EA018456B1 - Новые иммуногенные эпитопы для иммунотерапии - Google Patents

Новые иммуногенные эпитопы для иммунотерапии Download PDF

Info

Publication number
EA018456B1
EA018456B1 EA201000207A EA201000207A EA018456B1 EA 018456 B1 EA018456 B1 EA 018456B1 EA 201000207 A EA201000207 A EA 201000207A EA 201000207 A EA201000207 A EA 201000207A EA 018456 B1 EA018456 B1 EA 018456B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
peptide
cells
accordance
cell
peptides
Prior art date
Application number
EA201000207A
Other languages
English (en)
Other versions
EA201000207A1 (ru
Inventor
Харпрет Сингх
Оливер Шор
Клаудиа Траутвайн
Норберт Хильф
Тони Вайншенк
Штеффен Вальтер
Петер Левандровски
Original Assignee
Имматикс Байотекнолоджиз Гмбх
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Имматикс Байотекнолоджиз Гмбх filed Critical Имматикс Байотекнолоджиз Гмбх
Publication of EA201000207A1 publication Critical patent/EA201000207A1/ru
Publication of EA018456B1 publication Critical patent/EA018456B1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/06—Linear peptides containing only normal peptide links having 5 to 11 amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/14—Blood; Artificial blood
    • A61K35/17—Lymphocytes; B-cells; T-cells; Natural killer cells; Interferon-activated or cytokine-activated lymphocytes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • A61K38/08—Peptides having 5 to 11 amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/461—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
    • A61K39/4611—T-cells, e.g. tumor infiltrating lymphocytes [TIL], lymphokine-activated killer cells [LAK] or regulatory T cells [Treg]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
    • A61K39/4643—Vertebrate antigens
    • A61K39/4644—Cancer antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/18—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for pancreatic disorders, e.g. pancreatic enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4748—Tumour specific antigens; Tumour rejection antigen precursors [TRAP], e.g. MAGE
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • C07K14/495—Transforming growth factor [TGF]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/7051—T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/40—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/44—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material not provided for elsewhere, e.g. haptens, metals, DNA, RNA, amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/08—Linear peptides containing only normal peptide links having 12 to 20 amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0636—T lymphocytes
    • C12N5/0638—Cytotoxic T lymphocytes [CTL] or lymphokine activated killer cells [LAK]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0012—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7)
    • C12N9/0036—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on NADH or NADPH (1.6)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/13—Transferases (2.) transferring sulfur containing groups (2.8)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/515—Animal cells
    • A61K2039/5158—Antigen-pulsed cells, e.g. T-cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/57—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2
    • A61K2039/572—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2 cytotoxic response
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2502/00—Coculture with; Conditioned medium produced by
    • C12N2502/11—Coculture with; Conditioned medium produced by blood or immune system cells
    • C12N2502/1157—Monocytes, macrophages
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y208/00—Transferases transferring sulfur-containing groups (2.8)
    • C12Y208/02—Sulfotransferases (2.8.2)
    • C12Y208/02011—Galactosylceramide sulfotransferase (2.8.2.11)

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Neurology (AREA)

Abstract

Изобретение относится к аминокислотным последовательностям пептидов, образованных из опухолеассоциированных антигенов, которые способны связываться с комплексами МНС как одного, так и другого класса и вызывать иммунный ответ, а также применение указанных пептидов для лечения заболеваний.

