如：勃起功能障礙和尿失禁，因此治療討論往往注重於治療目標和生活方式改變的風險之間的平衡。
如果癌症已擴散出攝護腺，治療選擇會發生明顯的變化，因此，大多數治療攝護腺癌的醫生使用各種X射斷層照片來預測擴散概率。觀察等待、HIFU、放射治療、冷凍手術和外科手術一般在癌症仍然局限在攝護腺內的男性中進行。激素療法和化療常常在疾病已經擴散出攝護腺的 患者中進行。但是，也有特例：對於一些晚期腫瘤，可使用放射治療，對於一些早期腫瘤，可使用激素治療。如果初始的治療失敗並且癌症進展，也可使用冷凍療法、激素療法、化療。
在因臨床懷疑器官有限生長而接受攝護腺癌根治術的攝護腺癌患者中，很多人的手術準備確診性病理檢驗顯示，局部性擴展腫瘤擴展至器官的邊界之外。這些患者有早期局部復發的高風險，就生化復發而言，由於PSA水準不斷增高，通常可以檢測。在這種情況下的治療性選擇包括外部放療和激素治療；然而，這些治療方法的價值，特別是延長患者的長期存活率方面，不能認為已經得到證實。此外，可能的治療相關併發症，如尿道狹窄的發展(放療)、性欲喪失和陽痿、骨質疏鬆方面的骨骼中鈣鹽降低的風險、以及病理性骨折風險明顯增加(激素消融)，也必須予以考慮。
在所有攝護腺癌中，有90%以上在發現時處於局部性和區域性階段；腫瘤在此階段確診的患者5年相對存活率接近100%。在過去25年中，所有階段腫瘤組合在一起的5年存活率從69%上升至接近90%。根據最新的資料，10年相對存活率為93%，15年相對存活率為77%。存活率，特別是5年存活率的巨大提升，部分歸因於早期診斷和治療的改進。但是，在腫瘤擴散至其他組織和器官後，患者的存活率顯著下降。
肺癌
2007年美國預計新發病例為21萬例，約占確診癌症病例的15%。男性發病率顯著下降，從1984年的每10萬人102例高點，下降到2003年的78.5例。在女性中，這一發病率在一段長期的增長之後正趨向於平穩。為了治療之目的，臨床上肺癌分為小細胞肺癌(13%)和非小細胞肺癌(87%)。
在男性和女性中，癌症相關死亡的大多數均為肺癌。據估計，2007年有16.039萬人死亡，約占所有癌症死亡人數的29%。自1987年以來，每年死於肺癌的女性多於乳腺癌患者。從1991年至2003年，男性的死亡率持續下降，每年約下降1.9%。女性肺癌死亡率在連續增長幾十年後正趨於平穩。肺癌死亡率的這些趨勢反映了過去30年吸煙率的下降。
治療選擇根據癌症的類型(小細胞和非小細胞肺癌)和階段進行確定，包括手術、放療、化療、靶向生物治療，如貝伐單抗(Avastin®)和埃羅替尼(Tarceva®)。對於局部癌，通常選擇外科手術治療。最近的研究表明，手術隨後化療可提高早期非小細胞肺癌的存活率。由於該疾病在發現時通常已經擴散，因此，常常使用放射和化療，有時與手術聯合使用。單一化療或放化療結合是治療小細胞肺癌的通常選擇；採用這一方案，有很大比例的患者獲得緩解，在一些病例中，緩解為持久緩解。
肺癌的1年相對存活率在1975-1979年期間為37%，至2002年，略上升至42%，這主要是由於手術技術的改進和組合療法的使用。然而，所有階段的肺癌組合在一起，5 年存活率僅為16%。對於疾病在檢出時仍為局部性的病例，存活率為49%；但是僅有16%的肺癌在此早期得到確診。
因此，對於膠質母細胞瘤、攝護腺腫瘤、乳腺癌、食管癌、結直腸癌、透明細胞腎細胞癌、肺癌、中樞神經系統腫瘤、卵巢癌、黑色素瘤、胰腺癌、鱗狀細胞癌、白血病和髓母細胞瘤以及表現出過量表達生存素的其他腫瘤仍然需要有效且安全的新治療方案，從而在不使用化療藥物或其他可能導致嚴重副作用的藥物的情況下，增強患者的安康。
除非另有說明，否則本文使用的所有術語定義如下。本文所用「肽」這一術語，系指一系列氨基酸殘基，通常以α-氨基酸與相鄰氨基酸的羰基團之間的肽鍵相互連接。這些肽的長度優選為9個氨基酸，但至短可為8個氨基酸長度，至長可為10、11、12、13、14、15、16、17、或18個氨基酸長度。
本文所用「寡肽」這一術語，系指一系列氨基酸殘基，通常以α-氨基酸與相鄰氨基酸的羰基團之間的肽鍵相互連接。寡肽的長度對於本發明來說並不十分關鍵，只要在寡肽中保持正確的表位即可。通常，寡肽長度約小於30個氨基酸殘基，約長於14個氨基酸。
「多肽」這一術語系指一系列氨基酸殘基，通常以α-氨基酸與相鄰氨基酸的羰基團之間的肽鍵相互連接。多肽的長度對於本發明來說並不十分關鍵，只要保持正確的表位即可。與術語肽或寡肽相對，「多肽」這一術語是指包含多於約30個氨基酸殘基的分子。
肽、寡肽、蛋白質或編碼此類分子的核苷酸如果能誘導免疫反應，則具有「免疫原性」(因此是本發明中的一種「免疫原」)。在本發明的情況下，免疫原性的更具體定義是誘導T細胞反應的能力。因此，「免疫原」是一種能夠誘導免疫反應的分子，並且在本發明的情況下，是一種能誘導T細胞反應的分子。
T細胞「表位」要求的是一種結合至MHC I或II類受體上的短肽，從而形成一種三元複合體(MHC I類α鏈、β-2-微 球蛋白和肽)，其可由載有以相應親和力結合至MHC/肽複合體的匹配T細胞受體的一種T細胞進行識別。結合至MHC I類分子的肽的典型長度為8-14個氨基酸，最典型為9個氨基酸長度。與MHC-II類分子結合的T細胞表位通常長度為12-30個氨基酸。對於表位結合至MHC II類分子的情況，同一個肽與相應的T細胞表位可共用一個共同的核心節段，但是由於核心序列的氨基末端上游和核心序列的羧基端下游的側翼序列分別具有不同的長度，因而總體長度不同。MHC II類受體具有更開放的構造，結合至MHC II類受體上的肽相應地不完全埋於MHC II類分子的肽結合槽裂結構中，這是因為它們位於MHC I類分子的肽結合槽裂之中。出人意料的是，對於根據SEQ ID NO：1的肽，情況並非如此，因為肽長度的微小差異會導致活性的極度降低(見下文)。
在人類中，有三種編碼MHC I類分子的不同基因位點(人MHC分子也是指定的人白血球抗原(HLA))：HLA-A、HLA-B和HLA-C。HLA-A*01、HLA-A*02和HLA-A*11是可從這些基因位點表達的不同MHC I類等位元基因的實例。
MHC II類基因的人基因組有三種不同基因位點：HLA-DR、HLA-DQ和HLA-DP。MHC II類受體是異源二聚體，包含一個α鏈和一個β鏈，兩者均通過跨膜區在細胞膜中錨定。HLA-DRB1*04和HLA-DRB1*07是兩種不同的MHC II類β等位基因的例子，它們已知在這些位元點被編碼。II類 等位基因具有很高的多態性，例如，已經描述的有數百種不同的HLA-DRB1等位基因。對於HLA-A*02和最常見的HLA-DR血清類型，不同人群中的表達頻率如表2所示。
表3：提供了HLA-A*024和HLA*A02402血清類型的表達頻率F。頻率根據Mori等人(Mori et al.,1997)使用的Hardy-Weinberg公式F=1-(1-Gf)2改編，從美國人群範圍內的單體型頻率中推導出。有關詳細資訊，請參閱Chanock等人的文獻(Chanock et al.,2004).
因此，為了治療和診斷目的，與數種不同的HLA II類受體以合適的親和力結合的肽是非常理想的。與數種不同的HLA II類分子結合的肽被稱為混雜結合劑。
本文提到的DNA序列既包括單鏈DNA也包括雙鏈DNA。因此，除非本文另有所指，否則具體的序列是該序列的單鏈DNA、該序列與其互補序列的雙工(雙鏈DNA)以及該序列的互補序列。術語「編碼區」系指在自然基因組環境中自然或正常編碼基因表達產物的該基因部分，即，體內編碼該基因的天然表達產物的區域。
編碼區可來自正常基因、突變基因或異常基因，甚至還可以來自DNA序列，完全可在實驗室中使用本領域熟知的DNA合成方法合成。
術語「核苷酸序列」系指去氧核苷酸的雜聚物。
編碼特定肽、寡肽或多肽的核苷酸序列可為天然核苷酸序列，也可為合成核苷酸序列。一般來說，編碼肽、多肽以及本發明蛋白的DNA片段由cDNA片段和短寡核苷酸銜接物，或一系列寡核苷酸組成，以提供一種合成基因，該基因能夠在包含源自微生物或病毒操縱子的調節元素的重組轉錄單元中被表達。
術語表達產物摂系指多肽或蛋白，它是基因序列和任何核酸序列的翻譯產物，這些序列編碼遺傳密碼退化所造成的同等物，從而編碼同樣的氨基酸。
「片段」這一術語，當指的是一種編碼序列時，表示包含非完整編碼區的DNA的一部分，其表達產物與完整編碼區表達產物基本上具有相同的生物學功能或活性。
術語「DNA片段」系指一種DNA聚合物，以單獨的片段形式或一種較大DNA結構的組分形式存在，它們至少從分離過一次的DNA中以基本純淨的形式獲得，即，未污染內源性材料並且其數量或濃度使得能使用標準生化方法(如，使用複製載體)識別、處理和回收片段及其組分核苷酸序列准。此等片段以開放閱讀框架(未被內部未翻譯序列打斷)或內含子(通常存在於真核基因中)的形式存在。未翻譯DNA序列可能存在於開放閱讀框架的下游，在那裏其不會干預編碼區的操縱或表達。
術語「引物」表示一種短核酸序列，可配有一個DNA鏈，並在DNA聚合酶開始合成去氧核糖核酸鏈的地方含有 一個游離的3'OH端。
術語「啟動子」表示參與RNA聚合酶的結合從而啟動轉錄的DNA區域。
術語「分離」表示一種物質從其原來的環境(例如，如果是天然發生的則是天然環境)中被移走。例如，活體動物中的天然核苷酸或多肽不是分離的，但是，從天然系統中一些或所有共存物質中分離出來的核苷酸或多肽是分離的。此類多核苷酸可能是載體的一部分和/或此類多核苷酸和多肽可能是一種組合物的一部分，並且由於該載體或組合物不是其天然環境的一部分，因此它仍然是分離的。
本發明中披露的多核苷酸和重組或免疫原性多肽也可能以「純化」的形式存在。術語「純化」並非要求絕對的純度；它只是一個相對的定義，可以包括高度純化或部分純化的製劑，相關領域技術人員能理解這些術語。例如，各個從已用傳統方法純化為具有電泳同質性的cDNA庫中分離出的各種複製物。明確考慮到將起始材料或天然物質純化至少一個數量級，優選為兩或三個數量級，更優選為四或五個數量級。此外，明確考慮到所述多肽的純度優選為99.999%，或至少為99.99%或99.9%；甚而適宜為以重量計99%或更高。
根據本發明披露的核酸和多肽表達產物，以及包含此類核酸和/或多肽的表達載體可能以「濃縮的形式」存在。本文中所使用的術語「濃縮」系指材料的濃度至少是其自然濃度的大約2、5、10、100或1000倍，更方便地來說， 即按體重計為0.01%，優選為至少0.1%。也明確考慮到，按重量計約為0.5%、1%、5%、10%和20%的濃縮製劑。序列、構型、載體、複製物以及包含本發明的其他材料可有優勢地以濃縮或分離的形式存在。
「活性片段」這一術語是指產生免疫反應的片段(即具有免疫原性活性)，不論是單獨或可選地與合適的佐劑一起給予一種動物，比如哺乳動物，例如兔子或小鼠，也包括人；這種免疫反應採用的形式是在接受動物(如：人)體內刺激T細胞反應。或者，「活性片段」也可用於誘導體外T細胞反應。
本文中所使用的術語「部分」(portion)、「段」(segment)、「片段」(fragment)，如果與多肽相關，指的是殘基的連續序列(如：氨基酸殘基)，其序列是構成較大序列的一部分。例如，如果一個多肽以任一種肽鏈內切肽酶(如胰蛋白酶或糜蛋白酶)進行處理，則該處理獲得的寡肽會代表起始多肽的部分、節段或片段。這表示，任何此類片段必定包含與SEQ ID NO：1至20序列基本相同(如果不是完全相同)的一個節段、片段或部分作為其氨基酸序列的一部分，其對應於SEQ ID NO：1至20的天然蛋白或「親本」蛋白。當與多核苷酸相關地使用時，這些術語系指用任何共同核酸內切酶處理所述多核苷酸產生的產物。
根據本發明，術語百分比同一度摂或百分比同一摂，如果指的是序列，則表示在擬對比序列(對比序列摂)與所述序列或權利要求的序列(參考序列摂)排隊比對後，把一種 序列與所述序列或權利要求的序列進行比較。然後根據下列公式計算等同度百分比：等同度百分比=100[I-(C/R)]
其中C是參考序列與被對比序列之間對準長度上參考序列與被對比序列之間的差異數量，其中(i)參考序列中每個堿基或氨基酸序列在被對比序列中沒有對應的對準堿基或氨基酸；(ii)參考序列中每個空隙，以及(iii)參考序列中每個對準堿基或氨基酸與被比對比序列中對準堿基或氨基酸不同，即構成一個差異；並且R是參考序列與被對比序列對準長度上在參考序列中產生任何空隙也計算為一個堿基或氨基酸的參考序列中的堿基或氨基酸數目。
如果「被對比序列」和「參考序列」之間存在的一個對準按上述計算的等同度百分比大致等於或大於指定的最低等同度百分比，則被對比序列與參考序列具有指定的最低等同度百分比，雖然可能存在按本文上述計算的等同度百分比低於指定等同度百分比的對準。
如果無另有說明，那麼本文公開的原始肽可以通過在肽鏈內的不同(可能為選擇性)位點上取代一個或多個殘基而被修飾。此取代可能是保守性的，例如，其中一個氨基酸被具有類似結構和特點的另一個氨基酸所取代，比如其中一個疏水性氨基酸被另一個疏水性氨基酸取代。更保守的取代是具有相同或類似的大小和化學性質的氨基酸間的取 代，例如，亮氨酸被異亮氨酸取代。在天然同源蛋白質家族序列變異的研究中，某些氨基酸的取代往往比其他氨基酸更具有耐受性，這些氨基酸往往表現出與原氨基酸的大小、電荷、極性和疏水性之間的相似性相關，這是確定「保守取代」的基礎。
在本文中，保守取代定義為在以下五種基團之一的內部進行交換：基團1-小脂肪族、非極性或略具極性的殘基(Ala,Ser,Thr,Pro,Gly)；基團2-極性、帶負電荷的殘基及其醯胺(Asp,Asn,Glu,Gln)；基團3-極性、帶正電荷的殘基(His,Arg,Lys)；基團4-大脂肪族非極性殘基(Met,Leu,Ile,Val,Cys)以及基團5-大芳香殘基(Phe,Tyr,Trp)。
較不保守的取代可能涉及一個氨基酸被另一個具有類似特點但在大小上有所不同的氨基酸所取代，如：丙氨酸被異亮氨酸殘基取代。高度不保守的取代可能涉及一個酸性氨基酸被另一個具有極性或甚至具有鹼性性質的氨基酸所取代。然而，這種「激進」取代不能認為是無效的而不予考慮，因為化學作用是不完全可預測的，激進的取代可能會帶來其簡單化學原理中無法預見的偶然效果。
當然，這種取代可能涉及普通L-氨基酸之外的其他結構。因此，D-氨基酸可能被本發明的抗原肽中常見的L-氨基酸取代，也仍在本公開的範圍之內。此外，具有非標準R基團的氨基酸(即，除了天然蛋白的20個常見氨基酸之外的R基團)也可以用於取代之目的，以生產根據本發明的免 疫原和免疫原性多肽。
如果在一個以上位置上的取代發現導致肽的抗原活性基本上等於或大於以下定義值，則對這些取代的組合進行測試，以確定組合的取代是否產生對肽抗原性的疊加或協同效應。肽內被同時取代的位置最多不能超過4個。
術語「T細胞反應」是指由一種肽在體外或體內誘導的效應子功能的特異性擴散和啟動。對於MHC I類限制性CTL，效應子功能可能為溶解肽脈衝的、肽前體脈衝的或天然肽呈現的靶細胞、分泌細胞激素，優選為肽誘導的干擾素-γ、TNF-α或IL-2，分泌效應分子、優選為肽或脫顆粒作用誘導的顆粒酶或穿孔素。對於MHC II類限制輔助性T細胞效應子功能可能為肽誘導的細胞激素分泌，優選為，IFN-γ、TNF-α、IL-4、IL5、IL-10或IL-2或肽誘導的脫顆粒作用。CTL和輔助性T細胞的可能效應子功能不僅限於此列表所述功能。
免疫治療方法
是否能刺激免疫反應取決於是否存在被宿主免疫系統視為異物的抗原。發現腫瘤相關抗原的存在增加了運用宿主免疫系統干預腫瘤生長的可能性。對於癌症免疫療法，目前正在探索控制免疫系統中的體液和細胞免疫的各種機制。
細胞免疫反應的特定元素能特異性地識別和破壞腫瘤細胞。從腫瘤浸潤細胞群或外周血中分離出的細胞毒性T-細胞(CTL)表明，這些細胞在癌症的天然免疫防禦中發揮了 重要作用。特別是CD8陽性T細胞在這種反應中發揮重要作用，TCD8+能識別細胞液8至10個源自蛋白或缺損核糖體產物(DRIPS)(Schubert U,Antón LC,Gibbs J,Norbury CC,Yewdell JW,Bennink JR.；Rapid degradation of a large fraction of newly synthesized proteins by proteasomes；Nature 2000；404(6779)：770-774)的殘基中載有主要組織相容性複合體(MHC)的肽中所含的I類分子。人MHC分子也稱為人白血球-抗原(HLA)。
MHC分子有兩類：MHC-I類分子，在細胞核呈現因主要內源性、細胞質或細胞核蛋白質、DRIPS和較大肽蛋白裂解產生的肽的細胞上都能發現此類分子。然而，源自內體結構或外源性來源的肽也經常在MHC-I類分子上發現。這種I-類分子非經典呈現方式在文獻中被稱為交叉呈現。MHC-II類分子，主要發現於專職抗原呈現細胞(APC)上，並主要呈現內吞作用過程中被APC攝取並且隨後進行加工的外源性蛋白肽。對於I-類分子，抗原加工的其他方法描述為：其允許MHC-II類分子呈現來自外源性肽(如：自吞作用)。肽和MHC-I類分子的複合物由CD8陽性細胞毒性T淋巴細胞的相應TCR識別，而肽和MHC-II類分子的複合物由CD4陽性輔助T細胞的相應TCR識別。
CD4陽性輔助T細胞在安排抗腫瘤T細胞反應的效應子功能中發揮重要作用，因此，腫瘤相關抗原(TAA)衍生的CD4陽性T細胞表位元的識別對開發能引發抗腫瘤免疫反應的藥物可能非常重要(Gnjatic,S.,D.Atanackovic,E. Jäger,M.Matsuo,A.Selvakumar,N.K.Altorki,R.G.Maki,B.Dupont,G.Ritter,Y.T.Chen,A.Knuth,and L.J.Old.Survey of naturally occurring CD4+T-cell responses against NY-ESO-1 in cancer patients：Correlation with antibody responses.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.2003,100(15)：8862-7)。CD4+T細胞可局部提高IFN-γ的水準。
哺乳動物(如小鼠)模型顯示，即使沒有細胞毒性T淋巴細胞(CTL)效應細胞(如，CD8陽性T淋巴細胞)，CD4陽性T細胞也能通過分泌干擾素-γ(IFN γ)抑制血管生成，從而抑制腫瘤的出現(Qin,Z.and T.Blankenstein.CD4+ T-cell--mediated tumor rejection involves inhibition of angiogenesis that is dependent on IFN gamma receptor expression by nonhematopoietic cells.Immunity.2000,12：677-686)。此外，研究還顯示，CD4陽性T細胞可識別HLA-II類分子所呈現的腫瘤相關抗原中的肽，這樣可通過誘導抗體(Ab)反應而阻止腫瘤進展(Kennedy,R.C.,M.H.Shearer,A.M.Watts,and R.K.Bright.CD4+ T lymphocytes play a critical role in antibody production and tumour immunity against simian virus 40 large tumour antigen.Cancer Res.2003,63：1040-1045).與腫瘤相關肽和HLA-I類分子相結合相比較而言，迄今只對TAA的少量II類配體有過描述(www.cancerimmunity.org，www.syfpeithi.de)。
由於HLA II類分子的組成性表達通常僅限於免疫系統的細胞，因此，直接從原發腫瘤中分離II類肽被認為是不可 能的事。然而，發明家最近成功地在腫瘤中直接識別了MHC-II類表位(EP 1642905,EP 1760088；Dengjel J,Nastke MD,Gouttefangeas C,Gitsioudis G,Schoor O,Altenberend F,Müller M,Krämer B,Missiou A,Sauter M,Hennenlotter J,Wernet D,Stenzl A,Rammensee HG,KlingelK,Stevanovi S.；Unexpected abundance of HLA class II presented peptides in primary renal cell carcinomas；Clin Cancer Res.2006；12：4163-4170).
