EA022743B1

EA022743B1 - Композиция опухолеассоциированных пептидов и относящаяся к ним противораковая вакцина для лечения рака желудка и других видов рака

Info

Publication number: EA022743B1
Application number: EA201201305A
Authority: EA
Inventors: Йенс Фриче; Тони Вайншенк; Штеффен Вальтер; Петер Левандровский; Харприт Сингх
Original assignee: Имматикс Байотекнолоджиз Гмбх
Priority date: 2010-03-19
Filing date: 2011-03-16
Publication date: 2016-02-29
Also published as: KR101620132B1; SG183938A1; AU2011229177A1; JP5689140B2; WO2011113872A1; AU2011229177B2; ES2593409T3; JP2013522276A; GB201004575D0; PL2547691T3; MX2012010814A; US10159725B2; CA2793389A1; TWI533882B; EP2547691B1; NZ601818A; UA109891C2; EA201201305A1; US20110229524A1; US20130115188A1

Abstract

Изобретение относится к иммунотерапевтическим пептидам и их применению в иммунотерапии, в частности иммунотерапии рака. Настоящее изобретение раскрывает опухолеассоциированные пептидные эпитопы Т-хелперных клеток в отдельности или в комбинации с другими опухолеассоциированными пептидами, которые служат как активные фармацевтические ингредиенты для композиций вакцины, которая стимулирует противоопухолевые иммунные ответы. В частности, композиция пептидов настоящего изобретения может применяться в вакцинных композициях для инициации противоопухолевых иммунных ответов против рака желудка (РЖ).

Description

Изобретение относится к иммунотерапевтическим пептидам и их применению в иммунотерапии, в частности иммунотерапии рака. Настоящее изобретение раскрывает опухолеассоциированные пептидные эпитопы Т-хелперных клеток, в отдельности или в комбинации с другими опухолеассоциированными пептидами, которые служат как активные фармацевтические ингредиенты композиций вакцины, которая стимулирует противоопухолевые иммунные ответы. В частности, композиция пептидов настоящего изобретения может быть использована в вакцинных композициях для инициации противоопухолевых иммунных ответов против рака желудка и других видов рака (РЖ).

В соответствии с целями настоящего изобретения все цитаты описания включены во всей полноте путем ссылки.

Уровень техники

Рак желудка является заболеванием, при котором злокачественные клетки формируются в слизистой оболочке желудка. Рак желудка может развиваться в любой части желудка и может распространяться по всему желудку и проникать в другие органы; в частности пищевод, легкие и печень. Рак желудка занимает четвертое место по частоте распространения в мире, в 2002 г. этот диагноз был поставлен в 930000 случаев. Это заболевание связано с высокой смертностью (~800 000 случаев в год), из-за чего оно является второй по частоте причиной летального исхода от рака после рака легких. Оно более распространено среди мужчин и возникает чаще в странах Азии и развивающихся странах. (Информацию можно получить в ВОЗ).

На него приходятся ежегодно 2% (25500 случаев) всех новых случаев заболевания раком в США, однако данное заболевание больше распространено в других странах. Это самый распространенный вид рака в Корее, на который приходятся 20,8% всех злокачественных новообразований. В Японии рак желудка остается наиболее распространенным видом рака у мужчин. В США диагноз рак желудка ежегодно ставится около 13000 мужчин и 8000 женщин, большинству из которых больше 70 лет.

Рак желудка занимает четвертое место по частоте распространения в мире после рака легких, молочной железы, рака толстой и прямой кишки. Кроме того, рак желудка продолжает быть второй по частоте причиной летального исхода от рака. По прогнозу Американского общества по борьбе с раком в 2007 г. число новых случаев заболевания предположительно составило один миллион, около 70% из которых приходится на развивающиеся страны и около 800000 летальных исходов (см. публикации Американского общества по борьбе с раком).

В отношении частоты заболеваемости по всему миру существуют колоссальные географические различия. Наиболее высокий процент распространения заболевания приходится на Азию и части Южной Америки, наиболее низкий - на Северную Америку. Наиболее высокий уровень смертности зарегистрирован в Чили, Японии, Южной Америке и в странах бывшего Советского Союза.

Зачастую диагноз рака желудка ставится на поздней стадии, так как скрининговое исследование не проводится в большинстве стран мира, за исключением Японии (и в ограниченной степени в Корее), где обнаружение зачастую происходит на ранней стадии. Таким образом, это продолжает оставаться наиболее сложной задачей для специалистов здравоохранения. Фактором риска для заболевания раком желудка является бактериальная инфекция НейсоЬас1ег ру1оп (Н. ру1оп), курение, потребление соли в больших количествах и другие факторы, связанные с питанием. Небольшое число случаев рака желудка (1-3%) связано с синдромом наследственной предрасположенности к раку желудка. Мутации гена Е-кадхерина происходят приблизительно у 25% семей с аутосомным доминантным геном предрасположенности к раку желудка диффузного вида. Этот подвид рака желудка получил название наследственный диффузный рак желудка. Целесообразным может быть проведение генетического консультирования и принятие во внимание профилактической гастрэктомии в юном возрасте для носителей усеченной зародышевой линии при бессимптомном протекании.

Стенки желудка состоят из трех слоев тканей: слизистого (глубинного) слоя, мышечного (среднего) слоя и серозного (наружного) слоя. Рак желудка развивается в клетках, выстилающих слизистую оболочку, и распространяется во время роста во внешние слои. Применяются четыре стандартных способа лечения. Лечение рака желудка может включать хирургическую операцию, химиотерапию, лучевую терапию или химиолучевую терапию. Операция является основным способом лечения рака желудка. Целью операции является проведение полной резекции с отрицательным хирургическим краем (резекция типа К0). Однако приблизительно 50% пациентов, больных местно-распространенным раком желудка, не могут быть подвергнуты резекции типа К0. Тип К1 указывает на микроскопические признаки неполной резекции (положительные края); и К2 указывает на макроскопические признаки неполной резекции, но без отдаленного распространения заболевания. Исход для пациента зависит от стадии рака во время постановки диагноза. (Руководство по клинической практике в онкологии Национальной онкологической сети США (ЯССЫ СНшса1 РгасОсе Ошйейпек ίη Опсо1оду™))

Процент выживаемости в течение 5 лет в случае радикальной резекции составляет 30-50% для пациентов на II стадии заболевания и 10-25% для пациентов на III стадии заболевания. Для этих пациентов существует высокая вероятность появления локальных и системных рецидивов. Метастазы появляются у 80-90% лиц, больных раком желудка, а показатель шестимесячной выживаемости равен 65% для тех, кому диагноз был поставлен на ранних стадиях, и менее 15% для тех, кому диагноз был поставлен на

- 1 022743 поздних стадиях.

Таким образом, до сих пор существует потребность в новом, эффективном и безопасном способе лечения рака желудка, карциномы предстательной железы, карцином полости рта, плоскоклеточной карциномы полости рта (О8СС), острой миелоидной лейкемии (АМТ) (фап и соавт., 2009), вызываемом Н. ру1ог1 МАЬТ-лимфомы (Ваиецее и соавт., 2000), карциномы толстого кишечника/колоректального рака, глиобластомы, немелкоклеточного рака легких (Ы8СЬС), карциномы шейки матки, рака молочной железы человека, рака предстательной железы, рака толстого кишечника, рака поджелудочной железы, протоковой аденокарциномы поджелудочной железы, рака яичника, гепатоклеточной карциномы, рака печени, опухолей головного мозга различных фенотипов; лейкемии, такой как острая лимфобластная лейкемия (АЬЬ); рака легких, саркомы Юинга, эндометриального рака, плоскоклеточной карциномы головы и шеи, эпителиального рака гортани, карциномы пищевода, карциномы ротовой полости, карциномы мочевого пузыря, карцином яичника, почечно-клеточной карциномы, атипической менингиомы, папиллярной карциномы щитовидной железы, опухолей головного мозга, карциномы слюнного протока, рака шейки матки, экстранодальных Τ/ΝΚ-клеточных лимфом, нехожкинской лимфомы и злокачественных солидных опухолей легких и молочной железы, а также других видов опухолей. Также существует потребность в способах лечения для улучшения самочувствия пациентов без применения химиотерапевтических средств или же других препаратов, которые могут вызывать серьезные побочные эффекты.

Колоректальная карцинома

По данным Американского общества по борьбе с раком, колоректальный рак (СКС) занимает третье место по частоте распространения в США, это заболевание поражает ежегодно более 175000 новых пациентов. В США, Японии, Франции, Германии, Италии, Испании и Великобритании оно поражает более 480000 пациентов. Это одна из наиболее частых причин смертности от рака в развитых странах. Исследователи предполагают, что возникновение колоректального рака является результатом взаимодействия между наследственными факторами и факторами окружающей среды. В большинстве случаев появляются аденоматозные полипы, становясь предшественниками колоректальных опухолей, хотя процесс их перехода в опухоль может занять множество лет. Первостепенный фактор риска для заболевания колоректальным раком - это возраст, в 90% случаев диагноз был поставлен, когда возраст превышал 50 лет. Другие факторы риска заболевания колоректальным раком по данным Американского общества по борьбе с раком включают употребление алкоголя, питание с высоким содержанием жиров и/или красного мяса и неадекватное потребление фруктов и овощей. Число новых случаев продолжает расти в особенности на территории таких стран, как Япония, где виновником может быть внедрение западных образцов питания с избыточным потреблением жира и мяса и снижение потребления волокнистой пищи. Несмотря на это частота заболеваемости растет не так быстро, как раньше, что может быть связано с увеличением количества скрининговых обследований и удалением полипов, предотвращая, таким образом, прогрессирование заболевания и переход полипов в рак.

Как и при большинстве солидных опухолей, лечение первого ряда - операция, однако только пациенты на ранней стадии могут получить от этого пользу, значительной же доле пациентов диагноз ставится лишь на поздних стадиях заболевания. В химиотерапии колоректального рака на поздних стадиях стандартом лечения являются лечебные схемы, основанные на фторурациле. Большинство данных лечебных схем представляют собой т.н. курсы лечения РОЬРОХ (вливание 5-Ри/лейковорин плюс оксалиплатин) и РОЬР1К1 (иринотекан, лейковорин, болюсное и продолжительное вливание 5-РИ).

Внедрение цитотоксических препаратов третьего поколения, таких как иринотекан и оксалиплатин, увеличило надежду на значительное улучшение эффективности, однако прогнозы до сих пор относительно неблагоприятные. Срок выживаемости при метастатической болезни, как правило, составляет приблизительно 20 месяцев и, в результате этого, остается высокой неудовлетворенность потребностей медицины при данном заболевании.

Недавно стало доступным новое поколение медикаментов, действующих на молекулярные мишени, таких как Авастин (АуачОп) (бевацизумаб) и Эрбитукс (ЕгЪйих) (цетуксимаб), а около 40 соединений находятся на последней стадии клинических исследований по лечению различных стадий колоректального рака. Комбинации из нескольких таких соединений повышают число потенциальных вариантов лечения, ожидаемых в будущем. Подавляющее большинство веществ находятся на 2-ой фазе исследований, при этом данные соединения более часто, чем другие разрабатываемые медикаменты против колоректального рака, адресованы против ЕСРК (рецептор эпидермального фактора роста), что связано с тем фактом, что у ~80% пациентов с колоректальным раком наблюдается повышенная экспрессия ЕСРК.

На данный момент проводятся клинические исследования с пациентами II стадии с комбинацией химиотерапии с одобренными недавно моноклональными антителами (тАЪ) (цетуксимаб + иринотекан или РОЬРОХ4; бевацизумаб в качестве монотерапии или вместе с РОЬРОХ4). Для получения статистически достоверных результатов по данным исследованиям необходимы трех-, четырехгодичные периоды наблюдения.

Моноклональные антитела (тАЪ), используемые в настоящее время в онкологии, в целом имеют превосходные шансы на то, что они не будут создавать помех активной иммунотерапии. Действительно, имеются доклинические данные, предполагающие, что элиминация фактора роста эндотелия сосудов

- 2 022743

УБОР (в случае бевацизумаба) вносит положительный вклад в опосредованную ДК (дендритными клетками) активацию Т -клеток.

Карцинома предстательной железы и другие виды опухолей

Число смертей от рака предстательной железы в 2007 году составил 27050, что делает его наиболее частой причиной смерти от рака у мужчин. Несмотря на то, что процент смертности среди белого и афроамериканского населения снижается с начала 1990-х годов, до сих пор число афроамериканских мужчин более чем в два раза превышает число белых мужчин. Рак предстательной железы является наиболее часто диагностируемым видом рака у мужчин. По неизвестным причинам частота заболеваемости значительно выше среди афроамериканцев, чем среди белых мужчин. Частота заболеваемости раком предстательной железы постоянно менялась на протяжении последних 20 лет: быстрый рост с 1988 г. по 1992 г., резкое снижение с 1992 г. по 1995 г. и умеренный рост с 1995 года. Данные тенденции отражают, главным образом, увеличение числа скрининговых обследований на рак предстательной железы с помощью анализа крови на простата-специфический антиген (ΡδΑ). Умеренный рост частоты заболеваемости за последнее десятилетие связан, скорее всего, с распространенным скринингом ΡδΆ среди мужчин моложе 65 лет. Частота заболеваемости раком предстательной железы стабилизируется у мужчин 65 лет и старше. Число случаев достигло своего пика для белых мужчин в 1992 году (237,6 случаев на 100000 человек) и для афроамериканцев - в 1993 году (342,8 случаев на 100 000 человек).

Лечение рака предстательной железы может включать внимательное наблюдение, операцию, лучевую терапию, высокоинтенсивный фокусированный ультразвук (ШРИ), химиотерапию, криохирургию, гормональное лечение или какую-либо комбинацию указанных выше методов. Какая из возможностей является наилучшей, зависит от стадии заболевания, оценки по шкале Глисона и уровня ΡδΑ. Другие важные факторы включают возраст мужчины, общее состояние его здоровья и его отношение к возможным способам лечения и побочным эффектам от них. Так как все способы лечения могут иметь побочные эффекты, такие как эректильная дисфункция и недержание мочи, то в центре внимания при дискуссиях о способе лечения часто стоит возможность нахождения баланса между целью лечения и рисками, связанными с изменением стиля жизни.

Если рак распространился за пределы предстательной железы, то возможности для лечения значительно изменяются, так что большинство врачей, лечащих рак предстательной железы, используют множество томограмм для предсказания вероятности распространения. Лечение с использованием внимательного наблюдения, высокоинтенсивного фокусированного ультразвука (ШРИ), лучевой терапии, криохирургии и операции предлагаются обычно мужчинам, заболевание которых остается в пределах предстательной железы. Гормональная терапия и химиотерапия часто предусматриваются для лечения заболевания, которое распространилось за пределы предстательной железы. Однако возможны исключения: лучевая терапия может использоваться для некоторых опухолей на поздних стадиях, а гормональная терапия - для опухолей на ранней стадии. Криотерапия, гормональная терапия и химиотерапия могут быть также предложены, если первоначальное лечение было неудачным, и рак прогрессирует.

У значительного числа пациентов, страдающих раком предстательной железы, которые подвергаются простатэктомии из-за клинического подозрения на рост внутри органа, окончательное гистологическое обследование операционного материала показывает локально экстенсивное распространение опухоли за пределы органа. Для таких пациентов существует высокий риск быстрого локального рецидива, обнаруживаемого обычно как повышение уровня ΡδΑ с точки зрения биохимического рецидива заболевания. Терапевтические возможности в данной ситуации включают наружную лучевую терапию и гормон-депривационную терапию; однако значимость данных терапевтических подходов, в особенности в отношении продления жизни пациента в долгосрочной перспективе, не подтверждена. Кроме того, необходимо учитывать возможность связанных с лечением осложнений, таких как появление стриктуры уретры (лучевая терапия), потеря полового влечения и импотенция, риск снижения содержания солей кальция в костях в связи с остеопорозом и существенно возросший риск патологической хрупкости костей (гормон-депривационная терапия).

Более 90% всех случаев заболевания раком предстательной железы обнаруживаются на локальной и региональной стадиях; 5-летняя относительная выживаемость для пациентов, опухоли которых были диагностированы на этих стадиях, достигает 100%. В течение последних 25 лет 5-летняя выживаемость для всех стадий в целом увеличилась с 69% до примерно 90%. В соответствии с последними данными относительная 10-летняя выживаемость составляет 93%, а 15-летняя - 77%. Разительное увеличение выживаемости, в особенности 5-летней, отчасти связано с ранней постановкой диагноза и совершенствованием методов лечения. Несмотря на это, сроки выживаемости значительно сокращаются после распространения на другие ткани и органы.

Рак легких

В 2007 году ожидаются приблизительно 210000 новых случаев в США, что составляет около 15% диагнозов всех видов рака. Частота заболеваемости значительно снижается среди мужчин, с 102 случаев на 100000 человек в 1984 году до 78,5 в 2003 году. Среди женщин частота заболеваемости стабилизировалась после долгого периода роста. В целях лечения рак легких классифицируется клинически на мелкоклеточный (13%) и немелкоклеточный (87%).

- 3 022743

Рак легких является наиболее частой причиной смертности от рака как среди мужчин, так и среди женщин. Около 160390 смертей, составляющих приблизительно 29% всех летальных исходов от рака, ожидаются в 2007 году. Начиная с 1987 года, от рака легких ежегодно умирало больше женщин, чем от рака молочной железы. Число смертей среди мужчин значительно снижалось в период с 1991 по 2003 г., примерно на 1,9% ежегодно. Смертность от рака легких среди женщин сохраняется на неизменном уровне после продолжительного роста на протяжении нескольких десятилетий. Данные тенденции по смертности от рака легких отражают снижение числа курящих на протяжении последних 30 лет.

Вид лечения определяется типом (мелкоклеточный или немелкоклеточный) и стадией ракового заболевания и включают хирургическое вмешательство, лучевую терапию, химиотерапию, а также нацеленные биологические терапии, такие как бевацизумаб (ΛναδΙίη®) и эрлотиниб (Тагсеуа®). Для локализованного вида рака в качестве терапии обычно выбирается операция. Последние исследования указывают на то, что выживаемость с немелкоклеточным раком легких ранней стадии улучшается, если за операцией следует химиотерапия. Так как на момент своего обнаружения заболевание обычно уже распространено, часто используются лучевая терапия и химиотерапия, иногда в сочетании с операцией. Химиотерапия в отдельности или в сочетании с лучевой терапией является стандартным лечением, выбираемым для мелкоклеточного рака легких; при данной схеме лечения большой процент пациентов испытывает ремиссию, которая в некоторых случаях бывает продолжительной.

Одногодичная относительная выживаемость для пациентов, больных раком легких, слегка возросла с 37% в 1975-1979 г. до 42% в 2002 году, во многом благодаря усовершенствованиям в хирургической технике и комбинированным способам лечения. Однако 5-летний срок выживаемости для всех стадий в целом составил лишь 16%. Процент выживаемости для всех случаев, обнаруживаемых, когда заболевание все еще локализовано, составляет 49%; однако только 16% всех случаев рака легких диагностируются на этой ранней стадии.

Таблица 1. Предполагаемое количество случаев заболевания раком и смертей в зависимости от пола для

США в 2007 году (данные Американского общества по борьбе с раком. Факты и цифры о раке - 2007 г. АИайа: Атепсап Сапсег 5ос1е1у; 2007)

Место	Предполагаемое число новых случаев	Предполагаемое смертей	число
	Оба пола	Мужчин ы	Женщи- ны	Оба пола	Муж- чины	Женщи- ны
Глиома и головной мозг	20 500	11 170	9 330	12 740	7 150	5 590
Молочная железа	180510	2 030	178 480	40 910	450	40 460
Предстательная железа	218 890	218 890		27 050	27 050
Пищевод	15 560	12 130	3 430	13 940	10 900	3 040
Толстый кишечник	112 340	55 290	57 050	52 180	26 000	26 180
Почки	51 190	31 590	19 600	12 890	8 080	4810
Поджелудочная	37 170	18 830	18 340	33 370	16 840	16 530

железа
Плоскоклеточна я карцинома; неоплазмы кожи с участием кератиноцитов	1 000 000	не опред.	не опред.	не опред.	не опред.	не опред.
Лейкемия	44 240	24 800	19 440	21 790	12 320	9 470
Легкие	213 380	114 760	98 620	160 390	89 510	70 880
Нехожкинская лимфома	63 190	34 210	28 990	18 660	9 600	9 060
Яичник	22 430		22 430	15 280		15 280
Меланома	59 940	33 910	26 030	8 ПО	5 220	2 890

- 4 022743

Таким образом, до сих пор существует потребность в новом, эффективном и безопасном способе лечения глиобластомы, опухоли предстательной железы, рака молочной железы, рака пищевода, колоректального рака, светлоклеточной почечно-клеточной карциномы, рака легких, ЦНС, яичника, меланомы, рака поджелудочной железы, плоскоклеточной карциномы, лейкемии и медуллобластомы, а также других видов опухолей, демонстрирующих гиперэкспрессию сурвивина, который улучшал бы самочувствие пациентов без применения химиотерапевтических средств или других веществ, которые могут вызывать серьезные побочные эффекты.

Подробное описание изобретения

Все термины, используемые здесь, если не указано иное, имеют значения, данные ниже. Понятие пептид в контексте настоящего описания обозначает серии аминокислотных остатков, связанных друг с другом типично пептидными связями между альфа-аминными и карбонильными группами смежных аминокислот. Пептиды предпочтительно имеют длину в 9 аминокислот, но могут быть короче - 8 аминокислот в длину, и длиннее - 11 или 13, 14,15,16, 17 или 18 аминокислот в длину.

Понятие олигопептид в контексте настоящего описания обозначает серии аминокислотных остатков, связанных один с другим типично пептидными связями между альфа-аминными и карбонильными группами смежных аминокислот. Длина олигопептида не особенно важна для изобретения до тех пор, пока в нем сохраняются надлежащие эпитоп или эпитопы. Олигопептиды, как правило, состоят из менее чем примерно 30 аминокислотных остатков в длину и более чем примерно 14 аминокислот в длину.

Понятие полипептид обозначает серии аминокислотных остатков, связанных один с другим типично пептидными связями между альфа-аминными и карбонильными группами смежных аминокислот. Длина полипептида не особенно важна для изобретения до тех пор, пока сохраняются надлежащие эпитопы. В отличие от понятий пептид или олигопептид, понятие полипептид введено для обозначения молекул, содержащих более чем приблизительно 30 аминокислотных остатков.

Пептид, олигопептид, белок или полинуклеотид, кодирующий для такой молекулы, является иммуногенным (и, таким образом, иммуногеном в рамках настоящего изобретения), если он способен индуцировать иммунный ответ. В контексте настоящего изобретения, иммуногенность получает более специфическое определение как способность индуцировать Т-клеточный ответ. Таким образом, иммуноген будет представлять собой молекулу, которая способна индуцировать иммунный ответ, и, в случае настоящего изобретения, молекулу, способную индуцировать Т-клеточный ответ.

Для Т-клеточного эпитопа необходим короткий пептид, который связан с рецептором МНС I или II класса, образующий трехчленный комплекс (альфа-цепь МНС класса I, бета-2-микроглобулин и пептид), который может быть распознан Т-клеткой, несущей подходящий Т-клеточный рецептор, связывающийся с комплексом МНС/пептид с подходящей аффинностью. Пептиды, связывающиеся с молекулами МНС I класса, как правило, имеют длину в 8-14 аминокислот и, в особенности, как правило, длину в 9 аминокислот. Т-клеточные эпитопы, которые связываются с молекулами МНС II класса, как правило, имеют длину в 12-30 аминокислот. В случае пептидов, которые связываются с молекулами МНС II класса, один и тот же пептид и соответствующий Т-клеточный эпитоп могут иметь общий центральный сегмент, но различаться по общей длине из-за примыкающих последовательностей с различными длинами, расположенными перед аминным концом центральной последовательности и после ее карбоксильного конца, соответственно. Рецепторы МНС II класса имеют более открытую структуру, пептиды, связанные с рецепторами МНС II класса, соответствующим образом, не полностью углублены в структуру пептидсвязывающей бороздки молекулы МНС II класса, как это имеет место с пептидсвязывающей бороздкой молекулы МНС I класса. Как ни удивительно, это не применимо к пептиду в соответствии с 8ЕЦ ГО N0 1, так как небольшие изменения в длине пептида ведут к экстремальному снижению активности (см. ниже).

У человека имеется три различных генетических локуса, которые кодируют молекулы МНС I класса (молекулы МНС человека называются также человеческими лейкоцитарными антигенами (НЬЛ)): НЬЛ-Л, НЬА-В и НЬЛ-С, НЬЛ-Л*01, НЬЛ-Л*02 и НЬЛ-Л*11 являются примерами различных аллелей МНС I класса, которые могут экспрессироваться из этих локусов.

Человеческий геном имеет 3 различных локуса для генов МНС II класса: НЬЛ-ΌΚ, НЬЛ-Όρ и НЬЛΌΡ. Рецепторы МНС II класса являются гетеродимерами, состоящими из альфа- и бета-цепи, обе из которых фиксируются на клеточной мембране с помощью трансмембранного региона. НЬЛГОКВ1*04 и НЬЛ-ΌΡΒ1 *07 - это два примера различных бета-аллелей МНС II класса, о которых известно, что они кодируются в данных локусах. Аллели II класса очень полиморфны, к примеру, было описано несколько сотен различных аллелей НЬЛ-ΌΚΒΤ Для НЬЛ-Л*02 и наиболее частых серологических видов НЬЛ-ΌΚ частоты экспрессии в различных популяциях представлены в табл. 2.

- 5 022743

Таблица 2. Частота экспрессии (Р) НЬА*А02 и наиболее частые серотипы НЬА-ЭК. Частоты экспрессии выведены из частот гаплотипа Ог среди американцев, приводимых в работе Моб и соавт. (Моб и соавт., 1997), с использованием формулы Харди-Вейнберга Р=1-(1-О_г)² Комбинации А*02 с определенными аллелями НЬА-ΌΚ могут быть обогащенными или менее частыми, чем ожидается от их одиночных частот в связи с неравномерным распределением связей. Более подробная информация представлена в работе СЬапоск и соавт. (СЬапоск и соавт., 2004).

Частоты экспрессии НЬА*02 и серотипов НЬА-ΌΚ в подгруппах североамериканского населения

Аллель НЬА

Американцы европеоидной расы

Афро- американцы

Монголоиды

Латиноамерика и цы

А*02	49,1%	34,1%	43,2%	48,3%
ЭК1	19,4%	13,2%	6,8%	15,3%
υκ2	28,2%	29,8%	33,8%	21,2%
экз	20,6%	24,8%	9,2%	15,2%
ЭК4	30,7%	11,1%	28,6%	36,8%
ОК5	23,3%	31,1%	30,0%	20,0%
ΩΚ6	26,7%	33,7%	25,1%	31,1%
ЭК7	24,8%	19,2%	13,4%	20,2%
ЭК8	5,7%	12,1%	12,7%	18,6%
ОИ9	2,1%	5,8%	18,6%	2,1%

В табл. 3: показаны частоты экспрессии Р НЬА*А024 и серотипа НЬА*А02402. Частоты экспрессии выведены из частот гаплотипа О_г в популяции, опираясь на работу Моб и соавт. (Моб и соавт., 1997), с использованием формулы Харди-Вейнберга Р=1-(1-ОГ)² Более подробная информация представлена в работе СЬаиоек и соавт. (СЬаиоек и соавт., 2004).

Таблица 3. Частоты экспрессии НЬА*02 и серотипов А*2402 по всему миру

Аллель	Популяции	Подсчитанный фенотип из частоты аллеля
А*24	Филиппинцы	65%
А*24	Русские ненцы	61%
А*2402	Японцы	59%
А*24	Малазийцы	58%
А*2402	Филиппинцы	54%
А*24	Индийцы	47%
А*24	Южные Корейцы	40%
А*24	Жители Шри-Ланки	37%
А*24	Китайцы	32%
А*2402	Индийцы	29%
А*24	Западные Австралийцы	22%
А*24	США	22%
А*24	Россияне, Самара	20%
А*24	Южные Американцы	20%
А*24	Европейцы	18%

Поэтому для терапевтических и диагностических целей крайне желателен пептид, который связывается с подходящей аффинностью с несколькими различными рецепторами НЬА II класса. Пептид, связывающийся с несколькими различными молекулами НЬА II класса, называется беспорядочно связывающимся пептидом.

Используемая в контексте данного описания ссылка на последовательность ДНК включает как однонитевую, так и двунитевую ДНК. Таким образом, специфическая последовательность, если в контексте не указано иное, относится к однонитевой ДНК такой последовательности, дуплексу такой последовательности с его комплементом (двунитевая ДНК) и комплементу такой последовательности. Понятие кодирующая область относится к тому участку гена, который в естественных или обычных условиях кодирует продукт экспрессии того гена в его естественном геномном окружении, т.е., участку, кодирующему ίη у1уо нативный продукта экспрессии гена.

Кодирующая область может быть из нормального, мутировавшего или измененного гена или может даже быть из последовательности ДНК или же гена, целиком синтезированного в лаборатории с использованием методов, хорошо известных специалистам из области синтеза ДНК.

- 6 022743

Понятие нуклеотидная последовательность относится к гетерополимеру дезоксирибонуклеотидов.

Нуклеотидная последовательность, кодирующая конкретный пептид, олигопептид или полипептид, может быть встречающейся в природе или может быть синтезирована. В целом, сегменты ДНК, кодирующие пептиды, полипептиды и белки данного изобретения, собраны из фрагментов кДНК и коротких олигонуклеотидных линкеров или же из серий олигонуклеотидов для получения синтетического гена, который способен экспрессироваться в рекомбинантной транскрипционной единице, включающей регуляторные элементы, образованные из микробного или вирусного оперона.

Понятие продукт экспрессии означает полипептид или белок, являющийся естественным продуктом трансляции гена и любой последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей эквиваленты, образующиеся в результате вырожденности генетического кода и, таким образом, кодирующей ту/те же самую(ые) нуклеиновую(ую) кислоту(ы).

Понятие фрагмент, если относится к кодирующей последовательности, означает участок ДНК, включающий меньше, чем полную кодирующую область, продукт экспрессии которого, по существу, сохраняет ту же самую биологическую функцию или активность, что и продукт экспрессии целой кодирующей области.

Понятие сегмент ДНК относится к полимеру ДНК в виде отдельного фрагмента или в качестве компонента более крупной конструкции ДНК, которая была образована из ДНК, выделенной по меньшей мере один раз, по существу, в чистой форме, т.е. без контаминирующих эндогенных материалов и в количестве или с концентрацией, позволяющей идентификацию, манипуляцию и восстановление сегмента и его составных нуклеотидных последовательностей стандартными биохимическими методами, например, с использованием вектора для клонирования. Такие сегменты предлагаются в форме открытой рамки считывания, не прерываемой внутренними нетранслированными последовательностями или нитронами, которые обычно присутствуют в эукариотических генах. Последовательности нетранслированной ДНК могут присутствовать по ходу транскрипции из открытой рамки считывания, где она не интерферирует с манипуляцией или экспрессией кодирующих областей.

Понятие праймер означает короткую последовательность нуклеиновой кислоты, которая может быть спарена с одной нитью ДНК с получением свободного конца 3'ОН, на котором ДНК-полимераза начинает синтезировать дезоксирибонуклеотидную цепь.

Понятие промотор означает участок ДНК, задействованный в связывании РНК-полимеразы для инициации транскрипции.

Понятие выделенный означает, что материал удален из его исходного окружения (к примеру, естественного окружения, если он встречается в природе). Например, встречающийся в природе полинуклеотид или полипептид, представленный в живых организмах, не является выделенным, но тот же самый полинуклеотид или полипептид, отделенный от некоторых или всех сосуществующих материалов природной системы, является выделенным. Такие полинуклеотиды могли быть частью вектора и/или такие полинуклеотиды или полипептиды могли быть частью композиции и все-таки могли быть выделены, так что такой вектор или композиция не является частью своего естественного окружения.

Полинуклеотиды и рекомбинантные или иммуногенные полипептиды, раскрытые в соответствии с настоящим изобретением могут также быть в очищенной форме. Понятие очищенный не требует абсолютной чистоты; скорее он предназначен для дачи относительного определения и может включать препараты с высокой очисткой или препараты только с частичной очисткой, в соответствии с тем, как эти термины понимаются специалистами соответствующей области. Например, отдельные клоны, выделенные из библиотеки кДНК, как обычно очищались до электрофоретической чистоты. Очистка исходного материала или природного материала от примесей по меньшей мере на один порядок величины, предпочтительно два или три порядка, и, более предпочтительно, четыре или пять порядков величины определенно рассматривается в изобретении. Более того, определенно рассматривается заявленный полипептид, чистота которого составляет предпочтительно 99,999% или по меньшей мере 99,99% или 99,9%; и даже желательно 99% по массе или более.

Нуклеиновые кислоты и продукты экспрессии полипептида, раскрываемые в соответствии с настоящим изобретением, в равной степени как и векторы экспрессии, содержащие такие нуклеиновые кислоты и/или такие полипептиды, могут быть в обогащенной форме. В контексте настоящего описания понятие обогащенный означает, что концентрация материала по меньшей мере приблизительно в 2, 5, 10, 100 или 1000 раз выше его естественной концентрации (например), преимущественно 0,01 мас.%, предпочтительно по меньшей мере около 0,1 мас.%. Рассматриваются также обогащенные препараты с концентрацией примерно 0,5, 1, 5, 10 и 20 мас.%. Последовательности, конструкции, векторы, клоны и другие материалы, включенные в настоящее изобретение, могут быть предпочтительно в обогащенной форме или выделенными.

Понятие активный фрагмент означает фрагмент, который дает иммунный ответ (т.е. обладает иммуногенной активностью), если он введен отдельно или факультативно с подходящим адъювантом животному, такому как млекопитающее, например кролику или мыши, также включая человека; таковой иммунный ответ, принимающий форму стимуляции ответа Т-клетки, у животного-реципиента, такого как человек. Альтернативно активный фрагмент может также быть использован для инициации ответа

- 7 022743

Т -клетки ίη νίίτο.