Description

(57) Изобретение относится к аминокислотным последовательностям пептидов, образованных из опухолеассоциированных антигенов, которые способны связываться с комплексами МНС как одного, так и другого класса и вызывать иммунный ответ, а также применение указанных пептидов для лечения заболеваний.
Изобретение относится к новым аминокислотным последовательностям пептидов, образованных из опухолеассоциированных антигенов, которые способны связываться с комплексами МНС как одного, так и другого класса и вызывать иммунный ответ.
Уровень техники
Стимуляция иммунных ответов зависит от присутствия антигенов, распознающихся иммунной системой хозяина как чужеродные. Открытие существования опухолеассоциированных антигенов повысило сейчас возможность использования иммунной системы хозяина для вмешательства в рост опухоли. Различные механизмы объединения обеих ветвей иммунной системы, как гуморальной, так и клеточной, исследуются в настоящее время для иммунотерапии рака.
Конкретные элементы клеточных иммунных ответов способны к специфическому распознаванию и уничтожению опухолевых клеток. Изоляция цитотоксических Т-клеток (ЦТЛ) из популяций опухольинфильтрирующих клеток или из периферической крови предполагает, что такие клетки играют важную роль в естественной иммунной защите против рака СНссусг ек а1., Аппа1к Ν.Υ. Асаб. 8ск 1993 690:101112; 2ек Η 1 , Репу-ЬаЛеу Ό , Энб1еу М.Е., ВокепЬегд 8.А., Υαη§ ЕС; 1 1ттипо1. 1999, 162(2):989-94; Н1дй ау1б1ку СТЬк Юг Его ке1Г-апйдепк бетопккгаке кирепог ίη υιΙγο апб ίη νίνο апбкитоиг еГПсасу.). В частности, СЭ8-положнтельные Т-клетки (ТСЭ8+), которые распознают молекулы I класса главного комплекса гистосовместимости (МНС) с пептидами, имеющими обычно 8-10 аминокислотных остатков, образованными из белков или дефектных рибосомных продуктов (ΌΚΙΡ8) (8сНнЬег1 и., Апкоп Ь.С., С1ЬЬк 1., ΝοώιΐΓν С.С., Хе\гбе11 IV., Веппшк !В.; Вар1б бедгабайоп оГ а 1агде йасйоп оГ пе\\'1у купкИемхеб ргокешк Ьу ргокеакотек; Шкиге 2000; 404(6779):770-774), находящихся в цитозоли, играют важную роль в этом ответе. Молекулы МНС человека называются также человеческими лейкоцитарными антигенами (НЬА).
Существуют два класса молекул МНС: молекулы МНС I класса, которые могут встречаться на большинстве клеток, имеющих ядро, которые презентируют пептиды, образующиеся после протеолитического расщепления эндогенных белков, ΌΚΙΡ8, и более крупных пептидов. Молекулы МНС II класса могут встречаться преимущественно на профессиональных антигенпрезентирующих клетках (АПК) и презентировать пептиды экзогенных белков, которые поглощаются АПК в период эндоцитоза и впоследствии процессируются (СгеккхгеП Р. Аппи. Вем. Iттиηо1. 1994; 12:259-93). Комплексы из пептида и МНС класса I распознаются С^8-положнтельными цитотоксическими Т-лимфоцитами, несущими подходящий ТКР (Т-клеточный рецептор), комплексы из пептида и МНС класса II распознаются СЭ4положительными хелперными Т-клетками, несущими подходящий ТКР. Хорошо известно, что ТКР, пептид и МНС часто встречаются в стехиометрическом соотношении 1:1:1.
СЭ4-положительные хелперные Т-клетки играют важную роль в управлении эффекторными функциями противоопухолевых Т-клеточных ответов, и, поэтому, идентификация СЭ4-положительных Тклеточных эпитопов, образованных из опухолеассоциированных антигенов (ТАА), может быть чрезвычайно важна для разработки фармацевтических препаратов для инициации противоопухолевых иммунных ответов (КоЬауакЫ,Н., В. От1уа, М. Вшх, Е. Ниагке, Р. 8агоЬе, 1. 1. Ьакагке, М. Непшх, В. 8апдго, 1. Рпеко, Е. Воггак-Сиекка, апб Е. Сейк. 2002. !бепк1Г1сак1оп оГ ап апйдешс ер1коре Гог Не1рег Τ 1утр1осукек Ггот сагсшоетЬгуошс апйдеп. С1ш. Сапсег Век 8:3219-3225., Сфайс, 8., Ό. Акапаскомю, Е. 1адег, М. Маккио, А. 8екакитаг, Ν.Κ. А1когк1, В.С. Мак1, В. Эиропк, С. В1ккег, Υ.Τ. С1еп, А. Кпикй, апб ЬЛ. О1б. 2003. 8игмеу оГ пакигайу осситпд СЭ4+ Т-се11 гекропкек адашкк ΝΥΈ8Ο-1 ш сапсег райепкк: Согге1айоп Мкй апйЬобу гекропкек. Ргос. №1к1. Асаб. 8ски.8.А . 100(15):8862-7) СЭ4+ Т-клетки могут приводить к локальному увеличению уровней ΣΡΝγ (О1п Ζ, 8с11\уагк/корГГ 1, Ргабега Е, Каттегкоепк Τ, 8ейдег В, Рйсйег Н, В1апкепккеш Τ; А спйса1 гес.|шгетепк оГ шкегкегоп датта-теб1акеб апдюккакщ Гог китоиг ге.)есйоп Ьу СЭ8+ Τ се11к; Сапсег Век. 2003 1;63(14):4095-4100).
При отсутствии воспаления экспрессия молекул МНС II класса преимущественно рестриктирована по клеткам иммунной системы, в особенности профессиональным антигенпрезентирующим клеткам (АПК), например, моноцитам, образованным из моноцитов клеткам, макрофагам, дендритным клеткам. Неожиданным образом, у пациентов с опухолевыми заболеваниями было обнаружено, что клетки опухолей экспрессируют молекулы МНС II класса (Эепд)е1 1., №1ккке М.Э., СоиккеГапдеак С., С1ккюиб1к С., 8с1юог О., А1кепЬегепб Е., Ми11ег М., Кгатег В., М1ккюи А., 8аикег М., Неппеп1оккег 1., Vе^ηек Ό., 8кепх1 А., Ваттепкее Н.С., К1шде1 К., 8кемапоу1с 8.; Ипехрескеб аЬипбапсе оГ НЬА с1акк II ргекепкеб рерйбек ш рптагу гепа1 се11 сагсшотак; С1ш Сапсег Век. 2006; 12:4163-4170).
На моделях млекопитающих животных, например, мышах, было показано, что даже при отсутствии эффекторных клеток ЦТЛ (т.е., СЭ8-положительных Т-лимфоцитов), СЭ4-положительных Т-клеток достаточно для ингибирования визуализирования опухолей посредством ингибирования ангиогенеза при секреции интерферон-гамма (ΣΕΝγ) (Ош Ζ. апб Τ. В1апкепккеш. 2000. СЭ4+ Т-се11-теб1акеб китог гс)ескюп шмокек нбнЫкюп оГ апдюдепекщ к1ак 1к берепбепк оп ШЫ датта гесерког ехргеккюп Ьу попйетакоро1ейс се11к. [ттшнку. 12:677-686). К тому же было показано, что СЭ4-положительные Т-клетки, распознающие пептиды из опухолеассоциированных антигенов, презентированные молекулами НЬА класса II, могут препятствовать опухолевой прогрессии посредством индукции ответов антител (АЬ) (Кеппебу, В.С., М.Н. 8йеагег, А.М. ’№аккк, апб В.К. Вг1дНк. 2003. СЭ4+ Τ 1утр1осукек р1ау а спйса1 го1е ш апйЬобу ргобис
- 1 018456 боп апб (итог 1шшипйу адашк! 81Ш1ап уиик 40 1агде (итог апбдеп. Сапсег Век. 2003, 63:1040-1045). В отличие от опухолеассоциированных пептидов, связывающихся с молекулами НЬЛ класса I, до сих пор было описано лишь небольшое число лигандов класса II опухолеассоциированных антигенов (ТАА) (те^^.сапсебшшипйу.огд, \\л\лу.куГреЦ1п.бе).
Так как конститутивная экспрессия молекул НЬА класса II обычно ограничена клетками иммунной системы (Маск В., V. 8(е1ш1е, Е. Матбпе/-8оба, апб Вейй. 1996. ВедЛабоп οί МНС с1акк II депек: 1еккопк Ггош а б1кеаке. Аппи. Веу. Iтшиηο1. 14:301-331), то возможность изоляции пептидов класса II напрямую из первичных опухолей считалась невозможной. Тем не менее, Эепд]е1 и соавторам недавно удалось идентифицировать ряд эпитопов МНС класса II напрямую из опухолей (ЕР 04 023 546.7, ЕР 05 019 254.1; Эепд]е1 ί., №18(ке Μ.Ό., СоийеГапдеак С., СйкюиЛк С., 8скоот О., АНепЬетепб Е., Ми11ет М., Кгашег В., М188ЮИ А., 8аи(ег М., Неппеп1о((ег 1., \Уегпе( Ό., 8(епх1 А., Вашшепкее Н.С., К1Лде1 К., 8(еуапоу1с 8.; Ипехрес(еб аЬипбапсе оГ НЬА с1акк II ргекеп(еб рерббек ш рпшату гепа1 се11 сатсшошак; СИп Сапсег Век. 2006; 12:4163-4170).
Для того чтобы пептид инициировал (вызывал) клеточный иммунный ответ, он должен связываться с молекулой МНС. Этот процесс зависит от аллеля молекулы МНС и специфических полиморфизмов аминокислотной последовательности пептида. Пептиды, связывающиеся с МНС класса I, имеют обычно 8-10 аминокислотных остатков в длину и обычно содержат два консервативных остатка (якори) в их последовательности, которые взаимодействуют с соответствующей связывающей бороздкой молекулы МНС. Таким образом, каждый аллель МНС имеет соединительный элемент, определяющий, какие пептиды могут специфически связываться со связывающей бороздкой (Вашшепкее Н. С., Васйшапп 1. апб 8(еуапоую, 8; МНС Ыдапбк апб Рерббе МобГк, Сйаршап & На11 1998).
В зависящей от МНС класса I иммунной реакции пептиды не только должны быть в состоянии связываться с конкретными молекулами МНС класса I, экспрессируемыми опухолевыми клетками, но они также должны распознаваться Т-клетками, несущими специфические Т-клеточные рецепторы (ТКР).
Антигены, которые распознаются опухолевыми специфическими цитотоксическими Тлимфоцитами, то есть их эпитопами, могут быть молекулами, образованными из любого класса белков, таких как ферменты, рецепторы, факторы транскрипции и т.д., которые находятся в повышенном количестве в клетках соответствующей опухоли. Кроме того, опухолеассоциированные антигены могут, например, также быть уникальными для опухолевых клеток, например, как продукты мутировавших генов или альтернативных открытых рамок считывания (ОРС) или белкового сплайсинга (^дпетоп Ν., 8(гооЬап( V., СТарйо ί., Оошк А., Эедюуапш С., Моге1 8., уап бег Вгиддеп Р., Вооп Т., Vаη беп Еупбе ВЭ. Ап апбдешс рерббе ргобисеб Ьу рерббе крйсшд ш Ле рто1еакоше, 8с1епсе 2004 Арг 23; 304 (5670):587-90.). Другой важный класс опухолеассоциированных антигенов представлен тканеспецифическими антигенами, такими как антигены СТ (раковый тестикул), которые экспрессированы в различных видах опухолей и здоровой ткани семенника.
Были выявлены различные опухолеассоциированные антигены. Затем, много усилий было потрачено на исследования по идентификации дополнительных опухолеассоциированных антигенов. Некоторые группы опухолеассоциированных антигенов, также именуемые в области техники как опухолеспецифические антигены, являются тканеспецифическими. Примеры включают, но не ограничиваются тирозиназой для меланомы, Р8А (простата-специфический антиген) и Р8МА (простата-специфический мембранный антиген) для рака простаты и хромосомными аномалиями (кроссовер), такими как Ьсг/аЬ1 в лимфомах. Тем не менее, многие опухолеассоциированные антигены, которые были идентифицированы, встречаются во множестве видов опухолей, и некоторые, такие как онкогенные белки и/или гены-супрессоры опухоли (обзор генов-супрессоров опухоли для почечного рака дается, например, у Ыпейап ^.М., \Уа1(Нег М.М., 2Ьаг В. Т1е депебс Ьабк оГ сапсег оГ Ле Лбпеу. ί Ито1. 2003 Эес; 170(6 Р( 1):2163-72), которые фактически вызывают трансформационное явление, встречаются практически во всех видах опухолей. Например, нормальные клеточные белки, контролирующие рост и дифференциацию клетки, такие как р53 (который является примером гена-супрессора опухоли), гак, с-ше(, шус, рВВ, АНЬ, и НЕВ-2/пеи, могут аккумулировать мутации, приводящие к высокому уровню экспрессии продуктов этих генов, делая их тем самым онкогенными (МсСабеу е( а1. Сапсег Векеатсб 1998 15:58 2601-5; ЭМк е( а1. С1Ьа Еоипб. 8ушр. 1994 187:198-211). Эти мутантные белки также могут быть мишенью опухолеспецифического иммунного ответа при многих видах рака.
Для того чтобы белки были узнаны цитотоксическими Т-лимфоцитами в качестве опухолеспецифического или -ассоциированного антигена и чтобы они могли использоваться в терапии, должны выполняться особые предварительные требования. Антиген должен быть экспрессирован преимущественно опухолевыми клетками, а не здоровыми тканями или в сравнительно малом объеме. В дальнейшем желательно, чтобы соответствующий антиген не только присутствовал в каком-либо виде опухоли, но и также имел высокую концентрацию (т.е. число копий соответствующего пептида на клетку). Опухолеспецифические и опухолеассоциированные антигены часто бывают образованы из белков, напрямую задействованных в трансформации нормальной клетки в опухолевую, в связи с функцией, например, при контроле клеточного цикла или апоптозе. В дополнение мишени нисходящего пути белков, напрямую являющихся причиной трансформации, могут быть представлены в повышенном количестве и, таким образом, кос
- 2 018456 венно опухолеассоциированными. Такие косвенно опухолеассоциированные антигены могут также быть мишенями вакцинационного подхода (8шдЬ-1аки)а Н., ЕттепсН N. Р., Ваттепкее Н. С., Сапсег 1ттипо1. 1ттипос111сг. 2004 Маг; 453 (3): 187-95). В обоих случаях необходимо иметь эпитопы в аминокислотной последовательности антигена, поскольку такой пептид (иммуногенный пептид), который образован из опухолеассоциированного антигена, должен вести ίη νίίτο или ίη νίνο к Т-клеточному ответу.
В основном, любой пептид, способный связываться с молекулой МНС, может выполнять функцию Т-клеточного эпитопа. Предварительным условием для индукции Т-клеточного ответа ίη νίίτο или ίη νίνο является присутствие Т-клетки с соответствующим ТКР и отсутствие иммунологической толерантности к данному конкретному эпитопу.
Поэтому опухолеассоциированные антигены (ТАА) являются отправным пунктом для разработки противораковой вакцины. Методы идентификации и характеристики ТАА основаны на использовании ЦТЛ, которые могут быть изолированы у пациентов или здоровых субъектов, или же они основаны на генерировании дифференциальных транскрипционных профилей или дифференциальных паттернов пептидной экспрессии в сопоставлении между опухолевыми и нормальными тканями (Есшшс1 С, Метк 8., ЕЬег1е и., Оепде1 1., КгаИ Т., Вескег Η.Ό., Ваттепкее Н.С., 8ίеνаηον^с 8. №11. ВюФсЬпок 2004 Арг.; 22(4):450-4, Т. МешксНепк. С СоийеГапдеак, М. 8с1пт1е. Е. ОЬегтауг, 8. Макет. О. 8с1юот. В. Кигек, М. Боекет. К.Н. ВюЫет, Ό. Метер 8. 8ίеνаηον^с, апй Н. С. Ваттепкее. 1п1едга1ей Гипсйопа1 депоттск арртоаск Гог 111е Йекщп оГ раНеп1-тйпзйиа1 апШитот уассшек Сапсег Век. 62 (20):5818-5827, 2002.).
Однако идентификация генов, гиперэкспрессированных в опухолевых тканях или человеческих опухолевых клеточных линиях или же селективно экспрессированных в таких тканях или клеточных линиях, не обеспечивает точной информацией относительно использования антигенов, транскрибированных с данных генов, в иммунотерапии. Причиной тому то, что только отдельная субпопуляция эпитопов этих антигенов подходит для такого применения, так как Т-клетка с соответствующим ТКР должна быть в наличии, и необходимо, чтобы отсутствовала или была минимальной иммунологическая толерантность к этому конкретному эпитопу. Поэтому важно выбрать лишь те пептиды из гиперэкспрессированных или селективно экспрессированных белков, которые презентируются в соединении с молекулами МНС, против которых может быть обнаружена функциональная Т-клетка. Такая функциональная Т-клетка определяется как Т-клетка, которая при стимуляции специфическим антигеном может быть распространена клонально и способна к выполнению эффекторных функций (эффекторная Т-клетка).
Т-хелперные клетки играют важную роль в управлении эффекторной функцией ЦТЛ в противоопухолевом иммунитете. Эпитопы Т-хелперных клеток, инициирующие ответы Т-хелперных клеток типа ТН1, поддерживают эффекторные функции СЭ8-положительных киллерных Т-клеток, которые включают цитотоксические функции, направленные против опухолевых клеток, представляющих опухолеассоциированные пептиды/МНС-комплексы на их клеточной поверхности. Таким образом, опухолеассоциированные эпитопы Т-хелперных клеток, одни или в комбинации с другими опухолеассоциированными пептидами, могут служить в качестве активных фармацевтических ингредиентов вакцинных композиций, которые стимулируют противоопухолевые иммунные ответы.
Так как оба вида ответов, зависящие от СЭ8 и от СЭ4. вносят свой вклад в противоопухолевый эффект сообща и усиливая друг друга, то идентификация и характеристика опухолеассоциированных антигенов, распознаваемых как СЭ8+ ЦТЛ (лиганд: молекула МНС I класса + пептидный эпитоп), так и СЭ4положительными ЦТЛ (лиганд: молекула МНС II класса + пептидный эпитоп) являются важными при разработке противоопухолевых вакцин. Поэтому целью настоящего изобретения является обеспечение новых аминокислотных последовательностей для пептидов, которые способны связываться с комплексами МНС любого класса.
Краткое описание чертежей
На фиг. 1 представлены масс-спектры Е81-жидкостной хроматографии, идентифицирующие опухолеассоциированный пептид (ТИМАР) РС№002 из пробы карциномы толстой кишки ССА707 (фиг. 1а), ТОР-002 из пробы глиобластомы СВ1006 (фиг. 1Ь), РТР-001 из пробы глиобластомы СВ1006 (фиг. 1с), САБ-001 из пробы почечно-клеточной карциномы ВСС190 (фиг. 1й). СН1-001 из пробы глиобластомы СВ1002 (фиг. 1е), 1АК-001 из пробы глиобластомы СВ1002 (фиг. 1Г), АКВ-001 из пробы немелкоклеточного рака легкого №СЬС-Роо1 2 (фиг. 1д) и ΕΝΙ-001 из пробы карциномы поджелудочной железы РС330 (фиг. 11). которые были презентированы рестриктированным по МНС класса I образом.
На фиг. 2 представлены масс-спектры Е8I-жидкостной хроматографии, идентифицирующие опухолеассоциированный пептид (ТИМАР) СЕА-009 из пробы рака желудка СС-Роо1 2 (фиг. 2а), ТСЕВI-006 из пробы рака желудка СС-Роо1 1 (фиг. 2Ь), ТСЕВI-007 из пробы глиобластомы СВ6002 (фиг. 2с), ТСЕВЕ 008 из пробы глиобластомы СВ1004 (фиг. 2й). ТСЕВЕ009 из пробы немелкоклеточного рака легкого №СБС-Роо1 1 (фиг. 2е) и ТСЕВЕ010 из пробы глиобластомы СВ6002 (фиг. 2Г) которые были презентированы рестриктированным по МНС класса II образом.
На фиг. 3 представлены экспрессионные профили двух генов, кодирующих глиобластомаассоциированные пептиды РТР-001 (фиг. 3а) и СШ-001 (фиг. 3Ь). Экспрессия этих генов отсутствует или находится на низком уровне в нормальных тканях, в то время как она увеличена более чем в 250 раз в пробах глиобластомы (СВ1006Т по СВ1011Т; ^Н359Т и ^Н361Т).
- 3 018456
На фиг. 4 показаны аффинности связывания выбранных пептидов по отношению к НЬЛ-Л*0201, как показали измерения по методике Ер1 ЕЬ18Л в соответствии с 8у1уе81ет-Ну1б, С, Кпйепкеп, Ν, ВНсНег, Т, Ретте, Н, Еаието11ег, 8Ь, \Уо1Г, ХА, ЬатЬеПН. К, №ккеп, МН, Ребегкеп, ЬО, апб Виик, 8; 2002, Ек(аЬПкНтегИ оГ а с.|иап1йаНсе ЕЬ18А сараЬ1е оГ бе1егтйнпд рерббе - МНС с1акк I 1п(егас11оп, Тйкие Апйдепк, 59, 251-258. Анализ был ограничен пептидами, о которых известно, что они связываются с МНС класса I. Аффинность пептидов, связывающихся с НЬА-ЭК не могла быть измерена в данном анализе.
На фиг. показан тетрамерный анализ стимулированной микросферой пролиферации ООС-001 и ΝΟΧ-001-специфических 0Ό8+ лимфоцитов из периферической крови. ПК, обогащенные на лунку 1 х 106 0Ό8' здорового донора НЬА-А*0201 + НЭ100 стимулировались еженедельно микросферами, связанными с анти-СО28 плюс опухолевый антиген высокой плотности А*0201/ОЭС-001 (верхняя секция) или анти-СО28 плюс опухолевый антиген высокой плотности А*0201ТХОХ-001 (нижняя секция). После трех стимуляций ίη уйто клетки были окрашены антителом СЭ8 Р1ТС плюс тетрамеры Λ*0201/ΝΟΧ-001 РЕ и А*0201/ООС-001 АРС. Клетки высаживаются в популяцию лимфоцитов или СЭ8+ лимфоцитов (правая секция), и цифрами обозначена процентная доля тетрамера+ среди лимфоцитов СЭ8+.
На фиг. 6 представлена иммуногенность ίη уйто ТСРВ1-004, обнаруженного ΙΡΝγ ЕМ8РОТ после пяти циклов стимуляции.
Клетки примировали и рестимулировали повторно ТСРВ1-004, а затем инкубировали с релевантным ТСРВ1-004 (лунки 1, 2, 3 и 4) и нерелевантным (отриц. контроль) пептидом, соответственно. Анализ после 1Р^ ЕМ8РОТ был произведен на ЕЬ18РОТ-ридере (СТЬ, С1еуе1апб, США). ФГА-иономицин служил положительным контролем. Цифры соответствуют количеству положительных точек.
На фиг. 7 представлена иммуногенность ίη ейго ТСРВ1-004, обнаруженного методом 1С8 после пяти циклов стимуляции.
Клетки примировали аутологичными ДК с нагруженным ТСРВ1-004 и рестимулировали аутологичными МПК плюс ТСРВ1-004. Для считывания клетки инкубировали с релевантным ТСРВ1-004 (лунки 1, 2, 3 и 4) и нерелевантным (отриц. контроль) пептидом, соответственно. В дополнение к внутриклеточному окрашиванию ^Νγ, клетки были также окрашены антителами СЭ4-Р1ТС и СО8-РетСР. Анализ проводили на четырехцветном цитометре РАС8Са11Ьиг (ВО Вюкаепсек, Германия).
На фиг. 8 представлен анализ ЕМ8РОТ выработки ^Νγ линиями Т-клеток при рестимуляции ш νί1го пептидом NΟX-001. А. Т-клеточная линия 7+ донора НВС-154 (отсортированы СЭ8+ NΟX-001 тетрамер+); В. Т-клеточная линия 7- донора НВС-154 (отсортированы СЭ8+ NΟX-001 тетрамер).
Отсортированные клетки СЭ8+ NΟX-001 тетрамер+ (А.) и СЭ8+ NΟX-001 тетрамер-(В.) анализировали методом 1Р^ ЕЫ8РОТ после рестимуляции нерелевантным (МЬА-001) (верхние лунки) и релевантным ЩОХ-001) (нижние лунки) пептидом (10 мкг/мл). Цифры соответствуют количеству положительных точек.
На фиг. 9 показаны аффинности пептидов к НЕА-А*0201, содержащихся в настоящем изобретении. Константы диссоциации (Кс) пептидов Р116 НЬА класса I и вирусного пептида-маркера НВУ-001 были измерены основанным на методике ЕЬ18А анализом (см. примеры).
Детальное описание изобретения
В первом аспекте изобретение обеспечивает пептид, включающий последовательность, которая выбирается из группы 8ЕЦ ΙΌ № 1 по 8ЕЦ ΙΌ № 29 или ее вариант, который на 80% гомологичен 8ЕЦ ΙΌ № 1 по 8ЕЦ ΙΌ № 29, или вариант, который будет индуцировать Т-клеточную перекрестную реакцию с указанным пептидом.
В настоящем изобретении термин гомологичный относится к степени идентичности между последовательностями двух аминокислотных последовательностей, т.е. пептидных или полипептидных последовательностей. Упомянутая ранее гомология определяется при сравнении двух последовательностей, сопоставляемых в оптимальных условиях со сравниваемыми последовательностями. Сравниваемые последовательности могут иметь дополнение или делецию (например, разрыв и т.п.) в оптимальном противопоставлении двух последовательностей. Такая гомология последовательности может быть подсчитана с помощью создания противопоставления, например, по алгоритму С1ик1а1\У Щис1е1с Ас1б Кек., 22(22): 4673 4680 (1994). Также может быть использовано широко распространенное программное обеспечение для анализа последовательностей, в частности, Уес1ог ΝΊΊ, СЕХЕТУХ или аналитические инструменты, предоставляемые общественными банками данных, такие как, например, 1Шр:// бгадоп.Ыо .ригбие. еби/ЬюшРойпкк/.
Специалист данной области будет в состоянии оценить, будут ли Т-клетки, индуцированные вариантом специфического пептида, способны к перекрестной реакции с самим пептидом (Ропд, Ь., Нои, Υ., Кйак, А., Вешке, С., Υ^π, А., Р1кйет, С.А., Όπνίδ, М.М., апб Епд1етап, Е.С.; 2001, АЙетеб рер11бе йдапб сасс1па(1оп \\ЙН РЙ3 йдапб ехрапбеб бепбгН1с се11к Гог (итог 1ттипоЛетару, Ргос. №11. Асаб. 8сй И.8.А, 98, 8809-8814); (2атетЬа, 8., Вагхада, Е., ΖΗυ, М., 8оагек, Ν., Ткапд, Κ.Υ., апб 8сН1от, 1.; ШепбГюабоп оГ ап епНапсег адошк! су1о1охю Т 1утрНосу1е рерНбе Ггот Нитап сагсшоешЬтуошс апйдеп, Сапсег Кек., 1997, 57, 4570-4577; Со1отЬей1, 8., РадегЬегд, Т., Ваитдайпег, Р, СНарайе, Ь., 8ре1кег, О.Е., КиГег, Ν., МюЫейп, О., апб Весу, Р.;, !трас1 оГ оййо1одоик те1ап-А рерНбе нптишхаБопк оп (Не апй-ке1Г теИп-А/НЕА-А Т
- 4 018456 се11 стозз-теасйуйу, 1 1ттипо1., 2006, 176, 6560-6567; Аррау, V., 8ре1зег, Ό.Ε., КиГег, Ν., Кеупагй, 8., ВагЬеу, С., Сегой1ш, ТС., кеуугах, 8., РшШа, С. апй Котего, Р.; Оесгеазей зресШс ΟΌ8+ Т се11 стозз-теасйуйу о! апйдеп гесодпйюп Го11о\утд уасстайоп тейй Ме1ап-А рерййе, ЕигЭ 1ттипо1, 2006, 36, 1805-1814).
На табл. 1 представлены пептиды, их номера последовательностей (8ЕО ΙΌ №), а также информация о родительских белках.
Таблица 1. Пептиды настоящего изобретения
8ЕО Ю № Код пептида Последовательность Аллели НЬА Ген(ы)
1 С20-001 ΑΙ.8ΝΙ ΕνΤΙ Α*02 С20огГ42
2 ΝΟΧ-001 ΙΙ ΑΡνΐΙ ΥΙ Α*02 ΝΟΧ1
3 ΡΟΝ-001 ΚΙΜΟίΟνΕΟί Α*02 ΡΟΝΑ
4 ΡΟΝ-002 8Μ8Α0νΡΙ ν Α*02 ΡΟΝΑ
5 ТОР-001 ΚΙΕϋΕΙίνΝΑ Α*02 ТОР2А.ТОР2В
6 ТОР-002 ААЕУЕЕТОКУ Α*02 ТОР2В
7 СЕА-009 νίΛΙΔ/ΗΝΙ-ΡΟΗΙ-ΕΘ с1азз II СЕАСАМ5
8 ΤΟΕΒΙ-001 ΑίΕνκι υ\ι Α А*02,А*02/В*13? ΤΟΕΒΙ
9 ΤΟΕΒΙ-006 ΟΟΚΙ Εν8Ι.ΚΝΝνν8 класс II ΤΟΕΒΙ
10 ΤΟΕΒΙ-007 ΟΚΚΙ ΚνΕνΥΚΝ8Ι ΟΙΕΝ8 класс II ΤΟΕΒΙ
11 ΤΘΕΒΙ-008 ΙΚΝΝννδνΝΚΕΡνΑΕΡϋ класс II ΤΟΕΒΙ
ΚΝΝννδνΝΚΕΡνΑΕΡϋ класс II ΤΟΕΒΙ
ΚΝΝννδνΝΚΕΡνΑ класс II ΤΟΕΒΙ
Ι ΚΝΝ\Λ/8νΝΚΕΡνΑ класс II ΤΟΕΒΙ
12 ΤΘΕΒΙ-009 ΝθνίΗΥΙΟΕίίΙΡϋδ класс II ΤΟΕΒΙ
ΟνίΗΥΙΟΕΙΧΙΡϋδΑ класс II ΤΟΕΒΙ
13 ΤΟΕΒΙ-010 Ι ΝΚΙίβΟΡΕΑΙ.ΡΟ1 класс II ΤΟΕΒΙ
14 ТОЕВ1-004 ΤΡΡΙΟΑΗΤΚΝΙ 1 ΚΝΗ класс II ΤΟΕΒΙ
15 РТР-001 ΑΙ/ΓΠ.ΜΗΟΙ. А*02 ΡΤΡΚΖ1
16 ОАЮ01 δΐΌΡδδΡΩν А*02 САЬЗЗТ1
17 СН1-001 8Ι ννΑ0νννΐ А‘02 СН131.2
18 ЗАК-001 ΚΙ ΤϋΙΟΙΕΙ А*02 ΊΑΚΜΙΡ2
19 АКК-001 ΥίίΗΕΡνεν А*02 АКК1С1, АКК1С2
20 ΕΝ1-001 ΐνϋϋΙΤΥΝν А‘02 ΕΝ1
21 ЕСЕК-002 ΟΑνΚΕδΝΝΡΑίΟΝνΕδ класс II ЕСЕК
ΑνΚΕ8ΝΝΡΑΙ ΟΝνΕ8 класс II ЕСЕК
ΑνΚΕδΝΝΡΑΙ,ΟΝνΕ класс II ЕОЕК
22 ЕСЕК-005 ΝΡΤΤΥΟΜΟνΝΡΕΟΚΥδ класс II ЕСЕК
23 ЕСЕК-006 ΕΚΚΙΚνί-ΘδΟΑΕΟ класс II ЕОЕК
24 СН13Й1-001 ΤΠ.ΙΚΕΜΚΑΕΕΙΚΕΑΟΡΟ класс II СН131.1
ТЫКЕМКАЕЕ1КЕАОРО класс II СН13П
ТТЫКЕМКАЕЕ1КЕА класс II СН13Й1
ΤΙ-ΙΚΕΜΚΑΕΕΙΚΕΑ класс II СН13Е1
ΙΚΕΜΚΑΕΕΙΚΕΑΟΡΘ класс II СН13Ы
ΤΤίΙΚΕΜΚΑΕΕΙΚΕ класс II СН13И
25 СН13Ц1-007 νΚ8Κν0ΥίΚ0Κ0Ι ΑΟ класс II СН131Й
26 СН13И-008 8ККТЕ1К8УРРЕ1 КТ класс II СН131.1
27 ϋΟΑ-001 ΚίΟϋΕΟΙ-ΑΤνν А*02 ОСАМК1 2
28 ΚΟΝ-001 δΕΕϋοννκν ΑΌ2 КСШ10
29 СРМ-001 ΑΙ Ι 8ΕνΐΟΙ А‘02 ОРМ6В
Открытая рамка считывания 42 хромосомы 20
С20огГ42 является белком фокальной адгезии, задействованным в присоединении актинового цитоскелета к плазменной мембране и в опосредованных интегрином клеточных процессах. Дефицит С20огГ42 как результат мутаций с потерей функции приводит к синдрому Киндлера, аутосомальному рецессивному генодерматозу, характеризующемуся образованием волдырей на коже, прогрессивной атрофией кожи, светочувствительностью и, изредка, к канцерогенезу (Нет/, С., АишаШеу, М., 8с1ш11е, С., 8с111о1хег-8с11ге11агй1, и., Вгискпег-Тийегтап, Ь. апй Наз, С.; Ктййп-1 ίβ а рйозрйорго1ет шуокей шгеди1айоп оГ ро1агйу, ртойГетайоп, апй шойй!у оГ ер1йегта1 кегайпосу!ез, 1 Вю1 С1ет., 2006, 281, 36082-36090). Недавно сообщалось о серьезном поражении желудочно-кишечного тракта с гемоколитом у пациента с мутацией с потерей функции (8ай1ег, Е., К1аизеддег, А., Мизз, ЭД, ОетзЬегдег, и., РоЫа-биЬо, 6., Ьа1тет, М., Ьапзсйие12ег, С., Ваиег, ТЭД. апй НшЩет, Н.; №ге1 ΚΙΝΏ1 депе шФайоп т Кшй1ег зупйготе тейй зеуеге дазйот1ез1ша1 1гас( туокетепЕ Агсй. Оегта1о1, 2006, 142, 1619-1624).
В контексте раковых заболеваний С20огГ42 описывался в исследованиях, занимающихся изучением экспрессии генов в окружении, имеющем отношение к раку. Как было обнаружено, он был гиперэкспрессирован в 70% случаев рака толстой кишки и 60% случаев рака легких (п = 10). Нормальная тканевая экспрессия при нозерн-блоттинге (№ййетп В1о!) была ограничена нейромышечными тканями (ЭДетз1ет, Е.Т, Воигпег, М., Неай, К., 2акеп, Н., Ваиег, С. апй МаххагеНа, К.; ИКР1: а тетЬег оГ а поуе1 Гатйу оГ РН апй ТЕРМ йотат-соп1айппд тетЬгапе-аззоаа1ей рго!ешз 1з з1дшйсапйу оуег-ехргеззей ш 1ипд апй со1оп сатсшотаз, ВюсЫт. Вюрйуз. Ас!а, 2003, 1637, 207-216). Кроме того, С20огГ42 был идентифицирован как ген, участвующий в ΤΟΡ-β-опосредованной клеточной миграции и опухолевой инвазии (К1оекег, 8., Ма
- 5 018456 |ог. М.В., Са16сг\\'оо6. Ό.Ά., ОшкЬетд, МН, 1опек, Ό.Ά. апб Вескег1е, М.С.; Тйе Кшб1ет купбготе рго1еш ίκ геди1а1еб Ьу капкГогтшд дгоМй Гас1ог-Ье1а апб тчокеб ίη 1п1едг1п-теб1а1еб абйекюп 1. Вю1. Сйет., 2004, 279, 6824-6833).
ΝΑϋΡΗ-оксидазы гомолог-1 (N0X1)
N0X1 является чувствительным к факторам роста ферментом, который катализирует образование реактивных форм кислорода, высшего оксида (О2-) и перекиси водорода (Н2О2). Его экспрессия была первоначально выявлена в толстой кишке, простате, матке и пролиферирующих васкулярных гладкомышечных клетках (8ий, Υ.Α. е1 а1. 1999, Се11 КапкГоттайоп Ьу 1йе кирегох1бе-депегайпд ох1баке Мох1. №1Ц.1ге 401, 79-82). Его экспрессия связана с рядом биологических реакций, включая клеточную пролиферацию, ангиогенез и активацию клеточных сигнальных путей (Нагрет, Κ\ν., Хи, С, 8оисек, К., 8ебабт Н. апб Ещепсй, ЕР. Α теарргаща1 оГ 1йе депоиис огдашхайоп оГ йитап №х1 апб ίΐκ крйсе уалапК Агсй. Вюсйет. Вюрйук. 2005, 435, 323-330).
N0X1 высоко экспрессирован в толстой кишке, но его функция в кишечной физиологии или патологии до сих пор плохо изучена. В нормальных тканях экспрессия N0X1 была низкой в подвздошной кишке, средней в восходящей ободочной кишке и высокой в нисходящей ободочной кишке. Статистических различий по экспрессии N0X1 не наблюдалось между пробами, взятыми из аденом, хорошо или плохо дифференцированных аденокарцином толстой кишки. N0X1 был высоко экспрессирован в эпителиальных клетках толстой кишки, как в криптах, так и на люминальной поверхности. В заключение, N0X1 является ферментом, который конститутивно экспрессирован в эпителии толстой кишки и не ассоциирован напрямую с генезом опухоли (ЗхаШо, I. е1 а1. Ехртеккюп оГ N0X1, а кирегох1бе-депега1тд НАЭРН ох1баке, т со1оп сапсег апб тПаттаЮгу Ьо\\е1 бщеаке. бРа!йо1. 2005, 207, 164-176).
Иммуногистохимия показала, что N0X1 был конститутивно экспрессирован в поверхности слизистых клеток. Аденомы и хорошо дифференцированные аденокарциномы повышали уровень экспрессии N0X1. Ядерный фактор (ИЕ)-карраВ был преимущественно активирован в клетках аденомы и аденокарциномы, экспрессирующих в избытке N0X1, позволяя предположить, что N0X1 может стимулировать ИЕ-карраВ-зависимые антиапоптотические каскады реакций в опухолях толстой кишки (Еикиуата, М. е1 а1. 0уегехргеккюп оГ а похе1 кирегох1бе-ргобистд еп/уте, НАЭРН ох1баке 1, т абепота апб \\е11 б1ГГегеп(1а1еб абепосагсшота оГ 1йе йитап со1оп. Сапсег Ьей. 2005, 221, 97-104).
Сигнальные реакции ^п!3а/Ье1а-катенина, как было описано, индуцируют экспрессию N0X1 (Ре1торои1ок, Н. & 8кег|апс, I. 8. Ве1а-са1ешп ίκ еккепиб апб киШаеп! Гог кке1е1а1 туодепекщ т Р19 се11к. 1 Бю1 Сйет. 2002,277, 15393-15399).
Недавно предполагалось, что реактивные формы кислорода индуцируют эндотелиальный апоптоз, который впоследствии индуцирует экспрессию различных адгезивных молекул для опухолевых клеток. Это указывает на то, что при остановке выделения К08 (реактивные формы кислорода) препятствование рецидиву опухоли на отдаленных участках может быть обоснованным (Теп, К.М., чап бег ^а1, 1.В., 81ийет, НоГ1апб, Ь.1, 1ееке1, К 8оппеуе1б, Р. апб уап Еуск, С.Н.; Тйе го1е оГ кирегох1бе апюпк ш 1йе беуе1ортеп1 оГ б181ап( Штоит гесиггепсе, Вг.1. Сапсег, 2006, 95, 1497-1503).
Ядерный антиген пролиферирующих клеток (ΡΟΝΑ)
РСNΑ был обнаружен в ядре и является ко-фактором ДНК-полимеразы дельта. Кодируемый белок выступает в качестве гомотримера и помогает увеличить процессивность синтеза ведущей нити во время репликации ДНК. Поэтому он экспрессирован во всех пролиферирующих клетках, в особенности опухолевых клетках, и используется в качестве маркера для детекции пролиферации.
ДНК-топоизомераза II
ТОР2А и ТОР2В кодируют изоформы ДНК-топоизомеразы, фермента, который контролирует и меняет топологическое состояние ДНК во время транскрипции. Данный ядерный фермент задействован в таких процессах, как конденсация хромосом, сепарация хроматид и снятие торсионного напряжения, которое возникает во время транскрипции и репликации ДНК. ДНК-топоизомераза катализирует временный разрыв и воссоединение двух нитей дуплекса ДНК, который позволяет нитям пройти сквозь друг друга, меняя тем самым топологию ДНК. Две изоформы данного фермента существуют, как предполагается, как продукты явления дупликации гена. Г ен, кодирующий альфа-форму, локализован в хромосоме 17, а бета-ген локализован в хромосоме 3.
ТОР2А является мишенью для нескольких противораковых агентов, а ряд мутаций в этом гене были ассоциированы с развитием резистентности к лекарственным средствам.
Ген ТОР2А расположен смежно с онкогеном НЕК-2, наиболее часто амплифицируемым онкогеном при раке груди, на хромосомной локализации 17с|12-с|2Е и либо амплифицирован, либо делетирован, с одинаковой частотой, в почти 90% случаев первичных опухолей груди с амплификацией НЕК-2 (1атушеп, Т.А. апб Ьш, Е.Т.; Торощотетаке II а1рйа депе (Т0Р2А) атрййсайоп апб бе1е!1оп т сапсег-тоге соттоп 1йап апйара1еб, Су1ора1йо1оду, 2003, 14, 309-313). Более того, об амплификациях ТОР2А сообщалось и в связи с другими видами рака.
Без ТОР2А невозможны репликация ДНК и деление клетки. Поэтому он стал основной мишенью многих лечебных схем при лечении опухолей, хотя точный механизм уничтожения клеток остается неясным (Ке11пег, и., 8ейек1еб, М., .Тепкеп, Р.В., 01еке1ег, Е. апб Кибо1рй, Р.; Сы1ргИ апб νίαίιη - ЭХА 1оро1кот- 6 018456 егазе II, Ьапсе! Опсо1, 2002, 3, 235-243). Успех данного подхода ограничивается возникновением спонтанной резистентности, и индуцированное медикаментами повреждение ДНК может увеличить злокачественность. Последние данные позволяют предположить, что амплификация и делеция ТОР2А может сказываться как в чувствительности, так и резистентности к ТОР2А-ингибирующей химиотерапии, в зависимости от специфического генетического дефекта на локусе ТОР2А.
Неясно, имеет ли сходство участие ТОР2В в раковых заболеваниях с ТОР2А, или же между этими двумя изоформами имеется существенная разница. ТОР2В может, по крайней мере, быть дополнением в активности ТОР2А (8акадисН1, А апб К1кисЫ, А; Еипсйопа1 сотрайЬбйу Ье!гееп «оГогт а1рНа апб Ье1а οί 1уре II ΌΝΑ !оро1зотегазе, I Се11 8сг, 2004, 117, 1047-1054).
Карциномоэмбриональная, родственная антигену молекула клеточной адгезии 5
Карциномоэмбриональный антиген (СЕА = СЕАСАМ5), 180 кДа, является обильно гликозилированным мембранным белком, состоящим из трех С2 ^-подобных повторяющихся звеньев, примыкающих к Ν-концевому Ц У-подобному участку и С-концевому участку, который включает участок сцепления гликофосфатидилинозитола (Недбе, Р., Οί. Я, Оазрагб, Я, АЬета!Ну, К., ОНагар. 8., Еаг1е-НидНез, 1, Оау, С., ^гокекей Ν.Ή., СНеп, Т., 8аееб, АД, 8Нагоу, V., Ьее, Ν.Η., Уеа!тап, Т.1. апб ОпаскепкизН, 1; ШепИйсабоп оГ !итоиг тагкегз т тобе1з оГ Нитап со1огес!а1 сапсег изтд а 19,200-е1етеп1 сотр1етеп1агу ЭНА ткгоаггау, Сапсег Яез., 2001, 61, 7792-7797).
Являясь онкофетальным антигеном, СЕА экспрессируется во время эмбрионального развития, но и также, на низком уровне, в желудочно-кишечном эпителии взрослых. Однако СЕА гиперэкспрессирован в высокой степени в опухолях человека, включая 90% случаев желудочно-кишечного, колоректального рака и рака поджелудочной железы, 70% клеток немелкоклеточного рака легких и 50% случаев рака груди (ТНотрзоп, 1.А., Огипей, Е. апб 21ттегтапп, И.; СагстоетЬгуошс апйдеп депе ГатПу: то1еси1аг Ыо1оду апб с11тса1 регзресйуез, 1 СИп ЬаЬ Апа1, 2005, 5, 344-366). Из-за своего высокого уровня экспрессии в опухолевых клетках и секреции в сыворотку СЕА широко использовался в качестве опухолевого маркера (81когзка, Н., 8Низ!ег, 1., апб Оо1б, Р; С11шса1 аррйсайопз оГ сагстоетЬгуошс апйдеп, Сапсег Ие!ес!.Ргеу., 1988, 12, 321-355) и является стандартным сывороточным маркером для мониторинга колоректального рака (Ьоскег, Ο.Υ., НатШоп, 8., Нате, 1., 1е88ир, 1.М., Кетепу, Ν, Масбопа1б, 1.8., 8отегйе1б, МЯ, Науез, ИЕ, апб Ваз!, Я.С., 1г.; А8СО 2006 ирба!е оГ гесоттепбайопз Гог !Не изе оГ !итоиг тагкегз т даз1гот!езйпа1 сапсег, 1 СИп Опсо1, 24, 5313-5327).
