KR101620132B1

KR101620132B1 - 위암 및 다른 암의 치료를 위한 종양 관련 펩티드 및 관련된 항암 백신의 조성물

Info

Publication number: KR101620132B1
Application number: KR1020127027319A
Authority: KR
Inventors: 젠스 프리츄; 토니 베인쉔크; 스테펜 발터; 피터 레반드로브스키; 하프리트 싱
Original assignee: 이매틱스 바이오테크놀로지스 게엠베하
Priority date: 2010-03-19
Filing date: 2011-03-16
Publication date: 2016-05-12
Also published as: CA2793389A1; HK1180701A1; US10159725B2; EA022743B1; KR20130057428A; AU2011229177B2; TW201201834A; EA201201305A1; MY162850A; MX2012010814A; EP2547691B1; US20110229524A1; GB201004575D0; HUE030000T2; JP2013522276A; US9132177B2; BR112012023621A2; ES2593409T3; NZ601818A; UA109891C2

Abstract

본 발명은 면역요법 펩티드와 면역요법에서의 그 용도, 특히 암의 면역요법에 관한 것이다. 본 발명은 T-조력 세포 펩티드 에피톱만에 대하여 또는 항종양 면역 반응을 자극하는 백신 조성물의 활성 약학적 성분으로 사용되는 다른 종양 연관된 펩티드와 조합하여 개시한다. 특히, 본 발명의 펩티드의 조성물은 위암과 다른 암에 대한 항 종양 면역 반응을 도출하는 백신 조성물에서 사용될 수 있다.

Description

위암 및 다른 암의 치료를 위한 종양 관련 펩티드 및 관련된 항암 백신의 조성물{COMPOSITION OF TUMOR-ASSOCIATED PEPTIDES AND RELATED ANTI-CANCER VACCINE FOR THE TREATMENT OF GASTRIC CANCER AND OTHER CANCERS}

본 발명은 면역요법 펩티드와 면역요법에서의 그 용도, 특히 암의 면역요법에 관한 것이다. 본 발명은 T-조력 세포 펩티드 에피톱만에 대하여 또는 항종양 면역 반응을 자극하는 백신 조성물의 활성 약학적 성분으로 사용되는 다른 종양 연관된 펩티드와 조합하여 개시한다. 특히, 본 발명의 펩티드의 조성물은 위암(GC)과 다른 암에 대한 항 종양 면역 반응을 도출하는 백신 조성물에서 사용될 수 있다.

본 발명의 목적상, 본원에서 인용되는 모든 참조 자료는 그 전문이 참조 자료로 포함된다.

위암은 악성 세포가 위장의 내벽에 형성되는 질병이다. 위 또는 위암은 위의 어떤 부분에서도 발생할 수 있으며 위 내에서 그리고 특히 식도, 폐와 간을 비롯한 다른 기관으로 퍼질 수 있다. 위암은 세계에서 네번째로 가장 흔한 암이며 2002년에 93만 건이 진단되었다. 이는 높은 사망률(연당 약 80만 건)을 보이며 이로 인해 폐암 다음으로 세계에서 두번째로 가장 흔한 암 사망의 원인이다. 이 암은 남성에서 더 자주 발생하며 아시아 국가와 개발 도상국에서 더 자주 발생한다(정보는 세계 보건 기구에서 얻을 수 있다).

이 암은 미국에서 발생하는 총 연간 암 발생건의 약 2%(2만 5천 500건)에 해당하며, 이는 다른 국가에서 더 자주 발생한다. 이 암은 한국에서 가장 흔한 암 종류이며, 악성 암의 20.8%에 해당한다. 일본에서 위암은 남성에게 가장 흔한 암이다. 매년 미국에서 만 삼천명의 남성과 8천명의 여성이 위암으로 진단된다. 대부분 환자는 70세 이상이다.

위암은 폐암, 유방암, 및 대장암에 이어 세계에서 네번째로 가장 흔한 암이다. 또한, 위암은 세계에서 두번째로 가장 흔한 암 사망의 원인이다. 미국 암 협회(American Cancer Society)는 2007년에 백만 건이 새로 진단되었으며, 거의 70%가 개발 도상국에서 발생하고, 약 80만명이 이 질병에 의해 사망하였다고 추정한다(American Cancer Society 출판물 참조).

세계에서 이 질병의 발병률은 엄청난 지리적 편차가 있다. 이 질병은 아시아와 남미의 일부분에서 가장 많이 발생하며, 북미에서 가장 낮게 발생한다. 칠레, 일본, 남미와 구소련에서 가장 높은 사망률을 기록하였다.

조기 검진이 종종 수행되는 일본(그리고 제한된 방식으로 한국)을 제외하고 전세계 대부분에서는 검진이 수행되지 않기 때문에 위암은 종종 말기에 진단이 된다. 따라서, 이는 의료 전문가에게 해결해야할 숙제로 남아 있다. 위암의 위험 요인은 헬리코박터 파일로리(H.pylori)의 감염, 흡연, 높은 소금 섭취량, 기타 식습관 요소를 포함한다. 몇몇의 위암(1% 내지 3%)은 유전성 위암 소인 증후군과 관련되어 있다. 이-캐드헤린(E-cadherin) 돌연변이는 미만형 위암의 상염색체 우성 소인을 가지고 있는 대략 25%의 가족에서 발생한다. 이 위암의 소그룹을 유전성 미만성 위암이라고 한다. 젊은 무증상인 생식 세포 계열 절단 보인자의 경우 유전 상담을 하고 예방 위절제술을 고려하는 것이 유용할 수도 있다.

위벽은 점막층(가장 안쪽), 고유근층(중간), 장막층(가장 바깥쪽)을 포함한 3층의 조직으로 만들어져 있다. 위암은 점막층을 만드는 세포에서부터 시작하고 자라면서 바깥쪽의 층으로 퍼진다. 4가지 유형의 기본 치료법이 사용된다. 위암에 대한 치료는 수술, 화학 요법, 방사선 요법이나 화학 방사선요법을 포함한다. 수술은 위암에 대한 일차 치료이다. 수술의 목표는 절제 변연에서 조직학적으로 종양세포가 없는 완전 절단(R0 절단)을 달성하는 것이다. 그러나, 국소구역 위암을 가지고 있는 대략 50%의 환자에서 R0 절단이 불가능하다. R1은 미세 잔류 암(절제 변연에서 조직학적으로 종양세포가 있는)을 나타내고, R2는 전이병변이 없는 거시 잔류암을 나타낸다. 환자의 결과는 진단 시 암의 초기 단계에 따라 결정된다(NCCN Clinical Practice Guidelines in Oncology: 상표).

치료 목표의 외과적인 절제술의 5년 생존율은 2기 환자에서 30 내지 50%로 나타나고, 3기 환자에서 10 내지 25%로 나타난다. 이 환자들은 국소 및 전신 재발의 가능성이 높다. 전이는 위암 환자들의 80 내지 90%에서 나타나며, 6개월 생존율은 일찍 진단이 된 경우 65%이며, 늦게 진단이 된 경우 15%이다.

따라서 위암, 전립선 암종, 구강 암종, 구강 편평 암종(OSCC), 급성 골수성 백혈병(AML)(Qian et al., 2009), 헬리코박터 파일로리-유발 몰트 림프종(Banerjee et al., 2000), 대장 암종/대장암, 신경교종, 비소세포폐암(NSCLC), 자궁경부 암종, 인간 유방암, 전립선암, 결장암, 췌장암, 췌장선암종, 난소암, 간세포 암종, 간암, 다른 표현형의 뇌 종양, 급성 임파구성 백혈병(ALL)과 같은 백혈병, 폐암, 유잉 육종암, 자궁내막암, 머리와 목 편평세포 암종, 후두 상피세포암, 식도 암종, 방광 암종, 난소 암종, 신장세포 암종, 이형성 수막종, 갑상선 유두 암종, 뇌 종양, 침샘 암종, 절외 T/NK-세포 림프종, 비호지킨성 림프종과 폐, 유방과 다른 종양을 포함하는 악성 고형 종양에 대한 효능 및 안정성이 있는 새로운 치료 옵션이 필요하다. 또한 심한 부작용을 발생시킬 수 있는 화학 요법제나 다른 약제를 이용하지 않는 환자의 웰빙을 향상시킬 수 있는 치료 옵션이 필요하다.

대장암 암종

미국 암 협회에 따르면, 대장암(CRC)은 미국에서 세번째로 가장 흔한 암이며, 매년 175,000명 이상의 새로운 환자를 발생시킨다. 미국, 일본, 프랑스, 독일, 이탈리아, 스페인과 영국에서 이 암은 480,000명 이상의 환자에 영향을 미친다. 그것은 선진국에서 암 사망의 가장 흔한 원인 중의 하나이다. 연구에 따르면 대장암의 발병은 유전적 그리고 환경적 요인 사이의 상호 작용의 결과이다. 대부분의 경우 선종성 용종 폴립은 대장 종양의 전구체이다. 그러나 그 변화는 수 년이 걸릴 수 있다. 대장암의 주요 위험 인자는 나이이며, 진단되는 경우의 90%가 50세 이상에서 나타난다. 미국 암 협회에 따르면 대장암의 다른 위험 인자에는 알코올 섭취, 지방 및/또는 붉은 고기가 많은 식단, 과일과 야채의 불충분한 섭취 등이 있다. 발병률은 계속 오르고 있으며, 특히 일본 같은 경우에서는 지방과 고기 섭취가 많고 섬유소의 섭취가 감소되는 서양식의 식단의 채택의 탓으로 보여진다. 그러나, 발병률은 전보다 빠르게 상승하고 있지는 않으며 이는 검진의 증가 그리고 폴립을 암으로 발전시키는 것을 막는 폴립 제거 때문일 수도 있다.

다른 대부분의 고체 종양과 마찬가지로, 첫번째 라인 치료는 수술이지만, 그 혜택은 초기 단계의 환자에게만 국한되며, 상당한 비율의 환자들이 질병의 말기 단계에 진단된다. 플루오로유라실 기반으로 한 진행된 대장암 화학 요법이 치료의 표준이다. 대부분의 치료 요법은 소위 FOLFOX(주입 5-FU/류코보린 + 옥살리플라틴) 그리고 FOLFIRI(이리노테칸, 류코보린, 볼루스 및 지속적인 주입 5-FU)라고 불리는 프로토콜이다.

이리노테칸 및 옥살리플라틴과 같은 3 세대 세포독성 항암제의 도입은 효험 개선의 희망을 주었으나 예후는 아직도 불충분하며, 생존율도 일반적으로 전이성 질환에서 약 20개월로 남아있고 그 결과로 아직 충족되지 못한 질병에 대한 필요성이 남아있다.

최근 새로운 약물의 생성, 아바스틴(베바시주맙) 그리고 얼비툭스(세툭시맙)과 같은 분자 표적제가 사용가능해졌고, 약 40개 화합물이 대장암의 여러 단계를 위한 말기 임상 개발 중이다. 이런 화합물 여러 개의 조합은 미래에 기대되는 잠재적인 치료 방법의 숫자를 증가시킨다. 대부분의 물질들은 2상에 있으며, EGFR은 대장암을 위한 어떤 다른 약물보다 이런 화합물에 의해 더 자주 의논되는 데 이는 대장암 환자의 약 80%에서 EGFR 발현이 상향 조정되기 때문이다.

최근 승인된 단클론 항체(mAb)(세툭시맙 + 이리노테칸 또는 FOLFOX4; 단일 제제로서의 베바시주맙 또는 FOLFOX4와 같이)와 화학 요법을 결합하는 II 단계 환자의 임상 실험이 현재 실시되고 있다. 이런 실험들의 통계적으로 의미있는 결과를 위해서는 3년에서 4년의 관찰 기간이 예상된다.

현재 종양학에서 사용되는 단클론 항체(mAb)는 일반적으로 활성 면역요법을 방해하지 않을 가능성이 매우 크다. 사실, VEGF(베바시주맙에 의한)의 고갈이 DC-매개된 T-세포의 활성화에 긍정적으로 기여한다는 전임상 증거가 있다.

전립선암 및 기타 예시적인 종양

2007년에 추정된 27,050명의 사망으로, 전립선 암은 남성 암의 주요 사망 원인이다. 1990년대 초반부터 백인과 아프리카계 미국인 남성 사이에서는 사망률이 감소되고 있지만, 아프리카계 미국인 남성의 사망률은 백인 남성의 그것보다 두 배 이상으로 유지된다. 전립선 암은 남성에서 가장 자주 진단되는 암이다. 그 이유는 불분명하지만, 발병률은 백인보다 아프리카계 미국인에서 상당히 더 높다. 전립선 암의 발병률은 지난 20년 동안 상당한 변화가 있었다: 1988에서 1992년에는 증가, 1992에서 1995년에는 급속한 감소, 그리고 1995년 이후에는 완화된 증가. 이러한 경향은 전립선-특정 항원(PSA) 혈액 검사와 함께 전립선암 검진의 증가를 많은 부분 반영한다. 지난 10년의 완화된 발병률 증가는 65 세보다 젊은 남성들 사이에서 널리 보급된 PSA 검진 때문일 가능성이 크다. 전립선암 발병률은 65세 이상의 남성에서는 변화가 없었다. 발병률은 백인 남성에서는 1992년(10,000명 남성 중 237.6명) 그리고 아프리카계 백인에서는 1993년(10,000명 남성 중 342.8명)에 최고치를 보였다.

전립선 암의 치료는 주의깊은 기다림, 수술, 방사능 치료, 고강도 집중 초음파(HIFU), 화학 요법, 저온 수술, 호르몬 요법, 또는 이의 조합 치료를 포함한다. 가장 좋은 옵션은 질병의 단계, 글리슨(Glaason) 점수, 그리고 PSA 수준에 달려있다. 다른 중요한 요소에는 남성의 나이, 전반적인 건강, 그리고 잠재적인 치료와 가능성 있는 부작용에 대한 감정들을 포함한다. 모든 치료 방법이, 발기 부전 및 비뇨기 요실금 등의 상당한 부작용이 있을 수 있기 때문에, 치료 방법 토론은 종종 치료의 목표와 라이프 스타일 변경의 위험의 균형에 초점을 맞춘다.

만약 암이 전립선 밖으로 퍼질 경우에는, 치료 옵션이 크게 변경되기 때문에, 전립선 암을 치료하는 대부분의 의사들은 확산의 가능성을 예측하는 다양한 단층촬영을 사용한다. 주의깊은 기다림, HIFU, 방사능 치료, 저온 수술 그리고 수술이 암이 전립선 내에 남아있는 남성들에게 일반적으로 권해진다. 호르몬 치료와 화학 요법은 종종 전립선 밖으로 확산된 질병의 경우를 위해 보류된다. 그러나, 예외가 있다: 방사능 치료는 일부 진행된 암에 사용될 수 있으며, 호르몬 치료가 초기 단계의 종양에 사용될 수도 있다. 또한 냉동 요법, 호르몬 요법 그리고 화학 요법은 초기 치료가 실패하여 암이 진행될 때 권해질 수도 있다.

임상적으로 의심되는 조직-제한된 성장 때문에 과격한 전립선 절제술을 받는 전립선암 환자들의 상당수에서, 수술 준비의 최종 조직학적 정밀검사는 국소적으로 확산된 종양이 장기의 경계를 넘어 확장되는 것을 보인다. 이런 환자들은 초기의 국소 재발의 위험이 크며, 보통 생화학적 재발의 관점에서 PSA 수준의 증가로 감지된다. 이런 상황에서 치료 방법은 외부 방사선 치료 그리고 호르몬 박리를 포함한다; 그러나, 이런 치료적 접근 방법의 가치는, 특히 환자의 장기적인 생존 연장에 대해서는, 입증되었다고 간주하면 안된다. 또한, 요도 협착의 발달(방사선 치료), 성욕의 손실, 그리고 발기 불능, 골다공증에 대한 골격 칼슘 염분의 손실 위험, 그리고 병리학적 뼈 골절의 현저한 증가 위험(호르몬 박리) 같은 가능성 있는 치료-관련 합병증이 고려되어야 한다.

모든 전립선 암의 90%는 국소적이며 지역적인 단계에서 발견된다; 이런 단계에서 진단된 종양의 환자들의 5년 상대적 생존율은 100%에 접근한다. 지난 25년 동안, 모든 단계에서의 5년 생존율이 69%에서 거의 90%로 증가했다. 가장 최근의 데이터에 따르면, 상대적인 10년 생존율은 93%이고 15년 생존율은 77%이다. 생존율의 이 극적인 개선은, 특히 5년에서, 부분적으로 빠른 진단과 치료의 개선에 기인하고 있다. 그럼에도 불구하고, 생존률은 다른 조직이나 장기로 확산한 후에는 크게 떨어진다.

폐암

미국에서 2007년에 210,000건이 예상되고, 암 진단의 약 15%를 차지한다. 남성의 발병률은 1984년의 100,000건당 102건에서 2003년에 100,000건당 78.5건으로 크게 감소하고 있다. 여성의 경우, 발병률은 오랜 기간의 증가 후 안정기에 접근하고 있다. 폐암은 치료의 목적을 위해 소세포(13%) 또는 비소세포(87%)로 임상적으로 분류된다.

폐암은 남성과 여성에서 가장 큰 암-관련 사망의 이유이다. 2007년에는 모든 암 사망의 약 29%를 차지하는 160,390 건이 예상된다. 1987년부터, 매년 유방암보다 폐암으로 사망한 여성이 더 많았다. 남성 사망률은 1991년에서 2003년 사이 매년 약 1.9%씩 상당히 감소했다. 여성 폐암 사망률은 수 십년 동안의 지속적인 증가 후 안정기에 접근하고 있다. 폐암 사망률의 이런 경향은 지난 30년간의 흡연율 감소를 반영한다.

치료 방법은 유형(소세포 또는 비소세포) 그리고 암의 단계에 따라 결정되고 수술, 방사선 요법, 화학 요법, 그리고 베바시주맙(아바스틴(등록상표) 또는 얼로티닙(타세바(등록상표))과 같은 표적 생물학적 요법을 포함한다. 국소 암에서는 수술이 일반적인 선택이다. 최근의 연구는 초기 단계 및 비소세포 폐암에서의 생존율은 수술에 따른 화학 요법으로 인해 개선된다는 것을 보였다. 질병이 발견되는 때에는 이미 확산되었기 때문에, 방사선 요법과 화학 요법이, 때로는 수술과 함께 사용된다. 단일 화학 요법 또는 방사선과 같이 하는 병행 화학 요법은 소세포 폐암에서 사용되는 일반적인 치료 방법이며, 이 처방에서, 환자의 큰 비율이 완화를 경험하며, 이것은 어떤 경우에서는 오래 지속될 수 있다.

폐암의 1년 상대적 생존율은 1975에서 1979년 사이의 37%에서 2002년의 42%로 약간 증가했고, 이것은 대부분 수술 기술과 병행 요법의 개선 때문이다. 그러나, 모든 단계를 합한 5년 생존율은 16% 밖에 되지 않는다. 질병이 국소화되었을 때 발견된 경우에는 생존율이 49%이다; 하지만, 16%의 폐암만이 이 초기 단계에서 진단된다.

[표 1]

2007년 미국에서 성별에 따라 예상되는 새로운 암 발병 건수와 사망(미국 암 협회. 암 사실 및 수치들 2007. 아틀란타: 미국 암 협회; 2007)

그러므로 신경교종, 전립선 종양, 유방암, 식도암, 결장암, 명확한 세포 신장 세포선암, 폐암, CNS, 난소, 흑색종, 췌장암, 편평 상피 세포선암, 백혈병 그리고 수모세포종 그리고 서바이빈의 과잉발현을 보이는 다른 종양들에 대한, 화학 요법적인 제제나 다른 심한 부작용을 초래할 수 있는 제제들을 사용하지 않으면서 환자들의 웰빙을 향상시키는 새로운 효능이 있고 안전한 치료 방법에 대한 필요가 존재한다.

도 1은 마이크로스피어가 구동하는 건강한 공여자의 말초혈액의 CDC2-001과 ASPM-002 특이적 CD8+ 임파구에 대한 증식 테트라머 분석이다. 웰당 1 x 10⁶ CD8+ 농축된 PBMC는 고밀도 종양 항원 A*2402/CDC2-001(왼쪽 패널) 또는 항-CD28 및 고밀도 종양 항원 A*024/ASPM-002(오른쪽 패널)와 연결된 마이크로스피어로 매주 자극되었다. 세 번의 생체 외 자극 후, 모든 세포들은 항체 CD8 FITC 그리고 형광 표지된 테트라머 A*2404/CDC2-001과 A*2402/ASPM-002-001로 염색되었다. 세포들은 CD8+ 임파구에 입장하며; 플롯의 숫자들은 CD8+ 임파구(멀티머-양성 세포) 중 세포의 백분율을 나타낸다.
도 2는 IMA-BIR-002와 IMA-MET-005의 상대적 생체 외 결합은 15-머를 가장 빈번한 HLA-DR 대립유전자에 구동시켰다. 프로이뮨 리빌(ProImmune REVEAL: 상표) 기술은 생체 외 HLA-DR 조립 분석을 MHC의 속도를 결정하기 위해 사용한다: 펩티드 복합체는 각각 펩티드 결합 상수의 주요 결정인자이다. 분석은 프로이뮨(ProImmune, 영국 옥스포드 소재)에 의해 수행되었다. 고정된 시점에서, 완전한 MHC:펩티드 복합물의 양은 통과/실패 대조군(상대적으로 약한 결합제)의 양과 비교하여 측정된다. 강하고, 무작위적인 HLA-DR 결합제는 양성 대조군으로서 포함된다. 숫자들은 통과/실패 대조군에 비해 각각 펩티드와 HLA-DR 분자의 결합의 양을 나타낸다. 리빌(REVEAL: 상표) 기술이 15-머로 한정되어있기 때문에, 두 중복되는 15-머(위치 2 내지 16; 6 내지 20)가 전체 길이 MET-005 대신에 시험되었다.
도 3a 및 도 3b는 백신 접종된 환자의 다른 시점에서 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)의 PSMA와 서바이빈 특이적 IFNγ 분비 CD4⁺ T-세포의 존재를 도시하며 이는 IFNγ-엘리스팟(EliSpot)을 사용하여 정해진다. 시점: 백신 전 (a) 그리고 3차(b), 6차(c), 7차(d), 8차(e), 9차(f), 10차(g), 11차(h) 백신 후.
도 4는 백신 접종된 환자의 세 번의 다른 시점의 PMBC에 있는 서바이빈 특이적 IFNγ, IL-5, IL-10, TNFα 분비 CD4⁺ T-세포를 보여주며 이는 세포 내 염색-분석 (ICS)을 통해 정해진다. 시점: 백신 후 1차(a), 3차(b), 7차(c).

별도로 설명되지 않은 이상 본원에서 사용된 모든 용어는 아래와 같이 정의된다. "펩티드"라는 용어는 알파-아미노와 인접한 아미노산의 카르보닐 기 사이에서 보통 펩티드 결합으로 서로 연결되는 아미노산 잔기의 서열을 가리킨다. 펩티드는 9개 아미노산의 길이가 선호되지만 8개 아미노산만큼 짧을 수 있고, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 또는 18개 아미노산만큼 길 수도 있다.

본원에서 "올리고펩티드"라는 용어는 알파-아미노와 인접한 아미노산의 카르보닐 기 사이에서 보통 펩티드 결합으로 서로 연결되는 일련의 아미노산 잔기의 서열을 가리킨다. 본 발명에서 올리고펩티드의 길이는 정확한 에피톱 또는 에피톱들이 유지되는 이상 중요하지 않다. 올리고펩티드는 일반적으로 약 30개 아미노산보다 길이가 짧고, 약 14개 아미노산보다 길다.

"폴리펩티드"라는 용어는 알파-아미노와 인접한 아미노산의 카르보닐 기 사이에서 보통 펩티드 결합으로 서로 연결되는 일련의 아미노산 잔기의 서열을 가리킨다. 본 발명에서 폴리펩티드의 길이는 정확한 에피톱 또는 에피톱들이 유지되는 이상 중요하지 않다. 펩티드 또는 올리고펩티드와 다르게, 폴리펩티드는 약 30개 이상의 아미노산 잔기를 가지고 있는 분자를 말한다.

이런 분자의 펩티드, 올리고펩티드, 단백질 또는 폴리뉴클레오티드 암호화는 면역 반응을 유도할 수 있으면 "면역원성"이다(그러므로 "면역원"은 본 발명의 범주 내에 있다). 본 발명의 경우, 면역원성은 T-세포 반응을 유도하는 능력으로 특정하게 정의된다. 그러므로, "면역원"은 면역 반응을 유도할 수 있는 분자이고, 본 발명의 경우 T-세포 반응을 유도할 수 있는 분자이다.

T 세포 "에피톱"은 적당한 친화력을 가진 MHC/펩티드 복합물에 결합하는 매칭 T-세포 수용체를 갖는 T 세포에 의해 인식될 수 있는 삼항 복합물(MHC 유형 I 알파 쇄, 베타-2-미세글로블린 그리고 펩티드)을 생성하는 유형 I 또는 II MHC 수용체에 결합하는 짧은 펩티드를 필요로 한다. MHC 유형 I 분자에 결합하는 펩티드는 일반적으로 길이가 8 내지 14개인 아미노산이며, 가장 일반적으로 길이가 9개인 아미노산이다. MHC 유형 II 분자에 결합하는 T 세포 에피톱은 일반적으로 길이가 12 내지 31개인 아미노산이다. MHC 유형 II 분자에 결합하는 펩티드의 경우, 동일한 펩티드와 그에 상응하는 T 세포 에피톱은 공동의 핵심 분절을 공유할 수 있지만, 각각 핵심 서열의 아미노-말단의 상단과 카복시-말단의 하단의 다른 길이의 측면 서열 때문에 전체 길이는 다를 수 있다. MHC 유형 II 수용체는 더 열려있는 형태를 가지고 있으며, 그에 따라 MHC 유형 II 수용체에 결합한 펩티드는 MHC 유형 I 분자 펩티드-결합 틈보다 MHC 유형 II 분자 펩티드-결합 틈의 구조에 완전하게 묻혀있지 않다. 놀랍게도, 이것은 서열번호 1에 따른 펩티드에서는 사실이 아니며, 이는 펩티드 길이의 작은 변화가 활성의 극단적인 감소로 이끌기 때문이다(아래 참조).

인간에는 MHC 유형 I 분자를 암호화하는 3개의 유전자 좌가 있다(인간의 MHC-분자는 또한 지정된 인간 백혈구 항원이다(HLA)): HLA-A, HLA-B 및 HLA-C. HLA-A*01, HLA-A*02 및 HLA-A*11은 이 유전자 좌에서 발현할 수 있는 다른 MHC 유형 I 대립유전자의 예이다.

MHC 유형 II 유전자의 인간 게놈에는 3개의 다른 유전자 좌가 있다: HLA-DR, HLA-DQ, 그리고 HLA-DP. MHC 유형 II 수용체는 세포막에서 막을 통하는 영역을 통해 고정된 알파와 베타 쇄를 가지고 있는 이형 이중체이다. HLA-DRB1*04와 HLA-DRB1*07은 이 유전자 좌에 암호화되는 것으로 알려진 다른 MHC 유형 II 베타 대립유전자의 두 가지 예이다. 유형 II 대립유전자는 매우 다형성이고, 예를 들면, 수 백개의 다른 HLA-DRB1 대립유전자가 기재되었다. HLA-A*02와 가장 잦은 HLA-DR 혈청형에서, 다른 집단에서의 발현 빈도는 표 2에 나와있다.

[표 2]

HLA*A02와 가장 잦은 HLA-DR 혈청형의 발현 빈도 F를 제공한다. 빈도수는 모리(Mori) 등으로부터 적용된 미국 인구 사이의 일배체형 빈도 G_f에서 하디 바인베르그(Hardy-Weinberg) 공식 F=1-(1-G_f)²를 적용해 추론된다(Mori et al., 1997). A*02와 특정 HLA-DR 대립유전자의 조합은 풍부해지거나 연관 비평형으로 인해 단일 빈도에서 예상되는 것보다 덜 빈번할 수 있다. 자세한 내용은 문헌(Chanock et al., 2004)을 참조한다.

