MX2012010814A

MX2012010814A - Composicion de peptidos asociados a tumores y vacuna contra el cancer relacionada con ellos para el tratamiento del cancer gastrico y de otros tipos de cancer.

Info

Publication number: MX2012010814A
Application number: MX2012010814A
Authority: MX
Inventors: Harpreet Singh; Steffen Walter; Toni Weinschenk; Peter Lewandrowski; Jens Fritsche
Original assignee: Inmatics Biotechnologies Gmbh
Priority date: 2010-03-19
Filing date: 2011-03-16
Publication date: 2012-11-12
Also published as: TW201201834A; BR112012023621A2; AU2011229177B2; EA022743B1; EP2547691B1; WO2011113872A1; CN102892777A; ES2593409T3; AU2011229177A1; US9132177B2; GB201004575D0; US20110229524A1; JP5689140B2; US20130115188A1; CN102892777B; EA201201305A1; MY162850A; US10159725B2; NZ601818A; UA109891C2

Abstract

La presente invención se refiere a péptidos inmunoterapéuticos y a su uso en inmunoterapia, en particular la inmunoterapia del cáncer. La presente invención describe epítopos peptídicos para linfocitos T auxiliares asociados a tumores, solos o en combinación con otros péptidos asociados a tumores que actúan como ingredientes farmacéuticamente activos de composiciones de vacunas que estimulan las respuestas inmunes contra los tumores. En particular, la composición de los péptidos de la presente invención puede usarse en composiciones de vacunas para desencadenar respuestas inmunes antitumorales contra cánceres gástricos (CG).

Description

COMPOSICION DE PEPTIDOS ASOCIADOS A TUMORES Y VACUNA CONTRA EL CANCER RELACIONADA CON ELLOS PARA EL TRATAMIENTO DEL CANCER GASTRICO Y DE OTROS TIPOS DE CANCER Campo de la Invención La presente invención se refiere a péptidos inmunoterapéuticos y su uso en inmunoterapia, en particular, en la inmunoterapia del cáncer. La presente invención describe epítopos de linfocitos T auxiliares mediante el uso de péptidos asociados a tumores, solos o en combinación con otros péptidos asociados a tumores, que actúan como ingredientes farmacéuticos activos de composiciones de vacunas que estimulan las respuestas inmunitarias contra los tumores. En particular, la composición de los péptidos de la presente invención puede usarse en composiciones de vacunas que provoquen respuestas inmunitarias antitumorales contra el cáncer gástrico (CG) y otros tipos de cáncer.

Para los propósitos de la presente invención, todas las referencias aquí citadas en el presente documento se incorporan por referencia en su totalidad.

Antecedentes de la Invención El cáncer gástrico es una enfermedad en la que las células malignas se forman en el revestimiento (epitelio) del estómago. El cáncer de estómago o gástrico puede desarrollarse en cualquier parte del estómago, y puede diseminarse a través del estómago y a otros órganos, en particular el esófago, pulmones y el hígado. El cáncer de estómago es el cuarto cáncer más frecuente en todo el mundo, con 930,000 casos diagnosticados en 2002. Es una enfermedad con una elevada tasa de mortalidad (~800,000 por año), lo que la convierte en la segunda causa más frecuente de muerte por cáncer en todo el mundo, después del cáncer de pulmón. Es más habitual en hombres y más frecuente en los países Asiáticos y en países en desarrollo (se puede obtener información a partir de la OMS).

En Estados Unidos de Norteamérica representa el 2% (25,500 casos) de todos los nuevos casos de cáncer que aparecen cada año, pero es más frecuente en otros países. En Corea, por ejemplo, es el principal tipo de cáncer, responsable del 20.8% de las neoplasias malignas. En Japón, el cáncer gástrico sigue siendo el más común en los hombres. Cada año, en Estados Unidos de Norteamérica, alrededor de 13,000 hombres y 8,000 mujeres son diagnosticados de cáncer de estómago; la mayoría tiene más de 70 años de edad.

El cáncer de estómago es el cuarto cáncer más común en el mundo, después del cáncer de pulmón, mama y colon y recto. Además, el cáncer de estómago sigue siendo la segunda causa más frecuente de muerte por cáncer. La Sociedad Americana contra el Cáncer (American Cáncer Society) estima que en 2007 se produjeron un millón de nuevos casos, de los que cerca del 70% se diagnosticaron en los países en desarrollo, y alrededor de 800,000 muertes (ver las publicaciones de la American Cáncer Society).

Su incidencia presenta una inmensa variación geográfica de esta enfermedad alrededor del mundo. Las tasas de la enfermedad son más altas en Asia y partes de América del Sur y la más baja en Norteamérica. Las mayores tasas de mortalidad se registran en Chile, Japón, Sudamérica y en la antigua Unión Soviética.

El cáncer gástrico se diagnostica en una etapa avanzada, porque en la mayor parte del mundo no se lleva a cabo ninguna prueba preventiva, excepto en Japón (y, de forma limitada, en Corea), donde a menudo se detecta en una etapa temprana. Por lo tanto, sigue siendo un gran desafío para los profesionales de la salud. Los factores de riesgo del cáncer gástrico son la infección por Helicobacter pylori (H. pylori), tabaquismo, un elevado consumo de sal y otros factores dietéticos. Algunos cuantos cánceres gástricos (1% a 3%) están asociados con síndromes de predisposición hereditarios al cáncer gástrico. E-cadherina se producen mutaciones en aproximadamente el 25% de las familias con una predisposición autosómica dominante para difundir los cánceres de tipo gástrico. Este subtipo de cáncer gástrico ha sido denominado cáncer gástrico difuso hereditario.12 Puede ser útil para proporcionar asesoramiento genético a considerar gastrectomía profiláctica en portadores asintomáticos jóvenes, de truncar la línea germinal La pared del estómago está constituida por 3 capas de tejido: la capa mucosa (interna), la capa muscular (media) y la capa serosa (externa). El cáncer gástrico comienza en las células que tapizan la capa de mucosa y se propaga a las capas más externas a medida que crece. Cuatro son los tipos de tratamiento habituales. El tratamiento del cáncer gástrico puede consistir en Cirugía, Quimioterapia, Radioterapia o Quimiorradioterapia. Siendo la cirugía el tratamiento primario para el cáncer gástrico. El objetivo de la cirugía consiste en conseguir una resección completa con márgenes negativos (resección RO). Sin embargo, aproximadamente el 50% de los pacientes con cáncer gástrico locorregional no pueden ser sometidos a una resección RO. R1 indica un cáncer residual microscópico (márgenes positivos) y R2 indica un cáncer residual bruto (macroscópico) pero no una enfermedad distante. El resultado del paciente depende de la etapa inicial del diagnóstico del cáncer. (NCCN Clinical Practice Guidelines in Oncology™).

La tasa de supervivencia a cinco años lograda por la resección quirúrgica con intención curativa oscila entre el 30 -50% en los pacientes con enfermedad en etapa II y entre el 10 -25% con enfermedad en etapa III. Tales pacientes tienen una alta posibilidad de sufrir una recaída local y sistémica. El 80 - 90% de los afectados por cáncer de estómago sufren metástasis, con una tasa de supervivencia a seis meses del 65% en los diagnosticados en etapas iniciales y menos del 15% en los diagnosticados en etapas avanzados.

Hay por lo tanto permanece la necesidad de una nueva opción de tratamiento eficaz y seguro para el cáncer gástrico, carcinoma de próstata, carcinomas de cavidad oral, carcinoma escamoso oral (OSCC, por sus siglas en inglés), leucemia mieloide aguda (LMA) (Qian y colaboradores, 2009), linfoma MALT inducido por H. pylori (Banerjee y colaboradores, 2000), carcinoma de colon/cáncer colorrectal, glioblastoma, cáncer de pulmón de células no pequeñas (CPNIvl), carcinoma cervicouterino, cáncer de mama humano, cáncer de próstata, cáncer de colon, cáncer de páncreas, adenocarcinoma ductal de páncreas, cáncer de ovario, carcinoma hepatoceiular, cáncer de hígado, tumores cerebrales de diferentes fenotipos, leucemias tal como la leucemia linfoblástica aguda (LLA), cáncer de pulmón, sarcoma de Ewing, cáncer de endometrio, carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello, cáncer epitelial de laringe, carcinoma esofágico, carcinoma oral, carcinoma de la vejiga urinaria, carcinomas de ovario, carcinoma de células renales, meningioma atípico, carcinoma papilar de tiroides, tumores cerebrales, carcinoma de los conductos salivales, cáncer cervicouterino, linfomas extraganglionares de linfocitos T/células NK, linfoma No Hodgkiniano y tumores sólidos malignos de pulmón y mama y otros tumores. También persiste la necesidad de opciones de tratamientos que mejoren el bienestar de los pacientes sin utilizar agentes quimioterapéuticos u otros agentes que puedan causar efectos secundarios graves.

Carcinoma Colorrectal De acuerdo a la Sociedad Americana contra el Cáncer (American Cáncer Society), el cáncer colorrectal (CCR) es el tercer tipo de cáncer más habitual en Estados Unidos de Norteamérica que afecta a más de 175,000 nuevos pacientes cada año. En los Estados Unidos de Norteamérica, Japón, Francia, Alemania, Italia, España y Reino Unido, más de 480,000 pacientes se ven afectados. Los países en desarrollo, es una de las causas más comunes de muerte por cáncer. Las investigaciones sugieren que la aparición del cáncer colorrectal es el resultado de interacciones entre factores heredados y ambientales. En la mayor parte de los casos, parece que los pólipos adenomatosos son los precursores de los tumores colorrectales; sin embargo, la transición puede durar muchos años. El principal factor de riesgo para el cáncer colorrectal es la edad: el 90% de los casos se diagnostican a partir de los 50 años de edad. Otros factores de riesgo en el cáncer colorrectal incluyen, de acuerdo a la American Cáncer Society, incluye el consumo de alcohol, una dieta con un alto consumo de grasas o carnes rojas y una cantidad insuficiente de frutas y verduras. La incidencia sigue aumentado, especialmente en zonas como Japón, donde es posible que la causa radique en la adopción de dietas de estilo occidental, con una ingesta excesiva de grasas y de carne y una disminución del consumo de fibra. Sin embargo, las tasas de incidencia aumentan no tan rápido como anteriormente, que puede ser debido al aumento de la detección y eliminación de pólipo, evitando así la progresión de los pólipos de cáncer.

Al igual que en la mayor parte de los tumores sólidos, el tratamiento de primera línea es la cirugía, aunque sus beneficios siguen limitándose a los pacientes en etapa inicial, a pesar de que una parte importante de los pacientes es diagnosticada en etapas avanzadas de la enfermedad. En el cáncer colorrectal avanzado, los regímenes de quimioterapia basados en el fluorouracilo son los tratamientos más habituales. La mayor parte de estos regímenes son los protocolos denominados FOLFOX (leucovorina/5-FU más oxaliplatino en infusión) y FOLFIRI (irinotecán y leucovorina en bolo y 5-FU en infusión continua).

La introducción de citotóxicos de tercera generación, como el irinotecán y el oxaliplatino ha aumentado las esperanzas de lograr una mayor eficacia, aunque el pronóstico sigue siendo relativamente negativo y el índice de supervivencia suele ser de, aproximadamente, 20 meses cuando la enfermedad se encuentra en estado de metástasis. Por lo tanto, la necesidad de mejorar los resultados contra la enfermedad sigue siendo grande.

Recientemente ha salido al mercado una nueva generación de fármacos, agentes dirigidos contra moléculas, tal como por ejemplo Avastin (bevacizumab) y Erbitux (cetuximab), y aproximadamente de 40 compuestos para diferentes etapas del cáncer colorrectal se encuentran en las últimas etapas de desarrollo clínico. Las combinaciones de varios de estos compuestos aumentan el número de opciones de tratamiento posibles que pueden esperarse para el futuro. La gran mayoría de sustancias se encuentra en fase 2, con EGFR dirigida por estos compuestos con más frecuencia que por cualquier otro fármaco en desarrollo para el cáncer colorrectal, que es debido al hecho de que en -80% de los pacientes con expresión de EGFR de cáncer colorrectal es estimulada.

En la actualidad se están efectuando ensayos clínicos con pacientes en etapa II, que combinan la quimioterapia con los anticuerpos monoclonales (AcM) recientemente autorizados (cetuximab + irinotecán o FOLFOX4; bevacizumab como un agente simple o junto con FOLFOX4). Se prevén períodos de observación de entre tres y cuatro años antes de disponer de resultados estadísticamente significativos de estos ensayos.

Los anticuerpos monoclonales que actualmente se utilizan en oncología tienen, en general, tienen una excelente probabilidad de no interferir con la inmunoterapia activa. De hecho, existen datos preclínicos que sugiere que la disminución de VEGF (por bevacizumab) contribuye de forma positiva Demediada por la activación de linfocitos T.

Carcinoma de Próstata y otros Tumores de Ejemplares Con una cifra estimada de 27,050 fallecimientos en 2007, el cáncer de próstata es la principal causa de muerte por cáncer en hombres. Aunque los índices de deceso se han reducido entre la población blanca y afroamericana desde principios de los 90, el nivel registrado entre los hombres afroamericanos es más del doble con respecto al de los hombres de raza blanca. El cáncer de próstata es el que se diagnostica con mayor frecuencia en los hombres. Por motivos que siguen sin estar claros, los niveles de incidencia son significativamente mayores entre los hombres afroamericanos que entre los de raza blanca. Los niveles de incidencia del cáncer de próstata han cambiado notablemente durante los últimos 20 años: experimentaron un rápido incremento de 1988 a 1992, se redujeron drásticamente entre 1992 y 1995 y volvieron a aumentar ligeramente a partir de 1995. Estas tendencias reflejan, en gran parte, el aumento de los reconocimientos preventivos del cáncer de próstata mediante el análisis sanguíneo del antígeno específico de próstata (PSA). Es posible que el moderado incremento de la incidencia durante la última década pueda atribuirse a la generalización del reconocimiento preventivo del PSA entre los hombres menores de 65 años. La incidencia del cáncer de próstata se ha estabilizado entre los hombres de 65 años en adelante. Los índices marcaron su máximo entre los hombres de raza blanca en 1992 (237.6 por cada 100,000 hombres) y, en 1993, entre los hombres afroamericanos (342.8 por cada 100,000 hombres).

El tratamiento del cáncer de próstata puede implicar una espera en observación, cirugía, radioterapia, Ultrasonidos Focalizados de Alta Intensidad (HIFU), quimioterapia, criocirugía, terapia hormonal o alguna combinación de los anteriores. La mejor opción depende de la etapa de la enfermedad, de la escala Gleason y del nivel de PSA. Otros factores importantes incluyen la edad del varón, su estado general de salud y su actitud frente a los posibles tratamientos y sus posibles efectos secundarios. Debido a que todos los tratamientos pueden presentar importantes efectos secundarios, como por ejemplo disfunción eréctil e incontinencia urinaria, los debates sobre tales tratamientos suelen centrarse en equilibrar los objetivos de la terapia y los riesgos de las alteraciones en el estilo de vida.

Cuando el cáncer se ha extendido fuera de la glándula prostática, las opciones de tratamiento cambian significativamente, por lo que la mayor parte de los médicos que trata el cáncer de próstata utiliza una serie de tomografías para pronosticar la probabilidad de la propagación. Los tratamientos consistentes en la espera en observación, HIFU, radioterapia, criocirugía y cirugía suelen ofrecerse a los hombres cuyo cáncer aún permanece confinado en la próstata. La terapia hormonal y la quimioterapia suelen reservarse para los casos en que la enfermedad se ha extendido fuera de la próstata, aunque hay excepciones: la radioterapia puede utilizarse para algunos tumores avanzados, y la terapia hormonal se utiliza para algunos tumores en etapa inicial. La crioterapia, la terapia hormonal y la quimioterapia también pueden ofrecerse si el tratamiento inicial falla y el cáncer avanza.

En un número importante de pacientes con carcinoma de próstata sometidos a una prostatectomía radical como consecuencia de la sospecha clínica de un crecimiento limitado al órgano, el análisis histológico confirmatorio de la preparación quirúrgica revela un tumor extensivo a nivel local que se propaga fuera de los límites del órgano. Estos pacientes presentan un elevado riesgo de recurrencia local temprana, normalmente detectable como un incremento de los niveles de PSA en términos de una recaída bioquímica. Las opciones terapéuticas en esta situación incluyen la radioterapia externa y la ablación hormonal. No obstante, el valor de estos enfoques terapéuticos, especialmente en lo que respecta a prolongar la supervivencia del paciente a largo plazo, no deben considerarse como probados. Además, deben tenerse en cuenta posibles complicaciones asociadas con el tratamiento, como, por ejemplo, el desarrollo de una estenosis uretral (radioterapia), la pérdida de libido e impotencia, el riesgo de una reducción de las sales calcicas del esqueleto que puede acarrear o agravar la osteoporosis y un notable incremento en el riesgo de fracturas óseas patológicas (ablación hormonal).

Más del 90% de los cánceres de próstata se descubren en las etapas local y regional. El índice de supervivencia relativa tras 5 años para los pacientes cuyos tumores se diagnostican en estas etapas se aproxima al 100%. Durante los últimos 25 años, el índice de supervivencia combinado tras 5 años para la totalidad de las etapas ha pasado del 69% a casi el 90%. De acuerdo a los datos más recientes, la supervivencia relativa a 10 años es del 93%, mientras que a 15 años es del 77%. Las espectaculares mejoras en términos de supervivencia, especialmente a 5 años, son atribuibles en parte a los diagnósticos más tempranos y a las mejoras en el tratamiento. Sin embargo, la supervivencia desciende notablemente cuando el cáncer se ha extendido a otros tejidos y órganos.

Cáncer de Pulmón Se estima que en 2007 se diagnosticarán 210,000 nuevos casos en Estados Unidos de Norteamérica, cifra que representa aproximadamente el 15% de los diagnósticos de cáncer. La incidencia está cayendo notablemente entre los hombres, desde un máximo de 102 casos por cada 100,000 hombres en 1984 hasta 78.5 en 2003. En las mujeres, está estabilizándose tras un largo período de incremento. Clínicamente, el cáncer de pulmón se divide, a efectos de tratamiento, en dos grupos: el carcinoma microcítico de pulmón (13%) y el no microcítico (87%).

El cáncer de pulmón aún a la mayor parte de fallecimientos relacionados con el cáncer, tanto en hombres como en mujeres. Se estima que en 2007 se producirán 160,390 fallecimientos, que representan alrededor del 29% de la totalidad de las muertes por cáncer. Desde 1987, cada año han fallecido más mujeres a causa del cáncer de pulmón que por cáncer de mama. En los hombres, los índices de fallecimiento han seguido cayendo notablemente entre 1991 y 2003 a un ritmo aproximado de un 1.9% por año. La mortalidad por cáncer de pulmón entre las mujeres está estabilizándose, tras haber experimentado un constante aumento durante varias décadas. Estas tendencias en la mortalidad por cáncer de pulmón reflejan el descenso en los índices de fumadores durante los últimos 30 años.

Las opciones de tratamiento vienen determinadas por el tipo (microcítico o no) y la etapa del cáncer, e incluyen cirugía, radioterapia, quimioterapia y terapias biológicas dirigidas, como las de bevacizumab (Avastin®) y erlotinib (Tarceva®). Para cánceres localizados, la cirugía suele ser el tratamiento utilizado. Algunos estudios recientes indican que la tasa de supervivencia con cáncer de pulmón en etapa inicial y no microcítico se ve mejorada si tras la cirugía se aplica quimioterapia. Debido al hecho de que la enfermedad suele estar extendida cuando se descubre, suelen utilizarse la radioterapia y la quimioterapia, a veces en combinación con la cirugía. La quimioterapia por sí sola o combinada con radiación es el tratamiento que suele seleccionarse para el carcinoma microcítico de pulmón. Con este régimen, un alto porcentaje de pacientes experimentan remisión, que en algunos casos es duradera.

El índice de supervivencia relativa para el cáncer de pulmón después de 1 año se ha incrementado ligeramente desde el 37% en 1975 - 1979 hasta el 42% en 2002, en gran parte gracias a las mejoras en las técnicas quirúrgicas y las terapias combinadas. No obstante, el índice combinado de supervivencia tras 5 años para todas las etapas es tan solo del 16%. El índice de supervivencia es del 49% en los casos detectados cuando la enfermedad aún está localizada. No obstante, tan solo el 16% de los cánceres de pulmón se diagnostica en esta etapa inicial.

Tabla 1: Estimación de los nuevos casos de cáncer y fallecimientos de acuerdo al sexo en Estados Unidos de Norteamérica en 2007 (American Cáncer Society. Cáncer Facts & Figures, 2007. Atlanta: American Cáncer Society, 2007.).

Así pues, sigue existiendo una necesidad de nuevas opciones de tratamiento eficaz y seguro para el glioblastoma, tumor de próstata, cáncer de mama, cáncer de esófago, cáncer colorrectal, carcinoma de células claras de células renales, cáncer de pulmón, del SNC, ovarios, melanoma, cáncer de páncreas, carcinomas escamocelulares, leucemia y meduloblastoma, así como para otros tumores que muestran una sobreexpresión de survivina, de forma que se mejore el bienestar de los pacientes sin utilizar quimioterapia u otros fármacos que puedan provocar efectos secundarios graves.

Descripción Detallada de la Invención Tal como se utiliza en el presente documento y excepto cuando se indique lo contrario, todos los términos se definen como se indica a continuación. El término «péptido» se utiliza en el presente documento para designar una serie de residuos de aminoácidos conectados entre sí típicamente mediante enlaces peptídicos entre los grupos amino-alfa y carbonilo de los aminoácidos adyacentes. La longitud preferida de los péptidos es de 9 aminoácidos, aunque puede variar entre 8 y 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 ó 18 aminoácidos.

El término «oligopéptido» se utiliza en el presente documento para designar una serie de residuos de aminoácidos conectados entre sí típicamente por enlaces peptídicos entre los grupos amino-alfa y carbonilo de los aminoácidos adyacentes. La longitud del oligopéptido no es crucial en la invención, siempre que se mantenga el epítopo o epítopos adecuados. Los oligopéptidos suelen tener una longitud inferior a unos 30 aminoácidos y mayor de 14, aproximadamente.

El término «polipéptido» se designa una serie de residuos de aminoácidos conectados entre sí típicamente por enlaces peptídicos entre los grupos amino-alfa y carbonilo de los aminoácidos adyacentes. La longitud del polipéptido no es crucial en la invención, siempre que se mantengan los epítopos adecuados. En contraste con los términos «péptido» y «oligopéptido», el término «polipéptido» se refiere a las moléculas de más de unos 30 residuos de aminoácidos de longitud .

Un péptido, oligopéptido, proteína o polinucleótido que codifica tal molécula es «inmunogénico» (y, por lo tanto, un inmunógeno en la presente invención), si es capaz de inducir una respuesta inmune. En el caso de la presente invención, la inmunogenicidad se define más específicamente como la capacidad para desatar una respuesta por parte de los linfocitos T. Por lo tanto, un inmunógeno sería una molécula que es capaz de inducir una respuesta inmune y, en el caso de la presente invención, una molécula capaz de inducir una respuesta de los linfocitos T.

Un «epítopo» de un linfocito T requiere un péptido corto que esté unido a un receptor MHC de clase I ó clase II, formando un complejo ternario (cadena alfa de MHC de clase I, beta-2-microglobulina y péptido) que puede ser reconocido por un linfocito T que lleve un receptor de linfocito T que coincida y que se una al complejo MHC/péptido con la afinidad adecuada. Los péptidos que se unen a moléculas MHC de clase I suelen tener una longitud de entre 8 y 14 aminoácidos, y habitualmente de 9 aminoácidos. Los epítopos de linfocitos T que se unen a moléculas MHC de clase II suelen tener una longitud de entre 12 y 30 aminoácidos. En el caso de los péptidos que se unen a moléculas MHC de clase II, el mismo péptido y el epítopo del linfocito T correspondiente pueden compartir un segmento central común y diferir en la longitud total como consecuencia de secuencias de flanqueo de diferentes longitudes en dirección ascendente del extremo amino de la secuencia central y descendente con respecto a su terminal carboxílico, respectivamente. Los receptores MHC de clase II presentan una conformación más abierta; de la misma manera, los péptidos unidos a receptores MHC de clase II no se enclavan completamente en la estructura de la hendidura de unión al péptido de la molécula MHC de clase II, como ocurre con la hendidura de unión del péptido de la molécula MHC de clase I. Es de notar que éste no es el caso para el péptido con arreglo a la SEC ID No. 1, puesto que pequeñas variaciones en la longitud del péptido ocasionan un gran descenso de la actividad (ver más abajo).

En el humano, hay tres locus genéticos diferentes que codifican las moléculas MHC de clase I (las moléculas MHC del humano también se denominan antígenos leucocitarios humanos [HLA]): HLA-A, HLA-B y HLA-C. HLA-A*01, HLA-A*02 y HLA-A 1 son ejemplos de distintos alelos MHC de clase I que se pueden expresar a partir de estos locus.

Tres locus diferentes del genoma humano albergan los genes MHC de clase II: HLA-DR, HLA-DQ y HLA-DP. Los receptores MHC de clase II son heterod ímeros que constan de una cadena alfa y una beta, tanto de referencia como en la membrana celular a través de una región transmembranosa. HLA-DRB1*04 y H LA-DRB 1 *07 son dos ejemplos de diferentes alelos beta MHC de clase II que se sabe que están codificados en estos locus. Los alelos de clase II son muy polimorfos: por ejemplo, se han descrito varios cientos de alelos HLA-DRB1 distintos. En la Tabla 2 se muestran las frecuencias de expresión en distintas poblaciones del HLA-A*02 y de los serotipos HLA-DR más frecuentes.

Tabla 2: Proporciona las frecuencias de expresión F del HLA*A02 y de los serotipos HLA-DR más frecuentes. Las frecuencias se deducen de las frecuencias haplotípicas Gf en la población norteamericana adaptadas de Mori y colaboradores (Mori y colaboradores, 1997) con la fórmula de Hardy-Weinberg F=1-(1-Gf)2. Las combinaciones de A*02 con determinados alelos HLA-DR podrían ser más abundantes o menos frecuentes de lo esperado a partir de sus frecuencias aisladas debido al desequilibrio de ligamiento. Para más detalles, ver Chanock y colaboradores (Chanock y colaboradores, 2004).

Tabla 3: Proporciona las frecuencias de expresión F de los serotipos HLA*A024 y HLA*A02402. Las frecuencias se infieren de las frecuencias haplotípicas Gf en la población adaptada de Morí y colaboradores (Mori y colaboradores, 1997) utilizando la fórmula de Hardy-Weinberg F = 1-(1-Gf)2. Para más detalles ver Chanock y colaboradores (Chanock y colaboradores, 2004).

Tabla 3: Frecuencias de expresión de los serotipos HLA* 02 y A*2402 en el mundo.

Por lo tanto, a propósitos terapéuticos y de diagnóstico sería muy deseable contar con un péptido que se una, con la afinidad adecuada, a varios receptores HLA de clase II distintos. Un péptido que se une a varias moléculas HLA de clase II distintas recibe el nombre de ligante promiscuo.

