JP5689140B2 - 胃癌およびその他のがんの治療に用いる腫瘍関連ペプチド組成物と関連抗がんワクチン - Google Patents

胃癌およびその他のがんの治療に用いる腫瘍関連ペプチド組成物と関連抗がんワクチン Download PDF

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Description

本発明は、免疫療法で用いられるペプチドと、免疫療法、特にがんの免疫療法におけるその使用法に関する。本発明では、単独で、または他の腫瘍関連ペプチドと共に、抗腫瘍免疫応答を刺激するワクチン組成物の薬剤有効成分として働く、腫瘍関連ヘルパーＴ細胞ペプチドのエピトープについて公表する。特に、本発明のペプチド組成物は、胃癌（GC）に対して抗腫瘍免疫応答を誘発するワクチン組成物に利用することができる。
本発明の目的のため、本明細書で引用されている全ての参考文献が、その全体の参照として組み込まれている。
胃癌は胃内膜に悪性細胞が形成する疾患である。胃癌は胃ののどの部分にも発生する可能性があり、胃全体さらにその他の器官、特に食道、肺、および肝臓まで転移する可能性がある。胃癌は、世界で 4 番目に一般的ながんであり、2002 年には 930,000 症例が診断されている。
胃癌は、がんによる死亡原因では肺癌に続き世界で 2 番目であり、高い死亡率（約 80 万人／年）の疾患である男性で多く見られ、アジア諸国や開発途上国ではより多く発生する。（情報はWHOから得られる）。
米国では胃癌は毎年新ながん発生患者のおよそ 2%（25,500 例）であるが、他の国々ではより一般的である。韓国では最も多いがんのタイプであり、悪性新生物の 20.8% を占めている。日本では胃癌が男性ではまだ最も一般的ながんとなっている。米国では毎年、男性 13,000 人、女性 8,000 人が胃癌と診断されている。殆どの患者が 70 歳を超えている。
胃癌は、肺癌、乳癌、大腸癌に続き世界で 4 番目に一般的ながんである。さらに、胃癌はまだがんによる死因の 2 番目に高いものである。米国がん協会の推定によれば、2007 年にはおよそ 100 万人が新に胃癌と診断され、そのうち 70% 近くが開発途上国で発生し、約 80 万人が死亡している（米国がん協会の出版物を参照）。
本疾患の世界中での発生には地理的なばらつきが大きい。胃癌の発生率はアジアと南米の一部で最も高く、北米で最も低い。最も死亡率の報告が高いのは、チリ、日本、南米、および旧ソ連である。
胃癌は、進行した段階で診断されることが多いが、というのは日本（と韓国の上流階級）で多くは早期に発見される場合を除き、世界の殆どの地域でスクリーニングが実施されていないからである。そのため、ヘルスケア専門家達にとって大きな課題であり続けている。胃癌の危険因子は、ピロリ菌（H. pylori）の感染、喫煙、塩分の高摂取、および他の食事要因である。胃癌がその遺伝的素因症候群に関係しているのは、少数である。（1%〜3%）びまん性胃癌に対する常染色体優性の素因を有する家族の約 25% に Eーカドヘリンの変異が発生している。この胃癌のサブセットは遺伝性びまん性胃癌と言われてきた12。遺伝的カウンセリングを提供し、さらに生殖細胞系が短縮された、若くて無症状のキャリアーに予防的胃切除を考えるのは有用と思われる。
胃壁は、粘膜（最内）層、筋層（中間）、および漿膜（最外）層の 3 層から成っている。胃癌は、粘膜層の内側を覆っている細胞で始まり、増殖に従い外側層に広がる。標準的治療は 4 種類利用されている。胃癌の治療には手術、化学療法、放射線療法、または化学放射線療法が入ると思われる。胃癌の一次治療は手術である。手術の目標は、切除断片陰性（R0 切除）で完全に切除することである。しかし、局所領域の胃癌患者の約 50% は R0 切除で手術することはできない。R1 は顕微鏡的残存がん（切除断片陽性）を示し、R2 は肉眼的（巨視的）残存がんを示すが遠隔疾患はない。患者の転帰は診断時の癌の初期病期に依存する。（NCCN Clinical Practice Guidelines in Oncology登録商標（NCCN 腫瘍学臨床診療ガイドライン）による）
根治的切除術後の 5 年生存率は、病期 II の患者で 30〜50% 、病期 III で 10〜25% である。これらの患者は局所および全身での再発傾向が高い。胃癌患者の 80〜90% が転移し、6 ヶ月生存率は早期に診断されると 65% 、末期に診断されると 15% 未満である。
それ故、胃癌、前立腺癌、口腔癌、口腔扁平上皮癌（OSCC）、急性骨髄性白血病（AML）（Qian et al., 2009）、ピロリ菌誘発性 MALT リンパ腫（Banerjee et al., 2000）、大腸癌（結腸癌／結腸直腸癌）、神経膠芽細胞種、非小細胞肺癌（NSCLC）、子宮頸癌、ヒト乳癌、前立腺癌、大腸癌、膵臓癌、膵管腺癌、卵巣癌、肝細胞癌、肝臓癌、様々な表現型の脳腫瘍、急性リンパ芽球性白血病（ALL）などの白血病、肺癌、ユーイング肉腫、子宮内膜癌、頭頸部扁平上皮細胞癌、咽頭上皮癌、食道癌、口腔癌、甲状腺乳頭癌、脳腫瘍、唾液腺癌、子宮頸癌、節外性T/NK細胞リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、および肺と乳房の悪性固形腫瘍と他の腫瘍に対してなおも、有効で安全な新たな治療選択肢を必要としている。さらに、重度な副作用を起こす可能性のある、化学療法剤やその他の薬剤を使用せずに患者の健全な状態を高める治療選択肢の必要性はなおもある。
大腸癌
米国がん協会（ACS）によると、大腸癌（CRC）は米国で3番目に多いがんであり、175,000例を超える患者が毎年新たに罹患している。米国、日本、フランス、ドイツ、イタリア、スペイン、英国では480,000例を超える患者が罹患している。先進国でのがんによる死亡の最も一般的な原因の1つである。大腸癌の発症は遺伝的要因と環境的要因の相互作用の結果であることを調査が示唆している。殆どの場合、腺腫性ポリープが大腸癌の前駆状態として現れるが、癌への移行には多年を要することもある。大腸癌の主なリスク要因は年齢であり、大腸癌と診断される症例の90％が50歳を超えている。米国がん協会によると大腸癌の他のリスク要因には、アルコール消費量、脂肪および／または赤身肉の多い食事、および果物野菜の不十分な摂取などが含まれる。大腸癌の発症増加は、特に日本などの地域で続いており、脂肪や肉の過剰摂取と、食物線維摂取の低下につながる西洋化された食事を取り入れたことが原因と思われる。しかしながら、スクリーニングの増加やポリープの除去が、ポリープの癌への進行を防いでいると考えられ、発症率の増加は以前ほど速くはない。
殆どの固形腫瘍でファーストライン治療は手術であるが、その利点は早期の患者に限られ、大半の患者は進行期で診断されている。進行大腸癌には、フルオロウラシル系の化学療法レジメンが標準治療となっている。これらのレジメンの大半は、FOLFOX（5-FU点滴／ロイコボリン＋オキサリプラチン）とFOLFIRI（イリノテカン、ロイコボリン、5-FUのボーラス投与と持続点滴）と呼ばれるプロトコールである。
イリノテカンやオキサリプラチンのような第3世代の細胞障害性抗癌剤の導入により有意に有効性が向上するという期待が高まっているが、その予後はまだ比較的悪く、生存率は転移癌では約20ヶ月に留まっており、そのため、大腸癌の薬剤開発のニーズはなおも高くなっている。
最近、アバスチン（ベバシズマブ）やエルビタックス（セツキシマブ）のような、分子標的薬といわれる新世代の抗癌剤が利用できるようになり、大腸癌の異なる病期を対象とし、現在約40種の化合物が臨床開発の最終試験に入っている。これらの化合物数種を併用すると、将来期待される治療選択肢の数が増える。大部分の物質が第2相試験に入っており、これらの物質では、大腸癌の開発において他のどの薬物よりもEGFRが頻繁に着目されており、それは、約80％の大腸癌患者でEGFRの発現がアップレギュレートされているためである。
病期II期の患者を対象とし、最近承認されたモノクロナール抗体（mAbs）（セツキシマブ＋イリノテカンまたはFOLFOX4、ベバシズマブ単剤またはFOLFOX4との併用）の化学療法に関する臨床試験が現在実施されている。これらの臨床試験で統計的に有意な結果を出すためには、3〜4年の観察期間が求められる。
一般に腫瘍学で現在使われているモノクロナール抗体（mAbs）は、実施中の免疫療法を妨害しないという点で他を上回る可能性を有している。事実、（ベバシズマブによる）VEGFの枯渇は、DCによるT細胞活性化促進に貢献していることを示唆する前臨床結果がある。
前立腺癌およびその他の典型的な腫瘍
前立腺癌による死亡は2007年に27,050例と推定され、男性のがんにおいて主要な死因となっている。白人とアフリカ系米国人男性では1990年初頭より、その死亡率は減少しているが、アフリカ系米国人男性の死亡率はなおも白人男性の2倍を超えている。前立腺癌は男性で最も頻繁に診断されるがんである。理由は未だ不明であるが、アフリカ系米国人男性の発症率は白人男性よりも有意に高い。前立腺癌の発症率はここ20年でかなり変化している。つまり、1988〜1992年では急増し、1992〜1995年では急減し、1995年以降は徐々に増えている。この傾向は、前立腺特異抗原（PSA）血液検査による前立腺癌スクリーニングの増加によるところが大きい。過去10年間で発症率が徐々に上昇していることの大部分は、65歳未満の男性の間でPSAスクリーニングが広まったことに帰する可能性が最も高い。男性前立腺癌の発症率は65歳以上では横ばいとなる。白人男性での発症率のピークは1992年（10万人中237.6例）に、アフリカ系米国人男性では1993年（10万人中342.8例）にある。
前立腺癌の治療として、待機療法、手術、放射線療法、高密度焦点式超音波療法（HIFU）、化学療法、凍結手術、内分泌療法、または上述したそれらの併用療法が考えられる。治療法の最適な選択肢、病期、Gleasonスコア、PSAレベルによって決まる。他の重要な要因は、男性の年齢、全体的な健康状態、可能な治療法に対する患者の感情、および副作用の可能性などである。治療法は全て、勃起不全や尿失禁など重大な副作用をもたらす可能性があるため、治療法を検討する際は、しばしば、治療目標と生活習慣の変化によるリスクとのバランスに焦点が当てられる。
癌が前立腺以外に転移すると、治療選択肢はかなり変化するため、前立腺癌を治療する殆どの医師は、様々なトモグラムを利用して転移の可能性を予測する。待機療法、HIFU、放射線療法、凍結手術、手術などによる治療法は、一般的に癌が前立腺内に留まっている男性に実施される。内分泌療法と化学療法は、たびたび前立腺以外に転移した場合のためにとっておかれる。しかし、一部の進行性腫瘍に放射線療法を、一部の早期腫瘍に内分泌療法を使用するという例外もある。初期療法が成功せず、癌が進行する場合、凍結療法、内分泌療法、および化学療法が適用されることもある。
癌が臓器内の発育に限定されることが臨床的に推測されたため、前立腺全摘術を施行した前立腺癌患者のかなりの人数に、手術準備用の最も確実な組織化学的検査で、臓器の境界を越えて局部的に転移した腫瘍がみられる。これらの患者は早期に局部再発するリスクが高く、通常、生化学的再発という点でPSAレベルの上昇として検出されうる。この状況での治療選択肢は、外部放射線療法とホルモン除去療法があるが、これらの治療アプローチの価値は、特に患者の長期生存率を延長するという点において、証明されたとみなすわけにはいかない。更に、尿道狭窄の発生（放射線療法）、性欲の喪失やインポテンス、骨粗鬆症に関与する骨カルシウム塩の減少リスク、病理的骨折リスクの顕著な増加（ホルモン除去療法）など、治療に関連する合併症の可能性を考慮しなければならない。
前立腺癌患者全員の90％以上が局部的な段階および限局期で発見される。腫瘍と診断された患者の5年相対生存率は、これらの病期では100％に近い。過去25年間で、全病期を合わせた5年生存率は69％から90％近くに上昇した。つい最近のデータによれば、10年相対生存率は93％であり、15年生存率は77％である。生存率の劇的な改善、特に5年生存率の改善は、一部早期診断と治療法の改善に帰する。しかしながら、他の組織や臓器に転移後の生存率は大幅に低下する。
肺癌
2007年、米国では、癌診断症例の約15％にあたる、推定210,000例が新たに肺癌になることが予想されている。男性の発症率は、1984年の10,000人当たり102例から2003年の78.5例に有意に減少している。女性では、発症率は長期間にわたり上昇が続いた後、ほぼ横ばい状態となっている。肺癌は治療目的から、臨床的に小細胞癌（13％）または非小細胞癌（87％）に分類される。
肺癌は男女ともがんにおいて最も多い死因となっている。2007年には、推定死亡例は160,390例となることが予想され、これはがんの全死亡例の約29％を占める。1987年以降、毎年乳癌よりも肺癌により死亡する女性が多くなっている。男性の死亡率は1991年から2003年の間、毎年約1.9％ずつ有意に低下し続けた。女性の肺癌死亡率は数十年間連続して上昇した後、ほぼ横ばい状態となっている。肺癌死亡率のこれらの傾向は、過去30年間の喫煙率の低下を反映している。
治療選択肢は癌のタイプ（小細胞癌か非小細胞癌か）と病期によって決定され、手術、放射線療法、化学療法、ベバシズマブ（アバスチン登録商標）およびエルロチニブ（タルセバ登録商標）などの分子標的療法がある。限局性の癌には通常手術が選択される。最近の試験では、早期非小細胞肺癌の生存率は術後の化学療法により改善されることが示されている。肺癌は発見時には通常転移しているため、放射線療法と化学療法が頻繁に使われ、手術と併用されることもある。化学療法のみまたは放射線との併用が小細胞肺癌に通常選択される治療法である。このレジメンでは、高い割合の患者が、症例によっては長く続く寛解を経験している。
肺癌の1年相対生存率は、1975〜1979年の37％から2002年には42％にわずかながら増加したが、これは大部分が手術テクニックと併用療法の改善によるものである。しかし、5年生存率は全ての病期を合わせてもわずか16％である。癌がまだ限局しているうちに発見されると生存率は49％であるが、早期に診断される肺癌は16％にすぎない。
表1：2007年米国で推定された性別新規がん症例数と死亡数（米国がん協会、2007年版、がんの正確な情報（Cancer Facts & Figures 2007）、アトランタ、米国がん協会、2007年）
それ故、神経膠芽細胞腫、前立腺腫瘍、乳癌、食道癌、大腸癌、腎明細胞癌、肺癌、CNS、卵巣癌、メラノーマ、膵臓癌、扁平上皮癌、白血病、髄芽腫、およびサービビンの過剰発現を示す他の腫瘍に対し、重度の副作用に至る可能性がある化学療法剤や他の薬剤を使用せずに患者の幸福を促進させる、有効で安全な新規療法の選択肢の必要性は未だにある。
使用文言の定義
本発明で使用される全ての用語は、特に記載されない限り、以下に定義する通りである。「ペプチド」という用語は、本明細書では、隣接したアミノ酸の アミノ基とカルボニル基間のペプチド結合によって、通常互いに結合された一連のアミノ酸残基を表すために使用される。前記ペプチドは、好ましくは9アミノ酸長であるが、最短で8アミノ酸長、最長で10、11、12、13、14、15、16、17、または18アミノ酸長である。
「オリゴペプチド」という用語は、本明細書では、隣接したアミノ酸の アミノ基とカルボニル基間のペプチド結合によって、通常互いに結合された一連のアミノ酸残基を表すために使用される。正しいエピトープの1つあるいは複数がそこに保持される限り、オリゴペプチドの長さは本発明に決定的なものではない。オリゴペプチドの長さは通常、約30アミノ酸残基長未満で、約14アミノ酸長を超える
「ポリペプチド」という用語は、隣接したアミノ酸の アミノ基とカルボニル基間のペプチド結合によって、通常互いに結合された一連のアミノ酸残基を表す。正しいエピトープの1つあるいは複数がそこに維持される限り、ポリペプチドの長さは本発明に決定的なものではない。ペプチドやオリゴペプチドという用語とは対照的に、ポリペプチドという用語は、約30アミノ酸残基を超える分子を示す。
かかる分子をコード化するペプチド、オリゴペプチド、タンパク質、またはポリヌクレオチドは、免疫応答を誘発できる場合、「免疫原性」（従って、本発明内では「免疫原」）である。本発明の場合は、免疫原性はT細胞応答を誘発する能力としてより明確に定義される。従って、「免疫原」は、免疫応答の誘発が可能な分子で、本発明の場合は、T細胞応答を誘発できる分子と考えられる。
T細胞の「エピトープ」は、クラスIあるいはII MHC受容体に結合し、三元複合体（MHCクラスI 鎖、 −2−ミクログロブリン、およびペプチド）を形成する短鎖ペプチドを必要とし、この三元複合体は、適度な親和性でMHC／ペプチド複合体と結合する対応T細胞受容体を有するT細胞によって認識されうる。MHCクラスI分子と結合するペプチドは通常、8〜14アミノ酸長で、最も典型的には9アミノ酸長である。クラスII MHC分子と結合するT細胞エピトープは通常、12〜30アミノ酸長である。MHCクラスII分子と結合するペプチドの場合には、同じペプチドと対応するT細胞エピトープが共通のコア断片を共有することがあるが、コア配列のアミノ酸末端の上流とそのカルボキシ末端の下流で隣接配列の長さが異なるため、全体の長さが異なることがある。MHCクラスII受容体はより開いた立体構造になり、それに応じて、MHCクラスII受容体に結合しているペプチドは、MHCクラスI分子のペプチド結合溝に入るように、MHCクラスII 分子のペプチド結合溝の構造に完全には入らなくなる。ペプチド長の変化がわずかでも活性は非常に低下するため（以下参照）、意外にも、これはSEQ IDNO: 1のペプチドには当てはまらない。
ヒトでは、MHCクラスI分子をコード化する3種類の遺伝子座（ヒトMHC分子はまたヒト白血球抗原（HLA）と呼ばれる）、つまりHLA-A、HLA-B、およびHLA-Cがある。HLA-A*01、HLA-A*02およびHLA-A*11は、これらの遺伝子座から発現されうる異なるMHCクラスI対立遺伝子の例である。
MHCクラスII遺伝子のヒトゲノムには、HLA-DR、HLA-DQ、HLA-DPの3種類の遺伝子座がある。MHCクラスII受容体は、 鎖と 鎖から成るヘテロダイマーであり、両鎖とも膜貫通領域により細胞膜に固定される。HLA-DRB1*04とHLA-ERB1*07は、これらの遺伝子座でコード化されることが既知である、異なるMHCクラスII 対立遺伝子の2つの例である。クラスII対立遺伝子は非常に多様な形を持ち、例えば、数百種類のHLA-DRB1対立遺伝子が報告されている。HLA-A*02および最も発現頻度の高いHLA-DR血清型について、集団による発現頻度を表2に示す。

表2：HLA-A*02および最も発現頻度の高いHLA-DR血清型の発現頻度F。ハーディー・ワインベルク式F=1-(1-Gf)2を利用し、Moriらの文献 (Mori et al., 1997)から採用した米国人集団のハプロタイプ頻度Gfから頻度を推測した。A*02と特定のHLA-DR対立遺伝子が組み合わさると、連鎖不平衡により、それぞれ単一の頻度から予想されるよりも頻度が上下するかもしれない。詳細については、Chanockらの文献 (Chanock et al., 2004)を参照。
表3：血清型 HLA*A024 と HLA*A02402 の発現頻度 F 。ハーディー・ワインベルク式 F=1-(1-Gf)2 を利用し、Moriらの文献 (Mori et al., 1997)から採用した集団のハプロタイプ頻度 Gf から頻度を推測した。詳細については、Chanockらの文献を参照（Chanock et al., 2004）。
それ故、治療と診断の目的には、数種類のHLAクラスII受容体に適度な親和性で結合するペプチドが大変望ましい。数種類のHLAクラスII分子に結合するペプチドは無差別な結合因子と呼ばれている。
本発明で用いる通り、DNA配列に言及した場合、一本鎖DNAおよび二本鎖DNAの両方が含まれる。そのため、特に記載のない限り、特異的配列とは、かかる配列の一本鎖DNA、かかる配列の相補鎖との二本鎖（二本鎖DNA）、およびかかる配列の相補鎖を示す。「コード領域」という用語は、天然ゲノム環境、すなわち、in vivoにおける遺伝子の天然発現産物のコード領域において、自然にまたは正常状態で該遺伝子の発現産物をコード化する、遺伝子のその部分を示す。
コード領域は、正常の、変異した、または変化した遺伝子から成る可能性があり、また、DNA合成の当業者に周知の方法で研究室において完全に合成されたDNA配列または遺伝子のものである可能性もある。
「ヌクレオチド配列」という用語は、デオキシリボヌクレオチドのヘテロ多量体を示す。
特定のペプチド、オリゴペプチドまたはポリペプチドをコード化するヌクレオチド配列は、自然に発生することも、合成されることもある。一般に、本発明のペプチド、ポリペプチド、およびタンパク質をコード化するDNAセグメントは、cDNAフラグメントおよび短いオリゴヌクレオチドリンカー、または一連のオリゴヌクレオチドから作成され、微生物またはウイルスオペロン由来の調節要素から成る遺伝子組換え転写単位内で発現されうる合成遺伝子を与える。
「発現産物」という用語は、遺伝子コード縮重の結果、同等遺伝子をコード化するため、同一アミノ酸をコード化している、遺伝子およびあらゆる核酸配列から自然翻訳された、ポリペプチドまたはタンパク質を意味する。
「フラグメント」という用語は、コード配列に関する場合は、完全なコード領域より短いDNAの一部を意味し、その発現産物は、完全なコード領域の発現産物と本質的に同一の生物学的機能または活性を保持する。
「DNAセグメント」という用語は、分離フラグメントあるいはより大きいDNA構成物の一組成の形であるDNAポリマーを示し、このポリマーは十分に純粋な形、すなわち、内因性物質の混在がない形で、しかも、標準的な生化学的方法たとえばクローニングベクターによりセグメントやその構成ヌクレオチド配列の同定、操作、回収が可能な量と濃度で、少なくとも1回単離されたDNAから誘導されている。そのようなセグメントは、真核生物の遺伝子中で通常提示される内部非翻訳配列、すなわちイントロンによって中断されないオープンリーンディングフレームの形で与えられる。非翻訳DNA配列は、オープンリーンディングフレームの下流に存在することがあるが、コード領域の調節や発現を邪魔することはない。
「プライマー」という用語は一本鎖DNAと対になることができ、DNAポリメラーゼがデオキシリボ核酸鎖の合成を開始する遊離3'OH末端となる短い核酸配列を意味する。
「プロモーター」という用語は、転写を開始するRNAポリメラーゼの結合に関わるDNAの一領域を意味する。
「単離される」という用語は、物質がその本来の環境（例えば、それが自然に発生するのであれば、自然環境）から取り除かれることを意味する。例えば、生存する動物の自然発生したポリヌクレオチドまたはポリペプチドは単離されているとは言えないが、自然界の一部または全ての共存物質から分けられた同じポリヌクレオチドまたはポリペプチドは単離されていると言える。そのようなポリヌクレオチドはベクターの一部である可能性があり、および／またはそのようなポリヌクレオチドまたはポリペプチドは組成物の一部となる可能性があり、そのようなベクターまたは組成物がその自然環境の一部ではないため、単離されていると言える。
本発明によって公表されているポリヌクレオチドおよび、遺伝子組換えポリペプチドまたは免疫原性ポリペプチドも、「精製されている」状態である。「精製される」という用語は、完全に精製される必要はなく、むしろ、相対的な定義を意味し、高純度に精製された調製物または、部分的にのみ精製された調製物も含むが、これらの用語は関連分野の当業者には理解されている。例えば、cDNAライブラリーから単離された個々のクローンは、電気泳動で均一になるように従来法で精製されている。出発物質または天然物質の精製では、最低でも有効数字1桁、好ましくは2桁または3桁、より好ましくは4桁または5桁で明確に意図される。更に、請求項におけるポリペプチドの純度は、重量で、好ましくは99.999％、または少なくとも99.99％または99.9％、更に望ましくは99％以上で明確に意図される。
本発明によって公表される核酸およびポリペプチド発現産物、およびそのような核酸および／またはポリペプチドを含む発現ベクターは「濃縮型」である。本明細書で使用される通り、「濃縮型」と言う用語は、物質の濃度が（例えば）、それ自身の自然に存在する濃度の少なくとも約2、5、10、100、または1000倍であり、また、重量で0.01％であれば有利であり、好ましくは少なくとも約0.1％であることを意味する。また、濃縮型調製物で期待されるのは、重量で約0.5％、1％、5％、10％、および20％である。本発明における配列、構成物、ベクター、クローンおよび他の物質は、濃縮型または単離型であることが有利である。
