EA023013B1 - Пептид, индуцирующий противоопухолевый иммунный ответ, и его применение - Google Patents

Пептид, индуцирующий противоопухолевый иммунный ответ, и его применение Download PDF

Info

Publication number
EA023013B1
EA023013B1 EA201100586A EA201100586A EA023013B1 EA 023013 B1 EA023013 B1 EA 023013B1 EA 201100586 A EA201100586 A EA 201100586A EA 201100586 A EA201100586 A EA 201100586A EA 023013 B1 EA023013 B1 EA 023013B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
cells
peptide
cell
cancer
tumor
Prior art date
Application number
EA201100586A
Other languages
English (en)
Other versions
EA201100586A1 (ru
Inventor
Оливер Шоор
Норберт Хильф
Тони Вайншенк
Клаудия Траутвайн
Штеффен Вальтер
Харприт Сингх
Original Assignee
Имматикс Байотекнолоджиз Гмбх
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Имматикс Байотекнолоджиз Гмбх filed Critical Имматикс Байотекнолоджиз Гмбх
Publication of EA201100586A1 publication Critical patent/EA201100586A1/ru
Publication of EA023013B1 publication Critical patent/EA023013B1/ru

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • A61K38/08—Peptides having 5 to 11 amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/06—Linear peptides containing only normal peptide links having 5 to 11 amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/14—Blood; Artificial blood
    • A61K35/17—Lymphocytes; B-cells; T-cells; Natural killer cells; Interferon-activated or cytokine-activated lymphocytes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/461—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
    • A61K39/4611—T-cells, e.g. tumor infiltrating lymphocytes [TIL], lymphokine-activated killer cells [LAK] or regulatory T cells [Treg]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/462—Cellular immunotherapy characterized by the effect or the function of the cells
    • A61K39/4622—Antigen presenting cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/463—Cellular immunotherapy characterised by recombinant expression
    • A61K39/4634—Antigenic peptides; polypeptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
    • A61K39/4643—Vertebrate antigens
    • A61K39/4644—Cancer antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61M—DEVICES FOR INTRODUCING MEDIA INTO, OR ONTO, THE BODY; DEVICES FOR TRANSDUCING BODY MEDIA OR FOR TAKING MEDIA FROM THE BODY; DEVICES FOR PRODUCING OR ENDING SLEEP OR STUPOR
    • A61M5/00—Devices for bringing media into the body in a subcutaneous, intra-vascular or intramuscular way; Accessories therefor, e.g. filling or cleaning devices, arm-rests
    • A61M5/002—Packages specially adapted therefor, e.g. for syringes or needles, kits for diabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/18—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for pancreatic disorders, e.g. pancreatic enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/08—Drugs for disorders of the urinary system of the prostate
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/70539—MHC-molecules, e.g. HLA-molecules
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/08—Linear peptides containing only normal peptide links having 12 to 20 amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0636—T lymphocytes
    • C12N5/0638—Cytotoxic T lymphocytes [CTL] or lymphokine activated killer cells [LAK]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0639—Dendritic cells, e.g. Langherhans cells in the epidermis
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites
    • G01N33/57492—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites involving compounds localized on the membrane of tumor or cancer cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/53—DNA (RNA) vaccination
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55516—Proteins; Peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55522—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55561—CpG containing adjuvants; Oligonucleotide containing adjuvants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55588—Adjuvants of undefined constitution
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/57—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2
    • A61K2039/572—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2 cytotoxic response
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
    • A61K2039/6031—Proteins
    • A61K2039/605—MHC molecules or ligands thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
    • A61K2039/6031—Proteins
    • A61K2039/6081—Albumin; Keyhole limpet haemocyanin [KLH]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
    • A61K2039/6093—Synthetic polymers, e.g. polyethyleneglycol [PEG], Polymers or copolymers of (D) glutamate and (D) lysine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2121/00—Preparations for use in therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2300/00—Mixtures or combinations of active ingredients, wherein at least one active ingredient is fully defined in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/40—Fusion polypeptide containing a tag for immunodetection, or an epitope for immunisation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/50—Cell markers; Cell surface determinants
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Anesthesiology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Diabetes (AREA)

Abstract

Изобретение относится к пептидам, индуцирующим противоопухолевый иммунный ответ, где указанные пептиды связываются с молекулой главного комплекса гистосовместимости человека (МНС) класса I или II и где указанные пептиды способны стимулировать Т-клетки CD4 и/или CD8, и их применению в вакцинах для лечения рака. Изобретение относится также к нуклеиновым кислотам, кодирующим указанные пептиды, векторам, экспрессирующим указанные пептиды, клеткам-хозяевам, включающим указанные нуклеиновые кислоты, и их применению в вакцинах для лечения рака, а также к способам получения указанных пептидов и активированных цитотоксических Т-лимфоцитов и наборам для индукции противоопухолевого иммунного ответа.