En el presente documento, la referencia a una secuencia de ADN incluye tanto ADN monocatenario como bicatenario. Por lo tanto, la secuencia específica, a menos que el contexto indique otra cosa, se refiere al ADN monocatenario de tal secuencia, a la doble cadena formada por tal secuencia con su complementaria (ADN bicatenario) y la cadena complementaria de tal secuencia. El término «región codificante» hace referencia a la porción de un gen que, o bien de forma natural o normal, codifica el producto de expresión de tal gen en su ambiente genómico natural, por ejemplo, la región que codifica in vivo el producto de expresión natural del gen.

La región codificante puede formar parte de un gen normal, mutado o alterado, o incluso puede provenir de una secuencia de ADN, o gen, sintetizada íntegramente en el laboratorio con métodos bien conocidos para los expertos en la síntesis de ADN.

El término «secuencia de nucleótidos » hace referencia a un heteropolímero de desoxirribonucleótídos.

La secuencia de nucleótidos que codifica un péptido, oligopéptido o polipéptido en particular puede ser natural o estar construida de forma sintética. Generalmente, los segmentos de ADN que codifican los péptidos, polipéptidos y proteínas de la presente invención se enlazan a partir de fragmentos de ADNc y ligadores cortos de oligonucleótidos, o a partir de una serie de oligonucleótidos, con el fin de proporcionar un gen sintético capaz de ser expresado en una unidad transcripcional recombinante que comprenda elementos reguladores derivados de un operón microbiano o viral.

El término «producto de expresión» significa el polipéptido o la proteína que es el producto natural de la traducción del gen y cualquier secuencia de ácidos nucleicos que codifiquen los equivalentes resultantes de la degeneración del código genético y, por tanto, que codifican el mismo aminoácido o aminoácidos.

El término «fragmento», cuando se refiere a una secuencia de codificación, define una porción de ADN que no comprende la región codificante completa, cuyo producto de expresión retiene esencialmente la misma actividad o función biológica que el producto de expresión de la región codificante completa.

El término «segmento de ADN» hace referencia a un polímero de ADN, en la forma de un fragmento separado o como componente de un constructo de ADN mayor, que deriva de ADN aislado por lo menos una vez en una forma sustancialmente pura, es decir, sin materiales endógenos contaminantes y en una cantidad o concentración que permite la identificación, la manipulación y la recuperación del segmento y de sus secuencia de nucleótidos constituyentes mediante métodos bioquímicos estándar como, por ejemplo, mediante un vector de clonación. Tales segmentos se suministran en forma de un marco de lectura abierto sin interrupciones por secuencias internas no traducidas, o intrones, que suelen estar presentes en los genes eucariotas. Las secuencias de ADN no traducidas pueden estar presentes en dirección 3' (flujo descendente) desde el marco de lectura abierto, donde la misma no interfiere con la manipulación o la expresión de las regiones codificantes.

El término «cebador» se refiere a una secuencia corta de ácidos nucleicos que puede combinar con una cadena de ADN y que proporciona un extremo 3?? libre en el que una polimerasa de ADN puede comenzar la síntesis de una cadena de desoxirribonucleótidos.

El término «promotor» se refiere a una región de ADN involucrada en la unión de la polimerasa de ARN para iniciar la transcripción.

El término «aislado» se refiere al material que se extrae de su entorno original (por ejemplo, el entorno natural si ocurre de forma natural). Por ejemplo, un polinucleótido o un polipéptido natural presente en un animal vivo no está aislado, pero el mismo polinucleótido o polipéptido, separado de parte o de todos los materiales coexistentes en el sistema natural, está aislado. Tales polinucleótidos podrían ser parte de un vector y/o tales polinucleótidos o polipéptidos podrían ser partes de una composición y seguir estando aislados de forma que tal vector o composición no fuera parte de su entorno natural.

Los polinucleótidos, y los polipéptidos recombinantes o inmunógenos, descritos de acuerdo con la presente invención también pueden presentarse en una forma «purificada». El término «purificado» no implica pureza absoluta; más bien, se utiliza como definición relativa y puede incluir preparaciones altamente purificadas o preparaciones tan sólo parcialmente purificadas, tal y como los expertos en la técnica entienden tales términos. Por ejemplo, los clones individuales aislados de una genoteca de ADNc se han purificado de manera convencional hasta obtener una homogeneidad electroforética . Se contempla expresamente la purificación del material de inicio o del material natural hasta, al menos, un orden de magnitud; preferiblemente, dos o tres órdenes de magnitud; y, con mayor preferencia, cuatro o cinco órdenes de magnitud. Además, se contempla expresamente el polipéptido reivindicado que tiene una pureza de, preferiblemente, 99.999%, ó, al menos, del 99.99% ó 99.9%; y, más convenientemente, 99% por peso o mayor.

Los productos de expresión de los polipéptidos y los ácidos nucleicos descritos conforme a la presente invención, así como los vectores de expresión que contienen tales ácidos nucleicos y/o tales polipéptidos, pueden utilizarse en «forma enriquecida». Tal y como se usa en el presente documento, el término «enriquecido» significa que la concentración del material es, al menos, unas 2, 5, 10, 100 ó 1000 veces su concentración natural (por ejemplo), más ventajosamente 0.01% por peso, y, preferiblemente, aproximadamente 0.1% al menos, por peso. También se contemplan preparaciones enriquecidas de alrededor del 0.5%, 1%, 5%, 10% y 20% por peso. Las secuencias, constructos, vectores, clones y otros materiales que comprenden la presente invención pueden utilizarse, según convenga, en su forma enriquecida o aislada.

El término «fragmento activo» se refiere a un fragmento que genera una respuesta inmune (es decir, que posee actividad inmunógena) cuando se administra - solo u, opcionalmente, con un adyuvante adecuado - a un animal, que puede ser un mamífero tal como, por ejemplo, un conejo o ratón, sin excluir a un humano; tal respuesta inmune adopta la forma de estimulación de una respuesta de linfocitos T en el animal receptor tal como, por ejemplo, el humano. De forma alternativa, el «fragmento activo» también se puede usar para inducir una respuesta de linfocitos T in vitro.

Tal y como se usan en el presente documento, los términos «porción», «segmento» y «fragmento», cuando se utilizan en relación a los polipéptidos, hacen referencia a una secuencia continua de residuos, como residuos de aminoácidos, secuencia que es un subconjunto de una secuencia mayor. Por ejemplo, si un polipéptido se somete a un tratamiento con cualquiera de las endopeptidasas habituales, como la tripsina o la quimotripsina, los oligopéptidos resultantes de tal tratamiento representarán porciones, segmentos o fragmentos del polipéptido inicial. Esto significa que cualquiera de esos fragmentos, necesariamente y como parte de su secuencia de aminoácidos, va a contener un segmento, fragmento o porción que es sustancialmente idéntica, si no lo es exactamente, a una secuencia de las SEC ID No. 1 a 20, que corresponde a la estructura natural, o a las proteínas «precursoras» de las SEC ID No. 1 a 20. Utilizados en relación con los polinucleótidos, tales términos se refieren a los productos generados por el tratamiento de tales polinucleótidos con cualquiera de las endonucleasas habituales.

Conforme a la presente invención, el término «identidad porcentual» o «porcentaje idéntico», al referirse a una secuencia, significa que una secuencia se compara con una secuencia reivindicada o descrita después de alinear la secuencia que se va a comparar (la «Secuencia Comparada») con la secuencia descrita o reivindicada (la «Secuencia de Referencia»). La identidad porcentual se determina entonces con la siguiente fórmula: Identidad porcentual = 100 ? -(C/R)1 en donde C es el número de diferencias entre la Secuencia de Referencia y la Secuencia Comparada a lo largo de la alineación entre la Secuencia de Referencia y la Secuencia Comparada, en donde: (i) cada base o aminoácido de la Secuencia de Referencia que no tiene una base o aminoácido alineados en la Secuencia Comparada y (ii) cada hueco (gap) de la Secuencia de Referencia y (iii) cada base o aminoácido alineado de la Secuencia de Referencia que difiere de una base o aminoácido alineado de la Secuencia Comparada, constituye una diferencia; y R es el número de bases o aminoácidos de la Secuencia de Referencia a lo largo de la alineación con la Secuencia Comparada con cualquier hueco creado en la Secuencia de Referencia, también contabilizado como una base o un aminoácido.

Si existe una alineación entre la Secuencia Comparada y la Secuencia de Referencia para la identidad porcentual, calculada como se ha especificado arriba, es aproximadamente igual o mayor que una identidad porcentual mínima especificada, entonces la Secuencia Comparada guarda la identidad porcentual mínima especificada con la Secuencia de Referencia, aunque puedan existir alineaciones en las que la identidad porcentual calculada arriba resulte menor que la Identidad Porcentual especificada.

Los péptidos originales descritos en el presente documento se pueden modificar mediante la sustitución de uno o más residuos en sitios diferentes, posiblemente selectivos, dentro de la cadena peptídica, si no se especifica de otra manera. Tales sustituciones pueden ser de naturaleza conservadora como, por ejemplo, si un aminoácido es reemplazado por un aminoácido de estructura y características similares, como en el caso de un aminoácido hidrofóbico que es sustituido por otro aminoácido hidrofóbico. Aún más conservador sería el reemplazo de aminoácidos de tamaño y naturaleza química igual o similar como, por ejemplo, si una leucina se reemplaza por isoleucina. En diversos estudios de variaciones de secuencias en familias de proteínas homologas naturales, determinadas sustituciones de aminoácidos se toleran con más frecuencia que otras, y éstas muestran a menudo una correlación con similitudes de tamaño, carga, polaridad e hidrofobicidad entre el aminoácido original y su reemplazo, siendo ésta la base para la definición de las «sustituciones conservadoras».

Las sustituciones conservadoras se definen como intercambios dentro de uno de los cinco grupos siguientes: Grupo 1: residuos alifáticos pequeños, no polares o ligeramente polares (Ala, Ser, Thr, Pro, Gly); Grupo 2: residuos polares cargados negativamente y sus amidas (Asp, Asn, Glu, Gln); Grupo 3: residuos polares cargados positivamente (His, Arg, Lys); Grupo 4: residuos alifáticos grandes no polares (Met, Leu, Me, Val, Cys); y Grupo 5: residuos grandes aromáticos (Phe, Tyr, Trp).

Las sustituciones menos conservadoras pueden implicar el reemplazo de un aminoácido por otro con características similares pero diferenciado de alguna manera en el tamaño, como en el reemplazo de un residuo de isoleucina por alanina. Los reemplazos muy poco o nada conservadores pueden implicar la sustitución de un aminoácido ácido por otro polar, o incluso por uno de carácter básico. Estas sustituciones «radicales» no se pueden descartar, sin embargo, como potencialmente inefectivas, ya que los efectos químicos no son totalmente predecibles y las sustituciones radicales bien pueden provocar efectos inesperados imposibles de predecir de otra forma a partir de principios químicos simples.

Por supuesto, tales sustituciones pueden implicar otras estructuras distintas de los aminoácidos L habituales. De esta forma, aminoácidos D podrían sustituir a los aminoácidos L que habitualmente se encuentran en los péptidos antigénicos de la invención y, aun así, quedar englobados en la descripción del presente documento. Además, los aminoácidos que contienen grupos R no estándar (es decir, grupos R distintos de los que se encuentran en los 20 aminoácidos comunes de las proteínas naturales) también se pueden usar para hacer sustituciones, con el fin de producir inmunógenos y polipéptidos inmunógenos conformes a la presente invención.

Si se descubre que las sustituciones en más de una posición resultan en un péptido con actividad antigénica sustancialmente equivalente o mayor, como se define más abajo, entonces las combinaciones de tales sustituciones se probarán para determinar si las sustituciones combinadas provocan efectos aditivos o sinérgicos en la antigenicidad del péptido. Como máximo, se sustituirán hasta 4 posiciones simultáneamente dentro del péptido.

El término «respuesta de linfocitos T» define la proliferación y la activación específicas de las funciones efectoras inducidas por un péptido in vitro o in vivo. En el caso de los linfocitos T citotóxicos (CTL) restringidos a MHC de clase I, las funciones efectoras pueden consistir en la lisis de células objetivo presentadoras naturales de péptido o bien sensibilizadas de manera repetida con un péptido o con un precursor del mismo, la secreción de citocinas, preferiblemente de interferón gamma, TNF-alfa o IL-2 inducida por péptido; la secreción de moléculas efectoras, preferiblemente granzimas o perforinas inducidas por péptido; o la desgranulación. En el caso de los linfocitos T auxiliares restringido a HC de clase II, las funciones efectoras puede ser la secreción inducida por péptido de citocinas, preferiblemente de IFN-gamma, TNF-alfa, IL-4, IL-5, IL-10 ó IL-2, o la desgranulación inducida por péptido. Las funciones efectoras posibles de los CTL y los linfocitos T auxiliares no se limitan a esta lista.

Enfoques Inmunoterapéuticos para el Tratamiento La estimulación de la respuesta inmune depende de la presencia de antígenos, reconocidos como extraños por el sistema inmune del huésped. El descubrimiento de la existencia de antígenos asociados a tumores ha abierto la posibilidad de utilizar el sistema inmune del huésped para intervenir en el crecimiento del tumor. En la inmunoterapia del cáncer, actualmente se están explorando diversos mecanismos para aprovechar las ramas humoral y celular del sistema inmune.

Elementos específicos de la respuesta inmune celular son capaces de reconocer y destruir las células tumorales. El aislamiento de linfocitos T citotóxicos (CTL) entre poblaciones de células infiltradas en el tumor o en la sangre periférica sugiere que tales células desempeñan una función importante en las defensas inmunes naturales contra el cáncer. En particular, en esta respuesta desempeñan una importante función los linfocitos T CD8 positivos (CD8 + ), los cuales reconocen moléculas de clase I de los péptidos portadores del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) de entre, normalmente, 8 y 10 residuos, que derivan de proteínas o de productos ribosómicos defectuosos (DRIP) (Schubert U., L. C. Antón, J. Gibbs, C. C. Norbury, J. W. Yewdell, J. R. Bennink, «Rapid degradatíon of a large fraction of newly synthesized proteins by proteasomes» , Nature, 2000, 404

[6779]:770-774) ubicados en el citosol. Las moléculas MHC humanas también se designan como antígenos leucocitos humanos (HLA).

Existen dos clases de moléculas MHC: las moléculas MHC de clase I, que se encuentran en la mayoría de las células nucleadas y que presentan péptidos resultantes de la escisión proteolítica de proteínas principalmente endógenas, citosólicas o nucleares, DRIP, y péptidos más largos. A pesar de lo anterior, en las moléculas MHC de clase I también se suelen encontrar péptidos derivados de compartimentos endosomal o fuentes exógenas. En la bibliografía sobre el tema, a esta forma de presentación de clase I poco habitual se le denomina presentación cruzada. Las moléculas MHC de clase II se encuentran predominantemente en las células presentadoras de antígenos (APC) especializadas y presentan sobre todo péptidos de proteínas exógenas que son absorbidos por las APC durante el proceso de endocitosis y que, posteriormente, son procesados. Al igual que sucede con la clase I, se han descrito formas alternativas de procesamiento del antígeno que permiten que los péptidos procedentes de fuentes endógenas sean presentados por moléculas MHC de clase II (por ejemplo, la autofagocitosis). Los complejos de péptido y molécula MHC de clase I son reconocidos por los linfocitos T citotóxicos CD8+ portadores del TCR adecuado, mientras que los complejos de péptido y molécula MHC de clase II son reconocidos por los linfocitos T auxiliares CD4 + portadores del TCR adecuado.

Los linfocitos T auxiliares CD4+ desempeñan una función importante en la coordinación de las funciones efectoras de las respuestas antitumorales de los linfocitos T y, por este motivo, la identificación de epítopos de linfocitos T CD4+ derivados de antígenos asociados a tumores (TAA) podría ser de gran importancia para el desarrollo de productos farmacéuticos que desencadenen respuestas inmunitarias antitumorales (Gnjatic, S., D. Atanackovic, E. Jáger, M. Matsuo, A. Selvakumar, N. K. Altorki, R. G. Maki, B. Dupont, G. Ritter, Y. T. Chen, A. Knuth, y L. J. Oíd, «Survey of naturally occurring CD4+ T-cell responses against NY-ESO-1 in cáncer patients: Correlation with antibody responses», Proc. Nati. Acad. Sci. U.S. A., 2003, 100 [15]: 8862-7). Los linfocitos T CD4+ pueden incrementar los niveles locales de IFN-gamma.

En modelos animales de mamífero como, por ejemplo, en ratones, se mostró que, incluso en ausencia de linfocitos T citotóxicos (CTL) efectores (es decir, de linfocitos T CD8 + ), los linfocitos T CD4+ son suficientes para inhibir la manifestación de tumores por medio de la inhibición de angiogénesis a través de la secreción de interferón-? (IFNY) (Qin, Z. y T. Blankenstein , «CD4 + T-cell-mediated tumor rejection involves inhibition of angiogenesis that is dependent on IFN gamma receptor expression by nonhematopoietic cells», Immunity, 2000, 12:677-686). Adicionalmente, se demostró que los linfocitos T CD4+ que reconocen péptidos de antígenos asociados a tumores presentados por moléculas HLA de clase II pueden contrarrestar la progresión del tumor por medio de la inducción de un anticuerpo (Ac) (Kennedy, R. C, M. H. Shearer, A. M. Watts y R. K. Bright, «CD4+ T lymphocytes play a critical role in antibody production and tumor immunity against simian virus 40 large tumor antigen», Cáncer Res., 2003, 63:1040-1045). A diferencia de los péptidos asociados a tumores que se unen a moléculas HLA de clase I, hasta ahora sólo se ha descrito un pequeño número de ligandos de TAA de clase II (www.cancerimmunity.org, www.syfpeithi.de).

Teniendo en cuenta que la expresión constitutiva de las moléculas HLA de clase II normalmente está limitada a las células del sistema inmune, la posibilidad de aislar péptidos de clase II directamente de tumores primarios no se consideraba posible. Sin embargo, los inventores han logrado identificar recientemente una serie de epítopos de MHC de clase II directamente de tumores (PE 1642905, PE 1760088; Dengjel, J., M. D. Nastke, C.

Gouttefangeas, G. Gitsioudis, O. Schoor, F. Altenberend, M. Müller, B. Krámer, A. Missiou, M. Sauter, J. Hennenlotter, D. Wernet, A. Stenzl, H. G. Rammensee, K. Klingel, S. Stevanovic, «Unexpected abundance of HLA class II presented peptides in primary renal cell carcinomas», Clin. Cáncer Res., 2006, 12:4163-4170).

En ausencia de inflamación, la expresión de moléculas MHC de clase II está restringida principalmente a las células del sistema inmune, especialmente a las células presentadoras de antígenos (APC) como, por ejemplo, monocitos, células derivadas de monocitos, macrófagos o células dendríticas. Sorprendentemente, se ha descubierto que, en pacientes oncológicos, las células del tumor expresan moléculas MHC de clase II (Dengjel, J., M. D. Nastke, C. Gouttefangeas, G. Gitsioudis, O. Schoor, F. Altenberend, M. Müller, B. Krámer, A. Missiou, M. Sauter, J. Hennenlotter, D. Wernet, A. Stenzl, H. G. Rammensee, K. Klingel, S. Stevanovic, «Unexpected abundance of HLA class II presented peptides in primary renal cell carcinomas», Clin. Cáncer Res., 2006; 12:4163-4170).

Para que un péptido (inducir) desencadene una respuesta inmune celular, debe estar unido a una molécula MHC. Este proceso depende del alelo de la molécula MHC y de polimorfismos específicos de la secuencia de aminoácidos del péptido. Los péptidos que se unen a las moléculas MHC de clase I suelen tener una longitud de 8 a 10 residuos de aminoácido y contienen dos residuos conservados ("anclaje") en su secuencia que interaccionan con la hendidura de unión correspondiente de la molécula MHC. Así pues, cada alelo de MHC tiene un «motivo de unión» que determina qué péptidos pueden unirse específicamente a la hendidura de unión (Rammensee, H. G., J. Bachmann, S. Stevanovic, «MHC ligands and peptide motifs», Landes Bioscience, Estados Unidos de Norteamérica, 1997).

Durante la reacción inmune dependiente del MHC, los péptidos no sólo tienen que ser capaces de unirse a determinadas moléculas del MHC expresadas por las células tumorales, sino que también deben ser reconocidas por los linfocitos T portadores de receptores específicos de linfocitos T (TCR).

Los antígenos que son reconocidos por los linfocitos T específicos de tumores, es decir, sus epítopos, pueden ser moléculas derivadas de cualquier clase de proteínas, como enzimas, receptores, factores de transcripción, etc. Además, los antígenos asociados a tumores también pueden estar presentes sólo en células tumorales como, por ejemplo, en forma de productos de genes mutados. Otra clase importante de antígenos asociados a tumores son los antígenos específicos de tejidos, como los antígenos CT (testículo canceroso) que se expresan en distintos tipos de tumor y en tejido sano del testículo.

Se han identificado diversos antígenos asociados a tumores. Además, se gasta mucho esfuerzo de investigación para identificar antígenos tumorales adicionales asociados. Algunos grupos de antígenos asociados a tumores, también llamados por los expertos antígenos específicos de tumores, son específicos de tejidos. Entre otros ejemplos se encuentran, la tirosinasa para el melanoma, el PSA y PSMA para el cáncer de próstata y los cruzamientos cromosómicos (translocaciones) como el bcr/abl, en el linfoma. Sin embargo, muchos de los antígenos asociados a tumores que se han identificado aparecen en muchos tipos de tumores y, algunos, como las proteínas oncógenas y/o los genes supresores de tumores (los genes supresores de tumores en el cáncer renal, por ejemplo, son analizados en Linehan W. M., M. M. Walther, B. Zbar, «The genetic basis of cáncer of the kidney», J. Urol., diciembre de 2003, 170[6 Pt 1]:2163-72) que son los que realmente causan el evento de transformación, aparecen en casi todos los tipos de tumores. Por ejemplo, las proteínas celulares normales que controlan el crecimiento y la diferenciación celular, como las p53 (un ejemplo de gen supresor de tumor), ras, c-met, myc, pRB, VHL y HER-2/neu, pueden ir acumulando mutaciones, con el resultado de una regulación al alza de la expresión de estos productos génicos que acaba transformándolos en oncógenos (McCartey y colaboradores, Cáncer Research, 1998, 15:58 2601-5; Disis y colaboradores, Ciba Found. Symp., 1994, 187:198-211). Estas proteínas mutantes también pueden ser el objetivo de una respuesta inmune específica de tumor en muchos tipos de cáncer.

La inmunoterapia en pacientes con cáncer busca activar específicamente células del sistema inmune, especialmente los llamados linfocitos T citotóxicos (CTL, también conocidos como «linfocitos destructores» o linfocitos T CD8 + ), contra las células tumorales, pero no contra el tejido sano. Las células tumorales difieren de las células sanas por la expresión de las proteínas asociadas al tumor. Las moléculas de HLA de la superficie celular presentan el contenido de la célula al exterior, permitiendo así que un linfocito T citotóxico distinga entre una célula tumoral y una sana. Esto se lleva a cabo rompiendo todas las proteínas del interior de la célula en péptidos cortos, que a continuación se unen a las moléculas de HLA y son presentadas en la superficie celular (Rammensee y colaboradores, 1993). Los péptidos que aparecen presentados en las células tumorales pero nada o muy poco en las células sanas del organismo, se denominan péptidos asociados a tumores (TUMAP).

Para que las proteínas puedan ser reconocidas por los linfocitos T citotóxicos como antígenos específicos de tumores o asociados a ellos, y para que se puedan utilizar en terapia, deben cumplirse una serie de requisitos. El antígeno debe ser expresado principalmente por células tumorales, y no por tejidos sanos normales o bien en cantidades comparativamente pequeñas. También es deseable, no sólo que el antígeno correspondiente esté presente en un tipo de tumor, sino que, además, aparezca en concentraciones altas (en número de copias del péptido por célula). Los antígenos específicos de tumor y asociados a ellos suelen derivar de proteínas implicadas de forma directa en la transformación de una célula normal en una célula tumoral debido a una función, por ejemplo, en el control del ciclo celular o de la apoptosis. Adicionalmente, los objetivos descendentes a las proteínas directamente responsables de la transformación podrían sufrir una regulación al alza y quedar así asociados al tumor de forma indirecta. Tales antígenos asociados indirectamente al tumor podrían ser también objetivos en una estrategia de vacunación. En ambos casos, la presencia de epítopos en la secuencia de aminoácidos del antígeno es esencial, ya que el péptido («péptido inmunógeno») derivado de un antígeno asociado al tumor debe desencadenar una respuesta de los linfocitos T in vitro o in vivo.

Básicamente, cualquier péptido capaz de unirse a una molécula MHC podría funcionar como epítopo de linfocito T. La presencia de un linfocito T con un TCR correspondiente y la ausencia de tolerancia para este epítopo en particular es un prerrequisito para la inducción de una respuesta de linfocitos T in vitro o in vivo. En la inmunidad antitumoral, los linfocitos T auxiliares desempeñan una función importante en la organización de la función efectora de los CTL. Los epítopos de los linfocitos T auxiliares que desencadenan una respuesta de los linfocitos T auxiliares del tipo TH1 apoyan las funciones efectoras de los linfocitos T citotóxicos CD8 + , que incluyen funciones citotóxicos dirigidas contra las células tumorales en cuya superficie presentan complejos de M HC/péptido asociado al tumor. De esta forma, los epítopos peptídicos de linfocitos T auxiliares asociados a tumores, solos o en combinación con otros péptidos asociados a tumores, pueden actuar como principios activos de vacunas que estimulen las respuestas inmunitarias antitumorales.

Teniendo en cuenta que ambos tipos de respuesta, la dependiente de CD8 y de CD4, contribuyen conjuntamente y de forma sinérgica al efecto antitumoral, el desarrollo de vacunas antitumorales requieren de la identificación y caracterización de antígenos asociados a tumores que sean reconocidos por los linfocitos T citotóxicos CD8+ (molécula MHC de clase I) o CD4+ (molécula MHC de clase II). Un objeto de la presente invención es, por lo tanto, proporcionar composiciones de péptidos dotadas de péptidos que se unan a complejos MHC de ambas clases.

Los primeros ensayos clínicos con péptidos asociados a tumores se remontan a mediados de los 90 por Boon y sus colegas, principalmente con el melanoma. Las respuestas clínicas en los mejores ensayos oscilan entre un 10% y un 30%. En ningún ensayo clínico realizado con monoterapia de vacuna basada en péptidos se han registrado efectos secundarios graves ni autoinmunidad grave. En algunos pacientes tratados con péptidos asociados al melanoma se han observado formas leves de vitíligo.

Sin embargo, la sensibilización de un tipo de CTL no suele bastar para eliminar todas las células tumorales. Los tumores mutan con gran rapidez y, por tanto, son capaces de responder rápidamente a los ataques de los CTL modificando su perfil proteico para no ser reconocidos por estos. Con el fin de contrarrestar los mecanismos de evasión del tumor, se utiliza una variedad de péptidos específicos para la vacunación. De ese modo, se puede lanzar un amplio ataque simultáneo contra el tumor por medio de varios clones de CTL de forma simultánea, con el fin de reducir las posibilidades del tumor de eludir la respuesta inmune. Esta hipótesis ha sido confirmada recientemente en un estudio clínico en que se trataba a pacientes con melanoma en etapa tardía. Con pocas excepciones, los pacientes que tuvieron al menos tres respuestas diferenciadas de linfocitos T mostraron una respuesta clínica objetiva o enfermedad estable (Banchereau y colaboradores, 2001) así como una mayor supervivencia (información directa de J. Banchereau), mientras que a la inmensa mayoría de los pacientes con menos de tres respuestas de linfocitos T se les diagnosticó enfermedad progresiva.