Несмотря на гиперэкспрессию СЕА в опухолевых клетках, раковые пациенты обычно не дают иммунного ответа на данный антиген (Огейсе, 8, Еоззай, О, Р1е(го)и8Н, Е, апб ВопГапй, О; Ие1ауеб си1апеоиз НурегзепзШуку геасйоп !о сагстоетЬгуошс апйдеп т сапсег райеп!з, Титошг, 1982, 68, 473-475). Иммунная система обычно становится толерантной к СЕА, потому что он в нормальном случае экспрессирован в организме на низком уровне. Однако в сериях клинических исследований вакцин была продемонстрирована иммуногенность СЕА (8агоЬе, Р, Ниайе, Е, Ьазайе, Л, апб Воггаз-Сиез1а, Е; СагстоетЬгуошс апйдеп аз а !агде! Ю тбисе апййитоиг 1ттипе гезропзез, Сигг. Сапсег Игид Тагде!з., 2004, 4, 443-454), в особенности при колоректальном раке (КРР) (МозоШз, 8, И11епНад, О, апб Ме11з!еб!, Н; ТНегареийс хасстайоп 1п райеп!з гйН даз!гош!езйпа1 тайдпапаез. А геу1ег оГ 1ттипо1од1са1 апб с11шса1 гезийз, Апп.Опсо1, 2005, 16, 847-862), и СЕА является опухолеассоциированным антигеном (ТАА) с обширным количеством вакцин, протестированных на данном виде опухоли (уоп МеНгеп, М; Со1огес!а1 сапсег уасстез: гНа! ге кпог апб гЬа1 ге боп'! уе! кпог, 8етт Опсо1., 2005, 32, 76-84).
Несколько цитотоксических и хелперных Т-клеточных эпитопов были описаны для СЕА (Стозй, М, ЬопдЫ, Я, Сопзодпо, О, Ме11ош, О, 2апшпг Р, апб Рто!й, МР; Iбепйί1сайοп оГ похе1 зиЬбот1пап! ерйорез оп !Не сагстоетЬгуошс апйдеп гесодшхеб Ьу СИ4+ Т-се11з оГ 1ипд сапсег райеп!з, 1 Iттипο1., 2006, 176, 5093-5099; йохеИто, Ь, Саз!еШ, С, апб Рагт1аш, О; А йзйпд оГ Нитап !итоиг апйдепз гесодшхеб Ьу Тсе11з: МагсН 2004 ирба!е, Сапсег Iттипο1.Iттипο!ке^., 2004, 54, 187-207; Ртх, М, КоЬауазЫ, Н, Ьазайе, Л, Рпе!о, 1, Воггаз-Сиез!а, Е, Сейз, Е, апб 8агоЬе, Р; ШепИйсайоп апб сйагасЮпхайоп оГ а Т-Не1рег рерйбе Ггот сагстоетЬгуошс апйдеп, СИп Сапсег Яез., 2004, 10, 2860-2867), позволяющих проведение ряда основанных на пептидах клинических исследований вакцин против КРР (ВаЬаР, 1, ЯоШд, С, ЬоЬе1, В, Ео1ргесН!, О, Нааск, М, Оип!Нег, Н, Кокие, СН, ЕНптдег, О, 8с11тЦх, М, апб ВотНаизег, М; Шбисйоп оГ се11и1аг 1ттипе гезропзез адатз! сагстоетЬгуошс апйдеп т райеп!з гйН те!аз!айс !итоигз айег уасстайоп гйН а1!егеб рерйбе йдапб-1оабеб бепбпйс се11з, Сапсег ^типок Iттипο!ке^., 2006, 55, 268-276; Еопд, Ь, Нои, Υ, ЯИаз, А, Вешке, С, Υ^^ А, Е1зНег, ОА, Иау1з, ММ, апб Епд1етап, ЕО; А1!егеб рерйбе кдапб уасапайоп гкН Е1!3 кдапб ехрапбеб бепбпйс се11з Гог !итоиг хттипоШегару, Ргос. №!1. Асаб. 8ск И.8.А, 2001, 98, 8809-8814; Ьт, Кб, Иапд, СС, СНеп, ЬТ, СНепд, АЬ, Ьт, ИТ, Ии, ΥΟ, Υυ ИЬ, Нипд, ΥΗ Υ^, НУ, 1папд, 8Н, апб ИНапд-Репд, 1; Оепегайоп оГ сагстоетЬгуошс апйдеп (СЕА)-зресгйс Т-се11 гезропзез т НЬА-А*0201 апб НЬА-А*2402 1а!е-з!аде со1огес!а1 сапсег райеп!з аНег хасстаЬоп гйН бепбпйс се11з 1оабеб гйН СЕА рерйбез, С1т Сапсег Яез., 2004, 10, 2645-2651; Ма!зиба, К, Тзипоба, Т, Тапака, Н, Итапо, Υ, Таштига, Н, Nикауа, I, Такезако, К, апб Υатаие, Н; ЕпНапсетеп! оГ су!о!охю Т-1утрНосу!е гезропзез т райеп!з гкН даз1гот!езйпа1 такдпапаез Гойогтд хасстаЬоп гйН СЕА рерйбе-ри1зеб бепбпйс се11з, Сапсег Iттипο1. Iттипο!ке^., 2004, 53, 609-616; Иеба, Υ, ЙоН, Т, Nикауа, I, КагазЫта, I, Окидага, К, Υапο, Υ, Υататο!ο, Υ, Nа^!οк, К, 8Н1т17и, К, ^ωη, К, Еир, Ν, Еиргага, Н, ОсЫац Т, Ио1, Н, 8опоуата, Т, На
- 7 018456 дЮата, А, Такезако, К, апй Уатад1зкк Η; ЭепйпПс се11-Ьазей 1ттипо1кегару оГ сапсег \νί(1ι сатсшоетЬтуоп1с апйдеп-йейуей, НГА-А24-гез1пйей СТЬ ерйоре: С11шса1 ойсотез оГ 18 райейз \νί(1ι те1аз1акс даз!гоШ1е81та1 ог 1ипд айепосагстотаз, 1п1. 1 Опсо1., 2004, 24, 909-917; \Уе111гаис11. МЯ, Апзеп, 8, 1игк1е\\1сх. Е, Се1зеп, С, Х1а, Ζ, Апйегзоп, К8, Сгас1еп, Е, 8скт1й!, М, \Уййд, В, Э1ек1, V, ^о1Г, 1, Вок1еп, Н, апй Ыай1ег, ЬМ; Рказе Ι/ΙΙ сотЫпей скето1ттипо!кегару \\'кк сагсшоетЬгуошс апйдеп-йепуей НГА-А2-гез!г1с!ей САР-1 рерййе апй шпо!есап, 5-йиогоигас11, апй 1еисоуогт т райейз \\йк рптагу те!аз1айс со1огес!а1 сапсег, С1ш Сапсег Яез., 2005, 11, 5993-6001). Данные и другие клинические исследования на данный момент продемонстрировали безопасность вакцинаций СЕА и доказательства для индукции иммунного ответа против данного антигена (уоп Мекгеп, М; Со1отес!а1 сапсег уасстез: \гка1 \ге кпо\у апй \гка1 \ге йоп'1 уе! кпоте, 8етт. Опсо1., 2005, 32, 76-84).
Трансформирующий фактор роста, бета-индуцированный (ТСРБ1)
ТСЕВ1 был первым геном, идентифицированным в качестве ТСЕ-бета-индуцированного в клеточной линии человеческой аденокарциномы легких. Он кодирует секретируемый внеклеточный матричный белок, который, как предполагается, задействован в присоединении клеток и формировании внеклеточной матрицы.
Как было показано, ТСЕВ1 находится среди генов с наиболее значительно повышенным уровнем при колоректальном раке, и он также экспрессирован на высоком уровне в аденомах. Результаты количественной ПЦР демонстрируют сильное повышение, как в неочищенных опухолях, так и очищенных эпителиальных клетках опухоли. Соответственно, проведенные ш зйи эксперименты по гибридизации показали, что ТСЕВ1 экспрессирован во многих видах клеток, как в стромальных, так и эпителиальных компартментах (ВисккаиИз, Р, Яадо, С, 8ΐ, СВ, Яотапз, КЕ, 8ака, 8, Ζкаηд, Ь, ^де1з!е1п, В, апй Кт/кг, К\У; 8есге1ей апй се11 зигГасе депез ехргеззей ш Ьешдп апй такдпай со1огес!а1 Штоитз, Сапсег Яез., 2001, 61, 6996-7001).
При мета-анализе исследований, изучающих экспрессию генов при колоректальном раке, было установлено, что ТСЕВ1 является одним из всего девяти генов, которые были описаны как содержащиеся многократно в повышенном количестве (4 исследования для ТСЕВ1) (81ιί1τ Скейу, Я, апй Тзао, М8; Ехртеззюп ртоГПтд Ьу тютоаттауз ш со1отес!а1 сапсег, Опсо1. Яер., 2005, 13, 517-524).
В человеческих тканях поджелудочной железы наблюдалось повышение уровня ТСЕВ1 мРНК в 32,4 раза при раке поджелудочной железы в сравнении с нормальными контрольными тканями. Гибридизационный анализ ш зйи показывает, что ТСЕВ1 мРНК был экспрессирован, в основном, в раковых клетках внутри опухолевой массы поджелудочной железы (8скпе1йег, Ό, К1ееГГ, 1, ВетЬета!, РО, ΖΙιιτ Ζ, Когс, М, Епезз, Н, апй Виск1ег, М\У; 1пйисйоп апй ехртеззюп оГ Ье!а1д-к3 ш рапстеайс сапсег се11з, Вюскки. Вюркуз. Ас!а, 2002, 1588, 1-6).
В модели ш νίίΓΟ было установлено, что ТСЕВ1 является геном, способствующим ангиогенезу. К тому же резко повышенный уровень экспрессии ТСЕВ1 был обнаружен в нескольких видах опухолей. Антисмысловые олигонуклеотиды к ТСЕВ1 блокировали как экспрессию генов, так и образование эндотелиальных трубок ш νίίτο, заставляя предположить, что ТСЕВ1 может играть ведущую роль во взаимодействиях в эндотелиальной клеточной матрице (Айкепкеай, М, ^апд, 81, №1ка1з1г МЫ, Мез!аз, 1, Неагй, С, апй Нидкез, СС; 1йепйПсайоп оГ епйо!кейа1 се11 депез ехргеззей ш ап ш νίίτο тойе1 оГ апдюдепез1з: шйисйоп оГ Е8М-1, (Ье!а)1д-к3, апй ЫгСАМ, Мютоуазс. Яез., 2002, 63, 159-171).
Белковая тирозин-фосфатаза, рецепторного типа, ΖοίαΙ (ΡΤΡΚΖ1)
РТРЯΖ1 является членом семейства белковых тирозинфосфатаз рецепторного типа и кодирует проходящий через мембрану только один раз мембранный белок Ι типа с двумя цитоплазматическими тирозин-белковыми фосфатазными доменами, одним альфа-углеродным ангидразным доменом и фибронектиновым доменом III типа. Экспрессия этого гена индуцирована в раковых клетках желудка (^и, С^, Ь1, АЕ, Ск1, С^, апй Ып, \УС; Рто1еш 1угозше-ркозрка1азе ехртеззюп ртоГШпд ш дазйтс сапсег йззиез, Сапсег Ьей., 2006, 242, 95-103), при повторной миелинизации олигодендроцитов при поражении множественным склерозом (Наггоск, 8, Еийайо, СС, Вгиеск, ЯозепЫиШ, 1, ЬаГаШе, 1, Скао, М, ВихЬаит, ГО, апй 8ск1еззтдет, 1; А сгШса1 го1е Гог !ке рто!еш 1утозте ркозрка!азе гесерЮг !уре Ζ т Гипсйопа1 гесоуегу Ггот йетуекпайпд 1езюпз, №11. Сепек, 2002, 32, 411-414) и в эмбриональных клетках почек человека в условиях гипоксии (^апд, V, Эау1з, ЭА, Нацне, М, Ниапд, ЬЕ, апй Уатскоап, Я; Э1ГГегеп11а1 депе ир-теди1айоп Ьу курох1а-тйисШ1е Гас!от-1а1рка апй курох1а-шйис1Ь1е ГасЮг-2 а1рка ш НЕК293Т-се11з, Сапсег Яез., 2005, 65, 3299-3306).
Как белок, так и транскрипт гиперэкспрессированы в клетках глиобластомы, способствуя их гаптотактической миграции (Ьи, XV, 1опд, КА, К1т, СУ, 8шдк, 1, Э1а, Ер, УозЫток, К, ^апд, МУ, С1оидкезу, ТЕ, Ые1зоп, 8Е, апй М1зске1, Р8; Э1ГГегеп11а1 тйисйоп оГ дкоЫазЮта т1дгайоп апй дтоМк Ьу 1\\ό Гогтз оГ ркюйорЫп, 1 Вю1 Скет., 2005, 280, 26953-26964).
Кроме того, РТЯРΖ1 часто амплифицируется на уровне геномной ДНК в глиобластоме (Ми1ко11апй, Р1, Е1ед1ег, Н, Маххапй С, Согтап, Р, 8азкй, Р, Айатз, 1, 1опез, ТА, ВаЬЬаде, 1^, Vаΐскеνа, Я, кйтига, К, Еазк Р, РоиШказ, С, СоШпз, ντ, Сайет, ЫР, Тоткпзоп, 1Р, апй 8кеег, Ό; Сепотк ртоГШпд 1йепййез й1зстек йекйопз аззос1а!ей тейк 1тапз1осайопз ш дкоЬ1аз!ота тиШГотте, Се11 Сус1е, 2006, 5, 783-791).
- 8 018456
Янус-киназа и белок, взаимодействующий с микротрубочками 2 (ЛЛКМ1Р2)
1ΆΚΜΙΡ2 был идентифицирован в качестве одной из многих известных или предполагаемых мишеней нисходящего пути белков ΡΆΧ3-ΕΚΗΚ, которые были сильно гиперэкспрессированы в АВМ8 (РаеάίαίΓίο гйаЬйотуокагсота, а1уео1аг киЬ1уре) (Ьае, Μ, Айи, Е, Мегсайо, 6, Сйиа1, 8, Ейдаг, Μ, Ра\\е1. В, 01кйеп, А, Вагг, Е, апй Ьайаиу1, М; 61оЬа1 депе ехргеккюп ргоййпд оГ ΡΑΧ-ΕΚΗΒ Гикюп-рокШуе а1уео1аг апй ΡΑΧ-ΕΚΗΒ Гикюп-педаНуе етЬгуопа1 гйаЬйотуокагсотак, 1 Ра1йо1, 2007, 212, 143-151).
Фибронектин 1 (ΕΝ1)
Фибронектин является высокомолекулярным гликопротеином, содержащим около 5% углеводов, и связывающимся с рецепторными белками, которые заполняют клеточную мембрану и называются интегринами. Кроме интегринов они также связываются с компонентами внеклеточной матрицы, такими как коллаген, фибрин и гепарин. Существуют несколько изоформ фибронектина, каждая из которых является продуктом отдельного гена. ΕΝ играют важнейшую роль в поддержании нормальной клеточной морфологии, клеточной адгезии, миграции, гемостаза, тромбоза, заживления ран, дифференциации и пролиферации (Нупек, ВО; Е1Ьгопесйпк, 8с1. Ат., 1987, 254, 42-51).
Полимерный фибронектин, &ΕΝ, получают ш уйго при обработке растворимого фибронектина пептидом 76-аа, 1111-С (называемым Аиак1е1йп), который образован из повтора первого типа III в фибронектине. Исследования с мышами, имеющими опухоли, ш у1уо показали, что систематическое введение Анастеллина или δΕΝ подавляло рост опухоли, ангиогенез и метастазы (Υί, М апй Виок1айН, Е; А βЬгопесНп Ггадтеп! шЫйЦк 1ишоиг дгсшНг апдюдепекщ, апй те!ак1ак1к, Ριόο №11. Асай. 8сЕ И.8.А, 2001, 98, 620-624). Ангинекс является синтетическим пептидом из 33 аминокислот, который первоначально был смоделирован для воспроизведения бета-складчатой структуры антиангиогенных белков. Было показано, что ангинекс вызывает полимеризацию фибронектина, и он неактивен у мышей, которые испытывают недостаток в плазменном фибронектине (Акегтап, МЕ, ΡίΚΙι, 1, Ρеιе^к. Ό, апй Виок1айй, Е; Апд1ок1аНс рерНйек ике р1акта ВЬгопесНп 1о Ноте !о апдюдепк уакси1а1иге, Ριόο №11. Асай. 8ск И.8.А, 2005, 102, 2040-2045). В одном из исследований изучалось влияние ΕΝ на Ό-галактозамин (ОаШ)/липополисахарид (ЬР8)-индуцированной молниеносной печёночной недостаточности у мышей. Результаты позволяют предположить, что ΕΝ предохранял от ^а1N/^Ρ8-индуцированной печёночной недостаточности с помощью механизма, включающего ингибирование активации ΝΕ-карраВ, который вызывал снижение количества Т^-а1рйа и приводил к повышению уровня ИЛ-10, а повышение Вс1-хЬ индуцировало блокаду апоптических сигналов, при которых подавлялся апоптоз гепатоцитов, вызванный ^а1N/^Ρ8 (Οίιι, Ζ, Клгоп, АН, Тки)г К, ^тхуата, Υ, Окитига, Т, апй Нпао, Υ; ИЬгопесйп ргеуеп!к Э-даИсЮкатше/ 11роро1укассйапйе-шйисей 1е(На1 йераНс Гайиге ш писе, 8йоск, 2006, 25, 80-87). Другие результаты указывают на то, что ΕΝ стимулирует пролиферацию клеток карциномы легких человека и снижает апоптоз ш уйго посредством индуцирования экспрессии гена СОХ-2 и биосинтеза Ρ6Е2 (Нап, 8, 81йе11, Ν, ВокегΡаде, 8, апй Вотап, 1; ИЬгопесйп кйти1а1ек йитап 1ипд сагсшота се11 дго^1й Ьу шйисшд сус1оохудепаке-2 (СОХ-2) ехргеккюп, 1п!. 1 Сапсег, 2004, 111, 322-331).
Как было показано, фибронектин (ΕΝ) подвержен альтернативному сплайсингу исключительно во время органогенеза и генеза опухоли. Один такой сплайс-вариант, экстрадомен-В (ЕИ-В) ΕΝ, обычно отсутствует в нормальных взрослых тканях, и он был предложен в качестве маркера ангиогенеза опухоли (Ейап, ΖΑ, Саийего, 1, ВагЬш, ΥΡ, Сйап, ВМ, ишуа1, 8, апй СйакгаЬагй, 8; ЕИ-В ВЬгопесНп ш поп-кта11 се11 1ипд сагсшота, Ехр.Ьипд Век., 2005, 31, 701-711). Мйа\\есй и соавторы показали, что опухоли головы и шеи с положительным окрашиванием по ЕЭВ приводили к значительно более низкой общей выживаемости пациентов (Мйа^есй, Ρ, ИШдиегоу, Ρ, Акка1у, М, Агек, С, апй А11а1, А8; ЕВ-Ό ВЬгопесНп ехргеккюп ш кциатонк се11 сагсшота оГ 1йе йеай апй песк, Ога1 Опсо1., 2005, 41, 82-88).
Экспрессия фибронектина регулирует ангиогенез и васкулогенез и участвует в ответной реакции головного мозга на ишемию и пароксизм. Генная экспрессия фибронектина была значительно повышена (р < 0,05) в фибробластах 8\С8 (Синдром Стерджа-Вебера-Краббе) по сравнению с фибробластами из нормальной кожи при 8\С8 (С’отг АМ, Нип1, Ρ, Уа\\1ег, ΜΡ, Ρа^йо, СА, Вескег, Κ6, апй Ρеνкпе^. 1; 1псгеакей йЬгопесйп ехргеккюп ш к1игде-^еЬег купйготе ПЬгоЬ1ак1к апй Ьгаш Нккие, Ρей^аΐ^. Век., 2003, 53, 762-769). Концентрация фибронектина была значительно выше при раке яичника в сравнении с доброкачественными опухолями яичника и нормальным яичником. Концентрация фибронектина значительно повышена у пациентов с раком яичника с рецидивирующей болезнью в сравнении с пациентами с раком яичника без рецидива. Экспрессия образованных из опухоли матриолитических ферментов и фибронектина важны для роста опухолей яичника (ИетеГсг, А, 8/1гтаг К, О1ай, 1, Ρарр, Ζ, апй 1епеу, А; Е1еуа1ей ехргеккюп оГ та1пх те1а11орго1е1паке-9, апй ВЬгопесНп сопсеп1гайоп ш гесштеп! ерййейа1 оуапап сапсег, Огу. Ней1, 2004, 145, 1617-1624). Тот факт, что ΕΝ был одним из всего двух генов, которые были в значительно пониженном количестве из 1.176 проанализированных генов в рамках исследования, подчеркивает гипотезу, что ΕΝ может вести себя как важный ген-супрессор метастазов при раке груди (Иг1гедег, А1, ^егЬа)й, 8Е, УеггессЫа, Е, Маиу1е1, А, Ριιγ^11γ Ь1, ^1^1^11, АВ, апй Ва1 йе Каег 1оГГе ЕЙ; ИЬгопесНп 1к йШшсИу йо^пгеди1а1ей ш типпе таттагу айепосагсшота се11к тейй й1дй те1ак1айс ро!епНа1, Опсо1. Вер., 2006, 16, 1403-1410).
В докладе сообщается, что были обнаружены три растворимых фибронектиновых пептида (ВОИ,
- 9 018456
С8-1 и ΡΝ-С/Н-У), вызывающих апоптоз легочных фибробластов. Апоптоз появлялся при нарушении адгезии (аноикоз). Использование малых фибронектиновых пептидов для способствования апоптозу фибробластов обосновывается в дальнейшем исследовании в качестве возможной антифибротической терапии (Наббеп, НЬ апб Непке, СА; ΙηάιιοΙίοη ой 1ипд йЬгоЬ1ак! арорЮмк Ьу ко1иЬ1е ПЬгопесЬп рерйбек, АшЛ Рекрй.Сгй Саге Меб, 2000, 162, 1553-1560). В другом исследовании было продемонстрировано, что фибронектин (ΡΝ) стимулирует пролиферацию клеток немелкоклеточного рака легких человека (Ν8ί.Έί'). Оно показывает, что ΡΝ увеличивает количество белка ММР-9, экспрессию мРНК и желатинолитическую активность в клетках №СЬС (Нап, 8, КлИепИкНег, ГО, Зйагашап, 8У, апб Вошап, 1; ΡίЬтопесйп тсгеакек ша1п\ те1а11орго1етаке 9 ехргеккюп 1йтоидй асйуабоп οί с-Ро$ У1а ех1гасе11и1аг-геди1а1еб Шпаке апб рНозрВаНбуНпо511о1 3-Шпаке ра1й\\аук ш йитап 1ипд сатстота се11к, 1 Вю1 Сйет., 2006, 281, 29614-29624). В одном исследовании было изучено, могут ли подавляющие опухоль эффекты от соединений витамина И (УИ) быть опосредованы механизмами, которые управляют клеточной адгезивностью. Введение небольшой интерферирующей РНК против ΡΝ привело к понижению уровня экспрессии ΡΝ и уменьшило клеточную адгезивность к коллагеновой матрице типа I. Эта находка придает особое значение ΡΝ при моделировании клеточной адгезивности при раке щитовидной железы и, по крайней мере, частично в опосредовании действия УИ на рост опухолевых клеток (Ьш, У, Ака, 8Ь, апб ΕζζηΙ 8; 1а1рйа,25ГОШубгохууйатш ИЗ 1агде(к ΡΤΕΝ-берепбеШ йЬтопесйп ехртеккюп !о гек!оге 1йуго1б сапсег се11 абйекгуепекк, Мо1. Епбосппок, 2005, 19, 2349-2357).
Генерирование опухолеассоциированных изоформ ΡΝ позволяет разработку специфических лигандов (например, антител), которые могут быть использованы для селективной доставки терапевтических веществ к участкам распространения опухоли. ΡΝ используется в качестве мишени для биомолекулярного вмешательства как для разработки ингибирующих молекул, блокирующих взаимодействие ΡΝ с интегринами и другими рецепторами на поверхности клетки, так и для разработки основанной на лигандах нацеленной визуализации и терапевтических стратегий (Какраг, М, Ζιγ6γ Ь, апб Νοη, И; р|ЬгопесЬп ак 1агде( йог 1итоиг !йегару, ΙπΙ. 1 Сапсег, 2005, 118, 1331-1339). В одном исследовании было продемонстрировано, что лечение при экспрессии ш утуо рекомбинантного полипептида СВИ-Нер11 фибронектина, называемого СН50, сильно ингибировало рост опухоли, инвазию опухоли и ангиогенез. Генная терапия СН50 не только продлевала продолжительность жизни мышей, имеющих гепатокарциному, но и также подавляла рост и инвазивную способность опухоли в селезёнке и распространение ее метастазов в печень. Подводя итог, данные находки предполагают потенциальную пользу от СН50 в генной терапии против рака печени (Ыи, Υ, Ниапд, В, Уиап, Υ, Оопд, У, Х1ао, Н, Ы, И, Уи, ΖΒ, Уи, РН, ΖΗ^ι^, ОМ, апб Репд, Ζ4; 1п1иЬШоп ой йера1осатстота апб 1итоиг те!ак!ак1к Ю йуег Ьу депе !йегару тейй тесотЫпап! СВИНер11 ро1урерйбе ой ПЬгопесЬт 1п!. 1 Сапсег, 2007 121 (1) 184-92). Фибронектин (ΡΝ) имеет критический функциональный сайт (последовательность УТ1УУ1АЬ внутри 14-го типа III повтора), противодействующий клеточной адгезии к внеклеточной матрице. 22-мерный ΡΝ-пептид, содержащий данный сайт, именуемый ΡΝΠΗ4, ингибирует бета1 интегрин-опосредованную адгезию без связывания с интегринами. Исследование показывает, что ΡΝΠΗ4 обладает потенциалом для воспрепятствования клеточным метастазам лимфомы (Ка!о, В, НШката, Т, Кат1уа, 8, Одита, Ρ, Иек1, М, Оо1о, 8, Накатит, Н, Ка!ауата, Т, апб ΡηΚηί, Ρ; А пе\у !уре ой апйтекаккабс рерббе бепмеб йот ПЬгопесйт С1т Сапсег Век., 2002, 8, 24552462).
Рецептор эпидермального фактора роста (ЕСРК)
ΕΟΡΒ играет важную роль в регуляции нормальной клеточной пролиферации, дифференциации и выживаемости. По этой причине в ряде видов человеческих опухолей статус ΕΟΡΒ часто изменен и обычно соотносится с плохим прогнозом. В опухолевых клетках он способствует их росту и выживаемости посредством различных дивергентных сигнальных путей (Маейата, Т апб И1хоп, 1Ε; Тйе 1итоит кирргекког, РТЕ№ММАС1, берйокрйогу1а!ек !йе йр1б кесопб теккепдег, рйокрйайбуйпокйо1 3,4,54пкрйокрйа1е, 1 Вю1 Сйет., 1998, 273, 13375-13378). Нарушения ΕΟΡΒ являются одним из наиболее распространенных молекулярных отклонений от нормы в глиобластомах (Уа\\тоскг А апб В1етпа1, У; Ер1бегта1 дтоМй йас!ог гесер!ог ш дйоЫакШта, Ρο1^а №игора1йо1., 2005, 43, 123-132).
Амплификация ΕΟΡΒ и гиперэкспрессия мРНК являются частым явлением в глиомах высокой степени злокачественности астроцитного происхождения, и они всегда сильно ассоциированы с увеличенным уровнем белка ΕΟΡΒ (Уопд, АГ В1дпег, 8Н, В1дпег, ИИ, Ι<ίπζΚΓ КУ, НашШоп, 8Β, апб Уоде1к1ет, В; Шстеакеб ехртеккюп ой !йе ер1бегта1 дтоМй йас!ог гесер!ог депе ш тайдпап! дйотак 1к 1пмаг1аЬ1у аккосГ а!еб \\йй депе атрййсайоп, Ргос. №111. Асаб. 8ск И.8.А, 1987, 84, 6899-6903;Сйаййапе1, М, Сйаиу1п, С, Ьате, М, Вегдег, Ρ, Сйеб1п, М, Βοкΐ, Ν, №ккот МΡ, апб ВепаЫб, АЬ; ΕΟΡ гесер!ог атрййсайоп апб ехргеккюп т йитап Ьгат 1итоигк, 1992, Ειπ. 1 Сапсег, 28, 11-17). О гиперэкспрессии белка без генной амплификации сообщалось в 27% случаев глиобластом (ОВМ), однако также сообщалось, что менее злокачественные астроцитомы и олигодендроглиомы демонстрируют экспрессию ΕΟΡΒ без прохождения генной амплификации (Βе^йеиЬе^де^, 1, РейепЬегдег, О, ВЫшита, К, 8сйпибЕ ЕЕ, Уесйк1ег, У, апб СоШпк, УР; Рр1бегта1 дтоМй йас!ог гесер!ог ехртеккюп ш о11добепбгодйа1 Шшоитк, Ат 1 Ра!йо1, 1996, 149, 29-35).
Прогностические выводы из амплификации/гиперэкспрессии ΕΟΡΒ при опухолях головного мозга противоречивы. Некоторые авторы не обнаружили никакого влияния ΕΟΡΒ амплификации/гиперэкс
- 10 018456 прессии на выживаемость пациентов (О1коп, Л, ВагпсП. Ό, Уапд. 1, Акк1е((Л Я, СоГкошк, О, аиб 1атек, СО; Сепе атрБйеабои ак а ргодпокйс ГасЮг ίη рптагу Ьгаш Гитоигк, С1т Сапсег Яек , 1998, 4, 215-222; ЫетесотЬ, Е^, Сойеп, Н, Лее, 8Я, Вйа11а, 8К, В1оот, 1, Науек, ЯЬ, апб МШег, ОС; 8игугуа1 оГ раЛеШз \\Бй д1юЬ1акГота тиШГогте 1к поГ шЛиепсеб Ьу аИегеб ехргеккюп оГ р16, р53, ЕСЕЯ, МОМ2 ог Вс1-2 депек, Вгат Ра1Ло1, 1998, 8, 655-667; ^айа, А, Ваитапп, А, ^о1Г, НК, Е1ттегк, Я, Ыеитапп, 1, Ктбегтапп, Ό, АкГгайапГке£Г, К, В1итске, I, ход ΌΑ, апб 8сй1еде1, И; Ласк оГ ргодпокйс ге1еуапсе оГ а11ега(1оп8 т 1йе ерЛ бегта1 дготаГй ГасЮг гесерГог-БапкГогттд дготаГй ГасГог-а1рйа раГйтаау т йитап акГгосуйс дйотак, 1 №игокигд , 1996, 85, 634-641), в то время как другие делают вывод, что эти изменения были негативным прогностическим фактором (ЕБеппе, МС, ЕогтепГо, 1Л, ЛеЬгип-Егепау, С, Сюапш, 1, СйаГе1, М, Расцнк, Р, Вегпагб, С, Соигб1, А, Вепкабоип, Я1, Р1дпо1, 1Р, Егапсоиа1, М, СгеШег, Р, Ргепау, М, апб М11апо, О; Ер1бегта1 дготаГй ГасЮг гесерГог апб 1аЬе11тд тбех аге шберепбепГ ргодпокйс ГасГогк ш дйа1 Гитоиг оиГсоте, С1т Сапсег Яек , 1998, 4, 2383-2390; 1агок, Е, Репу, ЯН, Абат, Л. Ке11у, Р1, СгатеГогб, Р1, Ка1Ьад, ЯМ, Мепбе1ота, АО, 8епдирГа, ЯР, апб Реагкоп, АО; Ргодпокйс БпрКсаПопк оГ р53 ргоГеш, ер1бегта1 дготаГй ГасЮг гесерГог, апб К1-67 1аЬе11шд т Ьгаш Гитоигк, Вг. 1 Сапсег, 1992, 66, 373-385; 8сй1еде1, 1, Мегбек, А, 8Гитт, С, А1ЬеБ, ЕК, ЕогкБпд, М, Нупек, Ν, апб К1екк1шд, М; АтрБйсайоп оГ Гйе ер1бегта1-дгоМй-ГасГог-гесерГог депе согге1аГек \\Бй бШегепГ дготаГй Ьейауюиг т йитап д1юЬ1акГота, 1пГ. 1 Сапсег, 1994, 56, 72-77; ΖΙπ.γ А, 8йае£Гег, 1, Лекйе, 8, Ко1т, Р, апб Е1-Майб1, АМ; Ер1бегта1 дготаГй ГасГог гесерГог: ап шберепбепГ ргебюГог оГ кшугуа1 т ак!госу11с Гитоигк д|уеп беГБиЦуе 1ггаб1аГюп, 1пГ. 1 Яаб1аГ. Опсо1. Вю1 Рйук., 1996,34,809-815).
Существует немного лечебных подходов к молекуле ЕСЕЯ на раковой клетке. Особенно тщательно исследованные включают: терапию со специфическим антителом с использованием невооруженных антител или антител, конъюгированных с токсинами, липосомами или нуклидами, и применение ингибиторов рецепторной тирозинкиназы. Имеется несколько видов моноклональных антител, направленных против ЕСЕЯтаГ. Их применение приводит к блокировке доступа к рецептору его лигандов (цетуксимаб) и/или быстрой интернализации рецептора (АВХ-ЕСЕ) (8пбйаг, 88, 8еутоиг, Л, апб 8йерйегб, ЕА; 1пй1Ь1Гогк оГ ер|бегта1-дго\у111-Гас1ог гесерГогк: а гсу1с\у оГ сйшса1 гекеагсй \\Бй а Госик оп поп-кта11-се11 1ипд сапсег, ЛапсеГ Опсо1, 2003, 4, 397-406). Так как ЕСЕЯтаГ встречается также на поверхности нормальных клеток, то побочные эффекты могут ограничить его использование.
ЕСЕЯ гиперэкспрессирован при плоскоклеточной карциноме головы и шеи (Н№СС), где уровни экспрессии соотносятся с сокращением выживаемости. Терапии, блокирующие ЕСЕЯ, показали свою ограниченную эффективность в клинических исследованиях и, в первую очередь, когда они были скомбинированы со стандартной терапией. ЕСЕЯуШ экспрессируется в Н^СС, где он способствует улучшению роста и резистентности для нацеливании на дикий вид ЕСЕЯ. Эффективность в борьбе против опухоли стратегий нацеливания ЕСЕЯ может быть улучшена при добавлении ЕСЕЯуШ-специфического блокирования (8ок, 1С, Сорре1Б, ЕМ, Тйотак, 8М, Лапдо, М^ Х1, 8, НипГ, 1Л, ЕгеБто, МЛ, Сгапег, М^, ^1ккГгапб, С1, В1дпег, ϋϋ, Сообтд, ^Е, Еигпап, ЕВ, апб СгапбБ, 1Я; МиГапГ ер1бегта1 дготаГй ГасГог гесерГог (ЕСЕЯуШ) сопйгЬиГек Го йеаб апб песк сапсег дготаГй апб геыкГапсе Го ЕСЕЯ ГагдеБпд, Сйп Сапсег Яек., 2006, 12,5064-5073).
Другая стратегия представляет собой селективное индуцирование отмирания клеток глиобластомы и других раковых клеток, которые гиперэкспрессируют рецептор ЕСЕ. С использованием невирусного вектора доставки, нацеленного на рецептор ЕСЕ, синтетическая анти-пролиферативная бкРНК (полиинозин-цитозин [ро1у 1С]), сильный активатор апоптоза, была нацелена селективно на раковые клетки. Нацеленный на ЕСЕЯ ро1у 1С индуцировал быстрый апоптоз у клеток-мишеней ш уБго и ш у|уо. Доставка в опухоли ЕСЕЯ-нацеленного ро1у 1С индуцировала полную регрессию образовавшихся ранее внутричерепных опухолей у голых мышей без очевидных побочных токсических эффектов на нормальной ткани головного мозга. Спустя один год после завершения лечения у прошедших лечение мышей не было рака, и они были здоровы (8й1г, А, Одпк, М, ^адпег, Е, апб Яеу11хк1, А; ЕСЕ гесерГог-ГагдеГеб купГйейс боиЬ1екГгапбеб ЯNΑ ейт1паГек дйоЫакГота, ЬгеакГ сапсег, апб абепосагсшота Гитоигк т тюе, РЛо8. Меб, 2006 1ап; 3(1):е6. ЕриЬ 2005 Оес 6).
Применение небольших интерферирующих РНК (кГРНК) стало эффективным и высокоспецифическим инструментом для модуляции генной экспрессии, и обширный ряд онкогенов был успешно выключен. к1РНК-опосредованное снижение уровня ЕСЕЯ было продемонстрировано в двух установленных клеточных линиях глиомы с разными уровнями экспрессии ЕСЕЯ (И373 МС, ΚΝ18). Уровень экспрессии ЕСЕЯ мРНК и белка был снижен на 70-90%. Однако лечение кГРНК не производило ингибирующего эффекта на клеточную пролиферацию, миграцию и статус активации, связанных с ЕСЕЯ сигнальных каскадов. В соответствии с данными результатами анализ генной экспрессии с микрочипами показал только небольшие, хотя и специфические изменения в паттернах экспрессии. В заключение, эти данные указывают на то, что специфическое снижение уровня ЕСЕЯ может быть недостаточным для монотерапевтического подхода при лечении злокачественной глиомы (Уойтапп, А, Уогп1осйег, НР, 8Гетрй, Т, ВгоскйоГГ, С, АрГеГ Я, апб Водбайп, И; Ейесйуе кйепстд оГ ЕСЕЯ \\Бй ЯNΑ^ бетопкйаГек попЕСЕЯ берепбепГ ргойГегайоп оГ дйота се11к, 1пГ. 1 Опсо1., 2006, 28,1531-1542).
Несколько проведенных клинических исследований показали многообещающие результаты. Например: й-Я3 является гуманизированным моноклональным антителом, которое распознает внешний
- 11 018456 домен ЕСРК с высокой аффинностью, ингибируя активацию тирозинкиназы.
Для оценки безопасности, иммуногенности и предварительной эффективности Н-К3 с пациентами с недавно поставленным диагнозом глиомы высокой степени злокачественности проводилось исследование фазы Ι/ΙΙ (Каток, ТС, Р1диегейо, 1, Са(а1а, М, Сопха1сх. 8, 8е1уа, 1С, Стих, ТМ, То1ейо, С, 8йуа, 8, Рейапо, Υ, Каток, М, Ьеопатй, I, Тоггек, О, Матше11о, Р, Регех, К, апй Ьаде, А; Тгеа(теп( о! Ыдй-дтайе дйота райейк \\'НН (Не Ниташхей апй-ер1йегта1 дго\\1Н Гас(ог гесер(ог (ЕСРК) апйЬойу Н-К3: герой Ггот а рНаке Ι/ΙΙ 1па1, Сапсег Вю1 ТНег., 2006, 5, 375-379).
ЕКВ-569 является сильным, низкомолекулярным, селективным и необратимо действующим ингибитором рецептора эпидермального фактора роста (ЕСРК), который был разработан в качестве противоракового агента. Исследование фазы 1 с эскалацией дозы проводилось для японских пациентов. Основываясь на критериях КЕС!8Т, протекание болезни было стабильным, но радиографически наблюдалась регрессия опухоли ^окЫтита, Ν, КийоН, 8, К1тита, Т, Мйкиока, 8, Ма1киита, К, Нйа(а, К, Ма1кш, К, №дого, 8, №1када\уа, К, аий Рикиока, М; ЕКВ-569, а пете 1ггеуегк1Ь1е ер1йегта1 дго\\1Н Гас(ог гесер(ог (угокте к1паке 1пЫЬйог, \\йН с11шса1 асйуйу ίη рабейк \\'НН иои-кта11 се11 1иид сапсег тейй асцштей геййапсе (о деййпЬ, Ьипд Сапсег, 2006, 51, 363-368).
Гефитиниб, специфический ингибитор ассоциированной с рецептором эпидермального фактора роста (ЕСРК) тирозинкиназы, продемонстрировал эффективность в подгруппе пациентов с немелкоклеточным раком легких (№СЬС), для которых была безуспешной стандартная химиотерапия. Также сообщалось о противоопухолевом эффекте при метастазах в головном мозге от Ν8ί.Ή·Ο Кроме того, мутации ЕСРК показали сильную взаимосвязь с чувствительностью к гефитинибу для Ν8ί.Ή·Ο Была проанализирована эффективность гефитиниба при метастазах в головном мозге от №СЬС и оценена взаимосвязь этой эффективности с мутациями ЕСРК. Гефитиниб оказался эффективным для лечения метастазов головного мозга в подгруппе пациентов. Данные позволяют сделать предположение о возможной взаимосвязи между эффективностью гефитиниба в лечении метастазов головного мозга и мутациями ЕСРК (8Ыша1о, 8, Мйкийотц Т, Кокака, Т, ΥаΐаЬе, Υ, ^акаЬауакй, Т, М|/ипо, М, №1каНага, Ν, На(апо, Н, №1(ките, А, [кНИ, Ό, апй ΥокН^йа, 1; 2006, ЕСРК тйайопк ш райейк \\ЙН Ьгаш те(ак(акек Ггот 1ипд сапсег: аккоаайоп \\ЙН (Не еГПсасу оГдейййЬ, №иго. Опсо1, 8, 137-144).
Хитиназа-3-подобный белок 2 (СШ3Ь2)
СШ3Ь2 был первоначально идентифицирован в хондроцитах. Его часто описывали как антигенмишень при ревматическом артрите. Релевантной взаимосвязи СШ3Е2 с раком установлено не было. Имелось подозрение, что хитиназа-3-подобные белки стимулируют пролиферацию человеческих клеток соединительной ткани, например, фибробластов, посредством активирования внеклеточной сигналрегулируемой киназы и опосредованных РКВ (протеинкиназа) сигнальных путей (Кескйек АО, \УННе С, Ыпд Н; ТНе сЫйпаке 3-йке рто!ет Нитап саййаде д1усорто1ет 39 (НС-др39) кйти1а1ек ргойГегайоп оГ Нитап соппесйуе-йккие се11к апй асйуа!ек Ьо(Н ехйасе11и1аг к1дпа1-геди1а1ей ктаке- апй рго(ет ктаке Втей1а(ей йдпаШпд ра(Н\таук; ВюсНет 1. 2002; 365:119-126). У мышей был обнаружен сильно повышенный уровень хитиназа-3-подобных белков в моделях индуцированного хеликобактериями рака желудка (Така1кН1 8, \Уапд ТС; Сепе ехргеккюп ртоййпд ш а тоике тойе1 оГ НейсоЬайег-тйисей дакйгс сапсег; Сапсег 8сР 2007 (3): 284-293)
Даблкортин и СаМ киназа-подобный белок 2 (БСАМКЬ2)
Белок ОСХ, ассоциированный с микротрубочками (МТ), играет важную роль в развитии коры головного мозга млекопитающих. Сообщалось об идентификации протеинкиназы, даблкортин киназы-2 (ОСАМКЬ2), с доменом (ОС), высоко гомологичным ОСХ. ОСАМКЬ2 имеет активность по связыванию с микротрубочками, ассоциированную с их ОС-доменом, и активность протеинкиназы, опосредованную киназным доменом, они организованы в структуру, при которой оба домена функционально независимы.
Гиперэкспрессия ОСАМКЬ2 стабилизирует цитоскелет МТ по отношению к вызванной холодом деполимеризации. Автофосфорилирование ОСАМКЬ2 сильно снижает его аффинность для МТ. ОСАМКБ2 и ОСХ мРНК являются специфическими для нервной системы и экспрессируются во время периода отслоения коры головного мозга. Уровень ОСХ снижается постнатально, тогда как высокий уровень ОСАМКЕ2 сохраняется до взрослого возраста, позволяя предположить, что последовательность ОС имеет ранее не известные функции в зрелой нервной системе. В симпатических нейронах ОСАМКЕ2 располагается у клеточного тела и терминальных сегментах аксонов и дендритов.
ОСАМКЬ2 может представлять собой зависимое от фосфорилирования переключение для обратимого управления динамикой МТ в районе конуса роста нейрона. Паттерны экспрессии, функциональные активности, регуляция и локализация ОСАМКЬ2 позволяет предположить, что он функционирует параллельно или сообща с другими членами семейства генов ОС (генов, кодирующих домен ОС) в процессах, важных для развития нервной системы и, потенциально, в тех, которые характерны для зрелой нервной системы. ОСАМКЬ2 состоит из двух функциональных и независимых доменов, связывающегося с и стабилизирующего МТ домена (последовательность ОС) и киназного домена с активностью белковой фосфотрансферазы.
Предполагалось, что последовательность ОС играет ведущую роль в трансдукции внеклеточных стимулов и их внутриклеточных сигналов в изменения динамики МТ. В частности, основываясь на спо
- 12 018456 собности к взаимодействию с МТ по модели, регулируемой фосфорилированием, и локализации у терминальных сегментов аксонов и дендритов, регионов, в которых МТ динамически нестабильны, ЛСАМКЬ2 следует рассматривать как потенциального кандидата-медиатора быстрых цитоскелетных перестроек, которые происходят в ответ на нейронные сигнальные процессы (Ебе1тап, АМ, К1т, ^У, Ηίββίπχ Ό, Со1б51ет. ЕС, ОЬегбоегзГег, М, апб §1дшб8ои, ЛоиЫесойш к1пазе-2, а поуе1 боиЫесойтге1а1еб рго!ет кгпазе аззошаГеб \\ЙН 1егтта1 зедтепГз ок ахопз апб бепбгйез, 1Вю1 СЬет., 2005, 280, 85318543).
АТФ-чувствительный калиевый канал внутреннего выпрямления 10 (КСШ10)
Основная функция калиевых каналов внутреннего выпрямления (К1г) заключается в установлении высокой калиевой (К+) селективности мембраны глиальных клеток и строго негативного мембранного потенциала покоя (МИИ), что является характерными физиологическими чертами глии. Классическая особенность К1г - это то, что К+ движется во внутрь, когда МНИ отрицателен по отношению к потенциалу равновесия для К+ (Е(К)), но при более положительных потенциалах ингибируются потоки наружу. Чертой глии ЦНС является ее специфическая экспрессия подвида КСИЛО, который является основным проводником К+ в мембранах глиальных клеток и играет ключевую роль в установлении глиального МНИ. И, поэтому ,К1г и, в частности, КСИЛО являются ключевыми регуляторами глиальных функций, которые, в свою очередь, определяют нервную возбудимость и проведение аксонов (Вий, АМ апб Ка1зг А; 1п\\агб1у гес11Гу1пд роГаззшт сНаппе1з (Кй) ш сеп1га1 пегуоиз зузГет дПа: а зрес1а1 го1е Гог КЙ4.1 т дйа1 йпсГюпк, 1 Се11 Мо1. Меб, 2006, 10, 33-44).