В контексте настоящего описания понятия участок, сегмент и фрагмент, если они использованы по отношению к полипептидам, относятся к непрерывной последовательности остатков, таких как аминокислотные остатки, последовательность которых формирует подкласс более крупной последовательности. Например, если полипептид был подвергнут обработке любой из известных эндопептидаз, таких как трипсин или химотрипсин, то полученные в результате такой обработки олигопептиды будут представлять участки, сегменты или фрагменты исходного полипептида. Это означает, что любой таковой фрагмент будет обязательно содержать как часть его аминокислотной последовательности сегмент, фрагмент или участок, который по существу идентичен, если не в точности идентичен последовательности с §ЕЦ ГО N0 1 по 20, которая соответствует встречающимся в природе или материнским белкам последовательностей с 8ЕЦ ГО N0 1 по 20. При использовании по отношению к полинуклеотидам такие понятия относятся к продуктам, полученным при обработке указанных полинуклеотидов любой из известных эндонуклеаз.

В соответствии с настоящим изобретением понятие процентная доля идентичности или идентичный с процентной долей, если оно относится к последовательности, означает, что последовательность сравнивается с заявленной или описанной последовательностью после выравнивания сравниваемой последовательности (Сравниваемая последовательность) с описанной или заявленной последовательностью (Контрольная последовательность). Процентная доля идентичности определяется затем по следующей формуле:

Процентная доля идентичности ~ 100 [I -(С/К.)] где С является числом различий между Контрольной последовательностью и Сравниваемой последовательностью по длине выравнивания между Контрольной последовательностью и Сравниваемой последовательностью, где (ί) каждое основание или аминокислота в Контрольной последовательности, которые не имеют соответствующего выравненного основания или аминокислоты в Сравниваемой последовательности, и (ίί) каждая брешь в Контрольной последовательности и (ίίί) каждое выравненное основание или аминокислота в Контрольной последовательности, которые отличаются от выравненного основания или аминокислоты в Сравниваемой последовательности, представляют собой различие;

и К - это число оснований или аминокислот в Контрольной последовательности по длине выравнивания со Сравниваемой последовательностью с любой брешью, образующейся в Контрольной последовательности, считающейся также за основание или аминокислоту.

Если существует выравнивание между Сравниваемой последовательностью и Контрольной последовательностью, для которых процентная доля идентичности, по расчетам выше, приблизительного равна или выше установленной минимальной Процентной доли идентичности, тогда Сравниваемая последовательность имеет установленную минимальную процентную долю идентичности с Контрольной последовательностью, если даже могут существовать выравнивания, в которых подсчитанная здесь выше Процентная доля идентичности меньше, чем установленная Процентная доля идентичности.

Исходные пептиды, раскрываемые в данном описании, могут быть модифицированы путем замены одного или нескольких остатков в различных, возможно отобранных, участках по длине пептидной цепи, если не заявлено иное. Такие замены могут носить консервативный характер, например, где одна аминокислота заменяется аминокислотой с похожей структурой и характеристиками, так же как при замене гидрофобной аминокислоты на другую гидрофобную аминокислоту. Еще более консервативным будет замена аминокислот одинакового или похожего размера и химического характера, такое как при замене лейцина на изолейцин. В исследованиях вариаций последовательностей внутри семейств встречающихся в природе гомологичных белков определенные замены аминокислот допускаются чаще, чем другие, и они часто проявляют взаимосвязь со сходствами по размеру, заряду, полярности и гидрофобности между исходной аминокислотой и ее заменой; и таковой является основа понятия консервативных замен.

Консервативные замены определены в контексте настоящего описания как обмены внутри одной из последующих пяти групп: группа 1 - малые алифатические неполярные или слабо полярные остатки (А1а, §ет, ТНг. Рго, О1у); группа 2 - полярные отрицательно заряженные остатки и их амиды (Акр, Акп, О1и, О1п); группа 3 - полярные положительно заряженные остатки (Ηίκ, Агд, Ьук); группа 4 - крупные алифатические, неполярные остатки (Мер Ьеи, 11е, Уа1, Сук); и группа 5 - крупные ароматические остатки (РЬе, Туг, Тгр).

Менее консервативные замены могут охватывать замену одной аминокислоты другой, имеющей похожие характеристики, но отличающейся в какой-то степени по размеру, как в случае замены аланина остатком изолейцина. Высоко неконсервативные замены могут охватывать замену кислой аминокислоты другой, которая имеет полярность, или даже такой, которая имеет основный характер. Такие радикальные замены не могут, однако, быть отвергнуты как потенциально неэффективные из-за того, что химические эффекты не полностью предсказуемы, и радикальные замены могут неожиданно привести к благоприятным эффектам, не предсказуемых исходя из обычных химических принципов.

- 8 022743

Разумеется, в таких заменах могут участвовать другие структуры, отличающиеся от обычных Ьаминокислот. Таким образом, Ό-аминокислоты могут быть заменены Ь-аминокислотами, обычно встречающимися в антигенных пептидах по изобретению и также охватываемые настоящим раскрытием сущности изобретения. Кроме того, аминокислоты, содержащие нестандартные К-группы (т.е. К-группы, отличающиеся от обнаруженных в повсеместно встречающихся 20 аминокислотах природных белков) могут быть также использованы в целях замены для получения иммуногена и иммуногенных полипептидов в соответствии с настоящим изобретением.

Если были произведены замены на более чем одной позиции с получением пептида с практически эквивалентной или большей антигенной активностью, чем та, что определена ниже, то комбинации таких замен будут проанализированы для определения того, приведут ли эти комбинации замен к дополнительным или синергетическим эффектам по отношению к антигенности пептида. По большей части замены должны производиться не более чем на 4 позициях внутри пептида одновременно.

Понятие Т-клеточный ответ означает специфическую пролиферацию и активацию эффекторных функций, индуцированных пептидом ίη νίίτο или ίη νίνο. Для ЦТЛ, рестриктированных по МНС I класса, эффекторными функциями может быть лизис клеток-мишеней, нагруженных пептидом, нагруженных предшественником пептида или клеток-мишеней, естественно презентирующих пептид; секреция цитокинов, предпочтительно интерферона-гамма, ΤΝΡ-альфа или ИЛ-2, индуцированная пептидом; секреция эффекторных молекул, предпочтительно гранзимов или перфоринов, индуцированная пептидом, или дегрануляция. Для Т-хелперных клеток, рестриктированных по МНС II класса, эффекторными функциями может быть индуцированная пептидом секреция цитокинов, предпочтительно, ΙΡΝ-гамма, ΤΝΡ-альфа, ИЛ-4, ИЛ-5, ИЛ-10 или ИЛ-2, или индуцированная пептидом дегрануляция. Возможные эффекторные функции ЦТЛ и Т-хелперных клеток не ограничиваются данным списком.

Иммунотерапевтические подходы в лечении

Стимуляция иммунных ответов находится под воздействием присутствия антигенов, распознаваемых иммунной системой хозяина как чужеродные. Открытие существования опухолеассоциированных антигенов повысило сейчас возможность использования иммунной системы хозяина для вмешательства в рост опухоли. Различные механизмы объединения обеих ветвей иммунной системы, как гуморальной, так и клеточной, исследуются в настоящее время для иммунотерапии рака.

Отдельные элементы клеточных иммунных ответов способны к специфическому распознаванию и уничтожению опухолевых клеток. Выделение цитотоксических Т-клеток (ЦТЛ) из популяций опухольинфильтрирующих клеток или из периферической крови предполагает, что такие клетки играют важную роль в естественной иммунной защите против рака. В частности, СО8-положительные Т-клетки, которые распознают молекулы I класса главного комплекса гистосовместимости (МНС), связанные с пептидами, имеющими обычно 8-10 остатков, образованными из белков или дефектных рибосомных продуктов (ΟΚ!Ρδ) (§е1шЬсг1 и, Αηίόη ЬС, ΟίΡΡδ 1, №гЬигу СС, Ус\\'бс11 1У, Вепшпк 1К.;Кар1б бедгабаЕюп о! а 1агде 1гас1юп о! ικ\\ίν ууШкем/еб ртоЕетк Ьу ргоЕеакотек; №Пиге 2000; 404(6779):770-774), находящихся в цитозоли, играют важную роль в этом ответе. Молекулы МНС человека также являются человеческими лейкоцитарными антигенами (НЬА).

Существуют два класса молекул МНС: молекулы МНС I класса, которые могут встречаться на большинстве клеток, имеющих ядро, которые презентируют пептиды, образующиеся после протеолитического расщепления преимущественно эндогенных, цитозольных или ядерных белков, ΌΡΙΡδ, и более крупных пептидов. Однако пептиды, образованные из эндосомальных компартментов или экзогенных источников, также часто встречаются на молекулах МНС I класса. Этот неклассический способ презентации классом I в литературе называется кросс-презентацией. Молекулы МНС II класса могут встречаться преимущественно на профессиональных антигенпрезентирующих клетках (АПК) и презентировать пептиды экзогенных белков, которые поглощаются АПК в период эндоцитоза и впоследствии процессируются. Для I класса описаны альтернативные способы процессинга антигена, которые позволяют пептидам из эндогенных источников быть презентированными молекулами МНС II класса (например, аутофагоцитоз). Комплексы из пептида и молекулы МНС I класса распознаются СО8-положительными цитотоксическими Т-лимфоцитами с соответствующим ТКР (Т-клеточный рецептор), тогда как комплексы из пептида и молекулы МНС класса II распознаются 004-положительными хелперными Т-клетками с соответствующим ТКР.

СО4-положительные хелперные Т-клетки играют важную роль в управлении эффекторными функциями противоопухолевых Т-клеточных ответов, и поэтому идентификация СО4-положительных Тклеточных эпитопов, образованных из опухолеассоциированных антигенов (ТАА), может быть чрезвычайно важна для разработки фармацевтических препаратов для инициации противоопухолевых иммунных ответов (НфаОс, δ., Ώ. А1анаско\зс. Е. 1адет, М. МаЕкио, А. 8е1уакнтаг. Ν.Κ. АЬогкк К.О. Маку В. Энрот. О. КЕЕег, Υ.Τ. СЬещ Α. КпиЕЬ, апб Ь.Р О1б. 8нгуеу о! на1нга11у оссшттд СО4+ Т-се11 текрошек адаиМ ΝΥ-ΕδΟ-1 ίη сапсег раОепк: Соп-екИю!·! \νί11ι апОЬобу текрощек. Ргос. №и1. Асаб. 8с1 υ.δ.Α. 2003, 100 (15): 8862-7); СО4-положительные Т-клетки могут приводить к локальному повышению уровня 1ΡΝгамма.

На моделях млекопитающих животных, например мышах, было показано, что даже при отсутствии

- 9 022743 эффекторных клеток ЦТЛ (т.е. СО8-положительных Т-лимфоцитов), СО4-положительных Т-клеток достаточно для ингибирования проявления опухолей посредством ингибирования ангиогенеза при секреции интерферона -гамма (ΙΡΝγ) (Οίη. Ζ. аиб Т. ВкткспЛст. СЭ4+ Т-сс11-тсб1а1сб ΙιιιηοιίΓ гс)се1юп ίηνοίνβδ ίηΗίόίΙίοη οί аи§1одеие818 (На! ίδ берепбеШ οη ΙΡΝ датта гесерЮг ехргеввюи Ьу попЬста1оро1с11с себе. 1ттиибу. 2000, 12:677-686). К тому же было показано, что СО4-положительные Т-клетки, распознающие пептиды из опухолеассоциированных антигенов, презентированные молекулами НЬА II класса, могут препятствовать опухолевой прогрессии посредством индукции ответов антител (АЬ) (Кспис6у, КС., М.Н. 8Ьеагег, А.М. \Уа1К апб К.К. ВпдШ. 2003. СЭ4+ Т 1утрЬοсуΐеδ р1ау а сп0са1 го1е ίη а^^бу ргобисίίοη апб Битюг 1ттиш1у адаиъ! 81тгап νύυδ 40 1агде Битюг апОдеп. Сапсег Ке8. 2003, 63:1040-1045). В отличие от опухолеассоциированных пептидов, связывающихся с молекулами НЬА I класса, до сих пор было описано лишь небольшое число лигандов класса II ТАА (\γ\γ\γ.саηсе^^ттиηΠγ.ο^д. \г\г\гж\Тре111Б бе).

Так как конститутивная экспрессия молекул НЬА II класса обычно ограничена клетками иммунной системы, то возможность выделения пептидов II класса непосредственно из первичных опухолей считалась невозможной. Тем не менее, авторам изобретения недавно удалось идентифицировать ряд эпитопов МНС II класса непосредственно из опухолей (ЕР 1642905, ЕР 1760088; Оспд|е1 ί, №Мке ΜΌ, ΟοπίΚГапдеах С, ОЙ8юиб18 О, 8Πιοοτ О, АИепЬегепб Ρ, Ми11ег М, Кгатег В, Μίδδίοπ А, 8аШег Μ, ^ηικη^ΚΓ ί, \Уегпе1 Ό, 81еп/1 А, Каттепхее НО, К1шде1 К, 8ίеνаиον^с 8.; ипехрес1еб аЬиибаисе οί НЬА ск-ΐδδ II рге5еп1еб рер1|бе5 ίη рптагу гепа1 се11 са^с^иοтаδ; С1ш Сапсег Ке5. 2006; 12:4163-4170).

При отсутствии воспаления экспрессия молекул МНС II класса преимущественно ограничена клетками иммунной системы, в особенности АПК, например моноцитами, образованными из моноцитов клеткам, макрофагами, дендритными клетками. Неожиданным образом, у пациентов с опухолевыми заболеваниями было обнаружено, что клетки опухолей экспрессируют молекулы МНС II класса (Оспд|е1 ί, №ю1ке ΜΌ, ОοийеГаидеаδ С, ОЙ8юиб18 О, 8Πιοογ О, АИепЬегепб Ρ, Ми11ег М, Кгатег В, Μίδδίοπ А, 8атПег Μ, ^ηιη;η1οΙΝΓ ί, \Уегпе1 Ό, 81еп/1 А, Катающее НО, К1шде1 К, 8ίеνаиον^с 8.; ипехрес1еб аЬипбапсе οί НЬА ск-ΐδδ II р^еδеиίеб рерί^беδ ш рптагу гепа1 се11 сагсиюпт; С1ш Сапсег ^δ. 2006; 12:4163-4170).

Для того чтобы пептид инициировал (вызывал) клеточный иммунный ответ, он должен связываться с молекулой МНС. Этот процесс зависит от аллеля молекулы МНС и специфических полиморфизмов аминокислотной последовательности пептида. Пептиды, связывающиеся с МНС I класса, имеют, как правило, 8-10 аминокислотных остатков в длину и обычно содержат два консервативных остатка (якорь) в их последовательности, которые взаимодействуют с соответствующей связывающей бороздкой молекулы МНС. Таким образом, каждый аллель МНС имеет связывающий мотив, определяющий, какие пептиды могут специфически связываться со связывающей бороздкой (Каттещее НО, ВасЬтаиη ί, 8ίеνаиον^с 8. МНС Ьдат^ апб рер11бе ιηοΟΓδ, Εηι^δ В^^епсе, И8А, 1997).

В зависящей от МНС иммунной реакции пептиды не только должны быть в состоянии связываться с конкретными молекулами МНС, экспрессируемыми опухолевыми клетками, но они также должны распознаваться Т-клетками, несущими Т-клеточные рецепторы (ТКР).

Антигены, которые распознаются опухолеспецифическими Т-лимфоцитами, то есть их эпитопы, могут быть молекулами, образованными из любого класса белков, таких как ферменты, рецепторы, факторы транскрипции и т.д. Кроме того, опухолеассоциированные антигены, могут, например, также присутствовать только в опухолевых клетках, например, в качестве продуктов мутировавших генов. Другой важный класс опухолеассоциированных антигенов представлен тканеспецифическими антигенами, такими как СТ-антигены (раковые тестикулярные), которые экспрессированы в различных видах опухолей и здоровой ткани семенника.

Были идентифицированы различные опухолеассоциированные антигены. Затем много усилий было потрачено на исследования по идентификации дополнительных опухолеассоциированных антигенов. Некоторые группы опухолеассоциированных антигенов, также именуемые в области техники как опухолеспецифические антигены, являются тканеспецифическими. Примеры включают без ограничения тирозиназу для меланомы, Р8А (простата-специфический антиген) и Р8МА (простата-специфический мембранный антиген) для рака простаты и хромосомные кроссоверы (транслокации), такие как Ьсг/аЬ1 в лимфоме. Тем не менее, многие опухолеассоциированные антигены, которые были идентифицированы, встречаются во множестве видов опухолей, и некоторые, такие как онкогенные белки и/или генысупрессоры опухоли (обзор генов-супрессоров опухоли для почечного рака дается, например, в работе ЫпеЬап \УМ, ХУаЬЬег ММ, ΖΚιγ В. ТЬе депеОс Ь-ΐδίδ οί сапсег οί (Не кгбпеу. ί игок 2003 Эес; 170 (6Р11):2163-72), которые фактически вызывают трансформационное явление, встречаются практически во всех видах опухолей. Например, нормальные клеточные белки, контролирующие рост и дифференциацию клетки, такие как р53 (который является примером гена-супрессора опухоли), ηΐδ, с-ше!, тус, рКВ, УНЬ и НЕК-2/иси, могут аккумулировать мутации, приводящие к повышению уровня экспрессии этих генных продуктов, делая их тем самым онкогенными. (МсСайеу е( а1. Сапсег Кеδеа^сЬ 1998 15:58 2601-5; Όίδίδ е( а1. СлЬа Ρογιτι6. 8утр. 1994 187:198-211). Эти мутантные белки также могут быть мишенью опухолеспецифического иммунного ответа при многих видах рака.

Иммунотерапия больных раком направлена на специфическую активацию клеток иммунной систе- 10 022743 мы, в особенности т.н. цитотоксических Т-клеток (ЦТЛ, также известных как киллерные клетки, известных также как С'П8-положительные Т-клетки), против опухолевых клеток, но не против здоровой ткани. Опухолевые клетки отличаются от здоровых клеток экспрессией опухолеассоциированных белков. Молекулы НЬА презентируют наружу на клеточной поверхности клеточное содержимое, таким образом, давая возможность цитотоксическим Т-клеткам отличать здоровую клетку от опухолевой. Это происходит путем расщепления всех белков внутри клетки на короткие пептиды, которые присоединяются затем к молекулам НЬА и презентируются на клеточной поверхности (Каттеизее 1993). Пептиды, представленные на опухолевых клетках, но которые не презентируются или в намного меньшей степени презентируются на здоровых клетках организма, называются опухолеассоциированными пептидами (ТиМАР).

Для того чтобы белки были распознаны цитотоксическими Т-лимфоцитами в качестве опухолеспецифического или опухолеассоциированного антигена и чтобы они могли применяться в терапии, должны выполняться особые предварительные требования. Антиген должен быть экспрессирован преимущественно опухолевыми клетками, а не здоровыми тканями или в сравнительно малом объеме. Далее, желательно, чтобы соответствующий антиген не только присутствовал в каком-либо виде опухоли, но и также имел высокую концентрацию (т.е. число копий соответствующего пептида на клетку). Опухолеспецифические и опухолеассоциированные антигены часто образованы из белков, напрямую задействованных в трансформации нормальной клетки в опухолевую, в связи с функцией, например, при контроле клеточного цикла или в апоптозе. Кроме того, нисходящие мишени белков, напрямую являющихся причиной трансформации, могут быть представлены в повышенном количестве и, таким образом, косвенно опухолеассоциированными. Такие косвенно опухолеассоциированные антигены могут также быть мишенями вакцинационного подхода. В обоих случаях необходимо присутствие эпитопов в аминокислотной последовательности антигена, поскольку такой пептид (иммуногенный пептид), который образован из опухолеассоциированного антигена, должен вести ίη νίΐΓο или ίη νίνο к Т-клеточному ответу.

По существу любой пептид, способный связываться с молекулой МНС, может выполнять функцию Т-клеточного эпитопа. Предварительным условием для индукции Т-клеточного ответа ίη νίίτο или ίη νίνο является присутствие Т-клетки с соответствующим ТКР и отсутствие толерантности к данному конкретному эпитопу. Т-хелперные клетки играют важную роль в управлении эффекторной функцией ЦТЛ в противоопухолевом иммунитете. Эпитопы Т-хелперных клеток, инициирующие ответы Т-хелперных клеток типа ТН1, поддерживают эффекторные функции СЭ8-положительных киллерных Т-клеток, которые включают цитотоксические функции, направленные против опухолевых клеток, проявляющих комплексы опухолеассоциированный пептид/МНС на их клеточной поверхности. Таким образом, эпитопы опухолеассоциированных пептидов Т-хелперных клеток, одни или в комбинации с другими опухолеассоциированными пептидами, могут служить в качестве активных фармацевтических ингредиентов вакцинных композиций, которые стимулируют противоопухолевые иммунные ответы.

Так как оба вида ответов, зависящие от С'П8 и от СЭ4. вносят свой вклад в противоопухолевый эффект сообща и синергически, то идентификация и характеристика опухолеассоциированных антигенов, распознаваемых как СЭ8-положительными ЦТЛ (молекула МНС I класса), так и СЭ4-положительными ЦТЛ (молекула МНС II класса) являются важными при разработке противоопухолевых вакцин. Поэтому целью настоящего изобретения является предложение композиций пептидов, которые содержат пептиды, связывающиеся с комплексами МНС любого класса.

Первые клинические испытания с использованием опухолеассоциированных пептидов были начаты в середине 1990 гг. Буном (Βοοη) и коллегами, в основном, для меланомы.

Клинические ответы в лучших попытках достигали от 10 до 30%. О серьезных побочных эффектах или сильной аутоиммунности не сообщалось ни в одном клиническом исследовании с использованием основанной на пептидах вакцинной монотерапии. Сообщалось о слабых формах витилиго у некоторых пациентов, проходивших лечение меланома-ассоциированными пептидами.

Тем не менее, прайминга одного вида ЦТЛ обычно не достаточно для устранения всех опухолевых клеток. Опухоли обладают сильной мутагенностью и, таким образом, способны быстро реагировать на атаки ЦТЛ изменением своей белковой структуры во избежание узнавания ЦТЛ. Для противодействия механизмам уклонения опухоли от ударов для вакцинации использовались различные специфические пептиды. Таким способом по опухоли могла быть произведена одновременная атака несколькими клонами ЦТЛ. Так могут быть снижены шансы опухоли на ускользание от иммунного ответа. Эта гипотеза недавно получила подтверждение в клиническом исследовании по лечению пациентов с меланомой на поздней стадии. Со всего лишь несколькими исключениями, пациенты, имевшие по меньшей мере три различных Т-клеточных ответа, демонстрировали объективные клинические ответы или стабилизацию заболевания (Ваисйегеаи и соавт., 2001), а также увеличение выживаемости (личные беседы с ί. Ваисйегеаи), в то время как подавляющему большинству пациентов, имевшему менее трех Т-клеточных ответов, был поставлен диагноз прогрессирования заболевания.

Исследование заявителей продемонстрировало похожий эффект, если пациенты, страдавшие от почечно-клеточной карциномы, проходили курс лечения вакциной, составленной из 13 различных пептидов (Н. §шдЬ-1а8и)а, 8. №а11ег, Т. А. Мауег, Р. Υ. 01е1г1сП, М. 8ПеЬ1ег, А. δίοηζί, δ. δίеνаηον^с,

- 11 022743

Н. Раттепкее, I. ЕпксН; Согге1айоп οί Т-се11 гекропке, с1пнса1 αοίίνίΐν апй геди1а!огу Т-се11 1е\'е1к ίη гепа1 се11 сагсшота раПеШк 1геа1ей χνίΐΗ ΙΜΑ901, а ηονе1 тиЮ-рерОйе \'ассше; А8С0 МееОпд 2007 Рок1ег #3017; Μ. ШаеЫег, А. 81еп/к Р. Υ. О1е1пск Т. Е1кеп, А. НаГегкатр, 1. Веск, А. Мауег, 8. ^аНег, Н. 8шдк 1. Епкск С С. δί 1еГ; Ап ореп 1аЬе1 кШйу Ю еνа1иаΐе Ше каГе1у апй пптиподешсПу оГ Ше рерОйе Ьакей сапсег \'ассше ΙΜΑ901, А8СО тееппу 2007; Рок1ег #3017).

Основной задачей в разработке вакцины против опухолей является поэтому не только идентификация и характеристика новых опухолеассоциированных антигенов и полученных из них иммуногенных Тхелперных эпитопов, но и комбинирование различных эпитопов для увеличения вероятности ответа на более чем один эпитоп для каждого пациента. Поэтому целью настоящего изобретения является предложение комбинаций аминокислотных последовательностей таких пептидов, которые обладают способностью связываться с молекулой главного комплекса гистосовместимости человека (МНС) класса I (НЬА класса I) или II (НЬА класса II). Дополнительной задачей настоящего изобретения является предложение эффективной противораковой вакцины, которая основана на комбинации этих пептидов.

В рамках настоящего изобретении изобретатели выделили и охарактеризовали пептиды, связывающиеся с молекулами НЬА I или II класса непосредственно из опухолей млекопитающих, т.е. первичных образцов, взятых, в основном, у пациентов, страдающих раком желудка, но и также первичных образцов тканей глиобластомы, колоректального рака, почечно-клеточной карциномы, рака легких, рака поджелудочной железы, злокачественной меланомы и рака желудка.

В настоящем изобретении предложены пептиды, которые образованы из антигенов, связанных с генезом опухоли, и имеют способность связываться в достаточной мере с молекулами МНС (НЬА) II класса для инициации иммунного ответа человеческих лейкоцитов, в особенности лимфоцитов, в особенности Т-лимфоцитов, в особенности СО4-положительных Т-лимфоцитов, в особенности СЭ4положительных Т-лимфоцитов, опосредующих иммунные ответы типа Т_Н1.

В настоящем изобретении также предложены пептиды, которые образованы из антигенов, ассоциированных с генезом опухоли, и имеют способность связываться в достаточной мере с молекулами МНС (НЬА) I класса для инициации иммунного ответа человеческих лейкоцитов, в особенности лимфоцитов, в особенности Т-лимфоцитов, в особенности СО8-положительных цитотоксических Т-лимфоцитов, в равной степени как и комбинации двух вариантов, которые особенно полезны для вакцинации пациентов, страдающих от рака.

В соответствии с настоящим изобретением поставленная задача решена предложением фармацевтической композиции, включающей по меньшей мере два пептида, содержащих аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из 8ЕЦ ГО N0 1 по 8ЕЦ ГО N0 10, и/или содержащих вариантную аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 85% гомологична последовательностям с 8ЕЦ ГО N0 1 по 8ЕЦ ГО N0 10, и/или полинуклеотид, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую 8ЕЦ ГО N0 1 по 8ЕЦ ГО N0 10 или вариантную аминокислотную последовательность, и фармацевтически приемлемый носитель. Фармацевтические композиции по настоящему изобретению также могут включать по меньшей мере один дополнительный пептид, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из 8ЕЦ ГО N0 11 по 8ЕЦ ГО N0 22, или содержащий вариантную аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 85% идентична последовательностям с 8ЕЦ ГО N0 11 по 8ЕЦ ГО N0 22, или полинуклеотид, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую последовательности с 8ЕЦ ГО N0 11 по 8ЕЦ ГО N0 22 или вариантную аминокислотную последовательность. Пептиды могут иметь общую длину от 8 до 100, предпочтительно от 8 до 30 и особенно предпочтительно от 8 до 17 аминокислот. Пептиды могут также иметь непептидные связи.

Как будет описано далее, пептиды, формирующие основу настоящего изобретения, были все идентифицированы как презентируемые клетками, несущими МНС I или II класса. Таким образом, эти конкретные пептиды, так же как и все другие пептиды, содержащие данную последовательность (т.е. производные пептидов), вызывают специфический Т-клеточный ответ, хотя уровень, до которого такой ответ будет индуцирован, может варьироваться между отдельными пептидами и отдельными пациентами. Различия, например, могут быть вызваны мутациями в пептидах. Специалист данной области полностью осведомлен о способах, которые могут использоваться для определения силы, с которой был индуцирован ответ каждым отдельным пептидом, в частности, благодаря ссылкам на приведенные здесь примеры и соответствующую литературу.

Предпочтительным образом, варианты по изобретению будут индуцировать Т-клеточную перекрестную реакцию с соответствующим пептидом по изобретению.

Пептиды образованы из опухолеассоциированных антигенов, в особенности опухолеассоциированных антигенов с функциями, например, в протеолизе, ангиогенезе, росте клеток, регуляции клеточного цикла, делении клеток, регуляции транскрипции, регуляции трансляции, инвазии ткани и т.д. В табл. 4 представлены пептиды и функция белка, из которого они образованы.

- 12 022743

Таблица 4. Пептиды настоящего изобретения и функция материнского белка

Ид. № послед -ти	Ид. номер пептида	Последовательность	Символ гена	Связывается с МНС
1	СЭС2-001	ΕΥΟΙίΩΟίνΕ	СОК1	НЬА-А*024
2	А8РМ-002	δΥΝΡΙΛνίΚΙ	АЗРМ	НЬА-А*024
3	иснь5-оо1	ΝΥίΡΡΙΜΕΕ	иснь5	НЬА-А*024
4	МЕТ-006	δΥΙΏνίΡΕΡ	МЕТ	НЬА-А*024
5	РКОМ1-001	δΥϊωρίΝί	ΡΕΟΜΙ	НЬА-А*024
5	иоскв-οοι	ΥΥΝΑΑΟΡΝΚί	иоскв	НЬА-А*024
7	ΜδΤΙΚ-001	ΝΥΙ.Ι.ΥνβΝΡ	ΜδΤΙΚ	НЬА-А*024
8	РРАР2С-001	Αγινγιυκι.	РРАР2С	НЬА-А»024
9	ЗМС4-001	ΗΥΚ.ΡΤΡΙΎΡ	5МС4	НЬА-А*024
10	ММР11-001	ννδϋνΤΡΕΤΡ	ΜΜΡ1!	НЬА-А*024
20	АУЬ9-001	ΡΥΙδΡνΝΚΕ	ΛΥΙ.9	НЬА-А*024
24	ЕКВВЗ-001	νΥΙΕΚΝϋΚΕ	ЕКВВЗ	НЬА-А*024

Таблица 5. Дополнительные иммуногенные пептиды, пригодные для композиции по изобретению

Ид. № послед ти	Ид номер пептида	П ос л едовател ь ность	Символ гена	Связывается МНС	С
11	ΒΙΚ-002	ГЦСЕГЬКЬОЕЕЕАКК	В1КС5	ΗίΑ-ϋΚ НЬА-А*02	и
12	СОС42-001	ηΟΡδΤΙΠΚΙ.ΑΚΝ^ΚΡ	СОС42	Рьл-гж
13	СОС42-002	ΝΚφΚΡΙΤΡΕΤΑΕΚΙ,ΑΚυ	СОС42	НЬА-ЭК
14	5РР1-001	ΝΟΑΥΚΑΙΡνΑΟΟίΝΑΡδ	δΡΡΙ	ΗίΑ-ϋΚ
15	В1К-002а	Π-ΟΕΡίΚίΟΚΕΚΑΚΟ	Сурвивин	ΗίΑ-ϋΚ НЬА-А*02	и
16	ΒΙΚ-0026	РТЕЬТЕОЕР	Сурвивин	НЬА-А1
17	В1Е-002с	ΕΜΕΟΕΡίΚΤ	Сурвивин	НЬА-А2
18	ΒΙΚ-0026	ЕРОЬАОСРУ	Сурвивин	НЬА-В35
19	ΝυΡ2-001	νΥΟΙΚΕΕΗΡ	ΝΕΙΡ2	НЬА-А*024
20	АУЬ9-001	ΡΥΙδΡνΝΚί	ΑΥΙ.9	НЕА-А*024
21	АВЫ-001	ΓΥΟΝΕΕϋΥΕ	АВЫ	НЬА-А*024
22	ΝυΡ2-002	ΕΡΙ,δΟΙΙΝΡ	ΝΕΓΡ2	ΗίΑ-Α*024
23	(ΗΒΥ-001)	ΡΕΡδϋΡΡΡδν	Контрольный пептид

Белок цикла клеточного деления 2 (СБС2)

Белок СЭС2, также известный как р34сбс2 или Сйк1 (циклинзависимая киназа 1), относится к Сйкз, семейству сериновых/треониновых протеинкиназ, и играет ключевую роль в контроле клеточного цикла. Он известен как основной регулятор перехода от С2 к фазе М. В конце интерфазы он активируется путем связывания с циклинами А-типа и способствует началу митоза. После разрушения ядерной оболочки циклины А-типа распадаются и заменяются циклинами В. Комплекс из СЭС2 и циклина В образует фактор стимуляции митоза (МРР), который необходим для прохождения клетками фазы митоза.

Активный СЭС2 фосфорилирует более 70 субстратов. Например, фосфорилирование линкерного гистона Н1 ведет к ослаблению хроматиновой структуры и транскрипции специфических генов, а фосфорилирование РНК-полимеразы II усиливает транскрипцию (С18ек и Согбен 1989). Фосфорилирование ВКСА2 стимулирует репарацию с участием гомологичной рекомбинации (ΕδαδΗί и соавт., 2005), и фосфорилирование ΡΘΧΘ1 ингибирует его транскрипционную активность, приводящую к клеточной пролиферации и выживаемости. Фосфорилирование сепаразы ингибирует преждевременное разделение сестринских хроматид (§1еттаии и соавт., 2001). Активность СЭС2 снова падает во время анафазы, так как стимулирующий анафазу комплекс/циклосома (АРС/С) убиквитинирует циклин В, приводя к его деградации.

Функция белка СЭС2 в митозе не является избыточной и не может быть компенсирована активностью других Сбкю таких как Сбк2, 4 и 6. Напротив, об СЭС2 сообщалось, что он задействован в других фазах клеточного цикла, таких как переход 01-8, и он способен заменить Сбк периода интерфазы. Таким образом, как было предложено, СЭС2 является единственным Сбк, незаменимым для клеточного цикла. Кроме его экспрессии и функции в клеточном цикле, о нем сообщалось, что в некоторых случаях СЭС2 экспрессируется при апоптических условиях, и что увеличенная активность может привести к митотической катастрофе. Гиперэкспрессия СЭС2 была обнаружена при нескольких видах рака, хотя регулирование экспрессии других клеточных белков, таких как циклинов, нарушается еще чаще. К видам рака, при которых происходит гиперэкспрессия СЭС2, относятся карциномы предстательной железы, карциномы ротовой полости, плоскоклеточные карциномы ротовой полости (08СС), острая миелоидная лейкемия (АМЬ) (Οίαη и соавт., 2009), Н.ру1оп-индуцированная лимфома МАЬТ (Ваиецее и соавт., 2000) и карцинома толстой кишки (Уа8И1 и соавт., 1993). В нескольких случаях гиперэкспрессия соотносилась с плохим прогнозом. При раке желудка (РЖ) сообщалось о гиперэкспрессии и/или увеличении активности (14 из 23 случаев) и делалось предположение, что гиперэкспрессия СЭС2 может быть тому причиной. Более

- 13 022743 того, было обнаружено, что СЭС2 находится среди набора генов, которые активны во время митоза и которые при гиперэкспрессии приводят к хромосомной нестабильности опухолей. Ингибиторы СЭС2 и других Сбк рассматривали в качестве кандидатов для лекарственных средств для лечения рака (8Ьарио, 2006).

