EA018457B1 - Композиция опухолеассоциированных пептидов и относящаяся к ним противораковая вакцина - Google Patents

Abstract

Настоящее изобретение относится к иммунотерапевтическим пептидам и их применению в иммунотерапии, в частности иммунотерапии рака. Настоящее изобретение раскрывает опухолеассоциированные пептидные эпитопы Т-хелперных клеток, в отдельности или в комбинации с другими опухолеассоциированными пептидами, которые служат как активные фармацевтические ингредиенты для композиций вакцины, которая стимулирует противоопухолевые иммунные ответы. В частности, композиция пептидов настоящего изобретения может быть использована в вакцинных композициях для инициации противоопухолевых иммунных ответов против колоректального рака.

Description

Настоящее изобретение относится к иммунотерапевтическим пептидам и их применению в иммунотерапии, в частности иммунотерапии рака. Настоящее изобретение раскрывает опухолеассоциированные пептидные эпитопы Т-хелперных клеток, в отдельности или в комбинации с другими опухолеассоциированными пептидами, которые служат как активные фармацевтические ингредиенты для композиций вакцины, которая стимулирует противоопухолевые иммунные ответы. В особенности композиция пептидов настоящего изобретения может быть использована в вакцинных композициях для инициации противоопухолевых иммунных ответов против колоректального рака.

В соответствии с целями настоящего изобретения все цитаты описания включены в их целостности путем ссылки.

Уровень техники Колоректальная карцинома

По данным Американского общества по борьбе с раком колоректальный рак (КРР) занимает третье место по частоте распространения в США, это заболевание поражает ежегодно более 175000 новых пациентов. В США, Японии, Франции, Германии, Италии, Испании и Великобритании оно поражает более 480000 пациентов. Это одна из наиболее частых причин смертности от рака в развитых странах.

Исследователи предполагают, что возникновение колоректального рака является результатом взаимодействия между наследственными факторами и факторами окружающей среды. В большинстве случаев появляются аденоматозные полипы, становясь предшественниками колоректальных опухолей, хотя процесс их перехода в опухоль может занять многие годы. Первостепенный фактор риска для заболевания колоректальным раком - это возраст, в 90% случаев диагноз был поставлен в возрасте более 50 лет. Другие факторы риска заболевания колоректальным раком по данным Американского общества по борьбе с раком включают употребление алкоголя, питание с высоким содержанием жиров и/или сырого мяса и неадекватное потребление фруктов и овощей. Число новых случаев продолжает расти, в особенности на территории таких стран, как Япония, где виновником может быть внедрение западных образцов питания с избыточным потреблением жира и мяса и снижение потребления волокнистой пищи. Несмотря на это частота заболеваемости растет не так быстро, как раньше, что может быть связано с увеличением количества скринингов и удалением полипов, предотвращая, таким образом, прогрессирование заболевания и переход полипов в рак.

Как и при большинстве солидных опухолей, терапия первого ряда - операция, однако только пациенты на ранней стадии могут получить от этого пользу, значительной же доле пациентов диагноз ставится лишь на поздних стадиях заболевания. В химиотерапии колоректального рака на поздних стадиях стандартом лечения являются лечебные схемы, основанные на фторурациле. Большинство данных лечебных схем представляют собой т.н. курсы лечения ЕОЬЕОХ (вливание 5-Еи/лейковорин плюс оксалиплатин) и ЕОЬНКГ' (иринотекан, лейковорин, болюсное и продолжительное вливание 5-ЕИ).

Внедрение цитотоксических препаратов третьего поколения, таких как иринотекан и оксалиплатин, увеличило надежду на значительное улучшение эффективности, однако прогнозы до сих пор относительно безнадежные. Срок выживаемости при метастатической болезни, как правило, составляет приблизительно 20 месяцев и, в результате этого, остается высокой беспомощность медицины при данном заболевании.

Недавно стало доступным новое поколение медикаментов, действующих на молекулярные мишени, таких как Авастин (бевацизумаб) и Эрбитукс (цетуксимаб), а около 40 соединений находятся на поздней стадии клинических исследований для лечения различных стадий колоректального рака. Комбинации из нескольких таких соединений повышают число потенциальных возможностей лечения, ожидаемых в будущем. Подавляющее большинство веществ находятся на 2-й фазе исследований, при этом данные соединения более часто, чем другие разрабатываемые медикаменты против колоректального рака, адресованы против ЕСЕК (рецептор эпидермального фактора роста), что связано с тем фактом, что у ~80% пациентов с колоректальным раком наблюдается повышенная экспрессия ЕСЕК.

На данный момент проводятся клинические исследования с пациентами II стадии с комбинацией химиотерапии с одобренными недавно моноклональными антителами (шАЬ§) (цетуксимаб + иринотекан или ЕОЙЕОХ4; бевацизумаб в качестве монотерапии или вместе с ЕОЙЕОХ4). Для получения статистически достоверных результатов по данным исследованиям необходимы трех-четырех-годичные периоды наблюдения.

Моноклональные антитела (шАЬ§), используемые в настоящее время в онкологии, в целом имеют превосходные шансы на то, что они не будут создавать помех активной иммунотерапии. Действительно, имеются доклинические данные, предполагающие, что элиминация фактора роста эндотелия сосудов УЕСЕ (в случае бевацизумаба) вносит положительный вклад в опосредованную ДК (дендритные клетки) активацию Т-клеток.

На данный момент в около 16 исследованиях проверяется безопасность и потенциал новых иммунотерапевтических подходов для лечения КРР.

Иммунотерапевтические подходы в лечении

Стимуляция иммунных ответов зависит от присутствия антигенов, распознающихся иммунной системой хозяина как чужеродные. Открытие существования опухолеассоциированных антигенов повысило

- 1 018457 сейчас возможность использования иммунной системы хозяина для вмешательства в рост опухоли. Различные механизмы объединения обеих ветвей иммунной системы как гуморальной, так и клеточной, исследуются в настоящее время для иммунотерапии рака.

Специфические элементы клеточных иммунных ответов способны к специфическому распознаванию и уничтожению опухолевых клеток. Изоляция цитотоксических Т-клеток (ЦТЛ) из популяций опухоль-инфильтрирующих клеток или из периферической крови предполагает, что такие клетки играют важную роль в естественной иммунной защите против рака (Сйссусг е( а1., Аппа1з Ν.Υ. Асай. 8с1. 1993 690:101-112; 2ей ИЛ., Репу-ЬаПеу Ό., ИиШеу МЕ, РозепЬегд 8.А., Υαη§ 1.С.; 1 1ттиио1. 1999, 162(2):98994; Шдй ау1ййу СТЬз Гог 1\\ό зе1Г-ап(1депз йетопзййе зирепог ΐη νίίτο апй ίη νίνο аййитог еГПсасу.). В частности, СЭ8-положительные Т-клетки (ТСЭ8⁺), которые распознают молекулы I класса главного комплекса гистосовместимости (МНС) с пептидами, имеющими обычно 8-10 остатков, образованными из белков или дефектных рибосомных продуктов (ΌΡΙΡ8) (8с1шЬей и., Αηίοη Ь.С., С1ЬЬз 1., ИотЬиту С.С., Уе\\йе11 IV., Веппшк !Р.; Рар1й йедгайайоп оГ а 1агде Гтасйоп оГ пе\у1у зуп11ез1/ей рго1етз Ьу рго(еазотез; Иайие 2000; 404 (6779): 770-774), находящихся в цитозоли, играют важную роль при этом ответе. Молекулы МНС человека называются также человеческими лейкоцитарными антигенами (НЬА).

Существуют два класса молекул МНС: молекулы МНС I класса, которые могут встречаться на большинстве клеток, имеющих ядро, которые презентируют пептиды, образующиеся из протеолитического расщепления эндогенных белков ΌΡΙΡ8 и более крупных пептидов. Молекулы МНС II класса могут встречаться преимущественно на профессиональных антигенпрезентирующих клетках (АПК) и презентировать пептиды экзогенных белков, которые поглощаются АПК в период эндоцитоза и впоследствии процессируются. Комплексы из пептида и молекулы МНС класса I распознаются СЭ8положительными цитотоксическими Т-лимфоцитами с соответствующим ТКР (Т-клеточный рецептор), комплексы из пептида и молекулы МНС класса II распознаются СЭ4-положптельными хелперными Тклетками с соответствующим ТКР.