Нониженный уровень калия и глютаматные буферные способности астроцитов сказываются в чрезмерной возбудимости нейронов и абнормальной синаптической трансмиссии. Каналы КСИЛ0, в первую очередь, отвечают за значительную гиперполяризацию кортикальных астроцитов и, скорее всего, играют важную роль в регуляции содержания калия. Значительное ингибирование удаления глютамата в астроцитах с разрушением КСИЛ0 подчеркивает роль мембранной гиперполяризации в этом процессе (КисЬегуауукЬ, УУ, КисЬегуауукй, ЬУ, И1с1о1з, СС, Ма1бопабо, НМ, Вакз1, К, Ве1сЬепЬасЬ, А, 8ка!сЬкоу, 8Ν, апб ЕаГоп, М1;, Оо\\пгеди1а1юп оГ КЙ4.1 нпгагб гесйГушд роГаззшт сНаппе1 зиЬипбз Ьу ΕΝΛί нпрайз роГаззшт йапзГег апб д1и!ата!е нр1аке Ьу сийигеб согйса1 азйосуГез, Оба 2006, 55 (3), 274-281).
Пространственная регуляция содержания внеклеточного К(+) за счет КСИН0 в центральной нервной системе может осуществляться только благодаря неравномерному распределению КСИЛ0 по поверхности глиальной клетки. Наблюдалась неверная локализация КСИН0 в различных опухолях головного мозга человека (астроцитомы низкой и высокой степени злокачественности и олигодендроглиомы), позволяя предположить, что может быть нарушена способность глиальных клеток к регуляции содержания, приводя к притоку воды (цитотоксическому отеку) (^агт, А, Мй1е1Ьгопп, М, апб ^о1Ьигд, Н; Кеб1зйтЬиГюп оГ (Не \га1ег сНаппе1 ргоГет ас.|иаропп-4 апб (Не К+ сНаппе1 ргоГеш КЙ4.1 бйГегз ш 1о\\ - апб 1ндНдгабе Ьитап Ьгаш Гитоигз, Ас(а ИеигораШок (Вег1), 2005, 109, 418-426). КСИН0 был также представлен в повышенном количестве в астроцитах поврежденного головного мозга. Была выдвинута следующая гипотеза: в астроцитах при нормальных условиях АОР4 объединяет транспортировку воды с опосредованным КСИН0 отводом К+, однако при патологических состояниях АОР4 содействует оттоку жидкости из отека головного мозга, а КСИЛ0 регулирует возросшую концентрацию внеклеточного К+ (8аабоип, 8, Рараборои1оз, МС, апб КгГзНпа, 8; ^аГег (гапзрой Ьесотез ипсоир1еб Ггот К+ з1рНопшд т Ьгат сопГизюп, ЬасГейа1 тешпдШз, апб Ьгат йнпонгз: 1ттипоЫ8ГосЬет1са1 сазе геу1ете, 1 С1ш Ра(Ног 2003, 56, 972-975).
Вариантом данной аминокислотной последовательности изобретатели обозначают, что боковые цепи, например, одного или двух аминокислотных остатков изменены (например, при их замещении боковой цепью другого встречающегося в природе аминокислотного остатка или какой-либо другой боковой цепью), так что пептид по-прежнему способен связываться с молекулой НЬА по существу таким же путем, как и пептид, состоящий из данной аминокислотной последовательности. Например, пептид может быть модифицирован таким образом, что он, по крайней мере, сохранит, если не улучшит, способность взаимодействовать и связываться с подходящей молекулой МНС, такой как НЬА-А или -ΌΚ, и так что он, по крайней мере, сохранит, если не улучшит, способность генерировать активированные ЦТЛ, которые могут распознавать и уничтожать клетки, которые экспрессируют полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, как определено в аспектах данного изобретения. Как может быть извлечено из банка данных, определенные позиции связывающихся с НЬА-А пептидов являются типичными якорными остатками, образующими центральную последовательность, подходящую к соединительному элементу НЬА-связывающей бороздки.
Те аминокислотные остатки, которые не обязательны для взаимодействия с Т-клеточным рецептором, могут быть модифицированы при замещении другой аминокислотой, чье включение, по существу, не влияет на реактивность Т-клетки и не устраняет связь с релевантным МНС. Таким образом, помимо данного условия, пептид по изобретению может быть любым пептидом (в обозначение которого изобретатели включают олигопептиды или полипептиды), который включает аминокислотные последовательности или их участок или их вариант, как дано.
В дальнейшем известно, что пептиды, презентированные МНС класса II, образованы коровой последовательностью, имеющей конкретный НЬА-специфический аминокислотный фрагмент и, факуль
- 13 018456 тативно, Ν- и/или С-терминальные удлиняющие сегменты, которые не препятствуют функции коровой последовательности (т.е. считаются нерелевантными для взаимодействия пептида и всех или подклассов клонов Т-клетки, распознающих естественную копию). Ν- и/или С-терминальные удлиняющие сегменты могут иметь длину, например, от 1 до 10 аминокислот, соответственно. Эти пептиды могут быть использованы как непосредственно для погрузки на молекулы МНС класса II, так и последовательность может быть клонирована на векторы в соответствии с описанием ниже. Так как эти пептиды образуют конечный продукт процессинга более длинных пептидов внутри клетки, то более длинные пептиды могут использоваться в равной степени. Пептиды по изобретению могут быть любого размера, но, в основном, они могут иметь молекулярный вес меньше, чем 100000, предпочтительно меньше, чем 50000, более предпочтительно меньше, чем 10000, и типично около 5000. В отношении числа аминокислотных остатков пептиды по изобретению могут иметь менее чем 1000 остатков, предпочтительно менее чем 500 остатков, более предпочтительно менее, чем 100 остатков. Соответственно, настоящее изобретение обеспечивает также пептиды и их варианты, в которых пептид или вариант имеет общую длину между 8 и 100, предпочтительно между 8 и 30, и, наиболее предпочтительно, между 8 и 16, а именно 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 или 16 аминокислот.
В соответствии с этим, встречающиеся в природе или искусственные варианты, которые индуцируют Т-клеточную перекрестную реакцию с пептидом по изобретению, часто являются вариантами по длине. Примеры для таких встречающихся в природе вариантов по длине приведены в табл. 1 для 8ЕО ГО №№ 11 и 12 и 21 и 24, соответственно.
Если пептид, который длиннее, чем около 12 аминокислотных остатков, непосредственно используется для связывания с молекулой МНС II класса, предпочтительно, чтобы остатки, которые примыкают к центральному НЬА-связывающему региону, по существу, не влияли на способность пептида специфически связываться со связывающей бороздкой молекулы МНС II класса или презентировать пептид ЦТЛ. Тем не менее, как уже было указано выше, следует понимать, что могут быть использованы более крупные пептиды, например, если они закодированы полинуклеотидом, потому что такие крупные пептиды могут быть разделены на фрагменты подходящими антигенпрезентирующими клетками.
Также возможно, чтобы эпитопы МНС I класса, хотя они обычно имеют длину между 8-10 аминокислотами, генерировались при процессинге пептидов из более длинных пептидов или белков, включающих истинный эпитоп. Аналогично с эпитопами МНС II класса предпочтительно, чтобы остатки, которые примыкают к связывающему региону, по существу, не влияли на способность пептида специфически связываться со связывающей бороздкой молекулы МНС I класса или презентировать пептид ЦТЛ и не маскировали сайты для протеолитического расщепления, необходимые для выявления истинного эпитопа во время процессинга.
Соответственно, настоящее изобретение обеспечивает также пептиды и варианты эпитопов МНС I класса, имеющие общую длину между 8 и 100, предпочтительно между 8 и 30, и, наиболее предпочтительно, между 8 и 16, а именно 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 или 16 аминокислот.
Разумеется, пептид или вариант в соответствии с настоящим изобретением будет обладать способностью связываться с молекулой главного комплекса гистосовместимости человека (МНС) I или II класса. Связывание пептида или варианта с комплексом МНС может быть проверено методами, известными из уровня техники, например, теми, что описываются в примере 4 настоящего изобретения или в литературе для различных аллелей МНС II класса (например, Аод( АВ, КгоркЛоГег Н, Ка1ЬасЛег Н, Ка1Ьик М, Вашшепкее НС, СоНдап 1Е, МагЕп В; Ыдапб шобГк оГ НЬАГОВВ5*0101 апб ИВВ1*1501 шо1еси1ек беЕпеа(еб Ггош ке1Г-рерббек; ί Iшшиηο1. 1994; 153(4): 1665-1673; Ма1сЛегек С, Спаи V, 8(еуапоу1с 8, Вашшепкее НС, Лтд С, Ме1шк А; Апа1ук1к оГ а11е1е-крес1Пс соп(ас( кЛек оГ па(ига1 НЬАГОВ17 Ндапбк; ί Iшшиηο1. 1994; 153(3): 1141-1149; Маша 8, 8(игто1о Т, Епго МА, Нашшег ί, 81шдад11а Е, №рреп С, 8радпо11 С, Ма/ζί В, Ве11опе М, Ие11аЬопа Р, РгоЛ1 МР; Ме1апоша се11к ргекеп( а МАСЕ-3 ерЛоре (о СИ4(+) су(о(охю Т се11к ш аккоаабоп ^ЛЛ ЫЛосошрабЬЛЛу 1еикосу(е апбдеп ИВ11; ДЕхр Меб. 1999; 189(5): 871-876; Нашшег 1, Са1к-ιζζί Е, Вопо Е, Кагг В^, Сиепо( ί, Аа1какшш Р, Νηβν ΖΚ, 81шдад11а Е; РерЕбе Ьшбшд кресШсЛу оГ НЬАИВ4 шо1еси1ек: согге1а(юп ^ЛЛ гЛеиша1о1б айЛпбк аккоаабоп; 1 Ехр Меб. 1995 181(5): 1847-1855; Тошркшк 8М, Во(а РА, Мооге 1С, 1епкеп РЕ; А еигоршш Лиоготшипоаккау Гог шеакигшд Ьшбшд оГ апбдеп (о с1акк II МНС д1усорго1ешк; ί Iшшиηο1 Ме(Лобк. 1993;163(2): 209-216; Воу(оп В1, ЬоЛшапп Т, Ьопбе1 М, Ка1ЬасЛег Н, На1бег Т, Ега(ег АЛ Иоиек ИС, БекЕе ИС, Е1ауе11 ВА, АЛшапп ИМ; С1и(аш1с ааб бесагЬоху1аке Т 1ушрЛосу(е гекропкек аккоаа(еб ^ЛЛ киксербЬЛЛу ог гек1к(апсе (о (уре I б1аЬе(ек: апа1ук1к ш бЛеаке бЛсогбап( Лишап ЕуЕтк, поп-оЬеке б1аЬе(1с шюе апб НБАГОО (тапкдешс шюе; Λΐ Iшшиηο1. 1998 (12): 17651776).
В особенно предпочтительном воплощении изобретения пептид состоит или преимущественно состоит из аминокислотной последовательности в соответствии с 8ЕО ГО № 1 по 8ЕО ГО № 29.
Состоящий преимущественно из подразумевает, что пептид в соответствии с настоящим изобретением, помимо последовательности в соответствии с любой из 8ЕО ГО № 1 по 8ЕО ГО № 29 или одним из их вариантов, содержит дополнительные находящиеся на Ν- и/или С-конце фрагменты аминокислот, которые не являются обязательно формирующими часть пептида, которая функционирует как эпитоп для эпитопа молекул МНС.
- 14 018456
Тем не менее, эти фрагменты могут быть важны для обеспечения эффективного введения пептида в соответствии с настоящим изобретением в клетки. В одном воплощении настоящего изобретения пептид по изобретению является белком слияния, который включает, например, 80 Ν-терминальных аминокислот НЬА-ЭВ антиген-ассоциированной инвариантной цепи (р33, в дальнейшем П). как взятая из банка данных NСВI, инвентарный номер - СепВапк Лссе881оп-питЬег Х00497 (81гиЫп. М., Маск, В. апй Ьопд, Е.О. Тке сотр1е1е кециепсе оГ Фе шВNА Гог Фе Η^А-^В-аκκοс^аίей ккалай скат гетеай а рокрерПйе \\'кк ап ипикиа1 ί^аηκшешЬ^аηе ро1аг11у ЕМВО ί. 1984, 3 (4), 869-872).
Кроме того, пептид или вариант может быть модифицирован в дальнейшем для улучшения стабильности и/или связывания с молекулами МНС в целях получения более сильного иммунного ответа. Методы для такой оптимизации пептидной последовательности хорошо известны из уровня техники и включают, например, введение обратных пептидных или непептидных связей.
В пептидах с обратной связью аминокислотные остатки присоединены не пептидными связями (-СО-NΗ-), но пептидная связь является обратной. Такие ретро-обратные пептидомиметики могут быть получены методами, известными из уровня техники, например, такими, как описано в работе Ме/1еге еί а1 ί. Iшшиηο1. 1997, 159, 3230-3237, включенной сюда путем ссылки. Этот принцип охватывает получение псевдопептидов, содержащих изменения, которые охватывают остов, но не ориентацию боковых цепей. Ме/1еге и соавторы (1997) показывают, что эти псевдопептиды пригодны для ответов МНС и Тхелперных клеток. Ретро-обратные пептиды, содержащие связи NΗ-СО вместо пептидных связей СОNN намного более устойчивы к протеолизу.
Непептидной связью, является, например, -СН2-ХН, -СН28-, -СН2СН2-, -СН=СН-, -СОСН2-, -СН(ОН)СН2-, и -СН28О-. Патент США № 4897445 обеспечивает метод твердофазного синтеза непептидных связей (-СН2МН) в полипептидных цепях, что включает полипептиды, синтезированные с использованием стандартной методики, и непептидную связь, синтезированную при реакции аминоальдегида и аминокислоты в присутствии NаСNБΗз.
Пептиды, включающие последовательности, описанные выше, могут быть синтезированы с дополнительными химическими группами, находящимися на их аминном и/или карбоксильном концах, для увеличения, например, стабильности, биологической доступности и/или аффинности пептидов. Например, гидрофобные группы, такие как карбобензоксильные, данзильные или трет-бутилоксикарбонильные группы, могут быть добавлены к аминным окончаниям пептидов. Подобным образом, ацетильная группа или 9-фторенилметокси-карбонильная группа может быть введена в аминные окончания пептидов. Кроме того, гидрофобная группа, трет-бутилоксикарбонильная или амидная группа может быть добавлена к карбоксильным окончаниям пептидов.
Далее, все пептиды по изобретению могут быть синтезированы в целях изменения их пространственной конфигурации. Например, Ό-изомер одного или более аминокислотных остатков пептида может быть использован скорее, чем обычный Ь-изомер. Более того, по крайней мере, один из аминокислотных остатков пептидов по изобретению может быть замещен одним из хорошо известных не встречающихся в природе аминокислотных остатков. Изменения, такие как данные, могут служить для повышения стабильности, биологической доступности и/или связывающих свойств пептидов по изобретению.
Подобным образом, пептид или вариант по изобретению может быть модифицирован химическим способом посредством реакции специфических аминокислот как до, так и после синтеза пептида. Примеры таких модификаций хорошо известны из уровня техники и обобщаются, например, в работе В. ЬипйЫай, Скетюа1 Веадейк Гог РгсИет МойШсакоп, 3гй ей. СВС Ргекк. 2005, которая включена сюда путем ссылки. Химическая модификация аминокислот включает, но не ограничивается, модификацией с помощью ацилирования, амидирования, пиридоксилирования лизина, восстановительного алкилирования, тринитробензилирования аминных групп 2,4,6-тринитробензолсульфоновой кислотой (ТNБ8), амидной модификацией карбоксильных групп и сульфгидрильной модификацией с помощью окисления надмуравьиной кислотой цистеина до цистеиновой кислоты, образованием ртутных производных, образованием смешанных дисульфидов с другими тиоловыми соединениями, реакцией с малеимидом, карбоксиметилированием йодоуксусной кислотой или йодацетамидом и карбамоилированием цианатом при щелочном уровне рН, хотя не ограничиваясь ими. В этой связи специалист данной области может проконсультироваться с главой 15 раздела Сиггей РгоФсок в журнале РгоШп 8аепсе, Ейк. Сокдап еί а1. (1окп Мйеу & 8опк ΝΥ 1995-2000) для получения более обширной информации о методах, связанных с химической модификацией белков.
Вкратце, модификация, например, остатков аргинила в белках часто основана на реакции вицинальных дикарбонильных соединений, таких как фенилглиоксаль, 2,3-бутандион и 1,2-циклогександион для формирования аддукта. Другим примером является реакция метилглиоксаля с остатками аргинина. Цистеин может быть модифицирован без сопутствующей модификации других нуклеофильных сайтов, таких как лизин и гистидин. В результате для модификации цистеина доступно большое число реагентов. На веб-сайтах фирм Р1егсе Скетюа1 Сотрапу и 8^дша-Л1й^^ск и других представлена информация о специфических реагентах.
Также распространена селективная редукция дисульфидных связей в белках. Дисульфидные связи могут быть образованы и оксидированы во время тепловой обработки биофармацевтических средств. К
- 15 018456 реагент Вудворда может использоваться для модификации специфических остатков глютаминовой кислоты. N-(3-(диметиламинопропил)-N'-этилкарбодиимид может использоваться для формирования внутримолекулярных поперечных связей между остатком лизина и остатком глютаминовой кислоты. Диэтилпирокарбонат является, например, реагентом для модификации остатков гистидила в белках. Г истидин может также быть модифицирован при использовании 4-гидрокси-2-ноненала. Реакция остатков лизина и других а-аминных групп полезна, например, при связывании пептидов с поверхностями или перекрестном связывании (кросс-линкинг) белков/пептидов. Лизин является сайтом присоединения поли(этилен)гликоля и основным сайтом модификации при гликировании белков. Остатки метионина в белках могут быть модифицированы с помощью, например, йодацетамида, бромэтиламина, хлорамина Т. Тетранитрометан и Ν-ацетилимидазол могут быть использованы для модификации остатков тирозила. Кросс-линкинг через образование дитирозина может быть произведен с ионами перекиси водорода/меди.
В последних исследованиях по модификации триптофана используются Ν-бромсукцинимид, 2гидрокси-5-нитробензилбромид или 3-бром-3-метил-2-(2-нитрофенилмеркапто)-3Н-индол (ВР№скатол).
Успешная модификация терапевтических белков и пептидов с РЕС-полиэтиленгликолем часто ассоциируется с увеличением циркуляторного полураспада, в то время как кросс-линкинг белков с глутаральдегидом, полиэтиленгликоль-диакрилатом и формальдегидом используется для приготовления гидрогелей. Химическая модификация аллергенов для иммунотерапии часто достигается при карбамоилировании цианатом калия.
Пептид или вариант, в котором пептид модифицирован или включает непептидные связи, является предпочтительным воплощением изобретения.
В целом, пептиды и варианты (по крайней мере, те, что содержат пептидные связи между аминокислотными остатками) могут быть синтезированы Ртос-полиамидным способом твердофазного пептидного синтеза, как раскрыто у Ьи и соавторов 1. Огд. СНет. 1981, 46, 3433, и в прилагающихся ссылках. Временная защита Ν-аминогруппы предусмотрена группой 9-флуоренилметилоксикарбонил (Ртос). Повторное расщепление этой высоко щелоче-лабильной защитной группы осуществляется при использовании 20% пиперидина в Ν,Ν-диметилформамиде. Функциональности боковой цепи могут быть защищены как их бутиловые эфиры (в случае серинтреонина и тирозина), бутиловые сложные эфиры (в случае глютаминовой кислоты и аспарагиновой кислоты), бутилоксикарбониловое производное (в случае лизина и гистидина), тритиловое производное (в случае цистеина) и производное 4-метокси-2,3,6триметилбензолсульфонила (в случае аргинина). Где глютамин или аспарагин являются Стерминальными остатками, для защиты боковой цепи амидо-функциональностей используется 4,4'диметоксибензгидрильная группа. Твердофазный носитель основан на полимере полидиметилакриламида, состоящем из трех мономеров: диметилакриламида (остов-мономер), бис-акрилоилэтилендиамина (кросс-линкер) и метилового эфира акрилоилсаркозина (функционализирующий агент). Использованным агентом с расщепляемым соединением пептид-смола является кислотно-лабильное производное 4гидроксиметилфеноксиуксусной кислоты. Все аминокислотные производные добавляются как их преформированные симметричные ангидридные производные за исключением аспарагина и глютамина, которые добавляются с применением метода обратного соединения, опосредованного Ν,Ν-дициклогексилкарбодиимид/1-гидроксибензотриазолом. Все реакции сочетания и снятия защитных групп отслеживались с помощью нингидрина, тринитробензолсульфоновой кислоты или технологии контроля изотином. После завершения синтеза пептиды отщепляются от смолы-носителя сопутствующим удалением защитных групп боковой цепи при обработке 95% трифторуксусной кислотой, содержащей 50% поглотителя примесей. Обычно используемые поглотители - это этандитиол, фенол, анизол и вода, окончательный выбор зависит от составляющих аминокислот синтезированного пептида. В дополнение возможна комбинация твердофазных и жидкофазных методов для синтеза пептидов (см., например, ВгискбогГег Т, Магбег О, А1Ьепсю Р. Ргот ргобисйоп оГ рерйбек т тННдгат атошИк Гог гекеагсН (о тиНмопк диайШек Гог бгидк оГ (Не Гйиге Сигг РНагт Вю(есНпо1. 2004 РеЬ; 5(1):29-43 и ссылки, процитированные здесь).
Трифторуксусная кислота удаляется выпариванием в вакууме с последующим измельчением с диэтиловым эфиром для получения сырого пептида. Любые представленные поглотители удаляются простой технологией экстракции, которая позволяет получить сырой пептид без поглотителей при лиофилизации водной фазы. Реагенты для синтеза пептидов, как правило, имеются в наличии, например, в Са1Ь^осНет-NоνаЬ^осНет (Великобритания) Ыб, НоИтдНат NС7 2Ц1, Великобритания.
Очистка может быть произведена любой техникой или комбинацией таких техник как рекристаллизация, эксклюзивная хроматография, ионообменная хроматография, хроматография гидрофобного взаимодействия и (обычно) обратнофазная высокоэффективная жидкостная хроматография с использованием, к примеру, градиентного разделения ацетонитрил/вода.
Анализ пептидов может быть произведен при использовании тонкослойной хроматографии, электрофореза, в частности капиллярного электрофореза, твердофазной экстракции (ТФЭ), обратнофазной высокоэффективной жидкостной хроматографии, аминокислотного анализа после кислотного гидролиза и масс-спектрометрического анализа при быстрой бомбардировке атомами (РАВ), а также массспектрометрический анализ МАРИ! и Е8!-О-ТОР.
- 16 018456
Дальнейший аспект изобретения обеспечивает нуклеиновую кислоту (например, полинуклеотид), кодирующую пептид или вариант по изобретению. Полинуклеотид может быть, к примеру, ДНК, кДНК, ПНК, ЦНК, РНК, мРНК и к1РНК или их комбинацией как одно-, так и/или двухнитевыми; натуральными или стабилизированными формами полинуклеотидов, таких как, к примеру, полинуклеотиды с фосфоротиоатным остовом и может или не может содержать интроны в период времени кодирования для пептида. Конечно, только пептиды, содержащие встречающиеся в природе аминокислотные остатки, присоединенные встречающимися в природе пептидными связями, могут кодироваться полинуклеотидом. Еще один дальнейший аспект изобретения обеспечивает вектор экспрессии, способный экспрессировать полипептид в соответствии с изобретением.
Был разработан ряд методов для функционального связывания полинуклеотидов, в особенности ДНК, с векторами, например, с помощью дополнительных липких концов. К примеру, в сегмент ДНК могут быть добавлены дополнительные гомополимерные участки для внесения в вектор ДНК. Вектор и сегмент ДНК в таком случае соединены водородной связью между дополнительными гомополимерными концевыми участками, образуя рекомбинантные молекулы ДНК.
Синтетические сшивающие агенты, содержащие один или несколько сайтов рестрикции, обеспечивают альтернативный способ присоединения сегмента ДНК к векторам. Синтетические сшивающие агенты, содержащие ряд сайтов рестрикционной эндонуклеазы, имеются в продаже в различных источниках, включая Iηке^ηак^оηа1 Вюкескпо1од1ек Шс, Νον Намеп, СН США.
Желаемый путь модификации ДНК, кодирующей полипептид по изобретению использует полимеразную цепную реакцию, как раскрыто у 8а1к1 и соавторов (1988) 8с1епсе 239, 487-491. Этот метод может быть использован для введения ДНК в подходящий вектор, например, при инженерии в подходящих сайтах рестрикции, или же он может быть использован для модификации ДНК другими пригодными путями, известными из уровня техники.
Если используются векторы, то предпочтительными являются оспенные или аденовирусные векторы.
Затем ДНК (или в случае ретровирусных векторов РНК) может экспрессироваться в подходящего хозяина для получения полипептида, включающего пептид или вариант по изобретению. Таким образом, ДНК, кодирующая пептид или вариант по изобретению, может быть использована в соответствии с известными техниками, модифицированная соответствующим образом с учетом приведенных здесь идей, для создания вектора экспрессии, который затем используется для трансформации подходящей клеткихозяина для экспрессии и получения полипептида по изобретению. Такие техники включают также те, что раскрыты в патентах США №: 4,440,859, выданном 3 апреля 1984 на имя Виккег ек а1, 4,530,901, выданном 23 июля 1985 на имя Vе^κκтаη. 4,582,800, выданном 15 апреля 1986 на имя СгоМ, 4,677,063, выданном 30 июня 1987 на имя Магк ек а1, 4,678,751, выданном 7 июля 1987 на имя Соеббе1, 4,704,362, выданном 3 ноября 1987 на имя Йакига ек а1, 4,710,463, выданном 1 декабря 1987 на имя Миггау, 4,757,006, выданном 12 июля 1988 на имя Тоо1е, 1г. ек а1, 4,766,075, выданном 23 августа 1988 на имя Соеббе1 ек а1 и 4,810,648, выданном 7 марта 1989 на имя 8ка1кег, которые все включены сюда путем ссылки.
ДНК (или в случае ретровирусных векторов - РНК), кодирующая полипептид, представляющий собой соединение по изобретению, может быть присоединена к обширному ряду других последовательностей ДНК для введения в адекватного хозяина. ДНК-спутник будет зависеть от природы хозяина, способа введения ДНК хозяину и от того, желательно ли эписомальное поддержание или интеграция.
Как правило, ДНК вводится в вектор экспрессии, такой как плазмида, с правильной ориентацией и корректной рамкой считывания экспрессии. Если необходимо, то ДНК может быть сцеплена с адекватными транскрипционными и трансляционными регулирующими контрольными нуклеотидными последовательностями, распознающимися желательным хозяином, хотя такой контроль обычно имеется в векторе экспрессии. Вектор вводится затем хозяину стандартными способами. Как правило, не все хозяева трансформируются вектором. Поэтому будет необходимо выбрать трансформированные клетки-хозяева. Одна из техник отбора включает введение в вектор экспрессии последовательности ДНК с любыми необходимыми элементами контроля, кодирующей выбранный признак в трансформированной клетке, такой как невосприимчивость к антибиотикам.
Альтернативно ген для такого выбираемого признака может быть на другом векторе, который используется для ко-трансформации желаемой клетки-хозяина.
Клетки-хозяева, которые были трансформированы рекомбинантной ДНК по изобретению, культивируются затем в течение достаточного времени и при адекватных условиях, известных специалистам данной области, с учетом раскрытых здесь идей, что ведет к экспрессии полипептида, который после этого может быть получен.
Известно множество систем экспрессии, включающих бактерии (например, Е. сой и ВасШик киЬкШк), дрожжи (например, 8ассйаготусек сегеу!к1ае), мицелиальные грибы (например, АкрегдШик), растительные клетки, клетки животных и насекомых. Предпочтительно, чтобы система была клетками млекопитающих, такими как клетки колоректального рака или глиобластомы, как те, что имеются в наличии в АТСС Се11 Вю1оду Со11есйоп.
Типичная клеточная векторная плазмида млекопитающих р8УЪ имеется в наличии в Рйагтааа, Р1к
- 17 018456 са1а^ау, N1, США. Примером индуцируемого вектора экспрессии млекопитающих является рМ8С, имеющийся также в наличии в Рйагтааа. Пригодными плазмидными векторами дрожжей являются рК8403-406 и рК8413-416, и они, как правило, имеются в наличии в 81га1адепе С1ошпд 8ук1етк, Ьа 1о11а, СА 92037, США. Плазмиды рК8403, рК8404, рК8405 и рК8406 являются дрожжевыми интегрирующими плазмидами (Мрк) и включают дрожжевые селектируемые маркеры Ш83, ТКР1, ЬЕИ2 и ИКА3. Плазмиды рК8413-416 являются дрожжевыми центромерными плазмидами Шсрк). Другие векторы и системы экспрессии для применения с различными клетками-хозяевами хорошо известны из уровня техники.
Настоящее изобретение относится также к клетке-хозяину, трансформированной с помощью полинуклеотидной векторной модели настоящего изобретения. Клетка-хозяин может быть как прокариотической, так и эукариотической. Бактериальные клетки могут быть, предпочтительно, прокариотическими клетками-хозяевами в некоторых случаях и типично являются штаммом Е. сой, таким как, например, Е. сой штамма ОН5, имеющимся в наличии в ВеШекба Кекеагсй ЬаЬога1опек Шс., Ве1йекба, МО, США, и КК1, имеющимся в наличии в Американской коллекции типов культур Атепсап Туре Си11иге Со11ес11оп (АТСС) оГ КоскуШе, МО, США (№ АТСС 31343). Предпочтительные эукариотические клетки-хозяева включают дрожжи, клетки насекомых и млекопитающих, предпочтительно клетки позвоночных, таких как мышь, крыса, обезьяна или человеческие фибробластные клетки и клеточные линии толстого кишечника. Дрожжевые клетки-хозяева включают ΥРН499, ΥРН500 и ΥРН501, которые, как правило, имеются в наличии в 81га1адепе С1ошпд 8ук1етк, Ьа 1о11а, СА 92037, США. Предпочтительные клетки-хозяева млекопитающих включают клетки яичника китайского хомяка (СНО), имеющиеся в наличии в АТСС как ССЬ61, МН эмбриональные клетки швейцарской мыши М[Н/3Т3, имеющиеся в наличии в АТСС как СКЬ 1658, почечные клетки обезьяны С08-1, имеющиеся в наличии в АТСС как СКЬ 1650 и клетки 293, являющиеся эмбриональными клетками печени человека. Предпочтительными клетками насекомых являются клетки 8Г9, которые могут трансфецироваться с помощью бакуловирусных векторов экспрессии.
Трансформация адекватных клеток-хозяев с помощью модели ДНК настоящего изобретения совершается при помощи хорошо известных способов, которые обычно зависят от типа используемого вектора. Относительно трансформации прокариотических клеток-хозяев см., например, Сойеп и соавторы Ргос. №Г1. Асаб. 8сГ И8А 1972, 69, 2110 и 8атЬгоок е1 а1 (1989) Мо1еси1аг С1ошпд, А ЬаЬога1огу Мапиа1, Со1б 8рипд НагЬог ЬаЬога1огу, Со1б 8рппд НагЬог, Нью-Йорк. Трансформация дрожжевых клеток описывается у 8йегтап и соавторов (1986) Ме1йобк Ш Υеаκΐ Сепейск, А ЬаЬога1огу Мапиа1, Со1б 8рйпд НагЬог, Нью-Йорк. Также подходит метод Бигса (Веддк) №1Ц.1ге 1978, 275,104-109. Что касается клеток позвоночных, то подходящие для трансфекции таких клеток реагенты, например, фосфат кальция и ЬЕАЕдекстран или липосомальные составы, имеются в наличии в 8Гга1адепе С1ошпд 8ук1етк или ЬГГе Тесйпо1од1ек Шс., СаййегкЬигд, МО 20877, США. Электропорация также подходит для трансформации и/или трансфекции клеток и хорошо известна из уровня техники для трансформации дрожжевых клеток, бактериальных клеток, клеток насекомых и клеток позвоночных.
Успешно трансформированные клетки, т.е. клетки, которые содержат конструкцию ДНК настоящего изобретения, могут быть идентифицированы хорошо известными способами, такими как ПЦР. Альтернативно наличие белка в супернатанте может выявляться применением антител.
Следует понимать, что некоторые клетки-хозяева по изобретению подходят для получения пептидов по изобретению, например, бактериальные, дрожжевые клетки и клетки насекомых. Тем не менее, другие клетки-хозяева могут быть пригодны в конкретных терапевтических методах. Например, антигенпрезентирующие клетки, такие как дендритные клетки, могут быть использованы для экспрессии пептидов по изобретению так, что их можно будет нагружать на адекватные молекулы МНС. Таким образом, настоящее изобретение обеспечивает клетку-хозяина, включающую нуклеиновую кислоту или вектор экспрессии в соответствии с изобретением.
В предпочтительном воплощении клетка-хозяин является антигенпрезентирующей клеткой, в частности, дендритной клеткой или антигенпрезентирующей клеткой. АПК, нагруженные рекомбинантным белком слияния, содержащим простатическую кислую фосфатазу (РАР), на данный момент проходят исследования в целях лечения рака простаты (81ри1еисе1-Т) (8та11 Е1, 8сйе11йаттег РЕ, Шдапо С8, КебГегп СН, №тцпа1йк Л, Уа1опе ЕН, Уеуее 88, 1опек ЬА, НегкйЬегд КМ.; Р1асеЬо-соп1го11еб рйаке 3 1йа1 оГ 1ттипо1одю 1йегару \\йй к1ри1еисе1-Т (АРС8015) т райейк \\йй теШйайс, акутр1отайс йогтопе геГгас1огу ргок1а1е сапсег; 1 С1т 0псо1. 2006; 24(19):3089-3094; К1ш ВГ ХУетйегд V, Еопд Ь, Сопгу 8, НегкйЬегд КМ, 8та11 Е1; СотЫпайоп 1ттипо1йегару тейй ргок1а(1с ас1б рйокрйа1аке ри1кеб апйдеп-ргекепйпд се11к (Ргоуепде) р1ик ЬеуаахитаЬ ш райейк \\йй кего1одю ргодгеккюп оГ ргок1а1е сапсег айег беГшйГуе 1оса1 Шегару; Сапсег. 2006; 107(1):67-74)
Дальнейший аспект изобретения обеспечивает способ получения пептида или его варианта. Этот способ включает культивирование клетки-хозяина и изолирование пептида из клетки-хозяина или ее культуральной среды.
В другом воплощении пептид, нуклеиновая кислота или вектор экспрессии по изобретению используются в медицине. Например, пептид или его вариант может приготавливаться для внутривенной (ί.ν.) инъекции, подкожной (к.с.) инъекции, внутрикожной (Гб.) инъекции, внутрибрюшной (1.р.) инъекции, внутримышечной (1.т.) инъекции. Предпочтительные пути введения пептидной инъекции - к.с, Ϊ.6., 1.р.,
- 18 018456
1.т. и ί.ν. Предпочтительными путями введения инъекции ДНК являются 1.й., 1.т., 8.е, ί.ρ. и ί.ν. Вводиться могут дозы, к примеру, между 50 мкг и 1,5 мг, предпочтительно от 125 мкг до 500 мкг пептида или ДНК и будут зависеть от соответствующего пептида или ДНК. Дозы в данных пределах успешно использовались в предыдущих клинических исследованиях (Вгшътщ РР, Аатйа1 8, С)сг15сп МК, Куа1йсйп 6, Магко\У5к1-Спт5гий С1, 8ус I, Эугйаид М, Тгае115с1 8, ЫГсЙсг М, Епкзсп 1Л, Саийстаск 6; Тс1отсга5с рерййе уассшайоп: а рйазе Ι/ΙΙ 81ийу ίη ра(1сп15 \уйй поп-8та11 сс11 1ипд сапссг; Сапссг 1ттипо1 1ттипо1йсг. 2006; 55(12): 1553-1564; М. 81асй1сг, А. 8ΐαιζ1, Р. Υ. Э|с1пс11. Т. Е18сп, А. НаРсткашр, 1. Веск, А. Маусг, 8. ХМаЙсг, Н. 81пдй, 1. Рп^сй, С. С. 8ПсГ; Ап ореп 1аЬс1 51пйу !о стайкИс 1йс 5аГс1у апй йппшподсшсйу оГ 1йс рсрййс Ьазей сапссг уассшс 1МА901, А8СО тсейпд 2007; АЬЧгас! Ыо 3017).
Важным аспектом настоящего изобретения является способ ш уйго для получения активированных ЦТЛ. Способ, включающий контактирование ЦТЛ ш уйго с нагруженными антигеном человеческими молекулами МНС I или II класса, экспрессированными на поверхности подходящей антигенпрезентирующей клетки на период времени, достаточного для активации ЦТЛ антиген-специфическим образом. Антиген является пептидом в соответствии с изобретением. Предпочтительным образом достаточное количество антигена используется с антигенпрезентирующей клеткой.
В случае эпитопа МНС класса II, используемого в качестве антигена, ЦТЛ являются СЭ4положительными хелперными клетками, предпочтительным образом типа ТН1. Молекулы МНС класса II могут быть экспрессированы на поверхности любой подходящей клетки и, предпочтительно, если клетка в естественных условиях не экспрессирует молекулы МНС класса II (в этом случае клетка трансфецирована для экспрессии такой молекулы). Альтернативно, если клетка в естественных условиях экспрессирует молекулы МНС класса II, то клетка является дефектной для сигнальных путей процессинга или презентации антигена. Тогда для клетки, экспрессирующей молекулы МНС класса II, возможен, по существу, полный прайминг с выбранным пептидным антигеном до активации ЦТЛ.
Антигенпрезентирующая клетка (или клетка-стимулятор) типично имеет молекулы МНС класса II на своей поверхности и предпочтительно обычно является не способной самостоятельно нагружать на обозначенную молекулу МНС класса II выбранный антиген. Молекула МНС II класса может быть легко нагружена выбранным антигеном ш уйго.