[표 3]

HLA*A024와 HLA*A02402 혈청형의 발현 빈도 F를 제공한다. 빈도는 모리 등에서 적용된 인구의 반수체형 빈도 G_f에서 하디-바인베르그 공식 F=1-(1-G_f)²를 이용하여 추론되었다(Mori et al., 1997). 더 자세한 사항을 위해서는 문헌(Chanock et al., 2004)을 참조한다.

세계의 HLA*02 및 A*2402 혈청형의 발현 빈도

따라서, 치료와 진단 목적을 위해서 적당한 친화력으로 여러 다른 HLA 유형 수용체에 결합하는 펩티드가 매우 바람직하다. 몇 개의 다른 HLA 유형 II 분자에 결합하는 펩티드는 불규칙 결합자라고 불린다.

본원에서 사용되는 것처럼, DNA 서열에 대한 참조는 한 가닥 그리고 이중 가닥 DNA를 포함한다. 그러므로, 특정 서열은, 문맥에서 다르게 나타내지 않는 한, 그 서열의 한 가닥 DNA, 상보물이 있는 그 서열의 듀플렉스(이중 가닥 DNA) 그리고 그 서열의 상보물을 말하는 것이다. 용어 "암호화 영역"은 자연적인 게놈 환경에서 유전자의 발현 생성물을 자연스럽게 또는 정상적으로 암호화하는 유전자의 부분, 즉, 유전자의 본래의 발현 생성물을 위한 생체 내 암호화 영역을 말한다.

암호화 영역은 정상적이거나 변이 또는 개조된 유전자에 있을 수 있거나, 또는 DNA 서열, 또는 DNA 합성 분야의 기술자에게 잘 알려진 방법을 사용해서 실험실에서 전적으로 합성된 유전자에 있을 수 있다.

용어 "뉴클레오티드 서열"은 데옥시리보뉴클레오티드의 헤테로중합체를 말한다.

특정 펩티드, 올리고펩티드 또는 폴리펩티드에 대한 뉴클레오티드 서열 암호화는 자연적으로 발생하거나 합성적으로 구축될 수도 있다. 일반적으로, 이 발명의 펩티드, 폴리펩티드 그리고 단백질을 암호화하는 DNA 분절은 cDNA 단편들과 짧은 올리고뉴클레오티드 연결기(linker), 또는 올리고뉴클레오티드의 연속에서 미생물이나 바이러스 오페론에서 파생된 규제 요소를 가진 재조합 전사 단위에서 발현될 수 있는 합성 유전자를 제공하기 위해서 조립된다.

용어 "발현 생성물"은 유전자의 자연 번역 생성물인 폴리펩티드 또는 단백질 이고 유전적 암호화 퇴화로 인해 초래된 임의의 핵산 서열 암호화와 상응하므로 동일한 아미노산을 암호화한다.

암호화 서열을 말할 때, 용어 "단편"은 발현 생성물이 완전한 암호화 영역의 발현 생성물과 같은 동일한 생물학적 기능이나 활성을 본질적으로 유지하는 완전한 암호화 영역보다 적은 부분의 DNA를 말한다.

용어 "DNA 분절"은 예를 들면 복제 벡터를 사용하여 적어도 하나의 상당히 순수한 형태로 분리되는 DNA에서 파생된 별도의 단편 또는 큰 DNA 구성의 구성 요소로서의 형태의 DNA 중합체, 즉, 내생 오염 물질이 없고 분절의 식별, 조작 그리고 복구를 가능하게 하는 양 또는 농도이며 그의 표준 생화학적 방법에 따른 구성 요소 뉴클레오티드 서열을 말한다. 그러한 분절은 통상적으로 진핵 생물 유전자에 나타나는 내부 비번역 서열, 또는 인트론에 의해 방해되지 않는 오픈 리딩 프레임(open reading frame)의 형태로 제공된다. 비번역 DNA의 서열은 암호화 영역의 조작이나 발현을 방해하지 않는 오픈 리딩 프레임의 하단에 나타날 수 있다.

용어 "프라이머"는 하나의 표준 DNA와 짝을 이룰 수 있는 짧은 핵산 서열이며 DNA 중합효소가 데옥시리보뉴클레오티드 쇄의 합성을 시작하는 자유 3'-OH 끝을 제공한다.

용어 "프로모터"는 전사를 시작하기 위한 RNA 중합효소의 결합에 관련된 DNA의 영역을 뜻한다.

용어 "단리된"은 물질이 원래의 환경(예를 들면, 자연적으로 발생하는 경우에는 자연 환경)에서 제거가 되는 것을 뜻한다. 예를 들면, 자연-발생하는 살아 있는 동물에서 나타나는 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드는 단리되지 않지만, 자연계에서 공존하는 물질의 부분 또는 전체에서 분리되는 같은 뉴클레오티드 또는 폴리펩티드는 단리된다. 그러한 폴리뉴클레오티드는 벡터의 부분일 수 있고/있거나 그러한 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드는 성분의 한 부분일 수 있으며, 그러한 벡터 또는 조성물이 자연 환경의 한 부분이 아닐 때 여전히 단리될 수 있다.

본 발명에 따라 공개되는 폴리뉴클레오티드, 그리고 재조합 또는 면역원성의 폴리펩티드는 "정제된" 형태일 수도 있다. 용어 "정제된"은 완벽한 순도를 필요로 하지 않는다; 오히려, 그것은 상대적인 정의로 만들어졌으며, 관련된 기술자들이 이해하는 용어로서 상당히 정제된 제제 또는 부분적으로 정제된 제제를 포함할 수 있다. 예를 들면, cDNA 라이브러리에서 단리된 각각의 클론은 전기 영동 동일성으로 통상적으로 정제된다. 출발 물질 또는 자연 물질에 대한 하나 이상의 자릿수에 따른 정제는, 바람직하게는 10² 또는 10³ 정도, 그리고 더욱 바람직하게는 10⁴ 또는 10⁵ 정도는 명시적으로 고려된다. 더욱 바람직하게는 무게의 99.999중량%, 또는 99.99중량% 또는 99.9중량% 이상; 그리고 심지어는 99중량% 보다 큰 순도를 가진 것으로 주장되는 폴리펩티드가 명시적으로 고려된다.

본 발명에 따라 밝혀진 핵산과 폴리펩티드 발현 생성물뿐만 아니라, 그러한 핵산 및/또는 그러한 폴리펩티드를 가진 발현 벡터는 "강화된 형태"일 수 있다. 본원에서 사용되는 것처럼, 용어 "강화된"은 물질의 농도가 최소한 그의 자연적 농도의 (예를 들면) 2, 5, 10, 100, 또는 1000 배 정도이고, 유리하게 0.01중량%, 바람직하게는 최소한 약 0.1중량% 정도이다. 약 0.5중량%, 1중량%, 5중량%, 10중량%, 그리고 20중량% 강화된 제제도 고려된다. 본 발명이 포함되는 서열, 구성, 벡터, 클론, 그리고 다른 물질들은 유리하게 강화된 또는 단리된 형태가 될 수 있다.

용어 "활성 단편"은 예를 들면 토끼, 또는 쥐 그리고 인간을 포함한 포유류 같은 동물에게 단독으로 또는 임의적으로 적당한 아쥬반트와 함께 투여했을 때 면역 반응을(즉, 면역원성 활성이 있음) 생성하고 인간과 같은 수용 동물 내에서 T-세포 반응을 자극하는 형태로 면역 반응을 나타내는 단편이다. 다르게는, "활성 단편"은 또한 생체 외 T-세포 반응을 유도하기 위해서 사용될 수 있다.

본원에서 사용된 "부분", "분절", 그리고 "단편"이라는 용어는, 폴리펩티드와 관련하여 사용될 때, 서열이 더 큰 서열의 하위 집합을 형성하는 아미노산 잔기와 같은 잔기의 지속적인 배열을 말한다. 예를 들면, 폴리펩티드를 트립신이나 키모트립신 같은 임의의 일반적인 엔도펩티다제로 처리한다면, 그러한 처리로 인해 생기는 올리고펩티드는 출발 폴리펩티드의 부분, 분절 또는 단편을 나타낼 것이다. 이것은 임의의 그러한 단편이 완전히 동일하지 않은 경우 아미노산 서열의 한 부분으로써 서열번호 1 내지 서열번호 20의 자연적으로 생성하는, 또는 "모" 단백질에 상응하는 서열번호 1 내지 서열번호 20과 상당히 일치하는 분절, 단편 또는 부분을 포함할 것을 의미한다. 폴리뉴클레오티드와 관련해서 사용될 때, 그러한 용어들은 일반적인 엔도뉴클레아제 중 임의의 것과 함께 언급된 폴리뉴클레오티드의 처리에 의해 생성된 생성물을 말한다.

본 발명에 따라, 서열을 말할 때 용어 "백분율 일치" 또는 "백분율 일치하는"은 설명되거나 명시된 서열("기준 서열")과 비교될 서열의 정렬 후("비교 서열") 서열이 명시된 또는 설명된 서열에 비교되는 것을 말한다. 백분율 일치는 아래의 공식에 따라서 결정된다:

백분율 일치 = 100[I -(C/R)]

여기서, C는 기준 서열과 비교 서열의 정렬의 길이에 걸친 기준 서열과 비교 서열의 차이의 숫자이며, 여기서,

(i) 비교 서열에서 상응하는 정렬된 염기 또는 아미노산이 없는 기준 서열에 각 염기 또는 아미노산;

(ii) 기준 서열의 각 차이; 그리고

(iii) 비교 서열의 정렬된 염기 또는 아미노산과 다른 기준 서열의 각 정렬된 염기 또는 아미노산이 차이를 구성하며;

R은 비교 서열과의 정렬의 길이에 걸친 기준 서열 염기 또는 아미노산의 숫자이고 기준 서열에 생긴 공백도 염기 또는 아미노산 개수로 계산된다.

상기와 같이 계산된 비교 서열과 기준 서열 사이의 백분율 일치가 특정 최소 백분율 일치와 같거나 더 크다면 상기 계산된 백분율 일치가 특정 백분율 일치보다 작은 경우, 정렬이 있더라도 비교 서열은 기준 서열에 대해 특정한 최소 백분율 일치를 갖는다.

본원에 개시된 본래 펩티드는 달리 언급되지 않는 이상 다른, 선발적인, 펩티드 쇄내의 부위의 하나 또는 이상의 잔기의 대체에 의해 변형될 수 있다. 그러한 대체는, 예를 들면, 소수성의 아미노산이 다른 소수성의 아미노산으로 대체되는 것처럼, 하나의 아미노산이 유사한 구조 그리고 특징의 아미노산으로 대체되는, 보존적인 성격일 수 있다. 심지어 더 보존적인 것은 류신이 이소류신으로 대체되는 것 같이, 같거나 비슷한 크기와 화학적 특성을 가진 아미노산으로 대체되는 것이다. 자연적으로 발생하는 동종 단백질의 종족에서의 서열 변화의 연구에서, 특정 아미노산 대체는 다른 것들보다 더 자주 용납되고 있으며, 이들은 본래의 아미노산과 대체 사이에서 크기, 전하, 극성, 그리고 소수성이 비슷한 상관관계가 나타나며, 이것은 "보존적인 대체"를 정의하는데 기본이 된다.

여기서 보존적인 대체는 아래의 다섯 개 군 중 하나의 교환으로 정의된다: 군 1-작은 지방족, 비극성의 또는 약간 극성의 잔기(Ala, Ser, Thr, Pro, Gly); 군 2-극성의, 음성 전하된 잔기와 그들의 아미드(Asp, Asn, Glu, Gln); 군 3-극성의, 양성 전하된 잔기(His, Arg, Lys); 군 4-큰, 지방족, 비극성 잔기(Met, Leu, Ile, Val, Cys); 그리고 군 5-큰, 방향족 잔기(Phe, Tyr, Trp).

덜 보존적인 대체는 알라닌을 이소류신 잔기로 대체하는 것처럼, 비슷한 성질이지만 크기가 어느 정도 다른 아미노산으로 대체하는 것을 포함할 수 있다. 아주 비-보존적인 대체는 산성 아미노산을 극성의, 또는 심지어는 그 특성이 염기성인 아미노산으로 대체하는 것을 포함할 수도 있다. 이런 "라디칼" 대체는, 그러나, 화학적 작용이 완전히 예측불가능하고 라디칼 대체가 단순한 화학 원리에서 예측 가능하지 않은 뜻밖의 작용이 있을 수 있기 때문에 효과가 없다고 무시할 수 없다.

물론, 이런 대체는 일반적인 L-아미노산 외 다른 구조를 포함할 수 있다. 그러므로, D-아미노산이 본 발명의 항원 펩티드에서 흔히 발견되고 본원의 기재에 포함되는 L-아미노산을 대체할 수 있다. 또한, 비-표준 R 기(즉, 자연 단백질의 일반적인 20 아미노산에서 찾을 수 없는 R 기)를 갖는 아미노산 역시 본 발명에 따라 면역원성과 면역원성 폴리펩티드를 생산하기 위해서 대체될 수 있다.

하나 이상의 위치에서 아래에서 정의된 것과 매우 비슷하거나 더 큰 항원 활성을 가진 대체물이 발견되면, 그러한 대체의 조합은 조성된 대체물이 펩티드의 항원성에 더해지거나 시너지 효과를 내는지 결정하기 위해 검사될 것이다. 최대, 펩티드에서 네 가지 이상의 위치는 동시에 대체될 수 없다.

용어 "T-세포 반응"은 특정 확산과 생체 외 또는 생체 내에서 펩티드에 의해 유도되는 효과기(effector) 기능의 활성화를 뜻한다. MHC 유형 I 제한 CTL에서는, 효과기 기능이 펩티드-펄스, 펩티드-전조 펄스 또는 자연적 펩티드를 나타내는 목적 세포들의 세포 용해, 사이토킨, 바람직하게는 인터페론-감마, TNF-알파, 또는 펩티드에서 유도되는 IL-2의 분비, 효과기 분자의 분비, 바람직하게는 그랜자임(granzyme) 또는 펩티드에서 유도되는 퍼포린의 분비 또는 탈과립일 수 있다. MHC 유형 II-제한 조력 T 세포에서는, 효과기 기능이 사이토킨의 펩티드 유도된 분비, 바람직하게는, IFN-감마, TNF-알파, IL-4, IL-5, IL-10, 또는 IL-2, 또는 펩티드-유도되는 탈과립일 수 있다. CTL과 T 조력 세포의 가능한 효과기 기능은 이 목록에 국한되지 않는다.

치료에 대한 면역요법적 접근

면역 반응 자극은 숙주 면역계가 항원의 존재를 이질의 것으로 인식하는 것에 의존한다. 기존의 종양 관련된 항원의 발견은 자가 면역계를 종양의 성장에 방해하도록 사용하는 것의 가능성을 제기했다. 면역계의 체액 그리고 세포 암(arm), 양방을 활용하는 다양한 기전이 현재 암 면역 치료를 위해 탐구된다.

세포 면역 반응의 특정 요소는 종양 세포를 구체적으로 인식하고 파괴할 수 있다. 종양 침투 세포 집단 또는 말초 혈액에서의 독성 T세포(CTL)의 단리는, 그러한 세포들이 암에 대한 자연 면역 방어에서 중요한 역할을 한다는 것을 제시한다. 특히 CD8-양성 T 세포는 세포질에 있는 일반적으로 8 내지 10개의 단백질 잔류물이나 결함이 있는 리보솜 생성물(DRIPS)(Schubert U, Anton LC, Gibbs J, Norbury CC, Yewdell JW, Bennink JR.; 프로테아좀에 의해 새로 합성된 단백질의 큰 단편의 신속한 분해; Nature 2000; 404(6779):770-774)을 함유한 주조직 적합성 복합체(MHC)의 유형 Ι 분자를 인식하고, 이 반응에서 중요한 역할을 한다. 인간의 MHC-분자는 인간 백혈구 항원(HLA)으로도 지정된다.

MHC-분자에는 두개의 유형이 있다: MHC 유형 I 분자는 주요 내생 세포질 또는 핵 단백질(DRIPS)의 단백질 가수 분해 분열의 결과인 펩티드 및 큰 펩티드를 보이는 핵이 있는 대부분의 세포에서 찾을 수 있다. 하지만 엔도좀의 구획이나 외인성 출처로부터 유래하는 펩티드는 MHC 유형 I 분자에서도 종종 발견된다. 이러한 비전통적인 방식의 유형 I의 제시를 문헌에서는 교차-항원 제시라고 칭한다. MHC 유형 II 분자는 전문적인 항원을 보이는 세포(APC) 및 세포 이물 흡수 과정 동안 APC에 의해서 일어나는 외인성 단백질의 펩티드에서 주로 찾을 수 있으며, 이후 처리된다. 유형 I에 대하여, 펩티드가 내인성 출처로부터 MHC 유형 분자에 의하여 제시되는 것을 허용하는 항원 처리의 다른 방식들이 설명된다(예: 자가 포식). 펩티드와 MHC 유형 I 분자의 복합물은 적당한 TCR을 함유한 CD8-양성 세포독성 T-임파구에 의해 인식되는 반면, 펩티드와 MHC 유형 II 분자의 복합물은 적당한 TCR을 함유한 CD4-양성 조력 T-세포에 의해 인식된다.

CD4-양성 조력 T-세포는 항종양 T-세포 반응의 효과기 기능을 조정하는데 중요한 역할을 하고, 이 때문에, 종양 관련된 항원(TAA)에서 파생된 CD4-양성 T-세포의 식별이 항종양 면역 반응을 자극하는 의약 제품 개발에 매우 중요할 수 있다(Gnjatic, S., D. Atanackovic, E. Jager, M. Matsuo, A. Selvakumar, N.K. Altorki, R.G. Maki, B. Dupont, G. Ritter, Y.T. Chen, A. Knuth, and L.J. Old. 암 환자의 NY-ESO-1에 대해서 자연적으로 일어나는 CD4+ T-세포 반응에 대한 조사: 항체 반응과의 상호 작용. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2003, 100 (15): 8862-7). CD4+ T 세포는 IFN-감마를 국소 증가된 수준으로 이끌 수 있다.

쥐와 같은 포유류 동물 모델에서 보면, 세포독성 T 임파구(CTL) 효과기 세포 (즉, CD8-양성 T 임파구) 부재시라도, 인테페론-감마(IFNγ) 분비 작용에 의한 신생 혈관생성 억제를 통해 CD4 양성 T-세포는 종양의 발현을 충분히 억제한다(Qin, Z. and T. Blankenstein) CD4+ T 세포 매개된 종양 거부는 혈액 비생성 세포에 의한 IFN 감마 수용체 발현에 의존하는 신생 혈관생성 억제를 포함한다(Immunity. 2000, 12:677-686). 또한, HLA 유형 II 분자에서 보이는 종양 관련 항원에서 CD4 양성 T-세포를 인식하는 펩티드는 항체(Ab) 반응의 유도를 통해 종양의 진행을 방해할 수 있는 것으로 밝혀졌다(Kennedy, R.C., M.H. Shearer, A.M. Watts, and R.K. Bright). CD4+ T 임파구는 항체 생산과 유인원 바이러스 40 큰 종양 항원에 대한 종양 면역에서 중요한 역할을 한다(Cancer Res. 2003, 63:1040-1045). HLA 유형 I 분자와 결합하는 종양 관련 펩티드와 다르게, 지금까지 유형 II TAA 리간드의 소수만이 기재되었다(www.cancerimmunity.org, www.syfpeithi.de).

HLA 유형 II 분자의 요소 발현이 일반적으로 면역계의 세포에 제한되므로, 일차 종양에서 직접적으로 유형 II 펩티드를 단리하는 것은 불가능하다고 간주되었다. 그러나, 본 발명자들은 최근에 몇몇의 MHC 유형 II 에피톱을 종양에서 직접적으로 식별하는데 성공하였다(EP 1642905, EP 1760088; Dengjel J, Nastke MD, Gouttefangeas C, Gitsioudis G, Schoor O, Altenberend F, Muller M, Kramer B, Missiou A, Sauter M, Hennenlotter J, Wernet D, Stenzl A, Rammensee HG, Klingel K, Stevanovic S.; 일차 신장 세포 암종에서 HLA 유형 II를 제시하는 펩티드의 예기치 않은 과다; Clin Cancer Res. 2006; 12:4163-4170).

염증이 없을 시에는, MHC 유형 II 분자의 발현은 주로 면역계의 세포, 특히 전문적인 항원이 있는 세포(APC), 예를 들면, 단핵 세포, 단핵 세포 유래 세포, 대식 세포, 수지상 세포로 제한된다. 종양 환자들에게서 놀랍게도 종양 세포들이 MHC 유형 II 분자들을 발현하는 것이 발견되었다(Dengjel J, Nastke MD, Gouttefangeas C, Gitsioudis G, Schoor O, Altenberend F, Muller M, Kramer B, Missiou A, Sauter M, Hennenlotter J, Wernet D, Stenzl A, Rammensee HG, Klingel K, Stevanovic S.; 일차 신장 세포 암종에서 HLA 유형 II를 보이는 펩티드의 예기치 않은 과다; Clin Cancer Res. 2006; 12:4163-4170).

펩티드가 세포 면역 반응을 유도하려면, MHC-분자에 결합해야 한다. 이 과정은 MHC-분자의 대립유전자와 펩티드의 아미노산 서열의 특정 다형성에 의존한다. MHC 유형 I 결합 펩티드는 보통 길이가 8 내지 10개인 아미노산의 잔기이며 보통 해당하는 MHC-분자의 결합 홈과 상호작용하는 서열에 두 개의 보존 잔기("앵커")를 가지고 있다. 이런 식으로 각각의 MHC 대립유전자는 어떤 펩티드가 결합 홈에 특이적으로 결합하는가를 결정하는 "결합 모티프"를 가진다(Rammensee HG, Bachmann J, Stevanovic S. MHC 리간드와 펩티드 모티프, Landes Bioscience, USA, 1997).

MHC 의존 면역 반응에서, 펩티드는 종양 세포에 의해 발현되는 특정한 MHC 분자에 결합할 수 있어야 할 뿐 아니라, 특정의 T-세포 수용체(TCR)를 함유한 T-세포에 의해 인식되어야 한다.

종양 특이적 T-임파구, 즉, 에피톱에 의해 인식되는 항원들은 모든 단백질 부류, 예를 들면, 효소, 수용체, 전사 인자 등에서 유래된 분자일 수 있다. 더욱이 예를 들어 종양 관련 항원은 종양 세포들, 예로 변이된 유전자의 생성물에서만 나타날 수 있다. 또 다른 중요한 종양 관련 항원의 부류로는 여러 종류의 종양과 건강한 고환 조직에서 나타나는 CT("암 고환")같은 조직 특이적 항원이 있다.

다양한 종양 관련 항원이 동정되었다. 또한, 추가적인 종양 관련 항원을 동정하기 위해 많은 연구 노력이 소모된다. 또한, 당업계에서 종양 특이적 항원으로 불리는 종양 관련 항원의 일부 군은 조직에 특이적이다. 예 중에는 흑색종을 위한 티로시나아제, 전립선암을 위한 PSA와 PSMA, 그리고 림프종의 bcr/abl 같은 염색체 크로스오버(전좌)가 있지만 이로써 제한되지 않는다. 그러나 식별된 많은 종양 관련 항원은 여러 개의 종양 유형에서 일어나고, 그 중에 발암성 단백질 및/또는 사실상 변화를 일으키는 종양 억제 유전자(종양 억제 유전자는 예를 들면 신장암에서 검토된다(Linehan WM, Walther MM, Zbar B. 신장암의 유전적 기반. J Urol. 2003 Dec; 170(6Pt1):2163-72))는 거의 대부분의 종양 유형에서 나타난다. 예를 들어, p53(종양 억제 유전자의 예), ras, c-met, myc, pRB, VHL 및 HER-2/neu 같이, 세포 성장과 분화를 조절하는 정상 세포 단백질은 돌연변이를 누적시켜 이들 유전자 산물의 발현을 상향조절하여 발암성으로 만들 수 있다(McCartey et al. Cancer Research, 1998, 15:58 2601-5; Disis et al. Ciba Found. Symp. 1994, 187:198-211). 이런 돌연변이 단백질은 또한 여러 종류의 암에서 종양 특이적 면역 반응의 표적이 될 수 있다.

암환자의 면역요법의 목적은 면역계의 세포, 구체적으로 특히, 세포 독성 T-세포(CTL, 또는 "킬러 세포" 또는 CD8-양성 T-세포)라고 불리는 세포를 건강한 조직이 아닌 종양 세포에 대해서 활성화시키는데 있다. 종양 세포는 종양 관련 단백질을 나타내는 점에서 건강한 세포와 다르다. 세포 표면에 있는 HLA 분자는 밖으로는 세포 함량을 보여주고, 따라서 세포독성 T 세포가 건강한 세포와 종양 세포를 구별할 수 있도록 만들어 준다. 이것은 세포 속의 모든 단백질을 짧은 펩티드로 파괴하고, HLA 분자에 붙어 세포 표면에 나타남으로써 실현된다(Rammensee, et al., 1993). 신체의 건강한 세포에서는 잘 나타나지 않고, 종양 세포에 나타나는 펩티드는 종양 관련 펩티드(TUMAP)라고 불린다.

단백질이 세포독성 T 림프구에 의해 종양 특이적이거나 종양 관련된 항원으로 인식되고, 치료에 사용되기 위해서는 특정 전제 조건이 충족되어야 한다. 항원은 정상의 건강한 조직에서는 나타나지 않거나 비교적 조금만 나타나야 하고, 종양 세포에서 주로 나타나야 한다. 그리고 더욱 바람직한 것은, 각 항원이 종양 종류에서 나타나는 것뿐 아니라, 농도도 높아야 한다(예를 들면, 세포당 각 펩티드의 복제 수). 종양 특이적 그리고 종양 관련된 항원은 종종 세포 주기 제어나 아포토시스 같은 기능에 의해 정상 세포에서 종양 세포로의 변형에 직접 관련된 단백질에서 유래된다. 또한, 변형을 직접적으로 일으키는 단백질의 하류 목적은 상향조절될 수 있으며 따라서 간접적으로 종양과 관련될 수 있다. 이런 간접 종양 관련 항원은 백신의 표적이 될 수 있다. 두 가지 경우 모두 항원의 아미노산 서열에 있는 에피톱의 존재가 중요하며, 이는 이런 펩티드(면역 펩티드)가 종양 관련 항원에서 유래되었기 때문에 생체 외 또는 생체 내 T 세포 반응을 인도한다.

기본적으로, MHC 분자에 결합할 수 있는 임의의 펩티드는 T-세포 에피톱으로 작용할 수 있다. 생체 외 또는 생체 내 T 세포 반응 유도의 필요 조건은 상응하는 TCR이 있는 T-세포의 존재와 이 특정 에피톱에 대한 내성의 부재이다. T-조력 세포는 항종양 면역의 CTL 효과기 기능을 조정하는데 중요한 역할을 한다. TH1 유형의 T-조력 세포 반응을 유도하는 T-조력 세포 에피톱은 종양 관련 펩티드/MHC 복합물을 세포 표면에 드러내어 종양 세포에 향하게 하는 세포독성 기능을 포함한 CD8-양성 킬러 T-세포의 효과기 기능을 지원한다. 이 방법으로 단독으로 아니면 다른 종양 관련 펩티드와 같이 종양 관련 T-조력 세포 펩티드 에피톱은 항종양 면역 반응을 자극하는 백신 조성물의 활성 의약 성분의 역할을 할 수 있다.

CD8과 CD4에 의존하는 두 가지 유형의 반응이 항종양 효과에 공동으로 그리고 상조적으로 기여하므로, CD8+ CTL(MHC 유형 I 분자) 아니면 CD4-양성 CTL(MHC 유형 II 분자)에 의해 인식되는 종양 관련 항원의 식별과 특성화는 종양 백신의 개발에 중요하다. 따라서, MHC 복합물의 두 유형에 결합하는 펩티드를 가진 펩티드 조성물을 제공하는 것이 본 발명의 목적이다.