Un estudio de los solicitantes mostró un efecto similar al tratar a pacientes con carcinoma de células renales con una vacuna compuesta por 13 péptidos distintos (Singh-Jasuja, H., S. Walter, T. Weinschenk, A. ayer, P. Y. Dietrich, M. Staehler, A. Stenzl, S. Stevanovic, H. Rammensee, J. Frisch, «Correlation of T-cell response, clinical activity and regulatory T-cell levéis in renal cell carcinoma patients treated with IMA901, a novel multi-peptide vaccine», ASCO Meeting 2007, cartel No. 3017; Staehler, M., A. Stenzl, P. Y. Dietrich, T. Eisen, A. Haferkamp, J. Beck, A. Mayer, S. Walter, H. Singh, J. Frisen y C. G. Stief, «An open label study to evalúate the safety and immunogenicity of the peptide based cáncer vaccine IMA901», ASCO Meeting 2007, cartel No. 3017).

Por lo tanto, la principal tarea en el desarrollo de una vacuna antitumoral no se limita a la identificación y caracterización de antígenos asociados a tumores novedosos y de epítopos de linfocitos T auxiliares inmunógenos derivados de ellos, sino que también incluye la combinación de distintos epítopos para aumentar la probabilidad de respuesta a más de un epítopo en cada paciente. Un objeto de la presente invención es, por lo tanto, proporcionar combinaciones de secuencias de aminoácidos de los péptidos que sean capaces de unirse a una molécula del complejo mayor de hístocompatibilidad (MHC) humano de clase I (HLA de clase I) o II (HLA de clase II). Otro objeto de la presente invención consiste en proporcionar una vacuna anticancerosa eficaz basada en una combinación de los péptidos.

En la presente invención, los inventores aislaron y caracterizaron péptidos unidos a moléculas HLA de clase I o II directamente a partir de tumores de mamíferos, esto es, de muestras primarias de pacientes con cáncer gástrico en su mayoría, pero también de muestras de tejido primario de glioblastoma, cáncer colorrectal, carcinoma de células renales, cáncer de pulmón, cáncer de páncreas, melanomas malignos y cáncer de estómago.

La presente invención proporciona péptidos provenientes de antígenos asociados a la oncogénesis y capaces de unirse a moléculas MHC (HLA) de clase II para desencadenar la respuesta inmune de leucocitos humanos, especialmente linfocitos, especialmente linfocitos T, especialmente linfocitos T CD4 + , especialmente linfocitos T CD4+ mediadores de respuestas inmunitarias de tipo TH1.

La presente invención también proporciona péptidos provenientes de antígenos asociados a la oncogénesis y capaces de unirse a moléculas MHC (HLA) de clase I para desencadenar la respuesta inmune de leucocitos humanos, especialmente linfocitos, especialmente linfocitos T, especialmente, linfocitos T citotóxicos CD8 + , así como combinaciones de ambas que son particularmente útiles para la vacunación de pacientes con cáncer.

De acuerdo a la presente invención, el objeto se resuelve proporcionando una composición farmacéutica que comprenda al menos dos péptidos que contengan una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo constituido por las secuencias SEC ID No. 1 a SEC ID No. 10, y/o que contengan una secuencia de aminoácidos variante que sea, al menos, un 85% homologa a la del grupo de secuencias SEC ID No. 1 a SEC ID No. 10, y/o un polínucleótido que contenga un ácido nucleico que codifique las secuencias SEC ID No. 1 a SEC ID No. 10 ó la secuencia de aminoácidos variante, y un vehículo aceptable farmacéuticamente. Las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden también comprender, al menos, un péptido adicional que contenga una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo constituido por las secuencias SEC ID No. 11 a SEC ID No. 22, ó que contenga una secuencia de aminoácidos variante idéntica al menos en un 85% a la del grupo de secuencias SEC ID No. 11 a SEC ID No. 22, ó un polinucleótido que contenga un ácido nucleico que codifique las secuencias SEC ID No. 11 a SEC ID No. 22 ó la secuencia de aminoácidos variante. Los péptidos pueden tener una longitud total de entre 8 y 100 aminoácidos, preferentemente entre 8 y 30 y, con la mayor preferencia, entre 8 y 17 aminoácidos. Los péptidos también pueden tener enlaces no peptídicos.

Tal y como se describe más abajo, todos los péptidos que forman la base de la presente invención han sido identificados como presentados por células portadoras de MHC de clase I o II. Por lo tanto, todos estos péptidos, así como otros péptidos que contengan la secuencia (esto es, péptidos derivados), provocan una respuesta específica de los linfocitos T, aunque el alcance de tal respuesta podría variar de un péptido individual a péptido y de un paciente a paciente. Podrían surgir diferencias debido a mutaciones en los péptidos, entre otras causas. El experto en la técnica conoce bien los métodos que se pueden aplicar para determinar el alcance de una respuesta inducida por un péptido individual, en particular con respecto a los ejemplos contenidos aquí y en la literatura sobre la técnica.

Preferiblemente, las variantes de la invención inducirán la reacción cruzada de los linfocitos T con el péptido respectivo de la invención.

Los péptidos provienen de antígenos asociados a tumores, especialmente de antígenos de este tipo que desempeñan funciones en los procesos de proteólisis, angiogénesis, crecimiento celular, regulación del ciclo celular, división celular, regulación de la transcripción, regulación de la traducción o invasión de tejidos, entre otros procesos. En la Tabla 4 se indican los péptidos y las funciones de las proteínas de las que derivan. Tabla 4: Péptidos de la presente invención y función de la proteína original.

Tabla 5: otros péptidos inmunógenos útiles composición de la invención.

Proteína 2 del Ciclo de División Celular (CDC2) La CDC2, también conocida como p34cdc2 o Cdk1 (cinasa dependiente de ciclina 1), pertenece a las Cdk, una familia de proteincinasas de serina/treonina, y desempeña un papel clave en el control del ciclo celular. Se sabe que es el principal regulador de la transición de G2 a M. Al final de la inferíase, la CDC2 se activa uniéndose a las ciclinas de tipo A y facilita el inicio de la mitosis. Tras la ruptura de la membrana nuclear, las ciclinas de tipo A son degradadas y sustituidas por la ciclina B. El complejo formado por la CDC2 y la ciclina B constituye el factor promotor de la mitosis (MPF), que es esencial para conducir las células a través de la mitosis.

La CDC2 activa fosforila más de 70 sustratos. Por ejemplo, la fosforilación de la histona H1 "de enlace" propicia la relajación de la estructura de la cromatina y la transcripción de genes específicos, y la fosforilación de la ARN-polimerasa II aumenta la transcripción (Cisek and Corden, 1989). La fosforilación de BRCA2 estimula la reparación homologa dependiente de recombinación (Esashi y colaboradores, 2005), y la fosforilación de FOX01 inhibe su actividad transcripcional, lo que facilita la proliferación y la supervivencia de la célula. La fosforilación de la separasa inhibe la separación prematura de las cromátidas hermanas (Stemmann y colaboradores, 2001). La actividad de la CDC2 se paraliza de nuevo durante la anaetapa, cuando el complejo promotor de la anafase/ciclosoma (APC/C) ubiquitiniza la ciclina B, lo que conduce a su degradación .

La función de la CDC2 en la mitosis no es redundante y no puede ser compensada por la actividad de otras Cdk como las Cdk2, 4 y 6. Sin embargo, se ha descrito que la CDC2 también actúa en otras etapas del ciclo celular como en la transición G1-S, y es capaz de sustituir a las "Cdk de la interfase". Por ello, se ha propuesto que la CDC2 es la única Cdk del ciclo celular esencial .

Aparte de su expresión y función en el ciclo celular, se ha descrito que en ciertos casos la CDC2 se expresa en condiciones apoptóticas, y que el aumento de su actividad puede provocar una catástrofe mitótica. En varios tipos de cáncer se ha detectado la sobreexpresión de la CDC2, aunque la expresión de otras proteínas del ciclo celular como las ciclinas aparece desregulada aún con mayor frecuencia. Entre los tipos de cáncer que sobreexpresan la CDC2 se encuentran el carcinoma de próstata, los carcinomas de la cavidad bucal, carcinoma epidermoide oral (OSCC), leucemia mieloide aguda (AML) (Qian y colaboradores, 2009), linfoma MALT inducido por H. pylori (Banerjee y colaboradores, 2000) y carcinoma de colon (Yasui y colaboradores, 1993). En varios casos, la sobreexpresión está correlacionada con un pronóstico malo. En el carcinoma gástrico (CG) se ha descrito sobreexpresión y/o aumento de la actividad (14 de 23 casos), y se ha sugerido que la sobreexpresión de la CDC2 podría ser una causa. Es más, la CDC2 se ha encontrado entre el conjunto de genes activos durante la mitosis que, si se sobreexpresan, causa la inestabilidad cromosómica de los tumores. Los inhibidores de la CDC2 y de otras Cdk han sido considerados como candidatos a fármacos para el tratamiento contra el cáncer (Shapiro, 2006).

Proteína del Huso Anormal Asociada a Microcefalia (ASPM) El gen de la proteína del huso anormal asociada a microcefalia (ASPM) es el ortólogo humano del gen anormal spindle (asp) de Drosophila y el gen de la microcefalia primaria autosómica recesiva que aparece mutado con más frecuencia. En el humano, la neurogénesis defectuosa causada por una mutación homocigótica de la ASPM provoca microcefalia y retraso mental.

La causa más habitual de microcefalia primaria autosómica recesiva (MCPH) parece ser las mutaciones en el gen ASPM, que está implicado en la regulación de la neurogénesis. La ASPM está localizada en los polos del huso durante la mitosis.

La inhibición de la ASPM mediante la reducción por medio de ARNsi que inhibe la proliferación de células tumorales y la proliferación de células madre neurales, lo cual convierte a la ASPM en una objetivo molecular potencial en el glioblastoma. La ASPM aparece sobreexpresada en el glioblastoma en comparación con el cerebro normal. La expresión de la ASPM se podría usar como un marcador de la malignidad del glioma y representa un objetivo terapéutico potencial. La sobreexpresion de ASPM es un marcador molecular que predice el aumento del potencial agresivo/metastásico del carcinoma hepatocelular (HCC), un mayor riesgo de recidiva tumoral precoz (ETR) independientemente del estado de mutación de p53 y de la etapa del tumor y, por ende, un pronóstico poco satisfactorio. La ASPM también aparece regulada al alza en células inmortalizadas, células cancerosas, así como en tejidos de cáncer de pulmón no microcítico (CPNM) (Jung y colaboradores, 2009).

Hidrolasa de Ubiquitina Carboxi-Terminal L5 (UCHL5) La hidrolasa de ubiquitina carboxi-terminal L5 (UCHL5), también conocida como hidrolasa de ubiquitina C-terminal (UCH37) o INO80R, es una desubiquitinasa que está asociada con el proteosoma. Desmonta las cadenas de poliubiquitina unidas a proteínas en el extremo distal hidrolizando el enlace isopeptídico entre la Cys76 C-terminal y la Lys48 (Nishio y colaboradores, 2009).

La UCHL5 se une a hRpn13 (también conocida como Adrm 1), un componente de la partícula reguladora 19S (PA700) del proteosoma, que activa su actividad isopeptidasa . La hRpn13 también funciona como un receptor de la ubiquitina, acoplando así el reconocimiento del sustrato con la desubiquitinización. La UCHL5 también se une a la Rpn10/S5a, otro componente de la partícula 19S localizado entre su "tapa" y su "base", pero esta interacción no puede activar a la UCHL5. La UCH37 podría evitar la proteólisis de los sustratos poco ubiquitinizados o de otros conjugados-Ub que son degradados lentamente. Alternativamente, también podría potenciar la degradación al facilitar el desprendimiento de los sustratos poliubiquitinizados de su zona inicial de unión en el complejo regulador 19S, tras lo cual serían translocados al centro proteolítico, la partícula 20S del proteosoma 26S. En el núcleo celular, la UCHL5 también está asociada al complejo remodelado de la cromatina Ino80. Tras la unión de un proteosoma, ésta se activa y puede contribuir a la regulación de la transcripción o la reparación del ADN que se ha sugerido como mediada por el Ino80 y el proteosoma. La función de la UCHL5 podría ser suplida al menos en parte por otras proteínas, ya que la reducción mediante ARNi de la UCHL5 no tiene ningún efecto detectable en el crecimiento celular, la estructura del proteosoma o su capacidad proteolítica, aunque acelera la degradación de las proteínas celulares.

Las proteasas específicas de ubiquitina como la UCHL5 participan en varios procesos como el control de la progresión del ciclo celular, diferenciación, replicación y reparación del ADN, transcripción, control de calidad de las proteínas, respuesta inmune y apoptosis. Existen como mínimo algunos indicios de que la UCHL5 contribuye a la transformación cancerosa. Así, se ha demostrado que su actividad está regulada al alza en el tejido de carcinoma cervicouterino humano respecto al tejido normal adyacente. Además, es capaz de desubiquitinizar y, por lo tanto, de estabilizar el receptor TGF-beta y sus mediadores posteriores, las Smad, potenciando así la vía de señalización del TGF-beta. La potenciación de la señalización TGF-beta puede actuar como un promotor tumoral en las etapas avanzadas de la progresión del cáncer, aunque cumple una función doble y también puede actuar como un supresor tumoral en los etapas iniciales y antes de la iniciación (Wicks y colaboradores, 2005; Wicks y colaboradores, 2006; Horton y colaboradores, 2007; Bierie and Moses, 2006). c-Met Ver, por ejemplo, EP 08008292.8 y EP1507795B1. Además, se ha descubierto que la activación constitutiva de c-Met mediante fosforilación constituye un importante mecanismo de la oncogénesis en el carcinoma renal de células claras humano (Nakaigawa y colaboradores, 2006).

La sobreexpresión de MET, con frecuencia desatada por la hipoxia tumoral, conduce a la activación constitutiva del receptor y conlleva un pronóstico malo. El silenciamiento del gen MET endógeno, sobreexpresado en células tumorales, altera la ejecución de todo el programa de crecimiento agresivo en condiciones in vitro y anula el crecimiento tumoral y reduce la aparición de metástasis experimentales in vivo. Un hecho destacable es que el silenciamiento de MET en metástasis arraigadas propicia su regresión casi completa (Corso y colaboradores, 2008).

Receptor de la Proteína Estimuladora de Macrófa os (MST1R) El receptor MST1R (o RON) es un miembro de la familia Met de tirosincinasas de receptor de la superficie celular que se expresa fundamentalmente en las células epiteliales y los macrófagos. Como c-MET, RON se expresa en diversas líneas celulares cancerosas y tumores de origen epitelial y se cree que desempeña un papel en la carcinogénesis. Los estudios clínicos han demostrado que la sobreexpresión del MST1R está asociada tanto con un peor desenlace de los pacientes como con la aparición de metástasis.

La expresión del MST1R es significativa en el tejido de carcinoma gástrico y en el tejido paraneoplásico correspondiente, pero es nula en la mucosa gástrica normal (Zhou y colaboradores, 2008). El receptor MST1R puede inducir la migración, invasión, proliferación y supervivencia de la célula como respuesta a su ligando. Es más, el MST1R posee actividad oncogénica in vitro, en modelos animales in vivo y a menudo aparece desregulado en cánceres humanos (Dussault and Bellon, 2009). Los datos demuestran que la reducción del MST1R en células de cáncer de próstata provoca una quimiotaxia significativamente menor de las células endoteliales en comparación con las células que lo expresan in vitro, así como un crecimiento tumoral reducido y una disminución de la densidad microvascular tras el trasplante ortotópico en la próstata in vivo. Se ha demostrado que la reducción mediante ARN de interferencia de la cinasa MST1R en una línea celular de cáncer de colon muy oncógenas redujo la proliferación en comparación con las células control.

Proteína de Mantenimiento Estructural de los Cromosomas 4 (SMC4) Las proteínas de mantenimiento estructural de los cromosomas (SMC) son ATPasas cromosómicas muy conservadas en los seres vivos, desde las bacterias al humano, que desempeñan funciones fundamentales en numerosos aspectos de la organización y la dinámica cromosómica de orden superior.

La proteína SMC4 es un componente central del complejo de condensina que actúa en la condensación de la cromatina y también ha sido vinculada con la segregación nucleolar, la reparación del ADN y el mantenimiento del armazón de cromatina. Los organismos eucariotas poseen como mínimo seis proteínas SMC que forman tres heterodímeros distintos con funciones especializadas: SMC2 y SMC4 actúan como el núcleo de los complejos de condensina que son esenciales para el montaje y la segregación de los cromosomas.

El análisis de los niveles de ARNm en 25 tejidos normales distintos mediante RT-PCR demuestra que este gen se expresa mucho en la próstata y en las glándulas salivales normales, muy poco en el colon, páncreas e intestino, y nada en otros tejidos. Los estudios con RT-PCR en muestras de cáncer humanas demostraron que el ARN se expresa mucho en numerosas líneas celulares cancerosas y muestras de tejidos cancerosos, incluidos 26 de 33 cánceres de mama, 3 de 3 cánceres de próstata, 3 de 3 cánceres de colon, y 3 de 3 cánceres de páncreas (Egland y colaboradores, 2006).

AVL9 Resulta sorprendente que la proteína AVL9 se detectara como proteína fuente, ya que se disponen de pocos datos sobre ella y la función del gen correspondiente.

Proteína del Cinetocoro Nuf2 El gen NUF2 (CDCA-1) codifica una proteína que es muy similar a la Nuf2 de levadura, un componente de un complejo proteínico conservado y vinculado al centrómero. La Nuf2 de levadura desaparece del centrómero durante la proetapa meiótica cuando los centrómeros pierden su conexión con el cuerpo del polo del huso, y desempeña una función reguladora en la segregación de los cromosomas. Se ha demostrado que la reducción temporal de los ARNm de la survivina y de la hNuf2 mediante ARNcsi provoca multinucleación y muerte celular por parada de la mitosis, respectivamente (Nguyen y colaboradores, 2006). La Nuf2 y la Hec1 son necesarias para organizar los sitios de unión del extremo ( + ) estable de los microtúbulos en la placa externa, que son precisos para mantener las fuerzas dirigidas hacia los polos requeridas para la biorientación en los cinetocoros (DeLuca y colaboradores, 2005).

El análisis inmunohistoquímico con una micromatriz de tejido de cáncer pulmonar confirmó altos niveles de las proteínas CDCA1 y KNTC2 en la gran mayoría de cánceres de pulmón de diversos tipos histológicos. La elevada expresión de ambas acarreó un pronóstico peor en pacientes con CPNM. La inhibición de su unión por un péptido al que la célula es permeable y que es portador del péptido de 19 aminoácidos derivado de la CDCA1 (11 R-CDCA1 (398-416)), el cual corresponde al dominio de unión a la KNTC2, se suprimió de manera efectiva el crecimiento de células de CPNM (Hayama y colaboradores, 2006). Se ha comprobado que la reducción mediante ARNsi contra la CDCA1 ó la KNTC2 inhibe la proliferación celular y la inducción de la apoptosis en el CPNM, cáncer de ovario, cáncer cervicouterino, cáncer gástrico, cáncer colorrectal y glioma (Kaneko y colaboradores, 2009). El gen CDCA 1 se expresa de modo diferencial en el cáncer cervicouterino (expresión del ARNm comprobada mediante PCR en tiempo real y de la proteína mediante inmunohistoquímica) (Martin y colaboradores, 2009). La aplicación de RT-PCR en tejidos de cáncer gástrico extirpados quirúrgicamente (tipo difuso, 6; tipo intestinal, 4) confirmó que dos variantes de la CDCA1 estaban reguladas al alza en los tejidos tumorales. En este estudio se detectaron variantes de empalme alternativo, especialmente en la CDCA1, que podrían ser útiles como marcadores de diagnósticos y/o nuevos objetivos para el tratamiento antitumoral (Ohnuma y colaboradores, 2009).

Fosfohidrolasa Lípido Fosfato 2 (PPAP2C) La proteína codificada por este gen es un miembro de la familia de las fosfatasas del ácido fosfatídico (PAP). Las PAP convierten el ácido fosfatídico en diacilglicerol, e intervienen en la síntesis de novo de los glicerolípidos así como en la transducción de la señal activada por receptor mediada por la fosfolipasa D. Se han descrito tres variantes de empalme alternativo que codifican diversas isoformas de la misma.

La PPAP2C es un nuevo objetivo potencial que está regulado al alza en las células madre mesenquimáticas (MSC) adultas humanas primarias transformadas. La reducción de la PPAP2C reduce la proliferación celular retrasando la entrada en la etapa S del ciclo celular y está regulada transcripcionalmente por la p53. Algunos datos indican que la sobreexpresion de PPAP2C, observada en numerosos tipos de cáncer humano, puede ser necesaria para aumentar la proliferación celular (Flanagan y colaboradores, 2009). Un estudio demuestra que la PPAP2C es un regulador de la progresión del ciclo celular en los fibroblastos. La sobreexpresion de PPAP2C, pero no una variante muíante catalíticamente inactiva, precipitó la entrada prematura en la etapa S, acompañada de la acumulación prematura de ciclina A. Estos fenómenos generan cambios sustanciales en la velocidad de entrada en la etapa S que podrían repercutir en procesos como la mitogénesis, migración, cicatrización de heridas, desarrollo y carcinogénesís.

Proteína de Unión a la Ubiquinol-citocromo c Reductasa (UQCRB) El gen UQCRB codifica una proteína que forma parte del complejo de la ubiquinol-citocromo c oxidorreductasa que contiene diez subunidades de codificación nuclear y una subunidad de codificación mitocondrial. La proteína codificada se une a la ubiquinona y participa en la transferencia de electrones cuando la ubiquinona está unida. Ciertas mutaciones de este gen se han asociado con la deficiencia en el complejo mitocondrial III. Se ha descrito un seudogén en el cromosoma X.

El gen UQCRB podría actuar como oncogén o gen supresor de tumores en el adenocarcinoma ductal pancreático (Harada y colaboradores, 2009). El gen UQCRB está sobreexpresado en el carcinoma hepatocelular (Jia y colaboradores, 2007).

Prominina 1 (PromD La prominina-1 , también denominada CD133, se identificó inicialmente como una molécula específica de las células progenitoras hematopoyéticas CD34+ y después ha demostrado ser un marcador de células madre normales y cancerosas (CSC) de diversos tejidos ( izrak y colaboradores, 2008). Sin embargo, poco se sabe sobre su función. Como está localizada principalmente en las protuberancias de la membrana plasmática como las microvellosidades de las células epiteliales, a la prominina-1 se le ha asignado una función como Organizadora' de la topología de la membrana plasmática. Dado que se ha comprobado que interactúa con el colesterol, podría ser importante para el mantenimiento de la composición adecuada de lípidos en la membrana plasmática.

La prominina-1 se utiliza como marcador de CSC en muchos tumores humanos. Unicamente un pequeño porcentaje de células tumorales suele ser positivo para la prominina-1, como se esperaba para un marcador de CSC. Dependiendo del tipo de tumor, el número de células positivas por masa tumoral oscila entre el 1% y el 15% y en la mayoría de casos ronda el 2%. Los tumores con células que expresan la prominina-1 en los que se ha demostrado que estas son CSC mediante pruebas funcionales (como la formación de esferas, elevada capacidad para iniciar el crecimiento de tumores en ratones inmunodeficientes y división asimétrica / autorrenovación / pluripotencia) son: - cáncer de colon (2 - 2.5% de la masa tumoral) (Todaro y colaboradores, 2007; Ricci-Vitiani y colaboradores, 2007), - cáncer de hígado (Ma y colaboradores, 2007; Suetsugu y colaboradores, 2006; Yin y colaboradores, 2007), - cáncer de páncreas (Hermann 2007; Wang 2009), - cáncer de próstata (1% de la masa tumoral) (Richardson y colaboradores, 2004), - tumores cerebrales de diferentes fenotipos (Singh y colaboradores, 2003; Singh y colaboradores, 2004), - leucemias como la leucemia linfoblástica aguda, LLA (Cox y colaboradores, 2009), - melanoma (Monzani y colaboradores, 2007; Rappa y colaboradores, 2008), - cáncer de pulmón (Chen and O'Shea, 2008; Eramo y colaboradores, 2008; Tirino y colaboradores, 2009), - sarcoma de Ewing (Suva y colaboradores, 2009), - cáncer de endometrio (Rutella y colaboradores, 2009), - carcinoma epidermoide oral (Zhang y colaboradores, 2009), y - carcinoma epidermoide de cabeza y cuello (Harper y colaboradores, 2007).

Es más, varios estudios han demostrado el aumento de la expresión de la prominina-1 en el tejido canceroso respecto al tejido sano, y la mayoría de ellos han confirmado una correlación entre la expresión de la prominina-1 con parámetros clínicos tales como la supervivencia total, la etapa tumoral o la presencia de metástasis. Algunos ejemplos son el cáncer de pulmón no microcítico, melanoma maligno, retinoblastoma, neuroblastoma y carcinoma sinovial. La expresión de prominina-1 también estuvo correlacionada con un mal pronóstico en el glioma, cáncer de páncreas (hasta 15% de células PROM1+), cáncer colorrectal, rectal y de colon, y carcinoma ductal de mama. Un dato destacable es que el ARNm de PROM1 está regulado al alza en las PBMC de los pacientes con cáncer en etapa metastásico, sobre todo en los pacientes con metástasis óseas, y la expresión de PRO 1 en las PBMC es un factor pronóstico de la supervivencia total. No se ha hallado correlación con el pronóstico en el cáncer de ovario.

En el cáncer gástrico difuso, se ha sugerido la expresión de PROM1 basada en un análisis bioinformático (Katoh and Katoh, 2007) y se ha descrito la sobreexpresión proteica en el cáncer gástrico comparado con el tejido gástrico normal (Smith y colaboradores, 2008). No obstante, (Boegl and Prinz, 2009) describieron que la expresión de prominina-1 estaba reducida en el cáncer gástrico, sobre todo en los etapas avanzados, y afirmaron que la expresión de prominina-1 se correlacionaba más con la angiogénesis - que también está reducida en los etapas avanzados - que con el crecimiento del tumor. Un estudio realizado con líneas celulares de cáncer gástrico (Takaishi y colaboradores, 2009) afirma que la CD44, pero no la prominina-1, es un marcador de CSC en el cáncer gástrico.

(Zhu y colaboradores, 2009) aportaron pruebas de la implicación de las células que expresan la prominina-1 en la formación de tumores; este grupo de investigación describió que en un modelo de cáncer intestinal en ratón, todas las células neoplásicas surgieron a partir de células Prom1+, pero sólo el 7% retuvo el fenotipo Prom1 + . Aparte de lo anterior, se ha demostrado que las células prominina-1 ( + ) contribuyen a la angiogénesis tumoral. Como se esperaba en las CSC, las células prominina-1 ( + ) han demostrado ser quimiorresistentes gracias a la activación de la vía de supervivencia Akt (Ma 2008). (Bertolini y colaboradores, 2009) describieron que no responden al tratamiento con cisplatino. Asimismo, son resistentes a la apoptosis inducida por TRAIL y Fas debido a la regulación a la alza de FLIP. Y se protegen de la apoptosis mediante la secreción de IL-4. Sin embargo, podrían ser accesibles al sistema inmune, ya que pueden ser destruidas por las células NK (Castriconi y colaboradores, 2007; Pietra y colaboradores, 2009) y los linfocitos T citotóxicos (Brown y colaboradores, 2009).