Предпочтительно в клетке млекопитающих не хватает или имеется пониженный уровень или пониженная функция пептидного транспортера ТАР. Подходящие клетки, в которых не хватает пептидного транспортера ТАР, включают Т2, КМА-8 и клетки дрозофилы. ТАР - это транспортер, ассоциированный с процессингом антигена.
Нагружающая пептидом дефектная клеточная линия Т2 человека имеется в наличии в Ашепсап Туре СиЙитс СоИссЦоп, 12301 Рагк1а\уп Элус, КоскуШе, Магу1апй 20852, США под каталоговым № СКЙ 1992; клеточная линия дрозофилы линия 8сйпс1йсг 2 имеется в наличии в АТСС под каталоговым № СКЕ 19863; клеточная линия мыши КМА-8 описывается у Каггс и Ципддгсп (1985) 1. Ехр. Мей. 162,1745.
Предпочтительно, чтобы клетка-хозяин не экспрессировала молекулы МНС класса I до трансфекции. Предпочтительно, если клетка-стимулятор экспрессирует молекулу, важную для Т-клеточной костимуляции, такую как любая из В7.1, В7.2, [САМ-1 и ЬРА 3.
Последовательности нуклеиновой кислоты многочисленных молекул МНС II класса и костимулирующих молекул общедоступны в банках данных СспВапк и ЕМВЬ.
Аналогично, в случае использования эпитопа МНС класса I в качестве антигена, ЦТЛ являются СЭ8-положительными хелперными клетками. Молекулы МНС класса I могут быть экспрессированы на поверхности любой подходящей клетки и, предпочтительно, чтобы клетка в естественных условиях не экспрессировала молекулы МНС класса I (в этом случае клетка трансфецирована для экспрессии такой молекулы). Альтернативно, если клетка в естественных условиях экспрессирует молекулы МНС класса I, то она является дефектной для сигнальных путей процессинга или презентации антигена В этом случае для клетки, экспрессирующей молекулы МНС класса I, возможен, по существу, полный прайминг с выбранным пептидным антигеном до активации ЦТЛ.
Если антигенпрезентирующая клетка трансфецирована для экспрессии такого эпитопа, то предпочтительно, чтобы клетка включала вектор экспрессии, способный экспрессировать пептид, содержащий 8ЕС Ш № 1 по 8ЕС Ш № 29 или вариант такой аминокислотной последовательности.
Для генерации ЦТЛ ш уйго могут быть использованы многие другие способы. Например, в методах, описанных у Реор1с§ с! а1 Ргос №111 Асай 8а И8А 1995, 92, 432-436 и Ка^акат1 с! а1 (1992) 1 Iтшиηо1 148, 638-643 при генерации ЦТЛ используются аутологичные инфильтрующие опухоль лимфоциты. Р1сЬап8к1 и соавторы (1995) Еиг 1 Iтшиηо1 25, 1783-1787 для приготовления ЦТЛ используют аутологичные лимфоциты периферической крови (ЛПК). 1осйшп5 и соавторы (1997) 1 Сеп У1то1 78, 1689-1695 описывают получение аутологичных ЦТЛ методом импульсного введения пептида или полипептида в дендритные клетки или посредством инфицирования рекомбинантным вирусом. НШ и соавторы (1995) 1 Ехр Мей 181, 2221-2228 и 1сгошс и соавторы (1993) 1 Iтшиηо1 151, 1654-1662 для получения аутологичных ЦТЛ используют В-клетки Кроме того, для получения аутологичных ЦТЛ могут быть использованы макрофаги с введенным импульсным методом пептидом или полипептидом или инфицированные рекомбинантным вирусом. 8. ХМаЙсг и соавторы (^айст 8, Нсггдсп Ь, 8сйоог О, 1ипд С, \Устс1 Ό, Вийттд Ш, Кат
- 19 018456 тепкее НС, 8(су1поу1с 8. Сийтд ейде: ргейе(егт1пей аν^й^ίу оГ китам СЭ8 Т-се11к ехрапйей оп саНЬШей МНС/апи-СГО28-соа1ей ткгокркегек ί Iшшиηο1 2003 №ν 15; 171 (10):4974-8) описывают прайминг Тклеток 1п у11го с использованием искусственных антигенпрезентирующих клеток, который является также подходящим методом генерирования Т-клеток против выбранного пептида При получении ЦТЛ могут быть также использованы аллогенные клетки, и отдельный метод детально описывается в патенте МО 97/26328, включенном сюда путем ссылки.
Например, кроме клеток дрозофилы и Т2-клеток, для презентации антигенов могут использоваться другие клетки, такие как клетки яичника китайского хомяка (СНО), бакуловирус-инфицированные клетки насекомых, бактерии, дрожжи, инфицированные осповакциной клетки-мишени. Кроме того, могут быть использованы растительные вирусы (см., например, Ройа и соавторы У1го1оду 1994, 202, 449-955, который описывает развитие мозаичного вируса китайской вигны как высокопродуктивную систему для презентации чужеродных пептидов).
Активированные ЦТЛ, которые направлены против пептидов по изобретению, полезны для терапии. Таким образом, дальнейший аспект изобретения обеспечивает активированные ЦТЛ, получаемые вышеупомянутыми способами по изобретению.
Активированные ЦТЛ, полученные с помощью приведенного выше способа будут селективно распознавать клетку, которая аберрантно экспрессирует полипептид, включающий аминокислотную последовательность 8ЕО ГО № 1 по 29.
Предпочтительно, чтобы ЦТЛ распознавал клетку при взаимодействии посредством его ТКР с комплексом НЬА/пептид (например, соединение). ЦТЛ полезны в способе уничтожения клеток-мишеней у пациента, клетки-мишени которого аберрантно экспрессируют полипептид, включающий аминокислотную последовательность по изобретению. Пациенту вводится эффективное число активированных ЦТЛ. ЦТЛ, введенные пациенту, могут быть получены от пациента и активироваться, как описывалось выше (т.е. они являются аутологичными ЦТЛ). Альтернативно ЦТЛ получают не от пациента, а от другого индивида. Разумеется, предпочтительно, если донор является здоровым индивидом. Здоровым индивидом обозначается, что индивид имеет в общем хорошее здоровье, предпочтительно он имеет компетентную иммунную систему и более предпочтительно не страдает ни одним заболеванием, для которых можно легко провести анализы и выявить.
Клетками-мишенями для СГО4-положительных ЦТЛ ш νί\Ό в соответствии с настоящим изобретением могут быть клетки опухоли (которые иногда экспрессируют МНС класса II) и/или стромальные клетки, окружающие опухоль (опухолевые клетки) (которые иногда также экспрессируют МНС класса II); ГОепд|е1. ί. №к1ке. МО, СоийеГапдеак, С, С1(51оий1к. С, 8скоог, О, Λ1ίеηЬе^еηй, Е, Ми11ег, М, Кип пег. В, Мккюи, А, 8ап1ег. М, Неппеп1о11ег. ί. Метер Ό, 8ίеηζ1, А, Вашшеηκее, НС, Ккпде1. К, апй 8ίеνаηον^с, 8; Ипехрейей АЬипйапсе оГ НЬА С1акк II Ргекейей Рер11йек т Рптагу Вепа1 Се11 Сагстотак, С1т Сапсег Век., 2006, 12, 4163-4170).
ЦТЛ по изобретению могут быть использованы в качестве активных ингредиентов в терапевтической композиции. Таким образом, изобретение обеспечивает также способ по уничтожению клетокмишеней у пациента, клетки-мишени которого аберрантно экспрессируют полипептид, включающий аминокислотную последовательность по изобретению. Данный способ включает введение пациенту эффективного числа ЦТЛ, как определено выше.
В понятие аберрантно экспрессированный мы включаем значение, что полипептид гиперэкспрессирован по сравнению с нормальным уровнем экспрессии или что ген является молчащим в ткани, из которой образовалась опухоль, однако он экспрессирован в опухоли. Под понятием гиперэкспрессирован мы подразумеваем, что полипептид представлен на уровне, который по крайней мере в 1,2 раза выше уровня, представленного в нормальной ткани; предпочтительно по крайней мере в 2 раза и более предпочтительно по крайней мере в 5 или 10 раз выше уровня, представленного в нормальной ткани.
ЦТЛ могут быть получены способами, известными из уровня техники, например, теми, что описаны выше.
Протоколы для этого т.н. адоптивного переноса ЦТЛ хорошо известны из уровня техники, и с ними можно ознакомиться, например, в работах (ВокепЬегд, 8А, Бо1хе. МТ, Мии1, БМ, Скапд, АЕ, Айк. ЕР, Бектап. 8, Ыпекап, ММ, Вокейкоп. ΟΝ, Бее, ВЕ, ВиЬт, ТГ, еί а1., А ргодгекк герой оп Фе 1геа1теп1 оГ 157 раНеп1к \\йк айсапсей сапсег иктд 1ушркοк^ηе-асί^νаίей кШег се11к апй 1п1ег1еик1п-2 ог Ыдк-йоке 1п(ег1еик1п2 а1опе, Ν. Епд1. I. Мей, 1987, 316, 889-897; ВокепЬегд, 8А, Раскагй, В8, АеЬегко1й, РМ, 8о1отоп. Ό, Торакап, 8Б, Тоу, 8Т, 81шоп, Р, Бо1хе. МТ, Υηπ§. 1С, 8е1рр, СА, еί а1.; Ике оГ ίишο^-^ηГ1к^аί^ηд 1ушркοсуίек апй 1п(ег1еик1п-2 ш ίке ттшпоФегару оГ ра11еп1к \\йк те1ак1айс те1апота. А ргеШтпагу герой. №Епд12 Мей, 1988, 319, 1676-1680; Оий1еу. МЕ, Мипйегкск, ГВ, ВоЬЬтк, РЕ, Υηπ§. 1С, Нтеи, Р, 8сктеайхеп1гпЬег. ЭТ Торакап, 8Б, 8кеггу, В, ВекПГо. Ν₽, НиЫск1, АМ, ВоЬткоп, МВ, ВаГГе1й, М, Биту. Р, 8е1рр, СА, ВодегкЕгеехег. Б, Мойоп. КЕ, Махгоикак1к. 8А, Мкке. ЭЕ. апй ВокепЬегд, 8А; Сапсег гедгеккюп апй айоттшпку ш ра11еп1к аГ(ег с1опа1 герори1айоп \хкк айкитог 1ушркοсуίеκ, 8с1епсе, 2002, 298, 850-854; Υее, С, Ткотркоп, .ТА, Вугй, Ό, В1ййе11, 8В, Воске, Р, Секк, Е, апй СгеепЬегд, РЭ; АйорПус Т се11 (кегару иктд апйдепкресШс СГО8+ Т се11 с1опек Гог (ке (гейтей оГ раНеп1к тейк те1ак1айс те1апота: т νίνυ регыйепсе, 1тдгайоп. апй апШитог еГГес( оГ (гапкГеггей Т се11к, Ргос. №И1. Асай. 8ск И.8.А, 2002, 99, 16168-16173; Эий1еу.
- 20 018456
МЕ, ХУипйегНсй, 1В, Υапд, 1С, 8йеггу, ВМ, ТораНап, 8Ь, ВекНГо, ΝΡ, Воуа1, ВЕ, Κатши1а, и, ^йНе, ЭЕ, Маугоикакщ, 8А, Водегк, Ы, Огааа, 61, 1опек, 8А, Мапд1ате11, ΌΡ, Ρе11е1^е^, ММ, 6еа-Вапас1осйе, 1, ВоЬткоп, МВ, Вегтап, ОМ, ЕШе, АС, АЬаН, А, апй ВокепЬегд, 8А; АйорНуе се11 1гапкГег 1йегару ГоНо^тд поптуе1оаЬ1а11уе Ьи1 1утрйойер1еНпд сйетоШегару Гог 1йе 1геа1теп1 оГ раНеп1к ^Нй геГгас!огу те1ак1аНс те1апота, 1. С1т. Опсо1, 2005, 23, 2346-2357); обобщение (баШпош, Ь, Ρо\νе11, Ό1, 1г., ВокепЬегд, 8А, и ВекΙίίο, ΝΡ; АйорНуе ниншпоШегару Гог сапсег: Ьш1йшд оп киссекк, №1. Веу. 1шшипо1., 2006, 6, 383-393) и (Могдап, ВА, Оий1еу, МЕ, ^ипйегНсй, Ж, Нидйек, М8, Υапд, 1С, 8йеггу, ВМ, Воуа1, ВЕ, ТораНап, 8Ь, Κатти1а, И8, ВекНГо, ΝΡ, Ζйепд, Ζ, №ι1ινί, А, йе Упек, СВ, Водегк-Егее/ег, Ы, Маугоикакй, 8А, апй ВокепЬегд, 8А; Сапсег Ведгеккюп т Ρа1^еп1к Айег ТгапкГег оГ 6епеНса11у Епдтеегей Ьутрйосу1ек, 8с1епсе, 2006, 314(5796): 126-129).
Любая молекула по изобретению, т.е. пептид, нуклеиновая кислота, вектор экспрессии, клетка, активированные ЦТЛ, Т-клеточный рецептор или нуклеиновая кислота, кодирующая его, полезна для лечения нарушений, характеризующихся ускользанием клеток от иммунного ответа. Поэтому любая молекула настоящего изобретения может применяться в качестве медикамента или при изготовлении медикамента. Молекула может быть использована сама по себе или в комбинации с другой(ими) молекулой(ами) по изобретению или известной(ыми) молекулой(ами).
Предпочтительно, если медикамент является вакциной. Она может вводиться непосредственно пациенту, в пораженный орган или систематично, или вноситься ех у1уо в клетки, полученные от пациента, или в человеческую клеточную линию, которые затем могут вводиться пациенту или использоваться ш У11го для селекции субпопуляции из иммунных клеток, полученных от пациента, которые после этого вновь вводятся пациенту. Если нуклеиновая кислота введена в клетки ш νίΙΐΌ, то может быть полезно, чтобы клетки были трансфецированными, чтобы ко-экспрессировать иммуностимулирующие цитокины, такие как интерлейкин-2. Пептид может быть, по существу, чистым или комбинированным с иммуностимулирующим адъювантом (см. ниже) или использоваться в комбинации с иммуностимулирующими цитокинами или вводиться с подходящей системой доставки, например, липосомами. Пептид может быть также конъюгирован с подходящим носителем, таким как гемоцианин лимфы улитки (КИН) или маннан (см. \УО 95/18145 и Еопдепескег е1 а1 (1993) Апп. ΝΥ Асай. 8сЕ 690,276-291). Пептид может быть также меченым или являться белком слияния или гибридной молекулой. Ожидается, что пептиды настоящего изобретения стимулируют СГО4 или СЭ8 ЦТЛ. Тем не менее, стимуляция более эффективна в присутствии помощи, производимой Т-клетками, положительными для противоположного СО. Таким образом, для эпитопов МНС II класса, которые стимулируют СГО4 ЦТЛ, партнеры слияния или секции гибридной молекулы адекватно обеспечивают эпитопы, которые стимулируют 608-положительные Тклетки. С другой стороны, для эпитопов МНС I класса, которые стимулируют СЭ8 ЦТЛ, партнеры слияния или секции гибридной молекулы адекватно обеспечивают эпитопы, которые стимулируют СГО4положительные Т-клетки. СЭ4- и 608-стимулирующие эпитопы хорошо известны из уровня техники и включают те, что были идентифицированы в настоящем изобретении.
В одном аспекте изобретения вакцина включает, по крайней мере, один пептид, предпочтительно от двух до 50, более предпочтительно от двух до 25, еще более предпочтительно от двух до 15 и, наиболее предпочтительно, два, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять, десять, одиннадцать, двенадцать или тринадцать пептидов по изобретению или дополнительных пептидов. Пептид(ы) может(могут) быть образован(ы) из одного или более специфических ТАА и может(могут) связываться с молекулами МНС класса I и/или класса II.
Предпочтительно, когда пептиды по изобретению используются в вакцине или медикаменте по изобретению, они присутствуют в качестве соли, такой как, например, но не ограничиваясь ими, соль ацетата или соль хлорида. Пример 7 обеспечивает исследования вакцины ГМА-910, которая содержит некоторые из пептидов настоящего изобретения, и описывает приготовление вакцины с использованием пептидов в их солевой форме и с их размером частиц.
Полинуклеотид может быть, по существу, чистым или содержаться в подходящем векторе или системе доставки. Нуклеиновая кислота может быть ДНК, кДНК, ПНК, ЦНК (циклогексанилнуклеиновая кислота), РНК или их комбинацией. Методы конструирования и введения такой нуклеиновой кислоты хорошо известны из уровня техники. Обзор представлен, например, у 8. Ρаксо1о: УасапаНоп ^Нй теккепдег ВИА Ме1йойк Мо1 Мей 2006, 127; 23-40; В. 81ап, ГО \Уо1с1юк апй АО Сойеп ЭХА уасстек адатк1 сапсег. НетаЮ1 Опсо1 СИп НоПИ Ат 2006, 3; 613-636 или А Маййау1 апй В1 Мопк Весеп1 айуапсек т йитап рарШотауйик уасстек. Сигг Опсо1 Вер 2006, 6, 465-472. Полинуклеотидные вакцины легки в приготовлении, однако способ действия этих векторов по индуцированию иммунного ответа понят не полностью. Подходящие векторы и системы доставки включают вирусные ДНК и/или РНК, такие как системы, которые основаны на аденовирусе, вирусе осповакцины, ретровирусах, вирусе герпеса, аденоассоциированном вирусе или гибридах, содержащих элементы более чем одного вируса. Невирусные системы доставки включают катионные липиды и катионные полимеры и хорошо известны из уровня техники в области доставки ДНК. Также может быть использована физическая доставка, такая как посредством генпистолета. Пептид или закодированный нуклеиновой кислотой пептид может быть белком слияния, например, с эпитопом, который стимулирует Т-клетки для соответствующего противоположного гиперва
- 21 018456 риабельного участка (СОК), как описывается выше.
Медикамент по изобретению может также включать один или более адъювант. Адъюванты - это вещества, которые неспецифически усиливают или потенцируют иммунный ответ (например, иммунные ответы, опосредованные ЦТЛ или хелперными Т-клетками (Тн) на антиген, и могут, таким образом, рассматриваться как полезные в медикаменте настоящего изобретения. Подходящие адъюванты включают, но не ограничиваются, 1018 Ι88, соли алюминия, Атрйуах, А8 15, ВСС, СР-870,893, СрС7909, СуаА, й8ЫМ, СМ-С8Р, Ιϋ30, ΙΟ31, Имиквимод, ^иРай ЙМР321, Ι8 РаюН, Ι88, КСОМАТИХ, Ьиу1ттипе, ЫроУас, МР59, монофосфорил липид А, Монтанид ^8 1312, Монтанид КА 206, Монтанид КА 50У, Монтанид КА-51, ОК-432, ОМ-174, ОМ-197-МР-ЕС, ОЭТАК, векторная система РерТе1®, микрочастицы РЙС, резиквимод, 8КЙ172, вирусомы и другие вирусоподобные частицы, ΥΕ-17Ό, УЕСР (гар, К848, Бета-глюкан, Рат3Сук, стимулон Ацийа'к 0821, который получают из сапонина, микобактериальные экстракты и синтетические имитации бактериальных клеточных стенок и другие запатентованные адъюванты, такие как К1Ь1'к Ое(ох, 0ш1 или 8ирегГок.
Предпочтительными адъювантами являются такие как адъювант Фрейнда или ГМ-КСФ. Несколько иммунологических адъювантов (например, МР59), специфических для дендритных клеток, и их приготовление были описаны ранее (Оиршк М, Митрйу ТЬ, Шддтк Ό, Ыдо/хоН М, уап С, Ой С, МсЭопа1й
ОМ; Эепйпйс се11к нПетаНхе уассте ай)нуап( аГ(ег тйатиксйаг нцесНоп; Се11 Iттиио1. 1998; 186(1): 1827; АШкоп АС; ТНе тойе оГ асйоп оГ 1ттипо1одюа1 ай)иуап(к; Эеу Вю1 8(апй. 1998; 92:3-11). Также могут использоваться цитокины. Несколько цитокинов были присоединены напрямую для оказания влияния на миграцию дендритных клеток к лимфоидным тканям (например, !т№-а), ускоряя созревание дендритных клеток до эффективных, презентирующих антиген Т-лимфоцитам, клеток (например, ГМ-КСФ, ΙΚ-1 и Гй4) (амер. патент № 5,849,589, специфически включённый сюда в его целостности путём ссылки) и действуя как иммуноадъюванты (например, Ш-12) (СаЬЫоуюН ΌΙ, СиптпдНат НТ, СагЬопе ОР; Ш-12 апй ти(ап( Р53 рер(|йе-ри1кей йепйпйс се11к Гог (Не кресШс ттипоШегару оГ сапсег; Ь [ттиηо(Не^ ЕтрНайк Титог Ι^^θΙ 1996 (6):414-418).
Об иммуностимулирующих олигонуклеотидах СрС также сообщалось, что они усиливают эффекты адъювантов в составе вакцин. Теоретически не связанные, СрС-олигонуклеотиды при активации врождённой (неадаптивной) иммунной системы действуют с помощью То11-подобных рецепторов (ТЙК), в основном ТЙК9. Вызванная СрС активация ТЙК9 усиливает антиген-специфические гуморальные и клеточные ответы на широкий спектр антигенов, включая пептидные или белковые антигены, живые или убитые вирусы, вакцины из дендритных клеток, аутологичные клеточные вакцины и полисахаридные конъюгаты как в профилактических, так и терапевтических вакцинах. Более важно то, что улучшается созревание и дифференциация дендритных клеток, приводя к улучшенной активации ТН1-клеток и интенсивной генерации цитотоксических Т-лимфоцитов (ЦТЛ) даже при отсутствии помощи СЭ4 Тклеток. Отклонение в сторону ТН1, вызванное стимуляцией ТЙК9, сохраняется даже в присутствии вакцинных адъювантов, таких как квасцы или неполный адъювант Фрейнда (ША), который обычно способствует отклонению в сторону ТН2. СрС-олигонуклеотиды проявляют даже большую адъювантную активность, если они входят в состав или вводятся вместе с другими адъювантами или в таких составах как микрочастицы, наночастицы, липидные эмульсии или подобных составах, которые в особенности необходимы для инициации сильного ответа, если антиген относительно слаб. Они также ускоряют иммунную реакцию и позволяли снизить дозы антигена на приблизительно два порядка величины с ответами антитела, сравнимыми с полной дозой вакцины без СрС, в некоторых экспериментах (Агйшг М. Кпед, ТНетареийс ро!епйа1 оГ То11-йке гесер(ог 9 асйуайоп, №1(иге Кеу1етек, Эгид Ойсоуегу, 5, ΐυΝΉ 2006, 471484). В патенте США № 6,406,705 В1 описывается комбинированное применение СрСолигонуклеотидов, адъювантов, не включающих нуклеиновые кислоты, и антигена для вызывания антиген-специфического иммунного ответа. Имеющимся в продаже антагонистом СрС ТЙК9 является й8ЫМ (контурный иммуномодулятор двойного действия) компании Мо1одеп (Берлин, Германия), который является предпочтительным компонентом фармацевтической композиции настоящего изобретения. Также могут быть использованы другие молекулы, связывающиеся с ТЬК, такие как РНК, связывающаяся с ТЬК 7, ТЬК 8 и/или ТЬК 9.
Другие примеры полезных адъювантов включают, но не ограничиваются химически модифицированными СрС (например, СрК, Кета), Ро1у(йС), таким как АтрйСеп, не-СрС бактериальной ДНК или РНК, а также иммуноактивными малыми молекулами и антителами, такими как циклофосфамид, сунитиниб, бевацизумаб, целебрекс, Ж.’Х-4016, силденафил, тадалафил, варденафил, сорафениб, ХЙ-999, СР547632, пазопаниб, ΖΌ2171, АΖ^2171. анти-СТйА4 и 8С58175, которые могут действовать терапевтически и/или как адъювант. Количества и концентрации адъювантов и вспомогательных веществ, полезных в контексте настоящего изобретения, могут быть легко определены опытным специалистом без проведения излишних экспериментов.
Предпочтительными адъювантами являются й8ЫМ, ВСС, ОК432, АЙВАКА, Реу1Тет и Ьиу1ттипе.
Предпочтительным образом, медикаменты настоящего изобретения являются активными против рака. Рак может быть неметастатическим или метастатическим, в частности раком ротовой полости и глотки, раком пищеварительного тракта, раком толстой кишки, прямой кишки и анального отверстия,
- 22 018456 раком дыхательных путей, раком груди, раком шейки матки, влагалища и наружных половых органов, раком тела матки и яичника, раком мужских половых путей, раком мочевыводящих путей, раком костной и мягкой ткани и саркомой Капоши, меланомой кожи, меланомой глаза и немеланомным раком глаза, раком головного мозга и центральной нервной системы, раком щитовидной железы и других эндокринных желез, лимфомой Ходжкина, лимфомой не-Ходжкина и миеломой. Наиболее предпочтительно, чтобы неопластическое заболевание, лечащееся способом актуального изобретения, было колоректальным раком, раком легкого, раком груди, раком поджелудочной железы, раком простаты, раком желудка, раком почки, гастроинтестинальной стромальной опухолью (ОКТ) или глиобластомой.
Так как пептиды по изобретению были изолированы из глиобластомы, колоректального рака, рака поджелудочной железы, легкого, почки или желудка, медикамент по изобретению будет особенно полезен, если вид рака, подвергающегося лечению, будет глиобластомой, колоректальным раком, раком поджелудочной железы, легкого, почки или желудка.
Кроме того, пептиды настоящего изобретения полезны не только для лечения рака, но и также в качестве диагностических средств. Так как пептиды были получены из глиобластомы, и так как было определено, что данные пептиды не присутствуют в нормальных тканях, то эти пептиды могут быть использованы для постановки диагноза о наличии рака.
Присутствие пептидов настоящего изобретения на тканевых биоптатах может помочь патологу в постановке диагноза рака. Детекция конкретных пептидов настоящего изобретения с помощью антител, масс-спектрометрии или других методов, известных из уровня техники, может дать знать патологу, что ткань поражена злокачественным или воспалительным или же заболеванием общего порядка. Присутствие групп пептидов настоящего изобретения может сделать возможной классификацию или субклассификацию пораженных заболеванием тканей.
Детекция пептидов настоящего изобретения на образцах пораженной заболеванием ткани может позволить принять решение о преимуществах от терапии, воздействующей на иммунную систему, в особенности, если Т-лимфоциты, как известно или ожидается, задействованы в механизме действия. Отсутствие экспрессии МНС является хорошо описанным механизмом, при котором инфицированные или злокачественные клетки уклоняются от иммунного надзора. Так, присутствие пептидов настоящего изобретения показывает, что данный механизм не используется проанализированными клетками.
Пептиды настоящего изобретения могут использоваться для анализа ответов лимфоцитов на пептиды настоящего изобретения, таких как ответы Т-клеток или ответы антител на пептиды настоящего изобретения или пептиды настоящего изобретения в комплексе с молекулами МНС. Данные иммунные ответы лимфоцитов могут использоваться в качестве прогностических маркеров для принятия решения о дальнейших этапах терапии. Данные иммунные ответы могут также использоваться в качестве суррогатных маркеров в иммунотерапевтических подходах, направленных на индуцирование ответов лимфоцитов с помощью различных средств, как, например, вакцинации белком, нуклеиновыми кислотами, аутологичными материалами, адоптивного переноса лимфоцитов. При генной терапии ответы лимфоцитов на пептиды настоящего изобретения могут быть рассмотрены в рамках оценки побочных эффектов. Мониторинг ответов лимфоцитов может также быть ценным инструментом для последующих обследований в случае трансплантации, к примеру, для детекции реакций хозяин против трансплантата и трансплантат против хозяина.
Пептиды настоящего изобретения могут использоваться для генерации и разработки специфических антител к комплексам МНС/пептид. Они могут быть использованы в терапии, нацеливающей токсины или радиоактивные вещества на пораженную ткань. Другим видом использования данных антител может быть нацеливание радионуклидов на пораженную ткань в целях визуализации, такой как РЕТ (позитронно-эмиссионная томография). Это может помочь в обнаружении небольших метастазов или в определении размера и точного расположения пораженных тканей. Кроме того, пептиды могут быть использованы для верификации диагноза патолога, поставленного на основании биоптата.
В другом его аспекте настоящее изобретение относится к комплекту, включающему (а) контейнер, содержащий фармацевтическую композицию, описанную выше, в виде раствора или в лиофилизованной форме; (Ь) опционально - второй контейнер, содержащий разбавитель или восстанавливающий раствор для лиофилизованного состава; и (с) опционально - инструкции по (ί) применению раствора или (ίί) восстановителя, и/или по применению лиофилизованного состава. Указанное оборудование может включать один или более (ш) буфер, (ίν) разбавитель, (ν) фильтр, (νί) иглу или (νίί) шприц. Контейнер является, предпочтительно, флаконом, ампулой, шприцем или пробиркой; и он также может быть контейнером многоразового использования. Фармацевтическая композиция предпочтительно лиофилизована.
Вспомогательное оборудование настоящего изобретения предпочтительно включает лиофилизованный состав настоящего изобретения в подходящем контейнере и инструкции для ее восстановления и/или по ее применению. Подходящие контейнеры включают, например, флаконы, ампулы (например, двухкамерные ампулы), шприцы (такие как двухкамерные шприцы) и пробирки. Контейнер может быть сделан из разнообразных материалов, таких как стекло или пластик. Предпочтительным образом, вспомогательное оборудование и/или контейнер содержит инструкции для использования или связанные с контейнером, которые дают указания для восстановления и/или применения. Например, на этикетке мо
- 23 018456 жет быть указано, что лиофилизованный состав должен восстанавливаться до пептидных концентраций, как те, что описаны выше. На этикетке в дальнейшем может быть указано, что состав применяется или предназначается для подкожного введения.
Контейнер с составом может быть ампулой многоразового использования, которая позволяет повторное введение (например, от 2-6 введений) восстановленного состава. Вспомогательное оборудование может включать в дальнейшем второй контейнер, включающий подходящий разбавитель (например, раствор бикарбоната натрия).
При смешивании разбавителя и лиофилизованного состава окончательная концентрация пептида в восстановленном составе составляет, предпочтительно по крайней мере 0,15 мг/мл/пептид (=75 мкг) и предпочтительно не более чем 3 мг/мл/пептид (=1500 мкг). Вспомогательное оборудование может в дальнейшем включать другие материалы, желательные с коммерческой и с точки зрения пользователя, включая другие буферы, разбавители, фильтры, иглы, шприцы и упаковочные вкладыши с инструкциями по применению.
Вспомогательное оборудование настоящего изобретения может иметь один контейнер, который содержит состав фармацевтических композиций в соответствии с настоящим изобретением с или без других компонентов (например, других соединений или фармацевтических композиций этих других соединений) или может иметь отдельные контейнеры для каждого компонента.
Вспомогательное оборудование по изобретению предпочтительно включает состав по изобретению, укомплектованный для применения в комбинации с ко-введением второго соединения (такого как адъюванты (например, ГМ-КСФ), химиотерапевтического средства, натурального продукта, гормона или антагониста, средства против ангиогенеза или ингибитора; апоптоз-индуцирующего средства или хелатора) или их фармацевтической композиции. Компоненты вспомогательного оборудования до введения пациенту могут предварительно быть организованы в комплекс, или же каждый компонент может находиться в отдельном отличном контейнере. Компоненты вспомогательного оборудования могут обеспечиваться одним или несколькими жидкостными растворами, предпочтительно, водным раствором, более предпочтительно, стерильным водным раствором. Компоненты вспомогательного оборудования могут также обеспечиваться твердой формой, которая может быть превращена в жидкости при добавлении подходящих растворителей, которые, предпочтительным образом, предоставляются в другом, отличном, контейнере.
Контейнер терапевтического оборудования может быть ампулой, пробиркой, колбой, флаконом, шприцем или любыми другими средствами, заключающими в себе твердое вещество или жидкость. Обычно, если имеются более одного компонента, оборудование содержит вторую ампулу или другой контейнер, который позволяет отдельную дозировку. Оборудование может также содержать другой контейнер для фармацевтически приемлемой жидкости. Терапевтическое оборудование будет предпочтительно содержать приспособление (например, одну или более иглу, шприцы, пипетки для глаз, пипетки и т.д.), которое позволяет введение веществ по изобретению, которые являются компонентами настоящего оборудования.
Фармацевтический состав настоящего изобретения подходит для введения пептидов любым приемлемым способом, таким как оральный (энтеральный), назальный, офтальный, подкожный, внутрикожный, внутримышечный, внутривенный или трансдермальный. Предпочтительно, чтобы введение было к.с, и, наиболее предпочтительно, 1.б. Введение может производиться инфузионным насосом.
В соответствии с целями настоящего изобретения все цитаты описания включены в их целостности путем ссылки.
Примеры
1. Синтез и структура.
Пептиды были синтезированы стандартным и общепринятым методом твердофазного синтеза с использованием способа Ρшοс. После очистки на препаративной ВЭЖХ, проводилась ионообменная процедура для внедрения физиологически совместимых противоионов (ацетат или хлорид). Наконец, после лиофилизации были получены белые или серовато-белые твердые вещества. Все пептиды ТИМАР вводят в виде солей ацетата за исключением ГМА-СС№001, который применяется в виде соли хлорида -это обусловлено техническими причинами во время процесса производства.
2. Идентификация опухолеассоциированных пептидов (ТИМАРк), презентируемых на поверхности клетки.
Пробы тканей.
Опухолевые и здоровые ткани пациентов были предоставлены несколькими различными клиническими центрами (см. табл. ниже). Перед проведением хирургического вмешательства было получено информированное согласие всех пациентов в письменной форме. Сразу же после операции ткани были подвергнуты шоковой заморозке в жидком азоте и хранились до изоляции ТИМАРк при -80°С.
Изоляция пептидов НЬА из проб тканей.
Пептидные пулы НЬА из подвергнутых шоковой заморозке проб тканей были получены методом иммунопреципитации из плотных тканей в соответствии с незначительно измененным протоколом (ТаПеК., Βοΐζксйке, О., 81еуапоу1с, 8., 1ипд, Ο. & Βашшеикее, Н.С. А11е1е-кресй1с той теуеа1еб Ьу ке
- 24 018456
Чиепстд оГ зе1Г-рерййез е1и!ей Ггот МНС то1еси1ез. Иа!иге 351, 290-296 (1991); 8еедег, Е.Н. е! а1. Тке НЬА-А*6601 рерййе тойГ: ргейкйоп Ьу роске! з1гпс1пге апй уепйсайоп Ьу рерййе апа1уз1з. 1ттиподепейсз 49, 571-576 (1999)) при использовании НЬА-А*02-специфического антитела ВВ7.2 или НЬА-А, -В, -Сспецифического антитела \У6/32, СЫВг-активированной сефарозы, кислотной обработки и ультрафильтрации.
Детекция пептидов ТИМАРз масс-спектрометрическим анализом с Е81-жидкостной хроматографией (Е81-ЙСМ8).
Полученные пулы пептидов НЬА были разделены в соответствии с гидрофобностью обратнофазной хроматографией (СарЬС, ^а!егз), и элюированные пептиды анализировали на гибридном квадрупольном время-пролётном тандемном масс-спектрометре с ортогональным ускорением ионов (Р-ТОЕ ИШта, \Уа!егз), снабженном источником Е81. Пептидные пулы наносили на предколонку С18 для концентрирования и опреснения. После нанесения предколонку помещали в линию для разделения с помощью микрокапиллярной колонки из плавленого кварца (75 мкм 1.й. х 250 мм) с обратнофазным материалом С18 в 5 мкм (Июпех). Растворителем А был ацетат аммония/вода, 4 мМ. Растворителем В были 2 мМ ацетата аммония в 80% ацетонитрил/вода. В обоих растворителях был установлен уровень рН в 3,0 муравьиной кислотой. Был сформирован бинарный градиент от 15 до 60% В в течение 90 мин, с применением скорости потока в 5 мкл/мин, сниженного до приблизительно 200 нл/мин с помощью распределительной системы. Позолоченный стеклянный капилляр (Р1соТ1р, №\ν ОЬ)ес1п'е) использовали для введения в источник микро-Е81. Временем интеграции для ТОЕ-анализатора было 1,9 с со временем задержки между измерениями в 0,1 с. Затем определяли последовательности пептидов анализом индуцированного столкновением (СГО) масс-спектра (Е81-БСМ8/М8). Идентифицированную последовательность пептида ТИМАР подтверждали сравнением генерированного фрагментационного образца естественного пептида ТИМАР с фрагментационным образцом синтетического сравниваемого пептида с идентичной последовательностью.
На фиг. 1 и фиг. 2 представлены примеры спектров, полученных из опухолевой ткани для ТИМАРз, ассоциированных с МНС класса I, (фиг. 1а-1к) и ТИМАРз, ассоциированных с МНС класса II (фиг. 2а2Г).
3. Определение профиля экспрессии генов, кодирующих пептиды по изобретению.
Идентифицированные в качестве презентированных на поверхности опухолевых клеток молекулами МНС пептиды, скорее всего, способны индуцировать Т-клетки с высокой специфичностью распознавания для ткани, из которой они были образованы. Для минимизации риска аутоиммунности, вызванной при вакцинации такими пептидами, изобретатели фокусировали свое внимание на тех пептидах, которые образованы из белков, гиперэкспрессированных на опухолевых клетках в сравнении с большинством нормальных тканей.
Идеальный пептид будет образован из белка, являющегося уникальным для опухоли и не присутствующего ни в одной другой ткани. Для идентификации пептидов, которые образованы из генов с идеальной экспрессией, идентифицированные пептиды соотносили с белками и генами, из которых они были образованы и генерировали экспрессионные профили генов.
Источники РНК и приготовление.
Хирургически удаленные тканевые препараты были предоставлены несколькими различными клиническими центрами (см. табл. 2) после получения формы информированного согласия от каждого пациента.