종양 관련 펩티드를 이용한 첫번째 임상 실험은 주로 흑색종에 대해 1990년대 중반 분(Boon)과 동료들에 의해서 시작되었다. 임상 반응은 가장 좋은 실험에서 10% 내지 30% 정도의 범위를 나타냈다. 펩티드를 기반으로 한 백신 단독 요법을 사용한 임의의 임상 실험에서 심한 부작용이나 심한 자가 면역은 보고되지 않았다. 자극성이 적은 상태의 백반이 흑색종 관련 펩티드로 치료된 일부 환자에서 보고되었다.

그러나 모든 종양 세포를 없애기에는 CTL 한 종류에 대한 프라이밍(primimg)은 보통 충분하지 않다. 종양은 돌연변이 발생률을 높이는 성질이 있기 때문에 단백질 패턴을 바꿔 CTL의 인식을 피함으로써 CTL 공격에 반응할 수 있다. 종양 회피 기전을 반대로 공격하기 위해서는 다양한 특정한 펩티드가 백신으로 사용된다. 이러한 방식으로 종양에 대한 광범위한 동시 공격이 여러 CTL 클론에 의해 동시에 이루어질 수 있다. 이것은 종양이 면역 반응을 피할 가능성을 저하시킬 수 있다. 이 가설은 최근 말기 흑색종 환자를 치료하는 임상 연구에서 확인되었다. 단 몇 가지 예외를 제외하고, 최소한 3가지의 별개의 T-세포 반응을 보인 환자는 객관적인 임상 반응 또는 안정적인 질병(Banchereau et al., 2001)뿐만 아니라 증가된 생존(반케루(J. Banchereau)와 개별 소통)을 보였고, 3가지 미만의 T-세포 반응을 보인 환자들의 대부분은 진행중인 질병으로 진단되었다.

지원자의 연구 결과 신장 세포암 환자들이 13개의 다른 펩티드로 구성된 백신으로 치료되었을 때도 비슷한 효과를 보였다(H. Singh-Jasuja, S. Walter, T. Weinschenk, A. Mayer, P. Y. Dietrich, M. Staehler, A. Stenzl, S. Stevanovic, H. Rammensee, J. Frisch; 신종 멀티 펩티드 백신인 IMA901로 치료된 신장 세포암 환자들의 T-세포 반응, 임상 활동, T-세포 수준 규제의 상관 관계; ASCO Meeting 2007 Poster # 3017; M. Staehler, A. Stenzl, P. Y. Dietrich, T. Eisen, A. Haferkamp, J. Beck, A. Mayer, S. Walter, H. Singh, J. Frisch, C. G. Stief; 펩티드를 기반으로 한 암 백신 IMA901의 안정성 및 면역원성의 평가를 위한 공개 표지 연구, ASCO Meeting 2007; Poster #3017).

따라서 종양 백신의 개발의 주요 작업은 새로운 종양 관련 항원과 거기에서 유래된 면역원 T-조력 에피톱의 식별과 특성화뿐만 아니라, 각 환자의 하나 이상의 에피톱에 대한 반응의 확률을 높이기 위한 다른 에피톱의 조합이다. 따라서 인간의 주조직 적합성 복합물(MHC) 유형 I(HLA 유형 I) 또는 II(HLA 유형 II)의 분자에 결합할 수 있는 펩티드의 아미노산 서열의 조합을 제공하는 것이 본 발명의 목표이다. 펩티드 조합을 기반으로 한 효과적인 항암 백신을 제공하는 것 또한 본 발명의 목표이다.

본 발명에서, 발명자들은 포유류의 종양, 즉, 주로 위암 환자의 기본 샘플뿐만 아니라 대장암, 신장선암, 폐암, 췌장암, 악성 흑색종 그리고 위암의 기본 조직 샘플에서 HLA 유형 I 또는 II 분자에 직접 결합하는 펩티드를 단리하고 특성화하였다.

본 발명은 종양생성과 관련된 항원에서 생기고, 인간 백혈구, 특히 임파구, 그 중에 T 임파구, 그 중에 CD4 양성 T 임파구, 그 중에 TH1 유형 면역 반응을 매개하는 CD4 양성 T 임파구의 면역 반응을 자극하기 위해 MHC(HLA) 유형 II 분자에 충분히 결합할 수 있는 펩티드를 제공한다.

본 발명은 또한 종양생성과 관련된 항원에서 생기고, 인간 백혈구, 특히 임파구, 그 중에 T 임파구, 그 중에 CD8 양성 세포독성 T 임파구 면역 반응을 자극하기 위해 MHC(HLA) 유형 II 분자에 충분히 결합할 수 있는 펩티드뿐 아니라 암에 걸린 환자의 백신에 특히 유용한 두 가지의 조합을 제공한다.

본 발명에 따르면, 서열번호 1 내지 서열번호 10으로 이루어진 군 및/또는 최소한 85%가 서열번호 1 내지 서열번호 10과 동종인 다른 아미노산 서열을 가지고 있고/있거나 핵산 암호화 서열번호 1 내지 서열번호 10 또는 다른 아미노산 서열 그리고 약학적으로 허용가능한 담체 군 중에 선택된 최소한 두 가지의 아미노산 서열을 가지고 있는 약학적 조성물을 제공함에 따라 그 목표는 해결된다. 본 발명의 약학적 조성물은 또한 서열번호 11 내지 서열번호 22를 가지고 있는 군 중 선택된 아미노산 서열을 가지고 있거나, 서열번호 11 내지 서열번호 22와 85% 이상이 동일한 다른 아미노산 서열을 가지고 있거나, 핵산 암호화 서열번호 11 내지 서열번호 22나 다른 아미노산 서열을 가지고 있는 폴리뉴클레오티드를 가지고 있는 추가의 펩티드 하나로 이루어 질 수 있다. 이 펩티드는 전체 길이가 8에서 100개인 아미노산일 수 있으며, 8에서 30개가 더욱 바람직하고, 8에서 17개가 가장 바람직하다. 이 펩티드는 비펩티드 결합을 가질 수 있다.

아래에서 언급한대로, 본 발명을 기초로 한 펩티드는 MHC 유형 I이나 II로 나타내지는 세포로 식별되었다. 그러므로 그 서열을 가지고 있는 펩티드들(즉, 유래된 펩티드) 뿐만 아니라 이런 특정한 펩티드는 펩티드에 따라 그리고 환자들에 따라 다르지만, 모두 특정한 T 세포 반응을 유도한다. 예를 들면, 다른 점들은 펩티드에 있는 돌연변이 때문에 발생할 수 있다. 당업자라면 어느 정도의 반응이 펩티드에 의해 유도되는지를 정하는 방법, 특히, 본원에 나오는 실시예와 문헌에 참조된 방법을 알고 있다.

바람직하게 본 발명의 변이체들이 본 발명의 각각의 펩티드에 대한 T 세포 교차 반응을 유도할 것이다.

이 펩티드는 종양 관련 항원, 특히 예를 들면, 단백질 가수 분해, 신생 혈관생성, 세포 성장, 세포 주기 조절, 세포 분리, 전사 조절, 전이 조절, 조직 침투, 등의 기능이 있는 종양 관련 항원으로부터 나온다. 표 4는 펩티드와 펩티드가 유래된 단백질의 기능을 보여준다.

[표 4]

본 발명의 펩티드와 모단백질의 기능

[표 5]

본 발명의 조성물에 유용한 추가적인 면역원성 펩티드

세포 분열 주기 2 단백질( CDC2 )

p34cdc2 또는 Cdk1(사이클린 의존 키나제 1)로도 알려져 있는 CDC2는 세린/트레오닌 단백질 키나제 Cdk 패밀리에 속하며, 세포 주기의 제어에 중요한 역할을 한다. 이는 G2에서 M으로의 전이의 주 조절자로 알려져 있다. 세포 분열 간기 끝에, A형 사이클린과 결합하면서 활성화가 되어, 유사분열의 발생을 촉진한다. 핵막의 붕괴 이후, A형 사이클린은 분열이 되어 사이클린 B로 대체된다. CDC2와 사이클린 B의 결합체는 유사분열 촉진 요소(mitosis promoting factor - MPF)를 형성하고 이는 유사분열을 통한 세포 구동에 필수적이다.

활성 CDC2는 70개 이상의 기질을 인산화한다. 예를 들면, "연결기" 히스톤 H1의 인산화는 염색질 구조의 이완과 특정한 유전자의 전사를 불러일으키며, RNA-중합요소 II의 인산화는 전사를 향상시킨다(Cisek and Corden, 1989). BRCA2 인산화는 상동재조합 의존 복구를 촉진시키며(Esashi et al., 2005), FOXO1 인산화는 전사 활성을 억제하여, 세포 증식과 생존을 초래한다. 세퍼라아제(seperase)의 인산화는 자매 염색체의 조기 분리를 억제한다(Stemmann et al., 2001). CDC2 활성은 후기-촉진 복합체/사이클로솜(APC/C)이 사이클린 B를 유비퀴틴화시킴으로써 후기에 다시 스위치 오프되어 그 열화를 초래한다.

유사분열에서 CDC2의 기능은 비 중복적이며 Cdk2, 4와 6과 같은 다른 Cdk의 활성에 의해 보상이 되지 않는다. 반대로, CDC2는 G1에서 S로의 전이 과정 등과 같은 세포 주기에서도 기능을 한다고 밝혀진 바 있으며, "간기 cdk"를 대체할 수 있다. 따라서, CDC2는 단지 필수적인 세포 주기 Cdk인 것으로 제안되었다. 세포 주기에서의 발현과 기능 외에, 몇몇의 CDC2는 아포토시스 조건에서도 발현이 된다고 보고된 바 있으며, 향상된 활성은 유사분열의 재앙을 불러 일으킬 수 있다. 사이클린과 같은 다른 세포 주기 단백질의 발현이 더 자주 규제되지 않지만, CDC2의 과발현은 몇몇의 암에서 보여진 바 있다. 암 종류 중에서 CDC2의 과발현은 전립선암, 구강암, 구강 편평 암종(OSCC), 급성 백혈병 골수암(AML)(Qian et al., 2009), 헬리코박터 파일로리-유발 몰트 림프종(Banerjee et al., 2000)과 대장 암종(Yasui et al., 1993)에서 발생한다. 몇몇의 경우에, 과발현은 불량한 예후와 상관이 있다. 위암(GC)에서, 과발현 및/또는 향상된 활성이 보고된 바가 있으며(23건 중의 14건), CDC2 과발현이 원인이라고 제의된 바 있다. 더 나아가, CDC2는 세포 분열 중 활성 유전자 중의 하나로 밝혀졌고, 과발현된 경우 종양 염색체 불안정성을 일으킨다. CDC2의 억제제와 다른 Cdk는 종양치료제의 약물 후보로 고려된 바 있다(Shapiro, 2006).

비정상 스핀들 유사 소두증 관련 단백질(ASPM)

비정상 스핀들 유사 소두증 관련(ASPM) 단백질 유전자는 초파리의 비정상 스핀들(asp)의 인간 오르토로그(orthologue)이며 이는 상염색체 열성 원발성 소두증에서 가장 흔히 돌연변이되는 유전자이다. 인간에서 동형의 ASPM 돌연변이에 의해 생긴 결함이 있는 신경조직발생은 소두증과 정신지체를 일으킨다.

가장 흔한 원발성 상염색체 열성 소두증(MCPH)의 원인은 신경조직발생 조절에 참여하는 ASPM 유전자의 돌연변이로 보인다. ASPM은 유사분열시 스핀들 기둥 쪽에 집중된다.

siRNA 매개된 ASPM 억제는 종양 세포의 증식과 신경계 줄기세포 증식을 억제하며 이는 ASPM을 교모세포종의 잠재적인 분자 표적으로 삼는 것을 지지한다. ASPM은 정상 뇌와 비교했을 때 교모세포종에서 과발현된다. ASPM의 발현은 신경교종의 표지자로 사용될 수 있으며 치료 목표가 될 잠재성을 가지고 있다. ASPM 과발현은 향상된 침입성/전이성 잠재력의 간세포암종 HCC, p53 돌연변이 상태와 종양 단계에 관련 없는 고위험의 조기 종양 재발(ETR), 따라서 불량한 예후를 예측할 수 있는 분자 표지자이다. ASPM은 또한 불멸 세포, 암세포, 그리고 비소세포 폐암(NSCLC) 조직에서 상향조절된다(Jung et al., 2009).

유비퀴틴 　 카르복실산 -말단　가수분해 효소 L5( UCHL5 )

유비퀴틴 C-말단 가수분해 효소(UCH37) 또는 INO80R로도 알려진 유비퀴틴　카르복실산-말단　가수분해 효소 L5(UCHL5)는 탈유비퀴틴화 효소로서 프로테아솜과 관련이 있다. 이는 C-말단의 Cys76과 Lys48 사이의 이소펩티드 결합을 분해하여 멀리 있는 말단으로부터 단백질에 부착된 폴리유비퀴틴 쇄를 분열시킨다(Nishio et al., 2009).

UCHL5는 Adrm1로도 알려져 있는 19S(PA700)의 프로테아솜의 조절 분자 구성 요소이며 이소펩타이드 결합을 활성화시키는 hRpn13과 결합한다. hRpn13은 또한 유비퀴틴의 수용체의 기능을 하며, 따라서 탈유비퀴틴화에 기질 인식을 결합시킨다. UCHL5는 또한 19S 분자의 또 다른 구성 요소이며 "뚜껑"과 "받침" 사이에 자리잡고 있는 Rpn10/S5a와 결합을 하지만, 이 상호 작용은 UCHL5를 활성화시키지 못 한다. UCH37은 충분히 유비퀴틴화되지 않거나 다른 천천히 분열되는 Ub-접합체나 기질을 단백질 분해로부터 구할 수 있다. 그렇지 않다면, 이는 폴리유비퀴틴화된 기질을 최초 19S 조절 복합체 결합 위치에서 방출시켜 프로테아솜 26S의 20S의 단백질 분해 핵심으로 옮기는 것을 촉진시킴으로 분열을 향상시킨다. 핵에서, UCHL5는 또한 Ino80 염색질-리모델링 복합체과 관련이 되어 있다. 프로테아솜과 결합하면서 활성화되고 전사 또는 DNA 복구의 조절에 기여할 수 있으며 이는 Ino80 및 프로테아솜에 의해 매개된다고 제의된 바 있다. RNAi-매개된 녹다운(knockdown) UCHL5가 세포 성장, 프로테아솜 구조 또는 단백질 분해 능력에 감지될 수 있을 정도의 효과가 없지만, 세포 단백질 분해가 가속된 것으로 보아 UCHL5의 기능은 적어도 부분적으로는 다른 단백질에 의해 부여될 수 있다.

UCHL5와 같은 유비퀴틴 특정 프로테아제는 예를 들어 세포 주기의 진행, 분화, DNA 복제와 복구, 전사, 단백질 품질 관리, 면역 반응 그리고 아포토시스 등을 비롯한 몇몇의 과정과 관련이 있다. UCHL5가 악성 변환에 기여한다는 몇몇 증거가 있다. 이의 활성은 인접한 정상 조직에 비교했을 때 인간 자궁경부암 조직에서 상향조절된다고 밝혀 졌다. 이는 TGF-베타 수용체를 탈유비퀴틴화시키고 이의 하류 매개자, 스매드(Smad)를 안정화시킬 수 있으며, 따라서 TGF-베타 신호를 강화시킨다. TGF-베타 신호가 강화되면서 종양 촉진자로서 암의 말기에 이용될 수 있으나, 다른 한편으로는 이는 암 초기와 개시 전에 암 억제자로도 활동할 수 있다(Wicks et al., 2005; Wicks et al., 2006; Horton et al., 2007; Bierie and Moses, 2006).

c- Met

예를 들어 EP 08008292.8과 EP1507795B1을 참조한다. 또한, 인산화를 통한 구조적인 c-Met 활성화 또한 인간의 투명 세포 신세포암의 암 발생시 중요한 기전으로 식별되었다(Nakaigawa et al., 2006).

Met 과발현은 종종 종양 저산소증에 의해서 유도되고, 수용체의 구조적인 활성화로 이끌며, 빈약한 예후와 상관된다. 종양에서 과발현된 내생의 MET 유전자를 침묵시키는 것은 생체 외 전체 침입 성장 프로그램 실행의 손상, 종양 성장의 부족과 생체 내 실험적 전이의 생성 감소의 결과를 낳는다. 현저하게, 이미 확립된 전이에서 MET를 침묵시키는 것은 거의 완전한 퇴보를 일으킨다(Corso et al., 2008).

대식세포-자극 단백질 수용체(MST1R)

RON으로도 알려져 있는 MST1R 수용체는 세포 표면 수용체 티로신 키나아제 Met 패밀리의 일원으로서 주로 상피 세포 또는 대식세포에서 발현된다. c-MET와 마찬가지로, RON은 다양한 상피 세포 유래된 종양 또는 암에서 발현되며 이는 종양 발생에 중요한 기능을 한다고 알려져 있다. 임상 연구를 통해 MST1R의 과발현이 환자의 불리한 결과 그리고 암 전이와 관련되어 있다고 보고한 바 있다.

MST1R 발현은 위암 조직 또는 상응하는 부수 종양 조직에서 중요하지만, 이는 정상 위 점막에서 발현되지 않는다(Zhou et al., 2008). MST1R 수용체는 그 해당 리간드에 대해 세포 이동, 침입, 증식과 생존을 유도할 수 있다. 더 나아가 MST1R은 생체 외, 생체 내의 동물 모델에서 종양 활성을 가지고 있으며, 종종 인간 암에서 이상 조절된다(Dussault and Bellon, 2009). 데이터는 전립선 암세포에서의 MST1R의 녹다운은 MST1R-발현 세포와 생체 외, 뇌사자 전립선 생체 내 이식 시 비교했을 때 내피세포 주화성, 종양 성장, 미세혈관 밀도를 저하시킨다고 나타났다. 고도 종양생성 가능성이 있는 대장암 세포주에서 RNA 간섭 매개 MST1R 키나아제가 녹다운된 경우 대조군 세포와 비교했을 때 증식이 줄어든 것으로 나타났다.

염색체 구조 유지 단백질 4( SMC4 )

염색체 구조 유지(SMC) 단백질은 염색체 ATP아제로서 이는 박테리아에서 인간까지 고도로 보존되어 있으며, 이는 고차원의 염색체의 조직과 역학에 중요한 역할을 한다.

SMC4 단백질은 콘덴신 복합체의 핵심 구성 요소이며 이는 염색질 응축에서 역할을 하며 핵소체 분리, DNA 복구, 그리고 염색질 스캐폴드 유지와 관련이 있다. 진핵생물은 적어도 6개의 SMC 단백질을 각각 가지고 있으며, 이는 3가지의 특별한 기능을 가지고 있는 특유한 헤테로다이머를 형성한다. SMC2와 SMC4는 콘덴신 복합체의 기능을 하며 이는 염색체 집합과 분리에 중요한 역할을 한다.

25개의 다른 정상 조직에서 mRNA 수준의 RT-PCR에 의한 분석에 따르면, 이 염색체는 정상적인 전립선과 침샘에서 높게 발현이 되며, 대장, 췌장과 장에서 낮게 발현이 되고, 다른 조직에서는 전혀 발현이 되지 않는다. 인간 암 샘플에 대한 RT-PCR 연구는 33개 중 26개의 유방암, 전립선암 3개 중 3개, 대장암 3개 중 3개, 그리고 췌장암 3개 중 3개와 같은 많은 암 세포주와 암 표본에서 RNA가 높게 발현된다고 밝혔다(Egland et al., 2006).

AVL9

놀랍게도, 이 단백질은 공급원 단백질이며, AVL9 단백질에 대한 그리고 이에 해당하는 유전자 기능에 대한 소량의 데이터만이 존재한다.

키네토코어 단백질 Nuf2

NUF2(CDCA-1) 유전자는 동원체와 관련이 있는 보존된 단백질 복합체의 성분인 효모 Nuf2와 매우 비슷한 단백질을 암호화한다. 효모 Nuf2는 감수분열 전기 중 동원체가 스핀들 기둥과의 연결을 잃을 때 사라지며, 이는 염색체 분리에 조절 역할을 한다. 서바이빈과 hNuf2 csiRNA가 mRNA이 최저화되었을 때 다핵화가 되고 세포 분열 정지에 의해 세포 사멸을 일으킨다(Nguyen et al., 2006). Nuf2와 Hec1은 키네토코어에서 이중 방향에 필요한 기둥 쪽으로 향하는 힘을 유지하여 안정적인 미세소관 바깥 쪽의 말단 결합 부위의 조직에 필요하다(DeLuca et al., 2005).

폐암 조직의 마이크로어레이를 이용한 면역조직화학적 분석이 다양한 조직학적 유형의 폐암의 대부분에서 CDCA1과 KNTC2가 높은 수준으로 존재한다는 것을 확증했다. 이렇게 높은 발현은 NSCLC 환자의 불량한 예후와 관련이 있었다. CDCA1-유래된 19-아미노산 펩티드(11R-CDCA1(398-416))를 가지고 있는 세포 투과 가능 펩티드를 사용한 이들의 결합 억제는 효과적으로 NSCLC 세포의 성장을 억제하였다(Hayama et al., 2006). CDCA1 또는 KNTC2에 대해 siRNA-매개된 최소 발현은 세포 증식과 NSCLC, 난소암, 자궁경부암, 위암, 대장암과 신경아교종의 아포토시스의 유도를 억제한다고 밝혀졌다(Kaneko et al., 2009). CDCA 1 유전자는 자궁경부암에서 다르게 발현된다(mRNA와 단백질의 발현은 실시간 PCR과 면역조직화학검사에 의해 검증되었다) (Martin et al., 2009). 수술로 절단된 위암 조직의 RT-PCR(미만형 6, 장형 4)이 두 개의 CDCA1 변종이 암 조직에서 상향조절됨을 확인하였다. 대체 접합 변이, 특히 CDCA1이 이 연구에서 감지되었으며 이는 진단 마커로서 또는 항암 치료의 목표로 유용할 수 있다(Ohnuma et al., 2009).

지질 인산염 인산 가수분해효소 2( PPAP2C )

이 유전자에 의해 암호화되는 단백질은 포스파티드산 포스파타제(PAP) 패밀리의 일원이다. PAP는 인산을 다이실클리세롤로 전환시키고 글리세로지질의 신생 합성과 인산지방질 가수분해효소 D에 의해 매개되는 수용체-활성화 신호 형질 도입에 관련된다. 3가지의 다르게 접착된 다른 아이소형을 암호화하는 전사체가 보고되었다.

PPAP2C는 잠재적으로 변형된 일차적 인간 성인 간엽 줄기 세포 MSC에서 상향조절된 새로운 목표가 될 수 있다. PPAP2C의 녹다운은 S 기로의 진입을 늦춤으로서 세포 증식을 낮추고 이는 전사적으로 p53에 의해 조절된다. 몇몇 데이터는 여러 인간 암에서 발견된 PPAP2C의 과발현이 세포 증식의 증가에 중요한 요소라고 제시하였다 (Flanagan et al., 2009). 한 연구는 PPAP2C가 섬유아세포의 세포 주기 진행의 조절자 역할을 한다고 보고하였다. 촉매적으로 비활성화된 돌연변이가 아닌, PPAP2C의 과발현은 S 기로의 시기 상조의 진입을 초래하였고, 이는 사이클린 A의 축적을 일으켰다. 이는 S 기 진입 속도의 현저한 변화를 나타내며 이는 유사분열생식, 이동, 상처 치유, 발달과 종양 발생에 연관이 있을 수 있다.

유비퀴놀 -사이토크롬 c 환원 효소 결합 단백질( UQCRB )

UQCRB-유전자는 유비퀴놀-사이토크롬 c 환원 효소 복합체의 부분인 단백질을 암호화하고 이는 10개의 핵에 의해 암호화된 그리고 하나의 미토콘드리아에 의해 암호화된 하위단위를 지니고 있다. 이 암호화된 단백질은 유비퀴논에 결합을 하고 유비퀴논이 결합해 있을 때, 전자의 이동에 관여한다. 이 유전자의 돌연변이는 미토콘드리아 복합체 III 부족과 관련이 있다. 유사 유전자가 X 염색체에서 설명된 바 있다.

UQCRB-유전자는 잠재적으로 췌장담도암의 암유전자 또는 종양 억제 유전자일 가능성이 있다(Harada et al., 2009). UQCRB-유전자는 간세포암에서 과발현된다 (Jia et al., 2007).

프로미닌 1( Prom1 )

CD133으로도 알려진 프로미닌-1은 원래 CD34+ 조혈모세포로 발견이 되었고 후에 정상 줄기 세포의 마커로 사용이 되었으며 다양한 조직의 암 줄기 세포(CSC)로 식별되었다(Mizrak et al., 2008). 하지만, 이의 기능에 대해서는 많이 알려지지 않았다. 상피세포의 미세융모처럼 플라스마 막의 돌출부의 끝에 대부분 위치 하기 때문에, 프로미닌-1에 주어진 기능은 플라스마 막의 토폴로지의 "구성자"이다. 콜레스테롤과 상호작용하는 것으로 알려져 있기 때문에, 이는 플라스마 막의 적당한 지방의 구성을 유지하는 데 중요한 역할을 할 수 있다.

많은 인간 종양에서 프로미닌-1은 CSC 마커로 사용된다. 적은 퍼센트의 종양 세포가 프로미닌-1 양성을 나타내고 이것이 CSC 마커로서 기대되는 것이다. 종양 종류에 따라, 종양의 양성 세포의 수는 1 내지 15%이며 대부분 약 2%이다. 프로미닌-1을 발현하는 세포가 기능 실험(예를 들어, 구체 형성, 면역 결핍 쥐에서의 높은 종양 성장 시작 능력, 균형이 잡히지 않은 분열/자기 갱신/전분화능)을 통해 CSC로 나타난 종양은 다음과 같다:

- 대장암(종양 질량의 2 내지 2.5 %)(Todaro et al., 2007; Ricci-Vitiani et al., 2007),

- 간암(Ma et al., 2007; Suetsugu et al., 2006; Yin et al., 2007),

- 췌장암(Hermann 2007; Wang 2009),

- 전립선암(종양 질량의 1 %)(Richardson et al., 2004),

- 다른 표현형의 뇌종양(Singh et al., 2003; Singh et al., 2004),

- 급성임파구성 백혈병(CALL)과 같은 백혈병(Cox et al., 2009),

- 흑색종(Monzani et al., 2007; Rappa et al., 2008),

- 폐암(Chen and O'Shea, 2008; Eramo et al., 2008; Tirino et al., 2009),

- 유윙 종양(Suva et al., 2009),

- 자궁내막암(Rutella et al., 2009),

- 구강 편평세포 종양(Zhang et al., 2009), 및

- 머리와 목의 편평세포 종양(Harper et al., 2007).

또한, 몇몇의 연구가 건강한 조직과 비교하였을 때 암조직의 증가된 프로미닌-1의 발현을 보고하였고, 이들 중 대부분이 전체 생존, 종양 단계 또는 전이와 같은 임상 매개 변수와 연관이 있다는 것을 보고하였다. 예를 들면 비소세포 폐암, 악성 흑색종, 망막모세포종, 신경모세포종과 활막 종양 등을 포함한다. 프로미닌-1 발현은 교종, 췌장암(15%까지 PROM1 양성 세포), 대장암, 직장암, 대장과 유방암 등의 불량한 예후와 또한 관련이 있다. 흥미롭게도, PROM1 mRNA는 전이 질병의 암환자의 PBMC에서 상향조절되어 나타나고, 특히 골전이가 있는 환자들에게 높이 나타나며, PBMC에서 RPOM1 발현은 전체 생존율의 예후 요소이다. 난소암에서는 예후와 관련이 나타나지 않았다.