「活性フラグメント」という用語は、選択的に適切なアジュバントと共に、または単独で、動物例えばウサギまたはマウス、およびヒトも含む哺乳動物に投与した際、免疫応答を起こす（すなわち免疫原性活性を有する）フラグメントを意味し、このような免疫応答は、ヒトなどの受容動物内でT細胞応答を刺激する。また、この「活性フラグメント」は、in vitroでT細胞応答の誘導に使用されることもある。
本明細書では、「一部分」、「セグメント」、「フラグメント」という用語は、ポリペプチドに関して使用される時、アミノ酸残基のような残基の連続的な配列を指し、その配列はより大きな配列のサブセットを形成する。例えば、ポリペプチドがトリプシンまたはキモトリプシンのような一般的なエンドペプチダーゼの処理を受けた場合、そのような処理により得られるオリゴペプチドは、出発ポリペプチドの一部分、セグメントあるいはフラグメントに相当すると思われる。これは、そのようなフラグメントが必然的にアミノ酸配列の一部としてセグメント、フラグメント、あるいは一部分を含んでおり、それらが、SEQ ID NO: 1から20の配列を持つ自然発生タンパク質、あるいは「親」タンパク質に相当する、SEQ ID NO: 1から20の配列に、全く同一ではないにせよ実質的に同一であることを意味する。ポリヌクレオチドに関連して使用する時、そのような用語は任意の共通のエンドヌクレアーゼをもつ前記ポリヌクレオチドの処理によって生成された生成物を指す。
本発明に従って、配列に言及する場合、「同一性パーセント」または「同一パーセント」という用語は、比較する配列（「比較配列」）を報告済みまたは請求項の配列（「参照配列」）とアラインメントした後に、ある配列を、報告済みまたは請求項の配列と比較することを意味する。続いて、同一性パーセントは次式により決定される:
同一性パーセント＝100［I−（C/R）］
Cは、参照配列と比較配列間でアラインメントした長さにおいて、参照配列と比較配列間とで異なる残基数を示し、ここで、
（i）比較配列上で相当するアラインメントした塩基やアミノ酸を持たない参照配列の各塩基またはアミノ酸、および
（ii）参照配列の各欠落部、および
（iii）比較配列のアラインメントした塩基あるいはアミノ酸とは異なる、参照配列のアラインメントした各塩基あるいはアミノ酸が差の構成要素となっており、
Rは、塩基またはアミノ酸としても数えられ、参照配列に作られた任意の欠落部を伴い、比較配列とアラインメントした長さにおいて、参照配列の塩基またはアミノ酸の数である。
もし、比較配列と参照配列の間に一致があり、上記のように計算した同一性パーセントが、指定の最小同一性パーセント以上である場合、たとえ、本明細書で上述の計算した同一性パーセントが指定の同一パーセントより小さい一致がある可能性があったとしても、比較配列は参照配列に対し指定の最小同一性パーセントを有する。
本明細書で公表されている本来のペプチドは、特に記載されない限り、ペプチド鎖内で異なる、おそらく選択された部位において、一つまたは複数残基の置換によって修飾できる。そのような置換は保存的であってもよく、例えば、疎水性アミノ酸が別の疎水性アミノ酸に置き換わるように、1個のアミノ酸が類似構造および特性を持つアミノ酸に置換される。更に保存的な例として、ロイシンがイソロイシンに置換されるように、サイズおよび化学的性質が同一あるいは類似のアミノ酸に交換されることが考えられる。自然発生的な相同タンパク質ファミリーにおける配列多様性の研究において、ある種のアミノ酸置換は他のアミノ酸置換より認容性が高いことが多く、これらは元のアミノ酸とその置換物との間で、大きさ、電荷、極性、疎水性が類似の相関関係を示すことが多く、これが、「保存的置換」の定義の基礎である。
保存的置換は、本明細書では次の5グループの1つに交換されることと定義される：グループ1−分子量が小さい脂肪族の、非極性またはやや極性残基（Ala、Ser、Thr、Pro、Gly）；グループ2−極性、負電荷残基およびそれらのアミド類（Asp、Asn、Glu、Gln）；グループ3−極性、正電荷残基（His、Arg、Lys）；グループ4−分子量が大きい脂肪族の、非極性残基（Met、Leu、Ile、Val、Cys）；そしてグループ5−分子量が大きい、芳香族残基（Phe、Tyr、Trp）である。
より保存性の少ない置換には、イソロイシン残基によるアラニンの置換のように、類似の特性を有するがサイズが多少異なる別の分子によるアミノ酸1置換を含む可能性も多少ある。非常に非保存的な置換には、酸性アミノ酸と極性アミノ酸、あるいは塩基性アミノ酸との置換を含む可能性も多少ある。しかしながら、化学的効果が完全には予想できないこと、また、過激な置換は他に単純な化学的原理から予想できない限り、思いがけない効果を生じる可能性が多少あるため、そのような「過激な」置換は、効果がないと考えられるとは片付けることができない。
もちろん、そのような置換は、共通のL−アミノ酸以外の構造を含むこともある。そのため、D−アミノ酸は、本発明の抗原ペプチドで一般に見つかるＬ−アミノ酸の代わりに用いられ、依然として公表により本明細書に包含されている。更に、非標準R基（すなわち、自然タンパク質の一般的な20種類のアミノ酸に見られる以外のR基）を有するアミノ酸も、本発明によって免疫原および免疫原性ポリペプチドを生産する置換目的に使用されうる。
2つ以上の位置での置換が、以下に定義するように、実質的に同等かまたはより大きな抗原活性を有するペプチドに帰着することが分かっている場合、組み合わせた置換がペプチド抗原性への相加効果あるいは相乗効果に帰着するかを判断するために、これらの置換の組み合わせが検討される。ペプチド内で同時に置換されるのは多くても4箇所までであろう。
「T細胞応答」という用語は、in vitroまたはin vivoにおいて、ペプチドによって引き起こされるエフェクター機能の特異的増殖および活性化を意味する。MHCクラスI拘束性CTLにおいて、エフェクター機能とはパルスしたペプチド、パルスしたペプチド前駆体、または自然状態でペプチドを提示した標的細胞の溶解、ペプチドによって誘発されるサイトカイン、好ましくはインターフェロン 、TNF 、またはIL−2の分泌、エフェクター分子、好ましくはグランザイム、またはペプチドによって誘発されるパーフォリンの分泌、または脱顆粒のこともある。MHCクラスIIにより制御されるヘルパーT細胞において、エフェクター機能とはサイトカイン、好ましくはIFN− 、TNF− 、IL−4、IL−5、IL−10またはIL−2のペプチド誘発性分泌、またはペプチド誘発性脱顆粒のこともある。CTLとヘルパーT細胞に対する考えられるエフェクター機能は、このリストだけに限定されない。
治療の免疫療法アプローチ
免疫応答の刺激は、宿主の免疫系により異物であると認識された抗原が存在するかに依存する。腫瘍関連坑原が存在することが発見され、現在、腫瘍の発育に介入するため、宿主の免疫系を利用する可能性が浮上している。体液性免疫系と細胞性免疫系の両方を結びつける様々なメカニズムが、現在、がんの免疫療法において研究されつつある。
細胞性免疫応答の特定の要素は、腫瘍細胞を特異的に認識し破壊することができる。細胞傷害性T細胞（CTL）が腫瘍浸潤細胞群や末梢血から単離されることから、このような細胞ががんに対する自然免疫防御において重要な役割を果たしていることが示唆される。特に、CD8陽性T細胞は、タンパク質または不完全なリボゾーム産物（DRIPS）に由来する、通常8〜10残基の主要組織適合複合体（MHC）を有するペプチドである、クラスI分子を認識し（Schubert U, Anton LC, Gibbs J, Norbury CC, Yewdell JW, Bennink JR.; Rapid degradation of a large fraction of newly synthesized proteins by proteasomes; Nature 2000; 404(6779):770-774）、これは細胞質に存在するが、この反応に重要な役割を果たしている。ヒトのMHC分子はヒト白血球型抗原（HLA）とも呼ばれる。
MHC分子には2つのクラスがあり、MHCクラスI分子は、核を有する殆どの細胞にみられ、主に内因性、細胞質性または核タンパク質、DRIPS、より大きなペプチドのタンパク質分解的切断によって生じたペプチドを提示する。しかし、エンドソーム区画または外因性供給源に由来するペプチドも、MHCクラスI分子に認められることが多い。この非古典的なクラスIの提示方法は、文献ではクロスプレゼンテーションと呼ばれている。MHCクラスII分子は、主にプロフェッショナル抗原提示細胞（APC）に認められ、エンドサイトーシスの過程でAPCにより取り込まれた後処理される、外因性タンパク質のペプチドを主に与える。クラスIについては、別の抗原プロセシング方法が報告されており、内因性ペプチドをMHCクラスII分子に提示させることも可能である（例えば、自家食作用）。ペプチドとMHCクラスI分子の複合体は、適切なTCRを持つCD8陽性細胞傷害性Tリンパ球により認識され、ペプチドとMHCクラスII分子の複合体は、適切なTCRを持つCD4陽性ヘルパーT細胞により認識される。
CD4陽性ヘルパーT細胞は抗腫瘍T細胞応答のエフェクター機能の調整に重要な役割を果たしており、このため、腫瘍関連抗原（TAA）由来CD4陽性T細胞エピトープの同定は、抗腫瘍免疫応答を誘発する薬剤製品の開発において非常に重要と考えられる（Gnjatic, S., D. Atanackovic, E. Jager, M. Matsuo, A. Selvakumar, N.K. Altorki, R.G. Maki, B. Dupont, G. Ritter, Y.T. Chen, A. Knuth, and L.J. Old. Survey of naturally occurring CD4+ T-cell responses against NY-ESO-1 in cancer patients: Correlation with antibody responses. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2003, 100 (15): 8862-7）。CD4+ T細胞は、局所的にIFN- レベルを上昇させることができる。
マウスなどの哺乳類動物モデルでは、CTLエフェクター細胞（すなわち、CD8陽性Tリンパ球）がない場合も、CD4陽性T細胞があれば、インターフェロン−γ（IFNγ）の分泌により血管形成を抑制することで、腫瘍の兆候を阻止するため十分であることが示された（Qin, Z. and T. Blankenstein. CD4+ T-cell--mediated tumor rejection involves inhibition of angiogenesis that is dependent on IFN gamma receptor expression by nonhematopoietic cells. Immunity. 2000, 12:677-686）。更に、HLAクラスII分子が提示する腫瘍関連抗原のCD4陽性T細胞認識ペプチドは、抗体（Ab）反応を誘導することで、腫瘍の進行を相殺できることが示された（Kennedy, R.C., M.H. Shearer, A.M. Watts, and R.K. Bright. CD4+ T lymphocytes play a critical role in antibody production and tumor immunity against simian virus 40 large tumor antigen. Cancer Res. 2003, 63:1040-1045）。HLAクラスI分子に結合する腫瘍関連ペプチドと比較して、これまでに報告されたTAAクラスIIリガンドはわずかである（www.cancerimmunity.org, www.syfpeithi.de）。
HLAクラスII分子の構成的発現は、通常免疫系の細胞に限られているため、原発性腫瘍から直接クラスIIペプチドを単離することはできないと考えられていた。しかし、発明者は最近、腫瘍から直接多数のMCHクラスIIエピトープを同定することに成功した（EP 1642905, EP 1760088; Dengjel J, Nastke MD, Gouttefangeas C, Gitsioudis G, Schoor O, Altenberend F, Muller M, Kramer B, Missiou A, Sauter M, Hennenlotter J, Wernet D, Stenzl A, Rammensee HG, Klingel K, Stevanovic S.; Unexpected abundance of HLA class II presented peptides in primary renal cell carcinomas; Clin Cancer Res. 2006; 12:4163-4170）。
MHCクラスII分子の発現は、炎症がない場合、主に免疫系細胞、特にAPC、例えば、単核球、単核球由来細胞、マクロファージ、樹状細胞に限られる。腫瘍患者では、驚くべきことに、腫瘍細胞がMHCクラスII分子を発現していることが分かった（Dengjel J, Nastke MD, Gouttefangeas C, Gitsioudis G, Schoor O, Altenberend F, Muller M, Kramer B, Missiou A, Sauter M, Hennenlotter J, Wernet D, Stenzl A, Rammensee HG, Klingel K, Stevanovic S.; Unexpected abundance of HLA class II presented peptides in primary renal cell carcinomas; Clin Cancer Res. 2006; 12:4163-4170）。
ペプチドが細胞性免疫応答を始動する（引き起こす）には、MHC分子へ結合が必要である。この過程はMHC分子の対立遺伝子とペプチドアミノ酸配列の固有の多型性によって決定される。MHCクラスI結合ペプチドは通常8から10アミノ酸残基長であり、MHC分子の対応する結合溝と相互作用するペプチドの配列内に、通常2つの保存された残基（「アンカー」）を持つ。このように、それぞれのMHC対立遺伝子には、どのペプチドが結合溝と特異的に結合するかを決定する「結合モチーフ」がある（Rammensee HG, Bachmann J, Stevanovic S. MHC ligands and peptide motifs, Landes Bioscience, USA, 1997）。
MHC依存性免疫応答において、ペプチドは、腫瘍細胞によって発現されるある種のMHC分子と結合できる必要があるだけでなく、特定のT細胞受容体（TCR）を持つT細胞によって認識されることも必要である。
腫瘍特異的Tリンパ球、つまりそのエピトープによって認識された抗原は、酵素、受容体、転写因子など、あらゆるタンパク質クラスに由来する分子である可能性がある。更に、例えば、腫瘍関連抗原は、例えば突然変異遺伝子の産物として、腫瘍細胞のみに提示される可能性もある。もう1つ重要なクラスの腫瘍関連抗原は、様々な種類の腫瘍および健常な精巣組織に発現されるCT（「cancer testis（癌・精巣）」）抗原など、組織特異的抗原である。
様々な腫瘍関連抗原が同定されてきた。更に、追加の腫瘍関連抗原を特定するため、多くの研究努力が費やされている。一部の腫瘍関連抗原グループは、当該技術において腫瘍特異抗原とも呼ばれ、組織特異的である。例えば、これに限定されないが、メラノーマのチロシナーゼ、前立腺癌のPSAおよびPSMA、リンパ腫のbcr/ablなどの染色体交差（転座）などである。しかし、同定された多くの腫瘍関連抗原は多数の腫瘍タイプで発生し、発がんタンパク質および／またはがん抑制遺伝子など（がん抑制遺伝子は、例えば、Linehan WM, Walther MM, Zbar B. The genetic basis of cancer of the kidney. J Urol. 2003 Dec; 170 (6Pt1):2163-72で腎臓癌について検討されている）、実際に形質転換イベントを引き起こす抗原の一部は、ほぼ全ての腫瘍タイプに発生する。例えば、p53（がん抑制遺伝子の一例）、ras、c-met、myc、pRB、VHL、HER-2/neuなど、細胞の増殖および分化を制御する通常の細胞タンパク質は、突然変異を蓄積し、これらの遺伝子産物の発現をアップレギュレートさせることで、発がん性を生じさせる可能性がある（McCartey et al. Cancer Research, 1998, 15:58 2601-5; Disis et al. Ciba Found. Symp. 1994, 187:198-211）。これらの変異タンパク質も、複数のがんタイプで腫瘍特異的免疫応答の標的となる可能性がある。
がん患者の免疫療法は、腫瘍細胞に対抗し、免疫系の細胞、特にいわゆる細胞傷害性T細胞（CTL、「キラー細胞」、CD8陽性T細胞としても知られる）を特異的に活性化することを目的としているが、正常組織は標的としない。腫瘍細胞は腫瘍関連タンパク質が発現しているという点で、正常細胞とは異なる。細胞表面のHLA分子は外側に向かって細胞内容物を提示するため、細胞傷害性T細胞は正常細胞と腫瘍細胞を区別することができる。この事実は、細胞内の全てのタンパク質を短いペプチドに分解したことで理解され、この短いペプチドは、その後HLA分子に接着し、細胞表面に提示される (Rammensee et al., 1993)。腫瘍細胞に提示されるが、正常な体細胞には提示されないか、提示されたとしてもはるかに少ないペプチドは、腫瘍関連ペプチド（TUMAP）と呼ばれる。
タンパク質が腫瘍特異抗原または腫瘍関連抗原として細胞傷害性Tリンパ球に認識され、更に、治療に使用されるには、特定の条件を満たしていなければならない。この抗原は主に腫瘍細胞に発現されるものであり、正常な健康組織には発現されないか、比較的少量で発現される。個々の抗原はあるタイプの腫瘍に存在するだけでなく、濃度（つまり、1細胞あたりの各々のペプチドのコピー数）が高いことが更に好ましい。腫瘍特異抗原および腫瘍関連抗原は、例えば細胞周期の制御やアポトーシスのような機能により、正常細胞から腫瘍細胞への形質転換に直接関わるタンパク質から生ずる。更に、形質転換の直接原因となるタンパク質の下流ターゲットはアップレギュレートされるため、腫瘍に間接的に関連している可能性がある。このような間接的腫瘍関連抗原は、ワクチン療法のターゲットにもなることがある。いずれの場合も、エピトープが抗原のアミノ酸配列に存在することが不可欠であり、これは、このような腫瘍関連抗原由来のペプチド（「免疫原性ペプチド」）が、in vitroまたはin vivoでT細胞応答を引き起こすためである。
基本的に、MHC分子に結合できるいずれのペプチドも、T細胞エピトープとして機能しうる。in vitroまたはin vivoにおいてT細胞応答を誘発するには、対応するTCRを有するT細胞の存在と、更にこの固有エピトープに対する免疫学的耐性がないことが必須条件である。ヘルパーT細胞は、抗腫瘍免疫において、CTLのエフェクター機能を統合する際に重要な役割を果たす。TH1タイプのヘルパーT細胞応答を始動させるヘルパーT細胞エピトープは、腫瘍関連ペプチド／MHC複合体を細胞表面に提示している腫瘍細胞に対する傷害機能など、CD8陽性キラーT細胞のエフェクター機能をサポートしている。このようにして、腫瘍関連ヘルパーT細胞ペプチドのエピトープは、単独で、または他の主要関連ペプチドと共に、抗腫瘍免疫応答を刺激するワクチン組成物の薬剤有効成分とすることができる。
CD8およびCD4依存型の2つの免疫応答タイプは共に、連携し、相乗的に抗腫瘍効果に寄与しているため、CD8+ CTL（MHCクラスI分子）またはCD4陽性CTL（MHCクラスII分子）のいずれかにより認識される腫瘍関連抗原の同定と特徴決定は腫瘍ワクチンの開発において重要である。そのため、いずれかのクラスのMHC複合体に結合するペプチドを含むペプチド組成物を提供することが、本発明の目的である。
腫瘍関連ペプチドを用いた最初の臨床試験は、主にメラノーマに対して、1990年代中頃、Boonらによって開始された。臨床的奏功は、最高の試験で10％〜30％の範囲であった。ペプチドを基本としたワクチンの単独療法を利用した臨床試験において、重度の副作用または重度の自己免疫は報告されていない。メラノーマ関連ペプチドを投与した一部の患者に、軽度の白斑が報告された。
しかし、1種類のCTLをプライミングしても、通常は全ての腫瘍細胞を除去するには不十分である。腫瘍は非常に変異原性が高いため、タンパク質パターンを変化させ、CTLによる認識を逃れることで、CTLの攻撃に急速に反応することができる。腫瘍の回避メカニズムに抵抗するため、様々な特異的ペプチドがワクチンに使用されている。このようにして、いくつかのCTLクローンを同時に用い、腫瘍に対して広範囲に同時攻撃を開始することができる。これにより、腫瘍が免疫応答を逃れる可能性を低下させる。この仮説は、最近、末期メラノーマ患者を治療した臨床試験で確認された。わずかに例外はあるものの、少なくとも3回明確なT細胞応答が示された患者は、客観的な臨床的奏功または病態安定を示し (Banchereau et al., 2001)、生存年数が長くなるが（J. Banchereauとの私信）、T細胞応答が3回未満の患者は、大部分が進行性疾患と診断された。
出願者の研究では、腎細胞癌患者に13種類のペプチドから成るワクチンを投与し、同様の効果が示された（H. Singh-Jasuja, S. Walter, T. Weinschenk, A. Mayer, P. Y. Dietrich, M. Staehler, A. Stenzl, S. Stevanovic, H. Rammensee, J. Frisch; Correlation of T-cell response, clinical activity and regulatory T-cell levels in renal cell carcinoma patients treated with IMA901, a novel multi-peptide vaccine、2007年ASCO学会、ポスター番号3017; M. Staehler, A. Stenzl, P. Y. Dietrich, T. Eisen, A. Haferkamp, J. Beck, A. Mayer, S. Walter, H. Singh, J. Frisch, C. G. Stief; An open label study to evaluate the safety and immunogenicity of the peptide based cancer vaccine IMA901、2007年ASCO学会、ポスター番号3017）。
従って、腫瘍ワクチンの開発における重要な課題は、新規腫瘍関連抗原およびそれに由来する免疫原性ヘルパーTエピトープの同定と特徴決定のみならず、異なるエピトープを併用することで、各患者で1つ以上のエピトープに反応する可能性を高めることである。従って、ヒト主要組織適合複合体（MHC）クラス−I（HLAクラスI）またはII（HLAクラスII）分子に結合することのできる、そのようなペプチドのアミノ酸配列の組み合わせを提供することは、本発明の目的である。更に、1種類のペプチドの組み合わせに基づく、効果的な抗癌ワクチンを提供することも、本発明の目的である。
本発明では、発明者は、直接哺乳類の腫瘍、つまり主に胃癌患者の一次サンプルから、HLAクラスIまたはII分子に結合するペプチドを単離し、特徴を決定したが、神経膠芽細胞種、大腸癌、腎細胞癌、肺癌、膵臓癌、悪性メラノーマ、胃癌の一次組織サンプルからもペプチドを単離し、特徴を決定した。
本発明では、腫瘍形成に関連し、MHC（HLA）クラスII分子に十分結合し、ヒト白血球、特にリンパ球、特にTリンパ球、特にCD4陽性Tリンパ球、特にTH1タイプの免疫応答に介在するCD4陽性Tリンパ球の免疫応答を誘発することのできる抗原由来のペプチドを提供する。
また本発明では、腫瘍形成に関連し、MHC（HLA）クラスI分子に十分結合し、ヒト白血球、特にリンパ球、特にTリンパ球、特にCD8陽性細胞傷害性Tリンパ球、および、がんに罹患した患者のワクチン接種に特に有用なこのうち2つの組み合わせの免疫応答を誘発することのできる抗原由来のペプチドを提供する。