Белок, ассоциированный с аномальной веретеновидной микроцефалией (А8РМ)

Аномальный ген белка веретена деления (ΑδΡΜ), ассоциированный с микроцефалией, является человеческим ортологом аномального веретена дрозофилы (акр) и наиболее часто мутирующим геном аутосомной рецессивной первичной микроцефалии. Дефектный нейрогенез у человека, вызванный гомозиготной мутацией гена ΑδΡΜ, приводит к микроцефалии и умственной отсталости.

Наиболее частой причиной первичной аутосомной рецессивной микроцефалии (МСРН) являются, по-видимому, мутации в гене ΑδΡΜ, который задействован в регуляции нейрогенеза. Во время митоза ΑδΡΜ локализован на полюсах веретена деления.

Ингибирование ΑδΡΜ с помощью κίΡΗΚ-опосредованного нокдауна ингибирует пролиферацию опухолевых клеток и пролиферацию нейрональных стволовых клеток, подтверждая роль ΑδΡΜ как потенциальной молекулярной мишени в глиобластоме. ΑδΡΜ был гиперэкспрессирован в глиобластоме по сравнению с нормальным головным мозгом. Экспрессия белка ΑδΡΜ может использоваться в качестве маркера злокачественности глиомы, представляя собой потенциальную терапевтическую мишень. Гиперэкспрессия белка ΑδΡΜ является молекулярным маркером, предсказывающим увеличенный инвазивный/метастатический потенциал гепатоклеточной карциномы ГКК, более высокий риск быстрого рецидива опухоли (ЕТК) вне зависимости от статуса мутации р53 и стадии опухоли и, поэтому, плохого прогноза. ΑδΡΜ экспрессируется также в повышенном количестве в иммортализованных клетках, раковых клетках и в тканях немелкоклеточного рака легких (ΝδίΡΡ) (1ии§ и соавт., 2009).

Убиквитин карбоксил-терминальная гидролаза Ь5 (иСНЬ5)

Убиквитин карбоксил-терминальная гидролаза Ь5 (ИСНЬ5), известная также как Убиквитин Стерминальная гидролаза (ИСН37) или ΓΝΘ80Κ, является деубиквитиназой, которая связана с протеасомой. Она разбивает на части связанные с белком полиубиквитиновые цепи на дистальном конце путем расщепления изопептидной связи между С-концевыми Сук76 и Ьук48 (ΝίκΗίο и соавт., 2009).

ИСНЬ5 связывается с ЬКрп13 (известной также как Λάηηΐ). компонентом регулирующей частицы 19δ (РА700) протеасомы, которая инициирует ее изопептидазную активность. ЬКрп13 функционирует также в качестве рецептора убиквитина, тем самым связывая распознание субстрата с деубиквитинированием. ИСНЬ5 может также связываться с Ρρη10/δ5α, другим компонентом частицы 19δ, расположенной между его шапочкой и основанием, но данное взаимодействие не в состоянии активировать ИСНЬ5. ИСН37 может защищать слабо убиквитинированные субстраты или другие медленно деградирующие конъюгаты убиквитина от протеолиза. В качестве альтернативы, она также может усилить деградацию, способствуя высвобождению полиубиквитинированных субстратов из их начального сайта связывания в регуляторном комплексе 19δ для транслокации в протеолитическое ядро, частицу 20δ протеасомы 26δ. В ядре ИСНЬ5 соединен также с хроматин-ремоделирующим комплексом 1по80. После связывания с протеасомой она активируется и может вносить свой вклад в регуляцию транскрипции или репарации ДНК, что, как предполагают, опосредуется 1по80 и протеасомой. Функции ИСНЬ5 могут осуществляться, по меньшей мере частично, другими белками, так как ΚΝΑί-опосредованный нокдаун ИСНЬ5 не имеет обнаруживаемого воздействия на клеточный рост, структуру протеасомы или протеолитическую способность, хотя она ускоряет деградацию клеточных белков.

Убиквитин-специфические протеазы, подобные иСНЬ5, задействованы в нескольких процессах, таких как контроль прохождения клеточного цикла, дифференциация, репликация и репарация ДНК, транскрипция, контроль качества белков, иммунный ответ и апоптоз. Некоторые существующие данные указывают на то, что иСНЬ5 содействует злокачественной трансформации. Ее активность, как было продемонстрировано, повышена в тканях карциномы шейки матки человека по сравнению с соседней нормальной тканью. Она способна деубиквитинировать и, тем самым, стабилизировать рецептор ТОРбета и его медиаторы нисходящих путей, т. н. δтаά, тем самым стимулируя сигнальные каскады, активируемые ТОР-бета. Простимулированные ТОР-бета сигнальные каскады могут выступать в качестве стимулятора опухолевого роста на поздних стадиях прогрессии рака, хотя он обладает двоякой функцией и может также выступать в качестве супрессора опухоли на ранних стадиях и перед инициацией (ХУюкк и соавт., 2005; ХУюкк и соавт., 2006; Нойоп и соавт., 2007; Βίβτίβ и Μοκβκ, 2006).

с-Ме1

См., например, ЕР 08008292.8 и ЕР 1507795В1. Кроме того, конститутивная активация с-Μβί посредством фосфорилирования также описывалась в качестве важного механизма онкогенеза при светлоклеточной почечно-клеточной карциноме у человека (№4кнда\\а и соавт., 2006).

Гиперэкспрессия МЕТ, зачастую вызванная опухолевой гипоксией, ведет к конститутивной активации рецептора и соотносится с плохим прогнозом. Выключение эндогенного гена МЕТ, гиперэкспрессированного в опухолевых клетках, приводит к сбоям в выполнении полной программы инвазивного роста ίη νίίτο, отсутствию роста опухоли и снижению образования экспериментальных метастазов ίη νίνο. Примечательно, что выключение гена МЕТ при уже распространившихся метастазах приводит к

- 14 022743 их практически полной регрессии (Согко и соавт., 2008).

Макрофаг-стимулирующий белковый рецептор (М8Т1К)

Рецептор М8Т1К (также известный под названием ΚΌΝ) является членом семейства Ме! рецепторных тирозинкиназ клеточной поверхности, и он, в первую очередь, экспрессирован на эпителиальных клетках и макрофагах. Как и с-МЕТ, ΚΌΝ экспрессируется клетками различных опухолей эпителиального происхождения и линиями раковых клеток и, как считается, играет функциональную роль при онкогенезе. В клинических исследованиях было продемонстрировано, что гиперэкспрессия М8Т1К связана как с ухудшением исхода для пациента, так и с метастазами.

Экспрессия М8Т1К значительна в тканях карциномы желудка и соответствующей паранеопластической ткани, однако он не экспрессируется в нормальной слизистой оболочке желудка (ΖΙιοιι и соавт.,

2008) . Рецептор М8Т1К может вызывать клеточную миграцию, инвазию, пролиферацию и выживаемость в ответ на его соответствующий лиганд. Более того, М8Т1К имеет онкогенную активность ίη νίίτο, в моделях с животными ίη νίνο и часто дерегулирован при раковых заболеваниях человека (Эи55аи11 и Ве11оп,

2009) . Данные показывают, что нокдаун рецептора М8Т1К в раковых клетках предстательной железы приводит к существенно пониженному хемотаксису эндотелиальных клеток при сравнении с М8Т1Кэкспрессирующими клетками ίη νίΙΐΌ, в равной степени как и к снижению роста опухоли и уменьшению плотности микрососудов после ортотопической трансплантации в предстательную железу ίη νί\Ό. Было продемонстрировано, что опосредованный РНК-интерференцией нокдаун М8Т1К-киназы в клеточной линии высоко онкогенного рака толстой кишки приводил к снижению пролиферации в сравнении с контрольными клетками.

Белок 4 поддержания структуры хромосом (8МС4)

Белки, поддерживающие структуру хромосом (8МС), являются хромосомными АТФ-азами с высокой консервативностью от бактерий до человека, которые играют фундаментальную роль во многих аспектах поддержания структуры высшего порядка в хромосомах и их динамики.

Белок 8МС4 является центральным компонентом комплекса конденсина, который играет роль при конденсации хроматина, а также был связан с ядрышковой сегрегацией, репарацией ДНК и сохранением хроматинового каркаса. Эукариоты имеют по меньшей мере шесть белков 8МС в отдельных организмах, и они образуют три различных гетеродимера со специальными функциями: 8МС2 и 8МС4 функционируют в качестве центра комплексов конденсина, которые необходимы для сборки хромосомы и сегрегации.

Анализ уровней мРНК в 25 различных нормальных тканях с помощью ОТ-ПЦР (обратной транскрипции, совмещенной с полимеразной цепной реакцией) показывает, что этот ген высоко экспрессируется в тканях нормальной предстательной железы и слюнной железы, очень слабо - в тканях толстой кишки, поджелудочной железы и кишечника и вообще не экспрессируются в других тканях. Исследования с помощью ОТ-ПЦР проб ткани раковой опухоли человека показывают, что РНК высоко экспрессируется во многих раковых клеточных линиях и образцах ткани раковой опухоли, включая 26 из 33 образцах ткани раковых опухолей молочной железы человека, 3 из 3 образцах ткани раковой опухоли предстательной железы, 3 из 3 образцах ткани раковой опухоли толстой кишки и 3 из 3 образцах ткани раковой опухоли поджелудочной железы (Е§1апД и соавт., 2006).

АУЬ9

Неожиданным образом, данный белок был обнаружен в качестве белка-источника, так как имеется лишь ограниченная информация о белке АУБ9 и функции соответствующего гена.

Белок кинетохора Νπί2

Ген ΝυΡ2 (СЭСА-1) кодирует белок, который очень похож на дрожжевой белок ΝυΓ2, компонент консервативного белкового комплекса, связанного с центромерой. Дрожжевой ΝυΓ2 исчезает из центромеры во время мейотической профазы, когда центромеры теряют свою связь с полярными тельцами веретена деления, и играет регуляторную роль в хромосомной сегрегации. Было продемонстрировано, что свьРНК сурвивина и 1ιΝιιΓ2 производят временный нокдаун своих мРНК, вызывая образование многоядерных клеток и клеточную смерть за счет митотического блока, соответственно (Ν§ιι\όιί и соавт., 2006). ΝιιΓ2 и Нес1 требуются для организации стабильных сайтов связывания плюс-конца микротрубочек на внешней пластине, которые нужны для сохранения устойчивых сил, направленных к полюсу, необходимых для биоориентации на кинетохорах (ПеЬиса и соавт., 2005).

Иммуногистохимический анализ на основе тканевых микроматриц рака легких подтвердил высокие уровни белков СЭСА1 и КЫТС2 в значительном большинстве видов рака легких различных гистологических типов. Их повышенная экспрессия была связана с худшим прогнозом для пациентов с немелкоклеточным раком легких (ЫЗСЕС). Ингибирование их связывания с помощью проникающего в клетку пептида, нагруженного образованным из СЭСА1 пептидом из 19 аминокислот (11К-СЭСА1(398-416)), который соответствует домену связывания с КЫТС2, эффективно подавлял рост клеток ЫЗСЬС (Науата и соавт., 2006). Было обнаружено, что опосредованный 81РНК нокдаун СЭСА1 или КЫТС2 ингибирует клеточную пролиферацию и индукцию апоптоза при ЫЗСЕС, раке яичников, раке шейки матки, раке желудка, колоректальном раке и глиоме (Каиеко и соавт., 2009). Ген СЭСА 1 дифференциально экспрессирован в клетках рака шейки матки (экспрессия мРНК подтверждена по методике ПЦР в реальном време- 15 022743 ни и белком - иммуногистохимическим методом) (Магйп и соавт., 2009). Анализ ОТ-ПЦР на удаленных хирургической резекцией тканях рака желудка (диффузного типа, 6; кишечного типа, 4) подтвердил, что два варианта СЭСА1 были в повышенном количестве в раковых тканях. В этом исследовании были обнаружены варианты альтернативного сплайсинга, особенно в СЭСА1, которые могут быть потенциально пригодны в качестве диагностических маркеров и/или новых мишеней в рамках противораковой терапии (ОЬпита и соавт., 2009).

Липидная фосфат-фосфогидролаза 2 (РРАР2С)

Белок, кодируемый этим геном, является членом семейства фосфатаз фосфатидной кислоты (ΡΑΡ). ΡΑΡ преобразуют фосфатидную кислоту в диацилглицерин и имеет функцию как в синтезе глицеролипидов бе ηονο, так и в трансдукции активированного рецептором передачи сигнала, опосредованного фосфолипазой Ό. Сообщалось о трех транскрипционных вариантах альтернативного сплайсинга, кодирующих различные изоформы.

РРАР2С является потенциально новой мишенью, которая представлена в повышенном количестве в трансформированных первичных мезенхимных стволовых клетках (МδС) взрослого человека. Нокдаун РРАР2С приводит к снижению клеточной пролиферации за счет задержания вхождения в δ-фазу клеточного цикла и транскрипционно регулируется р53. Некоторые данные позволяют предположить, что гиперэкспрессия РРАР2С, наблюдаемая в клетках многочисленных видов рака человека, может быть необходима для увеличения клеточной пролиферации (Р1ападап и соавт., 2009). Исследование демонстрирует, что РРАР2С является регулятором протекания клеточного цикла в фибробластах. Гиперэкспрессия РРАР2С, но не каталитически неактивный мутант, вызывала преждевременное вхождение в δ-фазу, сопровождавшееся преждевременным накоплением циклина А. Это демонстрирует значительные изменения в скорости вхождения в δ-фазу, что могло отражаться на таких процессах, как митогенез, миграция, заживление ран, развитие и онкогенез.

Убихинон-связывающий белок комплекса убихинол-цитохром-с-оксиредуктаза (иЦСКБ)

Ген ИЦСКБ кодирует белок, который является частью комплекса убихинол-цитохром-соксидоредуктазы, который содержит десять субъединиц, кодируемых ядерной и одну - кодируемую митохондриальной ДНК. Закодированный белок связывается с убихиноном и участвует в передаче электронов, когда убихинон связан. Мутации этого гена связаны с недостаточностью митохондриального комплекса III. Был описан псевдоген на Х-хромосоме.

Ген ИЦСКБ может быть потенциальным онкогеном или геном-супрессором опухоли при аденокарциноме протока поджелудочной железы (Нагайа и соавт., 2009). Ген ИЦСКБ гиперэкспрессирован в клетках гепатоклеточной карциномы (Ла и соавт., 2007).

Проминин 1 (Ргот1)

Проминин-1, называемый также СЭ133, был первоначально идентифицирован как молекула, специфическая для СЭ34-положительных кроветворных клеток-предшественников, и, как было показано позже, он является маркером для нормальных стволовых клеток и раковых стволовых клеток (С8С) различных тканей (Μί/гак и соавт., 2008). Однако о его функции известно немного. Так как он в основном локализован на выростах плазматической мембраны, таких как микроворсинки эпителиальных клеток, приминину-1 приписывали функциональную роль, организатора топологии плазматической мембраны. Так как было обнаружено, что он взаимодействует с холестерином, то он может быть важным для сохранения надлежащей липидной композиции внутри плазматической мембраны.

Проминин-1 используют в качестве маркера СδС для многих видов опухолей человека. Обычно только небольшой процент опухолевых клеток является положительным для проминина-1, как это ожидается от маркера СδС. В зависимости от вида опухоли число положительных клеток на опухолевую массу достигает от 1 до 15% и в большинстве случаев составляет около 2%. Опухолями, для которых функциональные пробы (такие как формирование сфер, высокая способность к инициации роста опухоли у иммунодефицитных мышей и асимметрическое деление / самообновление / плюрипотентность) показали, что экспрессирующие проминин-1 клетки являются СδС, являются:

рак толстой кишки (2-2,5% опухолевой массы) (Тобаго и соавт., 2007; Кюа-УШат и соавт., 2007), рак печени (Ма и соавт., 2007; δικΐ5ΐι§ιι и соавт., 2006; Υίη и соавт., 2007), рак поджелудочной железы (Негтапп 2007; \Уапд 2009), рак предстательной железы (1% опухолевой массы) (Кюйагйкоп и соавт., 2004), опухоли головного мозга различных фенотипов (δίπβΐι и соавт., 2003; δίπβΐι и соавт., 2004), лейкемии, такие как острая лимфобластная лейкемия, АЬЬ (Сох и соавт., 2009), меланома (Моп/аш и соавт., 2007; Карра и соавт., 2008), рак легких (Сйеп и ОМюа, 2008; Егато и соавт., 2008; Ттпо и соавт., 2009), саркома Юинга (8^а и соавт, 2009), эндометриальный рак (Ки!е11а и соавт, 2009), плоскоклеточная карцинома полости рта (Ζΐκπίβ и соавт., 2009) и плоскоклеточная карцинома головы и шеи (Нагрег и соавт., 2007).

Более того, несколько исследований показали наличие повышенного уровня экспрессии проминина-1 в раковой ткани по сравнению со здоровой тканью, и в большинстве из них была установлена взаи- 16 022743 мосвязь экспрессии проминина-1 с клиническими параметрами, такими как общая выживаемость, стадия опухоли или метастазирование. Примерами являются немелкоклеточный рак легких, злокачественная меланома, ретинобластома, нейробластома и синовиальная карцинома. Экспрессия проминина-1 также соотносится с плохим прогнозом для пациентов, больных глиомой, раком поджелудочной железы (вплоть до 15% РКОМ1-положиткльных клеток), колоректальным, ректальным и раком толстой кишки и протоковой карциномы молочной железы. Интересно, что мРНК РКОМ1 представлена в повышенном количестве в РВМС (мононуклеарах периферической крови) больных раком с метастатической болезнью, в особенности у пациентов с костными метастазами, и экспрессия РКОМ1 в РВМС является прогностическим фактором для общей выживаемости. Взаимосвязи с прогнозом при раке яичников установлено не было.

Предположение об экспрессии РКОМ1 при диффузном раке желудка было основано на анализе ίη бПсо (КаЮЬ и КаЮк 2007), о гиперэкспрессии при раке желудка в сравнении с нормальной тканью желудка на уровне белка сообщалось в работе (διηίΐΐι и соавт., 2008). Однако (Воед1 и Рг1п/, 2009) сообщали, что уровень экспрессии проминина-1 был пониженным при раке желудка, в частности на поздних стадиях, и заявляли, что экспрессия проминина-1 скорее взаимосвязана с ангиогенезом - который также снижается на поздних стадиях - чем с ростом опухоли. В исследовании с использованием клеточных линий рака желудка (ТакаЫи и соавт., 2009) утверждается, что СЭ44, а не проминин-1 является маркером С8С при раке желудка.

Данные о том, что клетки, экспрессирующие проминин-1, задействованы в образовании опухоли, представлены в работе (Ζΐιιι и соавт., 2009), где сообщается, что в модели рака кишечника мышей все неопластические клетки возникли из Ргот1-положительных клеток, но только 7% сохраняли Ргот1положительный фенотип. Кроме того, проминин-1-положительные клетки, как было показано, участвуют в ангиогенезе опухоли. Как ожидалось от С8С, проминин-1-положительные клетки были хеморезистентными вследствие активации антиапоптозного Ак1-каскада (Ма 2008). В работе (ВейоНт и соавт., 2009) сообщается, что они не реагируют на лечение цисплатином. Они резистентны к ТКА1Ь- и Ра8индуцированному апоптозу из-за повышенного уровня РЫР. Они защищают самих себя от апоптоза секрецией ИЛ-4. Однако они могут быть доступны для иммунной системы, так как они могут быть уничтожены ΝΚ-клетками (СаЧпсош и соавт., 2007; Р1е1га и соавт., 2009) и цитотоксическими Т-клетками (Вто^п и соавт., 2009).

Матричная металлопротеиназа 11 (ММР11)

Матричная металлопротеиназа 11 (ММР11), как было сделано предположение, играет роль во время нескольких физиологических процессов, требующих ремоделирования тканей, таких как развитие, инволюция молочной железы после лактации, заживление ран и образование шрамов и во время менструального цикла. Также было сделано предположение, что она отрицательно регулирует гомеостаз жиров посредством снижения дифференциации адипоцитов. В отличие от других ММР, она не в состоянии расщеплять обычные молекулы внеклеточного матрикса - за исключением коллагена VI. Однако были идентифицированы другие субстраты, такие как альфа-2-макроглобулин, определенные ингибиторы серинпротеазы (серпины), включая альфа-1-антитрипсин, белок-1, связывающий инсулиноподобный фактор роста, и рецептор ламинина.

Было обнаружено, что ММР11 является продуктом, который специфически гиперэкспрессирован в клетках стромы, расположенных вокруг инвазивной карциномы молочной железы. Дальнейшие исследования подтвердили ее экспрессию в окружающей опухоль строме карциномы молочной железы и других видов рака, таких как рак кожи, немелкоклеточные в равной степени, как и мелкоклеточные карциномы легких, плоскоклеточная карцинома головы и шеи, карцинома толстой кишки и колоректальная карцинома, эпителиальный рак гортани, карцинома пищевода, карцинома ротовой полости, карцинома поджелудочной железы, карцинома мочевого пузыря, карциномы яичника, почечно-клеточная карцинома, атипичная менингиома, папиллярная карцинома щитовидной железы, опухоли головного мозга (ММР11 был экспрессирован в клетках астроцитом, но только в малой степени в клетках олигодендроглиом и злокачественных глиомах), карцинома слюнного протока, рак шейки матки, экстранодальные ΝΚ/Тклеточные лимфомы, нехожкинская лимфома и карцинома предстательной железы. Утверждалось, что ММР11 гиперэкспрессируется в строме наиболее инвазивных карцином человека, но редко в клетках сарком и других неэпителиальных опухолей. В основном, ММР11 экспрессируется в стромальных клетках, непосредственно граничащих с опухолью, тогда как сами опухолевые клетки, нормальные ткани и стромальные клетки, расположенные далеко от опухоли, остаются негативными. Однако это не следует обобщать, так как в некоторых случаях ММР11 была также обнаружена в нераковых тканях, таких как ткани толстой кишки или в опухолевых клетках, например, опухолей поджелудочной железы, молочной железы, паутинной оболочки мозга и желудка. Более высокие уровни ММР11 соотносятся со злокачественным фенотипом / более высокой инвазивностью и плохим прогнозом. Однако в клетках папиллярных карцином щитовидной железы экспрессия ММР11 была обратно пропорциональна агрессивным характеристикам.

Её участие в ангиогенезе является маловероятным, так как экспрессия ММР11 не связана с плотностью микрососудов. Скорее всего, она повышает выживаемость раковых клеток и подавляет апоптоз.

- 17 022743

Было сделано предположение, что ММР11 из фибробластов приводит к стимуляции ЮР-1К сигнального пути в клетках карциномы, таким образом увеличивая их пролиферативную способность. Ее способность приводить к дедифференциации адипоцитов стимулирует рак посредством аккумуляции перитуморальных фибробласт-подобных клеток, которые способствуют выживаемости раковых клеток и прогрессии опухоли (МоКекси и Κίο, 2008). ММР11 была обнаружена в опухолевой ткани, как и в сыворотке пациентов, страдающих раком желудка, и уровень экспрессии соотносился с метастазами (Уаид и соавт., 2008). Более того, (Ленд и соавт., 2005) показали, что ММР11 высоко экспрессирована в линиях опухолевых клеток и первичных опухолях рака желудка - в отличие от других видов рака, не исключительно в строме - и что она, по-видимому, усиливает пролиферацию опухолевых клеток.

АВЬ1

Протоонкоген ЛВЫ кодирует цитоплазматическую и ядерную протеинтирозинкиназу семейства 8тс, которые участвуют в процессах клеточной дифференциации, клеточного деления, адгезии и реакциях на стресс (Υοδίύύα. 2007). С-ЛЫ перемещается между ядерным и цитоплазматическим компартментами. Ядерный с-ЛЫ задействован в ингибировании клеточного роста и содействии апоптозу. Напротив, роль цитоплазматического с-ЛЫ описана не так хорошо. Существуют предположения о его роли в морфогенезе и динамике Р-актина, а также роли в сигнальных реакциях, вызванных внеклеточными стимулами, такими как факторы роста и лиганды интегринов. Цитоплазматический с-ЛЫ, как сообщалось, способствует митогенезу. Митогенные субстраты С-ЛЫ еще не были идентифицированы, но они, скорее всего, включают регуляторы малых ГТФаз семейства К1ю, в частности члены Уау и Зо8.

Связывающая активность ДНК повсеместно экспрессированной ЛВШ-тирозинкиназы регулируется СЭС2-опосредованным фосфорилированием, позволяя сделать предположение о функции ЛВЫ в клеточном цикле. Активность белка с-ЛЫ регулируется отрицательно ее доменом 8Н3, и делеция домена 8Н3 превращает ЛВЫ в онкоген. Нерецепторная тирозинкиназа с-ЛЫ регулирует реакции актина в некроветворных клетках. В некоторых исследованиях с-ЛЫ была идентифицирована как ведущий участник реакций сигнального каскада, приводящих к реорганизации актина во время Т-клеточной активации (Ниапд и соавт., 2008).

Мутации гена ЛВЫ ассоциируются с хронической миелоидной лейкемией (ХМЛ). При ХМЛ ген активируется посредством транслокации внутри гена ВСК (область локализации сайта инициации реаранжировки) на хромосоме 22. Новый слитый ген ВСК-ЛВЬ кодирует нерегулируемую тирозинкиназу, направленную в цитоплазму, которая позволяет клеткам пролиферировать без цитокиновой регуляции. Это, в свою очередь, позволяет клетке стать канцерогенной (Ζΐιηο и соавт., 2009). Активированная с-ЛЫ тирозинкиназа, не как слитый белок, играет важную роль в злокачественных клетках солидных опухолей легких и молочной железы (Ьш и ЛтЕпд^аик, 2008).

Последние наблюдения указывают на то, что с-ЛЫ также дерегулирован в клетках солидных опухолей. Высокая активность цитоплазматической киназы была обнаружена в клетках карцином молочной железы и Νδί'ΈΟ Гиперэкспрессии, однако, недостаточно, и для конститутивной киназной активности требуется фосфорилирование белка. В клетках рака молочной железы фосфорилирование с-ЛЫ вызывается тирозинкиназами плазматической мембраны, включая членов семейств 8РК, ЕОРК и рецептор ЮР1. Слитые белки ЛВЬ не были обнаружены в солидных опухолях.

ЛВЫ и рак желудка - в иммуногистохимическом исследовании экспрессии ЛВЫ анализу подвергали широкий спектр нормальных эмбриональных тканей и тканей взрослых людей и различные виды опухолей. Большинство опухолей проявляло фокальную или слабую иммунореактивность ЛВЬ. Наиболее интенсивное окрашивание было заметно в клетках хондросаркомы, липосаркомы и диффузной (перстневидного типа) аденокарциномы желудка. В двух последних случаях ЛВЬ экспрессировался также на микрососудах опухоли, указывая на возможную роль в ангиогенезе.

В рамках последних исследований было выявлено, что инфекция садЛ-положительными НеПсоЪас1ег ру1ог1 играет существенную роль в развитии карциномы желудка. Н. ру1оп блокирует эндоцитоз ЕОРК и деградацию рецепторов после длительной инфекции эпителиальных клеток желудка. Более того, это ингибирование возникает посредством СадЛ-зависимой, но не зависимой от фосфорилирования СадЛ, активации нерецепторной киназы с-ЛЫ, которая, в свою очередь, фосфорилирует сайт-мишень ЕОРК - ρΥ1173 (Ваиег и соавт., 2009). Селективное ингибирование активности с-ЛЫ-киназы ингибиторами 8Ή571 или 8ЬΚNЛ отменяет устойчивое фосфорилирование цитотоксин-ассоциированного гена Л (СадЛ) и миграцию эпителиальных клеток, указывая на ключевую роль с-ЛЫ в инфекции Н. ρνίοη и патогенности (Рорре и соавт., 2007).

Примером блокаторов киназного пути является иматиниб (иматиниба мезилат, О1ееуес, 8Ή571), ингибитор онкобелка Вст/ЛЫ, который стал терапевтическим средством первой линии для хронической миелоидной лейкемии (Ру1е1 и соавт., 2009). Иматиниб получил одобрение для лечения пациентов, имеющих стромальные опухоли желудочно-кишечного тракта (Ο!δΤ) на поздних стадиях, при которых наблюдается аномальное повышение экспрессии К!Т, рецептора тирозинкиназы (Сгоот и Репу, 2003). Другим ингибитором киназы, используемым в последнее время при лечении рака, является дазатиниб (ВМ8-354825), который является специфическим для ЛВЬ нерецепторного цитоплазматического типа (Ру1е1 и соавт., 2009). Нилотиниб является тирозинкиназным ингибитором Ъст-аЫ, средством второго

- 18 022743 поколения для орального применения, прописываемым для лечения РЬ-положительной ХМЛ хронической и ускоренной фазы у взрослых с резистентностью или непереносимостью иматиниба (Эегетег и соавт., 2008).

8ЕЦ II) N0 13, 8ЕЦ II) N0 14 и 8ЕЦ II) N0 15 раскрыты в патенте УС) 2007/028574, С1)С42 (цикл клеточного деления 42) является белком, вовлеченным в регуляцию клеточного цикла. Белок является малой ГТФазой подсемейства Р1ю. которая регулирует сигнальные пути, контролирующие различные клеточные функции, включая клеточную морфологию, миграцию, эндоцитоз и прохождение клеточного цикла. Как было установлено, СОС42 высоко гиперэкспрессирован при глиобластоме.

В патенте УО 2004/067023 описываются пептиды, рестриктированные по МНС I класса, образованные из опухолеассоциированного антигена сурвивина, пептиды из которого способны связываться с молекулами I класса НЬА с высокой аффинностью.

Секретированный фосфопротеин 1 (8РР1), также известный как костный сиалопротеин I (В8Р-1), ранний активатор Т-лимфоцитов (ЕТА-1) и под наиболее известным названием - остеопонтин (ΟΡΝ), является генным продуктом на основе человеческих генов, который также сохраняет свои функции и у других видов. Остеопонтин участвует в качестве важного фактора при ремоделировании костей. В частности, исследования указывают на то, что он играет роль в фиксации остеокластов к минеральному матриксу костной ткани. Органическая часть кости составляет около 20% сухой массы и включает, кроме остеопонтина, коллаген типа I, остеокальцин, остеонектин, костный сиалопротеин и щелочную фосфатазу. На коллаген типа I приходится 90% белковой массы.

ΟΡΝ связывается с несколькими рецепторами интегрина, включая α4β1, α9β1 и α9β4, экспрессируемыми лейкоцитами. Для этих рецепторов была хорошо обоснована их функция в клеточной адгезии, миграции и выживаемости в этих клетках. Поэтому последние исследования были сосредоточены на роли ΟΡΝ в опосредовании таковых ответов.

Остеопонтин экспрессирован в ряде иммунных клеток, включая макрофаги, нейтрофилы, дендритные клетки и Т- и В-клетки с разнообразной кинетикой. Об ΟΡΝ сообщалось, что он выступает в качестве иммунного модулятора с разнообразием способов действия. Во-первых, он имеет хемотактические свойства, которые способствуют рекрутингу клеток к местам воспаления. Он также действует как белок адгезии, участвуя в прикреплении клеток и заживлении ран. Помимо этого, ΟΡΝ опосредует клеточную активацию и выработку цитокинов, а также способствует выживаемости клеток при содействии регуляции апоптоза.

Активированные Т-клетки стимулируются ИЛ-12 для дифференциации до типа ТЬ1 с выработкой цитокинов, включая ИЛ-12 и ΓΡΝγ. ΟΡΝ ингибирует выработку ТЬ2 цитокина ИЛ-10, который приводит к усиленному ответу ТЬ1. ΟΡΝ влияет на опосредованную клетками иммунность и имеет функции цитокина ТЫ. Он усиливает выработку В-клетками иммуноглобулина и их пролиферацию. В последних исследованиях 2008 г. делается предположение, что ΟΡΝ также вызывает дегрануляцию мастоцитов. |Ναдазака А, Ма!зие Н, Ма18И8Ыта Н, е! а1. (РеЬтиату 2008). Οδΐеороηΐт 18 ргойисей Ьу таз! се11з апй аГГес!8 [дЕ-тей1а1ей йедгапи1айоп апй т1дтайоп оГ таз! се118. Еиг. I. Iттиηо1. 38 (2): 489-99]. Исследователи заметили, что IдЕ-оπосредованная анафилаксия была значительно снижена у ΟΡΝ-нокаутных мышей по сравнению с мышами дикого типа. Роль ΟΡΝ в активации макрофагов рассматривалась также в исследовании рака, когда исследователи обнаружили, что ΟΡΝ-вырабатывающие опухоли были способны индуцировать активацию макрофагов по сравнению с опухолями с недостатком ΟΡΝ.

ΟΡΝ является важным антиапоптическим фактором при многих обстоятельствах. ΟΡΝ блокирует вызванную активацией клеточную смерть макрофагов и Т-клеток, в равной степени как и фибробластов и эндотелиальных клеток, подверженных действию вредных факторов. ΟΡΝ предупреждает незапрограммированную смерть клетки при воспалительном колите.

Тот факт, что ΟΡΝ взаимодействует со множеством рецепторов на поверхности клетки, которые повсеместно экспрессированы, делает его активным участником многих физиологических и патологических процессов, включая заживление ран, ремоделирование кости, онкогенез, воспаление, ишемию и иммунные ответы. Поэтому манипуляция плазменными уровнями ΟΡΝ может быть полезна при лечении аутоиммунных заболеваний, раковых метастазов, остеопороза и некоторых форм стресса.