미만형 위암에서 PROM1 발현은 실리코 분석에 의해 제의되었으며(Katoh and Katoh, 2007) 정상 위 조직과 비교하였을 때 위암에서 높이 발현되는 단백질은 문헌[Smith et al., 2008]에 의해 보고되었다. 그러나, 문헌[Boegl and Prinz, 2009]은 프로미닌-1의 발현이 위암에서 특히 말기에 하향조절되었다고 보고하였으며, 이들은 프로미닌-1의 발현이 종양 성장이 아닌 혈관 생성과 관련이 있다고 주장하였다. 이는 역시 말기에 더 낮은 것으로 보고되었다. 위암 세포주의 한 연구(Takaishi et al., 2009)는 프로미닌-1이 아닌 CD44가 위암의 CSC 마커라고 주장한다.

프로미닌-1 발현 세포가 종양 생성에 관여되어 있다는 증거는 문헌[Zhu et al., 2009]에 의하여 제공되었으며, 이들은 쥐 창자 암 모델에서 모든 종양의 세포는 Prom1+ 세포에서부터 생성이 되지만, 단 7%가 Prom1+ 표현형을 유지한다고 보고하였다. 이를 제외하고는, 프로미닌-1(+) 세포는 종양의 혈관 형성에 관여한다고 보고되었다. CSC에 대해 예상이 되는 바와 같이 프로미닌-1(+) 세포는 Akt 생존 경로를 활성화함으로서 화학 저항성을 지닌다고 밝혀졌다(Ma 2008). 문헌[Bertolini et al., 2009]은 시스플라틴 치료에 반응하지 않는다고 보고하였다. 이들은 FLIP의 상향조절에 의해 TRAIL-과 Fas-유도 아포토시스에 저항할 수 있다. 그들은 아포토시스로부터 IL-4를 분비하여 그들을 보호한다. 그러나, 그들은 면역 시스템으로부터 접근이 가능할 수 있으며, 이들은 NK 세포(Castriconi et al., 2007; Pietra et al., 2009)에 의해 그리고 세포독성 T 세포(Brown et al., 2009)에 의해 파괴될 수 있다.

기질단백 분해효소 11( MMP11 )

기질단백 분해효소 11(MMP11)은 수유후 젖샘의 퇴축, 상처 치유와 흉터 생성 그리고 생리 주기를 비롯한 발달, 조직 리모델링의 몇몇의 생리학적 과정에 관련이 있다고 제안된 바 있다. 이는 또한 지방 세포 분화를 감소시킴으로써 지방 항상성을 부정적으로 규제한다고 알려져 있다. 다른 MMP와 반대로, 이는 콜라겐 VI을 제외하고는 보통 세포 외 기질 분자의 분열을 할 수 없다. 하지만, 알파 2-마크로글로불린, 알파 1 항트립신 인슐린 유사 성장인자 결합 단백질-1과 라미닌 수용체를 포함한 특정한 세린 프로테아제 억제제(세르핀)와 같은 다른 기질 역시 식별되었다. MMP11은 침습성 유방암 주변의 기질 세포에서 특별히 과발현되는 유전자로 발견되었다. 추가 연구가 피부암, 비소세포암 및 소세포폐암, 머리와 목 편평세포암종, 대장암, 후두 상피세포암, 식도암, 구강암, 췌장암, 방광암, 난소암, 신장세포암, 비정형 수막종, 상선 유두암, 뇌종양(MMP11은 성상세포종에서 발현이 되지만, 희돌기교종과 악성 교종에서는 낮게 발현된다), 타액관암종, 자궁경부암, 절외 T/NK-세포 림프종, 비호지킨성 림프종, 전립선암과 같은 다른 암 종류 및 유방암 주변의 기질에서 발현되는 것을 확인하였다. MMP11가 거의 대부분의 침습성 인간 종양의 기질에서 과발현되는 것으로 알려져 있으나, 육종암 또는 다른 비상피성암에서는 드물게 과발현된다. 대부분, MMP11은 종양의 바로 옆에 있는 기질 세포에서 발현이 되지만, 종양 세포 자체, 정상 조직과 종양에서 멀리 떨어져 있는 기질 세포는 음성을 나타낸다. 그러나, MMP11이 몇몇의 경우에는 대장과 같은 정상의 세포나 췌장암, 유방암, 중간막 종양과 위암과 같은 종양 세포에서도 발견되기 때문에 이는 일반화할 수 없다. MMP11의 높은 수준은 악성 표현형/높은 침습성과 불량한 예후와 연관되어 있다. 하지만, 상선 유두암에서는 MMP11 발현이 침습적인 성질과 반대로 연결되어 있다.

MMP11 발현이 미세 혈관 밀도와 관련이 없기 때문에 혈관 형성에의 기능은 가능하지 않다. 오히려, 이는 암세포의 생존을 향상시키고 아포토시스를 억제하는 것으로 보여진다. 섬유 아세포의 MMP11이 종양 세포의 IGF-1R 경로를 자극하여 증식 능력을 향상시킨다. 이의 지방세포 분화를 불러 일으키는 능력은 종양주변 섬유아세포 유사 세포의 축적을 돕고 따라서 암세포의 생존과 종양 진행을 선호하게 된다(Motrescu and Rio, 2008). MMP11은 위암 환자의 혈청과 종양 조직에서 감지되며, 이의 발현은 전이와 관련이 있다(Yang et al., 2008). 더 나아가, 문헌[Deng et al., 2005]은 MMP11이 위암의 종양 세포주와 원발성 종양에서 높은 수준으로 발현됨을 밝혔으며, 이는 다른 암 종류가 기질에서만 이를 발현하는 것과 차이가 있으며, 이는 종양 세포의 진행을 향상시킨다.

ABL1

ABL1 전암유전자는 Src 패밀리의 세포질과 핵 단백질 티로신 키나아제를 암호화하며, 이는 세포 분화, 세포 분열, 세포 부착과 스트레스 반응에 관련이 있는 것으로 밝혀졌다(Yoshida, 2007). C-Abl은 핵과 세포질 사이를 왕복한다. 핵 c-Abl은 세포 성장 억제와 아포토시스를 유도한다. 반대로, 세포질 c-Abl의 기능은 잘 알려져 있지 않다. 형태 형성과 F-액틴 기능과 인테그린 리간드와 세포외 자극 유사 성장 인자에 의한 신호에 역할이 있다는 약한 증거가 있다. 세포질 c-Abl은 유사분열생식을 촉진한다고 보고된 바 있다. C-Abl의 유사분열 기질은 아직 식별이 되지 않았으나, 이는 Rho 패밀리의 작은 GTP아제, 특히 Vav와 Sos 구성원의 규제자를 포함할 가능성이 있다.

ABL1 티로신 키나아제의 어디서나 발현이 되는 DNA-결합 활성은 CDC2-매개 인산화에 의해 규제가 되며, 이는 ABL1이 세포 주기 기능을 가지고 있다는 것을 나타낸다. C-Abl 단백질의 활성은 SH3 도메인에 의해 부정적으로 규제되며, SH3 도메인이 삭제될 시 ABL1은 발암유전자로 변한다. c-Abl 비수용체 티로신 키나아제는 비조혈성 세포에서 액틴 반응을 규제한다. 몇몇의 연구는 c-Abl의 기능이 T-세포 활성화 중 액틴 재편성을 돕는 신호 연쇄 반응에 있다고 주장한다(Huang et al., 2008).

ABL1 유전자의 돌연변이는 만성 골수성　백혈병(CML)과 연관이 있다. 만성 골수성 백혈병에서는 염색체 22번에 있는 유전자가 BCR(breakpoint cluster region - 클러스터 지역 중단점) 유전자 안에서 위치를 변경하면서 활성화된다. 이 새롭게 결합된 유전자 BCR-ABL은 규제되지 않은 세포질 목표 티로신 키나아제를 암호화하며 이는 세포가 사이토카인에 의해 규제가 되지 않고 증식할 수 있도록 한다. 이는 다시 세포가 암종이 되도록 한다(Zhao et al., 2009). 결합 단백질이 아닌 활성화된 c-Abl 티로신 키나아제는 폐와 유방의 악성 고체 종양에서 중요한 역할을 한다(Lin and Arlinghaus, 2008).

최근의 연구에서 c-Abl이 고체 종양에서 또한 비정상적으로 규제된다고 지적되었다. 높은 세포질 키나아제 활성이 유방암과 NSCLC에서 감지되었다. 그러나 과발현은 충분하지 않으며 구성적인 키나아제 활성이 단백질 인산화에 필요하다. 유방암 세포에서는 c-Abl 인산화가 SFK, EGFR 패밀리 멤버와 IGF-1 수용체를 포함한 플라스마 막 티로신 키나아제에 의해 유도된다. ABL 융합 단백질은 고체 종양에서 감지되지 않았다.

ABL1과 위암 - ABL1 발현의 면역조직화학 연구에서 정상의 태아, 성인 인간 조직과 여러 종양 유형이 검사되었다. 대부분의 종양이 초점의 또는 약한 ABL 면역 반응을 나타내었다. 가장 높은 수준의 염색은 연골육종, 지방육종, 미만성 위선암(반지 세포)에서 나타났다. 후자 2가지의 경우, ABL은 종양 미세혈관에서도 발현이 되었으며, 이는 혈관형성에서의 기능을 표시한다.

최근 연구는 cagA-양성 헬리코박터 파일로리에 의한 감염이 위암의 발생에 중요한 역할을 한다는 것을 밝혔다. 헬리코박터는 위 상피세포가 긴 시간동안 감염이 되었을 경우 EGFR 내포작용과 수용체 분해를 막는다. 또한, 이 억제는 비수용체 키나아제 c-Abl의 CagA-의존하지만 CagA 인산화-비의존 활성에 의해 발생을 하며, 이는 EGFR 목표 위치인 pY1173을 인산화시킨다(Bauer et al., 2009). ST I571 또는 shRNA에 의한 c-Abl 키나아제 활성의 선택적인 억제는 유지된 싸이토톡신 관련 유전자 A(CagA) 인산화와 상피세포 이동을 폐기하며, 이는 c-Abl이 헬리코박터 파이로리의 감염과 질병발생에 중요한 역할을 한다는 것을 나타낸다(Poppe et al., 2007).

키나아제 차단제의 예가 이마티닙(이마티닙 메실레이트, 글리벡(Gleevec), STI571)이며, 이는 Bcr/Abl 발암단백질의 억제제로서 만성 골수성 백혈병의 일차 요법으로 사용된다(Pytel et al., 2009). 이마티닙은 KIT, 티로신 키나아제 수용체가 비정상적으로 발현이 되는 말기 위장관 간질종양(GIST)을 가지고 있는 환자의 치료에 승인되었다(Croom and Perry, 2003). 또 하나의 최근에 암 치료에 사용되는 키나아제 억제제는 다사티닙(BMS-354825)이며, 이는 ABL 비수용체 세포질에 특이적이다 (Pytel et al., 2009). 닐로티닙은 구강 2세대 bcr-abl TKI이고 이는 이마티닙 저항 또는 Ph+ 불내증의 성인 CML-CP 및 -AP에 사용된다(Deremer et al., 2008).

서열번호 13, 서열번호 14와 서열번호 15는 WO 2007/028574에서 공개되며, CDC42(세포 분열 주기 42)는 세포 주기의 조절에 관련된 단백질이다. 단백질은 Rho-하위 패밀리의 작은 GTP아제이며 세포 형태, 전이, 세포 이물 흡수, 그리고 세포 주기 진행을 포함한 다양한 세포 기능을 조절하는 신호 경로를 조절한다. CDC42는 아교모세포종에서 높게 과발현되는 것으로 알려져 있다.

WO 2004/067023은 높은 친화력으로 유형 I HLA 분자에 결합할 수 있는 펩티드인 종양 관련된 항원 서바이빈에서 유래된 MHC 유형 I-제한된 펩티드를 기재한다.

뼈 골타액단백질 1(BSP-1), 초기 T-임파구 활성화(ETA-1) 그리고 가장 흔하게 오스테오폰틴(OPN)으로 알려진 분비된 인단백질 1(SPP1)은 인간 유전자 산물이며 다른 종에서도 보존된다. 오스테오폰틴은 뼈 리모델링에서 중요한 인자로 관련되어 있다. 특히, 연구에 따르면 파골세포를 뼈의 미네랄 세포간질에 고정시키는데 중요한 역할을 한다고 제안된다. 뼈의 유기 부분은 건조 중량의 약 20%이며 이것은 오스테오폰틴 외에, 콜라겐 유형 I, 오스테오칼신, 오스테오넥틴, 뼈 골타액단백질 그리고 알칼리성 포스파타아제를 포함시킨다. 콜라겐 유형 I은 단백질 중량의 90%를 차지한다.

OPN은 백혈구에 의해 발현되는 α4β1, α9β1과 α9β4를 포함한 여러 인테그린 수용체에 결합한다. 이 수용체들은 이런 세포들에서 세포 유착, 전이, 그리고 생존의 기능을 하는 것으로 잘 확립되어있다. 그러므로, 최근의 연구 노력은 이런 반응을 매개하는데 OPN 역할의 초점을 맞추었다.

오스테오폰틴은 면역 세포의 동력 변화가 있는 대식세포, 호중성 백혈구, 돌기 세포 그리고 T와 B세포를 포함한 범위에서 발현된다. OPN은 다양한 면에서 면역 변조기 역할을 한다고 보고된다. 우선, 염증 부위에 세포를 모집하는 화학주성이 있는 특성을 가지고 있다. 또한 세포 접착과 상처 치료에 관여하는 유착 단백질의 역할을 한다. 또한, OPN은 아포토시스를 조절함으로써 세포 생존을 촉진시키는 것뿐 아니라 세포 활성화와 사이토킨 생성을 매개한다.

활성화된 T 세포는 IL-12에 의해 Th1 유형으로 구별하도록 촉진되며, IL-12와 IFNγ를 포함한 사이토킨을 생성한다. OPN은 강화된 Th1 반응으로 이끄는 Th2 사이토킨 IL-10의 생성을 억제한다. OPN은 세포 매개된 면역원성에 영향을 끼치고 Th1 사이토킨 기능을 가진다. 그것은 B 세포 면역글로뷸린 생성과 증식을 강화한다. 2008년의 최근의 연구는 OPN이 비만 세포 탈과립을 유도한다고 제안했다(Nagasaka A, Matsue H, Matsushima H, et al. February 2008. 오스테오폰틴은 비만 세포에 의해서 생성되며 IgE 매개된 탈과립과 비만 세포의 전이에 영향을 준다. Eur. J. Immunol. 38 (2): 489-99). 이 연구자들은 IgE-매개된 아나필랙시스가 야행 유형 쥐에 비해서 OPN 녹아웃 쥐에서 상당히 감소된 것을 관찰했다. 대식세포의 활성화에서 OPN의 역할은 암 연구에서 연구자들이 OPN-생성 종양이 OPN-결핍 종양에 비해서 대식세포 활성화를 유도하는 것을 발견했을 때 관련되었다.

OPN은 많은 상황에서 중요한 항사멸성 인자이다. OPN은 유해 자극에 노출된 섬유아세포와 내피 세포뿐 아니라 대식 세포와 T-세포의 활성화 유도된 세포 사멸을 막는다. OPN은 염증성 대장염의 프로그램되지 않은 세포 사멸을 막는다.

OPN이 어디에서나 발현되는 여러 세포 표면 수용체와 상호 작용을 한다는 사실은 상처 치료, 뼈 회전율, 종양 형성, 염증, 국소 빈혈 그리고 면역 반응 같은 많은 생리학적 그리고 병리학적 과정에서 능동적인 역할을 하게 만든다. 그러므로 플라스마 OPN 수준의 조작이 자가면역 질환, 암 전이, 골다공증 및 스트레스의 일부 형태의 치료에 유용할 수 있다.

OPN이 IL-17 생성을 이끈다는 것이 보여졌다; OPN은 폐암, 유방암, 대장암, 위암, 난소암, 흑색종 그리고 중피종 같은 여러 암에서 과발현된다; OPN은 사구체신염과 간질성 신염에 기여한다; 그리고 OPN은 동맥내의 아테롬성 반에서 발견된다. 그러므로, 플라스마 OPN 수준의 조작은 자가면역 질환, 암 전이, 골다공증 및 스트레스의 일부 형태의 치료에 유용할 수 있다.

인간 상피 성장인자 수용체 3( ERBB3 )

ERBB3은 티로신 키나아제의 수용체 패밀리인 인간 상피 성장인자 수용체 (EGFR)의 구성원을 암호화한다. 이는 뉴레굴린(neuregulin)에 의해, 다른 ERBB와 비ERBB 수용체를 비롯한 다른 키나아제에 의해, 새로운 기전에 의해 활성화된다. 하류에서 이는 대부분 포스포이노시톨 3-키나아제/AKT 생존/유사분열 경로와 상호작용을 하지만, GRB, SHC, SRC, ABL, rasGAP, SYK 그리고 다른 전사 규제자 EBP1과 상호작용을 한다(Sithanandam and Anderson 413-48).

확실성의 차이는 있지만, 유방, 난소, 전립선, 특정한 뇌세포, 망막, 멜라닌세포, 대장, 췌장, 위, 구강과 폐암의 원발성 암과 배양된 세포의 ERBB3 발현의 연구에 따르면, 이의 기능은 이 암의 원인 또는 유지와 관련이 있다(Sithanandam and Anderson 413-48). ERBB3 단백질은 위장관 전체의 상피세포와 구인두와 식도, 위의 벽측 세포와 소장과 대장의 표면 장세포를 포함한 세포의 면역조직화학 실험에서 감지되었다(Poller et al. 275-80; Sanidas et al. 935-40). 위암 세포주는 모두 ERBB3를 발현하였으며, 잘라진 분비물을 발현하였다. ERBB3의 위암에서의 주요 역할에 대한 강한 증거는 저분화 반지 세포 위 종양의 연구에서 나왔다(Kobayashi et al. 1294-301). Zhang 등은 두 개의 병리 유형의 위암(장형과 미만형)에서 면역조직화학(IHC)을 통해 ERBB3의 발현을 연구하였다. 미만형의 위암은 장형에 비해 뛰어나게 높은 ERBB3 과발현을 나타냈다(26.2% 대 5.0%, p < 0.01). 이 두 개의 위암 조직학형에서의 ERBB3의 선택적인 과발현은 불량한 예후와 관련이 있다(Zhang et al. 2112-18). ERBB3 발현은 종양 침습 깊이와 관련된 임파구, 전이, 종양 단계, 재발과 같은 종양 진행 매개 변수와 연관이 있다(Hayashi et al. 7843-49). 신선한 조직 중 21개의 위암에서 그리고 20개의 만성 위염에서 EGFR, c-erbB-2와 c-erbB-3 발현과 동시 발현이 면역조직화학을 이용하여 임상병리학적 고찰을 염두에 두고 검사되었다. 보통, 위암 환자는 만성 위염과 비교할 때 EGFR, c-erbB-2와 d-erbB-3의 과발현의 높은 발생 정도를 나타내지만(각각, 81%와 43%; 38%와 45%; 35%와 20%), 통계학적으로 유의한 차이는 단지 EGFR 발현이었다(p = 0.01)(Slesak et al. 2727-32).

ERBB3을 목표로 하는 여러 가지의 치료 방법이 실험적으로 시도되었다. ERBB3의 세포외 도메인에 대한 RNA 압타머는 NRG-유도 ERBB3/ERBB2 헤테로다이머 생성, ERBB2 인산화와 MCF7 유방암 세포 성장을 억제하였다(Chen et al. 9226-31). A431 편평 암 세포에서 ERBB3 유전자 발현에 대한 인공 아연 핑거 전사 인자 억제는 증식과 이동을 억제하였으며, ERBB3 발현의 억제가 ERBB2를 바꾸는 것보다 더 큰 결과를 불러 일으켰다(Lund et al. 9082-91). 비타민 E 이소머 감마-토코트리놀은 ERBB3 활성과 그 하류의 PI3K/AKT 경로 자극을 특정하게 막음으로서 유선세포의 증식을 억제하였다(Samant and Sylvester 563-74). 미세-RNA 125a는 ERBB3 RNA와 단백질, AKT의 활성화와 세포 성장과 SKBR3 유선암 세포의 침습성을 낮추었다(Scott et al. 1479-86). 유방암 세포에서의 siRNA에 의한 ERBB3의 억제는 2차적인 티로신 키나아제 억제제에 대한 저항성을 폐기하였으며, 이에 따라 아포토시스가 일어났다(Sergina et al. 437-41). ERBB3 또는 AKT에 대한 siRNA는 폐 선암종에 대한 치료 방법으로서 가능성을 보여준다(Sithanandam et al. 1847-59).

서바이빈( BIRC5 )

세포 사멸 단백질(IAP) 종족의 구성원인 BIC5(서바이빈)의 발현은 태아 조직과 다양한 인간 암에서 증가된다. WO 2004/067023은 유형 I HLA 분자와 강한 결합성을 가지고 결합할 수 있는 종양 관련 항원 서바이빈으로부터 유도된 MHC 유형 I-제한 펩티드에 대해 기재한다. 서바이빈은 세포 증식과 세포 사멸 조절 능력을 소유하고 있다. 특히, 글리오블라스토마에서 아주 높은 수준의 서바이빈 발현이 나타난다(Angileri et al., 2008). 뇌 글리오마의 서바이빈 과잉발현은 악성 확산, 항세포 사멸과 혈관형성에 중요한 역할을 하는 것으로 보여진다(Zhen et al., 2005; Liu et al., 2006). 특히 글리오블라스토마, 그리고 다른 종양에서 서바이빈 발현은 서바이빈 음성 종양 환자와 비교했을 때 악성 등급(글리오블라스토마에서 가장 높은 서바이빈 발현을 가짐) 및 짧은 생존 기간과 관련되는 것으로 나타난다(Kajiwara et al., 2003; Saito et al., 2007; Uematsu et al., 2005; Mellai et al., 2008; Grunda et al., 2006; Xie et al., 2006; Sasaki et al., 2002; Chakravarti et al., 2002).

B 형 간염 핵 항원

B형 간염 바이러스(HBV) 핵 단백질 HBc 면역원성 펩티드는 잘 알려져 있다(Bertoletti et al., 1993; Livingston et al., 1997). HBc의 10개 아미노산 펩티드는 본 발명에 근거하여 환자의 면역능력과 암 백신으로의 성공적인 면역을 위한 양성 대조군으로 포함될 수 있다.

[표 6]

공급원 단백질의 암 관련 기능

랭킹 "-"<"(+)"<"+"; "?"은 현재 알려지지 않은 상황을 의미한다.

위의 표 6에서 보여지듯이, 당업자는 본 출원의 조성물을 환자 및/또는 종양에 쉽게 적응시키며 이에 따라 TUMAP를 선택할 수 있다.

본 발명의 바람직한 실시에서 약학적 조성물은 최소한 서열번호 1에 따른 아미노산 서열을 가지고 있는 1개의 펩티드와 서열번호 11에 따른 아미노산 서열을 가지고 있는 2개의 펩티드를 가지고 있다.

이 발명의 선호되는 실시에서 약학적 조성물은 최소한 서열번호 1에 따른 아미노산 서열을 가지고 있는 1개의 펩티드와 서열번호 2 및/또는 서열번호 11에 따른 아미노산 서열을 가지고 있는 2개의 펩티드를 가지고 있다.

이 발명의 바람직한 실시예에서 약학적 조성물은 최소한 서열번호 3에 따른 아미노산 서열을 가지고 있는 2개의 펩티드와 서열번호 2 및/또는 서열번호 11에 따른 아미노산 서열을 가지고 있다.

이 발명의 바람직한 실시에서 그 약학적 조성물은 최소한 서열번호 1에 따른 아미노산 서열을 가지고 있는 2개의 펩티드와 서열번호 7 및 선택적으로 서열번호 11에 따른 아미노산 서열을 포함한다.

이 발명의 바람직한 실시에서 그 약학적 조성물은 최소한 서열번호 2에 따른 아미노산 서열을 가지고 있는 2개의 펩티드와 서열번호 7 및 선택적으로 서열번호 11에 따른 아미노산 서열을 포함한다.

이 발명의 바람직한 실시에서 그 약학적 조성물은 최소한 서열번호 3에 따른 아미노산 서열을 가지고 있는 2개의 펩티드와 서열번호 7 및 선택적으로 서열번호 11에 따른 아미노산 서열을 포함한다.

더욱 바람직한 실시에서 그 약학적 조성물은 서열번호 2 내지 서열번호 10 그리고 서열번호 11 내지 서열번호 22 그리고 서열번호 24로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 하나 이상의 펩티드들 및/또는 서열번호 2 내지 서열번호 10 그리고 서열번호 11 내지 서열번호 22 그리고 서열번호 24와 최소한 85% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 하나 이상의 펩티드들 및/또는 서열번호 2 내지 서열번호 10 그리고 서열번호 11 내지 서열번호 22 그리고 서열번호 24 또는 변종 아미노산 서열을 암호화하는 핵산을 포함하는 폴리뉴클레오티드, 그리고 약학적으로 허용되는 담체를 포함한다.

본 발명의 보다 더욱 바람직한 실시는 서열번호 1 내지 서열번호 10 그리고 서열번호 11 내지 서열번호 22 그리고 서열번호 24로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 적어도 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 12, 13, 14, 15, 16, 17 또는 18개의 펩티드들 및/또는 서열번호 1 내지 서열번호 10과 적어도 85% 동일한 아미노산 서열 및/또는 서열번호 1 내지 서열번호 10 그리고 서열번호 11 내지 서열번호 22 그리고 서열번호 24, 또는 변종 아미노산 서열을 암호화하는 핵산을 포함하는 폴리뉴클레오티드, 그리고 약학적으로 허용되는 담체를 포함한다.

아래에서 더 설명되는 것과 같이, 약학적 조성물은 더 효과적이기 위해 또 추가적인 펩티드 및/또는 부형제를 가질 수 있다.

주어진 아미노산 서열의 "변종 아미노산 서열"로서 본 발명자들은 측면 서열, 예를 들면, 하나 또는 두 개의 아미노산 잔기는 펩티드가 HLA 분자에 주어진 아미노산 서열을 가지고 있는 펩티드가 하는 것처럼 충분이 결합할 수 있도록 변경된다(예를 들면 다른 자연적으로 생기는 아미노산 잔기 또는 어떤 다른 측면 서열로 교체함). 예를 들면, 펩티드는 HLA-A 또는 -DR같은 적합한 MHC 분자와 상호 작용을 하고 결합할 수 있는 능력을 유지하거나 개선시킬 수 있도록 변형될 수 있고, 이 발명의 관점에서 정의된 것처럼 아미노산 서열을 가진 폴리펩티드를 발현하는 세포를 인식하고 소멸시킬 수 있는 활성화된 CTL을 생성할 수 있는 능력을 유지하거나 개선시킬 수 있다. 데이터베이스에서 추론되듯이 HLA-A 결합 펩티드의 특정 위치는 일반적으로 잔기를 고정시키고 HLA 결합 홈의 결합 모티브에 맞는 핵심 서열을 만든다.

T-세포 수용체와 상호 작용을 하지 않아도 되는 아미노산 잔기는 혼합이 T-세포 반응성에 실질적으로 영향을 미치지 않고 관련된 MHC에의 결합을 제거하지 않는 다른 아미노산에 의한 교체에 의해 변형될 수 있다. 따라서, 주어진 단서를 떠나서, 본 발명의 펩티드는 아미노산 서열 또는 그 일부 또는 주어진 변수를 포함한 임의의 펩티드(발명자들이 사용한 용어는 올리고펩티드 또는 폴리펩티드 포함)가 될 수 있다.