在沒有炎症的情況下，MHC II類分子的表達主要局限於免疫系統細胞，尤其是專業抗原呈現細胞(APC)，例如，單核細胞、單核細胞源性細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞。令人吃驚的是，在腫瘤患者的腫瘤細胞中發現有MHC-II類分子的表達(Dengjel J,Nastke MD,Gouttefangeas C,Gitsioudis G,Schoor O,Altenberend F,Müller M,Krämer B,Missiou A,Sauter M,Hennenlotter J,Wernet D,Stenzl A,Rammensee HG,Klingel K,Stevanovi S.；Unexpected abundance of HLA class II presented peptides in primary renal cell carcinomas；Clin Cancer Res.2006；12：4163-4170)
對於觸發(引發)細胞免疫反應的肽，它必須與MHC分子結合。這一過程依賴於MHC分子的等位基因以及肽氨基酸序列的特異性多態性。MHC-I類-結合肽的長度通常為8-10個氨基酸殘基，並且在其與MHC分子相應結合溝槽相互作用的序列中通常包含兩個保守殘基(「錨」)。這樣，每個 MHC的等位基因都有「結合基序」，從而確定哪些肽能與結合溝槽特異性結合(Rammensee HG,Bachmann J,Stevanovic S.MHC ligands and peptide motifs,Landes Bioscience,USA,1997)。
在MHC依賴性免疫反應中，肽不僅必須能與腫瘤細胞表達的某些MHC分子結合，而且它們還必須能被T細胞特異性T細胞受體(TCR)識別。
腫瘤特異性T淋巴細胞識別的抗原，也就是說，它們的表位，可以是所有蛋白質類中的分子，如，酶、受體、轉錄因子等。此外，腫瘤相關抗原也可以只存在於腫瘤細胞中，如突變基因產物中。另一種重要的腫瘤相關抗原是組織特異性抗原，如，表達於不同類型腫瘤和健康睾丸組織中的癌睾丸(CT)抗原。
多種腫瘤相關抗原已經得到確定。此外，在識別其他腫瘤相關抗原方面也做了大量研究。有些腫瘤相關抗原，在本領域中也稱作腫瘤特異性抗原，具有組織特異性。例子包括但(不僅限於)黑色素瘤的酪氨酸酶、攝護腺癌的PSA和PSMA、淋巴瘤中諸如bcr/abl的染色體交叉(易位)部位。但是，許多得到確定的腫瘤相關抗原出現於多種類型腫瘤中，有些抗原，如，實際上導致轉化事件的致癌蛋白和/或腫瘤抑制基因(腫瘤抑制基因是Linehan WM,Walther MM,Zbar B關於腎癌綜述The genetic basis of cancer of the kidney.J Urol.2003 Dec；170(6Pt1)：2163-72中所提及的)幾乎出現於所有類型腫瘤中。例如，控制細胞生長和 分化的正常細胞蛋白，如p53(一種腫瘤抑制基因)、ras、c-met、myc、pRB、VHL和HER-2/neu可累積突變，導致這些基因產物的表達上調，從而致癌{McCartey1998}(McCartey et al.Cancer Research,1998,15：58 2601-5；Disis et al.Ciba Found.Symp.1994,187：198-211)。這些突變蛋白也可是多種癌症的腫瘤特異性免疫反應的一個標靶。
癌症患者免疫治療的目標是特異性啟動免疫系統細胞，特別是作用於腫瘤細胞而不作用于健康組織的所謂細胞毒性T細胞(CTL，稱為「殺手細胞」、也稱為CD8陽性T細胞)。腫瘤細胞因表達腫瘤相關蛋白而與健康細胞不同。細胞表面的HLA分子將細胞內容物呈現出細胞外，從而使細胞毒性T細胞辨別出健康細胞和腫瘤細胞。這通過把細胞內的所有蛋白分解為短肽，然後再粘附到HLA分子並呈現到細胞表面上而實現(Rammensee et al.,1993)。呈現於腫瘤細胞但在人體健康細胞上沒有或少得多的肽稱為腫瘤相關肽(TUMAP)。
對於被細胞毒性T淋巴細胞識別為腫瘤特異性抗原或相關性抗原以及用於治療的蛋白質，必須具備特殊的條件。該抗原應主要由腫瘤細胞表達，而正常健康組織根本不表達或表達數量較少。更為適宜的情況是，該相應抗原不僅出現於一種腫瘤中，而且濃度(即每個細胞的相應肽拷貝數目)高。腫瘤特異性抗原和腫瘤相關抗原通常是源於由於細胞週期調控或凋亡等功能在正常細胞轉化為腫瘤細胞中直接受累的蛋白。另外，這些直接導致轉化事件的蛋白 的下游靶標可能會被上調，因此可能與腫瘤間接相關。這些間接腫瘤相關抗原也可能是預防接種方法的靶標。在這兩種情況中，存在抗原氨基酸序列的表位都至關重要，所以這種來自腫瘤相關抗原的肽(「免疫原性肽」)可導致體外或體內T細胞反應。
基本上，任何能與MHC分子結合的肽都可能充當一個T細胞表位。誘導體外或體內T細胞反應的前提是存在有著相應TCR的T細胞並且沒有這個特定表位的免疫耐受性。輔助T細胞在編排抗腫瘤免疫的CTL效應子功能中發揮著重要作用。觸發TH1細胞反應的輔助T細胞表位支援CD8陽性殺傷T細胞的效應子功能，其中包括直接作用於腫瘤細胞的細胞毒性功能(該類腫瘤細胞表面顯示有腫瘤相關肽/MHC複合物)。這樣，腫瘤相關T輔助細胞表位單獨使用或與其他腫瘤相關肽結合使用可作為刺激抗腫瘤免疫反應的疫苗化合物的活性藥物成分。
由於CD8及CD4依賴型反應共同和協同促進抗腫瘤作用，因此，CD8+CTL(MHC-I分子)或CD4陽性CTL(MHC-II類分子)對腫瘤相關抗原的識別和鑒定對開發腫瘤疫苗非常重要。因此，提出含有與任一類MHC複合體結合的肽組合物是本發明的一個目標。
使用腫瘤相關肽進行的臨床試驗由Boon及其同事在20世紀90年代中期開始進行，主要針對黑色素瘤。試驗的最佳臨床有效率為10%至30%。使用基於肽的疫苗單一治療的任何臨床試驗中，都未曾報告有嚴重的副作用或嚴重的自 身免疫性。用黑色素瘤相關肽治療的一些患者報告有輕度的白斑症。
但是，使用一種CTL通常不足以消滅所有腫瘤細胞。腫瘤具有很強的誘變性，能快速對CTL的攻擊作出反應，通過改變CTL的蛋白質模式以逃避被CTL識別。為了反擊腫瘤逃逸機制，在接種疫苗中，運用各種特異性肽。這樣，可同時使用數種CTL複製物對腫瘤進行廣泛的同時攻擊。這可能會減少腫瘤逃避免疫反應打擊的機會。這一假設最近已經在治療晚期黑色素瘤患者的一項臨床研究中得到證實。除了少數情況之外，至少有三次不同T細胞反應的患者顯示出客觀的臨床有效率或穩定的病情(Banchereau et al.,2001)以及生存期延長(與J.Banchereau私下交流結果)，但絕大多數少於三次T細胞反應的患者診斷患有進展性疾病。
申請人的一項研究顯示，當使用一種由13種不同肽組成的疫苗接種腎細胞癌患者時，得到了類似結果(H.Singh-Jasuja,S.Walter,T.Weinschenk,A.Mayer,P.Y.Dietrich,M.Staehler,A.Stenzl,S.Stevanovic,H.Rammensee,J.Frisch；Correlation of T-cell response,clinical activity and regulatory T-cell levels in renal cell carcinoma patients treated with IMA901,a novel multi-peptide vaccine；ASCOMeeting 2007 Poster # 3017；M.Staehler,A.Stenzl,P.Y.Dietrich,T.Eisen,A.Haferkamp,J.Beck,A.Mayer,S.Walter,H.Singh,J.Frisch,C.G.Stief；An open label study to evaluate the safety and immunogenicity of the peptide based cancer vaccine IMA901,ASCO meeting 2007；Poster # 3017)。
因此，開發一種腫瘤疫苗的主要任務不僅要識別和鑒定新型腫瘤相關抗原及其免疫原T輔助表位元，而且還要組合不同抗原表位元以增加每位患者對一種以上表位產生反應的可能性。因此，本發明的一個目標是提出有能力與人主要組織相容性複合體(MHC)I(HLA-I)或II(HLA-II)類分子結合的肽氨基酸序列的組合物。本發明的另一目標是提出一種基於肽組合物的有效抗癌疫苗。
在本發明中，發明人分離和描述了與直接來自於哺乳動物腫瘤(主要為胃癌患者的原發樣本)中的HLA-I或II類分子結合的肽，腫瘤樣本還包括膠質母細胞瘤、結直腸癌、腎細胞癌、肺癌、胰腺癌、惡性黑色素瘤和胃癌的原發組織樣本。
本發明提出了這樣的肽：它們來源於致瘤相關抗原並且有能力與MHC(HLA)-II類分子充分結合，觸發人白血球免疫反應，特別是淋巴細胞、T淋巴細胞、CD4陽性T淋巴細胞、介導Th1型免疫反應的CD4陽性T淋巴細胞。
本發明還提出了這樣的肽：它們來源於致瘤相關抗原，並且有能力與MHC(HLA)-I類分子充分結合，觸發人白血球免疫反應，特別是淋巴細胞、T淋巴細胞、CD8陽性細胞毒性T淋巴細胞以及對癌症患者接種疫苗有益的兩種肽的組合物。
根據本發明，其目標通過這樣方式達成：提供了一種至少有兩種肽組成的藥物組合物，這兩種肽含有從SEQ ID NO 1至SEQ ID NO 10組成的基團中所選的氨基酸序列、和/或含有與SEQ ID NO 1至SEQ ID NO 10組成的基團85%同源的一個變異氨基酸序列，和/或含有編碼為SEQ ID NO 1至SEQ ID NO 10核酸的多聚核苷酸或變異氨基酸序列，以及藥用載體。同時，本發明的藥物組合物還可包括至少這樣一種額外的肽：它含有從SEQ ID NO 11至SEQ ID NO：22組成的基團中所選的氨基酸序列、或含有與SEQ ID NO 11至SEQ ID NO：22組成的基團85%相同的一個變異氨基酸序列，或含有編碼為SEQ ID NO11至SEQ ID NO：22核酸的多聚核苷酸核酸或變異氨基酸序列。這些肽的總長度可為8至100個氨基酸、優選為8至30個氨基酸，最優選為8至17個氨基酸。這些肽也可含有非肽鍵。
如下文所述，構成本發明基礎的肽都被確定為MHC-I類或II類承載細胞所呈現的肽。因此，這些特殊肽以及其他含有序列的肽(即衍生肽)都能引發特異性T細胞反應，雖然其誘導的反應程度可能會因不同的肽和患者而不同。差異可能因肽的突變等原因造成。本領域技術人員熟知可應用於確定各個肽誘導反應程度的方法，特別是參照本文實施例和有關文獻後。
優選情況是，發明中的變體可誘導T細胞與發明中各個肽發生交叉反應。
肽來源於腫瘤相關抗原，特別是具有蛋白酶解、血管生 成、細胞生長、細胞週期調控、細胞分裂、轉錄調控、翻譯調控、組織侵襲等功能的腫瘤相關抗原。表4描述了這些肽及生成這些肽的蛋白的功能。
細胞分裂週期2蛋白(CDC2)
CDC2，也稱為p34cdc2或Cdk1(細胞週期蛋白依賴性激酶1)，屬於絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族Cdk，在細胞週期調控中發揮著關鍵作用。他是細胞從G2期至M期轉換的主要調節基因。在間期結束時，他通過與A型細胞週期蛋白結合被啟動並促進有絲分裂發生。核膜破裂後，A型細胞週期蛋白退化並被B型細胞週期蛋白取代。CDC2和cyclinB之間的複合體形成有絲分裂促進因子(MPF)，這對於促進細胞完成有絲分裂至關重要。
活性CDC2可使70多種受質磷酸化。例如，「連接分子」組蛋白H1的磷酸化可導致染色質結構鬆散以及特定基因的轉錄，RNA聚合酶II的磷酸化增強轉錄(Cisek and Corden,1989)。BRCA2的磷酸化刺激同源性重組依賴性修復(Esashi et al.,2005)，FOXO1的磷酸化抑制其轉錄活性，導致細胞增殖和存活。分離酶的磷酸化抑制姐妹染色單體過早分離(Stemmann et al.,2001)。由於細胞分裂後期促進複合體(APC/C)使細胞週期蛋白B泛素化，因此在後期CDC2活性再次被切斷，導致其降解。
CDC2在有絲分裂的功能不具有冗餘性，因此其他Cdk(如Cdk2、4和6)的活性不能對其進行補償。與此相反，據報導，CDC2在細胞週期的其他期別(如G1/S轉換期)行使功能，並能夠替代「相間激酶」。因此，有人提出CDC2是細胞週期的唯一基本Cdk。
除了該基因在細胞週期中的表達和功能，據報導，在某些情況下，CDC2在細胞凋亡的條件下表達，並且活性增強可導致有絲分裂災變。在多種癌症中發現有CDC2過量表達，雖然其他細胞週期蛋白(如cyclin)的表達失調更加頻繁。過量表達CDC2的癌症類型包括攝護腺癌、口腔癌、口腔鱗狀癌(OSCC)、急性髓性白血病(AML)(Qian et al.,2009)，幽門螺旋桿菌引起的MALT淋巴瘤(Banerjee et al.,2000)和結腸癌(Yasui et al.,1993)。在一些情況下，過量表達與預後差相關。在胃癌(GC)中，已報告有過量表達和/或活性增強(14/23例)，表明CDC2表達可以發揮致病作用。此外，CDC2被認為屬於一種有絲分裂過程中具有活性的一組基因，如果過量表達，則導致腫瘤的染色體不穩定。CDC2和其他Cdk的抑制劑被視為癌症治療的候選藥物(Shapiro,2006)。
異常紡錘狀小頭畸形相關蛋白(ASPM)
異常紡錘狀小頭畸形相關(ASPM)基因是果蠅異常紡錘(asp)蛋白的人直系同源基因，也是常染色體隱性原發性小頭畸形的最常見突變基因。在人中，ASPM純合突變引起的缺陷性神經形成導致小頭症和智力遲鈍。
原發性常染色體隱性小頭畸形(MCPH)最常見的原因似乎是參與神經形成調節的ASPM基因發生突變。ASPM在有絲分裂期間位於紡錘體兩極。
siRNA介導的抑制而對ASPM的抑制性抑制了腫瘤細胞增殖和神經幹細胞增殖，這為ASPM是膠質母細胞一個潛 在分子靶點提供了支援。相對于正常大腦，ASPM在膠質細胞瘤中呈過量表達。ASPM的表達可作為惡性膠質瘤的一個標誌物，代表一個潛在的治療靶點。不論p53的突變狀態和腫瘤期別如何，ASPM過量表達都是一種預測肝細胞癌(HPC)侵襲性/轉移可能性增加、腫瘤早期復發(ETR)高風險的分子標誌物，因此預後差。ASPM在永生細胞、癌細胞和非小細胞肺癌(NSCLC)組織中表達上調(Jung et al.,2009)。
泛素羧基末端水解酶L5(UCHL5)
泛素羧基末端水解酶15(UCHL5)，也稱為泛素C-末端水解酶(UCH37)或INO80R，是與蛋白酶體相關的脫泛素酶。他通過切割C-端Cys76和Lys48之間的異肽鍵而使蛋白連接多聚泛素鏈與遠端分開(Nishio et al.,2009)。
UCHL5與hRpn13結合(也稱為Adrm1)，Adrm1是蛋白酶體19S(PA700)調節粒子的組成部分，啟動其異肽酶活性。hRpn13也有泛素受體的功能，從而使基質物識別耦合至去泛素化。UCHL5也可與Rpn10/S5a結合，後者為位於「頂蓋」與「底部」之間的19S粒子的另一組成部分，但這種相互作用未能啟動UCHL5。UCH37可援救泛素化不良的受質或其他因蛋白質水解而退化緩慢的泛共軛物。另外，它也可通過促進多聚泛素化受質從在易位入蛋白水解核心(26S蛋白酶體的20S粒子)的19S調節複合體中的最初結合位點釋放，從而增強降解作用。在細胞核中，UCHL5也與Ino80染色質重構複合體相關。蛋白酶體結合後，他被啟 動並可能有助於轉錄調節或表明由Ino80和蛋白酶體介導的DNA修復。UCHL5的功能可能至少部分是由其他蛋白質產生，因為雖然RNA干擾介導的UCHL5抑制加速了細胞蛋白質的降解，但對細胞生長、蛋白酶體結構或蛋白水解能力沒有產生可檢測到的影響。
泛素特異性蛋白酶，如UCHL5參與了細胞週期進展的控制、分化、DNA複製和修復、轉錄、蛋白質品質控制、免疫反應和細胞凋亡等幾個過程。至少有一些證據表明UCHL5可導致惡性轉化。UCHL5在人宮頸癌組織中的活性與相鄰正常組織相比已被證明為上調。它能夠去泛素化，並使TGF-β受體及其下游調節因子Smad穩定，從而增強TGF-β信號傳導。TGF-β信號傳導增強在癌症進展晚期充當一種腫瘤啟動子，儘管它具有雙重功能、並且在癌症早期和啟動之前也可能使一種腫瘤抑制因子(Wicks et al.,2005；Wicks et al.,2006；Horton et al.,2007；Bierie and Moses,2006)。
c-Met
參見實施例EP 08008292.8和EP1507795B1。
此外，c-Met通過磷酸化的組成性啟動也被認定為人類透明腎細胞癌的一種重要發生機制(Nakaigawa et al.,2006)。
往往由腫瘤缺氧誘導的Met過量表達可導致受體的組成性活化並與較差預後具有相關性。使內源性MET基因沉默、在腫瘤細胞中過量表達，導致體外完全侵襲性生長計 畫實施受損、缺乏腫瘤生長以及體內實驗性轉移發生的減少。值得注意的是，MET在已確定的轉移癌中沉默導致他們幾乎完全消退(Corso et al.,2008)。
巨噬細胞刺激蛋白受體(MST1R)