Metaloproteinasa de la Matriz 11 ÍMMP11) A la metaloproteinasa de la matriz 11 (MMP11) se le ha implicado en varios procesos fisiológicos que requieren la remodelación de tejidos, tales como el desarrollo, la involución de la glándula mamaria al término de la lactancia, la curación de heridas y la formación de cicatrices así como en el ciclo menstrual. También se ha propuesto que regula negativamente la homeostasis de los lípidos reduciendo la diferenciación de los adipocitos. A diferencia de otras MMP, no es capaz de degradar las moléculas típicas de la matriz extracelular, con la excepción del colágeno VI. No obstante, se han identificado otros sustratos tales como la alfa-2-macroglobulina, ciertos inhibidores serinproteasa (serpinas) como la alfa-1 -antitripsina, la proteína 1 de unión al factor de crecimiento insulinoide y el receptor de la laminina.

La MMP11 fue descubierta como un gen que se sobreexpresan específicamente en las células estromales que rodean el carcinoma agresivo de mama. Estudios posteriores confirmaron su expresión en el estroma que envuelve el tumor del carcinoma de mama y otros tipos de cáncer, como el cáncer de piel, los carcinomas de pulmón micro y no microcíticos, carcinoma epidermoide de cabeza y cuello, carcinoma de colon y colorrectal, cáncer epitelial de la laringe, carcinoma esofágico, carcinoma oral, carcinoma de páncreas, carcinoma de la vejiga urinaria, carcinomas de ovario, carcinoma de células renales, meningioma atípico, carcinoma papilar de tiroides, tumores cerebrales (la MMP11 aparece expresada en los astrocitomas, pero poco en los oligodendrogliomas, y en los gliomas malignos), carcinoma de los conductos salivales, cáncer cervicouterino, linfomas extraganglionares de linfocitos T/células NK, linfoma no Hodgkiniano y carcinoma de próstata. Se ha afirmado que la MMP11 está sobreexpresada en el estroma de la mayoría de carcinomas agresivos humanos, pero raramente en los sarcomas y en otros tumores no epiteliales. Sobre todo, la MMP11 se expresa en las células estromales inmediatamente adyacentes al tumor, mientras que las propias células tumorales, los tejidos normales y las células estromales alejadas del tumor son negativas. No obstante, este rasgo no se puede generalizar puesto que en algunos casos la MMP11 se ha detectado en tejidos no cancerosos como en el de colon, así como en células tumorales, por ejemplo en tumores de páncreas, mama, aracnoides y estómago. Los niveles elevados de MMP11 se correlacionan con un fenotipo maligno/agresividad elevada y un pronóstico malo. No obstante, en los carcinomas papilares de tiroides, la expresión de MMP11 apareció inversamente relacionada con las características agresivas.

No es probable que la MMP11 tenga un papel en la angiogénesis, ya que su expresión no se ha correlacionado con la densidad microvascular. Más bien, parece aumentar la supervivencia de las células cancerosas y suprimir la apoptosis. Se ha propuesto que la MMP11 secretada por los fibroblastos propicia la estimulación de la vía del IGF-1R en las células de carcinoma, aumentando así su capacidad de proliferación. Su capacidad para propiciar la desdiferenciación de los adipocitos avala la aparición del cáncer por la acumulación de células peritumorales similares a fibroblastos que facilitan la supervivencia de las células cancerosas y la progresión del tumor (Motrescu and Rio, 2008). La MMP11 se ha descubierto en el tejido tumoral y en el suero de pacientes con cáncer gástrico, y su expresión se ha correlacionado con metástasis (Yang y colaboradores, 2008). Además, (Deng y colaboradores, 2005) demostraron que la MP11 se expresa mucho en líneas celulares tumorales y en tumores primarios de cáncer gástrico - a diferencia de otros tipos de cáncer, en que sólo se expresa en el estroma - y que parece aumentar la proliferación de las células tumorales.

ABL1 El protooncogén ABL1 codifica una proteína tirosincinasa citoplasmática y nuclear de la familia Src que ha sido implicada en los procesos de diferenciación, división y adhesión celulares y en la respuesta al estrés (Yoshida, 2007). La c-Abl transita continuamente entre los compartimentos del núcleo y del citoplasma. La c-Abl nuclear participa en la inhibición del crecimiento celular y en la promoción de la apoptosis. En cambio, la función de la c-Abl citoplasmática es menos conocida. Respecto a esta última, existen indicios que apuntan a su participación en la morfogénesis y en la dinámica de la actina F, y a un papel en la señalización desencadenada por estímulos extracelulares como factores de crecimiento y ligandos de integrina. Se ha descrito que la c-Abl citoplasmática promueve la mitogénesis. Los sustratos mitógenos de la C-Abl no han sido descubiertos todavía, pero es probable que incluyan reguladores de GTPasas pequeñas de la familia Rho, sobre todo los miembros Vav y Sos.

La actividad de unión al ADN de la ubicua tirosincinasa ABL1 es regulada por la fosforilación mediada por la CDC2, lo que indica que la ABL1 desempeñaría una función en el ciclo celular. La actividad de la proteína c-Abl está regulada negativamente por su dominio SH3, y la dilección de tal dominio convierte la ABL1 en un oncogén. La tirosincinasa c-Abl, no ligada a un receptor, regula las respuestas de la actina en células no hematopoyéticas. Algunos estudios señalan a la c-Abl como una protagonista clave en la cascada de señalización que conduce a la reorganización de la actina durante la activación de los linfocitos T (Huang y colaboradores, 2008).

Las mutaciones del gen ABL1 están asociadas con la leucemia mielógena crónica (LMC). En la LMC, el gen se activa por su translocación dentro del gen BCR (breakpoint cluster región), situado en el cromosoma 22. Este nuevo gen de fusión, BCR-ABL, codifica una tirosincinasa citoplasmática no regulada que permite a las células proliferar sin estar reguladas por citocinas. Esto, a su vez, permite a la célula convertirse en una célula cancerosa (Zhao y colaboradores, 2009). La tirosincinasa c-Abl activada, no como una proteína de fusión, desempeña una función importante en los tumores sólidos malignos de pulmón y mama (Lin and Arlinghaus, 2008).

Observaciones recientes indican que la c-Abl también está desregulada en los tumores sólidos. En los carcinomas de mama y en el CPNM se ha detectado una gran actividad cinasa en el citoplasma. La sobreexpresión, no obstante, no basta y la actividad cinasa constitutiva requiere la fosforilación de la proteína. En las células de cáncer de mama, la fosforilación de la c-Abl está inducida por tirosincinasas de la membrana plasmática, incluidas la SFK, miembros de la familia del EGFR y el receptor del IGF-1. No se han detectado proteínas de fusión ABL en tumores sólidos.

ABL1 y cáncer gástrico - En un estudio inmunohistoquímico de la expresión de ABL1, se examinó una amplia gama de tejidos humanos fetales y adultos normales y diversos tipos de tumores. La mayoría de los tumores manifestaron una inmunorreactividad focal o débil a la ABL. La tinción más intensa se observó en el condrosarcoma, el liposarcoma y en el adenocarcinoma gástrico difuso (anillo de sello). En los dos últimos casos, la ABL también aparece expresada en los microvasos tumorales, lo cual indica un posible papel en la angiogénesis.

Estudios recientes han revelado que la infección por Helicobacter pylori cagA-positivo desempeña un papel esencial en el desarrollo del carcinoma gástrico. H. pylori bloquea la endocitosis y la degradación del EGFR con la infección prolongada de las células epiteliales gástricas. Además, esta inhibición se produce de una forma dependiente de CagA, pero la activación independiente de la fosforilación de CagA de la cinasa no ligada a receptor c-Abl, que a su vez fosforila la región objetivo pY1173 del EGFR (Bauer y colaboradores, 2009). La inhibición selectiva de la actividad cinasa de la c-Abl mediante STI571 ó ARNsh anula la fosforilación prolongada del gen A asociado a citotoxina (CagA) y la migración de la célula epitelial, hecho que indica el papel primordial de la c-Abl en la infección y la patogenia causada por H. pylori (Poppe y colaboradores, 2007) .

Un ejemplo de bloqueadores de cinasas es imatinib (Imatinib mesilato, Gleevec, STI571), el inhibidor de la oncoproteína Bcr/Abl, que se ha convertido en el tratamiento de primera línea para la leucemia mielógena crónica (Pytel y colaboradores, 2009). Imatinib ha sido autorizado para el tratamiento de pacientes con tumor estromales gastrointestinal (GIST) avanzado, en el que KIT, un receptor tirosincinasa, está expresado anormalmente (Croom and Perry, 2003). Otro inhibidor de cinasa utilizado recientemente como tratamiento contra el cáncer es dasatinib (BMS-354825) que es específico de la ABL no ligada a receptor citoplasmática (Pytel y colaboradores, 2009). NMotinib es un TKI oral de segunda generación del bcr-abl indicado para el tratamiento en adultos de la leucemia mieloide crónica en etapa crónica o aguda Ph + resistente o intolerante a imatinib (Deremer y colaboradores, 2008) .

En el documento WO 2007/028574 se describen las secuencias SEC ID No. 13, SEC ID No. 14 y SEC ID No. 15, CDC42 (ciclo de división celular 42) es una proteína que participa en la regulación del ciclo celular. La proteína es una GTPasa pequeña de la subfamilia Rho que regula los sistemas de transducción de señales que controlan diversas funciones celulares como la morfología celular, la migración, la endocitosis y la progresión del ciclo celular. Se descubrió que CDC42 estaba muy sobreexpresada en el glioblastoma.

El documento WO 2004/067023 describe péptidos restringidos a MHC de clase I derivados del antígeno asociado a tumores survivina, que son capaces de unirse a moléculas HLA de clase I con una afinidad alta.

La fosfoproteína 1 secretada (SPP1), también conocida como sialoproteína ósea I (BSP-1), activación temprana de linfocitos T (ETA-1), y más frecuentemente como osteopontina (OPN), es un producto génico humano también conservado en otras especies. Se ha mostrado que la osteopontina es un factor importante en la remodelación ósea. En concreto, las investigaciones sugieren que desempeña una función en el anclaje de los osteoclastos a la matriz mineral de los huesos. La parte orgánica del hueso supone cerca del 20% del peso seco e incluye, además de la osteopontina, colágeno de tipo I, osteocalcina, osteonectina , sialoproteína ósea y fosfatasa alcalina. El colágeno de tipo I cuenta el 90% de la masa proteica .

La OPN se une a varios receptores de integrina como a4ß1, a9ß1 y a9ß4, expresados por los leucocitos. Se ha determinado con certeza que estos receptores intervienen en la adhesión, migración y supervivencia de estas células. Por lo tanto, las investigaciones más recientes se han centrado en el papel de la OPN para mediar tales respuestas.

La osteopontina se expresa en un intervalo de células inmunes, como los macrófagos, neutrófilos, células dendríticas y linfocitos T y B, con cinéticas variables. De hecho, se ha descrito que la OPN actúa como un modulador inmune de diversas maneras. En primer lugar, tiene propiedades quimiotácticas que promueven el reclutamiento de células a sitios inflamatorios. También actúa como una proteína de adhesión, implicada en el anclaje celular y la curación de heridas. Además, la OPN media la activación celular y la producción de citocinas, además de promover la supervivencia celular mediante la regulación de la apoptosis.

La IL-12 promueve la diferenciación de los linfocitos T activados hacia el tipo Th1, que producen citocinas como la IL-12 y el IFNy. La OPN inhibe la producción de la citocina de Th2 IL-10, lo que acaba potenciando la respuesta Th1. La OPN influye en la inmunidad celular y cumple funciones de citocina de Th1. Potencia la producción de las inmunoglobulinas por parte de los linfocitos B así como su proliferación. Estudios del año 2008 sugieren que la OPN también induce la desgranulación de los mastocitos (Nagasaka, A., H. Matsue, H. Matsushima y colaboradores Febrero de 2008, Osteopontin is produced by mast cells and affects IgE-mediated degranulation and migration of mast cells. Eur. J. Immunol., 38 [2]: 489-99). Los investigadores observaron que la anafilaxia mediada por IgE se redujo significativamente en ratones OPN knock-out en comparación con ratones de tipo salvaje. La OPN también se ha visto implicada en la activación de macrófagos en un estudio del cáncer en el que los investigadores descubrieron que los tumores productores de OPN eran capaces de inducir la activación de los macrófagos en comparación con los tumores deficientes en OPN.

La OPN se comporta como un importante factor antiapoptósico en muchas circunstancias. Bloquea la muerte celular inducida por la activación en los macrófagos y los linfocitos T, además de los fibroblastos y las células endoteliales expuestas a estímulos dañinos. La OPN previene la muerte celular no programada en la colitis inflamatoria.

El hecho de que la OPN interaccione con múltiples receptores de la superficie celular expresados de forma ubicua la convierte en un participante activo de muchos procesos fisiológicos y patológicos, como la curación de heridas, el metabolismo óseo, la oncogénesis, la inflamación, la isquemia y las respuestas inmune. Por lo tanto, la manipulación de los niveles plasmáticos de OPN podría ser útil en el tratamiento de enfermedades autoinmunitarias, metástasis, osteoporosis y algunas formas de estrés.

Se ha demostrado que la OPN dirige la producción de IL-17. La OPN está sobreexpresada en diversos tipos de cáncer, como el cáncer de pulmón, mama, colorrectal, estómago, ovario, melanoma y mesotelioma. La OPN contribuye tanto a la glomerulonefritis como a la nefritis tubulointersticial. En las placas de ateroma de las arterias hay OPN. De esta forma, la manipulación de los niveles plasmáticos de OPN podría ser útil en el tratamiento de enfermedades autoinmunes, metástasis, osteoporosis y algunas formas de estrés.

Receptor 3 del Factor de Crecimiento Epidérmico Humano (ERBB3) El ERBB3 codifica un miembro de la familia de receptores del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) de tirosincinasas de receptores. Es activado por las neuregulinas, por otros receptores ERBB y no ERBB así como por otras cinasas, y mediante mecanismos nuevos. El flujo descendente interacciona de forma destacada con la vía de supervivencia/mitógena de la fosfoinositol 3-cinasa/AKT, así como con GRB, SHC, SRC, ABL, rasGAP, SYK y el regulador de la transcripción EBP1 (Sithanandam and Anderson 413-48).

Los estudios de expresión del ERBB3 en tumores primarios y de sus contribuciones mecanicistas en células cultivadas lo han implicado, con diversos grados de certeza, en el origen o el mantenimiento de cánceres de mama, ovario, próstata, ciertas células cerebrales, retina, melanocitos, colon, páncreas, estómago, cavidad bucal y pulmón (Sithanandam and Anderson 413-48). La proteína ERBB3 se ha detectado mediante métodos inmunohistoquímicos en células epiteliales dispuestas a lo largo del tubo digestivo, incluido el epitelio escamoso de la orofaringe y el esófago, las células parietales del estómago y los enterocitos superficiales del intestino grueso y delgado. La ERBB3 ha manifestado una expresión elevada en cánceres gástricos (Poller y colaboradores 275-80; Sanidas y colaboradores 935-40). Todas las líneas celulares de cáncer gástrico expresaron ERBB3 y un producto truncado segregado. Un estudio de carcinomas gástricos con células en sello poco diferenciadas aporta indicios sólidos del papel clave desempeñado por la ERBB3 en el cáncer gástrico (Kobayashi y colaboradores 1294-301). Zhang y colaboradores investigaron la expresión de la ERBB3 en el cáncer gástrico de dos tipos patológicos (tipo intestinal y difuso) mediante técnicas de inmunohistoquímica (IHQ). El tipo difuso de CG evidenció una tasa notablemente mayor de sobreexpresión de la ERBB3 que el tipo intestinal (26.2% frente a 5.0%, p < 0.01). La sobreexpresión selectiva de la ERBB3 en los dos tipos histológicos de cáncer gástrico está estrechamente asociada a un pronóstico malo (Zhang y colaboradores 2112-18). La expresión de la ERBB3 estuvo asociada de manera significativa con parámetros implicados en la progresión tumoral, incluidos la profundidad de la invasión tumoral, afectación de los ganglios linfáticos, metástasis a distancia, etapa tumoral y enfermedad recurrente (Hayashi y colaboradores 7843-49). La expresión y coexpresión de EGFR, c-erbB-2 y c-erbB-3 en 21 cánceres gástricos y 20 gastritis crónicas se examinaron con métodos inmunohistoquímicos en tejidos frescos congelados teniendo en cuenta variables clínico-patológicas. En general, los pacientes con cáncer gástrico presentaron una mayor incidencia de sobreexpresion de EGFR, c-erbB-2 y d-erbB-3 que el grupo con gastritis crónica (81% y 43%; 38% y 45%; 35% y 20%, respectivamente), aunque sólo se observaron diferencias estadísticamente significativas en lo que concierne a la expresión del EGFR (p = 0.01) (Slesak y colaboradores 2727-32).

Hasta ahora se han probado en condiciones experimentales diversas estrategias de tratamiento dirigido contra el ERBB3. El uso de aptámeros de ARN dirigidos contra el dominio extracelular del ERBB3 inhibió la heterodimerización ERBB3/ERBB2 inducida por NRG, la fosforilación de la ERBB2 y el crecimiento de células de cáncer de mama MCF7 (Chen y colaboradores 9226-31). La aplicación de un factor de transcripción de dedos de zinc sintético destinado a inhibir la expresión del gen ERBB3 en células de carcinoma epidermoide A431 propició la reducción de la proliferación y la migración, y la represión de la expresión de ERBB3 tuvo un efecto mayor que el cambio de la expresión de ERBB2 (Lund y colaboradores 9082-91). El isómero de la vitamina E ?-tocotrienol inhibió la proliferación de células mamarias mediante el bloqueo específico de la activación de la ERBB3 y de la estimulación subsiguiente de la vía PI3K/AKT (Samant and Sylvester 563-74). El micro-ARN 125a redujo el ARN y la proteína del ERBB3, la activación de la AKT y el crecimiento celular y la agresividad de células de carcinoma mamario SKBR3 (Scott y colaboradores 1479-86). La regulación a la baja de la ERBB3 mediante ARNsi en células de cáncer de mama anuló su resistencia secundaria a inhibidores de tirosincinasa y posibilitó la inducción de la apoptosis (Sergina y colaboradores 437-41). El uso de ARN inhibidores pequeños (ARNsi) contra la ERBB3 o la AKT ha ofrecido resultados prometedores como estrategia terapéutica para el tratamiento del adenocarcinoma de pulmón (Sithanandam y colaboradores 1847-59).

Survivina (BIRC5) La expresión de BIRC5 (survivina), un miembro de la familia de proteínas inhibidoras de la apoptosis (IAP), es elevada en tejidos fetales y en diversos cánceres humanos. WO 2004/067023 describe péptidos restringidos de MHC de clase I derivados del antígeno asociado a tumor survivina, péptidos que son capaces de unirse a las moléculas HLA de clase I con una alta afinidad. La survivina parece ser capaz de regular tanto la proliferación celular como la muerte celular apoptóticas. Sobre todo en el glioblastoma, pueden detectarse niveles muy altos de expresión de la survivina (Angileri y colaboradores, 2008). Se sugiere que la sobreexpresión de survivina en gliomas cerebrales puede desempeñar un importante papel en la proliferación maligna, la antiapóptosis y la angiogénesis (Zhen y colaboradores, 2005; Liu y colaboradores, 2006). Especialmente en el caso del glioblastoma, pero también en otras entidades tumorales, la expresión de survivina se ha asociado de forma significativa con el grado de malignidad (con la máxima expresión de survivina en el glioblastoma) y con tasas de supervivencia menores en comparación con los pacientes cuyos tumores son negativos para survivina (Kajiwara y colaboradores, 2003; Saito y colaboradores, 2007; Uematsu y colaboradores, 2005; Mellai y colaboradores, 2008; Grunda y colaboradores, 2006; Xie y colaboradores, 2006; Sasaki y colaboradores, 2002; Chakravarti y colaboradores, 2002).

Antíqeno Central de Hepatitis B En el virus de la hepatitis B (HBV), son bien conocidos los péptidos inmunógenos HBc de la proteína central (Bertoletti y colaboradores, 1993; Livingston y colaboradores, 1997). En las vacunas contra el cáncer basadas en la presente invención se podría incluir un péptido de diez aminoácidos del HBc como control positivo de la inmunocompetencia de los pacientes y del éxito de la inmunización.

Tabla 6: Funciones asociadas al cáncer de las proteínas fuente.

La clasificación "-" < "( + )" < " + "; "?" significa que la situación se desconoce actualmente.

Como puede verse en la Tabla 6, el experto en la técnica puede adaptar fácilmente la composición de la aplicación disponible a cada paciente y/o tumor específico y escoger los TUMAP de conformidad.

En una modalidad preferida de la invención, la composición farmacéutica comprende al menos dos péptidos, uno de ellos contiene una secuencia de aminoácidos conforme a la secuencia SEC ID No. 1 y el otro contiene además un péptido que contiene una secuencia de aminoácidos conforme a la secuencia SEC ID No. 11.

En una modalidad preferida de la invención, la composición farmacéutica comprende al menos dos péptidos, uno que contiene una secuencia de aminoácidos conforme a la secuencia SEC ID No. 1 y una secuencia de aminoácidos conforme a las secuencias SEC ID No. 2 y/o SEC ID No. 11.

En una modalidad preferida de la invención, la composición farmacéutica comprende al menos dos péptidos que contienen una secuencia de aminoácidos conforme a la secuencia SEC ID No. 3 y una secuencia de aminoácidos conforme a las secuencias SEC ID No. 2 y/o SEC ID No. 11.

En una modalidad preferida de la invención, la composición farmacéutica comprende al menos dos péptidos que contienen una secuencia de aminoácidos conforme a la secuencia SEC ID No. 1 y una secuencia de aminoácidos conforme a las secuencias SEC ID No. 7 y opcionalmente la secuencia SEC ID No. 11.

En una modalidad preferida de la invención, la composición farmacéutica comprende al menos dos péptidos que contienen una secuencia de aminoácidos conforme a la secuencia SEC ID No. 2 y una secuencia de aminoácidos conforme a las secuencias SEC ID No. 7 y opcionalmente la secuencia SEC ID No. 11.

En una modalidad preferida de la invención, la composición farmacéutica comprende al menos dos péptidos que contienen una secuencia de aminoácidos conforme a la secuencia SEC ID No. 3 y una secuencia de aminoácidos conforme a las secuencias SEC ID No. 7 y opcionalmente la secuencia SEC ID No. 11.

En una modalidad aún más preferida, la composición farmacéutica comprende al menos un péptido más que contiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo compuesto por las secuencias SEC ID No. 2 a SEC ID No. 10 y SEC ID No. 11 a SEC ID No. 22 y SEC ID No. 24 y/o una secuencia de aminoácidos que es al menos un 85% idéntica a aquella de las secuencias SEC ID No. 2 a SEC ID No. 10 y SEC ID No. 11 a SEC ID No. 22 y SEC ID No. 24 y/o un polinucleótido que contiene un ácido nucleico que codifica las secuencias SEC ID No. 2 a SEC ID No. 10 y SEC ID No. 11 a SEC ID No. 22 y SEC ID No. 24 ó la secuencia variante de aminoácidos, y un vehículo aceptable farmacéuticamente.

Las modalidades preferidas adicionales de la invención comprenden al menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 ó 18 péptidos que contienen una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo compuesto por las secuencias SEC ID No. 1 a SEC ID No. 10 y SEC ID No. 11 a SEC ID No. 22 y SEC ID No. 24 y/o una secuencia de aminoácidos que es idéntica en al menos un 85% a aquélla de las secuencias SEC ID No. 1 a SEC ID No. 10 y/o un polinucleótido que contiene un ácido nucleico que codifica las secuencias SEC ID No. 1 a SEC ID No. 10 y SEC ID No. 11 a SEC ID No. 22 y SEC ID No. 24 ó la secuencia variante de aminoácidos, y un vehículo aceptable farmacéuticamente.

La composición farmacéutica puede contener, además, péptidos y/o excipientes adicionales para aumentar su eficacia, tal y como se explicará más adelante.

El término «secuencia variante de aminoácidos» de la secuencia de aminoácidos dada significa, de acuerdo a los inventores, que las cadenas laterales de, por ejemplo, uno o dos de los residuos de aminoácido se alteran (por ejemplo, mediante su reemplazo con la cadena lateral de otro residuo de aminoácido natural u otra cadena lateral) de forma que el péptido todavía es capaz de unirse a una molécula HLA básicamente de la misma forma que un péptido constituido por la secuencia de aminoácidos dada. Por ejemplo, un péptido puede modificarse de forma que al menos mantenga, o incluso mejore, su capacidad para interactuar y unirse a una molécula MHC apropiada, como la HLA-A o -DR, de modo que al menos mantenga, o incluso mejore, la capacidad para generar CTL activados que reconozcan y maten células que expresen un polipéptido que contenga una secuencia de aminoácidos como la definida en los aspectos de la invención. Como puede deducirse de la base de datos, determinadas posiciones de péptidos que se unen a HLA-A son residuos conservados que forman una secuencia central que se ajusta al motivo de unión de la hendidura de unión del HLA.

Los residuos de aminoácidos que no sean esenciales para interactuar con el receptor del linfocito T pueden ser modificados mediante el reemplazo con otro aminoácido cuya incorporación no afecte de forma sustancial a la reactividad del linfocito T ni elimine la unión con el MHC relevante. Por lo tanto, aparte de la condición dada, el péptido de la invención podrá ser cualquier péptido (en cuya definición los inventores incluyen a los oligopéptidos y a los polipéptidos) que incluya las secuencias de aminoácidos o una porción o variante de las mismas, tal y como se ha especificado.

Se conoce, además, que los péptidos presentados por las MHC de clase II están compuestos de una «secuencia central» poseedora de un determinado motivo de aminoácidos específico de HLA y, opcionalmente, extensiones N- y/o C-terminal que no interfieren con la función de la secuencia central (es decir, que se consideran irrelevantes en la interacción del péptido y el linfocito T). Las extensiones de los extremos N y/o C-terminal pueden tener una longitud de entre 1 y 10 aminoácidos respectivamente, por ejemplo. Estos péptidos pueden ser usados o bien directamente, para cargar moléculas MHC de clase II, o bien la secuencia puede ser clonada en los vectores de acuerdo a la descripción que se detalla más abajo. Teniendo en cuenta que estos péptidos constituyen el producto final del procesamiento de péptidos más largos dentro de la célula, también pueden usarse péptidos más largos. Los péptidos de la invención pueden ser de cualquier tamaño, pero normalmente tendrán un peso molecular menor que 100,000, 50,000, 10,000, 5,000, 2,500 ó entre 1,000 y 2,000, por orden creciente de preferencia. En cuanto al número de residuos de aminoácidos, los péptidos de la invención podrán tener menos de 1,000, 500 ó 100 residuos, por orden creciente de preferencia. En consecuencia, la presente invención también proporciona composiciones de péptidos y sus variantes en las que el péptido o variante tiene una longitud total de entre 8 y 100 aminoácidos, en donde se prefiere una longitud de entre 8 y 30, y en donde, a su vez, se prefiere que sea de entre 8 y 17 aminoácidos, es decir, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ó 16 aminoácidos.