СЭ4-положптельные хелперные Т-клетки играют важную роль в управлении эффекторными функциями противоопухолевых Т-клеточных ответов, и поэтому идентификация СВ4-положительных Тклеточных эпитопов, образованных из опухолеассоциированных антигенов (ТАА), может быть чрезвычайно важна для разработки фармацевтических препаратов для инициации противоопухолевых иммунных ответов (КоЬауазЫ, Н., Р. От1уа, М. Ρυίζ, Е. НиаПе, Р. 8атоЬе, 1. 1. Ьазапе, М. Неп^, В. 8апдго, 1. Рпе(о, Р. Вотгаз-СиезШ, апй Е. Сейз. [йепийсйюп оГ ап апйдешс ерйоре Гог 1е1рег Т 1утр1юсу1ез Ггот сагстоетЬгуойс апйдеп. С1т. Сапсег Рез. 2002, 8:3219-3225., Сщайс, 8., Ό. А(апаскоу1с, Е. 1адег, М. Маίзиο, А. 8е1уакитаг, Ν.Κ. АЙоткц Р.С. Мак1, В. Вирой, С. Р1йет, Υ.Τ. С1еп, А. Кпйй, апй Ь.1 О1й. 8игуеу оГ па1ига11у осситпд СИ4+ Т-се11 гезропзез адашз! ΝΥ-Β8Ο-1 ш сапсег райейз: Сотте1айоп \\ύ1ι апйЬойу гезропзез. Ргос. №111. Асай. 8сй И.8.А. 2003, 100 (15): 8862-7); СВ4+ Т-клетки могут приводить к локальному повышению уровня ΧΝγ (О1п Ζ., 8с11\уагйкорГГ 1., Ргайега Р., Каттейоепз Т, 8ейдег В., Рпсйет Н., В1апкепз1ет Т.; А спйса1 гес.|шгетей оГ йИегГегоп датта-тей1а(ей апдюз(аз1з Гог (итог ге)есйоп Ьу СВ8+ Т се11з; 1 Сапсег Рез; 2003, 63 (14): 4095-4100)

На моделях млекопитающих животных, например мышах, было показано, что даже при отсутствии эффекторных клеток цитотоксических Т-лимфоцитов (ЦТЛ) (т.е., СВ8-положительных Т-лимфоцитов), СВ4-положительных Т-клеток достаточно для ингибирующего проявления опухолей посредством ингибирования ангиогенеза при секреции интерферон-гамма (ΧΝγ) (Ойт Ζ. апй Т. В1апкепз(ет. СЭ4+ Т-се11теШйей (итоиг ге|ес(1оп туокез шЫЫйоп оГ апдюдепез1з Ша1 1з йерепйей оп ШИ датта гесерЮг ехргеззюп Ьу попйета(оро1ейс се11з. [ттипйу. 2000, 12: 677-686). К тому же было показано, что СЭ4положительные Т-клетки, распознающие пептиды из опухолеассоциированных антигенов, презентированные молекулами НЬА класса II, могут препятствовать опухолевой прогрессии посредством индукции ответов антител (АЬ) (Кеппейу, Р.С., М.Н. 8йеатет, А.М. νηΙΚ апй Р.К. ВпдЙ. 2003. СЭ4' Т 1утр1юсу1ез р1ау а сгШса1 го1е т апйЬойу ргойисйоп апй (итог йптипйу адатз! з1т1ап у|гиз 40 1агде (итог апйдеп. Сапсег Рез. 2003, 63:1040-1045). В отличие от опухолеассоциированных пептидов, связывающихся с молекулами НЬА класса I, до сих пор было описано лишь небольшое число лигандов класса II опухолеассоциированных антигенов (ююю.сапсепттипйу.отд, \\уу\у.зуГреН1п.йе).

Так как конститутивная экспрессия молекул НЬА класса II обычно ограничена клетками иммунной системы (Мас1, В., V. 8(е1т1е, Е. Ма^ί^ηеζ-8ο^^а, апй V. Рейй. Реди1айоп оГ МНС с1азз II депез: 1еззопз Ггот а й1зеазе. Аппи. Реу. Iттиηο1. 1996, 14: 301-331), то возможность изоляции пептидов класса II напрямую из первичных опухолей считалась невозможной. Тем не менее, изобретателям недавно удалось идентифицировать ряд эпитопов МНС класса II напрямую из опухолей (ЕР 1642905, ЕР 1760088; Оепд|е1 1, Иаз(ке М.И., СоийеГапдеаз С, СйзюиШз С., 8с1оог О., АкепЬетепй Р., Ми11ет М., Кгатег В., М1ззюи А, 8айет М., Неппеп1ойег 1., '№етпе( Ό., 8(е^1 А., Раттепзее Н.С., Кйпде1 К., 81еуапоу1с 8.; Ипехрейей аЬипйапсе оГ НЬА с1азз II ргезейей рер(1йез т рптагу гепа1 се11 сагсшотаз; С1т Сапсег Рез. 2006; 12:41634170).

При отсутствии воспаления экспрессия молекул МНС II класса преимущественно рестриктирована по клеткам иммунной системы, в особенности профессиональным антигенпрезентирующим клеткам

- 2 018457 (АПК), например моноцитам, образованным из моноцитов клеткам, макрофагам, дендритным клеткам. Неожиданным образом у пациентов с опухолевыми заболеваниями было обнаружено, что клетки опухолей экспрессируют молекулы МНС II класса (Эепд|е1 I., Ыак1ке Μ.Ό., СоийеГапдеак С., Сйкюиб1к С., 8сйоог О., Айепйегепб Р., Ми11ег Μ., Кгатег В., М1ккюи А., 8аи1ег Μ., Неппеи1ойег I., \Уегпе1 Ό., 81епх1 А., Ваттепкее Н.С., К1шде1 К., 81еуапоую 8.; ипехрес!еб айипбапсе оГ НЬА с1акк II ргекейеб рерббек ίη рптагу гепа1 се11 сагстотак; С1т Сапсег Век. 2006; 12:4163-4170)

Для того чтобы пептид инициировал (вызывал) клеточный иммунный ответ, он должен связываться с молекулой МНС. Этот процесс зависит от аллеля молекулы МНС и специфических полиморфизмов аминокислотной последовательности пептида. Пептиды, связывающиеся с МНС класса I, имеют обычно 8-10 аминокислотных остатков в длину и обычно содержат два консервативных остатка (якорь) в их последовательности, которые взаимодействуют с соответствующей связывающей бороздкой молекулы МНС. Таким образом, каждый аллель МНС имеет соединительный элемент, определяющий, какие пептиды могут специфически связываться со связывающей бороздкой (Ваттепкее НС, Васйтапп 1, 8!еуапоую 8. МНС йдапбк апб рерйбе тойГк. Ьапбек Вюкаепсе, И8А, 1997).

В зависящей от МНС I класса иммунной реакции пептиды не только должны быть в состоянии связываться с конкретными молекулами МНС I класса, экспрессируемыми опухолевыми клетками, но они также должны распознаваться Т-клетками, несущими Т-клеточные рецепторы (ТКР).

Антигены, которые распознаются опухолеспецифическими Т-лимфоцитами, то есть их эпитопами, могут быть молекулами, образованными из любого класса белков, таких как ферменты, рецепторы, факторы транскрипции и т.д. Кроме того, опухолеассоциированные антигены, например, могут быть представлены также только в опухолевых клетках, например, как продукты мутировавших генов. Другой важный класс опухолеассоциированных антигенов представлен тканеспецифическими антигенами, такими как антигены СТ (раковый тестикул), которые экспрессированы в различных видах опухолей и здоровой ткани семенника.

Были выявлены различные опухолеассоциированные антигены. Затем много усилий было потрачено на исследования по идентификации дополнительных опухолеассоциированных антигенов. Некоторые группы опухолеассоциированных антигенов, также именуемые в области техники как опухолеспецифические антигены, являются тканеспецифическими. Примеры включают, но не ограничиваются тирозиназой для меланомы, Р8А (простата-специфический антиген) и Р8МА (простата-специфический мембранный антиген) для рака простаты и хромосомными кроссоверами (транслокации), такими как йсг/ай1 в лимфоме. Тем не менее многие опухолеассоциированные антигены, которые были идентифицированы, встречаются во множестве видов опухолей, и некоторые, такие как онкогенные белки и/или генысупрессоры опухоли (обзор генов-супрессоров опухоли для почечного рака дается, например, у Ыпейап ^.М., ^аййег М.М., Ζ6ηγ В. Тйе депейс йак1к оГ сапсег оГ 1йе к1бпеу. 1 Иго1. 2003 Эес; 170 (6Р!1): 2163-72), которые фактически вызывают трансформационное явление, встречаются практически во всех видах опухолей. Например, нормальные клеточные белки, контролирующие рост и дифференциацию клетки, такие как р53 (который является примером гена-супрессора опухоли), гак, с-те1, тус, рВВ, УНЬ и НЕВ2/пеи, могут аккумулировать мутации, приводящие к повышенной экспрессии продуктов этих генов, делая их тем самым онкогенными (МсСайеу е! а1. Сапсег Векеагсй 1998 15:58 2601-5; ЭМк е! а1. С1йа Роипб. 8утр. 1994 187:198-211). Эти мутантные белки также могут быть мишенью опухолеспецифического иммунного ответа при многих видах рака.

Иммунотерапия больных раком направлена особенно на активацию клеток иммунной системы, в особенности, т.н. цитотоксических Т-клеток (ЦТЛ, также известные как киллерные клетки, известные также как СЭ8-положительные Т-клетки) против опухолевых клеток, но не против здоровой ткани. Опухолевые клетки отличаются от здоровых клеток экспрессией опухолеассоциированных белков. Молекулы НЬА презентируют наружу на клеточной поверхности клеточное содержимое, таким образом, давая возможность цитотоксическим Т-клеткам отличать здоровую клетку от опухолевой. Это происходит путем расщепления всех белков внутри клетки на короткие пептиды, которые присоединяются затем к молекулам НЬА и презентируются на клеточной поверхности (Ваттепкее, Н.С., Ра1к, К., апб Во1/ксйке, О.; Рерйбек па!ига11у ргекеп!еб йу МНС с1акк I то1еси1ек, Аппи. Веу. Iттиηо1., 1993, 11, 213-244). Пептиды, представленные на опухолевых клетках, а не или в намного меньшей степени на здоровых клетках организма, называются опухолеассоциированными пептидами (ТИМАРк).