Description

Изобретение относится к пептидам, индуцирующим противоопухолевый иммунный ответ, где указанные пептиды связываются с молекулой главного комплекса гистосовместимости человека (МНС) класса I или II и где указанные пептиды способны стимулировать Т-клетки СИ4 и/или СИ8, и их применению в вакцинах для лечения рака. Изобретение относится также к нуклеиновым кислотам, кодирующим указанные пептиды, векторам, экспрессирующим указанные пептиды, клеткам-хозяевам, включающим указанные нуклеиновые кислоты, и их применению в вакцинах для лечения рака, а также к способам получения указанных пептидов и активированных цитотоксических Т-лимфоцитов и наборам для индукции противоопухолевого иммунного ответа.
Уровень техники
Глиомы являются опухолями головного мозга, развивающимися из глиальных клеток нервной системы. Глиальные клетки, называемые обычно нейроглией или просто глией, являются не-нейрональными клетками, которые обеспечивают поддержку и питание, поддерживают гомеостаз, формируют миелин и участвуют в передаче сигналов в нервной системе. Две наиболее важные подгруппы глиом - это астроцитомы и олигодендроглиомы, называемые в соответствии с видами нормальных глиальных клеток, из которых они образуются (астроциты или олигодендроциты соответственно). Относящаяся к подгруппе астроцитом мультиформная глиобластома (называемая далее глиобластомой) является наиболее распространенной злокачественной опухолью головного мозга взрослых людей и на ее счет приходится приблизительно 40% всех злокачественных опухолей головного мозга и приблизительно 50% глиом. Она агрессивно поражает центральную нервную систему и имеет наивысший уровень злокачественности (степень IV) среди всех глиом. Хотя наблюдается постоянный прогресс в их лечении благодаря усовершенствованию нейровизуализации, микрохирургии, различным терапевтическим возможностям, таким как Темозоломид или облучение, глиобластомы остаются неизлечимыми. Процент летальных исходов при этой опухоли головного мозга очень высок: средняя ожидаемая продолжительность жизни после постановки первого диагноза составляет 9-12 месяцев. 5-летний срок выживаемости в течение периода наблюдения с 1986 по 1990 гг. составил 8,0%. На данный момент пятилетний срок выживаемости вследствие агрессивной терапии, включая макроскопическое удаление опухоли, все еще ниже 10%. Соответственно, существует высокая потребность медицины в альтернативном и эффективном методе лечения.
Опухолевые клетки глиобластомы являются наиболее недифференцированными среди опухолей головного мозга, так что опухолевые клетки имеют высокий потенциал для миграции и пролиферации и являются высокоинвазивными, приводя к очень неутешительному прогнозу. Глиобластомы приводят к смерти из-за быстрого, агрессивного и инфильтрирующего роста в головном мозге. Паттерны инфильтрирующего роста являются причиной нерезектабельности этих опухолей. Глиобластомы также относительно резистентны к облучению и химиотерапии, поэтому высок процент рецидивов после лечения. Кроме того, иммунный ответ на неопластические клетки довольно неэффективен для полного устранения всех неопластических клеток после резекции и лучевой терапии.
Глиобластома подразделяется на первичную глиобластому (бе ηονο) и вторичную глиобластому в зависимости от различий в генном механизме во время злокачественной трансформации недифференцированных астроцитов или глиальных клеток-предшественников. Вторичная глиобластома возникает в более молодом возрасте, до 45 лет. В течение 4-5 лет, в среднем, вторичная глиобластома развивается из астроцитомы низкой степени, проходя стадию недифференцированной астроцитомы. Первичная глиобластома, напротив, возникает в более пожилом возрасте, в среднем это 55 лет. В целом, первичная глиобластома возникает как молниеносная глиобластома, характеризуясь прогрессированием опухоли в течение 3 месяцев, начиная с состояния без клинических или патологических отклонений (Ра1йо1оду апб ОепеИск о£ 1йе №πόιι5 ЗуЧепъ. 29-39 ДАКС Ргекк, Ьуоп, Ртапсе, 2000)).
Глиобластома мигрирует вдоль миелинизированных нервов и широко распространяется по центральной нервной системе. В большинстве случаев хирургическое вмешательство приводит лишь к ограниченно устойчивому терапевтическому эффекту. Злокачественные клетки глиомы ускользают от обнаружения иммунной системой хозяина за счет выработки иммуноподавляющих веществ, которые нарушают пролиферацию Т-клеток и выработку иммуностимулирующего цитокина ИЛ-2.
Внутричерепные новообразования могут возникнуть из любых структур или видов клеток, присутствующих в ЦНС, включая головной мозг, мягкие мозговые оболочки, мозговой придаток, череп и даже остаточную эмбриональную ткань. Общая ежегодная частота заболеваемости первичными опухолями головного мозга в Соединенных Штатах составляет 14 случаев на 100000. Наиболее распространенные первичные опухоли головного мозга - менингиомы, составляющие 27% всех первичных опухолей головного мозга, и глиобластомы, составляющие 23% всех первичных опухолей головного мозга (причем на счет глиобластомы приходятся 40% всех случаев злокачественных опухолей головного мозга взрослого населения). Многие из этих опухолей агрессивны и имеют высокую степень злокачественности. Первичные опухоли головного мозга являются наиболее распространенными солидными опухолями у детей и второй по частоте причиной смерти от рака после лейкемии у детей.
Поиск методов эффективного лечения пациентов от глиобластом продолжается и сейчас. Была изучена иммунотерапия, или лечение посредством стимуляции иммунной системы, в целях борьбы с данными неопластическими клетками. Первые обнадеживающие результаты от использования иммунотера- 1 023013 певтического подхода для пациентов, страдающих от глиобластомы, были получены Νογ11ι\υο51 ТНегареийск с использованием ЭСУах Втат, который представляет собой основанную на клетках вакцинацию с использованием полученных от пациента дендритных клеток, нагруженных лизатами аутологичных опухолевых клеток, и Се11Дех, в котором использовался пептид из ΕΟΡΚνΙΙΙ для индуцирования антигенспецифических ответов ЦТЛ, которые, в свою очередь, соотносились с увеличенным средним сроком выживаемости по сравнению со сроками при использовании стандартного лечения (НеппЬегдег е1 а1., 2006).
Колоректальная карцинома.
По данным Американского общества рака, колоректальный рак (КРР) занимает третье место по частоте распространения в США, это заболевание поражает ежегодно более 175000 новых пациентов. В США, Японии, Франции, Германии, Италии, Испании и Великобритании оно поражает более 480000 пациентов. Это одна из наиболее частых причин смертности от рака в развитых странах. 1-годичный и 5летний срок выживаемости для людей с колоректальным раком составляет 84 и 64% соответственно. Срок выживаемости продолжает снижается после 5 лет до 57% по истечении 10 лет после постановки диагноза. Если колоректальный рак обнаруживают на ранней, локализованной стадии, то 5-летняя выживаемость составляет 90%; однако на этой стадии диагностируются лишь 39% случаев заболевания колоректальным раком, по причине слишком низкого процента обследований. После того как рак распространился регионально, поразив соседние органы или лимфатические узлы, 5-летняя выживаемость сокращается до 68%. Для лиц с отдаленными метастазами 5-летняя выживаемость составляет 10%.
Исследователи предполагают, что возникновение колоректального рака является результатом взаимодействия между наследственными факторами и факторами окружающей среды. В большинстве случаев появляются аденоматозные полипы, становясь предшественниками колоректальных опухолей, хотя процесс их перехода в опухоль может занять много лет. Первостепенный фактор риска для заболевания колоректальным раком - это возраст, в 90% случаев диагноз был поставлен в возрасте более 50 лет. Другие факторы риска заболевания колоректальным раком по данным Американского общества рака включают употребление алкоголя, питание с высоким содержанием жиров и/или сырого мяса и неадекватное потребление фруктов и овощей. Число новых случаев продолжает расти, в особенности на территории таких стран, как Япония, где виновником может быть внедрение западных образцов питания с избыточным потреблением жира и мяса и снижение потребления волокнистой пищи. Несмотря на это частота заболеваемости растет не так быстро, как раньше, что может быть связано с увеличением количества скринингов и удалением полипов, предотвращающими прогрессирование заболевания и переход полипов в рак.
Как и при большинстве солидных опухолей, терапия первой линии - это операция, однако только пациенты на ранней стадии могут получить от этого пользу, значительной же доле пациентов диагноз ставится лишь на поздних стадиях заболевания. В химиотерапии колоректального рака на поздних стадиях стандартом лечения являются лечебные схемы, основанные на фторурациле. Большинство подобных схем лечения - это т.н. протоколы РОЬРОХ (инфузия δ-РИ/лейковорин плюс оксалиплатин) и РОБР1К1 (иринотекан, лейковорин, болюсное и длительная инфузия 5-РИ).
Внедрение цитотоксических препаратов третьего поколения, таких как иринотекан и оксалиплатин, увеличило надежду на значительное улучшение эффективности, однако прогнозы до сих пор относительно плохие. Срок выживаемости при метастатической болезни, как правило, составляет приблизительно 20 месяцев, в результате чего беспомощность медицины при данном заболевании остается высокой.
Недавно стало доступным новое поколение медикаментов, действующих на молекулярные мишени, таких как Λν;·ΐ5ΐίη® (бевацизумаб) и ЕтЪйих® (цетуксимаб), а около 40 соединений находятся на поздней стадии клинических исследований для лечения различных стадий колоректального рака. Комбинации из нескольких таких соединений повышают число потенциальных возможностей лечения, ожидаемых в будущем. Подавляющее большинство веществ находятся на 2-й фазе исследований, при этом данные соединения чаще, чем другие разрабатываемые медикаменты против колоректального рака, адресованы против ЕСРК (рецептор эпидермального фактора роста), что связано с тем фактом, что у ~80% пациентов с колоректальным раком наблюдается повышенная экспрессия ЕСРК.
На данный момент проводятся клинические исследования с участием пациентов ΙΙ стадии с комбинацией химиотерапии с одобренными недавно моноклональными антителами (тАЪк) (цетуксимаб + иринотекан или РОБРОХ4; бевацизумаб в качестве монотерапии или в комбинации с РОБРОХ4). Для получения статистически достоверных результатов по данным исследованиям необходимы трех-четырехгодичные периоды наблюдения.
Моноклональные антитела (тАЪ), используемые в настоящее время в онкологии, в целом имеют превосходные шансы на то, что они не будут создавать помех активной иммунотерапии.
Действительно, имеются доклинические (САВКШОУГСН 1999) и клинические данные, предполагающие, что элиминация фактора роста эндотелия сосудов УЕСР (в случае бевацизумаба) вносит положительный вклад в опосредованную ДК (дендритные клетки) активацию Т-клеток (ОкаДа Т., Сйоид С., Таи81к К., Нопд Т., ЗресЮг Ν., Китаг К., ΗιιπνίΙζ Η.Ι., Эе\' I., №хоп А.В., Ьует1у Н.К., С1ау Т., Могке М.А.
- 2 023013
ТНе еГГсс1 οί апй-УЕОР (Негару оп 1шта1иге туе1оЛ се11 апй йепйгШс се1к ίη сапсег раИсШк. Сапсег 1ттипо1 1ттппо1Нсг. 2008 1ап 10.).
Рак предстательной железы и другие опухоли.
Число смертей от рака предстательной железы в 2007 году составит 27050, что делает его наиболее частой причиной смерти от рака у мужчин. Несмотря на то что процент смертности среди белого и афроамериканского населения снижается с начала 1990-х годов, до сих пор число мужчинафроамериканцев более чем в два раза превышает число белых мужчин. Рак предстательной железы является наиболее часто диагностируемым видом рака у мужчин. По неизвестным причинам частота заболеваемости значительно выше среди афроамериканцев, чем среди белых мужчин. Частота заболеваемости раком предстательной железы постоянно менялась на протяжении последних 20 лет: быстрый рост с 1988 по 1992 г., резкое снижение с 1992 по 1995 г. и умеренный рост с 1995 года. Данные тенденции отражают большей частью увеличение числа обследований на рак предстательной железы с помощью анализа крови на простатоспецифический антиген (Р8Л). Умеренный рост частоты заболеваемости за последнее десятилетие связан, скорее всего, с распространенным скринингом Р8Л среди мужчин моложе 65 лет. Частота заболеваемости раком предстательной железы стабилизируется у мужчин 65 лет и старше. Число случаев достигло своего пика для белых мужчин в 1992 г. (237,6 случаев на 100000 человек) и для афроамериканцев - в 1993 г. (342,8 случаев на 100000 человек).
Лечение рака предстательной железы может включать внимательное наблюдение, операцию, лучевую терапию, высокоинтенсивный фокусированный ультразвук (ШРИ), химиотерапию, криохирургию, гормональное лечение или какую-либо их комбинацию. Какая из возможностей является наилучшей зависит от стадии заболевания, оценки по шкале Глисона и уровня Р8Л. Другие важные факторы - это возраст мужчины, общее состояние его здоровья и его отношение к возможным способам лечения и побочным эффектам от них. Так как все способы лечения могут иметь побочные эффекты, такие как эректильная дисфункция и недержание мочи, то в центре внимания при дискуссиях о способе лечения часто стоит возможность нахождения баланса между целью лечения и рисками, связанными с изменением стиля жизни.
Если рак распространился за пределы простаты, то возможности для лечения значительно изменяются, так что большинство врачей, лечащих рак предстательной железы, используют различные номограммы для предсказания вероятности распространения. Лечение с использованием бдительного наблюдения, высокоинтенсивного фокусированного ультразвука (НГРИ), лучевой терапии, криохирургии и операции предлагаются обычно мужчинам, у которых рак остается в пределах предстательной железы. Гормональная терапия и химиотерапия часто предусматриваются для лечения заболевания, которое распространилось за пределы простаты. Однако возможны исключения: лучевая терапия может использоваться для некоторых опухолей на поздних стадиях, а гормональная терапия - для опухолей на ранней стадии. Криотерапия, гормональная терапия и химиотерапия также могут быть предложены, если первоначальное лечение было неудачным и рак прогрессирует.
У значительного числа пациентов с раком предстательной железы, которые подвергаются простатэктомии из-за клинического подозрения на рост новообразования в пределах органа, окончательное гистологическое обследование операционного материала показывает локально интенсивное распространение опухоли за пределы органа. Для этих пациентов существует высокий риск быстрого локального рецидива, обнаруживаемого обычно как повышение уровня Р8Л с точки зрения биохимического рецидивирования заболевания. Терапевтические возможности в данной ситуации включают наружную лучевую терапию и гормональную абляцию; однако значимость данных терапевтических подходов, в особенности в отношении продления жизни пациента в долгосрочной перспективе, не подтверждена. Кроме того, необходимо учитывать возможность связанных с лечением осложнений, таких как появление стриктуры уретры (лучевая терапия), потеря полового влечения и импотенция, риск снижения содержания солей кальция в костях в связи с остеопорозом и существенно возросший риск патологической хрупкости костей (гормональная абляция).
Более 90% всех случаев заболевания раком предстательной железы обнаруживаются на локальной и региональной стадиях; 5-летняя относительная выживаемость для пациентов, опухоли которых были диагностированы на этих стадиях, достигает 100%. В течение последних 25 лет 5-летняя выживаемость для всех стадий в целом увеличилась с 69 до примерно 90%. В соответствии с последними данными относительная 10-летняя выживаемость составляет 93%, а 15-летняя - 77%. Разительное увеличение выживаемости, в особенности 5-летней, отчасти связано с ранней постановкой диагноза и улучшениями в лечении. Несмотря на это сроки выживаемости значительно сокращаются после распространения на другие ткани и органы.
Рак легких.
В 2007 году ожидаются приблизительно 210000 новых случаев в США, что составляет около 15% всех диагнозов рака. Частота заболеваемости значительно снижается среди мужчин, со 102 случаев на 100000 человек в 1984 г. до 78,5 в 2003 г. Среди женщин частота заболеваемости стабилизировалась после долгого периода роста. В целях лечения рак легких классифицируется клинически на мелкоклеточный (13%) или немелкоклеточный (87%).
- 3 023013
Рак легких является наиболее частой причиной смертности от рака как среди мужчин, так и среди женщин. Около 160390 смертей, составляющих приблизительно 29% всех летальных исходов от рака, ожидаются в 2007 году. Начиная с 1987 г., от рака легких ежегодно умирало больше женщин, чем от рака молочной железы. Число смертей среди мужчин значительно снижалось в период с 1991 по 2003 гг., примерно на 1,9% ежегодно. Смертность от рака легких среди женщин сохраняется на неизменном уровне после продолжительного роста на протяжении нескольких десятилетий. Данные тенденции по смертности от рака легких отражают снижение числа курящих на протяжении последних 30 лет.
Вид лечения определяется типом (мелкоклеточный или немелкоклеточный) и стадией ракового заболевания и включают хирургическое вмешательство, лучевую терапию, химиотерапию, а также целенаправленные биологические терапии, такие как бевацизумаб (ΛναδΙίη®) и эрлотиниб (Тагсеуа®). Для локализованного рака в качестве терапии обычно выбирается операция. Последние исследования указывают на то, что выживаемость с немелкоклеточным раком легких ранней стадии улучшается, если за операцией следует химиотерапия. Так как на момент своего обнаружения заболевание обычно распространилось, часто используются лучевая терапия и химиотерапия, иногда в сочетании с операцией. Химиотерапия сама по себе или в сочетании с лучевой терапией является стандартным лечением, выбираемым для мелкоклеточного рака легких; при такой схеме лечения большой процент пациентов испытывает ремиссию, которая в некоторых случаях бывает продолжительной.
Одногодичная относительная выживаемость для рака легких слегка возросла с 37% в 1975-1979 гг. до 42% в 2002 г., во многом благодаря усовершенствованиям в хирургической технике и комбинированным способам лечения. Однако 5-летний срок выживаемости для всех стадий в целом составил лишь 16%. Процент выживаемости для всех случаев, обнаруживаемых, когда заболевание все еще локализовано, составляет 49%; однако только 16% всех случаев рака легких диагностируются на этой ранней стадии.
Таким образом, существует потребность в новом, эффективном и безопасном способе лечения глиобластомы, опухоли предстательной железы, рака молочной железы, рака пищевода, рака толстого кишечника, светлоклеточной почечно-клеточной карциномы, рака легких, ЦНС, яичника, меланомы, рака поджелудочной железы, плоскоклеточной карциномы, лейкемии и медуллобластомы, а также других видов опухолей, демонстрирующих гиперэкспрессию сурвивина и/или других белков по настоящему изобретению, который улучшал бы самочувствие пациентов без применения химиотерапевтических средств или других веществ, которые могут вызывать серьезные побочные эффекты.
Краткое изложение сущности изобретения
В первом своем аспекте настоящее изобретение относится к пептиду, индуцирующему противоопухолевый иммунный ответ, где указанный пептид имеет общую длину между 8 и 16 аминокислот и включает последовательность, которая выбирается из группы §ЕЦ ГО Νο. 1-9, 11-13, 15-24 и 26-30, где указанный пептид связывается с молекулой главного комплекса гистосовместимости человека (МНС) класса I или II, и где указанный пептид способен стимулировать Т-клетки СБ4 и/или СБ8.
Во втором своем аспекте настоящее изобретение относится к нуклеиновой кислоте, кодирующей пептид в соответствии с настоящим изобретением, или вектору экспрессии, способному экспрессировать указанную нуклеиновую кислоту.
В третьем своем аспекте настоящее изобретение относится к клетке-хозяину, включающей нуклеиновую кислоту или вектор экспрессии в соответствии с настоящим изобретением, где указанная клеткахозяин предпочтительно является антигенпрезентирующей клеткой, в частности, дендритной клеткой или антигенпрезентирующей клеткой.
В четвертом своем аспекте настоящее изобретение относится к способу получения активированных цитотоксических Т-лимфоцитов (ЦТЛ) ίη νίίτο, включающему контактирование ЦТЛ ίη νίίτο с нагруженными антигеном молекулами человека МНС I класса, экспрессированными на поверхности подходящей антигенпрезентирующей клетки или искусственной конструкции, имитирующей антигенпрезентирующую клетку, на период времени, достаточного для активации указанных ЦТЛ антиген-специфическим образом, где указанный антиген является пептидом в соответствии с настоящим изобретением.
В пятом своем аспекте настоящее изобретение относится к применению пептида в соответствии с настоящим изобретением, нуклеиновой кислоты или вектора экспрессии в соответствии с настоящим изобретением, клетки в соответствии с настоящим изобретением или активированного цитотоксического Т-лимфоцита, полученного в соответствии с настоящим изобретением для лечения рака или для изготовления медикамента против рака, где указанный медикамент предпочтительно является вакциной. Предпочтительно, если указанный рак выбирается из астроцитомы, пилоидной астроцитомы, дисэмбриопластической нейроэпителиальной опухоли, олигодендроглиомы, эпендимомы, мультиформной глиобластомы, смешанных глиом, олигоастроцитом, медуллобластом, ретинобластом, нейробластом, термином, тератом, ганглиоглиом, ганглиоцитом, центральной ганглиоцитомы, примитивных нейроэктодермальных опухолей (ΡΝΕΤ, к примеру, медуллобластом, медуллоэпителиом, нейробластом, ретинобластом, эпендимобластом), опухолей паренхимы шишковидной железы (к примеру, пинеоцитом, пинеобластом), опухолей, развивающихся из эпендимных клеток, опухолей хороидного сплетения, нейроэпителиальных опухолей неопределенного происхождения (к примеру, глиоматоз головного мозга, астробластом), гли- 4 023013 областом, рака предстательной железы, рака молочной железы, рака пищевода, рака толстого кишечника, почечно-клеточной карциномы, светлоклеточной почечно-клеточной карциномы, рака легких, ЦНС, яичника, меланомы, рака поджелудочной железы, плоскоклеточной карциномы, лейкемии и медуллобластомы, а также других видов опухолей или рака, демонстрирующих гиперэкспрессию сурвивина и/или других белков настоящего изобретения.
В шестом своем аспекте настоящее изобретение относится к набору для индукции противоопухолевого иммунного ответа, включающему: (а) контейнер, который содержит фармацевтическую композицию, содержащую заявленный пептид, заявленную нуклеиновую кислоту, заявленный вектор, заявленную клетку, заявленный активированный цитотоксический Т-лимфоцит или заявленное антитело в буферном растворе или в лиофилизованной форме; и (Ь) второй контейнер, содержащий буферный разбавитель или восстанавливающий раствор для лиофилизованного состава. При необходимости, набор дополнительно включает инструкции по использованию раствора или восстановлению и использованию лиофилизованного состава, фильтр, иглу или шприц.
В седьмом своем аспекте настоящее изобретение относится к антителу, которое специфически связывается с главным комплексом гистосовместимости человека (МНС) класса I или II в комплексе с рестриктированным по НЬА антигеном, где антитело предпочтительно является поликлональным антителом, моноклональным антителом и/или химерным антителом.
Краткое описание чертежей
Фиг. 1 демонстрирует масс-спектры ΕδΙ-жидкостной хроматографии, идентифицирующие опухолеассоциированные пептиды (ТИМАР5) ЮР2ВР3-001 из пробы глиобластомы СВ6010, которые были презентированы рестриктированным по МНС класса I способом. Вкратце, А) цикл сканирования начинался с полного сканирования с высокой точностью масс на спектрометре ОтЬйтар (К = 30000), за чем следовало В) сканирование Μδ/Μδ на ОтЬйтар (К = 7500) на 5 особенно многочисленных ионахпредшественниках с динамическим исключением отобранных ранее ионов. Идентифицированную последовательность пептида подтверждали сравнением генерированного фрагментационного образца естественного пептида С) с фрагментационным образцом синтетического контрольного пептида с идентичной последовательностью Ό);
на фиг. 2 показан профиль экспрессии мРНК генов-мишеней по изобретению, которые в высокой степени гиперэкспрессированы в пробах глиобластомы. Экспрессия этих генов отсутствует или находится на очень низком уровне в нормальных тканях, в то время как она сильно повышена в пробах глиобластомы. Относительная экспрессия мРНК, измеренная с помощью генных чипов, показана для нескольких нормальных тканей и отдельных проб мультиформной глиобластомы (СВМ). Значения являются относительными по отношению к уровням экспрессии на нормальной почке (значение произвольно приравнивается к 1,0). Значения для нормальных тканей были установлены с помощью имеющихся в продаже пулов мРНК. Буквы в скобках обозначают наличие сигнала, как указано в программе анализа. Наличие сигнала обозначает, был ли вообще в пробе специфически детектирован транскрипт, или же не могло наблюдаться значимой детекции. Оно может принимать значения Р (присутствует), А (отсутствует) или М (детектируемо в незначительной степени);
фиг. 2а(а) демонстрирует профиль экспрессии РАВР7, фиг. 2а(Ь) демонстрирует профиль экспрессии ΝΚ2Ε1, фиг. 2Ь(а) демонстрирует профиль экспрессии δΡίΌΚ'Ί. и фиг. 2Ь(Ь) демонстрирует профиль экспрессии ЮР2ВР3. Перевод английских терминов, употребляющихся на фиг. 2а - 2Ь, представлен после фиг. 2Ь(Ь);
на фиг. 3 показан тетрамерный анализ стимулированной микросферой пролиферации СδР-001 и Ж-СШХ-001-специфических СЭ8+ лимфоцитов из периферической крови здорового донора. ПК, обогащенные на лунку 1 х 106 СЭ8+, стимулировали еженедельно микросферами, связанными с анти-СЭ28 плюс опухолевый антиген высокой плотности А*0201/СδР-001 (левая секция) или анти-СО28 плюс опухолевый антиген высокой плотности Α*0201/ΝΡ0Ν4Χ-001 (правая секция). После трех стимуляций ίη νίίτο клетки были окрашены антителом СЭ8 РГТС и тетрамерами с флуоресцентными метками Α*0201/СδР-001 и Α*0201/ΝΡ0Ν4Χ-001. Клетки высаживают на лимфоциты СЭ8+; цифрами представлена процентная доля клеток в обозначенном квадранте среди лимфоцитов СЭ8+;
на фиг. 4 показана аффинность пептидов НЬА I класса по изобретению к молекуле МНС, закодированной аллелем НЬА-А*0201. Константы диссоциации (ΚΌ) пептидов ТИМАР НЬА класса I из изобретения и контрольного пептида НВУ-001 (сильная связывающая сила А*02) были измерены основанным на методике ЕЬКА анализом по рефолдингу МНС (см. примеры).
Детальное описание изобретения
Все термины, используемые здесь, если не указано иное, имеют значения, данные ниже.
Термин пептид используется здесь для обозначения серий аминокислотных остатков, связанных друг с другом типично пептидными связями между альфа-аминными и карбонильными группами смежных аминокислот. Пептиды типично имеют длину 9 аминокислот, но могут быть короче - длиной 8 аминокислот и длиннее - 16 или 10, 11, 12, 13, 14 или 15 аминокислот.
Термин олигопептид используется здесь для обозначения серий аминокислотных остатков, связанных один с другим типично пептидными связями между альфа-аминными и карбонильными группа- 5 023013 ми смежных аминокислот. Длина олигопептида не особенно важна для изобретения до тех пор, пока в нём сохраняются надлежащие эпитоп или эпитопы. Олигопептиды типично бывают менее чем около 30 аминокислотных остатков в длину и более чем около 14 аминокислот в длину.
Термин полипептид обозначает серии аминокислотных остатков, связанных один с другим типично пептидными связями между альфа-аминными и карбонильными группами смежных аминокислот. Длина полипептида не особенно важна для изобретения до тех пор, пока сохраняются надлежащие эпитопы. В отличие от терминов пептид или олигопептид, термин полипептид введён для обозначения молекул, содержащих более приблизительно 30 аминокислотных остатков.
Пептид, олигопептид, белок или полинуклеотид, кодирующий для такой молекулы, является иммуногенным (и, таким образом, иммуногеном в рамках настоящего изобретения), если он способен индуцировать иммунный ответ. В случае настоящего изобретения иммуногенность получает более специфическое определение как способность индуцировать Т-клеточный ответ. Таким образом, иммуноген будет представлять собой молекулу, которая способна индуцировать иммунный ответ, и, в случае настоящего изобретения, молекулу, способную индуцировать ответ Т-клетки.
Для Т-клеточного эпитопа необходим короткий пептид, который связан с рецептором МНС I или II класса, образующий трехчленный комплекс (альфа-цепь МНС класса I, бета-2-микроглобулин и пептид), который может быть распознан Т-клеткой, несущей подходящий Т-клеточный рецептор, связывающийся с комплексом МНС/пептид с подходящей аффинностью. Пептиды, связывающиеся с молекулами МНС I класса, типично имеют длину в 8-14 аминокислот и, особенно типично, длину в 9 аминокислот. Т-клеточные эпитопы, которые связываются с молекулами МНС II класса, типично имеют длину в 12-30 аминокислот. В случае пептидов, которые связываются с молекулами МНС II класса, один и тот же пептид и соответствующий Т-клеточный эпитоп могут иметь общий центральный сегмент, но различаться по общей длине из-за примыкающих последовательностей с различными длинами, расположенными перед аминным концом центральной последовательности и после ее карбоксильного конца соответственно. Рецепторы МНС II класса имеют более открытую структуру, пептиды, связанные с рецепторами МНС II класса, соответствующим образом, не полностью углублены в структуру пептидсвязывающей бороздки молекулы МНС II класса, как то имеет место быть с пептидсвязывающей бороздкой молекулы МНС I класса. Как ни удивительно, это не применимо к пептиду в соответствии с 8ЕО ГО № 1, так как небольшие изменения в длине пептида ведут к экстремальному снижению активности (см. ниже).
У человека имеется три различных генетических локуса, которые кодируют для молекул МНС I класса (молекулы МНС человека называются также человеческими лейкоцитарными антигенами (НЬЛ)): НЬЛ-Л, НЬА-В и НЬЛ-С. НЬЛ-Л*01, НЬЛ-Л*02 и НЬЛ-Л*11 являются примерами различных аллелей МНС I класса, которые могут экспрессироваться этими локусами.
Человеческий геном имеет 3 различных локуса для генов МНС II класса: НЬЛ-ΌΚ, НЬЛ-Όρ и НЬЛΌΡ. Рецепторы МНС II класса являются гетеродимерами, состоящими из альфа- и бета-цепи, которые обе закрепляются в клеточной мембране с помощью трансмембранного участка. НЬЛГОКВ1*04 и НЬЛΌΚΒ1*07 - это два примера различных бета-аллелей МНС II класса, о которых известно, что они кодируются в данных локусах. Аллели II класса сильно полиморфны, к примеру, было описано несколько сотен различных аллелей НЬЛ-ΌΚΒΤ Поэтому для терапевтических и диагностических целей крайне желателен пептид, который связывается с подходящей аффинностью с несколькими различными рецепторами НЬЛ II класса. Пептид, связывающийся с несколькими различными молекулами НЬЛ II класса, называется беспорядочно связывающимся пептидом.
Используемая здесь ссылка на последовательность ДНК включает как однонитевую, так и двунитевую ДНК. Таким образом, специфическая последовательность, если в контексте не указано иное, относится к однонитевой ДНК такой последовательности, дуплексу такой последовательности с его комплементом (двунитевая ДНК) и комплементу такой последовательности. Термин кодирующая область относится к тому участку гена, который естественно или обычно кодирует для продукта экспрессии того гена в его естественном геномном окружении, т.е. участку, кодирующему ίη νίνο для нативного продукта экспрессии гена.
Кодирующая область может быть из нормального, мутировавшего или измененного гена или может даже быть из последовательности ДНК, или же гена, целиком синтезированного в лаборатории с использованием методов, хорошо известных специалистам из области синтеза ДНК.
Термин нуклеотидная последовательность относится к гетерополимеру дезоксирибонуклеотидов.
Нуклеотидная последовательность, кодирующая для конкретного пептида, олигопептида или полипептида, может быть встречающейся в природе или может быть получена синтетически. В целом, фрагменты ДНК, кодирующие пептиды, полипептиды и белки данного изобретения, собраны из фрагментов кДНК и коротких олигонуклеотидных линкеров или же из серий олигонуклеотидов для обеспечения синтетического гена, который способен экспрессироваться в рекомбинантной транскрипционной единице, включающей регуляторные элементы, образованные из микробиального или вирусного оперона.
Термин продукт экспрессии означает полипептид или белок, являющийся естественным продуктом трансляции гена и кодирующих эквивалентов любой последовательности нуклеиновой кислоты, образующихся в результате вырожденности генетического кода и, таким образом, кодирующих для той/тех
- 6 023013 же самой(-ых) нуклеиновой(-ых) кислот(-ы).
Термин фрагмент, если относится к кодирующей последовательности, означает участок ДНК, включающий меньше, чем полную кодирующую область, продукт экспрессии которого обязательно сохраняет ту же самую биологическую функцию или активность, что и продукт экспрессии целой кодирующей области.
Термин сегмент ДНК относится к полимеру ДНК в виде отдельного сегмента или в качестве компонента более крупной конструкции ДНК, которая была образована из ДНК, изолированной по крайней мере один раз в существенно чистой форме, т.е. без контаминирующих эндогенных материалов и в количестве или с концентрацией, позволяющей идентификацию, манипуляцию и получение сегмента и его составных нуклеотидных последовательностей стандартными биохимическими методами, например с использованием вектора для клонирования. Такие сегменты обеспечиваются в форме открытой рамки считывания, не прерываемой внутренними не-транслированными последовательностями или нитронами, которые типично присутствуют в эукариотических генах. Последовательности нетранслированной ДНК могут быть представлены по ходу транскрипции из открытой рамки считывания, где она не интерферирует с манипуляцией или экспрессией кодирующих областей.
Термин праймер означает короткую последовательность нуклеиновой кислоты, которая может быть спарена с одной нитью ДНК и обеспечивает свободный конец 3'ОН, на котором ДНК-полимераза начинает синтезировать дезоксирибонуклеотидную цепь.
Термин промотор означает участок ДНК, задействованный в связывании РНК-полимеразы для инициации транскрипции.
Термин открытая рамка считывания (ОРС) означает серии триплетов, кодирующих для аминокислот без каких-либо терминирующих кодонов, и является последовательностью (потенциально), способной транслироваться в белок.
Понятие изолированный означает, что материал удален из его исходного окружения (к примеру, естественное окружение, если он встречается в природе). Например, встречающийся в природе полинуклеотид или полипептид, представленный в живых организмах, не является изолированным, но тот же самый полинуклеотид или полипептид, выделенный из некоторых или всех сосуществующих материалов природной системы, является изолированным. Такие полинуклеотиды могли быть частью вектора и/или такие полинуклеотиды или полипептиды могли быть частью композиции и все-таки могли быть изолированы, так что такой вектор или композиция не является частью своего естественного окружения.
Полинуклеотиды и рекомбинантные или иммуногенные полипептиды, раскрытые в соответствии с настоящим изобретением, могут также быть в очищенной форме. Термин очищенный не требует абсолютной чистоты; скорее он предназначен для дачи относительного определения и может включать препараты с высокой очисткой или препараты только с частичной очисткой, в соответствии с тем, как эти термины понимаются специалистами в соответствующей области. Например, отдельные клоны, изолированные из библиотеки кДНК, обычно очищались до электрофоретической чистоты. Очистка исходного материала или природного материала до по крайней мере одного порядка величины, предпочтительно двух или трех порядков и более предпочтительно четырех или пяти порядков величины определенно рассматривается. Более того, определенно рассматривается заявленный полипептид, чистота которого составляет предпочтительным образом 99,999 или по крайней мере 99,99 или 99,9 и еще более желательно 99 мас.% или более.
Нуклеиновые кислоты и продукты экспрессии полипептида, раскрываемые в соответствии с настоящим изобретением, в равной степени как и векторы экспрессии, содержащие такие нуклеиновые кислоты и/или такие полипептиды, могут быть в обогащенной форме. Используемый здесь термин обогащенный означает, что концентрация материала по крайней мере в приблизительно 2, 5, 10, 100 или 1000 раз выше его естественной концентрации (например), преимущественно 0,01, предпочтительно по крайней мере около 0,1 мас.%. Рассматриваются также препараты с около 0,5, 1, 5, 10 и 20 мас.%. Последовательности, конструкции, векторы, клоны и другие материалы, включенные в настоящее изобретение, могут предпочтительно быть в обогащенной или изолированной форме.
Термин активный фрагмент означает фрагмент, который дает иммунный ответ (т.е. обладает иммуногенной активностью), если он введен отдельно или опционально с подходящим адъювантом животному, такому как млекопитающее, например кролику или мыши, также включая человека; таковой иммунный ответ, принимающий форму стимуляции ответа Т-клетки, у животного-реципиента, такого как человек. Альтернативно активный фрагмент может также быть использован для инициации ответа Тклетки ίη νίΐΓΟ.
Используемые здесь термины участок, сегмент и фрагмент, если они использованы по отношению к полипептидам, относятся к непрерывной последовательности остатков, таких как аминокислотные остатки, последовательность которых формирует подкласс более крупной последовательности. Например, если полипептид был подвергнут обработке любой из известных эндопептидаз, таких как трипсин или химотрипсин, то полученные в результате такой обработки олигопептиды будут представлять участки, сегменты или фрагменты исходного полипептида. Это означает, что любой таковой фрагмент будет обязательно содержать как часть его аминокислотной последовательности сегмент, фрагмент или
- 7 023013 участок, который в значительной степени идентичен, если не в точности идентичен последовательности 8ЕО ГО № 1 по 30, которая соответствует встречающимся в природе или материнским белкам последовательностей с 8ЕО ГО № 1 по 30. При использовании по отношению к полинуклеотидам такие термины относятся к продуктам, полученным при обработке указанных полинуклеотидов любой из известных эндонуклеаз.
В соответствии с настоящим изобретением термин процентная доля идентичности или идентичный с процентной долей, если он относится к последовательности, означает, что последовательность сравнивается с заявленной или описанной последовательностью после противопоставления сравниваемой последовательности (Сравниваемая последовательность) описанной или заявленной последовательностью (Контрольная последовательность). Процентная доля идентичности определяется затем по следующей формуле:
Процентная доля идентичности = 100 [I -(С/К)], где С является числом различий между Контрольной последовательностью и Сравниваемой последовательностью по длине противопоставления между Контрольной последовательностью и Сравниваемой последовательностью, где (ί) каждое основание или аминокислота в Контрольной последовательности, которые не имеют соответствующего противопоставленного основания или аминокислоты в Сравниваемой последовательности, и (п) каждая брешь в Контрольной последовательности и (ίίί) каждое противопоставленное основание или аминокислота в Контрольной последовательности, которые отличаются от противопоставленного основания или аминокислоты в Сравниваемой последовательности, представляют собой различие; и
К - это число оснований или аминокислот в Контрольной последовательности по длине противопоставления Сравниваемой последовательности с любой брешью, образующейся в Контрольной последовательности, считающейся также за основание или аминокислоту.
Если существует противопоставление между Сравниваемой последовательностью и Контрольной последовательностью, для которых процентная доля идентичности по расчетам приблизительно равна или выше установленной минимальной Процентной доли идентичности, тогда Сравниваемая последовательность имеет установленную минимальную процентную долю идентичности с Контрольной последовательностью, если даже могут существовать противопоставления, в которых вышеупомянутая расчетная Процентная доля идентичности меньше, чем установленная Процентная доля идентичности.
Исходные пептиды, раскрываемые здесь, могут быть модифицированы путём замещения одного или нескольких остатков в различных, по возможности отобранных, местах пептидной цепи, если не заявлено иное. Такие замещения могут носить консервативный характер, например, где одна аминокислота заменяется аминокислотой с похожей структурой и характеристиками, так же как при замене гидрофобной аминокислоты на другую гидрофобную аминокислоту. Ещё более консервативным будет замещение аминокислот одинакового или похожего размера и химического характера, такое как при замене лейцина на изолейцин. В исследованиях вариаций последовательностей внутри семейств встречающихся в природе гомологичных белков определённые замещения аминокислот переносятся гораздо чаще, чем другие, и они часто проявляют взаимосвязь со сходствами по размеру, заряду, полярности и гидрофобности между исходной аминокислотой и её заменой; и таковой является основа определения консервативных замещений.
Консервативные замещения определены здесь как обмены внутри одной из последующих пяти групп: группа 1 - малые, алифатические, неполярные или слабо полярные остатки (А1а, 8сг. ТЬг, Рго, С1у); группа 2 - полярные, отрицательно заряженные остатки и их амиды (Акр, Аки, С1и, С1и); группа 3 полярные, положительно заряженные остатки (Ηίκ, Агд, Ьук); группа 4 - крупные, алифатические, неполярные остатки (Мер Ьеи, 11е, Уа1, Сук); и группа 5 - крупные, ароматические остатки (РЬе, Туг, Тгр).
Менее консервативные замещения могут охватывать замещение одной аминокислоты другой, имеющей похожие характеристики, но отличающейся в какой-то степени по размеру, как в случае замещения аланина остатком изолейцина. Высоко неконсервативные замещения могут охватывать замещение кислой аминокислоты другой, которая имеет полярность, или даже такой, которая имеет щелочной характер. Такие радикальные замещения не могут, однако, быть отвергнуты как потенциально неэффективные из-за того, что химические эффекты не полностью предсказуемы, и радикальные замещения могут привести к увеличению случайных эффектов, в противном случае не предсказуемых, исходя из обычных химических принципов.
Разумеется, в таких замещениях могут участвовать другие структуры, отличающиеся от обычных Ь-аминокислот. Таким образом, И-аминокислоты могут быть замещены Ь-аминокислотами, обычно встречающимися в антигенных пептидах по изобретению и также охватываемые настоящим раскрытием сущности изобретения. Кроме того, аминокислоты, содержащие нестандартные К-группы (т.е. К-группы, отличающиеся от обнаруженных в распространённых 20 аминокислотах природных белков) могут быть также использованы в целях замещения для получения иммуногена и иммуногенных полипептидов в соответствии с настоящим изобретением.
- 8 023013
Если были произведены замещения в более чем одной позиции для получения пептида с практически эквивалентной или большей антигенной активностью, чем та, что определена ниже, то комбинации таких замещений будут проанализированы для определения того, приведут ли эти комбинации замещений к дополнительным или синергетическим эффектам по отношению к антигенности пептида. По большей части не более 4 позиций внутри пептида должны замещаться одновременно.
Термин Т-клеточный ответ означает специфическую пролиферацию и активацию эффекторных функций, индуцированных пептидом ίη νίίτο или ίη νίνο. Для ЦТЛ, рестриктированных по МНС класса I, эффекторными функциями может быть лизис клеток-мишеней с введенным импульсным способом пептидом, с введенным импульсным способом предшественником пептида или клеток-мишеней, естественно презентирующих пептид, секреция цитокинов, предпочтительно интерферона-гамма, ΤΝΡ-альфа или ИЛ-2, индуцированная пептидом, секреция эффекторных молекул, предпочтительно гранзимов или перфоринов, индуцированная пептидом, или дегрануляция. Для Т-хелперных клеток, рестриктированных по МНС класса II, эффекторными функциями может быть индуцированная пептидом секреция цитокинов, предпочтительно, ΙΡΝ-гамма, ΤΝΡ-альфа, ИЛ-4, ИЛ-5, ИЛ-10 или ИЛ-2, или индуцированная пептидом дегрануляция. Возможные эффекторные функции ЦТЛ и Т-хелперных клеток не ограничиваются данным списком.
Предпочтительно, чтобы ЦТЛ, специфичные для пептида с 8ЕЦ ГО № 1 по 30, были тестированы относительно замещённых пептидов; концентрация пептида, при которой замещённые пептиды достигают половины максимального роста лизиса относительно фона, составляет не более чем около 1 мМ, предпочтительно не более чем около 1 мкМ, более предпочтительно не более чем около 1 нМ и ещё более предпочтительно не более чем около 100 пМ и наиболее предпочтительно не более чем около 10 пМ. Также предпочтительно, чтобы замещённый пептид распознавался ЦТЛ более чем одного индивида, по крайней мере двух и более предпочтительно трёх индивидов.
Таким образом, эпитопы настоящего изобретения могут быть идентичны встречающимся в природе опухолеассоциированным или опухолеспецифическим эпитопам или могут включать эпитопы, отличающиеся не более чем 4 остатками от контрольного пептида, при условии, что они имеют, по существу, идентичную антигенную активность.
Стимуляция иммунных ответов находится под воздействием присутствия антигенов, распознаваемых иммунной системой хозяина как чужеродные. Открытие существования опухолеассоциированных антигенов улучшило возможности для использования иммунной системы хозяина для способствования иммунному ответу, специфическому для антигенов-мишеней, экспрессированных на поверхности опухолевых клеток, который благодаря данному механизму действия способен вызывать регрессию, задержку или замедление роста опухоли. Различные механизмы объединения обеих ветвей иммунной системы, как гуморальной, так и клеточной, исследуются в настоящее время для иммунотерапии рака.
Специфические элементы клеточных иммунных ответов способны к специфическому распознаванию и уничтожению опухолевых клеток. Изоляция цитотоксических Т-клеток (ЦТЛ) из популяций опухоль-инфильтрирующих клеточных популяций или из периферической крови предполагает, что такие клетки играют важную роль в естественной иммунной защите против рака (СНссусг с1 а1., 1993; Ζοΐι. III с1 а1., 1999). Основываясь на 415 тканевых препаратах пациентов, страдающих от колоректального рака, Оа1оп и соавторы были в состоянии продемонстрировать, что вид, плотность и местонахождение иммунных клеток в опухолевой ткани являются действительно лучшим прогностическим фактором выживаемости пациентов, чем широко используемая классификация опухолей по ΤΝΜ (Оа1оп с1 а1., 2006).
МНС класса I презентируют пептиды, образующиеся из протеолитического расщепления преимущественно эндогенных белков, ΌΡΡΡδ и более крупных пептидов. Молекулы МНС II класса могут встречаться преимущественно на профессиональных антигенпрезентирующих клетках (АПК) и, в первую очередь, презентировать пептиды экзогенных или трансмембранных белков, которые поглощаются АПК в период эндоцитоза и впоследствии процессируются (Сте55№е11, 1994). Комплексы из пептида и молекул МНС класса I распознаются СЭ8-положительными цитотоксическими Т-лимфоцитами, несущими подходящий ТКР (Т-клеточный рецептор), а комплексы из пептида и молекул МНС класса II распознаются СИ4-положительными хелперными Т-клетками, несущими подходящий ТКР. Хорошо известно, что ТКР, пептид и МНС часто встречаются в стехиометрическом соотношении 1:1:1.
СО4-положительные хелперные Т-клетки играют важную роль в индуцировании и поддержании эффективных ответов СО8-положительных цитотоксических Т-клеток (^апд апб ЬМпдкЮпе, 2003; §ип апб Βеνаη, 2003; §Ьеб1оск апб §Ьеп, 2003). Первоначально прайминг и экспансия ЦТЛ в лимфатических узлах поддерживается СГО4+ Т-клетками (ЗсЬоепЬетдет е1 а1., 1998). Один механизм поэтому может служить руководством для наивных СГО8+ клеток к месту функционального взаимодействия СГО4+ Т-клеток - АПК (Са81еШпо е1 а1., 2006). В итоге, образование функциональных клеток памяти СГО8+ в большинстве случаев зависит от поддержки СГО4+ Т-клеток (§ип апб Βеνаη, 2003; 1ап85еп е1 а1., 2003). По этим причинам идентификация СО4-положительных Т-клеточных эпитопов, получаемых из опухолеассоциированных антигенов (ТАА), может быть чрезвычайно важна для разработки фармацевтических препаратов для инициации противоопухолевых иммунных ответов (КоЬауакЫ е1 а1., 2002; Οίπ е1 а1., 2003; Сп)аОс е1 а1., 2003). В месте опухоли Т-хелперные клетки поддерживают благоприятное для ЦТЛ цитокиновое окру- 9 023013 жение (Οίη апб В1апкеп8!еш, 2000; Мойага е! а1., 2006) и привлекают эффекторные клетки, к примеру, ЦТЛ, естественные киллерные клетки (ΝΚ), макрофаги, гранулоциты (Маг/о е! а1., 2000; Н\уапд е! а1., 2007).
При отсутствии воспаления экспрессия молекул МНС II класса преимущественно рестриктирована по клеткам иммунной системы, в особенности профессиональным антигенпрезентирующим клеткам (АПК), например моноцитам, образованным из моноцитов клеткам, макрофагам, дендритным клеткам. Неожиданно было обнаружено, что клетки опухоли раковых пациентов экспрессируют молекулы МНС класса II (Иепд]е1 е! а1., 2006).
На моделях млекопитающих животных, например мышах, было показано, что даже при отсутствии эффекторных клеток (т.е. СИ8-положительных Т-лимфоцитов), СИ4-положительных Т-клеток достаточно для ингибирующего проявления опухолей посредством ингибирования ангиогенеза при секреции интерферон-гамма (ΣΡΝγ) (Οίη апб В1апкеи8!еш, 2000). Также предлагалось прямое уничтожение опухолевых клеток цитотоксическими СЭ4+ Т-клетками посредством лимфотоксинов и гранзимов В (Реппа е! а1., 1992; Ыбаиа е! а1., 1992).
К тому же было показано, что СИ4-положительные Т-клетки, распознающие пептиды из опухолеассоциированных антигенов, презентированные молекулами НЬА класса II, могут препятствовать опухолевой прогрессии посредством индукции ответов антител (АЬ) (Кеппебу е! а1., 2003).
В отличие от опухолеассоциированных пептидов, связывающихся с молекулами НЬА класса I, до сих пор было описано лишь небольшое число лигандов класса II опухолеассоциированных антигенов (ТАА).
Так как конститутивная экспрессия молекул НЬА класса II обычно ограничена клетками иммунной системы (Маек е! а1., 1996), то возможность изоляции пептидов класса II напрямую из первичных опухолей считалась невозможной. Тем не менее Оепд)е1 с соавторами недавно удалось идентифицировать ряд эпитопов МНС класса II напрямую из опухолей (\УО 2007/028574, ЕР 1760088 В1; (Иепд]е1 е! а1., 2006).
Антигены, которые распознаются опухолевыми специфическими цитотоксическими Тлимфоцитами, т.е. их эпитопами, могут быть молекулами, образованными из любого класса белков, таких как ферменты, рецепторы, факторы транскрипции и т.д., которые экспрессируются и, по сравнению с не измененными клетками того же происхождения, находятся в повышенном количестве в клетках соответствующей опухоли.
Актуальная классификация опухолеассоциированных антигенов (ТАА) включает следующие основные группы (ЫоуеШпо е! а1., 2005).
1. Раковые антигены семенника: первые в истории идентифицированные ТАА, которые могут распознаваться Т-клетками (уап бег Вгиддеп е! а1., 1991), принадлежат к этому классу, называвшемуся первоначально антиген ракового семенника (СТ), так как его члены экспрессируются в отличных по гистологической структуре опухолях человека, а среди нормальных тканей - только в сперматоцитах/сперматогониях семенника и изредка в плаценте. Так как клетки семенника не экспрессируют молекулы НЬА I и II класса, то эти антигены не могут быть распознаны Т-клетками в нормальных тканях и поэтому могут рассматриваться как иммунологически опухолеспецифические. Хорошо известными примерами антигенов СТ являются члены семейства МАСЕ или ΝΥ-Ε8Ο-1.
2. Дифференциационные антигены: данные ТАА встречаются в опухолевых и нормальных тканях, из которых образуется опухоль; большинство из них имеется в меланомах и нормальных меланоцитах. Многие из этих линиеспецифических белков меланоцитов участвуют в биосинтезе меланина и поэтому не являются опухолеспецифическими, однако, несмотря на это, они широко применяются в противораковой терапии. Примеры включают, но не ограничиваются, тирозиназой и Ме1ап-А/МАКТ-1 для меланомы или Р8А для рака простаты.
3. Гиперэкспрессированные ТАА: гены, кодирующие широко экспрессированные ТАА, были обнаружены в отличных по гистологической структуре опухолях, а также во многих нормальных тканях, в основном, с более низким уровнем экспрессии. Возможно, что многие эпитопы, процессируемые и потенциально презентируемые нормальными тканями, находятся ниже порогового уровня для распознавания Т-клетками, в то время как их гиперэкспрессия в опухолевых клетках может инициировать противораковый ответ, нарушая установившуюся ранее толерантность. Известными примерами ТАА этого класса являются Нег-2/пеи, сурвивин, теломераза или \УТ1.
4. Опухолеспецифические антигены: данные уникальные ТАА образуются из мутаций нормальных генов (таких как β-катенин, СИК4 и т.д.). Некоторые из этих молекулярных изменений ассоциированы с неопластической трансформацией и/или прогрессией. Опухолеспецифические антигены, в основном, способны индуцировать сильные иммунные ответы, не заключая в себе риска аутоиммунных реакций по отношению к нормальным тканям. С другой стороны, данные ТАА в большинстве случаев релевантны только для определенной опухоли, на которой они были идентифицированы, и обычно не являются общими для многих отдельных опухолей.
5. ТАА, образующиеся в результате аномальных пост-трансляционных модификаций: такие ТАА могут образоваться из белков, которые не являются ни специфическими, ни гиперэкспрессированными в
- 10 023013 опухолях, однако, несмотря на это, становятся опухолеассоциированными в ходе пост-трансляционных процессов, происходящих первоначально в опухолях. Примеры для этого класса берут свое начало в измененных паттернах гликозилирования, приводящих к новым эпитопам в опухолях, как в случае МиС1, или таких процессах как белковый сплайсинг во время деградации, который может или не может быть опухолеспецифическим (Напаба с1 а1., 2004; Ущпсгоп с1 а1., 2004).
6. Онковирусные белки: данные ТАА являются вирусными белками и могут играть ведущую роль в онкогенном процессе, и, так как они являются чужеродными (не человеческого происхождения), они могут провоцировать Т-клеточный ответ. Примерами таких белков являются вирусные белки человеческой папилломы типа 16, Е6 и Е7, которые экспрессированы в карциноме шейки матки.
Для того чтобы белки были узнаны цитотоксическими Т-лимфоцитами в качестве опухолеспецифического или -ассоциированного антигена, и в целях применения в терапии должны выполняться особые предварительные требования. Антиген должен экспрессироваться преимущественно опухолевыми клетками, а не здоровыми тканями или в сравнительно малом объеме. В дальнейшем желательно, чтобы соответствующий антиген не только присутствовал в каком-либо виде опухоли, но и также имел высокую концентрацию (т.е. число копий соответствующего пептида на клетку). Опухолеспецифические и опухолеассоциированные антигены часто образованы из белков, напрямую задействованных в трансформации нормальной клетки в опухолевую, в связи с функцией, например, при контроле клеточного цикла или подавлении апоптоза. Кроме того, мишени нисходящего пути белков, напрямую являющихся причиной трансформации, могут быть также представлены в повышенном количестве и, таким образом, косвенно опухолеассоциированными. Такие косвенно опухолеассоциированные антигены могут также быть мишенями вакцинационного подхода (ЫпдНЛаыца с1 а1., 2004). В обоих случаях необходимо, чтобы эпитопы присутствовали в аминокислотной последовательности антигена, поскольку такой пептид (иммуногенный пептид), который образован из опухолеассоциированного антигена, должен вести ίη νίίτο или ίη νίνο к Т-клеточному ответу.
В основном, любой пептид, способный связываться с молекулой МНС, может выполнять функцию Т-клеточного эпитопа. Предварительным условием для индукции Т-клеточного ответа ίη νίίτο или ίη νίνο является присутствие Т-клетки с соответствующим ТКР и отсутствие иммунологической толерантности к данному конкретному эпитопу.
Поэтому опухолеассоциированные антигены (ТАА) являются отправным пунктом для разработки противораковой вакцины. Методы идентификации и характеристики ТАА основаны на использовании ЦТЛ, которые могут быть изолированы у пациентов или здоровых субъектов, или же они основаны на генерировании дифференциальных транскрипционных профилей или дифференциальных паттернов пептидной экспрессии между опухолевыми и нормальными тканями (Ьетте1 с1 а1., 2004; ХУсиъсНспк с1 а1., 2002).
Однако идентификация генов, гиперэкспрессированных в опухолевых тканях или человеческих опухолевых клеточных линиях или же селективно экспрессированных в таких тканях или клеточных линиях, не дает точной информации об использовании антигенов, транскрибированных с данных генов, в иммунотерапии. Это обусловлено тем, что только отдельная субпопуляция эпитопов этих антигенов подходит для такого применения, так как Т-клетка с соответствующим ТКР должна быть в наличии, и необходимо, чтобы отсутствовала или была минимальной иммунологическая толерантность к этому конкретному эпитопу. Поэтому важно выбрать лишь те пептиды из гиперэкспрессированных или селективно экспрессированных белков, которые презентируются в соединении с молекулами МНС, против которых может быть обнаружена функциональная Т-клетка. Такая функциональная Т-клетка определяется как Тклетка, которая при стимуляции специфическим антигеном может быть распространена клонально и способна к выполнению эффекторных функций (эффекторная Т-клетка).
Т-хелперные клетки играют важную роль в управлении эффекторной функцией ЦТЛ в противоопухолевом иммунитете. Эпитопы Т-хелперных клеток, инициирующие ответы Т-хелперных клеток типа ТН1, поддерживают эффекторные функции СБ8-положительных киллерных Т-клеток, которые включают цитотоксические функции, направленные против опухолевых клеток, проявляющих опухолеассоциированные пептиды/МНС-комплексы на их клеточной поверхности. Таким образом, опухолеассоциированные пептидные эпитопы Т-хелперных клеток, одни или в комбинации с другими опухолеассоциированными пептидами, могут служить в качестве активных фармацевтических ингредиентов вакцинных композиций, которые стимулируют противоопухолевые иммунные ответы.
Так как оба вида ответов, зависящие от СБ8 и от СБ4. вносят свой вклад в противоопухолевый эффект сообща и усиливая друг друга, то идентификация и характеристика опухолеассоциированных антигенов, распознаваемых как СБ8+ ЦТЛ (лиганд: молекула МНС I класса + пептидный эпитоп), так и СБ4положительными хелперными Т-клетками (лиганд: молекула МНС II класса + пептидный эпитоп) являются важными при разработке противоопухолевых вакцин.
Ввиду серьезных побочных эффектов и расходов, связанных с лечением рака, крайне необходимы улучшенные методы прогнозирования и диагностики. Поэтому существует необходимость в идентификации других факторов, репрезентирующих биомаркеры рака вообще и глиобластомы в частности. Кроме того, существует необходимость в идентификации факторов, которые могут быть использованы при
- 11 023013 лечении рака вообще и глиобластомы в частности.
Кроме того, не существует признанного подхода к лечению пациентов с раком предстательной железы с биохимическим рецидивом после радикальной простатэктомии, обычно вызываемым резидуальным остатком опухоли ίη δίΐιι при наличии локально прогрессирующего роста опухоли. Желательны были бы новые терапевтические подходы, которые бы сопровождались низкой смертностью с адекватной терапевтической эффективностью по сравнению с имеющимися на данный момент терапевтическими подходами.