Se prefieren los péptidos que tienen una secuencia central seleccionada de un grupo compuesto por las secuencias SEC ID No. 11 a SEC ID No. 22 y SEC ID No. 24 con extensiones de 1 a 10 aminoácidos en los extremos C y/o N-terminal, prefiriéndose que el número total de estos aminoácidos flanqueadores sea de 1 a 12, de 1 a 10, de 1 a 8 ó de 1 a 6, por orden creciente de preferencia, pudiendo distribuirse los aminoácidos flanqueadores en cualquier proporción en los extremos C y N-terminal (por ejemplo, se pueden añadir todos los aminoácidos flanqueadores a un extremo o distribuirse equitativamente en ambos extremos o en cualquier otro orden), siempre que el péptido aún sea capaz de unirse a una molécula HLA de la misma forma que el mencionado péptido conforme a cualquiera de las secuencias SEC ID No. 11 a SEC ID No. 22 y SEC ID No. 24.

De la misma manera, las variantes que inducen la reacción cruzada de los linfocitos T con un péptido de la invención suelen ser variantes en cuanto a la longitud.

Si un péptido tiene una longitud mayor de unos 12 residuos de aminoácidos es usado directamente para unirse a una molécula MHC de clase II. Se prefiere que los residuos que flanquean la región central de unión a HLA no afecten de forma sustancial a la capacidad del péptido para unirse específicamente a la hendidura de unión de la molécula MHC de clase II o de presentar al péptido al CTL. Sin embargo, tal y como se indicó antes, se apreciará que puedan usarse péptidos más largos, especialmente si están codificados por un polinucleótido, ya que estos péptidos más largos pueden ser fragmentados por las células presentadoras de antígenos adecuadas. Además, los aminoácidos flanqueadores pueden reducir la velocidad de la degradación in vivo de los péptidos, de forma que la cantidad de péptido real disponible para los CTL sea mayor que con el péptido carente de aminoácidos flanqueadores.

También cabe la posibilidad de que los epítopos de MHC de clase I, aunque habitualmente tienen una longitud de entre 8 y 10 aminoácidos, sean generados por el procesamiento peptidico de proteínas o de péptidos más largos que incluyan el epítopo. De forma similar a los epítopos de MHC de clase II, se prefiere que los residuos flanqueadores de los péptidos precursores alargados situados en dirección 5' y/o en dirección 3' de los extremos N y C-terminal del epítopo real no afecten sustancialmente a la presentación del péptido a los CTL ni enmascaren los sitios de escisión proteolítica, necesarios para producir el epítopo real mediante el procesamiento del péptido alargado.

Se prefieren los péptidos con una secuencia central compuesta de las secuencias SEC ID No. 1 a SEC ID No. 10 y SEC ID No. 11 con extensiones de 1 a 10 aminoácidos en los extremos C y/o N-terminal, prefiriéndose que el número total de estos aminoácidos flanqueadores sea de 1 a 12, de 1 a 10, de 1 a 8 ó de 1 a 6, por orden creciente de preferencia, pudiendo distribuirse los aminoácidos flanqueadores en cualquier proporción en los extremos C y N-terminal (por ejemplo, se pueden añadir todos los aminoácidos flanqueadores a un extremo o distribuirse equitativamente en ambos extremos o en cualquier otro orden), siempre que el péptido aún sea capaz de unirse a una molécula HLA de la misma forma que el mencionado péptido conforme a cualquiera de las secuencias SEC ID No. 1 a SEC ID No. 10 y SEC ID No. 11.

De acuerdo a, la presente invención también proporciona péptidos y variantes de epítopos de MHC de clase I con una longitud total, por orden creciente de preferencia, de entre 8 y 100, preferiblemente entre 8 y 30 y más preferiblemente entre 8 y 18 aminoácidos, es decir, de 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 ó 17 aminoácidos.

Por supuesto, el péptido o variante conforme a la presente invención tendrá la capacidad de unirse a una molécula MHC de clase I o II humana. La unión de un péptido o una variante a un complejo MHC se puede probar con métodos conocidos por los expertos en la técnica como, por ejemplo, los descritos más abajo en los ejemplos de la presente invención o los que aparecen en material publicado para distintos alelos de MHC de clase II (por ejemplo, Vogt, A. B., H. Kropshofer, H. Kalbacher, M. Kalbus, H. G. Rammensee, J. E. Coligan, R. Martin, «Ligand motifs of HLA-DRB5*0101 and DRB1*1501 molecules delineated from self-peptides», J. Immunol., 1994, 153[4]:1665-1673; Malcherek, G., V. Gnau, S. Stevanovic, H. G. Rammensee, G. Jung, A. Melms, «Analysis of allele-specific contact sites of natural HLA-DR17 ligands», J. Immunol., 1994; 153[3]: 1141-1149; Manici, S., T. Sturniolo, M. A. Imro, J. Hammer, F. Sinigaglia, C. Noppen, G. Spagnoli, B. Mazzi, M. Bellone, P. Dellabona, M. P. Protti, «Melanoma cells present a MAGE-3 epitope to CD4[ + ] cytotoxic T cells in association with histocompatibility leukocyte antigen DR11», J. Exp Med., 1999; 189[5]: 871-876; Hammer, J., F. Gallazzi, E. Bono, R. W. Karr, J. Guenot, P. Valsasnini, Z. A. Nagy, F. Sinigaglia, «Peptide binding specificity of HLA-DR4 molecules: correlation with rheumatoid arthritis association», J.

Exp. Med., 1995 181 [5]: 1847-1855; Tompkins, S. M . , P. A. Rota, J. C. oore, P. E. Jensen, «A europium fluoroimmunoassay for measuring binding of antigen to class II MHC glycoproteins», J. Immunol. Methods., 1993;163[2]: 209-216; Boyton, R. J., T. Lohmann, M. Londei, H. Kalbacher, T. Halder, A. J. Frater, D. C. Douek, D. G. Leslie, R. A. Flavell, D. M. Altmann, «Glutamic acid decarboxylase T lymphocyte responses associated with susceptibility or resistance to type I diabetes: analysis in disease discordant human twins, non-obese diabetic mice and HLA-DQ transgenic mice», Int. Immunol., 1998 (12): 1765-1776).

Los péptidos de la presente invención pueden tener tramos adicionales de aminoácidos localizados en los extremos N y/o C-terminal que no necesariamente forman parte del péptido que funciona como el epítopo real para las moléculas MHC pero que pueden, sin embargo, ser importantes para facilitar una introducción eficiente del péptido en las células conforme a la presente invención (ver anteriormente). En una de las formas de modalidad de la presente invención, el péptido de la presente invención es una proteína de fusión que comprende, por ejemplo, los 80 aminoácidos N-terminal de la cadena invariante asociada al antígeno HLA-DR (p33, en lo sucesivo «li»), como se obtiene de la base de datos del NCBI, número de registro del GenBank X00497 (Strubin, M. , B. Mach y E. O. Long, «The complete sequence of the mRNA for the H LA-DR-associated invariant chain reveáis a polypeptide with an unusual transmembrane polarity», EMBO. J.; 1984; 3 [4], 869-872).

La presente invención también proporciona una composición farmacéutica que comprende al menos uno de los péptidos de la presente invención, en la que los péptidos tienen una longitud total de entre 8 y 100 aminoácidos, preferentemente de entre 8 y 30 y, con la mayor preferencia, de entre 8 y 17, ó 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ó 16 aminoácidos.

Además, el péptido o variante puede modificarse más para mejorar la estabilidad y/o la unión a las moléculas MHC con el fin de provocar una respuesta inmune más potente. Los métodos para tal optimización de una secuencia peptídica son bien conocidos por los expertos en la técnica e incluyen, por ejemplo, la introducción de enlaces peptídicos inversos o de enlaces no peptídicos.

De esta forma, conforme a otro aspecto, la invención proporciona una composición farmacéutica en la que al menos un péptido o variante incluye enlaces no peptídicos.

En un enlace peptídico inverso, los residuos de aminoácido no están unidos por enlaces peptídicos (-CO-NH-), sino que el enlace peptídico está invertido. Estas formas retro-inverso pueden hacerse mediante métodos conocidos por los expertos en la técnica, como los descritos por Meziere y colaboradores (1997), J. Immunol., 159, 3230-3237, incluidos aquí como referencia. Este enfoque implica sintetizar pseudopéptidos que contengan modificaciones en el esqueleto central y no en la orientación de las cadenas laterales. Meziere y colaboradores (1997) demuestran que, para las respuestas de los linfocitos T auxiliares y MHC, estos pseudopéptidos son útiles. Los péptidos de tipo retro-inverso, que contienen enlaces NH-CO en lugar de enlaces peptídicos CO-NH, son mucho más resistentes a la proteólisis.

Ejemplos de enlaces no peptídicos son -CH2-NH, -CH2S-, -CH2CH2-, -CH = CH-, -COCH2-, -CH(OH)CH2-, y -CH2SO-. La patente de Estados Unidos de Norteamérica No. 4,897,445 proporciona un método para la síntesis en etapa sólida de enlaces no peptídicos (-CH2-NH) en cadenas de polipéptidos que implica la síntesis de polipéptidos mediante procedimientos habituales y la síntesis de enlaces no peptídicos mediante la reacción de un aminoaldehído y un aminoácido en presencia de NaCNBH3.

Los péptidos que comprenden las secuencias de la invención descritas más arriba pueden ser sintetizados con grupos químicos adicionales presentes en los extremos amino y/o Carboxi terminal para potenciar, por ejemplo, la estabilidad, biodisponibilidad y/o afinidad de los péptidos. Por ejemplo, los grupos hidrofóbicos como los grupos carbobenzoxilo, dansilo o t-butiloxicarbonilo pueden añadirse a los extremos amínicos de los péptidos. De la misma forma, se puede situar un grupo acetilo o un grupo 9-fluorenilmetoxi-carbonilo en los extremos amínicos de los péptidos. Además, se puede añadir, por ejemplo, el grupo hidrofóbico t-butiloxicarbonilo, o un grupo amido a los extremos carboxílicos de los péptidos.

Además, todos los péptidos de la invención pueden sintetizarse para alterar su configuración estérica. Por ejemplo, se puede utilizar el D-isómero de uno o más residuos de aminoácido del péptido, en lugar del L-isómero habitual. Más aún, al menos uno de los residuos de aminoácido de los péptidos de la invención puede sustituirse por uno de los residuos de aminoácido no naturales conocidos por los expertos. Alteraciones como éstas pueden servir para aumentar la estabilidad, la biodisponibilidad y/o la acción de unión de los péptidos de la invención.

De forma similar, un péptido o variante de la invención puede modificarse químicamente mediante la reacción de aminoácidos específicos antes o después de la síntesis del péptido. Los expertos en la técnica conocen bien los ejemplos de tales modificaciones, que se resumen, por ejemplo, en Lundblad, R., Chemical Reagents for Protein Modification, 3a edición, CRC Press, 2005, incluido aquí como referencia. Entre las posibles modificaciones químicas de los aminoácidos se encuentran la acilación, amidinación, piridoxilación de la Usina, alquilación por reducción, trinitrobencilación de los grupos amino con ácido 2,4,6-trinitrobencenosulfónico (TNBS), amidación de los grupos carboxílicos y modificación su If h id rílica de la cisteína en ácido cisteico mediante la oxidación con ácido perfórmico, formación de derivados de mercurio, formación de disulfuros mixtos con otros compuestos de tiol, reacción con maleimida, carboximetilación con ácido iodoacético o iodoacetamida y carbamoilación con cianato en un medio de pH alcalino, entre otras. En este sentido, se remite a la persona especializada al capítulo 15 de Current Protocols In Protein Science, Eds. Coligan y colaboradores (John Wiley & Sons NY 1995-2000) para consultar metodologías más amplias en relación con la modificación química de las proteínas.

La modificación de péptidos y proteínas terapéuticos con PEG se suele asociar a la prolongación de la semivida circulatoria, mientras que la interconexión de las proteínas con glutaraldehído, diacrilato de polietilenglicol y formaldehído se aplica en la preparación de hidrogeles. La modificación química de alérgenos para inmunoterapia se suele lograr mediante la carbamoilación con cianato de potasio.

En general, los péptidos y las variantes (al menos las que contienen enlaces peptídicos entre los residuos de aminoácidos) se pueden sintetizar, por ejemplo, mediante síntesis peptídica en etapa sólida con el método de Fmoc-poliamida, tal y como se explica en Lu y colaboradores, J. Org. Chem. (1981), 46, 3433-3436 y la bibliografía ahí contenida.

La purificación se puede realizar mediante técnicas, o combinación de técnicas, tal como la recristalización, cromatografía de exclusión por tamaño, la cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de interacción hidrofóbica y, normalmente, cromatografía líquida de alto rendimiento en etapa invertida, utilizando, por ejemplo, separación por gradiente de agua/acetonitrilo.

El análisis de los péptidos puede efectuarse mediante cromatografía en capa fina, electroforesis - en particular, electroforesis capilar -, extracción en etapa sólida (CSPE), cromatografía líquida de alto rendimiento en etapa invertida, análisis de los aminoácidos tras hidrólisis ácida mediante espectrometría de masas por bombardeo con átomos rápidos (FAB), así como con análisis por espectrometría de masas MALDI y ESI-Q-TOF.

Otro aspecto más de la invención consiste en proporcionar un ácido nucleico (es decir, un polinucleótido) que codifica un péptido o variante de la invención. El polinucleótido puede ser, en forma monocatenario o binaria, ADN, ADNc, PNA, CNA o ARN, por ejemplo, o tratarse de formas nativas o estabilizadas de polinucleótidos, tal como, por ejemplo, polinucleótidos con un esqueleto de fosforotioato, o combinaciones de las mismas, y puede tanto contener intrones como no contenerlos, siempre que codifique el péptido. Obviamente, el polinucleótido sólo codifica péptidos que contengan residuos de aminoácido naturales unidos por enlaces peptídicos también naturales. Otro aspecto de la invención consiste en proporcionar un vector de expresión capaz de expresar un polipéptido conforme a la invención. Suponemos que el experto en la técnica conoce los vectores de expresión apropiados para los distintos tipos de células y que puede seleccionarlos sin necesidad de experimentación excesiva.

Generalmente, el ADN se inserta en un vector de expresión tal como, por ejemplo, un vector plasmídico, con la orientación adecuada y el marco de lectura correcto para la expresión. Si es necesario, el ADN puede unirse a las secuencia de nucleótidos adecuadas de control regulatorio de la transcripción y la traducción reconocidas por el huésped deseado, aunque tales controles suelen estar disponibles en el vector de expresión. El vector se introduce entonces en el huésped mediante las técnicas habituales. Se encontrarán orientaciones al respecto en la obra de Sambrook y colaboradores Molecular Cloning, a Laboratory Manual (1989, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Nueva York).

En una modalidad preferida particularmente de la presente invención, sin embargo, la composición farmacéutica que comprenda al menos dos péptidos que consisten de las secuencias de aminoácidos conforme a las secuencias SEC ID No. 1 a SEC ID No. 12.

El experto en la técnica puede determinar la cantidad óptima de cada péptido que se debe incluir en la vacuna, así como el régimen de dosificación más adecuado, sin necesidad de experimentar excesivamente. Por ejemplo, se puede preparar el péptido o su variante para su administración mediante inyección intravenosa (iv), subcutánea (se), intradérmica (id), intraperitoneal (ip) o inyección intramuscular (¡m). Las vías preferidas para la inyección del péptido son, en orden de preferencia: subcutánea, intradérmica, intraperitoneal, intramuscular e intravenosa; y las preferidas para la inyección de ADN son, en orden de preferencia: intradérmica, intramuscular, subcutánea, intraperitoneal e intravenosa. Se pueden administrar dosis de péptido y dependerá del péptido respectivo o ADN por ejemplo de entre 1 y 500 mg y 50 pg y 1.5 mg, preferiblemente 125 pg a 500 pg, del péptido o ADN y dependerá del péptido respectivo o ADN. En ensayos anteriores se utilizaron dosis de este intervalo (Brunsvig PF, S Aamdal, Gjertsen MK, G Kvalheim, C J- arkowski Grimsrud, Sve I, M Dyrhaug, S Trachsel, M Moller, Eriksen JA, Gaudernack G; Telomerase peptide vaccination: a phase l/ll; un estudio en pacientes con cáncer de pulmón no microcítico; Cáncer Immunol. 2006; 55(12): 1553 - 1564; M. Staehler, A. Stenzl, P. Y. Dietrich, T. Eisen, A. Haferkamp, J. Beck, A. Mayer, S. Walter, H. Singh, J. Frisch, C. G. Stief; Estudio de una etiqueta abierta para evaluar la seguridad e inmunogenicidad de la vacuna contra el cáncer basados en péptidos IMA901, meeting ASCO 2007, Abstract No 3017) .

Las composiciones farmacéuticas de la presente invención se pueden elaborar de forma que la selección, número y/o cantidad de péptidos presentes en las mismas sean específicos del tejido, cáncer y/o paciente. Por ejemplo, las pautas de expresión de las proteínas precursoras en un tejido dado pueden servir de guía para la selección exacta de los péptidos con el fin de evitar efectos secundarios. La selección puede depender del tipo de cáncer específico que el paciente sufra, así como del estado de la enfermedad, regímenes de tratamiento anteriores, estado inmunitario del paciente y, naturalmente, el haplotipo HLA del paciente. Además, la vacuna conforme a la invención puede contener componentes individualizados, conforme a las necesidades personales del paciente. Ejemplos de ello son distintas cantidades de péptidos conforme a la expresión de los TAA relacionados en tales pacientes, efectos secundarios indeseados debido a alergias del paciente u otros tratamientos, y ajustes para tratamientos secundarios después de un primer ciclo o esquema de tratamiento.

Para las composiciones que se vayan a usar como vacuna para el glioblastoma (GBM), por ejemplo, los péptidos cuyas proteínas precursoras se expresen en cantidades altas en los tejidos normales se evitarán o estarán presentes en pequeñas cantidades, en la composición de la invención. Por otro lado, si se sabe que el tumor de un paciente expresa altas concentraciones de una proteína determinada, la composición farmacéutica correspondiente para el tratamiento de este tipo de cáncer podrá estar presente en altas concentraciones y/o se podrá incluir más de un péptido específico de esta proteína en particular o del sistema de transducción de esta proteína. El experto en la técnica será capaz de seleccionar las combinaciones preferidas de péptidos inmunógenos por medio del análisis, por ejemplo, de la generación de linfocitos T in vitro así como su eficacia y presencia global, la proliferación, afinidad y expansión de determinados linfocitos T ante determinados péptidos, y la funcionalidad de los linfocitos T; por ejemplo, analizando la producción de IFN-gamma (ver también los ejemplos más abajo). Normalmente, los péptidos más eficaces acaban combinándose como vacuna para los propósitos descritos anteriormente.

Una vacuna adecuada contendrá preferiblemente entre 1 y 20 péptidos; más preferiblemente 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ó 20 péptidos distintos; aún más preferiblemente 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 ó 14 péptidos distintos y, con la mayor preferencia, 10, 11, 12, 13 ó 14 péptidos distintos. La longitud del péptido para una vacuna contra el cáncer puede ser cualquier longitud apropiada, como se describe en el presente documento. En particular, podrá ser un péptido adecuado de 9 unidades monoméricas, o un péptido adecuado de 8, 9, 10 u 11 unidades monoméricas o de 12, 13, 14 ó 15 unidades monoméricas. También se pueden utilizar péptidos más largos. Tal y como se describe en las Tablas 4 y 5 adjuntas a este documento, se prefieren los péptidos de 9 y 10 unidades para el complejo principal de histocompatibilidad (MHC) de clase I y los péptidos de 12 y 15 unidades para el MHC de clase II.

El/los péptidos constituyen una vacuna contra un tumor o un cáncer. Puede administrarse directamente al paciente, en el órgano afectado o sistémicamente; o aplicarse ex vivo en células del paciente o de una línea celular humana que después se administra al paciente; o usarse in vitro para seleccionar una subpoblación de células inmunes del paciente, al que luego se le vuelven a administrar.

El péptido puede ser sustancialmente puro o estar combinado con un adyuvante inmunoestimulante (ver más abajo) o puede ser utilizado en combinación con citocinas inmunoestimulantes o podría ser administrado con un sistema de liberación adecuado como, por ejemplo, liposomas. El péptido también podrá conjugarse con un vehículo apropiado como la hemocianina de lapa californiana (KLH) o el mañano (ver el documento WO 95/18145 y Longenecker y colaboradores (1993) «Ann. NY Acad. Sci. » 690, 276-291). El péptido también podrá estar etiquetado, o ser una proteína de fusión o una molécula híbrida. Se espera que los péptidos cuya secuencia se da en la presente invención estimulen los linfocitos T CD4 ó los CTL CD8. Sin embargo, la estimulación es más eficiente con la ayuda de linfocitos T positivos para el CD opuesto. Así, para epítopos de MHC de clase II que estimulan los linfocitos T CD4, las secciones o la pareja de fusión de una molécula híbrida proporciona de forma adecuada epítopos que estimulan a los linfocitos T CD8 + . Por otro lado, en el caso de los epítopos de MHC de clase I que estimulan CTL CD8, las secciones o la pareja de fusión de una molécula híbrida proporciona de forma adecuada epítopos que estimulan a los linfocitos T CD4+. Los epítopos estimulantes de CD4 y CD8 son conocidos por los expertos en la técnica e incluyen a los identificados en la presente invención.

Los vehículos aceptables farmacéuticamente se conocen bien y suelen ser líquidos, en los que se formula un agente terapéutico activo. Normalmente, el vehículo no añade ningún tipo de actividad farmacológica a la formulación, aunque puede proporcionar estabilidad química y/o biológica, características de liberación, y similares. Se pueden encontrar formulaciones de ejemplo, entre otras, en la obra de Alfonso R. Gennaro Remington. The Science and Practice of Pharmacy, 20a edición, Baltimore, MD, Lippincott Williams & Wilkins, 2000, y se incluyen, sin limitarse a ellas: solución salina, agua, agua amortiguada, glicina al 0.3%, ácido hialurónico, dextrosa y similares. Recientemente se descubrió que determinadas emulsiones grasas, que se han utilizado durante muchos años para la nutrición intravenosa de pacientes humanos, también pueden actuar como vehículo de los péptidos. Dos ejemplos de tales emulsiones son Intralipid y Lipofundin, disponibles en el mercado. Intralipid es una marca registrada de Kabi Pharmacia (Suecia) de una emulsión de grasas para nutrición intravenosa, que se describe en la patente de Estados Unidos de Norteamérica No. 3,169,094. Lipofundin es una marca registrada de B. Braun Melsungen (Alemania). Ambas contienen aceite de soja como grasa (100 ó 200 g en 1,000 mi de agua destilada: 10% ó 20%, respectivamente). En Intralipid se utilizan fosfolípidos de yema de huevo como emulsionantes (12 g/l de agua destilada) y, en Lipofundin, lecitina de yema de huevo (12 g/l de agua destilada). La isotonicidad se consigue añadiendo glicerol (25 g/l), tanto en Intralipid como en Lipofundin.

Para desencadenar una respuesta inmune, normalmente es necesario incluir adyuvantes que aumenten la capacidad inmunógena de la composición. De esta forma, en una modalidad preferida de la invención, la composición farmacéutica comprende además, al menos, un adyuvante adecuado.

Entre los adyuvantes adecuados se incluyen, entre otros, 1018 ISS, sales de aluminio, Amplivax®, AS15, BCG, CP-870,893, CpG7909, CyaA, dSLIM, flagelina o ligandos TLR5 derivados de la flagelina, ligando FLT3, G -CSF, IC30, IC31, Imiquimod (ALDARA®), resiquimod, ImuFact IMP321, interleucinas como IL-2, IL-13, IL-21, interferón alfa o beta o derivados pegilados de los mismos, IS Patch, ISS, ISCO ATRIX, ISCOMs, Juvlmmune, LipoVac, MALP2, MF59, lípido monofosforilo A, Montanide IMS 1312, Montanide ISA 206, Montanide ISA 50V, Montanide ISA-51, emulsiones de agua en aceite y de aceite en agua, OK-432, OM-174, OM-197-MP-EC, ONTAK, OspA, sistema de vectores PepTel®, micropartículas de dextrano y basadas en poli(láctido co-glicólido) [PLG], talactoferrina SRL172, virosomas y otras partículas similares a virus, YF-17D, VEGF trap, R848, beta- glucano, Pam3Cys, estimulón QS21 de Aquila, que deriva de la saponina, miméticos sintéticos de la pared bacteriana y extractos de micobacterias, y otros adyuvantes patentados como Detox de Ribi, Quil, o Superfos. Se prefieren los adyuvantes como el adyuvante de Freund o el GM-CSF. Se han descrito diversos adyuvantes inmunológicos (por ejemplo, MF59) específicos para las células dendríticas, así como la preparación de los mismos (Aucouturier y colaboradores, 2001; Allison and Krummel, 1995). También se pueden usar citocinas. Diversas citocinas se han vinculado directamente con la influencia en la migración de las células dendríticas a los tejidos linfoides (por ejemplo, TNF-), la aceleración de la maduración de las células dendríticas a células presentadoras de antígeno eficientes para los linfocitos T (por ejemplo, GM-CSF, IL- e IL-4) (patente de EE.UU. No. 5,849,589, incluida aquí específicamente por referencia en su totalidad) y que actúan como inmunoadyuvantes (por ejemplo, IL-12, IL-15, IL-23, IL-7, IFN-alfa o IFN-beta) (Gabrilovich y colaboradores, 1996).

También se sabe que los oligonucleótidos de CpG inmunoestimulantes potencian los efectos de los adyuvantes en el entorno de una vacuna. Sin quedar restringido a consideraciones teóricas, los oligonucleótidos de CpG actúan activando el sistema inmune innato (no adaptativo) a través de los receptores toll-like (TLR), principalmente el TLR9. La activación del TLR9 impulsada por CpG potencia las respuestas celular y humoral específicas de antígeno frente a una amplia variedad de antígenos, incluyendo antígenos peptídicos o proteínicos, virus vivos o muertos, vacunas de células dendríticas, vacunas celulares autólogas y conjugados de polisacáridos en vacunas tanto profilácticas como terapéuticas. Más importante aún es el hecho de que potencia la maduración y la diferenciación de las células dendríticas, lo que da como resultado una mayor activación de las células TH1 y una fuerte generación de CTL, incluso sin la ayuda de los Mnfocitos T CD4. El sesgo hacia TH1 inducido por la estimulación del TLR9 se mantiene incluso en presencia de adyuvantes vacúnales como el aluminio o el adyuvante de Freund incompleto (IFA), que normalmente tienden a decantar la respuesta hacia TH2. Los oligonucleótidos de CpG muestran una actividad adyuvante aún mayor cuando se formulan o se administran conjuntamente con otros adyuvantes o en formulaciones como micropartículas, nanopartículas, emulsiones lipídicas o formulaciones similares, que son especialmente necesarias para inducir una respuesta potente cuando el antígeno es relativamente débil. También aceleran la respuesta inmune y permiten que las dosis de antígeno se reduzca en dos órdenes de magnitud, aproximadamente, con respuestas de anticuerpos comparables a las de la dosis completa de vacuna sin CpG en algunos experimentos (Krieg, 2006). La patente de Estados Unidos de Norteamérica No. 6,406,705 B1 describe el uso combinado de oligonucleótidos de CpG, adyuvantes sin ácidos nucleicos y un antígeno para estimular una respuesta inmune específica de antígeno. Un componente preferido de la composición farmacéutica de la presente invención es un antagonista CpG del TLR9 conocido como dSLIM (inmunomodulador en horquilla doble), fabricado por Mologen (Berlín, Alemania). También es posible utilizar otras moléculas de unión a TLR como ARN que se une a los TLR 7, TLR 8 y/o TLR 9.