MST1R(別名RON)受體是細胞表面受體酪氨酸激酶Met家族的一員，主要表達于上皮細胞和巨噬細胞上。與c-MET一樣，RON由多種上皮源性腫瘤及癌細胞系表達，它被認為在腫瘤發生中發揮著功能性作用。臨床研究表明，MST1R過量表達與患者預後結果較差以及轉移相關。
MST1R在胃癌組織和相應的瘤旁組織表達顯著，但在正常胃黏膜中並不表達(Zhou et al.,2008)。MST1R受體可誘導與其各自配體發生反應的細胞遷移、侵襲、增殖和存活。此外，MST1R具有體外、動物模型體內致癌活性，而且往往在人癌症中下調(Dussault and Bellon,2009)。資料顯示，與體外以及腫瘤生長降低和原位移植到體內攝護腺後微血管密度下降的MST1R表達細胞相比，攝護腺癌細胞中的MST1R抑制可導致血管內皮細胞趨化作用明顯降低。研究表明，與對照細胞相比，MST1R激酶在高度致瘤性結腸癌細胞系中RNA干擾介導的抑制可導致增殖下降。
染色體結構維持蛋白4(SMC4)
染色體結構維持(SMC)蛋白是染色體ATP酶，自細菌至人類高度保守，在高品質染色體的組織和動力學許多方面發揮著基礎性作用。
SMC4蛋白是凝聚蛋白的核心組成部分，在染色質凝聚 中發揮作用，還與細胞核仁分離、DNA修復和染色質支架的維持相關。單個生物體的真核細胞至少有六個SMC蛋白，他們形成三個不同的異源二聚體且具有專門的功能：SMC2和SMC4的功能是充當凝聚蛋白複合體的核心，對染色體的組裝和分離非常重要。
用RT-PCR對25種不同的正常組織的mRNA水準分析結果顯示，該基因在正常攝護腺和唾液腺中呈高表達，在結腸、胰腺和小腸中表達很弱，在其他組織中無表達。對人癌細胞樣本的RT-PCR研究表明，RNA在很多癌症細胞系和癌症標本中呈高表達，包括26份人類乳腺癌標本中的23份、所有3份結腸癌標本、以及所有3份胰腺癌標本(Egland et al.,2006)。
AVL9
令人驚訝的是，該蛋白發現為源蛋白，而關於AVL9蛋白和相應基因的功能相關資料非常少。
動粒蛋白Nuf2
NUF2(CDCA-1)基因編碼一種與酵母Nuf2非常類似的蛋白，這是與著絲粒相關的一種的保守蛋白複合物的組成部分。在減數分裂前期，當著絲粒與紡錘極體斷開連接時，酵母Nuf2從著絲粒中消失，並在染色體分離中發揮著調節作用。研究表明，生存素和hNuf2 csiRNA暫時已知其mRNA，分別通過阻滯有絲分裂導致多核化和細胞死亡(Nguyen et al.,2006)。Nuf2和Hec1均是外板穩定微管正端微管結合點組織時所需要的，而這些結合點需要動粒蛋白 中雙軸取向所需的持續極向力量(DeLuca et al.,2005)。
使用肺癌組織微列陣方法的免疫組織化分析證實了在各種組織類型的絕大多數肺癌中，CDCA1和KNTC2蛋白質都處於高水準。表達升高與非小細胞肺癌患者預後較差相關。通過攜帶與KNTC2結合域相應的CDCA1衍生19-氨基酸肽(11R-CDCA1(398-416))的細胞滲透肽而抑制上述蛋白的結合，有效地抑制了非小細胞肺癌細胞(Hayama et al.,2006)。siRNA介導的對CDCA1或KNTC2的抑制發現可抑制非小細胞肺癌、卵巢癌、宮頸癌、胃癌、結直腸癌和膠質瘤的細胞增殖和誘導凋亡(Kaneko et al.,2009)。CDCA1基因在宮頸癌中表達不同(mRNA表達由即時PCR驗證，蛋白表達由免疫組化驗證)(Martin et al.,2009)。對手術切除胃癌組織(彌漫型，6；腸型，4)的RT-PCR證實了在癌症組織中CDCA1的2種變體表達上調。在本研究中發現到了選擇性剪接變體，特別是在CDCA1中發現，這些變體可用作抗癌療法的診斷標誌物和/或新型靶標(Ohnuma et al.,2009)。
磷酸酯磷酸水解酶2(PPAP2C)
該基因編碼的蛋白質是磷脂酸磷酸酶(PAP)家族的一員。PAP將磷脂酸轉化為甘油二酯，並在新合成甘油脂以及磷脂酶D介導的受體啟動信號轉導中發揮作用。已經報告有三種編碼不同異構體的選擇性剪接轉錄變體。
PPAP2C是在轉化的原發性成人間質幹細胞(MSC)中上調的一種潛在新型靶標。PPAP2C的抑制延緩其進入細胞週 期的S期，並由p53轉錄調控，從而降低細胞增殖。有些資料表明，在許多人類癌症中觀察到的PPAP2C過量表達可能是細胞增殖增加的必要條件(Flanagan et al.,2009)。一項研究表明，PPAP2C是成纖維細胞的一種細胞週期調節因子。PPAP2C過量表達(而不是一種催化無效突變)導致過早進入S期，並伴有早熟細胞週期蛋白A積聚。上述情況代表著進入S期進入速率的重大變化，可能影響有絲分裂、遷移、傷口癒合、發展和腫瘤發生的過程。
泛醇-細胞色素c還原酶結合蛋白(UQCRB)
UQCRB-基因編碼包含10個核編碼和1個線粒體編碼亞基的泛醇-細胞色素c氧化還原酶複合物組成的一種蛋白。編碼蛋白與泛醇結合，並在泛醇結合時參與電子轉移。此基因的突變與線粒體複合物III缺乏相關。在X染色體上已經描述有一種假基因。
UQCRB基因可能是胰腺導管腺癌中一種潛在的癌基因或腫瘤抑制基因(Harada et al.,2009)。UQCRB基因在肝細胞癌中過量表達(Jia et al.,2007)。
Prominin 1(Prom1)
Prominin-1，也稱為CD133，最初被認為是CD34+造血祖細胞的一種特定分子，之後被證明是各種組織正常幹細胞和癌幹細胞(CSC)的一種標誌物(Mizrak et al.,2008)。但是，關於其作用知之甚少。由於它主要位於漿膜的突出部位，如上皮細胞微絨毛，功能性作用歸因於作為漿膜拓撲「組織者」的prominin-1。由於它被發現與膽固醇相互作 用，因此，可能在漿膜內維持適當脂質成分起重要作用。
Prominin-1在很多人體腫瘤中用作CSC標誌物。只有一小部分腫瘤細胞的prominin-1通常為陽性，預期作為一種CSC標誌物。根據不同腫瘤類型，每個腫瘤陽性細胞數達到1至15%，主要為2%左右。其中經功能測試prominin-1表達細胞被證明為CSC(如形成球形，在免疫缺陷小鼠中啟動腫瘤生長的高能力和不對稱分裂/自我更新/多能性增長)的腫瘤是：- 結腸癌(2-2.5%的腫瘤)(Todaro et al.,2007；Ricci-Vitiani et al.,2007)，- 肝癌(Ma et al.,2007；Suetsugu et al.,2006；Yin et al.,2007)，- 胰腺癌(Hermann 2007；Wang 2009)，- 攝護腺癌(1%的腫瘤)(Richardson et al.,2004)，- 不同表型的腦腫瘤(Singh et al.,2003；Singh et al.,2004)，- 急性淋巴細胞性白血病(ALL)等白血病(Cox et al.,2009)，- 黑色素瘤(Monzani et al.,2007；Rappa et al.,2008)，- 肺癌(Chen and O'Shea,2008；Eramo et al.,2008；Tirino et al.,2009)，- 尤文氏肉瘤(Suva et al.,2009)，- 子宮內膜癌(Rutella et al.,2009)，- 口腔鱗狀細胞癌(Zhang et al.,2009)和 - 頭頸部鱗狀細胞癌((Harper et al.,2007)。
此外，幾項研究顯示，在癌組織中與健康組織相比，prominin-1表達增加，其中大部分研究發現prominin-1的表達與總生存期、腫瘤分期或轉移等臨床參數呈相關性。實例有非小細胞肺癌、惡性黑色素瘤、視網膜母細胞瘤、神經母細胞瘤和滑膜癌。Prominin-1的表達也與膠質瘤、胰腺癌(高達15%的PROM1+細胞)、結直腸癌、結腸癌、直腸癌和乳腺導管癌的預後較差相關。有趣的是，PROM1 mRNA在轉移癌患者的外周血單個核細胞(PBMC)中上調，特別是在有骨轉移的患者中上調，PROM1在PBMC中的表達是整體生存率的預後因素。在卵巢癌中未發現與預後相關。
在彌漫性胃癌中，矽片分析表明有PROM1表達(Katoh and Katoh,2007)，並且(Smith et al.,2008)報告了在蛋白水準與正常胃組織相比在胃癌中過量表達。然而，(Boegl and Prinz,2009)報告了prominin-1表達在胃癌中降低，尤其是在胃癌後期，並聲稱prominin-1表達與血管生成密切相關，在後期也降低，而與腫瘤生長無關。使用胃癌細胞株的一項研究(Takaishi et al.,2009)聲稱，CD44是胃癌中的一種CSC標誌物，而prominin-1不是。
(Zhu et al.,2009)提供了prominin-1表達細胞參與腫瘤形成的證據，並報告在小鼠腸道癌症模型中所有腫瘤細胞均產生於Prom1+細胞，但只有7%保留了Prom1+表型。此外，prominin-1(+)細胞已被證明有助於腫瘤血管生成。與 CSC預期的一樣，prominin-1(+)細胞已被證明因Akt生存途徑的啟動而具有化學抗性(Ma 2008)。(Bertolini et al.,2009)報告了這些細胞對順鉑治療無反應。由於FLIP的上調，他們對TRAIL和Fas誘導的細胞凋亡有抗性。他們通過分泌IL-4保護自身不會細胞凋亡。然而，由於他們能被NK細胞(Castriconi et al.,2007；Pietra et al.,2009)和細胞毒性T細胞(Brown et al.,2009)殺滅，因此，可能被免疫系統侵入。
基質金屬蛋白酶11(MMP11)
有人提出基質金屬蛋白酶11(MMP11)在需要組織重建的若干生理過程(如：乳腺發育、哺乳後恢復、傷口癒合和瘢痕形成)中以及月經週期中發揮作用。也有人提出它可通過脂肪細胞分化而負調控脂肪的動態平衡。相對於其他的MMP，它不能以裂解典型性細胞外基質分子-膠原VI除外。然而，已確認了其他基質，如α2-巨球蛋白，某些絲氨酸蛋白酶抑制劑(serpin)，包括α1抗胰蛋白酶、胰島素樣生長因子結合蛋白1和層粘連蛋白受體。
MMP11被發現是一種在浸潤性乳腺癌周圍基質細胞中特異性過量表達的基因。進一步研究證實其在乳腺癌和其他類型癌症周圍的基質中表達，如皮膚癌、非小細胞以及小細胞肺癌、頭頸部鱗狀細胞癌、結腸癌和結直腸癌、喉上皮癌、食管癌、口腔癌、胰腺癌、膀胱癌、卵巢癌、腎細胞癌、非典型腦膜瘤癌、乳頭狀甲狀腺癌、腦腫瘤(MMP11在星形細胞瘤中表達，但在少突膠質細胞瘤和惡 性膠質瘤中表達較低)、唾液腺導管癌、宮頸癌、結外T/NK細胞淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤和攝護腺癌。研究指出，MMP11在大多數浸潤性人癌症的基質中過量表達，但在肉瘤和其他非上皮腫瘤中很少表達，MMP11主要表達於與腫瘤直接相鄰的基質細胞中，而腫瘤本身、正常組織和腫瘤遠處的基質細胞為陰性。然而，這並不能概括為在某些情況下MMP11也發現於結腸等非癌組織中或腫瘤細胞(如：胰腺、乳腺、蛛網膜和胃腫瘤)中。MMP11水準較高與惡性表型/較高侵襲性及預後不良相關。然而，在乳頭狀甲狀腺癌中，MMP11表達與浸潤性特點呈負相關。
由於MMP11表達與微血管密度不相關，因此具有血管生成的作用可能性不大。相反，它似乎提高腫瘤細胞的生存並抑制細胞凋亡。有研究指出，成纖維細胞的MMP11導致刺激癌細胞的IGF-1R途徑，從而提高其增殖能力。其導致脂肪細胞分化的能力支持癌症中瘤周成纖維細胞樣細胞積聚從而有利於癌細胞生存和腫瘤進展的論點(Motrescu and Rio,2008)。
胃癌MMP11：
MMP11發現于腫瘤組織以及胃癌患者血清中，並且表達與轉移相關(Yang et al.,2008)。此外，(Deng et al.,2005)顯示，MMP11在胃癌腫瘤細胞系和原發腫瘤中呈高表達，而在其他類型癌症的基質中並非絕對沒有，並且MMP11似乎提高腫瘤細胞增殖。
ABL1
ABL1原癌基因編碼Src家族的細胞質和細胞核蛋白酪氨酸激酶，研究提示該家族參與細胞分化、細胞分裂、細胞粘附和應激反應過程(Yoshida,2007)。C-Abl在核和細胞質室之間穿梭。細胞核c-Abl參與細胞生長抑制和促進細胞凋亡。相比而言，對於細胞質c-Abl的作用描述較少。研究提示細胞質c-Abl在形態形成和F-肌動蛋白動力學發揮作用，並且在生長因子和整合素配體等細胞外刺激誘導的信號傳導中發揮作用。據報告，細胞質c-Abl可促進有絲分裂。C-Abl有絲分裂基質尚未確定，但它們很可能包括Rho家族(尤其是Vav和Sos成員)小GTP酶的調節因子。
廣泛表達ABL1酪氨酸激酶的DNA結合活性受CDC2介導的磷酸化調節，表明了ABL1的細胞週期功能。c-Abl蛋白的活性受其SH3域蛋負調節，並且SH3域缺失使ABL1成為一種癌基因。c-Abl非受體酪氨酸激酶調節肌動蛋白在非造血細胞中的反應。一些研究將c-Abl確定為信號級聯反應中一個主要作用者，導致肌動蛋白在T細胞活化期間重組(Huang et al.,2008)。
ABL1基因突變與慢性骨髓性白血病(CML)相關。在CML，該基因在22號染色體上的BCR(中斷點簇區)基因內易位而被啟動。這種新融合基因BCR-ABL編碼未調節的細胞質靶向酪氨酸激酶，從而使細胞增殖而不被細胞激素調節。這又使該細胞變成癌細胞(Zhao et al.,2009)。啟動c-Abl酪氨酸激酶，不充當融合蛋白，在肺癌和乳腺癌等實體惡性腫瘤中發揮了重要作用(Lin and Arlinghaus, 2008)。
最近的觀察表明，c-Abl在實體腫瘤中也有失調節發生。在乳腺癌和NSCLC中已發現有細胞質激酶高活性。但是，並沒有達到過量表達的程度，並且組成性激酶活性需要蛋白磷酸化。在乳腺癌細胞中，c-Abl磷酸化由細胞膜酪氨酸激酶(包括SFK、EGFR家族成員和IGF-1受體)誘導。在實體腫瘤中沒有發現ABL融合蛋白。
ABL1與胃癌
在對ABL1表達的一項免疫組化研究中，調查了廣泛的正常胎兒和成人人體組織以及多種類型的腫瘤類型。大多數腫瘤顯示了局灶性或較弱的ABL免疫反應性。在軟骨肉瘤、脂肪肉瘤、彌漫型胃(印戒)腺癌中發現了最強染色。在後兩種情況下，ABL也表達於腫瘤微血管上，提示可能在血管生成中發揮作用。
最近的研究顯示，感染cagA陽性幽門螺桿菌在胃癌發展中起著至關重要的作用。幽門螺旋桿菌在胃上皮細胞感染延長後阻止EGFR內吞作用和受體降解。此外，這種抑制作用除了通過對非受體激酶c-Abl的CagA磷酸化非依賴型活化外，還通過CagA依賴型活化發生，這反過來又使EGFR靶點pY1173磷酸化(Bauer et al.,2009)。STI571或shRNA對c-Abl激酶活性的選擇性抑制阻止了細胞毒素相關基因A(CagA)的持續磷酸化和上皮細胞遷移，提示了c-Abl在幽門螺旋桿菌感染和致病性中的關鍵作用(Poppe et al.,2007)。
激酶阻滯劑的一個實例為伊馬替尼(Imatinib mesylate,Gleevec,STI571)，是Bcr/Abl癌蛋白的抑制劑，已成為慢性粒細胞性白血病的一線療法(Pytel et al.,2009)。伊馬替尼已被批准用於治療晚期胃腸道間質瘤(GIST)患者，其中在KIT中，異常表達酪氨酸激酶受體(Croom and Perry,2003)。另一種最近用於癌症治療的激酶抑制劑是達沙替尼(BMS-354825)，其具有非受體細胞質型ABL特異性(Pytel et al.,2009)。Nilotinib是一種口服二代bcr-abl TKI，用於伊馬替尼耐藥或不耐受的Ph+CML-CP和-AP成人(Deremer et al.,2008)。
在WO 2007/028574中披露了SEQ ID NO 14、SEQ ID NO 15和SEQ ID NO 15，CDC42(細胞分裂週期42)是參與調解細胞週期的一種蛋白質。該蛋白質是Rho-子家族的一種小GTP酶，調節控制多種細胞功能的信號通路，其中包括細胞形態、遷移、內吞作用和細胞週期進展。CDC42被發現在膠質母細胞瘤中高度過量表達。
WO 2004/067023介紹了腫瘤相關抗原生存素衍生的MHC I類限制肽，這些肽能與HLA I類分子高親和性結合。
分泌磷蛋白1(SPP1)，亦稱為骨涎蛋白(BSP-1)、早期T淋巴細胞啟動(ETA-1)，最經常稱為骨橋蛋白(OPN)，是一種人類基因產物，其他物種中也含有。骨橋蛋白是骨重塑中重要的因子。具體來說，研究表明，其具有將破骨細胞錨固至骨礦物質基質的作用。除了骨橋素外，骨頭的有機 成分大約是I型膠原、骨鈣素、骨連接素、骨唾液酸蛋白和鹼性磷酸酶幹重和計數的20%。I型膠原占蛋白質量的90%。
OPN與數種整合素受體結合，包括白血球表達的α4β1、α9β1和α9β4。這些受體在這些細胞中有效地執行細胞黏附、遷移和生存的功能。因此，近期的研究工作主要集中於OPN在介導這些反應中的作用。
骨橋蛋白表達於廣泛的免疫細胞中，包括巨噬細胞、中性粒細胞、樹突狀細胞，T細胞和B細胞，動力學各不相同。據報導，OPN可以不同方式充當免疫調節劑。首先，它具有趨化特性，促進將細胞徵募至發炎部位。它還具有粘附蛋白的功能，參與細胞附著和傷口癒合。另外，OPN介導細胞活化和細胞激素產生，並通過調節細胞凋亡促進細胞存活。