Данным изобретением обеспечиваются пептиды, которые полезны для лечения глиобластомы, рака предстательной железы и других опухолей, которые гиперэкспрессируют сурвивин и/или С8Р и/или другие пептиды по изобретению. Как непосредственно показал масс-спектрометрический анализ, эти пептиды естественно презентировались молекулами НЬА на пробах первичной глиобластомы человека (см. пример 1 и фиг. 1) или в случае 8ΕΟ ГО №: 26, предсказанной по алгоритму 8УЕРЕ1ТН1 (Каттепкее с1 а1., 1995), они должны беспорядочно связываться с аллелями НЬА-ИК, НЬА-ИКВ1*01, ИКВ1*03, ИКВ1*04, ИКВ1*11 и ИКВ1*15. Основываясь на этих данных и частоте этих часто встречающихся аллелей ИКВ1, можно предположить, что 92% А*02-положительных европеоидов экспрессируют по крайней мере один аллель ИКВ1, который связывается с пептидом в соответствии с 8ΕΟ ГО № 26.
Исходный ген, из которого образованы 8ΕΟ ГО № 26 по 30 - сурвивин - был представлен в гиперэкспрессированном состоянии при глиобластоме, опухоли предстательной железы, раке молочной железы, раке пищевода, колоректальном раке, светлоклеточной почечной карциноме, раке легких, ЦНС, яичника, меланоме (Татт е1 а1. 1998), раке поджелудочной железы, плоскоклеточной карциноме, лейкемии и медуллобластоме в сравнении с нормальными тканями (см. пример 2 и фиг. 2), демонстрируя высокую степень ассоциации данных пептидов с опухолью, т.е. эти пептиды в большом количестве презентируются на опухолевой ткани, но не на нормальных тканях. В νΟ 2004/067023 описываются рестриктированные по МНС класса I пептиды, образованные из опухолеассоциированного антигена сурвивина, пептиды которого способны связываться с высокой аффинностью с молекулами I класса НЬА.
Связанные с НЬА пептиды могут распознаваться иммунной системой, специально Тлимфоцитами/Т-клетками. Т-клетки могут разрушать клетки, презентирующие распознанный комплекс НЬА/пептид; к примеру, опухолевые клетки глиобластомы, презентирующие полученные пептиды. Тхелперные клетки, активированные образованными из сурвивина пептидами, могут ингибировать васкуляризацию опухоли, могут привлекать эффекторные клетки иммунной системы и способствовать праймингу ЦТЛ, пролиферации и устойчивому СИ8+ Т-клеточному ответу.
Показано, что все пептиды настоящего изобретения в состоянии стимулировать Т-клеточные ответы (см. пример 3 и фиг. 3). Таким образом, пептиды полезны для генерирования иммунного ответа у пациента, который может уничтожать опухолевые клетки. Иммунный ответ у пациента может быть индуцирован при непосредственном введении описанных пептидов или подходящих веществпредшественников (к примеру, удлиненных пептидов, белков или нуклеиновых кислот, кодирующих эти пептиды) пациенту, в идеальном случае в комбинации с веществом, усиливающим иммуногенность (т.е. адъювантом). От иммунного ответа, вызванного такой терапевтической вакцинацией, может ожидаться, что он будет высоко специфическим против опухолевых клеток, так как целевые пептиды настоящего изобретения не презентируются на нормальных тканях со сравнимыми количествами копий, предотвращая тем самым риск нежелательных аутоиммунных реакций против нормальных клеток у пациента.
Фармацевтические композиции включают пептиды как в свободной форме, так и в форме фармацевтически приемлемой соли.
Используемое здесь понятие фармацевтически приемлемая соль относится к производным раскрытых пептидов, причём пептид модифицирован путём получения кислотных или щелочных солей агента. Например, кислотные соли получают из свободного основания (типично, где нейтральная форма лекарственного средства имеет нейтральную группу -ИН2) с применением реакции с подходящей кислотой. Подходящие кислоты для получения кислотных солей включают как органические кислоты, например уксусную кислоту, пропионовую кислоту, гликолевую кислоту, пировиноградную кислоту, щавелевую кислоту, оксиянтарную кислоту, малоновую кислоту, янтарную кислоту, малеиновую кислоту, фумаровую кислоту, винную кислоту, лимонную кислоту, бензойную кислоту, коричную кислоту, миндальную кислоту, метансульфоновую кислоту, этансульфоновую кислоту, р-толуолсульфокислоту, салициловую кислоту и подобные, так и неорганические кислоты, например хлористоводородную кислоту, бромистоводородную кислоту, серную кислоту, азотную кислоту, фосфорную кислоту и подобные. И наоборот, приготовление щелочных солей кислотных составляющих, которые могут присутствовать на пептиде, приготовляются при использовании фармацевтически приемлемого основания, такого как гидроксид натрия, гидроксид калия, гидроксид аммония, гидроксид кальция, триметиламин или подобных.
В одном особенно предпочтительном воплощении фармацевтические композиции включают пептиды в виде солей уксусной кислоты (ацетаты) или хлористоводородной кислоты (хлориды).
Кроме того, пептиды настоящего изобретения полезны не только для лечения рака, но и также в качестве диагностических средств. Так как пептиды были получены из глиобластомы, и так как было определено, что данные пептиды не присутствуют в нормальных тканях, то эти пептиды могут быть исполь- 12 023013 зованы для постановки диагноза о наличии рака.
Присутствие заявленных пептидов на тканевых биоптатах может помочь патологу в постановке диагноза рака. Детекция конкретных пептидов с помощью антител, масс-спектрометрии или других методов, известных из уровня техники, могут дать знать патологу, что ткань является злокачественной или воспаленной или же поражена заболеванием общего порядка. Присутствие групп пептидов может позволить классифицировать или выделить подклассы пораженных тканей.
Детекция пептидов на образцах пораженной заболеванием ткани может позволить принять решение о преимуществах от терапии, воздействующей на иммунную систему, в особенности, если Т-лимфоциты, как известно или ожидается, задействованы в механизме действия. Отсутствие экспрессии МНС является хорошо описанным механизмом, при котором инфицированные или злокачественные клетки уклоняются от иммунного надзора. Таким образом, присутствие пептидов показывает, что этот механизм не используется проанализированными клетками.
Пептиды могут использоваться в анализе ответов лимфоцитов против таковых пептидов, таких как Т-клеточные ответы или ответы антител против пептида или пептида в комплексе с молекулами МНС. Такие иммунные ответы лимфоцитов могут использоваться в качестве прогностических маркеров для принятия решения о дальнейших этапах терапии. Данные иммунные ответы могут также использоваться в качестве суррогатных маркеров в иммунотерапевтических подходах, направленных на индуцирование ответов лимфоцитов с помощью различных средств, как, например, вакцинации белком, нуклеиновыми кислотами, аутологичными материалами, адоптивного переноса лимфоцитов. При генной терапии ответы лимфоцитов на пептиды могут быть рассмотрены в рамках оценки побочных эффектов. Мониторинг ответов лимфоцитов может также быть ценным инструментом для последующих обследований в случае трансплантации, к примеру, для детекции реакций хозяин против трансплантата и трансплантат против хозяина.
Пептиды могут использоваться для генерации и разработки специфических антител к комплексам МНС/пептид. Они могут быть использованы в терапии, нацеливающей токсины или радиоактивные вещества на пораженную ткань. Другим видом использования данных антител может быть нацеливание радионуклидов на пораженную ткань в целях визуализации, такой как РЕТ (позитронно-эмиссионная томография). Это может помочь в обнаружении небольших метастазов или в определении размера и точного расположения пораженных тканей.
Кроме того, пептиды могут быть использованы для верификации диагноза патолога, поставленного на основании биоптата.
В табл. 1 показаны пептиды в соответствии с настоящим изобретением, соответствующие им номера последовательностей 5>Еф ГО №; аллели НЬЛ, с которыми связываются соответствующие пептиды, и исходные белки, из которых могут быть образованы данные пептиды. Особенно интересен факт, что пептид в соответствии с 5>Еф ГО № 1 связывается с НЬЛ-ЭК в равной степени, как и с НЬЛ-Л*02, таким образом, вызывая два различных ответа.
Таблица 1. Пептиды изобретения
послед-тн Код пептида Последовательность Аллели НЬА Исходный белок (белки)
1 ΝΕΟΝ4Χ-001 ΝΙ,ϋΙΊ,ΜΤΥν ΗίΑ-Α*02 ΝίΟΝ4Χ
2 8ЬС01С1-001 УЫАОНЗЬ НЬА-А*02 8ЬСО1С1
3 АС8-001 К1МЕК1ОЕУ НЬА-А*02 АС8ВС1
4 ВСА-001 РЬСОРРЕКЬ НЬА-А‘02 ВСА14
5 ВСА-002 А1ДУАЩР8Е1, НЬА-А*02 вели
6 СН13Ы-010 ΤΙΎΟΜΙ,ΝΤΙ, НЬА-А*02 СН13Ы
7 СЫР2-001 δΕΝΕΕΚνίί НЬА-А*02 СЫР2
8 ΟΤΝΑ-001 ΚΕρϋΕΑΥΟν НЬА-А*02 □ΤΝΑ
9 ЕОРК-007 Αΐ.Ανϊ.βΧΥϋΑ НЬА-А*02 ЕОРК.
10 РАВР7-001 υτροοννΑν НЬА-А*02 РАВР7
- 13 023013
11 ОРАР-001 ΝίΑςϋΙ,ΑΤν НЬА-А*02 ОРАР
12 СРК56-002 РЬЬЗЕРУАЬ НЬА-А*02 СРК56
13 СИ-001 ΝΙίΕφίνδν НЬА-А*02 СИА4
14 ЮР2ВРЗ-001 ККЗЕПТфУ НЬА-А*02 ΙΟΡ2ΒΡ3
15 МЬС-001 δννΕνίΑΟΙ НЬА-А*02 МЬС1
16 ΝΕ8-001 ОГТ,>801АС>У НЬА-А*02 ΝΕ8
17 ΝΕ8-002 3ΕρΡ.ΝΕΕ3Ι. НЬА-А*02 ΝΕ8
18 ΝΕ3-003 ΡίΡΡΟΤΕΝφΕί НЬА-А*02 ΝΕ8
19 ΝΕ8-004 ΝίΛΕΕίΕΟν НЬА-А*02 ΝΕ3
20 ΝΚ2Ε1-001 ΚΙΙδΕΙφΑί НЬА-А*02 ΝΚ2Ε1
21 ΝΒΟΑΜ-ΟΟΙ СЫУННОТЕУ НЬА-А*02 ЫКСАМ
22 ΡϋΡΝ-001 τίνοιινον НЬА-А*02 ΡϋΡΝ
23 ΤΝΰ-001 АМТОЬЬАОУ НЬА-А*02 ТЫС
24 ТМС-002 <31ХАОУРЬА 11ЬА-А*02 ТИС
25 С8Р-001 ТМЬАВЬАЗА НЬА-А*02 С8РС4
26 ΒΙΒ-002 ΤΙ.ΟΕΡΕΚΤϋΚΕΚΑΚΝ НЬА-ОЯ и НЬА-А*02 В1К.С5/сурвивин
27 В1К-002а ТЕОЕРЪКЬОКЕНАКП НЬА-ЬК В1КС5/сурвивин
28 В1К-002Ь РТЕЬТЬСЕР НЕА-А1 В1КС5/сурвивин
29 В1К-002С ЕМЬСЕРГ.КЬ НЬА-А2 В1КС5/сурвивин
30 ΒΙΚ-0026 ΕΡϋίΑφΟΡΥ НЬА-В35 В1КС5/сурвивин
Хондроитин сульфат протеогликан 4 (С8РО4).
С8РО4 (хондроитин сульфат протеогликан) представляет интегральный мембранный хондроитин сульфат протеогликан на зарождающихся перицитах с функциональной ролью в неоваскуляризации (Οζегбет 2006). Во время эмбриогенеза С8РО4 протеогликан экспрессируется на незрелых капиллярах, но при созревании сосудов эта экспрессия утрачивается. Он известен как ранний маркер прогрессии меланомы, присутствующий на клеточной поверхности и вовлеченный в стимуляцию пролиферации, миграции и инвазии опухолевой клетки. С8РО4 сильно экспрессирован в >90% случаях человеческой меланомы. Хотя С8РО4 не является строго опухолеспецифическим, опухолереактивные ответы СЭ4+ Т-клеток у пациентов с меланомой и здоровых индивидов распознают С8РО4693-709 на НЬА-ОК11экспрессирующих клетках меланомы при отсутствии аутоиммунности (Ег£ит1 е! а1., 2007).
Экспрессия С8РО4 улучшает интегрин-опосредованное распространение клеток, фосфориляцию РАК (киназа фокальной адгезии) и активацию ЕКК1/2 (киназа, регулирующая внеклеточные сигналы) (Уапд е! а1., 2004). Кроме того, накоплены доказательства на основе данных ίη νίίτο о том, что С8РО4 играет важную роль в ангиогенезе опухоли. Таким образом, С8РО4-положительные опухоли, как было обнаружено, имеют значительно повышенную степень неоваскуляризации и объем сосудистой массы, и, как было продемонстрировано, С8РО4 отделяет ангиостатин, который в нормальных условиях ингибирует пролиферацию и ангиогенез эндотелиальных клеток. Незрелые сосуды также содержат С8РО4положительные перициты, позволяя предположить, что эта клеточная популяция играет роль в модулировании пролиферации эндотелиальных клеток, блокируя ингибирующее действие ангиостатина во время развития сосудов (Сйекепуа е! а1., 2002Ь).
Кроме активированных перицитов экспрессия С8РО4 была также описана для некоторых нормальных тканей, таких как эндотелиальные клетки, хондроциты, гладкомышечные клетки, определенные виды базальных кератиноцитов внутри эпидермиса, в равной степени, как и внутри волосяного фолликула (Сатрой е! а1., 2004).
Во время ангиогенеза и в ответ на патологии СЫ8 высокоподвижные клетки С8РО4 подвергаются быстрым морфологическим изменениям и мобилизуются в места, где происходит рост и восстановление сосудов. С8РО4 гиперэкспрессированы и в опухолевых клетках, и в перицитах кровяных сосудов злокачественных опухолей головного мозга (Сйекепуа апб РНк1пд1оп, 2002). Вживлением клеток из С8РО4положительной клеточной линии человеческой глиомы в головной мозг иммунодефицитных голых крыс было продемонстрировано, что данные опухоли имеют более высокую капиллярную плотность по сравнению с контрольными пробами; это предполагает, что экспрессией С8РО4 регулируются как функции, так и структура полученной от хозяина сосудистой сети опухоли (Вгекке е! а1., 2006). В эксперименте с ксенотрансплантатом по вживлению сфероидов мультиформной глиобластомы (ОВМ), полученных биопсией, в голых крыс было установлено, что С8РО4 в основном ассоциируется с кровеносными сосудами как перицитов, так и компонентов основания мембраны сосудистой сети опухоли, и экспрессия
- 14 023013 ассоциирована с участками высокой клеточной пролиферации (СЬекепуа е! а1., 2002а). Кроме того, экспрессия С8РС4 сравнима с прогрессией опухоли в модели с имплантированной глиомой (\Уиапо\У5ка е! а1., 2006). Прогрессия злокачественного характера сохраняется при перекрестных помехах между опухолью и ее стромой, где активированная строма питает пролиферативные и инвазивные клетки новообразования, обеспечивая образование новых сосудов, внеклеточных матричных компонентов и стимулирующих факторов роста. В данном контексте С8РО4 играет ведущую роль в активации опухолевой стромы посредством изменений в клеточной адгезии, миграции, пролиферации и морфогенезе сосудов (СЬекепуа апб ЬптегуоП. 2007).
С8РО4 дифференциально экспрессирован в человеческих глиомах с более высокой экспрессией в глиомах высокой степени злокачественности по сравнению с глиомами низкой степени злокачественности (СЬекепуа е! а1., 1999). Высокая экспрессия С8РО4 соотносится с мультилекарственной резистентностью, опосредованной возросшей активацией сигнальных процессов с участием α3β1 интегрин/РВК и их мишеней по ходу транскрипции, способствуя выживанию клеток (СЬекепуа е! а1., 2008).
С8Р-001 был обнаружен в следующих органах/тканях и видах рака: головной мозг: глиобластома; вторичная глиобластома (образованная из астроцитомы); толстая кишка: аденокарцинома (за исключением муцинозного типа), первичная; прямая кишка: аденокарцинома с метастазами;
желудок: аденокарцинома (за исключением перстневидно-клеточного типа), первичная;
почка: почечно-клеточная карцинома, клеточная линия; почечно-клеточная карцинома, светлоклеточный тип с метастазами, все вторичные участки; почечно-клеточная карцинома, светлоклеточный тип, первичная; почечно-клеточная карцинома, первичная;
легкие: аденокарцинома, первичная; аденосквамозная карцинома, первичная; первичный рак; мелкоклеточная карцинома, первичная; сквамозная карцинома, первичная;
поджелудочная железа: аденокарцинома, первичная; рак из островковых клеток, злокачественный с метастазами;
предстательная железа: аденокарцинома, первичная; кожа: метастатическая злокачественная меланома, метастазы лимфатических узлов.
Поэтому фармацевтическая композиция, содержащая пептид в соответствии с 8ЕЦ ГО № 1, особенно предпочтительна для лечения головного мозга: глиобластома; вторичная глиобластома (образованная из астроцитомы); толстой кишки: аденокарцинома (за исключением муцинозного типа), первичная; прямой кишки: аденокарцинома с метастазами;
желудка: аденокарцинома (за исключением перстневидно-клеточного типа), первичная;
почек: почечно-клеточная карцинома, клеточная линия; почечно-клеточная карцинома, светлоклеточный тип с метастазами, все вторичные участки; почечно-клеточная карцинома, светлоклеточный тип, первичная; почечно-клеточная карцинома, первичная;
легких: аденокарцинома, первичная; Ей стадии, аденосквамозная карцинома, первичная; первичный рак; мелкоклеточная карцинома, первичная; сквамозная карцинома, первичная;
поджелудочной железы: аденокарцинома, первичная; рак из островковых клеток, злокачественный с метастазами;
предстательной железы: аденокарцинома, первичная;
кожи: метастатическая злокачественная меланома, метастазы лимфатических узлов.
Ацил-СоА синтетаза, член семейства ЬиЬЫедит 1 (АС8ВО1).
Белок, кодируемый этим геном, обладает активностью длинноцепочной ацил-СоА синтетазы. Считается, что он играет центральную роль в головном мозге при активации метаболизма жирных кислот с очень длинными цепями и при миелинизации. Активация жирных кислот при реакции тиоэтерификации до Ацил-СоА является предпосылкой для большинства реакций, в которых участвует этот класс молекул. Специфические для рака функции или гиперэкспрессия до сих пор не были описаны в литературе. Паттерны экспрессии АС8ВО1 в головном мозге, надпочечной железе, семеннике и яичнике и его функция предполагают роль данного белка в биохимической патологии Х-сцепленной адренолейкодистрофии (ΧΑΕΌ). ХАЬЭ - тяжелое, зачастую оканчивающееся летальным исходом нейродегенеративное нарушение, характеризующееся повышенным уровнем насыщенных жирных кислот очень длинных цепей в плазме и тканях (АкЬеиег е! а1., 2005; Ре1 е! а1., 2003).
Бревикан (ВСАИ).
Бревикан является внеклеточным матричным белком, сильно экспрессируемым при рождении, который экспрессируется от рождения в течение первых 8 лет жизни, а к 20 годам его активность снижается до низких уровней, которые сохраняются в нормальном взрослом корковом веществе. Изоформа ΟРI экспрессирована на постоянно низких уровнях во время развития (Сагу е! а1., 2000). Злокачественные глиомы агрессивно поражают окружающий нормальный головной мозг, что может быть опосредованно ткане-или опухолеспецифическими внеклеточными белками. Таким образом, внеклеточный матрикс отчасти может модулировать терпимость ткани по отношению к движению клетки. Соответственно, способность глиом модифицировать внеклеточный матрикс ЦНС может способствовать инвазивности этих
- 15 023013 клеток. Одной молекулой внеклеточного матрикса, которая имеет чрезмерно повышенный уровень в глиомах, является Βί','ΛΝ. специфический для головного мозга хондроитин сульфат протеогликан. Уровень экспрессии ΒСΑN увеличивается также во время периодов повышенной подвижности глиальных клеток во время развития и после травмы головного мозга. В глиоме может быть установлено приблизительно семикратное увеличение уровня экспрессии по отношению к нормальным тканям (Оагу е! а1., 2000; Оагу е! а1., 1998). В дополнение к увеличению уровня ΒСΑN в глиоме протеолитический процессинг белка полной длины может также вносить свой вклад в инвазию (Оагу е! а1., 1998; ΝιιΙΙ е! а1., 2001). Как могло быть показано, протеолитический процессинг ΒСΑN металлопротеазами семейства ΛΌΛΜΤδ является необходимым этапом в опосредовании его про-инвазивного эффекта в глиоме. Мутант, не расщепляемая форма ΒСΑN не способна усиливать инвазивность глиомных клеток ίη νίίτο и прогрессию опухоли ίη νίνο (νίηρίηηο е! а1., 2008). мРНК не детектируется для ΒСΑN в нормальной взрослой коре головного мозга или в какой-либо опухоли не глиомного ряда, так что ΒСΑN считается единственным и селективным маркером в глиоме (ΚηνοΓδΙά е! а1., 1996). Кроме того, анализ белка раскрыл не только повышенный уровень экспрессии ΒСΑN полной длины, но и также присутствие дополнительных уникальных изоформ в глиоме. Таким образом, В/ЬДд является продуктом ΒСΑN мРНК полной длины, который возникает из неполного или сокращенного гликозилирования центрального белка. В/ЬДд отсутствует в нормальном взрослом мозге, но обнаруживается в пробах глиом высокой степени злокачественности (νΐΗρΐοηο е! а1., 2005).
ВСΑN описывали как селективно гиперэкспрессированный в типе образованных из глиобластомы опухолевых клеток, подобных стволовым (ОиШНег е! а1., 2008). Этот подтип клеток, подобных стволовым, проявлял наиболее высокую плюрипотентность и онкогенность.
Хитиназа-3-подобный белок 1 (хрящевой гликопротеин-39) (СШ3Ь1).
СНВЫ, член семейства хитиназа-подобных белков млекопитающих, экспрессируется и секретируется несколькими видами солидных опухолей. Он вырабатывается раковыми клетками и опухолеассоциированными макрофагами, проявляет активность фактора роста для клеток, задействованных в процессах ремоделирования тканей, и может играть роль в пролиферации, дифференциации, инвазивности, метастазах раковых клеток, в ангиогенезе и воспалительных процессах и ремоделировании внеклеточного матрикса, окружающего опухоль (ίοΐιηη^η е! а1., 2006; ШНащем е! а1., 2007; Κίη^δΗοίΙ е! а1., 2007). Кроме того, СН!3К1 является аутологичным антигеном-кандидатом при ревматоидном артрите. Линии СБ4 Т-клеток здоровых доноров, направленные против СНЕТЕ-Е экспрессировали СБ25, глюкокортикоид-индуцированный фактор некроза, и молекулы Ροχρ3 были в состоянии подавлять антигенспецифические Т-клеточные ответы. Ответы 50% пациентов с ревматоидным артритом проявляют поляризацию по отношению к провоспалительному Т-хелперному 1 фенотипу и являются существенно менее действенными в подавлении антиген-специфических ответов (νηη ВШем е! а1., 2004).
СШ3Ь1 находится в повышенном количестве в онкостатине М, о котором известно, что он индуцируется в нервной системе в результате клеточного стресса, он экспрессирован в большинстве человеческих опухолей головного мозга и активирует сигнальный путь ίΛΚ/δΤΛΤ (Κτοηη е! а1., 2007). Экспрессия СШ3Ь1 была также ассоциирована с экспрессией р-МАРК, ρ-тТОК и ρ-ρ70δ6Κ в глиобластоме (РеШкИ е! а1., 2006).
В нескольких клинических исследованиях генной экспрессии было показано, что СШ3Ь1 был экспрессирован в более высоком количестве в глиобластоме в сравнении с нормальным головным мозгом с превышением уровня в нормальном головном мозге от 3 до 62 крат (δηίάί е! а1., 2007; Кгоез е! а1., 2007; ЕПюйак е! а1., 2003; Татуаг е! а1., 2002) Во время иммуногистохимических исследований обнаружилось, что клетки с функционирующим ядром способны экспрессировать СШ3Ь1 в своей цитоплазме, но интенсивность экспрессии СШ3Ь1 зависела от клеточной активности. Таким образом, клетки, о которых известно, что они вызывают высокую метаболическую активность, имели тенденцию демонстрировать наиболее интенсивное цитоплазматическое окрашивание (Βίη§δ1ιο1ΐ е! а1., 2007). В дальнейшем с помощью иммуногистохимии могло быть продемонстрировано, что глиобластомы демонстрируют поразительно большую экспрессию СШ3Ы, чем анапластические олигодендроглиомы (ΝηΙΙ е! а1., 2005). Анализ методом иммунного блотинга (’Ψеδ!е^η-Ь1ο!) проб глиомы на уровень белка СШ3Ь1 показал значительное повышение в 65% глиобластом и не обнаруживаемые уровни в глиомах низкой степени злокачественности (II и III степени) или нормальной ткани головного мозга (Татуаг е! а1., 2002). В сравнении с пилоидной астроцитомой, которая не распространяется и может быть вылечена с помощью операции, только глиобластома экспрессирует СШ3Ь1 (ί'.’ο1ίη е! а1., 2006).
Уровень сыворотки СШ3Ь1 повышен во множестве злокачественных образований и был ассоциирован с худшей выживаемостью. Наиболее высокие уровни сыворотки СШ3Ь1 были обнаружены у пациентов с метастатическим раком с наиболее коротким безрецидивным периодом и наиболее коротким сроком общей выживаемости. В особенности в сыворотке пациентов с глиобластомой наблюдалась повышенная экспрессия СШ3Ь1 (К1т е! а1., 2007; ^οЬаиδеη е! а1., 2007; ^οЬаи8еη е! а1., 2006; Лткег е! а1., 2005; Татуаг е! а1., 2002). Пациенты с глиобластомой с активной опухолью имеют значительно повышенный уровень СШ3Ь1 по сравнению с пациентами, не имеющими радиографического подтверждения
- 16 023013 заболевания. Кроме того, существует значительное обратнопропорциональное соотношение между СН13Ь1 и выживаемостью при ОВМ (Ногт1§о с! а1., 2006; Ре11о8к1 с! а1., 2005).
В дополнение, повышенная экспрессия СН13Ь1 может наблюдаться при раке молочной железы, где она соотносится с увеличенным размером опухоли, худшей дифференциацией опухоли и более краткими сроками выживаемости без заболевания (Κίιιι с! а1., 2007; Соккип с! а1., 2007). Более того, при сквамозной клеточной карциноме головы и шеи повышенные уровни сыворотки СН13Ь1 были обнаружены в 53%. Пациенты с высоким уровнем сыворотки СН13Ь1 имеют более краткий срок выживаемости, чем пациенты с нормальной сывороткой СН13Ь1 (33 по отношению к 84 месяцам) (Кокйпй с! а1., 2008).
Пациенты, страдающие от рака предстательной железы, демонстрировали значительно более высокие уровни сыворотки СН13Ь1 в сравнении с пациентами с ДКПЖ или здоровыми индивидами (Кисиг с! а1., 2008).
САР-ОЬУ доменсодержащий линкерный белок 2 (СЬ1Р2).
Белок, кодируемый СЫР2, принадлежит к семейству цитоплазматических линкерных белков, которые были предложены для опосредования взаимодействия между специфическими мембранными органеллами и микротрубочками. Было обнаружено, что СЫР2 ассоциирован как с микротрубочками, так и с органеллами, называемыми дендритная ламеллярная структура (общая информация с веб-сайта ЫСВ1).
СЫР2 расположен на концах тирозинированных микротрубочек, но не на концах детирозинированных микротрубочек. Тубулин-тирозин-лигаза (ТТЬ), фермент, который катализирует добавление Стерминального тирозинового остатка к альфа-тубулину в тубулин-тирозинационном цикле, задействован в опухолевой прогрессии и играет жизненно важную роль в нейрональной организации (Регк с! а1., 2006). В одном исследовании геномной ДНК методом ОспоЗспзог Аггау 300 на замороженных срезах 30 случаев первичной глиобластомы характеризовали генные амплификации, генные делеции и хромосомную информацию всего домена. Гены, которые часто были амплифицированы, включали =СЫР2 (63,3%), ЕОРК (53,3%), 1Ь6 (53,3%), АВСВ1 (ΜΌΚ1) (36,7%) и РПОРКЛ (26,7%) (8ιιζιιΚϊ е! а1., 2004).
Семейство транспортеров жидких переносчиков органического аниона, член 1С1 (8ЬСО1С1).
8ЬСО1С1 селективно экспрессирован на гематоэнцефалическом барьере (СНи с! а1., 2008). 8ЬСО1С1 характеризуется селективным предпочтением субстрата и может играть важную роль при распределении тироидных гормонов в головном мозге и семеннике (Р^ζζада11^ с! а1., 2002). 8ЬСО1С1 не детектировался специфически методом иммунофлуоресценции. 8ЬСО1А2 и 8ЬСО2В1 детектировались методом иммунофлуоресцентной микроскопии в люминальной мембране эндотелиальных клеток, формирующих гематоэнцефалический барьер и барьер между кровью и опухолью, но не в клетках глиомы (Вгопдег с! а1., 2005).
Дистробревин, альфа (ΌΤΝΛ).
Альфа-дистробревин первоначально был описан как компонент цитоплазмы дистрофингликопротеинового комплекса в клетках скелетных мышц. Изоформы ΌΤΝΛ демонстрируют различную локализацию в клетках и тканях; на базолатеральных мембранах в эпителиальных клетках дистробревины опосредуют контакт с внеклеточным матриксом, периферийными и трансмембранными белками и филаментным актиновым цитоскелетом. Помимо их структурообразующей роли, предполагается, что ΌΤΝΑ имеют важное значение в клеточных сигнальных реакциях и в клеточной дифференциации и они ассоциированы с плотными сочленениями во время их реорганизации (8_]о с1 а1., 2005). ΌΤΝΑ может быть задействован в формировании и стабилизации синапсов, в равной степени как и в образовании кластеров никотиновых ацетилхолиновых рецепторов.
Рецептор эпидермального фактора роста (эритробластический лейкемия вирусный (ν-сгЬ-Ь) онкогенный гомолог, птичий) (ЕОРК).
Рецептор эпидермального фактора роста (ЕОРК) находится в последнее время в центре внимания, так как его нарушения являются одним из наиболее распространенных молекулярных отклонений от нормы при глиобластоме. В особенности ЕОРГОШ (рецептор эпидермального фактора роста, вариант III) является онкогенной, конститутивно активной мутантной формой белка ЕОРК, которая обычно экспрессируется в глиобластоме (2а\\тос1<1 апй Вюгпа!, 2005). ЕОРК задействован в активации спектра сигнальных путей, которые регулируют фенотип клеток-предшественников. Активированная ЕОРК тирозинокиназная активность улучшает миграционные процессы, пролиферацию нейтральных стволовых клеток и выживаемость. Так как, как известно, сигнальные реакции ЕОРК играют роль при глиобластоме, то можно сделать заключение, что глиобластома образуется из стволовых раковых клеток и что сигналы ЕОРК обычно изменены в этих клетках-предшественниках (Уи8о-8ас1йо с! а1., 2006).
Первоначально глиобластомы появляются йс ηονο у пациентов постарше и часто гиперэкспрессируют ЕОРК. Гиперэкспрессия ЕОРК соотносится с повышенным ангиогенезом, эдемой (отечностью) и инвазией (А§Ы с! а1., 2005). Кроме того, ЕОРК-амплифицированные глиобластомы имеют резистентность к лучевой терапии (Вагксг с! а1., 2001) и рецидивируют быстрее после лечения (8сН1сдс1 с! а1., 1994).
ОВМ - единственная неэпителиальная опухоль человека, для которой эксцессивная активация ЕОРК связана с ростом опухоли и выживаемостью пациента, и активация ЕОРК способствует инфильтрации ОВМ ш νίϋΌ (Рспаг с! а1., 1997).
- 17 023013
ЕОРК является протоонкогеном егЬВ. Гиперэкспрессия БОРК может усиливать рост клеток из-за увеличения формирования активных комплексов лиганд-рецептор. Генная амплификация - это механизм, усиливающий гиперэкспрессию рецепторов ЕОР в опухолях ОВМ (Ткотркоп апб ОШ, 1985). О гене ЕОРК на хромосоме 7 известно, что он часто прибавляет число копий в глиомах высокой степени злокачественности (Окаба е! а1., 2007). Элиминация ЕОРК при короткой РНК-интерференции ликвидирует онкогенез клеток глиобластомы (Ниапд е! а1., 2007).
Гиперэкспрессия ЕОРК детектируется в 40-70% глиобластом, причем астроцитома: пилоидная, низкой степени злокачественности или анапластичная являются неизменно ЕОРК-негативными. (Λ§08ΐί е( а1., 1992; БсШуесккеипег е! а1., 1995; ЕррепЬегдег апб МиеПег, 1994; Нипскагек апб Кире1тск, 2000; Ьш е! а1., 2006а). Высокие уровни сыворотки ЕОРК указывают на сокращенный срок выживаемости (Циагап!а е! а1., 2007). Кроме того, как было показано, пациенты с долгим сроком выживаемости с астроцитомами высокой степени злокачественности являются ЕОРКуШ-негативными (Ыапд е! а1., 2008).
Локус №Юк-1 повышает уровень экспрессии ЕОРК и соотношения между уровнями ЕОРК, и Ыо1ск-1 мРНК может быть обнаружен на первичных глиомах человека высокой степени злокачественности (Риготе е! а1., 2008). ЕОРК сам по себе задействован в конститутивной активации с-Лт ΝΗ2терминальной киназы (ΊΝΚ), которая способствует пролиферации, выживаемости и онкогенезу некоторых опухолей, включая глиомы (Ы е! а1., 2008а).
Хотя ЕОРКуШ экспрессирован лишь малой долей глиомных клеток, у большинства клеток имеется трансформированный фенотип. Как было продемонстрировано, экспрессия ЕОРКуШ в клетках индолентной глиомы стимулирует формирование относящихся к липидному рафту микрополостей, содержащих ЕОРКуШ, которые высвобождаются в клеточное окружение и могут сливаться с плазменными мембранами раковых клеток, в которых недостаточно ЕОРКуШ, приводя к перемещению онкогенной активности (А1-№баМ е! а1., 2008).
Белок, связывающий жирную кислоту 7, головной мозг (РАВР7).
Белки, связывающие жирную кислоту (РАВРк), являются цитозольными белками 14-15 кДа, которые, как предполагается, задействованы в поглощении, транспортировке и нацеливании жирной кислоты (ЖК). Они могут модулировать концентрацию ЖК и таким способом влиять на работу ферментов, мембран, ионных каналов и рецепторов, а также на генную экспрессию и клеточный рост и дифференциацию. Различают девять видов РАВР со специфическим распространением в ткани. Вместо 30-70% идентичности аминокислотной последовательности они имеют похожую третичную бета-структуру скользящей застежки, в которой связана ЖК. Нервная ткань содержит четыре вида РАВР с различным пространственно-временным распространением (Уеегкатр апб 21ттегтап, 2001). РАВР7 высоко экспрессирован в развивающемся головном мозге и сетчатке глаза, и его экспрессия значительно снижается во взрослой ЦНС (ОобЬои! е! а1., 1998). Основываясь на результатах, полученных ш νίίτο, предполагается, что РАВР7 требуется для образования радиальной глиальной системы развивающегося головного мозга (Мба е! а1., 2007). В нормальном головном мозге белок РАВР7 практически не детектируется, но проявляет от умеренной до сильной ядерной и цитоплазмической экспрессии в нескольких мультиформных глиобластомах (ОВМ). Трансфицированные РАВР7 клетки проявляют в 5 раз большую миграционную активность, чем контрольные клетки. Таким образом, более короткая общая выживаемость, ассоциированная с гиперэкспрессией РАВР7, в особенности в глиобластоме, может быть обусловлена повышенной миграцией и инвазией опухолевых клеток в окружающую мозговую паренхиму (Ь1ап§ е! а1., 2005). Ядерная транслокация РАВР7 в особенности соотносится с амплификацией ЕОРК и более инвазивными опухолями (Ка1о8Й е! а1., 2007). Таким образом, РАВР7 может быть индуцирован активацией ЕОРК, чтобы способствовать миграции опухолевых клеток ОВМ (Ь1ап§ е! а1., 2006).
Экспрессия РАВР7, как было установлено, является также маркером для почечно-клеточной карциномы. Экспрессия РАВР7 может быть детектирована только в раковых тканях, но не в не пораженных раком частях проб почек (Тега!ат е! а1., 2007). Экспрессия РАВР7 в почечно-клеточной карциноме, как было показано, в 20 раз выше в опухоли в сравнении с нормальной почкой (Нотою е! а1., 2007; ВисЬпег е! а1., 2007). Было показано, что РАВР7 часто экспрессирован в меланоме, где он может быть задействован в клеточной пролиферации и инвазии (Оо!о е! а1., 2006).
Глиофибриллярный кислый белок (ОРАР).
ОРАР кодирует один из крупнейших белков промежуточных филаментов зрелых астроцитов. Он используется в качестве маркера для отличия астроцитов от других глиальных клеток во время развития. Мутации этого гена приводят к болезни Александера, редкое нарушение деятельности астроцитов в центральной нервной системе. Был описан дополнительный вариант транскрипта, однако его последовательность полной длины определена не была. Сообщалось о повышенном уровне в аутистическом головном мозге, в то время как в головном мозге людей с серьезной депрессией проявлялся пониженный уровень ОРАР.
Анализу подвергли головной мозг приматов, у которых заново возникли опухоли десять лет спустя после облучения головного мозга. Предшественники опухоли проявляли клеточный атипизм и митозы и были негативными для опухолеассоциированных маркеров ОРАР, ЕОРК и р53 (ЬиЬепкку е! а1., 2006).В новообразованиях с участием астроцитов количество ОРАР-положительных клеток и интенсивность ок- 18 023013 рашивания были прямо пропорциональны степени злокачественности. Во всех 3 случаях олигодендроглиомы происходила негативная реакция на ОРАР (Ксуа/ βί а1., 2005). Чистые олигодендроглиомы являются иммуногистологически негативными для ОРАР (МокШап βί а1., 2005). Уровни сыворотки ОРАР у пациентов с глиомой высокой степени демонстрировали линейную корреляцию с объемом опухоли (Вготте1ап6 βί а1., 2007). Даже среди пациентов с глиобластомой может быть установлена значительная корреляция между объемом опухоли, объемом некроза опухоли, количеством некротических ОРАРположительных клеток и уровнем ОРАР в сыворотке (1ип§ βί а1., 2007).
Последующее воздействие на клеточные линии глиобластомы ингибитором гистонной дезацетилазы 4-фенилбутиратом приводили к повышению концентрации нефосфорилированного ОРАР, в то время как фосфорилированные изоформы оставались без изменений (Акк1ипб βί а1., 2004).
В клеточной линии глиобластомы, обработанной ТОР-альфа, приблизительно на 50% снизились генная транскрипция ОРАР, уровень мРНК и специфический синтез белка (ΖΙιοιι апб δка11^, 2000).С технической точки зрения промотор ОРАР часто используется в качестве инструмента в моделях с мышами для индуцирования экспрессии желаемых белков, в особенности в нервной системе.
Островковые клетки Лангерганса поджелудочной железы окутаны околоостровковыми швановскими клетками (ρδΟ), экспрессирующими ОРАР. Аутоиммунное нацеливание элементов ткани панкреатической нервной системы, вероятно, является неотъемлемой, рано формируемой, частью естественно развившегося диабета типа 1 (\νίιτβΓ βί а1., 2003). Эта панкреатическая экспрессия не отражена в данных о генной экспрессии в смешанных тканях фирмы штабск или других источниках. ОРАР-001 был опубликован в качестве эпитопа, против которого пациенты с диабетом типа 1 в равной степени как и их не болеющие диабетом родственники с ответами антител против диабетических аутологичных антигенов (повышенный риск заболевания диабетом) проявляли усиленную реактивность секретирующих гранзим В ЦТЛ (ех νίνο ЕЬКРОТ) по сравнению со здоровыми донорами (δΙ;·ιιι6ίΓβΓ βί а1., 2006).
Интересно, что, вероятно, существует обратное соотношение между обнаружением аутоиммунных заболеваний, в особенности диабета, и риском развития глиомы (Агопкоп и Агопкоп, 1965; δΟι1β1ιοΓβΓ βί а1., 1999; 6112111^1 βί а1., 2002; δΟι\ν;·ΐΓΐζό;·ιιιιη βί а1., 2003; δΟι\ν;·ΐΓΐζό;·ιιιιη βί а1., 2005).
Рецептор, связанный с О-белком 56 (ОРК56).
ОРК56 - атипичный рецептор, связанный с О-белком (ОРСК), с необычно крупным Νтерминальным внеклеточным участком, который содержит длинный δβ^/ТΗ^-обогащенный участок, формирующий муцин-подобный стебель, и из-за этой черты считается, что ОРК56 играет роль во взаимодействиях клетка-клетка или клетка-матрикс. Вместе с высоким уровнем экспрессии мРНК и его широким распространением было сделано предположение о возможной роли для этого рецептора в процессах взаимодействия клетка-клетка (Ьш βί а1., 1999). ОРК56 принадлежит к ОРСК семейства секретинов, которое играет роль в развитии клеток-предшественников нервной системы и было соотнесено с пороками развития человеческого головного мозга. Более высокая экспрессия ОРК56 соотносится с клеточными трансформационными фенотипами нескольких раковых тканей по сравнению с их нормальными эквивалентами, заставляя предположить потенциальную онкогенную функцию. Опосредованное РНКинтерференциями выключение ОРК56 приводит к индукции апоптоза и снижению субстратнезависимого роста раковых клеток посредством увеличения аноикоза. Выключение ОРК56 сокращает также клеточную адгезию к внеклеточному матриксу (Κβ βί а1., 2007). Повышенный уровень ОРК56 был продемонстрирован для мультиформной глиобластомы при использовании функциональной геномики. Иммуногистохимические исследования подтвердили экспрессию ОРК56 в большинстве проб опухолевой ткани глиобластомы/астроцитомы с не устанавливаемыми уровнями экспрессии в нормальном взрослом головном мозге (δ1ι;ικ1ιί61ι;·ΐΓ βί а1., 2005). В панкреатических раковых клетках мРНК ОРК56 экспрессирована на высоком уровне, причем белок ОРК56 ничтожно мал и не детектируется в этих клетках, давая возможность предположить, что экспрессия белка ОРК56 подавляется в человеческих панкреатических раковых клетках (Ниапд βί а1., 2008). Более ранние исследования метастазов показали, что количество ОРК56 заметно снижено в высоко метастатических вариантах клеточной линии человеческой меланомы, заставляя предположить, что гиперэкспрессия ОРК56 подавляет рост опухоли и метастазы. Данное подавление роста, как предполагается, опосредуется взаимодействием ОРК56 с тканевой трансглютаминазой (ТО2), широко распространенным компонентом ткани и стромы, который задействован в подавлении прогрессии опухоли как таковой (Хи βί а1., 2006; Хи апб Нугек, 2007). О другом ингибирующем воздействии ОРК56 сообщалось в связи с миграцией клеток-предшественников нервной системы (ИРСк). ОРК56 высоко экспрессирован в ИРСк и, вероятно, принимает участие в регуляции движения ИРС через сигнальные пути Оа1рйа( 12/13) и Кбо, заставляя предположить, что ОРК56 играет важную роль в развитии центральной нервной системы ОдисЫ βί а1., 2008).
Рецептор глютамата, ионотрофический, АМРА 4 (ОЫА4).
Глютаматный рецептор типа а-Амин-3-гидрокси-5-метил-4-изоксазолпропионат (АМРА) (АМРАКк) опосредует быструю нейротрансмиссию в возбудительных синапсах ЦНС и состоят из субъединиц, взятых из комплекта из четырех белков, О1иК1 по О1иК4 (ОЫА4).
Субъединицы ОЫА4 повсеместно экспрессированы в клетках человеческой глиобластомы, действуя как Са2+-пропускающие АМРАКк. Конверсия в не пропускающие Са2+ рецепторы ингибирует дви- 19 023013 жение клеток и индуцирует апоптоз, причем гиперэкспрессия Са2+-пропускающих рецепторов АМРА упрощает миграцию и пролиферацию опухолевых клеток. Поэтому Са2+-пропускающие рецепторы АМРА, как предполагается, играют центральную роль в росте глиобластомы (1кЫисЫ е! а1., 2002).
Инсулиноподобный фактор роста, 2 мРНК-связывающий белок 3 (1СР2ВР3).
1СР2ВР3 является членом белкового семейства инсулиноподобных факторов роста II, связывающих мРНК, вовлеченным в локализацию, оборот и трансляционный контроль мРНК. Закодированный белок содержит несколько КН-доменов, которые важны в связывании РНК, и о которых известно, что они вовлечены в синтез и метаболизм РНК. Он экспрессируется, в основном, во время эмбрионального развития и в некоторых опухолях. Таким образом, 1СР2ВР3 рассматривается как онкофетальный белок (Ыао е! а1., 2005). Специальной информации об экспрессии 1СР2ВР3 в глиобластоме найдено не было, но, как описывается, 1СР2ВР3 гиперэкспрессирован в нескольких других злокачественных заболеваниях. Таким образом, 1СР2ВР3 экспрессирован в 30% из 716 проанализированных образцов почечно-клеточной карциномы, светлоклеточного типа. В этом исследовании его экспрессия была ассоциирована с высокой стадией и степенью злокачественности первичных опухолей в равной степени как и с другими побочными чертами, включая коагуляционный некроз опухоли и саркомоподобную дифференциацию. Кроме того, положительная экспрессия 1СР2ВР3 была ассоциирована с 5-10-кратно возросшим риском отдаленных метастазов и 42-50% ростом риска летального исхода от КСС (почечно-клеточная карцинома), позволяя предположить, что экспрессия 1СР2ВР3 представляет собой независимый прогностический фактор поведения агрессивной почечно-клеточной карциномы, светлоклеточного типа. (Нойтапп е! а1., 2008; Лап§ е! а1., 2006; Лап§ е! а1., 2008). Экспрессия 1СР2ВР3 обнаруживалась также в злокачественной меланоме в сравнении с доброкачественными невусами, где экспрессии установлено не было, даже если присутствовали диспластические черты (Ргуог е! а1., 2008). При эндометриальном раке экспрессия 1СР2ВР3 тесно связана с эндометриальным раком типа II и агрессивным гистологическим фенотипом среди эндометриальных неопластических образований (УНепд е! а1., 2008). У 20 пациентов, страдающих плоскоклеточной карциномой пищевода, индукция специфических Т-клеточных ответов ТГО (лимфоцитов, инфильтрирующих опухоль), лимфоцитов региональных лимфатических узлов и лимфоцитов периферической крови против рестриктированного по НЙА-А2402 пептид-эпитопа из ЮР2ВР3 могла наблюдаться в 40% всех случаев (Μίζιι1<ηιηί е! а1., 2008). ЮР2ВР3 также высоко экспрессирован в карциномах поджелудочной железы. В 2 исследованиях >90% проб тканей опухолей поджелудочной железы проявляли экспрессию ЮР2ВР3 после иммуноокрашивания, в то время как не-неопластические ткани поджелудочной железы были негативными для ЮР2ВР3. Кроме того, ЮР2ВР3 мРНК был гиперэкспрессирован в карциномах поджелудочной железы в сравнении с не-неопластическими пробами тканей, и экспрессия прогрессивно возрастала вместе со стадией опухоли (Уапйкк е! а1., 2005; Уапйкк е! а1., 2008). Экспрессия ЮР2ВР3 была также обнаружена в существенно повышенном состоянии в уротелиальных опухолях высокой степени, в то время как он обычно не экспрессирован в доброкачественном уротелии или уротелиальных опухолях низкой степени. Более того, пациенты с ЮР2ВР3-положительными опухолями имеют намного более низкий процент выживаемости без прогрессирования и выживаемости без болезни, чем те, что имеют ЮР2ВР3-негативные опухоли. У ЮР2ВР3-положительных пациентов с поверхностно инвазивной уротелиальной карциномой при первоначальном диагнозе также продолжали развиваться метастазы, в то время как у ЮР2ВР3-негативных пациентов метастазов обнаружено не было. Помимо этого, данные этих исследований позволяют сделать предположение, что ЮР2ВР3 может быть задействован в прогрессии уротелиальных опухолей с низкой до высокой стадии как при папиллярных, так и при поражениях с ровной поверхностью (0 е1 а1., 2008Ъ; 3^!η^коνа е! а1., 2008).
Мегало-энцефалитная лейкодистрофия с подкорковой кистой 1 (МЬС1).
Мегало-энцефалитная лейкодистрофия с подкорковыми кистами (МЬС) является аутосомальным рецессивным заболеванием белого вещества головного мозга у детей. МЬС вызывается мутациями гена МЬС1 (IЦа Воог е! а1., 2006). В соответствии со знаниями изобретателей никаких сообщений о взаимосвязи МЬС1 с опухолями головного мозга в имеющейся литературе найдено не было.
В одной работе исследовалось клеточное и региональное распространение МЬС1 в головном мозге мышей (ЗсЬтШ е! а1., 2003). Наивысшая экспрессия МЬС1 была обнаружена во время пре- и перинатального периода в многопотенциальных клетках-предшественниках нервной системы. В головном мозге взрослых мышей МЬС1 мРНК был обнаружен исключительно в глиальных клетках. В отличие от развивающихся и зрелых астроцитов, олигодендроциты были лишены экспрессии МЬС1.
Нестин (ΝΕ3).
Во время развития происходит экстенсивная экспрессия промежуточного филамента нестина в нейроэпителиальных клетках брюшного слоя в возрасте 11 недель пост-гравидарно во всех частях ЦНС, в то время как иммунореактивность нестина сокращается во время второго и третьего триместра (Такапо апб Вескег, 1997; ЬепДаЫ е! а1., 1990; 2штегтап е! а1., 1994; Тойуата е! а1., 1992). Во время и после миграции из пролиферативного брюшного слоя экспрессия нестина резко снижается в пост-митотических клетках-нейронах (Ато1Д и Тго)апо\У5кк 1996). Окрашивание нестина не-неопластических тканей взрослого головного мозга показало лишь слабое окрашивание очень малого количества эндотелиальных клеток (ОаЫккгапД е! а1., 1992). Нестин может экспрессироваться повторно во время неопластической транс- 20 023013 формации (Уеке1кка е! а1., 2006). В глиомных тканях иммунореактивность нестина появляется лишь в опухолевых клетках, и количество вырабатываемого нестина увеличивается, когда степень глиомы становится более злокачественной, приближаясь к глиобластоме. Глиобластомы ОУ-я степень злокачественности) экспрессируют наиболее высокое число возникающих нестин-положительных клеток и вообще наиболее высокие уровни окрашивания нестина. Экспрессия нестина может быть детектирована в опухолевых клетках различных видов первичных опухолей ЦНС, которые имеют нейроэктодермальное происхождение, но не в метастазирующих клетках карцином (НайЮгапб е! а1., 1992; Тойуата е! а1., 1992). Нестин практически не экспрессирован в диффузных астроцитомах, переменно экспрессирован в анапластических астроцитомах и сильно и нерегулярно экспрессирован в глиобластомах, где его распространение варьируется в комплементарном пути СРЛР и виментина (8сЫйег е! а1., 2006). С клинической точки зрения нестин-негативные опухоли зародышевых клеток ЦНС не демонстрировали распространения, в то время как все опухоли, которые демонстрировали распространение, также сильно экспрессировали белок нестин (8акига6а е! а1., 2007).
Опухолевые клетки, сильно экспрессирующие нестин, часто расположены рядом с кровеносными сосудами (ЭаЬШгапб е! а1., 1992), (Кштйага е! а1., 2000; §идатага е! а1., 2002; Иогепек е! а1., 1994; δΙίΌριίΙ; е! а1., 2007), и, как предполагалось, экспрессия нестина активированным эндотелием является маркером ангиогенеза (ТегаткЫ е! а1., 2007; Мабегпа е! а1., 2007; Лтой е! а1., 2005; Мокгу е! а1., 2004).
СВМ включает трансформированных предшественников, которые несут полный комплемент функциональных характеристик, ожидаемых от стволовых клеток, включая способность генерирования опухоли. Эти клетки могут сформировать СВМ даже при серийной трансплантации и могут поэтому быть идентифицированы как опухолевые стволовые клетки нервной системы (СаШ е! а1., 2004). Эти клетки принадлежат к клеточной субпопуляции С.Н133+ из опухолей человеческого головного мозга и коэкспрессируют Ы8С (стволовые клетки нервной системы)-маркер нестин, но не дифференцированные маркеры линии дифференцировки нервной системы (δίη§Η е! а1., 2004Ь; δίη§Η е! а1., 2003; δίη§Η е! а1., 2004а; Мао е! а1., 2007). Присутствие популяции СЭ133+/нестин+ в опухолях головного мозга предполагает, что нормальная стволовая клетка нервной системы могут быть клеткой происхождения глиом (δΗίгак е! а1., 2007). Так как сигнальные пути Ыо!сй активны в опухолях головного мозга и стволовых клетках, было продемонстрировано, что промотор нестина активируется в культуре посредством активности Ыо!сй (δΐιίΐι апб Но11ан6. 2006).
Трансфекция клеточной линии С6 астроцитомы у крыс с дуплексом к1РНК нестина раскрыл эффективное супрессионное влияние 51РНК нестина на клеточный рост культивированных клеток астроцитомы с зависимостью от дозы (^е1 е! а1., 2008).
Экспрессии нестина, как сообщается, происходит также в стволовых раковых клетках предстательной железы (Си е! а1., 2007; Срр е! а1., 2007) и рака поджелудочной железы (Сатеге е! а1., 2007) в равной степени как и меланомы (К1еш е! а1., 2007). Кроме того, нестин экспрессируется также в следующих опухолях: СЮТ (гастроинтестинальная стромальная опухоль) (Ткиртига е! а1., 2001; δа^1οтο-Κ^ка1а е! а1., 2002), меланомы (Иогспск е! а1., 1994; ВгусЫоуа е! а1., 2007), колоректальный рак (ТегаткЫ е! а1., 2007) и опухоли поджелудочной железы (ОЫке е! а1., 2007; К1ееЬег§ег е! а1., 2007).
Экспрессия нестина может быть также обнаружена в различных нормальных тканях: об экспрессии нестина сообщалось для подоцитов нормальных зрелых клубочков почки человека. В нормальных условиях нестин экспрессируется в нескольких видах клубочковых клеток на ранних стадиях развития и ограничивается подоцитами в зрелых клубочках (Ый/аЫ е! а1., 2006), указывая на то, что нестин чрезвычайно важен для некоторых функциональных аспектов подоцитов. Взрослые клубочки проявляют иммунореактивность нестина в виментин-экспрессирующих клетках с подоцитной морфологией (ВейеШ е! а1., 2007). Возможно, посредством взаимодействия с виментином нестин служит для улучшения механической прочности подоцитов, которые подвержены сильному растяжению во время клубочковой фильтрации (Репу е! а1., 2007). Таким образом, в человеческой почке нестин экспрессируется, начиная с первых этапов гломерулогенеза в подоцитах, мезангиальных и эндотелиальных клеток. Эта экспрессия ограничивается, затем, подоцитами в зрелых клубочках и не может быть обнаружена в других структурах почки взрослого человека (διι е! а1., 2007). Иммуногистохимический анализ раскрыл существование постоянной экспрессии нестина в корковом веществе нормальных взрослых надпочечников. Клетки, экспрессирующие нестин, преобладают в ретикулярной зоне, причем карциномы надпочечников выявляют вариабельное число нестин-иммунореактивных клеток (Той е! а1., 2005).
Также сообщалось об экспрессии нестина в интерстициальных клетках Кахала ^СС) в нормальном желудочно-кишечном тракте. Таким образом, большинство внутримышечных ЮС антрума и все мышечно-кишечные ЮС тонкого кишечника являются нестин-иммунореактивными, в равной степени как и некоторые мышечно-кишечные ЮС и большинство ЮС кольцевой мускулатуры толстого кишечника (Уаηάе^№^ηάеη е! а1., 2002). На поджелудочной железе нестин-иммунореактивные клетки могут быть обнаружены на островковых клетках и на экзокринном участке. В зоне главного протока поджелудочной железы нестин-положительные клетки представляют малые капилляры, рассеянные на соединительной ткани, окружающей эпителий протока. Таким образом, нестин экспрессируется васкулярными эндотелиальными клетками поджелудочной железы человека (К1еш е! а1., 2003). В самих островковых клетках
- 21 023013 могут быть обнаружены клетки-предшественники, экспрессирующие нестин. Выдвигается гипотеза, что эти нестин-положительные, образованные из островковых клеток, клетки-предшественники являются другой популяцией клеток, которая постоянно находится внутри островковых клеток поджелудочной железы и могут участвовать в неогенезе островковых эндокринных клеток (Би1е\укк1 е( а1., 2001). Из нормальной печени взрослого может быть изолирована популяция человеческих стволовых клеток печени, положительных для виментина и нестина (Неггега е( а1., 2006). При анализах клеточной культуры, анализе цитоскелета и матричной композиции при иммуноокрашивании обнаружилось, что клетки, происходящие из фетальных легких и взрослого костного мозга, экспрессируют белки виментин и нестин в промежуточных филаментах (8аЬа(ни е( а1., 2005). Нестин был обнаружен в функциональных одонтобластах молодых постоянных зубов. Его экспрессия снижается, и нестин отсутствует в более взрослых постоянных зубах, в то время как его уровень снова повышается в кариозных и поврежденных зубах (АЬои( е( а1., 2000).
Нестин-экспрессирующие взрослые стволовые клетки могут быть также обнаружены в перилюминальном регионе зрелой передней доли гипофиза и, при использовании генетически индуцируемой карты зачатков, было продемонстрировано, что они служат для генерирования подклассов всех шести терминально дифференцированных эндокринных видов клеток мозгового придатка. Данные стволовые клетки, так как они не играют значимой роли при органогенезе, подвергаются послеродовой экспансии и начинают вырабатывать дифференцированное потомство, которое колонизирует орган, который первоначально полностью состоял из дифференцированных клеток, образованных из эмбриональных предшественников (О1е1Ьегтап е( а1., 2008).
Подсемейство ядерных рецепторов 2, группа Е, член 1 (ИК2Е1).
ИК2Е1 (ТЬХ) - это фактор транскрипции, который необходим для пролиферации стволовых клеток нервной системы и самообновления посредством рекрутинга пистонных дезацетилаз (НИАСк) в его гены-мишени по ходу транскрипции, чтобы репрессировать их транскрипцию, что в свою очередь регулирует пролиферацию стволовых клеток нервной системы. Рекрутирование НИАСк приводит к транскрипционной репрессии ТЬХ генов-мишений, циклинзависимого ингибитора киназы, р21(С1Р1/^АР1)(р21) и гена-супрессора опухоли, РТΕN (8ип е( а1., 2007). Подсемейство ТЬХ/НОХ11 дивергентных содержащих гомеобокс генов задействовано в различных аспектах эмбриогенеза и, в случае ТЬХ1/НОХ11 и ТЬХ3/НОХ11Ь2, выступает главным образом в качестве онкогена при человеческой Т-клеточной острой лимфобластической лейкемии (Όίχοη е( а1., 2007). ΝΚ2Ε1 лежит в основе фундаментальной программы развития ретинальной организации и контролирует образование необходимого количества потомства ретинальных клеток и развитие глиальных клеток во время длительного периода ретиногенеза (Μίγ3\\<ι1<ί е( а1., 2004). Для глиобластомы специфической информации обнаружено не было.
Нейрональная молекула клеточной адгезии (ИКСАМ).
Человеческая ИКСАМ (молекула клеточной адгезии, связанная с нейроглией) гиперэкспрессирована в ткани мультиформной глиобластомы (ОМТ) в сравнении с нормальной тканью головного мозга (ИВТ). ИКСАМ описывается как однопроходной трансмембранный белок типа I, взаимодействующий с анкирином. Антисмысловой КИКСАМ был причиной снижения нативной экспрессии КИКСАМ, изменений в клеточной морфологии, пониженной клеточной пролиферации и удлинения клеточного цикла. Кроме того, гиперэкспрессия антисмыслового КИКСАМ в этих клетках вызывала обширную редукцию числа колоний мягкого агара и инвазию через гель внеклеточного матрикса (ЕСМ) ίη νίΐΓο. Подкожная инъекция антисмыслового КИКСАМ, гиперэкспрессирующего клетки глиобластомы в голых мышей, вызывала полное ингибирование опухолевого образования по сравнению с вектором только трансфецированных клеток. Внутриопухолевая инокуляция плазмидом, экспрессирующим антисмысловой КИКСАМ, также была причиной медленного роста опухоли у голых мышей ίη νίνο (8еКда1 е( а1., 1999). Ген-специфический анализ КТ-РСК указал на то, что КИКСАМ гиперэкспрессирован в астроцитомах высокой степени злокачественности, глиомах и опухолевых тканях глиобластомы по сравнению с нормальной тканью головного мозга (8еКда1 е( а1., 1998). ИКСАМ, молекула межклеточной адгезии семейства иммуноглобулин-подобных молекул клеточной адгезии, известная своей функцией в разрастании и управлении нейронами, недавно была идентифицирована как ген-мишень сигнального пути бетакатенина в меланоме человека, а также клетках и ткани карциномы толстой кишки. Опосредованная ретровирусами трансдукция ИКСАМ в фибробласты индуцирует клеточную подвижность и онкогенез (Сопасс1-8огге11 е( а1., 2005). Индукция транскрипции ИКСАМ бета-катенином или плакоглобином играет роль при онкогенезе в меланоме и раке толстого кишечника, вероятно, способствуя росту и подвижности клеток (Сопасс1-8огге11 е( а1., 2002). Также и другие мишени в сигнальных путях бета-катенина находятся в повышенном количестве, такие как МУС (Ьш е( а1., 2008). ИгСАМ гиперэкспрессирован в папиллярных карциномах щитовидной железы человека на уровне мРНК и белка на любой стадии опухоли (Оогка е( а1., 2007).
Гиперэкспрессия ИКСАМ мРНК в опухолях ассоциирована с индикаторами высокой пролиферации и была ассоциирована с неутешительным исходом при эпендимомах (Банден е( а1., 2007).
Подопланин (РИРИ).
РИРИ является муцинподобным интегральным мембранным гликопротеином типа I с различным
- 22 023013 распространением в человеческих тканях. Он задействован в миграции раковых клеток, инвазии, метастазах и злокачественной прогрессии, а также он участвует в накоплении тромбоцитов. СЬЕС-2 является первым идентифицированным патофизиологическим рецептором подопланина (КаЮ е1 а1., 2008). Было исследовано 115 случаев глиобластомы с помощью иммуногистохимического метода с использованием анти-РБРЫ-антитела. 47% глиобластом экспрессировали РБРЫ на поверхностных клетках в особенности вокруг некротических участков и пролиферирующих эндотелиальных клеток. Кроме того, РБРЫ мРНК и белковая экспрессия были значительно выше в глиобластоме, чем в анапластичных астроцитомах, позволяя предположить, что экспрессия РБРЫ может быть ассоциирована с злокачественностью астроцитов (МЫшпа е1 а1., 2006). Было также продемонстрировано, что РБРЫ экспрессируется в 82,9% глиобластом (29/35) в других анализах (8ЫЬаЬага е1 а1., 2006). В исследовании, изучающем экспрессию РБРЫ и действия по накоплению тромбоцитов клеточных линий глиобластомы, БЫ319 экспрессировал в высокой степени РБРЫ и индуцировал накопление тромбоцитов. ΝΖ-1, высоко реактивное анти-РБРЫ-антитело, нейтрализовало накопление тромбоцитов БЫ319, позволяя предположить, что РБРЫ является основной причиной для накопления тромбоцитов, индуцированного (КаЮ е1 а1., 2006). Уровни экспрессии генов РБРЫ были значительно выше в глиобластомах, чем в не-неопластическом белом веществе, что было подтверждено иммуногистохимией (ЗспбеП е1 а1., 2008). РБРЫ специфически экспрессирован лимфатическими, но не эндотелиальными клетками кровеносных сосудов в культуре и при опухольассоциированном лимфангиогенезе. Хотя РБРЫ первоначально отсутствовал в нормальном человеческом эпидермисе, его экспрессия была сильно индуцирована в 22 из 28 сквамозных карцином, позволяя предположить, что РБРЫ играет роль при прогрессии опухоли (§сНасН1 е1 а1., 2005). РБРЫ находится в повышенном количестве на инвазивном фронте многих раковых заболеваний человека. Исследование экспрессии РБРЫ на культивированных клетках человеческого рака молочной железы, на модели с мышами с панкреатическим бета-клеточным канцерогенезом и биоптатах рака человека указывают на то, что РБРЫ способствует инвазии опухолевых клеток ίη νίίτο и ίη νίνο. РБРЫ индуцирует коллективную клеточную миграцию при образовании филоподий посредством снижения активности малых СТР-аз семейства Р1ю. В заключение, РБРЫ индуцирует альтернативный путь инвазии опухолевых клеток при отсутствии эпителиально-мезенхимального перехода (\νΚ1<ί е1 а1., 2006); уровень экспрессии РБРЫ был повышен у большинства пациентов с колоректальным раком (КаЮ е1 а1., 2003); предполагается, что ТСРбета является физиологическим регулятором РБРЫ в опухолевых клетках (διιζιιΐά е1 а1., 2008); РБРЫ экспрессируется раковыми клетками, происходящими из пищевода, легких, печени, толстого кишечника и молочной железы, а также лимфатических эндотелиальных клеток (Κοηο е1 а1., 2007).
Тенасцин С (гексабрахион) (ТЫС).
Экспрессия внеклеточного матричного гликопротеина ТЫС в глиобластоме, но не в нормальном головном мозге, и его ассоциация с пролиферативными эндотелиальными мембранами основания при глиобластоме позволили предположить уже в 1983 г., что ТЫС может быть полезным маркером для глиом (Βοιπύοη е1 а1., 1983). Во время прогрессии опухоли ЕСМ опухолевых тканей переделывается, обеспечивая теперь окружение, которое более благоприятно для прогрессии опухоли, для которой ангиогенез является ключевым этапом (СатетсИа е1 а1., 1999). ТЫС гиперэкспрессируется в сосудах опухоли, которые имеют высокий пролиферативный индекс, указывающий на то, что ТЫС задействован в неопластическом ангиогенезе (Кип е1 а1., 2000). Экспрессия ТЫС в опухолях может быть вызвана гипоксией (Ьа1 е1 а1., 2001). Индукция ТЫС опосредована ТСР-бета 1, обеспечивая глиомам высокой степени злокачественности механизм для инвазии в здоровую паренхиму (Наи е1 а1., 2006). Также гиперэкспрессия ТЫС является последствием специфической активации промотора гена тенасцина-С гастрином, который, как известно, значительно модулирует миграцию клеток человеческой глиобластомы (КисНап^ак е1 а1., 2001). ТЫС снижает количество тропомиозина-1 и, таким образом, дестабилизирует стрессовые волокна актина. Это вызывает снижение количества ингибитора сигнального ^ηί-каскада, 'ΌχΚΚορΠ. Так как снижение экспрессии тропомиозина-1 и возрастание ^ηί-сигналинга тесно связаны с трансформацией и онкогенезом, то ТЫС специфически модулирует данные сигнальные пути, усиливая пролиферацию клеток глиомы (Κπίζ й а1., 2004).