Препараты опухолевой ткани были мгновенно заморожены в жидком азоте после операции и впоследствии гомогенизированы с помощью ступки и пестика в жидком азоте. Суммарная РНК была приготовлена из данных проб с использованием ТШ/о1 Дпуйгодеп, Каг1згике, Германия) с последующей очисткой на ЯЫеазу (Р[АСЕ№ Нййеп, Германия); оба метода осуществлялись в соответствии с указаниями производителей.
Суммарная РНК здоровых человеческих тканей была куплена (АтЫоп, Нипйпдйоп, Великобритания; С1оп!еск, Не1йе1Ьегд, Германия; 8!га!адепе, Атз!егйат, Нидерланды; ВюСкат, Нау^агй, СА, США). РНК нескольких индивидов (от двух до 123 индивидов) была смешана таким образом, что РНК каждого индивида имела равный вес. Лейкоциты были изолированы из проб крови 4 здоровых добровольцев.
Качество и количество проб суммарной РНК было подтверждено на биоанализаторе Адйеп! 2100 (Адйей, ^а1йЬгопп, Германия) с использованием лабораторного оборудования РИА 6000 Р1со ЬаЬСЫр Кй (Адйей).
Эксперименты с микрочипами.
Анализ экспрессии генов всех проб РНК из опухолевой и нормальной ткани был произведен с помощью олигонуклеотидных микрочипов АГутейгх Нитап Сепоте (НС) И133А или НС-И133 Р1из 2.0 (АГутейгх, 8ап!а С1ага, СА, США). Все этапы были выполнены в соответствии с руководством АГуте!пх (кйр://тетете.аГуте!пх.сот/зиррой/!есйтса1/таша1/ехргезз1оп_тапиа1.айх). Вкратце, двухнитевую кДНК синтезировали из 5-8 мкг суммарной РНК с использованием 8ирегзспр1 ЯТП ПпуЦгодеп) и олигойТ-Т7 праймера (М\УС Вю1сс1г ЕЬегзЬегд, Германия), как описывается в руководстве. Транскрипцию ш νίίτο производили на ВюАггау Н1дк У1е1й РИА Тгапзспр! ЬаЬеШпд К11 (ЕИО И1адпозйсз, Шс., Еагттд
- 25 018456 ба1е, ΝΥ, США) Гог (Не И133А аггаук ог νίΛ (Ле СепеСЫр ГУТ ЬаЬеШпд КЛ (АГГуше(г1х) для микрочипов И133 Р1ик 2.0 с последующей фрагментацией, гибридизацией кРНК и окрашиванием стрептавидинфикоэритрином и биотинилированным антистрептавидиновым антителом (Мо1еси1аг РгоЬек, Ье1беп, Нидерланды). Изображения сканировали на АдЛеп! 2500А СепеАггау 8саппег (И133А) или АГГуше(г1х СепеСЫр 8саппег 3000 (И133 Р1ик 2.0), а данные анализировали в программе ССО8 (АГГуше(г1х) с использованием настроек по умолчанию для всех параметров. Для нормализации использовали 100 генов домашнего хозяйства, предоставленных АГГуше(г1х (ЛЛр://^^^. айушеЛтх.сош/киррогЛесЛпюаРшакк Шек.айх). Относительные значения экспрессии были подсчитаны с показаний сигнальной программы, и значение нормальной пробы было произвольно задано значением 1,0.
Экспрессионные профили всех пептидов настоящего изобретения проявляют высокую экспрессию соответствующего гена в опухолевой ткани, в то время как он не экспрессировался, или же лишь на очень низком уровне, в нормальных тканях.
На фиг. 3 представлены такие профили для генов специфических для глиобластомы пептидов РТР001 (ген: РТРВ/Е фиг. 3а) и СНН001 (ген: СН3Л2, фиг. 3Ь).
4. Повторная детекция идентифицированных ТИМАРк масс-спектрометрическим анализом с Е8Iжидкостной хроматографией (Е8!-БСМ8) в дополнительных опухолевых пробах.
ТИМАРк, идентифицированные способом ПРИМЕРА 1, систематически отслеживались на пробах колоректальных опухолей с помощью масс-спектрометрии.
Полученные пулы пептидов НЬА были разделены в соответствии с гидрофобностью обратнофазной хроматографией (СарЬС, \Уа(егк), и элюированные пептиды анализировали на гибридном квадрупольном время-пролётном тандемном масс-спектрометре с ортогональным ускорением ионов (0-ТОЕ ИЛ1ша, \Уа(егк), снабженном источником Е8Т Пептидные пулы наносили на предколонку С18 для концентрирования и опреснения. После нанесения предколонку помещали в линию для разделения с помощью микрокапиллярной колонки из плавленого кварца (75 мкм 1.б. х 250 мм) с обратнофазным материалом С18 в 5 мкм (Июпех). Растворителем А был ацетат аммония/вода, 4 мМ. Растворителем В были 2 мМ ацетата аммония в 80% ацетонитрил/вода. В обоих растворителях был установлен уровень рН в 3,0 муравьиной кислотой. Был сформирован бинарный градиент от 15 до 60% В в течение 90 мин, с применением скорости потока в 5 мкл/мин, сниженного до приблизительно 200 нл/мин с помощью распределительной системы. Позолоченный стеклянный капилляр (РюоИр, Νον ОЬ)ес(Ае) использовали для введения в источник микро-Е8Т Временем интеграции для ТОЕ-анализатора было 1,9 с с временем задержки между измерениями в 0,1 с. Для детекции дефинированных пептидов в рамках данного вида экспериментов Е8Н ЬСМ8 проводили высокочувствительный скрининг на основе известных молекулярных масс и времени удерживания пептидов в хроматографической системе. Поэтому для выбора предшественников применялся список значений ш/ζ предварительно идентифицированных пептидов (одно- и/или двухзарядные). Затем определяли последовательность анализом индуцированного столкновением (СГО) масс-спектра (Е8[-ЕСМ8/М8). Последовательность пептида ТИМАР была подтверждена сравнением генерированного фрагментационного образца естественного пептида ТИМАР с фрагментационным образцом синтетического сравниваемого пептида с идентичной последовательностью. Оценку выхода пептида НЬА после очистки и воспроизводимость аналитической системы, включая время удерживания, производили с использованием интенсивности и времени удерживания избыточного эндогенного пептида НЬА-А*02 (Υ^^РАIVНI, образованного из ИИХ5) в качестве внутреннего стандарта. Поэтому критерий включения пробы КРР для детекции предварительно идентифицированного пептида ТИМАР в данных экспериментах был установлен на уровне минимальной интенсивности в 650 импульсов на измерение внутреннего двухзарядного стандартного сигнала (АЕТРАШШ) в эксперименте ЛСМ8/М8 в целях подтверждения успешной изоляции пептида НЬА и правильности работы аналитической системы.
На табл. 2 представлены результаты анализа проб при раке толстой и прямой кишки на различных стадиях, а также метастазов, возникающих из одного и того же первичного участка опухоли. Все пептиды НЬА-А*02 ТИМАР были обнаружены на большинстве проб. Частота повторной детекции пептидов НЬА-ИВ ТИМАР была, в основном, ниже. Этого можно ожидать, так как для пептидов НЬА II класса могут существовать несколько вариантов длин для каждой коровой последовательности. ОИС-001, идентифицированный ранее ТИМАР (М И1еЛ1, кандидатская работа 1998, Университет г. Тюбинген) и, как известно, представленный в многочисленных опухолях кишечника, служил в качестве положительного контроля.
- 26 018456
Таблица 2. Повторная детекция пептидов ТИМАР в пробах КРР
ΤΙΙΜΑΡ обнаружен повторно (+) или не обнаружен (-}
класс 1 класс II
№ Проба КРР Местонахожд. опухоли Стадия опухоли С20-001 ТСЕВ1-001 ТОР-001 ΝΟΧ-001 РС1Ч-001 О0С-001 ΤΘΡΒΙ-004
1 ССА062 толстая кишка п а л а п а л а л а па
2 ССА740 толстая кишка II + + + + + 4- η а
3 ССА165 толстая кишка II + + + + 4- + -
4 ССА712 толстая кишка III + + + + η а
5 ССА7О7 толстая кишка т + * + + + + η а
6 ССА718 толстая кишка III + 4- + 4- + 4- η а
7 ССА739 толстая кишка III + 4· + + + + η а
8 ССА166 толстая кишка III + + * 4· + * -
9 ССА734 толстая кишка III + + + 4- + η а
10 ССА719 толстая кишка IV + + + 4- 4- па
11 ССА725 толстая кишка IV + + + + + л а
12 ССА164 толстая кишка IV + + 4- +
13 ССА167 толстая кишка IV п а п а л а η а л а л а -
14 ССА056 толстая кишка η а η а η а η а η а п а -
15 ССА305 толстая кишка ? п а η а л а л а η а п а -
20 ССА708 толстая кишка метастаз IV + + + + + 4- 4-
16 ССА160 прямая кишка II + + + + + 4- 4-
17 ССА754 прямая кишка II + + + + 4- п а
18 ССА170 прямая кишка III η а п а η а η а л а η а +
15 ССА171 прямая кишка IV η а л а η а л а л а η а *
21 ССА724 прямая кишка метастаз IV + + - - + +
Обнаружены в % проанализированных проб 100% 100% 87% 67% 80% 100% 33%
п а - не проанализировано.
5. Связывание пептидов, рестриктированных по НЬА класса I, с НЬА-А*0201.
Анализ НЬА-связывания проводили с использованием оборудования ЕЫ8А ЕрI К1к (предоставленном 8оегеп Виик, ШкЕкике оГ Меб1са1 МюгоЬю1оду апб Iтшиηо1оду ак кке ипкегкйу оГ Сорепкадеп, Дания) в соответствии с 8у1меккег-Ну|б (8у1меккег-Ну|б, С, Кпккепкеп, Ν, Вкскег, Τ, Еегге, Н, Ьаието11ег, 8Ь, νο1ί, ХА, ЬатЬегкк, К, №кеп, МН, Ребегкеп, ЬО, апб Виик, 8; ЕккаЬккктепк оГ а диапИкакке ЕЫ8А сараЬ1е оГ бекегткппд реркбе - МНС с1акк I ткегаскоп, Т1ккие Апкдепк, 2002, 59, 251-258) и руководством производителя к ЕБЧ8А ЕрI К1к.
Приготовление пептидных растворов.
Пептиды растворяли в ЭМ8О + 0,5% ТЕА (Мегск, Эагтккабк, Германия) с концентрацией 10 мг/мл. Наивысшая концентрация пептидного рабочего раствора в данном анализе составила 200 мкМ, поэтому исходный раствор был разведен 1:50 в буфер пептидного раствора (РВ8 (забуференный фосфатом физиологический раствор) с 0,1% Ьи1го1-Е68 и 10 мг/л Ркепо1 геб) до конечного объема в 100 мкл. С буфером пептидного раствора производили серийное пятикратное разведение.
Рефолдинг комплексов НЕА-А*0201/пептид.
В соответствии с руководством 2-кратно концентрированный раствор НЬА-А*0201 был приготовлен при смешивании 3х рН буфера (рН 6,6), Ьи1го1-Е68, человеческого β2ιη, рекомбинантного НЬАА*0201 (все включены в оборудование ЕБЧ8А ЕрI К1к) с РВ8.
Для процесса рефолдинга 15 мкл серийных разведений пептида и 15 мкл 2-кратно концентрированной смеси МНС смешивали в 96-луночных планшетах (Мтс, Воскеккег,№У, И8А) и инкубировали при 18°С в течение 48 ч.
Количественный подсчет для комплексов методом ЕБЧ8А.
Планшеты Мах1когр (Мтс, Воскеккег, Нью-Йорк) покрывали 5 мкг/мл антитела ν6/32 в покрывающем буфере (рН 9,6), инкубировали в течение 24 ч при 4°С и блокировали 5% сухим обезжиренным молоком (Мегск, Эагтккабк, Германия) в РВ8 в течение ночи при 4°С.
Стандартный МНС-комплекс (ЕБЧ8А ЕрI К1к) разводили 2% сухим обезжиренным молоком в РВ8 (8МР/РВ8) до концентрации 10 нМ. Приготавливали серийное 3,16-кратное разведение и переносили его на покрытый и заблокированный планшет Мах1когр. Комплексы пептид-МНС 10-кратно разводили 2% 8МР/РВ8, переносили в тот же самый планшет Мах1когр и инкубировали в течение 2 ч при 4°С. Антитела кролика анти-кв2т (ЕЫ8А ЕрI К1к) добавляли в разведении 1:2500 в 2% 8МР/РВ8 и инкубировали в течение 1 ч при 4°С. Амплификационный буфер (НВР-конъюгированный козий анти-кроличий полимер) и мышиная сыворотка (оба поставляются с оборудованием ЕБЧ8А ЕрI К1к) разводили в 2% 8МР/РВ8, добавляли в планшеты и инкубировали 30 минут при комнатной температуре. Добавляли проявляющий буфер (тетраметилбензидин, ТМВ; ЕБЧ8А ЕрI К1к), планшеты инкубировали, предохраняя от попадания света, в течение 30 минут при комнатной температуре. Реакцию останавливали добавлением 0,2 М серной кислоты (ννκ., Эагтккабк, Германия). Считывание планшетов производили при ОЭ450 нм на ридере УЕВ8Атах ЕЬКА-Веабег (Мо1еси1аг Эеу1сек, 8иппууа1е, СА, США).
Данные интерпретировали в Ехсе1 и Рикш®, Сгаркраб 3.0.
- 27 018456
Результаты представлены на фиг. 4. Более низкое значение КО отражает более высокую аффинность к НЬА-А*0201. Аффинности связывания охватывают диапазон приблизительно четырех 102, но большинство пептидов имеют похожие аффинности связывания внутри одного промежутка 102 (С20-001, ООС-001, РСИ-001, ТОР-001). Аффинность МИС-001 примерно на один фактор 102 ниже в сравнении с большинством включенных лигандов, но, несмотря на это, МИС-001 был в состоянии индуцировать Тклеточный ответ, когда использовался в вакцине против почечной карциномы (ЭД1егеску, I, Ми11ег, МК, ЭДпТйз, 8, На1бег-ОеЬ1ег, Е, ЭогГеР Ό, 8сНт1б1, 8М, НапГзсНе1, М, Вгиддег, ЭД, 8сЬгобег, 8, Ногдег, М8, Кап/, Ь, апб Вгоззай, Р; 1ттипо1одю апб с1шка1 гезропзез айег уасстаГюпз \\ЙН рерйбе-ри1зеб бепбгШс се11з т те!аз!айс гепа1 сапсег райепГз, Сапсег Кез., 2006, 66, 5910-5918). С другой стороны, ИОХ-001 имеет слегка повышенную аффинность связывания, а ТСРВ1-001 обладает самой высокой связывающей силой, имея в 100 раз более низкий показатель КО в сравнении с большинством пептидов.
Выражая в абсолютных понятиях, показатели КО между 0,01 и 0,1 нМ, как те, что наблюдались для большинства пептидов, уже представляют собой высокую силу связывания. Нохожие аффинности наблюдались также у пептидов, содержащихся в вакцине против почечно-клеточной карциномы 1МА901, которая была успешно протестирована (Н. 8тдй-1ази)а, 8. ЭДа1Гег, Т. ЭДетзсНепк, А. Мауег, Р. Υ. И1еГг1сй, М. 81ае111ег, А. 81епх1, 8. 8Геуапоую, Н. Каттепзее, I. РпзсН; Согге1айоп оГ Т-се11 гезропзе, с11п1са1 асйуйу апб геди1аГогу Т-се11 1еуе1з ш гепа1 се11 сагсшота райепГз ГгеаГеб \\'НН 1МА901, а поуе1 тиШ-рерйбе уассте; А8СО Меейпд 2007 РозГег #3017; М. 81аеН1ег, А. 81епх1, Р. Υ. 01е1г1сН, Т. Е1зеп, А. НаГегкатр, I. Веск, А. Мауег, 8. ЭДа1Гег, Н. 8шдН, I. РйзсН, С. С. 8йеГ; Ап ореп 1аЬе1 зГибу Го еуа1иаГе (Не заГеГу апб иптиподешсЙу оГ ГНе рерйбе Ьазеб сапсег уассше 1МА901, А8СО теейпд 2007; РозГег # 3017). Поэтому характеристики связывания пептидов настоящего изобретения достаточно сходны с характеристиками пептидов, которые, как было продемонстрировано, индуцировали ш у1уо Т-клеточный ответ.
6. Иммуногенность ш уйго для пептидов, презентируемых МНС I класса.
Нрайминг ш уйго СИ8+ Т-клеток.
Для проведения стимуляций ш уйго искусственных антигенпрезентирующих клеток (аАРС), нагруженных комплексом пептид-МНС (рМНС) и антителом анти-СИ28, сначала были изолированы МИК (моноциты периферической крови) из свежей лейкоцитарной пленки НЬА-А*02+ с использованием стандартной среды для градиентного разделения (РАА, Со1Ье, Германия). Лейкоцитарные пленки были получены либо из банка крови г. Тюбинген, либо из госпиталя Ка1йагтепНозрйа1 г. Штутгарта. Изолированные МИК инкубировали в течение ночи для прайминга человеческого материала ш уйго в Тклеточной среде (ТСМ), состоящей из КРМ1-С1иГатах (1пуйгодеп, Каг1згнНе, Германия) с добавлением 10% инактивированной нагреванием человеческой сыворотки АВ (РАА, Со1Ье, Германия), 100 и/мл пенициллина / 100 мкг/мл стрептомицина (СатЬгех, Уегу1егз, Бельгия), 1 мМ пирувата натрия (СС Рго, ИеизГабГ, Германия) и 20 мкг/мл гентамицина (СатЬгех). Лимфоциты СИ8+ были изолированы с использованием СИ8+ МАС8 - оборудования для положительного отбора (М11Гепу1, Вегд1зсй С1абЬасН, Германия) в соответствии с указаниями производителя. Иолученные СИ8+ Т-клетки инкубировали до использования в ТСМ с добавлением 2,5 нг/мл ИЛ-7 (РготоСе11, Не1бе1Ьегд, Германия) и 10 и/мл ИЛ-2 (СНйои, Мишсй, Германия). Иолучение покрытых гранул рМНС/анти-СИ28, Т-клеточные стимуляции и считывание производили, как описывалось ранее (ЭДа1Гег, 8, Неггдеп, Ь, 8сНоог, О, Чнпд, С, ЭДегпеГ, Ό, ВиНппд, НЧ, Каттепзее, НС, апб 8Геуапоую, 8; СиГйпд ебде: ргебеГегттеб ау1бйу оГ Нитап СИ8 Т се11з ехрапбеб оп сайЬгаГеб МНС/апй-СИ28-соаГеб т1сгозрНегез, Р 1ттипо1., 2003, 171, 4974-4978) с минимальными модификациями. Вкратце, биотинилированные рекомбинантные молекулы НЬА-А*0201, в которых не хватает трансмембранного домена и которые были биотинилированы на карбоксильном конце тяжелой цепи, были получены в соответствии с методом, описанным в работе А1Гтап и соавторов (АНтаи, 4Ό, Мозз, РА, Сои1бег, РЧ, ВагоисН, ИН, Неу/ег-ЭД1Шатз, МС, Ве11, Л, МсМюНаеН АЧ, апб Иау1з, ММ; РНепоГурю апа1уз1з оГ апйдеп-зресйгс Т 1утрНосуГез, 8с1епсе, 1996, 274, 94-96). Очищенный ко-стимулированный мышиный 1дС2а к антителам человека СИ28 АЬ 9.3 Дипд, С, ЬебЬейег, ЧА, апб Ми11ег-ЕЬегНагб, НЧ; 1пбисйоп оГ суГоГохюйу ш гезйпд Нитап Т 1утрНосуГез Ьоипб Го Гитог се11з Ьу апйЬобу йеГегосопщдаГез, Ргос ИаГ1 Асаб 8с1 И8А, 1987, 84, 4611-4615) был химически биотинилирован с использованием сульфо-Игидроксисукцинимидобиотина, как рекомендуется изготовителем (РегЬю, Вопп, Германия). Использованные гранулы были покрытыми стрептавидином полистироловыми частицами величиной 5,60 мкм (Вапдз ЬаЬоогаГойез, 1Шпо1з/США). рМНС использовали в качестве положительных и отрицательных контролей, это были А*0201/МЬА-001 (пептид ЕЬАСЮШТУ из модифицированного МеНшА/МАКТИ) и А*0201/ИПХ5-001 ^ЬРАГУШ из ΌΌΧ5) или А*0201/НВУ-001 (РЬР8ИРРР8У), соответственно.
800.000 гранул / 200 мкл были покрыты в 96-луночном планшете в присутствии 600 нг биотина анти-СИ28 и 200 нг релевантного биотин-рМНС (высокоплотные гранулы) или 2 нг релевантного и 200 нг нерелевантного (библиотека рМНС) МНС (низкоплотные гранулы). Стимуляции были инициированы в 96-луночных планшетах при ко-инкубации 1х 106 СИ8+ Т-клеток с 2х105 промытых покрытых гранул в 200 мкл ТСМ с добавлением 5 нг/мл ИЛ-12 (РготоСе11) в течение 3-4 дней при 37°С. Иоловина среды была заменена на свежую ТСМ с добавлением 80 и/мл ИЛ-2, и инкубация была продолжена в течение 34 дней при 37°С. Данный цикл стимуляций проводили всего три раза. В заключение проводили тетрамерные анализы с флуоресцирующими тетрамерами МНС (полученными, как описывается у А1Гтап, 4Ό,
- 28 018456
Мокк, РА, Сои1бег, РТ ВагоисН, ИН, Неухег-^ННатк, МС, Ве11, Л, МсМ1сНае1, А1, апб Эас1к, ММ; РНепо1ур1с апа1ук1к оГ апйдеп-кресШс Т 1утрНосу1ек, 8с1епсе, 1996, 274, 94-96) с антителом СП8-РГГС клона 8ΚΙ (ВИ, Не1бе1Ьегд, Германия) на четырехцветном цитометре РАС8Са11Ьиг (ВИ). Пептид-специфические клетки были подсчитаны как процентная доля всех СЭ8+ Т-клеток. Оценку тетрамерного анализа производили с помощью программы РС8 Ехргекк (Эе №со 8оП\\аге). Прайминг ш сйго специфических лимфоцитов тетрамер+ СЭ8+ детектировался установкой подходящего гейта и при сравнении со стимуляциями негативного контроля. Иммуногенность для заданного антигена была детектирована, если было обнаружено, что, по крайней мере, в одной подлежащей оценке простимулированной ш с1(го лунке одного здорового донора содержалась специфическая СЭ8+ Т-клеточная линия после стимуляции ш с1(го (т.е. данная лунка содержала, по крайней мере, 1% специфического тетрамера+ среди СЭ8+ Т-клеток и процентная доля специфических клеток тетрамера+ была по крайней мере в 10 раз выше среднего значения стимуляций с негативным контролем).
Пептиды настоящего изобретения исследовали вместе с пептидами с известной иммуногенностью 1п с1со для сравнения. Репрезентативное окрашивание, выявляющее образование Т-клеточных линий, специфических для NΟX-001 и ОЭС-001, представлено на фиг. 5. Результаты обобщены ниже, в табл. 3.
Таблица 3. Иммуногенность ш с1(го пептидов по изобретению в сравнении с пептидами вакцины
Антиген Обнаружена иммуногенность
ТСЕВ1-001 да
ΝΟΧ-001 да
ΡΟΝ-ΟΟΙ да
ТОР-001 да
С20-001 да
СЮС-001 да
ССЫ-001 да
РТР-001 да
СН1-001 да
1АК-001 да
Таблица 3 а. Иммуногенность ш с1(го пептидов по изобретению
Антиген Положительн. доноры / проанализированные доноры Положительн. лунки / проанализированные лунки
ΙΜΑ-ΗΒν- 001 7/16(44%) 10/107(9%)
Антиген Положительн. доноры / проанализированные доноры Положительн. лунки / проанализированные лунки
ΙΜΑ- ТСЕВ1-001 3/4 ( 75% ) 4/22 ( 18%)
ΙΜΑ-ΝΟΧ- 001 3/5 (60%) 9/60 (15%)
ΙΜΑ-ΡΟΝ- 001 3/4 ( 75%) 4/42 ( 10%)
ΙΜΑ-ΤΟΡ- 001 2/5 (40%) 7/72 ( 10%)
1МА-С20- 001 1/5 (20%) 1/60 (2%)
1МА-СЮС- 001 1/5 (20%) 1/60 (2%)
ΙΜΑ-ΗΒν- 001 2/5 (40%) 10/54 ( 19%)
1МА-СЕА- 004 4/4 ( 100%) 50/60 ( 83%)
1МА-ССИ- 001 5/5 ( 100%) 42/54 ( 78%)
ΙΜΑ-ΜΕΤ- 001 4/6 (67%) 30/72 (42%)
Здесь обобщаются результаты экспериментов по иммуногенности ш с11го, проведенных изобретателями. Приводимые результаты были получены при стимуляции клеток СЭ8+ высокоплотными гранулами. Так как различные партии человеческой сыворотки могут сильно влиять на результаты по иммуногенности, то вместе оценивались только те анализы, в которых была использована одна и та же партия сыворотки.
7. Иммуногенность ш с11го для пептидов, презентируемых МНС ΙΙ класса.
Хелперные Т-клетки играют важную роль в содействии ЦТЛ при активации и поддержке иммунных ответов против опухолевых клеток. Поэтому пептиды МНС ΙΙ класса были включены в вакцину ГМА910. ТСРВС004, один из трех пептидов ΙΙ класса, содержащийся в ГМА910, был проверен на его иммуноген
- 29 018456 ный потенциал ш уйго и подтвержден в качестве индуцирующего фактора как для специфических СЭ4+, так и СЭ8+ Т-клеток. Генерация СЭ4+ и функциональных СЭ8+ Т-лимфоцитов показана в экспериментах с использованием стимуляций, проведенных в аутологичной системе.
Принципы теста/
Прайминг и экспансия специфических человеческих СЭ4+ и СЭ8+ клеток были проанализированы 1п у1Гго посредством прайминга МПК с пониженным содержанием моноцитов аутологичными ОС и повторной стимуляции аутологичными МПК. Вкратце, чтобы генерировать антигенспецифические СЭ4+ Т-клетки, МПК с пониженным содержанием моноцитов одного здорового донора (НЬА-генотип класса I: А1/А25/В8/В18 и класса II: ПрВ1*О2/ПрВ1*О6/ПЯВ1*О3/ПКВ1*15/ПЯВ3/ПЯВ5) были простимулированы с использованием аутологичных дендритных клеток с введенным импульсным методом пептидом и рестимулированы аутологичными МПК с пептидом. В качестве системы считывания выработку ΣΕΝγ при кратковременной рестимуляции анализировали по методике ЕЫ8РОТ и проточной цитометрии. Тклетки были проанализированы после восьми стимуляций по методике ЕЫ8РОТ и внутриклеточным окрашиванием ^Νγ плюс СО4-ЕГГС и СЭ8-РегСР для определения процентного выражения ΣΡΝγвырабатывающих клеток в специфических Т-клеточных субпопуляциях. В этом эксперименте клетки, простимулированные пептидом ТСЕВЛ004 из различных лунок, были объединены и инкубировались с нерелевантным пептидом для считывания и выступали в качестве негативных контролей.
Получение дендритных клеток (ДК).
Человеческие дендритные клетки были получены из моноцитов, культивированных в среде ДК, состоящей из ЯРМ! 1640-С1иГатах/25тМ Нерек (Iην^Г^одеη, Германия) с добавлением 10% аутологичной плазмы // 100 и/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина. Сначала были получены лейкоцитарные пленки и плазма при центрифугировании крови здорового донора (Банк крови г. Тюбинген). МПК были изолированы из лейкоцитарной пленки стандартным градиентным разделением (ЬутрйосуГе 8ерагаГюп Мебшт, РАА, Австрия) и ресуспендировались в среде ДК для определения общего числа клеток. 100-120 млн. МПК были промыты, ресуспендированы в 15 мл среды Х-У1уо 20 (Вю^ййШкег, Бельгия) и перенесены в колбу с клеточной культурой. После 2 часов при 37°С удаляли среду, содержащую лейкоциты периферической крови (ЛПК), адгезивные моноциты промывали дважды 10 мл РВ8 и культивировали 6 дней в 10 мл среды ДК с 100 нг/мл ГМ-КСФ и 30 нг/мл ИЛ-4 (IттиηоТоо1к, Германия) или 20 нг/мл (Я&О кукГетк, Германия). На 3ий и 5ый день добавляли 100 нг/мл ГМ-КСФ и 30 нг/мл ИЛ-4 (IттиηоГоо1к) или 20 нг/мл ИЛ-4 (Я&Л 8укГетк, Германия). На 7ой день незрелые ДК активировали 10 нг/мл ЮТ-а (Я&О 8укГетк, Германия) и 20 мкг/мл ро^ЦС) (81дта А1бпсй, Германия) или 100 нг/мл ЬР8 в течение 24 часов. Оставшиеся МПК и полученные ЛПК аликвотировали и замораживали.
Прайминг ш νίΙΐΌ специфических Т-клеток.
Для получения СЭ4+ Т-клеток 3 млн. МПК/ЛПК были простимулированы 2х105 аутологичными ДК. ДК были собраны на 8ой день (см. раздел 3.1. Получение дендритных клеток (ДК)). В этих целях использовался РВ8 с 5 мМ ЕЭТА, чтобы набрать как можно больше клеток (включая адгезивные клетки). После промывки средой ОС определяли число клеток. Для погрузки пептида ДК ресуспендировали в 1 мл среды ДК и инкубировали с 25 мкг/мл пептида в течение 2 ч при 37°С. Пептидами, использованными для введения импульсным способом в ДК, были ТСЕВК004, Рокт1х (смесь пептидов, относящихся к ЕВУ и СМУ), Рабге и СМУ. Аутологичные МПК/ЛПК размораживали, промывали средой ДК (по меньшей мере, дважды) и высеивали в 24-луночный планшет с плотностью 3 млн. клеток/мл в 1 мл. Затем добавляли ДК с введенным пептидом (как 1 мл суспензии, содержащей пептид) в высеянные МПК/ЛПК и инкубировали в течение 7 дней при 37° С. После прайминга полученные ЦТЛ сначала рестимулировали криоконсервированными аутологичными МПК, нагруженными пептидом, которые были облучены (30 Су; Саттасе11 1000 Е11Ге, №гбюп ШГетаГшпаф Канада). В этих целях добавляли 5х105 ЦТЛ и 2,5х106 МПК на лунку. Введение импульсным методом пептида в МПК было проведено, как упоминалось ранее (для ДК). На первый день после первой стимуляции добавляли ИЛ-2 (Я&О 8укГетк, Германия) и ИЛ-7 до окончательной концентрации 2 нг/мл и 5 нг/мл, соответственно. После этого на каждый 2ой и каждый 7ой день в среду добавляли ИЛ-2 и ИЛ-7. Вторую рестимуляцию проводили 7 дней спустя, но на этот раз пептид добавлялся в культивируемые ЦТЛ отдельно (без МПК). Рестимуляции проводили каждые 7 дней с нагруженными пептидом МПК и пептидом отдельно, добавляемом альтернативно. Анализы проводили после восьмой стимуляции с помощью внутриклеточного окрашивания ΣΕΝγ и методики ΣΕΝγ ЕЫ8РОТ.
Результаты.
Было возможно примировать СЭ4+ Т-клеточные линии, специфически реагирующие на интересующий пептид (фиг. 6 и фиг. 3). Т-клеточные ответы могли быть детектированы с помощью методики ЕЫ8РОТ в 2 из 4 Т-клеточных линий, тогда как в 3 из 4 Т-клеточных линиях ТСЕВI-004-специфические Ш^-вырабатывающие СЭ4+ и/или СЭ8+ клетки были установлены с помощью Κ'.'8. Таким образом, ТСЕВК004 был способен вызывать СЭ4+ и СЭ8+ Т-клеточные ответы у одного донора, подвергнутого анализу по описанной выше экспериментальной системе. В соответствии с этим многообещающим результатом данный пептид, скорее всего, является иммуногенным и имеет потенциал для индуцирования Т-клеточных ответов.
- 30 018456
8. Функциональное подтверждение на примере ΝΟΧ-001 и Т6ТВ1-001.
Иммуногенность пептидов, включенных в вакцину 1МА910, была продемонстрирована ш νίΙΐΌ при использовании методики валидации для пептидов ТИМАР (фирма нптаИсз Ыо1ес1то1од1ез 6тЬН, ТиЬтдеп, Германия). Индукция специфических Т-клеток является индикатором способности пептидов успешно активировать иммунную систему. Так как получение эффективного противоопухолевого иммунного ответа возможно только в том случае, если активированные Т-клетки имеют высокую авидность и функциональность, то исследовалась способность ТИМАРз к праймингу высокоавидных, функциональных Т-лимфоцитов посредством проверки их способности вырабатывать ΙΡΝγ или уничтожать опухолевые клеточные линии. Два пептида, ΝΟΧ-001 и ТСРВ1-001, были выбраны для более тщательной валидации из-за их способности индуцировать высокоавидные ЦТЛ ш νίΙΐΌ. Результаты подтвердили, что у человека существуют высокоавидные Т-клетки-предшественники, направленные против обоих пептидов, и что с помощью ΝΟΧ-001 могут быть генерированы функциональные СЭ8+ Т-клеточные линии.
Принципы теста.
Чтобы глубже проникнуть в сущность иммуногенности пептидов 1МА910 и свойства специфических Т-клеток, два пептида, ΝΟΧ-001 и ТСРВ1-001, были выбраны для дальнейшей оценки. Эксперименты для этих целей проводились на фирме пптайсз Ью1ес1то1од1ез 6тЬН, ТиЬшдеп, Германия (сортировку клеток проводили в Университете г. Тюбинген, лаборатории Эг. ВиЬппд).
В зависимости от их способности активироваться антигеном высокой или низкой плотности Тклеточные линии могут быть разделены на высоко- или низкоавидные. Как было продемонстрировано ранее (ЭДаИег, 8, Неггдеп, Ь, 8с1оог, Ο, 1ипд, 6, ЭДегпеТ Ό, ВиЬппд, НГ Каттепзее, Н6, апй 81ехапох1с, 8; СиШпд ейде: ргейе1епшпей ау1ййу оГ 1итап СЭ8 Т се11з ехрапйей оп са11Ьга!ей МНС/апй-СЭ28-соа1ей т1сгозрйегез, 1. 1ттипо1, 2003, 171, 4974-4978), человеческие высокоавидные ЦТЛ могут быть успешно индуцированы, если для активации использовать меньше пептида, чем для низкоавидных СЭ8+ Тклеток. Также было продемонстрировано, что обогащенные таким способом клетки являются более эффективными для распознавания экспрессирующих антиген клеточных линий опухоли, тем самым, представляя собой, возможно, важнейший инструмент в разработке терапевтических стратегий.
Чтобы можно было определить способность пептидов к генерации высокоавидных линий ЦТЛ, изолированные человеческие клетки СЭ8+ примировали и обогащали посредством повторяемых стимуляций 1п νίΙΐΌ гранулами, покрытыми низкоплотным рМНС (комплекс пептид-МНС) и антителом антиСЭ28 в присутствии ИЛ-12 и ИЛ-2. После трех стимуляций фракция примированных ш уйго Т-клеток была окрашена рМНС-тетрамером и обнаружена при цитометрическом анализе. Тетрамерположительные клетки каждого донора затем были объединены в соответствии с антигенной специфичностью, окрашены рМНС-тетрамером и человеческим антителом анти-СЭ8-ПТС и, в заключение, подвергнуты сортировке ТАС8 на сортере РАС8Апа. Отсортированные клетки культивировали и обогащали в присутствии облученных питающих клеток, цитокинов и митогена. В качестве рамки считывания для генерирования примированных высокоавидных антиген-специфических клеток проводили окрашивание рМНСтетрамером. Для определения их функциональности проводили анализ выработки ΙΡΝγ по методике Ε^I8РΟΤ и исследовали уничтожение опухолевых клеточных линий с использованием цитотоксического анализа, основанного на живом/мертвом окрашивании после рестимуляции клеток соответствующим пептидом и опухолевыми клеточными линиями.
Получение специфических СЭ8+ Т-клеточных линий.
Стимуляции 1п уйго с использованием искусственных антигенпрезентирующих клеток (аАРС), нагруженных комплексом пептид-МНС (рМНС) и антителом анти-СО28, проводили, как описано выше. Единственным отличием от описанного выше метода был тот факт, что стимуляции проводили с гранулами, нагруженными 2 нг релевантного и 200 нг нерелевантного (рМНС) МНС из библиотеки (низкоплотные гранулы) вместо 200 нг релевантного МНС (высокоплотные гранулы). Таким образом, были получены высокоавидные Т-клетки для более детальной валидации пептидов. После трех стимуляций фракция примированных ш уйго Т-клеток была окрашена рМНС-тетрамером и обнаружена цитометрическим анализом. Иммуногенность для заданного антигена была детектирована, если было обнаружено, что, по крайней мере, в одной подлежащей оценке простимулированной ш уйго лунке одного здорового донора содержалась специфическая СЭ8+ Т-клеточная линия после стимуляции ш уйго (т.е. данная лунка содержала, по крайней мере, 1% специфического тетрамера+ среди СЭ8+ Т-клеток и процентная доля специфических клеток тетрамера+ была, по крайней мере, в 10 раз выше среднего значения стимуляций с негативным контролем). Тетрамер-положительные клетки каждого донора затем были объединены в соответствии с антигенной специфичностью, окрашены соответствующим рМНС-тетрамером и человеческим антителом анти-СП8-Р1ТС, клон 8К1, и, в заключение, подвергнуты сортировке ТАС8 на сортере ТАС8Апа (ВЭ Вюзаепсез, Германия). Отсортированные клетки культивировали в Т-клеточной среде (КРМ1-О1Щашах с добавлением 10% инактивированной нагреванием человеческой сыворотки АВ, 100 и/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина, 1мМ пирувата натрия и 20 мкг/мл гентамицина) в присутствии 5х105 клеток/мл облученных свежих аллогенных МПК, 5х104 клеток/мл облученных клеток ΡΟΣ-ΕΡν, 150 и/мл ИЛ-2 (СЫгоп, Мишсй, Германия) и 0,5 мкг/мл РНА-Ь (Косйе Эгадпозйсз, Маппйегш,
- 31 018456
Германия). Экспансия данных клеток происходила в Т-клеточной среде, содержащей 150 и/мл ИЛ-2. В качестве рамки считывания для генерирования примированных высокоавидных антиген-специфических клеток проводили окрашивание рМНС-тетрамером, как было описано выше, и анализировали на четырехцветном цитометре ЕАС8СаНЬит (ВИ В1озс1епсез, Германия).
Проверка функциональности.
Для определения их функциональности проводили анализ выработки ΣΡΝγ по методике ЕЫ8РОТ (ΓΡΝγ ЕЫ8РОТ 8е!, ВИ, Германия) после рестимуляции клеток соответствующим пептидом. Кроме того, опосредованную клетками цитотоксичность специфических ЦТЛ исследовали на примере уничтожения опухолевых клеточных линий с использованием оборудования для определения опосредованной клетками цитотоксичности МУЕ/ЭЕАЭ се11-теб1а!еб су!о!охюйу Кй (Ь7010, ^Шодет Германия). Оба анализа проводились в соответствии с указаниями производителей, если не указано иное.
Результаты.
Оба пептида, NОX-001 и ТОЕВГ001, обладали иммуногенностью ш νίΙΐΌ, как показано на примере успешного прайминга низкоплотным рМНС АПК. Как для NОX-001, так и для ТОЕВГ001 могли быть установлены специфические Т-клеточные линии методом ЕАС8, тем самым демонстрируя, что высокоавидные СЭ8+ Т-клеточные предшественники имеются у здоровых доноров.
Кроме того, для NОX-001 могла быть установлена одна Т-клеточная линия, которая также была подтверждена как функциональная методом ЕЫ8РОТ, так как она специфически экспрессировала ΣΡΝγ после рестимуляции этим пептидом (фиг. 8).
9. Связывание пептидов по изобретению, рестриктированных по НЬА класса I, с НЬА-А*0201.
Целью данного анализа была оценка аффинности пептидов НЬА класса I СШ-001, ИСА-001, 1АК001 и РТР-001 по отношению к молекуле МНС, закодированной аллелем НЬА-А*0201. Аффинности для всех пептидов к НЬА-А*0201 были соотносимы с хорошо известным контрольным пептидом НВУ-001, константы диссоциации (Кс) находились в диапазоне от 0,05 до 1,6 нМ.
Принципы теста.
Стабильные комплексы НЬА/пептид состоят из трех молекул: тяжелой цепи НЬА, бета-2 микроглобулина (Ь2т) и пептидного лиганда. Активность денатурированных рекомбинантных молекул НЬАА*0201 с тяжелой цепью сама по себе может быть сохранена, делая их функциональными эквивалентами пустых молекул НЬА-А*0201. Если они растворены в водном буфере, содержащем Ь2т и подходящий пептид, то данные молекулы быстро и эффективно сворачиваются в полной зависимости от пептида. Наличие данных молекул использовалось в анализе, основанном на методике ЕЫ8А, для измерения аффинности взаимодействия между пептидом и молекулой НЬА класса I (8у1хез1ег-Н\тб С, Кпз1епзеп Ν, ВНсНег Т, Еегге Н, Ьаието11ег 8Ь, Ио1Г ХА, ЬатЬейй К, №ззеп МН, Ребегзеп ЬО, Вииз 8. Ез!аЬИзНтеп! оГ а с.|иапШаНуе ЕЫ8А сараЬ1е оГ бе!егт1шпд рерйбе - МНС с1азз I т!егасйоп. Иззие Апйдепз 2002, 59, 251258).
Очищенные рекомбинантные молекулы НЬА-А*0201 инкубировали вместе с Ь2т и ступенчатыми дозами интересующего пептида. Количество новообразовавшихся комплексов НЬА/пептид определялось количественным методом ЕЫ8А. Константы диссоциации (значения Ко) вычислялись с использованием стандартной калибровочной кривой, записанной с титров комплекса калибровки НЬА/пептид.
Результаты.
Результаты представлены на фиг. 9. Более низкое значение Кс отражает более высокую аффинность к НЬА-А*0201. Аффинности для всех пептидов к НЬА-А*0201 были соотносимы с хорошо известным контрольным пептидом НВУ-001, константы диссоциации (Кс) находились в диапазоне от 0,05 до 1,6 нМ.