Для того чтобы белки были узнаны цитотоксическими Т-лимфоцитами в качестве опухолеспецифического или ассоциированного антигена и чтобы они могли использоваться в терапии, должны выполняться особые предварительные требования. Антиген должен быть экспрессирован преимущественно опухолевыми клетками, а не здоровыми тканями или в сравнительно малом объеме. В дальнейшем желательно, чтобы соответствующий антиген не только присутствовал в каком-либо виде опухоли, но и также имел высокую концентрацию (т.е. число копий соответствующего пептида на клетку). Опухолеспецифические и опухолеассоциированные антигены часто бывают образованы из белков, напрямую задействованных в трансформации нормальной клетки в опухолевую, в связи с функцией, например, при контроле клеточного цикла или апоптозе. В дополнение также мишени белков нисходящего каскада реакций, напрямую являющихся причиной трансформации, могут быть представлены в повышенном количестве и,

- 3 018457 таким образом, косвенно опухолеассоциированными. Такие косвенно опухолеассоциированные антигены могут также быть мишенями вакцинационного подхода. В обоих случаях необходимо присутствие эпитопов в аминокислотной последовательности антигена, поскольку такой пептид (иммуногенный пептид), который образован из опухолеассоциированного антигена, должен вести ίη νίίτο или ίη νίνο к Т-клеточному ответу.

В основном, любой пептид, способный связываться с молекулой МНС, может выполнять функцию Т-клеточного эпитопа. Предварительным условием для индукции Т-клеточного ответа ίη νίίτο или ίη νίνο является присутствие Т-клетки с соответствующим ТКР и отсутствие толерантности к данному конкретному эпитопу. Т-хелперные клетки играют важную роль в управлении эффекторной функцией ЦТЛ в противоопухолевом иммунитете. Эпитопы Т-хелперных клеток, инициирующие ответы Т-хелперных клеток типа ТН1, поддерживают эффекторные функции СЭ8-положительных киллерных Т-клеток, которые включают цитотоксические функции, направленные против опухолевых клеток, проявляющих опухолеассоциированные пептиды/МНС-комплексы на их клеточной поверхности. Таким образом, опухолеассоциированные пептидные эпитопы Т-хелперных клеток, одни или в комбинации с другими опухолеассоциированными пептидами, могут служить в качестве активных фармацевтических ингредиентов вакцинных композиций, которые стимулируют противоопухолевые иммунные ответы.

Так как оба вида ответов, зависящие от СЭ8 и от СЭ4. вносят свой вклад в противоопухолевый эффект сообща и усиливая друг друга, то идентификация и характеристика опухолеассоциированных антигенов, распознаваемых как СЭ8+ ЦТЛ (молекула МНС I класса), так и СЭ4-положительными ЦТЛ (молекула МНС II класса) являются важными при разработке противоопухолевых вакцин. Поэтому целью настоящего изобретения является обеспечение композиций пептидов, которые содержат пептиды, связывающиеся с комплексами МНС любого класса.

Первые клинические испытания с использованием опухолеассоциированных пептидов были начаты в середине 1990 гг. Буном (Βοοη) и коллегами, в основном, для показания меланома. Клинические ответы в лучших попытках достигали от 10 до 30%. О серьезных побочных эффектах или сильной аутоиммунности не сообщалось ни в одном клиническом исследовании с использованием основанной на пептидах вакцинной монотерапии. Сообщалось о слабых формах витилиго у некоторых пациентов, проходивших лечение меланома-ассоциированными пептидами.

Тем не менее прайминга одного вида ЦТЛ обычно не достаточно для устранения всех опухолевых клеток. Опухоли обладают сильной мутагенностью и, таким образом, способны быстро реагировать на атаки ЦТЛ изменением своей белковой структуры для избегания узнавания ЦТЛ. Для контратаки по механизмам уклонения опухоли от ударов для вакцинации использовались различные специфические пептиды. Таким способом по опухоли могла быть произведена одновременная атака несколькими клонами ЦТЛ, действовавшим синхронно. Так могут быть снижены шансы опухоли на ускользание от иммунного ответа. Эта гипотеза недавно получила подтверждение в клиническом исследовании по лечению пациентов с меланомой на поздней стадии. С всего лишь несколькими исключениями пациенты, имевшие по меньшей мере три различных Т-клеточных ответа, демонстрировали объективные клинические ответы или стабильность заболевания (Вапсйегеаи, 1., Ра1иска, А.К., Э^Тарка^ Μ., Вш-кеШТет, 8., Тасщей Ν., Βο11ηπΤ, А., Тасщей 8., Εος^ιγ, 8., ΧνίίίΒοχνδΒί, К.М., ВйагТта), Ν., Рше1го, Ь., 8ίе^ηтаη, В. апТ Рау, 1.; Iттиηе апТ с11П1сл1 Γοφοηδοδ ίη райепй \νί11ι теИМайс теИтта ίο СЭ34(+) ρΐΌβοηίΙοΓ-άοπνοά ТепТпНс се11 гассше, Сапсег Ве8., 2001, 61, 6451-6458), а также увеличение выживаемости (личные беседы с 1. Вапсйегеаи), в то время как подавляющему большинству пациентов, имевшему менее трех Т-клеточных ответов, был поставлен диагноз прогрессирования заболевания.

Исследование кандидатов демонстрировало похожий эффект, если пациенты, страдавшие от почечно-клеточной карциномы, проходили курс лечения с вакциной, составленной из 13 различных пептидов (Н. 8шдй-1а8н)а, 8. ^а11ег, Т. ХМетзсНепк, А. Мауег, Р. Υ. 01е1г1сН, М. А. 8ίеηζ1, 8. 8ίеνаηον^с, Н.

Ваттепкее, 1. Ргйсй; ^π^ύοη οί Т-се11 κφοη^, с1йпса1 асйуЦу апТ гещ.11аЮгу Т-се11 1сус15 ίη гепа1 се11 сагсйюта райепй 1геа1еТ \νίΐ1ι 1МА901, а ηονе1 тиШ-рерйТе гассше; А8СО Меейпр 2007 Ρο^γ # 3017; М. 8Ηκ1ιΕγ А. 8ίеηζ1, Р. Υ. 01е1г1с11, Т. Ещеп, А. НаТегкатр, 1. Веск, А. Мауег, 8. ХУаНет Н. 8шдй, 1. Ргкск С. С. 811еГ; Ап οреη 1аЬе1 5й.1Ту ίο еνа1иаίе Ше 5аГе1у апТ ^ттиηοдеη^с^ίу οί Ше рерйТе ЬазеТ сапсег уассше 1МА901, А8СО тееппу 2007; ΡοδίβΓ #3017).

Основной задачей в разработке вакцины против опухолей является, поэтому, не только идентификация и характеристика новых опухолеассоциированных антигенов и полученных из них иммуногенных Т-хелперных эпитопов, но и комбинирование различных эпитопов для увеличения вероятности ответа на более чем один эпитоп для каждого пациента. Поэтому целью настоящего изобретения является обеспечение комбинаций аминокислотных последовательностей таких пептидов, которые обладают способностью связываться с молекулой главного комплекса гистосовместимости человека (МНС) класса I (НЬА класса I) или II (НЬА класса II). Дальнейшей целью настоящего изобретения является обеспечение эффективной противораковой вакцины, которая основана на комбинации этих пептидов.

В настоящем изобретении изобретатели изолировали и охарактеризовали пептиды, связывающиеся с молекулами НЬА класса I или II, напрямую из опухолей млекопитающих, т.е. колоректальных карцином.

- 4 018457

Настоящее изобретение обеспечивает пептиды, которые образованы из антигенов, ассоциированных с генезом опухоли, и имеют способность связываться в достаточной мере с молекулами МНС (НЬА) II класса для инициации иммунного ответа человеческих лейкоцитов, в особенности лимфоцитов, в особенности Т-лимфоцитов, в особенности СО4-положительных Т-лимфоцитов, в особенности СЭ4положительных Т-лимфоцитов, опосредующих иммунные ответы типа Т_Н1.

Настоящее изобретение обеспечивает также пептиды, которые образованы из антигенов, ассоциированных с генезом опухоли, и имеют способность связываться в достаточной мере с молекулами МНС (НЬА) I класса для инициации иммунного ответа человеческих лейкоцитов, в особенности лимфоцитов, в особенности Т-лимфоцитов, в особенности СО8-положительных цитотоксических Т-лимфоцитов, в равной степени как и комбинации обоих, которые особенно полезны для вакцинации пациентов, страдающих от рака.

В соответствии с настоящим изобретением поставленная задача решена обеспечением фармацевтической композиции, включающей по крайней мере два пептида, содержащих аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из 8ЕС ΙΌ № 1 по 8ЕС ΙΌ № 7, и/или содержащих вариантную аминокислотную последовательность, которая по крайней мере на 80% гомологична последовательностям с 8ЕС ΙΌ № 1 по 8ЕС ΙΌ № 7, и/или полинуклеотид, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую 8ЕС ΙΌ № 1 по 8ЕС ΙΌ № 7 или вариантную аминокислотную последовательность, и фармацевтически приемлемый носитель. Фармацевтические композиции по настоящему изобретению в дальнейшем могут включать по крайней мере один дополнительный пептид, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из 8ЕС ΙΌ № 8 по 8ЕС ΙΌ № 15, или содержащий вариантную аминокислотную последовательность, которая по крайней мере на 80% идентична последовательностям с 8ЕС ΙΌ № 8 по 8ЕС ΙΌ № 15, или полинуклеотид, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую 8ЕС ΙΌ № 8 по 8ЕС ΙΌ № 15 или вариантную аминокислотную последовательность. Пептиды могут иметь общую длину между 8 и 100, предпочтительно между 8 и 30 и особенно предпочтительно между 8 и 16 аминокислотами. Пептиды могут также иметь непептидные связи.