本発明によれば、その目的は、SEQ ID NO 1からSEQ ID NO 10 から成るグループから選択されたアミノ酸配列を含む、および／またはSEQ ID NO 1からSEQ ID NO 10 と少なくとも85％相同性の変異アミノ酸配列を含む少なくとも2つのペプチド、および／またはSEQ ID NO 1からSEQ ID NO 10 をコード化する核酸を含むポリヌクレオチドまたは変異アミノ酸配列、および薬剤的に認容される担体を有する薬剤組成物を提供することで解決される。本発明の薬剤組成物は、更に、SEQ ID NO: 11からSEQ ID NO: 22から成るグループから選択されるアミノ酸配列を含むか、またはSEQ ID NO: 11からSEQ ID NO: 22と少なくとも80％同一の変異アミノ酸配列を含む少なくとも1つの追加ペプチド、またはSEQ ID NO: 11からSEQ ID NO: 22をコード化する核酸を含むポリヌクレオチドまたは変異アミノ酸配列を有してもよい。前記ペプチド全体は、8〜100アミノ酸長、好ましくは8〜30アミノ酸長、最も好ましくは8〜17アミノ酸長である。前記ペプチドは非ペプチド結合を有することもある。
本明細書で以下に説明する通り、本発明の基礎となるMET-005を除くペプチドは、全てMHCクラスIまたはIIを有する細胞によって提示されることが同定された。従って、これらの特定ペプチドと前記配列（つまり、誘導ペプチド）を含む他のペプチドは、全て特異的T細胞応答を誘発するが、そのような反応が誘発される程度は個々のペプチドによって、また個々の患者によって異なるかもしれない。その違いは、例えば、ペプチドの変異による可能性がある。当業者は、特に、本明細書の例と個別の文献を参照し、反応がどの程度個々のペプチドによって誘導されるかの判定に応用することのできる方法を十分把握している。
好ましくは、本発明の変異体は本発明の各ペプチドと交差反応するT細胞を誘導する。
前記ペプチドは、腫瘍関連抗原、特に、例えば、タンパク質分解、血管形成、細胞増殖、細胞周期の制御、細胞分裂、転写の制御、翻訳の制御、組織浸潤などの機能を持つ腫瘍関連抗原に由来する。表 4 は、ペプチドと、ペプチドが由来するタンパク質の機能を示している。
表4：本発明のペプチドと親タンパク質の機能
表5:本発明の組成物に有用な追加免疫原性ペプチド
細胞分裂周期 2 タンパク質（CDC2）
CDC2 は、 p34cdc2 または Cdk1 （サイクリン依存性キナーゼ 1）とも知られ、セリン/スレオニンタンパク質キナーゼファミリーである Cdk に属しており、細胞周期のコントロールに重要な役割を果たしている。G2 / M 移行の主な調節因子として知られている。細胞分裂中間期の最後で、A 型サイクリンと結合して活性化され、有糸分裂の開始を促す。核膜の破壊後、A 型サイクリンは分解されサイクリン B に置き換わる。
CDC2 とサイクリン B の複合物から、有糸分裂中に細胞を誘導するのに不可欠な、有糸分裂促進因子（MPF）が形成される。
活性な CDC2 は 70 を超える基質をリン酸化する。例えば、「リンカー」ヒストン H1 のリン酸化により、クロマチン構造の緩和と特異遺伝子の転写が起こり、さらにRNAポリメラーゼ II のリン酸化により、転写が強化される（Cisek and Corden, 1989）。BRCA2 のリン酸化により相同組み換え依存修復が刺激され（Esashi et al., 2005）、FOXO1 のリン酸化により転写活動が阻害され、その結果細胞増殖と生存が起こる。セパラーゼのリン酸化は、未熟な姉妹染色分体の分離を抑制する（Stemmann et al., 2001）。後期促進複合体 / シクロソーム（APC/C）がサイクリン B をユビキノン化するとき、CDC2 活性は分裂後期中に再び断ち切られ、その分解が起こる。
細胞分裂で CDC2 の機能は重複せず、Cdk2、4 および 6など他の Cdk 活性によって補正することはできない。これに反して、CDC2 が G1/S移行のような細胞周期の他の相でも同様に働くことが報告され、つまり、「中間期 Cdk」の代わりになり得る。それ故、CDC2 は唯一の不可欠な細胞周期 Cdkであると思われた。
細胞周期でのその発現と機能とは別に、一部の例で CDC2 はアポトーシス状態で発現され、亢進された活性により有糸分裂のカタストロフィーが起こり得る。CDC2 の過剰発現が数種のがんで発見されたが、サイクリンのような他の細胞周期タンパク質の発現は、むしろ無調節になることが多くなる。がんの種類の中で CDC2 を過剰発現させるのは、前立腺癌、口腔癌、口腔扁平上皮癌（OSCC）、急性骨髄性白血病（AML）（Qian et al., 2009）、ピロリ菌誘発性 MALT リンパ腫（Banerjee et al., 2000）、大腸癌 （Yasui et al., 1993）である。いくつかの症例では、過剰発現は予後の悪化と相関していた。胃癌（GC）では、過剰発現および / または活性の増大が報告されており（14/23症例）、 CDC2 の過剰発現が原因となっている可能性が示唆された。さらにCDC2 は有糸分裂中に活性な遺伝子群であり、過剰発現されると、腫瘍の染色体を不安定に導くことが認められた。CDC2 および他の Cdk の阻害物質は、がんの薬物治療法の候補として考慮されてきた（Shapiro, 2006）。
異常紡錘体様小頭症関連タンパク質（ASPM）
異常紡錘体様小頭症関連（ASPM）遺伝子は、ショウジョウバエの異常紡錘体（asp）のヒト相同分子種であり、常染色体劣性原発性小頭症の最も一般的な変異遺伝子である。ヒトでは、ASPM の同型変異に起因する神経形成不全により、小頭症および精神遅滞が発生する。
原発性常染色体劣性小頭症（MCPH）の最も一般的な原因は、神経形成調節に関与する ASPM 遺伝子の変異であるようにみえる。ASPM は有糸分裂中、紡錘体極に局在化している。
siRNA 介在ノックダウンにより ASPM を阻害すると、腫瘍細胞の増殖と神経幹細胞の増殖が抑制されるため、神経膠芽細胞種中の考えられる分子標的として ASPM が支持される。ASPM は、正常脳と比較して神経膠芽細胞種で過剰発現された。ASPM の発現は、悪性神経膠腫のマーカーとして使用することもでき、治療標的となる可能性を示している。ASPM の過剰発現は、つまり p53 の変異状態および腫瘍病期とは無関係に腫瘍の早期再発（ETR）のリスクが高く、そのため予後が悪い、浸潤 / 転移の可能性が高い肝細胞癌（HCC）を予測する分子マーカーである。ASPM は、不死化細胞、がん細胞および非小細胞肺癌（NSCLC）組織でもアップレギュレートされていた（Jung et al., 2009）。
ユビキチンカルボキシル末端ヒドラーゼ L5（UCHL5）
ユビキチンカルボキシル末端ヒドラーゼ L5（UCHL5）は、ユビキチン C 末端ヒドラーゼ（UCH37）または INO80R としても知られる、プロテアソームに関連する脱ユビキチナーゼである。この酵素は、C 末端 Cys76 と Lys48 間のイソペプチド結合を開裂させ、遠位端からタンパク質に結合したポリユビキチン鎖を分解する。
UCHL5 は、イソペプチターゼの作用を活性化するプロテアソームの 19S (PA700) 調節粒子の成分である hRpn13 （Adrm1 としても知られる）と結合する。
hRpn13 は、ユビキチンの受容体としても機能し、その結果、脱ユビキチン化への基質認識と連結する。UCHL5 は「リッド」と「ベース」間に位置する 19S 粒子の別成分である、 Rpn10/S5a とも結合するが、この相互作用により UCHL5 は活性化されない。UCH37 はユビキチン化が進んでいない基質または、他の分解が遅いユビキチン抱合体をタンパク質分解から救済する。その代わり UCH37 はまた、タンパク質分解の中心である 26S プロテアソームの 20S 粒子内への転座を行う 19S 調節複合体内で、ポリユビキチン化した基質がそれらの開始結合部位から放出されるのを容易にし、分解を促進する可能性があるUCHL5 は核内で、Ino80 クロマチン再モデル化複合体にも関連している。プロテアソームと結合すると、活性化され、Ino80 とプロテアソームが介在すると指摘されている転写とDNA 修復の調節に寄与する可能性がある。UCHL5のRNAi介在ノックダウンは、細胞内タンパク質分解は促進したが、細胞成長、プロテアソーム構造またはタンパク質分解能力に対しては検出可能な作用を有していなかったので、UCHL5 の機能の少なくとも一部は他のタンパク質によって発揮される可能性がある。
UCHL5 のようなユビキチン特異的プロテアーゼは、細胞周期進行のコントロール、分化、DNA 複製と修復、転写、タンパク質品質制御、免疫応答およびアプトーシスなどいくつかのプロセスに関与している。UCHL5 が悪性形質転換に寄与するという証拠は、少なくともいくつかある。その活性は、ヒト子宮頸癌組織では、隣接する正常組織に比べアップレギュレートされていることが示された。脱ユビキチン化が可能なため、TGF-β受容体と、その下流メディエーターである Smad を安定化し、その結果TGF-βシグナル伝達を高める。高められたTGF-βシグナル伝達は、がん進行の末期で腫瘍プロモーターとして作用する可能性があるが、二重機能も有し、早期および発生前に腫瘍サプレッサーになる可能性もある（Wicks et al., 2005; Wicks et al., 2006; Horton et al., 2007; Bierie and Moses, 2006）。
c-Met
例として、EP 08008292.8 および EP1507795B1 を参照のこと。さらに、リン酸化による構成的 c-Met 活性化は、ヒト明細胞腎細胞癌における腫瘍形成の重要なメカニズムとしても同定された（Nakaigawa et al., 2006）。
c-Metの過剰発現は腫瘍の低酸素状態により誘導されることが多く、受容体の構成的活性化につながり、予後が悪いことと関連している。内因性c-MET遺伝子のサイレンシングによりin vitroで浸潤性増殖プログラムを完全に実行できなくなり、腫瘍が発育しなくなり、in vivoでは実験的転移の生成が低下する (Corso et al., 2008)。
マクロファージ刺激タンパク質受容体（MST1R）
MST1R（別名 RON）受容体は、細胞表面受容体チロシンキナーゼの Met ファミリーのメンバーで、上皮細胞とマクロファージで主に発現される。c-MET のように RON は、様々な上皮細胞由来腫瘍およびがん細胞株によって発現され、腫瘍形成で機能的役割を果たすと考えられている。臨床試験は、MST1R の過剰発現が患者転帰の悪化と転移の両方に関連していることを示している。
MST1R 発現は、胃癌組織および対応する腫瘍随伴性組織で著しいが、正常の胃粘膜では発現されない（Zhou et al., 2008）。MST1R 受容体は、各リガンドに対応して、細胞移動、浸潤、増殖および生存を誘発する。さらに、MST1R はin vitro で、動物モデルでは in vivo で発がん活性を有し、ヒトのがんでは脱調節されることが多い（Dussault and Bellon, 2009）。データによれば、前立腺癌細胞の MST1R ノックダウンは、 in vitro で MST1R発現細胞と比べて、内皮細胞走化性を有意に低下させ、腫瘍増殖の減少、および in vivoで前立腺内への同所移植後の微小血管密度の低下を起こすことを示している。発がん性の高い大腸癌細胞株中で MST1R キナーゼをRNA 干渉媒介性ノックダウンすると、対照細胞と比較して増殖が減少することが示された。
染色体タンパク質 4 の構造維持（SMC4）
構造維持された染色体（SMC）タンパク質は、細菌からヒトへ高く保存される染色体 ATPアーゼ であり、高次染色体組織およびダイナミクスの多数の側面で基本的役割を果たしている。
SMC4 タンパク質は、クロマチン縮合で役割を持つコンデンシン複合体の中心成分であり、核小体分離、DNA 修復、およびクロマチン骨格の維持にも関連している。真核生物は個々の生物で 6 種以上の SMC タンパク質を有し、特別な機能を持つ 3 つの独特のヘテロダイマーを形成する。SMC2 と SMC4 が、染色体の集合と分離に不可欠なコンデンシン複合体の中心として機能する。
25 種の異なる正常組織の mRNA レベルを RT-PCR で分析した結果、この遺伝子は正常な前立腺および唾液腺では高く発現し、大腸、膵臓、小腸では非常に弱く発現し、その他の組織では全く発現しないことが示された。ヒトのがんサンプルの RT-PCR による試験では、ヒト乳癌 33 例中 26 例、前立腺癌 3 例中 3 例、大腸癌 3 例中 3 例、膵臓癌 3 例中 3 例など、RNA は多数のがん細胞株およびがん標本で高く発現していることが示された（Egland et al., 2006）。
AVL9
驚いたことに、AVL9 タンパク質は、それ自体および対応する遺伝子の機能について不完全なデータしか得られていないため、ソースタンパク質として発見された。
動原体タンパク質 Nuf2
NUF2 (CDCA-1) 遺伝子は、セントロメアと関連した保存タンパク質複合体の成分である、酵母 Nuf2 に非常に似たタンパク質をコード化する。酵母 Nuf2 は、セントロメアが紡錘体極体との接続を失う時、減数分裂前にセントロメアから消失し、染色体分離の調節の役割を果たす。サービビンおよび hNuf2 csiRNA は、それらの mRNA を一時的にノックダウンし、それぞれ多核細胞化や有糸分裂停止による細胞死を起こすことが認められた。Nuf2 および Hec1 は、動原体で双直交に必須な極方向力の維持に必要とされる、外部プレート中の安定な微小管プラス端集積因子部位の組織化に必要である。
肺癌組織のマイクロアレイによる免疫組織化学的解析から、色々な組織学的タイプの肺癌の大半で、 CDCA1とKNTC2 タンパク質レベルが高いことが確認された。これらの高い発現が、NSCLC 患者の予後の悪化と関連していた。それらの結合を、KNTC2 への結合ドメインに対応する、CDCA1 由来 の 19 個アミノ酸ペプチド（11R-CDCA1(398-416)）を有する細胞透過性ペプチドにより阻害すると、 NSCLC 細胞の成長を効果的に抑制した（Hayama et al., 2006）。
CDCA1 または KNTC2 の siRNA 媒介ノックダウンは、NSCLC、卵巣癌、子宮頸癌、胃癌、大腸癌、および神経膠腫における細胞増殖およびアポトーシス誘導を阻害することが見出された（Kaneko et al., 2009）。CDCA 1 遺伝子は、子宮頸癌では異なった形で発現する（リアルタイムPCR（RT-PCR）により実証された mRNA の発現と免疫組織化学によるタンパク質の発現）（Martin et al., 2009）。切除術により摘出した胃癌組織（びまん性 6つ、腸型 4つ）のRT-PCR から、CDCA1 の 2 つの変異体が癌組織でアップレギュレートされていることが確認された。別のスプライシング変異体が特に CDCA1 において、この試験で検出され、抗がん治療の診断マーカーおよび / または新しいターゲットとして有用である可能性がある（Ohnuma et al., 2009）。
脂質リン酸リン酸ヒドラーゼ 2 （PPAP2C）
この遺伝子でコード化されたタンパク質は、ホスファチジン酸ホスファターゼ（PAP）ファミリーのメンバーである。PAP は、ホスファチジン酸をジアシルグリセロールに変換し、グリセロ脂質のデノボ合成、およびホスホリパーゼ D により媒介された受容体活性化シグナル変換で機能する。
異なるイソフォームをコード化する、3 つの別のスプライスされた転写変異体が報告されている。
PPAP2C は、形質変換された原発性ヒト成人間充織幹細胞 MSC でアップレギュレートされる、新規な標的になる可能性がある。PPAP2C のノックダウンは、細胞周期の S 相への進行を遅延させることで細胞増殖を減少させ、 p53 により転写が調節される。一部のデータは、多数のヒトのがんで観察される PPAP2C の過剰発現が、細胞増殖促進の必要条件であることを示唆している（Flanagan et al., 2009）。ある研究では、PPAP2C が線維芽細胞での細胞周期進行の調節因子であることを示している。PPAP2C であるが、触媒的に不活性な突然変異体ではない酵素が過剰発現し、早期に S 相へ進行させ、これにサイクリン A の早期蓄積が伴った。これらが、有糸分裂誘発、移動、創傷治癒、発病、および腫瘍形成などのプロセスに関連している可能性のある、S 相移行速度の大きな変化を説明している。
ユビキノール-チトクローム c レダクターゼ結合タンパク質（UQCRB）
UQCRB 遺伝子は、 10 個の核コード化サブユニットと 1 つのミトコンドリアコード化サブユニットを含む、ユビキノール-チトクローム c 酸化還元酵素複合体の一部であるタンパク質をコード化する。コード化タンパク質はユビキノンと結合し、ユビキノンが結合する時、電子の移動に加わる。この遺伝子の突然変異が、ミトコンドリア複合体 III 欠乏症に関連している。偽遺伝子が X 染色体上に報告された。
UQCRB 遺伝子は、膵臓腺癌の潜在的癌遺伝子または腫瘍抑制遺伝子の可能性がある（Harada et al., 2009）。UQCRB 遺伝子は肝臓細胞癌で過剰発現する（Jia et al., 2007）。
プロミニン 1（Prom1）
プロミニン 1 は CD133とも呼ばれ、元々 CD34+ 造血前駆細胞に特異な分子として同定され、その後様々な組織中の正常幹細胞とがん幹細胞（CSC）のマーカーであることが示された（Mizrak et al., 2008）1。しかし、その機能については殆ど知られていない。上皮細胞の微線毛のような細胞膜の突起部に主に存在するので、細胞膜局所構造の「オーガナイザー」としての機能的役割は、プロミニン 1 に属するものとみなされた。コレステロールとの相互作用が認められたため、細胞膜内での適切な脂質組成を維持するのに重要であるかもしれない。
プロミニン 1 は多数のヒト腫瘍において CSC マーカーとして使用される。CSC マーカーに予想される通り、僅かなパーセントの腫瘍細胞のみが、通常プロミニン 1 に陽性である。腫瘍タイプによって、腫瘍質量当たりの陽性細胞数は 1 〜 15 % であり、大抵は約 2 % である。細胞を発現するプロミニン 1 が機能テストで CSC であると示される腫瘍（球体形成、免疫不全マウスで腫瘍成長の高い開始能力、および非対称分裂/自己再生/多分化能）は以下の通りである。
- 大腸癌 （腫瘍質量の 2 〜 2.5 % ）（Todaro et al., 2007; Ricci-Vitiani et al., 2007）
- 肝臓癌（Ma et al., 2007; Suetsugu et al., 2006; Yin et al., 2007）
- 膵臓癌（Hermann 2007; Wang 2009）
- 前立腺癌（腫瘍質量の 1 % ）（Richardson et al., 2004）
- 異なる表現型の脳腫瘍（Singh et al., 2003; Singh et al., 2004）
- 急性リンパ芽球細胞白血病（ALL）のような白血病（Cox et al., 2009）
- メラノーマ（Monzani et al., 2007; Rappa et al., 2008）
- 肺癌（Chen and O'Shea, 2008; Eramo et al., 2008; Tirino et al., 2009）
- ユーイング肉腫（Suva et al., 2009）
- 子宮内膜癌（Rutella et al., 2009）
- 口腔扁平上皮細胞癌（Zhang et al., 2009）
- 頭頸部扁平上皮細胞癌（Harper et al., 2007）
さらに、いくつかの研究では、正常組織に比べ癌組織ではプロミニン 1 の発現が増大することを示し、それらの研究の殆どがプロミニン 1 の発現が全生存率、腫瘍病期または転移などの臨床パラメータと相関することを認めている。その例は、非小細胞肺癌、悪性メラノーマ、網膜芽腫、神経芽細胞腫、および滑膜癌である。プロミニン 1 の発現は、神経膠腫、膵臓癌（PROM1+ 細胞は最大15%）、大腸癌、直腸および結腸癌、および乳管癌の予後悪化とも相関している。興味深いことに、転移癌患者の PBMC ではPROM1 mRNA がアップレギュレートされ、特に骨へ転移している患者では顕著であり、PBMC での PROM1 発現は全生存率に対する予後因子となる。予後との相関は卵巣癌では認められなかった。
びまん性胃癌では、ケイ素分析に基づきPROM1 の発現が示唆され（Katoh and Katoh, 2007）、さらに正常胃組織に比べ、胃癌ではタンパク質レベルでの過剰発現が報告されている（Smith et al., 2008）。しかし、BoeglおよびPrinz（2009）は、プロミニン 1 の発現は胃癌、特に後期では減少すると報告し、プロミニン 1 の発現は腫瘍成長ではなくむしろ血管新生（後期でも減少する）と相関すると主張した。胃癌細胞株を使った研究では（Takaishi et al., 2009）、プロミニン 1 ではなく CD44が胃癌の CSC マーカーであると主張している。
腫瘍形成でプロミニン 1 発現細胞が関与するという証拠が出され（Zhu et al., 2009）、マウス腸癌モデルでは新生物細胞のすべてが Prom1+ 細胞から生じるが、Prom1+ 表現型を維持したのはわずか 7% であったと報告された。それ以外に、プロミニン 1（＋）細胞が腫瘍血管新生に寄与することが示された。CSCに予測したように、プロミニン 1（＋）細胞には、Akt 生存経路の活性化による化学療法耐性が示された（Ma 2008）。シスプラチン治療に奏効しないことが報告されている（Bertolini et al., 2009）。FLIP アップレギュレーションによる TRAIL- / Fas-誘発アポトーシスに耐性である。プロミニン 1（＋）細胞は、IL-4 の分泌により自らをアポトーシスから保護する。しかし、NK 細胞（Castriconi et al., 2007; Pietra et al., 2009）や細胞傷害性 T 細胞（Brown et al., 2009）によって死滅するので、免疫系が近づきやすいのかもしれない。
基質メタロプロテイナーゼ 11（MMP11）
基質メタロプロテイナーゼ 11（MMP11）は、乳腺の発達と授乳後の退縮、創傷治癒と瘢痕形成、および生理サイクル中など、組織の改造を要するいくつかの生理的プロセスに関与することが提言された。含脂肪細胞の分化を低減させることで、脂肪ホメオスタシスを負に調節するとも提言されている。他の MMP とは対照的に、コラーゲン VI を除き典型的な細胞外基質分子を開裂することはできない。しかし、α 1 抗トリプシン、インスリン様成長因子結合タンパク質 1 およびラミニン受容体など、ある種のセリンプロテアーゼ阻害剤（セルピン類）であるα 2 マクログロブリンのような他の基質が同定されている。
MMP11 は浸潤性乳癌周囲の間質細胞で特異的に過剰発現する遺伝子として発見された。さらなる研究でも、乳癌および他の癌で間質周囲の腫瘍に発現されることが確実となったが、他の癌とは、皮膚癌、非小細胞肺癌と小細胞肺癌、頭頸部扁平上皮細胞癌、結腸および大腸癌、咽頭上皮癌、食道癌、口腔癌、膵臓癌、膀胱癌、卵巣癌、腎細胞癌、非定型髄膜腫、甲状腺乳頭癌、脳腫瘍（MMP11 は星状細胞腫で発現されたが、乏突起膠腫と悪性神経膠腫では狭い範囲だけであった）、唾液管癌、子宮頸癌、節外性T/NK細胞リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、および前立腺癌である。MMP11 は、殆どのヒト浸潤性癌の間質で過剰発現するが、肉腫や他の非上皮腫瘍ではまれであることが明言された。大抵、MMP11 は腫瘍に直接隣接する間質細胞に発現する一方、腫瘍細胞自身、正常組織、および腫瘍から離れた間質細胞では発現しない。しかし、一部の症例では、MMP11 は結腸の非癌性組織や、腫瘍細胞、例えば膵臓、乳房、くも膜、および胃のなどの腫瘍中にも発見されることから、上述の内容を一般化することはできない。高レベルの MMP11 は、悪性表現型 / 高い浸潤性および予後の悪化と相関している。しかし、甲状腺乳頭癌では、MMP11 の発現は悪性な特徴とは逆な関係となった。
MMP11 の発現は微小血管密度とは相関しなかったので、血管新生での役割はないと思われる。むしろ、癌細胞生存の強化とアポトーシスの抑制を行うように見える。線維芽細胞からの MMP11 が癌細胞のIGF-1R 経路を刺激し、その結果増殖能力を高めると提言された。含脂肪細胞の脱分化へ導く能力が、癌細胞生存と腫瘍の増殖に有利な腫瘍周辺の線維芽細胞様細胞の蓄積によって、癌をサポートする。MMP11 は、腫瘍組織および胃癌患者の血清で発見され、発現は転移と相関している（Yang et al., 2008）。さらに、MMP11 は腫瘍細胞株と胃癌の原発性腫瘍で高く発現し（これに対し他の癌では、間質のみに発現するのではない）、腫瘍細胞の増殖を高めるらしいことが示された（Deng et al., 2005）。
ABL1