Estos ejemplos de adyuvantes útiles también se incluyen CpG modificados químicamente (por ejemplo, CpR, Idera), análogos ARNdc como p o I i ( I : C ) y derivados de los mismos (por ejemplo, AmpliGen®, Hiltonol®, poli-(ICLC), poli(IC-R), po I i ( I : C 12U), ARN o ADN bacteriano sin CpG así como anticuerpos y moléculas pequeñas inmunoactivas como ciclofosfamida, sunitinib, bevacizumab, celebrex, NCX-4016, sildenafilo, tadalafilo, vardenafilo, sorafenib, temozolomida, temsirolimus, XL-999, CP-547632, pazopanib, VEGF Trap, ZD2171, AZD2171, anti-CTLA4, otros anticuerpos que reconocen estructuras clave del sistema inmune (por ejemplo anti-CD40, anti-TGF-beta, anti-receptor TNF-alfa) y SC58175, que pueden actuar de forma terapéutica y/o como adyuvantes. El experto en la técnica puede determinar fácilmente las cantidades y concentraciones de adyuvantes y aditivos útiles en el contexto de la presente invención sin necesidad de experimentación excesiva.

Los adyuvantes preferidos son imiquimod, resiquimod, GM-CSF, ciclofosfamida, sunitinib, bevacizumab, interferón alfa, oligonucleótidos CpG y derivados, p o I i - ( I : C ) y derivados, ARN, sildenafilo, y formulaciones de partículas con PLG o virosomas.

En una modalidad preferida de la composición farmacéutica conforme a la invención, el adyuvante se selecciona del grupo constituido por factores estimulantes de colonias, como el factor estimulante de las colonias de granulocitos-macrófagos (GM-CSF, sargramostim), imiquimod, resiquimod e interferón alfa.

En una modalidad preferida de la composición farmacéutica conforme a la invención, el adyuvante es imiquimod o resiquimod.

En una modalidad preferida de la composición farmacéutica conforme a la invención, el adyuvante es imiquimod o resimiquimod.

En una modalidad preferida de la composición farmacéutica conforme a la invención, el adyuvante es la combinación de GM-CSF e imiquimod.

Las composiciones de la presente invención se pueden administrar por vía parenteral como, por ejemplo subcutánea, intradérmica, intramuscular o intraperitoneal, o bien por vía oral. Para ello, los péptidos y, opcionalmente, otras moléculas son disueltos o suspendidos en un vehículo aceptable farmacéuticamente y preferiblemente acuoso. Además, la composición puede contener excipientes como soluciones amortiguadoras, aglutinantes, disgregantes, diluyentes, aromas, lubricantes, etc. Los péptidos también pueden administrase junto con sustancias estimulantes de la respuesta inmune, como las citocinas. Una lista completa de excipientes utilizables para esta composición aparece, por ejemplo, en A. Kibbe, Handbook of Pharmaceutical Excipients, 3a Ed., 2000, American Pharmaceutical Association and Pharmaceutical Press. La composición puede usarse para la prevención, profilaxis y/o tratamiento de enfermedades adenomatosas o cancerosas, preferiblemente en el cáncer colorrectal.

Las formulaciones preferidas se pueden encontrar por ejemplo, en EP2113253.

Los linfocitos T citotóxicos (CTL) reconocen al antígeno en forma de péptido unido a una molécula de MHC, más que al propio antígeno extraño intacto. La molécula de MHC se encuentra en la superficie celular de una célula presentadora de antígenos (APC). Por lo tanto, la activación del CTL sólo es posible en presencia de un complejo trimérico formado por el antígeno peptídico, la molécula de MHC y la APC. Así pues, se puede potenciar la respuesta inmune utilizando no sólo el péptido para la activación de los CTL, sino añadiendo además la APC con la molécula de MHC correspondiente.

Por lo tanto, la composición farmacéutica conforme a la presente invención contiene además, en una modalidad preferida, al menos una célula presentadora de antígenos.

La célula presentadora de antígenos (o célula estimulante) se caracteriza por tener en su superficie una molécula MHC de clase I o II y, en una modalidad, por no ser capaz de realizar la carga por sí misma de la molécula MHC de clase I o II con el antígeno seleccionado. Tal y como se describe más abajo, la molécula MHC de clase I o II puede cargarse fácilmente in vitro con el antígeno seleccionado.

Preferiblemente, la célula de mamífero carece o tiene un nivel o función reducida del transportador peptídico TAP. Las células adecuadas que carecen del transportador peptídico TAP incluyen a T2, una línea celular humana deficiente en carga de péptidos que se puede adquirir en la colección American Type Culture Collection (12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, Estados Unidos de Norteamérica), con el No. de catálogo CRL 1992. Las líneas celulares deficientes de TAP como T2 pueden ser usadas como APC, y, debido a la falta de TAP, casi todos los péptidos presentados por el MHC de clase I serán los péptidos examinados usados para la carga externa de las moléculas MHC de clase I vacías de estas líneas celulares, por lo que todos los efectos se podrán atribuir a los péptidos utilizados.

Preferiblemente, las células presentadoras de antígenos son células dendríticas. Las células dendríticas son células dendríticas autólogas sensibilizadas de manera repetida con un péptido antigénico. El péptido antigénico puede ser cualquier péptido antigénico adecuado que desencadene una respuesta adecuada de los linfocitos T. El tratamiento con linfocitos T activados mediante células dendríticas autólogas sensibilizadas de manera repetida con péptidos de un antígeno asociado a un tumor se describe en Murphy y colaboradores (1996) «The Prostate» 29, 371-380 y en Tjua y colaboradores (1997) «The Prostate» 32, 272-278.

Así, en una modalidad preferida de la presente invención, la composición farmacéutica que contiene al menos una célula presentadora de antígeno se sensibiliza o se carga con el péptido. Una forma de hacerlo es, por ejemplo, el método mostrado en el ejemplo 5.

Como una alternativa, la célula presentadora de antígeno comprende un constructo de expresión que codifica el péptido. El polinucleótido puede ser cualquier polinucleótido adecuado y se prefiere que sea capaz de transducir la célula dendrítica, lo que da como resultado la presentación de un péptido y la inducción de la inmunidad.

Convenientemente, un ácido nucleico de la invención puede encontrarse comprendido en un virus o en un polinucleótido viral. Por ejemplo, se ha demostrado que las células dendríticas transducidas con adenovirus desencadenan una inmunidad antitumoral específica de antígeno frente a MUC1 (ver Gong y colaboradores

[1997] «Gene Ther. 4, 1023-1028). De forma similar, pueden usarse sistemas basados en adenovirus (ver, por ejemplo, Wan y colaboradores

[1997] «Hum. Gene Ther.» 8, 1355-1363); sistemas retrovirales (Koch y colaboradores

[2006], J. Exp. Med. 186, 1213-1221 y Szabolcs y colaboradores

[1997]); transferencia a células dendríticas mediada por partículas sanguíneas (Tuting

[1997], Eur. J. Immunol. 27, 2702-2707) y también ARN (Ashley y colaboradores

[2007] J. Exp. Med. 186, 1177-1182).

Generalmente, una composición farmacéutica de la invención que contiene ácidos nucleicos de la invención puede administrarse de forma similar a las que contienen péptidos de la invención. La forma de administración puede ser, por ejemplo: intravenosa, intraarterial, intraperitoneal, intramuscular, intradérmica, intratumoral, oral, dérmica, nasal, yugal, rectal, vaginal, por inhalación o administración tópica.

Diversos mecanismos de evasión hacen que un tumor desarrolle a menudo una resistencia al tratamiento. La resistencia farmacológica puede darse durante el tratamiento y se manifiesta mediante metástasis y tumores recurrentes. Con el fin de evitar tal resistencia, el tumor se suele tratar con una combinación de fármacos, mientras que las metástasis y tumores que aparecen tras un periodo sin enfermedad se tratan con una combinación distinta. Por lo tanto, en un aspecto de la invención, la composición farmacéutica se administra en conjunción con un segundo agente anticanceroso. Este segundo agente se puede administrar antes, después o al mismo tiempo que la composición farmacéutica de la invención. La administración simultánea se puede efectuar, por ejemplo, mediante la mezcla de la composición farmacéutica de la invención con el segundo agente anticanceroso, siempre que las propiedades químicas sean compatibles. Otra forma de administración simultánea consiste en administrar el mismo día la composición y el agente anticanceroso por vías distintas, de forma que, por ejemplo, la composición farmacéutica se inyecte y el segundo agente se administre por vía oral. La composición farmacéutica y el segundo agente anticanceroso también pueden ser administrados como parte del mismo ciclo de tratamiento pero en días diferentes y/o como parte de ciclos de tratamiento distintos.

Otro aspecto de la presente invención proporciona un método para tratar o prevenir un cáncer en un paciente, método que comprende la administración al paciente de una cantidad terapéuticamente eficaz de cualquiera de las composiciones farmacéuticas de la invención.

Una cantidad terapéuticamente eficaz consistirá en una cantidad suficiente para desencadenar una respuesta inmune, en particular la activación de una subpoblación de CTL. El experto en la técnica podrá determinar con facilidad si una cantidad es efectiva mediante los métodos inmunológicos habituales, como los que se proporcionan en los ejemplos de las presentes especificaciones. Otra forma de monitorizar el efecto de una determinada cantidad de composición farmacéutica consiste en observar el crecimiento del tumor tratado y/o su recurrencia.

En una modalidad particularmente preferida de la presente invención, la composición farmacéutica se utiliza como vacuna anticancerosa.

La composición que contiene péptidos o ácidos nucleicos codificadores del péptido también puede constituir una vacuna antitumoral o anticancerosa. Puede administrarse directamente al paciente, en el órgano afectado o sistémicamente; o aplicarse ex vivo en células del paciente o de una línea celular humana que después se administra al paciente; o ser usada in vitro para seleccionar una subpoblación de células inmunitarias del paciente, al que luego se le vuelve administrar.

La composición de la invención puede utilizarse en un método para tratar el cáncer o como vacuna anticancerosa. El cáncer puede ser un carcinoma de próstata, carcinomas de la cavidad bucal, carcinoma escamoso oral (OSCC), leucemia mieloide aguda (LMA) (Qian y colaboradores, 2009), linfoma MALT inducido por H. pylori (Banerjee y colaboradores, 2000), carcinoma de colon/cáncer colorrectal, glioblastoma, cáncer de pulmón no microcítico (CPNM), carcinoma cervicouterino, cáncer de mama humano, cáncer de próstata, cáncer de colon, cáncer de páncreas, adenocarcinoma ductal pancreático, cáncer de ovario, carcinoma hepatocelular, cáncer de hígado, tumores cerebrales de diferentes serotipos, leucemias como la leucemia linfoblástica aguda (LLA), cáncer de pulmón, sarcoma de Ewing, cáncer de endometrio, carcinoma epidermoide de cabeza y cuello, cáncer epitelial de la laringe, carcinoma esofágico, carcinoma oral, carcinoma de la vejiga urinaria, carcinoma de ovario, carcinoma de células renales, meningioma atípico, carcinoma papilar de tiroides, tumores cerebrales, carcinoma de los conductos salivales, linfomas de linfocitos T/células NK extraganglionares, linfoma no Hodgkiniano y tumores sólidos malignos de pulmón y mama, preferiblemente el cáncer es cáncer gástrico.

En la modalidad más preferida del método de tratamiento o de vacuna conforme a la invención, la vacuna es una vacuna antitumoral multipeptídica para el tratamiento del CG. Preferiblemente, la vacuna comprende un grupo de péptidos asociados a tumores seleccionados de las secuencias SEC ID No. 1 a 11 que se encuentran y han sido identificadas en células primarias de CG. Este grupo incluye péptidos HLA de clase I y clase II. El grupo de péptidos también puede contener al menos un péptido, como el del antígeno central del virus de la hepatitis B (SEQ ID 23), utilizado como control positivo que actúa como marcador inmunitario para probar la eficiencia de la administración intradérmica. En una modalidad particular, la vacuna consiste en 11 péptidos individuales (conforme a las secuencias SEC ID No. 1 a 11) con entre 1500 pg a 75 pg aproximadamente; preferiblemente entre 1000 Mg a 175 pg aproximadamente; más preferiblemente, entre 500 µg a 600 pg aproximadamente y, mas preferiblemente, unos 578 pg de cada péptido, todos ellos pueden ser purificados por HPLC y cromatografía de intercambio iónico y aparecer como polvo blanco o casi blanco. El liofilizado se disuelve preferentemente en hidrogenocarbonato de sodio y es utilizado para su inyección ¡ntradérmica en los 30 minutos posteriores a su reconstitución a temperatura ambiente. Conforme a la presente invención, las cantidades preferidas de péptidos pueden variar entre aproximadamente 0.1 y 100 mg, preferiblemente entre 0.1 y 1 mg y, más preferiblemente, entre 300 µg y 800 g por 500 µ? de solución. Con el término «aproximadamente» se quiere significar un porcentaje de +/- 10 por ciento del valor dado, si no se define de otra forma. El experto en la técnica sabrá ajustar la cantidad real de péptido necesaria basándose en diversos factores como, por ejemplo, el estado inmunitario del paciente y/o la cantidad de TUMAP que presenta un tipo particular de cáncer. Los péptidos de la presente invención podrían suministrarse en otras formas adecuadas (soluciones estériles, etc.), en lugar del liofilizado.

Las composiciones farmacéuticas constan de péptidos, ya sea en forma libre o en forma de sal aceptable farmacéuticamente.

Tal y como se utiliza en el presente documento, una «sal aceptable farmacéuticamente» hace referencia a un derivado de los péptidos mostrados en donde el péptido se modifica elaborando sales ácidas o básicas del agente. Por ejemplo, las sales ácidas se preparan a partir de la base libre (normalmente, en los casos en que la forma neutra del medicamento presenta un grupo -NH2 neutro), lo que implica la reacción con un ácido adecuado. Los ácidos adecuados para preparar sales ácidas incluyen tanto los ácidos orgánicos, como por ejemplo ácido acético, propiónico, glicólico, pirúvico, oxálico, málico, malónico, succínico, maléico, fumárico, tartárico, cítrico, benzoico, cinnámico, mandélico, metanosulfónico, etanosulfónico, p-toluenosulfónico, salicílico y similares, como también los inorgánicos, como por ejemplo clorhídrico, bromhídrico, sulfúrico, nítrico, fosfórico y similares. A la inversa, las sales básicas de las fracciones ácidas que pueden estar presentes en un péptido se preparan utilizando una base aceptable farmacéuticamente, como por ejemplo hidróxido de sodio, hidróxido de potasio, hidróxido de amonio, hidróxido de calcio, trimetilamina o similares.

En otra modalidad, las composiciones farmacéuticas comprenden los péptidos en forma de sales de ácido acético (acetatos), amonio o ácido clorhídrico (cloruros).

En otra modalidad, una composición farmacéutica de la presente invención podría incluir azúcares, alcoholes de azúcar, aminoácidos como la glicina, la arginina, el ácido glutámico y otros como formadores estructurales. Los azúcares pueden ser monosacáridos, disacáridos o trisacáridos. Estos azúcares pueden usarse aislados o en combinación con alcoholes de azúcar. Entre los monosacáridos se incluyen la glucosa, mañosa, galactosa, fructosa o sorbosa; entre los disacáridos, sacarosa, lactosa, maltosa o trehalosa y, entre los trisacáridos, la rafinosa. Un alcohol de azúcar podría ser, por ejemplo, la manitosa. Los ingredientes preferidos son la sacarosa, lactosa, maltosa, trehalosa, manit y/o sorbit, y, con mayor preferencia, manitol.

Además, las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden incluir excipientes bien tolerados fisiológicamente (ver Handbook of Pharmaceutical Excipients, 5a edición, editado por Raymond Rowe, Paul Sheskey y Sian Owen, 2006, Pharmaceutical Press), tales como antioxidantes como ácido asórbico o glutatión, conservantes como fenol, m-cresol, metil- o propilparabeno, clorobutanol, tiomersal o cloruro de benzalconio, estabilizante, formadores estructurales como sacarosa, lactosa, maltosa, trehalosa, manitosa, manit y/o sorbit, manit y/o lactosa y solubilizadores tal como los polietilenglicoles (PEG), esto es, PEG 3000, 3350, 4000 ó 6000, o ciclodextrinas, esto es, hidroxipropil-B-ciclodextrina, sulfobutiletil- -ciclodextrina o ?-ciclodextrina, o dextranos o poloxaómeros, esto es, poloxaómero 407, poloxámero 188, ó Tween 20, Tween 80. En una modalidad preferida, las composiciones farmacéuticas de la presente invención incluyen uno o varios excipientes bien tolerados, seleccionados del grupo que consiste en antioxidantes, formadores estructurales y estabilizantes.

El intervalo de pH aceptable es pH 2 - 12 para la administración intravenosa e intramuscular, pero por vía subcutánea se reduce a 2.7 - 9.0, como la tasa de dilución in vivo disminuye y genera un mayor potencial para la irradiación en el sitio de inyección. Strickley Robert G., Pharm. Res., 21, NO: 2, 201 - 230 (2004).

La preparación farmacéutica de la presente invención que comprende péptidos y/o uno/varios ácidos nucleicos conforme la invención se administra a un paciente con enfermedad adenomatosa o cancerosa asociada al antígeno o al péptido correspondiente. Así puede desencadenarse una respuesta inmune mediada por los linfocitos T.

Se prefiere una composición farmacéutica conforme a la invención en donde la cantidad de péptidos (asociados a tumores, en particular), ácidos nucleicos de acuerdo a la invención o vectores de expresión de acuerdo a la invención presentes en la composición es/son específicos de tejidos, cáncer y/o pacientes.

En otra modalidad de la invención, la vacuna es una vacuna de ácidos nucleicos. Se sabe que la inoculación de una vacuna de ácidos nucleicos como una vacuna de ADN, que codifique un polipéptido provoca una respuesta de los linfocitos T. Puede administrarse directamente al paciente, en el órgano afectado o sistémicamente; o aplicarse ex vivo en células del paciente o de una línea celular humana que después se administra al paciente; o usarse in vitro para seleccionar una subpoblación de células inmunes del paciente, al que luego se le vuelven a administrar. Si el ácido nucleico es administrado in vitro a las células, puede resultar útil que éstas sean transfectadas para coexpresar citocinas inmunoestimulantes, como la interleucina-2 ó el GM-CSF. El ácido nucleico puede ser sustancialmente puro o estar combinado con un adyuvante inmunoestimulante, o puede ser utilizado en combinación con citocinas inmunoestimulantes o administrado con un sistema de liberación adecuado como, por ejemplo, liposomas. La vacuna de ácidos nucleicos también puede administrarse con un adyuvante como los descritos más arriba para vacunas peptídicas. Se prefiere que la vacuna de ácidos nucleicos se administre sin adyuvantes.

El polinucleótido puede ser substancialmente puro o estar contenido en un vector o en un sistema de liberación adecuados. Entre los vectores y los sistemas de liberación adecuados se encuentran los virales, como los sistemas basados en adenovirus, virus vaccinia, retrovirus, virus del herpes, virus adenoasociados o híbridos que contengan elementos de más de un virus. Los sistemas de liberación no virales incluyen lipidos catiónicos y polímeros catiónicos, conocidos por los expertos en la liberación de ADN. La liberación física por medio de una «pistola genética», por ejemplo, también puede usarse. El péptido o el péptido codificado por el ácido nucleico puede ser una proteína de fusión, por ejemplo con un epítopo del toxoide tetánico que estimule los linfocitos T CD4 + .

Cualquier ácido nucleico administrado al paciente debe ser estéril y apirógeno. El ADN desnudo puede ser administrado por vía intramuscular, intradérmica o subcutánea. Convenientemente, la vacuna de ácidos nucleicos puede comprender cualquier medio de liberación adecuado del ácido nucleico. El ácido nucleico, preferiblemente ADN, también puede administrarse en un liposoma o como parte de un sistema de liberación con vector viral. Es preferible que la vacuna de ácidos nucleicos, como la vacuna de ADN, se administre en el músculo, mientras que las vacunas de péptidos se administren preferiblemente por vía subcutánea o intradérmica . También es preferible que la vacuna se administre en la piel.

Se cree que la absorción del ácido nucleico y la expresión del polipéptido codificado en el mismo por parte de las células especializadas en la presentación de antígenos, como las células dendríticas, puede ser el mecanismo para activar la respuesta inmune. No obstante, es posible que las células dendríticas no queden transfectadas, pero aun así son importantes, ya que pueden captar el péptido expresado por otras células transfectadas en el tejido (sensibilización cruzada, por ejemplo, Thomas AM, Santarsiero LM, Lutz ER, Armstrong TD, Chen YC, Huang LQ, Laheru DA, Goggins M, Hruban RH, Jaffee E . «Mesothelin-specific CD8( + ) T-cell responses provide evidence of in vivo cross-priming by antigen-presenting cells in vaccinated pancreatic cáncer patients». J. Exp. Med., 2 de agosto de 2004; 200(3):297-306).

La terapia de inmunización contra el cáncer por medio de polinucleótidos se describe en Conry y colaboradores (1996) «Seminars in Oncology» 23, 135-147; Condón y colaboradores (1996) «Nature Medicine» 2, 1122-1127; Gong y colaboradores (1997) «Nature Medicine» 3, 558-561; Zhai y colaboradores (1996) «J. Immunol. » 156, 700-710; Graham y colaboradores (1996) «Int J. Cáncer» 65, 664-670; y Burchell y colaboradores (1996) pp 309-313 In: Breast Cáncer, Advances ¡n biology and therapeutics, Calvo y colaboradores (Eds.), John Libbey Eurotext, todos ellos incluidos aquí íntegramente como referencia.

También puede ser útil el objetivo de la vacuna hacia poblaciones específicas de células como, por ejemplo, hacia células presentadoras de antígenos, o bien por medio del sitio de inyección, el uso de vectores y sistemas de liberación dirigidos, o por purificación selectiva de tal población de células del paciente y la administración ex vivo del péptido o del ácido nucleico (las células dendríticas, por ejemplo, pueden seleccionarse tal y como se describe en Zhoy y colaboradores

[1995] «Blood» 86, 3295-3301; o en Roth y colaboradores

[1996] «Scand. J. Immunology» 43, 646-651). Por ejemplo, los vectores dirigidos pueden comprender un promotor específico de tumor o de tejido que dirija la expresión del antígeno al lugar adecuado.

Finalmente, la vacuna conforme a la invención puede depender del tipo de cáncer específico que el paciente sufra así como del estado de la enfermedad, regímenes de tratamiento anteriores, el estado inmunitario del paciente y, naturalmente, el haplotipo HLA del paciente. Además, la vacuna conforme a la invención puede contener componentes individualizados, conforme a las necesidades personales del paciente. Ejemplos de ello son distintas cantidades de péptidos conforme a la expresión de los TAA relacionados en tales pacientes, efectos secundarios no deseados debido a alergias del paciente u otros tratamientos y ajustes para tratamientos secundarios después de in primer ciclo o esquema de tratamiento.

Además de su utilidad para el tratamiento del cáncer, los péptidos de la presente invención también son útiles con fines diagnósticos. Debido a que los péptidos se generaron a partir del glioblastoma y que se determinó que no estaban presentes en los tejidos normales, estos péptidos pueden usarse para diagnosticar la presencia de un cáncer.

La presencia de los péptidos de la presente invención en biopsias de tejidos puede ayudar al patólogo en el diagnóstico del cáncer. El patólogo puede saber si el tejido es maligno o está inflamado o afectado en general por medio de la detección de determinados péptidos de la presente invención con anticuerpos, espectrometría de masas u otros métodos conocidos por los expertos en la técnica. La presencia de grupos de péptidos de la presente invención puede permitir la clasificación o subclasificación de los tejidos enfermos.

La detección de los péptidos de la presente invención en muestras de tejido enfermo permite decidir acerca del beneficio de terapias que impliquen al sistema inmune, especialmente si se sabe o se espera que los linfocitos T estén implicados en el mecanismo de acción. La pérdida de expresión de MHC es un mecanismo bien conocido mediante el cual las células malignas o infectadas escapan a la vigilancia del sistema inmune. De esta forma, la presencia de los péptidos de la presente invención demuestra que las células analizadas no hacen uso de este mecanismo.

Los péptidos de la presente invención pueden utilizarse para analizar las respuestas de los linfocitos contra los péptidos de la presente invención, como las respuestas de los linfocitos T o de los anticuerpos contra los péptidos de la presente invención o los péptidos de la presente invención unidos a moléculas de MHC. Estas respuestas linfocitarias pueden usarse como marcadores de pronóstico para decidir las siguientes etapas de la terapia. Estas respuestas también pueden usarse como marcadores indirectos en enfoques inmunoterapéuticos dirigidos a inducir respuestas de linfocitos por medios distintos, como, por ejemplo, mediante vacunación con proteínas, ácidos nucleicos, material autólogo o la transferencia de linfocitos a un receptor. En la terapia génica, las respuestas de los linfocitos contra los péptidos de la presente invención se pueden tener en cuenta en el momento de valorar los efectos secundarios. La monitorización de las respuestas de los linfocitos también puede ser una herramienta útil en los estudios de seguimiento de terapias de trasplante, como, por ejemplo, para detectar enfermedades del injerto contra el huésped y del huésped contra el injerto.

En aún otro aspecto de la presente invención hace referencia a un equipo que comprende (a) un contenedor con una composición farmacéutica como la descrita más arriba, en forma de solución o liofilizada; (b) opcionalmente, un segundo contenedor con solución reconstituyente o diluyente para la formulación liofilizada; y (c), opcionalmente, instrucciones de (i) uso de la solución o de (ii) reconstitución y/o uso de la formulación liofilizada. El equipo puede constar, además, de uno o varios (iii) amortiguadores, (iv) diluyentes, (v) filtros, (vi) agujas o (v) jeringuillas. Se prefiere que el contenedor sea una botella, un frasco, una jeringuilla o un tubo de ensayo; puede ser multiuso. Se prefiere que la composición farmacéutica esté liofilizada.

Los equipos de la presente invención comprenden, preferiblemente, una formulación liofilizada de la presente invención en un contenedor adecuado e instrucciones para su reconstitución y/o uso. Entre los contenedores apropiados se incluyen, por ejemplo, botellas, frascos (frascos de cámara doble, por ejemplo), jeringuillas (como jeringuillas de cámara doble) y tubos de ensayo. El contenedor puede estar hecho de una variedad de materiales, como vidrio o plástico. Se prefiere que el equipo y/o el contenedor dispongan de instrucciones relacionadas con el contenedor que indiquen cómo utilizarlos y/o realizar la reconstitución. Por ejemplo, la etiqueta puede indicar que la formulación liofilizada debe reconstituirse para obtener las concentraciones de péptido descritas más arriba. La etiqueta también puede indicar que la formulación es útil o está destinada para su administración subcutánea.

El recipiente que contenga la formulación puede ser un frasco multiuso, lo que permite administraciones repetidas (de 2 a 6 administraciones, por ejemplo) de la formulación reconstituida. El equipo puede constar, además, de un segundo contenedor que comprenda un diluyente adecuado (por ejemplo, una solución de bicarbonato sódico).