Claims (22)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Пептид, включающий последовательность, которая выбирается из группы 8ЕО ГО № 1 по 8ЕО ГО № 29 или ее вариант, который на 80% гомологичен 8ЕО ГО № 1 по 8ЕО ГО № 29 и который будет индуцировать Т-клеточную перекрестную реакцию с указанным пептидом.
  2. 2. Пептид в соответствии с п.1, где указанный пептид обладает общей длиной между 8 и 100, предпочтительно между 8 и 30 и наиболее предпочтительно между 8 и 16 аминокислотами.
  3. 3. Пептид в соответствии с любым из пп.1 или 2, имеющий способность связываться с молекулой главного комплекса гистосовместимости человека (МНС) I или II класса.
  4. 4. Пептид в соответствии с любым из пп.1-3, где пептид состоит или состоит преимущественно из аминокислотной последовательности в соответствии с 8ЕО ГО № 1 по 8ЕО ГО № 29.
  5. 5. Пептид в соответствии с любым из пп.1-4, где пептид модифицирован или включает непептидные связи.
  6. 6. Пептид в соответствии с любым из пп.1-5, где пептид является слитым белком, в особенности включающим Ν-терминальные аминокислоты антиген-ассоциированной инвариантной цепи (й) НЬАИЯ.
  7. 7. Нуклеиновая кислота, кодирующая пептид в соответствии с любым из пп.1-6.
    - 32 018456
  8. 8. Нуклеиновая кислота в соответствии с п.7, которая является ДНК, кДНК, ПНК, ЦНК, РНК или их комбинациями.
  9. 9. Вектор экспрессии, способный экспрессировать нуклеиновую кислоту в соответствии с п.7 или 8.
  10. 10. Применение пептида в соответствии с любым из пп.1-6 или нуклеиновой кислоты в соответствии с п.7 или 8, или вектора экспрессии в соответствии с п.9 для лечения рака.
  11. 11. Клетка-хозяин, включающая нуклеиновую кислоту в соответствии с п.7 или 8 или вектор экспрессии в соответствии с п.9.
  12. 12. Клетка-хозяин в соответствии с п.11, которая является антигенпрезентирующей клеткой, в частности, дендритной клеткой или антигенпрезентирующей клеткой.
  13. 13. Способ получения пептида в соответствии с любым из пп.1-6, включающий культивирование клетки-хозяина в соответствии с п.11 и выделение пептида из клетки-хозяина или ее культуральной сре ды.
  14. 14. Способ получения активированных цитотоксических Т-лимфоцитов (ЦТЛ) ш уйго, включающий контактирование ЦТЛ ш уйго с нагруженными антигеном молекулами человека МНС I или II класса, экспрессированными на поверхности подходящей антигенпрезентирующей клетки на период времени, достаточный для активации антиген-специфическим образом указанных ЦТЛ, где указанный антиген является пептидом в соответствии с любым из пп.1-6.
  15. 15. Способ в соответствии с п.14, где антиген нагружен на молекулы МНС I или II класса, экспрессированные на поверхности подходящей антигенпрезентирующей клетки при контактировании достаточного количества антигена с антигенпрезентирующей клеткой.
  16. 16. Способ в соответствии с п.14, где антигенпрезентирующая клетка включает вектор экспрессии, способный экспрессировать указанный пептид, содержащий 8Ε0 ГО № 1 по 8Ε0 ГО № 29 или указанную вариантную аминокислотную последовательность.
  17. 17. Активированные цитотоксические Т-лимфоциты (ЦТЛ), полученные с помощью способа в соответствии с любым из пп.14-16, которые селективно распознают клетку, которая аберрантно экспрессирует полипептид, включающий аминокислотную последовательность, данную в любом из пп.1-4.
  18. 18. Способ уничтожения клеток-мишеней у пациента, чьи клетки-мишени аберрантно экспрессируют полипептид, включающий аминокислотную последовательность, данную в любом из пп.1-4, включающий введение пациенту эффективного числа цитотоксических Т-лимфоцитов (ЦТЛ), как определено в любом из пп.14-17.
  19. 19. Применение пептида в соответствии с любым из пп.1-6, или нуклеиновой кислоты в соответствии с п.7 или 8, или вектора экспрессии в соответствии с п.9, или клетки в соответствии с п.11 или 12, или активированных цитотоксических Т-лимфоцитов в соответствии с п.17 для изготовления лекарственного средства для лечения рака.
  20. 20. Применение в соответствии с п.19, где лекарственное средство является вакциной.
  21. 21. Применение в соответствии с п.19 или 20, где лекарственное средство является активным про тив рака.
  22. 22. Применение в соответствии с п.21, где указанные раковые клетки являются клетками глиобла-
EA201000207A 2007-07-27 2008-07-25 Новые иммуногенные эпитопы для иммунотерапии EA018456B1 (ru)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP07014797 2007-07-27
US95316107P 2007-07-31 2007-07-31
PCT/EP2008/006153 WO2009015842A2 (en) 2007-07-27 2008-07-25 Novel immunogenic epitopes for immunotherapy