Периваскулярное окрашивание ТЫС вокруг кровеносных сосудов, снабжающих опухоль, наблюдалось в тканях глиобластомы, причем периваскулярное окрашивание ТЫС встречается менее часто в глиомах II и III степени по ВОЗ, указывая на то, что интенсивность окрашивания ТЫС соотносится со степенью опухоли, а наиболее сильное окрашивание указывает на плохой прогноз (НсгоШ-Мспйс е1 а1., 2002; Ζιι1^1 еί а1., 2006). Наиболее высокая экспрессия ТЫС наблюдается в соединительной ткани, окружающей опухоли (01^11^^1113511^441 аиб Тискег, 2004). ТЫС также вносит свой вклад в генерацию ниши стволовых клеток внутри субвентрикулярной зоны (δνΖ), принимая участие в управлении сигналами фактора роста для ускорения развития нервных стволовых клеток. ТЫС необходим для временной экспрессии ЕСРК в стволовые клетки нервной системы, и он усиливает сигналинг РСР2. Доминирующим эффектом ТЫС на клетках δνΖ-зоны является регуляция процессов, связанных с прогрессией (Са^с^οη еί а1., 2004). ТЫС является сильнейшим инициатором направленной миграции Ы8С человека (нервных стволовых клеток) (гаптотаксис). Вырабатываемый опухолью ЕСМ, таким образом, обеспечивает терпимое окружение для тропизма Ы8С к рассеянным опухолевым клеткам (Ζίιι еί а1., 2006).
- 23 023013
Путь ТЫС играет также важную роль в росте опухоли молочной железы и метастазах. Таким образом, блокада сигналинга или резкое снижение ТЫС в клетках ΜΌΑ-ΜΒ-435 привела к значительному ухудшению клеточной миграции и субстрат-независимой клеточной пролиферации. Мыши, инъецированные клональными клетками ΜΌΑ-ΜΒ-435 со сниженной экспрессией ТЫС, демонстрировали значительное снижение роста первичной опухоли, в равной степени как и снижение рецидивов после хирургического удаления первичной опухоли и снижение частоты метастазов в легких (Са1уо е! а1., 2008).
Сурвивин (В1КС5).
Экспрессия ВГКС5 (сурвивин), члена семейства белков-ингибиторов апоптоза (ΙΑΡ), содержится в повышенном количестве в фетальных тканях и различных видах рака человека и со значительно сниженной экспрессией в нормальных взрослых дифференцированных тканях, в особенности, если у них низкий индекс пролиферации. Предполагается, что сурвивин способен к регуляции как клеточной пролиферации, так и отмирания апоптических клеток. Хотя сурвивин обычно находится на цитоплазматическом участке клетки и ассоциируется с плохим прогнозом при раке, также сообщалось о ядерной локализации, указывающей на благоприятный прогноз (О'БйбсоИ е! а1., 2003). Регуляцию сурвивина и с его помощью описывают несколькими механизмами. Предполагается, что сурвивин ассоциирован с молекулярным шапероном Нкр60. Ιη νίνο Нкр60 с избытком экспрессирован в первичных опухолях человека по сравнению с соответствующими нормальными тканями. Экстренная абляция Нкр60 небольшой интерферирующей РНК дестабилизирует митохондриальный пул сурвивина, вызывает митохондриальную дисфункцию и активирует каспаза-зависимый апоптоз (ОНокН е! а1., 2008). Кроме того, ингибирование Как приводит к снятию сурвивинового тормоза на апоптозе и активации митохондриального апоптотического каскада реакций. В особенности в глиобластоме устойчивость к апоптозу может быть ликвидирована посредством Как-ингибитора, мишенью которого является сурвивин (В1ит е! а1., 2006). Вероятно, существует взаимосвязь между ΝΡ-карраВ гиперактивностью в глиомах и гиперэкспрессией сурвивина, одного из генов-мишеней ΝΡ-карраВ. Таким образом, активированные ΝΡ-карраВ анти-апоптотические гены гиперэкспрессированы в пробах опухолей. В особенности, в глиобластоме обнаруживаются очень высокие уровни экспрессии сурвивина (АпдПеп е! а1., 2008). Предполагается, что гиперэкспрессия сурвивина в глиомах головного мозга может играть важную роль в злокачественной пролиферации, антиапоптозе и ангиогенезе (ХНеп е! а1., 2005; Ни е! а1., 2006Ь). Было произведено несколько анализов для изучения экспрессии сурвивина и его влияния на выживаемость при глиобластоме. В качестве обобщения, экспрессия сурвивина, в особенности одновременная экспрессия в ядре и цитоплазме в астроцитных опухолях была значительно ассоциирована со степенью злокачественности (с наибольшей экспрессией сурвивина в глиобластоме) и более короткими общими сроками выживаемости по сравнению с пациентами, у которых были сурвивин-негативные опухоли (Ка_|1^ага е! а1., 2003; 8аПо е! а1., 2007; иета!ки е! а1., 2005; Μе11а^ е! а1., 2008; Огипйа е! а1., 2006; Х1е е! а1., 2006; §акаИ е! а1., 2002; СНакгауагИ е! а1., 2002).
Гиперэкспрессия сурвивина описывалась также для других опухолевых форм. При раке молочной железы гиперэкспрессия сурвивина ассоциирована с более высокой степенью злокачественности и более коротким сроком выживаемости без заболевания (УатакЫ!а е! а1., 2007; Α1-ίουάί е! а1., 2007; §рап е! а1., 2004). Как было зафиксировано, в клеточных линиях рака пищевода промоторная активность сурвивина была в 28,5 раз выше, чем в нормальных тканях (§а!о е! а1., 2006). При колоректальном раке экспрессия сурвивина также ассоциирована с патологической степенью и метастазами лимфатических узлов (Тап е! а1., 2005). Как было показано, агрессивность светлоклеточной почечной карциномы ассоциирована с экспрессией сурвивина. Кроме того, экспрессия сурвивина обратно пропорционально ассоциирована со специфичной для рака выживаемостью (Кокай е! а1., 2005). Экспрессия сурвивина может быть обнаружена в наборе неоплазмов с участием кератиноцитов и гиперпролиферативных поражениях кожи, но не в нормальной коже (Во\\еп е! а1., 2004). В клеточных линиях рака поджелудочной железы сурвивин был амплифицирован в 58% проанализированных клеточных линий (ΜаЫатак^ е! а1., 2002). При плоскоклеточной карциноме экспрессия сурвивина может помочь идентифицировать случаи с более агрессивным и инвазивным клиническим фенотипом (Ьо е! а1., 2001).
Так как сурвивин является такой многообещающей мишенью при лечении рака, то исследования с использованием образованных из сурвивина пептидов показали, что сурвивин является иммуногенным для пациентов с опухолями, вызывая ответы, опосредованные СЭ8+ Т-клетками. В дополнение к этому, сурвивин специфически стимулировал СЭ4+ Т-клеточную реактивность лимфоцитов в периферической крови у тех же пациентов (Сакай е! а1., 2003; Р|ексНе е! а1., 2007).
Сурвивин (δνΝ, В1КС) гиперэкспрессирован во множестве раковых форм. Итак, гиперэкспрессия сурвивина в целом, как считается, ассоциирована с более коротким общим сроком выживаемости и более высокими степенями злокачественности.
Настоящее изобретение в дальнейшем относится к конкретным белкам-маркерам, которые могут быть использованы для прогнозирования глиобластомы. Кроме того, настоящее изобретение относится к применению этих новых мишеней для лечения рака. В соответствии с приводимой здесь информацией белки ОРАР, РАВР7, ПТЫА, ΝΚ2Ε1, 8ЬСО1С1, СН13Ь1, АС8ВС1, ΙΟΡ2ΒΡ3, ЫЬОЫ4Х, ΜΕϋ1, ΝΚϋΑΜ, ВСАЫ, ЕОРК, РЭРЫ. ΝΕδ и СЫР2 сильно гиперэкспрессированы в глиобластомах по сравнению с нормальным головным мозгом и другими жизненно важными тканями (к примеру, печень, почка, сердце).
- 24 023013
Белки СКР56, С8РС4, ЛКСАМ, ТЛС, ВШС5, СМР2, ΝΕδ, ΡΌΡΝ, ЕСРК, ВСАЛ, СК1А4, как продемонстрировано, играют важную роль в онкогенезе, так как они задействованы в злокачественной трансформации, клеточном росте, пролиферации, ангиогенезе или инвазии нормальной ткани.
Белки ΝΕδ, ТЛС, ВГКС5, ЕСРК ассоциированы с раковыми стволовыми клетками или нишами стволовых клеток при глиобластоме. Раковые стволовые клетки являются субпопуляцией раковых клеток с потенциалом для самообновления, необходимым для постоянного роста опухоли. Эти клетки находятся в специализированных и высоко организованных структурах, так называемых нишах раковых стволовых клеток, которые требуются для сохранения потенциала самообновления раковых стволовых клеток. Гиперэкспрессия белков ВГО.С5, ЛКСАМ, ЮР2ВР3 в опухолях, как было продемонстрировано, ассоциирована с поздними стадиями заболевания и неутешительным прогнозом для пациентов.
ВСА, СЫР2, ЭТЛА, ЛРСЛАХ, ΝΚ2Ε1, ЛИСАМ и РЭРЛ, как было продемонстрировано, играют важную роль в ремоделировании ткани, требуемом для роста опухоли в нервной системе. Поэтому экспрессия ВСА, СЫР2, ^ТNА. N^СNАX, ΝΚ2Ε1, ИКСАМ и Ρ^ΡN может быть использована в качестве маркера, чтобы отличить глиобластому от других форм рака.
Таким образом, настоящее изобретение обеспечивает способы идентификации животного, предпочтительно человека, у которого, вероятно, имеется глиобластома. В одном воплощении установленная вероятность составляет от 80 до 100%. Один таковой способ включает определение уровня по крайней мере одного из белков ВСА, СЫР2, ^ТNА. N^СNАX, ΝΚ2Ε1, ККСАМ и Ρ^ΡN в опухолевой пробе животного субъекта. В одном воплощении проба изымается методом радикальной хирургии. В другом воплощении проба изымается методом игольной биопсии.
Если уровень ВСА, СЫР2, ЭТНА, N^СNАX. ΝΚ2Ε1, NΚСАМ или РЭРИ как установлено, выше на 20% или более в клетках относительно уровня, установленного в доброкачественных эпителиальных клетках того же самого образца, то у животного субъекта, вероятно, имеется глиобластома.
Чем выше уровень различным белков группы, включающей ВСА, СЫР2, ПТЫА, N^СNАX, ΝΚ2Ε1, ККСАМ и РЭРЫ, чем выше вероятность того, что будет установлено, что у животного субъекта имеется глиобластома.
В одном воплощении определение уровня ВСА, СЫР2, ПТЫА, N^СNАX, ΝΚ2Ε1, ККСАМ или РЭРЫ производится ш Хи. В другом воплощении определение уровня ВСА, СЫР2, ПТЫА, N^СNАX, Ν^Ε! ККСАМ или РЭРЫ производится ш уйго. В другом отличном воплощении определение уровня ВСА, СЫР2, ПТЫА, N^СNАX. ЫКШБ ККСАМ или РЭРЫ производится ш У1уо. В предпочтительном воплощении определение уровня ВСА, СЫР2, ПТЫА, N^СNАX, ЫКШБ ККСАМ или РЭРЫ производится методом лазерной захватывающей микроскопии вместе с анализом ^е§!егп Ь1о!.
В одном конкретном воплощении определение уровня ВСА, СЫР2, ПТЫА, N^СNАX, Ν^Ε^ ККСАМ или РЭРЫ производится с помощью антитела, специфического для ВСА, СЫР2, ПТЫА, N^СNАX, Ν^Ε^ ККСАМ или РЭРЫ. В другом воплощении определение уровня ВСА, СЫР2, ПТЫА, N^СNАX, Ν^Ε^ ККСАМ или РЭРЫ производится методом ПЦР с праймером, специфическим для мРНК, кодирующей ВСА, СЫР2, ЭТКА, N^СNАX. Ν^Ε^ ККСАМ или РЭРП В другом отличном воплощении определение уровня ВСА, СЫР2, ОТХА, N^СNАX. Ν^Ε^ ЯКСАМ или РЭРХ производится методом с нуклеотидным зондом, специфическим для мРНК, кодирующей ВСА, СЫР2, □ТиА, N^СNАX, Ν^Ε^ ЯКСАМ или РЭРП В одном воплощении определение уровня ВСА, СЫР2, □ТиА, N^СNАX, Ν^Ε^ ЯКСАМ или РЭРЫ производится с использованием анализа Ыог1Ьегп Ь1о!. В другом воплощении определение уровня ВСА, СЫР2, ПТЫА, N^СNАX, Ν^Ε^ ЯКСАМ или РЭРЫ выполняется методом анализа с помощью защиты от рибонуклеазы. В других воплощениях могут быть использованы иммунологические тесты, такие как методы иммуноферментных зон (Ε^IδА), радиоиммунные методы (КА) и методы иммунного блоттинга (^е§!егп Ь1о!) для определения полипептидов ВСА, СЫР2, □ТиА, N^СNАX, ЯКШС NΚСАМ и РЭРи в жидкой пробе организма (такой как кровь, сыворотка, мокрота, моча или перитонеальная жидкость). Биоптаты, тканевые пробы и клеточные пробы (такие как из яичника, лимфатических узлов, соскобы эпителиальных клеток с поверхности яичника, биоптаты легкого, биоптаты печени и любые жидкостные пробы, содержащие клетки (такие как перитонеальная жидкость, мокрота и плейральный секрет), могут быть проанализированы посредством дезагрегации и/или растворения ткани или клеточного образца и проведения иммуноанализа на обнаружение полипептида, такого как БИМА, КМ или иммунного блоттинга (^е§!егп Ь1о!йпд). Такие клеточные или тканевые пробы могут также быть проанализированы методами, основанными на нуклеиновых кислотах, к примеру, методом полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (КТ-РСК) с амплификацией, гибридизации Нозерн-блоттинг или слот- или дот-блоттинг. Для визуализации распределения опухолевых клеток в тканевых образцах в целях обнаружения полипептидных маркеров глиобластомы или мРНК, соответственно, могут быть применены диагностические тесты, которые сохраняют структуру ткани, например иммуногистологическое окрашивание, ш Хи гибридизация РНК или ш Хи КТ-РСК. Для локализации опухолевой массы ш У1уо могут применяться методы визуализации, такие как магнитно-резонансная томография (МРТ) посредством введения в субъект антитела, которое специфически связывается с полипептидом ВСА, СЫР2, □ТиА, N^СNАX, Ν^Ε^ ЯКСАМ или РЭРи (в особенности полипептидом, находящимся на клеточной поверхности), где антитело конъюгировано или по-другому связано с парамаг- 25 023013 нитным индикатором (или другой подходящей детектируемой единицей в зависимости от используемого метода визуализации); альтернативно локализацию не меченого опухолевого маркер-специфического антитела можно определить с помощью вторичного антитела, связанного с детектируемой единицей.
В дополнение настоящее изобретение в дальнейшем обеспечивает химерные/белки слияния/пептиды, включающие полипептиды ВСА, СЫР2, ЬТИА, ИЬОИАХ, ИК2Е1, ИКСАМ и/или РИРИ и их фрагменты, включительно функциональные, протеолитические и атигенные фрагменты.
Партнеры по слиянию или части гибридной молекулы адекватно обеспечивают эпитопы, которые стимулируют СЭ4+ Т-клетки. Стимулирующие эпитопы СЭ4+ хорошо известны из уровня техники и включают те, что были выявлены в столбнячном токсине. В дальнейшем предпочтительном воплощении пептид является рекомбинантным белком, в частности включающим И-терминальные аминокислоты антиген-ассоциированной инвариантной цепи (П) НЬА-ЭК. В одном воплощении пептид по изобретению является укороченным белком человека или гибридным белком белкового фрагмента и другого сегмента полипептида, при условии, что человеческий сегмент включает одну или более аминокислотную последовательность изобретения.
Антитела к полипептидам ВСА, СЫР2, ИТИА, ИЬОИАХ, ИК2Е1, ИКСАМ или РИРИ, к химерным/белкам слияния, включающим полипептиды ВСА, СЫР2, ИТИА, ИЬОИАХ, ИК2Е1, ИКСАМ или РИРИ, в равной степени как и фрагменты полипептидов ВСА, СЫР2, ИТИА, ИЬОИАХ, ИК2Е1, ИКСАМ или РИРИ, включая протеолитические и антигенные фрагменты, и к химерным/белкам слияния/пептидам, включая эти фрагменты, являются также частью настоящего изобретения. Помимо этого, методы использования таких антител для прогнозирования рака и глиобластомы в частности также являются частью настоящего изобретения.
Антитела по настоящему изобретению могут быть поликлональными антителами, моноклональными антителами и/или химерными антителами. Бессмертные линии клеток, которые вырабатывают моноклональное антитело по настоящему изобретению, являются также частью настоящего изобретения.
Обычному специалисту данной области будет понятно, что в некоторых частных случаях более высокая экспрессия ВСА, СЫР2, ИТИА, ИЬОИАХ, ИК2Е1, ИКСАМ или РИРИ в качестве опухолевого гена-маркера будет указывать на худший прогноз для субъекта, имеющего глиобластому. Например, относительно более высокие уровни экспрессии ВСА, СЫР2, ИТИА, ИЬОИАХ, ИК2Е1, ИКСАМ или РИРИ могут указывать на относительно крупную первичную опухоль, более высокую тяжесть заболевания (к примеру, больше метастазов) или относительно более злокачественный фенотип опухоли.
Чем более различна гиперэкспрессия различных белков группы, включающей ВСА, СЫР2, ИТИА, ИЬОИАХ, ИК2Е1, ИКСАМ и РИРИ, тем хуже прогноз для пациента.
Диагностические и прогностические методы по изобретению охватывают использование известных методов, к примеру, основанных на антителах методов детекции полипептидов ВСА, СЫР2, ИТИА, ИЬОИАХ, ИК2Е1, ИКСАМ и РИРИ, а также методов, основанных на гибридизации и/или амплификации нуклеиновых кислот для детекции ВСА, СЫР2, ИТИА, ИЬОИАХ, ИК2Е1, ИКСАМ и/или РИРИ мРНК.
Помимо этого, в связи с тем, что быстрое уничтожение опухолевых клеток часто приводит к образованию авто-антитела, опухолевые маркеры глиобластомы по изобретению могут использоваться в серологических анализах (например, в тесте ЕЫ8А для сыворотки субъекта) для обнаружения автоантител против ВСА, СЫР2, ИТИА, ИЬОИАХ, ИК2Е1, ИКСАМ или РИРИ у субъекта. Уровни полипептид-специфического авто-антитела для ВСА, СЫР2, ИТИА, ИЬОИАХ, ИК2Е1, ИКСАМ и РИРИ, которые по крайней мере приблизительно в 3 раза выше (и предпочтительно по крайней мере в 5 раз или 7 раз выше, наиболее предпочтительно по крайней мере в 10 или 20 раз выше), чем в контрольной пробе, являются признаком глиобластомы.
Находящиеся на поверхности клетки внутриклеточные и секретируемые полипептиды ВСА, СЫР2, ИТИА, ИЬОИАХ, ИК2Е1, ИКСАМ и РИРИ могут быть также использованы в анализе биоптатов, например, ткани или клеточных проб (включая клетки, полученные из жидкостных проб, таких как полосная перитонеальная жидкость), для определения, содержит ли тканевый или клеточный биоптат клетки глиобластомы. Биоптат может быть проанализирован как интактная ткань или проба с целыми клетки, или же ткань или клеточная проба могут быть дисагрегированы и/или растворены, как то необходимо для конкретного вида используемого диагностического анализа. Например, биоптаты или пробы могут подвергаться цельнотканевому или цельноклеточному анализу для определения уровня полипептида или мРНК ВСА, СЫР2, ИТИА, ИЬОИАХ, ИК2Е1, ИКСАМ и РИРИ ш кйи, например, используя иммуногистохимический метод, гибридизацию мРНК ш М1и или ПЦР с обратной транскрипцией ш М1и. Опытному специалисту известно, как приготавливать ткани или клетки к анализу для определения уровня полипептида или мРНК с использованием иммуногистохимических методов, таких как ЕЫ8А, иммунный блоттинг или равноценные методы, или же методов анализа уровня мРНК посредством аналитических методов, основанных на нуклеиновых кислотах, таких как ПЦР с обратной транскрипцией, нозернгибридизация или слот- или дот-блоттинг.
- 26 023013
Оборудование для измерения уровней экспрессии ВСА, СЫР2, ΌΤΝΆ, ΝΕΟΝΆΧ, ΝΡ2Ε1, NΡСΑΜ или ΡΌΡΝ.
Настоящим изобретением обеспечивается оборудование для обнаружения повышенного уровня экспрессии ВСА, СЫР2, ΌΤΝΆ, ΝΣΟΝΆΧ, ΝΡ2Ε1, ΝΡΟΆΜ и ΡΌΡΝ в качестве гена-маркера глиобластомы у субъекта. Оборудование для обнаружения полипептидного маркера глиобластомы предпочтительно содержит антитело, которое специфически связывается с выбранным полипептидным маркером глиобластомы. Оборудование для обнаружения мРНК-маркера глиобластомы предпочтительно содержит одну или более нуклеиновых кислот (к примеру, один или более олигонуклеотидный праймер или зонд, зонды ДНК, зонды РНК или шаблоны для получения зондов РНК), которая специфически гибридизируется с мРНК белков ВСА, ΟΈΡΣ, ΌΤΝΆ, ΝΌΟΝΆΧ, ΝΡ2Ε1, ΝΡΟΆΜ и ΡΌΡΝ. Оборудование, основанное на антителах, в особенности может использоваться для обнаружения присутствия и/или измерения уровня полипептида ВСА, СЬ^, ΌΤΝΆ, ΝΌΟΝΆΧ, ΝΡ2Ε1, ΝΡΟΆΜ и/или ΡΌΡΝ, который специфически связан с антителом или его иммунореактивным фрагментом. Оборудование может включать антитело, реактивное по отношению к антигену, и реагент для обнаружения реакции антитела с антигеном. Такое оборудование может быть оборудованием ЕЫ§Л и может содержать контроль (например, специфицированное количество конкретного полипептидного маркера глиобластомы), первичные и вторичные антитела, когда это целесообразно, и любые другие необходимые реагенты, такие как детектируемые составляющие, субстраты ферментов и цветные реагенты, как описывалось выше. Диагностическое оборудование альтернативно может быть оборудованием для иммуноблоттинга, обычно включающим компоненты и реагенты, описываемые здесь.
Оборудование, основанное на нуклеиновой кислоте, может использоваться для обнаружения и/или измерения уровня экспрессии ВСА, ΟΈΡΣ, ΌΤΝΆ, ΝΌΟΝΆΧ, ΝΡ2Ε1, ΝΡΟΆΜ и ΡΌΡΝ посредством обнаружения и/или измерения количества мРНК белков ВСА, ΟΈΡΣ, ΌΤΝΆ, ΝΌΟΝΆΧ, ΝΡ2Ε1, ΝΡΟΆΜ и ΡΌΡΝ в пробе, такой как тканевый или клеточный биоптат. Например, оборудование для ПЦР с обратной транскрипцией для обнаружения повышенной экспрессии ВСА, СЬ^, ΌΤΝΆ, ΝΌΟΝΆΧ, ΝΡ2Ε1, ΝΡΟΆΜ и ΡΌΡΝ предпочтительно содержит олигонуклеотидные праймеры, которых достаточно для проведения обратной транскрипции мРНК-маркера глиобластомы до кДНК и амплификацию кДНКмаркера глиобластомы посредством ПЦР, и будет также предпочтительно содержать контрольные шаблонные молекулы ПЦР и праймеры для проведения адекватного негативного и положительного контроля, а также внутреннего контроля для квантизации. Обычный специалист данной области в состоянии отобрать подходящие праймеры для проведения реакций обратной транскрипции и ПЦР, а также адекватные контрольные реакции, которые должны быть выполнены. Такое руководство приводится, например, в работе Ρ. Ли5иЬе1 е1 а1., СиггеШ Ρ^οΐοсο18 ш Мо1еси1аг Вю1оду, 1оЬп \УПеу & §оп§, №ν Уотк, Ν.Υ., 1997. Многочисленные разновидности ПЦР с обратной транскрипцией известны из уровня техники. Нацеленная доставка иммунотоксинов к ВСА, СЬ^, ΌΤΝΆ, ΝΌΟΝΆΧ, ΝΡ2Ε1, ЯРСАМ и ΡΌΡΝ может осуществляться в качестве терапевтических мишеней для лечения или предупреждения глиобластомы. Например, молекула антитела, которая специфически связывается с находящимся на поверхности клетки полипептидом вСа, СЬ^, ΌΤΝΑ, ΝΌΟΝΑΧ, ΝΡ2Ε1, ЯРСАМ и ΡΌΡΝ, может быть конъюгирована с радиоизотопом или другим токсическим соединением. Конъюгаты антител вводятся в субъекта, так что связывание антитела с родственным ему полипептидом глиобластомы приводит к нацеленной доставке терапевтического соединения в клетки глиобластомы, тем самым производя лечение рака яичника.
Терапевтическим составляющим может быть токсин, радиоизотоп, лекарственное, химическое средство или белок (см., например, Вега е1 а1. ΡЬа^тасοк^ηеί^сδ апб апШитог асИуПу о£ а Ыуа1еШ б18и1Пбе-51аЫП/еб Ρν нптипоЮхиг \νί11ι ипргоуеб апйдеп Ьшбшд 1о егЬВ2 Сапсег Рез. 59:4018-4022 (1999)). Например, антитело может быть связано или конъюгировано с бактериальным токсином (например, токсин дифтерии, экзотоксин псевдомонас А, холерный токсин) или растительным токсином (например, рициновый токсин) для нацеленной доставки токсина к клетке, экспрессирующей ВСА, ^ΓΡ2, ΌΤΝΑ, ΝΌΟΝΑΧ, ΝΡ2Ε1, ЯРСАМ и ΡΌΡΝ. Этот иммунотоксин может быть доставлен к клетке, и при соединении с находящимся на поверхности клетки полипептидным маркером глиобластомы токсин, конъюгированный с антителом, специфическим для маркера глиобластомы, будет доставлен к клетке.
Еще один другой аспект настоящего изобретения относится к антителу, которое специфически связывается с главным комплексом гистосовместимости человека (МНС) I или II класса в комплексе с НЬАрестриктированным антигеном (именуемое в дальнейшем также комплекс-специфическое антитело). Еще один другой аспект настоящего изобретения относится, затем, к методу получения указанного антитела, специфически связывающегося с главным комплексом гистосовместимости человека (МНС) I или II класса в комплексе с НЬА-рестриктированным антигеном, метод, включающий иммунизацию полученного с помощью генной инженерии нечеловеческого млекопитающего, включающего клетки, экспрессирующие указанный главный комплекс гистосовместимости человека (МНС) I или II класса с растворимой формой молекулы МНС I или II класса в комплексе с указанным НЬА-рестриктированным антигеном; изолирование молекул мРНК из антитела, вырабатывающего клетки указанного нечеловеческого млекопитающего; получение библиотеки фагового отображения, отображающей белковые молекулы, закодированные указанными молекулами мРНК; и изолирование по крайней мере одного фага из указан- 27 023013 ной библиотеки фагового отображения, указанный по крайней мере один фаг, отображающий указанное антитело, специфически связываемое с указанным главным комплексом гистосовместимости человека (МНС) I или II класса, в комплексе с указанным НЬЛ-рестриктированным антигеном. Соответствующие методы для получения таких антител и одноцепочных главных комплексов гистосовместимости I класса, в равной степени как и другие инструменты для получения данных антител раскрыты в АО 03/068201, АО 2004/084798, АО 01/72768, АО 03/070752 и у Сокеп С.1, ОепкЬегд С., Ьеу А., Ере1 М., Кебет Υ. КесотЫпаШ апбЬоб1ез \\бк МНС-тезбтс1еб, рерббе-зресШс, Т-се11 гесерЮг-Пке зресШсбу: пе\у Юо1з !о з!ибу апбдеп ртезейабоп апб ТСК-рерббе-МНС иНегаскопз. I Мо1 Кесодпб. 2003 8ер-Ос!;16(5):324-32; ЭепкЬегд С., Ьеу А., Е1зепЬаск Ь., Вепкаг I., Кебет Υ. §е1есбуе 1атдебпд оГ те1апота апб АРСз изшд а гесотЫпап! апбЬобу \\бк ТСК-бке зресШсбу ббес1еб 1о\\агб а те1апота бШегепбабоп апбдеп. I Iттипο1. 2003 8ер 1; 171(5):2197-207; и Сокеп С.1, 8апд О., Υатаиο Υ., Тотаги и., 1асокзоп 8., Кебет Υ. Эпес! ркепо1урю апа1у515 оГ китап МНС с1азз I апбдеп ртезейабоп: зазиак/акоп, диайбабоп, апб т зби бе!есбоп оГ китап уна1 ерборез изшд рерббе-зрес!бс, МНС-тезбгйеб китап тесотЬшай апбЬоб1ез. I Iттииο1. 2003 Арг 15; 170(8):4349-61, которые в целях настоящего изобретения в открытой форме включены сюда в своей целостности путем ссылки.
Предпочтительно, если антитело связывается с аффинностью связывания ниже 20 нмоль, предпочтительно ниже 10 нмоль, с комплексом, который называется специфическим в контексте настоящего изобретения.
Термин антитело используется здесь в широком смысле и включает, как поликлональные, так и моноклональные антитела. В дополнение к интактным молекулам иммуноглобулина в термин антитела включены также фрагменты или полимеры таких молекул иммуноглобулина и гуманизированные версии молекул иммуноглобулина, при условии что они проявляют одно из желаемых свойств (например, являются комплекс-специфическим антителом, как упомянуто выше, доставляют токсин к раковой клетке, экспрессирующей раковый, предпочтительно ген-маркер глиобластомы, на повышенном уровне и/или ингибируют активность ракового полипептида-маркера, такого как сурвивин), описанных здесь.
Помимо этого, для любого полипептида ВСА, СиР2, ЭТНА, МбСМАХ, ΝΒ2Ε1, ИКСАМ и ΡΌΡΝ, для которого существует специфический лиганд (например, лиганд, который связывается с находящимся на поверхности клетки белком), лиганд может быть использован вместо антитела для нацеливания токсичного соединения на клетку глиобластомы, как описывалось выше.
Если возможно, антитела по изобретению могут быть куплены в коммерческих источниках. Антитела по изобретению могут быть также генерированы при использовании хорошо известных методов. Специалисту будет понятно, что для генерирования антител по изобретению могут использоваться либо полипептиды-маркеры глиобластомы полной длины, либо их фрагменты. Полипептид, необходимый для генерирования антитела по изобретению, может быть частично или полностью очищенным из естественного источника или же может быть получен с помощью техники рекомбинантной ДНК. Например, кДНК, кодирующая полипептид ВСА, СЫР2, ЭТНА, ΝΕΟΝΛΧ, ΝΒ2Ε1, ИКСАМ ог ΡΌΡΝ или его фрагмент, может быть экспрессирована в прокариотические клетки (например, бактерии) или эукариотические клетки (например, клетки дрожжей, насекомых или млекопитающих), после чего рекомбинантный белок может быть очищен и использован для получения препарата из моноклонального или поликлонального антитела, которое специфически связывается с полипептидом-маркером глиобластомы, использованным для получения антитела.
Специалисту данной области будет известно, что получение двух или более различных панелей моноклональных или поликлональных антител увеличивает вероятность получения антитела со специфичностью и аффинностью, необходимыми для предназначенного для него использования (например, ЕЫ8А, иммуногистохимия, визуализация ш У1уо, терапия на основе иммунотоксина). Антитела протестированы на желаемую для них активность с помощью известных методов в соответствии с целью использования антител (например, ЕЬЕЗА, иммуногистохимия, иммунотерапия и т.д.; для получения дальнейшей информации по генерированию и испытанию антител см., например, Наг1о\у апб Ьапе, АпбЬоб1ез: А ЬаЬота1огу Мапиа1, Со1б 8рбпд НагЬог ЬаЬота1огу Ргезз, Со1б 8рбпд НагЬог, Ν.Υ., 1988). Например, антитела могут быть протестированы с помощью анализов ЕЬЕЗА, метода иммунного блоттинга (Аез1егп-Ь1о1), иммуногистохимического окрашивания законсервированных формальдегидом образцов глиобластомы или замороженных тканевых срезов. После их первоначальной характеристики ш убто антитела, предназначаемые для терапевтического или диагностического использования ш У1уо тестируются в соответствии с известными клиническими методами анализа.
Термин моноклональное антитело, используемый здесь, обозначает антитело, полученное из, по существу, гомогенной популяции антител, т.е. отдельные антитела внутри популяции идентичны за исключением возможных естественных мутаций, которые могут быть представлены в небольших количествах. Моноклональные антитела здесь специфически включают химерные антитела, в которых участок тяжелой и/или легкой цепи идентичен или гомологичен с соответствующими последовательностями антител, образованных из конкретных видов или относящихся к конкретному классу или подклассу антител, в то время как остальная(ые) цепь(и) идентична с или гомологична с соответствующими последовательностями антител, образованных из других видов или относящихся к другому классу или подклассу
- 28 023013 антител, в равной степени как и фрагменты таких антител, пока они проявляют желаемую антагонистическую активность (патент США №4816567).
Моноклональные антитела по изобретению могут быть приготовлены при использовании гибридомного метода. В рамках гибридомного метода мышь или другое подходящее животное-хозяин обычно иммунизируется иммунизирующим веществом, чтобы инициировать лимфоциты, которые вырабатывают или способны вырабатывать антитела, которые будут специфически связываться с иммунизирующим веществом. Альтернативно лимфоциты могут быть иммунизированы ш уйго.
Моноклональные антитела могут быть также получены с помощью методов с рекомбинантной ДНК, таких как описываемые в патенте США № 4816567. ДНК, кодирующая моноклональные антитела по изобретению, может быть без труда изолирована и разделена на последовательности с помощью стандартной методики (например, при использовании олигонуклеотидных зондов, которые способны специфически связываться с генами, кодирующими тяжелые и легкие цепи мышиных антител).
1п νίϋΌ-методы также подходят для приготовления моновалентных антител. Расщепление антител для получения их фрагментов, в особенности РаЬ-фрагментов, может быть произведено при использовании стандартных техник, известных из уровня техники. К примеру, расщепление может производиться при использовании папаина. Примеры расщепления под воздействием папаина описываются в заявке \УО 94/29348, опубликованной 22.12.1994 г., и в патенте США № 4342566. Расщепление антител под воздействием папаина обычно приводит к двум идентичным фрагментам, связывающимся с антигеном, называемым РаЬ-фрагментами, каждый из которых имеет отдельный антиген-связывающий сайт и остаточный Рс-фрагмент. В результате воздействия пепсином получается фрагмент, который имеет два антиген-комбинирующих сайта и все еще способен к кросс-линкингу антигена.
Фрагменты антитела как связанные с другими последовательностями, так и не связанные, могут также включать вставки, делеции, замещения или другие избранные модификации конкретных участков или специфических аминокислотных остатков при условии, что активность фрагмента незначительно изменена или повреждена по сравнению с немодифицированным антителом или фрагментом антитела. Данные модификации могут обеспечивать некоторые дополнительные свойства, такие как добавление/удаление аминокислот, способных к дисульфидному связыванию, увеличение их биостойкости, изменение их секреторных характеристик и т.д. В любом случае фрагмент антитела должен обладать свойством биоактивности, таким как активностью связывания, регуляцией связывания на связывающем домене и т.д. Функциональные или активные участки антитела могут быть идентифицированы при мутагенезе специфического участка белка с последующей экспрессией и контролем экспрессированного полипептида. Такие методы полностью очевидны для опытного специалиста данной области техники и могут включать сайт-специфический мутагенез нуклеиновой кислоты, кодирующей фрагмент антитела.
Антитела по изобретению могут в дальнейшем включать гуманизированные антитела или человеческие антитела. Гуманизированные формы нечеловеческих (например, мышиных) антител - это химерные иммуноглобулины, иммуноглобулиновые цепи или их фрагменты (такие как Γν, РаЬ, РаЬ' или другие антиген-связывающие субпоследовательности антител), которые содержат минимальную последовательность, полученную из нечеловеческого иммуноглобулина. Гуманизированные антитела включают человеческие иммуноглобулины (антитело-реципиент), в которых остатки из определяющего комплементарного участка (СОК) реципиента замещены остатками из СОК нечеловеческих видов (донорское антитело), таких как мыши, крысы или кролики, имеющими желаемую специфичность, аффинность и емкость. В некоторых случаях остатки Рν-каркаса (РК) человеческого иммуноглобулина замещены соответствующими нечеловеческими остатками. Гуманизированные антитела могут также включать остатки, которые не встречаются ни в антителе-реципиенте, ни в импортированном СОК или каркасных последовательностях. В целом, гуманизированное антитело будет включать, по существу, все из по крайней мере одного и, типично, двух вариабельных доменов, в которых все или по существу все участки СОК соответствуют таковым из нечеловеческого иммуноглобулина, и все или по существу все из участков РК являются таковыми консенсусной последовательности человеческого иммуноглобулина. Гуманизированное антитело оптимально также будет содержать по крайней мере один сегмент константного участка иммуноглобулина (Рс), типично - человеческого иммуноглобулина.
Методы гуманизации нечеловеческих антител хорошо известны из уровня техники. В целом, гуманизированное антитело имеет один или более аминокислотный остаток, введенный в него из источника, являющегося нечеловеческим. Такие нечеловеческие аминокислотные остатки называются часто импортированными остатками, которые обычно берутся из импортированного вариабельного домена. Гуманизация может быть произведена в обязательном порядке посредством замены участков СОК или последовательностей СОК грызунов на соответствующие последовательности человеческого антитела. Соответственно, такие гуманизированные антитела являются химерными антителами (патент США № 4816567), где в обязательном порядке менее чем один интактный человеческий вариабельный домен был заменен соответствующей последовательностью нечеловеческого вида. На практике гуманизированные антитела являются типично человеческими антителами, в которых некоторые остатки СОК и, возможно, остатки РК заменены на остатки аналогичных сайтов антител грызунов.
Использоваться могут трансгенные животные (например, мыши), которые способны при иммуниза- 29 023013 ции вырабатывать полный спектр человеческих антител при отсутствии выработки эндогенного иммуноглобулина. Например, было описано, что гомозиготная делеция гена участка присоединения тяжелой цепи антитела у химерных и мутантных мышей зародышевой линии приводит к полному ингибированию выработки эндогенных антител. Перенос генной матрицы иммуноглобулина человеческой зародышевой линии в таких мутантных мышей зародышевой линии будет приводить к выработке человеческих антител с антигенной стимуляцией. Человеческие антитела могут также быть получены в библиотеках фагового отображения.
Антитела по изобретению предпочтительно вводятся в субъект в фармацевтически приемлемом носителе. Подходящее количество фармацевтически приемлемой соли типично используется в составе для усиления изотонности состава. Примеры фармацевтически приемлемых носителей включают раствор натрия хлорида, раствор Рингера и раствор декстрозы. Уровень рН раствора составляет предпочтительно от около 5 до около 8 и более предпочтительно от около 7 до около 7,5. Кроме того, носители включают препараты продолжительного высвобождения, такие как полупроницаемые матрицы твердых гидрофобных полимеров, содержащие антитело, матрицы которых имеют вид профилированных изделий, к примеру, пленки, липосомы или микрочастицы. Для специалиста данной области будет очевидно, что определенные носители могут быть более предпочтительными в зависимости от, например, способа введения и концентрации вводимого антитела.
Антитела могут вводиться в субъект, в пациента или клетку посредством инъекции (например, внутривенно, внутрибрюшинно, подкожно, внутримышечно) или другими способами, такими как вливание, которое гарантирует доставку к кровотоку эффективным образом. Антитела могут также вводиться внутритуморальными или перитуморальными способами, чтобы вызвать локальные, а также и системные терапевтические эффекты. Предпочтительными являются локальная или внутривенная инъекция.
Эффективная дозировка и график введения антител могут быть определены эмпирически, а принятие таковых решений под силу специалисту данной области. Специалистам данной области будет понятно, что дозировка антител, которые должны быть введены, будет варьироваться в зависимости от, например, субъекта, которому будет вводиться антитело, способа введения, конкретного типа используемого антитела и других вводимых медикаментов. ЛпбЬоб1е8 ш Нитап П1адпо818 апб Ткегару, НаЬег е! а1, ебк. Кауеп Ргекк, №\ν Уогк (1977) стр. 365-389. Типичная дневная дозировка антитела, используемого отдельно может варьироваться от около 1 мкг/кг вплоть до 100 мг/кг по весу тела или более в день в зависимости от факторов, упоминаемых выше. Последующее введение антитела для лечения глиобластомы, эффективность терапевтического антитела могут быть оценены различными способами, хорошо известными компетентному специалисту. Например, размер, количество и/или распределение глиобластомы у субъекта, проходящего лечение, может контролироваться с помощью стандартных методов визуализации опухоли. Введенное в терапевтических целях антитело, которое блокирует рост опухоли, приводит к уменьшению размера и/или предотвращает развитие новых опухолей в сравнении с течением болезни, которое бы имело место без введения антитела, и является эффективным антителом для лечения глиобластомы.
Так как опухолевые маркеры глиобластомы ВСА, СЬ1Р2, ^ΤNЛ, N^ОNАX, NК2Е1, NКСАМ и ΓΩΓΝ по изобретению высоко экспрессированы в клетках глиобластомы и экспрессированы на чрезвычайно низких уровнях в нормальных клетках, ингибирование экспрессии или полипептидной активности ВСА, СЬ1Р2, ^ΤNЛ, N^ОNАX, N^^1, NКСАМ или ΓΩΓΝ может быть интегрировано в любую терапевтическую стратегию для лечения или предупреждения глиобластомы.
Принцип антисмысловой терапии основан на гипотезе, что последовательность-специфическое подавлении генной экспрессии (посредством транскрипции или трансляции) может быть достигнуто при внутриклеточной гибридизации между геномной ДНК или мРНК и комплементарными антисмысловыми видами. Образование такого гибридного дуплекса нуклеиновых кислот интерферирует с транскрипцией геномной ДНК-мишени, кодирующей антиген, или процессингом/транспортировкой/трансляцией и/или устойчивостью антигенной мРНК-мишени опухоли.
Антисмысловые нуклеиновые кислоты могут быть доставлены с использованием различных подходов. Например, антисмысловые олигонуклеотиды или антисмысловая РНК могут непосредственно вводиться (например, внутривенной инъекцией) в субъект в форме, которая позволяет поглощение опухолевыми клетками. Альтернативно в клетки могут вводиться ш νί\Ό вирусные или плазмидные векторы, которые кодируют антисмысловую РНК (или фрагменты РНК). Антисмысловые эффекты также могут быть вызваны смысловыми последовательностями; однако степень фенотипических изменений крайне различна. Фенотипические изменения, индуцированные эффективной антисмысловой терапией, оценивались в соответствии с изменения, например, уровни мРНК-мишени, уровни белка-мишени и/или уровни активности белка-мишени.
В специфическом примере ингибирование функции маркера глиобластомы с помощью антисмысловой генной терапии может быть выполнено посредством прямого введения антисмыслового РНКмаркера глиобластомы в субъект. Антисмысловой опухолевый РНК-маркер может быть получен и изолирован с помощью любой стандартной техники, но наиболее просто его получить с помощью транскрипции ш νίΙΐΌ с использованием антисмыслового опухолевого кДНК-маркера под контролем высоко- 30 023013 эффективного промотора (например, Т7-промотор). Введение антисмыслового опухолевого РНК-маркера в клетки может быть произведено любым методом для прямого введения нуклеиновых кислот, описываемых ниже.
Альтернативная стратегия ингибирования функции ВСА, СЫР2, ЭТНА, Ж-СНАХ, ΝΚ2Ε1, ИКСАМ и/или РЭРИ при использовании генной терапии включает внутриклеточную экспрессию антиВСА, СЫР2, ЭТКА, N^ОNΑX, ЦК2Е1, ХНСАМ или Р1)Р\ антитела или фрагмента анти- ВСА, СЫР2, ЭТКА, N^СNΑX. ΝΡ2Ε1, ЯКСАМ или ΓΩΓΝ антитела. Например, ген (или фрагмент гена), кодирующий моноклональное антитело, которое специфически связывается с полипептидом ВСА, СЫР2, ^ТNΑ. N^СNΑX. ΝΡ2Ε1, МКСАМ или ΓΩΓΝ и ингибирует его биологическую активность, помещают под контролем транскрипции специфической (например, ткане- или опухоль-специфической) регуляторной последовательности генов внутрь вектора экспрессии нуклеиновой кислоты. Вектор вводится затем в субъект, так чтобы он поглощался клетками глиобластомы или другими клетками, которые затем секретируют анти- ВСА, СЫР2, ПТЫА, N^СNΑX. ΝΡ2Ε1, ЯКСАМ или РОРЫ антитело и, тем самым, блокируют биологическую активность полипептида ВСА, СЫР2, ^ТNΑ. N^ОNΑX, ΝΡ2Ε1, ЯКСАМ и ΓΩΓΝ. Предпочтительно, если полипептиды ВСА, СЫР2, ^ТNΑ. N^ОNΑX, ΝΡ2Ε1, ЯКСАМ или ΓΩΓΝ присутствуют на внеклеточной поверхности клеток глиобластомы.
В методах, описываемых выше, которые включают введение и поглощение экзогенной ДНК в клетках субъекта (т.е. генную трансдукцию или трансфекцию), нуклеиновые кислоты по настоящему изобретению могут быть в форме обнаженной ДНК, или же нуклеиновые кислоты могут быть в векторе для доставки нуклеиновых кислот к клеткам для ингибирования экспрессии белка-маркера глиобластомы. Вектор может представлять собой имеющийся в продаже препарат, такой как аденовирусный вектор (ОнапЦцп В^οίβсЬηο1οд^βκ, ГОс. (Ьауа1, Οιιβόβπ Канада). Доставка нуклеиновой кислоты или вектора к клеткам может производиться посредством различных механизмов. Например, доставка может производиться с помощью липосомы с использованием имеющихся в продаже липосомных препаратов, таких как ЫРОРЕСТШ, ПРОРЕСТА\П\Е (ОШСО- 25 ВКЬ, Шс., Мб.), ЗиРЕКРЕСТ (^1аΰβη. Шс.
Ш^п, Германия) и ТКАЖРЕСТАМ (Р^οтβда В^οίβс, Шс., Мабтон ^ίκ.), в равной степени как и других липосом, разработанных в соответствии со процедурами, стандартными для уровня техники. Кроме того, нуклеиновая или вектор по настоящему изобретению может быть доставлен ш νίνο посредством электропорации, технология для которой имеется в наличии в компании Оβηβί^οη^сκ, Шс. (Ьап Οίβ§ο, СаПР США), в равной степени, как и с помощью устройства δОNОРОКΑТIОN πκκίιίπβ (ЧтаРх РЬа^тасβиί^са1 Согр., Тископ, Ап/. США).
В качестве одного из примеров доставка вектора может осуществляться посредством вирусной системы, такой как ретровирусная векторная система, которая способна упаковывать рекомбинантный ретровирусный геном. Рекомбинантный ретровирус может быть затем использован, чтобы инфицировать и таким образом доставить к инфицированным клеткам антисмысловую нуклеиновую кислоту, которая ингибирует экспрессию ВСА, СЫР2, ^ТNΑ. N^ОNΑX, ХК2Е1, ЯКСАМ или РОРГО Правильный метод введения измененной нуклеиновой кислоты в клетки млекопитающего, разумеется, не ограничивается использованием ретровирусных векторов. Имеется широкий спектр других техник для данной процедуры, включая использование аденовирусных векторов, адено-ассоциированных вирусных (ААУ) векторов, лентивирусных векторов, псевдотипичных ретровирусных векторов. Также может применяться техника физической трансдукции, такие как липосомная доставка и рецептор-опосредованные и другие эндоцитозные механизмы. Данное изобретение может быть использовано вместе с любым из этих или других обычно используемых методов генного переноса.
Антитела могут также использоваться для диагностических анализов ш νίνο. В целом, антитело помечают радионуклеотидом (таким как 'П'!, 99Тс, 14С, 131! 3Н, 32Р или 35δ), так что опухоль может быть локализована с помощью иммуносцинтиграфии. В одном воплощении антитела или их фрагменты связываются с внеклеточными доменами двух или более раковых мишеней ВСА, СЫР2, ^ТNΑ. N^ОNΑX, ХК2Е1, ЯКСАМ и ΓΟΓΝ при показателе аффинности (Кб) ниже чем 1х 10 мкМ.
Антитела для диагностического применения могут помечаться зондами, подходящими для обнаружения различными способами визуализации. Способы обнаружения зондов включают, но не ограничиваются флуоресценцией, светом, конфокальной и электронной микроскопией; магнитно-резонансной визуализацией и спректроскопией; флюороскопией, компьютерной томографией и позитронноэмиссионной томографией. Подходящие зонды включают, но не ограничиваются флуоресцеином, родамином, эозином и другими флюорофорами, радиоизотопами, золотом, гадолинием и другими лантаноидами, парамагнитным железом, фтором-18 и другими позитронно-активными радионуклидами. Кроме того, зонды могут быть би- или мультифункциональными и обнаруживаться более чем одним из приведенных способов. Данные антитела могут быть помечены напрямую или опосредованно указанными зондами. Присоединение зондов к антителам включает ковалентное присоединение зонда, внедрение зонда в антитело и ковалентное присоединение комплексообразующего соединения для присоединения зонда, широко признанное среди прочих в данной области. Для иммуногистохимических исследований проба пораженной ткани может быть свежей или замороженной или может быть заделанной в парафин и законсервирована таким консервантом, как формалин. Законсервированный или заделанный срез содер- 31 023013 жит пробу, контактировавшую с помеченным первичным антителом и вторичным антителом, где антитело используется для обнаружения экспрессии белка ИСАИ ш κίΐιι.
Настоящее изобретение в другом предпочтительном воплощении обеспечивает пептид, включающий последовательность, которая выбирается из группы 8ЕЦ ГО № 1 по 8ЕЦ ГО № 30 или его вариант, который на 85% гомологичен 8ЕЦ ГО № 1 по 8ЕЦ ГО № 30, или его вариант, который будет индуцировать Т-клеточную перекрестную реакцию с указанным пептидом.
В предпочтительном воплощении пептид выбирается из группы пептидов, включающей последовательность, которая выбирается из группы 8ЕЦ ГО № 1 по 8ЕЦ ГО № 24 или его вариант, который на 85% гомологичен 8ЕЦ ГО № 1 по 8ЕЦ ГО № 24, или его вариант, который будет индуцировать Т-клеточную перекрестную реакцию с указанным пептидом.
Пептиды изобретения обладают способностью связываться с молекулой главного комплекса гистосовместимости человека (МНС) класса I или II.
В настоящем изобретении термин гомологичный относится к степени идентичности между последовательностями двух аминокислотных последовательностей, т.е. пептидных или полипептидных последовательностей. Упомянутая ранее гомология определяется при сравнении двух последовательностей, сопоставляемых в оптимальных условиях со сравниваемыми последовательностями. Сравниваемые последовательности могут иметь дополнение или делецию (например, разрыв и т.п.) в оптимальном противопоставлении двух последовательностей. Такая гомология последовательности может быть подсчитана с помощью создания противопоставления, например, по алгоритму С1и51а1\У (Иис1ею Ас1б Кек., 22(22): 4673 4680 (1994). Широко распространенное программное обеспечение для анализа последовательностей, в частности, Vес!ο^ ИТГ ОЕИЕТУХ или аналитические инструменты, предоставляемые общественными банками данных.
Специалист данной области будет в состоянии оценить, будут ли Т-клетки, индуцированные вариантом специфического пептида, способны к перекрестной реакции с самим пептидом (Ропд е! а1., 2001); (УагетЬа е! а1., 1997; Со1отЬе!б е! а1., 2006; Аррау е! а1., 2006).
Вариантом данной аминокислотной последовательности изобретатели обозначают, что боковые цепи, например, одного или двух аминокислотных остатков изменены (например, при их замещении боковой цепью другого встречающегося в природе аминокислотного остатка или какой-либо другой боковой цепью), так что пептид по-прежнему способен связываться с молекулой НЬА, по существу, таким же путем, как и пептид, состоящий из данной аминокислотной последовательности с 8ЕЦ ГО № 1 по 30. Например, пептид может быть модифицирован таким образом, что он, по крайней мере, сохранит, если не улучшит, способность взаимодействовать и связываться со связывающей бороздкой подходящей молекулы МНС, такой как НЬА-А*02 или -ЭК, и, таким образом, он, по крайней мере, сохранит, если не улучшит, способность связываться с ТКР активированных ЦТЛ. Данные ЦТЛ могут впоследствии вступать в перекрестную реакцию с клетками и уничтожать клетки, которые экспрессируют полипептид, который содержит естественную аминокислотную последовательность родственного пептида, как определено в аспектах этого изобретения. По информации из научной литературы (Каттепкее е! а1., 1997) и банков данных (Каттепкее е! а1., 1999) конкретные позиции связывающихся с НЬА пептидов являются типичными якорными остатками, формирующими центральную последовательность, подходящую к соединительному элементу рецептора НЬА, который определяется полярными, электрофизическими, гидрофобными и пространственными свойствами полипептидных цепей, образующих связывающую бороздку. Так, специалист данной области будет в состоянии модифицировать аминокислотные последовательности, предложенные в 8ЕЦ ГО № 1 по 30, сохраняя известные якорные остатки, и будет в состоянии определить, и будет способен определить, сохранят ли варианты способность связываться с молекулами МНС класса I или II. Варианты настоящего изобретения сохраняют способность связываться с ТКР активированных ЦТЛ, которые могут впоследствии вступать в перекрестную реакцию с и уничтожать клетки, экспрессирующие полипептид, который содержит естественную аминокислотную последовательность родственного пептида, как определено в аспектах этого изобретения.
Те аминокислотные остатки, которые необязательно вносят вклад во взаимодействие с Тклеточным рецептором, могут быть модифицированы при замещении другой аминокислотой, чье включение, по существу, не влияет на реактивность Т-клетки и не устраняет связь с релевантным МНС. Таким образом, помимо данного условия, пептид по изобретению может быть любым пептидом (в обозначение которого изобретатели включают олигопептиды или полипептиды), который включает аминокислотные последовательности или их участок или их вариант, как дано.
- 32 023013
Ь Υ Р К Ь Υ
Р т Υ т н
К Р N
М м Р
Υ 8 V
V К
Позиция 1 2 3 4 5 6 7 8 9
ВСА-0О2 Код пептида А ь * А V Р 8 Е Ь
8Е0 ГО 5 Варианты м
Е К
I А <3 I 1 А
Ь Υ Р к ь Υ
Р Р т Υ т Н
К Р N
м м Р
Υ 8 V
V К
Позиция 1 2 3 4 5 6 7 8 9
СН13Ы-010 Код пептида т ь Υ О м ь N Т Ь
8Е<ЗГО6 Варианты м
Е К
I А I 1 А Е
ь Р к Υ
Р Р Т Υ т Н
к Р N
м М Р
Υ 8 V
V К
Позиция 1 2 3 4 5 6 7 8 9
СЫР2-001 Код пептида 5 ь N Е ь к V Ь Ь
8Εζ) ГО 7 Варианты м
К
I А О 1 I А Е
ь Υ Р к ь Υ
Р Р т Υ т Н
к Р N
м м Р
Υ 8 V
V К
Позиция 1 2 3 4 5 6 7 8 9
- 33 023013
Υ Р К ь Υ
Г т Υ т н
К Р N
М м Г
Υ 8 V
V К
Позиция 1 2 3 4 5 6 7 8 9
СГ АР-001 Код пептида N ь А О ϋ ь А Т V
8Е0 ГО 11 Варианты м ь
ь
Е К
I О I 1 Е
ь Υ Р к Υ
Р Г т Υ т н
к Р N
м М Г
Υ 8 V
V К
Позиция 1 2 3 4 5 6 7 8 9
СРК56-002 Код пептида Р ь ь 8 Е Р V А ь
ЗЕЦГО 12 Варианты м
Е К
1 А С I I А Е
ь Υ Р К ь Υ
Г Т Υ т н
к Р N
м м Г
Υ 8 V
V К
Позиция 1 2 3 4 5 6 7 8 9
СК1-001 Код пептида N I ь Е 0 I V 8 V
8ЕЦ ГО 13 Варианты м Ь
ь Ь
Е К
I А С I I А Е
ь Υ Р к ь Υ
Р Г Т Υ т н
к Р N
м м Р
Υ 8 V
- 34 023013
- 35 023013
V к
Позиция 1 2 3 4 5 6 7 8 9
ТЫС-ОО! Код пептида А м т Ω Ь ь А С V
8Εζ) ГО 23 Варианты Е
ь Ь
Е К
I А О 1 I Е
Ь Υ Р К Υ
Р Р т Υ т н
к Р N
м м Р
Υ 8 V
V К
Позиция 1 2 3 4 5 6 7 8 9
ТОС-002 Код пептида 0 ь ь А С V Р Ь А
8ЕО ГО 24 Варианты м Ь
Ь
Е К
I А С I I А Е
ь Υ Р к ь Υ
Р Р Т Υ т Н
к Р N
м м Р
Υ 8 V
V К
В дальнейшем известно, что пептиды, презентированные МНС класса II, образованы коровой последовательностью, имеющей аминокислотную последовательность, подходящую к конкретному НЬАаллель-специфическому фрагменту и, факультативно, Ν-и/или С-терминальные удлиняющие сегменты, которые не препятствуют функции коровой последовательности (т.е. считаются нерелевантными для взаимодействия пептида и всех или подклассов клонов Т-клетки, распознающих естественную копию). Ν- и/или С-терминальные удлиняющие сегменты могут иметь длину, например, от 1 до 10 аминокислот соответственно. Эти пептиды могут быть использованы как непосредственно для погрузки на молекулы МНС класса II, так и последовательность может быть клонирована на векторы в соответствии с описанным ниже. Так как эти пептиды образуют конечный продукт процессинга более длинных пептидов внутри клетки, то более длинные пептиды могут использоваться в равной степени. Пептиды по изобретению могут быть любого размера, но, в основном, они могут иметь молекулярный вес меньше чем 100000, предпочтительно меньше чем 50000, более предпочтительно меньше чем 10000 и типично около 5000. В отношении числа аминокислотных остатков пептиды по изобретению могут иметь менее чем 1000 остатков, предпочтительно менее чем 500 остатков, более предпочтительно менее чем 100 остатков и наиболее предпочтительно между 30 и 8 остатками. Соответственно, настоящее изобретение обеспечивает
- 36 023013 также пептиды и их варианты, в которых указанный пептид или вариант имеет общую длину между 8 и 100, предпочтительно между 8 и 30 и наиболее предпочтительно между 8 и 16, а именно 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 или 16 аминокислот.
Более длинные пептиды могут быть также подходящими; 9-мерные или 10-мерные пептиды, как описано выше в табл. 2, являются предпочтительными для пептидов МНС класса I, в то время как 12- 15-меры предпочтительны для пептидов МНС класса II.
Для пептидов, рестриктированных по МНС II класса, в молекуле МНС могут быть представлены несколько различных пептидов с одинаковой центральной (коровой) последовательностью Так как взаимодействие с распознающей Т-(хелперной) клеткой определяется центральной последовательностью из 9 до 11 аминокислот, то одним и тем же клоном Т-(хелперной) клетки могут распознаваться несколько вариантов по длине. Таким образом, несколько различных вариантов по длине центральной связывающейся последовательности могут быть использованы для непосредственной погрузки на молекулы МНС II класса без нужды в дальнейшем процессинге и обработке на Ы- или С-терминальных концах. В соответствии с этим, встречающиеся в природе или искусственные варианты, которые индуцируют Тклеточную перекрестную реакцию с пептидом по изобретению, часто являются вариантами по длине.
Если пептид, который длиннее, чем около 12 аминокислотных остатков, непосредственно используется для связывания с молекулой МНС II класса, предпочтительно, чтобы остатки, которые примыкают к центральному НЬЛ-связывающему участку, по существу, не влияли на способность пептида специфически связываться со связывающей бороздкой молекулы МНС II класса или презентировать пептид Т(хелперной) клетке. Тем не менее, как уже было указано выше, следует понимать, что могут быть использованы более крупные пептиды, например, если они закодированы полинуклеотидом, потому что такие крупные пептиды могут быть разделены на фрагменты подходящими антигенпрезентирующими клетками. Однако в одинаковых случаях было показано, что примыкающие участки центральной последовательности могут оказывать влияние на связывание пептида с молекулой МНС II класса или взаимодействие димерного комплекса МНС-пептид с ТКР в обоих направлениях по сравнению с контрольным пептидом с такой же центральной последовательностью. Внутримолекулярные третичные структуры внутри пептида (к примеру, петлеобразное образование) обычно снижают аффинности к МНС или ТКР. Внутримолекулярные взаимодействия примыкающих участков с частями МНС или ТКР вне связывающих бороздок пептида могут стабилизировать взаимодействие. Такие изменения в аффинности могут иметь исключительное влияние на потенциал пептида МНС класса II по вызыванию ответов Т(хелперных) клеток.
Также возможно, чтобы эпитопы МНС I класса, хотя они обычно имеют длину между 8-10 аминокислотами, генерировались при процессинге пептидов из более длинных пептидов или белков, включающих истинный эпитоп. Предпочтительно, чтобы остатки, которые примыкают к истинному эпитопу, по существу, не влияли на протеолитическое расщепление, необходимое для выявления истинного эпитопа во время процессинга.
Предпочтительными являются, поэтому, пептиды с центральной последовательностью выбранной из группы, состоящей из δΕΟ ГО № 1 по δΕΟ ГО № 30 с удлиняющими сегментами из 1 до 10 аминокислот на С-терминальном и/или Ы-терминальном конце, более предпочтительно, если общее число данных примыкающих аминокислот составляет от 1 до 12, более предпочтительно от 1 до 10, более предпочтительно от 1 до 8, более предпочтительно от 1 до 6, более предпочтительно от 1 до 4 и, даже еще более предпочтительно, от 1 до 2, где примыкающие аминокислоты могут быть распределены в любом соотношении к С-концу и Ы-концу (например, все примыкающие аминокислоты могут быть добавлены к одному концу, или же аминокислоты могут быть добавлены в равном количестве к обоим концам или в любой другой пропорции), при условии, что пептид по-прежнему способен связываться с молекулой НЬЛ таким же путем, как и указанный пептид в соответствии с δΕΟ ГО № 1 по δΕΟ ГО № 30.
Примыкающие аминокислоты могут также снижать скорость деградации пептидов ίη νίνο, так что количество фактического пептида, находящегося в распоряжении ЦТЛ, выше по сравнению с пептидом без примыкающих аминокислот, таким образом, выступая в качестве пролекарства.
Соответственно, настоящее изобретение обеспечивает также пептиды и варианты эпитопов МНС класса I, в которых указанный пептид или вариант имеет общую длину между 8 и 100, предпочтительно между 8 и 30 и наиболее предпочтительно между 8 и 16, а именно 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 аминокислот.
Разумеется, пептид или вариант в соответствии с настоящим изобретением будет обладать способностью связываться с молекулой главного комплекса гистосовместимости человека (МНС) I или II класса. Связывание пептида или варианта с комплексом МНС может быть проверено методами, известными из уровня техники, например теми, что описываются в литературе для различных аллелей МНС II класса (к примеру, νο^ί еί а1., 1994; Ма1сНегек еί а1., 1994; Мата еί а1., 1999; Наттег еί а1., 1995; ^трк^ еί а1., 1993; Βογίοη еί а1., 1998).
В особенно предпочтительном воплощении изобретения пептид состоит или преимущественно состоит из аминокислотной последовательности в соответствии с δΕΟ ГО № 1 по δΕΟ ГО № 30.
Состоящий преимущественно из подразумевает, что пептид в соответствии с настоящим изобре- 37 023013 тением, помимо последовательности в соответствии с любой из 8ЕЦ ГО № 1 по 8ЕЦ ГО № 30 или одним из их вариантов, содержит дополнительные находящиеся на Ν- и/или С-конце фрагменты аминокислот, которые не являются обязательно формирующими часть пептида, которая функционирует как эпитоп для эпитопа молекул МНС.
Тем не менее эти фрагменты могут быть важны для обеспечения эффективного введения пептида в соответствии с настоящим изобретением в клетки. В одном воплощении настоящего изобретения пептид является белком слияния, который включает, например, 80 Ν-терминальных аминокислот НЬАГОК антиген-ассоциированной инвариантной цепи (р33, в дальнейшем Ιί), как взятый из банка данных ЫСВЕ инвентарный номер - ОепВапк Ассеккюп-питЬег Х00497 (§!гиЫп, Μ. е! а1 1984).
Кроме того, пептид или вариант может быть модифицирован в дальнейшем для улучшения стабильности и/или связывания с молекулами МНС в целях получения более сильного иммунного ответа. Методы для такой оптимизации пептидной последовательности хорошо известны из уровня техники и включают, например, введение обратных пептидных или непептидных связей.