또한 MHC-유형 II가 있는 펩티드는 어떤 HLA-특정 아미노산 모티브가 있는 "핵심 서열" 그리고 선택적으로 핵심 서열의 기능을 방해하지 않는 N- 및/또는 C-말단 확장을 가지고 있는 것으로 알려져 있다(즉, 펩티드와 T세포의 상호 작용에 관계가 없는 것으로 간주된다). N- 및/또는 C-말단 확장은 예를 들면 아미노산의 길이가 각각 1에서 10 사이가 될 수 있다. 이 펩티드들은 MHC 유형 II 분자를 취하는데 직접적으로 사용되거나 서열은 아래의 설명과 같이 벡터로 복제될 수 있다. 이 펩티드들이 세포 안의 큰 펩티드 처리의 최종 산출물을 만들기 때문에 더 긴 펩티드도 사용될 수 있다. 본 발명의 펩티드는 임의의 크기일 수도 있으나 일반적으로 분자 무게가 100,000보다 낮고, 50,000보다 낮은 것이 바람직하고, 10,000보다 낮은 것이 더욱 바람직하고, 5,000보다 낮은 것이 더욱 바람직하고, 2,500보다 낮은 것이 더욱 바람직하고, 일반적으로 약 1000에서 2000 사이이다. 아미노산 잔기의 숫자 측면에서, 본 발명의 펩티드는 1000보다 적은 잔기를 가지고 있으며, 500보다 적은 것이 바람직하고, 100보다 적은 것이 더욱 바람직하다. 따라서 본 발명은 펩티드와 이의 변종의 조성물도 제공하는데, 그 변종의 총괄적인 길이가 8에서 100 사이, 8에서 30 사이가 더욱 바람직하고, 8에서 17, 즉 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 또는 16 아미노산이 가장 바람직하다.

바람직한 펩티드는 C-말단 및/또는 N-말단의 1에서 10 아미노산의 확장이 있는 서열번호 11 내지 서열번호 22 그리고 서열번호 24로 구성된 군에서 선택된 핵 서열이 있고, 측면 아미노산의 전체 숫자가 1에서 12인 것이 더욱 바람직하고, 더욱 바람직한 것은 1에서 10, 더욱 바람직한 것은 1에서 8, 더욱 바람직한 것은 1에서 6이고, 펩티드가 HLA 분자에 서열번호 11 내지 서열번호 22 그리고 서열번호 24 중 하나에 따른 앞에서 말한 펩티드와 같은 방식으로 결합할 수 있을 때, 측면 아미노산은 C-말단과 N-말단의 임의의 비율에 의해 나누어진다(예를 들면 모든 측면 아미노산은 하나의 말단에 더해지거나 아미노산들은 두 개의 말단에 똑같이 더해지거나 임의의 비율에 의해 더해질 수 있다).

유사하게, 본 발명의 펩티드가 있는 T-세포 교차 반응을 유도하는 변종은 종종 길이 변종이다.

펩티드가 12 아미노산 잔기 정도보다 길면, 이는 MHC 유형 II 분자에 직접 결합하는데 사용된다. 핵심 HLA 결합 영역의 측면에 있는 잔기는 펩티드가 MHC 유형 II 분자의 결합 홈에 특정적으로 결합하는 능력에 크게 영항을 주지 않고 펩티드를 CTL에 나타내는 것이 바람직하다. 그러나, 위에서 말한 대로, 특히 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화될 때, 더 큰 펩티드가 적합한 항원을 보이는 세포에 의해 절단될 수 있으므로 더 큰 펩티드가 사용될 수도 있다. 또한 측면 아미노산은 생체 외 펩티드 열화의 속도를 줄일 수 있고 이는 CTL에 있는 실제 펩티드의 양이 측면 아미노산이 없는 펩티드에 비해 높기 때문이다.

또한 MHC 유형 I 에피톱의 길이가 보통 8 내지 10 아미노산이지만 더 긴 펩티드에서 생성되거나 실제 에피톱을 포함한 단백질에서 생성될 수도 있다. MHC 유형 II 에피톱과 비슷하게, 실제 에피톱의 N-그리고 C-말단의 길어진 전구체 펩티드 업스트림 및/또는 다운스트림의 측면 잔기가 CTL로의 펩티드의 표시에 상당한 영향을 주지 않거나 길어진 펩티드를 처리하면서 실제 에피톱을 매개하는데 필요한 단백 분해성 절단의 사이트를 감추지 않는 것이 바람직하다.

바람직한 펩티드는 C-말단 및/또는 N-말단의 1에서 10 아미노산의 확장이 있는 서열번호 1 내지 서열번호 10 그리고 서열번호 11을 가지고 있는 군에서 선택된 핵 서열이고, 측면 아미노산의 전체 숫자가 1에서 12인 것이 바람직하고, 더욱 바람직한 것은 1에서 10, 더욱 바람직한 것은 1에서 8, 더욱 바람직한 것은 1에서 6이고, 펩티드가 HLA 분자에 서열번호 1 내지 서열번호 10 그리고 서열번호 11 중 하나에 따른 앞에서 말한 펩티드와 같은 방식으로 결합할 수 있을 때, 측면 아미노산은 C-말단과 N-말단의 임의의 비율에 의해 나누어진다(예를 들면 모든 측면 아미노산은 하나의 말단에 더해지거나 아미노산들은 두 개의 말단에 똑같이 더해지거나 어떤 비율에 의해 더해질 수 있다).

따라서 본 발명은 펩티드와 MHC 유형 I 에피톱의 변종도 제공하는데, 그 변종의 전체 길이가 8에서 100 사이, 8에서 30 사이가 더욱 바람직하고, 8에서 18, 즉 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 또는 17 아미노산이 가장 바람직하다.

물론, 본 발명에 따른 펩티드나 변종은 인간 MHC 유형 I 또는 II 분자에 결합할 수 있는 능력이 있다. 펩티드 또는 변종의 MHC 복합물에의 결합은 예를 들어, 본 발명에서 또는 상이한 MHC 유형 II 대립유전자를 위한 다른 문헌에서 설명된 이 분야에서 알려진 방법으로 시험될 수 있다(예, Vogt AB, Kropshofer H, Kalbacher H, Kalbus M, Rammensee HG, Coligan JE, Martin R. 자가 펩티드에서 묘사된 HLA-DRB5*0101 및 DRB1*1501 분자의 리간드 모티프. J Immunol. 1994 153(4):1665-1673; Malcherek G, Gnau V, Stevanovic S, Rammensee HG, Jung G, Melms A. 자연 HLA-DR17 리간드의 대립유전자 특정한 접촉 부위의 분석. J Immunol. 1994 153(3):1141-1149; Manici S, Sturniolo T, Imro MA, Hammer J, Sinigaglia F, Noppen C, Spagnoli G, Mazzi B, Bellone M, Dellabona P, Protti MP. 조직친화성 백혈구 항원 DR11과 관련된 CD4(+) 세포독성 T 세포에 보이는 흑색종 세포의 MAGE-3 에피톱. J Exp Med. 1999 189(5): 871-876; Hammer J, Gallazzi F, Bono E, Karr RW, Guenot J, Valsasnini P, Nagy ZA, Sinigaglia F. HLA-DR4 분자에 특정하게 결합하는 펩티드: 류마티스 관절염과의 관련. J Exp Med. 1995 181(5):1847-1855; Tompkins SM, Rota PA, Moore JC, Jensen PE. 유형 II MHC 당단백질에 결합하는 항원을 측정하기 위한 유로퓸 형광면역법. J Immunol Methods. 1993 163(2):209-216; Boyton RJ, Lohmann T, Londei M, Kalbacher H, Halder T, Frater AJ, Douek DC, Leslie DG, Flavell RA, Altmann DM. 유형 I 당뇨병에 대한 자화률 또는 저항과 관련된 글루탐산의 탈카복실화효소의 T 임파구 반응: 부정합한 인간 쌍둥이, 비만이 아닌 당뇨가 있는 쥐 그리고 HLA-DQ 형질 전환 쥐의 질병의 분석. Int Immunol. 1998 (12):1765-1776).

본 발명의 펩티드는 추가적인 N- 및/또는 C-말단 위치된 MHC 분자의 실제 에피톱으로서 작용하는 펩티드의 부분을 형성하지 않는 아미노산의 확장이지만, 그럼에도 불구하고, 본 발명에 따르면 펩티드의 세포로의 효율적인 도입을 제공하는데 중요할 수 있다(위 참조). 본 발명의 실시 중 하나에서는, 본 발명의 펩티드는 예를 들면 NCBI, 젠뱅크(GenBank 수탁번호 X00497)(Strubin, M., Mach, B. and Long, E.O. HLA-DR-관련 불변 쇄의 mRNA의 전체 서열은 비정상적인 트랜스멤브레인 극성을 가진 폴리펩티드를 보인다. 문헌(EMBO J. 3 (4), 869-872 (1984))에서 나온 것처럼 HLA-DR 항원 관련된 불변의 쇄(33면, 아래의 "li")의 80N-말단 아미노산을 가지고 있는 융합 단백질이다.

본 발명은 또한 본 발명의 펩티드의 하나 이상의 약학적 조성물을 제공하며, 이는 펩티드의 전체 길이가 8에서 100 아미노산 사이이고, 8에서 30 사이가 바람직하고, 8에서 17 사이 또는 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 또는 16이 가장 바람직하다.

추가적으로, 펩티드나 그 변형은 안정성 및/또는 더 강한 면역 반응을 유도하기 위한 MHC 분자에 대한 결합을 증진시키기 위해서 더 변형될 수 있다. 펩티드 서열의 최적화를 위한 방법은 이 분야에 잘 알려졌으며 예를 들면 역 펩티드 결합 또는 비 펩티드 결합의 도입을 포함한다.

따라서, 발명의 다른 양태에 따르면, 최소한 하나의 펩티드 또는 변종이 비 펩티드 결합을 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.

역 펩티드 결합에서 아미노산 잔기는 펩티드(-CO-NH-) 연결에 의해서 결합되지 않지만, 펩티드 결합이 역전된다. 이런 레트로-인버소 펩타이드 모방체학은 문헌[Meziere et al (1997) J. Immunol. 159, 3230-3237]에서 설명되고 본원에서 참조로 통합된 예와 같은, 이 분야에 알려진 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 이 접근 방법은 골격과 관련된 변화를 가진 유사펩티드를 만드는 것을 포함하지만, 측면 쇄의 배향은 포함하지 않는다. 메지르(Meziere) 등(1997)은 MHC와 T-조력 세포 반응에서, 이 유사 펩티드가 유용하다고 했다. CO-NH 펩티드 결합 대신에 NH-CO 결합을 가지고 있는 레트로-인버소 펩티드는 단백질 가수 분해에 더 저항력이 있다.

비 펩티드 결합은 예를 들면 -CH₂-NH, -CH₂S-, -CH₂CH₂-, -CH=CH-, -COCH₂-, -CH(OH)CH₂-, 및 -CH₂SO- 이다. 미국 특허 제4,897,445호는 표준 절차에 의해 합성된 폴리펩티드와 NaCNBH₃ 존재 하에 아미노 알데히드와 아미노산을 반응시켜 합성되는 비 펩티드 결합에 관련된 폴리펩티드 쇄의 비 펩티드 결합(-CH₂-NH)의 고체 상 합성을 위한 방법을 제공한다.

위에 설명된 발명의 서열로 구성된 펩티드는 예를 들면, 안정성, 생물학적 이용가능성, 및/또는 펩티드와의 친화력을 증진시키기 위해서 아미노 및/또는 카르복시 말단들이 있는 추가적인 화학적 기와 함께 합성될 수 있다. 예를 들면, 카보벤족실, 단실, t-부틸록시카보닐 등의 소수성 기는 펩티드의 아미노 말단들에 더해질 수 있다. 비슷하게, 아세틸 기 또는 9-플루올렌일메톡시-카보닐 기는 펩티드의 아미노 말단에 자리잡을 수 있다. 추가적으로, 예를 들어 소수성 기, t-부틸록시카보닐 또는 아미노 기는 펩티드의 카르복시 말단들에 더해질 수 있다.

또한, 본 발명의 모든 펩티드는 그의 입체 서열을 변경하기 위해 합성될 수 있다. 예를 들면, 하나 또는 여러 펩티드 아미노산 잔기의 D-이성체는 보통 L-이성체 대신에 사용될 수 있다. 또한, 본 발명의 펩티드의 하나 이상의 아미노산 잔기는 다른 잘 알려진 비 자연적으로 나타나는 아미노산 잔기로 대체될 수 있다. 이런 변경은 안정성, 생물학적 이용가능성, 및/또는 본 발명의 펩티드의 결합 작용을 증진시킬 수 있다.

비슷하게, 본 발명의 펩티드 또는 변종은 펩티드 합성의 이전 또는 이후에 특정 아미노산에 반응함으로써 화학적으로 변형될 수 있다. 이런 변형의 예는 이 분야에서 잘 알려져 있고, 예를 들면, 문헌[R. Lundblad, 단백질 변형을 위한 화학 반응물, 3rd ed. CRC Press, 2005]에서 요약되고 본원에서 참조에 의해 통합되었다. 아미노산의 화학적 변형은 아실화, 아미드화, 리신의 피리독실화, 환원성 알킬화, 2,4,6-트리니트로벤젠 설폰산(TNBS)이 있는 아미노 기의 트리니트로벤젠화, 카르복실 기의 아미드 변형 그리고 시스테인의 시스테인산으로의 퍼포민산 산화작용에 의한 설피드릴 변형, 수은 유래의 형성, 다른 티올 화합물과 섞인 디설피드 형성, 말레이미드와의 반응, 요오드화 아세트산 또는 요오드아세트아미드와의 카르복시 메틸화, 알칼리성 pH에서의 시안산염의 카바모일화가 있지만 이로써 제한되지 않는다. 이것에 대해서, 당업자는 단백질의 화학적 변형에 관한 더 광범위한 방법을 위해 문헌[Chapter 15 of Current Protocols In Protein Science, Eds. Coligan et al. (John Wiley & Sons NY 1995-2000)]을 참조한다.

PEG로의 치료적인 단백질과 펩티드의 성공적인 변형은 순환계 반감기의 확장과 자주 연결이 되고, 단백질과 글루타르알데히드, 폴리에틸렌글리콜 다이아크릴레이트와 포름알데히드와의 교차 결합은 히드로겔의 제조에 사용된다. 면역치료를 위한 알레르기의 화학적 변형은 자주 카바밀화와 시안산 칼륨에 의해서 얻어진다.

일반적으로 펩티드와 변종(최소한 아미노산 잔기 사이에 펩티드 연결을 가지고 있는 것들)이 예를 들면, 문헌[Lu et al (1981) J. Org. Chem. 46, 3433]에서 밝혀진 대로 고체상의 펩티드 합성의 Fmoc-폴리아미드 모드를 사용하여 합성될 수 있다.

정제는 재결정화, 크기 배제 크로마토그래피, 이온-교환 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 및 예를 들면, 아세토니트릴/물 구배 분리를 사용하는 역상 고성능 액체 크로마토그래피와 같은 기법의 한 개 또는 여러 개의 조합으로 수행될 수 있다.

펩티드의 분석은 박막 크로마토그래피, 겔 전기 영동법, 특히, 모세관 전기 영동, 고체 상 추출(CSPE), 역상 고성능 액체 크로마토그래피, 산 가수분해 후 아미노산 분석과 고속 원자 폭격(FAB) 질량 분광계 분석 및 MALDI와 ESI-Q-TOF 질량 분광계 분석을 사용하여 수행될 수 있다.

본 발명의 추가 양태는 본 발명의 펩티드나 변종을 암호화하는 핵산(예를 들면, 폴리뉴클레오티드)을 제공한다. 폴리뉴클레오티드는 예를 들면, DNA, cDNA, PNA, CNA, RNA, 단독 및/또는 이중 가닥, 또는 본래의 또는 예를 들면, 티오 인산 에스테르 골격이 있는 폴리뉴클레오티드 같은 안정된 폴리뉴클레오티드 형, 또는 이들의 조합일 수 있고, 그것은 펩티드를 암호화하는 한 인트론을 가질 수도 있고 안 가질 수도 있다. 물론, 자연적으로 일어나는 아미노산 잔기를 가진 펩티드만이 자연적으로 일어나는 펩티드 결합과 만나 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된다. 본 발명의 또 다른 양태는 본 발명에 따른 폴리펩티드를 발현할 수 있는 발현 벡터를 제공한다. 다른 세포 유형의 발현 벡터는 이 분야에서 잘 알려져 있으며 과도한 실험 없이도 선택될 수 있다.

일반적으로, DNA는 발현에 적절한 방향과 발현을 위한 올바른 리딩 프레임으로 플라스미드와 같은 발현 벡터에 삽입된다. 필요하다면, DNA는 일반적으로 제어가 발현 벡터에서 유용할지라도, 원하는 숙주에 의해 인지되는 적절한 전사와 번역 조절 제어 뉴클레오티드 서열에 연결될 수 있다. 이어서, 벡터는 표준 기술에 의해 숙주에 도입된다. 그 지침은 예를 들어, 문헌[Sambrook et al (1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY]에서 찾을 수 있다.

그러나 본 발명의 특히 바람직한 실시에서, 약학적 조성물은 서열번호 1 내지 서열번호 12에 따른 아미노산 서열로 구성되는 두 개 이상의 펩티드를 포함한다.

백신에 포함될 각 펩티드의 최적의 양과 처방은 당업자가 과도한 실험 없이도 정할 수 있다. 예를 들면, 펩티드나 그 변종은 정맥(i.v.) 주사, 피하(s.c.) 주사, 피내(i.d.) 주사, 복막내(i.p.) 주사, 근육내(i.m.) 주사에 의해 준비될 수 있다. 바람직한 펩티드 주사 방법은 피하, 피내, 복막내, 근육내 및 정맥이다. 바람직한 DNA 주사 방법은 피내, 근육내, 피하, 복막내 및 정맥이다. 예를 들면, 1 내지 500mg과 50㎍ 내지 1.5mg, 더욱 바람직하게는 125㎍ 내지 500㎍의 펩티드 또는 DNA 처방할 수 있고, 이는 각각의 펩티드와 DNA에 따라 다르다. 이 범위의 처방은 이전 실험에 성공적으로 사용되었다(Brunsvig PF, Aamdal S, Gjertsen MK, Kvalheim G, Markowski-Grimsrud CJ, Sve I, Dyrhaug M, Trachsel S, Muller M, Eriksen JA, Gaudernack G; 텔로머라제 펩티드 백신: 비소세포 폐암 환자의 I/II 단계 연구; Cancer Immunol Immunother. 2006; 55(12):1553-1564; M. Staehler, A. Stenzl, P. Y. Dietrich, T. Eisen, A. Haferkamp, J. Beck, A. Mayer, S. Walter, H. Singh, J. Frisch, C. G. Stief; 펩티드를 기반으로 한 암 백신 IMA901의 안정성과 면역원성을 평가하는 공개 수준 연구, ASCO meeting 2007; Abstract No 3017).

본 발명의 약학적 조성물은 조성물에 존재하는 펩티드의 선택, 숫자 및/또는 양이 조직, 암, 및/또는 환자-특이적이 되도록 할 수 있다. 예를 들면, 정확한 펩티드의 선택은 부작용을 피하기 위해 주어진 조직의 모단백질의 발현 패턴에 의해 인도될 수 있다. 이 선택은 물론 환자가 앓고 있는 특정 암 유형, 질병의 상태, 이전 치료 요법, 환자의 면역 상태, 그리고 환자의 HLA-일배체형에 의존할 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 백신은 특정 환자의 개인의 필요에 따른 개별화된 구성 요소를 가질 수 있다. 예로는 특정 환자의 관련 TAA의 발현에 따른 펩티드의 양의 차이, 개인적인 알레르기와 다른 치료에 따른 원치 않는 부작용, 첫번째 또는 치료 방식에 따른 두번째 치료의 조정이 있다.

GBM에 대한 백신으로서 사용되는 조성물에서, 예를 들면, 모단백질이 정상 조직에서 많은 양이 발현되는 펩티드는 본 발명의 조성물에서 회피되거나 낮은 양으로 존재한다. 한편, 종양 환자에서 특정 단백질이 많은 양으로 발현되는 것이 알려지면 그에 따라 이 암에 대한 치료를 위한 약학적 조성물에 많은 양으로 존재할 수 있고/거나 이 특정 단백질 또는 단백질 경로의 펩티드를 하나 이상 포함될 수 있다. 당업자는 실험에 의해 바람직한 면역원성 펩티드 조합을 선택할 수 있다. 예를 들면, T 세포의 효율성, 전체적인 존재, 증식, 친화도, T 세포의 특정 펩티드를 위한 확대, 작용성뿐만 아니라 T 세포의 생체 외 생성, 예를 들면, IFN-감마 분석(아래의 예 참조)에 의해 바람직한 면역원성 펩티드 조합을 선택할 수 있다. 보통, 가장 효율적인 펩티드는 위에 설명된 목적을 위해 백신으로 결합된다.

적합한 백신은 1 내지 20 펩티드, 더욱 바람직하게는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20 상이한 펩티드, 더욱 바람직하게는 6, 7, 8, 9, 10 11, 12, 13, 또는 14 상이한 펩티드, 그리고 가장 바람직하게는 10, 11, 12, 13 또는 14 상이한 펩티드를 갖는다. 암 백신에서 사용되는 펩티드의 길이는 본원에 개시된 임의의 적당한 길이일 수 있다. 특히, 9-머 펩티드, 8-머, 9-머, 10-머, 11-머, 12-머, 13-머, 14-머 또는 15-머 펩티드가 적당할 수 있다. 더 긴 펩티드도 적당할 수 있다. 첨부된 표 4와 5에 기재된 9-머 또는 10-머 펩티드는 MHC 유형 I 펩티드로 바람직하며, 12- 내지 15-머는 MHC 유형 II 펩티드로 바람직하다.

펩티드는 종양 또는 암 백신을 구성한다. 그것은 영향을 받는 기관으로 또는 전신적으로 환자에게 직접 투여될 수도 있고, 환자에서 유래된 세포나 인간 세포주에 생체 외 적용하여 그 후 환자에게 투여될 수도 있고, 또는 환자에서 유래된 면역 세포 부분모집단을 선택하기 위해 생체 외에서 사용되어 다시 환자에게 투여될 수도 있다.

펩티드는 상당히 순수할 수 있거나 면역-자극 아쥬반트(아래 참조)와 결합될 수 있거나 면역-자극 사이토카인과 결합하여 사용될 수 있거나 예를 들면 리포솜 같은 적당한 전달 시스템으로 투여될 수 있다. 펩티드는 또한 열쇠구멍 삿갓조개 헤모시아닌(KLH)이나 마난(문헌[WO95/18145 및 Longenecker et al (1993) Ann. NY Acad. Sci. 690,276-291] 참조) 같은 적합한 담체와 결합될 수도 있다. 펩티드는 표지될 수도 있고, 융합 단백질일 수도 있고, 하이브리드 분자일 수도 있다. 본 발명에 주어진 서열의 펩티드는 CD4 T 세포 또는 CD8 CTL을 자극할 것으로 예상된다. 그러나, 반대의 CD에서 T 세포 양성의 도움이 있으면 자극은 더 효율적이다. 따라서, CD4 T 세포를 자극하는 MHC 유형 II 에피톱에서, 융합 파트너나 하이브리드 분자의 부분은 CD8 양성 T 세포를 자극하는 에피톱을 적절하게 제공한다. 한편, CD8 CTL을 자극하는 MHC 유형 I 에피톱에서, 융합 파트너나 하이브리드 분자의 부분은 CD4 양성 T 세포를 자극하는 에피톱을 적절하게 제공한다. CD4- 와 CD8-자극 에피톱은 이 분야에서 잘 알려졌으며 본 발명에서 식별된 것을 포함한다.

약학적으로 허용된 담체는 잘 알려져 있고 일반적으로 활성 치료제가 조성되어 있는 액체이다. 담체는 일반적으로 조성물에 약리학적 활성을 제공하지 않지만, 화학적 및/또는 생물학적 안정성, 방출 특성 등을 제공할 수 있다. 대표적인 조성물은 예를 들면, 문헌[Alfonso R. Gennaro. Remington: 약학의 과학과 실행 Edition. Baltimore, MD: Lippincott Williams & Wilkins, 2000]에서 찾을 수 있고 염수, 물, 완충물, 0.3% 글리신, 히알루론산, 포도당 등을 포함하지만 이로써 제한되지는 않는다. 최근에, 수년 동안 인간 환자의 정맥 주사 영양을 위해 사용된 특정 지방 유화제가 펩티드를 위한 비히클로 작용될 수 있는 것이 발견되었다. 상업적으로 사용되는 지방 유화제의 두 가지 예로는 인트랄리피드(Intralipid)와 리포펀딘(Lipofundin)이 있다. 미국 특허 제3,169,094호에서 설명된 대로 "인트랄리피드"는 정맥 주사 영양을 위한 지방 유화제로 스웨덴의 카비 파르마시아(Kabi Pharmacia)의 등록 상표이다. "리포펀딘"은 독일의 비 브라운 멜순젠(B.Braun Melsungen)의 등록 상표이다. 둘 다 콩기름을 지방으로 가지고 있다(각각 1,000ml의 증류수에 100 또는 200g : 10% 또는 20%). 계란 노른자 인지질은 인트랄리피드(12g/l 증류수)의 유화제로 사용되고 계란 노른자 레시틴은 리포펀딘(12g/l 증류수)에서 사용된다. 글리세린(12g/l)의 첨가 결과 인트랄리피드와 리포펀딘에서 둘 다 등장성이다.

면역 반응을 유도하기 위해서는 조성물을 더 면역원성있게 만드는 아쥬반트가 필요하다. 따라서, 본 발명의 바람직한 실시에서, 그 약학적 조성물은 하나 이상의 적절한 아쥬반트를 추가로 포함한다.

적절한 아쥬반트는, 1018 ISS, 알루미늄 염, 암플리박스(Amplivax, 등록상표), AS15, BCG, CP-870, 893, CpG7909, CyaA, dSLIM, 플라젤린, 또는 플라젤린으로부터 유래된 TLR5리간드, FLT3 리간드, GM-CSF, IC30, IC31, 이미퀴모드(알다라(ALDARA), 등록 상표), 레시퀴모드, 이뮤팩트(ImuFact) IMP321, IL-2, IL-13, IL-21 같은 인터루킨, 인터페론 알파 또는 베타, 또는 이의 페길화된 유도체, IS 패치(Patch), ISS, 이스코매트릭스(ISCOMATRIX), ISCOM, 쥬브이뮨(JuvImmune), 리포박(LipoVac), MALP2, MF59, 모노포스포릴 지질 A, 몬타니드(Montanide) IMS 1312, 몬타니드 ISA 206, 몬타니드 ISA 50V, 몬타니드 ISA-51, 수중유와 유중수 에멀전, OK-432, OM-174, OM-197-MP-EC, ONTAK, OspA, 펩텔(PepTel, 등록상표) 벡터 시스템, 폴리(락티드 코-글리코이드) [PLG]-기반 덱스트란 극미립자, 탈락토페린 SRL172, 비로좀(Virosome)과 다른 바이러스 같은 입자, YF-17D, VEGF 트랩, R848, 베타-글루칸, Pam3Cys, 사포닌에서 유래된 아퀼라(Aquila) QS21 스티뮬론, 마이코 박테리아 추출물과 합성 박테리아 세포 벽 유사체, 리비 디톡스(Ribi Detox), 퀼(Quil) 또는 수퍼포스(Superfos)와 같은 다른 독점 아쥬반트들이 있지만 이로써 제한되지는 않는다. 프로인트(Freund) 또는 GM-CSF 같은 아쥬반트가 바람직하다. 수지상 세포와 그 제제에 특정한 여러 면역원성 아쥬반트(예를 들면, MF59)는 이전에 설명되었다(Aucouturier et al., 2001; Allison and Krummel, 1995). 또한 사이토카인도 사용될 수 있다. 여러 가지 사이토카인은 임파 조직(예를 들면, TNF)으로의 수지상 세포 이동에 영향을 미치는 것으로 직접적으로 연결되어 있고, 수지상 세포를 T-임파구(예를 들면, GM-CSF, IL-1 및 IL-4)(미국 특허 제5,849,589호, 전체가 본원에 참조로서 포함됨)를 위한 효율적인 항원 제시 세포로의 성숙을 가속시키고, 면역 아쥬반트(예를 들면, IL-12, IL-15, IL-23, IL-7, IFN-알파, IFN-베타)의 역할을 한다(Gabrilovich et al., 1996).