ABL1 がん原遺伝子は、細胞分化、細胞分裂、細胞接着、およびストレス応答のプロセスに関与する、Src ファミリーの細胞質と核のタンパク質チロシンキナーゼをコード化する（Yoshida, 2007）。C-Abl は核と細胞質コンパートメント間を往復する。核 c-Abl は、細胞増殖の阻害とアポトーシス促進に関与している。これに対し、細胞質 c-Abl の役割はよく分かっていない。形態形成と F-アクチンの動態における役割、および成長因子やインテグリンリガンドのような細胞外刺激により誘発されたシグナル伝達における役割に対する手がかりがある。細胞質 c-Abl は有糸分裂誘発を促進すると報告された。C-Abl 有糸分裂誘発基質は同定されていないが、その基質は Rho ファミリー、特に Vav と Sos メンバーの低分子GTPアーゼの調節因子を含んでいる可能性がある。
偏在的に発現した ABL1 シロシンキナーゼのDNA 結合活性は、CDC2 媒介リン酸化によって調節され、ABL1では細胞周期に機能していることが示唆される。c-Abl タンパク質の活性はその SH3 ドメインによって負に調節され、SH3 ドメインを削除すると ABL1 はがん原遺伝子に変化する。c-Abl 非受容体チロシンキナーゼは、非造血細胞におけるアクチン応答を調節する。一部の研究では、c-Abl はシグナル伝達カスケードに関与する重要な因子であり、T 細胞活性化中にアクチンの再組織化に導くと同定している（Huang et al., 2008）。
ABL1 遺伝子の突然変異は、慢性骨髄性白血病（CML）に関連している。CML では、遺伝子が 22 染色体の BCR（breakpoint cluster region：切断点クラスター領域）遺伝子内で転座されることにより活性化される。
この新たな融合遺伝子 BCR-ABL は、サイトカインによる調節なしで細胞を増殖させる、無秩序な細胞質標的チロシンキナーゼをコード化する。これによって、細胞は次々にがん化する（Zhao et al., 2009）。活性化 c-Abl チロシンキナーゼは、融合タンパク質としてはなく、肺や乳房の悪性固形腫瘍で重要な役割を果たしている（Lin and Arlinghaus, 2008）。
最近の観察では、c-Abl は固形腫瘍でも脱調節されることを示している。細胞質キナーゼの高い活性は、乳癌とNSCLC で検出されている。しかし過剰発現は十分でなく、構成的なキナーゼ活性がタンパク質リン酸化には必要である。乳癌細胞では、c-Abl のリン酸化が、SFK、EGFR ファミリーメンバーおよび IGF-1 受容体などの細胞膜チロシンキナーゼにより誘発される。ABL 融合タンパク質は固形腫瘍では検出されていない。
ABL1 と胃癌−ABL1 発現の免疫組織学研究では、広範囲にわたるヒトの胎児と成人の正常組織と様々な腫瘍タイプを試験した。殆どの腫瘍は限局性で弱いABL 免疫反応性を示した。最も強い染色は軟骨肉腫、脂質肉腫、およびびまん性胃腺癌（印環細胞腺癌）で認められた。後者2例では、ABL も腫瘍微小血管で発現し、血管新生に関与している可能性を示した。
最近の研究で、cagA-陽性ピロリ菌への感染が、胃癌の発生に本質的な役割を果たすことが明らかにされた。
胃上皮細胞の長期感染時に、ピロリ菌はEGFR のエンドサイトーシスと受容体分解を遮断する。その上、この阻害は CagA-に依存するがCagA リン酸化には依存しない、非受容体キナーゼc-Ablの活性化を介して起こり、そのc-Ablは次々に EGFR 標的部位の pY1173 をリン酸化する（Bauer et al., 2009）。STI571 または shRNA によるc-Abl キナーゼ活性の選択的阻害により、持続性細胞毒関連遺伝子 A（CagA）のリン酸化と上皮細胞遊走を無効にし、ピロリ菌感染と病原性に極めて重要な役割を果たしていることを示している（Poppe et al., 2007）。
キナーゼ遮断薬の例が、 Bcr/Abl 癌タンパク阻害剤であるイマチニブ（化学名メシル酸イマチニブ、商品名グリベック、STI571）であり、慢性骨髄性白血病の第一選択薬となっている（Pytel et al., 2009）。イマチニブは進行性消化管間質腫瘍（GIST）の患者の治療に認可されており、その腫瘍ではチロシンキナーゼ受容体である KIT が異常に発現する（Croom and Perry, 2003）。がん治療に最近使用されている別のキナーゼ阻害薬は、細胞質性非受容体の ABL に特異的なダサチニブ（BMS-354825）である（Pytel et al., 2009）。ニロチニブは、成人でのイマチニブ耐性または不耐性Ph+ CML-CP /-APの治療に適応される二世代 bcr-abl TKI経口薬である（Deremer et al., 2008）。
SEQ ID NO 13、SEQ ID NO 14、SEQ ID NO 15はWO 2007/028574で公表され、CDC42（細胞分裂周期42）は細胞周期の制御に関与するタンパク質である。このタンパク質はRhoサブファミリーの低分子GTPアーゼであり、細胞の形態、遊走、移動、エンドサイトーシス、細胞周期の進行など、様々な細胞機能を管理するシグナル伝達経路を制御している。CDC42は神経膠芽細胞腫で大きく過剰発現されることが分かった。
WO 2004/067023では、腫瘍関連抗原サービビンに由来するMHCクラスI拘束性ペプチドについて報告しており、このペプチドは高い親和性でクラスI HLA分子に結合できる。
骨シアロタンパク質I（BSP-1）、早期Tリンパ球活性化タンパク質（ETA-1）、また最も一般的にはオステオポンチン（OPN）としても知られる分泌性リンタンパク質1（SPP1）はヒト遺伝子産物であり、他の種でも保存されている。オステオポンチンは骨再形成の重要な因子として関係があるとされてきた。特に、研究では、破骨細胞を骨の無機物基質に固定する役割を果たしていることが指摘されている。骨の有機物部分は乾燥重量の約20％であり、オステオポンチン以外の部分として、I型コラーゲン、オステオカルシン、オステオネクチン、骨シアロタンパク質、アルカリホスファターゼが含まれる。I型コラーゲンがタンパク質質量の90％に相当する。
OPNは、白血球で発現されるα4β1、α9β1、α9β4など、数種類のインテグリン受容体に結合する。これらの受容体は、白血球細胞の接着、遊走、生存に働くことが十分確立されている。そのため、最近の研究努力は、このような反応に介在する上でのOPNの役割に焦点が当てられている。
オステオポンチンは、マクロファージ、好中球、樹状細胞、TおよびB細胞など、一連の免疫細胞において、様々な動態で発現される。OPNは様々な方法で免疫調節因子として作用することが報告されている。まず、OPNには化学走性があり、細胞の炎症部位への補充を促す。接着タンパク質としても機能し、細胞接着および創傷治癒に関与する。更に、OPNは細胞の活性化とサイトカイン産生に介在し、アポトーシスを制御することで細胞の生存を促す。
活性化されたT細胞はIL-12の働きを受けてTh1タイプに分化し、IL-12およびIFNγなどのサイトカインを産生する。OPNはTh2サイトカインIL-10の産生を抑制し、Th1応答を亢進する。OPNは細胞性免疫に影響し、Th1サイトカインの機能を有する。また、B細胞の免疫グロブリン産生と増殖を増進する。2008年に実施された最近の研究では、OPNが肥満細胞の脱顆粒を誘導することが示唆されている。［Nagasaka A, Matsue H, Matsushima H, et al. (February 2008). "Osteopontin is produced by mast cells and affects IgE-mediated degranulation and migration of mast cells". Eur. J. Immunol. 38 (2): 489-99］この研究者らは、IgEが介在するアナフィラキシーは、野生型マウスと比較し、OPNノックアウトマウスで有意に減少することを観察した。マクロファージの活性化におけるOPNの役割はがん研究でも意味づけられ、この研究では、OPNを産生する腫瘍がOPNを産生しない腫瘍と比較し、マクロファージの活性化を誘導できることを発見した。
OPNは多くの状況で重要な抗アポトーシス因子である。OPNは、マクロファージおよびT細胞、また有害刺激に曝露した線維芽細胞や内皮細胞の活性化誘導細胞死を阻害する。OPNは炎症性大腸炎の非プログラム細胞死も予防する。
OPNが遍在的に発現された複数の細胞表面受容体と相互作用するという事実は、創傷治癒、骨代謝回転、腫瘍形成、炎症、虚血、免疫応答など、多くの生理的、病的プロセスにOPNが積極的に関与していることを示している。従って、血漿OPNレベルを操作することは、自己免疫疾患、がん転移、骨粗鬆症、一部のストレスの治療に有用と考えられる。
OPNはIL-17産生を促進することが示されたが、OPNは肺癌、乳癌、結腸直腸癌、胃癌、卵巣癌、メラノーマ、中皮腫など、様々ながんで過剰発現されており、OPNは糸球体腎炎、尿細管間質性腎炎のいずれにも関与し、OPNは動脈内の粥状斑に認められる。従って、血漿OPNレベルを操作することは、自己免疫疾患、がん転移、骨粗鬆症、一部のストレスの治療に有用と考えられる。
ヒト上皮細胞増殖因子受容体 3 (ERBB3)
ERBB3 は、受容体チロシンキナーゼの上皮細胞増殖因子受容体（EGFR）ファミリーのメンバーをコード化する。ERBB3 は、ニューレグリン、他の ERBB と非ERBB受容体、さらに他のキナーゼ、および新規メカニズムによって活性化される。ERBB3 は下流で、ホスホイノシトール 3 キナーゼ / AKT 生存 / 有糸分裂経路で顕著に相互作用するが、GRB、SHC、SRC、ABL、rasGAP、SYK および転写レギュレータの EBP 1 とも同様に相互作用する（Sithanandam and Anderson 413-48）。
原発性がんのERBB3 発現および培養細胞中でのその機序の寄与に関する研究では、様々な割合の確実性で、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、ある種の脳細胞癌、網膜癌、メラニン細胞癌、大腸癌、膵臓癌、胃癌、口腔癌および肺癌の原因または支持とERBB3 を関係付けている（Sithanandam and Anderson 413-48）。ERBB3 タンパク質は、中咽頭および食道の扁平上皮細胞、胃壁細胞および大小腸の表面腸細胞など、消化管全体の上皮細胞中で免疫組織学的方法により検出された。ERBB3 は胃癌で発現の増大を示した（Poller et al.275-80; Sanidas et al.935-40）。胃癌細胞株すべてが ERBB3 と切断型分泌物を発現した。胃悪性腫瘍で ERBB3 が重要な役割を果たしている強い証拠が、あまり分化されていない印環細胞胃癌の研究からもたらされた。（Kobayashi et al.1294-301） Zhang らは、免疫組織化学的方法（IHC）により、2 つの病理タイプの胃癌（腸型およびびまん性）で ERBB3 の発現を研究した。
びまん性胃癌は、腸型よりもERBB3 発現速度が有意に高かった（26.2% vs. 5.0%, p < 0.01）。
2 つの組織型の胃癌における ERBB3 の選択的過剰発現は、予後悪化と強く関連している（Zhang et al.2112-18）。ERBB3 の発現は、腫瘍浸潤の深さ、関与するリンパ節、遠隔転移、腫瘍病期、および再発など、腫瘍進行に関与するパラメータと有意に関連していた。（Hayashi et al.7843-49）胃癌 21 症例および慢性胃炎 20 症例において、臨床病理変数を考慮しながら、新鮮凍結組織の免疫組織化学的方法によりEGFR、c-erbB-2 および c-erbB-3 の発現と共発現が試験された。全般的に、胃癌患者は慢性胃炎群よりもEGFR、c-erbB-2 および c-erbB-3 の過剰発現発生率が高い（各々81% と 43%、38% と 45%、35% と 20%）ことが示されたが、統計的有意差は EGFR 発現のみで認められた（p = 0.01）（Slesak et al.2727-32）。
ERBB3 の治療標的に対するいくつかのアプローチが実験的に試みられた。ERBB3 の細胞外ドメインへのRNA アプタマーは、NRG-誘発性ERBB3/ERBB2 ヘテロ二量化、ERBB2 リン酸化、および MCF7 乳癌細胞の成長を阻害した。（Chen et al.9226-31） A431 扁平上皮細胞癌細胞の ERBB3 遺伝子発現を、合成デザイナージンクフィンガーを持つ転写因子により阻害すると、増殖と遊走が低減し、ERBB3 発現の抑制は ERBB2 の変化よりも大きい効果を与えた（Lund et al.9082-91）。
ビタミン E アイソマー γ-トコトリエノールは、ERBB3 活性化および PI3K/AKT 経路の下流刺激の特異的遮断により、乳腺細胞の増殖を阻害した（Samant and Sylvester 563-74）。
マイクロ RNA 125a は、ERBB3 RNA とタンパク質、AKT の活性化、SKBR3 乳癌細胞の成長と浸潤性を低減させた（Scott et al. 1479-86）。乳癌細胞での siRNA による ERBB3 のダウンレギュレーションにより、チロシンキナーゼ阻害薬への二次耐性を無効にし、アポトーシスを誘発させた（Sergina et al. 437-41）。低分子干渉 RNA（siRNA）によるERBB3 または AKT の阻害作用は、肺腺癌の治療へのアプローチとして有望であることを示している（Sithanandam et al.1847-59）。
サービビン（BIRC5）
アポトーシス阻害タンパク質（IAP）ファミリーの一員であるBIRC5（サービビン）の発現は、胎生組織および様々なヒトがんで上昇している。
WO 2004/067023では、腫瘍関連抗原サービビンに由来するMHCクラスI拘束性ペプチドについて報告しており、このペプチドは高い親和性でクラスI HLA分子に結合できる。
サービビンは、細胞増殖とアポトーシス細胞死の両方の調節が可能であると思われる。特に神経膠芽細胞腫では、非常に高レベルのサービビンの発現が検知できる (Angileri et al., 2008)。脳神経膠腫中のサービビン過剰発現が悪性増殖、抗アポトーシスおよび血管形成に重要な役割を果たしている可能性があることが指摘されている (Zhen et al., 2005; Liu et al., 2006)。特に神経膠芽細胞腫では、ただし他の腫瘍にも当てはまるが、サービビン陰性腫瘍患者と比較し、サービビンの発現が悪性度（神経膠芽細胞腫においてサービビンの発現が最も高い）および全体的な生存期間が短いことと有意に関連していた (Kajiwara et al., 2003; Saito et al., 2007; Uematsu et al., 2005; Mellai et al., 2008; Grunda et al., 2006; Xie et al., 2006; Sasaki et al., 2002; Chakravarti et al., 2002)。
B型肝炎コア抗原
B型肝炎ウイルス（HBV）コアタンパク質HBcでは、免疫原性ペプチドがよく知られている (Bertoletti et al., 1993; Livingston et al., 1997)。HBcの10アミノ酸ペプチドは、本発明に基づき、患者の免疫能およびがんワクチンへの免疫付与成功の陽性コントロールに含めることができる。
表6：ソースタンパク質のがん関連機能
順位 ："-" < "(+)" < "+"、
"?" は、現在未知状態であることを示す。
表 6 からわかるように、近い将来、当業者は本出願組成を特異的な患者および / または腫瘍に容易に採用し、それに応じて TUMAP を選択できる。
本発明の好ましい実施形態において、前記薬剤組成物は少なくとも2つのペプチドを有し、その1つはSEQ ID No 1のアミノ酸配列を含み、さらSEQ ID No 11のアミノ酸配列を含む。
本発明の好ましい実施形態において、前記薬剤組成物はSEQ ID No 1のアミノ酸配列とSEQ ID No 2および／またはSEQ ID No 11のアミノ酸配列を含む、少なくとも2つのペプチドを有する。
本発明の好ましい実施形態において、前記薬剤組成物はSEQ ID No SEQ ID No 3のアミノ酸配列とSEQ ID No 2および／またはSEQ ID No 11のアミノ酸配列を含む、少なくとも2つのペプチドを有する。
本発明の好ましい実施形態において、前記薬剤組成物はSEQ ID NoSEQ ID No 1のアミノ酸配列とSEQ ID No 7および任意選択としてSEQ ID No 11のアミノ酸配列を含む、少なくとも2つのペプチドを有する。
本発明の好ましい実施形態において、前記薬剤組成物はSEQ ID No 2のアミノ酸配列とSEQ ID No 7および任意選択としてSEQ ID No 17のアミノ酸配列を含む、少なくとも2つのペプチドを有する。
本発明の好ましい実施形態において、前記薬剤組成物はSEQ ID No SEQ ID No 3のアミノ酸配列とSEQ ID No 7および任意選択としてSEQ ID No 11のアミノ酸配列を含む、少なくとも2つのペプチドを有する。
更に好ましい実施形態において、前記薬剤組成物は、SEQ ID NO 2からSEQ ID NO 11およびSEQ ID No 11からSEQ ID No 22とSEQ ID No 24から成るグループから選択されたアミノ酸配列、および／またはSEQ ID NO 2からSEQ ID NO 10またはSEQ ID No 11からSEQ ID No 22とSEQ ID No 24の配列と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む少なくともう1つのペプチド、および／またはSEQ ID NO 2からSEQ ID NO 10またはSEQ ID No 11からSEQ ID No 22 とSEQ ID No 24をコード化する核酸を含むポリヌクレオチド、またはその変異型アミノ酸配列、および薬剤的に認容される担体を有する。
本発明の更に好ましい実施形態は、SEQ ID NO 1からSEQ ID NO 12およびSEQ ID No 14からSEQ ID No 20から成るグループから選択されたアミノ酸配列および／またはSEQ ID NO 1からSEQ ID NO 12の配列と少なくとも80％同一のアミノ酸配列を含む少なくとも3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、または18個のペプチド、および／またはSEQ ID NO 1からSEQ ID NO 12およびSEQ ID No 14からSEQ ID No 20をコード化する核酸を含むポリヌクレオチド、またはその変異型アミノ酸配列、および薬剤的に認容される担体を有する。
以下に更に説明される通り、前記薬剤組成物は、より効果的にするため、更に追加ペプチドおよび／または添加物を含むことができる。
特定のアミノ酸配列の「異型アミノ酸配列」により、発明者は、例えば、1もしくは2アミノ酸残基の側鎖を（例えば、これを別の自然に発生したアミノ酸残基の側鎖または一部の他の側鎖と置換することにより）変更していることを意味し、特定のアミノ酸配列から成るペプチドと実質的に同様に、ペプチドがなおもHLA分子に結合することができるようにする。例えば、HLA-Aまたは-DRなどの適切なMHC分子と相互作用し、結合する能力を改善しない場合も、少なくとも維持できるように、また、本発明の観点において定義したアミノ酸配列を含むポリペプチドを発現した細胞を認識し、死滅させることができる、活性化CTLを発生させる能力を改善しない場合も、少なくとも維持できるように、ペプチドを修飾してもよい。データベースから導出できる通り、HLA-A結合ペプチドの特定の位置は典型的にはアンカー残基であり、HLA結合溝の結合モチーフに合うコア配列を形成している。
T細胞受容体と相互作用することが不可欠ではないこれらのアミノ酸残基は、実質上T細胞の反応性に影響せず、また関連するMHCとの結合を阻害しない、他のアミノ酸との置換によって修飾できる。そのため、本発明のペプチドは、所定の条件とは別に、アミノ酸配列または、その一部分または変異体を含んだいずれかのペプチド（この用語により、発明者はオリゴペプチドまたはポリペプチドを含む）である。
更に、MHCクラスII提示ペプチドは、特定のHLA特異的アミノ酸モチーフを持つ「コア配列」と、任意選択として、コア配列の機能を阻害しないN末端および／またはC末端伸長アミノ酸配列（すなわちこのペプチドとT細胞との相互作用とは無関係とみなされる）から構成されることが知られている。N末端および／またはC末端の伸長は、それぞれ例えば、1から10アミノ酸長である。これらのペプチドはMHCクラスII分子に直接載せるために使用するか、または以下に示す方法で、この配列をベクターに入れてクローン化できる。これらのペプチドは、細胞内で、より大きなペプチドがプロセシングされた最終産物であるため、より長いペプチドも、同様に利用できる。本発明のペプチドは、いずれのサイズでもよいが、一般的には分子量は100,000未満、好ましくは50,000未満、より好ましくは10,000未満、より好ましくは5,000未満、より好ましくは2,500未満であり、また通常は約1000〜2000である。アミノ酸残基数に関して、本発明のペプチドは1000残基未満、好ましくは500残基未満、より好ましくは100残基未満である。更に、本発明ではペプチド組成物およびその変異体も提供するが、前記ペプチドまたは変異体は、全体が8から100アミノ酸長、好ましくは8から30アミノ酸長であり、最も好ましくは8から17アミノ酸長、すなわち8、9、10、11、12、13、14、15または16アミノ酸長である。
好ましくは、SEQ ID NO 11からSEQ ID No 22とSEQ ID No 24から成るグループから選択したコア配列を持ち、C末端および／またはN末端が1〜10アミノ酸伸長したコア配列を持つペプチドであり、より好ましくは、これらの隣接アミノ酸の総数が1〜12残基、より好ましくは1〜8残基、より好ましくは1〜6残基であり、SEQ ID NO 11からからSEQ ID No 22とSEQ ID No 24いずれかの前記ペプチドと同様に、前記ペプチドがHLA分子に結合できるならば、前記隣接アミノ酸は前記C末端および前記N末端にどのような比率でも分配することができる（例えば、全ての隣接アミノ酸を片方の末端に加えるか、前記アミノ酸を両方の末端に等しく、又は他のいかなる比率でも加えることができる）。
従って、本発明のペプチドとのT細胞交差反応を誘発する変異体は、しばしは長さが異なる変異体である。
約12アミノ酸残基より長いペプチドがMHCクラスII分子との結合に直接使用われる場合、コアHLA結合部位に隣接するアミノ酸残基は、MHCクラスII分子の結合溝に特異的に結合する、あるいは、CTLにペプチドを提示する、ペプチドの能力に実質上影響しない残基であることが好ましい。しかし、すでに上述した通り、より大きなペプチドは適当な抗体提示細胞によって断片化されるため、特に、ポリペプチドによってコード化される場合は、このようなより大きなペプチドが利用可能であることは理解される。更に、前記隣接アミノ酸はin vivoにおいてペプチド分解速度を減速させることができ、CTLが利用できる実際のペプチド量が、隣接アミノ酸がないペプチドと比較して多くなるようにする。
また、通常8から10アミノ酸長のMHCクラスIエピトープは、実際のエピトープを含んだより長いペプチド、またはタンパク質からプロセシングされたペプチドから作成することも可能である。MHCクラスIIエピトープと同様、実際のエピトープのNおよびC末端上流および／または下流の伸長した前駆ペプチドの隣接する残基は、実質的にCTLへのペプチド提示に影響せず、また前記伸長したペプチドのプロセシングにより、実際のエピトープが生成するために必要なタンパク質分解的切断部位を隠さないことが好ましい。
好ましくは、SEQ ID NO 1からSEQ ID NO 10およびSEQ ID No 11から成るコア配列を持ち、C末端および／またはN末端が1〜10アミノ酸伸長したペプチドであり、より好ましくは、これらの隣接アミノ酸の全数が1〜12残基、より好ましくは1〜10残基、より好ましくは1〜8残基、より好ましくは1〜6残基であり、前記ペプチドがSEQ ID NO 1からSEQ ID NO 10、およびSEQ ID No 11いずれかの前記ペプチドと同様に、なおもHLA分子に結合できるならば、前記隣接アミノ酸はC末端およびN末端にどのような比率でも分配することができる（例えば、全ての隣接アミノ酸を片方の末端に加えるか、前記アミノ酸を両方の末端に等しく、又は他のいかなる比率でも加えることができる）。
更に本発明では、MHCクラスIエピトープのペプチドおよび変異体も提供し、このペプチドまたは変異体の全体は、8〜100アミノ酸長であり、好ましくは8〜30アミノ酸長であり、最も好ましくは8〜18アミノ酸長、すなわち8、9、10、11、12、13、14、15、16または17アミノ酸長である。