В пептидах с обратной связью аминокислотные остатки присоединены не пептидными связями (-СО-ЫН-), но пептидная связь является обратной. Такие ретро-обратные пептидомиметики могут быть получены методами, известными из уровня техники, например такими, как описано в работе Μеζ^е^е и соавторов (1997) 1. Iттиηο1. 159, 3230-3237, включенной сюда путем ссылки. Этот принцип охватывает получение псевдопептидов, содержащих изменения, которые охватывают остов, но не ориентацию боковых цепей. Μеζ^е^е и соавторы (1997) показывают, что эти псевдопептиды пригодны для связывания с МНС и ответов Т-хелперных клеток. Ретро-обратные пептиды, которые содержат связи ЫН-СО вместо пептидных связей СО-ЫН, намного более устойчивы к протеолизу.
Непептидной связью является, например, -СН2-ЫН, -СН2§-, -СН2СН2-, -СН=СН-, -СОСН2-, -СН(ОН)СН2-, и -СН2§О-. Патент США № 4897445 обеспечивает метод твердофазного синтеза непептидных связей (-СН2-ЫН) в полипептидных цепях, что включает полипептиды, синтезированные с использованием стандартной методики, и непептидную связь, синтезированную при реакции аминоальдегида и аминокислоты в присутствии ЫаСЫВН3.
Пептиды, включающие последовательности, описанные выше, могут быть синтезированы с дополнительными химическими группами, находящимися на их аминном и/или карбоксильном концах, для увеличения стабильности, биологической доступности и/или аффинности пептидов. Например, гидрофобные группы, такие как карбобензоксильные, дансильные или трет-бутилоксикарбонильные группы, могут быть добавлены к амино-концам пептидов. Подобным образом, ацетильная группа или 9фторенилметокси-карбонильная группа может быть введена на амино-концах пептидов. Кроме того, гидрофобная группа, трет-бутилоксикарбонильная или амидная группа может быть добавлена к карбоксильным концам пептидов.
Далее, все пептиды по изобретению могут быть синтезированы в целях изменения их пространственной конфигурации. Например, Ό-изомер одного или более аминокислотных остатков пептида может быть использован скорее, чем обычный Ь-изомер. Более того, по крайней мере один из аминокислотных остатков пептидов по изобретению может быть замещен одним из хорошо известных не встречающихся в природе аминокислотных остатков. Изменения, такие как данные, могут служить для повышения стабильности, биологической доступности и/или связывающих свойств пептидов по изобретению.
Подобным образом, пептид или вариант по изобретению может быть модифицирован химическим способом посредством реакции специфических аминокислот как до, так и после синтеза пептида. Примеры таких модификаций хорошо известны из уровня техники и обобщаются, например, в работе К. ЬипйЫай, СНеппса1 Кеадеп!к Рог Рго!еш Μοά^ίϊса!^οη, 3гй ей. СКС Ргекк, 2005, которая включена сюда путем ссылки. Химическая модификация аминокислот включает, но не ограничивается, модификацией с помощью ацилирования, амидирования, пиридоксилирования лизина, восстановительного алкилирования, тринитробензилирования аминных групп 2,4,6-тринитробензолсульфоновой кислотой (ТЫВ§), амидной модификацией карбоксильных групп и сульфгидрильной модификацией с помощью окисления надмуравьиной кислотой цистеина до цистеиновой кислоты, образованием ртутных производных, образованием смешанных дисульфидов с другими тиоловыми соединениями, реакцией с малеимидом, карбоксиметилированием йодуксусной кислотой или йодацетамидом и карбамоилированием цианатом при щелочном уровне рН, хотя не ограничиваясь ими. В этой связи специалист данной области может проконсультироваться с главой 15 раздела Сиггеп! Рго!осо1к в журнале Рго!еш §аепсе, Ейк. СоНдап е! а1. ОоНп \νίΚν & §опк ЫУ 1995-2000) для получения более обширной информации о методах, связанных с химической модификацией белков.
Успешная модификация терапевтических белков и пептидов с РЕО-полиэтиленгликолем часто ассоциируется с увеличением циркуляторного полураспада, в то время как кросс-линкинг белков с глутаральдегидом, полиэтиленгликоль-диакрилатом и формальдегидом используется для приготовления гидрогелей. Химическая модификация аллергенов для иммунотерапии часто достигается при карбамоилировании цианатом калия.
Пептид или вариант, в котором пептид модифицирован или включает непептидные связи, является предпочтительным воплощением изобретения. В целом, пептиды и варианты (по крайней мере, те, что
- 38 023013 содержат пептидные связи между аминокислотными остатками) могут быть синтезированы Ртосполиамидным способом твердофазного пептидного синтеза, как раскрыто у Ьи и соавторов (1981), и в прилагающихся ссылках. Временная защита Ν-аминогруппы предусмотрена группой 9флуоренилметилоксикарбонил (Ртос). Повторное расщепление этой высоко щелоче-лабильной защитной группы осуществляется при использовании 20% пиперидина в Ν,Ν-диметилформамиде. Функциональности боковой цепи могут быть защищены как их бутиловые эфиры (в случае серинтреонина и тирозина), бутиловые сложные эфиры (в случае глютаминовой кислоты и аспарагиновой кислоты), бутилоксикарбониловое производное (в случае лизина и гистидина), тритиловое производное (в случае цистеина) и производное 4-метокси-2,3,6-триметилбензолсульфонила (в случае аргинина). Где глютамин или аспарагин являются С-терминальными остатками, для защиты функциональности боковой амидо-цепи используется 4,4'-диметоксибензгидрильная группа. Твердофазный носитель основан на полимере полидиметилакриламида, состоящем из трех мономеров: диметилакриламида (остов-мономер), бисакрилоилэтилендиамина (кросс-линкер) и метилового эфира акрилоилсаркозина (функционализирующий агент). Использованным агентом с расщепляемым соединением пептид-смола является кислотнолабильное производное 4-гидроксиметилфеноксиуксусной кислоты. Все аминокислотные производные добавляются как их преформированные симметричные ангидридные производные за исключением аспарагина и глютамина, которые добавляются с применением метода обратного соединения, опосредованного Ю^дициклогексилкарбодиимид/1-гидроксибензотриазолом. Все реакции сочетания и снятия защитных групп отслеживались с помощью нингидрина, тринитробензолсульфоновой кислоты или технологии контроля изотином. После завершения синтеза пептиды отщепляются от смолы-носителя сопутствующим удалением защитных групп боковой цепи при обработке 95% трифторуксусной кислотой, содержащей 50% поглотителя примесей. Обычно используемые поглотители включают этандитиол, фенол, анизол и воду, окончательный выбор зависит от составляющих аминокислот синтезированного пептида. Также возможна комбинация твердофазных и жидкофазных методов для синтеза пептидов (см., например, ВгискбогГег е! а1. 2004 и прилагаемые ссылки).
Трифторуксусную кислоту удаляют выпариванием в вакууме с последующим измельчением с диэтиловым эфиром для получения сырого пептида. Любые представленные поглотители удаляются простой технологией экстракции, которая при лиофилизации водной фазы позволяет получить сырой пептид без поглотителей. Реагенты для синтеза пептидов, как правило, имеются в наличии, например, в Са1ЫосНет-ШуаЫосНет (Великобритания) Ь!б, ШПтдйат NС7 2Ц1, Великобритания.
Очистка может быть произведена любой техникой или комбинацией таких техник, как рекристаллизация, эксклюзивная (по размеру) хроматография, ионообменная хроматография, хроматография гидрофобного взаимодействия и (обычно) обратнофазная высокоэффективная жидкостная хроматография с использованием, к примеру, градиентного разделения ацетонитрил/вода.
Анализ пептидов может быть произведен при использовании тонкослойной хроматографии, электрофореза, в частности капиллярного электрофореза, твердофазной экстракции (ТФЭ), обратнофазной высокоэффективной жидкостной хроматографии, аминокислотного анализа после кислотного гидролиза и масс-спектрометрического анализа при быстрой бомбардировке атомами (РЛВ), а также массспектрометрический анализ МЛЬ-О! и ΕδΡΡ-ТОР.
Дальнейший аспект изобретения обеспечивает нуклеиновую кислоту (например, полинуклеотид), кодирующую пептид или вариант пептида по изобретению. Полинуклеотид может быть, например, ДНК, кДНК, ПНК, ЦНК, РНК или их комбинациями, как одно-, так и/или двухнитевыми; натуральными или стабилизированными формами полинуклеотидов, таких как, например, полинуклеотиды с фосфоротиоатным остовом, и может или не может содержать интроны в период времени кодирования для пептида. Разумеется, только пептиды, которые содержат встречающиеся в природе аминокислотные остатки, присоединенные встречающимися в природе пептидными связями, могут кодироваться полинуклеотидом. Еще один дальнейший аспект изобретения обеспечивает вектор экспрессии, способный экспрессировать полипептид в соответствии с изобретением.
Был разработан ряд методов для связывания полинуклеотидов, в особенности ДНК, с векторами, например, с помощью дополнительных липких концов. К примеру, в сегмент ДНК могут быть добавлены дополнительные гомополимерные участки для внесения в вектор ДНК. Вектор и сегмент ДНК в таком случае соединены водородной связью между дополнительными гомополимерными концевыми участками, образуя рекомбинантные молекулы ДНК.
Синтетические сшивающие агенты, содержащие один или несколько сайтов рестрикции, обеспечивают альтернативный способ присоединения сегмента ДНК к векторам. Синтетические сшивающие агенты, содержащие ряд сайтов рестрикционной эндонуклеазы, имеются в продаже в различных источниках, включая [ШегпаИошй Вю1ес11по1ощек Шс, №ν Науеи ΟΝ, США.
Желаемый способ модификации ДНК, кодирующей полипептид по изобретению, - это использование цепной реакции полимеразы, как раскрыто в работе (δί·ιί1<ί е! а1 (1988)). Этот метод может быть использован для введения ДНК в подходящий вектор, например, при инженерии в подходящих сайтах рестрикции, или же он может быть использован для модификации ДНК другими пригодными путями, известными из уровня техники. Если используются векторы, то предпочтительными являются оспенные
- 39 023013 или аденовирусные векторы.
Затем ДНК (или в случае ретровирусных векторов РНК) может экспрессироваться в подходящего хозяина для получения полипептида, включающего пептид или вариант по изобретению. Таким образом, ДНК, кодирующая пептид или вариант по изобретению, может быть использована в соответствии с известными техниками, модифицированная соответствующим образом с учетом приведенных здесь идей, для создания вектора экспрессии, который затем используется для трансформации подходящей клеткихозяина для экспрессии и получения полипептида по изобретению. Такие техники включают те, что раскрыты в патентах США № 4440859, 4530901, 4582800, 4677063, 4678751, 4704362, 4710463, 4757006, 4766075 и 4810648.
ДНК (или в случае ретровирусных векторов - РНК), кодирующая полипептид, представляющий собой соединение по изобретению, может быть присоединена к обширному ряду других последовательностей ДНК для введения в адекватного хозяина. ДНК-спутник будет зависеть от природы хозяина, способа введения ДНК хозяину и от того, желательно ли эписомальное поддержание или интеграция.
Как правило, ДНК вводится в вектор экспрессии, такой как плазмида, с правильной ориентацией и корректной рамкой считывания экспрессии. Если необходимо, то ДНК может быть сцеплена с адекватными транскрипционными и трансляционными регулирующими контрольными нуклеотидными последовательностями, распознаваемыми желательным хозяином, хотя такой контроль обычно имеется в векторе экспрессии. Вектор вводится затем хозяину стандартными способами. Как правило, не все хозяева трансформируются вектором. Поэтому будет необходимо выбрать трансформированные клетки-хозяева. Одна из техник отбора включает введение в вектор экспрессии последовательности ДНК с любыми необходимыми элементами контроля, кодирующей выбранный признак в трансформированной клетке, такой как невосприимчивость к антибиотикам.
Альтернативно ген для такого выбираемого признака может быть на другом векторе, который используется для ко-трансформации желаемой клетки-хозяина.
Клетки-хозяева, которые были трансформированы рекомбинантной ДНК по изобретению, культивируются затем в течение достаточного времени и при адекватных условиях, известных специалистам данной области, с учетом раскрытых здесь идей, что ведет к экспрессии полипептида, который после этого может быть получен.
Известно множество систем экспрессии, включающих бактерии (например, Е.соП и ВасШик киЬййк), дрожжи (например, δ;·ι^1ι;·ιΐΌΐη\^5 сегеу1к1ае), мицелиальные грибы (например, АкрегдШик крес), растительные клетки, клетки животных и насекомых. Предпочтительно, чтобы система была клетками млекопитающих, такими как клетки СНО, имеющимися в наличии в АТСС Се11 Вю1оду Со11есйоп.
Типичная клеточная векторная плазмида млекопитающих для конститутивной экспрессии включает промотор СМУ или δν40 с подходящим концевым участком поли-А и маркером устойчивости, таким как неомицин. Одним примером является ρδνΈ, имеющимся в наличии в Рйагтаиа, Р1кса!атеау, ΝΙ, США. Примером индуцируемого вектора экспрессии млекопитающих является ρМδС, имеющийся также в наличии в Рйагтааа. Пригодными плазмидными векторами дрожжей являются рШ403-406 и рШ413416, и они, как правило, имеются в наличии в δίπι^^τκ С1отпд δук!етк, Ьа 1о11а, СА 92037, США. Плазмиды рШ403, рШ404, рШ405 и рШ406 являются дрожжевыми интегрирующими плазмидами (М!рк) и включают дрожжевые селектируемые маркеры НК3, ТКР1, ΕΕυ2 и ИКА3. Плазмиды рШ413416 являются дрожжевыми центромерными плазмидами (Усрк). Основанные на промоторе векторы СМУ (например, из δ^дта-А1б^^сй) обеспечивают кратковременную или устойчивую экспрессию, цитоплазмическую экспрессию или секрецию и Ν-терминальную или С-терминальную маркировку в различных комбинациях РЬАС, 3хРЬАС, с-тус или МАТ. Данные белки слияния позволяют детекцию, очистку и анализ рекомбинантного белка. Слияния с двойной меткой обеспечивают гибкость при детекции.
Сильный промоторный регуляторный участок цитомегаловируса человека (СМУ) возбуждает конститутивные уровни белковой экспрессии, достигающие 1 мг/л в клетках СΟδ. Для менее активных клеточных линий белковые уровни типично составляют ~0,1 мг/л. Присутствие точки начала репликации δν40 будет приводить к высоким уровням репликации ДНК в терпящих репликацию δν40 клетках СΟδ. Векторы СМУ, например, могут содержать точку начала для репликации рМВ1 (производное рВК322) в бактериальных клетках, ген Ь-лактамазы для отбора устойчивости к ампициллину у бактерий, йСН ро1уА и точку начала Н. Векторы, содержащие лидерную последовательность пре-про-трипсина (РРТ), могут направлять секрецию белков слияния РЬАС в культуральную среду для очистки с использованием антител АNТI-Р^АС, смол и планшетов. Другие векторы и системы экспрессии для применения с различными клетками-хозяевами хорошо известны из уровня техники.
Настоящее изобретение относится также к клетке-хозяину, трансформированной с помощью полинуклеотидной векторной модели настоящего изобретения. Клетка-хозяин может быть как прокариотической, так и эукариотической. Бактериальные клетки могут быть, предпочтительно, прокариотическими клетками-хозяевами при некоторых условиях и типично являются штаммом Е. сой, таким как, например, Е.сой штамма ОН5, имеющимся в наличии в ВеШекба Кекеагсй ЬаЬогаЮйек Шс., Ве!йекба, МО, СШМ, и КК1, имеющимся в наличии в Американской коллекции типов культур (Атепсап Туре СиЙиге Со11есйоп (АТСС)), КоскуШе, МО, США (№ АТСС 31343). Предпочтительные эукариотические клетки- 40 023013 хозяева включают дрожжи, клетки насекомых и млекопитающих, предпочтительно клетки позвоночных, таких как мышь, крыса, обезьяна или человеческие фибробластные клетки и клеточные линии толстого кишечника. Дрожжевые клетки-хозяева включают УРН499, УРН500 и УРН501, которые, как правило, имеются в наличии в 8!га!адспс С1отп§ 8ук!стк, Ьа 1о11а, СА 92037, США. Предпочтительные клеткихозяева млекопитающих включают клетки яичника китайского хомяка (СНО), имеющиеся в наличии в АТСС как ССЬ61, N14 эмбриональные клетки швейцарской мыши №Н/3Т3, имеющиеся в наличии в АТСС как СКЬ 1658, почечные клетки обезьяны СО8-1, имеющиеся в наличии в АТСС как СКЬ 1650 и клетки 293, являющиеся эмбриональными клетками печени человека. Предпочтительными клетками насекомых являются клетки 8Г9, которые могут трансфецироваться с помощью бакуловирусных векторов экспрессии. Обзор в отношении выбора подходящих клеток-хозяев для экспрессии представлен, например, в пособии авторов РаиНпа Ва1Ьак и Агдейа Ьогепсе Мс!Нойк ш Мо1сси1аг Вю1о§у КссотЬшап! Оспе Ехргеккюп КсуЮук апй Рго!осо1к, часть первая, второе издание, I8ВN 978-1-58829-262-9, и другой литературе, известной специалисту данной области.
Трансформация адекватных клеток-хозяев с помощью модели ДНК настоящего изобретения совершается при помощи хорошо известных способов, которые обычно зависят от типа используемого вектора. Относительно трансформации прокариотических клеток-хозяев см., например, СоНеп и соавторы (1972) Ргос. №!1. Асай. 8ск И8А 69, 2110 и 8атЬгоок и соавторы (1989) Мо1сси1аг С1отп§, А ЬаЬога!огу Мапиа1, Со1й 8рппд НагЬог ЬаЬога!огу, Со1й 8рппд НагЬог, Нью-Йорк. Трансформация дрожжевых клеток описывается у 8йсгтап и соавторов (1986) Мс!Нойк 1п Усак! Оспейск, А ЬаЬога!огу Мапиа1, Со1й 8рппд НагЬог, Нью-Йорк. Также подходит метод Бигса (Веддк) (1978) №Нигс 275,104-109. Что касается клеток позвоночных, то подходящие для трансфекции таких клеток реагенты, например фосфат кальция и ЭЕАЕ-декстран или липосомальные составы, имеются в наличии в 8!га!адспс С1отп§ 8ук!стк или Ьйе ТссНпо1одюк 1пс., ОаХЬсгкЬигд, МО 20877, США. Электропорация также подходит для трансформации и/или трансфекции клеток и хорошо известна из уровня техники для трансформации дрожжевых клеток, бактериальных клеток, клеток насекомых и клеток позвоночных.
Успешно трансформированные клетки, т.е. клетки, которые содержат конструкцию ДНК настоящего изобретения, могут быть идентифицированы хорошо известными способами, такими как ПЦР. Альтернативно наличие белка в супернатанте может выявляться с применением антител.
Следует понимать, что некоторые клетки-хозяева по изобретению подходят для получения пептидов по изобретению, например бактериальные, дрожжевые клетки и клетки насекомых. Тем не менее другие клетки-хозяева могут быть пригодны в конкретных терапевтических методах. Например, антигенпрезентирующие клетки, такие как дендритные клетки, могут с пользой быть использованы для экспрессии пептидов по изобретению так, что их можно будет нагружать на адекватные молекулы МНС. Таким образом, актуальное изобретение обеспечивает клетку-хозяина, включающую нуклеиновую кислоту или вектор экспрессии в соответствии с изобретением.
В предпочтительном воплощении клетка-хозяин является антигенпрезентирующей клеткой, в частности дендритной клеткой или антигенпрезентирующей клеткой. АПК, нагруженные рекомбинантным белком слияния, содержащим простатическую кислую фосфатазу (РАР), на данный момент проходят исследования в целях лечения рака простаты (81ри1еисс1-Т) (8та11 Е.Ь с! а1 2006; Ρίπί с! а1 2006).
Дальнейший аспект изобретения обеспечивает способ получения пептида или его варианта; способ, включающий культивацию клетки-хозяина и изоляцию пептида из клетки-хозяина или его культуральной среды.
В другом воплощении пептид, нуклеиновая кислота или вектор экспрессии по изобретению используются в медицине. Например, пептид или его вариант может приготавливаться для внутривенной (ί.ν.) инъекции, подкожной (к.с.) инъекции, внутрикожной (ί.ά.) инъекции, внутрибрюшной (ΐ.ρ.) инъекции, внутримышечной (1.т.) инъекции. Предпочтительные способы пептидной инъекции включают к.с, ί.ά., ΐ.ρ., 1.т. и ί.ν. Предпочтительные способы инъекции ДНК включают Ей., 1.т., к.с, ΐ.ρ. и ί.ν. Вводиться могут дозы, к примеру, между 50 мкг и 1,5 мг, предпочтительно от 125 до 500 мкг пептида или ДНК и будут зависеть от соответствующего пептида или ДНК. Дозы в данных пределах успешно использовались в предыдущих клинических исследованиях (ВгипкуЦ с! а1 2006; 81асН1сг с! а1 2007).
Другой аспект настоящего изобретения включает способ получения активированных Т-клеток ш νί!го; способ, включающий контактирование Т-клеток ш νίϋΌ с нагруженными антигеном молекулами МНС I или II класса человека, экспрессированными на поверхности подходящей антигенпрезентирующей клетки на период времени, достаточного для активации антиген-специфическим образом Т-клетки, где антиген является пептидом в соответствии с изобретением. Предпочтительным образом, достаточное количество антигена используется с антигенпрезентирующей клеткой.
В случае эпитопа МНС класса II, используемого в качестве антигена, Т-клетки являются СЭ4положительными хелперными клетками, предпочтительным образом, типа ТН1. Молекулы МНС класса II могут быть экспрессированы на поверхности любой подходящей клетки. Предпочтительно, если клетка в естественных условиях не экспрессирует молекулы МНС класса II (в этом случае клетка трансфецирована для экспрессии такой молекулы). Альтернативно, если клетка в естественных условиях экспрессирует молекулы МНС класса II, то предпочтительно, чтобы клетка была дефектной для сигнальных пу- 41 023013 тей процессинга или презентации антигена. Тогда на клетку, экспрессирующую молекулы МНС класса II, возможна полная погрузка выбранного пептидного антигена до активации Т-клетки.
Антигенпрезентирующая клетка (или клетка-стимулятор) типично имеет молекулы МНС класса II на своей поверхности и предпочтительно обычно является не способной самостоятельно нагружать на указанную молекулу МНС класса II выбранный антиген. Молекула МНС II класса может быть легко нагружена выбранным антигеном ш νίΙΐΌ.
Предпочтительно, если в клетке млекопитающих не хватает или имеется пониженный уровень или пониженная функция пептидного транспортера ТАР. Подходящие клетки, в которых не хватает пептидного транспортера ТАР, включают Т2, РМА-δ и клетки дрозофилы. ТАР - это транспортер, ассоциированный с процессингом антигена.
Нагружающая пептидом дефектная клеточная линия Т2 человека имеется в наличии в Атепсап Τуρе СиЬиге Со11есйоп, 12301 Ρа^к1аνη Όπιό, РоскуШе, Магу1апб 20852, США под каталоговым № СРЬ 1992; клеточная линия дрозофилы линия 8сЬпе1бег 2 имеется в наличии в АТСС под каталоговым № СРЬ 19863; клеточная линия мыши РМА-δ описывается у Кагге и соавторов 1985.
Предпочтительно, если указанная клетка-хозяин до трансфекции, в основном, не экспрессирует молекулы МНС I класса. Также предпочтительно, если клетка-стимулятор экспрессирует молекулу, важную для обеспечения сигнала ко-стимуляции для Т-клеток, такую как любая из В7.1, В7.2, ЮАМ-1 и ЬРА 3. Последовательности нуклеиновой кислоты многочисленных молекул МНС II класса и костимулирующих молекул общедоступны в банках данных ОепВапк и ΕМВ^.
Аналогично, в случае использования эпитопа МНС класса I в качестве антигена, Т-клетки являются СО8-положительными ЦТЛ.
Если антигенпрезентирующая клетка трансфецирована для экспрессии такого эпитопа, то предпочтительно, чтобы клетка включала вектор экспрессии, способный экспрессировать пептид, содержащий δΕΟ ГО № 1 по δΕΟ ГО № 30 или их вариантную аминокислотную последовательность.
Для генерации ЦТЛ ш у11го могут быть использованы многие другие способы. Например, в методах, описанных у Ρеορ1е8 и соавторов (1995) и Казуакаии и соавторов (1992), используются аутологичные опухоль-инфильтрующие лимфоциты при генерации ЦТЛ. Для приготовления ЦТЛ ΡΗ^-ηΜά и соавторы (1995) используют аутологичные лимфоциты периферической крови (ЛПК). 1осЬти8 и соавторы (1997) описывают получение аутологичных ЦТЛ посредством импульсного введения пептида или полипептида в дендритные клетки или посредством инфицирования рекомбинантным вирусом. НШ и соавторы (1995) и 1еготе и соавторы (1993) для получения аутологичных ЦТЛ используют В-клетки. Кроме того, для получения аутологичных ЦТЛ могут быть использованы макрофаги с введенным импульсным методом пептидом или полипептидом или инфицированные рекомбинантным вирусом. δ.^Vа1ιе^ и соавторы (2003) описывают прайминг Т-клеток ш у11го с использованием искусственных антигенпрезентирующих (аАПК) клеток, что является также подходящим способом генерации Т-клеток против выбранного пептида. В данном исследовании, аАПК были генерированы при соединении преформированных комплексов МНС-пептид с поверхностью полистироловых частиц (микрошарики) с помощью биохимического способа с биотином-стрептавидином. Данная система допускает точный контроль плотности МНС на аАПК, который позволяет селективно вызвать высоко- или низкоавидные антигенспецифические Тклеточные ответы с высокой эффективностью из проб крови. Кроме комплексов МНС/пептид аАПК должны нести другие белки с ко-стимулирующей активностью, такие как антитела анти-СО28, соединенные с их поверхностью. Кроме того, такая основанная на аАПК система часто требует добавления адекватных растворимых факторов, к примеру, цитокинов, таких как интерлейкин-12.
При получении Т-клеток могут быть также использованы аллогенные клетки, и метод детально описывается в патенте \УО 97/26328. Например, кроме клеток дрозофилы и Т2-клеток, для презентации антигенов могут использоваться другие клетки, такие как клетки яичника китайского хомяка (СНО), бакуловирус-инфицированные клетки насекомых, бактерии, дрожжи, инфицированные осповакциной клетки-мишени. Кроме того, могут быть использованы растительные вирусы (см., например, работу Ρο^ιа е1 а1. (1994)), которая описывает развитие мозаичного вируса китайской вигны как высокопродуктивную систему для презентации чужеродных пептидов.
Активированные Т-клетки, которые направлены против пептидов изобретения, полезны в терапии. Таким образом, дальнейший аспект изобретения обеспечивает активированные Т-клетки, получаемые вышеупомянутыми методами по изобретению.
Активированные Т-клетки, полученные с помощью приведенного выше способа, будут селективно распознавать клетку, которая аберрантно экспрессирует полипептид, включающий аминокислотную последовательность с δΕΟ ГО № 1 по 30.
Предпочтительно, чтобы Т-клетка распознавала клетку при взаимодействии посредством ее ТКР с комплексом НЬА/пептид (например, соединение). Т-клетки полезны в способе уничтожения клетокмишеней у пациента, клетки-мишени которого аберрантно экспрессируют полипептид, включающий аминокислотную последовательность по изобретению, где пациенту вводится эффективное число активированных Т-клеток. Т-клетки, которые введены пациенту, могут быть получены от пациента и активироваться, как описывалось выше (т.е. они являются аутологичными Т-клетками). Альтернативно Т- 42 023013 клетки получают не от пациента, а от другого индивида. Разумеется, предпочтительно, если индивид является здоровым индивидом. Здоровым индивидом изобретатели обозначают, что индивид имеет, в общем, хорошее здоровье, предпочтительно, он имеет компетентную иммунную систему и, более предпочтительно, не страдает ни одним заболеванием, которые можно легко проконтролировать и выявить.
Ш νί\Ό клетками-мишенями для СИ4-положительных Т-клеток в соответствии с настоящим изобретением могут быть клетки опухоли (которые иногда экспрессируют МНС класса II) и/или стромальные клетки, окружающие опухоль (опухолевые клетки) (которые иногда также экспрессируют МНС класса II ГОепд|е1 е! а1., 2006)).
Т-клетки настоящего изобретения могут быть использованы в качестве активных ингредиентов в терапевтической композиции. Таким образом, изобретение обеспечивает также способ уничтожения клеток-мишеней у пациента, чьи клетки-мишени аберрантно экспрессируют полипептид, включающий аминокислотную последовательность по изобретению; способ, включающий введение пациенту эффективного числа Т-клеток, как определено выше.
Под понятием аберрантно экспрессированный изобретатели понимают, что полипептид гиперэкспрессирован по сравнению с нормальными уровнями экспрессии, или что ген является молчащим в ткани, из которой образовалась опухоль, однако он экспрессирован в опухоли. Под понятием гиперэкспрессирован изобретатели понимают, что полипептид представлен на уровне, который по крайней мере в 1,2 раза выше уровня, представленного в нормальной ткани; предпочтительно по крайней мере в 2 раза и более предпочтительно по крайней мере в 5 или 10 раз выше уровня, представленного в нормальной ткани.
Т-клетки могут быть получены способами, известными из уровня техники, к примеру теми, что описаны выше.
Протоколы для этого т.н. адоптивного переноса Т-клеток хорошо известны из уровня техники, и с ними можно ознакомиться, например, в работах (КокепЬегд е! а1., 1987; КокепЬегд е! а1., 1988; Ииб1еу е! а1., 2002; Уее е! а1., 2002; Ииб1еу е! а1., 2005); обобщенных в (ОаШпот е! а1., 2006) и (Могдап е! а1., 2006).
Любая молекула по изобретению, т.е. пептид, нуклеиновая кислота, вектор экспрессии, клетка, активированные ЦТЛ, Т-клеточный рецептор или нуклеиновая кислота, кодирующая его, полезна для лечения нарушений, характеризующихся клетками, ускользающими от иммунного ответа. Поэтому любая молекула настоящего изобретения может применяться в качестве медикамента или при изготовлении медикамента. Молекула может быть использована сама по себе или в комбинации с другой(ими) молекулой(ами) по изобретению или известной(ыми) молекулой(ами).
Предпочтительно, если медикамент настоящего изобретения является вакциной. Она может вводиться непосредственно пациенту, в пораженный орган или систематично 1.б., 1.т., к.с, ί.ρ. и ί.ν. или вноситься ех νί\Ό в клетки, полученные от пациента, или в человеческую клеточную линию, которые затем могут вводиться пациенту или использоваться ш νίΙΐΌ для селекции субпопуляции из иммунных клеток, полученных от пациента, которые после этого вновь вводятся пациенту. Если нуклеиновая кислота введена в клетки ш νί!ΐΌ, то может быть полезно, чтобы клетки были трансфецированными, чтобы коэкспрессировать иммуностимулирующие цитокины, такие как интерлейкин-2. Пептид может быть, по существу, чистым или комбинированным с иммуностимулирующим адъювантом (см. ниже) или использоваться в комбинации с иммуностимулирующими цитокинами или вводиться с подходящей системой доставки, например, липосомами. Пептид может быть также конъюгирован с подходящим носителем, таким как гемоцианин лимфы улитки (КЬН) или маннан (см. \УО 95/18145 и Ьопдепескег е! а1 (1993)). Пептид может быть также меченым или может быть белком слияния или гибридной молекулой. Пептиды, последовательность которых дана в настоящем изобретении, как ожидается, стимулируют Т-клетки СЭ4 или СЭ8. Тем не менее стимуляция СЭ8 ЦТЛ более эффективна в присутствии помощи, производимой СЭ4 хелперными Т-клетками. Таким образом, для эпитопов МНС I класса, которые стимулируют СЭ8 ЦТЛ, партнеры слияния или секции гибридной молекулы адекватно обеспечивают эпитопы, которые стимулируют СИ4-положительные Т-клетки. СЭ4- и СИ8-стимулирующие эпитопы хорошо известны из уровня техники и включают те, что были идентифицированы в настоящем изобретении.
В одном аспекте вакцина включает по крайней мере один пептид, имеющий аминокислотную последовательность, предложенную в 8ЕЦ ГО № 1, 2 и 20, и по крайней мере один дополнительный пептид, предпочтительно от двух до 50, более предпочтительно от двух до 25, еще более предпочтительно от двух до 15 и наиболее предпочтительно два, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять, десять, одиннадцать, двенадцать или тринадцать пептидов. Пептид(ы) может(могут) быть образован(ы) из одного или более специфических ТАА и может(могут) связываться с молекулами МНС класса I и/или класса II.
Полинуклеотид может быть, по существу, чистым или содержаться в подходящем векторе или системе доставки. Нуклеиновая кислота может быть ДНК, кДНК, ПНК, ЦНК (циклогексанилнуклеиновая кислота), РНК или их комбинацией. Методы конструирования и введения такой нуклеиновой кислоты хорошо известны из уровня техники. Обзор представлен, к примеру, в работах Раксо1о 8. 2006; 8!ап К. 2006, или А МаЬбау1 2006. Полинуклеотидные вакцины легки в приготовлении, однако способ действия этих векторов по индуцированию иммунного ответа понят не полностью. Подходящие векторы и системы доставки включают вирусные ДНК и/или РНК, такие как системы, которые основаны на аденовирусе,
- 43 023013 вирусе осповакцины, ретровирусах, вирусе герпеса, аденоассоциированном вирусе или гибридах, содержащих элементы более чем одного вируса. Невирусные системы доставки включают катионные липиды и катионные полимеры и хорошо известны из уровня техники в области доставки ДНК. Также может быть использована физическая доставка, такая как посредством ген-пистолета. Пептид или пептиды, закодированные нуклеиновой кислотой, могут быть белком слияния, например, с эпитопом, который стимулирует Т-клетки для соответствующего противоположного гипервариабельного участка (СОК), как описывается выше.
Медикамент по изобретению может также включать один или более адъювант. Адъюванты - это вещества, которые неспецифически усиливают или потенцируют иммунный ответ (например, иммунные ответы, опосредованные ЦТЛ или хелперными Т-клетками (ТН) на антиген, и могут, таким образом, рассматриваться как полезные в медикаменте настоящего изобретения. Подходящие адъюванты включают, но не ограничиваются, 1018 Ι88, соли алюминия, Атркуах, А815, ВСО, СР-870,893, СрО7909, СуаА, б8Ь1М, флагеллин или лиганды ТЬК5, полученные из флагеллина, лиганд РЬТ3, ГМ-КСФ, 1С30, 1С31, Имиквимод (АЕНАКА), резимиквимод, 1тиРас! 1МР321, интерлейкины, такие как 1Ь-2, 1Ь-13, 1Ь-21, интерферон-альфа или бета или их пегилированные производные, Ι8 Ра!ск, Ι88, 18СОМАТК1Х, 18СОМк, 1иу1ттипе, Ыро Уас, МАЬР2, МР59, монофосфорил липид А, Монтанид 1М8 1312, Монтанид 18А 206, Монтанид 18А 50У, Монтанид 18А-51, эмульсии вода в масле и масло в воде, ОК-432, ОМ-174, ОМ197-МР-ЕС, ОЭТАК, ОкрА, векторная система РерТе1®, микрочастицы РЬО и декстрана, резиквимод, 8КЬ172, вирусомы и другие вирусоподобные частицы, ΎΕ-17Ό, УЕОР !гар, К848, Бета-глюкан, Рат3Сук, стимулон Ациба Ц821, который получают из сапонина, микобактериальные экстракты и синтетические имитации бактериальных клеточных стенок и другие запатентованные адъюванты, такие как КтЬГк ЭеЮх, Циб или Зиребок. Предпочтительными адъювантами являются такие как адъювант Фрейнда или ГМКСФ. Несколько иммунологических адъювантов (например, МР59), специфических для дендритных клеток, и их приготовление были описаны ранее (Ниршк М. е! а1 1998; АШкоп 1998). Также могут использоваться цитокины. Несколько цитокинов были присоединены напрямую для оказания влияния на миграцию дендритных клеток к лимфоидным тканям (например, ТОТ^а), ускоряя созревание дендритных клеток до эффективных, презентирующих антиген Т-лимфоцитам, клеток (например, ГМ-КСФ, ИЛ-1 и ИЛ4) (патент США № 5849589, специфически включенный сюда в его целостности путем ссылки) и действуя как иммуноадъюванты (например, ИЛ-12, ИЛ-15, ИЛ-23, ИЛ-7, 1РУ-альфа, ^Ν-бета) (ОаЬтбоуюб е! а1 1996).
Об иммуностимулирующих олигонуклеотидах СрО также сообщалось, что они усиливают эффекты адъювантов в составе вакцин. Теоретически не связанные, СрО-олигонуклеотиды при активации врождённой (неадаптивной) иммунной системы действуют с помощью То11-подобных рецепторов (ТЬК), в основном ТЬК9. Вызванная СрО активация ТЬК9 усиливает антиген-специфические гуморальные и клеточные ответы на широкий спектр антигенов, включая пептидные или белковые антигены, живые или убитые вирусы, вакцины из дендритных клеток, аутологичные клеточные вакцины и полисахаридные конъюгаты как в профилактических, так и терапевтических вакцинах. Более важно то, что улучшается созревание и дифференциация дендритных клеток, приводя к улучшенной активации ТН1-клеток и интенсивной генерации цитотоксических Т-лимфоцитов (ЦТЛ) даже при отсутствии помощи СН4 Тклеток. Отклонение в сторону ТН1, вызванное стимуляцией ТЬК9, сохраняется даже в присутствии вакцинных адъювантов, таких как квасцы или неполный адъювант Фрейнда (1РА), который обычно способствует отклонению в сторону ТН2. СрО-олигонуклеотиды проявляют даже большую адъювантную активность, если они входят в состав или вводятся вместе с другими адъювантами или в таких составах как микрочастицы, наночастицы, липидные эмульсии или подобных составах, которые в особенности необходимы для инициации сильного ответа, если антиген относительно слаб. Они также ускоряют иммунную реакцию и позволяют снизить дозы антигена на приблизительно два порядка величины с ответами антитела, сравнимыми с полной дозой вакцины без СрО в некоторых экспериментах (Кпед е! а1 2006). В патенте США № 6406705 В1 описывается комбинированное применение СрО-олигонуклеотидов, адъювантов, не включающих нуклеиновые кислоты, и антигена для вызывания антиген-специфического иммунного ответа. Антагонистом СрО ТЬК9 является бЗЫМ (контурный иммуномодулятор двойного действия) компании Мо1одеп (Берлин, Германия), который является предпочтительным компонентом фармацевтической композиции настоящего изобретения. Также могут быть использованы другие молекулы, связывающиеся с ТЬК, такие как РНК, связывающаяся с ТЬК 7, ТЬК 8 и/или ТЬК 9.
Другие примеры полезных адъювантов включают, но не ограничиваются химически модифицированными СрО (например, СрК, 1бега), аналогами бкРНК, такими как Ро1у(1:С) и АтрбОеп, не-СрО бактериальной ДНК или РНК, а также иммуноактивными малыми молекулами и антителами, такими как циклофосфамид, сунитиниб, бевацизумаб, целебрекс, ΝΟΧ-4016, силденафил, тадалафил, варденафил, сорафениб, темозоломид, темсиролимус, ХЬ-999, СР-547632, пазопаниб, УЕОР Тгар, ΖΌ2171, АΖ^2171, анти-СТЬА4 и 8С58175, которые могут действовать терапевтически и/или как адъювант. Количества и концентрации адъювантов и вспомогательных веществ, полезных в контексте настоящего изобретения, могут быть легко определены опытным специалистом без проведения излишних экспериментов. Предпочтительными адъювантами являются бЗЫМ, интерферон-альфа, -бета, СрО7909, 1С31, имиквимод,
- 44 023013 резиквимод, РеуПег, КИА, тадалафил, темозоломид и ЛпИптипе.
Предпочтительными адъювантами являются й8ЫМ, БЦЖ, ОК432, имиквимод, резиквимод, ГМКСФ, интерферон-альфа, РеуаТег и 1иу1ттипе или их комбинации.
В предпочтительном воплощении фармацевтической композиции в соответствии с изобретением адъювант выбран из группы, состоящей из колониестимулирующих факторов, таких как гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (ГМ-КСФ, сарграмостим), имиквимод, резиквимод и интерферон-альфа. В другом дальнейшем предпочтительном воплощении фармацевтической композиции в соответствии с изобретением адъювантом является имиквимод и резиквимод.
В еще более предпочтительном воплощении фармацевтической композиции в соответствии с изобретением адъювантом является комбинация из ГМ-КСФ и имиквимода.
Эта композиция используется для парентерального введения, такого как подкожное, внутрикожное, внутримышечное или оральное введение. Для этого пептиды и факультативно другие молекулы растворяются или суспендируются в фармацевтически приемлемом, предпочтительно водном носителе. Помимо этого, композиция может содержать наполнители, такие как буферы, связующие агенты, разрушающие агенты, разбавители, вкусоароматические добавки, смазочные вещества и т.д. Пептиды могут быть также введены вместе с иммуностимулирующими веществами, такими как цитокины. Пространный список наполнителей, которые могут быть использованы в такой композиции, может быть взят, например, из А. КзЬЬе, НапйЬоок оГ РКагтасеиБса1 Ехс1р1еп1к, 3. Ей., 2000, изд. Атепсап РКагтасеийса1 Аккоиайоп апй рКагтасеийса1 ргекк. Композиция может использоваться для предупреждения, профилактики и/или лечения аденоматозных или раковых заболеваний.
Настоящее изобретение обеспечивает медикамент, который полезен для лечения рака, в частности глиомы и рака головного мозга, рака груди, рака предстательной железы, рака пищевода, колоректального рака, рака почек, рака поджелудочной железы, плоскоклеточной карциномы и новообразований кожи с участием кератиноцитов, лейкемии, рака легких, рака яичника и меланомы.
Настоящее изобретение включает вспомогательное оборудование, включающее:
(a) контейнер, который содержит фармацевтическую композицию, как описанная выше, в виде раствора или в лиофилизованной форме;
(b) опционально - второй контейнер, содержащий разбавитель или восстанавливающий раствор для лиофилизованного состава; и (c) опционально - инструкции по (ί) использованию раствора или (ίί) восстановленного раствора и/или по использованию лиофилизованного состава.
В дальнейшем оборудование может включать один или более (ίίί) буфер, (ίν) разбавитель, (ν) фильтр, (νί) иглу или (νίί) шприц. Контейнер является, предпочтительно, флаконом, ампулой, шприцем или пробиркой; и он также может быть контейнером многоразового использования. Фармацевтическая композиция предпочтительно лиофилизована.
Вспомогательное оборудование настоящего изобретения предпочтительно включает лиофилизованный состав настоящего изобретения в подходящем контейнере и инструкции для ее восстановления и/или по ее применению. Подходящие контейнеры включают, например, флаконы, ампулы (например, двухкамерные ампулы), шприцы (такие как двухкамерные шприцы) и пробирки. Контейнер может быть сделан из разнообразных материалов, таких как стекло или пластик. Предпочтительно вспомогательное оборудование и/или контейнер содержат(ит) инструкции для или связанные с контейнером, которые дают указания для восстановления и/или использования. Например, на этикетке может быть указано, что лиофилизованный состав должен быть восстановлен до таких пептидных концентраций, как те, что описаны выше. На этикетке в дальнейшем может быть указано, что состав применяется или предназначается для подкожного введения.
Контейнер с составом может быть ампулой многоразового использования, которая позволяет повторное введение (например, от 2-6 введений) восстановленного состава. Вспомогательное оборудование может включать в дальнейшем второй контейнер, включающий подходящий разбавитель (например, раствор бикарбоната натрия).
При смешивании разбавителя и лиофилизованного состава окончательная концентрация пептида в восстановленном составе составляет предпочтительно по крайней мере 0,15 мг/мл/пептид (=75 мкг) и предпочтительно не более чем 3 мг/мл/пептид (=1500 мкг). Вспомогательное оборудование может в дальнейшем включать другие материалы, желательные с коммерческой и с точки зрения пользователя, включая другие буферы, разбавители, фильтры, иглы, шприцы и упаковочные вкладыши с инструкциями по применению.
Вспомогательное оборудование настоящего изобретения может иметь один контейнер, который содержит состав фармацевтических композиций в соответствии с настоящим изобретением с или без других компонентов (например, других соединений или фармацевтических композиций этих других соединений) или может иметь отдельные контейнеры для каждого компонента.
Вспомогательное оборудование по изобретению предпочтительно включает состав по изобретению, укомплектованный для применения в комбинации с ко-введением второго соединения (такого как адъюванты (например, ГМ-КСФ), химиотерапевтического средства, натурального продукта, гормона или ан- 45 023013 тагониста, средства против ангиогенеза или ингибитора; апоптоз-индуцирующего средства или хелатора) или их фармацевтической композиции. Компоненты вспомогательного оборудования до введения пациенту могут предварительно быть организованы в комплекс, или же каждый компонент может находиться в отдельном отличном контейнере. Компоненты вспомогательного оборудования могут обеспечиваться одним или несколькими жидкостными растворами, предпочтительно, водным раствором, более предпочтительно, стерильным водным раствором. Компоненты вспомогательного оборудования могут также обеспечиваться твердой формой, которая может быть превращена в жидкости при добавлении подходящих растворителей, которые, предпочтительным образом, предоставляются в другом, отличном, контейнере.
Контейнер терапевтического оборудования может быть ампулой, пробиркой, колбой, флаконом, шприцем или любыми другими средствами, заключающими в себе твердое вещество или жидкость. Обычно, если имеются более одного компонента, оборудование содержит вторую ампулу или другой контейнер, который позволяет отдельную дозировку. Оборудование может также содержать другой контейнер для фармацевтически приемлемой жидкости. Терапевтическое оборудование будет предпочтительно содержать приспособление (например, одну или более иглу, шприцы, пипетки для глаз, пипетки и т.д.), которое позволяет введение веществ по изобретению, которые являются компонентами настоящего оборудования.
Настоящий состав подходит для введения пептидов любым приемлемым способом, таким как оральный (энтеральный), назальный, офтальный, подкожный, внутрикожный, внутримышечный, внутривенный или трансдермальный. Предпочтительно, чтобы введение было к.с и наиболее предпочтительно ί.ά. Введение может производиться инфузионным насосом.
Так как пептиды по изобретению, полученные из ВСА, СЫР2, ЭТНА, ΝΣΟΝΑΧ, ΝΚ.2Ε1, ΝΚ<.ΆΜ и ΡΌΡΝ, были изолированы из глиобластомы, медикамент по изобретению предпочтительно используется для лечения глиобластомы.
Теперь настоящее изобретение будет описано с помощью последующих примеров и фигур, которые описывают его предпочтительные воплощения, тем не менее, не ограничивая ими изобретение. В соответствии с целями настоящего изобретения все цитаты описания включены в их целостности путем ссылки.
Фиг. 1 - отдельный масс-спектр из ЮР2ВР3-001, демонстрирующий его презентацию на пробе первичной опухоли ОВ6010. Нано-масс-спектрометрический анализ с ЕМ-жидкостной хроматографией (NаηοΕ§I-^СΜ§) производили на пептидном пуле, элюированном из пробы глиобластомы ОВ6010. Масс-хроматограмма для т/ζ 536,3238 ± 0,001 Да, ζ = 2 Да показывает пик пептида со временем удерживания 49,89 мин. В) Обнаруженный пик в масс-хроматограмме при 48,76 мин обнаружен сигналом т/ζ 536,3239 в масс-спектре. С) Индуцированный столкновением масс-спектр затухания из выбранного предшественника т/ζ 536,3239, записанный при эксперименте ηаηοΕ§I-^СΜ§ при заданном времени удерживания, подтвердил присутствие ЮР2ВР3-001 в опухолевой пробе ОВ6010. Ό) Фрагментационный паттерн синтетического контрольного пептида ЮР2ВР3-001 был записан и сравнен с генерированными образцами фрагментации естественных пептидов ТИМАР, представленными в С для верификации последовательности;
на фиг. 2 показаны экспрессионные профили мРНК выбранных белков в нормальных тканях и 19 пробах глиобластомы. На фиг. 2Ь показаны экспрессионные профили мРНК выбранных белков в нормальных тканях и 19 пробах глиобластомы;
на фиг. 3 - отдельный пример иммуногенности ίη νίίτο ГМА950 класса I пептидов ТИМАР;
на фиг. 4 - отдельные примеры аффинности связывания пептидов НЬА класса I по изобретению с
А*02. §ЕЦ ГО № 1 по 24 демонстрируют последовательности предпочтительных опухолеассоциированных пептидов в соответствии с настоящим изобретением.
Примеры
Пептиды РТЕЬТЬОЕР (НЬА-А1; Ρο1уΡеρί^бе ^аЬο^а!ο^^е8, ^ο1ίεώϋ!^1, Германия), ЬМРОЕРРКЬ (НЬА-А2; СНтПГа, §188асЬ, Швейцария) и ЕРБЬАОСРУ (НЬА-В35; Ρο1уΡеρί^бе ^аЬο^а!ο^^е8) были получены с фармацевтическим качеством.
Пример 1. Идентификация опухолеассоциированных пептидов, презентируемых на поверхности клетки.
Пробы тканей.
Опухолевые ткани пациентов были предоставлены клиниками НорПа1 Саη!οиа1 ишуегеПапе бе Оеηеνе, г. Женева (Меб1са1 Οη:ο1ο8\· ^аЬο^а!ο^у οί Тиц-юг Iттиηο1ο§у) и ИенгосЫгигдЕсНе ишуегкПаЮКЛтк г. Гейдельберг, Германия (молекулярно-биологическая лаборатория). Перед проведением хирургического вмешательства было получено информированное согласие всех пациентов в письменной форме. Сразу же после операции ткани были подвергнуты шоковому замораживанию в жидком азоте и хранились до изоляции пептидов ТИМАР при -80°С.
Изоляция пептидов НЬА из проб тканей.
Пептидные пулы НЬА из подвергнутых шоковой заморозке проб тканей были получены методом иммунопреципитации из плотных тканей в соответствии с незначительно измененным протоколом (Ра1к
- 46 023013
К. е( а1 1991; Зеедег Р.Н. е( а1. Т 1999) при использовании НЬА-А*02-специфического антитела ВВ7.2 или НЬА-А, -В, -С-специфического антитела ν6/32, СХВг-активированной сефарозы, кислотной обработки и ультрафильтрации.
Методы.
Полученные пулы пептидов НЬА были разделены в соответствии с их гидрофобностью обратнофазной хроматографией (Асцийу ИРЬС 8у8(ет, ХУаЮгЦ и элюированные пептиды анализировали на гибридном масс-спектрометре ЬТД-ОгЬйгар (ТНегтоЕ1ес!гоп), снабженном источником Е8Г. Пулы пептидов наносили непосредственно на аналитическую микрокапиллярную колонку из плавленого кварца (75 мкм ί.ά. х 250 мм) с обратнофазным материалом 1,7 мкм С18 (\Уа(ег5) с применением скорости потока в 400 нл/мин. Затем пептиды разделяли с использованием двухэтапного 180-минутного двойного градиента от 10 до 33% В при скорости потока в 300 нл/мин. Градиент был составлен из растворителя А (0,1% муравьиной кислоты в воде) и растворителя В (0,1% муравьиной кислоты в ацетонитриле). Позолоченный стеклянный капилляр (Р1соТ1р, №\ν ОЬ]есНуе) использовали для введения в источник микро-Е81. Массспектрометр ЬТО-ОгЬНгар работал в зависимом от данных режиме с применением стратегии ТОР5. Вкратце, цикл сканирования начинался с полного сканирования с высокой точностью масс на спектрометре ОгЬйгар (К = 30000), за чем следовало сканирование М8/М8 на ОгЬйгар (К = 7500) на 5 особенно многочисленных ионах-предшественниках с динамическим исключением отобранных ранее ионов. Тандемные масс-спектры интерпретировали на ЗЕДИЕЗТ с дополнительным ручным управлением. Идентифицированную последовательность пептида подтверждали сравнением генерированного фрагментационного образца естественного пептида с фрагментационным образцом синтетического контрольного пептида с идентичной последовательностью. На фиг. 1 представлен отдельный спектр, полученный из опухолевой ткани для пептида ЮР2ВР3-001, ассоциированного с МНС класса I, и его профиля элюции на системе ИРЬС.
Пример 2. Определение профиля экспрессии генов, кодирующих пептиды по изобретению.
Не все пептиды, идентифицированные как презентируемые на поверхности опухолевых клеток молекулами МНС, подходят для иммунотерапии, потому что большинство этих пептидов образованы из нормальных клеточных белков, экспрессируемых многими видами клеток. Только немногие из этих пептидов являются опухолеассоциированными и, скорее всего, способны индуцировать Т-клетки с высокой специфичностью распознавания опухоли, из которой они были образованы. В целях идентификации таких пептидов и минимизации риска аутоиммунности, вызванной при вакцинации, изобретатели фокусировали свое внимание на тех пептидах, которые образованы из белков, гиперэкспрессированных на опухолевых клетках в сравнении с большинством нормальных тканей.
Идеальный пептид будет образован из белка, являющимся уникальным для опухоли и не присутствующим ни в одной другой ткани. Для идентификации пептидов, которые образованы из генов с профилем экспрессии, похожим на идеальный, идентифицированные пептиды соотносили с белками и генами, из которых они были образованы и генерировали экспрессионные профили этих генов.
Источники РНК и приготовление.
Хирургически удаленные тканевые препараты были предоставлены двумя различными клиническими центрами (см. табл. 1) после получения формы информированного согласия от каждого пациента. Препараты опухолевой ткани были мгновенно заморожены в жидком азоте после операции и впоследствии гомогенизированы с помощью ступки и пестика в жидком азоте. Суммарная РНК была приготовлена из данных проб с использованием ТКШо1 (ШуНгодец Каг18гиНе, Германия) с последующей очисткой на К№азу (ДГАОЕЦ ННбеп, Германия); оба метода осуществлялись в соответствии с указаниями производителей.
Суммарная РНК здоровых человеческих тканей была куплена (АтЫоп, НипНпдбоп, Великобритания; С1оп(есН Не1бе1Ьегд, Германия; ЗНйадепе, Атйегбат, Нидерланды; ВюСНат, Нау^агб, СА, США). РНК нескольких индивидов (от 2 до 123 индивидов) была смешана таким образом, что РНК каждого индивида имела равный вес. Лейкоциты были изолированы из проб крови 4 здоровых добровольцев.
Качество и количество проб суммарной РНК было подтверждено на биоанализаторе АдПеп! 2100 (АдЛепр \Уа1бЬгопц Германия) с использованием лабораторного оборудования ^А 6000 Р1со ЬаЬСЫр Κίί (АдПей).
Эксперименты с микрочипами.
Анализ экспрессии генов всех проб РНК из опухолевой и нормальной ткани был произведен с помощью олигонуклеотидных микрочипов А££уте1г1х Нитап Оепоте (НО) И133А или НО-И133 Р1и8 2.0 (АРЕутеНгх, 8ап1а С1ага, СА, США). Все этапы были выполнены в соответствии с руководством Айуте(п.х. Вкратце, двухнитевую кДНК синтезировали из 5-8 мкг суммарной РНК с использованием Зирегзспр( КТ11 (ШуНгодеп) и олиго-бТ-Т7 праймера (М^О Вю(есН ЕЬегзЬегд, Германия), как описывается в руководстве. Транскрипцию ш νίίΐΌ производили на ВюАггау ШдН У1е1б КNА Тгапзспр! ЬаЬеШпд Κίί О7О П1адпо8Йс8, 1пс., Рагттд6а1е, ΝΥ, США) Гог (Не И133А аггауз ог ^НН (Не ОепеСЫр ГУТ ЬаЬеШпд Κίί для микрочипов И133 Р1и8 2.0 с последующей фрагментацией, гибридизацией кРНК и окрашиванием стрептавидин-фикоэритрином и биотинилированным антистрептавидиновым антителом (Мо1еси1аг РгоЬез, ЬеЫец Нидерланды). Изображения сканировали на АдНеп! 2500А ОепеАггау Зсаппег
- 47 023013 (И133Л) или АГГуте1п\ Оепе-СЫр 8саппег 3000 (И133 Р1ик 2.0), а данные анализировали в программе ОСО8 (АйутеИтх) с использованием настроек по умолчанию для всех параметров. Для упорядочивания использовались 100 генов домашнего хозяйства, предоставленных АйутеИтх. Относительные значения экспрессии были подсчитаны с показаний сигнальной программы, а значение пробы нормальной почки было произвольно задано значением 1,0.
Профили экспрессии исходных генов по настоящему изобретению, которые в высокой степени гиперэкспрессированы в глиобластоме по настоящему изобретению, представлены на фиг. 2.
Пример 3. Иммуногенность ίη νίΐτο для пептидов ΙΜΑ950, презентируемых МНС I класса.
Для получения информации об иммуногенности пептидов ТИМАР по настоящему изобретению нами были проведены исследования с использованием хорошо известных методов стимуляции, уже описанных в работах (ХУаИег 8., Неггдеп Ь., 8сИоог О., ίικίβ О., ХУегпе! И., ВиИттд Н.Т, Каттепкее Н.О., апб 8ΐеνаηον^с 8.; 2003, СиШпд ебде: ргебеЮгттеб аν^б^ΐу оГ Иитап СИ8 Т се11к е\рапбеб оп саПЬгаЮб МНС.’/ап0-С.’О28-соа1еб тютокрИетек, ί. 1ттипо1., 171, 4974-4978). Таким способом мы могли показать достаточно высокую иммуногенность для 13 рестриктированных по НЬА-А*0201 ТИМАР-пептидов по изобретению (у >= 50 % проверенных доноров могли быть обнаружены ТИМАР-специфические ЦТЛ), демонстрируя, что эти пептиды являются Т-клеточными эпитопами, против которых у человека существуют СИ8+ Т-клетки-предшественники (табл. 3).
Прайминг ш νίϋΌ СИ8+ Т-клеток.
Для проведения стимуляций ш уПго искусственных антигенпрезентирующих клеток (аАРС), нагруженных комплексом пептид-МНС (рМНС) и антителом анти-СИ28, мы сначала изолировали МПК (моноциты периферической крови) из свежей лейкоцитарной пленки НЬА-А*02+ с использованием стандартной среды для градиентного разделения (РАА, Сб1Ие, Германия). Лейкоцитарные пленки были получены либо из банка крови г. Тюбинген, либо из госпиталя КаЛаттепИокрИаТ г. Штутгарта. Изолированные МПК инкубировали в течение ночи для прайминга человеческого материала ш уйго в Тклеточной среде (ТСМ), состоящей из КРМ1-О1Шатах (ЕпуПгодеп. Каг1кгиИе, Германия) с добавлением 10% инактивированной нагреванием человеческой сыворотки АВ (РАА, Сб1Ие, Германия), 100 и/мл пенициллина /100 мкг/мл стрептомицина (СатИгех, УеМетк, Бельгия), 1 мМ пирувата натрия (СС Рго, Иеийабб Германия) и 20 мкг/мл гентамицина (СатИгех). Лимфоциты СИ8+ были изолированы с использованием СИ8+ МАС8-оборудования для положительного отбора (МШепуг Вет§1ксИ О1абИасИ, Германия) в соответствии с указаниями производителя. Полученные СИ8+ Т-клетки инкубировали до использования в ТСМ с добавлением 2,5 нг/мл ИЛ-7 (РготоСе11, Не1бе1Иет§, Германия) и 10 и/мл ИЛ-2 (СЫтоп, МишсИ, Германия). Получение покрытых гранул рМНС/анти-СИ28, Т-клеточные стимуляции и считывание производили, как описывалось ранее (ХУаНег еΐ а1., 2003), с минимальными модификациями. Вкратце, биотинилированные рекомбинантные молекулы НЬА-А*0201, в которых не хватает трансмембранного домена, и которые были биотинилированы на карбоксильном конце тяжелой цепи, были получены в соответствии с методом, описанным в работе (АНтап еΐ а1., 1996). Очищенный ко-стимулированный мышиный 1дО2а к антителам человека СИ28 АВ 9,3 (1ип§ еΐ а1., 1987) был химически биотинилирован с использованием сульфо-И-гидроксисукцинимидобиотина, как рекомендуется изготовителем (РегИю, Вопп, Германия). Использованные гранулы были покрытыми стрептавидином полистироловыми частицами величиной 5,60 мкм (Вапдк ЬаИогаЫпек, 1Шпо1к/США). рМНС, использованные в качестве положительных и отрицательных контролей, были А*0201/МЬА-001 (пептид ЕЬАОЮГОТУ из модифицированного Ме1апА/МАКТ-1) и А*0201/ИИХ5-001 (УЬЬРА1УН1 из ΌΌΧ5) или А*0201/НВУ-001 (РЬР8ИРРР8У) соответственно.
800000 гранул/200 мкл были покрыты в 96-луночном планшете в присутствии 600 нг биотина антиСИ28 и 200 нг релевантного биотин-рМНС (высокоплотные гранулы) или 2 нг релевантного и 200 нг нерелевантного (библиотека рМНС) МНС (низкоплотные гранулы). Стимуляции были инициированы в 96-луночных планшетах при ко-инкубации 1x106 СИ8+ Т-клеток с 2x105 промытых покрытых гранул в 200 мкл ТСМ с добавлением 5 нг/мл ИЛ-12 (РготоСе11) в течение 3-4 дней при 37°С. Половина среды была заменена на свежую ТСМ с добавлением 80 и/мл ИЛ-2, и инкубация была продолжена в течение 34 дней при 37°С. Данный цикл стимуляций производили в общей сложности три раза. В заключение проводили тетрамерные анализы с флуоресцирующими тетрамерами МНС (полученными, как описывается в работе (АНЫап еΐ а1., 1996)) с антителом СИ8-Р1ТС клона 8К1 (ВИ, Не1бе1Иет§, Германия) на четырехцветном цитометре РАС8СаИИит (ВИ). Пептид-специфические клетки были подсчитаны как процентная доля всех СИ8+ Т-клеток. Оценку тетрамерного анализа проводили с помощью программы РС8 Ехргекк (Ие Иото 8оП\\аге). Прайминг ш уйго специфических лимфоцитов тетрамер+ СИ8+ детектировался установкой подходящего гейта и при сравнении с негативными контрольными стимуляциями. Иммуногенность для заданного антигена была детектирована, если было обнаружено, что по крайней мере в одной подлежащей оценке простимулированной ш уйго лунке одного здорового донора содержалась специфическая СИ8+ Т-клеточная линия после стимуляции ш уйго (т.е. данная лунка содержала по крайней мере 1% специфического тетрамера+ среди СИ8+ Т-клеток и процентная доля специфических клеток тетрамера+ была по крайней мере в 10 раз выше среднего значения стимуляций с негативным контролем).
- 48 023013
Иммуногенность ш уйго для пептидов ГМА950.
Для проанализированных пептидов НЬА I класса, иммуногенность ш уйго могла быть продемонстрирована генерированием пептид-специфических Т-клеточных линий. Отдельные результаты цитометрического анализа после ТИМАР-специфического тетрамерного окрашивания для двух пептидов по изобретению показаны на фиг. 3. Результаты для 13 пептидов по изобретению обобщаются в табл. 3.
Таблица 3. Иммуногенность ш уйго высоко иммуногенных пептидов НЬА класса I по изобретению
Антиген Положительн. доноры / проанализированные доноры Положительн. лунки / проанализированные лунки
ВСА-001 60% 5%
ВСА-002 75% 35%
СЫР2-001 75% 6%
С8Р-001 100% 57%
РАВР7-001 100% 27%
1СР2ВРЗ-001 50% 21%
ΝΕ5-001 75% 38%
ΝίΟΝ4Χ-001 100% 62%
ЫЯСАМ-001 86% 39%
ΡϋΡΝ-001 60% 11%
8Ш01С1-001 60% 7%
ΤΝΟ-ΟΟΙ 60% 30%
ТЫС-002 50% 14%
В дополнение к этим результатам, полученным от здоровых доноров, пептиды ВСА-002, СН!301001 и ΝΡΟΝ4Χ-001 были также протестированы на небольшом количестве пациентов с глиобластомой. Все пептиды были подтверждены в качестве иммуногенных в равной степени по сравнению со здоровыми донорами, демонстрируя существование предшественников Т-клеток в соответствующей целевой популяции для вакцины.
Пример 4. Связывание пептидов по изобретению, рестриктированных по НЬА класса I, с НЬА-А*0201.
Цели и итоги.
Целью данного анализа была оценка аффинности пептидов НЬА класса I по отношению к молекуле МНС, закодированной аллелем НЬА-А*0201, так как это является важным параметром для способа действия пептидов, выступающих как часть иммунотерапии раковых заболеваний. Аффинности к НЬАА*0201 были от средних до высоких для всех протестированных, рестриктированных по НЬА класса I пептидов 0 по изобретению с константами диссоциации, находящимися в диапазоне пептида положительного контроля НВУ-001, известного своей связывающей силой для А*02, образованного из корового антигена вируса гепатита В. Данные результаты подтверждают сильную аффинность связывания всех протестированных пептидов НЬА класса I по настоящему изобретению.