IL-12促進活化T細胞向Th1型分化，從而產生包括IL-12和IFNγ的細胞激素。OPN可抑制Th2細胞激素IL-10的產生，從而加強Th1應答。OPN影響細胞介導的免疫，並具有Th1細胞激素的功能。它增強了B細胞免疫球蛋白的產生和增殖。2008年的最新研究表明，OPN還會引起肥大細胞脫顆粒。[Nagasaka A,Matsue H,Matsushima H,et al.(February 2008)。「骨橋蛋白由肥大細胞產生並影響IgE介導的肥大細胞脫顆粒和遷移」。Eur.J.Immunol.38(2)：489-99]研究人員觀察到，與野生型小鼠相比，IgE介導的過敏性反應在剔除OPN的小鼠中顯著降低。一項癌症 研究也提示了OPN在巨噬細胞活化中的作用，研究人員發現，與OPN缺乏腫瘤相比，產生OPN的腫瘤能夠誘導巨噬細胞活化。
在很多情況下，OPN是一種重要的抗凋亡因子。OPN阻止巨噬細胞和T細胞以及暴露於有害刺激物的成纖維細胞和血管內皮細胞的啟動誘導的細胞死亡。OPN可阻止炎症性結腸炎中的非程式性細胞死亡。
OPN與廣泛表達的多種細胞表面受體相互作用的事實使其在許多生理和病理過程中發揮著積極作用，包括傷口癒合、骨轉換、腫瘤的發生、炎症、缺血和免疫反應。因此，操縱血漿OPN水準可能有利於治療自身免疫性疾病、癌轉移、骨質疏鬆症和某些形式的應急。
研究表明，OPN促進IL-17的產生；OPN在多種癌症中多量表達，包括肺癌、乳腺癌、結直腸癌、胃癌、卵巢癌、黑色素瘤和間皮瘤；OPN還可導致腎小球腎炎和腎小管間質腎炎；並且OPN可在動脈內的粥樣硬化斑塊中發現。因此，操縱血漿OPN水準可能有利於治療自身免疫性疾病、癌轉移、骨質疏鬆症和某些形式的應急。
人表皮生長因子受體3(ERBB3)
ERBB3編碼受體酪胺酸激酶之表皮生長因子受體(EGFR)家族之一員。其係經神經調節蛋白、其他ERBB及非ERBB受體以及其他激酶及新穎機制活化。在其下游，其明顯與磷酸肌醇3-激酶/AKT生存/促有絲分裂途徑相互作用，且與GRB、SHC、SRC、ABL、rasGAP、SYK及轉錄調節因 子EBP1相互作用(Sithanandam及Anderson 413-48)。
原發癌之ERBB3表現以及其在培養細胞中之機理作用的研究暗示與乳癌、卵巢癌、攝護腺癌、某些腦細胞癌、視網膜癌、黑色素細胞癌、結腸癌、胰腺癌、胃癌、口腔癌及肺癌的發生及維持有不同程度的因果關係(Sithanandam及Anderson 413-48)。以免疫組織化學法偵測ERBB3蛋白在整個胃腸道之上皮細胞之表現，包括口咽及食管鱗狀上皮、胃壁細胞及小腸與大腸之表面腸上皮細胞。結果顯示ERBB3在胃癌中表現增加(Poller等人275-80；Sanidas等人935-40)。所有胃癌細胞株均表現ERBB3及截短分泌產物。ERBB3在胃惡性腫瘤中關鍵作用之有力證據來自於低分化印戒(signet-ring)細胞胃癌的研究(Kobayashi等人1294-301)。Zhang等人使用免疫組織化學(IHC)法研究了ERBB3在兩種病理類型(腸型及彌漫型)胃癌中之表現。彌漫型胃癌的ERBB3過量表現比例顯著高於腸型胃癌(26.2% vs.5.0%，p<0.01)。ERBB3在兩種組織學類型胃癌中之選擇性過量表現與預後較差緊密相關(Zhang等人2112-18)。ERBB3表現與包括腫瘤侵襲深度、淋巴結轉移、遠處轉移、腫瘤階段及復發性疾病之腫瘤進展相關參數顯著相關(Hayashi等人7843-49)。使用免疫組織化學方法檢驗EGFR、c-erbB-2及c-erbB-3在21例胃癌及20例慢性胃炎之新鮮冷凍組織中之表現及共同表現研究臨床病理變數。一般來說，胃癌患者顯示比慢性胃炎組患者高的EGFR、c-erbB-2及d-erbB-3過量表現發生率(分別為81%與43%；38% 與45%；35%與20%)，但只有EGFR表現有統計學顯著差異(p=0.01)(Slesak等人2727-32)。
已經用實驗性嘗試若干用於治療靶向ERBB3之方法。針對ERBB3細胞外域之RNA適體可抑制NRG誘導之ERBB3/ERBB2異源二聚體化、ERBB2磷酸化及MCF7乳癌細胞生長(Chen等人9226-31)。在A431鱗狀細胞癌細胞中抑制ERBB3基因表現之合成設計鋅指轉錄因子會導致增殖及轉移減少，且抑制ERBB3表現比改變ERBB2具有更大的影響(Lund等人9082-91)。維生素E異構體γ-生育三烯醇藉由特異性阻斷ERBB3活化及PI3K/AKT途徑之下游刺激而抑制乳腺細胞增殖(Samant及Sylvester 563-74)。微RNA 125a減少ERBB3 RNA及蛋白、AKT活化以及SKBR3乳腺癌細胞之細胞生長及侵襲(Scott等人1479-86)。乳癌細胞中siRNA對ERBB3的下調消除其對酪胺酸激酶抑制劑之二次抗性，且誘導細胞凋亡(Sergina等人437-41)。ERBB3或AKT之小抑制性RNA(siRNA)顯示出作為治療肺腺癌之治療方法的前景(Sithanandam等人1847-59)。
生存素(BIRC5)
在胎兒組織和各種人癌症組織中，BIRC5(生存素)-細胞凋亡抑制蛋白(IAP)家族中的一員-表達升高。WO 2004/067023介紹了腫瘤相關抗原生存素衍生的MHC I類限制肽，這些肽能與HLA I類分子高親和性結合。生存素似乎具有同時調節細胞增殖和凋亡的能力。特別是在膠質母細胞瘤中，可檢測到非常高水準的生存素表達(Angileri et al.,2008)。這表明，生存素在腦膠質瘤中的過量表達可能在惡性增殖、抗凋亡和血管生成中起著重要作用(Zhen et al.,2005；Liu et al.,2006)。尤其是對於膠質母細胞瘤以及其他腫瘤實體，與罹患生存素陰性腫瘤的患者相比，生存素的表達與惡性程度(在膠質母細胞瘤中生存素表達最高)和較短的總存活時間顯著相關(Kajiwara et al.,2003；Saito et al.,2007；Uematsu et al.,2005；Mellai et al.,2008；Grunda et al.,2006；Xie et al.,2006；Sasaki et al.,2002；Chakravarti et al.,2002)。
B肝核心抗原
對於B型肝炎病毒(HBV)核心蛋白HBc，致免疫肽為眾所周知(Bertoletti et al.,1993；Livingston et al.,1997)。根據本發明，來自HBc的10-氨基酸肽可能納入作為患者免疫活性的陽性對照，並成功接種入癌症疫苗。
從表6中可以看出，本領域技術人員可很容易地適應將本組合物應用于患者和/或特定的腫瘤，並相應選擇TUMAP。
在本發明的一個優選實施方案中，藥物組合物包括至少兩種肽，其總之一含有根據SEQ ID NO 1的氨基酸序列，並進一步包括含根據SEQ ID NO 11的氨基酸序列的肽。
在本發明的一個優選實施方案中，藥物組合物包括至少兩種肽，其中之一含有根據SEQ ID NO 1的氨基酸序列以及根據SEQ ID NO 2和/或SEQ ID No 11的氨基酸序列。
在本發明的一個優選實施方案中，藥物組合物包括至少兩種含有根據SEQ ID No SEQ ID No 3的氨基酸序列以及根據SEQ ID NO 2和/或SEQ ID No 11的氨基酸序列的肽。
在本發明的一個優選實施方案中，藥物組合物包括至少兩種含有根據SEQ ID No SEQ ID No 1的氨基酸序列以及根據SEQ ID NO 7和可選SEQ ID No 11的氨基酸序列的肽。
在本發明的一個優選實施方案中，藥物組合物包括至少兩種含有根據SEQ ID NoSEQ ID No 2的氨基酸序列以及根據SEQ ID NO 7和可選SEQ ID No 11的氨基酸序列的肽。
在本發明的一個優選實施方案中，藥物組合物包括至少兩種含有根據SEQ ID NoSEQ ID No 3的氨基酸序列以及根據SEQ ID NO 7和可選SEQ ID No 11的氨基酸序列的肽。
在更為優選的實施方案中，藥物組合物包括至少有一種以上肽，這些肽含有從SEQ ID NO 2至SEQ ID NO 10和SEQ ID No 11至SEQ ID No 22和SEQ ID No 24組成的基團中所選的氨基酸序列、和/或與SEQ ID NO 2至SEQ ID NO 10和SEQ ID No 11至SEQ ID No 22和SEQ ID No 24至少 85%同源的氨基酸序列，和/或含有編碼SEQ ID NO 2至SEQ ID NO 10和SEQ ID No 11至SEQ ID No 22和SEQ ID No 24核酸的多聚核苷酸或變異氨基酸序列，以及一種藥用載體。
本發明的進一步優選實施方案包括至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18個肽，這些肽含有從SEQ ID NO 1至SEQ ID NO 10和SEQ ID No 11至SEQ ID No 22和SEQ ID No 24組成的基團中所選的氨基酸序列、和/或與SEQ ID NO 1至SEQ ID NO 10至少85%同源的氨基酸序列、和/或含有編碼SEQ ID NO 1至SEQ ID NO 12和SEQ ID No 11至SEQ ID No 22和SEQ ID No 24核酸的多聚核苷酸或變異氨基酸序列，以及一種藥用載體。
該藥物組合物還可包含更有效的其他肽和/或賦形劑，將進一步解釋如下。
發明人用給定氨基酸序列的「變種氨基酸序列」表示，一個或多個氨基酸殘基等的側鏈通過取代另一個自然產生的氨基酸殘基的側鏈或其他側鏈而改變，這樣，這種肽仍然能夠以含有給定氨基酸序列的肽大致同樣的方式與HLA分子結合。例如，一種肽可能被修飾以便至少維持(如果不提升的話)其與HLA-A或HLA-DR等合適的MHC分子互動和結合，以及至少維持(如果不提升的話)其產生能識別和殺傷細胞(這些細胞表達含本發明中所定義的一種氨基酸序列的多肽)的啟動CTL的能力。從資料庫中可得 知，HLA-A結合肽的某些位點通常為錨定殘基，可形成一種與HLA結合槽的結合基序相稱的核心序列。
這些不與T細胞受體互動的氨基酸殘基可通過取代另一個幾乎不影響T細胞反應並不妨礙與相關MHC結合的氨基酸而得到修飾。因此，除了特定限制性條件外，本發明中的肽可能為任何包括給定氨基酸序列或段或變體的肽(發明人所用的這個術語包括寡肽或多肽)。
MHC-II類呈現肽更為大家熟知，這些肽由具有某種HLA特異性氨基酸基序並且N和/或C-端隨意延伸(不干擾肽核心序列功能，如，被視為與肽和T細胞相互作用無關)的「核心序列」組成。N-和/或C端可分別延伸1至10個氨基酸的長度。這些肽可直接用於載入MHC-II類分子或其序列可複製入下文所述載體。由於這些肽可在細胞內形成較大肽加工過程的最終產物，因此，也可用長肽。本發明的肽的大小不限，但通常它們的分子量可能小於100000，優選為小於50000，更優選為小於10000，更優選為小於5000，更優選為小於2500，通常約為1000至2000。對於氨基酸殘基數目，本發明中的肽可能少於1,000個殘基，優選為少於500個殘基，更優選為少於100個殘基。因此，本發明還提出了總長度為8至100個、優選為8至30個、最優選為8至17個(即8、9、10、11、12、13、14、15或16個)氨基酸的肽或變體的複合物。
優選情況是，這些肽含有一個核心序列，其選自由SEQ ID NO 11至SEQ ID NO 22和SEQ ID No 24組成並且C端 和/或N端上有1至10個氨基酸延長的群組，更優選的情況是，這些側翼氨基酸的總數為1至12個，更優選1至10個，更優選1至8個，更優選1至6個，其中側翼氨基酸可在C端和N端以任意比例分佈(例如所有側翼氨基酸可以被添加至一個末端，或氨基酸可均等地或以任何其他比例加入兩種末端)，但前提是，該肽仍然能根據SEQ ID NO 1至SEQ ID NO 22和SEQ ID No 24任何一個序列所得肽的同樣方式與HLA分子結合。
相應地，誘導T細胞與本發明中的肽發生交叉反應的變體往往為長度可變的變體。
如果一個肽不長於約為12個氨基酸殘基，則直接與MHC II類分子結合。優選情況是，兩側核心HLA結合區不會對該肽與MHC-II類分子的結合槽特異性結合能力或該肽呈現至CTL的能力產生重大影響。但是，正如上所述，應瞭解，可使用較大的肽(特別是核苷酸進行編碼時)，因為這些較大的肽可被適當的抗原呈現細胞分成片段。另外，側翼氨基酸可以降低體內肽降解速度，以使提供給CTL的肽實際量高於無側翼氨基酸的肽。
MHC I類表位(通常長度為8至10個氨基酸)也可能由肽從較長的肽或包含實際表位的蛋白中加工而產生。與MHC-II類表位元相似，首選情況是，實際表位元N-和C-端的拉長前體肽上游和/或下游的側翼殘基不會對該肽呈現至CTL產生重大影響、也不會掩蓋加工拉長肽介導的產生實際表位所需的蛋白裂解位點。
優選情況是，這些肽含有一個核心序列，其由SEQ ID NO 1至SEQ ID NO 10和SEQ ID No 11組成並且C端和/或N端上有1至10個氨基酸的延長，更優選的情況是，這些側翼氨基酸的總數為1至12個，更優選1至10個，更優選1至8個，更優選1至6個，其中側翼氨基酸可在C端和N端以任意比例分佈(例如所有側翼氨基酸可以被添加至一個末端，或氨基酸可均等地或以任何其他比例加入兩種末端)，但前提是，該肽仍然能根據SEQ ID NO 1至SEQ ID NO 10和SEQ ID No 11任何一個序列所得肽的同樣方式與HLA分子結合。
因此，本發明還提出了總長度為8至100個、優選為8至30個、最優選為8至18個(即8、9、10、11、12、13、14、15、16或17個)氨基酸的MHC-I類表位的肽或變體。
當然，本發明的肽或變體能與人MHC I或II類分子結合。肽或變體與MHC複合物結合性可用本領域內的已知方法進行測試，例如，本發明下列實施例中所述的方法或文獻中所述的檢測不同MHC-II類等位基因的方法(例如，Vogt AB,Kropshofer H,Kalbacher H,Kalbus M,Rammensee HG,Coligan JE,Martin R；Ligand motifs of HLA-DRB5*0101 and DRB1*1501 molecules delineated from self-peptides；J Immunol.1994；153(4)：1665-1673；Malcherek G,Gnau V,Stevanovic S,Rammensee HG,Jung G,Melms A；Analysis of allele-specific contact sites of natural HLA-DR17 ligands；J Immunol.1994；153(3)：1141- 1149；Manici S,Sturniolo T,Imro MA,Hammer J,Sinigaglia F,Noppen C,Spagnoli G,Mazzi B,Bellone M,Dellabona P,Protti MP；Melanoma cells present a MAGE-3 epitope to CD4(+)cytotoxic T cells in association with histocompatibility leukocyte antigen DR11；J Exp Med.1999；189(5)：871-876；Hammer J,Gallazzi F,Bono E,Karr RW,Guenot J,Valsasnini P,Nagy ZA,Sinigaglia F；Peptide binding specificity of HLA-DR4 molecules：correlation with rheumatoid arthritis association；.J Exp Med.1995 181(5)：1847-1855；Tompkins SM,Rota PA,Moore JC,Jensen PE；A europium fluoroimmunoassay for measuring binding of antigen to class II MHC glycoproteins；J Immunol Methods.1993；163(2)：209-216；Boyton RJ,Lohmann T,Londei M,Kalbacher H,Halder T,Frater AJ,Douek DC,Leslie DG,Flavell RA,Altmann DM；Glutamic acid decarboxylase T lymphocyte responses associated with susceptibility or resistance to type I diabetes：analysis in disease discordant human twins,non-obese diabetic mice and HLA-DQ transgenic mice；Int Immunol.1998(12)：1765-1776).