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA201000207A1 EA201000207A1 (ru) 2010-08-30
EA018456B1 true EA018456B1 (ru) 2013-08-30

Family

ID=39766525

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201000207A EA018456B1 (ru) 2007-07-27 2008-07-25 Новые иммуногенные эпитопы для иммунотерапии

Country Status (17)

Country Link
US (5) US8080634B2 (ru)
EP (7) EP2562182B1 (ru)
JP (4) JP5484326B2 (ru)
KR (3) KR101351195B1 (ru)
CN (3) CN105566450A (ru)
AU (1) AU2008281014B2 (ru)
BR (1) BRPI0813626A2 (ru)
CA (1) CA2694805C (ru)
EA (1) EA018456B1 (ru)
ES (7) ES2553270T3 (ru)
HK (7) HK1159129A1 (ru)
HU (5) HUE026142T2 (ru)
MX (1) MX2010001090A (ru)
NZ (1) NZ582822A (ru)
PL (7) PL2338907T3 (ru)
UA (2) UA101810C2 (ru)
WO (1) WO2009015842A2 (ru)

Families Citing this family (60)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1716234B1 (de) * 2004-02-20 2013-10-02 Mologen AG Substituiertes, nicht-kodierendes nukleinsäuremolekül zur therapeutischen und prophylaktischen immunstimulation in menschen und höheren tieren
US9732131B2 (en) 2006-02-27 2017-08-15 Calviri, Inc. Identification and use of novopeptides for the treatment of cancer
US20090004213A1 (en) * 2007-03-26 2009-01-01 Immatics Biotechnologies Gmbh Combination therapy using active immunotherapy
GB201004575D0 (en) * 2010-03-19 2010-05-05 Immatics Biotechnologies Gmbh Composition of tumor associated peptides and related anti cancer vaccine for the treatment of gastric cancer and other cancers
GB201004551D0 (en) 2010-03-19 2010-05-05 Immatics Biotechnologies Gmbh NOvel immunotherapy against several tumors including gastrointestinal and gastric cancer
GB201019331D0 (en) * 2010-03-19 2010-12-29 Immatics Biotechnologies Gmbh Methods for the diagnosis and treatment of cancer based on AVL9
CN102168066A (zh) * 2011-01-31 2011-08-31 浙江大学 体外诱导乙型肝炎病毒特异性细胞毒性t淋巴细胞的方法
CN102183640A (zh) * 2011-01-31 2011-09-14 浙江大学 筛选和鉴定乙肝病毒特异性细胞毒性t淋巴细胞表位方法
WO2013054320A1 (en) * 2011-10-11 2013-04-18 Tel Hashomer Medical Research Infrastructure And Services Ltd. Antibodies to carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule (ceacam)
US20130302366A1 (en) 2012-05-09 2013-11-14 Christopher Marshall Conformationally Specific Viral Immunogens
RS62602B1 (sr) 2013-08-05 2021-12-31 Immatics Biotechnologies Gmbh Nova imunoterapija za lečenje nekoliko tumora, kao što je rak pluća, uključujući nsclc
GB201319446D0 (en) * 2013-11-04 2013-12-18 Immatics Biotechnologies Gmbh Personalized immunotherapy against several neuronal and brain tumors
MX2019013161A (es) * 2013-11-04 2020-02-03 Immatics Biotechnologies Gmbh Inmunoterapia personalizada contra diversos tumores cerebrales y neuronales.
WO2015149016A2 (en) 2014-03-28 2015-10-01 University Of Washington Through Its Center For Commercialization Breast and ovarian cancer vaccines
US11427647B2 (en) 2014-04-27 2022-08-30 Famewave Ltd. Polynucleotides encoding humanized antibodies against CEACAM1
MD20160130A2 (ru) 2014-04-27 2017-04-30 Ccam Biotherapeutics Ltd. Гуманизированные антитела против CEACAM 1
IL248203A0 (en) 2014-05-09 2016-11-30 Immatics Biotechnologies Gmbh Innovative immunotherapy against blood tumors such as acute leukemia in the spinal cord
GB201408255D0 (en) * 2014-05-09 2014-06-25 Immatics Biotechnologies Gmbh Novel immunotherapy against several tumours of the blood, such as acute myeloid leukemia (AML)
MY190083A (en) 2015-03-17 2022-03-25 Immatics Biotechnologies Gmbh Novel peptides and combination of peptides for use in immunotherapy against pancreatic cancer and other cancers
GB201504502D0 (en) * 2015-03-17 2015-04-29 Immatics Biotechnologies Gmbh Novel peptides and combination of peptides for use in immunotherapy against pancreatic cancer and other cancers
GB201505305D0 (en) 2015-03-27 2015-05-13 Immatics Biotechnologies Gmbh Novel Peptides and combination of peptides for use in immunotherapy against various tumors
MD3388075T2 (ro) 2015-03-27 2023-10-31 Immatics Biotechnologies Gmbh Noi peptide și combinații de peptide pentru utilizare în imunoterapia împotriva unor diverse tumori (SEQ ID 25 - MXRA5-003)
GB201505585D0 (en) 2015-03-31 2015-05-13 Immatics Biotechnologies Gmbh Novel peptides and combination of peptides and scaffolds for use in immunotherapy against renal cell carinoma (RCC) and other cancers
GB201507030D0 (en) * 2015-04-24 2015-06-10 Immatics Biotechnologies Gmbh Immunotherapy against lung cancers, in particular NSCLC
GB201507719D0 (en) * 2015-05-06 2015-06-17 Immatics Biotechnologies Gmbh Novel peptides and combination of peptides and scaffolds thereof for use in immunotherapy against colorectal carcinoma (CRC) and other cancers
JP6985153B2 (ja) * 2015-05-06 2021-12-22 イマティクス バイオテクノロジーズ ゲーエムベーハー 結腸直腸がん（ｃｒｃ）およびその他のがんに対する免疫療法で使用するための新規ペプチドおよびペプチドとそのスキャフォールドとの組み合わせ
NL2014935B1 (en) 2015-06-08 2017-02-03 Applied Immune Tech Ltd T cell receptor like antibodies having fine specificity.
JP2018518956A (ja) * 2015-06-19 2018-07-19 イマティクス バイオテクノロジーズ ゲーエムベーハー 免疫療法で使用するための新規ペプチドおよびペプチド組み合わせおよび膵臓がんおよびその他のがんに対して使用するためにスキャフォールドを作製する方法
GB201510771D0 (en) 2015-06-19 2015-08-05 Immatics Biotechnologies Gmbh Novel peptides and combination of peptides for use in immunotherapy and methods for generating scaffolds for the use against pancreatic cancer
GB201511191D0 (en) * 2015-06-25 2015-08-12 Immatics Biotechnologies Gmbh T-cell epitopes for the immunotherapy of myeloma
GB201511546D0 (en) * 2015-07-01 2015-08-12 Immatics Biotechnologies Gmbh Novel peptides and combination of peptides for use in immunotherapy against ovarian cancer and other cancers
MA42294B1 (fr) 2015-07-01 2020-11-30 Immatics Biotechnologies Gmbh Nouveaux peptides et combinaison de peptides à utiliser en immunothérapie contre le cancer de l'ovaire et d'autres cancers
GB201512369D0 (en) * 2015-07-15 2015-08-19 Immatics Biotechnologies Gmbh Novel peptides and combination of peptides for use in immunotherapy against epithelial ovarian cancer and other cancers
US20170136108A1 (en) 2015-08-28 2017-05-18 Immatics Biotechnologies Gmbh Novel peptides, combination of peptides and scaffolds for use in immunotherapeutic treatment of various cancers
GB201515321D0 (en) 2015-08-28 2015-10-14 Immatics Biotechnologies Gmbh Novel peptides, combination of peptides and scaffolds for use in immunotherapeutic treatment of various cancers
CN115925806A (zh) 2015-08-28 2023-04-07 伊玛提克斯生物技术有限公司 用于各种癌症免疫治疗的新型肽、肽组合物和支架
LU92821B1 (en) 2015-09-09 2017-03-20 Mologen Ag Combination comprising immunostimulatory oligonucleotides
GB2542425A (en) 2015-09-21 2017-03-22 Mologen Ag Means for the treatment of HIV
GB201521894D0 (en) * 2015-12-11 2016-01-27 Immatics Biotechnologies Gmbh Novel peptides and combination of peptides for use in immunotherapy against various cancers
PE20181535A1 (es) 2015-12-16 2018-09-26 Gritstone Oncology Inc Identificacion, fabricacion y uso de neoantigeno
GB201603987D0 (en) * 2016-03-08 2016-04-20 Immatics Biotechnologies Gmbh Uterine cancer treatments
GB201604458D0 (en) * 2016-03-16 2016-04-27 Immatics Biotechnologies Gmbh Peptides and combination of peptides for use in immunotherapy against cancers
JP7075125B2 (ja) 2016-05-25 2022-05-25 イマティクス バイオテクノロジーズ ゲーエムベーハー 標的としてのおよび胆嚢がんおよび胆管がんおよびその他のがんに対する免疫療法で使用するための新規ペプチド、ペプチド組み合わせ
GB201609193D0 (en) 2016-05-25 2016-07-06 Immatics Biotechnologies Gmbh Novel peptides, combination of peptides as targets for use in immunotherapy against gallbladder cancer and cholangiocarcinoma and other cancers
TWI796299B (zh) * 2016-08-26 2023-03-21 德商英麥提克生物技術股份有限公司 用於頭頸鱗狀細胞癌和其他癌症免疫治療的新型肽和支架
KR102639592B1 (ko) 2016-12-08 2024-02-21 이매틱스 바이오테크놀로지스 게엠베하 짝짓기가 향상된 t 세포 수용체
DE102016123893A1 (de) 2016-12-08 2018-06-14 Immatics Biotechnologies Gmbh T-Zellrezeptoren mit verbesserter Bindung
EA201991444A1 (ru) 2017-01-27 2019-12-30 Имматикс Байотекнолоджиз Гмбх Новые пептиды и комбинации пептидов для применения в иммунотерапии рака яичника и других видов рака
HRP20230512T8 (hr) 2017-01-27 2023-09-15 Immatics Biotechnologies Gmbh Novi peptidi i kombinacija peptida za uporabu u imunoterapiji protiv karcinoma jajnika i drugih karcinoma
MA47367B1 (fr) * 2017-01-27 2023-06-28 Immatics Biotechnologies Gmbh Nouveaux peptides et combinaison de peptides à utiliser en immunothérapie contre le cancer de l'ovaire et d'autres cancers
US20200276285A1 (en) 2017-06-02 2020-09-03 Arizona Board Of Regents On Behalf Of Arizona State University A method to create personalized cancer vaccines
US12025615B2 (en) 2017-09-15 2024-07-02 Arizona Board Of Regents On Behalf Of Arizona State University Methods of classifying response to immunotherapy for cancer
JP7227237B2 (ja) 2017-10-10 2023-02-21 グリットストーン バイオ インコーポレイテッド ホットスポットを利用した新生抗原の特定
AU2018373154A1 (en) 2017-11-22 2020-07-02 Gritstone Bio, Inc. Reducing junction epitope presentation for neoantigens
US20200368336A1 (en) * 2017-12-01 2020-11-26 Shanghai Jenomed Biotech Co., Ltd. Method for preparing personalized cancer vaccine
CN109045290B (zh) * 2018-11-02 2021-08-31 遵义医学院附属医院 基于内皮细胞特异分子-1的双靶标肿瘤疫苗及其制备方法
EP4038222A4 (en) 2019-10-02 2023-10-18 Arizona Board of Regents on behalf of Arizona State University METHODS AND COMPOSITIONS FOR IDENTIFYING NEOANTIGENS FOR USE IN THE TREATMENT AND PREVENTION OF CANCER
AU2020399230A1 (en) 2019-12-11 2022-06-23 Molecular Partners Ag Recombinant peptide-MHC complex binding proteins and their generation and use
US20230041822A1 (en) * 2019-12-11 2023-02-09 Molecular Partners Ag Recombinant peptide-mhc complex binding proteins and their generation and use
CN113881707B (zh) * 2021-10-25 2023-07-14 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 调控脐带间充质干细胞免疫抑制作用的产品、方法及用途

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2002078524A2 (en) * 2001-03-28 2002-10-10 Zycos Inc. Translational profiling
WO2003000113A2 (en) * 2001-06-20 2003-01-03 Genentech, Inc. Compositions and methods for the diagnosis and treatment of tumor
WO2004030615A2 (en) * 2002-10-02 2004-04-15 Genentech, Inc. Compositions and methods for the diagnosis and treatment of tumor
WO2005044990A2 (en) * 2003-11-04 2005-05-19 Bayer Healthcare Llc Use of differentially expressed nucleic acid sequences as biomarkers for cancer
WO2005116051A2 (de) * 2004-05-25 2005-12-08 Immatics Biotechnologies Gmbh An mhc-moleküle bindende tumor-assoziierte peptide
WO2007028574A2 (en) * 2005-09-05 2007-03-15 Immatics Biotechnologies Gmbh Tumor-associated peptides binding promiscuously to human leukocyte antigen (hla) class ii molecules

Family Cites Families (58)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4440859A (en) 1977-05-27 1984-04-03 The Regents Of The University Of California Method for producing recombinant bacterial plasmids containing the coding sequences of higher organisms
US4704362A (en) 1977-11-08 1987-11-03 Genentech, Inc. Recombinant cloning vehicle microbial polypeptide expression
DK171727B1 (da) 1978-12-22 1997-04-14 Biogen Inc Rekombinante hepatitis B virus DNA-molekyler, værtsorganismer transformeret hermed, HBV-antigenspecifikke polypeptider, DNA-sekvenser kodende for HBV-antigenspecifikke polypeptider, metoder til påvisning af hepatitis B virus-antistoffer, metoder til fremstilling af nævnte DNA-molekyler, fremgangsmåder til fremstilling af nævnte polypeptider og midler til påvisning af HBV-infektion
US4530901A (en) 1980-01-08 1985-07-23 Biogen N.V. Recombinant DNA molecules and their use in producing human interferon-like polypeptides
US4678751A (en) 1981-09-25 1987-07-07 Genentech, Inc. Hybrid human leukocyte interferons
US4766075A (en) 1982-07-14 1988-08-23 Genentech, Inc. Human tissue plasminogen activator
US4582800A (en) 1982-07-12 1986-04-15 Hoffmann-La Roche Inc. Novel vectors and method for controlling interferon expression
JPS6081130A (ja) * 1983-10-07 1985-05-09 Fujisawa Pharmaceut Co Ltd 抗ｈｌａ−ａ２抗体およびそれを産生するハイブリド−マ
US4757006A (en) 1983-10-28 1988-07-12 Genetics Institute, Inc. Human factor VIII:C gene and recombinant methods for production
US4677063A (en) 1985-05-02 1987-06-30 Cetus Corporation Human tumor necrosis factor
US4810648A (en) 1986-01-08 1989-03-07 Rhone Poulenc Agrochimie Haloarylnitrile degrading gene, its use, and cells containing the gene
US4897445A (en) 1986-06-27 1990-01-30 The Administrators Of The Tulane Educational Fund Method for synthesizing a peptide containing a non-peptide bond
JP3055687B2 (ja) 1987-08-10 2000-06-26 ザ ユニバーシティー オブ メルボルン Ｖｐ７をコードするヒトロタウイルス血清型４遺伝子９の分子クローニング、糖タンパク質特異的主要外部カプシド中和及びワクチンに使用するためのｖｐ７及びそのフラグメントの発現
US5651972A (en) 1989-04-21 1997-07-29 University Of Florida Research Foundation, Inc. Use of recombinant swine poxvirus as a live vaccine vector
US5119700A (en) 1991-03-01 1992-06-09 Titan Tool Company Automatic stud driving tool having collarless retention mechanism for driven head
US20020168374A1 (en) * 1992-08-07 2002-11-14 Ralph T. Kubo Hla binding peptides and their uses
AUPM322393A0 (en) 1993-12-24 1994-01-27 Austin Research Institute, The Mucin carbohydrate compounds and their use in immunotherapy
WO1996031604A1 (en) * 1995-04-07 1996-10-10 The Regents Of The University Of California Antibodies for the detection of hla-g
ATE244300T1 (de) 1996-01-17 2003-07-15 Imp College Innovations Ltd Immunotherapie mit verwendung von zytotoxischen t lymphozyten (ctl)
US5849589A (en) 1996-03-11 1998-12-15 Duke University Culturing monocytes with IL-4, TNF-α and GM-CSF TO induce differentiation to dendric cells
ATE296313T1 (de) * 1996-03-21 2005-06-15 Epimmune Inc Hla-a2.1 bindende peptide und deren verwendung
JP4063359B2 (ja) * 1997-01-23 2008-03-19 タカラバイオ株式会社 硫酸基転移酵素遺伝子
US6406705B1 (en) 1997-03-10 2002-06-18 University Of Iowa Research Foundation Use of nucleic acids containing unmethylated CpG dinucleotide as an adjuvant
CA2291221A1 (en) * 1997-05-30 1998-12-03 Human Genome Sciences, Inc. 32 human secreted proteins
DE19739089A1 (de) 1997-09-06 1999-03-11 Hella Kg Hueck & Co Scheinwerfer für Fahrzeuge
JP2001516766A (ja) * 1997-09-19 2001-10-02 デイナ−ファーバー キャンサー インスティチュート，インコーポレイテッド 免疫反応の細胞内発現抗体仲介制御
US6747137B1 (en) 1998-02-13 2004-06-08 Genome Therapeutics Corporation Nucleic acid sequences relating to Candida albicans for diagnostics and therapeutics
EP1187924A1 (en) 1999-06-03 2002-03-20 Cold Spring Harbor Laboratory Substrate trapping protein tyrosine phosphatases
CA2384713A1 (en) * 1999-09-29 2001-04-05 Human Genome Sciences, Inc. Colon and colon cancer associated polynucleotides and polypeptides
WO2001055387A1 (en) * 2000-01-31 2001-08-02 Human Genome Sciences, Inc. Nucleic acids, proteins, and antibodies
US20020048763A1 (en) * 2000-02-04 2002-04-25 Penn Sharron Gaynor Human genome-derived single exon nucleic acid probes useful for gene expression analysis
WO2001072331A1 (en) * 2000-03-31 2001-10-04 Vaccine Chip Technology Aps Immunostimulating properties of a fragment of tgf-beta
GB0011220D0 (en) 2000-05-10 2000-06-28 Blockfoil Group Limited Foil embossing
CA2411278A1 (en) * 2000-06-09 2001-12-20 Corixa Corporation Compositions and methods for the therapy and diagnosis of colon cancer
US20030017167A1 (en) * 2000-06-09 2003-01-23 Corixa Corporation Compositions and methods for the therapy and diagnosis of colon cancer
WO2002006515A2 (en) * 2000-07-17 2002-01-24 Diadexus, Inc. Method of diagnosing, monitoring, staging, imaging and treating colon cancer
CA2420193A1 (en) * 2000-08-24 2002-02-28 Genentech, Inc. Compositions and methods for the diagnosis and treatment of tumor
JP2002173450A (ja) * 2000-12-07 2002-06-21 Hokkaido Technology Licence Office Co Ltd 糖脂質特異的硫酸転移酵素遺伝子を含む医薬組成物
MXPA03005004A (es) * 2000-12-08 2004-09-10 Protein Design Labs Inc Metodos de diagnostico de cancer colorrectal y/o cancer de pecho, composiciones, y metodos para rastrear moduladores de cancer colorrectal y/o cancer de pecho.
US6455026B1 (en) 2001-03-23 2002-09-24 Agy Therapeutics, Inc. Use of protein tyrosine phosphatase zeta as a biomolecular target in the treatment and visualization of brain tumors
US20030118585A1 (en) 2001-10-17 2003-06-26 Agy Therapeutics Use of protein biomolecular targets in the treatment and visualization of brain tumors
JP2003012544A (ja) * 2001-03-27 2003-01-15 Kouji Egawa 癌予防・治療剤
WO2003042661A2 (en) 2001-11-13 2003-05-22 Protein Design Labs, Inc. Methods of diagnosis of cancer, compositions and methods of screening for modulators of cancer
DE10225144A1 (de) * 2002-05-29 2003-12-18 Immatics Biotechnologies Gmbh An MHC-Moleküle bindende Tumor-assoziierte Peptide
JP2005185101A (ja) * 2002-05-30 2005-07-14 National Institute Of Agrobiological Sciences 植物の全長ｃＤＮＡおよびその利用
AU2003242163A1 (en) * 2002-06-06 2003-12-22 Yamanouchi Pharmaceutical Co., Ltd. Novel oxidase
KR100494979B1 (ko) 2003-07-14 2005-06-14 주식회사 정우인터내셔날 조직 절편 보호 및 해상력 증진용 액상 커버 슬립, 그제조용 조성물, 그로부터 제조된 커버슬립을 구비한슬라이드 구조체 및 그 제조방법
CA2536911A1 (en) * 2003-09-01 2005-03-10 Kureha Corporation Antibody against nox1 polypeptide, method of diagnosing cancer with the use of nox1 gene and method of screening cancer growth inhibitor
EP1716227A4 (en) 2004-01-27 2010-01-06 Compugen Ltd METHOD OF IDENTIFYING PUTATIVE GENE PRODUCTS USING THE INTERSPEZIES SEQUENCE COMPARISON AND BIOMOLECULAR SEQUENCES DISCOVERED THEREFOR
US8668905B2 (en) * 2005-05-12 2014-03-11 University Of South Florida P53 vaccines for the treatment of cancers
EP1748067A1 (en) * 2005-07-29 2007-01-31 Institut Pasteur Polynucleotides encoding MHC class I-restricted hTERT epitopes, analogues thereof or polyepitopes
EP1930427B1 (en) * 2005-08-09 2012-04-11 Kurume University Squamous cell carcinoma antigen-derived peptide binding to hla-a24 molecule
DE602005016112D1 (de) * 2005-09-05 2009-10-01 Immatics Biotechnologies Gmbh Tumorassoziierte Peptide, die HLA Klasse I oder II-Moleküle binden, und anti-Tumor Impfstoffe
CA2638912A1 (en) * 2006-02-20 2007-08-30 Phylogica Limited Method of constructing and screening libraries of peptide structures
CN101448938A (zh) * 2006-03-28 2009-06-03 佐藤升志 新肿瘤抗原肽
US10093977B2 (en) * 2007-03-05 2018-10-09 International Institute Of Cancer Immunology, Inc. Cancer antigen-specific T-cell receptor gene, peptide encoded by the gene, and use of them
US20090004213A1 (en) * 2007-03-26 2009-01-01 Immatics Biotechnologies Gmbh Combination therapy using active immunotherapy
PT2113253E (pt) 2008-04-30 2010-06-15 Immatics Biotechnologies Gmbh Formulações novas de peptídeos associados a tumores que se ligam a moléculas de classe i ou ii do antígeno leucocitário humano (hla) para vacinas

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2002078524A2 (en) * 2001-03-28 2002-10-10 Zycos Inc. Translational profiling
WO2003000113A2 (en) * 2001-06-20 2003-01-03 Genentech, Inc. Compositions and methods for the diagnosis and treatment of tumor
WO2004030615A2 (en) * 2002-10-02 2004-04-15 Genentech, Inc. Compositions and methods for the diagnosis and treatment of tumor
WO2005044990A2 (en) * 2003-11-04 2005-05-19 Bayer Healthcare Llc Use of differentially expressed nucleic acid sequences as biomarkers for cancer
WO2005116051A2 (de) * 2004-05-25 2005-12-08 Immatics Biotechnologies Gmbh An mhc-moleküle bindende tumor-assoziierte peptide
WO2007028574A2 (en) * 2005-09-05 2007-03-15 Immatics Biotechnologies Gmbh Tumor-associated peptides binding promiscuously to human leukocyte antigen (hla) class ii molecules

Non-Patent Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DATABASE Geneseq [Online] 18 November 2004 (2004-11-18), "Tumour-associated antigenic target (TAT) polypeptide PR080966, SEQ:1080." XP002505845 retrieved from EBI accession no. GSP:ABM80429 Database accession no. ABM80429 Discloses sequence 1080 of WO2004030615. the whole document *
DATABASE Geneseq [Online] 29 January 2003 (2003-01-29), "Human expressed protein tag (EPT) #29." XP002505843 retrieved from EBI accession no. GSP:ABU03249 Database accession no. ABU03249 Discloses sequence 29 of WO02078524- the whole document *
DATABASE Geneseq [Online] 3 September 2001 (2001-09-03), "Human colon cancer antigen protein SEQ ID NO:6503." XP002505842 retrieved from EBI accession no. GSP:AAG75739 Database accession no. AAG75739 the whole document *
DATABASE Geneseq [Online] 7 November 2001 (2001-11-07), "Novel signal transduction pathway protein, Seq ID 642." XP002497882 retrieved from EBI accession no. GSP:AAU17077 Database accession no. AAU17077 the whole document *
DATABASE UniProt [Online] 1 July 1989 (1989-07-01), "RecName: Full=DNA topoisomerase 2-alpha; EC=5.99_. 1.3; AltName: Full=DNA topoisomerase II, alpha isozyme;" XP002505847 retrieved from EBI accession no. UNIPR0T:P11388 Database accession no. P11388 the whole document *
DATABASE UniProt [Online] 1 July 1993 (1993-07-01), "RecName: Full=DNA topoisomerase 2-beta; EC=5.99. 1.3; AltName: Full=DNA topoisomerase II, beta isozyme;" XP002505846 retrieved from EBI accession no. UNIPROT:Q02880 Database accession no. Q02880 the whole document *
DATABASE UniProt [Online] 1 May 2000 (2000-05-01), "RecName: Full=NADPH oxidase 1; Short=NOX-1; EC=l.-.-. -; AltName: Full=NOH-l; AltName: Full=NADH/NADPH mitogenic oxidase subunit P65-MOX; AltName: Full=Mitogenic oxidase 1; Short=MOX1;" XP002505848 retrieved from EBI accession no. UNIPROT:Q9Y5S8 Database accession no. Q9Y5S8 the whole document *
DATABASE UniProt [Online] 1 October 1989 (1989-10-01), "RecName: Full=Proliferating cell nuclear antigen; Short=PCNA; AltName: Full=Cyclin;" XP002505844 retrieved from EBI accession no. UNIPROT:P12004 Database accession no. P12004 Comprises present sequence 3. the whole document *
DATABASE UniProt [Online] 13 September 2005 (2005-09-13), "SubName: Full=FERMTl protein;" XP002497883 retrieved from EBI accession no. UNIPROT:Q49AC8 Database accession no. Q49AC8 the whole document *

Also Published As

Publication number Publication date
CA2694805C (en) 2014-09-09
ES2689851T3 (es) 2018-11-16
PL2338907T3 (pl) 2016-03-31
CN103864893B (zh) 2017-01-04
HUE025636T2 (en) 2016-04-28
HK1183039A1 (en) 2013-12-13
PL3042914T3 (pl) 2019-01-31
EA201000207A1 (ru) 2010-08-30
EP2562184A1 (en) 2013-02-27
PL2565204T3 (pl) 2016-03-31
WO2009015842A3 (en) 2009-04-02
HUE027057T2 (en) 2016-08-29
JP2016040257A (ja) 2016-03-24
EP2562184B1 (en) 2015-10-07
PL2562183T3 (pl) 2016-03-31
CN101765610A (zh) 2010-06-30
EP2562182B1 (en) 2015-10-07
HUE027164T2 (en) 2016-08-29
HK1223381A1 (zh) 2017-07-28
US20110117117A1 (en) 2011-05-19
JP2016074693A (ja) 2016-05-12
EP2562182A1 (en) 2013-02-27
US9511128B2 (en) 2016-12-06
KR20130079650A (ko) 2013-07-10
EP2338907B1 (en) 2015-09-30
EP2183278B1 (en) 2018-07-04
KR101291394B1 (ko) 2013-08-07
JP2010534463A (ja) 2010-11-11
ES2689725T3 (es) 2018-11-15
NZ582822A (en) 2012-06-29
WO2009015842A2 (en) 2009-02-05
ES2551589T3 (es) 2015-11-20
CN105566450A (zh) 2016-05-11
HK1183040A1 (en) 2013-12-13
BRPI0813626A2 (pt) 2014-12-23
ES2553270T3 (es) 2015-12-07
ES2555282T3 (es) 2015-12-30
PL2183278T3 (pl) 2018-12-31
UA101810C2 (ru) 2013-05-13
JP6130469B2 (ja) 2017-05-17
US10420800B2 (en) 2019-09-24
HUE026142T2 (en) 2016-05-30
EP2562183B1 (en) 2015-10-07
ES2553229T3 (es) 2015-12-07
EP3042914A1 (en) 2016-07-13
KR20100040889A (ko) 2010-04-21
HK1183041A1 (en) 2013-12-13
EP2183278A2 (en) 2010-05-12
EP3042914B1 (en) 2018-07-04
EP2338907A1 (en) 2011-06-29
EP2565204A1 (en) 2013-03-06
CA2694805A1 (en) 2009-02-05
MX2010001090A (es) 2010-04-07
KR101313915B1 (ko) 2013-10-01
HK1183038A1 (en) 2013-12-13
US20140271692A1 (en) 2014-09-18
EP2565204B1 (en) 2015-10-07
JP2014138588A (ja) 2014-07-31
HK1159129A1 (en) 2012-07-27
ES2553207T3 (es) 2015-12-07
CN103864893A (zh) 2014-06-18
KR20120087897A (ko) 2012-08-07
CN101765610B (zh) 2014-01-29
KR101351195B1 (ko) 2014-01-14
HUE026776T2 (en) 2016-08-29
US8080634B2 (en) 2011-12-20
US20190076476A1 (en) 2019-03-14
EP2562183A8 (en) 2013-05-08
PL2562182T3 (pl) 2016-03-31
JP5818920B2 (ja) 2015-11-18
PL2562184T3 (pl) 2016-03-31
US20160051654A1 (en) 2016-02-25
AU2008281014A2 (en) 2010-04-29
UA103751C2 (ru) 2013-11-25
AU2008281014B2 (en) 2012-06-28
EP2562183A1 (en) 2013-02-27
HK1223382A1 (zh) 2017-07-28
US9950048B2 (en) 2018-04-24
US20090136528A1 (en) 2009-05-28
US8669230B2 (en) 2014-03-11
JP5484326B2 (ja) 2014-05-07
AU2008281014A1 (en) 2009-02-05

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EA018456B1 (ru) Новые иммуногенные эпитопы для иммунотерапии
AU2021204201B2 (en) Peptides, combination of peptides, and cell based medicaments for use in immunotherapy against urinary bladder cancer and other cancers
TWI776245B (zh) 用於小細胞肺癌和其他癌症免疫治療的新型肽和肽組合物
TWI689516B (zh) 用於對抗多種癌症的免疫療法的新胜肽及胜肽組合
JP2020198875A (ja) 上皮性卵巣がんおよびその他のがんに対する免疫療法において使用するための新規ペプチドおよびペプチドの組み合わせ
EA029831B1 (ru) Пептид, индуцирующий цитотоксические т-лимфоциты и стимулирующий антиопухолевые иммунные ответы
TW201841934A (zh) 用於治療癌症免疫治療的新穎肽及其肽組合物
TW201713682A (zh) 用於攝護腺癌和其他癌症免疫治療的新型肽和肽組合物
TW201720842A (zh) 用於抗cll及其他癌症之免疫治療的新穎胜肽及胜肽組合物
EA018457B1 (ru) Композиция опухолеассоциированных пептидов и относящаяся к ним противораковая вакцина
EA023013B1 (ru) Пептид, индуцирующий противоопухолевый иммунный ответ, и его применение
TWI781104B (zh) 新型肽、肽組合物作為靶標以及用於膽囊癌、膽管癌和其他癌症免疫治療
EA019603B1 (ru) Новые и действенные пептиды мнс ii класса, полученные из сурвивина
KR20180038550A (ko) 다양한 암의 면역요법 치료에서의 사용을 위한 신규 펩티드, 펩티드의 조합 및 골격
TW201738274A (zh) 子宮癌治療
CN114040921A (zh) 用于不同类型癌症免疫治疗的非经典来源的肽和肽组合
EA013466B1 (ru) Опухолеассоциированные пептиды, связывающиеся с молекулами человеческого лейкоцитарного антигена (hla) i или ii класса, и относящаяся к ним противораковая вакцина
CN109734777B (zh) 用于各种癌症免疫治疗的新型肽、肽组合物和支架
CN111499714A (zh) 用于癌症免疫治疗的肽及其肽组合物
CN113164569A (zh) A*01限制肽和肽组合物在抗癌免疫治疗中的用途和相关方法
TWI755365B (zh) 用於小細胞肺癌和其他癌症免疫治療的新型肽和肽組合物
CN112920257A (zh) 用于不同类型癌症免疫治疗的非经典来源的肽和肽组合
CN114028549A (zh) 用于nhl和其他癌症免疫治疗的新型肽和肽组合物
TW202246303A (zh) 用於 aml 和其他癌症免疫治療的新型肽和肽組合物
TW202126676A (zh) 用於抗cll及其他癌症之免疫治療的新穎胜肽及胜肽組合物

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ BY KZ KG MD TJ TM RU