Было показано, что ΟΡΝ стимулирует выработку ИЛ-17; ΟΡΝ гиперэкспрессирован в различных видах рака, включая рак легких, рак молочной железы, колоректальный рак, рак желудка, рак яичника, меланому и мезотелиому; ΟΡΝ играет роль в развитии гломерулонефрита и тубулоинтерстициального нефрита, и ΟΡΝ был обнаружен в атеросклеротических бляшках внутри артерий. Таким образом, манипуляция плазменными уровнями ΟΡΝ может быть полезна при лечении аутоиммунных заболеваний, раковых метастазов, остеопороза и некоторых форм стресса.

Рецептор 3 человеческого эпидермального фактора роста (ЕКВВ3)

ЕКВВ3 кодирует члена семейства рецепторов эпидермального фактора роста (ЕСРК) рецепторных тирозинкиназ. Он активируется нейрегулинами, другими ЕКВВ и рецепторами, не принадлежащими к ЕКВВ, в равной степени как и другими киназами и новыми механизмами. По нисходящей он взаимодействует, главным образом, с фосфоинозитол-3-киназой/АКТ-каскадом, определяющим выживание клеток/

- 19 022743 митогенным каскадом, но и также с СКВ, 8НС, 8КС, АВЬ, гакСАР, 8ΥΚ и регулятором транскрипции ЕВР1 (8йкапапйат и Апйегкоп 413-48).

Исследования экспрессии ЕКВВ3 в клетках первичного рака и механизмов его воздействия в культуре клеток показали, с различной степенью уверенности, его причастность к возникновению или поддержанию рака молочной железы, яичника, предстательной железы, конкретных клеток головного мозга, сетчатки глаза, меланоцитов, толстой кишки, поджелудочной железы, желудка, ротовой полости и легких (8ййапапйат и Апйегкоп 413-48). Белок ЕКВВ3 был обнаружен с помощью иммуногистохимического анализа в эпителиальных клетках по всему желудочно-кишечному тракту, включая плоскоклеточный эпителий ротоглотки и пищевода, париетальные клетки желудка и поверхностные энтероциты тонкого и толстого кишечника. ЕКВВ3 проявлял повышенную экспрессию в клетках рака желудка (Ро11ег и соавт. 275-80; 8атйак и соавт. 935-40). Все клеточные линии рака желудка экспрессировали ЕКВВ3 и усеченный, секретированный продукт. Убедительное подтверждение ключевой роли ЕКВВ3 при злокачественных заболеваниях желудка пришло из исследования слабо дифференцированных карцином желудка перстневидно-клеточного типа (КоЪауакЫ и соавт. 1294-301). Ζ1ιηη§ и соавт. исследовали экспрессию ЕКВВ3 в клетках раковой опухоли желудка двух патологических типов (диффузного и кишечного типа) с помощью иммуногистохимического анализа (ГНС). РЖ диффузного типа имел значительно более высокий уровень гиперэкспрессии ЕКВВ3, чем кишечный тип (26,2% в сравнении с 5,0%, р < 0,01). Селективная гиперэкспрессия ЕКВВ3 в двух гистологических типах рака желудка тесно взаимосвязана с плохим прогнозом (Ζ1ιηη§ и соавт. 2112-18). Экспрессия ЕКВВ3 была в значительной степени связана с параметрами, определяющими прогрессию опухоли, включая глубину инвазии опухоли, поражение лимфатических узлов, отдаленные метастазы, стадию опухоли и рецидивы заболевания (НауакЫ и соавт. 784349). Экспрессия и совместная экспрессия ЕСРК, с-егЪВ-2 и с-егЪВ-3 в 21 случае рака желудка и 20 случаях хронического гастрита были исследованы с помощью иммуногистохимического анализа на свежезамороженных пробах тканей с учетом клинико-патологических переменных величин. В целом, у пациентов, больных раком желудка, встречалась более высокая частота гиперэкспрессии ЕСРК, с-егЪВ-2 и йегЪВ-З, чем у группы больных хроническим гастритом (81 и 43%; 38 и 45%; 35 и 20%, соответственно), однако, статистически значимые различия были установлены только для экспрессии ЕСРК (р = 0,01) (81екак и соавт. 2727-32).

Экспериментально испробованы были несколько терапевтических подходов к нацеливанию на ЕКВВ3. РНК-аптамеры к внеклеточному домену ЕКВВ3 ингибировали NКС-индуцированную гетеродимеризацию ЕКВВ3/ЕКВВ2, фосфорилирование ЕКВВ2 и рост раковых клеток молочной железы МСР7 (Скеп и соавт. 9226-31). Синтетический фактор транскрипции с доменом типа цинковые пальцы, ингибирующий экспрессию гена ЕКВВ3 в клетках А431 плоскоклеточной карциномы, приводил к снижению пролиферации и миграции, и подавление экспрессии ЕКВВ3 имело большее воздействие, чем изменение ЕКВВ2 (Ьипй и соавт. 9082-91). Изомер витамина Е γ-токотриенол ингибировал пролиферацию клеток молочной железы за счет специфической блокировки активации ЕКВВ3 и стимуляции сигнального пути Р13К/АКТ по нисходящей (8атап! и 8у1уек1ег 563-74). Микро-РНК 125а снижала уровень РНК ЕКВВ3 и белка, активацию АКТ и клеточный рост и инвазивность клеток 8КВК3 карциномы молочной железы (8сой и соавт. 1479-86). Снижение уровня ЕКВВ3 с помощью κίΡΗΚ в клетках рака молочной железы устранило их вторичную резистентность к ингибиторам тирозинкиназы и дало возможность осуществления индукции апоптоза (8егдша и соавт. 437-41). Малая РНК (κίΡΗΚ), ингибиторная к ЕКВВ3 или АКТ, подает надежды в качестве терапевтического подхода для лечения аденокарциномы легких (8ккапапйат и соавт. 1847-59).

Сурвивин (В1КС5)

Экспрессия В1КС5 (сурвивина), члена семейства белков-ингибиторов апоптоза (1АР), происходит в повышенном количестве в эмбриональных тканях и различных видах рака человека. В патенте \УО 2004/067023 описываются пептиды, рестриктированные по МНС класса I, образованные из опухолеассоциированного антигена сурвивина, пептиды из которого способны связываться с молекулами I класса НЬА с высокой аффинностью. Предполагается, что сурвивин способен к регуляции как клеточной пролиферации, так и отмирания апоптических клеток. Особенно в глиобластоме обнаруживаются очень высокие уровни экспрессии сурвивина (АпдПеп и соавт., 2008). Предполагается, что гиперэкспрессия сурвивина в глиомах головного мозга может играть важную роль в злокачественной пролиферации, антиапоптозе и ангиогенезе (®кеп и соавт., 2005; Ьш и соавт., 2006). В особенности для глиобластомы, но и также для других видов опухолей экспрессия сурвивина была существенно ассоциирована со степенью злокачественности (с наибольшим уровнем экспрессии сурвивина в глиобластоме) и более короткими общими сроками выживаемости по сравнению с пациентами, у которых были сурвивин-негативные опухоли (Кащуага и соавт, 2003; 8айо и соавт., 2007; ИетаГки и соавт., 2005; Ме11а1 и соавт., 2008; Сгипйа и соавт., 2006; Х1е и соавт., 2006; 8акак1 и соавт., 2002; Скакгауагй и соавт., 2002).

Коровый антиген вируса гепатита В

Для корового белка НВс вируса гепатита В (НВУ) иммуногенные пептиды хорошо известны (Вейо1ей1 и соавт., 1993; ЫушдкЮп и соавт., 1997). Пептид из НВс, состоящий из десяти аминокислот, может быть включен в качестве положительного контроля в противораковые вакцины, основанные на настоя- 20 022743 щем изобретении, для контроля иммунокомпетентности и успешной иммунизации пациентов.

Таблица 6. Связанные с раком функции исходных белков.

Категория < (+) < +; ? означает, что ситуация на данный момент не известна

ПептидыТиМАР НЬА класса I

Пептид ы ШМАР НЬА класса N

Связанные с оаком функции исходных белков ^активность ΙΌΜΑΡ

> Ч £ © ©

СОС2-001

—г ч о о <7\

δ ζΛ Ч 5* о о

* о ό О

С о я ч ил © ©

© о

5МС4-001

РРАР2С-001

ч 40 © ©

с /3 η % © ©

> со ч © ©

Ч ю © ©

В1КС5-002

Онкофетальный белок (ОГ) / Тестикулярный раковый антиген (СТ)

7

ст

ОР

Онкогенез (прохождение клеточного цикла, пролиферация)

4-

?

4-

7

4*

4-

Инвазия опухоли, миграция, метастазы

4-

?

4-

-

7

4-

Связанные с раком сигнальные каскады

По нисходящей ЕСРК

Клеточный цикл (С2/М)

п 2 > э

Я о 1 X ω 2 ГО ч

£

ТСР-Ъеха (усиленный)

[Каскад ЮР) К

г 5 ё

Клеточный цикл

-О

-пит х· Й Й У 2 3 А⁵ -Ч § 1 Л - в §

клеточное деление

Ингибирование апоптоза

Противоапопто гические эффекты

(+)

4-

7

4-

Ангиогенез

-

7

4-

					>
Раковые клетки, подобные стволовым	-				4-	-		(+)	(+)	7		-		4-
Гиперэкспресси я в клетках РЖ	?	4-	4-	4-	(+ )	?	4-	7	7	7	7	4-	4-	4-
Гиперэкспресси я в клетках цругих видов рака	4-	4-	4-	4-	4-	(+)	4-	4-	+	?	4-	4-	4-	4-
Плохой прогноз	4-	4-	4-	4-	+	7	4-		1?	7		4-	4-	4-
Поздние стадии	-	9	4-	9			-		4-	9				4-

Как видно из табл. 6, специалист данной области может легко привести композицию данной патентной заявки в соответствие с пациентом и/или специфической опухолью и выбрать соответствующие опухолеассоциированные пептиды.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения фармацевтическая композиция включает по меньшей мере два пептида, один из которых содержит аминокислотную последовательность в соответствии с 8ЕЦ ГО N0 1, и дополнительно включает пептид, содержащий аминокислотную последовательность в соответствии с 8ЕЦ ГО N0 11.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения фармацевтическая композиция включает по меньшей мере два пептида, причем один содержит аминокислотную последовательность в соответствии с 8ЕЦ ГО N0 1 и аминокислотную последовательность в соответствии с 8ЕЦ ГО N0 2 и/или §ЕЦ ГО N0 11.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения фармацевтическая композиция включает по меньшей мере два пептида, содержащих аминокислотную последовательность в соответствии с 8ЕЦ ГО N0 3 и аминокислотную последовательность в соответствии с 8ЕЦ ГО N0 2 и/или §ЕЦ ГО N0 11.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения фармацевтическая композиция включает по меньшей мере два пептида, содержащих аминокислотную последовательность в соответствии с 8ЕЦ ГО N0 1 и аминокислотную последовательность в соответствии с 8ЕЦ ГО N0 7 и факультативно 8ЕЦ ГО N0 11.

- 21 022743

В предпочтительном варианте осуществления изобретения фармацевтическая композиция включает по меньшей мере два пептида, содержащих аминокислотную последовательность в соответствии с 8ЕД ГО N0 2 и аминокислотную последовательность в соответствии с 8ЕЦ ГО N0 7 и факультативно 8ЕЦ ГО N0 11.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения фармацевтическая композиция включает по меньшей мере два пептида, содержащих аминокислотную последовательность в соответствии с 8ЕД ГО N0 3 и аминокислотную последовательность в соответствии с 8ЕД ГО N0 7 и факультативно 8ЕЦ ГО N0 11.

В еще более предпочтительном воплощении фармацевтическая композиция включает по меньшей мере еще один пептид, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из 8ЕО ГО N0 2 по 8ЕО ГО N0 10 и с 8ЕО ГО N0 11 по 8ЕО ГО N0 22 и 8ЕО ГО N0 24, и/или аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 85% идентична 8ЕЦ ГО N0 2 по ЗЕЦ ГО N0 10 и 8ЕД ГО N0 11 по 8ЕД ГО N0 22 и 8ЕД ГО N0 24, и/или полинуклеотид, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую последовательности с 8ЕД ГО N0 2 по 8ЕД ГО N0 10 и с 8ЕД ГО N0 11 по 8ЕД ГО N0 22 и 8ЕД ГО N0 24, или вариантную аминокислотную последовательность, и фармацевтически приемлемый носитель.

Другие предпочтительные варианты осуществления изобретения включают по меньшей мере 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 12, 13, 14, 15, 16, 17 или 18 пептидов, содержащих аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из 8ЕД ГО N0 1 по 8ЕД ГО N0 10 и с 8ЕД ГО N0 11 по 8ЕД ГО N0 22 и та 8ЕД ГО N0 24, и/или аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 85% идентична последовательности с 8ЕД ГО N0 1 по 8ЕД ГО N0 10, и/или полинуклеотид, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую последовательности с 8ЕД ГО N0 1 по 8ЕД ГО N0 10 и с 8ЕД ГО N0 11 по 8ЕД ГО N0 22 и 8ЕД ГО N0 24, или вариантную аминокислотную последовательность и фармацевтически приемлемый носитель.

Фармацевтическая композиция может дополнительно содержать дополнительные пептиды и/или вспомогательные вещества для большей эффективности, как это будет пояснено ниже.

Вариантной аминокислотной последовательностью данной аминокислотной последовательности изобретатели обозначают, что боковые цепи, например, одного или двух аминокислотных остатков изменены (например, при их замещении боковой цепью другого встречающегося в природе аминокислотного остатка или какой-либо другой боковой цепью), так что пептид по-прежнему способен связываться с молекулой НЬА, по существу, таким же путем, как и пептид, состоящий из данной аминокислотной последовательности. Например, пептид может быть модифицирован таким образом, что он по меньшей мере сохранит, если не улучшит, способность взаимодействовать и связываться с подходящей молекулой МНС, такой как НЬА-А или -ΌΚ, и так что он по меньшей мере сохранит, если не улучшит, способность генерировать активированные ЦТЛ, которые могут распознавать и уничтожать клетки, которые экспрессируют полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, как определено в аспектах данного изобретения. Как может быть извлечено из банка данных, определенные позиции связывающихся с НЬА-А пептидов являются типичными якорными остатками, образующими ключевую последовательность, подходящую к связывающему мотиву НЬА-связывающей бороздки.

Те аминокислотные остатки, которые не обязательны для взаимодействия с Т-клеточным рецептором, могут быть модифицированы замещением другой аминокислотой, чье включение, по существу, не влияет на реактивность Т-клетки и не устраняет связывание с соответствующим МНС. Таким образом, помимо данного условия, пептид по изобретению может быть любым пептидом (в понятие которого изобретатели включают олигопептиды или полипептиды), который включает аминокислотные последовательности или их участок или их вариант, как представлено в настоящем изобретении.

Дополнительно известно, что пептиды, презентированные МНС класса II, образованы коровой последовательностью, имеющей конкретный НЬА-специфический аминокислотный мотив и, факультативно, N и/или С-терминальные удлиняющие сегменты, которые не препятствуют функции коровой последовательности (т.е. считаются нерелевантными для взаимодействия пептида и Т-клетки). N и/или С-терминальные удлиняющие сегменты могут иметь длину, например, от 1 до 10 аминокислот, соответственно. Эти пептиды могут быть использованы как непосредственно для нагрузки молекул МНС класса II, так и последовательность может быть клонирована в векторы в соответствии с описанием ниже. Так как эти пептиды образуют конечный продукт процессинга более длинных пептидов внутри клетки, то более длинные пептиды могут использоваться в равной степени. Пептиды по изобретению могут быть любого размера, но, как правило, они могут иметь молекулярную массу менее чем 100000, предпочтительно менее чем 50000, более предпочтительно менее чем 10000, более предпочтительно менее чем 5000, более предпочтительно менее чем 2500 и, как правило, около 1000 и до 2000. В отношении числа аминокислотных остатков, пептиды по изобретению могут иметь менее чем 1000 остатков, предпочтительно менее чем 500 остатков, более предпочтительно менее чем 100 остатков. Соответственно, в настоящем изобретении предложены также композиции из пептидов и их вариантов, в которых пептид или вариант имеет общую длину между 8 и 100, предпочтительно между 8 и 30, и, наиболее предпочтительно, между 8 и 17, а именно, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 или 16 аминокислот.

- 22 022743

Предпочтительными являются пептиды с коровой последовательностью, выбранной из группы, состоящей из δΕΟ ΙΌ N0 11 по δΕΟ ΙΌ N0 22 и δΕΟ ΙΌ N0 24 с удлиняющими сегментами длиной от 1 до 10 аминокислот на С-конце и/или Ν-конце, более предпочтительно, если общее число данных примыкающих аминокислот составляет от 1 до 12, более предпочтительно от 1 до 10, более предпочтительно от 1 до 8, более предпочтительно от 1 до 6, где примыкающие аминокислоты могут быть распределены в любом соотношении к С-концу и Ν-концу (например, все примыкающие аминокислоты могут быть добавлены к одному концу, или же аминокислоты могут быть добавлены в равном количестве к обоим концам или в любой другой пропорции), при условии, что пептид по-прежнему способен связываться с молекулой НЬА таким же путем, как и указанный пептид в соответствии с любой из последовательностей с δΕΟ ГО N0 11 по δΕΟ ГО N0 22 и δΕΟ ГО N0 24.

В соответствии с этим, варианты, которые индуцируют Т-клеточную перекрестную реакцию с пептидом по изобретению, часто являются вариантами по длине.

Если пептид длиннее, чем около 12 аминокислотных остатков, он непосредственно используется для связывания с молекулой МНС II класса. Предпочтительно, чтобы остатки, которые примыкают к центральному НБА-связывающему участку, по существу, не влияли на способность пептида специфически связываться со связывающей бороздкой молекулы МНС II класса или презентировать пептид ЦТЛ. Тем не менее, как уже было указано выше, преимущество имеет использование более крупных пептидов, в особенности, если они закодированы полинуклеотидом, потому что такие крупные пептиды могут быть разделены на фрагменты подходящими антигенпрезентирующими клетками. Кроме того, примыкающие аминокислоты могут также снижать скорость деградации пептидов ίη νίνο, так что количество фактического пептида, находящегося в распоряжении ЦТЛ, выше по сравнению с пептидом без примыкающих аминокислот.

Также возможно, чтобы эпитопы МНС I класса, хотя они обычно имеют длину между 8-10 аминокислотами, генерировались при процессинге пептидов из более длинных пептидов или белков, включающих истинный эпитоп. Также как и в случае с эпитопами МНС II класса, предпочтительно, чтобы примыкающие остатки удлиненных пептидов-предшественников за и/или перед N и С-концом истинного эпитопа существенно не влияли на презентацию пептида ЦТЛ и не маскировали сайты для протеолитического расщепления, необходимые для получения истинного эпитопа, опосредованного процессингом удлиненного пептида.

Предпочтительными являются пептиды с коровой последовательностью, состоящие из δΕΟ ГО N0 1 по δΕΟ ГО N0 10 и δΕΟ ГО N0 11 с удлиняющими сегментами из 1 до 10 аминокислот на С-и/или N конце, более предпочтительно, если общее число данных примыкающих аминокислот составляет от 1 до 12, более предпочтительно от 1 до 10, более предпочтительно от 1 до 8, более предпочтительно от 1 до 6, где примыкающие аминокислоты могут быть распределены в любом соотношении к С-концу и Оконцу (например, все примыкающие аминокислоты могут быть добавлены к одному концу, или же аминокислоты могут быть добавлены в равном количестве к обоим концам или в любой другой пропорции), при условии, что пептид по-прежнему способен связываться с молекулой НЬА таким же путем, как и указанный пептид в соответствии с любой из последовательностей с δΕΟ ГО N0 1 по δΕΟ ГО N0 10 и δΕΟ ГО N0 11.

Соответственно, в настоящем изобретении предлагаются также пептиды и варианты эпитопов МНС I класса, имеющие общую длину между 8 и 100, предпочтительно между 8 и 30 и наиболее предпочтительно между 8 и 18, а именно 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 или 17 аминокислот.

Разумеется, пептид или вариант в соответствии с настоящим изобретением будет обладать способностью связываться с молекулой МНС I или II класса человека. Связывание пептида или варианта с комплексом МНС может быть проверено методами, известными из уровня техники, например, теми, что описываются в примерах настоящего изобретения или в литературе для различных аллелей МНС II класса (например, νο§1 АВ, КгорЦюГег Н, Ка1Ьаскег Н, Ка1Ьи8 М, Каттешее НО, СоИдам ίΕ, Майт К; Елдаиб ιηοΙίΙΤ, οΓ НБАГОКВ5*0101 апб ΌΚΒ1*1501 тсксикБ бе1^ηеаίеб Ггот 5е1Г-рер1|бе5; ί ^титк 1994; 153(4): 1665-1673; Ма1скегек О, Отт V, δίеνаηον^с δ, Каттещее НО, Лтд О, Ме1т8 А; АпЦукгк οΓ а11е1е-8ресШс οοηί3Λ 8Йе8 οΓ тИша НБАГОК17 кда^в; I Iттиηο1. 1994; 153(3): 1141-1149; Мата δ, δΙιιπιίο1ο Т, Епго МА, Наттег ί, δ^η^дад1^а Р, Nοрреη С, δрадηο1^ О, Маζζ^ В, ВеШ^ М, ^е11аЬοиа Р, РгоШ МР; Ме1агюта се118 ргезеШ а МАОΕ-3 ер!Юре ίο СГО4(+) суЮЮ.Ос Т се118 ίη а88οс^аί^οη \νί11ι Из^^траЕМ^ 1еикοсуίе аниден ΌΚ11; ί Εχρ Меб. 1999; 189(5): 871-876; Наттег ί, Оа1к^1 Р, Βοηο Ε, Кагг К№, Оиеηοί I, Vа18а8шт Р, №ду ЪК, δ^η^дад1^а Р; Рерббе Ьшбшд 8реаПсЦу οΓ НБАГОК4 тο1еси1е8: ^ΠΌΕιΙίοη νίΐίι гкеитаίοί6 айкйЙ8 а88οс^аί^οη; ί Εχρ Меб. 1995 181(5): 1847-1855; Тстрктв ЗМ, Кοίа РА, Мοο^е 6С, ^еи8еη РΕ; А енгортт Γ1иο^ο^ттиηοа88ау Гэг теа8игтд Ьшбшд οΓ аниден ίο с1а88 II МНС д^торг^е^; ί Iттиηο1 Мебюб8. 1993; 163(2): 209-216; Βοуίοη Кб, Εοΐιπτιηη Т, Εοι^ί М, Ка1Ьаскег Н, На1бег Т, Ега1ег Аб, ΩοικΕ ОС, Ье8Не ЭО, Е1ате11 КА, А1ίтаиη ОМ; О1и1апис ааб беса^Ьοxу1а8е Т 1утρЬοсуίе ^е8ροи8е8 а88οс^аίеб \νίΐ1ι 8И8сербЬббу ογ ^е8^8ίаηсе ίο 1уре I б1аЬе1е8: ΗηΗ1\·8ί8 ίη б18еа8е б^8сο^баηί Ιηπιτιη Ι\νίη8, ηοη-οЬе8е б1аЬе11с тюе апб НБА-ЭЦ йашдетс тюе; И ^титк 1998 (12): 1765-1776).

Пептиды, предложенные в настоящем изобретении, могут иметь дополнительные фрагменты аминокислот, находящиеся на N и/или С-конце, которые не обязательно образуют часть пептида, который

- 23 022743 функционирует как истинный эпитоп для молекул МНС, но могут, тем не менее, быть важны для обеспечения эффективного введения пептида в соответствии с настоящим изобретением в клетки (см. выше). В одном варианте осуществления настоящего изобретения пептид настоящего изобретения является слитым белком, который включает, например, 80 Ν-терминальных аминокислот НЬА-ЭК антигенассоциированной инвариантной цепи (р33, в дальнейшем Ιί), полученной из банка данных ΝΟΕΙ, инвентарный номер (СеиВаик Ассеззюп-питЪег) Х00497 (§1гиЫи, М., МасН, В. апД Ьопд, Е.О. ТНе сотр1е!е зециепсе оГ 1Не тКЫА Гог 1Не НЬА-ОК-а88ос1а1еД шуапай сйат геуеаЕ а ро1урерДДе νίΐΐι ап ипи8иа1 КапзтетЪгапе ро1агку ЕМВО ί. 3 (4), 869-872 (1984)).

В настоящем изобретении также предложена фармацевтическая композиция, включающая по меньшей мере один из пептидов настоящего изобретения, где пептиды имеют общую длину между 8 и 100, предпочтительно между 8 и 30, и, особенно предпочтительно, между 8 и 17 или 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 или 16 аминокислот.

Кроме того, пептид или вариант может быть дополнительно модифицирован для улучшения стабильности и/или связывания с молекулами МНС в целях получения более сильного иммунного ответа. Методы для такой оптимизации пептидной последовательности хорошо известны из уровня техники и включают, например, введение реверсированных пептидных или непептидных связей.

Таким образом, в соответствии с другим аспектом в изобретении предложена фармацевтическая композиция, в которой по меньшей мере один пептид или вариант включает непептидные связи.

В реверсированной пептидной связи аминокислотные остатки присоединены не пептидными связями (-СО-ΝΉ-), а пептидная связь реверсируется. Такие ретроинвертированные пептидомиметики могут быть получены методами, известными из уровня техники, например, такими, как описано в работе Мегтеге е! а1. (1997) ί. 1ттипо1. 159, 3230-3237, включенной сюда путем ссылки. Этот принцип охватывает получение псевдопептидов, содержащих изменения, которые охватывают остов, но не ориентацию боковых цепей. Ме/1еге и соавторы (1997) показывают, что эти псевдопептиды пригодны для ответов МНС и Т-хелперных клеток. Ретро-инвертированные пептиды, содержащие связи МН-СО вместо пептидных связей СО-ΝΉ намного более устойчивы к протеолизу.

Непептидной связью является, например, -СН₂-№Н, -СН₂§-, -СН₂СН₂-, -СН=СН-, -СОСН₂-, -СН(ОН)СН₂- и -СН₂§О-. В патенте США 4897445 предложен метод твердофазного синтеза непептидных связей (-СН₂-ЫН) в полипептидных цепях, которые включают полипептиды, синтезированные с использованием стандартной методики, и непептидную связь, синтезированную при реакции аминоальдегида и аминокислоты в присутствии №СНВН₃.

Пептиды, включающие последовательности по изобретению, описанные выше, могут быть синтезированы с дополнительными химическими группами, находящимися на их аминном и/или карбоксильном концах, для увеличения, например, стабильности, биологической доступности и/или аффинности пептидов. Например, гидрофобные группы, такие как карбобензоксильные, данзильные или третбутилоксикарбонильные группы, могут быть добавлены к аминным окончаниям пептидов. Подобным образом, ацетильная группа или 9-фторенилметоксикарбонильная группа может быть введена в аминные окончания пептидов. Кроме того, гидрофобная группа, трет-бутилоксикарбонильная или амидная группа может быть, например, добавлена к карбоксильным окончаниям пептидов.

Далее, все пептиды по изобретению могут быть синтезированы в целях изменения их пространственной конфигурации. Например, может быть использован Ό-изомер одного или более аминокислотных остатков пептида, а не обычный Ь-изомер. Более того, по меньшей мере один из аминокислотных остатков пептидов по изобретению может быть замещен одним из хорошо известных не встречающихся в природе аминокислотных остатков. Изменения, такие как данные, могут служить для повышения стабильности, биологической доступности и/или связывающих свойств пептидов по изобретению.

Подобным образом, пептид или вариант по изобретению может быть модифицирован химическим способом посредством реакции отдельных аминокислот как до, так и после синтеза пептида. Примеры таких модификаций хорошо известны из уровня техники и обобщаются, например, в работе К. ЬипДЪ1аД, СНет1са1 КеадеШъ Гог Рго1ет МоДШсайоп, 3гД еД. СКС Рге88, 20 05, которая включена сюда путем ссылки. Химическая модификация аминокислот включает, но без ограничения, модификацию с помощью ацилирования, амидинирование, пиридоксилирование лизина, восстановительное алкилирование, тринитробензилирование аминных групп 2,4,6-тринитробензолсульфоновой кислотой (ТКВ!?), амидную модификацию карбоксильных групп и сульфгидрильную модификацию с помощью окисления надмуравьиной кислотой цистеина до цистеиновой кислоты, образование ртутных производных, образование смешанных дисульфидов с другими тиоловыми соединениями, реакцию с малеимидом, карбоксиметилирование йодуксусной кислотой или йодацетамидом и карбамоилирование цианатом при щелочном уровне рН, хотя не ограничиваясь ими. В этой связи специалист данной области может проконсультироваться с главой 15 в Сиггеп! РгоЮсоЕ 1п Рго1еш 8с1епсе, ЕДз. СоНдап е! а1. (1оНп \Уйеу & §оп8 ΝΥ 1995-2000) для получения более обширной информации о методах, связанных с химической модификацией белков.

Успешная модификация терапевтических белков и пептидов с РЕС (полиэтиленгликолем), которая часто ассоциируется с увеличением полупериода циркуляции при поперечной сшивке белков с глутаральдегидом, полиэтиленгликольдиакрилатом и формальдегидом используется для приготовления гид- 24 022743 рогелей. Химическая модификация аллергенов для иммунотерапии часто достигается при карбамоилировании цианатом калия.

В целом, пептиды и варианты (по меньшей мере те, что содержат пептидные связи между аминокислотными остатками) могут быть синтезированы, к примеру, Ртοс-полиамидным способом твердофазного пептидного синтеза, как раскрыто у Ьи е( а1. (1981) I. Огд. СЬет. 46, 3433 и в прилагающихся ссылках.

Очистка может быть произведена любой методикой или комбинацией таких методик как рекристаллизация, эксклюзивная хроматография, ионообменная хроматография, хроматография гидрофобного взаимодействия и (обычно) обращено-фазовая высокоэффективная жидкостная хроматография с использованием, к примеру, градиентного разделения в системе ацетонитрил/вода.

Анализ пептидов может быть произведен при использовании тонкослойной хроматографии, электрофореза, в частности, капиллярного электрофореза, твердофазной экстракции (ТФЭ), обращенофазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии, аминокислотного анализа после кислотного гидролиза и масс-спектрометрического анализа при бомбардировке быстрыми атомами (ΡΑΒ), а также масс-спектрометрического анализа ΜΑΣΌΙ и ΕδΙ-Ц-ТОР.

В еще одном аспекте изобретения предложена нуклеиновая кислота (например, полинуклеотид), кодирующая пептид или вариант по изобретению. Полинуклеотид может быть, к примеру, ДНК, кДНК, ПНК, ЦНК, РНК, как одно-, так и/или двухнитевыми; природными или стабилизированными формами полинуклеотидов, таких как, к примеру, полинуклеотиды с фосфоротиоатным остовом, или их комбинациями и может содержать или не содержать интроны при условии, что полинуклеотид кодирует пептид. Разумеется, только пептиды, содержащие встречающиеся в природе аминокислотные остатки, присоединенные природными пептидными связями, могут кодироваться полинуклеотидом. Еще в одном аспекте изобретения предложен вектор экспрессии, способный экспрессировать полипептид в соответствии с изобретением. Векторы экспрессии для различных видов клеток хорошо известны из уровня техники и могут быть выбраны без проведения излишних экспериментов.

Как правило, ДНК вводится в вектор экспрессии, такой как плазмида, с соответствующей ориентацией и корректной рамкой считывания экспрессии. Если необходимо, то ДНК может быть сцеплена с адекватными нуклеотидными последовательностями, обеспечивающими координацию транскрипции и трансляции, распознающимися желательным хозяином, хотя такие контрольные элементы обычно имеются в векторе экспрессии. Вектор вводится затем хозяину стандартными способами. С руководством можно ознакомиться, к примеру, в работе δαιηόΐΌοΚ еί а1 (1989) ΜοΚαι1;·π Οοηίη§, Α ίαόοπιΙοίΎ Μαηυαΐ, Οοΐά δρπη§ ^Λογ ί/Λοη-Κοιν, Сб1б δρπη§ Ηа^Ьο^, ΝΥ.

В особенно предпочтительном варианте осуществления изобретения, однако, фармацевтическая композиция включает по меньшей мере два пептида, состоящих из аминокислотных последовательностей в соответствии с δΕΟ ΙΌ ΝΟ 1 по δΕΟ ΙΌ ΝΟ 12.

Оптимальное количество каждого пептида, включаемого в вакцину, и оптимальная схема дозировки может быть определена специалистом данной области без проведения излишних экспериментов. Например, пептид или его вариант может приготавливаться для внутривенной (ί. ν.) инъекции, подкожной (к. с.) инъекции, внутрикожной (ί. б.) инъекции, внутрибрюшинной (ί. р.) инъекции, внутримышечной (ί. т.) инъекции. Предпочтительные пути введения пептидной инъекции - к.с, 1.б., 1.р., 1.т. и ί.ν.

Предпочтительными путями введения инъекции ДНК являются 1.б., 1.т., к.с, 1.р. и ί.ν. Вводиться могут дозы, к примеру, между 1 и 500 мг, и 50 мкг и 1,5 мг, предпочтительно от 125 до 500 мкг пептида или ДНК, в зависимости от соответствующего пептида или ДНК. Дозы в данных пределах успешно использовались в предыдущих клинических исследованиях (ВгигаЮд ΡΡ, Αатба1 δ, О^е^ίкеη ΜΚ, 1<уа1Ьепп О, ΜαΛο№κΗ-θΓ™κιυ6 С1, δνе I, ИугЬаид Μ, ТгасЬке1 δ, ΜοΙΚγ Μ, Епккеи ΙΑ, Оаибетаск О; ТеЦтегаке рерПбе λ/κάη-Κίοη: а рЬаке Ι/ΙΙ к(ибу ίη раРеШк \\ЬЬ ηοη-ктаЬ се11 Ьтд с;тсег; Сансе!· Ιιηιηιιηοΐ IттиηοίЬе^. 2006; 55(12):1553-1564; Μ. δΡ-Όι^ι; Α. δίеηζ1, Ρ. Υ. П1ейгсЬ, Т. Е^еп Α. НаТегкатр, I. Веск, Α. Μауе^, δ. ХУаНеи Н. δί^ΐκ ί. РпксЬ, С. О. δ^Γ; Αη οреη 1аЬе1 к(ибу ίο еνа1иаίе (Ье ка1с(у апб ^ттиηοдеη^с^ίу οί (Ье рерббе Ьакеб сапсег уассте ΙΜΑ901, ΑδΟΟ тее(тд 2007; Αδκίπκί Νο 3017).