本發明中的肽可能在氨基酸延伸處有其他N和/或C端，其不一定能形成作為MHC分子實際表位的肽，但對有效將本發明中的肽引進細胞具有重要作用(見上文)。在本發明的一實施案中，本發明的肽為融合蛋白，含來自NCBI、 GenBank登錄號X00497的HLA-DR抗原相關不變鏈(p33，以下稱為「Ii」)的80個N-端氨基酸等(Strubin,M.,Mach,B.and Long,E.O.The completeSEQuence of the mRNA for the HLA-DR-associated invariant chain reveals a polypeptide with an unusual transmembrane polarity EMBO J.3(4),869-872(1984)。
本發明還提出一種藥物組合物，其包含至少一種本發明中的肽，其中，這些肽的總長度可為8至100個氨基酸、優選為8至30個氨基酸，最優選為8至17個(即9、10、11、12、13、14、15或16個)氨基酸。
此外，該肽或變體可進一步修飾以提高穩定性和/或與MHC分子結合，從而引發更強的免疫反應。肽序列的該類優化方法是本領域內所熟知的，包括，例如，反式肽鍵和非肽鍵的引入。
因此，另一方面，本發明提出了一種藥物組合物，其中，至少有一個含非肽鍵的肽或變體。
在反式肽鍵氨基酸中，肽(-CO-NH-)並未連接其殘基，但是其肽鍵是反向的。這種逆向反向模擬肽(retro-inverso peptidomimetics)可通過本領域已知的方法製備，例如：Meziere等在《免疫學雜誌》((1997)J.Immunol.159,3230-3237)中所述的方法，以引用的方式併入本文。這種方法涉及製備包含骨架(而並非側鏈)改變的模擬肽。Meziere等人(1997年)的研究顯示，這些類比肽有利於MHC和輔助性T細胞的反應。以NH-CO鍵替代CO-NH肽 鍵的逆向反向肽大大地提高了抗水解性能。
非肽鍵為-CH2-NH、-CH2S-、-CH2CH2-、-CH=CH-、-COCH2-、-CH(OH)CH2-和-CH2SO-等。美國4897445號專利提出了多肽鏈中非肽鍵(-CH2-NH)的非固相合成法，該方法涉及按標準程序合成的多肽以及通過氨基醛和一種含NaCNBH3的氨基酸相互作用而合成的非肽鍵。
含上述本發明序列的肽可與其氨基和/或羧基末端的其他化學基團進行合成，從而提高肽的穩定性、生物利用度、和/或親和力等。例如，苄氧羰基、丹醯基等疏水基團或叔丁氧羰基團可加入肽的氨基末端。同樣，乙醯基或9-芴甲氧羰基可能位於肽的氨基末端。此外，例如，疏水基團、叔丁氧羰基團或氨基團都可能被加入肽的羧基末端。
另外，本發明中的所有肽都可能經合成而改變其空間構型。例如，可能使用這些肽的一個或多個氨基酸殘基的右旋體，通常不是其左旋體。更進一步地，本發明中肽的至少一個氨基酸殘基可被熟知的一個非天然氨基酸殘基取代。諸如此類的改變可能有助於增加本發明肽的穩定性、生物利用度和/或結合作用。
同樣，本發明中的肽或變體可在合成肽之前或之後通過特異氨基酸的反應而進行化學修飾。此類修飾的實施例為本領域所熟知，例如，在R.Lundblad所著的《Chemical Reagents for Protein Modification》(3rd ed.CRC Press,2005)中有概述，以參考文獻的方式併入本文。雖然氨基 酸的化學修飾方法無限制，但其包括(但不限於)通過以下方法修飾：醯基化、脒基化、賴氨酸吡哆基化、還原烷基化、以2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS)三硝基苯基化氨基團、通過將半胱氨酸過甲酸氧化為磺基丙氨酸而對羧基團和巰基進行氨基修飾、形成易變衍生物、與其他巰基化合物形成混合二硫化合物、與馬來醯亞胺反應，與碘乙酸或碘乙醯胺羧甲基化、在鹼性pH值下與氰酸鹽甲氨醯化。在這方面，技術人員參考了《Current Protocols In Protein Science》(Eds.Coligan et al.(John Wiley & Sons NY 1995-2000))中第15章所述的在蛋白質化學修飾相關的廣泛方法。
當蛋白與戊二醛、聚乙二醇二丙烯酸酯和甲醛的交聯用於配製水凝膠時，治療性蛋白和含聚乙二醇的肽的成功修飾往往可延長迴圈半衰期。針對免疫治療的變態反應原化學修飾往往通過氰酸鉀的氨基甲醯化實現。
一般來說，肽和變體(至少含氨基酸殘基之間的肽聯接)可使用Lu等人(1981)J.Org.Chem.46,3433)以及此處列出的參考文獻所披露的固相肽合成Fmoc-聚醯胺模式等方法進行合成。
純化可通過以下技術的任何一種或組合方法實現，如：再結晶法、體積排阻色譜法、離子交換色譜法、疏水作用色譜法以及(通常)反相高效液相色譜法(如使用乙腈/水梯度分離)。
肽分析可使用以下方法進行：薄層色譜法、電泳法、特 別是，毛細管電泳法、固相萃取法(CSPE)、反相高效液相色譜法、酸水解後的氨基酸分析、快原子轟擊(FAB)質譜分析法以及MALDI、ESI-Q-TOF質譜分析法。
另一方面，本發明提出了一種編碼本發明中肽或變體的核酸(如多聚核苷酸)。多聚核苷酸可能為DNA、cDNA、PNA、CAN、RNA等或為單鏈和/或雙鏈，或多聚核苷酸的原生或穩定形式，如：具有硫代磷酸骨架的多聚核苷酸，或其組合物，並且只要它編碼肽，就可能包含也可能不包含內含子。當然，多聚核苷酸只能編碼加入天然肽鍵並含有天然氨基酸殘基的肽。另一個方面，本發明提出了一種可根據本發明表達多肽的表達載體。不同類型細胞的表達載體為本領域所熟知並且無需過度不當實驗就可選定。
一般來說，DNA可以適當的方向和正確的表達閱讀框架附著到一種表達載體(如質粒)中。如有必要，該DNA可能與所需宿主所識別的相應轉錄和翻譯調節控制核苷酸序列連接，儘管表達載體中一般存在此類控制功能。然後，該載體通過標準方法被引入宿主。指導可參閱，如：Sambrook等(1989)所著Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,NY。
但是，在本發明的一個特別優選實施方案中，藥物組合物至少包括兩種含有從SEQ ID NO 1至SEQ ID NO 12所選的氨基酸序列的肽。
疫苗所含每種肽的最佳量以及最佳給藥方案可由一名對 本領域技術人員確定，而無需進行過度不當實驗。例如，肽或其變體可製備為靜脈(i.v.)注射劑、皮下(s.c.)注射劑、皮內(i.d.)注射劑、腹腔(i.p.)注射劑、肌肉(i.m.)注射劑。肽注射的優選途徑為s.c.、i.d.、i.p.、i.m.和i.v.注射。DNA注射的優選途徑為i.d.、i.m.、s.c.、i.p.和i.v.注射。例如，給予1至500mg、50μg至1.5mg，優選為125μg至500μg的肽或DNA，這取決於具體的肽或DNA。上述劑量範圍在以前的試驗中成功使用(Brunsvig PF,Aamdal S,Gjertsen MK,Kvalheim G,Markowski-Grimsrud CJ,Sve I,Dyrhaug M,Trachsel S,Mller M,Eriksen JA,Gaudernack G；.Telomerase peptide vaccination：a phase I/II study in patients with non-small cell lung cancer；Cancer Immunol Immunother.2006；55(12)：1553-1564；M.Staehler,A.Stenzl,P.Y.Dietrich,T.Eisen,A.Haferkamp,J.Beck,A.Mayer,S.Walter,H.Singh,J.Frisch,C.G.Stief；An open label study to evaluate the safety and immunogenicity of the peptide based cancer vaccine IMA901,ASCO meeting 2007；Abstract No 3017)
本發明的藥物組合物可能會進行彙編，從而組合物中肽的選擇和所含數量都具有組織、癌症和/或患者特異性。例如，特定組織中親本蛋白的表達模式可引導肽的準確選擇，從而避免副作用。這種選擇可能會依賴于待治療患者具體的癌症類型、以及疾病狀態、早期治療方案、患者免疫狀態，當然，還有患者的HLA單倍型。此外，根據特 定患者的個人需求，本發明的疫苗可包含個性化成分。根據特定患者的相關TAA的表達、由於個人過敏或其他治療方法而產生的意外副作用、以及第一輪治療後對二次治療或治療方案的調整，各實施例中的肽含量有所不同。
對於用作GBM疫苗的一種組合物，例如，親本蛋白在正常組織中高表達的肽在本發明的組合物中將會避免使用或含量較低。另一方面，如果已知某個患者的腫瘤高表達某種蛋白，則治療這種癌症的各藥物組合物可能含有大量和/或一個以上針對這種特定蛋白的肽，或者可能含有這種蛋白的通路。技術人員可通過以下測試選擇免疫原性肽的優選組合，如：測試體外T細胞的代及其效果和總量、針對某些肽的某些T細胞的增殖、親和力和擴增，以及通過分析IFN-γ的產生(參閱下文實施例)測試細胞的功能性。通常為了上述之目的，最有效的肽然後組合為一種疫苗。
一種合適的疫苗將優選為包含1至20個肽，更優選為2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個不同的肽，進一步優選為6、7、8、9、10、11、12、13或14個不同的肽，最優選為10、11、12、13或14個不同的肽。用於癌症疫苗的肽長度為本文披露的任何合適長度。特別是，它可能是一種合適的9-mer肽或一種合適的8-mer或9-mer或10-mer或11-mer肽或12-mer、13-mer、14-mer或15-mer肽。較長的肽也可能適合，附表4和5中所述的9-mer或10-mer肽優選為MHC-I類肽，而12-至15-mer肽優選為MHC-II類肽。
肽組成了腫瘤或癌症疫苗。該疫苗可直接給到患者的受影響器官，也可全身給藥，或體外應用到來自患者或其細胞株的細胞(隨後再將這些細胞注入到患者中)，或體外用於從來自患者的免疫細胞的一個細胞亞群(然後再將細胞重新給予患者)。
該肽可能為純肽，也可能是與免疫刺激佐劑的組合物(見下文)、或與免疫刺激細胞激素聯合使用、或可能以適當的輸送系統給藥，例如脂質體。該肽也可共軛形成一種合適的載體(如鑰孔蟲戚血藍蛋白(KLH)或甘露)到合適的載體(參閱WO 95/18145及Longenecker等(1993)Ann.NY Acad.Sci.690,276-291)。該肽也可進行標記、或是一種融合蛋白或是雜合分子。本發明中給出肽序列的肽預期會刺激CD4或CD8 CTL。但是，有反向CD陽性T細胞提供幫助時，刺激更為有效。因此，對於刺激CD4T細胞的MHC-II類表位，一種雜合分子的融合夥伴或片段提供了刺激CD8陽性T細胞的適當表位。另一方面，對於刺激CD8 CTL的MHC-I類表位，一種雜合分子的融合夥伴或片段提供了刺激CD4陽性T細胞的適當表位。CD4-和CD8刺激表位為本領域所熟知、並包括本發明中確定的表位。
藥用載體通常是已熟知的液體，可配製其中的一種有效治療劑制。劑型中的載體雖然可能具有化學和/或生物穩定性、釋放特性等等，但是一般不具備任何藥理活性。典型配方可在諸如Alfonso R.Gennaro.Remington：The Science and Practice of Pharmacy,20th EditionBaltimore, MD：Lippincott Williams & Wilkins,2000等書籍中找到，包括(但不限於)鹽水、水、緩衝水、0.3%甘氨酸、透明質酸、葡萄糖等。最近，人們發現在人類患者中用作靜脈營養很多年的某些脂肪乳劑也可充當一種肽賦形劑。有兩種此類乳劑已用作商用脂肪乳劑，名叫Intralipid、Lipofundin。"Intralipid"是瑞典Kabi Pharmacia公司一種靜脈營養脂肪乳劑的注冊商標，美國專利號為3169094。"Intralipid"是德國B.Braun Melsungen公司的注冊商標。兩者均包含大豆油脂肪(1000蒸餾水中含100或200克：即含量分別為10%或20%)。Intralipid中卵黃磷脂用作乳化劑(12g/l蒸餾水)，Lipofundin中蛋黃卵磷脂用作乳化劑(12g/l蒸餾水)。Intralipid和Lipofundin的等滲性均是在它們中加入甘油(25g/l)的結果。
為了引發免疫反應，通常疫苗有必要包括使該組合物具有更多免疫原性的佐劑。因此，在本發明的一個優選實施方案中，本藥物組合物進一步包括了至少一種合適的佐劑。
適合的佐劑包括(但不僅限於)1018ISS、鋁鹽、安普利維(Amplivax®)、AS15、BCG、CP-870,893、CpG7909、CyaA、dSLIM、鞭毛蛋白或鞭毛蛋白衍生的TLR5配體、FLT3配體、GM-CSF、IC30、IC31、咪喹莫特(ALDARA®)、瑞司奎莫(resiquimod)、ImuFact IMP321、白細胞介素IL-2、IL-13、IL-21、干擾素α或β，或其聚乙二醇衍生物、IS Patch、ISS、ISCOMATRIX、ISCOMs、 JuvImmune、LipoVac、MALP2、MF59、單磷醯脂A、Montanide IMS 1312、Montanide ISA 206、Montanide ISA 50V、Montanide ISA-51、水包油和油包水乳狀液、OK-432、OM-174、OM-197-MP-EC、ONTAK、OspA、PepTel®載體系統、基於聚丙交酯複合乙交酯[PLG]和右旋糖苷微粒、重組人乳鐵傳遞蛋白SRL172、病毒顆粒和其他病毒樣顆粒、YF-17D、VEGF trap、R848、β-葡聚糖、Pam3Cys、源自皂角苷、分支桿菌提取物和細菌細胞壁合成模擬物的Aquila公司的QS21刺激子，以及其他專有佐劑，如：Ribi's Detox、Quil或Superfos。優選佐劑如：弗氏佐劑或GM-CSF。前人對一些樹突狀細胞特異性免疫佐劑(如MF59)及其製備方法進行了描述(Aucouturier et al.,2001；Allison and Krummel,1995)。也可使用細胞激素。一些細胞激素直接影響樹突狀細胞向淋巴組織遷移(如，TNF-)，加速樹突狀細胞成熟為T淋巴細胞的有效抗原呈現細胞(如，GM-CSF、IL-1和IL-4)(美國5849589號專利，特別以其完整引用形式併入本文)，並充當免疫佐劑(如IL-12、IL-15、IL-23、IL-7、IFN-α、IFN-β)(Gabrilovich et al.,1996)。
據報告，CpG免疫刺激寡核苷酸可提高佐劑在疫苗中的作用。如果沒有理論的約束，CpG寡核苷酸可通過Toll樣受體(TLR)(主要為TLR9)啟動先天(非適應性)免疫系統從而起作用。CpG引發的TLR9活化作用提高了對各種抗原的抗原特異性體液和細胞反應，這些抗原包括肽或蛋白抗 原、活病毒或被殺死的病毒、樹突狀細胞疫苗、自體細胞疫苗以及預防性和治療性疫苗中的多糖結合物。更重要的是，它會增強樹突狀細胞的成熟和分化，導致TH1細胞的活化增強以及細胞毒性T淋巴細胞(CTL)生成加強，甚至CD4T細胞說明的缺失。甚至有疫苗佐劑的存在也能維持TLR9活化作用誘發的TH1偏移，這些佐劑如：正常促進TH2偏移的明礬或弗氏不完全佐劑(IFA)。CpG寡核苷酸與以下其他佐劑或配方一起製備或聯合給藥時，表現出更強的佐劑活性，如微粒、納米粒子、脂肪乳或類似製劑，當抗原相對較弱時，這些對誘發強反應尤為必要。他們還能加速免疫反應，使抗原劑量減少約兩個數量級，在有些實驗中，對不含CpG的全劑量疫苗也能產生類似的抗體反應(Krieg,2006)。美國6406705 B1號專利對CpG寡核苷酸、非核酸佐劑和抗原結合使用促使抗原特異性免疫反應進行了描述。一種CpG TLR9拮抗劑為Mologen公司(德國柏林)的dSLIM(雙幹環免疫調節劑)，這是本發明藥物組合物的優選成分。也可使用其他如TLR結合分子，如：RNA結合TLR7、TLR8和/或TLR9。
其他有用的佐劑例子包括(但不限於)化學修飾性CpG(如CpR、Idera)、dsRNA模擬物，如，Poly(I：C)及其衍生物(如：AmpliGen®、Hiltonol®、多聚-(ICLC)、多聚(IC-R)、多聚(I：C12U))、非CpG細菌性DNA或RNA以及免疫活性小分子和抗體，如：環磷醯胺、舒尼替單抗、貝伐單抗、西樂葆、NCX-4016、西地那非、他達拉非、伐地那 非、索拉非尼、替莫唑胺、temsirolimus、XL-999、CP-547632、帕唑帕尼、VEGF Trap、ZD2171、AZD2171、抗-CTLA4、免疫系統的其他抗體靶向性主要結構(如：抗-CD40、抗-TGFβ、抗-TNFα受體)和SC58175，這些藥物都可能有治療作用和/或充當佐劑。技術人員無需過度進行不當實驗就很容易確定本發明中有用的佐劑和添加劑的數量和濃度。
優選佐劑為咪喹莫特、瑞司奎莫(resiquimod)、GM-CSF、環磷醯胺、舒尼替尼、貝伐單抗、干擾素-α、CpG寡核苷酸和衍生物、聚(I：C)和衍生物、RNA、西地那非、以及PLG的微粒製劑或病毒顆粒。
本發明藥物組合物的一個優選實施方案中，佐劑從含集落刺激因子製劑中選擇，如粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF，沙格司亭)、咪喹莫特、瑞司奎莫(resiquimod)和干擾素-α。
在本發明藥物組合物的一個優選實施方案中，佐劑為咪喹莫特或瑞司奎莫(resiquimod)。
在本發明藥物組合物的一個優選實施方案中，佐劑為咪喹莫特或瑞司密奎莫(resimiquimod)。
在本發明藥物組合物的一個優選實施方案中，佐劑為GM-CSF和咪喹莫特的組合物。