CpG 면역 촉진 올리고뉴클레오티드도 백신에서 아쥬반트의 효과를 향상시킨다고 보고되었다. 이론에 구속됨이 없이, CpG 올리고뉴클레오티드는 주로 TLR9 같은 톨-유사 수용체(TLR)를 통해 고유의(비적용성) 면역 시스템을 활성화시키는 작용을 한다. CpG가 촉진하는 TLR9 활성화는 살아있는 또는 죽은 바이러스, 수지상 세포 백신, 자가 조직의 세포 백신 그리고 예방과 치료 백신의 다당류 결합같은 펩티드 또는 단백질 항원을 포함한 여러 가지 종류의 항원에 대한 항원 특정 체액성 그리고 세포성 반응을 향상시킨다. 더 중요한 것은 T_H1 세포의 향상된 활성화와 CD4 T 세포의 도움이 없을 때도 강한 세포 독성 T-임파구(CTL) 생성의 결과를 낳는 수지상 세포 성숙과 분화를 향상시킨다. TLR9 자극에 의해 유도된 T_H1 경향은 명반 또는 보통 T_H2 경향을 증진시키는 불완전한 프로인트 아쥬반트(IFA) 같은 백신 아쥬반트의 존재 하에도 유지된다. CpG 올리고뉴클레오티드는 항원이 비교적 약할 때 강한 반응을 유도하도록 본질적으로 필요한 마이크로입자, 나노입자, 지질 유화제 또는 다른 아쥬반트과 함께 배합되거나 투여될 때 더욱 큰 아쥬반트 활성을 보인다. CpG 올리고뉴클레오티드는 면역 반응을 가속시킬 수 있고, 어떤 실험에서는 CpG 없는 전체 용량 백신에 대한 비교할 만한 항체 반응으로 항원 복용을 대략 두 등급 정도 감소시킬 수 있다(Krieg, 2006). 미국 특허 제6,406,705 B1호는 CpG 올리고뉴클레오티드, 비-핵산 보조물 그리고 항원-특정 면역 반응을 유도하는 항원의 결합된 이용을 기재한다. CpG TLR9 길항제는 본 발명의 바람직한 약학적 조성물의 성분인 몰로젠(Mologen)(독일 베를린 소재)의 dSLIM(이중 가닥 루프 면역 조절제)이다. RNA 결합 TLR 7, TLR 8 및/또는 TLR 9 같은 다른 TLR 결합 분자 역시 사용될 수 있다.

유용한 아쥬반트의 다른 예로는 치료적으로 및/또는 아쥬반트로서 역할을 하는 시클로포스파미드, 수니티닙, 베바시주맵, 쎄레브렉스, NCX-4016, 실데나필, 타다라필, 바데나필, 소라페닙, 테모졸로마이드, 템시로리머스, XL-999, CP-547632, 파조파닙, VEGF 트랩, ZD2171, AZD2171, 항-CTLA4, 면역 시스템의 중요한 구조를 목표로 하는 다른 항체(예를 들면, 항-CD40, 항-TGF베타, 항-TNF알파 수용체) 그리고 SC58175와 같은 항체뿐만 아니라 화학적으로 변형된 CpG(예를 들면, CpR, 이데라(Idera)), 폴리(I:C)와 같은 dsRNA 유사체와 이의 유도체(예를 들면, 암플리젠(AmpliGen, 등록 상표), 힐토놀(Hiltonol, 등록 상표), 폴리-(ICLC), 폴리(IC-R), 폴리(I:C12U), 비-CpG 박테리아 DNA 또는 RNA가 있으나 이로 제한되지 않는다. 아쥬반트와 본 발명의 맥락에서 용이한 첨가제의 양과 농도는 당업자가 과다한 실험 없이도 쉽게 정할 수 있다.

바람직한 아쥬반트는 이미퀴모드, 레시퀴모드, GM-CSF, 시클로포스파미드, 수니티닙, 베바시주맵, 인테페론-알파, CpG 올리고뉴클리오티드와 유도체, 폴리(I:C)와 유도체, RNA, 시데나필, 그리고 PLG의 미립자 제형 또는 비로좀이 있다.

본 발명에 따른 약학적 조성물의 바람직한 실시에서, 아쥬반트는 그래뉼로사이트 마크로파지 콜로니-자극 인자(GM-CSF, 사르그라모스팀), 이미퀴모드, 레시퀴모드, 그리고 인테페론-알파같은 콜로니-자극 인자로 구성된 군에서 선택된다.

본 발명에 따른 약학적 조성물의 바람직한 실시에서, 아쥬반트는 이미퀴모드 또는 레시퀴모드이다.

본 발명에 따른 약학적 조성물의 바람직한 실시에서, 아쥬반트는 GM-CSF와 이미퀴모드의 조합이다.

본 발명의 조성물은 피하, 피부내, 근육내, 복막내 등의 비경구 투약 또는 경구 투약에 사용된다. 이를 위해서, 펩티드 및 임의적으로 다른 분자들은 약학적으로 허용되는, 바람직하게는 수용성 담체에 용해되거나 현탁된다. 추가로, 조성물은 완충제, 결합제, 파쇄제, 희석제, 향미료, 윤활제 등과 같은 첨가제를 함유할 수 있다. 또한 펩티드는 사이토카인 같은 면역 자극 물질과 같이 투여될 수 있다. 이런 조성물에서 사용될 수 있는 첨가제의 광범위한 목록은 예를 들면 문헌[A. Kibbe, 약학적 첨가제의 안내서, 3rd. Ed. 2000, American Pharmaceutical Association and pharmaceutical press]에서 찾을 수 있다. 이 조성물은 선종성 또는 암, 바람직하게는 CRC의 방지, 예방 및/또는 치료에 사용될 수 있다.

바람직한 조성물은 예를 들어 유럽 특허 제2113253호에서 볼 수 있다.

세포 독성 T세포(CTL)는 항원을 완전한 이질적인 항원 그 자체가 아닌 MHC 분자에 결합한 펩티드의 형상으로 인식한다. MHC 분자 그 자체는 항원 제시 세포의 표면에 자리잡고 있다. 따라서 CTL의 활성화는 펩티드 항원, MHC 분자, 그리고 APC의 삼량체 복합물이 있을 때만 가능하다. 유사하게, 펩티드가 CTL의 활성화에만 사용되는 것이 아니라 각각의 MHC 분자가 있는 APC가 추가로 더해지면 면역 반응을 강화시킬 수 있다.

그러므로, 본 발명에 따른 약학적 조성물의 바람직한 실시는 추가로 하나 이상의 항원 제시 세포를 갖는다.

일반적으로 항원 제시 세포(또는 자극 세포)는 MHC 유형 I 또는 II 분자를 표면에 가지고 있으며 한 실시에서 선택된 항원으로 MHC 유형 I이나 II에 적재하기는 상당히 부족하다. 아래에서 더 설명되는 바와 같이, MHC 유형 I 또는 II 분자는 선택된 생체 외 항원으로 쉽게 적재될 수 있다.

바람직하게는 포유 동물 세포는 TAP 펩티드 전달의 기능이 없거나, 감소되었거나 기능이 떨어진다. TAP 펩티드 전달자가 없는 적당한 세포에는 T2(American Type Culture Collection(ATCC)(미국, 매릴랜드주 20852, 록빌, 파크론 드라이브 12301 소재, 카탈로그 번호 CRL 1992)에서 구할 수 있는 인간 펩티드 적재 결핍 세포주)를 포함하고; T2와 같은 TAP-결핍 세포주는 APC로서 사용될 수 있고 TAP 결여 때문에 MHC 유형 I에 나타나는 거의 대부분의 펩티드는 이 세포주의 빈 MHC 유형 I 분자의 외부 적재를 위해 감시 아래 사용된 펩티드이고, 따라서 모든 효과는 사용된 펩티드에 따라 명확히 제시된다.

바람직하게는, 항원 제시 세포는 수지상 세포이다. 적당하게, 수지상 세포는 항원성 펩티드로 펄스된 자가조직 수지상 세포이다. 항원성 펩티드는 적절한 T 세포 반응에 증가를 주는 임의의 적당한 항원성 펩티드일 수 있다. 종양 관련 항원의 펩티드로 펄스된 자가조직 수지상 세포를 사용하는 T 세포 치료는 문헌[Murphy et al(1996) The Prostate 29, 371-380과 Tjua et al(1997) The Prostate 32, 272-278]에 개시된다.

따라서, 본 발명의 바람직한 실시에서 하나 이상의 항원 제시 세포를 포함하는 약학적 조성물은 예를 들면, 실시예 5에 나타낸 방법으로 펩티드로 펄스되거나 적재된다.

대안으로서 항원 제시 세포는 펩티드를 암호화하는 발현 구조를 포함한다. 폴리뉴클레오티드는 임의의 적절한 폴리뉴클레오티드일 수 있으며, 수지상 세포를 변환하여 펩티드와 면역유도를 이끌 수 있는 것이 바람직하다.

편리하게도, 본 발명의 핵산은 바이러스 폴리뉴클레오티드 또는 바이러스로 구성될 수 있다. 예를 들면, 아데노바이러스-변환된 수지상 세포는 MUC1(Gong et al.(1997) Gene Ther. 4, 1023-1028 참조) 관련된 항원-특정 항종양 면역을 유도하는 것으로 나타났다. 마찬가지로, 아데노바이러스 기반의 시스템이 사용될 수 있다(예를 들면, Wan et al.(1997) Hum. Gene Ther. 8, 1355-1363 참조). 레트로바이러스 시스템이 사용될 수 있다(Koch et al.(2006) J. Exp. Med. 186, 1213-1221 및 Szabolcs et al.(1997)). 혈액 입자-매개된 수지상 세포로의 이동도 사용될 수 있다(Tuting 1997 Eur. J. Immunol. 27, 2702-2707). 그리고 RNA도 사용될 수 있다(Ashley et al. (2007) J. Exp. Med. 186, 1177-1182 참조).

일반적으로, 본 발명의 핵산을 가진 본 발명의 약학적 조성물은 본 발명의 펩티드를 가지고 있는 약학적 조성물과 비슷한 방식으로 투여될 수 있다. 예를 들면, 정맥 주사, 동맥 주사, 복막 주사, 근육 주사, 피부 주사, 종양 주사, 경구, 피부, 코, 구강, 직장, 질, 흡입, 국소 요법.

회피 기전 때문에 종양은 치료에 내성을 발달시킨다. 약물 내성은 치료 중 생길 수 있으며, 암의 전이와 재발에서 나타난다. 약물 내성을 피하기 위해서는 일반적으로 종양은 약물의 조합으로 치료되고, 질병이 없는 기간이 지나면 전이와 재발은 다른 조합을 필요로 한다. 그러므로, 본 발명의 한 양태에서 약학적 조성물은 제2 항암제와 함께 투여된다. 제2 제제는 본 발명의 약학적 조성물의 전, 후 또는 동시에 투여될 수 있다. 동시 투여는 예를 들면, 화학 특성이 호환되면, 본 발명의 약학적 조성물과 제2 항암제를 섞어서 달성될 수 있다. 동시 투여의 또 다른 방법은 예를 들면 본 발명의 약학적 조성물이 주사로 투여되는 동안 제2 항암제는 경구 투여되는 것처럼, 동일한 날에 조성물과 다른 방법으로 항암제를 투여할 수 있다. 약학적 조성물과 제2 항암제는 같은 치료 과정에서 투여될 수 있으나 다른 날 및/또는 다른 치료 과정에서 투여된다.

본 발명의 다른 양상은 본 발명의 약학적 조성물의 치료적으로 효과적인 양을 환자에게 투여함으로써 환자의 암 치료와 예방 방법을 제공한다.

치료적으로 효과적인 양은 면역 반응을 유도, 특히 CTL의 소집단을 활성화 하기에 충분한 양이다. 당업자는 본 명세서에 제공된 예 같은 표준 면역 방법을 이용하여 효과적인 양을 쉽게 정할 수 있다. 약학적 조성물의 특정량의 효과의 모니터하는 다른 방법은 치료된 종양의 성장 및/또는 재발을 관찰하는 것이다.

본 발명에 특히 바람직한 실시에서 그 약학적 조성물은 항암 백신으로 사용된다.

펩티드 또는 펩티드 암호화 핵산을 가지고 있는 조성물은 종양 또는 암 백신을 만들 수 있다. 그것은 영향을 받는 기관이나 전신적으로 환자에게 직접 투여될 수도 있고, 환자에서 유래된 세포나 인간 세포주에 생체 외 적용하고 그 후 환자에게 투여될 수도 있고, 또는 환자에서 유래된 면역 세포 부분모집단을 선택하기 위해 생체 외에서 사용되어 다시 환자에게 투여될 수도 있다.

본 발명의 조성물은 암의 치료 방법 또는 백신으로 사용될 수 있다. 암은 전립선 암종, 구강 암종, 구강 편평 암종(OSCC), 급성 골수성 백혈병(AML)(Qian et al., 2009), 헬리코박터 파일로리-유발 몰트 림프종(Banerjee et al., 2000), 대장 암종/대장암, 신경교종, 비소세포폐암(NSCLC), 자궁경부 암종, 인간 유방암, 전립선암, 결장암, 췌장암, 췌장선암종, 난소암, 간세포 암종, 간암, 다른 표현형의 뇌 종양, 급성 임파구성 백혈병(ALL)과 같은 백혈병, 폐암, 유잉 육종암, 자궁내막암, 머리와 목 편평세포 암종, 후두 상피세포암, 식도 암종, 경구 암종, 방광 암종, 난소 암종, 신장세포 암종, 이형성 수막종, 갑상선 유두 암종, 뇌 종양, 침샘 암종, 절외 T/NK-세포 림프종, 비호지킨성 림프종과 폐와 유방의 악성 고형 종양 그리고 바람직하게는 위암이 될 수 있다.

본 발명에 따른 치료방법 또는 백신의 가장 바람직한 실시에서, 백신은 위암치료를 위한 여러 펩티드 종양 백신이다. 바람직하게는, 백신은 초기 위암세포에서 인식되고 자리잡은 서열번호 1 내지 서열번호 11에서 선택된 종양 관련 펩티드 세트를 가지고 있다. 이 세트는 HLA 유형 I과 유형 II 펩티드를 포함하고 있다. 펩티드 세트는 피부내 투여의 효율성을 시험하는 면역 마커로 사용되는 양성 대조군 펩티드로 사용되는 HBV 핵심 항원(서열번호 23) 같은 하나 이상의 펩티드를 또한 포함한다. 하나의 특정 실시에서 백신은 각각 펩티드 1500㎍ 내지 약 75㎍, 더욱 바람직하게는 약 1000㎍ 내지 약 175㎍, 더욱 바람직하게는 약 500㎍ 내지 약 600㎍, 그리고 가장 바람직하게는 약 578㎍인 11개의 개별 펩티드(서열번호 1 내지 서열번호 11에 따른)로 구성되어 있고, 이들은 모두 HPLC와 이온 교환 크로마토그라피로 정제될 수 있으며, 백색이나 회색이 도는 백색으로 보인다. 동결건조물은 바람직하게는 탄산 수소 나트륨에서 용해되며, 실내 온도에서 재구성 후 30분 이내에 피부내 주사된다. 본 발명에 따르면, 펩티드의 바람직한 양은 용액의 500㎕마다 약 0.1 내지 100mg, 약 0.1 내지 1mg이 더욱 바람직하고, 약 300㎍ 내지 800㎍이 가장 바람직하다. 본원에서 "약"이라는 용어는 달리 정해지지 않으면 주어진 숫자의 +/- 10 퍼센트이다. 당업자는 펩티드의 실제로 사용되는 양을 개개 환자의 면역 상태 및/또는 특정 암 유형에 나타나는 TUMAP 양 등의 여러 가지 인자를 기반으로 하여 조절할 수 있다. 본 발명의 펩티드는 동결건조물 대신에 다른 적당한 형태(무균 용액 등)로 제공될 수 있다.

약학적 조성물은 펩티드 유리 형태 또는 약학적으로 허용가능한 염의 형태로 구성된다.

본원에서 사용되는 "약학적으로 허용가능한 염"은 제제의 산이나 염기의 염을 만듦으로써 변형되는 개시된 펩티드의 유도체를 말한다. 예를 들면, 산 염은 적당한 산에 대한 반응을 포함한 유리 염(일반적으로 약물의 중성 형태가 중성 -NH₂ 기를 가지고 있을 때)에서 제조된다. 산 염을 제조하는 적당한 산은 예를 들면 아세트산, 프로피온산, 글리콜산, 피루브산, 옥살산, 말산, 말론산, 숙신산, 말레산, 푸마르산, 주석산, 구연산, 벤조산, 계피산, 만델산, 메탄설폰산, 에탄설폰산, p-톨루엔설폰산, 살리실산 등과 같은 유기산과 예를 들어, 염산, 브롬화수소 초산, 황산, 질산, 인산 등과 같은 무기산을 포함한다. 반대로, 펩티드에 나타날 수 있는 산 잔기의 염기성 염의 생성은 수산화 나트륨, 수산화 칼륨, 수산화 암모늄, 수산화 칼슘, 트리메틸아민 등과 같은 약학적으로 허용가능한 염기를 사용한다.

특히 바람직한 실시에서 약학적 조성물은 아세트산(아세테이트), 암모늄 또는 염산(클로라이드)의 염으로 펩티드를 구성한다.

또 다른 실시에서, 본 발명의 약학적 조성물은 당, 당 알코올, 글리신, 아르기닌, 글루타민산 같은 아미노산 그리고 프레임워크 형성제를 포함할 수 있다. 당은 단-, 이- 또는 삼당류 일 수 있다. 이 당은 단독으로 사용될 수도 있고, 당 알코올과 함께 사용될 수도 있다. 당의 예는 단당류로서 글루코스, 맨노스, 갈락토스, 프룩토스 또는 소르보스, 그리고 이당류로서 사카로스, 락토스, 말토오스 또는 트레할로스, 그리고 삼당류로서 라피노오스를 포함한다. 당 알코올은 예를 들어 만니토스일 수 있다. 바람직한 재료로는 사카로스, 락토오스, 말토오스, 트레할로스, 매닛 및/또는 소르빗이 있고 만니톨이 더욱 바람직하다.

또한 본 발명의 약학적 조성물은 아스코르브산 또는 글루타티온 같은 항산화제, 페놀, m-크레솔, 메틸 또는 프로필파라벤, 클로로부탄올, 티오메르살 또는 벤잘코늄클로라이드 같은 보존제, 안정제, 사카로스, 락토오스, 말토오스, 트레할로스, 매니토스, 매닛 및/또는 소르빗, 매닛 및/또는 락토스 같은 프레임워크 형성제, 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 같은 용해화제, 즉, PEG 3000, 3350, 4000 또는 6000, 또는 싸이크로덱스트린, 즉 히드록시프로필-β-싸이클로덱스트린, 설포부틸에틸-β-싸이클로덱스트린 또는 γ 싸이클로덱스트린 또는 덱스트란 또는 폴록사오머, 즉, 폴록사오머 407, 폴록사오머 188, 또는 트윈 20, 트윈 80 같은 생리학적으로 허용되는 부형제를 포함할 수 있다(약학적 첨가제 핸드북, 5^thed., edited by Raymond Rowe, Paul Sheskey and Sian Owen, Pharmaceutical Press (2006) 참조). 본 발명의 바람직한 실시에서 약학적 조성물은 항산화제, 프레임워크 형성제 또는 안정제에서 선택된 허용되는 부형제를 하나 이상 포함한다.

허용되는 pH-범위는 정맥과 근육 내 투여를 위해 pH 2 내지 12이지만, 피하에서는 생체 내 희석 감소가 주사 영역에서 더 퍼질 수 있게 하므로 2.7 내지 9.0으로 감소한다(Strickley Robert G., Pharm. Res., 21, NO:2, 201-230 (2004)).

본 발명에 따른 펩티드 및/또는 핵산으로 구성되는 본 발명의 약학적 제제는 해당 펩티드나 항원과 연관있는 선종 또는 암에 걸린 환자에게 투여된다. 이로써 T 세포 매개 면역 반응이 유발될 수 있다.

본 발명에 따른 약학적 조성물은 조성물에 존재하는 본 발명에 따른 핵산의 (특히 종양 관련) 펩티드 또는 본 발명에 따른 발현 벡터의 양이 조직, 암 및/또는 환자 특이적인 경우 바람직하다.

발명의 또 다른 실시에서 백신은 핵산 백신이다. 폴리펩티드를 암호화하는 DNA 백신 같은 핵산 백신의 접종은 T 세포 반응을 이끌어내는 것으로 알려져 있다. 그것은 영향을 받는 기관이나 전신적으로 환자에게 직접 투여될 수도 있고, 환자에서 유래된 세포나 인간 세포주에 생체 외 적용하여 그 후 환자에게 투여될 수도 있고 또는 환자에서 유래된 면역 세포 부분모집단을 선택하기 위해 생체 외에서 사용되어 다시 환자에게 투여될 수도 있다. 핵산이 생체 외에서 세포에 투여되면, 세포들이 인터루킨-2 또는 GM-CSF 같은 면역 자극 사이토카인과 같이 공동 발현하도록 감염시키는 것이 유용할 수도 있다. 핵산은 상당히 순수할 수 있고, 또는 면역 자극 아쥬반트과 섞일 수 있고 또는 면역 자극 사이토카인과 섞여 사용될 수 있고 또는 리포솜 같은 적당한 전달 시스템에 의해 투여될 수 있다. 핵산 백신은 위의 펩티드 백신에서 설명된 아쥬반트와 같이 투여될 수도 있다. 핵산 백신이 아쥬반트 없이 투여되는 것이 바람직하다.

폴리뉴클레오티드는 상당히 순수하거나 적당한 벡터나 전달 시스템에 포함될 수 있다. 적당한 벡터와 전달 시스템은 아데노바이러스, 우두 바이러스, 레트로 바이러스, 헤르페스 바이러스, 아데노 관련 바이러스 또는 하나 이상의 바이러스를 가진 하이브리드에 기반을 둔 바이러스를 포함한다. 비 바이러스성 전달 시스템은 양이온 지질을 포함하며 양이온 중합체도 DNA 전달 방면에서 잘 알려졌다. "유전자 총" 같은 물리적 전달도 사용될 수 있다. 펩티드나 핵산으로 암호화된 펩티드는 예를 들면 CD4-양성 T 세포를 자극하는 파상풍 독소류의 에피톱 같은 융합 단백질일 수 있다.

적당하게, 환자에게 투여된 임의의 핵산은 무균이고 발열원이 없다. 노출된 DNA는 근육내 또는 피부내 또는 피하에 투여될 수 있다. 편리하게도, 핵산 백신은 임의의 적당한 핵산 전달 방법으로 구성될 수 있다. 핵산, 바람직하게는 DNA는 리포좀 또는 바이러스 벡터 전달 시스템의 부분으로 전달될 수 있다. DNA 백신 같은 핵산 백신이 근육내로 투여되는 경우, 펩티드 백신은 피하 또는 피내로 투여되는 것이 바람직하다. 백신이 피부내로 투여되는 경우도 바람직하다.

핵산 및 수지상 세포 같은 전문화된 항원 제시 세포에 의해 암호화된 폴리펩티드의 발현 흡수는 면역 반응 감작의 기전이 될 수 있다고 여겨진다. 수지상 세포는 감염되지 않을 수 있으나 조직의 감염된 세포에서 발현된 펩티드를 가져올 수 있기 때문에 여전히 중요하다("교차-감작", 예를 들면, 문헌[Thomas AM, Santarsiero LM, Lutz ER, Armstrong TD, Chen YC, Huang LQ, Laheru DA, Goggins M, Hruban RH, Jaffee EM. 메소텔린-특정 CD8(+) T 세포 반응은 백신 접종된 췌장암 환자들의 항원 제시 세포로 생체 내 교차-감작의 증거를 보여준다. J Exp Med. 2004 Aug 2;200(3):297-306]).

암의 폴리뉴클레오티드-매개된 면역 치료는 문헌[Conry et al (1996) 암 연구의 세미나 23, 135-147; Condon et al (1996) Nature Medicine 2, 1122-1127; Gong et al (1997) Nature Medicine 3, 558-561; Zhai et al (1996) J. Immunol. 156, 700-710; Graham et al (1996) Int J. Cancer 65, 664-670; 및 Burchell et al (1996) 309-313 In: 유방암, 생물학과 치료의 진보, Calvo et al (eds), John Libbey Eurotext]에 기재되며 그 전문이 참조로서 포함된다.

또한, 주사 부위, 목표 벡터와 전달 시스템의 사용, 또는 환자로부터의 세포 군집의 선택적인 정제 및 펩티드 또는 핵산의 생체 외 투여(예를 들면, 수지상 세포는 문헌[Zhou et al (1995) Blood 86, 3295-3301; Roth et al (1996) Scand. J. Immunology 43, 646-651]에 기재된 것처럼 정렬될 수 있다)에 의해 항원 제시 세포 같은 특정 세포 군집을 백신의 목표로 하는 것은 유용하다. 예를 들면, 목표 벡터는 항원의 발현을 적당한 장소에 이끄는 조직- 또는 종양-특이적 촉진제를 포함할 수 있다.

마지막으로, 본 발명에 따른 백신은 환자가 앓고 있는 특정 암 유형, 질병의 상태, 이전 치료 방법, 환자의 면역 상태 그리고 환자의 HLA-일배체형에 의존적일 수 있다. 또한, 발명에 따른 백신은 특정 환자의 요구 사항에 따라 개인화된 구성 요소를 포함할 수 있다. 예로는 특정 환자에 있어서 관련 TAA의 발현에 따른 펩티드의 양의 차이, 개인적인 알레르기와 다른 치료에 따른 원치 않는 부작용, 첫번째 또는 치료 방식에 따른 두번째 치료의 조정이 있다.

암의 치료에 유용한 것 이외에도, 본 발명의 펩티드는 진단에도 유용하다. 펩티드들이 아교모세포종에서 생성되고, 정상 조직에서는 나타나지 않기 때문에 펩티드들은 암의 존재를 진단하는데 사용될 수 있다.

조직 생체 검사에서 본 발명의 펩티드의 존재는 암 진단에 있어 병리학자에게 도움을 줄 수 있다. 항체, 질량 분석 또는 이 분야에 알려진 다른 방법으로 본 발명의 특정 펩티드의 감지는 조직이 악성, 염증 또는 일반적인 질병이 있는가를 병리학적으로 말할 수 있다. 본 발명의 펩티드 군의 존재는 질병 조직의 분류 또는 하위분류를 가능하게 한다.

질병 조직 표본에서 본 발명의 펩티드의 감지는, 특히 T 임파구가 알려졌거나 실행의 기전에 관련될 것이라고 예상될 때, 면역 시스템에 관련된 치료의 혜택에 대해 결정할 수 있게 한다. MHC 발현의 손실은 감염된 또는 악성 세포가 면역 감시를 피하는 기전을 잘 설명한다. 따라서, 본 발명의 펩티드의 존재는 이 기전이 분석된 세포에 의해 악용되지 않는 것을 보여준다.

본 발명의 펩티드는 T 세포 반응이나 본 발명의 펩티드 또는 MHC 분자에 혼합된 본 발명의 펩티드에 대한 항체 반응 같은 본 발명의 펩티드에 대한 임파구 반응을 분석하는데 사용될 수 있다. 임파구 반응은 추가 치료 단계의 전조 마커로 사용될 수 있다. 이 반응은 다른 방법들, 예를 들면, 단백질의 백신, 핵산, 자가조직 물질, 임파구의 선택 전달 등을 이용해서 임파구 반응을 유도하려고 하는 면역 치료 접근의 대리 마커로 사용될 수 있다. 유전자 치료 환경에서, 본 발명의 펩티드에 대한 임파구 반응은 부작용에 대한 평가로서 고려할 수 있다. 임파구 반응의 관찰은 예를 들면, 이식 대 숙주나 숙주 대 이식 질병의 감지 같은, 이식 치료의 사후 검사의 유용한 도구가 될 수 있다.