Фармацевтические композиции, предложенные в изобретении, могут быть составлены так, что выбор, число и/или количество пептидов, присутствующих в композиции является/являются ткане-, раковои/или пациентспецифической/ими. Например, руководством для точного отбора пептидов могут служить профили экспрессии родительских белков в данной ткани во избежание побочных эффектов. Выбор может зависеть от конкретного вида рака, от которого страдает пациент, которому предназначено лечение, в равной степени, как и от статуса заболевания, ранних схем лечения, иммунного статуса пациента и, естественно, от Η^Α-гаπлотиπа пациента. Кроме того, вакцина в соответствии с изобретением может содержать индивидуализированные компоненты, соответствующие личным потребностям отдельного пациента. Примерами являются различные количества пептидов в соответствии с экспрессией связанных с ними ТАА у конкретного пациента, нежелательными побочными эффектами в связи с аллергиями или другими видами лечения и согласованием для вторичного лечения, следующего за первым циклом или схемой лечения.

Для композиции, предназначенной для использования в качестве вакцины против глиобластомы,

- 25 022743 например, будут игнорироваться пептиды, родительские белки которых экспрессированы в больших количествах в нормальных тканях, или они будут присутствовать в малых количествах в композиции по изобретению. С другой стороны, если известно, что опухоль пациента экспрессирует большие количества конкретного белка, то соответствующая фармацевтическая композиция для лечения данного вида рака может быть представлена в больших количествах и/или может включать более одного пептида, специфичного для данного конкретного белка или сигнального пути данного белка. Специалист данной области будет способен выбрать предпочтительные комбинации иммуногенных пептидов при проверке, например, популяции Т-клеток ш νίΙΐΌ в равной степени, как их эффективности и общего присутствия, пролиферации, аффинности и размножения конкретных Т-клеток для конкретных пептидов, и функциональных свойств Т-клеток, например, при анализе выработки ШЫ-гамма (см. также примеры ниже). Обычно наиболее эффективные пептиды комбинируются затем в состав вакцины в соответствии с целями, описанными выше.

Подходящая вакцина будет предпочтительно содержать от 1 до 20 пептидов, более предпочтительно 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 различных пептидов, еще более предпочтительно 6, 7, 8, 9, 10 11, 12, 13 или 14 различных пептидов и, наиболее предпочтительно, 10, 11, 12, 13 или 14 различных пептидов. Длина пептида для применения в вакцине против рака может быть любой подходящей длиной, как это раскрыто в контексте данного изобретения. В частности, он может быть подходящим пептидом из 9 аминокислотных остатков или подходящим пептидом из 8 или 9 или 10 или 11 аминокислотных остатков или 12, 13, 14 или 15 аминокислотных остатков. Более длинные пептиды могут быть также подходящими; пептиды из 9 или 10 аминокислотных остатков, как описано в приложенных Таблицах 4 и 5, являются предпочтительными для пептидов МНС I класса, в то время как 12-15 аминокислотных остатков предпочтительны для пептидов МНС II класса.

Пептид(ы) представляет(ют) собой вакцину против опухоли или рака. Она может вводиться непосредственно пациенту в пораженный орган или системно, или вноситься ех νί\Ό в клетки, полученные от пациента, или в человеческую клеточную линию, которые затем могут вводиться пациенту или использоваться 1п ν^ι^ο для селекции субпопуляции из иммунных клеток, полученных от пациента, которые после этого вновь вводятся пациенту.

Пептид может быть, по существу, чистым или комбинированным с иммуностимулирующим адъювантом (см. ниже) или использоваться в комбинации с иммуностимулирующими цитокинами или может вводиться с подходящей системой доставки, например, липосомами. Пептид может быть также конъюгирован с подходящим носителем, таким как гемоцианин фиссуреллы (КЬН) или маннан (см. заявку \У0 95/18145 и Ьопдепескег е1 а1 (1993) Апп. ΚΥ Асай. 8ск 690,276-291). Пептид может быть также меченым или быть слитым белком или гибридной молекулой. Пептиды, последовательность которых представлена в настоящем изобретении, как ожидается, стимулируют ί'Ό4 Т-клетки или СЭ8 ЦТЛ. Тем не менее, стимуляция более эффективна в присутствии поддержки, предоставляемой Т-клетками, положительными для противоположного СО. Таким образом, для эпитопов МНС II класса, которые стимулируют СЭ4 Тклетки, партнеры в слиянии или участки гибридной молекулы надлежащим образом предоставляют эпитопы, которые стимулируют СО8-положительные Т-клетки. С другой стороны, для эпитопов МНС I класса, которые стимулируют ί'Ό8 ЦТЛ, партнер в слиянии или участки гибридной молекулы надлежащим образом предоставляют эпитопы, которые стимулируют СО4-положительные Т-клетки. СЭ4- и СИ8-стимулирующие эпитопы хорошо известны из уровня техники и включают те, что были идентифицированы в настоящем изобретении.

Фармацевтически приемлемые носители хорошо известны и обычно представляют собой жидкости, в которых приготавливается активное терапевтическое вещество. Носитель обычно не обеспечивает состав никакой фармакологической активностью, хотя он может обеспечивать химическую и/или биологическую стабильность, характеристики высвобождения и т.п. Примеры составов рассматриваются, например, в работе А1Гопко К. Сеппаго. КетшдЮп: ТНе Баепсе апй РтасБсе оГ РЬаттасу, 201Н ЕйШоп. ВаШтоте, ΜΌ: ЫрршсоЧ ХУППатк & ХУПктк, 2000 и включают, но без ограничения, физиологический раствор, воду, воду с буфером, 0,3% глицин, гиалуроновую кислоту, глюкозу и т.п. Недавно было обнаружено, что определенные жировые эмульсии, которые в течение многих лет использовались для внутривенного питания людей, могут также выступать в роли носителя для пептидов. Два примера таких эмульсий представляют собой имеющиеся в продаже жировые эмульсии, известные как Интралипид и Липофундин. Интралипид является зарегистрированной торговой маркой фирмы КаЫ РЬаттааа, Швеция, и представляет собой жировую эмульсию для внутривенного питания и описывается в патенте США 3 169 094. Липофундин - это зарегистрированная торговая марка фирмы В. Вгаип Μе1киηдеη. Германия. Обе эмульсии в качестве жира содержат масло соевых бобов (100 или 200 г на 1000 мл дистиллированной воды: 10% или 20%, соответственно). Фосфолипиды яичного желтка используются в качестве эмульгатора в Интралипиде (12 г/л дистиллированной воды) и лецитин яичного желтка - в Липофундине (12 г/л дистиллированной воды). Изотоничность является результатом добавления глицерина (25 г/л) как в Интралипид, так и в Липофундин.

Чтобы вызвать иммунный ответ, обычно необходимо включить адъюванты, что приводит к большей иммуногенности композиции. Таким образом, в предпочтительном варианте осуществления изобре- 26 022743 тения фармацевтическая композиция включает дополнительно по меньшей мере один подходящий адъювант.

Подходящие адъюванты включают, но без ограничения, 1018 ^δ, соли алюминия, АтрПуах®, Αδ 15, ВСО, СР-870,893, СрО7909, СуаΑ, бδ^IМ, флагеллин или лиганды ТЬК5, полученные из флагеллина, лиганд РЬТЗ, ОМ-ϋδΡ, Ю30, Ю31, имиквимод (ΑΣΌΑΚΑ®), резиквимод, ПпиРас! IМΡ321, интерлейкины, такие как ИЛ-2, ИЛ-13, ИЛ-21, интерферон-альфа или бета или их пегилированные производные, К Ра1сН, ^δ, IδСΟМΑΤКIX, иммуностимулирующие комплексы КСОМ, биОтипте, ЫроУас, МЛБР2, МР59, монофосфорил липид А, Монтанид ^δ 1312, Монтанид !δΑ 206, Монтанид !δΑ 50У, Монтанид ΚΑ^Γ эмульсии вода в масле и масло в воде, ОК-432, ОМ-174, ОМ-197-МР-ЕС, ΟΝΤΑΚ, Ο8рΑ, векторная система ΡерΤе1®, основанные на поли(лактид когликолиде) [РЬО] и декстране микрочастицы, талактоферрин δΚΠ72, виросомы и другие вирусоподобные частицы, ΥΡ-17Ό, УЕОР бгар, К848, бетаглюкан, Рат3Сук, стимулон Α^и^1а Οδ21, который получают из сапонина, микобактериальные экстракты и синтетические имитаторы бактериальных клеточных стенок и другие запатентованные адъюванты, такие как ЭеЮ.х компании КтЫ, Οιιί1 или δире^Γο5. Предпочтительными адъювантами являются такие как адъювант Фрейнда или ОМ-ϋδΡ. Несколько иммунологических адъювантов (например, МБ59), специфических для дендритных клеток, и их приготовление были описаны ранее (Αисοиΐи^^е^ и соавт., 2001; Α11^8οη и Кгитте1, 1995). Также могут использоваться цитокины. Несколько цитокинов были непосредственно соотнесены с влиянием на миграцию дендритных клеток к лимфоидным тканям (например, ΤΝΡальфа), ускоряя созревание дендритных клеток до эффективных, презентирующих антиген Тлимфоцитам, клеток (например, ОМ-ϋδΡ, ИЛ-1 и ИЛ-4) (патент США 5 849 589, отдельно включенный сюда в полном объеме путем ссылки) и действуя как иммуноадъюванты (например, ИЛ-12, ИЛ-15, ИЛ23, ИЛ-7, ШЫ-альфа, ШЫ-бета) (ОаЬгНоОсН и соавт. 1996).

Об иммуностимулирующих олигонуклеотидах СрО также сообщалось, что они усиливают эффекты адъювантов в составе вакцин. Теоретически не связанные, СрО-олигонуклеотиды при активации врожденной (не приобретенной) иммунной системы действуют с помощью ШН-подобных рецепторов (ΤΓΚ), в основном ΤΗΚ9. Вызванная СрО активация ΤΗΚ9 усиливает антиген-специфические гуморальные и клеточные ответы на широкий спектр антигенов, включая пептидные или белковые антигены, живые или убитые вирусы, вакцины из дендритных клеток, аутологичные клеточные вакцины и полисахаридные конъюгаты как в профилактических, так и терапевтических вакцинах. Более важно то, что улучшается созревание и дифференциация дендритных клеток, приводя к повышенной активации Хп-клеток и интенсивной выработке цитотоксических Т-лимфоцитов (ЦТЛ) даже при отсутствии помощи СИ4 Тклеток. Активация Τ_Η1, вызванная стимуляцией ΤΓΚ9, сохраняется даже в присутствии вакцинных адъювантов, таких как квасцы или неполный адъювант Фрейнда (ΓΡΑ), которые обычно способствуют активации Τ_Η2. СрО-олигонуклеотиды проявляют даже большую адъювантную активность, если они входят в состав или вводятся в организм вместе с другими адъювантами или в таких составах как микрочастицы, наночастицы, липидные эмульсии или подобных составах, которые в особенности необходимы для инициации сильного ответа, если антиген относительно слаб. Они также ускоряют иммунную реакцию и позволяют снизить дозы антигена приблизительно на два порядка в сравнении с ответами антитела на полную дозу вакцины без СрО в некоторых экспериментах (Кпед, 2006). В патенте США 6406705 В1 описывается комбинированное применение СрО-олигонуклеотидов, адъювантов, не включающих нуклеиновые кислоты, и антигена для вызывания антиген-специфического иммунного ответа. Антагонистом СрО ΤΓΚ9 является бδ^IМ (иммуномодулятор со структурой типа двуцепочечный стебель-петля) компании Мο1οдеη (Берлин, Германия), который является предпочтительным компонентом фармацевтической композиции настоящего изобретения. Также могут быть использованы другие молекулы, связывающиеся с ΤΓΚ, такие как РНК, связывающаяся с ΤΓΚ 7, ΤΓΚ 8 и/или ΤΓΚ 9.

Другие примеры пригодных к использованию адъювантов включают, но без ограничения, химически модифицированные СрО (например, СрК, [бега), аналоги бкРНК, такие как ро1у(ИС), и их производные (например, Αтр1^Оеη®, НШопо1®, поли-ОСЬС), поли(Ю-К), поли(ГС12и), бактериальные ДНК или РНК, отличные от СрО, а также иммуноактивные малые молекулы и антитела, такие как циклофосфамид, сунитиниб, бевацизумаб, целебрекс, ΝΗΧ-4016, силденафил, тадалафил, варденафил, сорафениб, темозоломид, темсиролимус, ХЬ-999, СР-547632, пазопаниб, УΕОΡ Τη-ηι, ΖΌ2171, ΑΖΌ2171, анти€0^4, другие антитела, нацеленные на основные структуры иммунной системы (например, антитела к СИ40, ΤОΡ-бета, рецептору ΤΝΡ-альфа) и δС58175, которые могут действовать терапевтически и/или как адъюванты. Количества и концентрации адъювантов и добавок, пригодных для использования в контексте настоящего изобретения, могут быть легко определены опытным специалистом без проведения излишних экспериментов.

Предпочтительными адъювантами являются имиквимод, резимиквимод, ОМ-СδΡ, циклофосфамид, сунитиниб, бевацизумаб, интерферон-альфа, СрО-олигонуклеотиды и производные, поли-(ГС) и производные, РНК, силденафил и составы из твердых частиц с РЬО или виросомами.

В предпочтительном варианте осуществления фармацевтической композиции в соответствии с изобретением адъювант выбран из группы, состоящей из колониестимулирующих факторов, таких как гра- 27 022743 нулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (ОМ-С8Р, сарграмостим), имиквимод, резиквимод и интерферон-альфа.

В предпочтительном варианте осуществления фармацевтической композиции в соответствии с изобретением адъювантом является имиквимод и резиквимод.

В предпочтительном варианте осуществления фармацевтической композиции в соответствии с изобретением адъювантом является комбинация из ОМ-С8Р и имиквимода.

Композиции настоящего изобретения могут быть использованы для парентерального введения, такого как подкожное, внутрикожное, внутримышечное, внутрибрюшинное или для орального введения. Для этого пептиды и факультативно другие молекулы растворяются или суспендируются в фармацевтически приемлемом, предпочтительно водном носителе. Помимо того, композиция может содержать вспомогательные вещества, такие как буферы, связующие агенты, балластные агенты, разбавители, ароматизаторы, смазывающие вещества и т.д. Пептиды могут быть также введены вместе с иммуностимулирующими веществами, такими как цитокины. Пространный список вспомогательных веществ, которые могут быть использованы в такой композиции, может быть взят, например, из работы А. КЪЪе, НапбЬоок оГ РЬаттасеибса1 Ехс1р1еп!8, 3^гб Еб., 2000, Атебсап РЬаттасеибса1 Аввоиабоп апб ркагтасеибса1 рге88. Композиция может применяться для предупреждения, профилактики и/или лечения аденоматозных или раковых заболеваний, предпочтительно СКС.

Предпочтительные составы могут быть взяты, например, из ЕР 2113253.

Цитотоксические Т-клетки (ЦТЛ) распознают антиген в форме пептида, связанного с молекулой МНС, а не интактный чужеродный антиген сам по себе. Сама молекула МНС находится на клеточной поверхности антигенпрезентирующей клетки. Таким образом, активация ЦТЛ возможна только, если имеется в наличии тримерный комплекс из пептидного антигена, молекулы МНС и АПК. Соответственно, иммунный ответ может быть усилен, если для активации ЦТЛ использован не только пептид, а если, кроме того, добавлены АПК с соответствующей молекулой МНС.

Поэтому в предпочтительном варианте осуществления фармацевтическая композиция в соответствии с настоящим изобретением дополнительно содержит по меньшей мере одну антигенпрезентирующую клетку.

Антигенпрезентирующая клетка (или клетка-стимулятор) обычно имеет молекулу МНС I или II класса на своей поверхности и в одном варианте осуществления является, по существу, не способной самостоятельно нагружать на молекулу МНС I или II класса выбранный антиген. Как более подробно описано ниже, молекула МНС I или II класса может быть легко нагружена выбранным антигеном ш уНго.

Предпочтительно, если в клетке млекопитающих отсутствует или имеется пониженный уровень или пониженная функция пептидного транспортера ТАР. Подходящие клетки, в которых не хватает пептидного транспортера ТАР, включают Т2 - не способную нагружать пептидом клеточную линию человека, которая имеется в наличии в Атебсап Туре СиИите Со11есбоп, 12301 Ратк1а^п Эпуе, КоскуШе, Магу1апб 20852, США под каталоговым № СКЬ 1992; клеточные линии, в которых не хватает ТАР, такие как Т2, могут быть использованы в качестве АПК, и из-за недостатка ТАР практически все пептиды, презентируемые МНС I класса, будут пептидами для загрузки извне пустых молекул МНС I класса этих клеточных линий, следовательно, все эффекты будут определенно приписываться использованным пептидам.

Предпочтительно, чтобы антигенпрезентирующие клетки являлись дендритными клетками. Подходящим образом, дендритные клетки являются аутологичными дендритными клетками, на которые нагружен антигенный пептид. Антигенный пептид может быть любым подходящим антигенным пептидом, который вызывает адекватный Т-клеточный ответ. Т-клеточная терапия с использованием аутологичных дендритных клеток с нагруженными пептидами из опухолеассоциированного антигена раскрывается в работе МигрЬу е! а1 (1996) ТЬе Рго51а1е 29, 371-380 и Т)иа е! а1 (1997) ТЬе Рго51а1е 32, 272-278.

Таким образом, в предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения в фармацевтическую композицию, содержащую по меньшей мере одну антигенпрезентирующую клетку с введенным в нее импульсным методом или нагруженным на нее пептидом, к примеру, методом, представленном в примере 5.

В качестве альтернативы, антигенпрезентирующая клетка включает экспрессионную конструкцию, кодирующую пептид. Полинуклеотид может быть любым соответствующим полинуклеотидом, и, предпочтительно, чтобы он был способен к трансдукции дендритной клетки, таким образом, приводя к презентации пептида и индукции иммунитета.

Представляет удобство то, что нуклеиновая кислота по изобретению может быть включена в вирусный полинуклеотид или вирус. Например, показано, что аденовирус-трансдуцированные дендритные клетки проявляли способность индуцировать антиген-специфический противоопухолевый иммунитет по отношению к МИС1 (см. Оопд е! а1. (1997) Оепе ТЬег. 4, 1023-1028). Подобным образом могут быть использованы системы, основанные на аденовирусе (см., например, \Уап е! а1 (1997) Нит. Оепе ТЬег. 8, 1355-1363); могут быть использованы ретровирусные системы (КосЬ е! а1 (2006) 1. Ехр. Меб. 186, 12131221 и §гаЪо1с8 и соавт. (1997), также может быть использован опосредованный частицами крови перенос в дендритные клетки (Тибпд и соавт. (1997) Еиг. 1. Iттиηо1. 27, 2702-2707); а также может быть использована РНК (АвЫеу е! а1 (2007) 1. Ехр. Меб. 186, 1177-1182).

- 28 022743

В целом, фармацевтическая композиция по изобретению, содержащая (а) нуклеиновую(ые) кислоту(ы) по изобретению, может вводиться подобным образом, как и те, что содержат пептид(ы) по изобретению, например, внутривенно, внутриартериально, внутрибрюшинно, внутримышечно, внутрикожно, внутрь опухоли, орально, дермально, назально, буккально, ректально, вагинально, с помощью ингаляции или посредством топического введения.

По причине действия механизмов уклонения опухоль часто вырабатывает резистентность к медикаменту. Резистентность к медикаменту может появиться во время лечения, и она проявляется в метастазах и рецидивах опухоли. Во избежание таковой медикаментозной резистентности опухоль обычно лечат комбинацией медикаментов, и для лечения метастазов и опухоли, возвращающейся повторно после периода ремиссии, часто требуется комбинация, отличающаяся от первой. Поэтому в одном аспекте изобретения фармацевтическая композиция вводится в соединении со вторым противораковым средством. Второе противораковое средство может вводиться до, после или одновременно с фармацевтической композицией по изобретению. Одновременное введение может быть достигнуто, например, при смешивании фармацевтической композиции по изобретению со вторым противораковым средством при условии совместимости их химических свойств. Другая возможность для одновременного введения - это введение композиции и противоракового средства в один и тот же день, независимо от способа введения, так что фармацевтическая композиция по изобретению может быть, например, инъецирована, в то время как второе противораковое средство вводится, например, орально. Фармацевтическая композиция и второе противораковое средство могут также вводиться в рамках одного и того же курса лечения, но в разные дни и/или в рамках отдельных курсов лечения.

В другом аспекте настоящего изобретения предложен метод лечения или предупреждения рака у пациента, включающий введение пациенту терапевтически эффективного количества любой из фармацевтических композиций по изобретению.

Терапевтически эффективным количеством будет количество, достаточное для вызывания иммунного ответа, в частности, активации субпопуляции ЦТЛ. Специалист данной области может легко определить, будет то или иное количество эффективным, при использовании стандартных иммунологических методов, таких как те, что приводятся в примерах к настоящему описанию. Другим способом мониторинга эффекта от конкретного количества фармацевтической композиции является наблюдение за ростом опухоли, подвергающейся лечению, и/или ее рецидива.

В особенно предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения фармацевтическая композиция применяется в виде противораковой вакцины.

Композиция, содержащая пептиды или кодирующие пептиды нуклеиновые кислоты, может также составлять вакцину против опухоли или рака. Она может вводиться непосредственно пациенту в пораженный орган или системно, или вноситься ех νίνο в клетки, полученные от пациента, или в человеческую клеточную линию, которые затем могут вводиться пациенту, или использоваться ίη νίίτο для селекции субпопуляции из иммунных клеток, полученных от пациента, которые после этого вновь вводятся пациенту.

Композиция по изобретению может использоваться в методе лечения или в качестве вакцины против рака. Рак может быть карциномой предстательной железы, карциномой полости рта, плоскоклеточной карциномой полости рта (08СС), острой миелоидной лейкемией (АМЬ) (Οίαη и соавт., 2009), вызываемой Н. ργίοτί МЛЬТ-лимфомой (Вапецее и соавт., 2000), карциномой толстого кишечника/колоректальным раком, глиобластомой, немелкоклеточным раком легких (Х8СЕС). карциномой шейки матки, раком молочной железы человека, раком предстательной железы, раком толстого кишечника, раком поджелудочной железы, протоковой аденокарциномой поджелудочной железы, раком яичника, гепатоклеточной карциномой, раком печени, опухолями головного мозга различных фенотипов; лейкемиями, такими как острая лимфобластная лейкемия, АЕЬ; раком легких, саркомой Юинга, эндометриальным раком, плоскоклеточной карциномой головы и шеи, эпителиальным раком гортани, карциномой пищевода, карциномой ротовой полости, карциномой мочевого пузыря, карциномами яичника, почечноклеточной карциномой, атипической менингиомой, папиллярной карциномой щитовидной железы, опухолями головного мозга, карциномой слюнного протока, экстранодальными Т/ПК-клеточными лимфомами, нехожкинскими лимфомами и злокачественными солидными опухолями легких и молочной железы, предпочтительным видом рака является рак желудка.

В наиболее предпочтительном варианте осуществления метода лечения или вакцины в соответствии с изобретением вакцина является противоопухолевой вакциной из нескольких пептидов для лечения РЖ. Предпочтительно, чтобы вакцина включала комплекс опухолеассоциированных пептидов, выбранных из последовательностей с 8ЕЦ ГО N0 1 по 8ЕЦ ГО N0 11, которые локализованы и были идентифицированы на клетках первичного РЖ. Этот комплекс включает пептиды НЬА класса I и II. Пептидный комплекс может также содержать по меньшей мере один пептид, например, из корового антигена НВУ (8ЕЦ ГО 23), используемый в качестве пептида положительного контроля, служащего как иммунный маркер для проверки эффективности внутрикожного введения. В одном конкретном варианте осуществления вакцина состоит из 11 отдельных пептидов (в соответствии с 8ЕЦ ГО N0 1 по 11) с массой каждого пептида от около 1500 мкг до около 75 мкг, предпочтительно от около 1000 мкг до около 175 мкг, и бо- 29 022743 лее предпочтительно от около 500 мкг до около 600 мкг, и наиболее предпочтительно около 578 мкг каждого пептида, причем все они могут быть очищены ВЭЖХ (высокоэффективной жидкостной хроматографией) и ионообменной хроматографией и имеют вид белого или грязно-белого порошка. Лиофилизат предпочтительно растворяют в гидрокарбонате натрия и используют для внутрикожной инъекции в течение 30 мин после восстановления при комнатной температуре. В соответствии с настоящим изобретением предпочтительные количества пептидов могут варьироваться между приблизительно 0,1 и 100 мг, предпочтительно между приблизительно 0,1 и 1 мг и наиболее предпочтительно между приблизительно 300 и 800 мкг на 500 мкл раствора. Понятие приблизительно в контексте настоящего изобретения подразумевает +/- 10 процентов заданного значения, если не указано другое. Специалист данной области будет способен установить фактическое количество пептида для использования, исходя из нескольких факторов, таких как, например, иммунный статус отдельного пациента и/или количество ΤυΜΑΡ, который презентируется в конкретном виде рака. Пептиды настоящего изобретения могут быть предложены в других подходящих формах (стерильные растворы и т.д.) вместо лиофилизата.

Фармацевтические композиции включают пептиды как в свободной форме, так и в форме фармацевтически приемлемой соли.

Используемое в контексте данного изобретения понятие фармацевтически приемлемая соль относится к производным раскрытых пептидов, причем пептид модифицирован путем получения кислых или основных солей вещества. Например, кислые соли получают из свободного основания (обычно, где нейтральная форма лекарственного средства имеет нейтральную группу -ΝΗ2) с применением реакции с подходящей кислотой. Подходящие кислоты для получения кислых солей включают как органические кислоты, например, уксусную кислоту, пропионовую кислоту, гликолевую кислоту, пировиноградную кислоту, щавелевую кислоту, яблочную кислоту, малоновую кислоту, янтарную кислоту, малеиновую кислоту, фумаровую кислоту, винную кислоту, лимонную кислоту, бензойную кислоту, коричную кислоту, миндальную кислоту, метансульфокислоту, этансульфокислоту, п-толуолсульфокислоту, салициловую кислоту и им подобные, так и неорганические кислоты, например, соляную кислоту, бромистоводородную кислоту, серную кислоту, азотную кислоту, фосфорную кислоту и подобные. И наоборот, основные соли кислотных составляющих, которые могут присутствовать на пептиде, приготовливают при использовании фармацевтически приемлемого основания, такого как гидроксид натрия, гидроксид калия, гидроксид аммония, гидроксид кальция, триметиламин или подобные.

В одном особенно предпочтительном варианте осуществления фармацевтические композиции включают пептиды в виде солей уксусной кислоты (ацетаты), аммония или соляной кислоты (хлориды).

В другом воплощении изобретения фармацевтическая композиция настоящего изобретения может включать сахара, сахарные спирты, аминокислоты, такие как глицин, аргинин, глютаминовую кислоту и другие в качестве формирователей остова. Сахара могут быть моно-, ди- или трисахаридами. Эти сахара могут быть использованы в отдельности, в равной степени как и в комбинации с сахарными спиртами. Примеры сахаров включают глюкозу, маннозу, галактозу, фруктозу или сорбозу в качестве моносахаридов; сахарозу, лактозу, мальтозу или трегалозу в качестве дисахаридов и раффинозу в качестве трисахарида. Сахарный спирт может быть, например, маннитозой. Предпочтительными ингредиентами являются сахароза, лактоза, мальтоза, трегалоза, маннит и/или сорбит и, более предпочтительно, маннитол.

Кроме того, фармацевтические композиции настоящего изобретения могут включать физиологически хорошо переносимые вспомогательные вещества (см. НапйЬоок о£ ΡЬа^тасеиΐ^са1 Ехс1р1еп1к, 5-ое изд., под ред.: Каутопй Коте, Ρаи1 δΐ^δΐ^ν апй δ^аη О\уеп, ΡЬа^тасеиΐ^са1 Ριόκκ (2006)), такие как антиоксиданты, подобные аскорбиновой кислоте или глутатиону; консерванты, такие как фенол, м-крезол, метил- или пропилпарабен, хлорбутанол, тиомерсал или бензальконий хлорид; стабилизатор, формирователь остова, такие как сахароза, лактоза, мальтоза, трегалоза, маннитоза, маннит и/или сорбит, маннит и/или лактоза и солюбилизатор, такие как полиэтиленгликоли (ΡΕΟ), т.е., ΡΕΟ 3000, 3350, 4000 или 6000; или циклодекстрины, например, гидроксипропил-бета-циклодекстрин, сульфобутилэтил-бета-циклодекстрин или гамма-циклодекстрин; или декстраны или полоксамеры, например, полоксамер 407, полоксамер 188 или Твин 20, Твин 80. В предпочтительном варианте осуществления фармацевтические композиции настоящего изобретения включают один или более хорошо переносимых вспомогательных веществ, выбранных из группы, состоящей из антиоксидантов, формирователей остова и стабилизаторов.

Приемлемый диапазон значений рН находится между 2-12 для внутривенного и внутримышечного введения, но для подкожного введения диапазон снижается до 2,7-9,0, так как скорость растворения ш νί\Ό понижена, приводя к увеличению вероятности возникновения раздражения на месте инъекции. δίΓΚΙΚν КоЬей О., ГЬагт. Кек., 21, N0:2, 201-230 (2004).

Фармацевтический препарат по настоящему изобретению, содержащий пептиды и/или нуклеиновую(ые) кислоту(ы) в соответствии с изобретением, водится пациенту, страдающему аденоматозным или раковым заболеванием, ассоциированным с соответствующим пептидом или антигеном. Тем самым может быть инициирован иммунный ответ, опосредованный Т-клетками.

Предпочтительна фармацевтическая композиция в соответствии с изобретением, в которой количество (в особенности опухолеассоциированного(ых)) пептида(ов), нуклеиновых(ой) кислот(ы) в соответствии с изобретением или вектора(ов) экспрессии в соответствии с изобретением в том виде, в котором

- 30 022743 они представлены в указанной композиции, являе(ю)тся ткане-, раково- и/или пациент-специфическим.

В другом варианте осуществления изобретения вакцина является вакциной на основе нуклеиновой кислоты. Известно, что инокуляция вакциной на основе нуклеиновой кислоты, такой как ДНК-вакцина, кодирующей полипептид, приводит к Т-клеточному ответу. Она может вводиться непосредственно пациенту, в пораженный орган или системно, или вноситься ех νίνο в клетки, полученные от пациента, или в человеческую клеточную линию, которые затем могут вводиться пациенту или использоваться ίη νίίτο для селекции субпопуляции из иммунных клеток, полученных от пациента, которые после этого вновь вводятся пациенту. Если нуклеиновая кислота введена в клетки ίη νίίτο, то может быть полезно, чтобы клетки были трансфецированными, чтобы совместно экспрессировать иммуностимулирующие цитокины, такие как интерлейкин-2 или ОМ-СЗР. Нуклеиновая(ые) кислота(ы) может/могут быть, по существу, чистыми или комбинированными с иммуностимулирующим адъювантом или использоваться в комбинации с иммуностимулирующими цитокинами или вводиться с подходящей системой доставки, например, липосомами. Вакцина на основе нуклеиновой кислоты может также вводиться с адъювантом, таким как те, что описывались выше для пептидных вакцин. Предпочтительно, если вакцина на основе нуклеиновой кислоты вводится без адъюванта.

Полинуклеотид может быть, по существу, чистым или содержаться в подходящем векторе или системе доставки. Подходящие векторы и системы доставки включают вирусные системы, такие как те, что основаны на аденовирусе, вирусе коровьей оспы, ретровирусах, вирусе герпеса, аденоассоциированном вирусе или гибридах, содержащих элементы более чем одного вируса. Невирусные системы доставки включают катионные липиды и катионные полимеры, хорошо известные из уровня техники в области доставки ДНК. Также может быть использована физическая доставка, такая как посредством генной пушки. Пептид или закодированный нуклеиновой кислотой пептид может быть слитым белком, например, с эпитопом из столбнячного анатоксина, который стимулирует СО4-положительные Т-клетки.

Соответственно, любая нуклеиновая кислота, вводимая пациенту, является стерильной и свободной от пирогенов. Обнаженная ДНК может вводиться внутримышечно или внутрикожно или подкожно. Что удобно, вакцина на основе нуклеиновой кислоты может включать любое подходящее средство доставки нуклеиновой кислоты. Нуклеиновая кислота, предпочтительно ДНК, может быть также доставлена в липосоме или как часть системы доставки на основе вирусного вектора. Предпочтительно, если вакцина на основе нуклеиновой кислоты, такая как ДНК-вакцина, вводится в мышцу, тогда как пептидные вакцины предпочтительно вводятся к.с. или ί.ά. Предпочтительно также, если вакцина вводится в кожу.

Полагают, что поглощение нуклеиновой кислоты и экспрессия закодированного полипептида профессиональными антигенпрезентирующими клетками, такими как дендритные клетки, может быть механизмом прайминга иммунного ответа; тем не менее, дендритные клетки не могут быть трансфецированными, однако они по-прежнему важны, так как они могут поглощать экспрессированный пептид из трансфецированных клеток в ткани (кросс-прайминг, например, ТЬотак ЛМ, ЗаФатыето ЬМ, Ьи1/ ЕК, Лгтк1гопд ΤΌ, С’Неп ΥΟ, Ниапд ЬО, ЬаНеги ОЛ, Ооддтк М, НгиЪап КН, 1аГГее ЕМ. МекоШеНп-кресШс СЭ8(+) Т-се11 гекропкек рготФе етФепсе оГ ш νίνο стокк-рпттд Ъу апЬдеп-ргекепЬпд се11к т уасста1еЬ рапсгеаЬс сапсег раНеШк. I Ехр МеЬ. 2004 Лид 2; 200(3):297-306).

Полинуклеотид-опосредованная иммунизационная терапия рака описывается у Сопгу еί а1 (1996) Зетшатк ш 0псо1оду 23, 135-147; СопЬоп еί а1 (1996) №-11иге МеФсше 2, 1122-1127; Оопд еί а1 (1997) №-11иге МеФсше 3,558-561; Ζΐκ-ιί еί а1 (1996) I. Iттипο1. 156, 700-710; ОгаЬат еί а1 (1996) Φί I. Сапсег 65, 664670; и ВигсЬе11 еί а1 (1996) стр. 309-313 В: ВгеаЧ Сапсег, ЛЬуапсек ш Ъю1оду апЬ ШегареиЬск, Са1уо еί а1 (еЬк), 1оНп ЫЪЪеу Еиго1ех1, все из которых включены во всей полноте в описание путем ссылки.