本發明的組合物可經非腸道注射使用，如皮下、皮內、肌肉、腹腔注射，也可口服。為此，肽和其他選擇性分子在藥用載體中分解或懸浮，優選為水載體。此外，組合物 可包含輔料，如：緩衝劑、結合劑、衝擊劑、稀釋劑、香料、潤滑劑等。這些肽也可與免疫刺激物質合用，如：細胞激素。可用於此類組合物的更多輔料可在從A.Kibbe所著的Handbook of Pharmaceutical Excipients(第3版，2000年，美國醫藥協會和制藥出版社)等書中獲知。此組合藥物可用於阻止、預防和/或治療腺瘤或癌性疾病，優選為結直腸癌。
EP2113253中有優選製劑。
細胞毒性T細胞(CTL)可識別與MHC分子而不是與完整外來抗原本身結合的以一種肽形式出現的抗原。MHC分子本身位於抗原呈現細胞的細胞表面。因此，只有出現肽抗原、MHC分子和APC三聚體複合物時，才可能啟動CTL。相應地，如果並非只有該肽用於啟動CTL，而是添加了含各MHC分子的額外APC，則可提高免疫反應。
因此，在本發明藥物組合物的一個優選實施方案中，另外至少包含一種抗原呈現細胞。
抗原呈現細胞(或刺激者細胞)通常在其表面有一個MHC-I類或II類分子，在一個實施方案中，該抗原呈現細胞自身基本上不能向MHC-I類或II類分子載入選定抗原。正如下面的更為詳細描述，MHC-I類或II類分子在體外可很容易載入選定抗原。
優選情況是，哺乳動物細胞的TAP肽轉運載體缺乏或水準下降或功能降低。缺乏TAP肽轉運載體的適合細胞包括人體肽載入缺陷細胞株T2，從屬美國菌種保藏中心(12301 Parklawn Drive,Rockville,Maryland 20852，美國)目錄號CRL1992；諸如T2的TAP缺陷細胞株可用作APC，並且由於缺乏TAP，幾乎所有由MHC I類分子呈現的肽均受到關注，用於外部載入這些細胞株的空載MHC-I類分子，因此所有作用都將無疑地歸因於使用的肽。
抗原呈現細胞優選為樹突狀細胞。適當的樹突狀細胞為自體樹突狀細胞，用抗原肽作脈衝處理。抗原肽可以是產生適當T細胞反應的任何合適的抗原肽。Murphy等人(1996)在《攝護腺》雜誌(The Prostate 29,371-380以及The Prostate 32,272-278)中披露了一種使用自體樹突狀細胞的T細胞療法，自體樹突狀細胞由一種抗原相關腫瘤的肽進行脈衝處理。
因此，在本發明的一個優選實施方案中，至少包含一種抗原呈現細胞的藥物組合物以該肽進行脈衝處理或進行載入，例如，通過實施例5所示方法。
作為一種替代物，抗原呈現細胞包括一個編碼肽的表達載體。多聚核苷酸可能選為任何合適的多聚核苷酸，優選為能轉導樹突狀細胞，從而呈現一種肽並誘導免疫性。
本發明的核酸優選為由一種病毒核苷酸或病毒組成。例如，腺病毒轉導的樹突狀細胞表明可誘導與MUC1相關的抗原特異性抗腫瘤免疫(參閱Gong et al(1997)Gene Ther.4,1023-1028).同樣地，可使用基於腺病毒的系統(例如參閱，Wan et al(1997)Hum.Gene Ther.8,1355-1363)；可使用逆轉錄病毒系統(Koch et al.,2006)J.Exp.Med.186, 1213-1221和Szabolcs et al(1997)；也可使用血液顆粒介導移轉至樹突狀細胞的方法{Tuting1997}Eur.J.Immunol.27,2702-2707)；亦可使用RNA(Ashley et al.,2007)J.Exp.Med.186,1177 1182)。
一般來說，本發明中，含有發明中的一種(多種)核酸的藥物組合物可用本發明中那些含有肽的藥物複合物的相似給藥方式給予，如：靜脈注射、動脈注射、腹腔注射、肌肉注射、皮內注射、瘤內注射、口服、經皮、經鼻腔、經口腔、經直腸、經陰道、吸入、或外用。
由於逃逸機制的原因，腫瘤往往對治療產生抗性。耐藥性可能在治療期間出現，並轉移和復發腫瘤中表現出來。為了避免這種耐藥性，腫瘤通常通過聯合給藥治療，轉移瘤和無病期後復發的腫瘤後往往需要不同的藥物組合來治療。因此，在本發明的一方面，藥物組合物與第二種抗癌藥物結合使用。第二種藥物可在本發明中的藥物組合物給藥之後給予，也可同時給藥。例如，如果化學性質相容，本發明中的藥物組合物可與第二種抗癌藥物混合使用，從而實現同時給藥。同時給藥的另一種方法是，本組合物與抗癌藥物同一天給藥，給藥途徑可不同，例如，本發明的藥物組合物可注射給藥，而第二種抗癌藥物可口服。藥物組合物和第二種抗癌藥物也可在同一療程給藥，但是不在同一天和/或在不同的療程內給藥。
另一個方面，本發明提出了一種治療或預防患者癌症的方法，包括給予患者本發明中的任何一種藥物組合物的有 效治療量。
有效治療量是指能引發免疫反應的量，特別是啟動CTL亞群。本領域的技術人員可使用免疫學標準方法很容易確定使用量是否有效，如：本說明書實施例中的方法。監測本藥物組合物某種量效果的方法是觀察受治療腫瘤的生長和/或其復發情況。
在本發明藥物組合物的一個特別優選實施方案中，本藥物組合物作為抗癌疫苗使用。
含肽組合物或肽編碼的核酸也可以構成腫瘤或癌症的疫苗。該疫苗可直接給到患者的受影響器官，也可全身給藥，或體外應用到來自患者或其細胞株的細胞(隨後再將這些細胞注入到患者中)，或體外用於從來自患者的免疫細胞的一個細胞亞群(然後再將細胞重新給予患者)。
本發明的藥物組合物可用於治療癌症或作為癌症疫苗使用。癌症可能為攝護腺(上皮)癌、口腔癌、口腔鱗狀細胞癌(OSCC)、急性髓性白血病(AML)(Qian et al.,2009)、幽門螺旋桿菌引起的MALT淋巴瘤(Banerjee et al.,2000)、結腸(上皮)癌/結直腸癌、膠質母細胞瘤、非小細胞肺癌(NSCLC)、宮頸(上皮)癌、人乳腺癌、攝護腺癌、結腸癌、胰腺癌、胰腺導管腺癌、卵巢癌、肝細胞癌、肝癌、不同表型的腦腫瘤、急性淋巴細胞白血病(ALL)等白血病、肺癌、尤因氏肉瘤、子宮內膜癌、頭頸部鱗狀細胞癌、喉上皮癌、食管癌、口腔(上皮)癌、膀胱癌、卵巢(上皮)癌、腎細胞癌、非典型腦膜瘤、乳頭狀甲狀腺癌、腦 腫瘤、涎腺導管癌、結外型T/NK細胞淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、肺癌和乳腺癌等惡性實體瘤，優選癌症為胃癌。
根據本發明，治療方法或疫苗的一個最優選實施方案中，疫苗為治療胃癌的一種多肽腫瘤疫苗。該疫苗優選包括從SEQ ID No.1至SEQ ID No.11選定的一系列腫瘤相關肽，它們已經被確定位於原發性胃癌細胞中。這些肽包括HLA-I類和II類肽。這些肽還可至少包括B肝病毒核心抗原中的一種肽(SEQ ID 23)，這種肽為陽性對照肽，作為檢測皮內給藥療效的免疫標記物。在一個特別的實施方案中，疫苗包括11種肽(根據SEQ ID No.1至SEQ ID No.11)，每種肽含量約為1500μg至75μg，優選為約1000μg至175μg，更優選為約500μg至600μg，最優選為約578μg，所有的肽都可用HPLC和離子交換色譜法進行純化，外觀為白色或類白色粉末。真空凍乾粉最好溶於碳酸氫鈉，在室溫下重組後30分鐘用於皮內注射。根據本發明，肽的首選含量約為0.1至100mg，優選為約0.1至1mg，最優選為每500mg溶液中約300μg至800μg。在此，如果未具體說明，「約」一詞系指給定值的+/-10%。技能嫺熟的人能根據以下因素調整肽的實際使用量，如：患者個體的免疫狀態和/或特定癌種所呈現的TUMAP含量。本發明的肽可能有其他形式(無菌溶液等)，而不是真空凍乾粉。
藥品組合物包括游離形式或以一種藥用鹽形式存在的肽。
此處使用的「藥用鹽」系指所公開的肽的一種衍生物， 其中該肽由制酸或藥劑的堿鹽進行改性。例如，酸性鹽採用自由基(通常其中藥物的中性形式具有一種中性-NH2基團)通過與合適酸發生反應而制得。適合製備酸鹽的酸包括有機酸，如：乙酸、丙酸、羥基酸、丙酮酸、草酸、蘋果酸、丙二酸、丁二酸、馬來酸、富馬酸、酒石酸、檸檬酸、苯甲酸酸、肉桂酸、扁桃酸、甲磺酸、甲磺酸、苯磺酸、水楊酸等等、以及無機酸，如：鹽酸、氫溴酸、硫酸、硝酸和磷酸等。相反，可在一種肽上呈現的酸性基團的堿鹽使用藥用堿基進行製備，如氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化銨、氫氧化鈣、三甲胺等等。
在特別優選的實施例中，藥物組合物包括乙酸(醋酸鹽)銨或鹽酸(氯化物)形式的肽。
在一個實施方案中，本發明的藥物組合物可能包括糖、糖醇、氨基酸(如：甘氨酸、精氨酸、谷氨酸等)作為骨架形成劑。這些糖可能為單糖、雙糖或三糖。這些糖可單獨使用，也可與糖醇組合。糖的實例包括：單糖(如：葡萄糖、甘露糖、半乳糖、果糖或山梨糖)、雙糖(如：蔗糖、乳糖、麥芽糖或海藻糖)以及三糖(如：棉子糖)。糖醇可能為，例如，甘露糖。優選成分為蔗糖、乳糖、麥芽糖、海藻糖、甘露醇和/或山梨醇，更優選為甘露醇。
此外，本發明的藥物組合物可能包括生理耐受性好的輔料(參見《藥用輔料手冊(Handbook of Pharmaceutical Excipients)》，第五版，Raymond Rowe、Paul Sheskey和Sian Owen編著，醫藥出版社(2006年))，抗氧化劑如：抗 壞血酸或谷胱甘肽，防腐劑如：苯酚、間甲酚、甲基或對羥苯甲酸丙酯、氯丁醇、硫柳汞或苯紮氯銨、穩定劑，骨架形成劑如：蔗糖、乳糖、麥芽糖、海藻糖、甘露糖、甘露醇和/或山梨醇，甘露醇和/或乳糖及增溶劑如：聚乙二醇(PEG)，即PEG3000、3350、4000或6000或環糊精，即羥丙基-β-環糊精、磺丁基醚-β-環糊精和γ環糊精、或右旋糖酐或泊洛沙姆，即泊洛沙姆407、泊洛沙姆188、或吐溫20、吐溫80。在一項優選實施方案中，本發明的藥物組合物包括一種或多種選自抗氧化劑、骨架形成劑和穩定劑組成的基團耐受性良好的輔料。
靜脈和肌注給藥可接受的pH值範圍為pH 2-12，但皮下給藥的pH範圍降至2.7-9.0，這是因為體內稀釋率降低，導致注射部位產生放射的可能性加大。Strickley Robert G.,Pharm.Res.,21,NO：2,201-230(2004)。
本發明中含肽和/或核酸的藥物製劑給予罹患與各種肽或抗原相關的腺瘤或癌性疾病患者。通過這種方法可以觸發T細胞介導的免疫反應。
根據本發明，優選的一種藥物組合物，其中(尤其是腫瘤相關的)肽、核酸或表達載體含量為組織、癌症和/或患者特異性含量。
本發明的另一實施方案中，疫苗為核酸疫苗。接種核酸疫苗(如DNA疫苗)編碼多肽會導致T細胞反應。該疫苗可直接給到患者的受影響器官，也可全身給藥，或體外應用到來自患者或其細胞株的細胞(隨後再將這些細胞注入到 患者中)，或體外用於從來自患者的免疫細胞的一個細胞亞群(然後再將細胞重新給予患者)。如果核酸給予體外細胞，可能有益於細胞轉染，以共同表達免疫刺激細胞激素，如白細胞介素-2或GM-CSF。核酸可完全單獨給藥，也可與免疫刺激佐劑或與免疫刺激細胞激素聯合使用，或以適當的輸送系統給藥，例如脂質體。核酸疫苗可與佐劑一起使用，如上述與肽疫苗一起使用的佐劑。核酸疫苗優選為不與佐劑聯合給藥。
多聚核苷酸可為基本純化形式，也可包被於載體或輸送系統。合適的載體和輸送系統包括病毒系統，如基於腺病毒、牛痘病毒、逆轉錄病毒、皰疹病毒、腺相關病毒或含一種以上病毒元素的混合病毒的系統。非病毒輸送系統包括陽離子脂質體和陽離子聚合物，都是DNA輸送本領域內熟知的方法。也可使用物理輸送系統，如通過基因槍摂。肽或核酸編碼的肽可以是一種融合蛋白，例如，含破傷風類毒素的一個表位(刺激CD-4陽性T細胞)。
適當的情況是，給予患者的任何核酸都是無菌、無熱原的。裸DNA可肌肉注射、皮內注射或皮下注射。核酸疫苗優選可包括任何合適的核酸輸送工具。核酸，優選為DNA，也可用一種脂質體或病毒載體輸送系統輸送。如果是核酸疫苗(如DNA疫苗)，首選注入肌肉，而肽疫苗首選皮下注射。疫苗也優選注入皮內。
我們認為，核酸的吸收和專業抗原呈現細胞(如樹突狀細胞)編碼的肽的表達可能是免疫反應的啟動機制所致； 然而，樹突狀細胞可能不會被轉染，但是由於它們可能會從組織中的轉染細胞中挑選出被表達的肽，因此仍然很重要(「交叉啟動」，例如，Thomas AM,Santarsiero LM,Lutz ER,Armstrong TD,Chen YC,Huang LQ,Laheru DA,Goggins M,Hruban RH,Jaffee EM.Mesothelin-specific CD8(+)T cell responses provide evidence of in vivo cross-priming by antigen-presenting cells in vaccinated pancreatic cancer patients.J Exp Med.2004 Aug 2；200(3)：297-306)。
Conry等(1996年)在《腫瘤學論文集》(Seminars in Oncology 23,135-147)中、Condon等(1996年)在《自然-醫學》(Nature Medicine 2,1122-1127)中、Gong等(1997年)在《自然-醫學》(Nature Medicine 3,558-561)中、Zhai等(1996年)在《免疫學雜誌》(J.Immunol.156,700-710)中、Graham等(1996年)在《國際癌症雜誌》(Int J.Cancer 65,664-670)中、Burchell等(1996)309-313在Breast Cancer,Advances in biology and therapeutics一文中、Calvo等(Eds)、John Libbey Eurotext都對多聚核苷酸介導的癌症免疫化治療進行了描述，以完整引用形式併入本文。
這也可能有益於疫苗特異性靶向作用於細胞群(例如抗原呈現細胞)，可使用局部注射、使用靶向性載體和輸送系統、或對患者該類細胞群的選擇性純化以及體外給予肽或核酸(例如，樹突狀細胞可按Zhou等人(1995年)在Blood 86,3295-3301中、Roth等人(1996年)在Scand.J. Immunology 43,646-651中所述的方法進行分類)。例如，靶向性載體可包括一個組織或腫瘤特異性啟動子，引導抗原在適當的位置表達。
最後，本發明的疫苗可由待治療患者具體的癌症類型、以及疾病狀態、早期治療方案、患者免疫狀態所決定，當然，還有患者的HLA單倍型。此外，根據特定患者的個人需求，本發明的疫苗可包含個性化成分。根據特定患者的相關TAA的表達、由於個人過敏或其他治療方法而產生的意外副作用、以及第一輪治療後對二次治療或治療方案的調整，各實施例中的肽含量有所不同。
本發明的肽除了用於治療癌症，也可用於診斷。由於肽由膠質母細胞瘤產生，並且已確定這些肽在正常組織中不存在，因此這些肽可用於診斷癌症是否存在。
含本發明肽的組織切片有助於病理師診斷癌症。用抗體、質譜或其他本領域內已知的方法檢測本發明的某些肽可使病理師判斷該組織為惡性的、炎症還是一般病變。本發明肽的提出使得能對病變組織進行分類或進一步分成子類。
對病變標本中本發明肽的檢測使得能對免疫系統治療方法的利益進行判斷，特別是如果T淋巴細胞已知或預計與作用機制有關。MHC表達的缺失是一種機制，充分說明了哪些受感染或哪些惡性細胞逃避了免疫監視。因此，本發明肽的提出表明，分析過的細胞並沒有利用這種機制。
本發明的肽可用于分析對本發明肽發生的淋巴細胞反應 (如T細胞反應)，或對本發明肽發生的抗體反應，或分析本發明中與MHC分子絡合的肽。這些淋巴細胞反應可以作為預後指標，決定是否採取進一步的治療。這些反應也可以用作免疫療法中的替代指標，旨在以不同方式誘導淋巴細胞反應，如接種蛋白疫苗、核酸、自體材料、淋巴細胞過繼轉移。基因治療中，對本發明肽發生的淋巴細胞反應可以在副作用的評估中考慮。淋巴細胞反應監測也可能成為移植療法隨訪檢查中的一種有價值的工具，如，用於檢測移植物抗宿主和宿主抗移植物疾病。
在另一個方面，本發明涉及一個套件，包括(a)一個容器，包含上述溶液或凍乾粉形式的藥物組合物；(b)可選項，第二個容器，含凍乾粉劑型的稀釋劑或重組溶液；及(c)可選項，(i)使用溶液或(ii)重組和/或使用凍乾粉劑型的說明書。該套件還步包括一個或多個(iii)緩衝劑，(iv)稀釋劑，(v)過濾液，(vi)針，或(v)注射器。容器優選為瓶子、西林瓶、注射器或試管；也可為多用途容器。藥物組合優選為凍幹粉劑。
本發明中的套件優選包含一種置於合適容器中的凍幹製劑以及重組和/或使用說明。適當的容器包括，例如瓶子、西林瓶(如雙室瓶)、注射器(如雙室注射器)和試管。該容器可能由多種材料製成，如玻璃或塑膠。優選情況是，套件和/或容器上有說明，表明重組和/或使用的指示。例如，標籤可能表明凍幹劑型將重組為上述肽濃度。該標籤可進一步表明製劑用於皮下注射。
存放製劑的容器可使用多用途西林瓶，使得可重複給予(例如，2-6次)重組劑型。該套件可進一步包括裝有合適稀釋劑(如碳酸氫鈉溶液)的第二個容器。
稀釋液和凍幹製劑混合後，重組製劑中的肽終濃度優選為至少0.15mg/mL/肽(=75靰g)，不超過3mg/mL/肽(=1500靰g)。該套件還可包括商業和用戶角度來說可取的其他材料，包括其他緩衝劑、稀釋劑，過濾液、針頭、注射器和帶有使用說明書的包裝插頁。
本發明中的套件可能有一個單獨的容器，其中包含本發明所述的藥物組合物製劑，該製劑可有其他成分(例如，其他化合物或及其藥物組合物)，也可無其他成分，或者每種成分都有其不同容器。
優選情況是，本發明的套件包括與本發明的一種製劑，包裝後與第二種化合物(如佐劑(例如GM-CSF)、化療藥物、天然產品、激素或拮抗劑、抗血管生成劑或抑制劑、凋亡誘導劑或螯合劑)或其藥物組合物聯合使用。該套件的成分可進行預絡合或每種成分在給予患者之前可放置於單獨的不同容器。該套件的成分可以是一種或多種溶液，優選為水溶液，更優選為無菌水溶液。該套件的成分也可為固體形式，加入合適的溶劑後轉換為液體，最好放置於另一個不同的容器中。