Как будет описано далее, пептиды, формирующие основу настоящего изобретения, были все идентифицированы как презентируемые несущими клетками МНС Ι или ΙΙ класса. Таким образом, эти конкретные пептиды так же, как и другие пептиды, содержащие данную последовательность (т.е. дериваты пептидов), все вызывают специфический Т-клеточный ответ, хотя уровень, до которого такой ответ будет простимулирован, может варьироваться между отдельными пептидами и отдельными пациентами. Различия, например, могут быть вызваны мутациями в пептидах. Специалист данной области полностью осведомлен о способах, которые могут использоваться для определения силы, с которой был индуцирован ответ каждым отдельным пептидом, в частности, благодаря ссылкам на приведенные здесь примеры и соответствующую литературу.

Предпочтительным образом, варианты по изобретению будут индуцировать Т-клеточную перекрестную реакцию с соответствующим пептидом по изобретению.

Процентная доля гомологии между аминокислотной последовательностью пептида или последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей пептид, и вариантом может быть подсчитана с помощью алгоритмов, хорошо известных из уровня техники. В настоящем изобретении термин гомологичный относится к степени идентичности между последовательностями двух аминокислотных последовательностей, т.е. пептидных или полипептидных последовательностей. Упомянутая ранее гомология определяется при сравнении двух последовательностей, сопоставляемых в оптимальных условиях со сравниваемыми последовательностями. Сравниваемые здесь аминокислотные или нуклеино-кислотные последовательности могут иметь дополнение или делецию (например, разрыв и т.п.) в оптимальном противопоставлении двух последовательностей. Такая гомология последовательности может быть подсчитана с помощью создания противопоставления, например по алгоритму С1и81а1\У (Νιιοίοίο Ас1б Век., 22(22): 4673 4680 (1994). Также может быть использовано широко распространенное программное обеспечение для анализа последовательностей, в частности УееЮг ΝΤΙ, ΟΕΝΕΤΎΧ или аналитические инструменты, предоставляемые общественными банками данных, такие как, например, Ьйр://гек1оо1к.кбкс.еби/Ыо1оо1к/Ыо1оо1к16.Ыт1.

Фармацевтически приемлемые носители хорошо известны и обычно представляют собой жидкости, в которых приготавливается активное терапевтическое вещество. Носитель обычно не обеспечивает состав никакой фармакологической активностью, хотя он может обеспечивать химическую и/или биологическую стабильность, характеристики высвобождения и т.п. Примеры составов рассматриваются, например, у АНоико В. Сеииато. Ветшдои: Тйе 8с1еисе апб Ртасйсе оГ Рйаттасу, 20ιΗ Ебйюп. ВаШтоте, ΜΌ: Мрртсой ^бйатк & ХУПктк, 2000 и включают, но не ограничиваются, раствором натрия хлорида, водой, буферной водой, 0,3% глицином, гиалуроновой кислотой, декстрозой и т.п. Недавно было обнаружено, что определенные жировые эмульсии, которые в течение многих лет использовались для внутривенного питания пациентов (людей), могут также выступать в роли наполнителя для пептидов. Два примера таких эмульсий представляют собой имеющиеся в продаже жировые эмульсии, известные как Интралипид Дийайрхб) и Липофундин (ЫроГиибт). 'Чп1гаНр1б является зарегистрированной торговой маркой фирмы КаЫ Рйаттааа, Швеция, для жировой эмульсии для внутривенного питания и описывается в

- 5 018457 патенте США И.8. Рак Νο. 3169094. ЫроГилбт - это зарегистрированная торговая марка фирмы В. Вгаип Ме1киидеи, Германия. Обе эмульсии в качестве жира содержат масло соевых бобов (100 или 200 г на 1000 мл дистиллированной воды: 10% или 20%, соответственно). Фосфолипиды яичного желтка используются в качестве эмульгатора в Интралипиде (12 г/л дистиллированной воды) и лецитин яичного желтка - в Липофундине (12 г/л дистиллированной воды). Изотоничность является результатом добавления глицерола (25 г/л) как в Интралипид, так и в Липофундин.

Пептиды образованы из опухолеассоциированных антигенов, в особенности опухолеассоциированных антигенов с функциями, например, в протеолизе, ангиогенезе, росте клеток, регуляции клеточного цикла, делении клеток, регуляции транскрипции, регуляции трансляции, инвазии ткани и т.д. В табл. 1 представлены пептиды и функция белка, из которого они образованы.

Таблица 1. Пептиды настоящего изобретения и функция материнского белка

8ЕО Ю№	Ιϋ пептида	Последовательность	Символ гена	Функция	связывается с МНС
1	С20-001	АЪВИЬЕУТЬ	С20ог£42	задействован в присоединении актинового цитоскелета к ЕСМ	НЬА-А*02
2	ΝΟΧ-001	1ЬАРУ1ЬУ1	ΝΟΧ1	ΝΑ13ΡΗ-оксидаза	НЬА-А*02
3	ΟϋΟΟΟΙ	1ЬООК1ЫЕУ	0ΌΟ1	Орнитин- де карбоксилаза	НЬА-А*02
4	РСЙ-001	КЬМОЮТЕОЬ	ΡΟΝΑ	вспомогательный белок ДНКполимеразы дельта	НЬА-А*02
5	ТСРВ1- 001	АЬЕУРЬЬАЬА	ΤΟΡΒΙ	трансформирующий фактор роста, бетаиндуцированный	НЬА-А*02
6	тор-001	К1ЕОЕ11ЛША	ТОР2А/ТОР2В	топоизомераза	НЬА-А*02
7	ТСЕВ1- 004	ТРРШАНТЕШЬЬНМН	ΤΟΡΒΙ	трансформирующий фактор роста, бета- ин дуциро ванный	НЬА-ϋΚ

Открытая рамка считывания 42 хромосомы 20

С20огГ42 является белком фокальной адгезии, задействованным в присоединении актинового цитоскелета к плазменной мембране и в опосредованных интегрином клеточных процессах. Дефицит С20огГ42 как результат мутаций с потерей функции приводит к синдрому Киндлера. аутосомальному рецессивному генодерматозу, характеризующемуся образованием волдырей на коже, прогрессивной атрофией кожи, светочувствительностью и, изредка, к канцерогенезу (Негх. С., АитаШеу, М., 8сйийе, С., 8сй1о1хег-8сйгейагбГ и., Вгискпег-Тибегтап, Ь., апб Нак, С.; Κίη61ίη-1 1к а рйокрйоргоШп шуокеб ίη гедиΙαΙίοη о! ро1аг11у, рго11Гсга(1оп, апб то(1П(у о! ер1бегта1 кегайиосу1ек, 1 Вю1 Сйет., 2006, 281, 36082-36090). Недавно сообщалось о серьезном поражении желудочно-кишечного тракта с гемоколитом у пациента с мутацией с потерей функции (8аб1ег, Е., К1аикеддег, А., Микк, ПеткЬегдег, и., Рой1а-ОиЬо, О., Ьатег, М, Еапксйиейег, С., Ваиег, 1.^., апб НтШег, Н.; №че1 ΚΙΝΏ1 деие ши1айои ίη К1иб1ег куибготе \\йй кеуеге дак1го1п(ек(1па11гас( туокетепГ Агсй ОегтаЮк 2006, 142, 1619-1624).

В контексте раковых заболеваний С20огГ42 описывался в исследованиях, занимающихся изучением экспрессии генов в окружении, имеющем отношение к раку. Как было обнаружено, он был гиперэкспрессирован в 70% случаев рака толстой кишки и 60% случаев рака легких (и = 10). Нормальная тканевая экспрессия при нозерн-блоттинге (№г1йегп В1о1) была ограничена нейромышечными тканями (^е1пк1ет, ЕЛ., Воигиег, М., Неаб, В., 2акей, Н., Ваиег, С., апб МаххагеПа, В.; ИВР1: а тетЬег оГ а иоуе1 Гатбу оГ РН апб ЕЕВМ ботат-соп1аттд тетЬгапе-аккос1а1еб рго1ешк ίκ йдшйсаийу оуег-ехргеккеб т 1иид апб со1ои сагстотак, ВюсШт Вюрйук. Ас1а, 2003, 1637, 207-216). Кроме того, С20огГ42 был идентифицирован как ген, участвующий в ΤΟΕ-β-опосредованной клеточной миграции и опухолевой инвазии (К1оекег, 8., Ма|ог, М.В., Са1бегоооб, Э.А., ОткЬегд, М.Н., 1оиек, Э.А. аиб Вескег1е, М.С.; Тйе К1иб1ег куибготе рго1ет 1к геди1а1еб Ьу йаикГогттд дго\\1й Гас1ог-Ье1а аиб туокеб т йИедпп-теб1а1еб абйекюи, 1 Вю1 Сйет , 2004, 279, 6824-6833).