Можно также оказаться целесообразным направлять вакцину на специфические популяции клеток, например, в антигенпрезентирующие клетки либо по месту инъекции с использованием нацеленных векторов и систем доставки, либо селективной очисткой такой клеточной популяции у пациента с введением пептида или нуклеиновой кислоты ех νίνο (например, дендритные клетки могут быть отсортированы, как описывается у ΖΙιοιι еί а1 (1995) В1ооЬ 86, 3295-3301; КоШ еί а1 (1996) ЗсапЬ. I. Iттипο1ο§у 43, 646-651). Например, нацеленные векторы могут включать ткане- или опухолеспецифический промотор, который направляет экспрессию антигена в подходящее место.

Наконец, вакцина в соответствии с изобретением может зависеть от специфического типа рака, от которого страдает пациент, которому предназначено лечение, в равной степени, как и от статуса заболевания, ранних схем лечения, иммунного статуса пациента и, естественно, от НЬЛ-гаплотипа пациента. Кроме того, вакцина в соответствии с изобретением может содержать индивидуализированные компоненты, соответствующие личным потребностям отдельного пациента. Примерами являются различные количества пептидов в соответствии с экспрессией связанных с ними ТАА у конкретного пациента, нежелательными побочными эффектами в связи с аллергиями или другими методами лечения и согласованием для вторичного лечения, следующего за первым циклом или схемой лечения.

Кроме того, пептиды настоящего изобретения пригодны не только для лечения рака, но и также в качестве диагностических средств. Так как пептиды были получены из глиобластомы, и так как было определено, что данные пептиды не присутствуют в нормальных тканях, то эти пептиды могут быть использованы для постановки диагноза о наличии рака.

- 31 022743

Присутствие пептидов настоящего изобретения на тканевых биоптатах может помочь патоморфологу в постановке диагноза рака. Обнаружение конкретных пептидов настоящего изобретения с помощью антител, масс-спектрометрии или других методов, известных из уровня техники, может дать знать патоморфологу, что ткань злокачественна или воспалена и поражена ли заболеванием вообще. Присутствие групп пептидов настоящего изобретения может сделать возможной классификацию или субклассификацию пораженных заболеванием тканей.

Обнаружение пептидов настоящего изобретения на образцах пораженной заболеванием ткани может позволить принять решение о целесообразности терапии, воздействующей на иммунную систему, в особенности, если Т-лимфоциты, как известно или ожидается, задействованы в механизме действия. Отсутствие экспрессии МНС является хорошо описанным механизмом, при котором инфицированные или злокачественные клетки уклоняются от иммунного контроля. Таким образом, присутствие пептидов настоящего изобретения показывает, что данный механизм не используется проанализированными клетками.

Пептиды настоящего изобретения могут использоваться для анализа ответов лимфоцитов на пептиды настоящего изобретения, таких как ответы Т-клеток или ответы антител на пептиды настоящего изобретения или пептиды настоящего изобретения в комплексе с молекулами МНС. Данные иммунные ответы лимфоцитов могут использоваться в качестве прогностических маркеров для принятия решения о дальнейших этапах терапии. Данные иммунные ответы могут также использоваться в качестве суррогатных маркеров в иммунотерапевтических подходах, направленных на индуцирование ответов лимфоцитов с помощью различных средств, как, например, вакцинации белком, нуклеиновыми кислотами, аутологичными материалами, адоптивным переносом лимфоцитов. При генной терапии ответы лимфоцитов на пептиды настоящего изобретения могут быть рассмотрены в рамках оценки побочных эффектов. Мониторинг ответов лимфоцитов может также быть ценным инструментом для последующих обследований в случае трансплантации, к примеру, для обнаружения реакций хозяин против трансплантата и трансплантат против хозяина.

В другом его аспекте настоящее изобретение относится к комплекту, включающему (а) контейнер, содержащий фармацевтическую композицию, описанную выше, в виде раствора или в лиофилизированной форме; (Ь) факультативно - второй контейнер, содержащий разбавитель или восстанавливающий раствор для лиофилизированного состава; и (с) факультативно - инструкции по (ί) применению раствора или (ίί) восстановлению и/или по применению лиофилизированного состава. Кроме того, комплект может включать один или более (ίίί) буферов, (ίν) разбавителей, (ν) фильтров, (νί) игл или (νίί) шприцев. Контейнер является, предпочтительно, бутылью, флаконом, шприцем или пробиркой; и он может быть контейнером многоразового применения. Фармацевтическая композиция предпочтительно является лиофилизированной.

Комплект согласно настоящему изобретению предпочтительно включает лиофилизированный состав настоящего изобретения в подходящем контейнере и инструкции для его восстановления и/или по его применению. Подходящие контейнеры включают, например, бутыли, флаконы, (например, двухкамерные флаконы), шприцы (такие как двухкамерные шприцы) и пробирки. Контейнер может быть сделан из разных материалов, таких как стекло или пластмасса. Предпочтительный комплект и/или контейнер содержат(ит) инструкции на контейнере или связанные с контейнером, которые дают указания для восстановления и/или применения. Например, на этикетке может быть указано, что лиофилизированный состав должен быть восстановлен до таких концентраций пептидов, как описано выше. На этикетке далее может быть указано, что состав применяется или предназначается для подкожного введения.

Контейнер с составом может быть флаконом многоразового использования, который позволяет повторное введение (например, от 2-6 введений) восстановленного состава. Комплект может дополнительно включать второй контейнер, включающий подходящий разбавитель (например, раствор бикарбоната натрия).

При смешивании разбавителя и лиофилизированного состава окончательная концентрация пептида в восстановленном составе составляет предпочтительно по меньшей мере 0,15 мг/мл/пептида (=75 мкг) и предпочтительно не более чем 3 мг/мл/пептида (=1500 мкг). Комплект может дополнительно включать другие материалы, желательные с коммерческой и с точки зрения пользователя, включая другие буферы, разбавители, фильтры, иглы, шприцы и вкладыши в упаковку с инструкциями по применению.

Комплект по настоящему изобретению может включать один контейнер, который содержит фармацевтический состав в соответствии с настоящим изобретением с другими компонентами или без других компонентов (например, других соединений или фармацевтических композиций этих других соединений) или может иметь отдельные контейнеры для каждого компонента.

Комплект по изобретению предпочтительно включает состав по изобретению, упакованный для применения в комбинации с совместным введением второго соединения (такого как адъюванты (например, СМ-С8Р), химиотерапевтического средства, натурального продукта, гормона или антагониста, средства против ангиогенеза или ингибитора ангиогенеза; апоптоз-индуцирующего средства или хелатора) или их фармацевтической композиции. Компоненты комплекта до введения пациенту могут предварительно быть смешаны или же каждый компонент может находиться в отдельном контейнере. Компонен- 32 022743 ты комплекта могут быть предоставлены в виде одного или нескольких жидких растворов, предпочтительно, водного раствора, более предпочтительно, стерильного водного раствора. Компоненты комплекта могут также быть предоставлены в виде твердой формы, которая может быть превращена в жидкость при добавлении подходящих растворителей, которые, предпочтительным образом, предоставляются в другом отдельном контейнере.

Контейнер терапевтического комплекта может быть флаконом, пробиркой, колбой, бутылью, шприцем или любыми другими средствами, заключающими в себе твердое вещество или жидкость. Обычно, если имеются более одного компонента, оборудование содержит второй флакон или другой контейнер, который позволяет провести отдельную дозировку. Комплект может также содержать другой контейнер для фармацевтически приемлемой жидкости. Лечебный комплект будет предпочтительно содержать аппарат (например, одну или более игл, шприцы, пипетки для глаз, пипетки и т.д.), который обеспечивает введение веществ по изобретению, которые являются компонентами настоящего комплекта.

Фармацевтический состав настоящего изобретения подходит для введения пептидов любым приемлемым способом, таким как оральный (энтеральный), назальный, глазной, подкожный, внутрикожный, внутримышечный, внутривенный или трансдермальный. Предпочтительно, чтобы введение было к.с., и наиболее предпочтительно ί.ά. Введение может производиться инфузионным насосом.

Следует понимать, что признаки изобретения, раскрываемые и описываемые здесь, могут быть использованы не только в соответствующей комбинации, как было показано, но и также по отдельности, не выходя за объем патентных притязаний настоящего изобретения. В соответствии с целями настоящего изобретения все упомянутые ссылки включены во всей полноте путем ссылки.

Теперь изобретение будет описано более подробно посредством ссылок на последующие фигуры, список последовательностей и примеры. Следующие примеры приведены исключительно для иллюстрационных целей и не направлены на ограничение изобретения.

Краткое описание фигур

Фиг. 1 - тетрамерный анализ пролиферации СЭС2-001 и А8РМ-002-специфических СЭ8положительных лимфоцитов из периферической крови здорового донора и использованием микросфер. 1 х 10⁶ обогащенных СО8-положительных РВМС на лунку стимулировались еженедельно микросферами, связанными с анти-СО28 плюс опухолевый антиген высокой плотности А*2402/ СЭС2-001 (левая панель) или анти-СО28 плюс опухолевый антиген высокой плотности А*024/ А8РМ-002 (правая панель). После трех стимуляций ш уйго клетки были окрашены антителом СЭ8 РГТС и тетрамерами с флуоресцентными метками А*2402/ СЭС2-001 и А*0201/^СЖХ-001. Клетки ограничиваются СЭ8положительными лимфоцитами; цифрами в диаграмме обозначена процентная доля клеток в указанном квадранте среди СО8-положительных лимфоцитов (мультимер-положительные клетки).

Фиг. 2 - относительное связывание ш уйго образованных из IМЛ-ВIК-002 и IМЛ-МЕТ-005 15-м с наиболее частыми аллелями НЬА-ЭК. В технологии Ргойптипе КЕУЕАЬ™ используются анализы связывания ш уйго НЬА-ЭК для определения скорости ассоциации комплекса МНС - пептид, являющейся одним из основных определяющих факторов для констант связывания отдельных пептидов. Анализ проводили с помощью Рго1ттипе (Оксфорд, Великобритания). В установленный момент времени измеряется количество интактного комплекса МНС - пептид и сравнивается с количеством комплексов контроля годен/не годен (относительно слабая сила связывания). Пептид беспорядочного сильного связывания НкА-ОК включен в качестве положительного контроля. Значения указывают на количество связываний для отдельных пептидов с молекулами НЬА-ЭК относительно контроля годен/не годен. Так как технология КЕУЕАЬ™ ограничивается 15-мерами, то протестированы были два 15-мера с перекрывающимися участками (положение 2-16; 6-20) вместо МЕТ-005 полной длины.

На фиг. 3а и 3Ъ показаны присутствие Р8МА и сурвивин-специфических секретирующих ΣΕΝ-γ СО4-положительных Т-клеток в мононуклеарах периферической крови (РВМС) в различные точки времени у вакцинированного пациента, которые были определены с использованием метода Ш^-Е^рой Точки времени: до вакцинации (а) и после 3-ей (Ъ), 6-ой (с), 7-ой (й), 8-ой (е), 9-ой (£), 10-ой (д), 11-ой (к) вакцинации.

На фиг. 4 показано присутствие сурвивин-специфических ^Νγ-, ИЛ-5, ИЛ-10, ΤΝΡ-αсекретирующих С04-положительных Т-клеток в РВМС в три различные точки времени у вакцинированного пациента, которые определялись посредством метода внутриклеточного окрашивания ДС8). Точки времени: после 1-ой (а), 3-ей (Ъ), 7-ой (с) вакцинации.

Примеры

Пример 1.

1. Синтез.

Пептиды были синтезированы стандартным и общепринятым методом твердофазного пептидного синтеза с использованием Ртос-методики. После очистки препаративной ОФ ВЭЖХ (обращеннофазовой высокоэффективной жидкостной хроматографией) проводилась ионообменная процедура для внедрения физиологически совместимых противоионов (например, ацетата, аммония или хлорида). Наконец, после

- 33 022743 лиофилизации были получены белые или грязно-белые твердые вещества. Все пептиды ТИМАР предпочтительно вводят в виде ацетатов, возможны также другие солевые формы.

Особенно важно, что идентичность и чистота каждого отдельного пептида могут быть определены с помощью масс-спектрометрии и аналитической ОФ ВЭЖХ. После ионообменной процедуры были получены пептиды в виде белых или грязно-белых лиофилизатов с уровнями чистоты, указанными в табл. 7:

Таблица 7

К» ПОСЛЕД-ТИ	ИД. ПЕПТИДА	Длина пептида (число АМИНОКИСЛОТ)	Форма соли	Чистота [относит, пл. %]
1	А8РМ-002	9	АЦЕТАТ	92,5
2	ΒΙΚ-002	15	АЦЕТАТ	96,3
3	ССЮ2-001	10	АЦЕТАТ	94,8
4	МЕТ-006	9	АЦЕТАТ	96,0
5	ΜΜΡΙ1-001	10	АЦЕТАТ	96,1
6	М8Т1 К-001	9	АЦЕТАТ	96,3
7	РРАР2С-001	9	АЦЕТАТ	94,4
$	РКОМ1-001	9	АЦЕТАТ	97,1
9	8МС4-001	9	АЦЕТАТ	90,7
10	иснь5-оо1	9	АЦЕТАТ	95,1
11	ирскв-οοι	10	АЦЕТАТ	97,3
12	(ΗΒν-001)	10	АЦЕТАТ	99,5
20	АУЬ9-001	9	АЦЕТАТ	98,6
24	ЕКВВЗ-001	9	АЦЕТАТ	99,1

Все пептиды были испытаны относительно их стабильности в различных физико-химических условиях, таких как различные температуры и уровни рН.

2. Компоненты образца фармацевтической композиции ГМА941.

ГМА941 составлена из смеси синтетических опухолеассоциированных пептидов (ТИМАР), большинство из которых было выявлено на клетках первичного колоректального рака. Пептиды ТИМАР включают 10 пептидов, связывающихся с НЬА I класса со способностью активировать цитотоксические Т-клетки (СИ8-положительные Т-клетки), и 1 пептид, связывающийся с НЬА II класса, со способностью активировать хелперные Т-клетки (СИ4+ Т-клетки). Хелперные Т-клетки играют центральную роль при поддержании функции цитотоксических Т-клеток, высвобождая цитокины, которые усиливают киллерную функцию СИ8-положительных Т-клеток и могут также напрямую действовать против опухолевых клеток (Κηπΐδοη и Όίδίδ, 2005). В дополнение к этим 11 ТИМАР, [МА941 может содержать один вирусный контрольный пептид.

Образцы хирургически удаленной злокачественной и нормальной ткани пациентов, больных глиобластомой, и кровь здоровых доноров были проанализированы поэтапно.

Сначала для определения гиперэкспрессированных генов в злокачественной ткани по сравнению с диапазонами показателей для нормальных органов и тканей применялся анализ экспрессии мРНК всего генома с помощью микроматриц. На втором этапе НЬА-лиганды злокачественного материала идентифицировались с помощью масс-спектрометрии. Затем идентифицированные НЬА-лиганды сравнивали с данными по генной экспрессии. Пептиды, кодируемые выборочно экспрессированными или гиперэкспрессироваными генами, выявленными на этапе 1, считались подходящими ТИМАР-кандидатами для мультипептидной вакцины.

Наконец, периферические СИ8-положительные Т-клетки здоровых индивидов тестировали на реактивность по отношению к опухолеассоциированным НЬА-лигандам посредством нескольких иммунных анализов (анализ Т-клеток ίη νίίτο).

3. Презентация опухолеассоциированных пептидов (ТИМАР), содержащихся в ΣΜΆ941, на образцах опухолей.

Образцы тканей.

Опухолевые ткани пациентов были предоставлены Медицинским университетом префектуры Киото (КРИМ)), Киото, Япония и Школой медицины Осакского университета (ОСИ)), Осака, Япония. Перед проведением хирургического вмешательства было получено информированное согласие всех пациентов в письменной форме. Сразу же после операции ткани были подвергнуты шоковой заморозке в жидком азоте и хранились до выделения ТИМАР при -80°С.

Выделение комплексов пептид-НЬА из образцов тканей.

Пулы комплексов пептид-НЬА из подвергнутых шоковой заморозке образцов тканей были получены методом иммунопреципитации из плотных тканей в соответствии с незначительно измененным протоколом (Ра1к и соавт. 1991) (8еедег, Р.Н. и соавт. 1999) при использовании НЬА-А, -В, -Сспецифического антитела \У6/32, СNВ^-активированной сефарозы, кислотной обработки и ультрафильтрации.

- 34 022743

Обнаружение ТиМАР методом жидкостной хроматографии и масс-спектрометрии с ионизацией электрораспылением (Е§Г-ЬСМ§).

Полученные пулы комплексов пептид-НЬА были разделены в соответствии с их гидрофобностью обратнофазовой хроматографией (Асцийу ИРЬС ууЧепт Ща1сг5). и элюированные пептиды анализировали на гибридном масс-спектрометре ЬТЦ- ОгЬйгар (ТЬегтоЕ1ес1гои), снабженном источником Е§1. Пулы пептидов загружали непосредственно на аналитическую микрокапиллярную колонку из плавленого кварца (75 мкм внут.д. х 250 мм) с материалом для обратнофазовой хроматографии 1,7 мкм С18 (^а!ег§) с применением скорости потока в 400 нл в минуту. Затем пептиды разделяли с использованием двухэтапного 180-минутного бинарного градиента от 10 до 33% В при скорости потока 300 нл в минуту. Градиент был составлен из растворителя А (0,1% муравьиной кислоты в воде) и растворителя В (0,1% муравьиной кислоты в ацетонитриле). Позолоченный стеклянный капилляр (ΡκοΤίρ, Ыете ОЬ|ес0уе) использовали для введения в источник НаНоЕЗГ. Масс-спектрометр ЬТЦ-ОгЫГгар работал в зависимом от данных режиме с применением стратегии ТОР5. Вкратце, цикл сканирования начинался с полного сканирования с высокой точностью масс на спектрометре ОгЬйгар (К = 30000), за чем следовало сканирование М8/М8 на ОгЬйгар (К = 7500) на 5 особенно многочисленных ионах-предшественниках с динамическим исключением отобранных ранее ионов. Тандемные масс-спектры интерпретировали ЗЕЦИЕЗТ с дополнительным ручным управлением. Идентифицированную пептидную последовательность подтверждали сравнением генерированной картины фрагментации природного пептида с картиной фрагментации синтетического контрольного пептида с идентичной последовательностью. На фиг. 1 представлен образец спектра, полученный из опухолевой ткани для пептида СИС2-001, ассоциированного с МНС класса I, и его профиля элюции на системе ИРЬС.

Пример 2. Профили экспрессии генов, кодирующих пептиды по изобретению.

Не все пептиды, идентифицированные как презентируемые на поверхности опухолевых клеток молекулами МНС, подходят для иммунотерапии, потому что большинство этих пептидов образованы из нормальных клеточных белков, экспрессируемых многими видами клеток. Только немногие из этих пептидов являются опухолеассоциированными и, вероятно, способны индуцировать Т-клетки с высокой специфичностью распознавания для опухоли, из которой они были получены. В целях идентификации таких пептидов и минимизации риска аутоиммунности, вызванной вакцинацией, авторы данного изобретения сосредоточили свое внимание на тех пептидах, которые получены из белков, гиперэкспрессированных на опухолевых клетках в сравнении с большинством нормальных тканей.

Идеальный пептид может быть получен из белка, являющимся уникальным для опухоли и не присутствующим ни в одной другой ткани. Для идентификации пептидов, которые образованы из генов с профилем экспрессии, близким к идеальному, идентифицированные пептиды соотносили с белками и генами, соответственно, из которых они были образованы, и строили профили экспрессии этих генов.

Источники и приготовление РНК.

Хирургически удаленные образцы тканей были предоставлены двумя различными клиническими центрами (см. пример 1) после получения письменной формы информированного согласия от каждого пациента. Образцы опухолевой ткани были мгновенно заморожены в жидком азоте после операции и впоследствии гомогенизированы с помощью ступки и пестика в жидком азоте. Суммарная РНК была приготовлена из данных проб с использованием реагента ТКГ (АтЫои, Дармштадт, Германия) с последующей очисткой на КИеаку (ОМОЕХ Хильден, Германия); оба метода осуществлялись в соответствии с указаниями производителей.

Суммарная РНК здоровых человеческих тканей была куплена (АтЫои, Хантингдон, Великобритания; С1ои1есй, Гейдельберг, Германия; §1га1адеие, Амстердам, Нидерланды; ВюС’каЫ Хейвард, Калифорния, США). РНК нескольких индивидов (от 2 до 123 индивидов) была смешана таким образом, что РНК каждого индивида имела равный вес. Лейкоциты были выделены из образцов крови 4 здоровых добровольцев. Качество и количество образцов суммарной РНК было подтверждено на биоанализаторе АдПеШ 2100 (Адйей, Вальдбронн, Германия) с использованием набора ΚΝΑ 6000 Рко ЬаЬСЫр Κίΐ (АдПеиЬ).

Эксперименты с микрочипами.

Анализ экспрессии генов всех проб РНК из опухолевой и нормальной ткани был произведен с помощью олигонуклеотидных микрочипов АГГутеМх Нитап Оеиоте (НО) И133А или НО-И133 Р1и8 2.0 (АйутеЫх, Санта Клара, Калифорния, США). Все этапы были выполнены в соответствии с руководством АйутеШх. Вкратце, двухнитевую кДНК синтезировали из 5-8 мкг суммарной РНК с использованием §ирег8сг1р1 КТ11 (Гиуйгодеи) и олиго-бТ-Т7 праймера (М\УО Вю1еск Эберсберг, Германия), как описывается в руководстве. Транскрипцию ίη νίΙΐΌ производили с использованием набора для мечения РНК-транскриптов ВюАггау Нщк У1е1б Ρ.ΝΛ Тгащспр! ЬаЬеШид Κίΐ (ЕИ2О Игадиоккск, 1ис., Фармингейл, Нью-Йорк, США) для микрочипов И133А или набора ОеиеСЫр ГУТ ЬаЬеЫид Κίΐ (АйутеЫх) для микрочипов И133 Р1и8 2.0 с последующей фрагментацией, гибридизацией кРНК и окрашиванием стрептавидин-фикоэритрином и биотинилированным антистрептавидиновым антителом (Мо1еси1аг РгоЬек, Лейден, Нидерланды). Изображения сканировали на АдйеЫ 2500А ОеиеАггау Зсаииег (И133А) или АГГутеМ.х Оеие-СЫр Зсаииег 3000 (И133 Р1и8 2.0), а данные анализировали в программе ОСО8 (АйутеЫх) с использованием настроек по умолчанию для всех параметров. Для нормализации использовались 100

- 35 022743 служебных генов, предоставленных АГГуте1п\. Относительные значения экспрессии были подсчитаны из отношений зарегистрированных сигналов, полученных компьютерной программой, а значение для образца нормальной почки было произвольно задано значением 1,0.

Профили экспрессии исходных генов, предложенных в настоящем изобретении, которые в высокой степени гиперэкспрессированы в клетках рака желудка, представлены на фиг. 2.

4. Иммуногенность ίη νίίτο для пептидов, презентируемых МНС I класса, в 1МА941.

Для получения информации об иммуногенности пептидов ТИМАР по настоящему изобретению были проведены исследования с использованием хорошо известных методов стимуляции ίη νίίτο, уже описанных в работе (ХУаЙег, 8, Неггдеп, Ь, ЗсЬоот, О, 1ипд, О, ХУетей Ό, ВиЬтшд, НГ Каттепкее, НО, апб 81еуапоу1с, 8; 2003, Сиййпд ебде: ргебейетттеб ауабйу оГ Ьитап СЭ8 Т се11к ехрапбеб оп саНЬнИеб МНС/апб-СО28-соа1еб тктокрйегек, Пттипок, 171, 4974-4978). С использованием этой платформы иммуногенность могла быть показана для 10 рестриктированных по НЬА-А*2402 пептидов ТИМАР по изобретению, таким образом, демонстрируя, что эти пептиды являются Т-клеточными эпитопами, против которых у человека направлены СИ8-положительные Т-клетки-предшественники (табл. 6).

Прайминг СИ8-положительных Т-клеток ш уйго.

В целях проведения стимуляций ш уйго искусственными антигенпрезентирующими клетками (иАПК), нагруженными комплексом пептид-МНС (рМНС) и антителом к СИ28, авторы сначала изолировали СЭ8 Т-клетки из свежего продукта лейкафереза НЬА-А*24 здоровых доноров, полученных из Банка крови г. Тюбингена, Германия.

СЭ8 Т-клетки, непосредственно обогащенные либо из продукта лейкафереза, либо из РВМС (мононуклеарные клетки периферической крови), сначала выделили с использованием стандартной среды для градиентного разделения (РАА, Кёльбе, Германия). Выделенные СИ8-лимфоциты или РВМС инкубировали до использования в Т-клеточной среде (ТСМ), состоящей из КРМI-О1иίата\ Опуйгодеп, Карлсруэ, Германия) с добавлением 10% инактивированной нагреванием человеческой сыворотки АВ (РАИВю1еск Эйденбах, Германия), 100 Ед/мл пенициллина / 100 мкг/мл стрептомицина (СатЬгех, Кёльн, Германия), 1 мМ пирувата натрия (СС Рго, Обердола, Германия) и 20 мкг/мл гентамицина (СатЬгех). 2,5 нг/мл ИЛ-7 (РготоСе11, Гейдельберг, Германия) и 10 Ед/мл ИЛ-2 (Яоуагбк РЬагта, Нюрнберг, Германия) также добавляли на этом этапе в среду ТСМ. Выделение СИ8-положительных лимфоцитов производили методом позитивной селекции с помощью микросфер СЭ8 МттоВеабк (МШепул Вюйес, Бергиш-Гладбах, Германия).

Получение покрытых рМНС/анти-СИ28 микросфер, Т-клеточные стимуляции и считывание производили, как описывалось ранее (АУаИег и соавт., 2003), с минимальными модификациями. Вкратце, были получены биотинилированные нагруженные пептидом рекомбинантные молекулы НЬА-А*2402, в которых не хватает трансмембранного домена и которые были биотинилированы на карбоксильном конце тяжелой цепи. Очищенный костимулированный мышиный 1дО2а к антителам человека СЭ28 АЬ 9,3 (1ипд и соавт., 1987) был химически биотинилирован с использованием сульфо-Ы-гидроксисукцинимидобиотина, как рекомендуется изготовителем (РетЬю, Бонн, Германия). Использованные микросферы были покрытыми стрептавидином полистирольными частицами диаметром 5,6 мкм (Вапдк ЬаЬога1ог1ек, Иллинойс/США). рМНС, использованные в качестве контролей, были А*0201/МЬА-001 (пептид ЕЬАО1О1БТУ из модифицированного Ме1ап-А/МАКТ-1) и А*0201/Э0Х5-001 (УИЬРА1УН1 из ΌΌΧ5), соответственно.

800000 микросфер / 200 мкл были покрыты в 96-луночном планшете в присутствии 600 нг биотинилированных анти-СЭ28 и 200 нг релевантного биотин-рМНС (микросферы высокой плотности). Стимуляции были инициированы в 96-луночных планшетах при совместной инкубации 1х10⁶ СЭ8положительных Т-клеток с 2х 10⁵ промытых покрытых микросфер в 200 мкл среды ТСМ с добавлением 5 нг/мл ИЛ-12 (РготоСе11) в течение 3-4 дней при 37°С. Половина среды была заменена на свежую среду ТСМ с добавлением 80 Ед/мл ИЛ-2, и инкубация была продолжена в течение 3-4 дней при 37°С. Данный цикл стимуляций производили в общей сложности три раза. Наконец, проводили анализы мультимеров посредством окрашивания клеток набором Пуе/беаб-Асща буе Опуйгодеп, Карлсруэ, Германия), клоном 8К1 антитела СИ8-Р1ТС (ВИ, Гейдельберг, Германия) и мультимерами А*2402 МНС, связанными с РЕ или АПК. Для анализа использовали цитометр ΒΌ Ь8КП 80КР, снабженный подходящими лазерами и фильтрами. Пептид-специфические клетки были подсчитаны как процентная доля от всех СЭ8положительных клеток. Оценку результатов мультимерного анализа проводили с помощью программы Р1о\уП (Тгее 81аг, Орегон, США). Прайминг ш У11го специфических мультимер-положительных СЭ8+ лимфоцитов оценивали установкой подходящего дискриминационного окна и сравнением со стимуляциями отрицательного контроля. Иммуногенность для заданного антигена была определена, если было обнаружено, что по меньшей мере в одной подлежащей оценке простимулированной ш уйго лунке одного здорового донора содержалась специфическая СО8-положительная Т-клеточная линия после стимуляции ш У11го (т.е. когда данная лунка содержала по меньшей мере 1% специфичных мультимер-положительных среди СИ8-положительных Т-клеток и процентная доля специфичных мультимерположительных клеток была по меньшей мере в 10 раз выше среднего значения стимуляций отрицатель- 36 022743 ного контроля).

Иммуногенность ίη νίίτο для пептидов ГМА941.

Для проанализированных пептидов НЬА I класса иммуногенность ίη νίίτο могла быть продемонстрирована для всех 14 пептидов генерированием пептид-специфических Т-клеточных линий. Отдельные результаты цитометрического анализа после ТиМАР-специфического мультимерного окрашивания для двух пептидов по изобретению показаны на фиг. 3 вместе с соответствующим отрицательным контролем. Результаты для пептидов, предложенных в изобретении, обобщаются в табл. 8, в которой показана иммуногенность ίη νίίτο пептидов НЬА класса I по изобретению. Результаты экспериментов по иммуногенности ίη νίίτο показывают процентную долю доноров и лунок с положительными результатами среди подлежавших оценке пептидов. По меньшей мере два донора и 24 лунки каждого пептида подлежали оценке.

Таблица 8. Иммуногенность ίη νίίτο пептидов НЬА I класса по изобретению

Антиген	Положит, доноры /всего доноров \|%]	Положит, лунки / всего лунок [%]	8ЕО Ю Νο
СОС2-001	88	28	1
А8РМ-002	63	31	2
МЕТ-006	63	22	4
ис\|[\|..5-оо1	75	14	3
М8Т1К-001	50	14	7
8МС4-001	75	9	9
РКОМ1-001	83	26	5
ММР11-001	33	11	10
АВЫ-001	50	13	21
Ανί9-001	100	50	20
ΝΙΙΡ2-002	50	4	22
ΝΡΙΡ2-001	100	25	19
РРАР2С-001	100	54	8
ирскв-οοι	100	38	6

ЕКВВЗ-001

5. Иммуногенность ТИМАР ВГО-002 класса ШМА941.

Клиническое исследование проводилось для подтверждения иммуногенности пептида с 8ЕЦ ГО N0

11.

Первоочередной целью было исследование основанного на Р8А (простата-специфический антиген) ответа (Р8А-К) на подкожное введение набора простата-специфических пептидов (вакцинационная терапия) пациентам с биохимическим рецидивом после радикальной простатэктомии без обнаружения явных метастатических очагов.

Второй целью исследования было изучение переносимости и осуществимости введения вакцины пациентам, больным раком предстательной железы, при особенном учете иммунологических проявлений с точки зрения Т-клеточного ответа.

Исследование имело дизайн проспективного рандомизированного исследования фазы VII для показания биохимический рецидив после радикальной простатэктомии без обнаружения явных метастатических очагов.

Испытуемая группа.

Частью данного исследования фазы Σ/Π стала попытка вызвать регрессию Р8А в качестве индикатора прекращения роста опухоли посредством вакцинации набором простата-специфических пептидов НЬА-А*02-положительных пациентов с биохимическим рецидивом после радикальной простатэктомии. Комбинация простата-специфических пептидов вводилась подкожно с оценкой силы соответствующего иммунного ответа в контексте разнообразных форм введения антигенных структур.

В отличие от предыдущих исследований вакцинаций, целью запланированного исследования было лечение пациентов с небольшим бременем опухолевого заболевания, еще не обнаруживаемого с помощью процедур визуализации. Все пациенты были иммунизированы одинаковым способом с использованием известных простата-специфических антигенных структур для усиления иммунного ответа на злокачественные трансформированные клетки. Лечение прошли девятнадцать пациентов.

- 37 022743

Таблица 9. Характеристики испытуемой группы

	Всег о	%	Медианное	Диапазон
Возраст	19		63	55-77
Предварительное нео- / адъювантное лечение
Отсутствует	11	58
Лучевая терапия	3	16
Прерывистая гормональная терапия	2	11
Лучевая + Прерыв, горм. терапия	2	11
Лучевая + Химиотерапия	1	5
Классификация ΤΝΜ в момент радикальной простатэктомии
Т2а-с КО	6	32
ТЗа-с КО	б	32
Т2а-сК1	3	16
ТЗа-с К1	3	16
Τ3βΝ2 КО	1	5
По шкале Глисона
5-7	10	53
8-10	3	16
неизвестно	6	32
Радикальная простатэктомия до вакцинации в м-цах			41	9- 124
Первый рецидив после операции в м-цах			14	1 -90
Уровень Р8А в начале цикла вакцинации			0,76	0,14- 10,8

План лечения.

После исключения явных метастатических очагов с помощью компьютерной томографии и сцинтиграфии скелета простата-специфическая пептидная вакцина вводилась подкожно, в соответствии с различными формами введения, пациентам с обнаруженным Р8А-рецидивом после предварительной радикальной простатэктомии (увеличение Р8А на 50% во время двух измерений с интервалом по меньшей мере 14 дней). Вакцину вводили по схеме 8х в 0, 7, 14, 28, 42 и 56 день (приблизительно 100 мкг на пептид и инъекцией каждый раз). После каждой вакцинации и снова на 70 день проводилось измерение Р8А для оценки терапевтической реакции.

Если обнаруживалась реакция опухоли (полная ремиссия [Р8А-СК], частичная ремиссия [Р8А-РК] или стабильное клиническое состояние [без изменений Р8А-ИС]), пациенту вводили вакцину один раз в месяц как поддерживающую терапию в соответствии с выбранной формой введения. Реакции пациента на вакцинацию давали подробную оценку следующим образом:

Полная ремиссия (Р8А-СК): нормализация первоначально повышенного уровня Р8А, подтвержденная измерениями, проведенными с интервалом по меньшей мере 4 недели. Нормализация определяется как самый низкий уровень Р8А, составляющий <0,2 нг/мл, который мог бы ожидаться после радикальной простатэктомии с полным удалением опухоли или простаты.