当然のことながら、本発明のペプチドまたは変異体は、ヒトMHCクラスIあるいはII分子に結合する能力を持つ。MHC複合体へのペプチドまたは変異体の結合は、例えば、本発明の以下の例で説明される方法、または異なるMHCクラスII対立遺伝子に関する文献で報告された方法など、該分野で既知の方法により検討することができる（例として、Vogt AB, Kropshofer H, Kalbacher H, Kalbus M, Rammensee HG, Coligan JE, Martin R; Ligand motifs of HLA-DRB5*0101 and DRB1*1501 molecules delineated from self-peptides; J Immunol. 1994; 153(4):1665-1673; Malcherek G, Gnau V, Stevanovic S, Rammensee HG, Jung G, Melms A; Analysis of allele-specific contact sites of natural HLA-DR17 ligands; J Immunol. 1994; 153(3):1141-1149; Manici S, Sturniolo T, Imro MA, Hammer J, Sinigaglia F, Noppen C, Spagnoli G, Mazzi B, Bellone M, Dellabona P, Protti MP; Melanoma cells present a MAGE-3 epitope to CD4(+) cytotoxic T cells in association with histocompatibility leukocyte antigen DR11; J Exp Med. 1999; 189(5): 871-876; Hammer J, Gallazzi F, Bono E, Karr RW, Guenot J, Valsasnini P, Nagy ZA, Sinigaglia F; Peptide binding specificity of HLA-DR4 molecules: correlation with rheumatoid arthritis association; .J Exp Med. 1995 181(5):1847-1855; Tompkins SM, Rota PA, Moore JC, Jensen PE; A europium fluoroimmunoassay for measuring binding of antigen to class II MHC glycoproteins; J Immunol Methods. 1993;163(2): 209-216; Boyton RJ, Lohmann T, Londei M, Kalbacher H, Halder T, Frater AJ, Douek DC, Leslie DG, Flavell RA, Altmann DM; Glutamic acid decarboxylase T lymphocyte responses associated with susceptibility or resistance to type I diabetes: analysis in disease discordant human twins, non-obese diabetic mice and HLA-DQ transgenic mice; Int Immunol. 1998 (12):1765-1776）。
本発明のペプチドは更に、必ずしも、MHC分子の実際のエピトープとして機能するペプチドの一部を形成する必要のないNおよび／またはC末端に位置する追加のアミノ酸伸長を有しているが、それでも、本発明のペプチドを細胞に効率的に導入するために重要と考えられる（上記参照）。本発明の1つの実施形態において、本発明のペプチドが、例えば、NCBIのGenBank受入番号X00497由来のHLA-DR抗原関連不変鎖の80残基のN末端アミノ酸（p33、以下「Ii」）を有する融合タンパク質である（Strubin, M., Mach, B. and Long, E.O. The complete sequence of the mRNA for the HLA-DR-associated invariant chain reveals a polypeptide with an unusual transmembrane polarity EMBO J. 3 (4), 869-872 (1984)）。
本発明はまた、少なくとも1つの本発明のペプチドからなる薬剤組成物を提供し、該ペプチドの全体は8〜100アミノ酸長、好ましくは8〜30アミノ酸長、最も好ましくは8〜17アミノ酸長、または9、10、11、12、13、14、15、または16アミノ酸長である。
更に、前記ペプチドまたは変異体は、より強い免疫応答を引き起こすため、MHC分子に対する安定性および／または結合性を向上できるようにさらに修飾される。そのようなペプチド配列の最適化の方法は、該分野では良く知られており、逆方向ペプチド結合または非ペプチド結合の導入などがある。
従って、本発明の別の観点では、少なくとも1つのペプチドまたは変異体が非ペプチド結合を含む薬剤組成物を提供する。
逆方向ペプチド結合において、アミノ酸残基はペプチド（-CO-NH-）結合ではなく、逆向きに結合している。このようなレトロインバーソ型ペプチド模倣物は、例えば、参照文献として引用されるMeziere et al (1997) J. Immunol. 159, 3230-3237に記載のように、該分野で知られている方法で作成される。この方法では、骨格の変化はあるが側鎖方向は変化させずに擬ペプチドを作成する。Meziereら（1997）は、これらの擬ペプチドが、MHCとヘルパーT細胞応答に有用であることを示している。CO-NHペプチド結合の代わりにNH-CO結合を含むレトロインバーソ型ペプチドは、タンパク質分解にはるかに耐性がある。
非ペプチド結合とは、例えば、-CH2-NH、-CH2S-、-CH2CH2-、-CH=CH-、-COCH2-、-CH(OH)CH2-、およびCH2SO-などのことである。米国特許4,897,445では、標準的方法で合成したポリペプチドを含むポリペプチド鎖内の非ペプチド結合（-CH2-NH）と、NaCNBH3存在下アミノアルデヒドとアミノ酸を反応させ合成した非ペプチド結合の固相合成法が提供されている。
上述の本発明の配列を持つペプチドは、アミノ末端および／またはカルボキシ末端にある別の化学基を用いて合成され、例えば、ペプチドの安定性、バイオアベイラビリティ、および／または親和性を向上させることもできる。例えば、カルボベンゾキシル基、ダンシル基、またはt−ブチルオキシカルボニル基などの疎水基は、ペプチドのアミノ末端に付加できる。同様に、アセチル基または9−フルオレニルメトキシ−カルボニル基をペプチドのアミノ末端に付加することもできる。更に、疎水基、t−ブチルオキシカルボニル基、またはアミノ基を、ペプチドのカルボキシ末端に付加することもできる。
更に、本発明の全てのペプチドは、その立体配置が変化するように合成することもできる。例えば、通常のL異性体の代わりに、前記ペプチドの1個またはそれ以上のアミノ酸残基のD異性体を使用する。更に、本発明のペプチドの少なくとも1つのアミノ酸残基を、既知の合成アミノ酸残基の1つに置換してもよい。このような変化は、本発明のペプチドの安定性、バイオアベイラビリティ、および／または結合作用を向上させることもある。
同様に、本発明のペプチドまたは変異体は、ペプチド合成の前後において、特定のアミノ酸と反応して化学的に修飾することもできる。このような修飾の例は、当該分野では良く知られており、本明細書で参考文献として引用した、R. Lundblad, Chemical Reagents for Protein Modification, 3rd ed. CRC Press, 2005などに要約されている。アミノ酸の化学的修飾としては、アシル化、アミジン化、リジンのピリドキシル化、還元的アルキル化、2,4,6−トリニトロベンゼンスルホン酸（TNBS）によるアミノ基のトリニトロベンジル化、カルボキシル基のアミド修飾、およびシステインからシステイン酸への過蟻酸酸化によるスルフィドリル修飾、水銀誘導体の形成、他のチオール化合物との混合ジスルフィドの形成、マレイミドとの反応、ヨード酢酸またはヨードアセトアミドとのカルボキシメチル化、およびアルカリ性pH下でのシアン酸塩とのカルバモイル化が挙げられるが、これだけに限定されない。これに関して、当業者は、より広義なタンパク質の化学修飾に関する方法論について、Eds. ColiganらのCurrent Protocols In Protein Science（John Wiley & Sons NY 1995-2000）の15章を参照されたい。
治療用のタンパク質およびペプチドをPEGによりうまく修飾できると、しばしば循環血液中の半減期の延長につながり、一方、グルタルアルデヒト、ポリエチレングリコールジアクリレート、およびホルムアルデヒドによるタンパク質の架橋は、ヒドロゲルの調製用として使われる。免疫療法のためのアレルゲンの化学的修飾は、しばしばシアン酸カリウムとのカルバミル化によって達成される。
一般的に、（少なくともアミノ酸残基間にペプチド結合を持つ）ペプチドおよび変異体は、Lu et al (1981) J. Org. Chem. 46, 3433および参考文献で公表されているように、固相ペプチド合成のFmocポリアミド法によって合成される。
精製は、再結晶、分子篩クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、および（通常）アセトニトリル／水の勾配分離などによる逆相高速液体クロマトグラフィーの1つあるいはその組み合わせにより達成される。
ペプチド解析は、薄層クロマトグラフィー、電気泳動、特にキャピラリー電気泳動、固相抽出（CSPE）、逆相高速液体クロマトグラフィー、酸加水分解後のアミノ酸分析および、高速原子衝撃（FAB）質量分析法、そしてMALDIおよびESI-Q-TOF質量分析法にて行われる。
本発明のさらなる観点では、本発明のペプチドもしくは変異体をコード化する核酸（例、ポリヌクレオチド）を提供する。前記ポリヌクレオチドはDNA、cDNA、PNA、CAN、RNAなどであり、一本鎖および／または二本鎖、天然型または例えばホスホロチオエート結合骨格を有するポリヌクレオチドなどの安定型ヌクレオチド、またはその組み合わせであってもよく、また、ペプチドをコード化している限り、イントロン含有または不含どちらの場合であってもよい。当然のことながら、前記ペプチドは、ポリヌクレオチドでコード化可能な天然発生のペプチド結合によって連結される天然発生のアミノ酸残基を含むペプチドのみである。更に、本発明のさらなる観点では、本発明に従うポリペプチドを発現できる発現ベクターを提供する。異なる細胞タイプの発現ベクターは該分野で周知であり、必要以上に実験を重ねなくても選択可能である。
一般的に、DNAは、発現の適切な配向と正しいリーディングフレームで、プラスミドなどの発現ベクターに挿入される。必要に応じて、DNAは、目的とする宿主に認識される適切な転写および翻訳の調節制御ヌクレオチド配列に連結されるが、そのような制御は一般に発現ベクターで行われる。続いてベクターは、標準的な技術で宿主に導入される。指針は、Sambrook et al (1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NYなどに見ることができる。
ただし、本発明の特に好ましい実施形態において、前記薬剤組成物は、SEQ ID NO 1からSEQ ID NO 12に示されたアミノ酸配列から構成される、少なくとも2つのペプチドを有する。
ワクチンおよび最適な投与法に含めるべき各ペプチドの最適量は、必要以上に実験を重ねなくても当業者が決定することができる。例えば、ペプチドまたはその変異体を、静脈内注射（i.v.）、皮下注射（s.c.）、皮内注射（i.d.）、腹腔内注射（i.p.）または筋肉内注射（i.m.）として調製してもよい。ペプチドの好ましい注射経路は、s.c.、i.d.、i.p.、i.m.、i.v.である。DNAの好ましい注射経路は、i.d.、i.m.、s.c.、i.p.、i.v.である。ペプチドまたはDNAの投与量は、例えば、1〜500mg、50μg〜1.5mgであり、好ましくは125μg〜500μgであり、投与量は各ペプチドやDNAにより異なる。この範囲の投与量は、これまでの試験で成功裏に使用された（Brunsvig PF, Aamdal S, Gjertsen MK, Kvalheim G, Markowski-Grimsrud CJ, Sve I, Dyrhaug M, Trachsel S, Muller M, Eriksen JA, Gaudernack G; . Telomerase peptide vaccination: a phase I/II study in patients with non-small cell lung cancer; Cancer Immunol Immunother. 2006; 55(12):1553-1564; M. Staehler, A. Stenzl, P. Y. Dietrich, T. Eisen, A. Haferkamp, J. Beck, A. Mayer, S. Walter, H. Singh, J. Frisch, C. G. Stief; An open label study to evaluate the safety and immunogenicity of the peptide based cancer vaccine IMA901, ASCO meeting 2007; Abstract No 3017）。
本発明の薬剤組成物は、前記組成に存在するペプチドの選択、数、および／または量が組織、がん、および／または患者特異的となるように作ることができる。例えば、ペプチドは、特定組織の親タンパク質の発現パターンによって正確に選択し、副作用を避けることができる。この選択は、治療を行う患者が罹患している具体的ながんのタイプ、およびがんの状態、早期治療法、患者の免疫状態、また当然ながら、患者のHLAハプロタイプに左右される。更に、本発明のワクチンには、特定の患者の個人的必要性によって、個別の成分を含めることができる。例えば、特定患者の関連するTAAの発現によってペプチドの量が異なる、個人的なアレルギーまたは他の治療のため望ましくない副作用が生じる、初回の治療または治療計画後の二次的な治療を調節するなどである。
例えば、GBMのワクチンとして使用される組成物については、親タンパク質が正常組織で大量に発現されるペプチドは、本発明の組成物中には避けるか、少量とする。他方、患者の腫瘍が特定のタンパク質を大量に発現していることが分かっている場合、このがんの治療に用いる個別の薬剤組成物は大量としてもよく、および／またはこの特定タンパク質またはこのタンパク質の経路に特異的なペプチドを2種類以上含めてもよい。当業者は、例えば、in vitroにおけるT細胞の作成、およびその効率と全体的な存在、特定ペプチドに対する特定T細胞の増殖、親和性、増大、またT細胞の機能性を、例えばIFN- 産生を分析することにより検討することで、免疫原性ペプチドの好ましい組み合わせを選択することができる（以下の例も参照）。続いて、通常、最も効率的なペプチドは、上述の目的においてワクチンとして混合される。
適切なワクチンは、好ましくは1〜20個のペプチド、より好ましくは2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20種類の異なるペプチド、更に好ましくは6、7、8、9、10、11、12、13、または14種類の異なるペプチド、最も好ましくは10、11、12、13、または14種類のペプチドを含む。がんワクチンに使用するペプチドの長さについては、本明細書で開示したいかなる適切な長さでもよい。特に、適切な9merのペプチド、または適切な8merまたは9merまたは10merまたは11merのペプチド 、または12mer、13mer、14mer、または15merとしてもよい。より長いペプチドも適当であり、添付の表4および5に説明されている9merまたは10merのペプチドがMHCクラスIペプチドに適しているが、12〜15merがMHCクラスIIペプチドには適している。
前記ペプチドは腫瘍またはがんワクチンの構成要素となる。本ワクチンは患者、患部の器官、または全身に直接投与するか、または、その後患者に投与される、患者またはヒト細胞株に由来の細胞にex vivoで適用するか、あるいはin vivoで使用して、その後患者に再投与される、患者由来の免疫細胞の亜集団を選択する。
前記ペプチドは実質的に純粋であるか、免疫刺激アジュバントと併用されるか（以下参照）、または免疫刺激性サイトカインと併用される、あるいはリポソームなど適当な送達システムを用いて投与される。前記ペプチドは、また、キーホールリンペットヘモシアニン（HLH）またはマンナンなど、適切な担体に接合させることもできる（WO 95/18145およびLongenecker et al (1993) Ann. NY Acad. Sci. 690,276-291参照）。前記ペプチドは、標識化するか、融合タンパク質とするか、ハイブリッド分子とすることもある。配列が本発明で与えられるペプチドは、CD4 T細胞またはCD8 CTLを刺激することが期待される。ただし、逆のCDに陽性のT細胞による助けがあると、刺激はより効率的となる。従って、CD4 T細胞を刺激するMHCクラスIIエピトープに対し、融合パートナーまたはハイブリッド分子の一部は、CD8陽性T細胞を刺激するエピトープを適切に提供する。他方、CD8 CTLを刺激するMHCクラスIエピトープに対し、融合パートナーまたはハイブリッド分子の一部は、CD4陽性T細胞を刺激するエピトープを適切に提供する。CD4およびCD8を刺激するエピトープは、該分野で良く知られており、本発明により同定されたエピトープを含む。
薬剤的に認容される担体はよく知られており、通常は液体で、この担体中に有効な治療薬が調剤される。前記担体は製剤に薬理活性を与えないが、化学的および／または生物学的安定性、放出特性などを与えることができる。典型的製剤は、例えばAlfonso R. Gennaro. Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th Edition. Baltimore, MD: Lippincott Williams & Wilkins, 2000などに見ることができ、生理食塩水、水、緩衝用水、0.3％グリシン、ヒアルロン酸、デキストロースなどを含むが、これに限定されない。最近、長年、ヒト患者の静脈栄養に利用されてきた若干の脂肪乳剤が、ペプチドの溶媒としての役割を果たすことができることが分かった。そのような乳剤の2つの例は、イントラリピッド、リポフンディンとして知られる市販の脂肪乳剤である。「イントラリピッド」は米国特許3,169,094に報告された、静脈栄養用脂肪乳剤に付けられた、スウェーデンKabi Pharmacia社の登録商標である。「リポフンディン」は、ドイツB. Braun Melsungen社の登録商標である。いずれも脂肪として大豆油を含む（1,000mlの蒸留水中、100gまたは200g：それぞれ10%または20%）。イントラリピッドでは卵黄リン脂質が乳化剤として使用され（12g/l蒸留水）、リポフンディンでは卵黄レシチンが使用されている（12g/l蒸留水）。イントラリピッドおよびリポフンディンのいずれにおいても、グリセロール（25g/l）が添加され、等張性が保たれている。
免疫応答を誘発するため、通常、前記組成物により高い免疫原性を与えるアジュバントを含めることが必要である。そのため、本発明の好ましい実施形態では、前記薬剤組成物が更に少なくとも1つの適切なアジュバントを有する。
適切なアジュバントには、1018 ISS、アルミニウム塩、Amplivax、AS15、BCG、CP-870,893、CpG7909、CyaA、dSLIM、 フラジェリンまたはフラジェリン由来TLR 5リガンド、FLT3リガンド、GM-CSF、IC30、IC31、イミキモド（ALDARA登録商標）、レシキモド、ImuFact IMP321、IL-2, IL-13, IL-21などのインターロイキン、インターフェロン− または 、ペグインターフェロン誘導体、IS Patch、ISS、ISCOMATRIX、ISCOM、JuvImmune、LipoVac、MALP2、MF59、モノホスホリルリピドA、モンタニドIMS 1312、モンタニドISA 206、モンタニドISA 50V、モンタニドISA-51、油中水型エマルジンおよび水中油型エマルジン、OK-432、OM-174、OM-197-MP-EC、ONTAK、OspA、PepTel登録商標ベクター系、ポリ(ラクチド共グリコリド)[PLG]
ベース微粒子 および デキストラン微粒子、タラクトフェリン、SRL172、ビロソームおよび他のウイルス様粒子、YF-17D、VEGF trap、R848、 −グルカン、Pam3Cys、サポニン、マイコバクテリア抽出物、合成細菌細胞壁模倣体由来のAquila's QS21 stimulon、およびRibi's Detox. QuilまたはSuperfosなど、他の所有権のあるアジュバントが含まれるが、これに限定されない。フロイントもしくはGM-CSFなどのアジュバントなども好ましい。樹状細胞およびその調製物に特異的ないくつかの免疫学的アジュバント（MF59など）については、これまでに報告がある（Aucouturier et al., 2001; Allison and Krummel, 1995）。またサイトカインを使用してもよい。いくつかのサイトカインは、リンパ系組織への樹状細胞の遊走に対する影響（例えば、TNF）、Tリンパ球に効率的に抗原を提示する抗原提示細胞への樹状細胞の成熟加速（例えば、GM-CSF、IL-1、IL-4）（米国特許5,849,589、その全体を本明細書の参考文献として明確に引用している）、更に免疫アジュバントとしての作用（例えば、IL-12, IL-15, IL-23, IL-7, IFN-α IFN-β) などに、直接関連性があった（Gabrilovich et al., 1996）。
CpG免疫刺激性オリゴヌクレオチドも、ワクチン環境におけるアジュバントの作用を増強することが報告されている。理論に拘束されずに、CpGオリゴヌクレオチドは、Toll様受容体（TLR）、主 としてTLR9によって生来の（獲得）免疫系を活性化することで作用する。CpGによって誘発されたTLR9活性化は、ペプチドもしくはタンパク抗原、生ウイルスもしくは死滅ウイルス、樹状細胞ワクチン、自家細胞ワクチン、および予防／治療用ワクチン両方の多糖類接合体を含む、種々様々の抗原に対する抗原特異的体液性および細胞性免疫応答を増強する。更に重要なことには、この活性化は、CD4 T細胞の助けがない状態でさえ、樹状細胞の成熟および分化を増強し、TH1細胞の活性化の増強、および強力な細胞傷害性Tリンパ球（CTL）の生成をもたらす。TLR9刺激により誘発されたTH1バイアスは、通常、TH2バイアスを促進するミョウバンもしくは不完全フロイントアジュバント（IFA）のようなワクチンアジュバントが存在する状態でさえ維持される。CpGオリゴヌクレオチドは、他のアジュバントと処方された場合もしくは併用して投与された場合、または微粒子、ナノ粒子、脂肪乳剤などの製剤もしくは同様の製剤の場合、更に大きなアジュバント活性を呈するが、それは抗原が比較的弱い場合に、強い応答を誘発するために特に必要である。CpGオリゴヌクレオチドは免疫応答も加速し、抗原投与量を約2桁減少させることができ、一部の実験では、CpGを用いない全量ワクチンに対する抗体応答と同等である（Krieg, 2006）。米国特許6,406,705 B1は、抗原特異的免疫応答を誘発するためにCpGオリゴヌクレオチド、非核酸アジュバントおよび抗原を組み合わせた使用について記述している。CpG TLR9拮抗薬は、本発明の薬剤組成物の好ましい成分であるMologen社（ドイツ、ベルリン）によるdSLIM（ダブルステムループ免疫賦活剤）である。RNA結合TLR7、TLR8および／またはTLR9など、他のTLR結合分子も使用される。