ΝΑϋΡΗ-оксидазы гомолог-1 (N0X1)

N0X1 является чувствительным к факторам роста ферментом, который катализирует образование

- 6 018457 реактивных форм кислорода, высшего оксида (О₂.) и перекиси водорода (Н2О2). Его экспрессия была первоначально выявлена в толстой кишке, простате, матке и пролиферирующих васкулярных гладкомышечных клетках (8ий, Υ. А. с1 а1. Се11 [гапкГогтаЬоп Ьу (йе кирегох1бе-депегайпд ох1баке Νοχί. №11игс 1999, 401, 79-82). Его экспрессия связана с рядом биологических реакций, включая клеточную пролиферацию, ангиогенез и активацию клеточных сигнальных путей (Нагрег, В. У., Хи, С, 8оисек, К., 8еЬабг Н. апб Е1кепсй, ЕР. А геаррга1ка1 оГ 1йе депотк огдашхайоп оГ йитап Νοχί апб йк кр11се уапапК Агсй, Βίοсйет. Вюрйук. 2005, 435, 323-330).

N0X1 высоко экспрессирован в толстой кишке, но его функция в кишечной физиологии или патологии до сих пор плохо изучена. В нормальных тканях экспрессия N0X1 была низкой в подвздошной кишке, средней в восходящей ободочной кишке и высокой в нисходящей ободочной кишке. Статистических различий по экспрессии N0X1 не наблюдалось между пробами, взятыми из аденом, хорошо или плохо дифференцированных аденокарцином толстой кишки. N0X1 был высоко экспрессирован в эпителиальных клетках толстой кишки, как в криптах, так и на люминальной поверхности. В заключение, N0X1 является ферментом, который конститутивно экспрессирован в эпителии толстой кишки и не ассоциирован напрямую с генезом опухоли (8/апВ, I. е1 а1. Ехртеккюп оГ N0X1, а кирегох1бе-депега1тд NА^РН ох1баке, т со1оп сапсег апб тГ1атта1огу Ьо\\е1 б1кеаке. 1 Ра1йо1. 2005, 207, 164-176).

Иммуногистохимия показала, что N0X1 был конститутивно экспрессирован в поверхности слизистых клеток. Аденомы и хорошо дифференцированные аденокарциномы повышали уровень экспрессии N0X1. Ядерный фактор (№)-карраВ был преимущественно активирован в клетках аденомы и аденокарциномы, экспрессирующих в избытке N0X1, приводя к предположению, что N0X1 может стимулировать NΕ-карраΒ-зависимые антиапоптотические каскады реакций в опухолях толстой кишки (Еикиуата, М. е1 а1. 0уегехргеккюп оГ а поуе1 кирегох1бе-ргобистд епхуте, NА^РН ох1баке 1, т абепота апб \\е11 б1ГГегепШЦеб абепосагстота оГ 1йе йитап со1оп. Сапсег йен. 2005, 221, 97-104).

Сигнальные реакции с Уп13а/Ье1а-кагенином, как было описано, индуцируют экспрессию N0X1 (Ре1горои1ок, Н. & 8кег|апс, I. 8. Ве1а-са1ешп 1к еккепИа1 апб киГВВШ Гог кке1е1а1 туодепекВ т Р19 се11к. 1 Вю1 Сйет. 2002, 277, 15393-15399).

Недавно предполагалось, что реактивные формы кислорода индуцируют эндотелиальный апоптоз, который впоследствии индуцирует экспрессию различных адгезивных молекул для опухолевых клеток. Это указывает на то, что при остановке выделения В08 (активные формы кислорода) препятствование рецидиву опухоли на отдаленных участках может быть обоснованным (Теп, К.М., уап бег Уа1, ТВ., 81ийет, У., НоДапб, ЬЭ., 1ееке1, 1., 8оппеуе1б, Р. апб уап Еуск, С.Н.; Тйе го1е оГ кирегох1бе апюпк ш (йе беуе1ортеп1 оГ б1к!ап( 1итоиг гесиггепсе, 2006, Вг. 1 Сапсег).

Орнитин-декарбоксилаза 1 (ОБС1)

0ИС1 - это ограничивающий количество фермент при реакциях биосинтеза полиаминов, который катализирует орнитин в путресцин. Уровень активности фермента варьируется в зависимости от способствующих росту стимулов и проявляет высокую интенсивность обмена веществ по сравнению с другими белками млекопитающих.

Метаболизм полиаминов является неотъемлемым компонентом механизма канцерогенеза в эпителиальных тканях. Увеличения 0ИС1 часто ассоциируются с началом роста нормальных клеток и с продолжительным ростом опухолевых клеток. Ингибиторы 0ИС1 подавляют образование опухоли в экспериментальных моделях канцерогенеза мочевого пузыря, груди, толстой кишки и кожи. Г иперэкспрессия активности 0ИС1 - это хорошо известная черта многих видов рака, и 0ИС1 считался протоонкогеном (Аиутеп, М., Раактеп, А., Апбегккоп, Ь.С. апб Но1йа, Е. 0гпййте бесагЬоху1аке асИм11у 1к сг111са1 Гог се11 ВапкГогтайоп. №11иге 1992, 360, 355-358).

Мутации в линиях гоноцитов в гене аденоматозного полипоза толстой кишки (АРС) являются одной из наиболее явно выраженных наследственных предрасположенностей к раку толстой кишки. Мутации АРС вызывают значительное увеличение уровней свободного β-катенина, который перемещается в ядро, где формирует комплекс с членами семейства лимфоидно-усиливающих факторов (ЬЕЕ)/Тклеточных факторов (ТсГ) последовательность-специфических факторов транскрипции. Онкоген с-тус является одним из генов-мишеней ТсГ (Не, Т.С. е1 а1. 1беп(1Г1са(1оп оГ с-МΥС ак а 1агде( оГ 1йе АРС ра1й\гау 8с1епсе 281, 1509-1512 (1998). с-Мус РНК и белок гиперэкспрессированы как на ранних, так и на поздних стадиях онкогенеза колоректального рака). 0ЭС является геном-мишенью с-Мус.

Потеря функции АРС приводит к увеличению количества 0ЭС1 (бегпег, Е.У. апб Меуккепк, Е.Ь., 1т., Ро1уаттек апб сапсег: о1б то1еси1ек, пе\\' ипбегкйпбтд, №1. Веу. Сапсег, 2004, 4, 781-792), и гиперэкспрессия наблюдается часто при колоректальной карциноме (Ни, Н. Υ. е1 а1. 0гпййте бесагЬоху1аке депе 1к оуетехргеккеб ш со1огес1а1 сагстота, Уог1б ί. Сак1гоеп1его1. 2005, 11, 2244-2248; Кйайага, 0. е1 а1. АПегаПопк оГ депе ехртеккюп биттд со1огес1а1 сагстодепекВ теуеа1еб Ьу с^NА тВгоаггаук айет 1акегсарШге тВгоб1ккесйоп оГ (итог Пккиек апб погта1 ерййейа; Сапсег Век. 2001, 61, 3544-3549; №то1о, Т., КиЬо!а, 8., 1кй1ба, Н., Мита1а, N. апб НакЫтоШ, Ό. 0гпййте бесагЬоху1аке, тйодеп-асйуа1еб ргокш ктаке апб тайгх те1а11орго1ешаке-2 ехргеккюпк т йитап со1оп Штогк. Уог1б ί. Сак1гоеп1его1. 2005, 11, 30653069).

0ЭС1 обладает про-ангиогенными свойствами, действуя в качестве супрессора эндостатина

- 7 018457 (Истою. Т., Ноп. Η., Υοκίιίιηοίο. М., 8еуата, Υ. & КиЬо!а, 8. Оуегехргеккюп о! огпккте йесагЬоху1аке епкапсек епйо(кеНа1 ргокТегайоп Ьу кирргеккшд епйок(йш ехргеккюп. В1оой 2002, 99, 1478-1481).

Инфекция клеточной линии НТ-29 КРР аденовирусом, кодирующим антисмысловую РНК для ОЭС1 и 8-аденосилметионин декарбоксилазу (другой важный фермент при реакциях биосинтеза полиаминов), приводит к снижению уровня ССИЭ1 и блокировке клеточного цикла. Более того, ядерная транслокация бета-катенина была также ингибирована (6опд, Ь., Лапд, С., 2капд, В., Ни, Н., Мапд, М. апй Ьт, X.; Айепоу1гик-тей1а1ей Ехргеккюп о! Во(к Апйкепке ОгпйЫпе ИесагЬоху1аке апй 8айепоку1те(кюшпе ИесагЬоху1аке 1пйисек 6(1) Аггек! ш НТ-29 Се11к, 1 Вюскет. Мо1. Вю1, 2006, 39, 730736). Аденовирус индуцировал также регрессию опухоли уже сформировавшихся опухолей у голых мышей (2капд, В., Ьт, Х.Х., 2капд, Υ., Лапд, СА/, Ни, Η.Υ., 6опд, Ь., Ьт, М. апй Тепд, О.8.; Ро1уатте йер1е11оп Ьу ОЭС-АйоМе(ЭС апйкепке айепоуиик трайк китап со1огес!а1 сапсег дготе(к апй шуакюп ш уйго апй ш угуо, 2006, 1 6епе Мей, 8, 980-989).

Специфическим и необратимо действующим ингибитором ОЭС1 является 2-дифторметилорнитин (ЭМЕО, Ейогпййпе (8апой-Ауепйк)). Он применяется для лечения сонной болезни (вызываемой трипаносомами) и является активным ингредиентом крема для удаления волос Уапй|а.