Принципы теста.
Стабильные комплексы НЬА/пептид состоят из трех молекул: тяжелой цепи НЬА, бета-2 микроглобулина (Ъ2т) и пептидного лиганда. Активность денатурированных рекомбинантных молекул НЬАА*0201 с тяжелой цепью сама по себе может быть сохранена, делая их функциональными эквивалентами пустых молекул НЬА-А*0201. Если они растворены в водном буфере, содержащем Ъ2т и подходящий пептид, то данные молекулы быстро и эффективно сворачиваются в полной зависимости от пептида. Наличие данных молекул использовалось в анализе, основанном на методике ЕЫЗА, для измерения аффинности взаимодействия между пептидом и молекулой НЬА класса I (3уКек!ег-Ну1Д е! а1., 2002).
Очищенные рекомбинантные молекулы НЬА-А*0201 инкубировали вместе с Ъ2т и ступенчатыми дозами интересующего пептида. Количество новообразовавшихся комплексов НЬА/пептид определялось количественным методом ЕЫЗА. Константы диссоциации (значения КО) вычисляли с использованием стандартной калибровочной кривой, записанной с титров комплекса калибровки НЬА/пептид.
Результаты.
Результаты представлены на фиг. 4. Более низкое значение КО отражает более высокую аффинность к НЬА-А*0201. Все протестированные пептиды по изобретению имели сильную аффинность связывания по отношению к НЬА-А*0201 в пределах КО для пептида положительного контроля НВУ-001, имеющего, как известно, высокую силу связывания с А*02. Таким образом, все пептиды ТИМАР I класса по изобретению имеют сильную аффинность связывания по отношению к молекуле МНС А*02.
- 49 023013
Список использованной литературы
АЬои( I, Ьаигет-Мацит Ό, ЬепбаЫ и, Мкз1аб15 ТА (2000). ΝεκΙίη ехргеззюп ίη етЪгуотс апб абиН Нитап (ее(Н ипбег погта! апб ра(Но1одюа! сопбкюпз. Ат 1 Ра(Нок157,287-295.
АдН) М, Оау!ат Р, Непзоп IV/, Ва(сНе1ог ТТ, Ьошз ΌΝ, Вагкег РС (2005). Мадпебс гезопапсе 1тадтд сЬагас(ебзбсз ргебю( ер1бегта! дгоМН Гас1ог гесер(ог атрНЛсабоп з(а(из ϊη дНоЫазЮта. СПп Сапсег Кез. 11, 8600-8605.
Адозб КМ, Ьеи(Но1б М, ОиПюк ТО, УазагдП МО, ТО езбег СЮ (1992). Ехргеззюп оГ (Не ер]бегта1 дгоудН Гасюг гесерЮг ίη азбосубс (итоигз Ϊ3 зрес1Йса11у аззос1а(еб ννίΐΗ дНоЫазЮта тикДогте. УбсНолъ АгсЬ. А Рабток Апак РПзЮрабюк 420, 321-325.
ΑΙ-Ιοικϋ РЗ,1зкапбаг ΖΑ, 1тгап АК (2007). διιτνίνίη ехргеззюп согге!а(ез ννϊΐΗ ипГа»оигаЫе ргодпозез ίη ίηνββΐνβ бис(а1 сагстота оГ (Не Ьгеазк Меб 1 Ма1ауз1а 62, 6-8.
АМЧебаТО К, МееНап В, МюэНеО, ЬНо(ак V, Мау Ь, ОиНа А, Как 1 (2008). 1п(егсе11и1аг (гапзГег оГ (Не опсодетс гесер(ог ΕΟΡΚνΙΙΙ Ьу тюгоуезкбез бсгКеб Ггот (итоиг сеПз. Иа1. Се11 ΒίοΙ.
АНтап Л), Мозз РА, Оои1бег ΡΙ, ВагоисН ОН, Неугег-ТОЖатз МО, Век Л, МсМюНае! А1, ϋβνίβ ММ (1996). РНепо(урю апа1уз1з оГ апбдеп-зресДю Т 1утрЬосу(е5. 5с1епсе 274,94-96.
АтоЬ Υ, Уап§ М, Ы Ь, Кеупозо 3, Βουνβΐ М, Моозза АК, Ка(зиока К, НоГГтап КМ (2005). Иезбп-Ппкеб дгееп Яиогезсеп( рго(ет (гапздетс пибе тоизе Гог 1тадтд Нитап (итог апдю§епез15. Сапсег Кез. 65, 5352-5357.
Апдбеп РР, Адиеппоиг М, Сопб А, Ьа Τϋ, Сагбаб 8, Οηιρί К, ТотазеПо С, Оегспапо А, Ука О, ТотазеПо Р (2008). Ыис1еаг ГасЮг-карраВ асбуабоп апб ббГегепба! ехргеззюп оГ3ΐΐΓνίνίη апб Вс1-2 ίη Нитап дгабе 2-4 аз(госу(отаз. Сапсег.
Аррау V, 8ре1зег ϋΕ, КиГег Ν, Кеупагб 3, ВагЬеу С, Сегокбб 1С, Ьсууга/ 3, ΡΐηП1а С, Котего Р (2006). Оесгеазеб зресЖс СО8+ Т се11 сгозз-геасбуку оГапбдеп гесодтбоп ГоIIοινίη§ уасстабоп \νί(Η Ме1ап-А рерббе. Еиг. 11ттипо1. 36, 1805-1814,
Ато1б ЗЕ, Тпуапо^узЖ К) (1996). Нитап Ге(а> Ырросатра! беуе1ортеп(: II. ТНе пеигопа! су1озке1е(оп. 1 Сотр Иеигок 367,293-307.
ΑΚΟΝ3ΟΝ ЗМ, ΑΚΟΝ3ΟΝ ВЕ (1965). СЕИТКАЬ ТМЕКУОиЗ 3Υ8ΤΕΜ ΙΝ ΟΙΑΒΕΤΕ3 МЕШТиЗ: ЬОХУЕКЕО ΡΚΕΟΙΙΕΝΟΥ ОР СЕКТАПЧ ПЧТКАСКАЪПАЬ ИЕОРЬАЗМЗ.
АгсН. Меигок 12, 390-398.
АзНеиег Μ, ΒίβοΗε I, Ьаигепбеаи I, Мозег А, НаЫяие В, \ббаиб М, АиЬоигд Р (2005). Оесгеазеб ехргеззюп оГ АВСО4 апб ВО1 депез еаг!у ίη (Не ра(Ьодепез13 оГХ-Ппкеб абгепо!еикобуз(горНу. Нит. Мок ОепеГ. 14, 1293-1303.
- 50 023013
Акк1ипс1 Т, Арре1зко§ ΙΒ, АттегроЫ О, Екз1гот Τί, Αΐιυςνίδΐ РМ (2004). Ηίδίοηβ беасе1у1азе тЫЫ1ог 4-рЬепу 1Ьи1уга1е тоби1а1ез §0а1 ЯЪгШагу асЫю ρΐΌίβΐη апб соппехт 43 ехргеззюп, апд епЬапсез £ар-)ипс1юп соттишсайоп, ίη Ьитап ёНоЫазюта се11з. Еиг. ί Сапсег 40, 10731081.
Вагкег РО, 31ттопз МЬ, СЬап§ 8М, Ргабоз МБ, Ьагзоп БА, Зпееб РК, %'ага 9/М, Вегдег М3, СЬеп Р, 1згае1 МА, АЫаре КБ (2001). ЕОРК оуегехргеззюп апб гасНаНоп гезропзе ίη £1юЫазгота тиЫГогте. Ιηί. 1 КасЬак Опсо1 ΒίοΙ. РЬуз. 57,410-418.
Вег1е1 Ιί Е, Ке§оП Μ, Ροηζί Ь, ОссЫт К., Мапписа 8, Ειτηΐηί Ь, Τοίί Р (2007). Νεβΐίη ехргеззюп ίη абиИ апб άενείορΐηβ Ьитап кИпеу. I НьЮсЬет. Су1осЬет. 55,411-421.
В1цт К, 1асоЬ-Н|гзеЬ ί, КесЬаУ! С, К1оо§ Υ (2006). Зирргеззюп оГзигутп ехргеззюп ίη §НоЫаз1ота се11з Ьу <Ье Каз тЫЬког ГатезуЬЫозаНсуНс асИ ргото(ез сазразе-берепбеп! арор1оз15. Мок Сапсег ТЬег. 5,2337-2347.
Воигбоп МА, МкзКапб Ск РиПЬтауг Н, МаПЬе^з Тк ЕП^пег ББ (1983). Нитап ^ПотатезепсЬута1 ехсгасе!1и1аг та1пх апй§еп беГтеб Ьу топос1опа1 апНЬобу. Сапсег Кев. 43, 2796-2805.
Βον,εη АК, Напкз ΑΝ, МигрЬу Кб, Р1оге11 ЗК, Сгоззтап Б (2004). РгоМегаПоп, арор(оз1з, апб δΐιτνίνιη ехргеззюп ίη кегаСпосуис пеор1азтз апб Ьурегр1аз1аз, Ат I Бегта1орабю1. 26, 177181.
Βογίοη КЗ, ЬоЬтапп Τ, Ьопбе! М, Ка1ЬасЬег Н, НаМег Т, Рга1ег Ак Боиек БС, ЬезПе БС, Р1ауе11 КА, АЬтапп БМ (1998). С1и(апж асН бесагЬоху1азе Т 1утрЬосу1е геэропзез аззоаагеб χνίϊΕ зизсербЬНЬу ог гез151апсе (о 1уре I б1аЬе1ез: апа1уз13 ίη Лзеазе Лзсогбап!
Ьитап ί\νίη8, поп-оЬезе б1аЬе()с писе апб НЬА-БО 1гапз§етс гглсе. Ιηί. 1ттипо1.10, 17651776.
Вгекке С, Ьипбегуо1б А, Еп§ег РО, Вгеккеп С, 31а1зеК Е, Ребегзеп ТВ, Нага1бзе1Ь О, Кпщег РО, В)егкУ1£ К, СЬекепуа М (2006). N02 ехргеззюп ге§и!а1ез уазси1аг тогрЬо1о£у апб ГипсОоп ίη Ьитап Ьгат штоигз. Ыеиго1та§е. 29,965-976.
Вгеппег АУ, Ьте1 М3, Рте НА, ЗЬарио λνκ, Зе1кег КО, В1аск РМ, 1пзк1р РБ (2002). Н151огу оГа!1ег§1ез апб аиЬйттипе скзеазез апб пзк оГЬгат Штогз ίη абиЬз. Ιηί. 1 Сапсег 99, 252259.
Вготте1апб Т, Козеп^геп Ь, Рпб1ипб 3, Ηεηηίβ К, 1закзеп V (2007). Зегит Ιενβΐβ οί §11а1 ЯЬпНагу аабю рго1ею согге1а1е ίο Штоиг уо1ите оГЫ§Ь-§габе зИотаз. АсГа №иго1. Зсапб. 116, 380-384.
Вгоп§ег Η, Κοηί§ I, ΚορρΙοχν К, 51етег НН, АЬтасЬ К, Него1б-Мепбе С, Керр1ег Б, №ез АТ (2005). АВСС бги§ еЯ1их ритрз апб огеатс атоп ир1аке 1гапзроПегз ίη Ьитап ^Потаз апб 1Ье Ыооб-Штог Ьатег. Сапсег Кез, 65, 11419-11428.
ВгусЬфуа 5, Ршгазкоуа М, Н1оЬПкоуа А, ВгусЫа Т, Нппак ί (2007). Νεβίΐη ехргеззюп ίη си1апеоиз те!апотаз апб те!апосу1ю ηενί. 1 Си(ап. Ра(Ьо1.34,370-375.
- 51 023013
ВисНпег А, Саз(го Μ, Непшд А, Рорр Т, Аззтапп О, НоГбебег А, 8беГ С, 21ттегтапп XV (2007). [Тгапзспрюте апа!узез ίη гепа! сеП сагстота. СотЬтабоп оПазег пбсгоб15зесбоп апб пбсгоаггауз]. иго1оде А 46, 1170-1175.
Сако А, Са(епа К, ЫоЫе М8, СагЬоП В, ΟΐΙ-Вагю 1, Оопга1ег-Могепо О, НиЬ Л, 8Ьагр К, (^и ΤΗ, ΑηνοΓ МК, МегНпо О, Гбск.зоп КВ, ЗоЬпзоп МО. Огееп 1Е (2008). 1бепббсабоп оГ УЕОРгеди1а1еб депез аззос1а1еб ννϊίΗ тсгеазеб 1ип§ те1а51абс рсбепба!: Гипсбопа) ίηνοίνβηιβηΐ оГ 1епазс1п-С ΐη (итог дгоМЬ апб 1ипд теХаз1аз1з. Опсодепе.
СатроН МК, СЬапд СС, КадезЬка Т, ХХ'апд X, МсСабНу ΙΒ, Реггопе 8 (2004). Нитап ЫдЬ то1еси!аг \уе1дЬ1-тс1апота-аззос1а1еб апбдеп (ΗΜ\ν-ΜΑΑ): а те1апота сеП зигГасе сЬопбгокт зиИаСе рго!еод!усап (М8СР) χνίϋι Ью1од1са1 апб ебтеа! 5]дтбсапсе. Сгк Κεν. 1ттипо1. 24,267-296.
СатетоИа В, СазЮПаш Р, Ропазз! М, Вогз1 Б, Б1гЬпб δ, Νίοοίο О, ОогсагаПо А, У1а1е О,
XVίηΙεΓ О, Νεπ ϋ, Ζ3γ6ϊ Б (1999). МепбПсабоп оГа дНоЫазХота-аззос1а1еб 1епазОп-С ϊκοί’οπη Ьу а ЫдЬ аГПпбу гесотЫпап! апбЬобу. Ат Д Ра1Ьо1.154,1345-1352.
Сатеге С, 8ее1еу Е8, ОоеХге Т, Бопдпескег ϋδ, Когс М (2007). ТЬе ΝβκΙίη ргодепког Ппеаде 151Ье сотрабтеп! оГопдт Гог рапегеабе шбаерКЬеКа! пеор!аз1а. Ргос Νβίΐ. Асаб. 80. и. 8. А 104, 4437-4442.
Сазаб С, Оа1егЬа Ρ, Κίνοίΐΐηί Б, ОаШпо О, ϋβΗο Ρ, Κίηΐ Р, ВеШ Р, Меггапгатса О, Соз1а А, Апбгео)а 8, Бео Е, Рагпбаш О, СазХеШ С (2003). ТЬе арор(оз15 тШЬког ρΓΟΐβίη βωνΐνΐη тбисез Ситог-зреОбс ΟΏ8+ апб СЭ4+ Т се11з ίη со1огес1а1 сапсег рабепХз. Сапсег Кез. 63, 4507-4515.
Саз1е1Нпо Р, Пиапд ΑΥ, Хап-Воппе! О, 8(о11 8, ЗсНетескег С, Оегтат ΚΝ (2006). СНетокхпез епЬапсе ттипку Ьу дшбшд паке СЭ8+ Т се11з ΐο З11ез оГСО4+ Т сеН-бепбпбс сеП тХегасбоп. ТЧаХиге 440, 890-895.
СНакгауаба Α, ΝοΐΙ Е, В1аск РМ, Рткекхеш ΌΡ, РкхкекХет ОМ, Оузоп N6, БоеГПег 68 (2002). (}иапб1абуе1у беХегттпеб зигукт ехргеззюп 1еуе1з аге оГ ргодпозбе уа1ие ίη Китап дботаз. 3 С1т Опсо120, 1063-1068.
СЬееуег МА, СЬеп XV, ϋΐ5Ϊ3 МБ, ТакаЬазЫ М, Реасе ЭЗ (1993). Т-се11 ттипку 1о опсодетс ргоХетз тОибтд тиХаХеб газ апб сЫтепс Ьсг-аЫ. Апп Ν. Υ. Асаб. 80. 690, 101-112.
СКекепуа М, Епдег РО, ТЬогзеп Р, Тузпез ВВ, ΑΙ-Загга) 8, Кеаб ТА, Ригтапек Т, МаКезрагап К, Беуте 1М, ВиХХ АМ, РПктдхоп ОД, В)егку1д К (2002а). ТЬе дПа! ргесигзог рго1еод1усап, N02, Ϊ3 ехргеззеб оп Хитоиг пеоуазси1аХиге Ьу уазси1аг репсуХез ίη Китап табдпапХ Ьгат Хитоигз. ИеигораХНок Αρρί. ΝεωτοΚΐοΙ. 28, 367-380.
СКекепуа М, Н)е1з(иеп М, Епдег РО, ТЬогзеп Р, ЗасоЬ АБ, РгоЬз1 В, Нага1бзеХЬ О, РПктдХоп О, Виб А, Беуте ЗМ, В)егкУ1д К (2002К). N02 ргоХеод1усап рготоХез апдюдепез1з-берепбепХ 1итог дгоибЬ ΐη ΟΝ 8 Ьу зециезХегтд апдюзХаХт. РА8ЕВ ί 16, 586-588.
СКекепуа М, 1ттегуо11 Н (2007). ΝΟ2/ΗΜΡ рго1еод1усап аз а сапсег ХЬегареибс ХагдеХ. МеХЬобз Мок Βϊοΐ. 361, 93-117.
- 52 023013
СЬекепуа М, Кгакз1аб С, Зуепбзеп А, Ж(1апб ΙΑ, 8(аа1е5сп V, Тузпез ВВ, δοΙΗοίηι р, Аап§ 5, Закапаззеп РО, 8апба1 Т, Εοηηίη§ РЕ, Пайпагк Т, Еп^сг РО, В]егк\ щ К, 8ίοιι6 М, 8(а11сир АВ (2008). ТЬе ргоцепког се11 тагкег ΝΟ2/ΜΡΟ ргото1ез сЬетогез15(апсе Ьу асйуайоп оГ 1п1е£пп-берепбеп1 Р13К/Ак1 з!§паПп§. Опсо§епе.
СЬекепуа М, РНкт§1оп ОТ (2002). N02 ргесигзог сеПз ίη пеор1аз1а: Гипс(1опа1, Ь|з1о§епез15 апб (ЬегареиПс кпрПсайопз Гог таП@пап( Ьгат пнпоигз. б ΝειηΌογΐοΙ. 31, 507-521.
СЬекепуа М, Еоорга] НК, Оау|ез Ό, Ьеу|пе 6М, Вии АМ, РНкт^оп Об (1999). ТЬе N02 сНопбгокт зи1Га1е рго1ео§1усап: го!е ίη таП§пап1 рго£гезз1оп оГЬитап Ьгат (итоиге. Пк 1 Оеу, Ыеигозск 17,421-435.
СЫяиеСЕЬпзтапп К., Тискег ЕР (2004). Соппесхке Оззиез: 31§па1Пп§ Ьу (епазстз. Ιηΐ. б ВюсЬет. СеП ΒίοΙ. 36, 1085-1089.
СЬи С, и 6Υ, Воабо Кб, Рагбпб§е АМ (2008). В1ооб-Ьгат Ьагпег §епот1сз апб с1отп£ оГ а ηονβΐ ог§ашс ашоп (гапзроЛег. I СегеЬ. В1ооб Иолу Ме1аЬ 28,291-301.
СоНп С, Ваега Ν, ВаЛоН С, Рта Р, Еибез Ν, Νβηηΐ I, МаП1П РМ, Оиайк Ь, р|§аге)1а-Вгап§ег ΰ (2006). 1бепйПсайоп оГ §епез бИГегепйаПу ехргеззеб ίη §ПоЫазЮта уегзиз рбосуйс азггосуЮта ιΐ3Ϊη§ Зирргеззюп ЗиЬХгасОуе НуЬпб^гайоп. Опсо§епе 25, 2818-2826.
Со1отЬеи1 8, Ваззо V, МиеПег ОЬ, Μοη6ίηο А (2006). Рго1оп§еб ТСК/СО28 сп§а§етеп1 бпуез 1Ь-2-тберепбеп1 Т се11 с!опа! ехрапзюп (Ьгои§Ь 31§паПп§ теб1а(еб Ьу (Ье таттаНап 1аг£е( оГгаратуст. б1ттипо1. 176,2730-2738.
Сопасс1-8огге11 М, Кар1ап А, КауеЬ 8, Оауеб Ν, 8акига1 Т, Ββη-Ζβ'βν А (2005). ТЬе зНеб есЮботат οΓΝγ-САМ зйтиЫез се11 ргоПГсгаиоп апб тоЫку, апб сопГегз сеН (гапзГогта1юп. Сапсег Еез. 65, 11605-11612.
Сопасс1-8огге11 МЕ, Веп-УебкНа Т, ЗЬйктап Μ, ΡβίηκΙείη Е, ΕίηαΙ Р, Ββη-Ζβ'βν А (2002). ΝγСАМ Ϊ5 а 1аг§е1 §епе оГ(Ье Ье(а-са1еп1п/ЬЕР-1 ра(Ь\уау ίη те1апота апб со!оп сапсег апб кз ехргеззюп епЬапсез тоЫку апб сопГегз 1итопеепе51$. Оепез ϋεν. 16, 2058-2072.
Созкип и, Уатас Ό, Ои1ЬаЬаг О, Запсак В, Кагатап Ν, Огкап 3 (2007). ЬосаПу абуапсеб Ьгеаз! сагстота (геа!еб ν/ίΐΐι пеоабуиуап! сЬетоГЬегару: аге 1Ье сЬап^ез ΐη зегит 1еуе1з оГ УКЬ-40, ММР-2 апб ММР-9 согге!а1еб χνίιΗ (итог гезропзе? №ор1азта 34, 348-352.
СгеззууеП Р (1994). АззетЫу, 1гапзрог1, апб Гипсбоп оГМНС с1азз II то1еси1ез. Аппи. Кеу. 1ттипо1.12,259-293.
ОаЫзкапб б, Со1Нпз УР, ЬепбаЫ и (1992). Ехргеззюп оГ 1Ье с1азз VI т1егтеб]а(е Л1атеп1 пезбп ΐη Ьитап сепЬа! пегуоиз зуз(ет (итоге. Сапсег Еез, 52, 5334-5341.
Оеп§)е11, Ыаз(ке МО, ОоиПеГап^еаз С, Скзюиб|з О, ЗсЬоог О, АкепЬегепб Р, Ми11ег М, Кгатег В, М1зз1ои А, 5аи1ег М, Неппеп1оиег б, Аете1 ϋ, δίβηζΙ А, Еаттепзее НО, КПп§е1 К, 81еуапоУ1с 8 (2006). ипехрес1еб АЬипбапсе оГНЬА С1азз II Ргезеп(еб Рерйбез ίη Рптагу Еепа! СеП Сагстотаз. СПп Сапсег Еез. 12,4163-4170.
- 53 023013
Οίχοη ϋΝ, Ιζοη Ой, Оаддег 8, Са11о\у ΜΙ, ТарНп КН, Кеез 1ДК, Огеепе XVК (2007). ТБХ1/НОХ111гап8спр1юп Гас1ог тЫЬкз ШГГсгспйайоп апй ргото1ез а поп-Ьаеторо1ейс рйепотуре ίη типпе Ьопе таггоху се11з. Вг. 1 Наета1о1. 735, 54-67.
ОотоЮ Т, М]уата Υ, ЗигиИ Н, ТегаЮш Т, Ага1 К, Зи§|уата Т, Такауата Т, Ми^уа 8, Οζοηο 5, Иогахуа К (2007). Еуа1иакоп οί 3100А10, аппехт И апй В-РАВР ехргеззюп аз тагкегз Гог гепа! се11 сагстота. Сапсег Зек 05, 77-82.
Оий1еу МЕ, ХУипйегКсН Ж. КоЬЫпз РР, Уап§ ДС, Или Р, 8сН\\аг[7еп(гиЬег ОД, ТораНап ЗЬ, ЗЬеггу К, КезНГо ΝΡ, НиЫсЫ АМ, КоЬтзоп МК, Кайе1й М, Оигау Р, 5е1рр СА, Ко§егзРгеегег Ь, МоЛоп КЕ, Маугоикак1з ЗА, ХУККе ОЕ, КозепЬегд ЗА (2002). Сапсег гедгеззюп апй аиЮттипКу ίη райепЮ айег с!опа1 герорикайоп ννΚΗ аШкитог 1утрНосу1ез. Зиепсе 295, 850-854.
Оий1еу МЕ, ХУипйегксЬ ДК, Уап§ ДС, ЗНеггу КМ, ТораНап ЗЬ, КезНГо ΝΡ, Коуа1 КЕ,
Катти1а и, ХУКке ОЕ, МаУГоикаЫз ЗА, Кодегз БД, Огааа ОД, Допез ЗА, Мап§1атеП ϋΡ, РеНеПег ММ, Оеа-Вапас1осЬе Д, Κ,οΚίηκοη МК, Вегтап ОМ, Ρΐ Не АС, А Кар А, КозепЬег§ 8А (2005). АйорНуе се11йапзГег Шегару Го11о0пд поп-туеЮаЫаНуе Ьи11утрЬойер1е(т§ сКетоЮегару Гог 1Ке 1геа1теп1 оГраНеп(з ννίΐΗ геГгасЮгу те1аз1аНс те1апота. Д. СНп. Опсок 23,2346-2357.
ЕррепЬегдег I), МиеПег Н (1994). ОгоМН ГасЮг гесерЮгз апй 1Нек Пдапйз. Д Иеигоопсок 22, 249-254.
ЕгГиг! С, Зип Ζ, Наепй1е I, ЗсЬи1ег-ТНитег В, Не1гтап С, ТЫе1етапз К, уап йег ВР, 8сЬи1ег О, ЗсНикг Е8 (2007). Титог-геасруе СО4+ Т се11 гезропзез Ю 1ке те1апота-аззос1а1ей сНопйгоКт зи1рЬа1е рго1еод1усап ίη те1апота райетз апй НеакЬу тЙ1У1Йиа1з ίη 1Ье аЬзепсе οί аикпттипку, Д Пптипок 775, 7703-7709.
Ыогепез УА, Но1т К, Мук1еЬоз10, ЬепйаН! и, РойзЮй О (1994). Ехргеззюп оГ (Не пеигоесЮйегта! 1п1егтеЙ1а1е ГПатепХ пезХт ίη Китап те1апотаз. Сапсег Кез. 54,354-356,
Роп§ Ь, Нои Υ, Κίνββ А, Ветке С, Уиеп А, Р1зЬег ОА, Оаухз ММ, Еп§1етап ЕО (2001). Акегей рерййе Пдапй уасстаХюп ν/кН РкЗ Пдапй ехрапйей йепйгтс се!1з Гог 1итог 1ттипо1Ьегару. Ргос. ИаХк Асай. Зек и. 3. А 95, 8809-8814.
Оа1Н К, Втйа Е, ОгГапеШ и, ΟϊρβΠβΐΐί В, ΟπΧΐί А, Ое УЗ, Рюссо К, ΡοΓοηί С, Οίηιβοο Р, Уезсоу| А (2004). 1зо1аХ<оп апй сНагасХепгаХюп оГ (итоп§етс, зХет-Пке пеига! ргесигзогз Йот Китап дПоЫазХота. Сапсег Кез. 64, 7011-7021.
Оа1оп Д, Соз1ез А, ЗапсЬег-СаЬо Р, КкНоузку А, М1естк В, Ьадогсе-Радез С, ΤοβοΙίηί М, Сатиз М, Вегдег А, XV тй Ρ, ΖίηζίηύοΗουβ Р, Вгипеуа1 Р, Сидпепс РН, Тпцапозк! Ζ, Рпйтап XVН, Радек Р (2006). Туре, йепзку, апй 1осаНоп оГ ]ттипе се11з ννίχΗίη Китап со1огесХа1 ютогз ргеЫсх сНп]са1 оиХсоте. Зеленее 313,1960-1964.
Оагсюп Е, НаШадю А, Ра1ззпег А, йгепсН-СопзХапХ С (2004). Оепегайоп оГап епукоптепХа! тсКе Гог пеига! зХет сеП йеуеЮртепХ Ьу (Не ех(гасе11и1аг таХпх то1еси!е Хепазст С. ОеуеЮртепХ 737, 3423-3432.
- 54 023013
Сагу ЗС, КеИу СМ, Носкйе1й 8 (1998). ВЕНАВ/Ьгеукап: а Ьгат-зресШс 1есХ1сап ипрНсаХей ΐη ёНотаз апй §На1 сеП тохйхху. Сигг. Ορΐη. ЦеигоЫок8. 576-581.
Сагу 8С, Ζεπίΐο СА, СЫап§ УЬ, Са\у ЙЫ, Огау С, НоскПе1й 8 (2000). οϋΝΑ οΙοηίη§, сЬготозота) 1осаНга11оп, апй ехргеззюп апа1уз1з оГЬитап ВЕНАВ/Ьгеу|сап, а Ьгат зресШс ргоХео§1усап ге^ЫаХей йипп§ согХюа! йеуе1ортепХ апй ΐη ^Пота. Оепе 256, 139-147.
СаХХтот Ь, ΡοννβΙΙ Ой, йг., КозепЬег§ ЗА, КезОГо ΝΡ (2006). Αάορίΐνβ хттипоХЬегару Гог сапсег: Ьи)1Й1П§ оп зиссезз. Ыа1. Κβν. 1ттипо1. 6, 383-393.
СНозЬ ЙС, ОоЫ Т, Кап§ ВН, ΑΙΐΐβπ ОС (2008). НзрбО ге^и1айоп оГХитог сеН арорхоз1з. Й ΒίοΙ. СЬет. 283, 5188-5194.
Οΐρρ й, Си О, Сгу1еп С, Казрег 3, ВизЬтап XV (2007). Ней§еЬо§ раХЬ\уау асХ1У]1у ΐη ХЬе ЬАОУ ргозХаХе Хитог тойеЬ Мок Сапсег 6, 19.
ОШЬеппап АЗ, МюЬиппа Т, Епстаз ЙМ, Κοΐ§ ЙЬ, Кгазпоу Р, Ва1огй| Р, ПзЬеИ О, КозепГек! МС, Еп1ко1ороу О (2008). Оепехю арргоасЬез хйепПГу айик рЛийагу з(ет се11з. Ргос 14аХ1. Асай. Зек и. 5. А 105, 6332-6337.
Оп)аХ1с 8, АХапаскоук ϋ, йа§ег Е, МаХзио М, Зе1уакитаг А, АИогк· ΝΚ, Мак) КС, ЭиропХ В, ΚίΧΧβΓ С, СЬеп ΥΤ, КпиХЬ А, О1Й Ьй (2003). 8игуеу оГ паХигаПу оссигпп§ СО4+ Т сеП гезропзез а£атз! ΝΥ-Ε8Ο-1 ΐη сапсег раХхепХз: согге1а11оп ννΐχΐι апХйюйу гезропзез. Ргос К'аХк Асай. ЗсЬ и. 3. А 100, 8862-8867.
СойЬоиХ К, В13§гоуе ЭА. ЗЬко1пу ϋ, Рау КЗ, III (1998). Согге1аХ1оп оГВ-РАВР апй ОРАР ехргеззюп ίη таЬ§папХ §Нота. Опсо§епе 16,1955-1962,
Оогка В, 5киЬ1з-2е^ай1о й, М1ки1а М, Вагйайт К, РаПсгка Е, Сгатоска В (2007). ЫгСАМ, а пеигопа! зузХет сеП-айЬезюп то1еси1е, Ϊ3 тйисей ΐη рарШагу ХЬуклй сагстотаз. Вг. й Сапсег 97, 531-538.
ОоХо Υ, МаХзигак1 Υ, КипЬага 3, ЗЮпиги А, Окайа Т, УататоХо К, МигаХа Н, ТакаХа М, АЬигаХат Н, Нооп ОЗ, 8а1йа Т, Ка\уакагш Υ (2006), А пе\у текпота ап11§еп ГаХХу ас|йЬтйт£ ргоХет 7, ΐηνοίνβά ΐη ргоВГегаХюп апй ΐηνβχΐοη, Ϊ3 а ро!епХ!а1 Хаг§е[ Гог 1ттипоХЬегару апй то1еси!аг Хаг§ех хЬегару. Сапсег Кез. 66,4443-4449.
Огипйа ЙМ, ИаЬогз ЬВ, Ра1тег СА, СЬЫеп§ ОС, 8Хе§ А, М1кке1зеп Т, Охазю КВ, Ζ1ηη§ К, АШзоп О, Οπζζΐβ ΧΧΈ, ХУап§ XV, СШезр1е ΟΥ, ЙоЬпзоп МК (2006). 1псгеазей ехргеззюп оГ ХЬутгйукХе зупХЬеХазе (ТЗ), υόΐηυΐχίη зрес|йс ргоХеазе 10 (ИЗРЮ) апй зигстп Ϊ3 аззоскХей \νΐΐΗ роог зигу|уа1 ΐη §ПоЫазХота тиШГогте (ОВМ). й ΝβυΓΟοηεοΙ. 80, 261-274.
Ου С, Уиап й, XV ί Из М, Казрег 3 (2007). Ргозхахе сапсег се11з ννΐχΗ зХет сеП сЬагасхепзПсз гесопзхххихе (Не оп§та1 Ьитап хитог ΐη νίνο. Сапсег Кез. 67, 4807-4815.
СипхЬег Н8, ЗсЬппйХ ΝΟ, РЬППрз Н8, Кеттт£ Ό, КЬагЬапйа 8, Зопапо К, Мойгизап Ζ, Ме]ззпег Н, ХУезХрЬа! М, Ьатзгиз К (2008). ОИоЫазХота-йепуей зХет сеП-еппсНей сиКигез Гогт ШзХтсх зиЬзгоирз ассогйт§ хо то1еси1аг апй рЬепоХурге спХепа. Опсо§епе 27, 28972909.
- 55 023013
Наттег I, СаПа/ζί Ρ, Βοηο Ε, Кагг К XV, СиепоХ Л, УаЬазшт Р, Шаеу ΖΑ, 5|П1§а§йа Ρ (1995), Рерйбе 6ίπ6ΐη§ зреаПаХу оГНБА-ОК4 то1еси1ез: согге1а1юп ννΐΐΗ гйеитаХО|б агхЬпХгз аззоаабоп. Л Ехр. Меб 181, 1847-1855.
Напаба К, Уе\\бе11 Л XV, Уапд ЛС (2004), 1ттипе гесодпШоп оГ а Йитап гена! сапсег апбдеп (йгоидй розХ-Хгапз1аХ1Опа! ргоХет зрНсшд. ИаХиге 427,252-256.
Наи Р, Κυηζ-ЗсЬидЬагХ ЬА, Китте1е Р, Агз1ап Р, ОогГеЙ А, КосЬ Н, БоНте^ег А, Нйзсйтапп В, МиПег А, Водбайп и, ВоззегЬоГГ АК (2006). Тепазст-С ргоХет Ϊ8 тбисеб Ьу ХгапзГогттд дгоМй Гасхог-Ье1а1 Ьи1 боез ηοί согге!ахе \νϊΙΙι Сипе хо Хитог ргодгеззюп 1п Ыдй-дгабе дНотаз. Л№игоопсо1. 77, 1-7.
Не1тЬегдег АВ, Низзат 8Р, А1баре К, За\уауа К, Агсйег ОА, Рпебтап Н, Кеагбоп Э, Рпебтап А, В1дпег ϋϋ, Затрзоп ЛН. Титог-зресШс рерйбе уасстаХюп ΐη пеубучПадпозеб рабеп1з ννΐΐΐι СВМ. Лоита! оГСПшса! Опсо1оду, 2006 А8СО Аппиа! МееХтд Ргосеебтдз Ран I Уо1 24, Νο. 188 (Липе 20 5ирр1етепХ), 2006: 2529. 6-20-2006.
Него1б-Мепбе С, МиеНег ММ, ВопзапХо ММ, ЗсЬпйХХ НР, Кипге 5, ЗХетег НН (2002).
СНшса! 1трас1 апб Гипсбопа! азресХз оГхепазст-С ехргеззюп биппд дПота ргодгеззюп. ΙηΧ. Л Сапсег 98,362-369.
Неггега МВ, Вгипо 3, ВигбдНеп 3, Тена С, Саба 8, Оегед^Ьиз МС, Виззо1ай В, Сатизз1 С (2006). 1зо1абоп апб сйагасипгайоп оГ а зхет се II рори!а(юп Ггот абиИ Ьитап ΙΐνβΓ. Зхет Се11з 24, 2840-2850.
НоГГтапп ΝΕ, ЗЬетт Υ, БоЬзе СМ, Рагкег АЗ, Бе|Ьоу1сЬ ВС, Л1апд Ζ, Κ\νοη ЕО (2008). Ех(ета1 уайбабоп оПМРЗ ехргеззюп аз ап тберепбепг ргодпозбс тагкег Гог те(аз(ахю ргодгеззюп апб беаХЬ Гог рабепХз \νίΐΗ с!еаг се11 гепа! се11 сагстота. Сапсег 112, 1471-1479.
I Ιοηηίεο А, Ои В, Капгш 3, Клебе1 Е, Рападеаз КЗ, Ебдаг МА, Тапм/аг МК, Као ЛЗ, РЫзйег М, РеАпдейз БМ, НоПапб ЕС (2006), УКБ-40 апб тахпх те1а1!оргохетазе-9 аз ро(епба1 зегит Ыотагкегз Гог рабепГз χνΐίΗ ЫдЬ-дгабе дНотаз. СНп Сапсег Кез. 12, 5698-5704.
Ниапд Л, Ни Л, Βΐβη X, СЙеп К, Оопд XV, 1>ип1ор ΝΜ, Ηον/агб ОМ, №апд ЛМ (2007). Тгапзасбуабоп оГхЬе ер1бегта1 дгохмй ГасГог гесерЮг Ьу Гогту1рерббе гесерХог ехасегЬаХез 1йе таНдпап! ЬеЬауюг оГйитап дйоЫазХота се11з. Сапсег Кез, 67, 5906-5913.
Ниапд Υ, Рап Л, Уапд Л, ΖΗυ ΟΖ (2008). СЬагасХепгабоп оГ ОРК56 рго(е!п апб 11з зирргеззеб ехргеззюп ίη Йитап рапсгеабс сапсег се11з. Мо1. Се11 ВюсЬет. 308, 133-139.
НипсЬагек М, Кире1шск В (2000). Ер|бегта1 дгоубЬ Гас(ог гесерХог депе атрййсабоп аз а ргодпозХю тагкег ίη дЙоЫазЮта тиЬЛГогте: гезиИз оГ а теха-апа1уз18. Опсо1 Кез. 12, 107112.
Н\уапд МБ, Бикепз ЛК, ВиНоск ΤΝ (2007). СодпаХе тетогу СЭ4+ Т се11з депегахеб убхЬ бепбпХю се11 рпттд тЯиепсе (Ье ехрапзюп, ХгаЙюктд, апб б]ГГегепХ1аХюп оГ зесопбагу СО8+ Т се11з апб епйапсе Хитог сопХгок Л 1ттипо1. 179, 5829-5838.
- 56 023013
1дисЫ Т, 8ака(а К, УозЫгаЬ К, Тадо К, Μίζιιηο Ν, ИоЬ Н (2008). ОгрЬап С рго1е1п-соир1еб гесер!ог ОРК56 геди1а1ез пеига) ргодепког сеИ пидгаЬоп У1а а Са1рЬа 12/13 апд КЬо рабтоау. 1 ВЫ. СЬет.
1Ца Воог РК, бе ОК, М^азкьВозгуак V, Вгеппег С, уап бег Кпаар МЗ, ЗсНерег СС, Ргопк ДС (2006). МедакпсерНаПс 1еикоепсерКа1ора(Ну ννΐΐΚ зиЬсогЬса! суз1з: ап ирба1е апс! ех1епбеб ти(аЬоп апа1уз1з о£МЬС1. Нит. МиШ. 27, 505-512.
ШнисЫ 8, Тзи/,ик| К, УозЫба Υ, Уатаба Ν, НадЫига Ν, Окабо Н, Μΐν/а А, КипЬага Н, Иакагаю Υ, Татига М, Зазак! Т, Ога\уа 8 (2002). В1оскадс οί Са(2+)-регтеаЫе АМРА гесерЮгз зирргеззез гтдгаЬоп апс1 шбисез арорЮз1з ΐη Ьитап дЬоЫазЮта се! 1а. ΝβΙ. Мед 8, 971-978.
[зЫгаИ М, 1зЫ\уа!а Т, АбасЫ А, Татига Ν, ОЬаг1габеЬ М, ККатига Н, 5и§1зак1 Υ,
Уатапака Ν, Иабо Ζ, Рикиба Υ (2006). Ехргеззюп οί пезйп ίη га1 апс1 Ьитап §1отеги1аг робосугез. Д ЗиЬгшсгозс. Суток РаХЬок 35,193-200.
Дапззеп ЕМ, Ьеттепз ЕЕ, \УоНе Т, СЬпз1еп и, νοη НеггаТО МО, ЗсЬоепЬегдег ЗР (2003). 0ϋ4+ Т се!1з аге гецц!гес1 Сог зесопбагу ехрапзюп апс! тетогу ίη СО8+ Т 1утрЬосу1ез. ИаТОге 421,852-856.
Дачюгзк) ΌΜ, Ке11у ОМ, Р1ерте1ег ДМ, НоскЛе1б 8 (1996). ВЕНАВ (Ьгаш еппсЬеб Ьуа!игопап Ьтбтд) Ϊ3 ехргеззеб ίη зигдка! $атр!ез οί дЬота апс! ίη Ыгасгата1 дгайз οί туаз|уе дЛота се111тез. Сапсег Кез. 56,2293-2298.
Д)ап§ Ζ, СЬи РО, А¥оба ВА, Коек КЬ, Ыи б, Нз1еЬ СС, Ιί С, СЬеп ΥΥ, Пиап НО, МсОоида] 8, 9/и СЬ (2006). Апа1уз1з οί ΚΝΑ-Ьтбтд ргоЮт ΙΜΡ3 ТО ргесЬс! те1аз1аз18 апб рго§поз15 οί гепаксеН сагстота: а геЬозресЛуе зТОбу. Ьапсе( Опсо! 7, 556-564,
Д]апд Ζ, ЬоЬзе СМ, СЬи РО, XV и СЬ, \Уоба ВА, Коек КЬ, Κννοη Εϋ (2008). Опсоке(а1 рго(ет ΙΜΡ3: а ηονβΙ то1еси!аг тагкег бга1 ргебЫз те1аз1аз13 οί рарЫагу апб сЬготорЬоЬе гепа! сеП сагстотаз. Сапсег 112,2676-2682.
ДоЬапзеп ДЗ, Депзеп ВУ, КозЬпб А, РЪекеп ϋ, Рпсе РА (2006). 8егит УКЬ-40, а пей/ ргодпозЛс Ьютагкег ΐη сапсег раЛеп1з? Сапсег Ер1бетЫ. Вютагкегз Ргеу. 15, 194-202.
ДоЬапзеп Д8, Депзеп ВУ, КозЬпб А, Рпсе РА (2007), 1з УКЬ-40 а пе\у (ЬегареиЬс 1агде1 ίη сапсег? ЕхреП. Ορίη. ТЬег. Таг§е1з. 11,219-234.
Дипд СЗ, РоегсЬ С, ЗсЬапгег А, Неск А, Р1а1е КН, δείίειΐ V, 51етте1г Н, КааЬе А, ЗЬгег М (2007). Зегит ОРАР 1з а б1адпозЬс тагкег ίοΓ дЬоЫазЮта тиШкогте. Вгат 130, 3336-3341.
Дипд С, ЬебЬепег ДА, МиНег-ЕЬегЬагб НД (1987). ЮбисЬоп οίсуТОТОхЫгу ΐη гезЛпд Ьитап Т 1утрЬосу1ез Ьоипб ТО (итог се11з Ьу апЬЬобу Ье1егосоп]и§а1ез. Ргос Ца(1 Асаб 8с51Д 8 А 84, 4611-4615.
Дипкег Ν, ДоЬапзеп ДЗ, Напзеп ЬТ, Ьипб ЕЬ, Кпз1)апзеп РЕ (2005). Кеди1аЛоп οί ΥΚί-40 ехргеззюп биппд депоЮхю ог ппегоепуиоптейа! з1гезз ίη Ьитап дЬоЫазЮта сеНз. Сапсег Зск 96, 183-190.
- 57 023013
Кар\\ага Υ, Уатазак) Р, Наша 3, УаЬага К, УозЫока Н, Зи^уата К, АпХа К, Кипзи К (2003). Ехргеззюп οί ΒυΓνΐνίη ΐη азХгосуХ1с Хитогз: согге1аДоп ννΐίΐι таНдпапХ дгабе апб рго§поз1з. Сапсег 97, 1077-1083.
Ка1озЫ О, МокЬХал К, С'агрепПег С, РабПЬеП 8, Ье^еипе б, Мале Υ, Ое1аХХге 6Υ, ОобЬоиХ К, Запзоп М (2007). РАВР7 ехргеззюп ΐη §1юЫазХотаз: ге1аХюп Хо рго§поз13, туазюп апб ЕОРК зХаХиз. б Иеигоопеок 54, 245-248.
КаХо Υ, ΡυμΟΝ, Кипка А, ЗаХо 3, Капеко М, Озалуа М, Тзигио Т (2003). Мо1еси1аг (бспбЯсабоп οί Аддгиз/Т1а1рЬа аз а р1аХе!еХ аддгедаХюпчпбистд ГасЮг ехргеззеб ΐη со1огсс1а1 1итогз. б ΒΐοΙ, СЬет. 278, 51599-51605.
Ка1о Υ, Капеко МК, Кипба А, 1хо Н, Катеуата А, Одазам/ага 3, МаХзиига Ν, Назе§а\уа Υ, ЗигикНпоие К, 1поие О, ОгаЖ Υ, Иаптахзи Н (2008). Мо1еси1аг апа1уз!з оГ хЬе рахЬорЬузю1о§1са1 Ьтбтд οί ХЬе р1аХе1еХ а§£ге§аХюп-тбист§ РасХог робор1апт ίο ХЬе С-1уре 1есХш-Нке гесерХог СЬЕС-2. Сапсег Зек 99, 54-61.
Кахо Υ, Капеко МК, Кипо А, ббсЖуата Ν, Атапо К, СЖЬа Υ, Назе§а\уа Υ, НкаЬауазЖ б, ИагипаХзи Н, М)зЖта К, Оза\уа М (2006). 1пЬίδΐίΐοη οί 1итог сеН-тбисеб р1аХе!еХ аддгедабоп изт§ а ηονβΐ апб-робор1апт апиЬобу геасХтд \νίίΗ кз р1аХе1еХ-১ге§а1юп-з11ти1а1т£ боташ. ВюсЬет. ВюрЬуз. Кез. Соттип. 349, 1301-1307.
Ке Ν, Зипбагат К, Εΐυ О, СЖошз б, Рап IV, Кодегз С, А\уаб Т, ОпРтап М, Уи Э, \\'опд-ЗХаа! Ρ, 16 ЦХ (2007). ОгрЬап С ргохет-соир!еб гесерЮг ОРК56 р1ауз а го1е ΐη сеП ХгапзРогтаХюп апб Хитоп§епез1з ΐηνο1νίη§ ХЬе сеП абЬезюп ра1Ь\уау. Мок Сапсег ТЬег. 6, 1840-1850.
Кеппебу КС, ЗЬеагег МН, \¥а11з АМ, Вп§Ы КК (2003). СЭ4+ Т 1утрЬосуХез р1ау а егкюа! го1е ΐη апХкэобу ргобисХюп апб Хитог кптипку а§а»пзх зшиап νΐηιβ 401аг§е хитог апХ1§еп. Сапсег Кез. 63,1040-1045.
Κίηι СН, Вак КН, Κΐηι Υ8, Κΐιη 6М, Ко Υ, ОЬ 86, Κίηι КМ, Ноп§ ЕК (2000). Ехргеззюп οί Хепазст-С ίη азХгосуХю Хитогз: кз ге1еуапсе Хо ргоПГегаХюп апб апдюдепез15. Зигд Иеигок 54, 235-240.
Κΐιη ЗН, 1>аз К, Иогееп 3, СоГГтап Р, Натееб М (2007). РгодпозХю !тр1|саХюпз οί 1ттипоЬ1зХосЬет1са11у беХесХеб ΥΚί-40 ехргеззюп ΐη ЬгеазХ сапсег. \Уог1б б 5иг§ Опсо1 5, 17.
КкеЬегдег XV. Βονα ОЗ, ΝΐβΙββη ΜΕ, Нега\\л М, СЬиапд ΑΥ, ЕрзХеш 61, Вегтап ОМ (2007). Ко1ез Й>г хЬе зхет сеП аззоиаХеб тХегтеб1аХе ГбатепХ Иезбп ίη ргозХаХе сапсег гтдгаПоп апб теХазХазхз. Сапсег Кез. 67,9199-9206.
К1еп1 Т, 1лп§ Ζ, НеппЬегд Н, Мабзеп ОО, НеНег КЗ, Зегир Р (2003). Νθβίΐη Ϊ3 ехргеззеб ΐη уазси1аг епбохЬеПа! се11з ΐη хЬе абик Ьитап рапегеаз. б НДюсЬет. СуХосЬет. 57,697-706.
К1ет А'М, Άλι ВР, ΖΕβο 3,\Уи Н, Ккт-ЗгапХо Аб, ТаЬап ЗК (2007). 1псгеазеб ехргеззюп οί зхет сеП тагкегз ΐη таН§папХ те!апота. Моб. РаХЬок 20,102-107.
- 58 023013
КоЬауазЫ Н, Огтуа К, Κιιΐζ М( НиаЛе Е, ЗагоЬе Р, ЕазаЛе Ц, Негта1г М, Запдго В, РпеЕо ί, Воггаз-СиезЕа Р, СеИз Е (2002). 1беп(1Йса(1оп оГ ап апЕЁдешс срИоре Гог Ье1рег Т 1утрНосу(ез Ггот сагстоетЪгуотс апбдеп. СПп Сапсег Кез. 8, 3219-3225.
Копо Т, ЗМтоба М, ТакаНазМ М, Ма(зито(о К, УозЖтоЕо Τ, Μίζιιίβηΐ М, ТаЬа(а С, ОкозЫ К, ν/аба Н, КиЬо Н (2007). НптипоШзЕосНеписа! беЕесЕюп оГ (Не 1утрНа()с тагкег робор1атп ΐη б|уегее (урез οί Нитап сапсег сеИз изтд а ηονεί апЕЁЬобу. Ιηί I Опсо! 31, 501-508.
Козап Р, Рагкег А5, КиЬе ОМ, БоНзе СМ, ΕβΐδονΐοΗ ВС, В1и(е МБ, СНе\ П1е ДС, УазтаДгЁз С (2005). С1еаг сеН гепа1 сеН сагстота: депе ехргеззюп апа!узез ЁбепйГу а ро(епйа1 31дпа(иге Гог (итог ১гез51Уепез5. СНп Сапсег Кез. 11, 5128-5139.
Кгоез КА, Оа\узоп О, Мозка! ДК (2007). Росизеб тюгоаггау апа!узЁз оГ д!усо-депе ехргеззюп ΐη Нитап дНоЫазЮтаз. ДЦеигосЬет. 103 8ирр11, 14-24.
Кгопа А, Атап Р, Огпба! С, ДозеГззоп А (2007). Опсоз(а(1п М-тбисеб депез ΐη Нитап аз(госу1отаз. 1п(. Д Опсо1 31, 1457-1463.
КисНагсгак Д, Раппеяит Д, СатЪу I, Оесаез(ескег С, КДзз К, МаЛтег Д (2001). Оаз(гт тбисез оуег-ехргеззюп оГ депез ϊηνοίνεύ ίη Нитап 0373 дНоЫаз(ота сеН гтдгаЕюп. Опсодепе 20, 7021-7028.
Кисиг М, 1зтап РК, Ва1с1 С, Опа1 В, НааЬеккоДи М, Огкап р, О/кап А (2008). 8егит ΥΚΕ40 1еуе1з апб сНкоЕлоз^базе ас(т(у аз ро1еп<Да1 Ыотагкегз ϊη рптагу ргоз(а(е сапсег апб Ьетдп ргоз(а(ю Ьурегр1аз1а. Б1го1. Опсо126,47-52.
КипНага Н, гата А, Татига М, Такеба Д, ЗазакЁ Т, ТакеисН| Т (2000). ОИота/дНоЫазЮтазрес|Лс абепоУ1га! деле ехргеззюп изтд (Не пезйп депе геди!а(ог. Оепе ТНег. 7, 686-693.
Ба1 А, Ре(егз Н, 5( СВ, Нагооп 2А, Оеу/ЫгеЕ МАУ, 3(гаизЬегд КБ, Каапбегз ДН, уап бег Коде! АД, К|ддтз ОД (2001). ТгапзспрОопа! гезропзе (о Нурох1а ΐη Нитап (итоге. Д Ца(). Сапсег 1пз(. 93, 1337-1343.
Бетте1 С, \Уе!к 3, ЕЬег1е и, Бепд)е1 Д, Кгап Т, Вескег НО, Каттепзее НО, Згеуапоую 3 (2004). ОЁГГегепЕЁа! чиапШабуе апа1уз1з оГ МНС Ндапбз Ьу тазз зрес(готе(гу изтд з(аЫе 1зо(оре 1аЬеПпд. ИаЕ. Вю(есЬпо1. 22,450-454.
БепбаН! Б!, Ζίπιπιεπηαη БВ, МсКау КО (1990). ΟΝ8 з(ет сеИз ехргезз а пелу с!азз оГ 1п1егтеб1а(е Н1атеп( ргоЕет. СеН 60, 585-595.
Εΐ ДУ, АУапд Н, Мау 3, Зопд X, Риеуо Д, Ри11ег ΟΝ, АУапд Н (2008а). Сопзйшйуе асНуайоп оГ с-Дип Ν-ΙβηηΐηβΙ ктазе согге1а(ез ννΐίΗ Н1з(о1од1с дгабе апб ЕОРК ехргеззюп ΐη сНГГизе дПотаз. Д ΝειίΓΟοηοοΙ. 88, 11-17.
Εΐ Б, Хи Н, ЗраикНпд ВО, СНепд Б, ЗЁтоп К, Уао ДБ, 6ΐ ЗапСадпезе РА, Войте РА, Ниапд Д (2008Ь). Ехргеззюп оГКНА-Ътбтд ргоЕет ΙΜΡ3 (КОС) ίη Ьетдп ипЯНеНит апб иго(НеНа! (итоге. Нит. Ра(Ьо1.
- 59 023013
Фап£ МЬ, Ма Л, Но М, 8о1отоп Ь, ВоиЯе! Е, Ки1ка Л, Начуктз С (2008). Тугозте Ипаве ехргеззюп ϊη ре<йа1пс Ηί§Η §габе аЫгосуЮта. б Иеигоопсок 87,247-253.
Папе Υ, ВоНеп АIV, А1баре КВ, Оир1а N (2006). 14ис1еаг РАВР7 !ттипогеасйут1у ϊβ ргеГегепйаИу ехргеззеб ίη ϊηϊιΙϋΏΐΐνβ §Нота апб ϊβ аззос]а1еб ννϊΐΗ роог рго£поз1в ίη ЕОРКоуегехргеззт§ £НоЫа51ота. ВМС. Сапсег 6, 97.
Фап^ Υ, ϋϊβΗη Μ, \Уа1зоп Ν, ВоНеп ΑΧν, А1баре Κϋ, ΝΐοΗοΙβδ МК, ЬатЬот КК, Вег^ег М3, Βοιβίεΐη ϋ, ΒΐΌ\νη РО, 1згае1 МА (2005). Оепе ехргеззюп ргойПп§ геуеа!з то1еси1аг1у апб сНтсаНу 6Ϊ5ΐϊηοΙ зиЬ(урез οί§НоЫазЮта тикИогте. Ргос. Νβΐΐ. Асаб. Зек Ы. 5. А 702, 58145819,
Фао В, Ни Υ, Негпск ϋ6, Вгечлег С (2005). ТНе ΚΝΑ-Βίηάΐηβ ргсйет ΙΜΡ-3 Ϊ8 а 1гапз1а1юпа1 асЙуаЮгоГ шзийп-Нке §гоуйН ГасЮгП 1еабег-3 πιΚΝΑ бипп£ ргоПГегакоп оГ Нитап К562 1еикет1а се11з. 1 ΒίοΙ. СНет. 280, 18517-18524.
Фкаиа КА, Такеба Α, Сгиг 1, Εηηϊδ РА (1992). УассЫа укиз-зреекк Нитап Οϋ4+ сукйохю Т-1утрНосу1е с!опез. б У1го1. 66,2274-2280.
Фи М, Рагкег КМ, ОагЬу К, Еуге Ш, Соре1апб ΝΟ, СгачуГогб б, ОкЬег! ϋ6, 5и(Нег1апб ОК, бепктз ΝΑ, Негго§ Н (1999). ОРК56, а ηονβΐ зесгейп-Нке Нитап О-рго1е1п-соир1еб гесер1ог §епе. Оепотюз 55,296-305.
Фи 8, Отезйег С, СНагаГе-баиЙге! Е, Косо Н, К1еег СО, Мега)уег 8ϋ, ϋοηίυ О, ХХксЬа М3 (2008). ВКСА1 ге§и1а1ез Нитап таттагу з1ет/рго§епког сеП Га1е. Ргос 14аЙ. Асаб. Зек и. 8. А 105, 1680-1685.
Фи XV, Ри1пат АЬ, Хи-Υυ Ζ, 8ζοΙ ОЬ, Ьее МК, ΖΗυ 3, ОокПеЬ РА, Каргапоу Р, От§егаз ТК, бе 81 ОгобН ВР, С1ауЬег§ег С, Зорег ОМ, Ζϊβ§1βΓ 8Р, В1иез1опе 6А (2006а). СО 127 ехргеззюп 1пуегзе1у согге1а!ез \νϊ(Η РохРЗ апб зирргезз^уе Гипсйоп оГ Нитап СО4(+) Т ге§ сеПз. б Ехр. Меб 203, 1701-1711.
Фи X, СНеп Ν, \7ап£ X, Не Υ, СНеп X, Ниап§ Υ, Υΐη XV, ΖΗου 9 (2006Ь). Αρορΐοβίδ апб ргоНГегайоп тагкегз ϊη ббби5е1у тйкгайп§ аз!госу1отаз: ргоЯ1т$оГ 17 то1еси1ез. б ЦеигораЙю], Ехр. Неигок 65,905-913.
Ьо МЬ, Зикэапо 3, Раппопе О, М|£по§па Μϋ, Мап§ёю А, 8а1уа1оге О, ΟΗϊβίΏ Р, Тгатоп1апо ϋ, Бе КО, А1йеп ϋθ (2001). Ехргеззюп οίΐΗβ арорю$13 ΐηΗϊΗϊίΟΓ зипбут ίη ১гезз1Уе зциатоиз сеП сагстота. Ехр. Мо1. Ра1Ьо1. 70,249-254.
ЬиЬепзку ΙΑ, УоПтеуег АО, К1т 8, Ьопзег КК, Рагк ϋΜ, 1керН В, Ф б, ОкатоЮ Н,
ХУа1Ьг 1б§е 5, КузсНке\У11зсЬ С, Ма)ог Е, О1бЯе1б ЕН, гНиап§ Ζ (2006). 1бепйЯсайоп оГ (итог ргесигзог сеПз ϊη 1Не Ьгатз окрппийез ν/ϊίΗ габ|айоп-тбисеб бе ηονο ёПоЫазЮта тикИогте. СеП Сус1е 5, 452-456.
МасН В, 81е1т1е V, Магйпег-Зопа Е, КекН XV (1996). Кеди1айоп оГМНС с1азз II §епез: !еззопз Ггот а б!зеазе. Аппи. Кеу. 1ттипо1.14, 301-331.
- 60 023013
МаДета Е, За1т১1 А, Са1аюгго!о С, ЫпнДо Ь, Ροϊΐο В (2007). Νβδΐίη, РЯСРКЬе1а, СХС142 апД УЕСР ΐη 01 юта Райепй: Я1ЙегепХ РгоШез οί(Рго-Ап§Ю£ешс) Мо1еси1е Ехргеззюп Аге Ке1а1еД \υΐΐΗ Титог ОгаДе апД Мау Рго\тДе Ргодпозйс 1пГогтаДоп. Сапсег ΒίοΙ. Тйег. 6.
МаЫатак1 ЕН, ВаНипД М, Таппег М, Оогипоуа Ь, Иод1ипД М, КагНи К, КаШотетг А (2002). Ргедиеп! атрПйсайоп οί 8ς24, 11д, 17ς, апД 20я-зрес!йс депез ΐη рапсгеайс сапсег. Оепез СЬготозотез. Сапсег 35,353-358.
МакЬегек О, Опаи V, 81еуапоУ1с 8, Каттепзее НО, Дипд О, Ме1тз А (1994). Апа1уз13 οί а11е1е-зрес1Йс соп(ас1 зкез οί пахига! НЬА-ЯК17 НдапДз. ί 1ттипо1.153, 1141-1149.
Мап1С1 8, 8Хит1о1о Т, 1тго МА, Наттег 1, 8|т§а§||а Ρ, Νορρεη С, ЗрадпоН О, Μβζζΐ В, ВеИопе М, ЯеПаЬопа Ρ, Ргогй МР (1999). Ме1апота сеНз ргезепг а МАОЕ-3 ерйоре ΐο СЯ4(+) сую(ох1с ТсеНз ίη аззоаайоп ννίιΗ Н|з1осотрайЬШ1у кикосуХе апйдеп РКП, 1 Ехр. МеД 189, 871-876.
Мао Υ, ΖΗοιι Ь, ΖΗιι У/, У/апд X, Уап§ О, Χίε й, Мао X, ίΐη К (2007). РгоПГсгайус з1а(из оГ 1итог з(ет сеНз тау Ье согге1а1еД ννΐΐΗ тайдпапсу дгаДе οί Нитап аз1госу1отаз. Ргоп! Вюзск 12,2252-2259.
Магго АЬ, Клппеаг ВР, Йаке КА, РгеПпдег Я, СоШпз Εί, КоЬтзоп ВАУ, ЗсоИ В (2000), Титог-зрес1Йс СЯ4+ Т сеНз йауе а та)ог ”роз1-йсспз1п§ го!е ΐη СТЬ теД1а1еД апй-йипог йптипку. ί 1ттипо1. 165, 6047-6055.
Ме11а1 М, Са1Дега V, Райиссо Α, Αηηοναζζί Е, ЗсЫЯег Я (2008). Зигутп ехргеззюп ΐη дйоЫазЮтаз согге1а1ез ννίΐΗ ргоНГегайоп, Ьи1 ηοί ννΐΐΚ арорЮ315. Апйсапсег Кез. 28, 109-118.
М1зЫта К, КаГо Υ, Капеко МК, ЙйзЫкау/а К, Нйозе Т, Ма1зиХат М (2006). 1псгеазеД ехргеззюп οί роДор1атп ΐη тайдпап! азйосуйс Титогз аз а ηονβΙ то1еси1аг тагкег οί тайдпаш ргодгеззюп. Ас1а Ыеигора1йо1.111,483-488.
Мйа К, Со1ез ДЕ, О1иЬгесй£ ЯЯ, 8ипд К, Зип X, ОоДЬои! К (2007). В-РАВР-ехргеззтд гаД1а1 §На1 сеНз: 1йе тайдпап! дйота сеП οί οπβΐη? №ор1аз1а. 9, 734-744.
М1уа\уак1 Т, иетига А, Яегагуа М, Уи КТ, 1Де С, ЬДзЫкауга 5, НопДа Υ, ТапаЬе Υ, ТапаЬе Т (2004). Т1х, ап огрйап пис1еаг гесерюг, ге§и1а1ез сеП питйегз апД аз1госу!е Деуе1ортеп1 ΐη 1йе Дсуе1орт§ гейпа. Д Кеигозск 24, 8124-8134,
М|гикат1 Υ, Копо К, Яащо Υ, Такапо А, ТзипоДа Т, КагуадисЫ Υ, Иакатига Υ, Рц)й Н (2008). Яе1есйоп οί ηονβΐ сапсегЧезйз апйдеп-зреайс Т-се11 гезропзез ίη Т1Ь, гедюпа! 1утрЬ поДез, апД РВЬ ίη райеп1з χνίΐΗ езорйа§еа1 зчиатоиз сеП сагстота. Сапсег Зек
Мокй1ап К., Рапз 8, §шгге-Сгиг Ь, Рпуа! Ν, Сптеге Е, Мале Υ, Наиу/ ДД, Кщаз Μ, Ко\уксй О, Ноапд-Хиап К, Яе1акге ДУ, Запзоп М (2005). ОН§2 ехргеззюп, СРАР, р53 апД 1р 1озз апа1уз1з сопйДЬиГе ΐο §Нота зиЬс1азз)йсайоп. Ькигорайток Аррк Иеигойю!. 31, 62-69.
Мокгу Д, Огкоуа Я, ΡίΓιρ 8, Ейгтапп Д, Озкггекйег Д, Ко1аг Ζ, Еп§Изй Я (2004). ΝβΒΐΐη ехргеззюп Ьу пеуДу ГогтеД йитап ЫооД уекзе!з. 81ет СеНз Яеу. 13, 658-664.
- 61 023013
Могдап КА, Оиб1еу МЕ, АипбегНсН ЗК, НидНек М3, Уапд ДС, ЗНеггу КМ, Коуа! КЕ, ТораНап ЗЬ, Катти1а Ы8, КезйГо ΝΡ, ΖΗεη£ Ζ, №Ηνΐ А, бе Упез СК, Кодегз-Ргеегег Ы, Маугоикак13 ЗА, КозепЬег§ ЗА (2006), Сапсег Кедгеззюп ίη Райетз Айег ТгапзГег оГ ОепейсаПу Епдтеегеб ЬутрНосу1ез. Заепее.
МоПага Ь, Саз1е11агп Р, Меагга К, Той О, Ое Ьегта ВА, Ргосорю РА, Сотез Α, Ζεατάΐ Ь, Регпш 5, АссоИа КЗ (2006). СПТАчпбисеб МНС с1азз II ехргеззюп ίη таттагу абепосагстота 1еабз (о а ТЫ ро1апгайоп оГ (Не (итог пйсгоепубоптепй (итог ге)ес(юп, апб зреете атбитог тетогу. СНп Сапсег Кез. 12, 3435-3443.
ΝονεΙΗηο Ь, Саз(е1Н С, Раглнаш С (2005). А Нзйп§ оГНитап (итог апйдепз гесодшгеб Ьу Т сеПз; МагсН 2004 ирба(е. Сапсег 1ттипо1.1ттипо(Ьег. 54,187-207.
ΝυΙί СЬ, Ве(епзку КА, Вго»ег МА, Ва(сНе1ог ТТ, Ьошз ΟΝ, 8(еттег-КасНат]тоу АО (2005). УКЬ-40 Ϊ5 а б!Йегеп(1а1 б!а§позйс тагкег Гог Ь 13(о1о£1С зиЫурез оГЫдН-дгабе дНотаз. СНп Сапсег Кез. 11,2258-2264.
Νυίί СЬ, Ма((Не\У5 КТ, Носкйе1б 3 (2001). ОНа1 (итог туазюп: а го1е Гог (Не иргедиЫюп апб с!еауаде оГВЕНАВ/Ьгеуюап. №игозс1епНз1. 7, 113-122.
О’ОКзсоП Ь, ЬтеЬап К, С1упез М (2003). Зигутп: го1е ίη погта1 сеНз апб ΐη ра(Но!о§юа1 сопбкюпз. Сигг. Сапсег Огид Тагдегз. 3, 131 -152.
ОЫке Ν, ЗаЮ М, ШзауиЫ Т, 1та(ака Н, За(о 8, А аба У, Зако К, ТакаНазЫ Μ, Тарп Т, Киттига Т, МогоЬозЫ Т (2007). 1ттипоЫз(осЬет]са1 апа1уз1з оГпезйп апб с-кб апб (Неб 51£П1Йсапсе ΐη рапсгеайс (итогз. Ра(Ьо1.1п(. 57, 589-593.
Окаба У, ОНпо С, Ыек] К, Ο§ίηο М, Ка\уато(о 8, Κίηι Р (2007). Сотралзоп оГпитепса! сНапде оГ ер!бегта1 §το\ν(Η Гас(ог гесер(ог §епе атопд рге- апб розбжНайоп §Нота, апб §Ιίο3Ϊ3, апб кз сНшса! изе. Вгат Титог Рабюк 24, 15-18.
Огегбет и (2006), Тагдейпд оГ рег1су(ез бшЫзНез пеоуазсШапгайоп апб 1утрНапдюдепез15 ίη ргоз(а(е сапсег. Ргоз(а(е 66, 294-304.
Ρβί Ζ, Оеу ΝΑ, гшбегуааг! ММ, Ла Ζ, П У, ЗЮшЬегд 31, ЗтбН КО, Аа(ктз РА (2003). ТЬе асуЙСоА зуп(Ье(азе ЬиЬЫедит (Πρί6θ5ΐη): ГиПбег сНагасЮпгайоп апб го1е ίη пеигопа! ГаНу ас!б Ье(а-ох1ба(юп. ί Βΐοΐ. СЬет. 278,47070-47078.
Ре11озк1 СЕ, Ып Е, /Напд Ь, Уипд АК, Со1тап Н, 1ли Л,, Аоо ЗУ, Не!тЬег§ег АВ, 5ик1 О, Ргабоз М, СНапд 3, Вагкег РО, III, РиПег ΟΝ, А1баре КО (2006). Ргодпозйс аззоаайопз оГ ас(1Уа(еб тбо§еп-ас(|уа(еб ρτοΐείη ктазе апб Ак( ра(Н\уауз ίη дПоЫазЮта. СНп Сапсег Кез. 12, 3935-3941.
Ре11озк1 СЕ, МаНа)ап А, Маог М, СНапд ЕЬ, Аоо 3, ОПЬеп М, Со1тап Н, Уап§ Н, Ьебоих А, В1аб Н, Разве 3, Зепктз КВ, А1баре КО (2005). УКЬ-40 ехргеззюп Ϊ3 аззос!а(еб ννίίΗ роогег гезропзе (о гасПаРоп апб зкогХег оуегаП зитуа! ΐη дПоЫазЮта. СПп Сапсег Кез. 11, 33263334.
- 62 023013
Репаг РЬ, КЬозЬуотп 8, ВЬизЬап А, ΤπίΙοη ТК (1997). 1пЫЫйоп о£ер1беппа1 §го\\1Ь ГасЮг гесер1ог-аззос1а1еб1угоз1пе к!пазе Ыоскз ДюЫазЮта ίηνβδίοη оПЬе Ьгат. Кеигозигдегу 40, 141-151.
Реппа А, Ρον/кг Р, Вег1о1еШ Α, ОиИЬо1 8, Мозз В, Маг§о1зкее КР, СауаШ А, УаШ А, р|ассадоп Р, СЫзап РУ,. (1992), Нераййз В νϊηΐδ (НВУ)-зрес1Йс су1о1ох1с Т-сеП (СП ) гезропзе ίη Ьитапз: сЬагаскпгайоп οί НЬА с!азз Н-гез1Г1с1еб СТкз гНа1 Γβοο§ηϊζβ епбо§епоиз1у зуп1Ьез1/еб НВУ епуе1оре апН^епз. б Уко1, 66,1193-1198.
Репз Ь, ТЬегу М, Раите б, 8аоиб| Υ, ЬаГапесЬеге Ь, С Ιίί коп Ж, Оогбоп-АУеекз Р, Оа1]аг1 Ν, Вогпепз М, АУогбетап Ь, У/еЫапб 1, Апбпеих А, боЬ О (2006). ТиЬиНп (угозшайоп Ϊ5 а пирт ГасЮг аНесипр 1Ье гесгиктет οίСАР-О1у рго1ешз а! пнсго1иЬи1е р1 из епбз. ί СеП ΒίοΙ. 174, 839-849.
Реггу 1, Но Μ, νίβτο δ, ΖΗεη§ К, басоЬз К, Ткотег РЗ (2007). Тке ийегтесНаге Й1атеп1 пезйп Ϊ5 Ы§Ыу ехргеззеб ίη погта! Ьитап робосу1ез апб робосу1ез ίη §1отеги!аг скзеазе. Реб1а1г. Осу. Ра1ко1.10, 369-382.
Р1езсЬе М, НПбеЬгапб! Υ, Ζείΐΐ Р, СЬариу В, ЗсЬткг М, \Уи1 Г О, Тгитрег к, ЗсЬгоегз К (2007). ЫепйПсайоп οί а ргопизсиоиз НЬА ОК-гез1пс1еб Т-се11 еркоре бепуеб Ггот 1Ье тЫЬког о£ арор(оз18 ρτοίβίη 3ΐιτνίνίη. Нит. 1ттипо1. 68, 572-576.
Р|/7ара1 Ιί р, НадепЬисЬ В, Зп'едег В, К1епк С РоПсегз С, Μείετ Рб (2002). 1бепййса(юп οί а ηονβΐ Ьитап огеатс атоп Ггапзрогкпд ро1урерйбе аз а Ь!§Ь аГГтку (Ьугохте (гапзроПег. Мо1. Епбосппок 16,2283-2296.
Ргуог КЗ, Войте РА, Уапд 9, 5раи1бт§ ВО, ЗсоП ОА, Хи Н (2008). ΙΜΡ-3 Ϊ3 а поус! ргодгеззюп тагкег ίη та1|§пап( те1апота. Моб. Ра(Ьо1. 21, 431 -437.
Ρυτονν В, Зипбагезап ТК, Вигбкк Мб, Ке£аз В, Сотеаи Ь, На\уктзоп М, 8и 9, КоШагоу Υ, Ьее б, 2Ьап§ V/, Рте НА (2008). ΝοΙςΙι-Ι Кеди!а(ез Тгапзспрйоп οί (Ье Ер1бегта1 Ого\у(Ь Рас1ог КесерСог ТНгоидЬ р53. Сатсто£епез18.
9ίη Ζ, В1апкепз(еш Т (2000). С'О4+ Т сеП—теб!а1еб (итог ге)ес(юп ίηνοίνββ ϊηΗίΒίίίοη οί апдюдепезД (Ьа( Ϊ3 берепбеШ оп ΙΕΝ датта гесерЮг ехргеззюп Ьу попЬета(оро!ейс се11з. 1ттипку. 12, 677-686.
9ίη Ζ, ЗсН\\аг12корП'б, Ргабега Г, Каттепоепз Т, 8еИ§ег В, РнсЬег Н, В1апкепз(ет Т (2003). А спбса! гедшгетеп! οί ίηίετίετοη датта-теб1а(еб апдюз(аз15 ίοτ (итог ге)есйоп Ьу СО8+ Т секз. Сапсег Кез. 63,4095-4100.
9иатап(а М, ОПеНа К, Оате1е Α, Οί ТЗ, Уеппеп МТ, Ьо1Н I, ТгоссоП О (2007). Ер1бегта1 егоМЬ £ас(от гесерЮг зегит 1еуе1$ апб рго§позйс та1ие ίη таПдпап! дПотаз. Титоп 93,275280.
Каттепзее НО, ВасЬтапп б, ЕттепсЬ ΝΡ, ВасЬог ОА, 8(еуапоУ1с 3 (1999). 8ΥΡΡΕΙΤΗΙ: ба1аЬазе ίοτ МНС Н§апбз апб рерйбе токГз, Ьптиподепеисз 50, 213-219.
- 63 023013
Каттепзее,Н.О., ВасЬтаппД., апб 8Хеуапоу|С,8. (1997). МНС П§апбз апб Рерйбе МоХИз. 8рпп§ег-Уег1а§, Не]бе1Ьег§, Оегтапу).
Каттепзее НО, Рпебе Т, ЗХеуапоупс 8 (1995). МНС П^апба апб рерйбе тоИГз: ЯгзХ ПйОпц. 1ттипо§епеХюз 41, 178-228.
Кеуаг Ν, ТаууаЬ М, КЬап 8А, 3ΐ66ΐςυ€ Т (2005). Согге1аНоп οί £Па1 ЛЬпНагу ас|б]с ρΓοΙβΐη (ОРАР) ννίίΗ §габт§ οίχΗβ пеиго^Иа! Хитоигз. Д СоП. РЬуз1С1апз Зиг^. Рак. 75,472-475,
Κΐη§8Ηοΐ! М, Но§ба11 Εν, ДоЬапзеп 15, Рпсе РА, СНпзХепзеп Г.Н (2007). ΥΚ6-40 ргоХет ехргеззюп ίη погта1 аби!Х Ьитап Пззиез—ап (ттипоЫзХосЬеппса! зХибу. 7 ΜοΙ. ΗιβΙοΙ . 38,3343.
КозепЬег^ 8А, ЬоХге МТ, Мии! ЬМ, СЬап§ АЕ, Ανΐδ РР, Ьектап 3, ЬтеЬап 1УМ, КоЬейзоп С1Ч, Ьее КЕ, КиЫп ДТ,. (1987). А рго§гезз герои оп ХЬе ХгеаХтепХ οί 157 раЬепк \νίΧΐι абуапсеб сапсег изш§ 1утрЬокте-асХ1УаХеб кШег се11з апб тХег!еикт-2 ог ΗΐβΗ-бозе 1п1ег1еик1п-2 аГопе. Ν. Еп§1. Д. Меб. 316, 889-897.
КозепЬег§ ЗА, Раскагб В8, АеЬегзо1б РМ, 8о1отоп β, ТораНап ЗЕ, Тоу 8Т, 8ΐηιοη Р, Ьоке МТ, Уап£ ДС, 3βίρρ С А,, (1988). ЕГзе οί (итог-ίη ЫХгаНпд 1утрЬосуХез апб т(ег1еикт-2 ΐη (Ье 1ттипо(Ьегару οί раИсЫз χνίΐΗ те(аз(а(1с те1апота. А ргеНттагу герой. Ν. Εη§1. ί Меб 319, 1676-1680.
КозНпб А, ДоЬапзеп ДЗ, СЬпзХепзеп 1Д, Клзз К, ВаЫеу Е, №е1зеп ЦЬ, ΒεηΙζβη Д, Рпсе РА, Апбегзеп Е (2008). Ηΐ§Η зегит 1еуе1з οί ΥΚΕ-40 ΐη раПеп(з ν/ΐχΗ зциатоиз се11 сагстота οί (Не Ьеаб апб песк аге аззоааХеб ν/ίΐΗ зЬой зипбуак 1п(. Д Сапсег 722, 857-863.
Κιιΐζ С, Ниап§ λν, Не§1 МЕ, Ьап§е К, Натои МР, Р1ип Е, Оаке1еу ЕД, СЫциеХ-ЕЬпзтапп К, Огепб О (2004). ОгоуйН рготобп§ з^паНп^ Ьу Хепазст-С [соггес(еб]. Сапсег Кез. 64, 73777385.
ЗаЬаИш Р, Ре(есс1иа Ь, Тау(ап М, Добоп 6У, V, Козз( ОА, ВгоиХу-Воуе О (2005). Нитап ЬгопсГиа! ПЬгоЫазХз ехЫЬк а тезепсЬута! зХет се11 рЬепоХуре апб тиНШпеа^е б(ЙегепХ1аХт8 ро1епИаНПез. ЬаЬ Ιηνββΐ 85, 962-971.
5а1б1 А, ДауеггаХ 8, ВеИаЬсепе А, Ое УД, ВеИо Ь, СазХгопоуо V, Осргсг М, Ео1зеаи Н, В)кГа1 νί А, На^ебот М (2007). ЕхрептепХа! ап11-ап£ю§епез15 саизез ирге§и!аХюп οί §епез аззоаахеб \уЬЬ роог зигу|уа1 ΐη §НоЫазХота. 1пХ. Д Сапсег.
8а11о Τ, Απίΐη МТ, Наша 5, Ка)|\уага Υ, 8и§1уата К, Уатазак1 Р, Н)бака Т, Агка К, Кипзи К (2007). Зиппут зиЬсе!1и1аг 1осаПгаХюп ΐη Ь]§Ь-§габеазХгосуХотаз: зппи]Хапеоиз ехргеззюп ΐη Ьо(К пис1еиз апб суХор!азт Ϊ3 пе^аХке ргодпозЬс тагкег. Д Ыеигоопсок 82, 193-198.
Закигаба К, Зато М, Моип XV, ЗаХо А, Ккапака С, Кауата Т (2007). Νβδίΐη ехргеззюп ΐη сепХга! пегуоиз зузХет §егт сеП Хитогз. 1Чеигозиг§. Кеу,
Заг1ото-Клка1а М, Тзиртига Т, ЬепбаЫ и, ΜίβΙΧΐηβη М (2002). РаХХетз οί пезхт апб охЬег 1пХегтеб]аХе ШатепХ ехргеззюп 6Ϊ5Χίη§υ 1зЬ ЬеГкуееп ^азХготХезХта! зХгота! Хитогз, кютуотаз апб зсЬтппотаз. ΑΡΜΙ3 770,499-507.
- 64 023013
5азак1 Т, Ьорез МВ, Напктз ОК, Некп ОА (2002). Ехргеззюп οί зипбут, ап тЫЬйог οί арор(оз!з ρΓοίοίη, ϊη (итогз οί (Не пегуоиз зуз1ет. Ас(а Ыеигора1Гю1.104, 105-109,
За(о Р, АЬгаЬат ДМ, Υΐη Д. Кап Τ, Ιΐο Τ, Μοπ Υ, 11атϊ Ноп ДР, Дт Ζ, СНспд Υ, Раип В, Вегк( АТ, \Уапд 8, ЗЫтаба Υ, Мекгег 8Д (2006). ΡοΙο-бке ктазе апб зипбут аге езорЬадеа! 1шпогзрес!Йс ргото(еге. ВюсЬет. ВюрЬуз. Кез. Соттип. 342,465-471.
ЗсНасЫ V, Ьабгаз 88, ДоЬпзоп ЬА, Даскзоп ЭО, Нопд ΥΚ, Ое(таг М (2005). Ыр-геди1абоп οί (Не 1утрНабс тагкег робор1апт, а тист-(уре (гапзтетЬгапе д1усорго(ет, ϊη Нитап зяиатоиз се11 сагстотаз апб дегт се1] (итоге, Ат Д Ра(Но1. 166, 913-921.
ЗсЫГГег ϋ, Мапагга А, Татадпо I (2006). 1Чезбп ехргеззюп ϊη пеигоеркНеНа! (итоге.
Иеигозсъ Ьеб. 400, 80-85.
8сЫеде1 Д, Мегбез А, 8(итт О, А1Ьег( РК, Рогебпд М, Нупез Ν, К^еззПпд М (1994). АтрНЛсабоп οί (Не ер1бегта1-§го\у1Ь-Гас(ог-гесер1ог депе согге1а(ез ννϊΐΗ б1Йегеп( дгоуу(Ь ЬеЬауюиг ίη Нитап дНоЫазЮта. Ιηί. Д Сапсег 56,72-77.
8сН1еЬоГег В, В1еПпег М, РгезЮп-Магбп 8, ΝΐεΗοίΓΟ, УУаНгепбогГ Д, Агз1ап А, АН1Ьот А,
СЬо( ОПез СС, Но\\е СК, Ыб1е Д, Мепедог Р, Куап Р (1999). Ко1е οί тебюа! Ыз(огу ϊη
Ьгат (итоиг бе\е1ортеп(. КезиКз (гот (Не ш(ета(юпа! абиК Ьгат (итоиг з(ибу. Ιηί. Д Сапсег 82, 155-160.
ЗсНплб А, Оойеде V, ХкеЬег М, Меуег Д, Моззпег К, ЬезсН КР (2003). ТНе Ьгат-зресШс рго(ет МЬС1 1трбса(еб ίη теда!епсерНабс 1еикоепсерЬа1ора(Ну ννΐ(Η зиЬсогбса! суз(з >з ехргеззеб ϊη §На1 сеИ$ ϊη (Не типпе Ьгат. СНа 44,283-295.
8сНоепЬегдег 8Р, Тоез КЕ, уап б, V, ОГГппда К, МеПеГ СД (1998). Т-сеН Ье1р Гог су(о(охю Т 1утрНосу(ез Ϊ5 теб)а(еб Ьу СБ40-С040Ь т(егасбопз. Ыа(иге 393,480-483.
ЗсНиаПгЬаит Д, Допззоп Р, АЫЬот А, Ргез(оп-Магбп 8, Ьопп δ, ЗобегЬегд КС, РеусНбпд М (2003). СоЬог! з(иб(ез оГ аззослабоп Ьебуееп зе1Г-герог(еб аПегдю сопбКюпз, лттипе-ге1а(еб сНадпозез апб дбота апб тептдюта пзк. Ιηί. Д Сапсег 106,423-428,
ЗсН\уаг(гЬаит Д, Допззоп Р, АЫЬот А, Ргез(оп-Магбп 5, Ма1тег В, Ьопп 8, ЗобегЬегд К, РеусНбпд М (2005). Рпог Нозрбабгабоп Гог ерПерзу, б|аЬе(ез, апб збоке апб зиЬзедиеЫ дПота апб тептдюта пзк. Сапсег Ерлбетю!. Вютагкегз Ргеу. 14, 643-650.
ЗсНууесННелтег К, Ниапд 8, Сауепее У/К (1995). ЕОРК депе атрППсабоп--геаггапдетеп( ϊη Нитап дНоЫаз(отаз. Ιηί. Д Сапсег 62,145-148.
ЗспбеН СА, Саг1о(б СО, Дг., Окато(о ОК, Апбгабе УЗ, СоНе/ МА, Моба РД, Ьисю-Е(егоулс АК, Иебег Ь, КозетЬегд 8, ОЬа-ЗЫпр 8М, Мапе ЗК, Топе ЬС (2008). Оепе ехргеззюп ргоГНе апа1уз15 оГ рптагу дНоЫаз(отаз апб поп-пеор1азбс Ьгат бззие: лбепббсабоп οί ро(еп6а1 (агде( депез Ьу обдопис1еоббе гтсгоаггау апб геаЬбте циапб(абуе РСК. Д 1Чеигоопсо1.
- 65 023013
8еЬда1 А, Воупхоп АЬ, Уоипд КР, Уегтеикп 35, Уопешига КЗ, КоЫег ЕР, А Шаре НС, 8|тгеН СК, МигрЬу ОР (1998). Се11 абЬез1оп то1еси!е Νγ-САМ Ϊ3 оуег-ехргеззеб ίη Ьитап Ьгат Хитогз. ΙηΧ Л Сапсег 76, 451-458.
ЗеЬда! А, Кюкз 5, ХУаглск Л, ВоупХоп АЬ, МигрЬу ОР (1999). Апбзепзе Ьитап пеигодПа ге1ахеб се11 абЬезюп то!еси1е Ь№-САМ, гебисез (Ье Хитопдетс ргорегбея оГ Нитап дПоЫазХота сеПз. Апбсапссг Кез. 19,4947-4953.
ЗЬазЫбЬаг 5, ЬогепХе О, Иадауагари и, Νείβοη А, Кио Л, Ситттз Л, №коНсЬ К, игГег К, РоеЬг Ей (2005). ОРК56 Ϊ5 а ОРСК (ЬаХ)з оуегехргеззеб ϊη дНотаз апб ГипсХюпз ΐη (итог се!1 абЬезюп. Опсодепе 24, 1673-1682.
8Ьеб1оск ГН, ЗЬеп Н (2003). КецшгетепХ Гог СО4 Т се11 Ье1р ίη депегабпд Липсхюпа! СО8 Т се11 тетогу. Зскпсе 300, 337-339.
ЗЫЬаЬага Л, КазЫта Т, ЮкисЫ У, КишХа А, Рикауата М (2006). Роборктп 1з ехргеззеб ΐη зиЬзеХз оГ Хитогз оГ (Ье сепХга! пегуоиз зуз(ет. ХЧгсЬоууз АгсЬ. 448,493-499.
ЗЫЬ АН, НоПапб ЕС (2006). Νοίοίι з1дпаНпд епЬапсез пезхт ехргеззюп ίη дНотаз. №ор1а31а. 8,1072-1082.
ЗЫгаз А, СЬегбаг ЗТ, ЗЬера1 V, Ка)епбгап О, Ргазаб ОК, ЗНазХгу Р (2007). ЗропХапеоиз (гапзГогтабоп оГ Ьитап абиН попХитопдетс з(ет сеПз (о сапсег з(ет сеПз 1з бпуеп Ьу депогтс тзхаЬШху ϊη а Ьитап тобе) оГдНоЫазХота. 3(ет СеПз 25, 1478-1489.
ЗЬозХак К, ЬаЬипзкуу V, ЭпиХгепко V, МаНзЬеуа Т, ЗЬатауеу М, Когитепко V, 2оги1уа У, геЬетег О, Каузап V (2003). НС др-39 депе 13 иргеди!а(еб ΐη дНоЫазЮтаз. Сапсег ЬеХХ.198, 203-210.
ЗтдЬ ЗК, С1агке ГО, Ибе Т, Оикз РВ (2004а). Сапсег з(ет сеПз ίη пегуоиз зузХет (итоге. Опсодепе 23, 7267-7273.
ЗтдЬ ЗК, С1агке ГО, Тегазак] М, Вопп УЕ, НаМбпз С, Зяшге Л, Ойкз РВ (2003).
1бепббсабоп оГ а сапсег з(ет се11 ίη Ьитап Ьгат (итоге. Сапсег Кез. 63, 5821-5828.
ЗтдЬ ЗК, На\уктз С, С1агке ГО, Здипе ЛА, Вауат Л, Н(бе Т, Непке1тап КМ, Сиз1тапо Μϋ, Оккз РВ (2004Ь). Тбепббсабоп оГ Ьитап Ьгат (итоиг 1тбабпд сеПз. ИаХиге 432, 396-401.
ЗтдЬ-Лазща Н, ЕттепсЬ ΝΡ, Каттепзее НС (2004). ТЬе ТиЬтдеп арргоасН: ШепбПсабоп, зе!есбоп, апб уаббабоп оГ Хитог-аззос1аХеб НЬА рерббез Гог сапсег (Ьегару. Сапсег 1ттипо1. 1ттипо1Ьег. 53, 187-195.
ЗЬткоуа Ь, Мепбезе С, Ыи О, ν/оба ВА, Ьи ϋ, Эгеззег К, МоЬап(у 8, Коек КЬ, Л1апд Ζ (2008). ΙΜΡ3 ргебюХз аддгезз|уе зирегйс1а1 игоХЬеНа! сагстота оГ (Ье Ыаббег, СНп Сапсег Кез. 14,1701-1706.
8}0 А, Мадпиззоп КЕ, РеХегеоп КН (2005). АззоааХюп оГ а1рЬа-бузХгоЬгеут ννϊχΗ геогдашгтд бдЬхрпсбопз. Л МетЬг. ΒίοΙ. 203,21-30.
- 66 023013
Зрап ΡΝ, 8\уеер РС, ААНедеппск ЕТ, Т]ап-1I еупеп УС, Мапбегз Р, Веех ЬУ, бе Кок ДВ (2004). 5ιΐΓνΐνίη Ϊ5 ап шберепбеп1 ргодпозНс тагкег Гог пзк зйаНПсайоп оГЬгеазх сапсег райепСз. СНп СНет. 50,1986-1993.
ЗипбЛег ΝΕ, Оиуапд О, РападюЮрои1оз С, УегсЬеге СВ, Тап К, СгеепЪашп СД, Рбюкег С, Иерот СТ (2006). 1бепНЕсаНоп οΓΝονβΙ НЕА-А*0201-Кез1лс1еб Еркорез ΐη Кесеп1-Опзе1 Туре 1 О|аЬейс 8иЬ)ес1з апб АпйЬобу-РозШуе Ке1айуез. В|аЬе1ез 55, 3061-3067.
51го)п|к Т, Коз1апб СУ, Закапаззеп РО, Кауа1аг К, БаЬ Т (2007). Меига! з!ет сеП тагкегз, пезНп апб тизазМ рго1етз, ΐη (Не ргодгеззюп оГ Нитап дНота: согге1айоп оГ пезНп \νί(Η ргодпоз15 оГрайеш зигу|уак Зигд Цеигок 68, 133-143.
Зи АУ, СНеп Д, Уапд Н, Уои Б, Хи Б, АУапд X, Εΐ К, Сао Б, Си У, Εΐη 8, Хи Н, Вгеуег МО.
Нао СМ (2007). Ехргеззюп оГ пезНп ΐη 1Не робосу1ез оГпогта! апб б1зеазеб Нитап Шбпеуз, Ат Д РЬузю! Кедик 1п1едг. Сотр РЬузю! 292, К1761 -К.1767.
Зидахуага К, КипНага Н, ЦедЫи М, Зако Ν, Иакагаю У, Зазак! Т, ТакеисШ Т (2002). Νββίΐη аз а тагкег Гог ргоНГегайуе епбоШеПит ΐη дНотаз. БаЬ 1пуез1 82, 345-351.
Зип С, Уи КТ, Еуапз КМ, 3ΗΪ У (2007). ОгрНап пис1еаг гесерюг ТЕХ гесгикз ЫзЮпе беасе(у1азез Ю гергезз йапзспрйоп апб геди1а1е пеига! з1ет се!I ргоНГегайоп. Ргос 1Ча1к Асаб. Зек 11.5. А 104, 15282-15287.
Зип ДС, Веуап МД (2003). ВеГесЙуе СБ8 Т сеН тетогу ГоНолутд аси1е шГесНоп ν/кЬои! СБ4 Т сеН Ηβίρ. Зшепсе 300, 339-342.
Зи/икп Н, КаЮ У, Капеко МК, Окка У, ИаптаХзи Н, КаЮ М (2008). 1пбисНоп оГробор1ашп Ьу 1гапзГогттд дгоМН Гас1ог-Ье1а ίη Нитап НЬгозагсота. РЕВ8 Бей. 582, 341-345.
Зигик! Т, Магипо М, АУаба К, Кадара Ν, Риртою У, НазЫтоЮ Ν, ΙζυιηοΙο 3, УозЫтте Т (2004). ОепеНс апа1уз1з оГ Нитап дНоЫаз1отаз изтд а депогтс гтсгоаггау зуз1ет. Вгат Титог Рабюк 21, 27-34.
Такапо Т, Вескег БЕ (1997). Беуе1ортеп1а1 сЬапде оГхНе пезхтчттипогеасхШе гтбНпе гарЬе дИа1 зХгисХиге ΐη Нитап ЬгатзХет апб зрта! согб. Беу. Иеигозск 19, 202-209.
Тап НУ, Е1и Д, АУи ЗМ, Био Н8 (2005). Ехргеззюп оГ а ηονβΐ арорХоз15 кбиЬког-зипбУШ ίη со1огесха1 сагстота. АУог1б Д СазХгоепХего!. 11,4689-4692.
Тапууаг МК, ОПЬегХ МК, НоНапб ЕС (2002). Оепе ехргеззюп гтсгоаггау апа1уз!8 геуеа1з ΥΚΕ40 Хо Ье а роХепба! зегит тагкег Гог таНдпапХ сЬагасХег ίη Нитап дНота. Сапсег Кез. 62, 4364-4368.
ТегатзЫ Ν, Νηΐΐο Ζ, 1зН!\уа1а Т, Тапака Ν, Ригика\уа К, Зеуа Т, 8Ып]ί 3, ТаЦп Т (2007). 1бепНЛсаНоп оГ пеоуазси1аХиге изтд пезбп ΐη со1огесХа! сапсег. ΙηΙ. Д Опсо1 30, 593-603.
Тега1ап1 Т, ВотоХо Т, Кипк] К, Кадеуата Т, Такауата Т, 1зЫка\уа Α, Οζοηο 8, Νοζ^γλή К (2007). ВехесХюп оГ ХгапзснрХ Гог Ьгат-Хуре Гайу Асхб-Ътбхпд ρτοΐείη ΐη 1итог апб иппе оГ рабетз ννΐίΗ гепа! сеН сагстота. Еко1оду 69,236-240.
- 67 023013
ТЬотрзоп БМ, Οΐΐΐ ΟΝ (1985). ТЬе ЕСР гесерЮг: збъсшге, ге§и1абоп апб ро1епба1 го1е ΐη таП§папсу. Сапсег Зигу. 4, 767-788.
ТоЬуата Т. Ьее УМ, Котке ЬВ, Ματνίη М, МсКау КО, Тпцапохузк! ДЦ (1992). Иезбп ехргеззюп ΐη етЪгуошс Ьитап пеигоерНЬеНит апб ίη Ьитап пеигоеркЬеПа! (итог се11з. ЬаЬ ΙηνβδΙ 66, 303-313.
Тотрктз 8М, КоГа РА, Мооге ДС, Депзеп РЕ (1993). А еигоршт Пиоготлтипоаззау Гог теазипп§ Ыпбт§ οίапб§еп (о с1азз II МНС §1усорго1етз. Д 1ттипо1. МеЫобз 163,209-216.
Тоб Р, Ке§оИ Μ, Νβ3ΐ О, ОссЫт К, ВаПо1отте1 8, Ροηζί Ь, ВеПеШ Е (2005). Νεκίίη ехргеззюп ίη погта! абгепа! §1апб апб абгепосогбса1 Штогз. Ηί5ΐο1. №з(ора1Ьо1. 20, 11151120.
Тзиртига Т, МакНьЫ-ЗЫтоЬауазЫ С, ЬипбкУ1з1Д, ЬепбаЫ 1Д, ЬЫказЬо К, 8и§Ыага А, ууазак! Т, Мапо М, Уатаба Ν, УатазЬка К, Тоуозака А, Тегаба N (2001). Ехргеззюп οί Ые 1п1егтеб)а1е Я1атеп1 пезбп ίη ^азйчнЫезбпа! 51гота11итогз апб тТегзГίΐϊαΐ се11з οί Са)а1. Ат Д РаЫок158, 817-823.
Ыета1зи М, ОЬзахуа I, Аока§е Τ, Ν ΐ зН йпак! К, МаШитою К, ТакаЬазЫ Н, АзоЬ 8, ТегатоШ А, ОЬ1а 8 (2005). Рго^позбс 51§тПсапсе оГЫе 1ттипоЫзюсЬет1са1 тбех οίδΐιτνίνίη ίη ёПота. а сотрагабуе зшбу \νϊΐΗ Ые ΜΙΒ-1 тбех. Д ΝοϋΓοοικοΙ. 72,231-238.
уап ВПзеп ДН, уап ОН, Ьагб ЬК, уап б, V, ЕНеппк ОС, Ваккег АМ, МП(епЬиг£ АМ, НЫгтда ТУ, бе Упез КК, Тоез КЕ (2004). Рипсбопа! ге^гбаЮгу 1ттипе гезропзез а^атзГ Ьитап сагб1а§е §1усорго(ет-39 ίη ЬеаЬЬ уз. рготЯаттаЮгу гезропзез ϊη гЬеитаКлб агЫпбз. Ргос. КаИ Асаб. Зек и. 8. А 101, 17180-17185.
уап бег Вги£@еп Р, Тгауегзап С, СЬотег Р, Ьш-дшп С, Ое РЕ, Уап беп ЕВ, КпиЫ А, Вооп Т (1991). А §епе епсобш£ ап апб§еп гесофб/еб Ьу су1о1у11с Т 1утрЬосуГез оп а Ьитап те1апота. ЗЫепсе 254, 1643-1647.
Уапбегубпбеп ДМ, СШагб К, Ое Ьае1 МН, Меззат СА, ЗсЫГГтапп 3Ν (2002). О1зГпЬибоп оГ Ые 1п1егтеб|а1е П1атеп1 пезбп ίη Ые тизсШапз ргорпа οί Ые Ьитап £аз1гот1езбпа11гас1. СеП Чззие Кез. 309,261-268.
Уеегкатр ДН, /пптегтап А У (2001). Рабу аск)-ЫгмНп£ ргоитз οί пегуоиз бззие. Д Мок ΝβυΓΟΒΟΪ. 16,133-142.
Уезе1зка К, Ки^бк Р, Се)рек Р, ЗуасЬоуа Н, Иегабб Д, Ьо)а Т, КебсЬоуа Д (2006). Νεδίίη ехргеззюп ίη Ые сеН Нпез бепуеб Ггот ^НоЫазЮта тикНогте. ВМС. Сапсег 6,32.
У|ар1апо М3, Βί УЬ. Ρίσρηκίοτ Д, Носкбе1б 3, МабЬешз КТ (2005). Νονοί Штог-зреЫЯс (ЗоГогтз оГВЕНАВ/ЬгеУюап 1бепбПеб ίη Ьитап таН§пап1 §1ютаз. Сапсег Кез. 65,67266733.
У1ар1апо М8, НоскЯе1б 8, МабЬехуз КТ (2008). ВЕНАВ/Ьгеуюап геяииез ЛОЛМТ8-теб|а1еб рго1ео!убс с!еауа§е Го рготоХе §Пота туазюп. Д .Меигоопсо!.
- 68 023013
ХПдпегоп Ν, ЗхгооЬапХ V, СЬарио б, Оотз А, Оедюуапш О, Моге! 3, уап бег ВР, Βοοη Т, Уап Оеп Еупбе Вб (2004). Ап апх1дешс ρβριίάβ ргобисеб Ьу ρβρχΐάε зр1 1С1пд ίη хЬе ргохеазоте. Заепсе 304, 587-590.
УодХ АВ, КгорзЬоГег Н, Ка1ЬасЬег Н, Ка1Ьиз М, Каттепзее НО, СоНдап 6Е, МагХт К (1994). Ыдапб тоХИз оГНЬА4ЖВ5*0101 апб ϋΚΒΙ* 1501 то1еси1ез беНпеаХеб Ггот зе1Г-рерХ1без. б 1ттипо1.153, 1665-1673.
\Уа1Хег 3, Неггдеп Ь, ЗсЬоог О, бипд О, \УетеХ Э, ВиЬппд Нб, Каттепзее НО, Зхеуапоую 8 (2003). СиХХ1п§ ебде: ргебеХегттеб аучббу οί Ьитап СО8 Т се11з ехрапбеб оп саНЬгаХеб МНС/ап1]-С028-соаХеб тюгозрЬегез. б, 1ттипо1.171,4974-4978.
\Уапд 6С, Ь|У1пдз1опе АМ (2003). СиХХтд ебде: СЭ4+ Т сеП Ье1р сап Ье еззепЛа! Гог рптагу СО8+ Т сеП гезропзез ΐη νίνο. б бттипок 777, 6339-6343.
\Υβί ЬС, 8ЫМ, Сао К, СЬеп ЬАУ, СЬап Υ8 (2008). ΝββΧίη зта11 тХегГеппд ΚΝΑ (3ΪΚΝΑ) гебисез сеП дго\УХЬ ΐη сикигеб азХгосуХота се11з. Вгаш Кез. 1196, 103-112.
\УетзсЬепк Т, ОоиХХеГапдеаз С, ЗсЫНс М, ОЬегтауг Р, \Уа1Хег 5, ЗсЬоог О, Кигек К, Ьоезег V/, ВюЫег КН, АУетеХ О, Зхеуапоую 5, Каттепзее НО (2002). 1пХедгаХеб ХипсХюпа! депогшсз арргоасЬ Гог ХЬе без1дп оГраХ1епХ-тб!У1биа1 апХПитог уасстез. Сапсег Кез. 62, 5818-5827.
\У|ск1 А, ЬеЬетЬге Р, \Уюк Ν, НапХизсЬ В, КецазсЬИ ϋ, СЬпзХоГоп О (2006). Титог туазюп ΐη ХЬе аЬзепсе οί ер]ХЬеПа1-тезепсЬута1 Хгапз1Хюп: робор1ап1п-теб!аХеб гетобеНпд оГхЬе асХт суХозке!еХоп. Сапсег СеН 9,261-272, \νίηβΓ 8, Тзи1 Н, Ьаи А, Зопд А, 0 X, СЬеипд КК, Затрзоп А, АЛЛуап р, Е1Гогб А, баскохузИ О, Вескег ϋί, ЗапХатапа Р, ОЬазЫ Р, ОозсЬ НМ (2003). ЛиЮпптипе 1з1ех безХгисХюп ΐη зропХапеоиз Хуре 1 б^аЬехез Ϊ5 поХ Ьеха-сеП ехс!из1Уе. Иах. Меб 9,198-205.
\\'|гапо\узка М, Ьабб 3, ЗинХЬ ЗК, ОоХХзсЬаП РЕ (2006). СЭ44 абЬезюп то1еси)е апб пеигодНа1 ргоХеод1усап N02 аз туаз!уе тагкегз оГ дНота. Вгат СеН Βΐοΐ. 35, 159-172,
Χίε ϋ, Ζβη§ ΥΧ, \Уапд Нб, \Уеп 6М, Тао Υ, ЗЬат 68, Оиап ΧΥ (2006). Ехргеззюп οί суЮр1азтю апб пис1еаг 8ω·νΐνίη ΐη рптагу апб зесопбагу Ьитап дНоЫазХота. Вг. б Сапсег 94, 108-114.
Хи Ь, Ведит 8, Неат 60, Нупез КО (2006). ОРК56, ап аХур!са1 О рго!ет-соир1еб гесерХог, Ьтбз Х13зие ХгапздЫХаттазе, ТС2, апб тЫЫХз те1апота Хитог дгоМЬ апб теХазХаз1з. Ргос ИаН. Асаб. Зек и. 3. А 103, 9023-9028.
Хи Ь, Нупез КО (2007). ОРК56 апб ТО2: роззЖк го1ез ΐη зирргеззюп οί Хитог дгоМЬ Ьу Же гтсгоепутоптепХ. СеП Сус1е 6, 160-165.
УатазЫХа 8, Мазиба Υ, Кипгак! Т, Нада Υ, Мигауата Т, Тке! 8, Кате! М, Такепо 8, Ка\уаЬага К (2007). διηνΐνίπ ехргеззюп ргебюхз еаг!у гесипепсе ίη еаг!у-зхаде ЬгеазХ сапсег. АпХюапсег Кез. 27,2803-2808.
- 69 023013
Уапд 3, Рпсе МА, Иеибаиег СЬ, ΧΧ'ί 1зоп С, Реггопе 8, Χϊβ Н, Пба 3, Зтрзоп МА, МсСагХЬу 1В (2004). Ме1апота сЬопбгокт зиИаХе ргоХеод!усап епНапсез РАК апб ЕКК асбуаХюп Ьу сЛзХтсХ тесЬатзтз. 3 СеП ΒίοΙ. 165, 881-891.
Уапбзз КК, Созаг Е, РззсЬег АН (2008). Ызе оПМРЗ ϊη (бепббсабоп оГсагстота ίη Йпе пееб1е азриабоп Ьюрз1ез оГрапсгеаз. АсХа СуХок52, 133-138,
Уапбзз КК, ХУоба ВА, Рапдег ОК, Ка1оз М, \УЬа1еп ОР, Таба Н, Апбегзеп ОК, Коек КБ, Огеззег К (2005). КОС (К Ьото1оду ботат сопХаттд ргоХет оуегехргеззеб ΐη сапсег): а поуе! то1еси1аг тагкег ХЬаХ б1збпди!зНез Ьебуееп Ьешдп апб таНдпапх 1езюпз οί (Не рапегеаз. Ат Д Зигд Рабюк 29, 188-195.
Уее С, ТЬотрзоп ЗА, Вугб ϋ, К|ббе11 8К, КосЬе Р, СеПз Е, ОгеепЬегд РО (2002). Аборбуе Т сеП (Ьегару изтд апбдеп-зресШс СО8+ Т сеН с1опез Гог (Не (геа(теп( оГ рабепХз убхЬ те(аз1абс те!апота: ίη νίνο регз13Хепсе, пбдгабоп, апб апбХитог ейесХ οί (гапзГеггеб Т сеНз. Ргос. Иаб. Асаб. Зек и. 8. А 99, 16168-16173.
уизо-Заабо А, ОгаЬат С, Огееп Пе1б ЗР, Вооскуаг 1А (2006). ТЬе биаПХу оГ ер|бегта! дгоуДЬ ГасХог гесерХог (ЕОРК) з]дпаПпд апб пеига! з1ет сеП рНепоХуре: сеП епНапсег ог сеН (гапзГогтег? Сигг. 3(ет СеН Кез. ТЬег. 1, 387-394, /апдеп I, ΚηείΙζ 8, Мопогапи СМ, Ки(ко\узк1 8, Нткез В, Утсе ОН, Ниапд В, КоддепбогГХУ (2007). Ерепбутота депе ехргеззюп ргоГбез аззос1а(еб ννΐίΗ Н1з(о1од1са1 зиЬХуре, ргоПГегабоп, апб рабеп( зигу|уак АсХа ИеигораХНок 113, 325-337.
гагетЬа 8, Ваггада Ε, ΖΗιι М, Зоагез Ν, Тзапд КУ, ЗсЫот 3 (1997). МепбПсабоп оГ ап епНапсег адотзх сухохохю Т 1утрЬосу(е рерббе (гот Ьитап сагстоетЬгуотс апбдеп. Сапсег Кез. 57,4570-4577.
гажоск! А, В|ета( У? (2005). Ер1бегта1 дгоМЬ ГасХог гесерХог ϊη дНоЫазХота. Роба №игораХЬо1. 43, 123-132.
ΖβΗ Ш, III, Реггу-Бабеу О, Оиб1еу МЕ, КозепЬегд 8А, Уапд ГС (1999). ШдЬ ανίάίΐχ СТБз Гог Χ\νο зе1Г-апХ1депз бетопзХгаХе зирепог ΐη νίίτο апб ίη νίνο ап(1(итог еййсасу. 3 1ттипок 162, 989-994.
гНеп ΗΝ, гЬапд X, Ни ΡΖ, Уапд ТТ, Ρβί Ζ, гЬапд 3Ν, Ри БА, Не ХЗ, Ма РС, ХУапд ХБ (2005). δυτνίνΐη ехргеззюп апб ΪΧ3 ге1абоп А1ХЬ ргоПГегабоп, арорХоз18, апб апдюдепез15 ΐη Ьгат дНотаз. Сапсег 104, 2775-2783.
ΖΗεη£ XV, Υί X, Рабате О, Б]апд ЗХ, МагХе! М, ЗсЬлуагХг РЕ, Зхапд Ζ (2008). ТЬе опсоГеХа! ргоХет ΙΜΡ3: а ηονβΙ Ьютагкег Гог епботеХпа! зегоиз сагстота. Ат 1 8игд РаХЬок 32, 304315.
гЬои К, Зка1П О (2000). ТОР-а1рЬа ббТегепба! 1у геди1аХез ОРАР, νίηιβηΧΐη, апб пезХт депе ехргеззюп ίη и-373 МО дНоЫазХота сеПз: согге!ахюп ννΐχΗ сеН зНаре апб тоХШХу. Ехр. СеН Кез, 254, 269-278.
- 70 023013 ггттсгтап Ь, Рагг В, ЬепбаЫ и, СиптпдЬат М, МсКау К, Саут В, Мапп Д, УаззНеуа О, МсМаЬоп А (1994). 1пберепбеп1 ге§и1а1огу е!етеп1з ϊη 1Ье ηεκίίη депе бйес!1гапздепе ехргеззюп 1о пеига1 з1ет сеНз ог тизс1е ргесигзогз, Цеигоп 12, 11-24.
Ζϊιι М, 5сЬпиб1 N0, СагдюН ТС, АЬообу КЗ, В1аск РМ, СаггоП КЗ (2006). СНота-ргобисеб ех1гасе11и!аг та1пх тбиепссз Ьгат 1итог 1гор1зт оГИитап пеига! з1ет сеНз. Д Яеигоопсок 79, 125-133.
гик1е1 К, Νον/ак 5, У/узгко Е, Ко11е К, Салугопзка I, Ватзгелузка ΜΖ, Вагс1згелузк1 Д (2006). Зирргеззюп оГ Нитап Ьгат (итог \νί(Η тТОгГегепсе ΚΝΑ зресШс Гог (епазст-С. Сапсег ΒίοΙ. ТНег. 5, 1002-1007.
ги1с\узк1 Н, АЬгаЬат ЕД, Оег1асЬ МД, Оаше1 РВ, ΜοπΙζ V/, МиПег В, Уа11е)о М, ТНотаз МК, НаЬепег ДР (2001). МиШрогепНа! пезбп-розШуе 51ет сеНз !зо1а1еб йот абиН рапсгеайс 1з1егз бПТегепйаТО ех νίνο ίηΐο рапсгеайс епбосгте, ехосппе, апб Нерайс рЬепо1урез. В^аЬеЮз 50, 521-533.
Список последовательностей
<110> тттаМсз ЫоРесЬпо1од1ез СшЬН
<120> Новая иммунотерапия против нескольких видов опухолей.
нейрональные опухоли и опухоли головного мозга
<130> Ι31774ΕΑ
<150> ЕР08017305.7
<151> 2008-10-01
<150> ЕР08017921.1
<151> 2008-10-13
<150> 0361/105,928
<151> 2008-10-16
<160> 30
<170> РаРепЫп νβΓΒίοη 3.4
<210> 1
<211> 9
<212> РКТ
<21Э> Ното зартепз
<4 00> 1
Азп Ьеи Азр ТЬг Ьеи Мер ТЬг Туг Уа1
1 5
<210> 2
<211> 9
<212> РКТ
<213> Ното зарЬепз
<400> 2
Туг Ьеи Не АЬа <31у 1Ье ТЬе Зег Ьеи
1 5
<210> 3
<211> 9
<212> РКТ
<213> Ното зархепз
<400> 3
Ьуэ 11е Ме£ СЬи Агд ТЬе СЬп СЬи Уа1
1 5
<210> 4
<2ΐι> 9
<212> РКТ
<213> Ното зарЬепз
<400> 4
РЬе Ьеи СЬу Азр Рго Рго СЬи Ьуз Ьеи
- 71 023013
1 5
<210> 5
<211> 9
<212> РЕТ
<213> Ното зар1епз
<400> 5
АЬа Ьеи Тгр А1а Тгр Рго Зег <31и Ьеи
1 5
<210> 6
<211> 9
<212> РЕТ
<213> Ното зархепз
<400> 6
ТЬг Ьеи Туг С1у МеЪ Ьеи Азп ТЬг Ьеи
1 5
<210> 7
<211> 9
<212> РЕТ
<213> Ното зархепз
<400> 7
Зег Ьеи Азп С1и Ъеи Агд УаЬ Ьеи Ьеи
1 5
<210> 8
<211> 9
<212> РЕТ
<213> Ното зархепз
<400> 8
Ъуз Ъеи С1п Азр С1и А1а Туг 61п Уа1
1 5
<210> 9
<211> 10
<212> РЕТ
<213> Ното зархепз
<400> 9
А1а Ъеи А1а Уа1 Ъеи Зег Азп Туг Азр АЬа
1 5 10
<210> 10
<211> 9
<212> РКТ
<213> Ното зархепз
- 72 023013 <400> 10
Ьеи ТЬг РЬе С1у Аэр Уа1 Уа1 А1а Уа1
1 5
<210> 11
<211> 9
<212> РКТ
<213> Ното зарьепэ
<400> 11
Аэп Ьеи А1а 61п Азр Ьеи А1а ТЬг Уа1
1 5
<210> 12
<211> 9
<212> РКТ
<213> Ното эарЬепз
<400> 12
РЬе Ьеи Ьеи Зег С1и Рго Уа1 А1а Ьеи
1 5
<210> 13
<211> 9
<212> РКТ
<213> Ното зархепз
<400> 13
Аэп Не ι Ьеи С1и С1п 11е Уа1 Зег Уа1
1 5
<210> 14
<211> 9
<212> РКТ
<213> Ното эараепз
<4 00> 14
Ьуэ 11е ί <31п С1и 11е Ьеи ТЬг С1п Уа1
1 5
<210> 15
<211> 9
<212> РКТ
<213> Ното эарЬепз
<400> 15
Зег Уа1 7а1 61и Уа1 11е А1а 61у 11е
1 5
<210> 16
<211> 9
<212> <213> РКТ Ното зарЬепз
<400> 16
С1у Ьеи 61п Зег С1п Не А1а С1п 7а1
1 5
<210> <211> <212> <213> 17 9 РКТ Ното зарЬепз
<400> 17
Зег Ьеи С1п С1и Азп Ьеи Е1и Зег Ьеи 1 5
<210> <211> <212> <213> 18 11 РКТ Ното зарЬепз
<400> 18
РНе Ьеи РЬе Рго С1у ТЬг С1и Азп СХп С1и Ьеи
1 5 10
<210> <211> <212> <213> 19 9 РКТ Ното зар!епз
<400> 19
Азп Ьеи А1а Е1и 51и Ьеи С1и С1у 7а 1
1 5
<210> <211> <212> <213> 20 9 РКТ Ното зарЬепз
<400> 20
Ьуз 11е 11е Зег С1и 11е 61п А1а Ьеи
1 5
<210> <211> <212> <213> 21 9 РКТ Ното зариепз
<400> 21
С1у Ьеи Тгр НЬз НЬз С1п ТЬг 6Ьи Уа1 1 5
- 74 023013
<210> <211> <212> <213> 22 9 РЕТ Ното зарХепз
<4ОО> 22
ТЬг Ьеи Уа1 С1у 11е Не Уа1 С1у Уа1
1 5
<210> <211> <212> <213> 23 9 РЕТ Ното зарХепз
<400> 23
А1а МеЬ ТЬг С1п Ьеи Ьеи АХа С1у Уа1
1 5
<210> <211> <212> <213> 24 9 РЕТ Ното зарХепз
<400> 24
ЕХп Ьеи Ьеи А1а С1у Уа1 РЬе Ьеи А1а
1 5
<210> <211> <212> <213> 25 9 РЕТ Ното зарХепз
<400> 25
ТЬг МеЬ Ьеи А1а Агд Ьеи АХа 5ег АХа
1 5
<210> <211> <212> <213> 26 15 РЕТ Ното зартепз
<400> 26
ТЬг Ьеи СХу СХи РЬе Ьеи Ьуз Ьеи Азр Агд СХи Агд АХа Ьуз Азп 15 10 15
<210> <211> <212> <213> 27 15 РЕТ Ното зартепз
<400> 27
- 75 023013
ТЬг Ьеи СЬу СЬи РЬе Ьеи Ьуз Ьеи Азр Агд СЬи Агд А1а Ьуз Азр
1 5 10 15
<210> 23
<211> Э
<212> РЕТ
<213> Ното зарйепз
<400> 28
РЬе ТЬг СЬи Ьеи ТЬг Ьеи СЬу СЬи РЬе
1 5
<210> 29
<211> 9
<212> РКТ
<213> Ното зарйепз
<400> 29
Ьеи МеС Ьеи СЬу СЬи РЬе Ьеи Ьуз Ьеи
1 5
<210> 30
<211> 9
<212> РЕТ
<213> Ното зарЬепз
<400> 30
СЬи Рго Азр Ьеи А1а С1п Суз РЬе Туг
5