治療套件的容器可能為西林瓶、試管、燒瓶、瓶子、注射器、或任何其他盛裝固體或液體的工具。通常，當成分不只一種時，套件將包含第二個西林瓶或其他容器，使之 可以單獨定量。該套件還可能包含另一個裝載藥用液體的容器。優選情況是，治療套件將包含一個設備(如，一個或多個針頭、注射器、滴眼器、吸液管等)，使得可注射本發明的藥物(本套件的組合物)。
本發明的藥物配方適合以任何可接受的途徑進行肽給藥，如口服(腸道)、鼻內、眼內、皮下、皮內、肌內，靜脈或經皮給藥。優選為皮下給藥，最優選為皮內給藥，也可通過輸液泵給藥。
應該認識到，此處披露和描述的本發明特點不僅可聯合使用，而且也可以單獨的方式使用，只要在本發明的預期用途範疇內。為了本發明之目的，所有參考文獻均以完整引用的形式併入本文。
下列參考圖、序列表和實施例將對本發明進行詳細描述。以下實施例僅作為說明之用，而不是為了限制本發明。
實施例
1. 合成
肽通過使用Fmoc策略以標準、廣為接受的固相肽合成法合成。用製備方法RP-HPLC純化之後，進行離子交換純化程序從而加入生理相容性反離子(例如，醋酸、氨或氯化物)。最後，在凍幹後制得白色至類白色固體。所有的TUMAP優選作為醋酸鹽進行給藥，其他鹽形式也可以。
重要的是，每個肽的身份和純度已使用質譜和RP-HPLC 分析法確定。離子交換程序後，用凍幹法獲得白色至類白色的肽，純度如表7所示：
所有的肽接受測試其不同物理化學條件下(如：不同溫度和pH值)的穩定性。
2. 典型藥物組合物IMA941的組成
IMA941由合成腫瘤相關肽(TUMAP)的混合物組成，其中大部分已在原發性結直腸癌細胞中得到確定。TUMAP包括10種能啟動細胞毒性T細胞(CD8+T細胞)的HLA-I類結合肽、1種能啟動T輔助細胞(CD4+T細胞)的HLA-II類結合肽。輔助性T細胞通過釋放細胞激素而輔助細胞毒性T細胞 的功能，此類細胞激素能提高CD8+T細胞殺傷力，也可直接作用於腫瘤細胞(Knutson and Disis,2005)。除了這11種TUMAP外，IMA941也可能包含一種病毒控制肽。
手術切除的惡性腫瘤樣本和GBM患者的正常組織以及健康供體的血液以循序漸進的方法進行分析：
首先，使用微陣列全基因組mRNA表達分析法來確定惡性腫瘤組織與一系列正常器官和組織相比過量表達的基因。在第二個步驟中，惡性腫瘤的HLA配體用質譜法確定。隨後，確定的HLA配體與基因表達資料進行比較。第1步中檢測到的選擇性表達或過量表達基因所編碼的肽考慮為多肽疫苗的合適候選TUMAP。
最後，使用多種免疫檢測方法(體外T細胞檢測法)檢測健康個體中的外周血CD8+T細胞對腫瘤相關HLA配體的活性。
3.腫瘤樣本IMA941所包含的細腫瘤相關肽(TUMAP)的呈現
組織樣本
患者腫瘤組織由日本大阪的京都府立醫科大學(KPUM)和日本大阪的大阪市立大學醫學研究生院(OCU)提供。所有患者在手術前都獲得了書面知情同意。手術後立即用液態氮對組織進行冷休克處理，在分離TUMAP前儲存於-80℃下。
從組織樣本中分離HLA肽
根據方案(Falk et al.,1991)(Seeger et al.,1999)略加修 改，使用HLA-A、HLA-B、HLA-C特異性抗體W6/32、CNBr活化的瓊脂糖凝膠、酸處理和超濾方法以固體組織的免疫沉澱法獲得了冷休克組織樣本的HLA肽庫(Falk,K.1991；Seeger,F.H.T1999)。
用電噴霧-液相色譜質譜(ESI-LCMS)檢測TUMAP
獲得的HLA肽庫根據其疏水性用反相色譜(Acquity UPLC system,Waters)分離，洗脫肽用裝有電噴霧源的LTQ-Orbitrap雜交質譜(ThermoElectron)進行了分析。肽庫被直接載入填充有1.7μm C18反相材料(Waters)的分析用熔煉石英微毛細管柱(75μm內徑x250mm)，應用流速為400nL每分鐘。隨後，使用來自流速為300nL每分鐘、濃度為10%至33%溶劑B中的兩步180分鐘二元梯度法對肽進行分離。梯度由溶劑A(含0.1%甲酸的水)和溶劑B(含0.1%甲酸的乙腈)。金鍍膜玻璃毛細管(PicoTip,New Objective)用於引入到納升電噴霧源。使用前5(TOP5)策略在資料依賴模式下操作LTQ-Orbitrap質譜儀。簡言之，首先以高精確品質完全掃描在orbitrap開始一個掃描週期(R=30 000)，之後用先前選定離子的動態排除技術在orbitrap中對5種含量最為豐富的前體離子進行MS/MS掃描(R=7500)。串聯質譜以SEQUEST和另一種手動控制器進行解讀。生成的自然肽破碎模式與合成序列相同參考肽的破碎模式進行比較後，確保了被識別的肽序列。圖1顯示了從腫瘤組織中獲得的MHC I類相關肽CDC2-001的一個典型譜及其在UPLC系統中的洗脫譜。
實施例2：
編碼本發明肽的基因的表達譜
並不是所有確定為由MHC分子呈現于腫瘤細胞表面的肽都適合用於免疫治療，這是因為這些肽大部分都由許多類型細胞表達的正常細胞蛋白衍生而來。這些肽只有很少一部分具有腫瘤相關性，並可能能夠誘導對其來源腫瘤識別有高特異性的T細胞。為了確定這些肽並最大限度地降低這些肽接種所誘導的自身免疫風險，發明人主要採用從過量表達於腫瘤細胞上(與大多數正常組織相比)的蛋白中所獲得的肽。
理想的肽來源於對該腫瘤獨一無二且不出現於其他組織中的蛋白中。為了確定具有與理想基因相似表達譜的基因所產生的肽，確定的肽被分別分配到蛋白和基因中，從中獲得基因並生成這些基因的表達譜。
RNA來源與製備
手術切除組織標本由兩個不同的臨床中心(參見實施例1)在獲得每名患者的書面知情同意後提供。手術後立即在液態氮中速凍腫瘤組織標本，之後在液態氮中用杵臼勻漿。使用TRI試劑(Ambion公司，Darmstadt，德國)之後用RNeasy(QIAGEN公司，Hilden，德國)清理從這些樣本中製備總RNA；這兩種方法都根據製造商的方案進行。
健康人體組織中的總RNA從商業途徑獲得(Ambion公司，Huntingdon，英國；Clontech公司，海德堡，德國；Stratagene公司，阿姆斯特丹，荷蘭；BioChain公司， Hayward,CA，美國)。混合數個人(2至123個人)的RNA，從而使每個人的RNA得到等加權。白血球從4個健康志願者的血液樣本中分離獲得。
所有RNA樣本的品質和數量都在Agilent 2100 Bioanalyzer分析儀(Agilent公司，Waldbronn，德國)上使用RNA 6000 Pico LabChip Kit試劑盒(Agilent公司)進行評估。
微陣列實驗
所有腫瘤和正常組織的RNA樣本都使用Affymetrix Human Genome(HG)U133A或HG-U133 Plus 2.0Affymetrix寡核苷酸晶片(Affymetrix公司，Santa Clara，CA，美國)進行基因表達分析。所有步驟都根據Affymetrix手冊進行。簡言之，如手冊中所述，使用SuperScript RTII(Invitrogen公司)以及oligo-dT-T7引物(MWG Biotech公司，Ebersberg，德國)從5-8μg RNA中合成雙鏈cDNA。用BioArray High Yield RNA Transcript Labelling Kit(ENZO Diagnostics公司，Farmingdale,NY，美國)進行U133A測定或用GeneChip IVT Labelling Kit(Affymetrix公司)進行U133 Plus 2.0測定，之後用鏈黴親和素-藻紅蛋白和生物素化抗鏈黴素蛋白抗體(Molecular Probes公司，Leiden，荷蘭)進行破碎、雜交和染色，這樣完成體外轉錄。用Agilent 2500A GeneArray Scanner(U133A)或Affymetrix Gene-Chip Scanner 3000(U133 Plus 2.0)對圖像進行掃描，用GCOS軟體(Affymetrix公司)在所有參數默認設置情 況下對資料進行分析。為了實現標準化，使用了Affymetrix公司提供的100種管家基因(housekeeping gene)。相對表達值用軟體給定的signal log ratio進行計算，正常腎組織樣本的值任意設置為1.0。
本發明的源基因在胃癌中高度過量表達的表達譜如圖2所示。
4. IMA941 MHC-I類呈現肽的體外免疫原性
為了獲知關於本發明的TUMAP免疫原性方面的資訊，我們使用了Walter,S、Herrgen,L、Schoor,O、Jung,G、Wernet,D、Buhring,HJ、Rammensee,HG和Stevanovic,S等人2003年在Cutting edge：predetermined avidity of human CD8 T cells expanded on calibrated MHC/anti-CD28-coated microspheres,J.Immunol.,171,4974-4978一文中所述的被廣為接受的體外刺激平臺進行了研究。使用此平臺，本發明10種HLA-A*2402限制TUMAP可顯示出免疫原性，從而表明這些肽為對抗人CD8+前體T細胞的T細胞表位(表6)。
CD8+T細胞體外啟動
為了用載有肽-MHC複合物(pMHC)和抗CD28抗體的人工抗原呈現細胞(aAPC)進行體外刺激，我們首先從Tuebingen血庫中獲取健康供體白血球清除術後新鮮HLA-A*24產物而分離出CD8T細胞。
然後，以白血球清除術所得產物直接豐富CD8T細胞，或首先運用標準梯度分離介質(PAA公司，Cölbe，德國)分離出PBMC(外周血單核細胞)。分離出的CD8淋巴細胞或 PBMC使用前在T細胞培養基(TCM)中培養，培養基包括RPMI-Glutamax(Invitrogen公司，Karlsruhe，德國)並補充10%熱滅活人AB血清(PAN-Biotech公司，Aidenbach，德國)、100U/ml青黴素/100μg/ml鏈黴素(Cambrex公司，Cologne，德國)，1mM丙酮酸鈉(CC Pro公司，Oberdorla，德國)和20μg/ml慶大黴素(Cambrex公司)。在此步驟，2.5ng/ml的IL-7(PromoCell公司，Heidelberg，德國)和10U/ml的IL-2(Novartis Pharma公司，Nürnberg，德國)也加入TCM。CD8+淋巴細胞使用MicroBeads(Miltenyi Biotec公司，Bergisch-Gladbach，德國)通過正向選擇進行分離。
pMHC/抗-CD28塗層珠的生成、T細胞的刺激和讀出方法如前所述(Walter et al.,2003)並作微小改動。簡言之，製備了缺乏跨膜域和在重鏈羧基端生物素化的生物素化載肽重組HLA-A*2402分子。純化的共刺激小鼠IgG2a抗人CD28抗體9.3(Jung et al.,1987)使用製造商(Perbio公司，波恩，德國)推薦的N-羥基琥珀醯亞胺生物素進行化學生物素化處理。所用珠為5.6μm的大鏈黴抗生物素蛋白包裹的多聚苯乙烯顆粒(Bangs Labooratories，伊利諾州，美國)。作為對照的pMHC分別為A*0201/MLA-001(從Melan-A/MART-1中修飾制得的肽ELAGIGILTV)和A*0201/DDX5-001(從DDX5中獲得的YLLPAIVHI)。
800.000珠/200μl包裹於96孔板，以600ng生物素抗CD28+200ng相關生物素pMHC(高密度珠)存在。在37℃ 下，在含5ng/ml IL-12(PromoCell)的200μl TCM中共培養1x106 CD8+T細胞與2x105的清洗塗層珠3至4天，從而在96孔板中啟動刺激。之後，一半培養基與補充80U/ml IL-2的新鮮TCM進行交換，並且在37℃下持續培養3至4天。這種刺激週期總共進行3次。最後，用Live/dead-Aqua染料(Invitrogen公司，Karlsruhe，德國)、CD8-FITC抗體複製SK1(BD公司，Heidelberg，德國)和PE-或APC-耦合A*2402 MHC多聚體染色而執行多聚體分析。對於分析，使用了配有合適鐳射儀和篩檢程序的BD LSRII SORP細胞儀。肽特異性細胞以占總CD8+細胞的百分比形式進行計算。多聚體分析結果使用FlowJo軟體(Tree Star公司，Oregon，美國)進行評估。特定多聚體+CD8+淋巴細胞的體外填裝用適當的門控技術以及與陰性對照刺激組比較而進行檢測。如果健康供體中的至少一個可評價的體外刺激孔在體外刺激後發現含有特異性CD8+T細胞株(即該孔包含至少1%特定多聚體+CD8+細胞，並且特定多聚體+的百分比至少為陰性對照刺激中位數的10倍)，則檢測給定抗原的免疫原性。
IMA941肽的體外免疫原性
對於受到測試的HLA-I類肽，可通過肽特異性T細胞株的生成證明所有14種肽均具有體外免疫原性。TUMAP特異性多聚體對本發明的兩種肽染色後流式細胞儀檢測的典型結果如圖3所示，同時也含有相應的陰性對照資訊。本發明中肽的結果匯總於表8，提出了本發明HLA I類肽的體 外免疫原性。體外免疫原性實驗的結果顯示了可評估肽中的受測試陽性供體和板孔的百分比。每個肽至少有兩個供體和24個板孔可評估。
5. IMA941 II類TUMAP BIR-002的免疫原性
為了確認含有SEQ ID NO：11肽的免疫原性，進行了一項臨床研究。
主要研究目標是：在未檢測到明確的轉移病灶且攝護腺癌根治術後出現生物化學復發的患者中，對皮下注射攝護腺特異性肽(接種療法)的基於PSA(攝護腺特異抗原)的反應(PSA-R)。
次要研究目標是：在患有特別考慮為T細胞反應相關的免疫現象的攝護腺癌患者中，研究給予接種療法的耐受性和可行性。
該研究設計為前瞻性、隨機I/II期研究，適應症為「未檢測到明確的轉移病灶且攝護腺癌根治術後出現生物化學復發」。
研究人群
作為本I/II期研究的一部分，我們試圖通過在攝護腺癌根治術後出現生物化學復發的HLA-A*02+患者中接種攝護腺特異性肽從而誘導PSA衰退作為腫瘤生長停止的指標。攝護腺特異性肽的組合物經皮下注射，並在抗原性結構的各種給藥方式下評估各自的免疫反應程度。
相對於以前的疫苗接種研究，本研究計畫的目標是治療腫瘤負荷小且影像學程序不能檢測出的患者。所有的患者都使用已知的攝護腺特異性抗原結構的同樣方式進行免疫，以增強對惡性轉化細胞的免疫反應。19例患者接受了治療。
治療計畫
在使用電腦斷層掃描和骨骼顯像排除明顯的轉移病灶後，根據不同的給藥方式將攝護腺特異性肽疫苗皮下注射至在攝護腺根治術後檢測到PSA復發的患者中(PSA在至少14天間隔的兩次測量中上升了50%)。該疫苗在每8天的倍數給予，即第0、7、14、28、42和56天給予(每個肽以及每次注射量約為100微克)。每次接種治療以及在第70天，測定PSA以評估治療反應。
如果檢測到了腫瘤反應(完全緩解[PSA-CR]、部分緩解[PSA-PR]、或病程穩定[無變化，PSA-NC])，則接受了疫苗的患者根據所選擇的給藥方式每月維持一次。對患者的免疫治療反應進行了評估，詳細如下：
完全緩解(PSA-CR)：在間隔至少4周後測量確定：最初升高的PSA水準正常化。正常化定義為PSA最低值<0.2ng/ml，這是完全摘除腫瘤或攝護腺的攝護腺癌根治術後的預期值。
部分緩解：a)PSA-PR Ü 80%(在間隔至少4周後測量確定最初升高的PSA水準下降80%)；以及b)PSA-PR U 50%(在間隔至少4周後測量確定最初升高的PSA水準下降50%。)
病情穩定(PSA-SD)：在至少四周後無顯著變化。這包括 在間隔至少4周後測量確定具有穩定性以及下降小於50%、升高小於10%。
進展(PSA-PD)：PSA水準上升超過10%。如果PSA進展，則終止研究。
在患者進入研究後，使用表位特異性疫苗；考慮在攝護腺上皮細胞(如：PSMA/PSCA)中特異性表達的蛋白。除了研究注射疫苗的一般療效(PSA監測方法評估的殘留腫瘤生長分數)，本研究還研究了各種接種方法的效果(免疫系統的有效調製)。除了僅僅單獨皮下注射該肽之外，還使用了佐劑的各種組合物。特別是，用了Montanide(適合用於人身上的一個經典的不完全弗氏佐劑)肽疫苗的長效和輔助活性，最近其被描述為十分有利。為此，500μL肽溶液以500μl Montanide混合，之後給藥。因此，製成油水乳劑，在數周內緩慢釋放水相中所含的抗原。該乳劑的物理穩定性非常高，可在4℃的環境下儲存3個月以上，並且無明顯相位分離。Montanide的長效功能數個疫苗接種試驗中得到了使用，並且獲得良好效果(Oka et al.,2004)。
有一個研究組研究了以生長因子、GM-CSF、Leukine®注射液伴隨刺激期間的接種療效。GM-CSF是肽接種試驗中非常常用的一種佐劑，這些研究中有幾個研究報告提高了臨床及T細胞反應。最初，GM-CSF為樹突狀細胞招募和分化因子，被認為可增加疫苗注射部位的樹突狀細胞的數量。雖然GM-CSF不能自身啟動抗原，將細胞呈現為樹突狀細胞和巨噬細胞，但是有體內間接啟動的報導 (Molenkamp et al.,2005)。
另一個研究組研究了經上皮細胞使用咪喹莫特伴隨活化樹突狀細胞期間接種的療效。咪喹莫特以5%軟膏(Aldara)給予。它通過對TLR7陽性細胞(如：漿細胞樣DC、朗格漢斯細胞、皮膚DC)的作用而具有強免疫刺激性，並啟動MyD88依賴性途徑。被啟動的APC釋放T細胞刺激性和炎症細胞激素，上調共刺激和遷移到引流淋巴結。通過將抗原混合至軟膏或通過向皮下或皮內注射抗原部位應用Aldara，從而使咪喹莫特有可能加強肽誘導的CTL反應，這已經在動物模型中得到證明。
另一個研究組通過將樹突狀細胞與魚精蛋白穩定的mRNA編碼粘蛋白-1混合以將其伴隨啟動以活化TLR 7/8，該組研究了在所述伴隨啟動期間接種的療效。mRNA顯示了小鼠和人免疫細胞群的廣泛啟動。該製劑中聚鹼性蛋白魚精蛋白的存在提高了mRNA的半衰期並誘導了可能長效粒子的形成。因此，這種佐劑可與長效特性和APC啟動特性結合。
總之，該疫苗的給予方式包括以下方法：
- Montanide乳化肽疫苗的皮下注射
- 500μl Montanide中乳化肽疫苗的皮下注射聯合外用225μl GM-CSF，以期達到伴隨生長因子給藥所引發的更強的免疫反應