Al mezclar el diluyente y la formulación liofilizada, la concentración final de péptidos en la formulación reconstituida es, preferiblemente, de al menos 0.15 mg/ml/péptido (= 75 pg) y, preferiblemente, no mayor de 3 mg/ml/péptido (= 1500 pg). El equipo también puede incluir otros materiales deseables desde un punto de vista comercial y del usuario, como otros amortiguadores, diluyentes, filtros, agujas, jeringuillas u otros añadidos con instrucciones de uso.

Los equipos de la presente invención pueden constar de un solo recipiente que contenga la formulación de las composiciones farmacéuticas conforme a la presente invención junto con otros componentes o sin ellos (por ejemplo, otros compuestos o composiciones farmacéuticas de estos otros compuestos), o, por el contrario, pueden constar de recipientes distintos para cada uno de los componentes.

Preferiblemente, los equipos de la invención incluyen una formulación de la invención empaquetada para su uso en combinación con la administración conjunta de un segundo compuesto (tal como adyuvantes [por ejemplo, GM-CSF], un agente quimioterapéutico, un producto natural, una hormona o antagonista, un inhibidor de la angiogénesis, un agente de inducción de apoptosis o un quelante) o una composición farmacéutica de la misma. Los componentes del equipo pueden estar previamente combinados o bien cada componente puede estar contenido en un recipiente distinto antes de la administración al paciente. Los componentes del equipo pueden proporcionarse en una o varias soluciones líquidas, preferiblemente en una solución acuosa y, con mayor preferencia, en una solución acuosa estéril. Los componentes del equipo también se pueden proporcionar en forma de sólido, que se podrán convertir en líquidos mediante la adición de solventes adecuados, que se suministrarán, preferiblemente, en un contenedor distinto.

El contenedor de un equipo terapéutico puede ser un frasco, un tubo de ensayo, un matraz, una botella, una jeringuilla o cualquier otro recipiente que pueda contener un sólido o un líquido. Normalmente, cuando hay más de un componente, el equipo contendrá un segundo frasco u otro contenedor, lo que permite la dosificación por separado. El equipo también puede contener otro recipiente con un líquido aceptable farmacéuticamente. Preferiblemente, el equipo terapéutico contendrá una serie de aparatos (por ejemplo, una o varias agujas, jeringuillas, cuentagotas, pipetas, etc.) que permitan la administración de los agentes de la invención que componen el presente equipo.

La formulación farmacéutica de la presente invención es aquella adecuada para la administración de los péptidos por cualquier vía adecuada como la oral (enteral), nasal, oftálmica, subcutánea, intradérmica, intramuscular, intravenosa o transdérmica. Se prefiere la administración subcutánea y, con mayor preferencia, la intradérmica. Se puede utilizar una bomba de infusión para la administración.

Debe comprenderse que las características de la invención tal y como se describen en el presente documento pueden ser usadas no sólo en la combinación indicada, sino también de forma singular sin alejarse del ámbito deseado de la presente invención. Para cumplir con los objetivos de la presente invención, todas las referencias aquí citadas se incorporan íntegramente.

Ahora se describirá la invención en más detalle, haciéndose referencia a las siguientes figuras, al listado de secuencias y a los ejemplos. Los siguientes ejemplos se ofrecen sólo con fines ilustrativos y no pretenden limitar la invención.

Breve Descripción de las Figuras Figura 1: Análisis tetramérico de la proliferación mediante microesferas de linfocitos CD8+ específicos para CDC2-001 y ASPM-002 obtenidos de sangre periférica de un donante sano. Semanalmente se estimularon los pocilios, cada uno de los cuales contenía 1 x 106 PBMC enriquecidas con CD8 + , con microesferas que llevaban incorporadas anti-CD28 más una alta densidad de antigeno tumoral A*2402/CDC2-001 (panel izquierdo) o anti-CD28 más una alta densidad de antígeno tumoral A*024/ASPM-002 (panel derecho). Después de tres estimulaciones in vitro, se tiñeron todas las células con anticuerpo CD8-FITC, y tetrámeros marcados con fluorescencia A*2402/CDC2-001 y A* 2402/ASPM-002-001. Las células se seleccionaron con los linfocitos CD8 + ; las cifras de las gráficas representan el porcentaje de células en el cuadrante indicado entre los linfocitos CD8+ (células positivas para el multímero).

Figura 2: Unión relativa in vitro de péptidos de 15 unidades monoméricas derivados de IMA-MET-005 e IMA-BIR-002 a los alelos más frecuentes de la HLA-DR. La tecnología Prolmmune REVEAL™ utiliza análisis in vitro de montaje de la HLA-DR para determinar las tasas de asociación del complejo MHC:péptido como determinante principal de la constante de unión de péptidos individuales. El análisis fue realizado por Prolmmune (Oxford, Reino Unido). En un plazo de tiempo determinado, la cantidad de complejos MHC:péptido intactos se mide y se compara con la cantidad correspondiente a un control pasa/no pasa (ligante débil relativo). Como control positivo se incluye un ligante HLA-DR fuerte y promiscuo. Los valores indican la cantidad de unión observada con las moléculas HLA-DR y los péptidos individuales respecto al control pasa/no pasa. Como la tecnología REVEAL™ está limitada a péptidos de 15 unidades monoméricas, se probaron dos elementos solapados de 15 unidades monoméricas (posiciones 2-16; 6-20) en lugar del MET-005 completo.

Figuras 3a y 3b representan la presencia de PSMA y de linfocitos T CD4+ secretores de IFN-? específicos para survivina en células mononucleares de sangre periférica (PBMC) en diferentes plazos de tiempo de un paciente vacunado, determinada con un IFN ?-EMSpot. Plazos de tiempo: antes de la primera vacunación (a) y después de la 3a (b), 6a (c), 7a (d), 8a (e), 9a (f), 10a (g) y 11a (h) vacunación.

Figura 4 muestra la presencia de linfocitos T CD4+ secretores de TNFa, IFN-?, IL-5 e IL-10 específicos para survivina en PBMC en tres plazos de tiempo distintos de un paciente vacunado, que se determinaron mediante el análisis de tinción intracelular (ICS). Plazos de tiempo: después de la 1a (a), 3a (b) y 7a (c) vacunación.

Ejemplos 1. Síntesis Los péptidos se sintetizaron mediante síntesis peptídica en etapa sólida normalizada y bien establecida siguiendo el método de Fmoc. Tras la purificación con RP-HPLC de preparación, se efectuó un procedimiento de intercambio iónico para incorporar contra-iones fisiológicamente compatibles (como acetato, amonio o cloruro). Finalmente, tras la liofilización se obtuvo una sustancia sólida de color blanco o casi blanco. Todos los TUMAP se administran preferiblemente en forma de sales de acetato, siendo posibles también otras formas salinas.

Es importante destacar que la identidad y la pureza de cada péptido han sido determinadas mediante espectrometría de masas y RP-HPLC. Tras el procedimiento de intercambio iónico los péptidos se obtuvieron en forma de liofilizados blancos o casi blancos con las purezas indicadas en Tabla 7: Tabla 7: Con respecto a su estabilidad de todos los péptidos ha sido analizada en diferentes condiciones fisicoquímicas, tales como diferentes temperaturas y valores de ph. 2. Componentes de la Composición Farmacéutica de Ejemplo IMA941 IMA941 está compuesta por un cóctel de péptidos asociados a tumor (TUMAP) sintéticos, la mayoría de los cuales han sido identificados en células primarias de cáncer colorrectal. Los TUMAP incluyen 10 péptidos de unión a HLA de clase I con la capacidad de activar linfocitos T citotóxicos (linfocitos T CD8 + ), 1 péptido de unión a HLA de clase II con la capacidad de activar linfocitos T auxiliares (linfocitos T CD4 + ). Los linfocitos T auxiliares cumplen una función crucial ayudando a la función de los linfocitos T citotóxicos mediante la liberación de citocinas que potencian la función destructora de los linfocitos T CD8 + , y es posible que también actúen directamente contra las células tumorales (Knutson and Disis, 2005). Además de estos 11 péptidos asociados a tumor, IMA941 puede contener un péptido de control viral.

Se analizaron muestras de tejido normal y maligno extraídas quirúrgicamente de pacientes de GBM y la sangre de donantes sanos en varias etapas: En primer lugar, se hizo un análisis de la expresión de ARNm en todo el genoma mediante micromatrices para identificar genes sobreexpresados en el tejido maligno, en comparación con diferentes órganos y tejidos normales. En una segunda etapa, los ligandos HLA del material maligno se identificaron mediante espectrometría de masas. Después, los ligandos HLA identificados se compararon con los datos de expresión génica. Los péptidos codificados por los genes expresados selectivamente o sobreexpresados que se habían detectado en la primera etapa se consideraron candidatos apropiados a péptidos asociados a tumor (TUMAP) para una vacuna multipeptídica.

Finalmente, mediante diversos ensayos inmunológicos (ensayos con linfocitos T in vitro) se probaron los linfocitos T CD8+ periféricos de individuos sanos en busca de reactividad contra los ligandos HLA asociados a tumor. 3. Presentación de péptidos asociados a tumores (TUMAP) contenidos en IMA941 en muestras de tumor.

Muestras de tejido Los tejidos tumorales de pacientes fueron facilitados por la Universidad de Medicina de la Prefectura de Kioto (KPUM), Kioto, Japón, y la Facultad de Medicina de la Universidad de la Ciudad de Osaka (OCU), Osaka, Japón. Antes de la intervención quirúrgica se obtuvieron los consentimientos por escrito de todos los pacientes. Los tejidos se congelaron de golpe en nitrógeno líquido, inmediatamente después de la operación, y se guardaron hasta el aislamiento de los TUMAP a -80°C.

Aislamiento de los péptidos HLA de las muestras de tejido Las mezclas de péptidos HLA derivados de las muestras de tejido congelado de golpe se obtuvieron mediante inmunoprecipitación de los tejidos sólidos conforme a un protocolo ligeramente modificado (Falk y colaboradores, 1991) (Seeger y colaboradores, 1999) utilizando el anticuerpo W6/32 específico de HLA-A, -B, -C, sefarosa activada por CNBr, tratamiento ácido y ultrafiltración.

Detección de TUMAP mediante cromatografía de líquidos acoplada a espectrometría de masas ESI (ESI-LC/EM) Las mezclas de péptidos HLA obtenidas se separaron en función de su hidrofobicidad mediante cromatografía en etapa inversa (sistema Acquity UPLC, Waters) y los péptidos eluidos se analizaron en un espectrómetro de masas híbrido LTQ-Orbitrap (ThermoElectron), equipado con una fuente ESI. Las mezclas de péptidos se cargaron directamente en la columna analítica microcapilar de silicio fundido (75 pm de d.i. x 250 mm) rellena de material C18 de etapa inversa de 1.7 pm (Waters), aplicando una tasa de flujo de 400 ni por minuto. Posteriormente, los péptidos se separaron utilizando un gradiente binario de 180 minutos en dos etapas con B del 10% al 33% y una tasa de flujo de 300 ni por minuto. El gradiente estaba compuesto de solvente A (ácido fórmico al 0.1% en agua) y solvente B (ácido fórmico al 0.1% en acetonitrilo). Se utilizó un capilar de vidrio con revestimiento de oro (PicoTip, New Objective) para la introducción en la fuente nanoESI. El espectrómetro de masas LTQ-Orbitrap se utilizó en el modo dependiente de datos utilizando una estrategia TOP5. En resumen, se inició un ciclo de escaneado con un escaneo completo de gran exactitud de masa, realizado en el Orbitrap (R = 30,000), seguido de escaneos EM/EM, también en el Orbitrap (R = 7500) con los 5 iones precursores más abundantes, con exclusión dinámica de los iones previamente seleccionados. Los espectros de masa en tándem fueron interpretados con SEQUEST y control manual adicional. La secuencia peptídica identificada se aseguró comparando la pauta de fragmentación generada por el péptido natural con la pauta de fragmentación de un péptido de referencia sintético de secuencia idéntica. La figura 1 muestra un espectro de ejemplo obtenido de tejido tumoral correspondiente al péptido CDC2-001 asociado a MHC de clase I y su perfil de elución en el sistema UPLC.

EJEMPLO 2 Determinación del perfil de expresión de los genes que codifican los péptidos de la invención No todos los péptidos detectados en la superficie de las células tumorales por las moléculas MHC resultan adecuados para inmunoterapia, porque la mayoría de ellos derivan de proteínas celulares normales que son expresadas por muchos tipos de células. Sólo unos pocos de tales péptidos están asociados a tumores y probablemente sean capaces de estimular los linfocitos T con una especificidad elevada para reconocer el tumor del cual derivan. Con el fin de identificar tales péptidos y minimizar el riesgo de autoinmunidad provocada por la vacunación, los inventores se centraron en aquellos péptidos derivados de proteínas que aparecen sobreexpresadas en las células tumorales respecto a la mayoría de tejidos normales.

El péptido ideal debe proceder de una proteína que sea exclusiva del tumor y que no esté presente en ningún otro tejido. Para identificar los péptidos que derivan de los genes dotados de un perfil de expresión similar al ideal, los péptidos identificados se asignaron a las proteínas y a los genes de los cuales derivaban y se generaron los perfiles de expresión de estos genes.

Origen y preparación del ARN Dos centros clínicos facilitaron muestras de tejido extirpadas quirúrgicamente (ver el ejemplo 1) tras obtener el consentimiento informado por escrito del paciente. Las muestras de tejido tumoral se sometieron a congelación rápida en nitrógeno líquido inmediatamente después de la intervención quirúrgica y después se homogeneizaron en un mortero con nitrógeno líquido. El ARN total se preparó a partir de estas muestras con reactivo TRI (Ambion, Darmstadt, Alemania) y se purificó con RNeasy (QIAGEN, Hilden, Alemania); ambos métodos se realizaron siguiendo el protocolo del fabricante.

El ARN total procedente de tejidos humanos sanos se adquirió a empresas comerciales (Ambion, Huntingdon, UK; Clontech, Heidelberg, Alemania; Stratagene, Amsterdam, Países Bajos; BioChain, Hayward, CA, EE.UU.). El ARN procedente de varios individuos (entre 2 y 123 personas) se mezcló de tal forma que el ARN de cada persona fuera equitativo. Se aislaron los leucocitos de muestras de sangre de 4 voluntarios sanos.

Se evaluó la calidad y la cantidad de todas las muestras de ARN con un analizador Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent, Waldbronn, Alemania) mediante el kit RNA 6000 Pico LabChip Kit (Agilent).

Experimentos con micromatrices El análisis de la expresión génica de todas las muestras de ARN de tejido tumoral y normal se llevó a cabo con micromatrices de oligonucleótidos Affymetrix Human Genome (HG) U133A o HG-U133 Plus 2.0 (Affymetrix, Santa Clara, CA, EE.UU.). Todas las etapas se llevaron a cabo siguiendo el manual de Affymetrix. En resumen, se sintetizó el ADNc bicatenario a partir de 5-8 pg de ARN total, con SuperScript RTII (Invitrogen) y el cebador oligo-dT-T7 ( WG Biotech, Ebersberg, Alemania) del modo descrito en el manual. La transcripción in vitro se realizó con el kit BioArray High Yield RNA Transcript Labelling Kit (ENZO Diagnostics, Inc., Farmingdale, NY, EE.UU.) en el caso de las matrices U133A o con el GeneChip IVT Labelling Kit (Affymetrix) con las matrices U133 Plus 2.0, a la que siguió la fragmentación del ARNc y su hibridación y tinción con estreptavidina-ficoeritrina y un anticuerpo anti-estreptavidina biotinilado (Molecular Probes, Leiden, Países Bajos). Las imágenes se escanearon con los aparatos Agilent 2500A GeneArray Scanner (U133A) o Affymetrix Gene-Chip Scanner 3000 (U133 Plus 2.0), y los datos se analizaron con el software GCOS (Affymetrix), utilizando los ajustes por defecto en todos los parámetros. Para la normalización, se utilizaron 100 genes housekeeping, facilitados por Affymetrix. Se calcularon los valores de expresión relativa con los cocientes de señal logarítmicos ofrecidos por el software y la muestra de riñon normal se fijó arbitrariamente en un valor de 1.0.

En Fig. 2 se muestran los perfiles de expresión de los genes fuente de la presente invención, que aparecen notablemente sobreexpresados en el cáncer gástrico. 4. Inmunogenicidad in vitro de los péptidos IMA941 presentados por MHC de clase I Con el fin de obtener información referente a la inmunogenicidad de los TUMAP de la presente invención, se llevaron a cabo investigaciones con ayuda de una probada plataforma de estimulación in vitro descrita con anterioridad (Walter, S, Herrgen, L, Schoor, O, Jung, G, Wernet, D, Buhring, HJ, Rammensee, HG, and Stevanovic, S; 2003, Cutting edge. predetermined avidity of human CD8 T cells expanded on calibrated MHC/anti-CD28-coated microspheres, J. Immunol., 171, 4974-4978). Mediante esta plataforma, se pudo demostrar la inmunogenicidad de 10 TUMAP restringidos al HLA-A*2402, lo que demuestra que estos péptidos son epítopos de linfocitos T contra los que existen linfocitos T CD8+ precursores en el humano (Tabla 6).

Sensibilización in vitro de linfocitos T CD8 + Con el fin de efectuar estimulaciones in vitro mediante células presentadoras de antígeno artificiales (aAPC) cargadas con el complejo péptido- HC (pMHC) y el anticuerpo anti-CD28, se aislaron, en primer lugar, linfocitos T CD8 de productos frescos de leucocitaféresis HLA-A*24 obtenidos de donantes sanos en el banco de sangre de Tuebingen.

Los linfocitos T CD8 ó bien se enriquecieron directamente con el producto de leucocitaféresis o bien primero se aislaron las células PBMC (células mononucleares de sangre periférica) con un medio estándar de separación en gradiente (PAA, Cólbe, Alemania). Las células PBMC o los linfocitos CD8 aislados se incubaron hasta su uso en medio de linfocitos T (TCM) consistente en RPM l-G lutamax (Invitrogen, Karlsruhe, Alemania) con un suplemento de suero AB humano inactivado por calor al 10% (PAN-Biotech, Aidenbach, Alemania), 100 U/ml de penicilina/100 pg/ml de estreptomicina (Cambrex, Colonia, Alemania), 1 mM de piruvato de sodio (CC Pro, Oberdorla, Alemania), 20 pg/ml de gentamicina (Cambrex). En esta etapa también se añadieron IL-7 2.5 ng/ml (PromoCell, Heidelberg, Alemania) e IL-2 10 U/ml (Novartis Pharma, Nürnberg, Alemania) a los TCM. El aislamiento de los linfocitos CD8+ se efectuó mediante selección positiva con MicroBeads CD8 (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Alemania).

La fabricación de las esferas revestidas de pM HC/anti-CD28, las estimulaciones de los linfocitos T y la lectura se hicieron de un modo que se ha descrito anteriormente (Walter y colaboradores, 2003) con pequeñas modificaciones. Brevemente, se produjeron moléculas HLA-A*2402 recombinantes cargadas con péptido biotinilado, sin dominio transmembranosa y biotinilado en el extremo carboxilo de la cadena pesada. El anticuerpo, Ab 9.3 coestimulador purificado anti-CD28 humano de lgG2a de ratón (Jung y colaboradores, 1987), fue biotinilado químicamente con sulfo-N-hidroxisuccinimidobiotina, siguiendo las recomendaciones del fabricante (Perbio, Bonn, Alemania). Las esferas utilizadas consistían en partículas de poliestireno revestidas de estreptavidina de 5.6 pm de grosor (Bangs Laboratories, Illinois, EE.UU.). Los pMHC utilizados como controles fueron el A*0201/MLA-001 (péptido ELAGIGI LTV de Melan-A/MART-1 modificado) y el A*0201 /DDX5-001 (YLLPAIVH I de DDX5), respectivamente.

Se revistieron 800,000 esferas/200 µ? en placas de 96 pocilios en presencia de 600 ng de anti-CD28 biotinilado y 200 ng del pMHC biotinilado pertinente (esferas de alta densidad). Las estimulaciones se iniciaron en placas de 96 pocilios mediante la coincubación de 1 x 106 linfocitos T CD8+ con 2 x 105 esferas revestidas y lavadas en 200 µ? de TCM suplementado con 5 ng/ml de IL-12 (PromoCell) durante 3-4 días, a una temperatura de 37 C. La mitad del medio se recambió por TCM fresco suplementado con 80 U/ml de IL-2 y la incubación prosiguió durante 3-4 días a 37°C. Este ciclo de estimulación se efectuó tres veces en total. Finalmente, se realizaron análisis multiméricos tiñendo las células con Live/dead-Aqua dye (Invitrogen, Karlsruhe, Alemania), anticuerpo CD8-FITC clon SK1 (BD, Heidelberg, Alemania) y multímeros MHC A*2402 acoplados a PE o APC. El análisis se hizo con un citómetro BD LSRII SORP equipado con los láseres y filtros adecuados. Las células específicas de péptido se calcularon en forma de porcentaje respecto al total de linfocitos CD8 + . El análisis multiméricos se evaluó con el programa informático FlowJo (Tree Star, Oregón, EE.UU.). La sensibilización in vitro de los linfocitos CD8 + multímero+ específico se detectó mediante la selección adecuada en el citómetro y la comparación con las estimulaciones del control negativo. La inmunogenicidad de un antígeno dado era detectable si, al menos un pocilio estimulado in vitro evaluable de un donante sano, contenía una línea celular de linfocitos T CD8 + específicos tras la estimulación in vitro (es decir, este pocilio contenía, al menos, un 1% de células multímero+ entre los linfocitos T CD8+ y el porcentaje de células multímero + específicas era, al menos, 10 veces la mediana de las estimulaciones del control negativo).

Inmunogenicidad in vitro de los péptidos de IMA941 La inmunogenicidad in vitro de los 14 péptidos HLA de clase I probados se pudo demostrar mediante la generación de líneas de linfocitos T específicas de péptidos. En Figura 3 se muestran a modo de ejemplo los resultados de una citometría de flujo después de la tinción de multímeros específica de TUMAP de dos péptidos de la invención, junto con el control negativo correspondiente. La Tabla 8 proporciona la inmunogenicidad in vitro de péptidos HLA de clase I de la invención y resume los resultados de los péptidos de la invención Los resultados de los experimentos de inmunogenicidad in vitro muestran el porcentaje de donantes y pocilios positivos entre los péptidos evaluables. Al menos dos donantes y 24 pocilios resultaron evaluables para cada péptido.

Tabla 8. Inmunogenicidad in vitro de péptidos HLA de clase I de la invención 5. Inmunogenicidad de TUMAP de clase II IMA941 BIR-002 Se llevó a cabo un estudio clínico para confirmar inmunogenicidad del péptido con la SEC ID No. 11.

El objetivo principal del estudio era la investigación de la respuesta basada en el antígeno específico de la próstata (PSA-R) ante la administración subcutánea de un conjunto de péptidos específicos de la próstata (terapia de vacunación) en pacientes con recaída bioquímica tras una prostatectom ía radical sin detección de lesiones metastáticas manifiestas.

El objetivo secundario del estudio era la investigación de la tolerabilidad y la viabilidad de la terapia de vacunación en pacientes con carcinoma de próstata, con una atención especial hacia los fenómenos inmunológicos en términos de respuesta de los linfocitos T.

El estudio fue diseñado como un ensayo prospectivo y aleatorizado de etapa l/ll para la indicación de la «recaída bioquímica tras una prostatectomía radical sin detección de lesiones metastáticas manifiestas».

Población del estudio En este estudio de etapa l/ll se intentó inducir la regresión del PSA como indicador del cese del crecimiento tumoral mediante la vacunación con un conjunto de péptidos específicos de la próstata en pacientes HLA-A*02+ con recaída bioquímica tras una prostatectomía radical. Con ese fin, se administró por vía subcutánea una combinación de péptidos específicos de la próstata y se evaluó el alcance de las respectivas respuestas inmunes en el contexto de diversas formas de administración de las estructuras antigénicas.

A diferencia de los estudios de vacunación anteriores, el estudio planificado estaba dirigido al tratamiento de pacientes con una carga tumoral pequeña, aún no detectable con técnicas de diagnóstico por la imagen. Todos los pacientes fueron vacunados con el mismo método, utilizando estructuras antigénicas conocidas y específicas de la próstata para mejorar la respuesta inmune contra las células cancerosas. Se trató a diecinueve pacientes.

Tabla 9: Características de la población del estudio Plan de tratamiento Una vez descartada la existencia de lesiones metastásicas manifiestas por medio de tomografía computerizada y gammagrafía ósea, la vacuna de péptidos específicos de la próstata se administró por vía subcutánea, con arreglo a las diferentes formulaciones de administración, a pacientes con una recaída del PSA tras prostateoctomía radical (aumento del PSA consistente en una elevación del 50% durante dos mediciones hechas al menos con 14 días de diferencia). La vacuna se administró 8 veces en los días 0, 7, 14, 28, 42 y 56 (aproximadamente 100 microgramos por péptido e inyección cada vez). Después de cada tratamiento de vacunación y de nuevo en el día 70, se midió el PSA para valorar la respuesta terapéutica.

Si se detectaba una respuesta tumoral (remisión completa [PSA-CR], remisión parcial [PSA-RR] o un curso clínico estable [sin cambios, PSA-NC]), el paciente recibía la vacuna una vez al mes como terapia de mantenimiento con arreglo a la formulación de administración seleccionada. La respuesta del paciente a la terapia de vacunación se evaluó de forma detallada como sigue: Remisión completa (PSA-CR): normalización de un nivel de PSA inicialmente elevado, confirmada por la medición tras un intervalo de, al menos, 4 semanas. La normalización se define como un valor más bajo del PSA <0.2 ng/ml, que podría esperarse tras una prostatectom ía radical con una extirpación completa del tumor o de la próstata.

Remisión parcial: a) PSA-PR < 80% (reducción de un nivel de PSA inicialmente elevado en un 80%, confirmada por la medición tras un intervalo de, al menos, 4 semanas); y b) PSA-PR =50% (reducción de un nivel de PSA inicialmente elevado en un 50%, confirmada por la medición tras un intervalo de, al menos, 4 semanas).

Enfermedad estable (PSA-SD): ningún cambio significativo durante un periodo de, al menos, cuatro semanas. Esto incluye estabilización y reducción inferior al 50% y un incremento inferior al 10%, confirmados por una medición después de un intervalo de, al menos, 4 semanas.

Progresión (PSA-PD): incremento del nivel de PSA superior al 10%. En caso de progresión del PSA, el estudio se daba por finalizado.

Tras la admisión de los pacientes en el estudio, se utilizó la vacuna específica de epítopo; se tuvieron en cuenta las proteínas expresadas específicamente en las células epiteliales prostáticas (por ejemplo, PSMA/PSCA). Además de investigar la eficacia general de la vacuna administrada comparándola con el control del crecimiento de las fracciones residuales del tumor mediante el análisis periódico del PSA, este estudio investigó los efectos de diversos métodos de vacunación en términos de modulación eficaz del sistema inmune. Además de la simple administración subcutánea de los péptidos solos, también se estudiaron diversas combinaciones con adyuvantes. En concreto, se analizó la actividad de liberación lenta y adyuvante que en las vacunas peptídicas ejerce Montanide (una formulación del clásico adyuvante incompleto de Freund adecuada para el uso en seres humanos), que recientemente ha recibido opiniones muy favorables. Con este fin, se mezclaron 500 µ? de la solución peptídica con 500 µ? de Montanide antes de la administración, creando así una emulsión de aceite en agua que libera lentamente el antígeno contenido en la etapa acuosa durante semanas. La estabilidad física de la emulsión es muy alta, puesto que a 4°C puede almacenarse durante más de 3 meses sin una separación importante de las etapas. La función de liberación lenta de Montanide se ha aprovechado en multitud de pruebas de vacunación con buenos resultados (Oka y colaboradores, 2004).