Частичная ремиссия: а) Р8А-РК < 80% (снижение первоначально повышенного уровня на 80%, подтвержденное измерениями, проведенными с интервалом по меньшей мере 4 недели); и Ь) Р8А-РК < 50% (снижение первоначально повышенного уровня на 50%, подтвержденное измерениями, проведенными с интервалом по меньшей мере 4 недели).

Стабильное состояние (Ρ8Λ-8Ό): без существенных изменений в течение по меньшей мере четырех недель. Это включает стабилизацию и снижение менее чем на 50% и увеличение менее чем на 10%, подтвержденное измерениями, проведенными с интервалом по меньшей мере 4 недели.

Прогрессирование (Р8А-РО): увеличение уровня Р8А более чем на 10%. В случае прогрессии Р8А исследование завершалось.

После набора пациентов для исследования применялась эпитоп-специфическая вакцина; учитыва- 38 022743 лись белки, специфически экспрессируемые в эпителиальных клетках простаты (к примеру, Р8МА / Р8СА). В дополнение к исследованию общей эффективности вводившейся вакцины в отношении мониторинга роста остаточных опухолевых фракций, как это было оценено при Р§А-мониторинге, в данном исследовании изучались эффекты от различных способов вакцинации в отношении эффективной модуляции иммунной системы. В дополнение к простому подкожному введению пептидов в отдельности использовались также различные комбинации с адъювантами. В частности, для пептидных вакцин использовались накопительная и адъювантная активность Монтанида (состав из классического неполного адъюванта Фрейнда, подходящий для введения человеку), который недавно был описан в очень выгодном свете. В этих целях 500 мкл пептидного раствора смешивали с 500 мкл Монтанида и вводили. Тем самым получалась эмульсия вода в масле, которая медленно, в течение нескольких недель, высвобождает антиген, содержащийся в водной фазе. Физическая стойкость эмульсии очень высока, так как при 4°С она может храниться более 3 месяцев без значительного разделения фаз. Депо-образующая функция Монтанида успешно нашла применение в нескольких исследованиях вакцин (Ока и соавт., 2004).

На одном направлении исследования изучалась эффективность вакцинации во время сопутствующей стимуляции иммунной системы факторами роста, ОМ-С8Р, раствором для инъекций Ьеикше®. ОМС8Р - это адъювант, очень часто используемый в исследованиях пептидных вакцинаций, в некоторых из которых сообщается об усиленных клинических и Т-клеточных ответах. Изначально ОМ-С8Р играет роль в рекрутинге и является фактором дифференциации дендритных клеток, за счет которого, как считается, увеличивается число дендритных клеток в месте введения вакцины. Хотя ОМ-С8Р самостоятельно не активирует антигенпрезентирующие клетки, такие как дендритные клетки и макрофаги, сообщалось о непрямой активации ш У1уо (Мо1епкатр и соавт., 2005).

Другое направление исследования было посвящено изучению эффективности вакцинации во время сопутствующей активации дендритных клеток при накожном использовании имиквимода. Имиквимод применялся в виде 5% мази (А1бага). Она имеет сильное иммуностимулирующее воздействие посредством своего влияния на ТЬК7-положительные клетки (к примеру, плазмацитоидные ДК, клетки Лангерганса, дермальные ДК) и активирует МуО88-зависимый сигнальный путь. Активированные АПК высвобождают Т-клеточные стимулирующие и воспалительные цитокины, увеличивают костимуляцию и мигрируют к дренирующим лимфатическим узлам. Потенциал имиквимода по усилению пептидиндуцированного ответа ЦТЛ при смешивании антигенов в мазевую форму или применении А1бага на месте в.с. или ΐ.ά. инъекций для антигенов был продемонстрирован на моделях с животными.

Другое плечо исследования было посвящено изучению эффективности вакцинации во время сопутствующей активации дендритных клеток при их смешивании с протамин-стабилизированной мРНК, кодирующей муцин-1 для активации ТЕК 7/8. мРНК демонстрирует широкую активацию популяций иммунных клеток мыши и человека. Присутствие в составе многоосновного белка протамина повышает полураспад мРНК и вызывает формирование потенциальных депо-образующих частиц. Этот адьювант может поэтому совмещать депо-образующие и АПК-активирующие свойства.

Вкратце, формы введения вакцины включали следующие методы: подкожное введение пептидной вакцины, эмульсифицированной в Монтаниде;

подкожное введение пептидной вакцины, эмульсифицированной в 500 мкл Монтанида в комбинации с топическим введением 225 мкл ОМ-С8Р с целью получения более сильного иммунного ответа, вызванного сопутствующим введением факторов роста;

подкожное введение пептидной вакцины, эмульсифицированной в 500 мкл Монтанида в комбинации с локальной гипертермией, применяемой после с целью получения термально-индуцированного более сильного иммунного ответа;

подкожное введение пептидной вакцины, эмульсифицированной в 500 мкл Монтанида в комбинации с накожным применением имиквимода в целях активации дендритных клеток посредством ТЬК 7;

подкожное введение пептидной вакцины, эмульсифицированной в 500 мкл Монтанида вместе с 55 мкл муцина-1 мРНК/протамина в целях активации дендритных клеток посредством ТЬК 7/8.

График: общая продолжительность исследования составила 3 года.

Простата-специфические пептидные вакцины вводили пациентам в дни 0, 7, 14, 28, 42 и 56. Пациентам со стабильным протеканием болезни или объективным ответом опухоли (Р8А-СК или Р8А-РК) вакцинацию проводили раз в месяц ΐ.ά., пока не обнаруживалась явная прогрессия. Исходя из имеющегося на данное время опыта, инъекции на основе пептидов переносятся без значительных побочных реакций. Так как реакция на вакцинацию оценивалась только серологически на основе измерений уровня Р8А, то в начале исследования проводили тест для определения, не интерферирует ли введенная вакцина с измерениями Р8А ш уПго, что могло бы имитировать клинический ответ. В дни 0, 7, 14, 28, 42, 56 и 70 брали образцы крови для лабораторных анализов, определения уровней Р8А, лейкоцитарной формулы, анализа сортировки клеток с активированной флуоресценцией и цитокинов. Если лечение продолжалось после дня 70, проводили 6-недельный мониторинг уровня Р8А в целях своевременного обнаружения неудачи лечения.

Лечение прекращали, если документировалось появление прогрессии болезни, выражавшееся в непрерывном повышении уровня Р8А.

- 39 022743

Начиная с дня 84, иммунизационная терапия продолжалась с 4-х недельными интервалами до документированной прогрессии вплоть до дня 420 (15 месяцев). Решения в отношении продолжения лечения (в случае успеха) вне данного исследования принимались, исходя из каждого индивидуального случая. Неожиданных побочных реакций в этом исследовании не было.

Лабораторные анализы включали тесты на коагуляцию, электролиты, лактатдегидрогеназу, β2-Μ, креатинкиназу, ферменты печени, билирубин, креатинин, мочевую кислоту, общий белок, С-реактивный белок, лейкоцитарную формулу с мазком, уровень ΡδΑ, цитокины, сортировки клеток с активированной флуоресценцией, ЕНкроР

Анализ реакции кожи на указанные бактериальные и грибные антигены (48-72 ч после введения, гиперчувствительность замедленного типа (ЭТН), опосредованной Т-клетками, будет служить в качестве анализа клеточной иммунной системы пациента до начала исследования.

Пептиды, необходимые для исследования (нонапептиды), были изготовлены в лаборатории д-ра Стефана Стевановича (ΡΌ Όγ. 81еГап ЗЮузпоую) на кафедре проф. Х.-Г. Раммензее (ГгоГ. Н.-О. Каттепкее). Эти пептиды были очищены на ВЭЖХ и проанализированы с помощью масс-спектрометрии. Чистоту пептидов можно также проверить посредством анализа на ВЭЖХ, масс-спектрометрии и секвенированием методом Эдмана. С помощью этих методов может документироваться чистота вплоть до 98% (которая должна рассматриваться как максимально возможная в соответствии с современными методами). Синтезированные пептиды растворяли в ДМСО (СгуоЗиге, νΑΚ СНеиие МеФса1 ОтЬН; 10 мг/мл), разбавляли до соотношения 1:10 в Αтри№а (Ргекетик КаЫ) и аликвотировали в стерильных условиях.

Клинический ответ.

У двух пациентов с помощью ПЭТ-КТ сканирования обнаружился локальный рецидив после того как была обнаружена локальная опухоль при цифровом ректальном обследовании. У оставшихся 17 пациентов по окончании исследования не удалось установить локализацию активного заболевания.

Во время повторного лабораторного анализа лейкоцитарной формулы и расширенного клинического химического анализа не обнаружилось ни каких-либо отклонений, ни изменений во время исследования.

Из 19 пациентов 16 пациентов реагировали на пептид сурвивина II (ΙΡΝ-д ΕΟδΡΟΤ, +/-1СЗ) в соответствии с δΕΟ ГО N0 12. Среди них были 12 пациентов с индукцией анти-сурвивинового Т-клеточного ответа при вакцинации, 2 с существовавшими предварительно анти-сурвивиновыми Т-клетками и 2 пациента, у которых невозможно было установить, были ли существовавшие предварительно Т-клетки в избытке.

Биохимический ответ.

Полный ответ рассматривался как не обнаруживаемый уровень ΡδΑ в соответствии с самым низким уровнем, обнаруживаемым лабораторией, участвующей в исследовании, после изначально повышенного уровня ΡδΑ. Измерения должны были быть подтверждены после периода времени, составляющего, по меньшей мере, четыре недели. ΡΚ > 80% и > 50% должны были пройти повторную оценку после четырех недель, соответственно. Уровень ΡδΑ, находящийся в диапазоне между снижением на менее чем 50% и ростом на менее чем 10%, отражал стабильное состояние заболевания, если был подтвержден, по меньшей мере, после четырех недель. Прогрессирующим заболевание считалось, если уровень ΡδΑ возрастал на более чем 10% по сравнению с началом лечения.

Биохимический ответ у пациентов, которые завершили исследование, наблюдался, пока они не начинали последующее лечение с местной лучевой или антигормональной терапией.

пациентов дали согласие на участие в исследовании, и данные анализировали с наиболее долгим последующим наблюдением, составившим около 3,75 года.

Стабильность уровня ΡδΑ и увеличение ΌΤ (время удвоения).

Уровень ΡδΑ двух пациентов (10,2%) выражал стабильность в соответствии с упомянутыми выше критериями для биохимического ответа, которые подразумевают, что по окончании исследования не было зафиксировано роста уровня ΡδΑ более чем на 10% по сравнению с началом исследования (фиг. 6, табл. 10, 11 и 12). Последующее наблюдение в этих двух случаях проводилось через 14 и 16 месяцев после проведения последней вакцинации. Средняя продолжительность стабильного состояния составила 24 месяца (28 и 31) в момент прекращения сбора данных со средним числом вакцинаций - 18 (14 и 20).

Один пациент из данных двух пациентов имел частичный ответ > 50% в течение периода в 9 месяцев с последующим периодом медленного роста уровня ΡδΑ со временем удвоения в 20,5 в сравнении с 9,8 месяцами до вакцинации. Рецидив начального уровня ΡδΑ начинался 18 месяцев спустя после операции для опухоли рТ2р№) с показателем по шкале Глисона 5.

Во время анализа данных пациент №8 имел стабильное протекание болезни с начала программы вакцинации 28 месяцев тому назад. Он прервал лечение в связи с аллергической реакцией после 10 месяцев и 14-ой вакцинации. У него сложилась неблагоприятная ситуация с опухолью рТ3Ь с показателем по шкале Глисона 3+4 с наиболее низким уровнем ΡδΑ после радикальной простатэктомии, не ниже 0,6 нг/мл, и прогрессией ΡδΑ без задержки во времени после начального снижения после операции. Время удвоения замедлилось с 6,6 до 148 месяцев.

Эти два пациента лечились Имиквимодом, наносившемся при каждой пептидной вакцинации дер- 40 022743 мально на место введения.

Рост времени удвоения уровня Р8А без стабильности Р8А.

Время удвоения Р8А пациента 11 выросло с 1,5 до 10,1 месяцев в течение шести месяцев исследования. Так как он начал с уровнем Р8А в 10,8 нг/мл и достиг 17,8 нг/мл, он завершил процедуры исследования для прохождения антиандрогенной монотерапии без каких-либо злокачественных поражений, выявленных ПЭТ-КТ. Ему вводили А1йага в качестве адъюванта.

Пациент 16 начал вакцинацию с муцин-1-мРНК/протамином со временем удвоения в 6,1 месяцев. Скорость роста Р8А снизилась с полупериодом в 2,7 месяцев в течение пяти месяцев с последующим статистически подсчитанным ростом времени удвоения Р8А до 14,4 месяцев, который продолжался 16 месяцев после начала лечения. При начальном уровне Р8А в 0,29 нг/мл он снизился до 0,19 нг/мл во время первых 5 месяцев во время лечения в рамках исследования, вырос до 0,4 нг/мл в течение последующих 8 месяцев и привел к прекращению исследования согласно протоколу при значении 0,41 нг/мл через 19 месяцев после начала лечения.

Прогрессия уровня Р8А.

У пациента 5 во время исследования наблюдалась прогрессия в соответствии с предполагавшимся временем удвоения Р8А до вакцинации. Однако у него произошло снижение уровня Р8А с полупериодом в 20,2 месяца после завершения лечения, составившего 10 месяцев на момент завершения сбора данных. Он все же не проходил никакого вторичного лечения после завершения вакцинации. Ему вводили Монтанид в качестве единственного адъюванта.

Таблица 10. Время удвоения уровня Р8А в месяцах

	Веег о	%	Среднее геометри чеекое значение	Диапазон времени удвоения

Р8А ϋΤ до вакцинации в месяцах	19		8,3	1,5-44,8
РЗА ΏΤ по завершении исследования или в конце последующего наблюдения	18*		11,2	2,2 -148
Без изменений РЗА ОТ во время вакцинации	11	58		2,2 - 44,8
Повышенный уровень Р8А ϋΤ, имеющийся по завершении исследования	4	21
Без изменении Р8А ОТ во время вакц., но со снижением после	1	5
Временное снижение РЗА или рост ОТ с последующим снижением ОТ	3	16

* Время удвоения Р8А по завершении исследования или в конце последующего наблюдения не было учтено для пациента 5 из-за снижения уровня Р8А.

7. Связывание пептидов по изобретению, рестриктированных по НЬА класса I, с НЬА-А*0201.

Цели и обобщение.

Целью данного анализа была оценка аффинности пептидов НЬА класса I по отношению к молекуле МНС, кодируемой аллелем НЬА-А*0201, так как это является важным параметром для способа действия ^А941. Степень аффинности к НЬА-А*0201 была средней до высокой для всех 10 пептидов в ^А941, рестриктированных по НЬА класса I в ^А941 и МЕТ-001, константы диссоциации (КО) находились в диапазоне от 0,14 (МЕТ-001) до 2,05 нМ (С8Р-001). Все значения находятся в пределах от 0,1 для сильного связывающего элемента НВУ-001 до 4,4 для элемента со средней силой связывания Μυθ-001. Данные результаты подтверждают сильную аффинность связывания всех пептидов НЬА класса I из вакцины-кандидата ^А941 и МЕТ-001, образованного из МЕТ-005, по отношению к НЬА-А*02.

Принципы испытания.

Стабильные комплексы НЬА/пептид состоят из трех молекул: тяжелой цепи НЬА, бета- 2 микроглобулина (Ь2т) и пептидного лиганда. Активность денатурированных рекомбинантных молекул НЬАА*0201 тяжелой цепи самих по себе может быть сохранена, делая их функциональными эквивалентами пустых молекул НЬА-А*0201. Если они растворены в водном буфере, содержащем Ь2т и подходящий пептид, то данные молекулы быстро и эффективно сворачиваются в полной зависимости от пептида. Наличие данных молекул использовалось в анализе по методике ЕЫ8А для измерения аффинности взаимодействия между пептидом и молекулой НЬА класса I (8уКек1ет, 2002).

Очищенные рекомбинантные молекулы НЬА-А*0201 инкубировали вместе с Ь2т и ступенчатыми дозами интересующего пептида. Вместо полноразмерного МЕТ-005, который не имеет способности связываться с НЬА I класса, в анализ был включен проверенный продукт, МЕТ-001, связывающийся с А*0, полученный ш νί\Ό из МЕТ-005 при естественно происходящем процессинге антигена. Количество вновь образовавшихся комплексов НЬА/пептид определялось количественным методом ЕЫ8А. Константы диссоциации (значения КО) вычислялись с использованием стандартной калибровочной кривой, записанной при разведении комплекса для калибровки НЬА/пептид.

Результаты.

- 41 022743

Результаты представлены на фиг. 2. Более низкое значение КО отражает более высокую аффинность к НЬА-А*0201. Большинство из пептидов 1МА941 имели похожие и сильные аффинности к НЬАА*0201 в диапазоне от 0,1 (НВУ-001, сильный связывающий элемент) до 44,4 нМ (МиС-001, связывающий элемент средней силы). Таким образом, все пептиды ТиМАР I класса из вакцины 1МА941 имеют среднюю или сильную аффинность связывания по отношению к молекуле МНС А*02.

8. Связывание пептидов по изобретению, рестриктированных по НЬА класса II, с НЬА-ЭК.

Цели и обобщение.

Пептиды ТиМАР II класса активируют хелперные Т-клетки, которые играют решающую роль в содействии функции ЦТЛ, инициированной пептидами ТиМАР, рестриктированными по I классу. Связывание пептидов II класса вакцины ГМА941 с несколькими различными молекулами НЬА II класса (беспорядочное связывание) важно для подтверждения того, что большинство из пациентов, проходящих лечение вакциной-кандидатом ГМА941, способны получить пользу от поддерживающего ответа Тхелперных клеток. Например, НЬА-ЭК, наиболее доминантно экспрессированная человеческая молекула НЬА II класса, высоко полиморфна, с несколькими сотнями известных аллелей. Исходя из известной частоты аллелей для гаплотипов НЬА-ЭКВ1 и широко применяемых алгоритмов связывания, можно предсказать, что оба лиганда НЬА II класса в ^А941 - IМА-ВIК-002 и ^А-МЕТ-005 - являются пептидами, беспорядочно связывающимися с НЬА-ЭК. Конкретнее, вероятность того, что НЬА-А*02положительный европеоид экспрессирует по меньшей мере один подходящий аллель НЬА-ЭК, превышает 90% для обоих ТиМАР II класса вакцины ГМА941. Так как остальные человеческие аллели II класса НЬА-Оф и -ЭР были опущены в этих расчетах из-за недостатка данных по частоте или алгоритмов предсказания связывания, действительная беспорядочность связывания, скорее всего, еще выше. Подсчитанная беспорядочность связывания двух пептидов ТиМАР II класса вакцины ГМА941 находится в том же диапазоне, что и для известного эпитопа рап-ЭК (РАЭКЕ, частота генотипа Р прогнозируемая = 93,1%). Кроме того, беспорядочное связывание этих пептидов было подтверждено экспериментально анализами связывания ш У11го. Более того, для IМА-ВIК-002 могла быть продемонстрирована высокая иммуногенность ш νί\Ό (см. выше). Обобщая, данные результаты подтверждают, что МЕТ-005 и ВГК-002 являются пептидами беспорядочного связывания с НЬА-ЭК.

Принцип прогнозирования связывания.

С помощью алгоритма 8ΥРРЕIТНI, разработанного в Университете г. Тюбинген (Каттепкее и соавт., 1997; Каттепкее и соавт., 1999), был составлен рейтинг связывания пептидов ТиМАР II класса вакцины ГМА941 с несколькими общими аллелями НЬА-ЭК. Этот алгоритм уже успешно применялся для идентификации эпитопов I и II класса из широкого спектра антигенов, например, из человеческих опухолеассоциированных антигенов ТКР2 (класс I) (8ип и соавт., 2000) и 88X2 (класс II) (Ыеитапп и соавт., 2004). Пороговое значение для связывания было задано числом 18, основываясь на анализе опубликованных показателей связывания для известных беспорядочно связывающихся лигандов НЬА-ЭК.

Использовались частоты гаплотипа, опубликованные для гаплотипа НЬА-ЭК, среди НЬА-А*02положительных представителей европеоидной расы (Моп и соавт., 1997) и частоты гаплотипов высокого разрешения (СЬапоск и соавт., 2004) (см. табл. 2). Частота гаплотипа - это частота определенного аллеля на отдельной хромосоме. По причине наличия диплоидного набора хромосом в клетках млекопитающих частота встречаемости генотипа этого аллеля выше и может быть подсчитана с использованием принципа Харди-Вейнберга (частота гаплотипа С_Г ведет к встречаемости генотипа Р (Р = 2С_Г-С_Г ²]).

Суммарная частота гаплотипов ОКБ 1 с известной матрицей 8ΥРРЕIТНI и известной индивидуальной частотой среди А*02-положительных представителей европеоидной расы составляет 47,8%. Поэтому предсказанное распределение связывания пептидов ТиМАР II класса с этими аллелями было спроецировано на оставшиеся 52,2% аллелей ПКВ1, для которых эта информация отсутствует.

В заключение, беспорядочное связывание определяется как связывание пептида с несколькими аллелями НЬА-ЭК с вероятностью, что один из них экспрессирован у представителей европеоидной расы, составляющей, по меньшей мере, 50%.

Принцип анализа связывания ш νίΙΐΌ (Рго1ттипе КЕУЕАЬ™).

IМА-ВIК-002 и ^А-МЕТ-005 были составлены с большим количеством антигенов НЬА-ЭК (с НЬА-ОК1 по ΌΡ7, которые включают также сплит-антигены с НЬА-ЭК11 по -ЭК15 (Моп и соавт., 1997)) и проанализированы с помощью анализа связывания МНС и пептида с использованием системы КЕУЕАЬ™ (Рго1ттипе, Оксфорд, Великобритания) для определения их уровня внедрения в молекулы МНС. В этом анализе связывание сравнивали с показаниями для контрольного связывающего элемента по критерию годен/не годен и пептидом положительного контроля для каждого антигена НЬА-ЭК.

Результаты.

Исходя из прогноза по алгоритму 8ΥРРЕIТНI, IМА-ВIК-002, скорее всего связывается с 7/8 аллелей НЬА-ЭК с известным связывающим мотивом (табл. 11). Вероятность того, что НЕА-А*02положительный представитель европеоидной расы экспрессирует по меньшей мере один подходящий аллель НЕА-ПКВ1 для IМА-ВIК-002, составляет 92,6%. Таким образом, оба пептида II класса вакцины ^А941, как было предсказано, беспорядочно связываются с НЬА-ЭК.

- 42 022743

Если частота гаплотипа с пептидсвязывающими аллелями НЬА-ЭКЫ была завышена в рамках данного подхода вдвое, то их генотипическая встречаемость все равно составляет более 50% для всех пептидов ТИМАР II класса вакцины ЙМА941. Кроме того, экспериментальное подтверждение беспорядочного связывания IМЛ-ВIК-002 с НЕА-ЭКГ 3, 4 и 11 было получено сбором данных по связыванию ш уйго (фиг. 3).

Так как широкая иммуногенность IМЛ-ВIК-002 была подтверждена в рамках клинического исследования для пациентов, больных раком предстательной железы, с различными аллелями НЬА-ЭК, беспорядочность связывания этого пептида II класса была отчетливо подтверждена ш У1уо.

В заключение, анализ ш кШсо свойств связывания с НЬА-ЭК двух пептидов II класса, содержащихся в вакцине ЙМА941, и дополнительные экспериментальные свидетельства анализов ш уйго и клинического исследования с ЫК-002 дают все основания предполагать, что данные пептиды ТИМАР беспорядочно связываются с человеческими молекулами НЬА II класса.

Таблица 11. Показатели связывания для пептидов ТИМАР II класса вакцины ЙМА941 с аллелями НЬА-ЭК с известным связывающим мотивом. Приводятся показатели связывания по алгоритму 8ΥΕΡЕIΤΗI для наиболее распространенных аллелей НЬА-ЭКЫ среди представителей европеоидной расы, р показывает частоту гаплотипа среди НЕА-А*02-положительных представителей европеоидной расы. Пептид рассматривался как связывающийся с молекулой НЬА, если показатель был равен или выше 18. Результатом накопления значений р для связывания с аллелями ИКВ1 является минимальная частота гаплотипа р_т1п. Экстраполяция этих частот на все аллели ИКВ1, включая те, что имеют неполную прогностическую матрицу по связыванию или данные по частоте, дает прогнозируемую частоту гаплотипа р_рго_]е_с£е_й, которая соответствует частоте встречаемости генотипа Р_рго;_ес!е_й. н.д.= нет данных.

- 43 022743

Список литературы

ΑΠίϊοη .ТР, Кштте1 МР (1995). ТЬе Υϊη апб Уапд оГТ сеЛ созНти1аНоп. 8с1епсе 270, 932933.

АпдПеп РР, Адиеппоиг М, СопП А, Ьа ТО, СагбаП 8, Сгир! К, ТотазеПо С, Оегтапо А, νΐΐθ О, ТотазеПо Р (2008). Ыискаг Гас1ог-карраВ асНуаПоп апб б1ГГегепиа1 ехргеззюп οί βιίΓνΐνίη апб Вс1-2 ϊη Ьитап дгабе 2-4 аШгосуЮтаз. Сапсег 112, 2258-2266.

АзЫеу АС, 8агдеп101, А1ЬеПз 8К, ОтоПзеу А, СатрЬеП МЕ, МогЮп КР, РисЬз С8, Катапа(Ьап КК, АУППатзоп 8 К, Ртб1ау ВР, Ρΐίοί НС, Со1бЬегд КМ (2007). Е’рба1еб еЙ1сасу апб Ιοχϊοίίν апа1уз1з оПппо1есап апб охаНркПп (ΙΚΟΧ): т1егдгоир 1г1а1 N9741 ΐη ЯгзСНпе 1геа1тепГ οί те1азГаНс со1огес1а1 сапсег, Сапсег ПО, 670-677.

Аисои(ипег б, Оиршз Ь, Саппе V (2001). АбртуаШз без1дпеб ίοΓ уе1ег!пагу апб Ьитап уасстез. Уассте 19, 2666-2672.

ВапсЬегеаи ί, Ра1иска АК, ОЬобаркаг М, ВигкеЬо1бег 8, Тацис! Ν, КоНапб А, Тацие! 8, Социегу 8, \\'1бко\узк1 КМ, ВЬагб'Л'а] Ν, Ртеио к, 8гс1птап К, Рау I (2001). 1ттипе апб сПтса1 гезропзез ΐη райеШз ν/ΐΐΗ те1аз1а1к те1апота 1о СО34(+) ргодепког-бепуеб бепбпНс сеН уассте. Сапсег Кез, 61, 6451-6458.

Вапсг)ее 8К, 9/сз1оп АР, ΖουΗΐηβ ΜΝ, СатрЬеП ОК, СЬепап К (2000). Ехргеззюп οί сбс2 апб сусПп ΒΙ ΐη НеНсоЬас1ег ру1оп-аззос1а1еб даз1пс МАЕТ апб МАЬТ 1утрЬота : ге1аНопзЫр ίο сеН беа1Ь, ргоПГегаНоп, апб (гапзГогтайоп. Ат I Ра(Ьо1. 156, 217-225.

Ваиег В, Ваг11е1б 8, Меуег ТР (2009), Н. ру!оп зе1еспуе1у Ыоскз ЕОРК епбосуЮ513 νίβ 1Ье поп-гесерюг ктазе с-АЫ апб СадА. СеН ΜΐατοΒΐοΙ. 11,156-169.

Вег1о1еШ А, СЬ1зап РУ, Реппа А, СиПЬо!8, Оа1аН Ь, М]зза1е С РоМег Р, ЗсЬНсЬ! Ш, УШе11о А, СЬезпи» КС,. (1993). ОеЯЫНоп οί а пйтта! орНта1 суЮЮх!С Т-се11 ерборе ννΐίΗΐη тЬе ЬераННз В νϊηΐ3 пис1еосарз1б рго1ет. Е Упок 67, 2376-2380.

ВейоПт О, Κοζ Ь, Регедо Р, Тойоге(о М, РопипеНа Е, ОаШ Ь, РгаГез! С РаЬЬН А, Апбпаш Р, ТтеШ 8, Κοζ Е, Сазепт К, Ео У8, Сатепт Т, Малаш Е, ОеИа О, Са1аЬго Е, Раз1оппо и, 8οζζΐ О (2009). Н|§Ыу Ютопдетс 1ипд сапсег СО 133+ се11з б1зр1ау з(ет-Нке ГсаЮгез апб аге зрагеб Ьу с1зр1аПп 1геа1теп1. Ргос ИаП. Асаб. 8с1. ЕЕ 8. А106, 16281-16286.

В1епе В, Мозез Ηί (2006). ТОР-Ье1а апб сапсег. Суюкте ОгоибЬ Расюг Κεν. 17, 29-40.

Вгоу™ СЕ, 81агг К, Майте/ С, АдиПаг В, ОАригго М, Тобогоу I, 3ΗΐΗ СС, Ваб1е В, Нибесек Μ, Κΐ66βΙ1 8К, 1епзеп МС (2009). Кесодшбоп апб кПНпд οί Ъгат 1итог з(ет-Нке тЫаНпд сеНз Ьу СЭ8+ су!о1уНс Т се11з. Сапсег Кез 69, 8886-8893.

СазМсот К, Оопбего А, Ыедп Р, ВеПога Р, Ыогга Р, СатетоПа В, Казо А, МогеИа Б, МогеИа Α, Βοίίΐηο С (2007). Во(Ь СО133+ апб С, Еиг. 11ттипо1. 37, 3190-3196.

СЬакгауагИ Α, ΝοΙΙ Е, В1аск РМ, РткеЫет ОР, Р1пке1з1ет ОМ, Оузоп Νί, ЬоеШег 13 (2002). РиапМаИуе1у беЮгттеб зигуМп ехргеззюп 1еуе1з аге οί ргодпозНс уа1ие ΐη Ьитап дНотаз. I СНп Опсо! 20, 1063-1068.

- 44 022743

СЬапоск 53, ЕозЕег СВ, МЁПегРУ, О’НаЫоп ТР (2004), НБА-А, -В, -С'\у, -ЭрА1 апб ОКБ 1 А11е1ез ίη а СаисазЁап РориЁабоп Ггот ВеЕЬезба, Б13А. Нит. 1ттипо1. 65,12111223.

СЬеп Ζ, О'ЗНеа Л (2008). Кеди1аЕЁоп оИБ-17 ргобисЕЁоп ϊη Ьитап (утрЬосуЕез. СуЕокте 41, 71-78.

СЁзек Ы, Согбеп Л, (1989). РЬозрЬогу1аЕЁоп οί ΚΝΑ ро1утегазе Ьу ЕЬе тигте Ьото1одие οί (Ье сеН-сус1е сопЕго! ргоЕеЁп сбс2. ЫаЕиге 339, 679-684.

Согзо 3, МЁдПогс С, ОЬЁзо Е, Ое КО, СотодНо РМ, ОЁогбапо 3 (2008). ЗПепсЁпд ЕЬе МЕТ опсодепе 1еабз Ео гедгеззЁоп οί ехрептепЕа! Еитогз апб теЕазЕазез. Опсодепе 27,684-693.

Сох СУ, ОЁатапЕЁ Р, Еуе1у КЗ, Кеатз РК, В1аЁг А (2009). Ехргеззюп οί СО 133 оп 1еикетЁа-ЁпЁ11аЕтд сеПз ίη сЬббЬооб АБЬ. В1ооб 113, 3287-3296.

ОеБиса 30, Оопд Υ, НегдегЕ Р, ЗЕгаизз }, НЁскеу ЗМ, 8а1топ ЕО, МсЕу/еп ВР (2005). Нес1 апб пиП аге соге сотропепЕз οί ЕЬе ктеЕосЬоге оиЕег р1аЕе еззепЕЁа! ίοτ огдашгЁпд тЁсгоЕиЬи1е аЕЕасЬтепЕ зЁЕез. Μοί. ΒίοΙ. СеП 76, 519-531.

Г)епд Н, Оио КЕ, Ы УМ, 2Ьао М, Би ΥΥ (2005). МаЕпх теЕаПоргоЕеЁпазе 11 бер1еЕюп ЁпЪЁЬИз сеП ргоЫегабоп ίη дазЕпс сапсег сеПз. ВюсЬет, ВЁорЬуз, Кез Соттип. 326, 274281.

Оегетег ОБ, БГзЕип С, КаЕага)ап К (2008). Νϋοΐίηΐδ: а зесопб-депегаЕЁоп (угозЁпе кЁпазе ёпЫЬёЕог ίοτ ЕЬе ЕгеаЕтепЕ οί сЬгошс туе!одепоиз 1еикетЁа. СНп ТЬег. 30, 1956-1975.

Ед1апб КА, Ыи ХР, ЗциЁгез 3, Иада1а 8, Мап ΥΟ, ВегаТК, Опба М, УтсепЕ Л, ЗЕгаизЬегд КБ, Бее В, РазЕап 1 (2006). НЁдЬ ехргеззюп οί а суЕокегаЕт-аззосЁаЕеб ргоЕет ίη тапу сапсегз. Ргос КаЕБ Асаб. Зек ББ 3. А103, 5929-5934.

Егато А, ЬоЕЕё Р, ЗеЕЕе О, Ρίΐοζζΐ Ε, ΒΐΐΓοηί Μ, Оё УА, СопЕЁсеПо С, Кисо Б, РезсЫе С, Ое МК (2008). 1беп(1ЙсаЕюп апб ехрапзюп οί ЕЬе Еитопдепю 1ип§ сапсег з(ет сеП рори!а1юп. СеП ОеаЕЬ ОПГег 75, 504-514.

ЕзазЬЁ Р, СЬпзЕ Ν, Оаппоп 3, БЁи Υ, НипЕ Т, ЗазЁп М, УезЕ 8С (2005). СЛК-берепбепЕ рЬозрЬогу!аЕЁоп оГВКСА2 аз а гедиШогу тесЬашзт 7ог гесотЬЁпаЕЁопа! гераЁг. ИаЕиге 434, 598-604.