- 500μl Montanide中乳化肽疫苗的皮下注射聯合局部熱療，後者的目的是達到熱誘導的更強的免疫反應
- 500μl Montanide中乳化肽疫苗的皮下注射聯合經上皮給予咪喹莫特，以通過TLR 7啟動樹突狀細胞
- 500μl Montanide中乳化肽疫苗與55μl粘蛋白-1mRNA/魚精蛋白一起皮下注射，以通過TLR 7/8啟動樹突狀細胞
日程表：本研究為期3年。
攝護腺特異性肽疫苗在第0、7、14、28、42和56天給予患者。對於病情穩定或獲得客觀腫瘤反應(PSA-CR或PSA-PR)的患者，每月皮內注射接種一次疫苗直到發生可檢測到的進展。根據迄今為止的經驗，肽注射液可耐受且沒有明顯不良反應。由於對接種療法的反應僅根據PSA測量進行了血清學評估，因此，在研究開始時進行一項測試以確定注射的疫苗是否干擾體外的PSA測量值，這可刺激臨床反應。在第0、7、14、28、42、56和70天，抽取血液樣本做化驗、PSA水準、血細胞分類計數、FACS分析和細胞激素測試。如果連續治療到第70天，則進行為期6周的PSA監測，以便及時發現治療失敗。
如果疾病進展得到證明且伴有PSA持續升高，則結束治療。
從第84天開始，繼續運用免疫療法，間隔時間為4周，直到發生可證明的進展或至第420天(第15個月)。在本研究外繼續治療(在成功病例中)的決定在逐個病例的基礎上作出。本研究未發生意料之外的不良反應。
該實驗室測試包括凝血、電解質、LDH、ß2-M、CK、肝酶、膽紅素、肌酐、尿酸、總蛋白、CRP、塗片血細胞 分類計數、PSA水準、細胞激素、FACS、Elispot。
皮膚對定義細菌和真菌抗原的反應(注射48-72小時後，T細胞介導的遲發型超敏反應(DTH))的分析在本研究開始前將作為患者細胞免疫系統的分析。
研究所需的肽(九肽)由PD Dr.Stefan Stevanovic實驗室在Prof.H.-G.Rammensee部製造。這些肽用HPLC法進行純化和質譜分析。這些肽的純度也可用HPLC、質譜和Edman測序法進行檢查。使用這些方法，純度可高達98%(根據當前方法的狀態必須視為最高值)。所合成的肽溶於DMSO(CryoSure,WAK Chemie Medical GmbH；10mg/ml)中，在Ampuwa(Fresenius Kabi)中稀釋為1：10，並在無菌條件下分成等份。
臨床反應
在兩名患者中，在連續直腸指檢發現局部腫瘤後，PET-CT掃描可顯示局部復發。在其餘的17名患者中，在終止研究時，無法證實疾病活躍部位。
血細胞分類計數或大量臨床化學的的重複實驗室評估未發現研究期間有任何異常。
在這19例患者中，有16例對根據SEQ ID NO：12所述的生存素II肽(IFN-g ELISPOT,+/- ICS)發生反應。其中，有12名患者在疫苗接種後，誘導了抗生存素T細胞反應。有2名患者之前存在抗T細胞以及2名患者未確定之前是否存在豐富的抗生存素T細胞。
生化反應
根據PSA初次升高後合作實驗室最低可檢測值，完全反應被視為不可檢測的PSA值。測量值必須在至少間隔4周後確認。PR>80%和>50%必須在四周後做相應的重新評估。PSA下降小於50%或升高小於10%反映了病情穩定(如果在至少四周後確認)。疾病進展被視為在治療開始時PSA上升超過10%。
終止研究的患者的生化反應得到跟蹤，直到他們獲得了放射或抗荷爾蒙療法的進一步治療。
19例患者同意參加並且對資料進行了分析，隨訪最長為時約3.75年。
PSA穩定性和DT升高
根據上述生化反應的標準：治療開始時PSA值上升不超過10%，2例(10.2%)患者在研究結束時PSA值表現出穩定性(圖6，表10、11、12)。在最後一次注射疫苗後的14和16月分別對上述兩名病例進行了隨訪。在資料截止時，穩定的平均時間為24個月(28和31個月)，平均接種了18(14和20)次疫苗。
在這兩個患者中，1例患者顯示部分反應>50%的時間為9個月，之後一段時間PSA緩慢上升，倍增時間為20.5個月，相比之下，疫苗接種之前倍增時間為9.8個月。初始PSA在pT2pN0 Gleason 5腫瘤手術後18個月開始復發。
分析資料發現，8號患者自28個月前接種計畫開始以來病情穩定。在第10個月以及第14次疫苗接種後因過敏反應而停止了治療。他存在不利的pT3b Gleason 3+4情況，在 攝護腺癌根治術後PSA值不低於0.6ng/ml，在術後首次下降後PSA很快進展。倍增時間從6.6個月減緩至148個月。
這兩名患者在每次接種肽疫苗時都在給藥部位皮下注射咪喹莫特。
PSA DT升高，PSA不穩定
第11號患者的PSADT在研究的六個月期間從1.5個月上升至10.1個月。開始時他的PSA值為10.8ng/ml，在終止研究程序接受抗雄激素單一療法時，進展至17.8ng/ml，但PET-CT未發現可見的惡性病變。他接受了Aldara作為佐劑。
第16號患者開始進入疫苗治療+粘蛋白-1-mRNA/魚精蛋白，倍增時間為6.1個月間。五個月期間的PSA速率下降至半衰期為2.7個月，之後，PSA DT經統計學計算為上升14.4個月，且在治療後持續16個月。最初PSA為0.29ng/ml，在治療期間的前5個月內下降至0.19ng/ml，在以後的8個月內上升至0.4ng/ml，在治療開始19個月後按研究方案終止研究時，為0.41ng/ml。
PSA進展
根據接種疫苗前估計的PSA倍增時間，第5號患者在研究期間出現了進展。但是，截止資料顯示，在治療結束繼續10個月後，他的PSA值下降，半衰期為20.2個月。他在接種疫苗結束後仍未接受任何二次治療。他接受了montanide疫苗注射作為唯一的佐劑。
表10：按月計算的PSA倍增時間
7.將本發明中的HLA-I類限制肽與HLA-A*0201結合
目的和摘要
本分析的目的是評價HLA-I類肽對HLA-A*0201等位元基因編碼的MHC分子的親和力，因為這是IMA941作用模式的一項重要參數。IMA941和MET-001中全部10種HLA-I類限制肽都對HLA-A*0201具有中度至高度的親和力，解離常數(KD)範圍為0.14(MET-001)到2.05nM(CSP-001)。所有值均在0.1(強力結合劑HBV-001)至4.4(中等強度結合劑MUC-001)。這些結果證實了IMA941候選疫苗和MET-005衍生的MET-001的所有HLA I類肽均對HLA-A*02具有結合親和力。
測試原理
穩定HLA/肽複合物包括三種分子：HLA重鏈、β-2微球蛋白(b2m)和肽類配體。變性重組HLA-A*0201重鏈分子的活性便可進行保存，使之功能與「空載HLA-A*」相當。被稀釋為包含b2m和相應肽的水緩衝液後，這些分子以完全肽依賴方式迅速有效地折疊。這些可用的分子用於基於ELISA的檢測方法中，來衡量肽和HLA-I類分子相互作用 間的親和力(Sylvester,2002)。
純化的重組HLA-A*0201分子與b2m、不同等級劑量的肽一起培養。與不具備HLA-I類結合能力的全長MET-005相反，通過自然抗原加工、MET-005體內產生並被證實的A*0-結合產物MET-001被納入分析。從頭折疊HLA/肽複合物的量用定量ELISA法測定。解離常數(KD值)使用從校準HLA/肽複合物稀釋液中記錄的標準曲線進行計算。
結果
結果如圖2所示。較低的KD值反映了對HLA-A*0201具有較高的親和力。大多數IMA941肽對HLA-A*0201都具有相似的較強親和力，範圍為0.1(HBV-001，強力結合劑)到44.4nM(MUC-001，中等強度結合劑)。因而，所有IMA941 I類TUMAP均對MHC分子A*02具有中等至較強的親和力。
8.本發明中的HLA-II類限制肽與HLA-DR結合
目的和摘要
II類TUMAP啟動輔助性T細胞，輔助性T細胞在協助I類限制TUMAP引發的CTL功能中起到了至關重要的作用。IMA941 II類肽與集中不同的HLA-II類分子結合(混雜結合)對於確保多數接受候選疫苗IMA941的患者能夠從支持性輔助T細胞反應中獲益非常重要。例如，最顯性表達的人類HLA-II類分子HLA-DR具有高度多態性，含有數百種已知等位基因。基於HLA-DRB1單體型的已知等位元基因頻率和完善的結合演算法，可預測，IMA941-IMA-BIR-002 和IMA-MET-005-中的HLA II類配體均是混雜HLA-DR結合肽。具體來說，對於兩種IMA941 II類TUMAP，HLA-A*02-陽性白種人表達至少一種適當的HLA-DR等位基因的概率大於90%。至於其餘的人II類等位基因HLA-DQ和-DP，由於缺乏頻率資料或結合預測演算法，從在此計算中忽略，實際混雜比例很有可能更高。對於已知的泛DR表位(PADRE，基因型頻率Fprojected=93.1%)，兩種IMA941 II類TUMAP計算所得的混雜性範圍相同。此外，這些肽的混雜結合在實驗中通過體外結合方法進行了確認。另外，對於IMA-BIR-002，證實了體內高免疫原性(見前文)。總而言之，這些結果確認了MET-005和BIR-002是混雜HLA-DR結合肽。
結合預測定律
使用Tübingen大學開發的SYFPEITHI演算法(Rammensee et al.,1997；Rammensee et al.,1999)，對IMA941 II類TUMAP與幾種常見HLA-DR等位基因的結合進行排名。該演算法已被成功地用於確定來自廣泛抗原，如，來自人類腫瘤相關抗原TRP2(I類)(Sun et al.,2000)和SSX2(II類)(Neumann et al.,2004)的I類和II類表位。結合閾值根據對公佈的已知混雜HLA-DR配體的結合分數分析而被定義為18分。
使用了HLA-A*02陽性白種人人群中的已公佈的HLA-DR單體型頻率(Mori et al.,1997)以及高清晰度單體型頻率(Chanock et al.,2004)(見表2)。該單體型頻率是個體染色 體上獨特等位元基因的頻率。由於哺乳動物細胞內的二倍體染色體組，該等位元基因的基因型出現頻率較高，可以使用Hardy-Weinberg定律進行計算(基因型出現頻率F中的單體型頻率Gf結果(F=2Gf-Gf 2])。
已知SYFPEITHI矩陣的DRB1-單體型頻率和A*02+白種人人群中的已知個體頻率之和為47.8%。因此，預計II類TUMAP與這些等位基因的結合分佈為剩餘的52% DRB1等位元基因，這些資料尚未獲得。
最後，混雜結合被定義為一種肽與幾種HLA-DR等位基因結合，並且其中之一在白種人群中表達的概率至少為50%。
體外結合檢測方法原則(ProImmune REVEALTM)
IMA-BIR-002和IMA-MET-005與HLA-DR寬抗原(HLA-DR1至DR7，也包括分裂抗原HLA-DR11至-DR15(Mori et al.,1997))集合，並使用REVEALTM MHC：肽結合分析方法(ProImmune,Oxford,UK)以確定合併入MHC分子的水準。在此檢測方法中，結合力與合格/不合格對照結合劑、以及每種HLA-DR抗原陽性對照肽的結合力進行比較。
結果
根據SYFPEITHI演算法預測，IMA-BIR-002可能與含已知結合基序的7/8個HLA-DR等位基因結合(表11)。對於IMA-BIR-002，HLA-A*02陽性白種人表達至少一種適當的HLA-DRB1等位基因的概率為92.6%。因此，兩種IMA941 II類肽被預測為是混雜HLA-DR結合劑。
如果結合HLA-DRB1等位元基因的單體型頻率通過本方法的第二個因子被估計過高，則其在IMA941中對於所有II類TUMP的基因型發生率仍然高於50%。此外，IMA-BIR-002與HLA-DR1、3、4和11的混雜結合的實驗性確認通過體外結合資料進行(圖3)。
由於在針對含不同HLA-DR等位基因的攝護腺癌患者的臨床試驗中已經證明IMA-BIR-002具有廣譜免疫原性，該II類肽的混雜性已在體內得到明確證實。
總之，IMA941包含的這兩種II類肽的HLA-DR結合特性的電腦模擬分析以及體外檢測和BIR-002臨床試驗的其他實驗證據強有力地表明，這些TUMAP是人類II類HLA分子的混雜結合劑。
表11：IMA941 II類TUMP與含已知結合基序的HLA-DR等位元基因的結合分數。表中顯示的是白種人群中最常見HLA-DRB1等位基因的SYFPEITHI結合分數。p為HLA-A*02陽性白種人的單體型頻率。如果分數等於或大於18，則肽被視為與HLA分子結合。結合DRB1等位基因的p值累積為最小單體型頻率pmin。所有DRB1等位基因(包括含不完全結合預測矩陣或頻率資料的等位元基因)的這些頻率的外推法獲得了與基因型出現頻率Fprojected對應的預計單體頻率pprojected。n.d.=無資料
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圖1：微球四聚體技術分析促進了健康供體外周血CDC2-001和ASPM-002特異性CD8+淋巴細胞增殖。與抗CD28+高密度腫瘤抗原A*2402/CDC2-001(左板)或抗CD28+高密度腫瘤抗原A*024/ASPM-002(右板)耦合的微球每週對每孔中1x106 CD8+濃縮PBMC進行了刺激。經過三次體外刺激，所有細胞用抗體CD8 FITC+螢光標記的四聚體A*2402/CDC2-001和A*2402/ASPM-002-001進行了染色。細胞在CD8+淋巴細胞上得到門控；圖中數字代表CD8+淋巴細胞指定象限內的細胞百分比。
圖2：IMA-BIR-002和IMA-MET-005衍生15-聚體與最常見HLA-DR等位基因的體外相對結合。為了確定MHC的速率，ProImmune REVEALTM技術採用了HLA-DR裝配檢測法：肽複合物作為各個肽結合常數的主要決定因素。該法是由ProImmune(Oxford,UK)執行。在固定時間點，完整MHC的量：肽複合物測得後與合格/不合格對照劑(較弱結合劑)進行比較。強力混雜性HLA-DR結合劑作為陽性對照。數值表示各個肽和HLA-DR分子相對于合格/不合格對照劑的結合量。由於REVEALTM技術只限於15聚體，因此只測試了兩個重疊的15聚體(第2-16、6-20位置)，而並非 測試了全長MET-005。
圖3a和3b描述了外周血單核細胞(PBMC)中PSMA和生存素特異性IFNγ-分泌CD4+T細胞的呈現，它們於不同時間點取自使用IFNγ-EliSpot檢測的免疫患者中。時間點：疫苗接種前(a)以及第3(b)、6(c)、7(d)、8(e)、9(f)、10(g)、11(h)次疫苗接種後。
圖4顯示了PBMC中生存素特異性IFNγ-、IL-5、IL-10、TNFα-分泌CD4+T細胞的呈現，它們於三個不同時間點取自使用細胞內染色法(ICS)檢測的接種患者中。時間點：第1(a)、3(b)、7(c)次疫苗接種後。

Claims (13)

  1. 一種藥物組合物，其包括至少有兩種肽，該等肽係選自於由SEQ ID NO 1至SEQ ID NO 10、SEQ ID No 20和SEQ ID No 24組成之群的氨基酸序列所組成，以及一種醫藥上可接受載體。
  2. 如請求項1之藥物組合物，其進一步包括至少另外一種肽，其係由選自於SEQ ID NO 11至SEQ ID NO 22組成之群的氨基酸序列所組成。
  3. 如請求項1或2之藥物組合物，其中至少有一種肽包含非肽鍵。
  4. 如請求項1之藥物組合物，包括至少兩種如SEQ ID NO 1及如SEQ ID NO 11的MHC I類肽、或該兩MHC I類肽中之一者係如SEQ ID NO 2及如SEQ ID NO 11、或該兩MHC I類肽中之一者係如SEQ ID NO 3及如SEQ ID NO 11。
  5. 如請求項1之藥物組合物，其中存在該組合物中之肽的選擇性、數目及/或數量具組織、癌症和/或患者特異性。
  6. 如請求項1之藥物組合物，其進一步包括至少一種合適的佐劑，該佐劑係選自含下列的群組：1018ISS、鋁鹽、安普利維(Amplivax)、AS15、BCG、CP-870,893、CpG7909、CyaA、dSLIM、GM-CSF、IC30、IC31、艾密奎莫(Imiquimod)、ImuFact IMP321、IS Patch、ISCOMATRIX、JuvImmune、LipoVac、MF59、單磷醯 脂A、Montanide IMS 1312、Montanide ISA 206、Montanide ISA 50V、Montanide ISA-51、OK-432、OM-174、OM-197-MP-EC、ONTAK、PepTel®載體系統、PLG微粒、瑞司奎莫(resiquimod)、SRL172、病毒顆粒和其他病毒樣顆粒、YF-17DBCG、Aquila公司的QS21刺激子、Ribi's Detox、Quil、Superfos、Freund's、霍亂毒素、免疫佐劑、MF59和細胞激素。
  7. 如請求項6之藥物組合物，其中該佐劑係選自於由集落刺激因子組成的群。
  8. 如請求項7之藥物組合物，其中該集落刺激因子係GM-CSF、或咪喹莫特或瑞司奎莫(resiquimod)。
  9. 如請求項1之藥物組合物，另外含有至少有一種抗原呈現細胞。
  10. 如請求項9之藥物組合物，其中該抗原呈現細胞為樹突狀細胞。
  11. 如請求項9之藥物組合物，其中該至少有一種抗原呈現細胞為a)用選自於SEQ ID NO1至SEQ ID NO 22組成之群的肽衝擊或載入，或b)包括一種編碼及表現該肽的表達載體。
  12. 如請求項1之藥物組合物，其中該藥物組合物係抗癌疫苗且其中該疫苗係用於靜脈內、動脈內、腹腔內、肌肉內、皮內、瘤內、口服、經皮、經鼻腔、經口腔、經直腸、經陰道或外用投藥，或用於吸入。
  13. 一種如請求項1之藥物組合物的用途，其係用於製備治療或預防患者癌症的藥物，其中該癌症為攝護腺上皮癌或結腸上皮癌/結直腸癌。
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