Una de las ramas del estudio investigó la eficacia de la vacunación durante la estimulación concomitante del sistema inmune por medio de factores de crecimiento, GM-CSF y Leukine® solución para inyección. El GM-CSF es un adyuvante muy utilizado en los ensayos de vacunación peptídica, y muchos de ellos han descrito la mejora de las respuestas clínicas y de los linfocitos T. Inicialmente, el GM-CSF es un factor de reclutamiento y diferenciación de las células dendriticas que está pensado para aumentar el número de células dendriticas en el lugar de inyección de la vacuna. No obstante, el GM-CSF no activa por sí solo las células presentadoras de antígenos como las células dendriticas y los macrófagos, y se ha registrado una activación indirecta in vivo (Molenkamp y colaboradores, 2005).

Otra rama del estudio investigó la eficacia de la vacunación durante la activación concomitante de las células dendriticas por medio del uso epicutáneo de imiquimod. El imiquimod se administró como un ungüento al 5% (Aldara): éste ejerce una potente acción inmunoestimuladora gracias a su efecto sobre las células TLR7 positivas (por ejemplo, DC plasmocitoides, células de Langerhans, DC dérmicos) y activa la ruta dependiente del MyD88. Las APC activadas liberan citocinas inflamatorias y estimuladoras de los linfocitos T, regulan al alza la coestimulación y migran hacia los ganglios linfáticos drenantes.

En modelos animales, se ha demostrado el potencial de imiquimod para mejorar la respuesta de los CTL inducida por péptidos resultado de mezclar los antígenos con el ungüento o de la aplicación de Aldara sobre el lugar de la inyección subcutánea o intradérmica de los antígenos.

Otra rama del estudio investigó la eficacia de la vacunación en el curso de la activación concomitante de las células dendriticas al mezclarlas con ARNm de mucina-1 estabilizado con protaminas a fin de activar los TLR 7/8. El ARNm desencadena una amplia activación de las poblaciones de células inmunitarias, tanto en ratones como en humanos. La presencia en la formulación de la protamina, una proteína muy básica, alarga la semivida del ARNm y facilita la formación de partículas con un potencial de liberación prolongada. Por lo tanto, este adyuvante puede combinar las propiedades de la liberación prolongada con la activación de las APC.

En resumen, las formas de administración de la vacuna incluyen los siguientes enfoques: Administración subcutánea de la vacuna peptídica emulsionada en Montanide; Administración subcutánea de la vacuna peptídica emulsionada en 500 µ? de Montanide en combinación con la administración tópica de 225 µ? de GM-CSF con el objetivo de lograr una respuesta inmune más potente provocada por la administración concomitante de factores de crecimiento; Administración subcutánea de la vacuna peptídica emulsionada en 500 µ? de Montanide en combinación con hipertermia local, ésta última con el objetivo de lograr una respuesta inmune más fuerte inducida por el calor; Administración subcutánea de la vacuna peptídica emulsionada en 500 µ? de Montanide en combinación con imiquimod epicutáneo para activar las células dendríticas a través del TLR 7; Administración subcutánea de la vacuna peptídica emulsionada en 500 µ? de Montanide junto con 55 µ? de ARNm de mucina-1 /protamina para activar las células dendríticas a través de los TLR 7/8.

Calendario: La duración total del estudio fue de 3 años.

Las vacunas de péptidos específicos de la próstata se administraron a pacientes los días 0, 7, 14, 28, 42 y 56. En pacientes con enfermedades estables o una respuesta tumoral objetiva (PSA-CR o PSA-PR), las vacunaciones se efectuaron una vez al mes por vía intradérmica hasta que tuvo lugar una progresión detectable. En base a la experiencia disponible hasta ahora, las inyecciones peptídicas parecen tolerarse sin reacciones adversas importantes. Debido a que la respuesta ante la terapia de vacunación sólo se evaluó serológicamente mediante la medición del PSA, al inicio del estudio se llevó a cabo una prueba para determinar si la vacuna suministrada interfiere con la medición del PSA in vitro, lo cual podría simular una falsa respuesta clínica. En los días 0, 7, 14, 28, 42, 56 y 70, se tomaron muestras de sangre para pruebas de laboratorio, niveles de PSA, hemograma diferencial, análisis FACS y citocinas. Si el tratamiento proseguía pasado el día 70, se llevaba a cabo un control del PSA durante 6 semanas para detectar los fracasos terapéuticos a tiempo.

El tratamiento se daba por finalizado si se confirmaba la progresión de la enfermedad a raíz de una elevación continua del PSA.

Comenzando en el día 84, la terapia de inmunización continuó a intervalos de 4 semanas hasta una progresión documentada o hasta el día 420 (15 meses). Las decisiones relativas a la continuación de la terapia (en los casos satisfactorios) fuera del estudio se adoptaron caso por caso. En el estudio no se produjeron reacciones adversas inesperadas.

Las pruebas de laboratorio incluían: coagulación, electrolitos, LDH, ß2-?, CK, enzimas hepáticas, bilirrubina, creatinina, ácido úrico, proteína total, coagulación, CRP, hemograma diferencial con frotis, nivel de PSA, citocinas, FACS y Elispot.

El análisis de la reacción cutánea frente a antígenos bacterianos y fúngicos definidos (48-72 horas después de la administración, hipersensibilidad retardada (DTH), mediada por linfocitos T), servía como un análisis del sistema inmune celular del paciente antes del inicio del estudio.

Los péptidos necesarios para el estudio (nonapéptidos) fueron elaborados en el laboratorio del Dr. Stefan Stevanovic, en el departamento del Prof. H.-G. Rammensee. Estos péptidos fueron purificados mediante HPLC y analizados por espectrometría de masas. La pureza de los péptidos también puede comprobarse mediante HPLC, espectrometría de masas y secuenciación de Edman. Con estos métodos puede documentarse una pureza de hasta el 98% (que debe considerarse como el máximo con arreglo a la situación actual de los métodos). Los péptidos sintetizados se disolvieron en DMSO (CryoSure, WAK Chemie Medical GmbH, 10 mg/ml), se diluyeron a razón de 1:10 en Ampuwa (Fresenius Kabi) y se alicuotaron en condiciones estériles.

Reacción clínica En dos pacientes, la exploración con PET-TC pudo revelar recurrencia local después de detectar el tumor local mediante el tacto rectal practicado de forma continua. En los 17 pacientes restantes, al acabar el estudio no se había podido localizar actividad de la enfermedad.

Ni los repetidos análisis del hemograma diferencial ni la exhaustiva bioquímica clínica revelaron anomalía o cambio alguno durante el estudio.

De los 19 pacientes, 16 reaccionaron al péptido de la survivina II (IFN-g ELISPOT, +/- ICS) conforme a la SEC ID No. 12. Entre éstos, 12 pacientes manifestaron la inducción de una respuesta de linfocitos T antisurvivina tras la vacunación, dos con linfocitos T antisurvivina preexistentes y otros dos en los que no se pudo determinar si los linfocitos T antisurvivina preexistentes eran abundantes.

Respuesta bioquímica La respuesta completa se consideró como un valor de PSA ¡ndetectable con arreglo al menor valor detectable en el laboratorio colaborador tras un valor de PSA inicialmente elevado. La medición tuvo que ser confirmada tras un intervalo de, al menos, cuatro semanas. Del mismo modo, la PR > 80% y > 50% tuvo que ser revaluada tras cuatro semanas. La enfermedad estable se definió como un PSA dentro del intervalo delimitado por un descenso inferior al 50% y un aumento inferior al 10%, confirmado con otra medición realizada, al menos, al cabo de cuatro semanas. Se consideró enfermedad progresiva cualquier incremento superior al 10% del PSA respecto al inicio del tratamiento.

Los pacientes que terminaron el estudio fueron sometidos a un seguimiento de la respuesta bioquímica hasta que recibieron tratamiento con radiación local o terapia antihormonal. 19 pacientes aceptaron participar y los datos fueron analizados. El mayor seguimiento fue de unos 3.75 años.

Estabilidad del PSA e incremento del tiempo de duplicación (TD) Los valores del PSA de dos pacientes (10.2%) se mostraron estables con arreglo a los criterios antes mencionados de respuesta bioquímica, que establecen que al final del estudio no debía haberse producido ningún incremento del valor del PSA superior al 10% respecto al inicio del mismo (Fig. 6, Tablas 10, 11 y 12). El seguimiento de ambos casos se prolongó hasta 14 y 16 meses después de la aplicación de la última vacuna. La duración media de la estabilidad fue de 24 meses (28 y 31) en el momento del cierre de los datos, con una media de 18 vacunas (14 y 20).

Uno de estos dos pacientes mostró una respuesta parcial > 50% durante un período de 9 meses, seguido de un período de lento incremento del PSA con un tiempo de duplicación de 20.5 en comparación con los 9.8 meses previos a la vacunación. La recaída inicial del PSA se inició 18 meses después de la cirugía por un tumor pT2pN0 de Gleason 5.

En el análisis de datos, el paciente 8 mostró una enfermedad estable desde el principio del programa de vacunación, hacía 28 meses. Había detenido el tratamiento como consecuencia de una reacción alérgica tras 10 meses y la 14a vacunación. Presentaba una situación desfavorable con pT3b Gleason 3 + 4 y un valor más bajo del PSA tras la prostatectomía radical no inferior a 0.6 ng/ml y una progresión del PSA sin demora tras el descenso inicial postoperatorio. El tiempo de duplicación se ralentizó de 6.6 meses a 148 meses.

Estos dos pacientes recibieron Imiquimod dérmico en el lugar de aplicación en cada vacunación peptídica.

Incremento del tiempo de duplicación del PSA sin estabilidad del PSA El tiempo de duplicación del PSA del paciente 11 pasó de 1.5 a 10.1 meses durante seis meses de estudio. Como comenzó con un PSA de 10.8 ng/ml y progresó hasta 17.8 ng/ml, finalizó los procedimientos del estudio para pasar a recibir monoterapia antiandrógena sin que se visualizara ninguna lesión maligna en el PET-TC. Recibió Aldara como adyuvante.

El paciente 16 comenzó un tratamiento de vacunación más ARNm de mucina-1 /protamina con un tiempo de duplicación de 6.1 meses. La velocidad del PSA se redujo hasta un tiempo de semivida de 2.7 meses durante cinco meses, seguida de un incremento calculado estadísticamente del TD del PSA de 14.4 meses, que continúa 16 meses después del inicio del tratamiento. Con un PSA inicial de 0.29 ng/ml, esta cifra descendió a 0.19 ng/ml durante los primeros 5 meses de tratamiento del estudio, aumentó hasta 0.4 ng/ml durante los siguientes 8 meses y finalizó el estudio conforme al protocolo con 0.41 ng/ml 19 meses después del inicio del tratamiento.

Progresión del PSA El paciente 5 manifestó progresión durante el estudio de acuerdo con el tiempo de duplicación del PSA estimado antes de la vacunación. No obstante, experimentó un descenso del PSA con una semivida de 20.2 meses después del final del tratamiento durante un período continuo de 10 meses en el momento del cierre de los datos. Aún no estaba recibiendo ningún tratamiento secundario después de la finalización de la vacuna. El único adyuvante que recibió durante la vacunación fue Montanide.

Tabla 10: Tiempo de duplicación (TD) del PSA en meses * El TD del PSA al término del estudio o del seguimiento no se incluyó en el caso del paciente 5 debido al descenso del PSA. 7. Unión de péptidos restringidos a HLA de clase I de la invención a HLA-A*0201 Objetivo y resumen El objetivo de este análisis consistió en evaluar la afinidad de los péptidos HLA de clase I con la molécula MHC codificada por el alelo HLA-A*0201, ya que éste constituye un parámetro importante para el mecanismo de acción de IMA941. Las afinidades de los 10 péptidos restringidos a HLA de clase I en IMA941 y MET-001 con el HLA-A*0201 resultaron medias o altas, situándose las constantes de disociación (KD) en un intervalo comprendido entre 0.14 (MET-001) y 2.05 nM (CSP-001). Todos los valores se encuentran en un intervalo de entre 0.1 en el caso del ligante fuerte HBV-001 y 4.4 en el del ligante intermedio MUC-001. Estos resultados confirmaron la fuerte afinidad de unión al HLA-A*02 de todos los péptidos HLA de clase I del candidato a vacuna IMA941 y del MET-001 derivado de MET-005.

Principio de la prueba Los complejos HLA/péptido estables constan de tres moléculas: la cadena pesada de HLA, la microglobulina beta-2 (b2m) y el ligando peptídico. La actividad de las moléculas de cadena pesada HLA-A*0201 recombinantes desnaturalizadas se puede preservar convirtiéndolas en equivalentes funcionales de «moléculas HLA-A*0201 vacías». Cuando se diluyen en un amortiguador acuoso con b2m y un péptido apropiado, estas moléculas se pliegan con rapidez y eficacia de una forma completamente dependiente del péptido. La disponibilidad de estas moléculas se utiliza en un análisis ELISA para medir la afinidad de la interacción entre el péptido y la molécula HLA de clase I (Sylvester, 2002).

Las moléculas HLA-A*0201 recombinantes purificadas se incubaron junto con b2m y dosis escalonadas del péptido en cuestión. En lugar del MET-005 completo que no posee capacidad de unión a las HLA de clase I, en el análisis se incluyó el probado producto de unión a A*0- MET-001, el cual se genera in vivo a partir del MET-005 por medio del procesamiento natural del antígeno. La cantidad de complejos HLA/péptido plegados de novo se determinó mediante un ELISA cuantitativo. Las constantes de disociación (valores KD) se calcularon con una curva estándar elaborada con diluciones de un complejo HLA/péptido calibrador.

Resultados En Figura 2 se muestran los resultados. Un valor KD inferior refleja una mayor afinidad a HLA-A*0201. La mayoría de los péptidos de IMA941 tenían afinidades fuertes y similares hacia el HLA-A*0201 dentro del intervalo de entre 0.1 (HBV-001, ligante fuerte) y 44.4 nM (MUC-001, ligante intermedio). Así, todos los TUMAP de clase I de IMA941 tienen una afinidad de unión a la molécula de MHC A*02 media o fuerte. 8. Unión de péptidos restringidos a HLA de clase II de la invención al HLA-DR Objetivo y resumen Los TUMAP de clase II activan a los linfocitos T auxiliares, que desempeñan una función crucial apoyando la función de los CTL activados por los TUMAP restringidos a la clase I. La unión de los péptidos de clase II IMA941 a varias moléculas HLA de clase II distintas (unión promiscua) es importante para asegurar que la mayoría de los pacientes tratados con el candidato a vacuna IMA941 puedan beneficiarse de una respuesta de apoyo de los linfocitos T auxiliares. El HLA-DR, por ejemplo, la molécula HLA de clase II humana expresada de forma más dominante, es muy polimórfica y cuenta con varios cientos de alelos conocidos. De acuerdo a las frecuencias alélicas conocidas de los haplotipos HLA-DRB1 y los algoritmos de unión bien establecidos, se puede predecir que los dos ligandos de HLA de clase II presentes en IMA941 - IMA-BIR-002 e IMA-MET-005 - son péptidos de unión al HLA-DR promiscuos. Esto es, la probabilidad de que un hombre blanco HLA-A*02-positivo exprese al menos un alelo HLA-DR adecuado es mayor del 90% para ambos TUMAP de clase II de IMA941. Puesto que los restantes alelos humanos de clase II HLA-DQ y -DP quedaron excluidos de este cálculo por falta de datos de frecuencia o algoritmos de predicción de la unión, es muy probable que la promiscuidad real sea aún mayor. La promiscuidad calculada de los dos TUMAP de clase II de IMA941 se encuentra en el mismo intervalo que la del epítopo pan-DR conocido (PADRE, frecuencia genotípica Fproyectada = 93.1%). Además, la unión promiscua de estos péptidos fue confirmada experimentalmente mediante el análisis in vitro de la unión. Además, se pudo demostrar la alta inmunogenicidad in vivo de IMA-BIR-002 (ver más arriba). En resumen, estos resultados confirman que MET-005 y BIR-002 son péptidos de unión al HLA-DR promiscuos.

Principio de la predicción de la unión Por medio del algoritmo SYFPEITHI desarrollado en la Universidad de Tubinga (Rammensee y colaboradores, 1997; Rammensee y colaboradores, 1999), se clasificó la unión de los TUMAP de clase II de IMA941 a varios alelos comunes del HLA-DR. El algoritmo ya se ha utilizado con éxito para identificar epítopos de clase I y II entre un amplio intervalo de antígenos como, por ejemplo, los antígenos humanos asociados a tumores TRP2 (clase I) (Sun y colaboradores, 2000) y SSX2 (clase II) (Neumann y colaboradores, 2004). El umbral para la unión se fijó en una puntuación de 18 a partir del análisis de las puntuaciones de ligandos del HLA-DR promiscuos conocidos y publicados.

Se usaron las frecuencias haplotípicas publicadas del HLA-DR entre la población caucásica HLA-A*02 positiva (Mori y colaboradores, 1997), así como las frecuencias de haplotipos de alta resolución (Chanock y colaboradores, 2004) (ver tabla 2). La frecuencia haplotípica es la frecuencia de un alelo diferenciado en un cromosoma individual. Debido a la dotación diploide de cromosomas presente en las células de mamíferos, la frecuencia genotípica de este alelo es mayor y se puede calcular aplicando la Ley de Hardy-Weinberg (la frecuencia aplotípica Gf da como resultado una frecuencia genotípica F (F = 2Gf - Gf2]).

La suma de la frecuencia de los haplotipos DRB1 con una matriz conocida SYFPEITHI y la frecuencia individual conocida entre la población caucásica A*02+ es del 47.8%. Por lo tanto, la distribución pretal de la unión de los TUMAP de clase II a estos alelos se extrapoló al restante 52.2% de los alelos DRB1, de los cuales se carece de tales datos.

Finalmente, la unión promiscua se define como la unión de un péptido a varios alelos HLA-DR, siendo la probabilidad de que uno de ellos se exprese en la población caucásica de al menos el 50%.

Principio del ensayo de unión in vitro (Prolmmune REVEAL™) IMA-BIR-002 e I M A-M ET-005 se montaron con antígenos amplios de HLA-DR (HLA-DR1 a DR7, que también comprenden los antígenos discontinuos HLA-DR11 a -DR15 Morí y colaboradores, 1997)) y se analizaron por medio del ensayo de unión MHC:péptido REVEAL™ (Prolmmune, Oxford, Reino Unido) para determinar su nivel de incorporación a las moléculas MHC. En este análisis, la unión se comparó a la de un ligante de control pasa/no pasa, y a un péptido de control positivo para cada antígeno HLA-DR.

Resultados De acuerdo a la predicción del algoritmo SYFPEITHI es probable que IMA-BIR-002 se una a 7/8 de los alelos HLA-DR con motivo de unión conocido (Tabla 11). La probabilidad de que un caucásico HLA-A*02 positivo exprese al menos un alelo HLA-DRB1 adecuado para IMA-BIR-002 es del 92.6%. Por lo tanto, se predice que ambos péptidos IMA941 de clase II serán ligantes de HLA-DR promiscuos.

Aunque la frecuencia haplotípica de los alelos HLA-DRB1 que se unen se sobreestimara debido a este enfoque en un factor de dos, su frecuencia genotípica seguiría siendo superior al 50% para todos los TUMAP de clase II presentes en IMA941. Además, los datos de unión in vitro confirmaron experimentalmente la unión promiscua de IMA-BIR-002 a los HLA-DR1, 3, 4 y 11 (Figura 3).

Puesto que IMA-BIR-002 ha demostrado una amplia inmunogenicidad en un ensayo clínico con pacientes de cáncer de próstata portadores de distintos alelos HLA-DR, la promiscuidad in vivo de este péptido de clase II ha quedado claramente demostrada .

En conclusión, los análisis bioinformáticos de las propiedades de unión al HLA-DR de los dos péptidos de clase II contenidos en IMA941 y los datos probatorios experimentales aportados por los ensayos in vitro y por un ensayo clínico con BIR-002 indican con bastante fiabilidad que estos TUMAP son ligantes promiscuos de moléculas HLA de clase II humanas.

Tabla 11: índices de unión de los TUMAP de clase II de IMA941 a alelos HLA-DR con motivo de unión conocido. Se muestran los índices de unión SYFPEITHI correspondientes a los alelos HLA-DRB1 más comunes en la población caucásica. El valor p indica las frecuencias haplotípicas entre caucásicos HLA-A*02 positivos. Se consideró que el péptido se unía a una molécula HLA si el índice resultaba igual o superior a 18. La acumulación de los valores p correspondientes a los alelos DRB1 unidos da como resultado la frecuencia haplotípica mínima pm¡n-La extrapolación de estas frecuencias a todos los alelos DRB1, incluidos aquellos con datos de frecuencia o una matriz de predicción de unión incompletos, proporciona la frecuencia haplotípica prevista pproyectado, que corresponde a la frecuencia genotípica Fproyectado- s. d. = sin datos.

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Claims

REIVINDICACIONES

1. Una composición farmacéutica, que comprende al menos dos péptidos que contienen una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEC ID No. 1 a SEC ID No. 10, SEC ID No. 20 y SEC ID No. 24, y/o que contienen una secuencia de aminoácidos variante que es idéntica al menos en un 85% a la de las SEC ID No. 1 a SEC ID No. 10, SEC ID No. 20 y SEC ID No. 24, y/o un polin ucleótido que contiene un ácido nucleico que codifica las SEC ID No. 1 a SEC ID No. 10, SEC ID No. 20 y SEC ID No. 24 ó la secuencia de aminoácidos variante, y un vehículo aceptable farmacéuticamente.

2. La composición farmacéutica de acuerdo a la reivindicación 1, que además comprende al menos un péptido adicional que contiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEC ID No. 11 a SEC ID No. 22, ó que contiene una secuencia de aminoácidos variante que es idéntica al menos en un 85% a la SEC ID No. 11 a SEC ID No. 22, ó un polinucleótido que contiene un ácido nucleico que codifica las SEC ID No. 9 a SEC ID No. 22 ó la secuencia de aminoácidos variante.

3. La composición farmacéutica de acuerdo a las reivindicaciones 1 ó 2, en donde los péptidos tienen una longitud total de entre 8 y 100, preferiblemente entre 8 y 30, y más preferentemente entre 8 y 17 aminoácidos.

4. La composición farmacéutica de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde al menos un péptido incluye enlaces no peptídicos.

5. La composición farmacéutica de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que comprende al menos dos péptidos que consisten en secuencias de aminoácidos de acuerdo a las SEC ID No. 1 a SEC ID No. 22 y SEC ID No. 24.

6. La composición farmacéutica de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que comprende al menos dos péptidos MHC de clase I, uno de los cuales contiene una secuencia de aminoácidos de acuerdo a la SEC ID No. 1 y una secuencia de aminoácidos de acuerdo a la SEC ID No. 11, ó uno de los dos citados péptidos MHC de clase I contiene una secuencia de aminoácidos de acuerdo a la SEC ID No. 2 y una secuencia de aminoácidos de acuerdo a la SEC ID No. 11, ó uno de los dos citados péptidos MHC de clase I contiene una secuencia de aminoácidos de acuerdo a la SEC ID No. 3 y una secuencia de aminoácidos de acuerdo a la SEC ID No. 11.

7. La composición farmacéutica de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde la selección, el número y/o la cantidad de péptidos presentes en la composición son específicos del tejido, el cáncer, y/o el paciente.

8. La composición farmacéutica de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, que además comprende al menos un adyuvante adecuado, seleccionado del grupo que comprende 1018 ISS, sales de aluminio, Amplivax, AS15, BCG, CP-870,893, CpG7909, CyaA, dSLIM, GM-CSF, IC30, IC31, Imiquimod, ImuFact IMP321, IS Patch, ISCOMATRIX, Juvlmmune, LipoVac, MF59, lípido monofosforilo A, Montanide IMS 1312, Montanide ISA 206, Montanide ISA 50V, Montanide ISA-51, OK-432, OM-174, OM-197-MP-EC, ONTAK, sistema de vectores PepTel, micropartículas PLG, resiquimod, SRL172, virosomas y otras partículas similares a virus, YF-17DBCG, estimulón QS21 de Aquila, Detox de Ribi, Quil, Superfos, Freund, GM-CSF, toxina del cólera, adyuvantes inmunológicos, MF59 y citocinas.

9. La composición farmacéutica de acuerdo a la reivindicación 8, en donde el adyuvante se selecciona del grupo que consiste en factores de estimulación de colonias, como el factor de estimulación de colonias de granulocitos-macrófagos (GM-CSF), o imiquimod o resimiquimod.

10. La composición farmacéutica de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, que contiene adicionalmente al menos una célula presentadora de antígenos.

11. La composición farmacéutica de acuerdo a la reivindicación 10, en donde la célula presentadora de antígenos es una célula dendrítica.

12. La composición farmacéutica de acuerdo a las reivindicaciones 10 u 11, en donde al menos una célula presentadora de antígenos es: a) se sensibiliza o carga con el péptido o b) comprende un constructo de expresión que codifica el péptido.

13. La composición farmacéutica de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la vacuna se administra por vía intravenosa, intraarterial, intraperitoneal, intramuscular, intradérmica, intratumoral, oral, dérmica, nasal, yugal, rectal, vaginal, mediante inhalación o mediante administración tópica.

14. Un método para tratar o prevenir un cáncer en un paciente que comprende la administración al paciente de una cantidad terapéuticamente eficaz de la composición farmacéutica de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones precedentes.

15. Un método de acuerdo a la reivindicación 14, en donde la composición farmacéutica es una vacuna contra el cáncer.

16. Un método de acuerdo a la reivindicación 15, en donde el cáncer es carcinoma de próstata, carcinoma de la cavidad bucal, carcinoma epidermoide oral (OSCC), leucemia mieloide aguda (LMA), linfoma MALT inducido por H. pylori, carcinoma de colon/cáncer colorrectal, glioblastoma, cáncer de pulmón no microcítico (CPNM), carcinoma cervicouterino, cáncer de mama humano, cáncer de próstata, cáncer de colon, cáncer de páncreas, adenocarcinoma ductal de páncreas, cáncer de ovario, carcinoma hepatocelular, cáncer de hígado, tumores cerebrales de diferentes serotipos, leucemias como la leucemia linfoblástica aguda (LLA), cáncer de pulmón, sarcoma de Ewing, cáncer de endometrio, carcinoma epidermoide de cabeza y cuello, cáncer epitelial de la laringe, carcinoma esofágico, carcinoma oral, carcinoma de la vejiga urinaria, carcinomas de ovario, carcinoma de célula renal, meningioma atípico, carcinoma papilar de tiroides, tumores cerebrales, carcinoma de los conductos salivales, linfomas de linfocito T/célula NK extraganglionares, linfoma no Hodgkiniano y tumores sólidos malignos de pulmón y de mama, preferiblemente el cáncer es cáncer gástrico.

17. El método de acuerdo a la reivindicación 16, en donde el cáncer es cáncer gástrico.