Claims (21)

1. Пептид, индуцирующий противоопухолевый иммунный ответ, где указанный пептид имеет общую длину между 8 и 16 аминокислот и включает последовательность, которая выбирается из группы δΕΟ ГО №. 1-9, 11-13, 15-24 и 26-30, где указанный пептид связывается с молекулой главного комплекса гистосовместимости человека (МНС) класса I или II и где указанный пептид способен стимулировать Тклетки СГО4 и/или СГО8.
2. Пептид по п.1, где указанный пептид имеет аминокислотную последовательность согласно δΕΟ ГО №. 1-9, 11-13, 15-24 и 26-30.
3. Пептид по п.1 или 2, где указанный пептид включает непептидные связи, выбранные из группы СЪ-ЫН, -СН28-, -СН2СН2-, -СН=СН-, -СОСН2-, -СН(ОН)СН2- и -ОД£О-.
4. Пептид по любому из пп.1-3, где указанный пептид является белком слияния, в частности включающего Ν-терминальные аминокислоты антиген-ассоциированной инвариантной цепи (Σί) НЬЛ-ΌΚ.
5. Нуклеиновая кислота, кодирующая пептид по любому из пп.1-4.
6. Вектор, способный экспрессировать нуклеиновую кислоту по п.5.
7. Клетка-хозяин, включающая нуклеиновую кислоту по п.5 или вектор по п.6, где указанная клетка-хозяин является антигенпрезентирующей клеткой, или дендритной клеткой.
8. Способ получения пептида по любому из пп.1-4, включающий культивирование клетки-хозяина по п.7, которая экспрессирует нуклеиновую кислоту по п.5 или вектор по п.6, и выделение пептида из клетки-хозяина или его культуральной среды.
9. Способ получения активированных цитотоксических Т-лимфоцитов (ЦТЛ) ίη νί!ΐΌ, включающий контактирование ЦТЛ ίη У11го с нагруженными антигеном молекулами человека МНС I или II класса, экспрессированными на поверхности подходящей антигенпрезентирующей клетки или искусственной конструкции, имитирующей антигенпрезентирующую клетку, на период времени, достаточный для активации указанных ЦТЛ антиген-специфическим образом, где указанный антиген является пептидом по любому из пп.1-3.
10. Активированный цитотоксический Т-лимфоцит (ЦТЛ), полученный с помощью способа по п.9, который селективно распознает клетку, которая аберрантно экспрессирует полипептид, включающий аминокислотную последовательность, представленную в любом из пп.1-3.
11. Антитело, которое специфически связывается с пептидом по пп.1, 2 в комплексе с главным комплексом гистосовместимости человека (МНС) класса I или II, где указанным антителом предпочтительно является поликлональное антитело, моноклональное антитело и/или химерное антитело.
12. Применение пептида по любому из пп.1-3 для изготовления вакцины для лечения рака.
13. Применение нуклеиновой кислоты по п.5 для изготовления вакцины для лечения рака.
14. Применение вектора по п.6 для изготовления вакцины для лечения рака.
- 76 023013
15. Применение клетки-хозяина по п.7 для изготовления вакцины для лечения рака.
16. Применение активированного цитотоксического Т-лимфоцита по п.10 для изготовления вакцины для лечения рака.
17. Применение антитела по п.11 для изготовления вакцины для лечения рака.
18. Применение по любому из пп.12-17, где указанный рак выбирается из астроцитомы, пилоидной астроцитомы, дисэмбриопластической нейроэпителиальной опухоли, олигодендроглиомы, эпендимомы, мультиформной глиобластомы, смешанных глиом, олигоастроцитомы, медуллобластомы, ретинобластомы, нейробластомы, герминомы, тератомы, ганглиоглиомы, ганглиоцитомы, центральной ганглиоцитомы, примитивных нейроэктодермальных опухолей (РМЕТ, к примеру, медуллобластомы, медуллоэпителиомы, нейробластомы, ретинобластомы, эпендимобластомы), опухолей паренхимы шишковидной железы (к примеру, пинеоцитомы, пинеобластомы), опухолей, развивающихся из эпендимных клеток, опухолей хориоидного сплетения, нейроэпителиальных опухолей неопределенного происхождения (к примеру, глиоматоза головного мозга, астробластомы), глиобластомы, опухоли предстательной железы, рака груди, рака пищевода, колоректального рака, светлоклеточной почечно-клеточной карциномы, рака легких, ЦНС, яичника, меланомы, рака поджелудочной железы, плоскоклеточной карциномы, лейкемии или медуллобластомы, опухолей толстого кишечника, прямого кишечника, желудка, почек, легких, поджелудочной железы, предстательной железы, кожи.
19. Набор для индукции противоопухолевого иммунного ответа, включающий:
(a) контейнер, который содержит фармацевтическую композицию, содержащую пептид по любому из пп.1-4, нуклеиновую кислоту по п.5, вектор по п.6, клетку по п.7, активированный цитотоксический Тлимфоцит по п.10 или антитело по п.11 в буферном растворе или в лиофилизованной форме;
(b) второй контейнер, содержащий буферный разбавитель или восстанавливающий раствор для лиофилизованного состава.
20. Набор по п.19, дополнительно включающий инструкции по использованию раствора или восстановлению и использованию лиофилизованного состава.
21. Набор по п.19 или 20, дополнительно содержащий фильтр, иглу или шприц.
- 77 023013
а) РАВР7 (РгоЬезес ГО: 205030_а!) зсс.о·, гв1ав ν· «хрге*«1ол κίββν· ехргедеЮл
- 78 023013
Фиг. 2Ь
- 79 023013
ΓβΙβΙΐνβ ехргезз!оп -> относительная экспрессия абгела! д!апб -> надпочечная железа иппагу Ыаббег-> мочевой пузырь
Ьопе тагго«г-> костный мозг
Ьгеаз1-> молочная железа аПегуЭ артерия νθίη-> вена ννήοΐβ Ьга1п-> головной мозг в целом
С019+1утрЬосу1ез-> лимфоциты СО19+
СОЗ+ 1утрЬосу1ез-> лимфоциты СОЗ+ к(еппе семх-> шейка матки со1оп-> толстая кишка
1еикосу1ез, бепбпйс -> лейкоциты, дендритные езорНадиз-> пищевод
Ьеаг1-> сердце кйпеу-> почка
1еикосу(ез-> лейкоциты
ΙίνβΓ-> печень
1утрГ| побе-> лимфоузел
1ипд-> легкие оуагу-> яичник рапсгеаз-> поджелудочная железа р1асеп1а-> плацента ргоз1а{е-> предстательная железа заМуагу д1апб-> слюнная железа зта111п(ез(1пе-> тонкий кишечник зк1п-> кожа зке1е1а1 тизс1е-> скелетные мышцы зр1еел-> селезёнка з1отасГ|-> желудок
1ез118-> семенник №утиз-> вилочковая железа
1Ьугой-> щитовидная железа и!егиз-> матка
EA201100586A 2008-10-01 2009-09-28 Пептид, индуцирующий противоопухолевый иммунный ответ, и его применение EA023013B1 (ru)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP20080017305 EP2172211B1 (en) 2008-10-01 2008-10-01 Composition of tumor-associated peptides and related anti-cancer vaccine for the treatment of glioblastoma (GBM) and other cancers
EP08017921.1A EP2172212B1 (en) 2008-10-01 2008-10-13 Novel immunotherapy against several tumors including neuronal and brain tumors
US10592808P 2008-10-16 2008-10-16
PCT/EP2009/006980 WO2010037514A2 (en) 2008-10-01 2009-09-28 Novel immunotherapy against several tumors including neuronal and brain tumors