他の有用なアジュバントの例には、化学的に修正されたCpGs（例えば、CpR、Idera）、poly(I:C) のようなdsRNA 類似化合物およびその誘導体(例、 AmpliGen登録商標, Hiltonol登録商標, poly-(ICLC), poly(IC-R), poly(I:C12U),（例えば、polyI:C12U）、非CpG細菌DNAもしくはRNAの他にも、シクロホスファミド、スニチニブ、ベバシズマブ、セレブレックス、NCX-4016、シルデナフィル、タダラフィル、バルデナフィル、ソラフェニブ、テモゾォミド、テムシロリムス、XL-999、CP-547632、パゾパニブ、VEGF Trap、ZD2171、AZD2171、抗CTLA4, 免疫系の主要構造を標的とする他の抗体 （例、抗CD40、抗TGFbeta、抗TNFα 受容体) およびSC58175などの免疫活性小分子および抗体が上げられ、これらは治療用としておよび／またはアジュバントとして作用しうるが、それらだけに限定されるものではない。本発明の状況において有用なアジュバントおよび添加物の量および濃度は、必要以上に実験を重ねなくても熟練した当業者により容易に決定されうる。
好ましいアジュバントはイミキモド、レシミキモド、GM-CSF、シクロホスファミド、スニチニブ、ベバシズマブ、インターフェロン− 、CpG オリゴヌクレオチド および誘導体、poly-(I:C) および誘導体、RNA、シルデナフィル、およびPLG またはビロソームの微粒子製剤である。
本発明の薬剤組成物の好ましい実施形態において、アジュバントは、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF、サルグラモスチム）、イミキモド、レシミキモド、インターフェロン− などのコロニー刺激因子から成るグループから選択される。
本発明の薬剤組成物の好ましい実施形態において、アジュバントはイミキモドまたはレシキモドである。
本発明の薬剤組成物の好ましい実施形態において、アジュバントはGM-CSFおよびレシミキモドまたはレシミキモドである。
本発明の組成物は、皮下、皮内、筋肉内、腹腔内などの非経口投与、または経口投与に用いられる。このため、ペプチドおよび任意選択の他の分子は、薬剤的に認容可能な、好ましくは水性担体に溶解または懸濁される。更に、前記組成物は緩衝剤、結合剤、爆破剤、希釈剤、香料、潤滑剤などの賦形剤を含むこともできる。前記ペプチドは、サイトカインなどの免疫刺激物質と併用投与することもできる。そのような組成物に使用できる賦形剤の広範なリストは、例えばA. Kibbe, Handbook of Pharmaceutical Excipients, 3rd Ed. 2000, American Pharmaceutical Association and pharmaceutical pressなどから引用することができる。前記組成物は、腺腫またはがん性疾患、好ましくはCRCの阻止、予防および／または治療に利用することができる。
好ましい製剤は、例えば、EP2113253の中で見出される。
細胞傷害性T細胞（CTL）は、完全な外来抗原自体ではなく、MHC分子に結合したペプチドの形で抗原を認識する。MHC分子自体は抗原提示細胞の細胞表面にある。そのため、ペプチド抗原、MHC分子、APCの三量体複合体が存在する場合しか、CTLの活性化を行うことができない。対応して、ペプチドがCTLの活性化に利用されるだけでなく、更にAPCと各MHC分子が追加される場合、免疫応答を増進させることができる。
従って、好ましい実施形態では、本発明の薬剤組成物が更に少なくとも1つの抗原提示細胞を含む。
抗原提示細胞（または刺激細胞）は通常は表面にMHCクラスIまたはII分子を有し、一実施形態では、抗原提示細胞自体が実質的に選択された抗原をMHCクラスIまたはII分子に載せることができない。以下に詳細に説明する通り、前記MHCクラスIまたはII分子はそれ自身、in vitroにおいて選択された抗原を容易に載せることができる。
好ましくは、哺乳動物細胞に、TAPペプチドトランスポーターがないか、そのレベルが低下しているか、機能が低下している。TAPペプチドトランスポーターがない適切な細胞は、American Type Culture Collection（12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, USA）からカタログ番号CRL 1992として販売されている、ヒトペプチドを載せた欠損細胞株T2などである。T2などのTAP欠損細胞株はAPCとして利用でき、TAPがないため、MHCクラスIによって提示されるほぼ全てのペプチドが、これら細胞株の空のMHCクラスI分子を細胞外に載せるために使用される監視下のペプチドとなる。したがって全ての効果は使用したペプチドに明確に帰着することになる。
好ましくは、前記抗原提示細胞が樹状細胞である。当然のことながら、前記樹状細胞は自己樹状細胞であり、抗原ペプチドでパルスされている。前記抗原ペプチドは、適切なT細胞応答を引き起こす、いかなる適切な抗原ペプチドであってもよい。腫瘍関連抗原のペプチドをパルスした自己樹状細胞を用いるT細胞療法については、Murphy et al (1996) The Prostate 29, 371-380, and Tjua et al (1997) The Prostate 32, 272-278で公表されている。
そのため、本発明の好ましい実施形態において、少なくとも1つの抗原提示細胞を含む薬剤組成物は、例えば例5で示す方法によりペプチドがパルスされているか、ペプチドが載せられている。
別の可能性として、前記抗原提示細胞はペプチドをコード化する発現構成物を有する。ポリヌクレオチドはいかなる適切なポリヌクレオチドであってもよく、樹状細胞を形質導入でき、結果としてペプチドを提示し、免疫を誘導できることが好ましい。
便宜上、本発明の核酸はウイルスのポリヌクレオチドまたはウイルスに含まれていてもよい。例えば、アデノウイルスを形質導入した樹状細胞は、MUC1と関連し、抗原特異的抗腫瘍免疫を誘導することが示された（Gong et al (1997) Gene Ther. 4, 1023-1028を参照）。同様に、アデノウイルスを基本とした系を利用することができ（例えば、Wan et al (1997) Hum. Gene Ther. 8, 1355-1363を参照）、レトロウイルス系を利用することができる（Koch et al.,2006) J. Exp. Med. 186, 1213-1221およびSzabolcs et al (1997)）。樹状細胞への血液粒子が介在した移動も利用することができ（Tuting 1997) Eur. J. Immunol. 27, 2702-2707）、RNAも利用することができる（Ashley et al., 2007) J. Exp. Med. 186, 1177 1182）。
一般に、本発明の核酸を含む本発明の薬剤組成物は、本発明のペプチドを含む薬剤組成物と同様、例えば、静脈内、動脈内、腹腔内、筋肉内、経皮、腫瘍内、経口、経皮、経鼻、頬側、直腸、経膣、吸入、または局所投与により、投与することができる。
腫瘍は、回避メカニズムにより、治療に耐性を生じることが多い。薬物耐性は投与中に発生し、転移および腫瘍の再発として現れる。そのような薬物耐性を回避するため、腫瘍は薬物を併用して治療されることが多く、無病期間後の転移と腫瘍の再発には、しばしば異なる併用が必要となる。そのため、本発明の一観点では、前記薬剤組成物を第2の抗がん剤と併用投与する。第2の薬剤は、本発明の薬剤組成物の前後またはこれと同時に投与する。同時投与は、化学的性質から混合可能であれば、例えば、本発明の薬剤組成物を第2の抗がん剤と混合することにより達成可能である。同時投与の別の方法は、本発明の薬剤組成物を例えば注射し、第2の抗がん剤を例えば経口投与するなどの投与経路から、前記組成物と抗がん剤を同じ日に別々に投与するものである。前記薬剤組成物と第2の抗がん剤は同じ投与経路で投与することもできるが、異なる日および／または別の投与経路で投与することもできる。
本発明の別の観点では、本発明の薬剤組成物のいずれか1つを治療有効量で患者に投与することを含め、患者のがんを治療または予防する方法を提供する。
治療有効量は、特にCTL亜集団の活性化など、免疫応答を誘発するために十分な量である。当業者は、本明細書の例で提供される方法などの標準的免疫学的方法を利用することで、ある量が有効か否かを容易に決定することができる。薬剤組成物のある量の効果をモニターする別の方法は、治療している腫瘍の発育および／またはその再発を観察することである。
本発明の特に好ましい実施形態においては、前記薬剤組成物を抗がんワクチンとして使用する。
ペプチドまたはペプチドをコード化する核酸を含む組成物が腫瘍またはがんワクチンを構成することも可能である。本ワクチンは患者、患部の器官、または全身に直接投与するか、または、その後患者に投与される、患者またはヒト細胞株由来の細胞にex vivoで適用するか、あるいはin vivoで使用して、その後患者に再投与される、患者由来の免疫細胞の亜集団を選択する。
本発明の組成物は、がんの治療法に利用するか、がんワクチンとして利用することができる。
前記がんは、前立腺癌、口腔癌、口腔扁平上皮癌（OSCC）、急性骨髄性白血病（AML）（Qian et al., 2009）、ピロリ菌誘発性 MALT リンパ腫（Banerjee et al., 2000）、大腸癌（結腸癌／結腸直腸癌）、神経膠芽細胞腫、非小細胞肺癌（NSCLC）、子宮頸癌、ヒト乳癌、前立腺癌、大腸癌、膵臓癌、膵管腺癌、卵巣癌、肝細胞癌、肝臓癌、様々な表現型の脳腫瘍、急性リンパ芽球性白血病（ALL）などの白血病、肺癌、ユーイング肉腫、子宮内膜癌、頭頸部扁平上皮細胞癌、咽頭上皮癌、食道癌、口腔上皮癌、膀胱癌、卵巣癌、腎細胞癌、非定型髄膜腫、甲状腺乳頭癌、脳腫瘍、唾液管癌、節外性T/NK細胞リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、および肺と乳房の悪性固形腫瘍であってもよく、好ましくは胃癌である。
本発明の治療法またはワクチンの最も好ましい実施形態において、前記ワクチンはGC治療用の複数ペプチドを含む腫瘍ワクチンである。好ましくは、前記ワクチンがSEQ ID No. 1からSEQ ID No. 11から選択される一連の腫瘍関連ペプチドを有し、このペプチドは原発性胃癌に認められ、この細胞で同定されている。この一連のペプチドには、HLAクラスIおよびクラスIIペプチドが含まれる。前記一連のペプチドは、HBVコア抗原（SEQ ID 23）のペプチドなど、少なくとも1つのペプチドを含み、皮内投与の効率を検証する免疫マーカーとして機能する、陽性コントロールペプチドとして用いられる。特定の一実施形態では、前記ワクチンが（SEQ ID No. 1からSEQ ID No. 11の）個別のペプチド11個から成り、各ペプチドは約1500μg〜約75μg、好ましくは約1000μg〜約175μg、より好ましくは約500μg〜約600μg、最も好ましくは約578μgであり、全てHPLCおよびイオン交換クロマトグラフィーにより精製され、白色から黄色がかった白色の粉末に見える。凍結乾燥品は好ましくは炭酸水素ナトリウムに溶解し、室温で再溶解後30分以内に皮内注射に用いる。本発明によれば、好ましいペプチドの量は、溶液500μlあたり約0.1〜100mg、好ましくは約0.1〜1mg、最も好ましくは約300μg〜800μgで変化する可能性がある。本明細書において、「約」という用語は、別に記載のない限り、特定の値の平均+/-10％を意味する。当業者は、実際に使用するペプチドの量を、例えば個別患者の免疫状態、および／または特定のがんタイプに存在するTUMAPの量など、いくつかの要因に基づき、調節することができる。本発明のペプチドは、凍結乾燥品の代わりに他の適切な形態（滅菌溶液など）で提供されることもある。
前記薬剤組成物は、遊離型のペプチドあるいは薬剤的に認容可能な塩型のペプチドのいずれかを含む。
ここに使用されるような「薬剤的に認容可能な塩」は、公表されたペプチドの誘導体を言い、前記ペプチドは、作用薬の酸性または塩基性塩を調製することにより修飾される。例えば、酸性塩は、適切な酸との反応に関与する遊離塩基（通常、中性型の薬物は中性NH2基を持つ）から調製される。酸性塩の調製に適当な酸は、無機酸（例えば、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸など）だけでなく、有機酸（例えば、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、ピルビン酸、シュウ酸、リンゴ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、桂皮酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、p−トルエンスルホン酸、サリチル酸など）も含む。反対に、ペプチドに存在する酸部分の塩基性塩の調製は、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム、トリメチルアミンのような薬剤的に認容可能な塩基を使用して調製される。
特に好ましい実施形態において、前記薬剤組成物は酢酸（酢酸塩）、アンモニウム、あるいは塩酸（塩化物）の塩としてペプチドを含む。
別の実施形態において、本発明の薬剤組成物が、骨格形成物質として糖類、糖アルコール、グリシン、アルギニン、グルタミン酸などのアミノ酸などを含む。前記糖類は一、二、三糖であってもよい。これらの糖類は単独で用いるか、糖アルコールと併用して使用されることもある。糖類の例は、単糖としてグルコース、マンノース、ガラクトース、フルクトース、またはソルボース、二糖としてサッカロース、ラクトース、マルトース、トレハロース、三糖としてラフィノースなどである。糖アルコールは、例えば、マンニトースとしてもよい。好ましい成分は、サッカロース、ラクトース、マルトース、トレハロース、マンニットおよび／またはソルビット、より好ましくはマンニトールである。
更に、本発明の薬剤組成物は、アスコルビン酸またはグルタチオンのような抗酸化物質、フェノール、m−クレゾール、メチル−またはプロピルパラベン、クロロブタノール、チオマーサル、またはベンズアルコニウムクロライドなどの保存料、安定剤、サッカロース、ラクトース、マルトース、トレハロース、マンニトース、マンニットおよび／またはソルビット、マンニットおよび／またはラクトースなどの骨格形成物質、およびポリエチレングリコール（PEG）、つまりPEG 3000、3350、4000、または6000、またはシクロデキストリン、つまりヒドロキシプロピレン−β−シクロデキストリン、スルホブチルエチル−β−シクロデキストリンまたはγシクロデキストリン、またはデキストランまたはポロキサマー、つまりポロキサマー407、ポロキサマー188、またはTween 20、Tween 80などの可溶化剤など、生理学的に忍容性に優れた賦形剤（Handbook of Pharmaceutical Excipients, 5th ed., edited by Raymond Rowe, Paul Sheskey and Sian Owen, Pharmaceutical Press (2006)を参照）を含む。好ましい実施形態では、本発明の薬剤組成物が抗酸化物質、骨格形成物質、安定剤から成るグループから選択される、1つ以上の忍容性に優れた賦形剤を含む。
許容可能なpH範囲は、静脈内および筋肉内投与でpH 2〜12であるが、in vivoでは希釈率が減少し、注射部位で放散する可能性が高くなるため、皮下ではこの範囲は2.7〜9.0に減少する。Strickley Robert G., Pharm. Res., 21, NO:2, 201 - 230 (2004)。
本発明のペプチドおよび／または核酸を含む本発明の薬剤組成物は、それぞれのペプチドまたは抗原が関連した腺腫様またはがん性疾患に罹患した患者に投与される。これにより、T細胞性免疫応答が誘発される可能性がある。
本発明の薬剤組成物が好ましいのは、前記組成物に存在する（特に腫瘍関連）ペプチド、本発明の核酸、または本発明の発現ベクターの量が組織、がん、および／または患者特異的である場合である。
本発明の別の実施形態において、前記ワクチンは核酸ワクチンである。ポリペプチドをコード化したDNAワクチンなどの核酸ワクチンを接種すると、T細胞応答が誘発されることが知られている。本ワクチンは患者、患部の器官、または全身に直接投与するか、または、その後患者に投与される患者またはヒト細胞株に由来の細胞にex vivoで適用するか、あるいはin vivoで使用して、その後患者に再投与される患者由来の免疫細胞の亜集団を選択する。細胞にin vitroで核酸を投与する場合は、インターロイキン−2またはGM-CSFなどの免疫刺激サイトカインを同時発現できるように細胞に核酸を形質移入することが有用である。前記核酸は実質的に純粋であるか、免疫刺激アジュバントと併用されるか、または免疫刺激性サイトカインと併用される、あるいはリポソームなど適当な送達システムを用いて投与される。前記核酸ワクチンは、ペプチドワクチンについて上述したように、アジュバントと併用投与されることもある。前記核酸ワクチンがアジュバントなしで投与される場合も好ましい。
ポリヌクレオチドは実質的に純粋であり、適切なベクターまたは送達系に含まれる。適切なベクターと送達系は、アデノウイルス、ワクシニアウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、アデノ随伴ウイルスや、複数のウイルスの要素を含むハイブリッドウイルスを基にした系などの、ウイルス系である。ウイルスを用いない送達系は、陽イオン性脂質や陽イオン性ポリマーなどで、DNA送達に関する技術分野で周知である。「遺伝子銃」などの、物理的な送達法を使用してもよい。ペプチドまたは核酸でコード化されたペプチドは、例えば、CD4陽性T細胞を刺激する破傷風トキソイドのエピトープとの融合タンパク質である。
当然のことながら、患者に投与される核酸は滅菌されており、発熱性物質を含まないものとする。裸DNAは、筋肉内または経皮または皮下投与することができる。便宜上、前記核酸ワクチンはいかなる適切な核酸送達手段を有してもよい。前記核酸、好ましくはDNAは、リポソームまたはウイルスベクター送達系の一部として送達されてもよい。DNAワクチンなどの核酸ワクチンは筋肉に投与される場合に好ましいが、ペプチドワクチンは好ましくはs.c.またはi.d.投与される。前記ワクチンが皮膚に投与されることも好ましい。
樹状細胞などのプロフェッショナル抗原提示細胞による核酸の取り込みとコード化されたポリペプチドの発現は、免疫応答のプライミングのメカニズムであると考えられるが、樹状細胞は組織中の形質移入された細胞から、発現されたペプチドを受け取ることができるため、樹状細胞は形質移入されないと考えられるが、まだ重要である（「クロスプライミング」、例えば、Thomas AM, Santarsiero LM, Lutz ER, Armstrong TD, Chen YC, Huang LQ, Laheru DA, Goggins M, Hruban RH, Jaffee EM. Mesothelin-specific CD8(+) T cell responses provide evidence of in vivo cross-priming by antigen-presenting cells in vaccinated pancreatic cancer patients. J Exp Med. 2004 Aug 2; 200(3):297-306）。
ポリヌクレオチドによるがんの免疫療法については、Conry et al (1996) Seminars in Oncology 23, 135-147; Condon et al (1996) Nature Medicine 2, 1122-1127; Gong et al (1997) Nature Medicine 3, 558-561; Zhai et al (1996) J. Immunol. 156, 700-710; Graham et al (1996) Int J. Cancer 65, 664-670;およびBurchell et al (1996) 309-313 In: Breast Cancer, Advances in biology and therapeutics, Calvo et al (Eds), John Libbey Eurotextに報告されており、全ての参考文献が、その全体の参照として本明細書に組み込まれている。
注射部位で、標的化ベクターおよび送達系を利用することにより、または患者のそのような細胞集団の選択的精製およびペプチドまたは核酸のex vivo投与により、前記ワクチンの標的を特定の細胞集団、例えば、抗原提示細胞とすることも有用である（例えば、樹状細胞は、Zhou et al (1995) Blood 86, 3295-3301; Roth et al (1996) Scand. J. Immunology 43, 646-651に報告される通り分類することができる）。例えば、標的化ベクターには、適切な場所で抗原を発現させる、組織または腫瘍特異的プロモーターが含まれる。
最後に、本発明のワクチンは、治療を行う患者が罹患している具体的ながんのタイプ、およびがんの状態、早期治療法、患者の免疫状態、また当然ながら、患者のHLAハプロタイプに左右される可能性がある。更に、本発明のワクチンには、特定患者の個人的必要性によって、個別の成分を含めることができる。例えば、特定患者の関連するTAAの発現によってペプチドの量が異なる、個人的なアレルギーまたは他の治療のため望ましくない副作用が生じる、初回の治療または治療計画後の二次的な治療を調節するなどである。
本発明のペプチドは、がんの治療に有効であるのに加えて、診断にも有効である。前記ペプチドは神経膠芽細胞腫から作成し、しかも正常組織には存在しないことが判明しているため、がんの有無を診断するために使用できる。
本発明のペプチドが組織生検に存在することを、病理学者のがん診断に役立てることができる。病理学者は、抗体、マススペクトロメトリー、または該分野で既知の他の方法を用いて本発明の特定のペプチドを検出し、その組織が悪性または炎症性、あるいは病変組織であるかを判断できる。本発明のペプチドのグループが存在すれば、病変組織の分類または下位分類が可能である。
特に、Tリンパ球が既知である、またはTリンパ球が作用機序に関わっていると予想される場合は、病変組織標本で本発明のペプチドを検出することにより、免疫学的療法の有効性を決定できる。MHCの発現欠失は、感染した悪性腫瘍細胞が免疫学的監視から逃れる、十分報告されたメカニズムである。従って、本発明のペプチドの存在は、このメカニズムが分析した細胞により利用されていないことを示している。
本発明のペプチドは、T細胞応答など、本発明のペプチドに対するリンパ球応答、または本発明のペプチドまたはMHC分子と複合体を形成した本発明のペプチドに対する抗体応答を分析するために使用されることもある。これらのリンパ球応答は、それ以上の治療段階を決定する際、予後マーカーとして使用できる。これらの応答は、タンパク質ワクチン、核酸、自己物質、リンパ球養子免疫療法など異なる方法を使った、リンパ球応答の誘発を目的とした免疫療法的アプローチにおいて、代理マーカーとしても利用できる。遺伝子療法において、副作用を評価する際、本発明のペプチドに対するリンパ球応答を考慮できる。また、リンパ球応答を監視することで、移植片対宿主病および宿主対移植片病を検出するなど、移植治療の追跡検査に有効であるかもしれない。
これに関するまた別の観点では、本発明が（a）上述の薬剤組成物（溶液または凍結乾燥物）を含む容器、（b）任意に、希釈剤もしくは、該凍結乾燥製剤用の再溶解用溶液を含む第二の容器、および（c）任意に、（i）溶液の使用あるいは（ii）再溶解および／または該凍結乾燥製剤の使用に関する説明書を有するキットに関する。前記キットは更に、（i）緩衝剤、（ii）希釈剤、（iii）フィルタ、（iv）針もしくは（v）注射器を1つまたは複数を含むことがある。前記容器は、好ましくはボトル、バイアル、注射器もしくは試験管であり、容器は再利用してもよい。前記薬剤組成物は、好ましくは凍結乾燥される。
本発明のキットには、好ましくは適切な容器中に本発明の凍結乾燥製剤および再溶解および／または使用に関する説明書が含まれる。適切な容器は、例えば、ボトル、バイアル（例えば、ダブルチャンバーバイアル）、注射器（ダブルチャンバー注射器など）および試験管を含む。前記容器はガラスもしくはプラスチックのような様々な材料から形成される。好ましくは、前記キットおよび／または容器は、再溶解および／または使用の方法を示す、容器あるいはその容器に関連する説明書を含む。例えば、ラベルに、前記凍結乾燥製剤が上述のペプチド濃縮物に再溶解されることを表示してもよい。ラベルは更に、製剤が皮下投与に有用であるか、あるいは皮下投与を意図するものであることを表示してもよい。
製剤を入れる容器は再利用可能なバイアルとしてもよく、再溶解した製剤の反復投与（例えば2〜6回）が許される。キットは更に、適切な希釈剤（例えば重炭酸ナトリウム溶液）を含む、第2容器を含んでもよい。