Что касается раковых заболеваний, ОМРО широко использовался в преклинических моделях и проявил многообещающие антиопухолевые эффекты при снижении уровней полиамина (Оетег, ЕМ апй Меуккепк, ЕЬ, 1г.; Ро1уаттек апй сапсег: о1й то1еси1ек, пете ипйегкйпйшд, Иа(. Вес. Сапсег, 2004, 4, 781792). Клинические исследования проводились для нескольких видов рака, и некоторые реализуются сейчас для КРР. Однако данные исследования представляют собой, в основном, комбинированные подходы, проводящиеся в профилактических целях для пациентов, особенно восприимчивых к КРР (аденоматозные полипы). Иммуногенный ОЭС-пептид ОЭС-001 был идентифицирован ранее (М. Э1ек1, РЮ Ткекй, Итуегкйу о! ТиЬшдеп, 1998)

Ядерный антиген пролиферирующих клеток (РСИА)

РСИА был обнаружен в ядре и является ко-фактором ДНК-полимеразы дельта. Кодируемый белок выступает в качестве гомотримера и помогает увеличить процессивность синтеза ведущей нити во время репликации ДНК. Поэтому он экспрессирован во всех пролиферирующих клетках, в особенности опухолевых клетках, и используется в качестве маркера для детекции пролиферации.

Индексы пролиферации в неопластической и смежной нормальной слизистой оболочке, как установлено при иммуногистохимическом анализе РСИА, на протяжении долгого времени известны как независимые прогностические факторы рецидива и низкой выживаемости пациентов с колоректальным раком (а1-8кепеЬег, 1.Е., 8к1Ьа!а, Н.В., 8атра1й, 1. апй 1о1ку, 8.; Ргодпокйс ыдшйсапсе о! ргоНТегайпд се11 пис1еаг апйдеп ехргеккюп ш со1огес!а1 сапсег, Сапсег, 1993, 71, 1954-1959; Мауег, А., Такто(о, М., ΕγιΙζ, Е., 8ске11апйег, 6., Койег, К. апй Ьийте1д, Н.; Тке ргодпокйс кщтПсапсе о! ргок!егайпд се11 пис1еаг апйдеп, ер1йегта1 дготе(к ГасЮг гесерЮг, апй тйг депе ехргеккюп ш со1огес!а1 сапсег, Сапсег, 1993, 71, 2454-2460; Иакатига, Т., ТаЬисЫ, Υ., Иакае, 8., Окпо, М. апй 8айок, Υ.; 8егит сагстоетЬгуойс апйдеп 1есе1к апй ргок!егайпд се11 пис1еаг апйдеп 1аЬекпд шйех !ог райейк тейк со1огес!а1 сагсшота. Согге1айоп тейк (итог ргодгеккюп апй 8ШУ1уа1, Сапсег, 1996, 77, 1741-1746)

ДНК-топоизомераза II (ТОР2)

ТОР2А и ТОР2В кодируют изоформы ДНК-топоизомеразы, фермента, который контролирует и меняет топологическое состояние ДНК во время транскрипции. Данный ядерный фермент задействован в таких процессах, как конденсация хромосом, сепарация хроматид и снятие торсионного напряжения, которое возникает во время транскрипции и репликации ДНК. Он катализирует временный разрыв и воссоединение двух нитей дуплекса ДНК, который позволяет нитям пройти сквозь друг друга, меняя тем самым топологию ДНК. Две изоформы данного фермента существуют, как предполагается, как продукты явления дупликации гена. Ген, кодирующий альфа-форму, локализован в хромосоме 17, а бета-ген локализован в хромосоме 3.

ТОР2А является мишенью для нескольких противораковых агентов, а ряд мутаций в этом гене были ассоциированы с развитием резистентности к лекарственным средствам.

Ген ТОР2А расположен смежно с онкогеном НЕВ-2, наиболее часто амплифицируемым онкогеном при раке груди, на хромосомной локализации 17с|12-с|2Е и либо амплифицирован, либо делетирован, с одинаковой частотой, в почти 90% случаев первичных опухолей груди с амплификацией НЕВ-2 (1агу1пеп, Т.А. апй Ьт, Е.Т.; Торойотегаке 11а1рка депе (ТОР2А) атрййсайоп апй йе1е(юп ш сапсег-тоге соттоп (кап апйс1ра(ей, Су(ора(ко1оду, 14, 309-313). Более того, об амплификациях ТОР2А сообщалось и в связи с другими видами рака. Недавние экспериментальные, а также многочисленные, крупные, мультицентровые клинические исследования позволяют сделать предположение, что амплификация (и/или делеция) ТОР2А может сказываться как в чувствительности, так и резистентности к используемым обычно цитотоксическим лекарственным препаратам, т.е. ингибиторам топоизомеразы-ΙΙ (антрациклины и т.д. Ке11пег, и., 8екек!ей, М, 1епкеп, Р.В., 61еке1ег, Е. апй Вийо1рк, Р.; Си1ргй апй учсНт - ЭИА (оройотегаке II, Ьапсе! Опсо1, 2002, 3, 235-243), в зависимости от специфического генетического дефекта на локусе ТОР2А (.Тагушеп, Т.А. апй Ьт, Е.Т.; 8ти1(апеоик атркйсайоп о! НЕВ-2 (ЕВВВ2) апй (оройотегаке II а1рка (ТОР2А) депек-то1еси1аг Ьакй !ог сотЫпайоп скето(кегару ш сапсег, Сигг. Сапсег Эгид Таг

- 8 018457 дей, 2006, 6, 579-602).

Без ТОР2А невозможны репликация ДНК и деление клетки. Поэтому он стал основной мишенью многих лечебных схем при лечении опухолей, хотя точный механизм уничтожения клеток остается неясным (Ке11пег, и., 8ейек1ей, М., 1еикеи, Р.В., С1еке1ег, Р. аий Вийо1рй, Р.; Си1ртй аий νίοΐίιη - ΌΝΑ ΐοροίκοтегаке II, Ьаиее! Оисо1, 2002, 3, 235-243). Успех данного подхода ограничивается возникновением спонтанной резистентности, и индуцированное медикаментами повреждение ДНК может увеличить злокачественность.

Внимание исследований рака не было в такой степени сконцентрировано на ТОР2В, втором потенциальном белковом источнике для ТОР-001, потому что он находится в хромосомном регионе (3р24), известном по частой амплификации при опухолях. Однако ТОР2В по первичной структуре сходен с ТОР2А и имеет практически идентичные каталитические свойства (Ьеоийои, С., Б1дй1оМетк, В., Баксу, БН. аий АикИи, С.А.; Кшейс аиа1ук1к оГ йитаи 1оро1котетаке Па1рйа аий Ье1а ΌΝΑ Ьшйшд Ьу кигГасе р1актои гекоиаисе, ЕЕВ8 Бей., 2003, 554, 206-210). В другом исследовании было показано, что обе изоформы могут заменять друг друга (8акадисй1, А. аий К1кисЫ, А.; ЕипсЦошй сотрайЬййу Ье1^ееи 1коГогт а1рйа аий Ье1а оГ 1уре II ΌΝΑ 1оро1котегаке, I Се11 8с1., 2004, 117, 1047-1054).

В настоящем изобретении изобретатели обеспечивают неопровержимую очевидность того, что опухолеассоциированные пептиды, в достаточной мере связывающиеся с молекулами НБА I класса, способны вызывать иммунные ответы, опосредованные СЭ8-положительными цитотоксическими Тлимфоцитами человека, демонстрируя также, что заявленные пептиды пригодны для инициации ответов человеческой иммунной системы против выбранных пептидов пептидомы опухолевых клеток.

Аналогично было обнаружено, что опухолеассоциированные пептиды, в достаточной мере связывающиеся с молекулами НБА II класса, в особенности с такими аллелями НБА II класса, которые генетически закодированы локусом НБА ЭР человеческого генома, способны вызывать иммунные ответы, опосредованные СЭ4-положительными Т-клетками человека. СЭ4-положительные Т-клетки были изолированы из периферической крови человека, демонстрируя, что заявленные пептиды пригодны для инициации Т-клеточных ответов человеческой иммунной системы против выбранных пептидов пептидомы опухолевых клеток. Как поясняется далее на примере с пептидом из ΤСЕВI-004, этот связывающийся с НБА-ЭВ опухолеассоциированный пептид, как было обнаружено, распознается СЭ4положительными Т-клетками.

Так как пептиды могут быть синтезированы химическим путем и могут быть использованы в качестве активных фармацевтических ингредиентов в фармацевтических препаратах, то пептиды, обеспечиваемые настоящим изобретением, могут быть использованы для иммунотерапии, предпочтительно для иммунотерапии рака.

В другом аспекте фармацевтическая композиция в дальнейшем включает по крайней мере один дополнительный пептид, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из 8ЕО Ш № 8 по 8ЕО Ш № 15 или содержащий вариантную аминокислотную последовательность, которая по крайней мере на 80% гомологична последовательностям с 8ЕО Ш № 8 по 8ЕО Ш № 15, или полинуклеотид, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую 8ЕО Ш № 8 по 8ЕО Ш № 15 или вариантную аминокислотную последовательность. Пептиды с 8ЕО Ш № 8 по 8ЕО Ш № 13 и 15 являются иммуногенными пептидами, идентифицированными ранее, и связываются с молекулами МНС I класса и МНС II класса (см. табл. 2).