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA201100586A1 EA201100586A1 (ru) 2011-10-31
EA023013B1 true EA023013B1 (ru) 2016-04-29

Family

ID=40342382

Family Applications (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201100586A EA023013B1 (ru) 2008-10-01 2009-09-28 Пептид, индуцирующий противоопухолевый иммунный ответ, и его применение
EA201401104A EA032437B1 (ru) 2008-10-01 2009-09-28 Композиция опухолеассоциированных пептидов и относящаяся к ним противораковая вакцина для лечения глиобластомы (gbm) и других видов рака
EA201100587A EA023378B1 (ru) 2008-10-01 2009-09-28 Композиция опухолеассоциированных пептидов и относящаяся к ним противораковая вакцина для лечения глиобластомы (gbm) и других видов рака

Family Applications After (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201401104A EA032437B1 (ru) 2008-10-01 2009-09-28 Композиция опухолеассоциированных пептидов и относящаяся к ним противораковая вакцина для лечения глиобластомы (gbm) и других видов рака
EA201100587A EA023378B1 (ru) 2008-10-01 2009-09-28 Композиция опухолеассоциированных пептидов и относящаяся к ним противораковая вакцина для лечения глиобластомы (gbm) и других видов рака

Country Status (25)

Country Link
US (19) US8119139B2 (ru)
EP (12) EP2172211B1 (ru)
JP (10) JP5855940B2 (ru)
KR (6) KR102392070B1 (ru)
CN (3) CN106986919A (ru)
AU (2) AU2009300088B2 (ru)
BR (2) BRPI0920791B8 (ru)
CA (9) CA2936868C (ru)
CY (11) CY1116302T1 (ru)
DK (12) DK2172211T3 (ru)
EA (3) EA023013B1 (ru)
ES (12) ES2536465T3 (ru)
HK (2) HK1159526A1 (ru)
HR (12) HRP20201025T8 (ru)
HU (11) HUE031030T2 (ru)
LT (10) LT2172212T (ru)
MX (3) MX2011003540A (ru)
NZ (4) NZ624533A (ru)
PL (12) PL2172211T3 (ru)
PT (12) PT2172211E (ru)
RS (12) RS53782B1 (ru)
SI (12) SI2172211T1 (ru)
TR (2) TR201900809T4 (ru)
UA (3) UA110599C2 (ru)
WO (2) WO2010037514A2 (ru)

Families Citing this family (107)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006023598A2 (en) 2004-08-19 2006-03-02 University Of Maryland, Baltimore Prostate-specific antigen-derived mhc class ii-restricted peptides and their use in vaccines to treat or prevent prostate cancer
WO2006034334A2 (en) 2004-09-21 2006-03-30 University Of Pittsburgh Of The Commonwealth System Of Higher Education Peptide analogs capable of enhancing stimulation of a glioma-specific ctl response
PT2660248E (pt) * 2007-07-27 2015-10-12 Immatics Biotechnologies Gmbh Nova imunoterapia para tumores neuronais e cerebrais
ATE462442T1 (de) * 2008-04-30 2010-04-15 Immatics Biotechnologies Gmbh Neuartige formulierungen von tumor-assoziierten peptiden, welche an menschliche leukozytenantigene der klasse i oder ii für impfungen binden
NO2119726T3 (ru) 2008-05-14 2015-05-23
EP2172211B1 (en) 2008-10-01 2014-12-03 Immatics Biotechnologies GmbH Composition of tumor-associated peptides and related anti-cancer vaccine for the treatment of glioblastoma (GBM) and other cancers
TW201124530A (en) * 2009-12-01 2011-07-16 Oncotherapy Science Inc IMP-3 oligopeptides and vaccines including the same
SE535982C2 (sv) * 2009-12-15 2013-03-19 Theravac Pharmaceuticals Ab Ett nytt vaccin som angriper tumörkärl som ett effektivt redskap i tumörterapi
GB201004551D0 (en) 2010-03-19 2010-05-05 Immatics Biotechnologies Gmbh NOvel immunotherapy against several tumors including gastrointestinal and gastric cancer
AU2015200751B2 (en) * 2010-03-19 2016-11-10 Immatics Biotechnologies Gmbh Novel immunotherapy against several tumors including gastrointestinal and gastric cancer
MX353165B (es) * 2010-08-24 2017-12-20 Univ Of Pittsburgh Of The Commonwealth System Of Higher Education Star Vacunas contra el cancer cerebral basadas en peptido alfa 2 del receptor de interleucina 13.
WO2012075490A2 (en) * 2010-12-03 2012-06-07 Duke University Anti-podoplanin antibodies and methods of use
NZ609916A (en) * 2010-12-14 2015-03-27 Immatics Biotechnologies Gmbh Hla-binding peptides derived from prostate-associated antigenic molecules and methods of use thereof
WO2013052158A2 (en) * 2011-04-26 2013-04-11 William Marsh Rice University Targeted nanovectors and their use for treatment of brain tumors
ES2856091T3 (es) * 2011-09-14 2021-09-27 Univ Northwestern Nanoconjugados capaces de atravesar la barrera hematoencefálica
GB201120779D0 (en) * 2011-12-02 2012-01-11 Immodulon Therapeutics Ltd Cancer therapy
JP2015511936A (ja) * 2012-01-20 2015-04-23 ブラウン、デニス 多形神経膠芽腫及び髄芽腫を含む新生物疾患及び癌幹細胞を処置するためのジアンヒドロガラクチトール及び類似体を含めた置換ヘキシトールの使用
US10704021B2 (en) 2012-03-15 2020-07-07 Flodesign Sonics, Inc. Acoustic perfusion devices
CN103372217B (zh) * 2012-04-28 2014-12-10 中国科学院深圳先进技术研究院 聚合物纳米载体制剂及其制备方法和应用
DK3536334T3 (da) 2012-05-16 2021-09-13 Stemline Therapeutics Inc Cancer stamcelle målrettede cancer vacciner
CN112587658A (zh) * 2012-07-18 2021-04-02 博笛生物科技有限公司 癌症的靶向免疫治疗
TWI819228B (zh) * 2013-08-05 2023-10-21 德商伊瑪提克斯生物科技有限公司 新穎肽類，細胞及其用於治療多種腫瘤的用途，其製造方法及包含其等之醫藥組成物（八）
CN110041403B (zh) * 2013-08-05 2023-03-10 伊玛提克斯生物技术有限公司 针对多种肿瘤例如包括nsclc在内的肺癌的新型免疫疗法
GB201319446D0 (en) 2013-11-04 2013-12-18 Immatics Biotechnologies Gmbh Personalized immunotherapy against several neuronal and brain tumors
MX2019013161A (es) * 2013-11-04 2020-02-03 Immatics Biotechnologies Gmbh Inmunoterapia personalizada contra diversos tumores cerebrales y neuronales.
CN104698059B (zh) * 2013-12-04 2017-07-21 苏州中赢医疗科技有限公司 一种脑胶质瘤肿瘤标志物及其应用
GB201322725D0 (en) 2013-12-20 2014-02-05 Immodulon Therapeutics Ltd Cancer therapy
US9725710B2 (en) 2014-01-08 2017-08-08 Flodesign Sonics, Inc. Acoustophoresis device with dual acoustophoretic chamber
KR101503341B1 (ko) * 2014-03-12 2015-03-18 국립암센터 자가암항원 특이적 cd8+ t 세포의 분리 및 증식방법
SG10201809379UA (en) 2014-04-25 2018-11-29 Bluebird Bio Inc Mnd promoter chimeric antigen receptors
JP6613526B2 (ja) * 2014-05-28 2019-12-04 学校法人東京女子医科大学 膠芽腫の予測方法
JP2015227292A (ja) * 2014-05-30 2015-12-17 国立大学法人高知大学 膵がん細胞浸潤転移抑制ワクチン
US10479975B2 (en) 2014-06-06 2019-11-19 Bluebird Bio, Inc. Methods of making T cell compositions
JP6366379B2 (ja) * 2014-06-20 2018-08-01 キヤノン株式会社 被検体情報取得装置
CN106795217B (zh) 2014-07-24 2021-08-06 蓝鸟生物公司 Bcma嵌合抗原受体
KR102043725B1 (ko) * 2014-11-06 2019-11-13 오제 이뮈노테라프틱스 뇌 전이 치료를 위한 치료용 다중 펩타이드 t 특이적 면역 요법
SG11201704727WA (en) 2014-12-12 2017-07-28 Bluebird Bio Inc Bcma chimeric antigen receptors
MD3236985T3 (ro) * 2014-12-23 2023-03-31 Immatics Biotechnologies Gmbh Noi peptide și combinații de peptide pentru utilizare în imunoterapie împotriva carcinomului hepatocelular (HCC) și altor tipuri de cancere
GB201501017D0 (en) * 2014-12-23 2015-03-04 Immatics Biotechnologies Gmbh Novel peptides and combination of peptides for use in immunotherapy against hepatocellular carcinoma (HCC) and other cancers
GB201423361D0 (en) * 2014-12-30 2015-02-11 Immatics Biotechnologies Gmbh Method for the absolute Quantification of naturally processed HLA-Restricted cancer peptides
GB201505585D0 (en) 2015-03-31 2015-05-13 Immatics Biotechnologies Gmbh Novel peptides and combination of peptides and scaffolds for use in immunotherapy against renal cell carinoma (RCC) and other cancers
US11708572B2 (en) 2015-04-29 2023-07-25 Flodesign Sonics, Inc. Acoustic cell separation techniques and processes
US11377651B2 (en) 2016-10-19 2022-07-05 Flodesign Sonics, Inc. Cell therapy processes utilizing acoustophoresis
GB201507719D0 (en) 2015-05-06 2015-06-17 Immatics Biotechnologies Gmbh Novel peptides and combination of peptides and scaffolds thereof for use in immunotherapy against colorectal carcinoma (CRC) and other cancers
JP6985153B2 (ja) * 2015-05-06 2021-12-22 イマティクス バイオテクノロジーズ ゲーエムベーハー 結腸直腸がん（ｃｒｃ）およびその他のがんに対する免疫療法で使用するための新規ペプチドおよびペプチドとそのスキャフォールドとの組み合わせ
NL2014935B1 (en) 2015-06-08 2017-02-03 Applied Immune Tech Ltd T cell receptor like antibodies having fine specificity.
WO2016200787A2 (en) 2015-06-09 2016-12-15 The Board Of Regents Of The University Of Oklahoma Compositions and treatments for haemophilus influenzae
MX2017016931A (es) 2015-06-24 2018-09-26 Immodulon Therapeutics Ltd Inhibidor del punto de regulacion y un mycobaterium de celula entera para uso en la terapia del cancer.
GB201511546D0 (en) 2015-07-01 2015-08-12 Immatics Biotechnologies Gmbh Novel peptides and combination of peptides for use in immunotherapy against ovarian cancer and other cancers
PE20230321A1 (es) 2015-07-01 2023-02-22 Immatics Biotechnologies Gmbh Nuevos peptidos y nuevas combinaciones de peptidos para el uso en la inmunoterapia contra el cancer de ovario y otros tipos de cancer
CA3221001A1 (en) * 2015-07-06 2017-01-12 Immatics Biotechnologies Gmbh Novel peptides and combination of peptides for use in immunotherapy against esophageal cancer and other cancers
GB201512369D0 (en) * 2015-07-15 2015-08-19 Immatics Biotechnologies Gmbh Novel peptides and combination of peptides for use in immunotherapy against epithelial ovarian cancer and other cancers
GB201513921D0 (en) 2015-08-05 2015-09-23 Immatics Biotechnologies Gmbh Novel peptides and combination of peptides for use in immunotherapy against prostate cancer and other cancers
TWI794761B (zh) 2015-08-28 2023-03-01 德商英麥提克生物技術股份有限公司 用於多種癌症之免疫治療的新穎胜肽、胜肽的組合物及支架
GB201515321D0 (en) * 2015-08-28 2015-10-14 Immatics Biotechnologies Gmbh Novel peptides, combination of peptides and scaffolds for use in immunotherapeutic treatment of various cancers
EP3344276B1 (en) 2015-09-03 2020-04-22 The Board of Regents of the University of Oklahoma Peptide inhibitors of clostridium difficile tcdb toxin
CN108289909A (zh) 2015-10-19 2018-07-17 巴尔的摩马里兰大学 用于产生工程改造的人原代血液树突细胞系的方法
US11479755B2 (en) 2015-12-07 2022-10-25 2Seventy Bio, Inc. T cell compositions
GB201521746D0 (en) * 2015-12-10 2016-01-27 Immatics Biotechnologies Gmbh Novel peptides and combination of peptides for use in immunotherapy against CLL and other cancers
CN108601731A (zh) 2015-12-16 2018-09-28 磨石肿瘤生物技术公司 新抗原的鉴别、制造及使用
WO2017123996A1 (en) 2016-01-15 2017-07-20 City Of Hope Targeting glioblastoma stem cells through the tlx-tet3 axis
GB201603568D0 (en) * 2016-03-01 2016-04-13 Immatics Biotechnologies Gmbh Efficient treatment options including peptides and combination of peptide and cell based medicaments for use in immunotherapy against urinary bladder cancer
CN105664134B (zh) * 2016-03-13 2019-04-26 浙江药苑生物科技有限公司 一种用于治疗骨癌的药物组合物
GB201604494D0 (en) 2016-03-16 2016-04-27 Immatics Biotechnologies Gmbh Transfected T-Cells and T-Cell receptors for use in immunotherapy against cancers
LT3430037T (lt) 2016-03-16 2022-12-12 Immatics Biotechnologies Gmbh Transfekuotos t ląstelės ir t ląstelių receptoriai, skirti naudoti vėžio gydymui taikant imunoterapiją
GB201604490D0 (en) * 2016-03-16 2016-04-27 Immatics Biotechnologies Gmbh Peptides combination of peptides for use in immunotherapy against cancers
BR112018070067A2 (pt) * 2016-04-06 2019-02-12 Immatics Biotechnologies Gmbh peptídeos e combinações de peptídeos para uso em imunoterapia contra lma e outros cânceres
US11214789B2 (en) 2016-05-03 2022-01-04 Flodesign Sonics, Inc. Concentration and washing of particles with acoustics
WO2017194170A1 (en) * 2016-05-13 2017-11-16 Biontech Rna Pharmaceuticals Gmbh Methods for predicting the usefulness of proteins or protein fragments for immunotherapy
KR101881300B1 (ko) 2016-06-30 2018-07-25 영남대학교 산학협력단 아조피라졸 화합물 및 은 촉매 반응을 이용한 이의 신규한 합성방법
ES2950435T3 (es) * 2016-10-03 2023-10-10 Ottawa Hospital Res Inst Composiciones y métodos para mejorar el crecimiento, la propagación y la eficacia oncolítica e inmunoterapéutica de virus oncolíticos de ARN
MX2019005277A (es) 2016-11-04 2019-09-27 Bluebird Bio Inc Composiciones de celulas t con car anti-bcma.
DE102016123893A1 (de) 2016-12-08 2018-06-14 Immatics Biotechnologies Gmbh T-Zellrezeptoren mit verbesserter Bindung
KR102639592B1 (ko) 2016-12-08 2024-02-21 이매틱스 바이오테크놀로지스 게엠베하 짝짓기가 향상된 t 세포 수용체
AU2017379900A1 (en) * 2016-12-22 2019-06-13 Cue Biopharma, Inc. T-cell modulatory multimeric polypeptides and methods of use thereof
SG10201914064QA (en) 2017-01-06 2020-03-30 Eutilex Co Ltd Anti-human 4-1 bb antibodies and use thereof
GB201702863D0 (en) * 2017-02-22 2017-04-05 Evox Therapeutics Ltd Improved loading of EVs with therapeutic proteins
WO2018160498A1 (en) * 2017-02-28 2018-09-07 Lyten, Inc. Mixed allotrope particulate carbon films and carbon fiber mats
JP2020518648A (ja) * 2017-05-08 2020-06-25 グリットストーン オンコロジー インコーポレイテッド アルファウイルス新生抗原ベクター
CN107034305A (zh) * 2017-06-19 2017-08-11 上海市第十人民医院 恶性胶质瘤的一种诊断标志物
CN107058596A (zh) * 2017-06-19 2017-08-18 上海市第十人民医院 一种与恶性胶质瘤诊断相关的标志物及其应用
CA3078744A1 (en) 2017-10-10 2019-04-18 Gritstone Oncology, Inc. Neoantigen identification using hotspots
CA3083097A1 (en) 2017-11-22 2019-05-31 Gritstone Oncology, Inc. Reducing junction epitope presentation for neoantigens
WO2019118921A1 (en) 2017-12-14 2019-06-20 Flodesign Sonics, Inc. Acoustic transducer drive and controller
EP3724327A4 (en) * 2017-12-14 2022-01-12 EZY Biotech LLC SUBJECT-SPECIFIC TUMOR-INHIBITING CELLS AND THEIR USE
WO2019197567A2 (en) * 2018-04-11 2019-10-17 Enterome S.A. Antigenic peptides for prevention and treatment of cancer
CN108715832B (zh) * 2018-06-01 2020-11-10 段海峰 一种抑制肿瘤生长的间充质干细胞及制备方法和应用
WO2020110154A1 (en) * 2018-11-30 2020-06-04 Bharat Biotech International Limited A chimeric therapeutic vaccine
RU2706554C1 (ru) * 2018-12-13 2019-11-19 Российская Федерация, от имени которой выступает ФОНД ПЕРСПЕКТИВНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ Способ создания противоинфекционной иммунологической защиты к Salmonella typhimurium и Listeria monocytogenes с помощью трансгенеза Т-лимфоцитов
CN109796536B (zh) * 2019-02-22 2021-09-17 上海尚泰生物技术有限公司 一种靶向胶质母细胞瘤多种抗原表位的ctl的制备方法
JP2022527629A (ja) 2019-04-05 2022-06-02 アーリー・インコーポレイテッド 合成バイオマーカーのための改良された方法及び組成物
US10937541B2 (en) 2019-05-28 2021-03-02 PAIGE.AI, Inc. Systems and methods for processing images to prepare slides for processed images for digital pathology
SG11202113187WA (en) 2019-05-30 2021-12-30 Gritstone Bio Inc Modified adenoviruses
CN110579457B (zh) * 2019-09-20 2021-11-02 郑州大学第一附属医院 波形蛋白特异响应性荧光探针及其制备方法和应用
CN112824427B (zh) * 2019-11-18 2022-06-24 杨小骏 一种抑制胶质瘤的短肽及其应用
CN113318225B (zh) * 2020-02-28 2024-01-19 无锡派列博生物医药科技有限公司 肿瘤免疫增强剂及其制法和应用
CN113444149A (zh) * 2020-03-18 2021-09-28 北京鼎成肽源生物技术有限公司 一种乳腺癌靶标抗原、乳腺癌靶标抗原刺激培养的ctl细胞及其应用
MX2022012295A (es) * 2020-03-31 2023-03-06 Walking Fish Therapeutics Celulas b modificadas y metodos de uso de las mismas.
EP4127188A4 (en) 2020-03-31 2024-08-21 Walking Fish Therapeutics MODIFIED B CELLS AND METHODS OF USE THEREOF
WO2022032196A2 (en) 2020-08-06 2022-02-10 Gritstone Bio, Inc. Multiepitope vaccine cassettes
KR102711471B1 (ko) 2020-08-14 2024-09-30 서울대학교산학협력단 B형 간염 바이러스 유래 폴리펩티드를 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물
CA3190707A1 (en) * 2020-08-28 2022-03-03 Torigen Pharmaceuticals, Inc. Immune memory enhanced preparations and uses thereof
US11058751B1 (en) 2020-11-20 2021-07-13 Think Therapeutics, Inc. Compositions for optimized RAS peptide vaccines
US11421015B2 (en) 2020-12-07 2022-08-23 Think Therapeutics, Inc. Method of compact peptide vaccines using residue optimization
US11464842B1 (en) 2021-04-28 2022-10-11 Think Therapeutics, Inc. Compositions and method for optimized peptide vaccines using residue optimization
WO2023192820A2 (en) * 2022-03-30 2023-10-05 Iogenetics, Llc Tumor-associated antigens in brain tumors
PL441229A1 (pl) * 2022-05-19 2023-11-20 Instytut Biologii Doświadczalnej im. Marcelego Nenckiego Polska Akademia Nauk Zaprojektowane, syntetyczne peptydy, zawierające je kompozycje i sposoby ich zastosowania w leczeniu glejaków złośliwych

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2002020036A1 (de) * 2000-09-06 2002-03-14 Mueller Friederike Arzneimittel mit einer für das rna-bindende koc-protein kodierenden dna-sequenz, einem koc-protein oder einer dna-sequenz des koc-promotors
WO2002046767A2 (en) * 2000-12-08 2002-06-13 Oxford Glycosciences (Uk) Ltd. Diagnosis and treatment of alzheimer's disease
WO2003045998A2 (fr) * 2001-11-30 2003-06-05 Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) Polynucléotide et protéine impliqués dans la synaptogenèse, variants de ceux-ci, et leurs applications thérapeutiques et diagnostiques.
WO2004015390A2 (en) * 2002-08-09 2004-02-19 Applera Corporation Lung cancer target proteins and use thereof
WO2005116051A2 (de) * 2004-05-25 2005-12-08 Immatics Biotechnologies Gmbh An mhc-moleküle bindende tumor-assoziierte peptide
WO2007150077A2 (en) * 2006-06-23 2007-12-27 Immunotope, Inc. Cytotoxic t-lymphocyte-inducing immunogens for prevention, treatment, and diagnosis of cancer
EP2111867A1 (en) * 2008-04-24 2009-10-28 Immatics Biotechnologies GmbH Novel formulations of tumour-associated peptides binding to human leukocyte antigen (HLA) class I or II molecules for vaccines

Family Cites Families (63)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4440859A (en) 1977-05-27 1984-04-03 The Regents Of The University Of California Method for producing recombinant bacterial plasmids containing the coding sequences of higher organisms
US4704362A (en) 1977-11-08 1987-11-03 Genentech, Inc. Recombinant cloning vehicle microbial polypeptide expression
ES487106A0 (es) 1978-12-22 1981-05-16 Biogen Nv Un metodo para producir al menos un polipeptido que muestra antigenicidad de hbv
US4530901A (en) 1980-01-08 1985-07-23 Biogen N.V. Recombinant DNA molecules and their use in producing human interferon-like polypeptides
US4342566A (en) 1980-02-22 1982-08-03 Scripps Clinic & Research Foundation Solid phase anti-C3 assay for detection of immune complexes
US4678751A (en) 1981-09-25 1987-07-07 Genentech, Inc. Hybrid human leukocyte interferons
US4766075A (en) 1982-07-14 1988-08-23 Genentech, Inc. Human tissue plasminogen activator
US4582800A (en) 1982-07-12 1986-04-15 Hoffmann-La Roche Inc. Novel vectors and method for controlling interferon expression
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4757006A (en) 1983-10-28 1988-07-12 Genetics Institute, Inc. Human factor VIII:C gene and recombinant methods for production
US4677063A (en) 1985-05-02 1987-06-30 Cetus Corporation Human tumor necrosis factor
US4810648A (en) 1986-01-08 1989-03-07 Rhone Poulenc Agrochimie Haloarylnitrile degrading gene, its use, and cells containing the gene
US4897445A (en) 1986-06-27 1990-01-30 The Administrators Of The Tulane Educational Fund Method for synthesizing a peptide containing a non-peptide bond
US5338839A (en) * 1988-04-12 1994-08-16 Massachusetts Institute Of Technology DNA encoding nestin protein
KR100235089B1 (en) 1992-05-14 1999-12-15 Mitsui Chemicals Inc Ptp or blister packaging articles and packaging material therefor
GB2267257A (en) 1992-05-14 1993-12-01 Ford Motor Co A vehicle load compartment liner.
ES2108460T3 (es) 1993-06-03 1997-12-16 Therapeutic Antibodies Inc Fragmentos de anticuerpos en terapeutica.
AUPM322393A0 (en) 1993-12-24 1994-01-27 Austin Research Institute, The Mucin carbohydrate compounds and their use in immunotherapy
PT879282E (pt) 1996-01-17 2003-11-28 Imp College Innovations Ltd Imunoterapia utilizando linfocitos t citotoxicos (ctl)
US5849589A (en) 1996-03-11 1998-12-15 Duke University Culturing monocytes with IL-4, TNF-α and GM-CSF TO induce differentiation to dendric cells
IL120561A0 (en) * 1996-04-24 1997-07-13 Akzo Nobel Nv Peptides suitable for use in immunosuppressive therapy
EP0942748A4 (en) * 1996-07-22 2004-12-08 Univ Rockefeller ENV-GLYCOPROTEIN VACCINE FOR PROTECTION AGAINST HTLV-I AND HTLV-II INFECTIONS
AU6240798A (en) 1997-01-15 1998-08-07 Zymogenetics Inc. Zppar6, human tailless nuclear hormone receptor (tlx receptor)
JPH11507845A (ja) * 1997-02-13 1999-07-13 スミスクライン・ビーチャム・パブリック・リミテッド・カンパニー 神経細胞付着分子スプライシング変種
US6406705B1 (en) 1997-03-10 2002-06-18 University Of Iowa Research Foundation Use of nucleic acids containing unmethylated CpG dinucleotide as an adjuvant
AU750358B2 (en) * 1997-12-02 2002-07-18 Medarex, Inc. Cells expressing anti-Fc receptor binding components
US7258860B2 (en) * 1998-03-18 2007-08-21 Corixa Corporation Compositions and methods for the therapy and diagnosis of lung cancer
AU3762699A (en) * 1998-04-27 1999-11-16 Pacific Northwest Cancer Foundation (nr-cam) gene, nucleic acids and nucleic acid products for therapeutic and diagnostic uses for tumors
US6960651B2 (en) * 1999-06-29 2005-11-01 Millennium Pharmaceuticals, Inc. TANGO 332 polypeptides
US20020090672A1 (en) * 2000-01-31 2002-07-11 Rosen Craig A. Nucleic acids, proteins, and antibodies
WO2001055208A1 (en) * 2000-01-31 2001-08-02 Human Genome Sciences, Inc. Nucleic acids, proteins, and antibodies
AU785493B2 (en) 2000-03-27 2008-01-03 Technion Research & Development Foundation Ltd. Single chain class I major histo-compatibility complexes, constructs encoding same and methods of generating same
US20040191260A1 (en) 2003-03-26 2004-09-30 Technion Research & Development Foundation Ltd. Compositions capable of specifically binding particular human antigen presenting molecule/pathogen-derived antigen complexes and uses thereof
AU2002226030A1 (en) * 2000-12-04 2002-06-18 Argonex Pharmaceuticals Cytotoxic t-lymphocyte-inducing immunogens for prevention, treatment, and diagnosis of cancer
US20030109434A1 (en) * 2001-03-19 2003-06-12 Corixa Corporation Compositions and methods for the therapy and diagnosis of kidney cancer
US6589642B1 (en) 2001-12-21 2003-07-08 Kloeckner Pentaplast Of America, Inc. Three part high moisture barrier for packages
US7892559B2 (en) * 2002-01-30 2011-02-22 Survac Aps Survivin-derived peptides and use thereof
US6992176B2 (en) 2002-02-13 2006-01-31 Technion Research & Development Foundation Ltd. Antibody having a T-cell receptor-like specificity, yet higher affinity, and the use of same in the detection and treatment of cancer, viral infection and autoimmune disease
CA2476625A1 (en) 2002-02-20 2003-08-28 Dyax Corp. Mhc-peptide complex binding ligands
JP4721633B2 (ja) * 2002-10-11 2011-07-13 財団法人癌研究会 血小板凝集促進活性を有する物質
WO2004067029A1 (fr) * 2002-12-27 2004-08-12 Shenzhen Tsinghua Yuanxing Bio-Pharm Science & Technology Co., Ltd. Procede de preparation d'un vaccin et vaccins antitumoraux
US7273980B2 (en) 2004-01-13 2007-09-25 Wardle Scott A Position and velocity transducer using a phonograph disc and turntable
US7655751B2 (en) * 2004-01-23 2010-02-02 Green Peptide Co., Ltd. Epidermal growth factor receptor-derived peptides
US20080280317A1 (en) * 2004-08-27 2008-11-13 Northeastern University Comprehensive Characterization Of Complex Proteins At Trace Levels
DE602004019215D1 (de) * 2004-10-02 2009-03-12 Immatics Biotechnologies Gmbh Immunogene T-Helfer Epitope von menschlichen Tumorantigenen und deren Verwendung in immunotherapeutischen Methoden
US7902143B2 (en) * 2004-12-07 2011-03-08 Toray Industries, Inc. Cancer antigen peptide and the use thereof
KR100809410B1 (ko) * 2005-07-06 2008-03-05 주식회사 브레인가드 줄기세포 분화 유도용 조성물 및 그의 용도
DK1760089T3 (da) * 2005-09-05 2009-11-16 Immatics Biotechnologies Gmbh Tumor-associeret peptides bindende til human leukocyte antigen (HLA) class I eller II molecules og relateret anti-cancer vaccine
DK1806359T3 (da) 2005-09-05 2010-06-14 Immatics Biotechnologies Gmbh Tumorassocierede peptider, der bindes promiskuøst til Humant Leukocyt-Antigen (HLA) klasse II molekyler
AU2006304605A1 (en) 2005-10-17 2007-04-26 Institute For Systems Biology Tissue-and serum-derived glycoproteins and methods of their use
US20070248628A1 (en) * 2005-12-06 2007-10-25 Keller Lorraine H Immunogens in cancer stem cells
WO2007072494A1 (en) 2005-12-23 2007-06-28 Naik Praful Ramchandra Metallized packaging blister container
CA2665816C (en) * 2006-09-21 2016-07-12 Vaxil Biotherapeutics Ltd. Antigen specific multi epitope vaccines
CA2700573C (en) * 2006-09-26 2016-11-22 Cedars-Sinai Medical Center Cancer stem cell antigen vaccines and methods
CA2679743A1 (en) * 2007-03-06 2008-09-12 Barry G. Arnason Methods and compositions involving polymeric immunoglobulin fusion proteins
US8747855B2 (en) * 2008-04-09 2014-06-10 Technion Research & Development Foundation Limited Anti human immunodeficiency antibodies and uses thereof
KR101184869B1 (ko) * 2008-04-24 2012-09-20 이매틱스 바이오테크놀로지스 게엠베하 백신을 위한 인간 조직 적합성 항원(ｈｌａ) 종류 ｉ 또는 ｉｉ 분자에 결합하는 종양 관련 펩티드의 신규한 제형
EP2172211B1 (en) 2008-10-01 2014-12-03 Immatics Biotechnologies GmbH Composition of tumor-associated peptides and related anti-cancer vaccine for the treatment of glioblastoma (GBM) and other cancers
GB201004551D0 (en) 2010-03-19 2010-05-05 Immatics Biotechnologies Gmbh NOvel immunotherapy against several tumors including gastrointestinal and gastric cancer
GB201021289D0 (en) 2010-12-15 2011-01-26 Immatics Biotechnologies Gmbh Novel biomarkers for a prediction of the outcome of an immunotherapy against cancer
MX2016015457A (es) * 2014-05-28 2017-06-30 Nono Inc Sal de cloruro de tat-nr2b9c.
AU2017253549B2 (en) * 2016-04-21 2021-01-21 Immatics Biotechnologies Gmbh Immunotherapy against melanoma and other cancers
JP7382310B2 (ja) * 2017-09-06 2023-11-16 カリフォルニア インスティチュート オブ テクノロジー シグナリング及び抗原提示の２機能性レセプター（ｓａｂｒ）

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2002020036A1 (de) * 2000-09-06 2002-03-14 Mueller Friederike Arzneimittel mit einer für das rna-bindende koc-protein kodierenden dna-sequenz, einem koc-protein oder einer dna-sequenz des koc-promotors
WO2002046767A2 (en) * 2000-12-08 2002-06-13 Oxford Glycosciences (Uk) Ltd. Diagnosis and treatment of alzheimer's disease
WO2003045998A2 (fr) * 2001-11-30 2003-06-05 Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) Polynucléotide et protéine impliqués dans la synaptogenèse, variants de ceux-ci, et leurs applications thérapeutiques et diagnostiques.
WO2004015390A2 (en) * 2002-08-09 2004-02-19 Applera Corporation Lung cancer target proteins and use thereof
WO2005116051A2 (de) * 2004-05-25 2005-12-08 Immatics Biotechnologies Gmbh An mhc-moleküle bindende tumor-assoziierte peptide
WO2007150077A2 (en) * 2006-06-23 2007-12-27 Immunotope, Inc. Cytotoxic t-lymphocyte-inducing immunogens for prevention, treatment, and diagnosis of cancer
EP2111867A1 (en) * 2008-04-24 2009-10-28 Immatics Biotechnologies GmbH Novel formulations of tumour-associated peptides binding to human leukocyte antigen (HLA) class I or II molecules for vaccines

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ANIL SEHGAL ET AL.: "Cell adhesion molecule Nr-CAM is over-expressed in human brain tumors" INTERNATIONAL JOURNAL OF CANCER. JOURNAL INTERNATIONAL DU CANCER, vol. 76, no. 4, 18 May 1998 (1998-05-18), pages 451-458, XP002572958 ISSN: 0020-7136 cited in the application abstract *
GARY S.C. ET AL.: "cDNA cloning, chromosomal localization, and expression analysis of human BEHAB/brevican, a brain specific proteoglycan regulated during cortical development and in glioma" GENE, vol. 256, no. 1-2, 3 October 2000 (2000-10-03), pages 139-147, XP004238399 ELSEVIER, AMSTERDAM, NL ISSN: 0378-1119 cited in the application abstract page 143, column 2, last paragraph - page 145, column 1, paragraph 1 *
GUNTHER H.S. ET AL.: "Glioblastoma-derived stem cell-enriched cultures form distinct subgroups according to molecular and phenotypic criteria." ONCOGENE, vol. 27, no. 20, 1 May 2008 (2008-05-01), pages 2897-2909, XP002557755 ISSN: 1476-5594 cited in the application page 2899, left-hand column, last paragraph - right-hand column, paragraph 1 *
PRAKASH SONAM ET AL.: "Gastrointestinal stromal tumors in children and young adults: a clinicopathologic, molecular, and genomic study of 15 cases and review of the literature." JOURNAL OF PEDIATRIC HEMATOLOGY/ONCOLOGY: OFFICIAL JOURNAL OF THE AMERICAN SOCIETY OF PEDIATRIC HEMATOLOGY/ONCOLOGY APR 2005, vol. 27, no. 4, April 2005 (2005-04), pages 179-187, XP008107312 ISSN: 1077-4114 cited in the application abstract page 183, left-hand column, paragraph 1; table 4 *
SHIBAHARA JUNJI ET AL.: "Podoplanin is expressed in subsets of tumors of the central nervous system." VIRCHOWS ARCHIV: AN INTERNATIONAL JOURNAL OF PATHOLOGY, vol. 448, no. 4, April 2006 (2006-04), pages 493-499, XP002557757 ISSN: 0945-6317 cited in the application abstract *
SUZUKI TSUYOSHI ET AL.: "Genetic analysis of human glioblastomas using a genomic microarray system." BRAIN TUMOR PATHOLOGY, vol. 21, no. 1, 2004, pages 27-34, XP002557756 ISSN: 1433-7398 cited in the application abstract page 29, left-hand column, last paragraph - right-hand column, paragraph 1 *

Also Published As

Publication number Publication date
HRP20200722T1 (hr) 2020-10-16
EP2172212A3 (en) 2010-04-14
KR102392070B1 (ko) 2022-04-29
EP3120870B1 (en) 2020-04-01
DK2172211T3 (en) 2015-02-16
HRP20170115T1 (hr) 2017-03-24
US10227381B2 (en) 2019-03-12
US20160376314A1 (en) 2016-12-29
TR201900852T4 (tr) 2019-02-21
US10047123B2 (en) 2018-08-14
EP2172211A1 (en) 2010-04-07
US20160355550A1 (en) 2016-12-08
PL3111952T3 (pl) 2019-04-30
EP3132801A1 (en) 2017-02-22
CN102170901A (zh) 2011-08-31
EP3111952A1 (en) 2017-01-04
HRP20201025T8 (hr) 2022-01-07
HRP20201015T1 (hr) 2020-10-16
CA2739384C (en) 2017-05-02
HRP20150223T1 (hr) 2015-06-05
HUE050428T2 (hu) 2020-12-28
EA201100586A1 (ru) 2011-10-31
HRP20161504T1 (hr) 2016-12-30
CY1123526T1 (el) 2022-03-24
EP3069728A1 (en) 2016-09-21
ES2710608T3 (es) 2019-04-26
US10919931B2 (en) 2021-02-16
AU2009300088B2 (en) 2014-09-04
HRP20182151T1 (hr) 2019-02-08
CA2936920C (en) 2019-12-03
DK2172212T3 (da) 2016-12-19
CA2936887C (en) 2019-11-12
PT3106175T (pt) 2020-07-01
RS58229B1 (sr) 2019-03-29
RS58443B1 (sr) 2019-04-30
EP3111952B1 (en) 2018-10-31
HRP20190202T1 (hr) 2019-03-22
EP3106175B1 (en) 2020-04-01
DK3120870T3 (da) 2020-06-22
PL3132801T3 (pl) 2020-06-15
DK3120869T3 (da) 2020-08-10
PT3124043T (pt) 2020-05-12
NZ603016A (en) 2014-05-30
LT3069728T (lt) 2019-02-11
EP2341927B1 (en) 2016-05-04
US20130004456A1 (en) 2013-01-03
HUE031030T2 (en) 2017-06-28
EP3069728B1 (en) 2018-11-14
SI3069728T1 (sl) 2019-03-29
RS60385B1 (sr) 2020-07-31
CY1121098T1 (el) 2019-12-11
SI3106175T1 (sl) 2020-08-31
JP6297632B2 (ja) 2018-03-20
EP3106175A1 (en) 2016-12-21
DK3069728T3 (en) 2019-02-25
EP2172212A2 (en) 2010-04-07
PT3132801T (pt) 2020-02-04
CA2936920A1 (en) 2010-04-08
WO2010037514A2 (en) 2010-04-08
US8119139B2 (en) 2012-02-21
JP2017000148A (ja) 2017-01-05
PL3120870T3 (pl) 2020-07-27
CA2936870C (en) 2019-11-26
NZ591882A (en) 2012-12-21
CN102170900B (zh) 2016-10-26
JP2017018102A (ja) 2017-01-26
JP5883476B2 (ja) 2016-03-15
US20130309193A1 (en) 2013-11-21
US20150125478A1 (en) 2015-05-07
KR102133402B1 (ko) 2020-07-14
US11136352B2 (en) 2021-10-05
CY1122913T1 (el) 2021-10-29
MX2011003540A (es) 2011-06-20
HRP20200110T1 (hr) 2020-05-15
RS60386B1 (sr) 2020-07-31
PT2331118T (pt) 2017-02-06
MX338294B (es) 2016-04-11
EP3120869A1 (en) 2017-01-25
CN102170901B (zh) 2015-01-07
US8653035B2 (en) 2014-02-18
CY1121258T1 (el) 2020-05-29
LT3132801T (lt) 2020-02-10
HUE049366T2 (hu) 2020-09-28
ES2819244T3 (es) 2021-04-15
LT3106175T (lt) 2020-08-10
ES2584245T3 (es) 2016-09-26
PL2172212T3 (pl) 2017-04-28
CN102170900A (zh) 2011-08-31
US20210238227A1 (en) 2021-08-05
US20160376313A1 (en) 2016-12-29
HRP20201228T1 (hr) 2021-02-05
ES2612466T3 (es) 2017-05-17
KR101687840B1 (ko) 2016-12-19
SI3120868T1 (sl) 2020-08-31
CA2936870A1 (en) 2010-04-08
CA2936924A1 (en) 2010-04-08
EP3124043A1 (en) 2017-02-01
HRP20160915T1 (hr) 2016-10-07
ES2804723T3 (es) 2021-02-09
SI3111952T1 (sl) 2019-01-31
JP2016047825A (ja) 2016-04-07
US20120141517A1 (en) 2012-06-07
HK1159526A1 (zh) 2012-08-03
KR101883426B1 (ko) 2018-07-31
CY1123089T1 (el) 2021-10-29
BRPI0920791B8 (pt) 2022-02-15
JP6294913B2 (ja) 2018-03-14
RS55531B1 (sr) 2017-05-31
SI3120870T1 (sl) 2020-08-31
PL2341927T3 (pl) 2016-11-30
JP5753783B2 (ja) 2015-07-22
EP3132801B1 (en) 2019-10-30
LT3120868T (lt) 2020-08-10
UA110599C2 (uk) 2016-01-25
EP3120869B1 (en) 2020-07-22
KR20110082155A (ko) 2011-07-18
JP2017029135A (ja) 2017-02-09
RS60381B1 (sr) 2020-07-31
US8318677B2 (en) 2012-11-27
US20160376316A1 (en) 2016-12-29
EP3120868A1 (en) 2017-01-25
BRPI0920791B1 (pt) 2022-01-18
SI2331118T1 (sl) 2017-01-31
DK3132801T3 (da) 2020-02-10
JP2017018101A (ja) 2017-01-26
US20100158931A1 (en) 2010-06-24
CA2936982A1 (en) 2010-04-08
US20190010190A1 (en) 2019-01-10
HUE029360T2 (en) 2017-02-28
US10046037B2 (en) 2018-08-14
KR101756488B1 (ko) 2017-07-11
PT3111952T (pt) 2019-02-05
SI3120869T1 (sl) 2020-10-30
TR201900809T4 (tr) 2019-02-21
WO2010037513A1 (en) 2010-04-08
CY1123098T1 (el) 2021-10-29
RS53782B1 (en) 2015-06-30
NZ591855A (en) 2012-11-30
DK3111952T3 (en) 2019-01-28
AU2009300087B2 (en) 2014-09-04
LT3120870T (lt) 2020-08-10
SI2172211T1 (sl) 2015-03-31
NZ624533A (en) 2015-09-25
DK3106175T3 (da) 2020-06-22
JP2012504563A (ja) 2012-02-23
BRPI0920759A2 (pt) 2016-03-08
JP2012504393A (ja) 2012-02-23
US8895514B2 (en) 2014-11-25
PT3069728T (pt) 2019-02-13
US10047124B2 (en) 2018-08-14
PL2172211T3 (pl) 2015-05-29
JP6367266B2 (ja) 2018-08-01
EA201401104A1 (ru) 2015-05-29
AU2009300087A1 (en) 2010-04-08
PL3120868T3 (pl) 2020-08-24
US10941181B2 (en) 2021-03-09
CA2936869C (en) 2019-08-06
JP2016145210A (ja) 2016-08-12
LT3124043T (lt) 2020-07-10
US20160376312A1 (en) 2016-12-29
ES2536465T3 (es) 2015-05-25
HUE030296T2 (en) 2017-04-28
EA023378B1 (ru) 2016-05-31
EA201100587A1 (ru) 2011-10-31
ES2607460T3 (es) 2017-03-31
US8961985B2 (en) 2015-02-24
JP6150859B2 (ja) 2017-06-21
US20170326217A1 (en) 2017-11-16
EA032437B1 (ru) 2019-05-31
PT2172211E (pt) 2015-03-09
US9993540B2 (en) 2018-06-12
CY1118702T1 (el) 2017-07-12
HUE051030T2 (hu) 2021-01-28
JP6294914B2 (ja) 2018-03-14
CN106986919A (zh) 2017-07-28
ES2788129T8 (es) 2020-11-04
JP2014239681A (ja) 2014-12-25
LT2331118T (lt) 2016-12-27
PT2341927T (pt) 2016-08-02
HUE042115T2 (hu) 2019-06-28
JP2017023136A (ja) 2017-02-02
DK2331118T3 (da) 2017-01-09
EP2331118A1 (en) 2011-06-15
CY1123113T1 (el) 2021-10-29
PL3124043T3 (pl) 2020-07-27
CA2739387C (en) 2019-10-29
JP5855940B2 (ja) 2016-02-09
CA2936887A1 (en) 2010-04-08
WO2010037514A3 (en) 2010-06-03
LT2172212T (lt) 2016-11-10
US20210253637A1 (en) 2021-08-19
US10100085B2 (en) 2018-10-16
US20110002963A1 (en) 2011-01-06
PT3120868T (pt) 2020-07-16
HUE047365T2 (hu) 2020-04-28
CA2739384A1 (en) 2010-04-08
HK1161106A1 (en) 2012-08-24
DK3124043T3 (da) 2020-05-04
RS55043B1 (sr) 2016-12-30
CY1116302T1 (el) 2017-02-08
HRP20150223T8 (hr) 2015-07-03
ES2788129T3 (es) 2020-10-20
HRP20201025T1 (hr) 2020-12-25
LT3120869T (lt) 2020-11-10
US11208434B2 (en) 2021-12-28
CA2739387A1 (en) 2010-04-08
SI3132801T1 (sl) 2020-03-31
ES2708654T3 (es) 2019-04-10
EP2341927A2 (en) 2011-07-13
EP2172212B1 (en) 2016-10-05
EP3120868B1 (en) 2020-04-08
EP3124043B1 (en) 2020-04-29
US20210347822A1 (en) 2021-11-11
CA2936868A1 (en) 2010-04-08
LT3111952T (lt) 2018-12-27
CY1122677T1 (el) 2021-03-12
RS60006B1 (sr) 2020-04-30
RS60656B1 (sr) 2020-09-30
EP2172211B1 (en) 2014-12-03
JP6214066B2 (ja) 2017-10-18
HUE049364T2 (hu) 2020-09-28
PL3069728T3 (pl) 2019-05-31
PL3120869T3 (pl) 2021-01-25
DK2341927T3 (en) 2016-08-15
HUE041446T2 (hu) 2019-05-28
SI2172212T1 (sl) 2016-12-30
PT2172212T (pt) 2016-12-22
PL2331118T3 (pl) 2017-05-31
BRPI0920791A2 (pt) 2019-12-10
SI2341927T1 (sl) 2016-08-31
UA125277C2 (uk) 2022-02-16
SI3124043T1 (sl) 2020-07-31
ES2770090T3 (es) 2020-06-30
RS55543B1 (sr) 2017-05-31
KR20180088494A (ko) 2018-08-03
US20210261614A1 (en) 2021-08-26
ES2802227T3 (es) 2021-01-18
PT3120869T (pt) 2020-09-22
MX2011003539A (es) 2011-06-20
US10906936B2 (en) 2021-02-02
US20160376317A1 (en) 2016-12-29
DK3120868T3 (da) 2020-06-22
KR20200085381A (ko) 2020-07-14
EP2331118B1 (en) 2016-10-26
KR20110074894A (ko) 2011-07-04
HUE049367T2 (hu) 2020-09-28
UA103202C2 (ru) 2013-09-25
PL3106175T3 (pl) 2020-08-24
RS60338B1 (sr) 2020-07-31
CA2936869A1 (en) 2010-04-08
CA2936868C (en) 2019-10-22
CY1119744T1 (el) 2018-06-27
AU2009300088A1 (en) 2010-04-08
US20160376315A1 (en) 2016-12-29
HRP20201015T8 (hr) 2022-01-21
CA2936982C (en) 2019-12-03
PT3120870T (pt) 2020-07-01
CA2936924C (en) 2019-07-16
EP3120870A1 (en) 2017-01-25
KR20160103558A (ko) 2016-09-01
KR20220058655A (ko) 2022-05-09
DK2331118T5 (en) 2017-06-19
ES2802226T3 (es) 2021-01-18
HRP20200988T1 (hr) 2020-10-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EA023013B1 (ru) Пептид, индуцирующий противоопухолевый иммунный ответ, и его применение
TWI641617B (zh) 用於膀胱癌和其它癌症免疫治療的肽、肽組合物和基於細胞的藥物
US11542303B2 (en) Peptides and combination thereof for use in the immunotherapy against cancers
CN109475596B (zh) 子宫癌治疗
TWI689516B (zh) 用於對抗多種癌症的免疫療法的新胜肽及胜肽組合
EA019603B1 (ru) Новые и действенные пептиды мнс ii класса, полученные из сурвивина
TW201841937A (zh) 用於白血病和其他癌症免疫治療的新穎肽和肽組合物
CN109152813B (zh) 作为靶标以及用于胆囊癌和胆管癌以及其他癌症免疫治疗的新型肽、肽组合物
EA024497B1 (ru) Пептид, связывающийся с молекулой главного комплекса гистосовместимости человека i класса, и его применение для лечения рака
CN109734777B (zh) 用于各种癌症免疫治疗的新型肽、肽组合物和支架
EA018456B1 (ru) Новые иммуногенные эпитопы для иммунотерапии
CN111533796A (zh) 用于癌症免疫治疗的肽及其肽组合物
JP7564183B2 (ja) 膀胱がんおよびその他のがんに対する免疫療法で使用するためのペプチド、ペプチド組み合わせ、および細胞ベースの薬剤
CN112521478A (zh) 用于白血病和其他癌症免疫治疗的肽和肽组合物
CN113164569A (zh) A*01限制肽和肽组合物在抗癌免疫治疗中的用途和相关方法
TW202035441A (zh) 用於對抗多種癌症的免疫療法的新胜肽及胜肽組合
CN113444148A (zh) A*03限制肽在抗癌免疫治疗和相关方法中的用途
CN112135629A (zh) 用于抗癌免疫治疗的肽
CN114028549A (zh) 用于nhl和其他癌症免疫治疗的新型肽和肽组合物
TW202246303A (zh) 用於 aml 和其他癌症免疫治療的新型肽和肽組合物