또 다른 양상에서, 본 발명은 (a) 상기된 약학적 조성물을 액체 또는 동결 건조된 형태로 가지고 있는 용기; (b) 임의적으로 동결 건조된 제형을 위해서 희석된 또는 재구성된 용액을 가지고 있는 제2 용기; 및 (c) 임의적으로 (i) 용액의 이용, 또는 (ii) 동결건조된 제형을 위한 재구성 및/또는 이용에 대한 지침을 가지고 있는 키트에 관한 것이다. 그 키트는 (iii) 완충제; (iv) 희석제; (v) 필터; (vi) 바늘; 또는 (v) 주사기 중 하나 또는 그 이상을 추가로 포함할 수 있다. 용기로는 병, 약병, 주사기 또는 시험관이다; 그리고 그것은 다중 이용 용기일 수 있다. 약학적 조성물은 동결건조되는 것이 바람직하다.

본 발명의 키트는 바람직하게는 본 발명의 동결건조된 제형을 적당한 용기에 가지고 있고 재구성 및/또는 이용에 대한 지침을 포함한다. 적당한 용기는, 예를 들면, 병, 약병(예, 듀얼 챔버 튜브), 주사기(예, 듀얼 챔버 주사기) 그리고 시험관을 포함한다. 용기는 유리나 플라스틱 같은 다양한 재료로 만들어질 수 있다. 키트 및/또는 용기는 재구성 및/또는 이용에 대한 방침을 말해주는 지침서를 가지고 있다. 예를 들면, 라벨은 상기된 대로 동결건조된 제형이 펩티드 농도로 재구성되어야 함을 나타낸다. 라벨은 또한 제형이 피하 투여에 유용하게 고안된 것이라는 것을 알릴 수 있다.

제형을 가지고 있는 용기는 재구성된 제형의 반복적인 투여(예를 들면, 2 내지 6회 투여)를 가능하게 하는 다중-사용 약병일 수 있다. 키트는 적절한 희석액(예를 들면, 중탄산나트륨 용액)을 가지고 있는 제2 용기를 가지고 있을 수 있다.

희석액과 동결건조된 제형을 혼합함으로써, 재구성된 제형에서 최종적 펩티드 농도는 바람직하게는 최소한 0.15 mg/mL/펩티드(=75㎍)이며 바람직하게는 3 mg/mL/펩티드(=1500㎍)를 넘지 않는다. 키트는 다른 완충제, 희석제, 필터, 바늘, 주사, 사용법이 있는 패키지 삽입물 등 상업 및 사용자의 관점에서 바람직한 다른 물질을 가지고 포함할 수 있다.

본 발명의 키트는 본 발명에 따른 약학적 조성물의 제형을 가진 하나의 용기를 다른 구성 요소(예를 들면, 다른 화합물이나 다른 화합물의 약학적 조성물)와 함께 또는 없이 가질 수 있거나 각각의 구성 요소를 위한 다른 용기를 가질 수 있다.

바람직하게는, 본 발명의 키트는 제2 화합물(아쥬반트(예를 들면, GM-CSF), 화학 요법제, 천연 물질, 호르몬이나 길항제, 항-신생 혈관생성제나 반응 억제제, 아포토시스-유도제나 킬레이트 같은)이나 그의 약학적 조성물과 공동 투여를 위해 포장된 제형을 포함한다. 키트의 각각의 구성 요소는 혼합 전이거나 환자에게 투여 전까지 다른 용기에 담겨 있을 수 있다. 키트의 구성 요소는 하나 또는 여러 가지 액체 용액으로 제공될 수 있으며, 수성의 용액이 바람직하고, 무균 수용성 용액이 더욱 바람직하다. 키트의 구성 요소는 또한 적절한 용매가 더해졌을 때 액체로 바뀌는 고체로 제공될 수 있고, 다른 용기에 제공되는 것이 더욱 바람직하다.

치료 키트의 용기는 바이알, 시험관, 플라스크, 병, 주사기 또는 임의의 다른 고체나 액체를 동봉하는 수단이 될 수 있다. 일반적으로, 하나 이상의 구성 요소가 있을 때, 키트는 제2 병 또는 다른 용기를 가지며, 이것은 분리된 복용을 가능하게 한다. 키트는 또한 약학적으로 허용가능한 액체를 위한 다른 용기를 가질 수 있다. 바람직하게는, 치료 키트는 현재의 키트에 있는 본 발명의 제제의 투여를 가능하게 하는 장치(예를 들면, 하나 이상의 주사 바늘, 주사기, 점안기, 피펫 등)를 가진다.

본 발명의 약학적 제형은 경구, 코, 눈, 피하, 피부내, 근육내, 정맥내 또는 경피성 같은 어떤 펩티드 투여 방법에도 적합하다. 바람직하게는 투여는 피하이고 피내가 가장 바람직하다. 투여는 주입 펌프로 될 수 있다.

본원에 개시되고 기재된 본 발명의 특징은 나타낸 해당 조합에서만 사용될 수 있는 것이 아니라 본 발명의 의도된 범위를 벗어나지 않는 한, 단독으로도 사용될 수 있다는 것이 이해되어야 한다. 본 발명의 목적상 본원에 인용된 모든 참조는 그 전문이 참조 문헌으로 포함된다.

본 발명은 이제 도면, 서열 목록 및 실시예를 참조하여 더 자세히 설명된다. 하기 실시예는 예시의 목적으로만 제공되며 본 발명을 제한하기 위한 것이 아니다.

실시예

1. 합성

펩티드는 표준과 잘 확립된 고체상 펩티드 합성에 의해서 Fmoc 화학 기법을 사용하여 합성되었다. 예비 RP-HPLC에 의한 정제 후, 이온-교환 절차는 생리적으로 호환가능한 반대 이온(예를 들면 아세트산염, 암모늄 또는 염화물)을 포함시키기 위해 수행되었다. 마지막으로, 동결건조후 백색이거나 회색에 가까운 백색의 고체가 취득되었다. 모든 TUMAP는 아세트산 염으로 투여되는 것이 바람직하고, 다른 염의 형태 또한 가능하다.

중요한 것은, 각각의 개별적인 펩티드의 정체성과 순도는 질량 분석법, 분석적인 RP-HPLC를 사용하여 결정하였다.

이온-교환 절차 후 백색이거나 회색에 가까운 백색의 동결된 펩티드가 하기 표 7에 나타낸 바와 같은 순도로 취득되었다:

[표 7]

모든 펩티드는 다른 온도 및 pH 값과 같은 다른 물리화학적 상태에서 이들의 안정성을 알아보기 위해 시험하였다.

2. 예시적인 약학적 조성물 IMA941의 구성 요소

IMA941은 대부분이 초기 대장암 세포에서 발견된 합성 종양 관련 펩티드 (TUMAP)의 혼합으로 구성되어 있다. TUMAP는 세포 독성 T 세포(CD8+ T세포)를 활성화할 수 있는 능력이 있는 10개 HLA 유형 I 결합 펩티드와 T 조력 세포(CD4+ T 세포)를 활성화할 수 있는 능력이 있는 1개 HLA 유형 II 결합 펩티드를 포함한다. T 조력 세포는 CD8+ T 세포의 살해 기능을 증진시키는 사이토카인을 방출하여 세포 독성 T 세포의 기능을 도와주는 주요한 역할을 하고 종양 세포에 직접 작용할 수도 있다(Knutson and Disis 2005). 이 11개 TUMAP 외에도 IMA941은 하나의 바이러스 조절 펩티드를 포함할 수 있다.

수술에서 제거된 GBM 환자의 악성과 정상 조직 샘플과 건강한 공여자의 혈액을 단계적인 방법으로 분석하였다:

먼저, 마이크로어레이에 의한 게놈 영역 mRNA 발현 분석은 정상 기관과 조직의 범위에 비해서 악성 조직에서의 유전자 과발현을 인식하는데 사용되었다. 두번째 단계에서, 악성 물질에서의 HLA 리간드가 질량 분석기에 의해 인식되었다. 이후, 인식된 HLA 리간드를 유전자 발현 데이터와 비교하였다. 1 단계에서 감지된, 선택적으로 발현되거나 과발현된 유전자에 의해서 암호화된 펩티드는 멀티-펩티드 백신을 위한 TUMAP에 적당한 후보로 간주되었다.

마지막으로, 건강한 사람의 말초 CD8+ T 세포는 종양 관련 HLA 리간드에 대한 반응성을 얻기 위해 여러 가지 면역 분석(생체 외 T세포 분석)을 이용하여 시험하였다.

3. 종양 샘플의 IMA941에 포함된 종양 관련 펩티드(TUMAP)의 제시

조직 샘플

환자들의 종양 조직은 일본 교토 소재의 교토 의과대학(KPUM), 그리고 일본 오사카 소재 오사카 시립 의학대학원(OCU)에서 제공되었다. 모든 환자들의 고지에 의한 승락서는 수술 전에 받았다. 조직은 수술 직후 액체 질소에 충격 동결되었고(shock-frozen) TUMAP가 단리될 때까지 -80℃에서 저장되었다.

조직 샘플에서 HLA 펩티드의 단리

약간 변형된 프로토콜에 따르면, 충격 동결된 조직 샘플의 HLA 펩티드 풀(pool)은 고형 조직의 면역 침전에 의해 HLA-A, -B, -C- 특이적 항체 W6/32, CNBr-활성화된 세파로오스, 산성 처리와 한외 여과를 이용해 취득되었다(Falk,. et al., 1991)(Seeger. et al., 1999).

ESI -액체 크로마토그라피 -질량 분석법( ESI - LCMS )에 의한 TUMAP 검출

HLA 펩티드 풀은 역상 크로마토그래피 단계(애퀴티 유피엘씨 시스템(Acquity UPLC system), 워터스(Waters))에 의해 소수성에 따라 분리되고, 녹여서 분리된 펩티드는 ESI 원천을 갖춘 엘티큐-오르비트랩(LTQ-Orbitrap) 하이브리드 질량 분석기 (써모일렉트론(ThermoElectron))에 의해 분석되었다. 펩티드 풀은 1분에 400nL의 유속에서 적용되는 1.7㎛ C18 역상 물질(워터스)로 패킹된 분석적 융합-실리카 마이크로-모세관 컬럼(75㎛ i.d. x 250 mm)으로 직접적으로 적재된다. 이후에, 펩티드는 1 분에 300nL의 유속에서 10% 내지 33%의 2 단계 180분-이진 구배를 이용하여 분리된다. 구배는 용매 A(물에 0.1% 포름산) 그리고 용매 B(아세토니트릴에 0.1% 포름산)로 이루어졌다. 금 코팅 유리 모세관(피코팁(PicoTip), 뉴 옵젝티브(New Objective))은 나노ESI 원천으로의 도입을 위해 사용되었다. LTQ-오르비트랩 질량 분석기는 TOP5 전략을 사용하여 데이터 종속 모드로 운영되었다. 간단하게, 스캔 주기는 오르비탑(R=30,000)의 높은 질량 정확성이 있는 전체 스캔으로 시작되었고, 이어서 전에 선택된 이온의 동적 제외가 있는 5개의 가장 풍부한 전구체 이온의 오르비트랩(R=7500)의 MS/MS 스캔이 또한 실시되었다. 탠덤 질량 스펙트럼은 시퀘스트(SEQUEST)와 추가적 수동 제어에 의해서 해석되었다. 식별된 펩티드 서열은 합성 서열과 동일한 참조 펩티드의 분할 패턴이 있는 생성된 자연 펩티드 분할 패턴을 비교함으로써 확인되었다. 도 1은 MHC 유형 I 관련 펩티드 CDC2-001에 대해 종양 조직으로부터 수득된 예시적인 스펙트럼 및 UPLC 시스템상에서의 용리 프로필을 나타낸다.

실시예 2

본 발명의 펩티드를 암호화하는 유전자의 발현 프로필

종양세포의 표면에 MHC 분자에 의해 제시되는 모든 펩티드가 면역치료에 적합한 것은 아니며, 이는 이 펩티드의 대부분이 많은 세포 종류에서 발현된 정상적인 세포 단백질에서 유래되었기 때문이다. 소수의 몇 개의 펩티드만이 종양과 관련이 되어 있고, 이는 T 세포를 이 종양이 어디서 유래되었는지를 알 수 있는 높은 특이성을 가지고 유도할 수 있다. 이러한 펩티드를 식별하고 백신에 의해 유래된 자가 면역의 위험을 낮추기 위해서 본 발명자들은 대다수의 정상적인 조직과 비교했을 때 종양 세포에서 더 높은 양으로 과발현되는 단백질로부터 유래된 펩티드에 초점을 맞추었다.

가장 이상적인 펩티드는 종양에서만 만들어지고 임의의 다른 조직에서는 존재하지 않는 단백질에서 유래되는 펩티드이다. 이러한 이상적인 펩티드와 비슷한 발현 프로필을 가지고 있는 유전자로부터 유래된 펩티드를 식별하기 위해서, 식별된 펩티드는 단백질과 유전자에 각각 지정되었고, 이들 유전자의 발현 프로필이 생성되었다.

RNA 공급원 및 준비

수술로 제거된 조직 샘플은 두 개의 다른 임상 센터에서 각 환자로부터 동의를 받은 후 제공되었다(실시예 1 참조). 종양 조직 샘플은 수술 직후 액화 질소에서 얼렸으며, 나중에 액화 질소 내에서 막자와 사발을 이용하여 갈았다. 총 RNA는 이 샘플과 TRI 시약(앰비온(Ambion), 독일 담스타트 소재)을 이용하여 알엔이지(RNeasy, 퀴아젠(QIAGEN, 독일 힐덴 소재))로 세척한 후 준비하였다. 이 두 가지의 과정은 모두 제조자의 사용법에 따라 실시되었다.

건강한 인간 조직에서 유래된 총 RNA는 앰비온(Ambion, 영국 헌팅던 소재); 클론테크(Clontech, 독일 하이델베르그 소재); 스트라타진(Stratagene, 네델란드 암스테르담 소재); 바이오체인(BioChain, 미국 캘리포니아주 헤이워드 소재)에서 구입하였다. 여러 명의 개인에서(2명에서 123명의 개인) 유래된 RNA는 혼합되어 각 개인에서 유래된 RNA가 같은 비율로 섞이도록 하였다. 백혈구는 4명의 건강한 자원 봉사자의 혈액 샘플로부터 얻었다.

모든 RNA 샘플의 질과 양은 RNA 6000 피코 랩칩 키트(Pico LabChip Kit, 아질런트(Agilent))를 사용하여 아질런트 2100 바이오분석기(Agilent 2100 Bioanalyzer, 아질런트(독일 왈드브론 소재))를 통해 평가하였다.

마이크로어레이 실험

모든 종양 그리고 정상 조직 RNA 샘플의 유전자 발현 분석은 어피메트릭스 인간 게놈(Affymetrix Human Genome(HG)) U133A 또는 HG-U133 플러스 2.0 올리고뉴클레오티드 마이크로어레이(어피메트릭스, 미국 캘리포니아주 산타 클라라 소재)를 이용하여 실시하였다. 모든 과정은 어피메티릭스 사용 설명서에 의해 실시하였다. 간단히, 이중 가닥 cDNA는 수퍼스크립트(SuperScript) RTII(인비트로젠(Invitrogen)) 그리고 올리고-dT-T7 프라이머(엠더블유지 바이오테크(MWG Biotech, 독일 에버스버그 소재))를 이용하여 RNA 5 내지 8㎍을 이용하여 사용 설명서에 따라 합성하였다. 생체 외 전사는 U133A 어레이에는 바이오어레이 고효율 RNA 전사체 표지 키트(BioArray High Yield RNA Transcript Labelling Kit)(엔조 다이어그노스틱스 인코포레이티드(ENZO Diagnostics, Inc., 미국 뉴욕주 파밍데일 소재)를 사용하였고 U133 플러스 2.0 어레이에는 유전자칩 아이브이티 표지 키트(GeneChip IVT Labelling Kit, 어피메트릭스)를 사용하였으며, 이어서, cDNA 단편화, 혼성화, 스트렙타비딘-피코에리트린 그리고 바이오티닐화된 항-스트렙타비딘 항체(Molecular Probes, 네덜란드 레이덴 소재)에 의한 염색 과정을 거쳤다. 영상은 아질런트 2500A 유전자어레이 스캐너(GeneArray Scanner)(U133A) 또는 어피메트릭스 유전자칩 스캐너 3000(U133 플러스 2.0)에 의해 스캔하였으며 데이터는 GCOS 소프트웨어(어피메트릭스)에 의해서 모든 매개 변수에 대한 기본 설정값을 사용하여 분석하였다. 표준화를 위해, 어피메트릭스에서 제공한 100개의 하우스키핑(housekeeping) 유전자를 사용하였다. 상대적인 발현 값은 소프트웨어에서 제공되는 정상 신장 샘플의 신호 로그 비율에 의해 계산하였으며 이는 임의로 1.0으로 설정하였다.

도 2에 나타난 바와 같이 본 발명의 유전자 원천의 발현 프로파일은 위암에서 높은 수준으로 과발현된다.

4. IMA941 MHC 유형 I이 나타난 펩티드의 생체 외 면역원성

본 발명의 TUMAP의 면역원성에 대한 더 많은 정보를 얻기 위해서, 문헌[(Walter, S, Herrgen, L, Schoor, O, Jung, G, Wernet, D, Buhring, HJ, Rammensee, HG, and Stevanovic, S; 2003, 최첨단: 보정된 MHC/항-CD28-코팅된 마이크로스피어로 확장된 인간 CD8 T 세포의 미리 결정된 결합성, J.Immunol., 171, 4974-4978)]에 의해서 이미 잘 확립된 생체 외 자극 플랫폼을 사용한 조사를 수행하였다. 이 플랫폼을 이용하여, 본 발명의 10개의 HLA-A*2402 제한된 TUMAP의 면역원성을 보여줄 수 있었으며 따라서 이 펩티드들은 CD8+ 전구체 T 세포가 인체에 존재하는 것에 대한 T-세포 에피톱임을 잘 보여준다(표 6).

CD8 + T 세포의 생체 외 프라이밍

펩티드-MHC 복합체(pMHC)와 항-CD28 항체가 적재된 인공 항원 제시 세포(aAPC)에 의한 생체 외 자극을 수행하기 위해서, 본 발명자들은 먼저 혈액 은행 퉤빙겐(Blood Bank Tuebingen)의 건강한 공여자에서 얻어진 신선한 HLA-A*24 백혈구 성분 수집으로부터 CD8 T 세포를 단리하였다.

CD8 T 세포는 백혈구 성분 수집에 의하여 직접 농축되거나 또는 PBMC(말초 혈액 단핵 세포)는 표준 구배 분리 배지(PAA, 독일 쾰브 소재)를 사용하여 먼저 단리하였다. 단리된 CD8 임파구 또는 PBMC는 10% 열 활성화된 인간 AB 혈청(팬 바이오텍(PAN-Biotech), 독일 아이덴바흐 소재)이 보충된 알피엠아이-글루타맥스(RPMI-Glutamax, 인비트로겐, 독일 칼스루흐 소재), 100U/ml 페니실린/100㎍/ml 스트렙토마이신(캄브렉스(Cambrex), 독일 콜론 소재), 1mM 나트륨 피루브산(씨씨 프로(CC Pro), 독일 오베르돌라 소재), 20㎍/ml 젠타마이신(캄브렉스), 2.5ng/ml IL-7(프로모셀(PromoCell), 독일 하이델베르그 소재) 및 10U/ml IL-2(노바티스 파마(Novartis Pharma), 독일 뇌른베르그 소재)로 구성된 T-세포 배지(TCM)에서 배양하였다. CD8+ 임파구의 단리는 CD8 마이크로비드(MicroBeads, 밀테니 바이오텍(Miltenyi Biotec), 독일 버지슈-글라드바흐 소재)를 이용한 양성 선택에 의해 수행하였다.

pMHC/항-CD28 코팅된 비드의 생성, T 세포 자극과 해독은 약간의 변형 이전에 기재된 대로 수행하였다(Walter et al., 2003). 간략하게, 막 통과 도메인이 결핍되고 중쇄의 카르복시 말단에서 펩티드 결합된 바이오틴화된 항체 재조합 HLA-A*2402 분자를 제조하였다. 정제된 동시자극 마우스 IgG2a 항 인간 CD28 항체 9.3 (Jung et al., 1987)은 제조 업체(페르비오(Perbio), 독일 본 소재)가 권장하는 대로 설포-N-히드록시석신이미도바이오틴(Sulfo-N-hydroxysuccinimidobiotin)을 이용하여 화학적으로 바이오틴화하였다. 사용된 비드는 크기가 5.6㎛인 큰 스트렙트아비딘 코팅된 폴리스티렌 입자였다(뱅스 래보래토리즈(Bangs Laboratories), 미국 일리노이주 소재). 대조군으로 사용된 pMHC는 각각 A*0201/MLA-001(변형된 멜란-A/MART-1의 펩티드 ELAGIGILTV)와 A*0201/DDX5-001(DDX5의 YLLPAIVHI)였다.

600ng의 바이오틴 항-CD28과 200ng의 관련된 바이오틴-pMHC(고밀도 비드)의 존재 하에 800,000비드/200㎕를 96-웰 플레이트에 코팅하였다. 96-웰 플레이트의 자극은 1x10⁶ CD8+ T 세포와 5ng/ml IL-12(프로모셀(PromoCell)) 보충된 200㎕ TCM 중 2x10⁵세척하고 코팅된 비드를 3 내지 4일간 37℃에서 공동배양함으로써 시작하였다. 이어서, 배지의 반은 80U/ml IL-2 보충된 새로운 TCM에 의해 교환하고 배양을 37℃에서 3 내지 4 일간 계속하였다. 이 자극 주기는 총 3회 수행하였다. 마지막으로, 멀티머 분석은 생/사-아쿠아 염료(Live/dead-Aqua dye(인비트로겐), 독일 칼스루흐 소재)로 CD8-FITC 항체 클론 SK1(BD, 독일 하이델베르그 소재)과 PE- 또는 APC-결합 A*2402 MHC 멀티머를 염색함으로써 수행하였다. 분석을 위해서, 적당한 레이저와 필터가 장착된 BD LSRII SORP 사이토머를 사용하였다. 펩티드 특이적 세포는 총 CD8+ 세포의 백분율로 계산하였다. 멀티머 분석의 평가는 플로우조 소프트웨어(FlowJo software, 트리스타(Tree Star), 미국 오레곤주 소재)를 사용하여 수행하였다. 특이적인 멀티머+ CD8+ 임파구의 생체 외 프라이밍은 적절한 게이팅(gating)과 음성 대조군 자극과 비교함으로써 검출하였다. 건강한 공여자의 하나 이상의 생체 외 자극된, 평가가능한 웰에서 생체 외 자극 후 CD8+ T 세포주를 보이는 경우에 주어진 항원의 면역원성이 발견되었다(즉, 이 웰은 CD8+ T 세포 중 1% 이상의 특이적인 멀티머+를 가졌으며 특이적인 멀티머+ 세포의 백분율은 음성 대조군 자극된 중간값보다 10배 이상이어야 한다).

IMA 941 펩티드를 위한 생체 외 면역원성

시험된 HLA 유형 I 펩티드에 대한 생체 외 면역원성은 펩티드 특이적인 T-세포주의 생성에 의해 모든 14개의 펩티드에 대해서 나타내어질 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 두 개의 펩티드에 TUMAP-특이적인 멀티머 염색 유세포 분석 결과는 도 1에 음성 대조군과 나란히 나타내었다. 본 발명의 펩티드에 대한 결과는 표 8에 요약하였고, 이는 본 발명의 HLA 유형 I 펩티드의 생체 외 면역원성을 제공한다. 생체 외 면역원성 실험의 결과는 평가가능한 펩티드 중 공여자와 웰의 백분율을 나타낸다. 각 펩티드에 대해 적어도 두 명의 공여자와 24 웰이 평가된다.

[표 8]

본 발명의 HLA 유형 I 펩티드의 생체 외 면역원성

5. IMA941 유형 II TUMAP BIR -002의 면역원성

서열번호 11을 사용하여 펩티드의 면역원성을 확인하기 위해 임상 연구를 실시하였다. 일차적 연구 목적은 근치 전립선 절제술 후 생화학적 재발되었지만 전이성 병변이 탐지되지 않은 환자에서 전립선-특이적 펩티드 패널(백신 치료) 피하 투여에 대한 PSA(전립선 특이적 항원)-기반 반응(PSA-R)을 연구하는 것이었다.

이차적 연구 목적은 T 세포 반응에 대한 면역 현상을 특별히 고려하여 전립선암을 가지고 있는 환자들에게 백신 치료제를 투여하는 것의 내성과 실행 가능성을 알아보기 위한 것이었다.

연구는 "전이성 병변이 탐지되지 않은 근치 전립선 절제술 후 생화학적 재발" 표시를 위해 전향적, 무작위 및 I/II 상 연구로 설계되었다.

연구 인구

I/II 상 연구의 일부로, 근치 전립선 절제술 후 생화학적 재발 환자 중 HLA-A*02⁺의 전립선-특이적 펩티드 패널을 갖는 백신에 의한 종양 성장의 중단의 표시로 PSA 퇴화를 유도하는 것을 시도하였다. 전립선-특이적 펩티드의 조합을 피하내로 투여하여 면역 반응의 정도를 각각의 다양한 투여 형태의 항원 구조에 대해 평가하였다.

이전 백신 연구에 반해, 이 계획된 연구는 아직 영상 절차로 감지가 되지 않는 작은 종양을 가지고 있는 환자의 치료를 목표로 하였다. 환자는 모두 알려진 전립선-특이적 항원 구조를 사용하여 같은 방법으로 면역화하였으며 이는 악성으로 변형된 세포에 대한 면역 반응을 높이기 위한 것이었다. 19명의 환자가 치료되었다.

[표 9]

연구 인구의 특성

치료 계획

전이성 병변을 전산화 단층 촬영과 골격 신티그래피 촬영으로 제외한 후, 전립선-특이적 펩티드 백신을 근치 전립선 절제술 후 PSA 재발이 감지(14일 이상 떨어진 2 번의 측정에서 50% 이상 PSA 증가)된 환자에게 피하 투여하였다. 백신은 0, 7, 14, 28, 42와 56일째에 걸쳐 8번 투여하였다(펩티드 당 약 100㎎, 매번 주사 투여). 각 백신 치료 후 70일째, PSA를 다시 측정하여 치료 반응을 평가하였다.

종양 반응이 감지될 시(완전 관해[PSA-CR], 부분 관해[PSA-PR] 또는 안전 임상 진행[변화 없음, PSA-NC]), 환자는 선택된 투여 형태에 따라, 유지 치료 방법으로서 한 달에 한번씩 백신을 투여하였다. 백신 치료에 대한 환자의 반응의 평가는 다음에 자세히 나타내었다:

완전 관해(PSA-CR): 처음에 증가되었던 PSA 수준이 정상화되었는데, 이는 4주 이상의 간격 후에 측정함으로써 확인하였다. 정상화란 PSA 최하점이 0.2ng/ml 미만인 것으로 정의되며, 이는 완전한 종양 또는 전립선 적출술이 이루어진 근치 전립선 절제술 후에 기대된다.

부분 관해: a) PSA-PR ≤ 80%(처음에 증가되었던 PSA 수준이 80% 감소되고, 4주 이상의 간격 후에 측정함으로서 확인됨); 및 b) PSA-PR ≤ 50%(처음에 증가되었던 PSA 수준이 50% 감소되고, 4주 이상의 간격 후에 측정함으로서 확인됨.)

안정적 상태(PSA-SD): 4주 이상 동안 현저한 변화가 없음. 이는 4주 이상의 간격을 둔 측정에 의해 확인된 안정된 상태 그리고 50% 이하의 감소 그리고 10% 이하의 증가를 포함한다.

진행(PSA-PD): PSA 레벨의 10% 이상 증가. PSA가 진행되는 경우, 연구를 종료하였다.