Было показано, что данные пептиды вызывают Т-клеточные ответы ш у1уо у пациентов, страдающих от почечно-клеточной карциномы (ПКК) (Н. 8шдй-1аки)а, 8. Уайет, Т. Уешксйеик, А. Мауег, Р. Υ. О|е1пс11, М. 81аей1ет, А. 8ΐеηζ1, 8. 81еуаиоу1с, Н. Ваттеикее, I. Епксй; Согге1айои оГ Т-се11 гекроике, с1йиса1 асйуйу аий теди1а1оту Т-се11 1еуе1к ш геиа1 се11 сатсшота райейк йеа1ей \\йй ГМА901, а иоуе1 тиШ-рерййе уассше; А8СО Меейид 2007 Рок1ег # 3017; М. 81аей1ет, А. 8ΐеηζ1, Р. Υ. О|е1пс11, Т. Е1кеи, А. НаГегкатр, I. Веск, А. Мауег, 8. Уайет, Н. 8шдй, I. Епксй, С. С. 8йеГ; Аи ореи 1аЬе1 к1ийу 1о еуа1иа1е 1йе каГе!у аий 1ттииодейсйу оГ 1йе рерййе Ьакей саисег уассше ГМА901, А8СО теейид 2007; Рок1ег # 3017). Так как материнские белки гиперэкспрессированы не только в ПКК, но и также в КРР и других видах рака, эти пептиды полезны также в вакцинах для лечения опухолей других видов, в частности в вакцинах против КРР.

- 9 018457

Таблица 2. Дополнительные иммуногенные пептиды, полезные для композиции по изобретению

№ послед -ТИ	ΙΟ пептида	Последовательность	Символ гена	функция	Связывает 2Я с МНС
8	СЕА-006	3Ρ0Υ3ΗΚΙΝΟΙΡ<2ΩΗΤ	СЕАСАМ5	(арциномоэмбриональ- 1	(ЬА-ϋΚ
				ный антиген
9	ССЙ-001	ЫЮАТСМГУ	ССЫВ1	Циклин Ώ1	НЬА-А*02
10	мис-οοι	ЗТАРРУНМУ	мисг	Муцин 1	НЬА-А*02
11	(4МР-001	30РО1КС10КЬУСККЗ	ММР7	Металлопротеиназа 7	НЬА-ϋΕ
12	СЕА-005	УЬЗСАПЬЙЪ	СЕАСАМ5	Вариант пептида СЕА	НЬА-А*02
13	МЕТ-001	ΥνΟΡνίΤΞΙ	МЕТ	Протоонкоген МеЬ	НЬА-А*02
14	(НВУ- 001}	ГЬРЗОЕЕРЗУ		Контрольный пептид
15	СЕА-004	УЬЗСАНЬЫЬ	СЕАСАМ5	Пептид СЕА	НЬА-А*02

Карциномоэмбриональная, родственная антигену молекула клеточной адгезии 5

Карциномоэмбриональный антиген (СЕА = СЕАСАМ5), 180 кДа, является обильно гликозилированным мембранным белком, состоящим из трех С2 1д-подобных повторяющихся звеньев, примыкающих к Ν-концевому 1д У-подобному участку и С-концевому участку, который включает участок сцепления гликофосфатидилинозитола (Недбе Р., Οί К., Сазрагб К.. АЬета(йу К., Эйагар 8., Еаг1е-Нидйез 1., Сау С., ^уокекей Ν.υ., Сйеп Т., 8аееб ΑΙ, 8йагоу У., Ьее Ν.Η., ¥еа1таи Т.Е, апб ОиаскепЬизй 1.; 1беп(1йса(юп оТ 1итоиг тагкегз ш тобе1з оТ йитап со1огес!а1 сапсег цзшд а 19,200-е1етеп( сотр1етеп(агу ΌΝΑ тсгоаггау, Сапсег Кез., 2001, 61, 7792-7797).

Являясь онкофетальным антигеном, СЕА экспрессируется во время эмбрионального развития, но и также на низком уровне, в желудочно-кишечном эпителии взрослых. Однако СЕА гиперэкспрессирован в высокой степени в опухолях человека, включая 90% случаев желудочно-кишечного, колоректального рака и рака поджелудочной железы, 70% клеток немелкоклеточного рака легких и 50% случаев рака груди (Тйотрзоп Ι.Α., Сгипег, Е. апб 21ттегтапп V.; СагсшоетЬгуошс апйдеп депе Татйу: то1еси1аг Ыо1оду апб с11шса1 регзресйуез, 1 СИп ЬаЬ Апа1, 5, 344-366 2005). Из-за своего высокого уровня экспрессии в опухолевых клетках и секреции в сыворотку СЕА широко использовался в качестве опухолевого маркера (81когзка Н., 8йиз(ег 1. апб Со1б Р.; Сйшса1 аррйсайопз оТ сагсшоетЬгуошс апйдеп Сапсег Эе1ескРгеу.. 12, 321-355 1988) и является стандартным сывороточным маркером для мониторинга колоректального рака (Ьоскег С.У., Натй(оп 8., Натз 1., 1еззир 1.М., Кетепу Ν., Масбопа1б 1.8., 8отегТ1е1б, М.К., Науез, Ό.Ρ., апб Ваз!, К.С., 1г.; А8СО 2006 ирба!е оТ гесоттепбайопз Тог (йе изе оТ (итоиг тагкегз ш даз(гош(езйпа1 сапсег, 1 СИп Опсо1, 24, 5313-5327, 2006).

Несмотря на гиперэкспрессию СЕА в опухолевых клетках, раковые пациенты обычно не дают иммунного ответа на данный антиген (Огейсе 8., Еоззай С., Р1е(го.)изй Е. апб ВопТапй С.; Эе1ауеб си(апеоиз йурегзепыйуйу геасйоп (о сагсшоетЬгуошс апйдеп ш сапсег ра(1еп(з, Титошг, 1982, 68, 473-475,). Иммунная система обычно становится толерантной к СЕА, потому что он в нормальном случае экспрессирован в организме на низком уровне. Однако в сериях клинических исследований вакцин была продемонстрирована иммуногенность СЕА (8агоЬе Р., Ниайе Е., йазаг(е 1.1. апб Воггаз-Сиез(а Е.; СагсшоетЬгуошс апйдеп аз а (агде( (о шбисе апй-(итоиг (ттипе гезропзез, Сигг. Сапсег Эгид Тагде(з., 2004, 4, 443-454), в особенности при колоректальном раке (КРР) (Мозо1йз 8., и11епйад С. апб Ме11з(еб( Н.; Тйегареийс уассшайоп ш райеп(з уйй даз(гош(ез(ша1 тайдпапаез. А гег1еу оТ 1ттипо1од1са1 апб сйшса1 гези1(з, Апп.Опсо1, 2005, 16, 847-862), и СЕА является опухолеассоциированным антигеном (ТАА) с обширным количеством вакцин, протестированных на данном виде опухоли (уоп Мейгеп, М.; Со1огес(а1 сапсег уассшез: уйа( уе кпоу апб уйа( уе боп'( уе( кпоу, 8етш. Опсо1., 2005, 32, 76-84).

Несколько цитотоксических и хелперных Т-клеточных эпитопов были описаны для СЕА (Сгозй М., ЬопдЫ К., Сопзодпо С., Ме11оп1 С., 2апшп1 Р. апб Рго(й МР; 1бепййсайоп оТ поуе1 зиЬбот1пап( ерйорез оп (йе сагсшоетЬгуошс апйдеп гесодшхеб Ьу СЭ4+ Т-се11з оТ 1ипд сапсег райеп(з, 1 1ттипо1., 2006, 176, 50935099; ХоуеШпо Ь., Саз(еШ С. апб Рагт1ап1 С.; А йзйпд оТ йитап (итоиг апйдепз гесодшхеб Ьу Т-се11з: Магсй 2004 ирба(е, Сапсег 1ттипо1.1ттипо(йег., 2004, 54, 187-207; Βιιίζ М., КоЬауазй Н., Ьазайе 1.1., Рпе(о 1., Воггаз-Сиез(а Е., Сейз Е. апб 8агоЬе Р.; 1бепййсайоп апб сйагас(еТОа(юп оТ а Т-йе1рег рерйбе Тгот сагсшоетЬгуошс апйдеп, СИп Сапсег Кез., 2004, 10, 2860-2867), позволяющих проведение ряда основанных на пептидах клинических исследований вакцин против КРР (ВаЬай 1., КоШд С., ЬоЬе1 В., Ео1ргесй( С., Нааск М., Сип(йег Н., Койпе С.Н., Ейпшдег С., 8с1ишй М. апб Вогпйаизег М.; 1пбисйоп оТ се11и1аг 1ттипе гезропзез адашз( сагсшоетЬгуошс апйдеп ш райеп(з уйй те(аз(айс (итоигз айег уасшпайоп уйй