希釈剤および凍結乾燥製剤の混合に際して、再溶解した製剤の最終ペプチド濃度は、好ましくは少なくとも0.15mg/mL/ペプチド（＝75μg）であり、好ましくは最高3mg/mL/ペプチド（＝1500μg）までである。前記キットは更に、他の緩衝剤、希釈剤、フィルタ、針、注射器および添付文書と使用説明書を含む、商業上および使用者の観点から見て望ましい他の資材を含む。
本発明のキットは、他の成分（例えば、他の化合物あるいはこれら他の化合物の薬剤組成物）の有無に関わらず、本発明による薬剤組成物の製剤を含む単一容器を有してもよく、あるいは各成分を入れる別個の容器を有してもよい。
好ましくは、本発明のキットは、第2化合物（アジュバント（例えば、GM-CSF）、化学療法剤、天然産物、ホルモンもしくは拮抗薬、抗血管形成薬もしくは阻害剤、アポトーシス誘導剤もしくはキレート剤など）、またはその薬剤組成物の併用投与を組み合わせる使用目的で包装された本発明の製剤を含む。前記キットの成分は、あらかじめ複合体を形成するか、または各成分が患者に投与する前に個別の容器に入っていてもよい。前記キットの成分は、1つまたはそれ以上の溶液中、好ましくは水溶液、更に好ましくは無菌水溶液中に提供される。前記キットの成分はまた、固体として提供され、好ましくは他の別個の容器で提供される、適切な溶媒を添加することで液体に変換されてもよい。
治療用キットの容器は、バイアル、試験管、フラスコ、ボトル、注射器もしくは固体または液体を入れるその他の手段であってもよい。通常、2つ以上の成分がある時、前記キットは第2のバイアルあるいは他の容器を含み、それにより別々の投与が可能となる。前記キットはまた、薬剤的に認容可能な液体用の別の容器を含んでもよい。好ましくは、治療用キットは器具（例えば、1つまたはそれ以上の針、注射器、点眼容器、ピペットなど）を含み、現在のキットの成分である、本発明の薬剤の投与を可能にする。
本発明の製剤は、経口（腸内）、経鼻、点眼、皮下、皮内、筋肉内、静脈内、もしくは経皮など、任意の許容可能な経路によるペプチドの投与に適するものである。好ましくは、投与はs.c.で、最も好ましくはi.d.である。投与は輸液ポンプにより行ってもよい。
本明細書で公表および報告された本発明の特徴は、明示された各々の組み合わせで使用されるだけでなく、本発明で意図する範囲から逸脱せずに、単一の方法で使用することもできる。本発明の目的のため、本明細書で引用されている全ての参考文献が、その全体の参照として組み込まれている。
本発明は、以下の図、配列表、例を参照することで、これからより詳細に説明される。以下の例は説明の目的のみで提供され、本発明を限定する意図はない。
健常ドナーの末梢血から採取したCDC2-001およびASPM-002特異的CD8+リンパ球のミクロスフェアによる増殖のテトラマー分析。抗CD28抗体＋高密度腫瘍抗原A*2402/CDC2-001（左図）または抗CD28抗体＋高密度腫瘍抗原A*024/ASPM-002（右図）を結合したミクロスフェアを用い、1ウェルあたり1×106個のCD8+強化PBMCを1週間ごとに刺激した。in vitroで3回刺激後、全ての細胞を抗体CD8 FITC、および蛍光標識した四量体A*2402/ CDC2-001およびA*2402/ ASPM-002により染色した。細胞はCD8+リンパ球のゲートを通過させ、プロットの数値はCD8+リンパ球（マルチマー陽性細胞）について、図の四分区に入った細胞の割合を示す。 IMA-BIR-002およびIMA-MET-005由来の15merが最も頻度の高いHLA-DR対立遺伝子に結合する際のin vitroにおける相対的結合性。ProImmune REVEAL 技術ではin vitro HLA-DRアセンブリ法を採用し、個別ペプチドの結合定数の主な決定因子の1つとして、MHC：ペプチド複合体のオンレートを決定する。この方法はProImmune（英国オックスフォード）により行う。一定の時点でそのままのMHC：ペプチド複合体の量を測定し、合否判定用のコントロール（相対的に弱い結合因子）の量と比較した。陽性コントロールとして、強力で無差別なHLA-DR結合因子が含まれる。値は合否判定用のコントロールと比較した個別ペプチドおよびHLA-DR分子の結合量を示している。REVEAL 技術は15merに限定されるため、全長MET-005の代わりに2つの重なった15mer（位置2-16、6-20）を検討した。 IFNγ-EliSpotにより決定された、ワクチン接種患者の異なる時点における末梢血単核細胞（PBMC）中のPSMAとサービビン特異的IFNγ分泌CD4+T細胞の存在を示すものである。時点は、ワクチン接種前（a）と、ワクチン接種3（b）、6（c）、7（d）、8（e）、9（f）、10（g）、11（h）回後とした。 同上 細胞内染色法（ICS）により決定された、ワクチン接種患者の異なる3時点におけるPBMC中のサービビン特異的IFNγ-、IL-5、IL-10、TNFα分泌CD4+T細胞の存在を示すものである。時点は、ワクチン接種1（a）、3（b）、7（c）回後とした。
実施例１
1. 合成
ペプチドはFmoc法を利用し、標準的で十分確立された固相合成により合成した。分取用RP-HPLCによる精製後、イオン交換法を行い、生理的に適合可能な対イオン（例えば、酢酸、アンモニウム、または塩化物イオン）を組み込んだ。最終的に、凍結乾燥後、白色から黄色がかった白色の固体が得られた。全てのTUMAPは好ましくは酢酸塩として投与され、他の塩の形態も可能である。
重要なことに、個々の各ペプチドの同一性と純度は、質量分析、分析用HPLCを用い、容易に、高い精度で決定することができる。イオン交換操作後、表7 で示す純度で白色からオフホワイトの凍結乾燥物として得られた。
表7ではすべてのペプチドは、温度や pH 値などが異なる物理化学的条件でその安定性を試験した。
2. 典型的な薬剤組成IMA941の成分
IMA941は、大部分が原発性大腸癌細胞で同定された合成腫瘍関連ペプチド（TUMAP）の混合物から成る。TUMAPには、細胞傷害性T細胞（CD8+ T細胞）活性化能を持つ10個のHLAクラスI結合ペプチド、ヘルパーT細胞（CD4+ T細胞）活性化能を持つ1個のHLAクラスII結合ペプチドが含まれる。ヘルパーT細胞は、CD8+ T細胞の殺傷機能を高めるサイトカインを放出することで、細胞傷害性T細胞の機能を助ける重要な役割を果たし、腫瘍細胞に直接作用することもある (Knutson and Disis, 2005)。上記11個のTUMAPに加え、IMA941はウイルスのコントロールペプチドも1つ含んでもよい。
GBM患者の外科的に切除した悪性組織および正常組織のサンプルおよび健常ドナーの血液は、段階的アプローチで分析した。
まず、マイクロアレイによるゲノム規模のmRNA発現分析を利用し、一連の正常な臓器および組織と比較し、悪性組織で過剰発現した遺伝子を同定した。第2段階では、悪性材料のHLAリガンドを質量分析により同定した。その後、同定したHLAリガンドを遺伝子発現データと比較した。第1段階で検出された、選択的に発現または過剰発現された遺伝子によりコード化されるペプチドは、マルチペプチドワクチンを開発するために適切な候補TUMAPとみなした。
最後に、健常人の末梢CD8+ T細胞は、数種類の免疫測定法（in vitro T細胞測定法）により、腫瘍関連HLAリガンドに対する反応性を検討した。
3. 腫瘍サンプルのIMA941に含まれる腫瘍関連ペプチド（TUMAP）の提示
組織サンプル
患者の腫瘍組織は、 京都府立大学（KPUM）、京都、日本、および大阪市立大学医学部大学院（OCU）、大阪、日本から提供された。手術前に全ての患者から書面でインフォームドコンセントを得た。組織は、術後直ちに液体窒素で衝撃冷凍し、TUMAPを単離するまで−80℃で保存した。
組織サンプルからのHLAペプチドの単離
衝撃冷凍した組織サンプルのHLAペプチドプールは、わずかに変更したプロトコール（Falk et al., 1991)(Seeger et al. ,1999）に従い、HLA-A、-B、-C特異的抗体W6/32、CNBr活性化セファロース、酸処理、および限外ろ過により、固形組織から免疫沈降によって得た。
ESI液体クロマトグラフィー質量分析法（ESI-LCMS）によるTUMAPの検出
得られたHLAペプチドプールをその疎水性に従い逆相クロマトグラフィー（Acquity UPLC system、Waters）により分離し、溶出したペプチドは、ナノESI源付きLTQオービトラップ型ハイブリッド質量分析計（ThermoElectron）で分析した。ペプチドプールを1.7μmの逆相C18充填剤（Waters）が詰まった分析用溶融石英マイクロキャピラリーカラム（75μm i.d. x 250 mm）に、流速400nL/分とし、直接装填した。その後前記ペプチドは、流速300nL/分で10％から33％に、2段階の180分バイナリー勾配をかけて分離した。勾配は、溶媒A（0.1％蟻酸水溶液）と溶媒B（0.1％蟻酸アセトニトリル溶液）から成る。金被覆ガラスキャピラリー（PicoTip、New Objective）をnanoESI源への導入に使った。LTQオービトラップ型質量分析計をTOP5戦略により、データ依存モードで操作した。手短に言えば、オービトラップで（R＝30000）、高い質量精度の全スキャンからスキャンサイクルを開始し、続いて、以前に選択したイオンを動的排除した5つの最も多量に存在する前駆イオンについて、オービトラップ内で（R＝7500）MS/MSスキャンを実施した。タンデム質量スペクトルは、SEQUESTおよび別の手動コントロールにより解釈した。同定したペプチド配列は、作成された天然ペプチドの断片化パターンを、合成配列の同一参照ペプチドの断片化パターンと比較して確認した。図1は、腫瘍組織から得たMHCクラスI関連ペプチドCDC2-001 の典型的スペクトルおよびその UPLC 系での溶出プロフィールを示している。
実施例2：
本発明のペプチドをコード化する遺伝子の発現プロフィール
MHC分子による腫瘍細胞表面に提示されることが同定されたペプチドすべてが、免疫療法に適しているとはいえないが、その理由は、これらの多くのペプチドが多数の細胞タイプにより発現された正常の細胞タンパク質に由来しているからである。これらのペプチドのほんの僅かだけが、腫瘍に関連しており、由来する腫瘍を認識するのに高い特異性を有するＴ細胞を誘発できる傾向を有している。このようなペプチドを同定し、ワクチン接種により誘発される自己免疫のリスクを最小限にするため、本発明者は多数の正常組織と比較して、腫瘍細胞で過剰発現されるタンパク質に由来するこれらのペプチドに焦点を当てた。
理想的なペプチドは、腫瘍に特異的で他の組織には提示されないタンパク質に由来する。理想的なペプチドに近い発現プロフィールを有する遺伝子に由来するペプチドを同定するために、同定したペプチドを、それらが由来するタンパク質と遺伝子にそれぞれ割り当て、これらの発現プロフィールを生成した。
RNA源と予備調製
書面によるインフォームドコンセントを各患者から得たのちに、外科的に切除した組織標本が異なる2ヶ所の臨床施設（例1を参照）から提供された。腫瘍組織標本は、術後直ちに液体窒素でスナップ凍結し、その後、液体窒素下で乳鉢と乳棒を使い均質化した。総 RNAを TRI 試薬（Ambion、ドイツ、ダルムシュタット）、続いて RNeasy（QIAGEN、ドイツ、ヒルデン） によるクーンアップによりこれらのサンプルから調製し、両方法とも製造者のプロトコールに従って実施した。
健常ヒト組織の総 RNAは市販品から得た（Ambion、英国ハンティンドン; Clontech、ドイツ、ハイデルベルク; Stratagene、オランダ、アムステルダム; BioChain、米国カリフォルニア州ヘーワード）。数人（2名から123名の間）の RNA を混合し、各個人の RNA を等重量にした。白血球は 4 名の健常ボランティアの血液サンプルから単離した。
総 RNA サンプルの質と量は、RNA 6000 Pico LabChip Kit（Agilent）を用いて Agilent 2100 Bioanalyzer（Agilent、ドイツ、ヴァルトブロン）で測定した。
マイクロアレイ実験
すべての腫瘍と正常組織の RNAサンプルの遺伝子発現解析は、Affymetrix Human Genome（HG）U133A または HG-U133 Plus 2.0 オリゴヌクレオチドマイクロアレイ（Affymetrix、米国カリフォルニア州サンタクララ）を使って実施した。すべてのステップは Affymetrix マニュアルに従って実施された。簡単にいうと、二本鎖 cDNA を総 RNA 5〜8 μg から SuperScript RTII（Invitrogen）とオリゴ-dT-T7 プライマー（MWG Biotech、ドイツ、エーバースベルク）を使って取扱説明書の説明通りに合成した。In vitro 転写は、U133A アレイには BioArray 高収率 RNA 転写ラベルキット（ENZO Diagnostics, Inc.、米国ニューヨーク州ファーミンデール）で、U133 Plus 2.0 アレイには GeneChip IVT ラベルキット（Affymetrix）で実施した後、cRNA フラグメンテーション、ハイブリダイゼーション、およびストレプトアビジン−フィコエリトリンとビオチン化抗ストレプトアビジン抗体（Molecular Probes、オランダ、ライデン）による染色を行った画像は Agilent 2500A 遺伝子アレイスキャナー（U133A）またはAffymetrix 遺伝子チップスキャナー 3000（U133 Plus 2.0）でスキャンし、データは全パラメータの初期設定値を用いて GCOS ソフトウェア（Affymetrix）で解析した。正規化は、Affymetrix により提供された100 個のハウスキーピング遺伝子を使った相対的発現値は、ソフトウェアで得たシングルログ比から計算し、正常腎サンプルは適宜 1.0に設定した。
胃癌で高く過剰発現する本発明の遺伝子源の発現プロフィールを図 2 に示す。
4. IMA941 MHCクラスI 提示ペプチドのin vitro免疫原性
本発明の TUMP の免疫原性について情報を得るため、すでに（Walter, S, Herrgen, L, Schoor, O, Jung, G, Wernet, D, Buhring, HJ, Rammensee, HG, and Stevanovic, S; 2003, Cutting edge: predetermined avidity of human CD8 T cells expanded on calibrated MHC/anti-CD28-coated microspheres, J.Immunol., 171, 4974-4978）により報告され、十分確立されたin vitro刺激プラットフォームを用いて検討を行った。このプラットフォームを使って、本発明の10 HLA-A*2402拘束性 TUMAP に対して、免疫原性が示された。それ故、これらのペプチドはT細胞エピトープであり、ヒトではこれに対するCD8+前駆T細胞が存在することを証明している（表 6）。
CD8+ T細胞のin vitroプライミング
ペプチド−MHC複合体（pMHC）と抗CD28抗体を載せた人工抗原提示細胞（aAPC）によるin vitro刺激を実行するために、発明者はまず、血液バンクのTubingenから入手した健常なドナーの新しいHLA-A*24の白血球分離生成物からCD8 T 細胞を単離した。
CD8 T 細胞は、白血球分離生成物から直接濃縮されたか、またはPBMC(peripheral blood mononuclear cells:末梢血液単核細胞)が標準勾配分離媒体により最初に単離された。単離されたCD8 リンパ球またはPBMCは、10％熱不活性化ヒトAB血清（PAN-Biotech、Aidenbach、ドイツ）が補充されたRPMI−グルタマックス（Invitrogen、Karlsruhe、ドイツ）、100U/mlペニシリン／100μg/mlストレプトマイシン（Cambrex、Cologne、ドイツ）、1mMピルビン酸ナトリウム（CC Pro、Oberdorla、ドイツ）、および20μgml／ゲンタマイシン（Ｃambrex）で構成される、T細胞培地（TCM）で使用直前までインキュベートした。CD8+リンパ球は、製造業者の指示に従い、CD8+ MACS陽性分離キット（Miltenyi、Bergisch Gladbach、ドイツ）を用いて単離した。2.5ng/ml IL-7（PromoCell、Heidelberg、ドイツ）および10U/ml IL-2（Chiron、Munich、ドイツ）がこの段階で、TCM中に補充された。
CD8+ リンパ球の単離は、CD8 MicroBeads（Miltenyi Biotec, Bergisch-Gladbach, Germany）を使って陽性選択により実施した。
pMHC／抗CD28被覆ビーズの作成、T細胞刺激および読み出しなどは、わずかな変更を行い、すでに報告の通り（Walter et al., 2003）に実施した。簡単に言うと、膜貫通型ドメインを欠き重鎖のカルボキ末端でビオチン化された、ビオチン化組み換えペプチド負荷 HLA-A*2402分子は、（Altman et al., 1996）が報告した方法に従い生成した。精製した共刺激マウスIgG2a抗ヒトCD28 Ab 9.3（Jung et al., 1987）は、スルホ−N−ヒドロキシスクシンイミドビオチンで化学的にビオチン化した。使用したビーズは、5.6μmの大きいサイズのストレプタビジン被覆ポリスチレン粒子（Bangs Laboratories、米国イリノイ州）である。コントロールとして使用したpMHCは、A*0201/DDX5-001（DDX5から得たYLLPAIVHI）である。
ビーズ800.000個／200μlを、600ngのビオチン抗CD28＋200ngの関連ビオチン−pMHC（高密度ビーズ）の存在下、96ウェルプレート中で被覆した。5ng/ml IL-12（PromoCell）が補充された200μl TCM中で2×105個の洗浄済み被覆ビーズおよび1×106個のCD8+ T細胞を37℃で3〜4日間共インキュベートし、96ウェルプレート中刺激を開始した。続いて、培地の半分を80U/ml IL-2が補充された新しいTCMと交換し、インキュベーションは37°Cで3〜4日間続けた。この刺激サイクルを合計3回実施した。最後に、
Live/dead-Aqua色素（Invitrogen、ドイツ、カルルスルーエ）、CD8-FITC 抗体クローンSK1（BD、ドイツ、ハイデルベルク）、および PE または APCカップリング A*2402 MHC 多量体で細胞を染色して多量体解析を実施した。解析は、適切なレーザーとフィルターを装備したBD LSRII SORPサイトメータを使用した。ペプチド特異的細胞を総 CD8+ T 細胞のパーセンテージとして計算した。多量体解析の評価は、FlowJo ソフトウェアによって行った（Tree Star、米国オレゴン州）。 特定の多量体＋CD8 +リンパ球のin vitroプライミングは、適切なゲート開閉と陰性コントロール刺激との比較によって、検出した。一例の健常ドナーについてin vitroで刺激された評価可能な少なくとも1つのウェルに、in vitro刺激後、特異的なCD8+ T細胞株が含まれることが発見された場合（すなわち、このウェルがCD8+ T細胞中に少なくとも1％の特異的多量体+を含んでおり、特異的多量体＋細胞のパーセンテージが陰性コントロール刺激の中央値の少なくとも10倍であった場合）、特定抗原の免疫原性が検出された。
IMA941ペプチドのIn vitro免疫原性
検討した HLA クラス Iペプチドは 14 個すべてについて、in vitro 免疫原性をペプチド特異的 T 細胞株を生成させることにより証明できた。本発明の 2 つのペプチドに対する、TUMAP 特異的多量体染色後の典型的なフローサイトメトリーの結果を、対応する負のコントロールと共に図 3 に示す。本発明のペプチドの結果を表 8 にまとめ、本発明の HLA クラス I の in vitro 免疫原性を示している。in vitro 免疫原性の実験結果は、テストした陽性ドナーと評価可能なペプチド間のウェルのパーセンテージを示している。少なくとも 2 つのドナーと 24 個のウェルが各ペプチドについて評価可能であった。
表8：本発明に含まれるHLAクラスIペプチドのin vitro 免疫原性
5. IMA941クラスII TUMAP BIR-002の免疫原性
SEQ ID NO:11ペプチドの免疫原性を確認するために、臨床試験を実施した。
試験の主な目的は、顕性転移病変が検出されず、根治的前立腺切除術の施行後、生化学的に再発した患者を対象とし、前立腺特異的ペプチドパネルの皮下注投与（ワクチン接種療法）に対するPSA（前立腺特異抗原）に基づく奏効（PSA-R）を検討することであった。
試験の第2の目的は、T細胞応答の点から免疫現象を特別に検討した前立腺癌患者について、ワクチン接種療法施行の忍容性と実現性を検討することであった。
試験は、「顕性転移病変が検出されず、根治的前立腺切除術を施行後、生化学的に再発した」徴候を検討する、プロスペクティブランダム化第I／II相試験としてデザインされた。
試験集団
この第I／II相試験の一部として、根治的前立腺切除術後に生化学的に再発した HLA-A*02+患者において、前立腺特異的ペプチドパネルのワクチン接種による腫瘍発育停止の指標として、PSAレベルを軽減させる試みが行われた。前立腺特異的ペプチドの組み合わせが皮下投与され、抗原構造の様々な投与形態に照らし、各免疫応答の程度が評価された。
以前のワクチン接種試験とは対照的に、この計画された試験では、画像診断ではまだ検出不可能な、少量の腫瘍組織量を持つ患者の治療を目標とした。患者は全員、既知の前立腺特異的抗原構造を使った同一の方法でワクチン接種を受け、悪性形質転換した細胞への免疫応答を強化した。19例の患者が治療を受けた。
表9：試験集団の背景
治療計画
事前の根治的前立腺切除術後にPSA再発が検出された（14日以上の間隔で2回測定し、PSAが50％上昇した）患者に、CTと骨シンチグラフィーにより顕性転移病変を除外した後、前立腺特異的ペプチドワクチンを異なる投与形態で皮下投与した。ワクチンは0、7、14、28、42、56日目に8倍投与した（1ペプチド、注射1回につき約100mg）。各ワクチン接種後と70日目に再度、PSAを測定し、治療の奏効を評価した。
腫瘍の応答（完全寛解［PSA-CR］、部分寛解［PSA-PR］、または安定な臨床経過［変化なし、［PSA-NC］））が検出される場合、患者は、選択した投与形態で維持療法として毎月1回ワクチンを接種した。ワクチン接種療法に対する患者の奏効は以下のように詳細に評価した。
完全寛解（PSA-CR）：初期に上昇したPSAレベルが正常化し、これが少なくとも4週間後の測定で確認される。正常化はPSA最低値が＜0.2ng/mlと定義され、全腫瘍または全前立腺の根治的切除術後に期待される。
部分寛解：a）PSA-PR≦80％（初期に上昇したPSAレベルの80％減少が、少なくとも4週間後の測定で確認される）、b）PSA-PR≦50％（初期に上昇したPSAレベルの50％減少が、少なくとも4週間後の測定で確認される）。
病態安定（PSA-SD）：4週間以上にわたり有意な変化がない。これには、安定化および50％未満の減少および10％未満の上昇が、少なくとも4週間後の測定で確認されることが含まれる。
病態進行（PSA-PD）：PSAレベルが10％を超えて上昇する。PSA進行の場合は、試験を中止する。
患者の本試験への登録後、エピトープ特異的ワクチンを使用し、前立腺上皮細胞（例えば、PSMA／PSCA）に特異的に発現するタンパク質を検討した。PSAのモニタリングにより評価される残存腫瘍画分の増殖モニリングに関連した、投与ワクチンの全体的有効性を検討することに加え、本試験では免疫系の効果的な調節に関連した、様々なワクチン接種法の効果も検討した。ペプチドのみの単純な皮下投与に加え、様々なアジュバントの併用も利用した。特に、最近非常に好意的に報告された、モンタニド（ヒトでの使用に適した従来からの不完全フロイントアジュバント製剤）ペプチドワクチンのデポーおよびアジュバント活性を利用した。この目的では、ペプチド溶液500μlをモンタニド500μlと混合して投与した。これにより、油中水滴型エマルジョンが形成され、水層に含まれる抗原が数週間かけてゆっくり放出される。このエマルジョンの物理的安定性は非常に高く、4℃で、明らかな相分離を起こさずに3ヶ月を超えて保存できる。モンタニドのデポー製剤としての機能は、数件のワクチン接種試験で開発され、良好な結果を得ている（Oka et al., 2004）。