Еа1к К, КоЕгзсЬке О, ЗЕеуапоуЁс 3, Зипд О, Каттепзее НО (1991). А11е1е-8рес1Йс тобГз геуеа1еб Ьу зециепстд οί зеИ-рерЕЁбез е1и!еб йот МНС то1еси!ез. №Еиге 351, 290-296.

Иападап ЗМ, Рипез ЗМ, Непбегзоп 8, УПб Б, Сагеу Ν, ВозЬоГГС (2009). Оепогтсз зсгееп ίη ЕгапзБогтеб зЕет сеПз геуеа1з ΚΝΑ3ΕΗ2Α, РРАР2С, апб АОАКВ1 аз риЕаЕЁуе апЕЁсапсег бгид ЕагдеЕз. МоБ Сапсег ТЬег. 8, 249-260.

ОаЬгПоуЁсЬ ΟΙ, СЬеп НЬ, ОЁгдЁз КК, СипптдЬат НТ, Мепу ОМ, ИабаГ 8, КауапаидЬ ϋ, СагЬопе ΩΡ (1996). РгобисЕЁоп οί уазси1аг епбоЕЬеПа! дгоМЬ ГасЮг Ьу Ьитап Еитогз ЁпЫЬЁЕз (Ье птсЕюпа! таЕигаЕюп οί бепбпПс сеПз, ИаЕ. Меб 2, 1096-1103.

Огипба ЗМ, КаЬогз БВ, Ра1тег СА, СЬЫепд ОС, ЗЕед А, МЁкке1зеп Т, ОЁазЁо КВ, гЬапд К, АШзоп О, Οπζζΐε УЕ, Уапд У, ОШезрЁе ΟΥ, ЗоЬпзоп МК (2006). 1псгеазеб ехргеззюп οί

- 45 022743

ХЬуппбу1а(е зушЬсбазе (Т8), иЫяикш зресШс рго(еазе 10 (1!8Р10) апб зипбут ίδ аззос1а(еб \νί(Η роог зигхбуа! ίη дПоЫаз1отати1ПГогте (ОВМ). б Ыеигоопсок 80, 261-274,

Нагаба Т, СЬе1а1а С, Стодогас-бигсеую Т, Ьетоте ΝΚ (2009). Оепоте-чббе апа1у818 οί рапсгеабс сапсег изтд писгоалау-Ъазеб (есЬшчиез. Рапсгеа(о1о§у. 9, 13-24.

Нагрег Ьб, Р1рег К., Соттоп б, Ройипе Р, Маскепг1е 1С (2007) 3(ет сеИ райетз ΐη се!1 1те$ бепуеб Ггот Ьеаб апб песк зциатоиз сеП сагстота. б Ога! Ра(Ьо1. Меб 36, 594-603.

Науата 8, На^до Υ, КаЮ Т, ТкМкахуа Ν, УзтаЬик1 Т, М|уатото Μ, По Т, ТзисЫуа Е, Копбо 8, Какатига Υ (2006). Асруабоп οίСОСА! -ΚΝΤΟ2, тетЬегз οί сеп(готеге рго(ет сотр!ех, ϊηνοίνβά ϊη ргбтопагу сагстодепез15. Сапсег Кез 66, 10339-10348,

Нойоп КА, ЗйасЬап ЕА, Уоде1 К№, К1бб1е ЗМ (2007). А зиЬзйаХе Гог беиЫциНтайпд епгутез Ьазеб оп Пте-гезоКеб Йиогезсепсе гезопапсе епегду (гапзГег Ьебуееп (егЬшт апб уе11о\у Пиогезсеп! рго1ет. Апа1. ВюсЬет. 360,138-143,

Ниапд Υ, Рап б, ¥апд б, ΖΗιι ΟΖ (2008). СЬагасбепгайоп οί ОРК56 ргоХет апб Пз зирргеззеб ехргеззюп ΐη Ьитап рапсгеайс сапсег се11з. Мо1. СеП ВюсЬет. 308, 133-139.

Ла НЬ, Уе ОН, Цт ЬХ, ВибЬи А, Рогдиез М, СЬеп Υ, 16и ΥΚ, Зип НС, №апд Е, Ьи ΗΖ, ЗЬеп Р, Тапд ΖΥ, №апд XXV (2007). Оепе ехргеззюп ргойПпд геуеа1з рохепйа! Ьютагкегз оГЬитап Ьера1осе11и1аг сагстота. СЬп Сапсег Кез 13, 1133-1139, бипд О, ЕебЬеПег 6А, МиПег-ЕЬегЬагб Нб (1987). 1пбисбоп оГсу1о!ох1С11у ίη гезбпд Ьитап Т 1утрЬосуХез Ьоипб (о (итог се11з Ьу апбЬобу Ье1егосоп)идатез. Ргос 14аН Асаб 8а и 8 А 84, 4611-4615, бипд НМ, СЬо! 86, Ют 6К (2009). Ехргеззюп ргоШез οί ЗХЧОбттойаПгайоп-аззоаакб депез иргеди1а(еб ίη уапоиз Ьитап сапсегз. б СеП ВюсЬет. 106, 703-713.

Кар\уага Υ, Уатазак1 Р, Ната 8, УаЬага К, УозЬюка Н, ЗщДуата К, Ап(а К, Кипзи К (2003), Ехргеззюп οί βιιτνίνίη ίη азйосубс (итогз: согге1аПоп \уйЬ таНдпап! дгабе апб ргодпоз1з. Сапсег 97, 1077-1083.

Капеко Ν, Мшга К, Ои Ζ, Кагаза\уа Н, ОЬпита 3, Зазак1 Н, ТзикатоЮ Ν, Уокоуата 3, Уататига А, Иадазе Н, 8ЫЬа(а С, 8азак] I, Ηοπί А (2009). з1КНА-теб1а(еб кпоскбои-п адатз( СНСА1 апб ΚΝΤΟ2, Ьо(Ь Ггециепбу оуегехргеззеб ίη со1огес(а1 апб даз(пс сапсегз, зирргеззез сеИ ргоПГегайоп апб тбисез арор1оз15. ВюсЬет. ВюрЬув. Кез Соттип. 390, 1235-1240.

Кпи(зоп КБ, ϋΪ5Ϊ3 МЬ (2005). Аидтепбпд Т Ье1рег сеИ 1ттипйу ίη сапсег. Сип. Огид ТагдеСз. Ьптипе, Епбосг. Ме(аЬо1. ϋίϊοΜ, 5,365-371.

КосЬ М, ВескЬоуе Р, Ор беп Ψ6, Аи(еппе(Ь ϋ, №адпег Р, Ыиттег ϋ, ЗресЬ! 8, Αηΐοίονιο ϋ, ОаНпбо Б, ЗсЬяп(2-№1ппеп1Ьа1 РН, ЗсЫггтасЬег V, ВисЫег М№, ΧΥείΐζ б (2006), Титог тйЬгабпд Т 1утрЬосу1ез ίη со1огес(а1 сапсег: Титог-зексбуе асйуабоп апб суЮЮхк асйуйу ίη 31(и. Апп, Зигд. 244, 986-992.

Кпед АМ (2006). ТЬегареибс ро1еп1га1 οί ТоП-Нке гесерЮг 9 асйуабоп. 1Ча(. Κεν. Эгид Οΐ3θον. 5, 471-484.

- 46 022743

Пи X, СЬеп Ν, ЗУапд X, Не Υ, СЬеп X, Ниапд Υ, Υϊη ЗУ, ΖΗου О (2006). Αρορίοδίβ апб ргоНГегабоп тагкегз ίη ббТизе1у 1пй11га1тд азйосуйэтаз: ргойНпд оГ 17 то1еси1ез. 1 ИеигораЙюк Ехр. Νβιιτοί. 65, 905-913.

Путдзюп Βϋ, Спгш С, Огеу Н, 1зЬюка О, СП зал РУ, Икез I, Сгеу Н, СЬезпи! КЗУ, 8еНе А (1997). ТЬе ЬераНйз В У1гиз-зрес1Йс СТЬ гезропзез тбисеб ίη Ьитапз Ьу Нрорерббе хасстабоп аге сотрагаЫе ίο (Ьозе еЬсбеб Ьу аси!е уиа! тГесбоп. 1.1ттипо1. 159, 13831392.

Ма 5, СЬап КЗУ, Ни Ь, Ьее ТК, ЗУо 6Υ, Νβ Ю, ΖΗβη^ Вб, Оиап ΧΥ (2007). Иепбйсабоп апб сЬагас1ептабоп оГ (итопдетс Нуег сапсег з(ет/ргодет(ог се11з, Оазйоеп(его1оду 132, 2542-2556.

Магбп СМ, Аз(Ьигу К, МсЕуоу Ь, 0'Тоо1е 8, 5ЬеПз О, О'Ьеагу Л (2009). Оепе ехргеззюп ргойНпд ίη сепбса! сапсег; |бепб11са1юп οί поуе! тагкегз Гог б!зеазе б1адпоз1з апб (Ьегару. Ме(Ьобз Мок ΒίοΙ. 511, 333-359.

Ме11а1 М, Са1бега V, Райиссо Α, Αηηονηζζΐ Ь, ЗсЬгЯег Б (2008). δυτνΐνίη ехргеззюп ίη дНоЫазЮтаз согге1а1ез ννίίΗ ргоШегабоп, Ьи1 ηοί ννϊίΗ арор1оз1з. Апбсапсег Кез. 28, 109118.

Μίζι-ак Б, Впбап М, Абзоп М (2008). СБ133: то1еси!е οί 1Ье тотепк б Ра(Ьо1. 214, 3-9.

Мо1епкатр ВО, Уиу1з1еке Кб, уап Ьеетусп РА, Меуег 8, Уоз ЗУ, ЗУупапбз РО 8сЬерег Кб, бе Огиу1 ТО (2005). МаСсЬеб зкт апб зепбпе! 1утрЬ побе затр1ез оГте1апота рабепгз геуеа1 ехс1из!Уе пидгабоп оГта1иге бепбпбс се11з. Ат. б Ра1Ьо1.167, 1301-1307.

Мопгаш Е, РассЬеШ Ρ, Οαίιηοζζϊ Е, Согз1т Е, Вепе(б Α, ΟΤιναζζίη С, Οπίίί Α, Ρίοοίηίηί А, Рогго О, Запбпат! Μ, Ιηνεπύεί О, Рагаб Е, А1еззапбп О, Ьа РоПа СА (2007). Ме1апота сопгатз СБ133 апб АВСС2 розфуе се11з \νίίΗ епЬапсеб (итоипдетс ро(епбак Еиг. б Сапсег 43, 935-946.

Моп М, ВеаИу РО, Ога уез М, ВоисЬег КМ, МПГогб ЕЬ (1997). НЬА депе апб Ьар1о(уре Ггециепаез ίη (Ье ΝοΠΗ Атепсап рорШабоп: (Ье Иабопа! Магго« Оопог Ргодгат Бопог Кед1з1гу. Тгапзр1ап1абоп 64, 1017-1027.

Мака^датеа Ν, Уао М, ВаЬа М, Ка1о 3, К1зЫба Т, НаПоп К, ЫадазЫта Υ, КиЬо(а Υ (2006). Шасбуабоп οί νοη Н1рре1-Ппбаи депе тбисез сопзбблбуе рЬозрЬогу1абоп оГ МЕТ ρτοΐείη ίη с1еаг се11 гепа1 сагстота. Сапсег Кез. 66, 3699-3705.

Иеитапп Р, ЗУадпег С, КиЬизсЬок В, 81еуапоУ1С 3, Каттепзее НО, РГгеипбзсЬиЬ М (2004). 1бепббсабоп оГап апбдешсрерббе бепуеб Ггот (Ье сапсегИезбз апбдеп ΝΥ-Ε3Ο1 Ьтбтд Ю а Ьгоаб гапде оГНЬА-БК зиШурез. Сапсег 1ттипо1.1ттипо1Ьег. 53, 589-599.

1Чдиуеп ОК, СЬауН КУ, Магяиез 6Т, Сопгаб РО, бг., ЗУапд Б, Не ЗУ, ВеПз1е ВЕ, Ζ1ιβη§ А, Раз1ог ЬМ, ЗУНпеу РК, Могпз Μ, Ηείίζ Ρ, БКба О ЗУПНатз ВК, МсМаз1ег ОК (2006), ПдЬ( сопйоПаЫе 3ΪΚΝΑ3 геди!а!е депе зирргеззюп апб рЬепо(урез ίη се11з, ВгасЫт. ВюрЬуз. Ас1а 1758, 394-403.

№зЫо К, Κίιη 83У, Ка\уа1 К, М1гизЫта Т, Уатапе Т, НатагаП б, Мига1а 3, Тапака К, ΜοππίοΙο Υ (2009). Сгуз1а1 з1гис1иге оГ 1Ье бе-иЫчшбпабпд ептуте 16СН37 (Ьитап 16СНЬ5) са(а1убс ботат. ВюсЬет. ВюрЬуз. Кез Соттип. 390, 855-860.

- 47 022743

ОНпита 8, Мшга К, Ноги А, РирЪисЫ А, Капеко Ν, Оо(оЬ О, НадазаИ Η, Μίζοί Т, ТзикатоЮ Ν, КоЬауазЫ Т, КтоисЫ М, ОкаЬе М, ЗазаФ Н, ЗНпЬа К, М^уадалуа К, Зазак) (2009). Сапсег-аззошаЮй зрНстд уапаФз оГ (Ье СЭСА1 апй М8МВ депез ехргеззей ίη сапсег сеИ Ппез апй зигдюаИу гезесГей дазЬтс сапсег Нззиез. Зигдегу 145,57-68,

Ока Υ, ТзиЬо] А, ТадисН] Т, Озак! Т, Куо Т, Макар та Н, ЕНззееуа О А, Ор Υ, Кахуакагт М, 1кедате К, Нозеп Ν, УозЫЬага 8, Аи Ρ, Рирк1 Р, Мигакапн М, Мазила Τ, ΝίεΗίάβ 3, 8Ыгака1а Т, Иакакика 8, ЗаяаИ А, Ыйака К, ОоЬу Н, Аогаза К, ЫодисЫ 8, Камазе I, 8ид)уата Н (2004), Фйисйоп оГ ΑΤΙ (АПтз’ (итог депе)-зрес1Йс суйЯохю Т 1утрНосу1ез Ьу АТ1 рерййе уассте апй (Ье гекикап) сапсег гедгеззюп, Ргос ИаЙ. Асаск Зек и. 8. А 101, 13885-13890.

Р]е1га О Мап/Гт С, Ука1е М, Ва1зато М, Одшо Е, ВоЙапо М, Оиеко1о Р, МогеИа Ь, Мтдап МС (2009), Ыатга1 кШег сеПз кП1 Нитап текпота сеПз ννίΐΗ сЬагас(епзйсз оГ сапсег з1ет сеПз. Ιηί 1ттипо1. 21, 793-801.

Рорре М, Ре11ег ЗМ, Котег С, Аезз1ег 3 (2007). РЬозрЬогукйоп оГНеНсоЬас1ег ру!оп СадА Ьу с-АЫ 1еайз ίο се11 тоЫпу. Опсодепе 26,3462-3472.

Ру1е1 ϋ, 5П\Нпзк1 Т, Рорки/зЫ Т, Регпок О, Ма)з(егек I (2009). Тугозте ктазе Ыоскегз: пе\у Ьоре Гог зиссеззГи! сапсег (Негару. Лпйсапсег Адеп1з Мед СЬет. 9, 66-76, р1ап Ζ, ЗозНп ΙΜ, Теппат ТК, КезЬпп 5С, Уоипд ΌΡ 5(оййап А, Ьагзоп КА, Ье Веаи ММ (2009). СуЮдепейс апй депейс ра(И\уауя ΐη 1Ьегару-ге1а1ед асфе туекпй 1еикепиа. СЬет. ΒίοΙ. 1п(егаск

Каттепзее НС ВасЬтапп I, ЕттепсЬ ΝΡ, ВасЬог ОА, δίονβηονκ 3 (1999), 3ΥΡΡΕΙΤΗΙ: йа(аЬазе Гог МНС Ндапйз апй рерййе тойГз. 1ттиподепейсз 50, 213-219.

Каттепзее,Н.О, ВасЬтапп,к, апй 8ίοναηονΚ,3. (1997). МНС Ыдапйз апй Рерййе МойГз. Зрппдег-Уегкд, Не)йе1Ьегд, Оегтапу).

Каттепзее НО, Ра1к К, Ко(гзсЬке О (1993). Рерййез па1ига11у ргезеШей Ьу МНС с1азз I то!еси1ез, Аппи, Ке\'. 1ттипо1.11, 213-244.

Карра О, Ройз(ай О, Ьопсо А (2008). ТЬе з1ет се11-аззос1а(ей апйдеп ΟΌ133 (Ргоппшп-1) а то1еси!аг (Ьегареийс 1агде1 Гог те1аз!айс текпота. 81ет СеПз 26, 3008-3017.

ЮссьУШап] Ь, ЬотЬагф ОС, 81дпоге Μ, Βΐίϊοηί М, РаШт К, Рагай Е, РезсЫе С, Ое Мала К (2007). Нитап пеига1 ргодепйог сеПз Фзрку НтНей суГОкшску апй тсгеазей оНдойепйгодепез13 йийпд тйаттайоп. Се11 Оеа(Н. ОйГег. 14, 876-878.

ЮсЬагйзоп Οϋ, КоЬзоп ΟΝ, Ьапд ЗН, Иеа! ОЕ, МаЫапй N1, СоШпз АТ (2004). СО133, а ηονεί тагкег Гог Нитап ргозТайс ер11ЬеНа1 з1ет сеПз. I СеП Зек 117, 3539-3545.

Ки1е11а 3, Вопаппо О, РгосоИ А, Мапо(й А, СогаНо М, Рпзсо МО Егато А, Царо1е1апо С, Оа11о ϋ, РейПо Α, Νυίϊ М, Р1еге11 ϊ Ь, Тез(а и, ЗсатЫа О Реггапйта О (2009). СеПз ννίΐΗ сЬагаФепзйсз оГ сапсег Жет/ргодепНог сеПз ехргезз (Не ΟΌ133 апйдеп ϊη Нитап епйоте(па1 (итоге. СНп Сапсег Кез 15, 4299-4311.

ЗаНо Τ, Απίίη МТ, Наша 8, Карсеага Υ, 8и§1уата К, УатазаЫ Р, Н1Йака Т, Ап1а К, Кийзи К (2007). Зиг-νίνίη зиЬссПикг ЮсаПтайоп ϊη ЫдН-дгайе азйосуЮтаз: з1тиНапеоиз

- 48 022743 ехргеззюп ίη Ьо(Ь пискиз апб су!ор1азт 15 педайуе ргодпозйс тагкег. Г ЦеигоопсоЕ 82, 193-198.

8азак1 Т, Борез МВ, Напктз ОК, Не1т ОА (2002). Ехргеззюп οί зип'Мп, ап тЫЬког οί арор1оз15 рго1ет, ίη (итога οί (Ье пегтоиз зуз1ет. Ас1а ЦеигораЙюк 104,105-109.

Зеедег РН, 8сЫг1е М, Оа»йе1й Е, Ато1б Ό, КеЛЬо!ζ \У, 1Мско1аиз Р, Каттепзее НО, δίβνβηονίο 8 (1999). ТЬе НЬА-А*6601 рерПбе тоИГ: ргебюйоп Ьу роске! з!гис1иге апб уегШсайоп Ьу рерйОе апа1уз!з. 1ттиподепейсз 49, 571-576.

8Ьарио 01 (2006). СусЬп-берепбеп! ктазе ратЬ'лауз аз 1аг§е1з ίοΓ сапсег 1геа1теп1. Е СНп Опсо1 24, 1770-1783.

8тдЬ ЗК, С1агке ГО, ТегазаН М, Вопп УЕ, Напктз С, Зцшге Е, Оикз РВ (2003). ИепНИсайоп οί а сапсег з!ет се11 ίη Ьитап Ьгат Штогз. Сапсег Кез. 63, 5821-5828.

5тдН ЗК, Напктз С, С1агке ГО, δςιιίΓβ ЕА, Вауаш Е, Ηίάε Т, Непке1тап КМ, Сизтапо МО, Б1гкз РВ (2004), 1бепп1гсайоп οί Ьитап Ьгат (итоиг нййайпд сеИз. Ыа1иге 432,396401.

8т НЬ ЕМ. №з!егоуа А, Куап МС, ГЭипйю 8, .Топаз М, Апбегзоп М, 2аЬтзк] КР,

ЗиЛеНапб МК, ОегЬег НР, Уап Огбеп КЬ, Мооге РА, КиЬеп 8М, С'айег РЕ (2008), СО133/рготтт-1 Ϊ3 а ро1епПа1 тЬегареийс ШгдеТ ίοΓ апИЬобу-бгид соп)ида1ез ίη Ьера1осе11и!аг апб §аз1пс сапсегз. Вг. Г Сапсег 99, 100-109.

81еттапп О, Ζου Н, ОегЬег 8Α, Ον§ί ЗР, КйзсЬпег М\У (2001), Оиа1ίηΗίΗίΙϊοη οί 5151ег сЬготайб зерагаПоп а1 те1арЬазе. СеП 107, 715-726.

ЗиеГзиди А, Иадак1 М, Аок1 Н, МоЮЬазЫ Т, Кишзаба Т, Моп\уак1 Н (2006).

СЬагас1еп/абоп οί ΟΏ133+ Ьера1осе11и1аг саги пота сеПз аз сапсег з(ет/ргодет(ог сеПз. ВюсЬет. ВюрЬуз. Кез. Соттип. 351, 820-824.

8ип Υ, 8оп§ М, Зюуэпоую 8,Еапкотоак С, РазсЬеп А, Каттепзее НО, ЗсЬабспбогГП (2000). МепПйсаПоп оГ а пе№ НЕА-А(*)0201-гез1лс1еб Т-се11 ерйоре Кот Пае (угозтазеге!а(еб рго1ет 2 (ТКР2) те1апота апйдеп, Ιηί. Е. Сапсег 87,399-404,

Зиуа МЬ, Κί§£ΐ Ν, 81еЫе ГС, Ваитег К, Тегаег 8, ЕозерЬ ЕМ, 8и\'а О, С1етеп1 V, Ргоуего Ρ, ΟίΓοηί Е, Оз(егЬе1б МС, ОиП1ои Е, 3(атепкоук I (2009). ГбепИйсаПоп οί Сапсег 81ет СеП з ΐη Ε\νϊη§*3 Загсота. Сапсег Кез.

Зу1уез1ег КК (2002). СНпюа! аррНсайопз οί со1опу-збти1а1тд Гас1огз: а Ыя1опеа1 регзресйуе. Ат Е НеаИЬ ЗузЕ РЬагт. 59, 86-12.

Така1зЫ 8, Окитига Т, Ти 8, \Сапд 88, 8ЫЬа1а XV, У1§пезЬ\уагап К, Оогбоп ЗА, ЗЬЬпаба Υ, )Уап§ ТС (2009), МепИйсаИоп οί §аз1пс сапсег з1ет сеИз изт§ Ню сеП зиНасе тагкег СО44. 31ет СеНз 27, 1006-1020.

Τίηηο V, СатегПпдо К, Ргапсо К, Ма1апда О, Еа КА, УщНейо О, Коссо О, Ρϊγοζζϊ О (2009). ТЬе го1е οί СО133 ίη Фе гбепИЯсайоп апб сЬагас1елзайоп οί Штош-пийаНпд сеПз ίη поп-зтаН-сеП 1ип§ сапсег. Еиг. Е СагбюНюгас. Зиге, 36,446-453.

- 49 022743

Тойаго М, А1еа МР, ϋί 31еГапо АВ, Саттагеп Р, Уегтеи1еп Е, Ιονϊηο Р, Тпройо С, Кцззо А, Ои1ойа О, Мейета ЙР, 81азз1 О (2007). Со1оп сапсег з1ет сеПз Йк1а1е 1итог дготеШ апй ге8131 сеИ йеаШ Ьу ргойисйоп οί т1ег1еикт-4. СеИ 81ет СеИ 1, 389-402.

иетаки М, ОЬзатеа I, Локаде Т, РНзЫтак» К, Макитою К, ТакаЬазЫ Н, АзоЬ 8, Тегатою А, ОЬ1а 8 (2005), РгодпозКс з1дпШсапсе οί Ше 1ттипоЫзЮсЬетка1 тйех оГ ίΐίΓνίνΐη ίη дНота: а сотрагайуе зЮйу теЬЬ Ше ΜΙΒ-1 тйех. Й Хеигоопсо!. 72, 231-238.

Уакег 8, Непдеп Ь, ЗсЬоог О, йипд О, УетеХ О, ВиЬппд Нй, Каттепзее НО, δίεναηονίο 8 (2003). СиШпд ейде: ргейеЮгттей βνίάίΐγ оГЬитап СО8 Т сеПз ехрапйей оп саНЪгаЮй МНС/апЬ-СО28-соа(ей пмсгозрЬегез. й. 1ттипо1.171,4974-4978.

У'ккз Зй, ОгосоМ Т, Нагоз К, МаШагй М, 1еп ΩΡ, СЬапГгу А (2006). КеуетЫе иЫцийтайоп геди!а(ез Ше 8тай/ТОР-Ье(а з]дпаШпд раШтеау. ВюсЬет. Зое Тгапз, 34, 761-763.

ЗУскз 8Й, Нагоз К, МаШагй М, Зопд Ь, СоЬеп КЕ, Ццке РТ, СЬапГгу А (2005). ТЬе йеиЫдишпайпд епгуте 1ЙСН37 тгегаск тетШ Зтайз апй гедикюз ТОР-ЬеШ 31дпаШпд. Опсодепе 24, 8080-8084.

Χΐβ ϋ, гепд ΥΧ, ЗУапд Нй, \Уеп ЙМ, Тао Υ, ЗЬат Й8, Сиап ΧΥ (2006). Ехргеззюп оГ суЮр1азтк апй пис1еаг Зипйут ίη рптагу апй зесопйагу Ьитап дПоЫазФта. Вг. й Сапсег 94, 108-114.

Уапд Ь, Апйегзоп ЭЕ, ВаесЬег-АПап С, Назйпдз ΨΌ, ВеПеП, Е, Оикка М, КисЬгоо УК, НаЙег ОА (2008). 1Ь-21 апй ТОР-Ье1а аге гецФгей Гог йКТегепйаЬоп οί Ьитап Т(Н)17 сеПз. ИаШге.

Уази! XV, АуЬап А, К|1айа1 Υ, РПзЫтига К, УокогаИ Н, Ко Н, ТаЬага Е (1993). 1псгеазей ехргеззюп οί р34сйс2 апй Ьв ктазе аейуйу ίη Ьитап даз(пс апй со!ошс сагстотаз. Тп1 й Сапсег 53, 36-41.

Υίη 8, Ы й, Ни С, СЬеп X, Уао М, Уап М, Лапд О Ое С, Χίε Н, 9/ап ϋ, Уапд 8, гЬепд 8,

Ои Й (2007). СО 133 розЬФе Ьераюсе11и1аг сагстота сеПз роззезз ЫдЬ сарас(ху Гог (итопдетсКу. Ιηΐ. Й Сапсег 120, 1444-1450.

/Ьапд X, Кей1 КМ, Хгапд й (2009). СО40 Ндайоп сопуегк ТОР-Ье1а-зесге(тд ю1егодетс СО4-8- йепйпйс сеПз ίηΐο 1Ь-12-зесге1тд 1ттиподетс опез. ВюсЬет. ВюрЬуз. Кез Соттип. 379,954-958.

ΖΗηο С, СЬеп А, йагтезоп СН, РегезЫеЬ М, АЬгаЬатззоп А, В1ит й, Ктеоп НУ, Ют й, СЬи(е ЙР, Κϊζζΐεπ О, МипсЫюй М, Уапагзйа1е Т, ВеасЬу РА, Кеуа Т (2009). НейдеЬод 51дпа1Ппд 13 еззепйа! Шг татЮпапсе οί сапсег з1ет сеПз ίη туеЮШ кикаегта. №(иге.

гЬеп ΗΝ, гЬапд X, Ни ΡΖ, Уапд ТТ, Ρεί Ζ, гЬапд ЙЫ, Ри ЬА, Не ХЗ, Ма РС, \Ушд ХЬ (2005). διιτνίνΐη ехргеззюп апй Из ге1айоп тетШ ргоЬГегайоп, арорЮзгз, апй апдюдепез13 ίη Ьгат дПотаз. Сапсег 104,2775-2783.

/Ьои ί, Ьорез ЙЕ, СЬопд ММ, Напое II, Μίη К, УкЮга ОО, ЗЬеп У, Ои й, КиЬкоу ΥΡ, Кийепзку ΑΥ, Игедкг 8Р, ЬШтап ОК (2008). ТОР-Ье(а-тйисей РохрЗ ϊηίιίΒΐΙκ Т(Н)17 сеИ Шйегепйайоп Ьу ап!адошгтд КОКдатта! (ипейоп. ЦаЮге 453, 236-240.

ΖΦι Кй, Сеп ЙР, Ьои ЙХ, \Уапд 0, гЬапд X, Хи У, СЬеп ΧΖ, СЬепд Н (2009). 1ппцштой тЫЬКз Ше йКТегепйайоп Ьи1 епЬапсез Ше таюгайоп οί Ьитап тогюсук-йсгНей йепйгШс сеПз. 1п( 1ттипорЬагтасо1. 9,412-417.

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Фармацевтическая композиция, включающая по меньшей мере два пептида, состоящих из аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из 8ЕЦ ГО N0 1 по 8ЕЦ ГО N0 10, 8ЕЦ ГО N0 20 и 8ЕЦ ГО N0 24, и/или полинуклеотид, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую 8ЕЦ ГО N0 1 по 8ЕЦ ГО N0 10, 8ЕЦ ГО N0 20 и 8ЕЦ ГО N0 24, и фармацевтически приемлемый носитель.
2. Фармацевтическая композиция по п.1, дополнительно включающая по меньшей мере один дополнительный пептид, состоящий из аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из 8ЕЦ ГО N0 11 по 8ЕЦ ГО N0 22, или полинуклеотид, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую 8ЕЦ ГО N0 9 по 8ЕЦ ГО N0 22.
3. Фармацевтическая композиция в соответствии по п.1 или 2, где по меньшей мере один пептид включает непептидные связи.
4. Фармацевтическая композиция по любому из пп.1-3, включающая по меньшей мере два пептида МНС класса I с 8ЕЦ ГО N0 1 и с 8ЕЦ ГО N0 11, или один из этих двух пептидов МНС класса I с 8ЕЦ ГО N0 2 и с 8ЕЦ ГО N0 11, или один из этих двух пептидов МНС класса I с 8ЕЦ ГО N0 3 и с 8ЕЦ ГО N0 11.
5. Фармацевтическая композиция по любому из пп.1-4, где выбор, число и/или количество пептидов, присутствующих в композиции, является/являются ткане-, раково- и/или пациентспецифической/ими.
6. Фармацевтическая композиция по любому из пп.1-5, дополнительно включающая по меньшей мере один приемлемый адъювант, выбранный из группы, включающей 1018 ^8, соли алюминия, АшрГОах, А815, ВСО, СР-870,893, СрО7909, СуаА, б8ЫМ, ОМ-С8Р, Ю30, Ю31, Имиквимод, ^иРас! IΜР321, К Ра!сЬ, К^МАТКЕХ, ^иν1тшиие, ^^рοVас, МР59, монофосфорил липид А, Монтанид !М8 1312, Монтанид КА 206, Монтанид КА 50У, Монтанид КА-51, 0Κ-432, 0М-174, 0М-197-МР-ЕС, 0\'ТАК, векторную систему РерТе1, микрочастицы РЬО, резиквимод, 8КЬ172, виросомы и другие вирусоподобные частицы, УР-ПИВСО, стимулон Λςυί1η'δ Ц821, ЭеЮх компании МЫ Цш1, 8ире^Гοδ. адъювант Фрейнда, ОМ-С8Р, холерный токсин, иммунологические адъюванты, МР59 и цитокины.
7. Фармацевтическая композиция по п.6, где адъювант выбран из группы, состоящей из колониестимулирующих факторов, таких как гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (ОМ-С8Р) или имиквимод или резимиквимод.
8. Фармацевтическая композиция по любому из пп.1-7, дополнительно содержащая по меньшей мере одну антигенпрезентирующую клетку, такую как, например, дендритную клетку.
9. Фармацевтическая композиция по п.8, где по меньшей мере одна антигенпрезентирующая клетка является:

a) клеткой с введенным импульсным методом или нагруженной пептидом, выбранным из группы, состоящей из 8ЕЦ ГО N0 1 по 8ЕЦ ГО N0 22, или

b) включает экспрессионную конструкцию, кодирующую и экспрессирующую пептид.
10. Фармацевтическая композиция по любому из предыдущих пунктов, где указанная фармацевтическая композиция является противораковой вакциной и где указанная вакцина вводится внутривенно, внутриартериально, внутрибрюшинно, внутримышечно, внутрикожно, внутрь опухоли, перорально, дермально, назально, буккально, ректально, вагинально, с помощью ингаляции или посредством топического введения.
11. Применение композиции по любому из предшествующих пунктов для лечения или профилактики рака у пациента.
12. Применение по п.11, где рак является карциномой предстательной железы, карциномой полости рта, плоскоклеточной карциномы полости рта (08СС), острой миелоидной лейкемией (АМЬ), вызываемой Н. рукп МАЬТ-лимфомой, карциномой толстого кишечника/колоректальным раком, глиобластомой, немелкоклеточным раком легких (№СЬС), карциномой шейки матки, раком молочной железы человека, раком предстательной железы, раком толстого кишечника, раком поджелудочной железы, протоковой аденокарциномой поджелудочной железы, раком яичника, гепатоклеточной карциномой, раком печени, опухолями головного мозга различных фенотипов; лейкемиями, такими как острая лимфобластная лейкемия, АЬЬ; раком легких, саркомой Юинга, эндометриальным раком, плоскоклеточной карциномой головы и шеи, эпителиальным раком гортани, карциномой пищевода, карциномой ротовой полости, карциномой мочевого пузыря, карциномами яичника, почечно-клеточной карциномой, атипической менингиомой, папиллярной карциномой щитовидной железы, опухолями головного мозга, карциномой слюнного протока, экстранодальными Т/NΚ-клеточными лимфомами, нехожкинскими лимфомами и злокачественными солидными опухолями легких и молочной железы, предпочтительным видом рака является рак желудка.
13. Применение по п.11 или 12, где рак является раком желудка.