환자가 연구에 등록한 후, 에피톱-특이적 백신을 사용하였다; 전립선 상피 세포에서 특이적으로 발현되는 단백질(예, PSMA/PSCA)이 고려되었다. 투여한 백신의 잔여 종양의 성장 모니터링에 대한 일반적인 효능을 PSA 모니터링으로 평가하는 것 외에도, 이 연구는 다양한 백신 방법에 대한 효과적인 면역 체계 조절에 대해 조사하였다. 펩티드 단독의 간단한 피하 투여 외에도 아쥬반트의 여러 가지의 결합도 함께 사용되었다. 특히, 예전에 매우 긍정적으로 묘사된 바 있는 몬타니드(Montanide, 인간에게 사용하기에 적합한 전형적인 불완전 프로인트 아쥬반트의 제형)가 펩티드 백신을 위한 데포(depot)와 아쥬반트 활성을 위해 사용되었다. 이 목적을 위하여 500㎕ 펩티드 용액과 500㎕의 몬타니드를 혼합하여 투여하였다. 그 때문에, 수중유 에멀전이 구축되었고, 이는 수성상에 포함되어 있는 항원을 몇 주에 걸쳐 천천히 방출한다. 에멀전의 물리적 안정성은 섭씨 4도에서 3개월 이상 현저한 상 분리없이 저장될 수 있을만큼 아주 높다. 몬타니드의 데포 기능은 몇몇의 백신 임상 실험에서 좋은 결과를 얻은 바가 있다(Oka et al., 2004).

하나의 연구 그룹은 성장 인자, GM-CSF, 주사를 위한 루카인(Leukine, 등록 상표) 액체의 면역 체계의 동시 자극에 의한 백신의 효능을 조사하였다. GM-CSF는 펩티드 백신 임상 실험에서 임상적인 그리고 T-세포 반응을 증가시키는 것으로 알려져 널리 사용되는 아쥬반트이다. 초기에, GM-CSF는 수지상 세포 모집, 분화의 인자로서 이는 백신 주사 부위의 수지상 세포의 숫자를 높인다고 생각된다. GM-CSF는 그 자체에 의해 항원 제시 세포를 직접 활성화시키지는 않지만, 수지상 세포와 대식 세포의 간접적인 생체 내 활성이 보고된 바 있다(Molenkamp et al., 2005).

또 다른 연구 그룹은 피내 이미퀴모드 사용에 의한 수지상 세포의 동시 활성화 중 백신의 효능을 조사하였다. 이미퀴모드는 5%의 연고(알다라(Aldara))로서 투여하였다. TLR7 양성 세포(예를 들어, 플라스마시토이드 DC, 랑게르한스 세포, 피부의 DC)의 효과를 통해 이는 강한 면역 자극을 일으키고, MyD88-의존 경로를 활성화시킨다. 활성화된 APC는 T-세포 자극성 및 염증성 사이토카인을 배출하고, 동시에 자극을 상향 조절하며 배출되는 림프절로 이동한다. 이미퀴모드를 연고 내의 항원과 섞거나 알다라를 피하 또는 피내 주사 부위에 바르는 것에 의한 펩티드-유도 CTL 반응의 향상은 동물 모델에서 증명된 바가 있다.

다른 연구 그룹은 백신을 프로타민-안정화 mRNA 암호화 뮤신-1과 혼합함으로써 TLF 7/8을 활성화시켜 수지상 세포를 동시 활성화 시키는 백신의 효능을 조사하였다. mRNA는 광범위한 생쥐와 인간 면역 세포 인구의 활성화를 보인다. 다염기성 단백질 프로타민이 제형에 존재함으로써 mRNA의 반감기가 증가하고 이는 잠재적으로 데포-형성 입자의 형성을 유도한다. 따라서, 이 아쥬반트는 데포-형성과 APC-활성화 성질을 결합시킬 수 있다.

요약한다면, 백신의 투여 형태는 다음을 포함하였다:

-몬타니드를 이용하여 유화된 펩티드 백신의 피하 투여;

-성장 인자의 동시 투여에 의해 더 강한 면역 반응을 일으키기 위해 500㎕의 몬타니드를 이용하여 유화된 펩티드 백신의 피하 투여와 225㎕의 GM-CSF의 국소 투여의 조합;

-500㎕의 몬타니드를 이용하여 유화된 펩티드 백신과 열로 인하여 더 강한 면역 반응을 유도하기 위한 국소 발열 요법을 사용한 피하 투여;

-500㎕의 몬타니드를 이용하여 유화된 펩티드 백신의 피하 투여와 TLR7을 통한 수지상 세포의 활성화를 위한 피내 이미퀴모드의 조합;

-TLR 7/8을 통한 수지상 세포의 활성화를 위한 500㎕의 몬타니드를 이용하여 유화된 펩티드 백신과 55㎕의 뮤신-1 mRNA/프로타민을 병행하여 피하 투여.

스케쥴

연구의 총 기간은 3년이었다.

전립선-특이적 펩티드 백신은 환자에게 0, 7, 14, 28, 42와 56일째에 투여하였다. 안정적 상태 또는 객관적인 종양 반응(PSA-CR 또는 PSA-PR)이 있는 환자에게는, 검출가능한 진행이 있을 때까지 백신을 한 달에 한번씩 피내 투여하였다. 지금까지의 경험에 기반하여, 펩티드 주사는 중증의 이상 반응이 없이 내성을 보였다. 백신 치료의 반응이 완전히 PSA 측정에 의한 혈청학적인 방법으로만 평가되었기 때문에, 연구 시작 시 백신의 투여가 PSA 측정 결과에 생체 외에서 영향을 미쳐 임상적 반응을 자극할 수 있는지를 알아내기 위해 실험을 진행하였다. 0, 7, 14, 28, 42, 56과 70일째, 실험실 분석, PSA 수준, 감별 혈구 계산, 유세포 분석 및 사이토카인 측정을 위해 혈액 샘플을 채취하였다. 치료가 70일 이상 지속되면 치료 실패를 빠르게 감지하기 위해, 6주마다 PSA 모니터링을 실행하였다.

PSA 증가가 계속되는 질병의 진행이 기록되면 치료를 중단하였다.

84일째 시작 시, 면역 치료는 4주 간격으로 진행이 기록될 때까지 또는 420일(15달)까지 계속되었다. (성공적일 경우) 치료의 지속에 대한 결정은 건별로 이루어졌다. 이 연구에서 예상치 못한 이상 반응은 일어나지 않았다.

실험실 시험은 응고, 전해질, LDH, β2-M, CK, 간 효소, 빌리루빈, 크레아티닌, 요산, 총 단백질, 응고, CRP, 도말 표본 포함 감별 혈구 계산, PSA 수준, 사이토카인, FACS, 엘리스팟을 포함한다.

정의된 박테리아와 균주 항원에 대한 피부 반응(투여 후 48 내지 72 시간 후, 지연형 과민 반응(DTH), T-세포 매개) 분석은 연구 시작 전 환자의 세포 면역 체계 분석으로 사용될 것이다.

이 연구에 필요한 펩티드(9개 펩티드)는 라멘시(H.G. Rammensee) 교수의 과 소속인 스테판 스테바노빅(Stefan Stevanovic) 박사에 의해 제조되었다. 이 펩티드를 HPLC에 의해 정제하고, 질량 분석법에 의해 분석하였다. 펩티드의 순도는 HPLC, 질량 분석법 및 에드만(Edman) 서열에 의해서 확인하였다. 이 방법을 사용하여, 98% 이하의 순도가 기록되었다(현재 방법에 의해서는 이 순도가 최고의 순도라고 간주되어야 한다). 합성된 펩티드는 DMSO(크리오슈어(CryoSure), 왁 케미 메디칼 게엠베하(WAK Chemie Medical GmbH); 10 mg/ml)에 용해한 다음, 암푸와(Ampuwa, 프레세니우스 카비(Fresenius Kabi))와 1:10으로 희석하여 무균 상태에서 분획하였다.

임상 반응

두 명의 환자의 지속적인 수지 직장 검사에서 국소 종양이 감지된 후, PET-CT 스캔을 했을 때 국소 재발이 드러났다. 나머지 17명의 환자에서는 질병 활동의 위치가 연구 종료 때까지 확인이 되지 않았다.

반복된 실험 평가와 감별 혈구 계산 또는 광범위한 임상 화학 실험은 연구 내에 어떠한 이상도 변화도 보여주지 않았다.

19명의 환자 중, 16명의 환자는 서바이빈 II 펩티드(서열번호 12에 따른 IFN-γ 엘리스팟, +/- ICS)에 반응하였다. 이 중 12명의 환자는 백신 접종시 항-서바이빈 T 세포 반응 유도를 보였고, 2명의 환자에서는 이전에 존재하는 항-서바이빈 T 세포를 보였으며, 2명의 환자에서는 항-서바이빈 T 세포가 충분히 존재했는지가 결정되지 않았다.

생화학적 반응

초기 증가된 PSA 후 실험실에서 감지 불가능한 가장 낮은 PSA 값을 완전한 반응으로 간주하였다. 이 측정값을 적어도 4주 후에 다시 확인하였다. PR > 80% 그리고 > 50%는 4주 후에 다시 평가해야 했다. PSA 50% 이하의 감소 또는 10% 이하의 증가는 4주 후에 다시 확인이 되면 안정적인 상태라고 반영되었다. 진행상태는 치료 시작시 10% 이상의 PSA 수준의 증가로 간주되었다.

연구를 종료했던 환자의 생화학적 반응은 환자가 다음 국소 방사선 또는 항호르몬 치료를 받을 때까지 계속되었다.

19명 환자들이 연구에 참여하기로 동의하였고, 데이터는 가장 길게는 약 3.75년까지의 추적 기간 동안에 분석하였다.

PSA 안정성 및 DT 증가

두 명의 환자의 PSA 값(10.2%)은 연구 종료시 PSA 값이 연구 시작 시의 값보다 10% 이상의 증가가 없는 것으로, 위에 언급된 생화학 반응 조건에 따라 안정된 상태를 보였다(도 6, 표 8, 9, 10). 이 두 명의 환자의 추적은 마지막 백신 투여 후 14개월에서 16개월까지 진행되었다. 데이터 중단 시, 평균 안정적 상태 기간은 24개월(28 개월과 31개월)이었고, 평균 백신 접종 수는 18회였다(14회와 20회).

이 두 명의 환자 중 한 명의 환자는 9개월 동안 50% 초과의 부분 반응을 처음 보였고, 이 후 배가 시간이 백신 투여 전 9.8개월에 비해 높은 20.5개월의 배가 시간으로 더딘 PSA 증가 추세를 보였다. pT2pN0 글리슨(Gleason) 5 종양인 경우 최초 PSA 재발은 수술 후 18개월 후에 시작이 되었다.

환자 8의 데이터 분석은 28개월 전인 백신 시작 때부터 안정적인 상태를 보였다. 이 환자는 치료를 14번째 백신 후 연구 시작 후 10개월 때 알러지 반응 때문에 중단하였다. 이 환자는 긍정적이지 않은 pT3b 글리슨 3+4 상황이었고, 근치 전립선 절제술 후 가장 낮은 PSA 값이 0.6 ng/ml 보다 낮지 않았으며 PSA 진행이 수술 후 최초 감소 후에 시간 지연 없이 발생하였다. 배가 시간은 6.6개월에서 148개월로 늦어졌다.

이 두 명의 환자는 각 펩티드 백신 부위에 피부용 이미퀴모드를 적용하였다.

PSA 안정성 없이 PSA DT 증가

환자 11의 PSA DT는 연구 중 6개월 동안 1.5 내지 10.1개월로 증가되었다. PSA가 처음 10.8ng/ml에서 17.8ng/ml로 증가함에 따라 환자는 연구를 중단하고 PET-CT 스캔에서 악성 종양이 시각화되지 않은 상태에서 항안드로젠 단독 요법을 받았다. 그는 알다라를 아쥬반트로 받았다.

환자 16은 백신 치료와 뮤신-1-mRNA/프로타민을 배가 시간이 6.1개월일 때 시작하였다. 반감기가 통계학적으로 계산된 PSA DT의 14.4개월로의 증가에 이어 2.7개월로 감소하였고, 이는 치료 시작 후 16개월 동안 계속되었다. 처음 PSA는 0.29ng/ml였고, 이는 연구 시작 후 5개월 동안 0.19ng/ml로 감소하였으며, 그 후 8개월 동안 0.4ng/ml으로 증가하였고, 치료 시작 후 19개월에 0.41ng/ml가 되어 계획서에 따라 연구가 중단되었다.

PSA 진행

환자 5는 연구 기간 동안에 추측된 백신 전 PSA 배가 시간에 따라 병이 진행되었다. 그러나, 그는 치료 중단 후 10개월 동안 (데이터 중단 시간) 반감기가 20.2개월로서 PSA 감소를 경험하였다. 그는 백신 중단 후 다른 어떠한 치료도 받고 있지 않다. 그는 몬타니드를 단 하나의 아쥬반트로 받았다.

[표 10]

PSA의 배가 기간(개월)

*연구 종료 또는 추적 종료 시 환자 5에 대한 PSA DT는 PSA 감소에 의해 이 데이터에 포함되지 않았다.

7. 발명의 HLA 유형 1 제한된 펩티드의 HLA -A*0201에 대한 결합

목적과 요약

이 분석의 목적은 HLA 유형 I 펩티드의 HLA-A*0201 대립유전자로 암호화된 MHC 분자에 대한 친화력을 평가하기 위한 것이었고, 이는 이것이 IMA941의 행동 양식에 중요한 매개 변수이기 때문이다. HLA-A*0201에 대한 친화력은 IMA941와 MET-001의 10개 모두의 HLA 유형 I 제한된 펩티드에서 중간이거나 높았고, 분리 상수(KD)는 0.14(MET-001) 내지 2.05nM(SCP-001) 범위에 있었다. 모든 숫자는 강한 결합제 HBV-001에서 0.1과 중간 결합제 MUC-001에서 4.4 사이에 있었다. 이 결과들은 IMA941 백신 후로의 HLA 유형 I 펩티드 모두의 강한 결합 친화력을 나타내고 MET-005 유래된 MET-001에서 HLA-A-A*02를 확인하였다.

시험의 원리

안정된 HLA/펩티드 복합물은 3개의 분자로 구성되어 있다: HLA 중쇄, 베타-2 미세글로불린(b2m) 그리고 펩티드 리간드. 변성된 재조합형 HLA-A*0201 대량 서열 분자 단독 활성은 "빈 HLA-A*0201 분자"의 기능적인 등량이 되도록 보존될 수 있다. B2m과 적당한 펩티드를 가지고 있는 수용성의 완충제로 희석되었을 때, 이 분자들은 완전히 펩티드에 의존하는 방식으로 빠르고 효율적으로 접힌다. 이 분자들의 가용성은 펩티드와 HLA 유형 I 분자의 상호작용의 친화력을 측정하기 위해 엘라이사(ELISA)를 기반으로 한 분석에서 사용된다(Sylvester, 2002).

정제된 재조합 HLA-A*0201 분자를 b2m와 함께 배양하고 해당 펩티드의 용량에 대한 등급을 매겼다. 새로운-접힌 HLA/펩티드 복합물의 양은 양적 엘라이사에 의해 정했다. HLA 유형 I 결합 능력을 가지고 있지 않은 전체 길이 MET-005 대신, 자연적으로 일어나는 항원 처리에서 MET-005에서 생체 내에서 생성되는 증명된 A*0-결합 산출물 MET-001을 분석에 포함시켰다. 드 노보(De novo)-접힌 HLA/펩티드 복합물의 양은 양적 엘라이사에 의해 정했다. 분리 상수(KD 값)는 검량선용 시약 HLA/펩티드 복합물의 희석물에서 기록된 표준 곡선을 사용하여 계산하였다.

결과

결과는 도 2에 나타내었다. 더 낮은 KD 값은 더 높은 HLA-A*0201에 대한 친화력을 나타낸다. IMA941 펩티드의 대부분은 HLA-A*0201에 대해 비슷하고 강한 친화력이 있으며 그 범위는 0.1(HBV-001, 강한 결합제) 내지 44.4nM(MUC-001, 중간 결합제)이다. 그 때문에, 모든 IMA941 유형 I TUMAP는 MHC 분자 A*02에 대한 중간 내지 강한 결합 친화력을 가진다.

8. 본 발명의 HLA 유형 II 제한된 펩티드의 HLA-DR에 대한 결합

목적과 개요

유형 II TUMAP는 유형 I 제한된 TUMAP에 의해 자극된 CTL의 기능을 돕는 중요한 역할을 하는 조력 T 세포를 활성화시킨다. IMA941 유형 II 펩티드의 여러 다른 HLA 유형 II 분자에 대한 결합(무차별적 결합)은 IMA941 백신 후보로 치료를 받는 대부분의 환자가, 도움을 주는 조력 T 세포 반응으로부터 혜택을 받을 수 있도록 하는 것이 중요하다. 예를 들면, 가장 월등하게 발현되는 인간 HLA 유형 II 분자인 HLA-DR은 수백 개의 알려진 대립유전자로서 고도의 다형성을 가지고 있다. HLA-DRB1 일배체형에 대한 알려진 대립유전자 빈도와 잘 확립된 결합 알고리즘에 기반을 두었을 때, IMA941의 HLA 유형 II 리간드(IMA-BIR-002 및 IMA-MET-005)는 무차별적 HLA-DR 결합 펩티드이다. 자세하게, HLA-A*02 양성 백인이 하나 이상의 적당한 HLA-DR 대립유전자를 발현할 가능성은 IMA941 유형 II TUMAP 둘 다에서 >90%이다. 나머지 인간 유형 II 대립유전자 HLADQ와 DP가 이 계산에서 빈도 데이터 또는 결합 예측 알고리즘의의 부족으로 인해서 생략되므로, 실제 혼란은 더 클 가능성이 높다. 두 IMA941 유형 II TUMAP의 계산된 혼란은 알려진 팬(pan)-DR 에피톱(파드레(PADRE), 유전자형 빈도 F 예상 = 93.1%)의 범위와 같다. 또한, 이 펩티드의 무차별적 결합은 생체 외 결합 시험에 의해 확인되었다. 또한, IMA-BIR-002에서는 생체 내 높은 면역원성이 시연될 수 있다(위 참조). 요약하자면, 이런 결과들은 MET-005와 BIR-002가 HLA-DR의 무차별적 결합 펩티드라는 것을 나타낸다.

결합 예측의 원칙

튀빙겐 대학교에서 개발된 SYFPEITHI 알고리즘을 사용해서(Rammensee et al., 1997; Rammensee et al., 1999), HLA-DR 대립유전자에 대한 IMA941 유형 II TUMAP의 결합 순위를 매겼다. 알고리즘은 유형 I과 II 에피톱을 넓은 범위의 항원 예를 들면, 인간 종양-관련 항원 TRP2(유형 I)(Sun et al., 2000)와 SSX2(유형 II)에서 식별하는데 이미 성공적으로 사용되었다(Neumann et al., 2004). 결합의 역치는 알려지고 공개된 무차별적 HLA-DR 리간드의 결합 점수의 분석에 따라 18점으로 정의되었다.

HLA-A*02 양성 백인 인구 중에서 공개된 HLA-DR 일배체형 빈도(Mori et al., 1997)와 고주파수 일배체형(Chanock et al., 2004)이 사용되었다(표 2 참조). 일배체형 빈도는 각 염색체의 뚜렷한 대립유전자의 빈도이다. 포유류 세포 중 배수의 염색체의 집합으로 인하여, 이 대립유전자의 유전자형 발생 빈도는 더 높으며 하디-바인베르그 원칙을 이용하여 계산될 수 있다(일배체형 빈도 G_f는 유전자형 발생 F(F = 2G_f - G_f ²)를 초래한다)

A*02+ 백인 인구 중 알려진 SYFPEITHI 매트릭스 및 알려진 개별 주파수가 있는 DRB1-일배체형의 빈도의 합계는 47.8%이다. 그러므로, 이런 대립유전자의 유형 II TUMAP의 예상된 결합 분포는, 나머지 데이터를 사용할 수 없는 DRB1-대립유전자의 52.2%로 예상되었다.

마지막으로, 무차별적 결합은 백인 인구의 최소한 50%에서 하나 이상이 발현되는 여러 HLA-DR 대립유전자에 대한 펩티드의 결합으로 정의된다.

생체 외 결합 분석의 원칙( 프로이뮨 리빌 ( ProImmune REVEAL , 등록상표))

IMA-BIR-002와 IMA-MET-005는 HLA-DR 광범위 항원(분할 항원 HLA-DR11 내지 -DR15 역시 포함하는 HLA-DR1에서 DR7(Mori et al., 1997))에 의해서 조립되었고 REVEAL(등록상표)MHC:펩티드 결합 분석(ProImmune, 옥스포드, 영국)을 사용하여 MHC 분자로의 혼입의 수준을 결정하기 위하여 분석하였다. 이 분석에서, 결합은 성공/실패 대조군 결합제의 결합과 그리고 각각의 HLA-DR 항원의 양성 대조군 펩티드의 결합과 비교되었다.

결과

SYFPEITHI 알고리즘에 의한 예측에 기반을 두면 IMA-BIR-002는 알려진 결합 모티프가 있는 HLA-DR 대립유전자의 7/8와 결합할 가능성이 크다(표 11). HLA-A*02 양성 백인이 하나 이상의 적당한 HLA-DRV1 대립유전자를 IMA-BIR-002를 위해 생성할 가능성은 92.6%이다. 그러므로, IMA941 유형 II 펩티드 둘 다 무차별적 HLA-DR 결합제라고 예측된다.

HLA-DRB1 대립유전자의 일배체형 빈도가 이 방법의 요인 2에 의해서 과대평가되었다면 그들의 유전자형 발생은 IMA941의 모든 유형 II TUMAP에서 >50% 일 것이다. 또한, IMA-BIR-002의 HLA-DR 1,3,4와 11에 대한 무차별적 결합의 실험적인 확인은 생체 외 결합 데이터에서 얻어졌다(도 3).

다른 HLA-DR 대립유전자를 가진 전립선암 환자의 임상 실험에서 IMA-BIR-002가 광범위한 면역원성을 증명함으로써, 이 유형 II 펩티드의 무차별성이 생체 내에서 명확하게 증명되었다.

결과적으로, IMA941에 있는 두 유형 II 펩티드의 HLA-DR 결합 특성의 인 실리코 분석과 생체 외 분석의 추가적 실험 증거, 그리고 BIR-002의 임상 실험에 의하면, TUMAP가 인간 유형 II HLA 분자의 무차별적 결합제라는 것을 나타낸다.

[표 11]

알려진 결합 모티프가 있는 IMA941 유형 II TUMAP의 HLA-DR 대립유전자에 대한 결합 점수. 나타낸 것은 백인 인구의 가장 흔한 HLA-DRB1 대립유전자의 SYFPEITHI 결합 점수이다. P는 HLA-A*02 양성 백인의 일배체형 빈도를 나타낸다. 점수가 18과 같거나 높을 때 펩티드는 HLA 분자에 결합한다고 간주된다. 결합 DRB1 대립유전자에 대한 P 숫자의 축적은 최저 일배체형 빈도 p_min의 결과를 낳는다. 불완전한 결합 예측 매트릭스 또는 빈도 데이터를 포함한 모든 DRB1 대립유전자에 대한 이런 빈도의 추정치는 유전자형 발생의 빈도(F_projected. n.d. = 데이터 없음)에 해당하는 예상 일배체형 빈도(p_projected)를 보여준다.

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SEQUENCE LISTING <110> Immatics biotechnologies GmbH <120> Composition of tumor-associated peptides and related anti-cancer vaccine for the treatment of Gastric Cancer and other cancers <130> I31891PCT <140> PCT/EP2011/053996 <141> 2011-03-16 <150> US61/315,715 <151> 2010-03-19 <150> GB1004575.5 <151> 2010-03-19 <160> 24 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Leu Tyr Gln Ile Leu Gln Gly Ile Val Phe 1 5 10 <210> 2 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Ser Tyr Asn Pro Leu Trp Leu Arg Ile 1 5 <210> 3 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Asn Tyr Leu Pro Phe Ile Met Glu Leu 1 5 <210> 4 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Ser Tyr Ile Asp Val Leu Pro Glu Phe 1 5 <210> 5 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Ser Tyr Ile Ile Asp Pro Leu Asn Leu 1 5 <210> 6 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Tyr Tyr Asn Ala Ala Gly Phe Asn Lys Leu 1 5 10 <210> 7 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 Asn Tyr Leu Leu Tyr Val Ser Asn Phe 1 5 <210> 8 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Ala Tyr Leu Val Tyr Thr Asp Arg Leu 1 5 <210> 9 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9 His Tyr Lys Pro Thr Pro Leu Tyr Phe 1 5 <210> 10 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10 Val Trp Ser Asp Val Thr Pro Leu Thr Phe 1 5 10 <210> 11 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 11 Thr Leu Gly Glu Phe Leu Lys Leu Asp Arg Glu Arg Ala Lys Asn 1 5 10 15 <210> 12 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 12 Asp Asp Pro Ser Thr Ile Glu Lys Leu Ala Lys Asn Lys Gln Lys Pro 1 5 10 15 <210> 13 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 13 Asn Lys Gln Lys Pro Ile Thr Pro Glu Thr Ala Glu Lys Leu Ala Arg 1 5 10 15 Asp <210> 14 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 14 Asn Gly Ala Tyr Lys Ala Ile Pro Val Ala Gln Asp Leu Asn Ala Pro 1 5 10 15 Ser <210> 15 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 15 Thr Leu Gly Glu Phe Leu Lys Leu Asp Arg Glu Arg Ala Lys Asp 1 5 10 15 <210> 16 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 16 Phe Thr Glu Leu Thr Leu Gly Glu Phe 1 5 <210> 17 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 17 Leu Met Leu Gly Glu Phe Leu Lys Leu 1 5 <210> 18 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 18 Glu Pro Asp Leu Ala Gln Cys Phe Tyr 1 5 <210> 19 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 19 Val Tyr Gly Ile Arg Leu Glu His Phe 1 5 <210> 20 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 20 Phe Tyr Ile Ser Pro Val Asn Lys Leu 1 5 <210> 21 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 21 Thr Tyr Gly Asn Leu Leu Asp Tyr Leu 1 5 <210> 22 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 22 Arg Phe Leu Ser Gly Ile Ile Asn Phe 1 5 <210> 23 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 23 Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val 1 5 10 <210> 24 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 24 Val Tyr Ile Glu Lys Asn Asp Lys Leu 1 5

Claims

서열번호 1의 아미노산 서열로 구성된 펩티드 및 서열번호 2의 아미노산 서열로 구성된 펩티드를 포함하는 2개 이상의 펩티드 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는, 암을 치료 또는 예방하기 위한 약학적 조성물.
제 1 항에 있어서,
하나 이상의 펩티드가 비 펩티드 결합을 포함하는, 약학적 조성물.
제 1 항에 있어서,
조성물에 존재하는 펩티드의 선택, 수 및/또는 양이 조직, 암 및/또는 환자에 특이적인, 약학적 조성물.
제 1 항에 있어서,
하나 이상의 아쥬반트를 추가로 포함하는 약학적 조성물.
제 4 항에 있어서,
아쥬반트가 집락 자극 인자인, 약학적 조성물.
제 5 항에 있어서,
집락 자극 인자가 과립구 대식세포 집락 자극 인자(GM-CSF), 이미퀴모드 및 레시미퀴모드로 구성된 군으로부터 선택되는, 약학적 조성물.
제 1 항에 있어서,
하나 이상의 항원 제시 세포를 추가로 포함하는 약학적 조성물.
제 7 항에 있어서,
항원 제시 세포가 수지상 세포인, 약학적 조성물.
제 7 항에 있어서,
하나 이상의 항원 제시 세포가
(a) 펄스되거나 펩티드로 적재되거나,
(b) 상기 펩티드를 암호화하는 하나의 발현 구조체를 포함하는,
약학적 조성물.
제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서,
정맥내, 동맥내, 복막내, 근육내, 피부내(intradermal), 종양내, 경구, 피부(dermal), 비강, 구강, 직장, 음부, 흡입 또는 국소 투여를 위한, 약학적 조성물.
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