1試験群では、増殖因子GM-CSF製剤である注射用Leukine登録商標溶液により、免疫系の同時刺激中にワクチン接種の効能を検討した。GM-CSFはペプチドワクチン接種試験で非常に一般的に使用されるアジュバントであり、この試験のうち数件で臨床的なT細胞応答が強化されることが報告されている。最初に、GM-CSFはワクチン注入部位で樹状細胞数を増加させると考えられる、樹状細胞の補充／分化因子である。GM-CSF自体は、樹状細胞およびマクロファージとしての抗原提示細胞を活性化しないが、in vivoでの間接的活性化が報告されている（Molenkamp et al., 2005）。
別の試験群では、イミキモドの経皮投与による樹状細胞の同時活性化中のワクチン接種の有効性を検討した。イミキモドは5％軟膏（Aldara）として投与した。イミキモドはTLR7陽性細胞（例、形質細胞様DC、ランゲルハンス細胞、皮膚DC）への作用を通じて強い免疫刺激作用を有し、MyD88依存性経路を活性化する。活性化APCはT細胞刺激サイトカインと炎症性サイトカインを遊離し、共刺激をアップレギュレートし、流入領域リンパ節まで遊走する。抗原を軟膏中に混合するか、抗原のs.c.またはi.d.注射部位にAldaraを塗布することによりペプチド誘発CTL応答が高まるという、イミキモドの可能性が動物モデルで証明された。
別の試験群では、樹状細胞をムチン−1をコード化するプロタミン安定化mRNAと混合してTLR7/8を活性化することにより、樹状細胞を同時に活性化している間のワクチン接種の有効性を検討した。mRNAは、マウスおよびヒトの免疫細胞集団を広範囲に活性化することが示された。製剤中に多塩基タンパク質プロタミンが存在すると、mRNAの半減期が増大し、デポーを形成する可能性のある粒子の形成を誘発する。そのため、このアジュバントはデポー形成とAPC活性化の性質を兼ね備えている可能性がある。
要約すると、ワクチンの投与形態には以下の方法が含まれる。
- モンタニド中で乳化されたペプチドワクチンの皮下投与
- 増殖因子の同時投与によりより強力な免疫応答を得る目的で、GM-CSF 225μlの局所投与を併用した、モンタニド500μl中に乳化したペプチドワクチンの皮下投与
- 熱で誘発されるより強力な免疫応答を得る目的で行われる局所温熱療法と併用した、モンタニド500μl中に乳化したペプチドワクチンの皮下投与
- TLR 7を介して樹状細胞を活性化するためにイミキモド経皮投与を併用した、モンタニド500μl中に乳化したペプチドワクチンの皮下投与
- TLR 7/8によって樹状細胞を活性化するため、ムチン−1のmRNA／プロタミン55μlと共に、モンタニド500μl中に乳化したペプチドワクチンの皮下投与
スケジュール：全試験期間は3年であった。

前立腺特異的ペプチドワクチンは0、7、14、28、42、56日目に患者に投与した。病態安定または目的とする腫瘍応答（PSA-CRまたはPSA-PR）が見られる患者では、検出可能な進行が起こるまで毎月1回i.d.でワクチン接種を行った。これまで得られた経験に基づき、ペプチド注射は忍容性があり、重大な有害反応はない。ワクチン接種療法への奏効は、PSA測定に基づき血清学的にのみに評価されたため、検査は試験の開始時に実施し、in vitroのPSA測定を投与ワクチンが妨害するか否かを決定したが、これにより臨床奏効をシミュレートできる。0、7、14、28、42、56、70日目に、臨床検査、PSAレベル、白血球百分率数、FACS分析およびサイトカイン測定用に血液サンプルを採取した。70日目を過ぎて治療が継続される場合、時宜、治療失敗を検出するために、6週間のPSAのモニタリングが実施された。
PSA上昇の持続という点からみて疾病の進行が確認されれば、治療は終了とした。
免疫療法は84日目に開始し、病態進行が確認されるまで、または最長420日目まで（15ヶ月間）、4週間隔で継続した。本試験終了後に（成功例について）治療を継続するかの決定は、臨機応変に行った。予想外の有害反応は本試験では発生しなかった。
臨床検査では、血液凝固、電解質、LDH、β2-M、CK、肝酵素、ビリルビン、クレアチニン、尿酸、総タンパク質、血液凝固、CRP、塗抹による白血球百分率数、PSAレベル、サイトカイン、FACS、Elispotを測定した。
確認された細菌および真菌抗原に対する皮膚反応の分析（投与48〜72時間後、T細胞による遅延型過敏症（DTH））は、試験開始前の患者の細胞性免疫系の分析として役立つ。
試験に必要なペプチド（ノナペプチド）は、Prof. H.-G. Rammenseeの学部のPD Dr. Stefan Stevanovic研究室で製造された。これらのペプチドはHPLCで精製し、質量分析計で分析された。ペプチドの純度は、HPLC、質量分析計、Edman配列決定により確認することもできる。これらの方法により、最大98％までの純度が確認できる（現状の方法では、どうしても最高とみなされる値である）。合成ペプチドはDMSO（CryoSure、WAK Chemie Medical GmbH、10mg/ml）に溶解し、Ampuwa（Fresenius Kabi）で1:10に希釈し、滅菌条件下で分取した。
臨床的奏効
患者2例に継続的なデジタル直腸検査によって局所腫瘍が検出された後、PET-CTスキャンで局所再発を発見できた。残る17例の患者では、疾患活動部位を試験終了時に確認できなかった。
白血球百分率数または広範な生化学試験の臨床評価を繰り返しても、試験期間中にいかなる異常あるいは変化も発見されなかった。

19例の患者のうち16例がSEQ ID NO:12のサービビンIIペプチド（IFN-g ELISPOT、+/- ICS）に反応した。このうち12例ではワクチン接種で抗サービビンT細胞応答が誘導され、2例では事前に抗サービビンT細胞が存在し、2例では事前に抗サービビンT細胞が十分存在したどうかは確認されなかった。
生化学的奏効
完全奏功とは、PSA値の初期上昇後、共同研究している検査室の検出可能最小値に従い、PSA値が検出不能の場合とみなした。測定は4週間以上の間隔後に確認する必要があった。従って、80％超および50％超のPRは、4週間後に再評価する必要があった。少なくとも4週間後にPSAが50％未満の低下または10％未満の上昇の範囲内と確認されれば、病態安定を示した。病態進行は、治療開始時にPSAの上昇が10％を超えた場合と考えた。
試験を中止した患者の生化学的奏効は、患者が局所放射線照射または抗内分泌療法の追加療法を受けるまで追跡した。
19例が試験の参加に同意し、最長約3．75年継続した追跡調査によりデータを解析した。
PSAの安定とDTの増加
患者2例（10.2％）のPSA値は上述した生化学的奏効基準に従う病態安定を示し、これは、治療開始時に10％を超えていたPSA値は、試験終了時に上昇していなかったことを示している（図6、表10、11、12）。最後のワクチンを投与後、これらの2症例の追跡調査は14ヶ月間および16ヶ月間実施された。病態安定の平均期間は、データのカットオフ時点で24ヶ月（28ヶ月および31ヶ月）であり、平均ワクチン接種回数は18回（14回および20回）であった。
これら2例の患者のうち1例は、9ヶ月間で50％を超える部分的奏功を示し、その後ゆっくりとしたPSAの上昇期間が続き、倍加時間（DT）はワクチン接種前の9.8ヶ月に比べ20.5ヶ月となった。最初のPSA再発は、pT2pN0 Gleasonスコア5の腫瘍の手術後18ヶ月で始まった。
データ解析では、患者8は28ヶ月前のワクチン接種プログラム開始時から病態安定を示していた。この患者は10ヶ月後の14回目のワクチン接種後、アレルギー反応のため投与を中止した。この患者はpT3b Gleasonスコア3+4という好ましくない状況であり、根治的前立腺切除術後もPSA最低値が0.6ng/ml未満とならず、PSA進行であり、この進行は術後最初に鈍化した後、適時遅くなることはなかった。倍加時間は6.6ヶ月から148ヶ月まで延びた。
これら2例の患者では、ペプチドワクチン接種時に毎回、接種部位にイミキモドも経皮投与した。
PSAの安定が認められないPSA DTの延長
患者11のPSA DTは6ヶ月の試験期間中に1.5ヶ月から10.1ヶ月に延びた。この患者は、PSAが最初に10.8ng/mlであり、17.8ng/mlまで進行したため試験を中止し、PET-CTでは視覚的に悪性病変はなく、抗アンドロゲン単剤療法を受けた。アジュバントとしてAldaraが投与された。
患者16は、倍加時間が6.1ヶ月であり、ワクチン投与とムチン−1−mRNA／プロタミンの併用で開始した。PSAの速度は5ヶ月間で半減期2.7ヶ月まで低下し、続いてPSA DT上昇の統計的計算値は14.4ヶ月となり、これは治療開始後16ヶ月間続いている。この患者の初期PSA値は0.29ng/mlであり、試験治療を行った最初の5ヶ月間で0.19ng/mlに低下し、次の8ヶ月で0.4ng/mlまで上昇し、治療開始19ヶ月後0.41ng/mlであったため、プロトコールにつき試験を中止した。
PSA進行
患者5は、ワクチン接種前の推定PSA倍加時間から判断して試験中に進行した。しかし、この患者はPSA低下を経験し、治療終了後半減期が20.2ヶ月であり、データカットオフ時点で10ヶ月間継続していた。この患者はワクチン接種終了後2回目の治療を受けなかった。この患者には、唯一のアジュバントとしてモンタニドをワクチン接種した。
表10：PSA倍加時間（月）
*試験終了時または追跡調査終了時のPSA DTは、患者5ではPSAが低下したため含めなかった。
7. 本発明のHLAクラスI拘束性ペプチドのHLA-A*0201への結合
目的および概要
本分析の目的は、IMA941の作用機序の重要なパラメータであるため、HLA-A*0201対立遺伝子によってコード化されるMHC分子へのHLAクラスIペプチドの親和性を評価することであった。HLA-A*0201への親和性は、IMA941およびMET-001では、10個のHLAクラスI拘束性ペプチド全てにおいて中等度から高度であり、解離定数（KD）は0.14（MET-001）から2.05nM（CSP-001）であった。全ての値が、強力な結合因子HBV-001の0.1から中等度の結合因子MUC-001の4.4までの範囲内にあった。これらの結果から、ワクチン候補のIMA941およびMET-005由来MET-001からHLA-A*02のHLAクラスIペプチド全てにおいて強い結合親和性が確認された。
試験の原理
安定なHLA／ペプチド複合体は、HLA重鎖、β2ミクログロブリン（b2m）、およびペプチド性リガンドの3つの分子から構成される。変性組み換えHLA-A*0201重鎖分子単独の活性は、その重鎖分子に「空のHLA-A*0201分子」と同等な機能を与えながら保存することができる。これらの分子は、b2mと適切なペプチドを含む水性緩衝剤に希釈すると、完全にペプチド依存的に迅速に効率よく折り畳まれる。これらの分子の有用性は、ペプチドとHLAクラスI分子間の相互作用の親和性を測定する、ELISAに基づくアッセイで利用されている（Sylvester, 2002）。
精製された組み換えHLA-A*0201分子は、b2mと共にインキュベートされ、関心のあるペプチドの用量を評価した。HLAクラスI結合能を持たない全長MET-005に代わり、証明されたA*0結合生成物のMET-001を分析に含めたが、これは自然発生する抗原プロセシングによりMET-005からin vivoで作成した。新規折り畳みHLA／ペプチド複合体の量は、定量的ELISA法で測定した。解離定数（KD値）は、較正物質であるHLA／ペプチド複合体を希釈して記録した標準曲線を用いて計算した。
結果
結果は、図2に示している。KD値が低いほどHLA-A*0201への親和性は高い。殆どのIMA941ペプチドは、0.1nM（HBV-001、強力な結合因子）から44.4nM（MUC-001、中等度の結合因子）の範囲でHLA-A*0201に対して同様の強い親和性を示した。従って、全てのIMA941クラスI TUMAPはMHC分子A*02に対して中等度から強度の結合親和性を持つ。
8. 本発明のHLAクラスII拘束性ペプチドのHLA-DRへの結合
目的および概要
クラスII TUMAPは、クラスI拘束性TUMAPにより誘発されるCTLの機能を補助する上で重要な役割を果たすヘルパーT細胞を活性化する。IMA941クラスIIペプチドが数種類の異なるHLAクラスII分子に結合することは（無差別な結合）、ワクチン候補IMA941を投与した患者の大部分が補助的なヘルパーT細胞応答の利益を得ることができる、ということを確認するために重要である。例えば、最も優位に発現されるヒトHLAクラスII分子のHLA-DRは、非常に多様な形を持ち、数百種類の対立遺伝子が知られている。HLA-DRB1ハプロタイプの既知の対立遺伝子頻度および十分確立された結合アルゴリズムに基づき、IMA941のいずれのHLAクラスIIリガンド、IMA-BIR-002およびIMA-MET-005とも、無差別なHLA-DR結合ペプチドであると予測できる。詳細には、HLA-A*02陽性白人が少なくとも1つ適切なHLA-DR対立遺伝子を発現している可能性は、いずれのIMA941クラスII TUMAPとも90％を超える。頻度データあるいは結合予測アルゴリズムがないという理由から、残りのヒトクラスII対立遺伝子HLA-DQおよび-DPはこの計算から除外したため、実際の無差別性は更に高くなる可能性が最も高い。2つのIMA941クラスII TUMAPについて計算された無差別性は、既知のpan-DRエピトープ（PADRE、遺伝子型頻度Fprojected＝93.1％）と同じ範囲である。更に、これらのペプチドの無差別な結合は、in vitro結合アッセイにより実験的に確認された。また、IMA-BIR-002では、高いin vivo免疫原性を証明することができた（上記参照）。要約すると、これらの結果から、MET-005およびBIR-002は無差別なHLA-DR結合ペプチドがあることが確認される。
結合予測の原理
University of Tubingenで開発されたSYFPEITHIアルゴリズムにより (Rammensee et al., 1997; Rammensee et al., 1999)、IMA941クラスII TUMAPのいくつかの共通HLA-DR対立遺伝子への結合をランク付けした。このアルゴリズムは、例えばヒト腫瘍関連抗原TRP2（クラスI） (Sun et al., 2000)およびSSX2（クラスII） (Neumann et al., 2004)など、広範な抗原からクラスIおよびクラスIIエピトープを同定するため、すでに使用され、成功している。結合閾値は、公表された既知の無差別HLA-DRリガンドの結合スコア分析に基づき、スコア18に定義した。
HLA-A*02陽性白人集団について公表されたHLA-DRハプロタイプの頻度 (Mori et al., 1997)および高分解能ハプロタイプ頻度 (Chanock et al., 2004)を利用した（表2参照）。ハプロタイプ頻度とは、個々の染色体上で異なる対立遺伝子が発生する頻度である。哺乳類細胞では染色体が2倍体であるため、この対立遺伝子の遺伝子型が発生する頻度は高く、ハーディー・ワインベルクの法則を用いて計算することができる（ハプロタイプ頻度Gfから遺伝子型発生頻度Fが得られる（F＝2Gf−Gf2））。
既知のSYFPEITHIマトリックスを用いたDRB1ハプロタイプ頻度とA*02+白人集団における既知の個別頻度の合計は、47.8％である。従って、クラスII TUMAPのこれらの対立遺伝子に対する予測結合分布は、DRB1対立遺伝子で残りの52.2％になると予想されたが、このデータは利用できない。
最後に、無差別な結合は1つのペプチドが数種類のHLA-DR対立遺伝子に結合することと定義され、この対立遺伝子のうち1つが白人集団で発現される確率は50％以上である。
in vitro結合アッセイの原理（ProImmune REVEAL登録商標）
IMA-BIR-002およびIMA-MET-005を広範なHLA-DR抗原（HLA-DR1からDR7、分割された抗原HLA-DR11から-DR15も含む (Mori et al., 1997)）と会合させ、REVEAL登録商標 MHC：ペプチド結合アッセイ（ProImmune、英国オックスフォード）により分析し、MHC分子に組み込まれたレベルを決定した。このアッセイでは、結合を合否判定用のコントロール結合因子、および各HLA-DR抗原の陽性コントロールペプチドと比較した。
結果
SYFPEITHIアルゴリズムの予測に基づき、IMA-BIR-002は、それぞれ既知の結合モチーフを持つHLA-DR対立遺伝子7/8個と結合する可能性がある（表11）。HLA-A*02陽性白人がIMA-BIR-002に対して少なくとも1つ適切なHLA-DRB1対立遺伝子を発現する確率は、それぞれ92.6％である。従って、いずれのIMA941クラスIIペプチドも無差別なHLA-DR結合因子と予想される。
結合HLA-DRB1対立遺伝子のハプロタイプ頻度がファクター2のため、このアプローチにより過大評価された場合でも、この遺伝子型の発生率は、IMA941における全てのクラスII TUMAPでまだ50％を超える。更に、in vitroの結合データから、IMA-BIR-002のHLA-DR1、3、4、11への無差別な結合が実験的に確認された（図3）。
異なるHLA-DR対立遺伝子を持つ前立腺癌患者を対象とした臨床試験において、IMA-BIR-002は広範な免疫原性が証明されたため、このクラスIIペプチドの無差別性はin vivoで明らかに証明された。
結論として、IMA941に含まれる2つのクラスIIペプチドのHLA-DR結合特性に関するコンピュータによる解析、および、更にBIR-002に関するin vitroアッセイおよび臨床試験の実験的根拠は、これらのTUMAPがヒトクラスII HLA分子の無差別な結合因子であることを強く示唆している。
表11：既知の結合モチーフを持つHLA-DR対立遺伝子に対する、IMA941クラスII TUMAPの結合スコア白人集団で最も多いHLA-DRB1対立遺伝子について、SYFPEITHI結合スコアが示されている。pは、HLA-A*02陽性白人のハプロタイプ頻度を示している。スコアが18以上の場合、そのペプチドはHLA分子に結合するとみなした。DRB1対立遺伝子の結合についてp値を蓄積すると、最小ハプロタイプ頻度pminが得られる。これらの頻度を結合予測マトリックスまたは頻度データが不完全なものを含む全てのDRB1対立遺伝子に外挿すると、遺伝子型発生頻度Fprojectedに対応する予測ハプロタイプ頻度pprojectedが得られる。n.d.＝データなし
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Claims (17)

  1. SEQ ID NO 1からSEQ ID NO 10、SEQ ID NO 20およびSEQ ID NO 24から成るグループから選択されたアミノ酸配列を含む少なくとも2つのペプチド、および／または
    SEQ ID NO 1からSEQ ID NO 10、SEQ ID NO 20およびSEQ ID NO 24と少なくとも85％同一の変異アミノ酸配列を含む少なくとも2つのペプチド、および／または
    SEQ ID NO 1からSEQ ID NO 10、SEQ ID NO 20およびSEQ ID NO 24に示されるアミノ酸配列またはこれらのアミノ酸配列と少なくとも85％同一の変異アミノ酸配列をコードする核酸を含むポリヌクレオチド、および薬剤的に認容される担体
    を含む、がんの免疫療法に使用するための薬剤組成物。
  2. SEQ ID NO 11からSEQ ID NO 22から成るグループから選択されるアミノ酸配列を含む少なくとも1つの追加ペプチド、または
    SEQ ID NO 11からSEQ ID NO 22と85％以上同一の変異アミノ酸配列を含む少なくとも1つの追加ペプチド、または
    SEQ ID NO 11からSEQ ID NO 22に示されるアミノ酸配列またはこれらのアミノ酸配列と少なくとも85％同一の変異アミノ酸配列をコードする核酸を含むポリヌクレオチド
    をさらに含む、請求項１に記載のがんの免疫療法に使用するための薬剤組成物。
  3. ペプチドの全長が、8〜100アミノ酸長、8〜30アミノ酸長、または8〜17アミノ酸長である、請求項１または２に記載のがんの免疫療法に使用するための薬剤組成物。
  4. 少なくとも1つのペプチドは非ペプチド結合を含むものである、請求項１〜３のいずれか一に記載のがんの免疫療法に使用するための薬剤組成物。
  5. SEQ ID NO 1からSEQ ID NO 22およびSEQ ID NO 24のアミノ酸配列から成る少なくとも2つのペプチドを含む、請求項１〜４のいずれか一に記載のがんの免疫療法に使用するための薬剤組成物。
  6. 2つのMHCクラスIペプチドのうち１つは、SEQ ID NO 1のアミノ酸配列およびSEQ ID NO 11のアミノ酸配列を含む、または
    2つのMHCクラスIペプチドのうち１つは、SEQ ID NO 2のアミノ酸配列およびSEQ ID NO11のアミノ酸配列を含む、または
    2つのMHCクラスIペプチドのうち１つは、SEQ ID NO 3のアミノ酸配列およびSEQ ID NO11のアミノ酸配列を含む、
    少なくとも2つのMHCクラスIペプチドを含む、請求項１〜５のいずれか一に記載のがんの免疫療法に使用するための薬剤組成物。
  7. 組成物に存在するペプチドの選択が、数が、および／または量が、組織特異的、がん特異的、および／または患者特異的である、請求項１〜６のいずれか一に記載のがんの免疫療法に使用するための薬剤組成物。
  8. 1018 ISS、アルミニウム塩、Amplivax、AS15、BCG、CP-870,893、CpG7909、CyaA、dSLIM、GM-CSF、IC30、 IC31、イミキモド、ImuFact IMP321、IS Patch、ISCOMATRIX、JuvImmune、LipoVac、MF59、モノホスホリルリピドA、モンタニドIMS 1312、モンタニドISA 206、モンタニドISA 50V、モンタニドISA-51、OK-432、OM-174、OM-197-MP-EC、ONTAK、PepTelベクター系、PLG微粒子、レシキモド、SRL172、ビロソームおよび他のウイルス様粒子、YF-17DBCG、Aquila's QS21 stimulon、Ribi's Detox. Quil、Superfos、フロイントアジュバント、GM-CSF、コレラ毒素、免疫学的アジュバント、MF59、およびサイトカインから成るグループから選択される、少なくとも1つの適切なアジュバントをさらに含む、請求項１〜７のいずれか一に記載のがんの免疫療法に使用するための薬剤組成物。
  9. アジュバントが顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）を含むコロニー刺激因子、イミキモドおよびレシミキモドから成るグループから選択される、請求項８に記載のがんの免疫療法に使用するための薬剤組成物。
  10. 少なくとも1つの抗原提示細胞をさらに含む、請求項１〜９のいずれか一に記載のがんの免疫療法に使用するための薬剤組成物。
  11. 抗原提示細胞は樹状細胞である、請求項１０に記載のがんの免疫療法に使用するための薬剤組成物。
  12. 少なくとも1つの抗原提示細胞が、
    a）ペプチドでパルスされている、もしくはペプチドを載せている、または
    b）ペプチドをコードする発現構成物を含む、
    請求項１０または１１記載のがんの免疫療法に使用するための薬剤組成物。
  13. ワクチンが静脈内、動脈内、腹腔内、筋肉内、経皮、腫瘍内、経口、経皮、経鼻、頬側、直腸、経膣、吸入、または局所投与されるものである、請求項１〜１２のいずれか一に記載のがんの免疫療法に使用するための薬剤組成物。
  14. 患者のがんを治療または予防するための医薬の製造における、請求項１〜１３のいずれか一に記載のがんの免疫療法に使用するための薬剤組成物の使用。
  15. 薬剤組成物が抗がんワクチンである、請求項１４に記載の使用。
  16. がんは、胃癌であるか、または、前立腺癌、口腔癌、口腔扁平上皮癌（OSCC）、急性骨髄性白血病（AML）、ピロリ菌誘発性 MALT リンパ腫、結腸癌または結腸直腸癌を含む大腸癌、神経膠芽細胞種、非小細胞肺癌（NSCLC）、子宮頸癌、ヒト乳癌、前立腺癌、大腸癌、膵臓癌、膵管腺癌、卵巣 癌、肝細胞癌、肝臓癌、様々な表現型の脳腫瘍、急性リンパ芽球性白血病（ALL）などの白血病、肺癌、ユーイング肉腫、子宮内膜癌、頭頸部扁平上皮細胞 癌、咽頭上皮癌、食道癌、口腔癌、膀胱癌、卵巣癌、腎細胞癌、非定型髄膜腫、甲状腺乳頭癌、脳腫瘍、唾液管癌、節外性 T/NK 細胞リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、もしくは肺と乳房の悪性固形腫瘍である、請求項１５に記載の使用。
  17. がんは大腸癌である、請求項１６に記載の使用。
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