- 10 018457 а1кегеб рерйбе йдапб-1оабеб бепбгШс се11к, Сапсег 1ттипо1. 1ттипо111сг.. 2006, 55, 268-276; Еопд Ь., Нои Υ., Вгуак А., Вешке С., Миеп А., Е1ккег С.А., Эаузк М.М. апб Епд1етап Е.С.; А1кегеб рерйбе Идапб уасс1пайоп текк Е1к3 йдапб ехрапбеб бепбпйс се11к Гог китоиг 1ттипокйегару, Ргос Νη11 Асаб 8а И.8.А, 2001, 98, 8809-8814; Ыи Κ.Ι, капу С.С., Скеп Ь.Т., Скепд А.Ь., Ып Ώ.Τ., ки У.С., Υυ к.Ь., Нипд Υ.Μ., Υапд Η.Υ., Чиапд 8.Н. апб ккапд-Репд 1.; Сепегайоп оГ сагсшоетЬгуошс апйдеп (СЕА)-креайс Т-се11 гекропзек ш НЬА-А*0201 апб НЬА-А*2402 1аке-ккаде со1огеска1 сапсег райепкк айег уасапайоп те1кк бепбгШс се11к 1оабеб те1кк СЕА рерйбек, Сйп Сапсег Век , 2004, 10, 2645-2651; Маккиба Κ., Ткипоба Т., Тапака Н., Итапо Υ., Таштига Н., Nикауа I., Такекако Κ. апб Υатаие Н.; Епкапсетепк оГ сукокохю Т-1утркосуке гекропкек ш райепкк те1кк даккгошкекйпа1 такдпапаек Гойотетд уасапайоп те1кк СЕА рерйбе-ри1кеб бепбгШс се11к, Сапсег 1ттипо1 1ттипокйег, 2004, 53, 609-616; Иеба Υ., 1кок Т., Nикауа I., 1<а\уак1шна I., Окидатеа Κ., Υапо Υ., Υататоко Υ., Nа^кок Κ., 81ιίιηίζι.ι Κ., 1тига Κ., Еир Ν., Еиртеага Н., ОсЫа1 Т., 1ко1 Н., 8опоуата Т., Надпуага А., Такекако Κ. апб Υашад^κк^ Н.; ЭепбгШс се11-Ьакеб 1ттипокйегару оГ сапсег те1кк сагсшоетЬгуошс апйдеп-бейуеб, НЕА-А24-геккпскеб СТЬ ер1коре: С1шка1 оиксотек оГ 18 райепкк те1кк текаккайс даккгошкекйпа1 ог 1ипд абепосагсшотак, 1пк 1 Опсо1, 2004, 24, 909-917; кебшшск МВ, Апкеп 8., ,1игк1е\\ас/ Е., Се1кеп С., Х1а, Ζ., Апбегкоп Κ8, Сгааеп Е., 8скт1бк М., к1кйд В., Э|ек1 V., ко1Г 1., Вок1еп Н. апб №1б1ег ЬМ; Ркаке Ι/ΙΙ сотЬшеб скето1ттипоккегару те1кк сагсшоетЬгуошс апйдеп-бепуеб НЬА-А2-геккпскеб САР-1 рерйбе апб шпокесап, 5-йиогоигасб, апб 1еисоуопп ш райепкк те1кк рптагу текаккайс со1огеска1 сапсег, Сйп Сапсег Век, 2005, 11, 5993-6001). Данные и другие клинические исследования на данный момент продемонстрировали безопасность вакцинаций с СЕА и доказательства для индукции иммунного ответа против данного антигена (уоп Мекгеп, М.; Со1огеска1 сапсег уассшек: текак тее кпо\у апб текак тее боп'к уек кпоте, 8етш Опсо1, 2005, 32, 76-84).

Вариант СЕА-006 был опубликован ранее (Вш/, М., ΚоЬауакк^, Н., Ьакагке, И, Рпеко, 1., ВоггакСиекка, Е., Сейк, Е., апб 8агоЬе, Р.; 1бепййсайоп апб скагааеп/абоп оГ а Т-ке1рег рерйбе Ггот сагсшоетЬгуошс апйдеп, Сйп Сапсег Век., 2004, 10, 2860-2867). СЕА-005 является мутантом с единственной аминокислотной заменой, о котором сообщалось, что он преодолевает центральную иммунную толерантность ^агешЬа 8., Вагхада Е., Ζΐιιι М., 8оагек Ν., Ткапд Κ.Υ. апб 8ск1от 1.; 1бепййсайоп оГ ап епкапсег адошкк сукокохю Т 1утркосуке рерйбе йот китап сагапоеткгуошс апйдеп, Сапсег Век, 1997, 57, 45704577).

Трансформирующий фактор роста, бета-индуцированный (ТСЕБ1)

ТСЕВ1 был первым геном, идентифицированным в качестве ТСЕ-бета-индуцированного, в клеточной линии человеческой аденокарциномы легких. Он кодирует секретируемый внеклеточный матричный белок, который, как предполагается, задействован в присоединении клеток и формировании внеклеточной матрицы.

Как было показано, ТСЕВ1 находится среди генов с наиболее значительно повышенным уровнем при колоректальном раке, и он также экспрессирован на высоком уровне в аденомах. Результаты количественной ПЦР демонстрируют сильное повышение как в неочищенных опухолях, так и очищенных эпителиальных клетках опухоли. Соответственно проведенные ш к1ки эксперименты по гибридизации показали, что ТСЕВ1 экспрессирован во многих видах клеток, как в стромальных, так и эпителиальных компартментах (Висккаи1кк Р., Вадо С., 8к С.В., Вотапк ΚΈ., 8ака 8., Ζкапд Ь., ^де1ккет В. апб ΚπιζΕγ Κν; 8есгекеб апб се11 кигГасе депек ехргеккеб ш Ьешдп апб такдпапк со1огеска1 китоигк, Сапсег Век., 2001, 61, 6996-7001).

При мета-анализе исследований, изучающих экспрессию генов при колоректальном раке, было установлено, что ТСЕВ1 является одним из всего девяти генов, которые были описаны как содержащиеся многократно в повышенном количестве (4 исследования для ТСЕВ1) (8к1к V., Скекку В. апб Ткао, М8; Ехргеккюп ргойкпд Ьу тюгоаггаук ш со1огеска1 сапсег, Опсо1.Вер., 2005, 13, 517-524).

В человеческих тканях поджелудочной железы наблюдалось повышение уровня ТСЕВ1 мРНК в 32,4 раза при раке поджелудочной железы в сравнении с нормальными контрольными тканями. Гибридизационный анализ ш к1ки показывает, что ТСЕВ1 мРНК был экспрессирован, в основном, в раковых клетках внутри опухолевой массы поджелудочной железы (8скпе1бег Ό., 1<1ееГГ 1., ВегЬегак Р.О., ΖΙπ.ι Ζ., 1<огс М., Епекк Н. апб Виск1ег М.к.; 1пбисйоп апб ехргеккюп оГ Ьека1д-к3 ш рапсгеайс сапсег се11к, Вюсккн.Вюркук. Аска, 2002, 1588, 1-6).

В модели ш νίϋΌ было установлено, что ТСЕВ1 является геном, способствующим ангиогенезу. К тому же резко повышенный уровень экспрессии ТСЕВ1 был обнаружен в нескольких видах опухолей. Антисмысловые олигонуклеотиды к ТСЕВ1 блокировали как экспрессию генов, так и образование эндотелиальных трубок ш νίύΌ, позволяя предположить, что ТСЕВ1 может играть ведущую роль во взаимодействиях в эндотелиальной клеточной матрице (А1ккепкеаб М., капд 8.1., Nакакκи М.К, Меккак 1., Неагб С., апб Нидкек С.С.; 1бепййсайоп оГ епбоккека1 се11 депек ехргеккеб ш ап ш уЦго тобе1 оГ апдюдепек1к: шбисйоп оГ Е8М-1, (Ьека)1д-к3, апб №САМ, Мюгоуакс. Век., 2002, 63, 159-171).

Муцин-1 (МиС1)

Муцины - это высокомолекулярные эпителиальные гликопротеины с высоким содержанием кластерных олигосахаридов, соединенных о-гликозидной связью с пептидами тандемного повтора, богатыми треонином, серином и пролином. Существуют два класса муцинов, различающихся по структуре и

- 11 018457 функциям: трансмембранные муцины, к которым относится МиС1, и секретируемые гелеобразующие муцины. Муцины рака толстой кишки имеют различия в углеводных структурах, которые исследуются как диагностические и прогностические маркеры, а также как мишени для противораковых вакцин.

Внеклеточный домен белка МиС1 образован из высоко консервативных повторов 20 аминокислот, фактическое число варьируется между 25 и 100 в зависимости от аллеля. Каждый тандемный повтор содержит пять потенциальных сайтов гликозилирования, а между дублетами треонинов и серинов находится иммунодоминантный участок, содержащий эпитопы, распознаваемые различными антителами анти-МиС1 (Тау1ог-Рараб1тйпои 1., ВигсНе1 1.. Мбез ΌΠ апб Ωαΐζίοΐ М.; МиС1 апб сапсег, ВюсНип. ВюрНуз. Лс!а, 1999, 1455, 301-313).

В сравнении с большинством других эпителиев МНС1 толстого кишечника более сильно гликозилирован, тем самым маскируя белок МИС1 от иммуногистохимического окрашивания МНС1специфическими антителами. В колоректальных аденокарциномах МНС1 менее гликозилирован, позволяя осуществление иммунодетекции. Аберрантно гликозилированный МИС1 предоставляет новые связующие способности и может одновременно опосредовать и блокировать связывание с адгезивными молекулами с некоторой молекулярной специфичностью, тем самым играя двойственную роль в метастатическом распространении опухолевых клеток (МсИетшой К.М., Сгоскег Р.К., Натз А., Витбюк М.Э., Н1поба Υ., Науазй Т., 1та1 К. апб НоШпдзгойН, М.А.; Оуетехртеззюп о! МНС1 гесопПдпгез (Не Ьшбшд рторетйез о! (итог се11з, 1п1. 1 Сапсег, 2001,94,783-791).

Как было установлено иммунологическим путем, МИС1 имеет повышенный уровень при экспрессии при раке толстой кишки, что соотносится с худшим прогнозом (Вугб, 1.С. апб ВтезаНет, К.8.; Мпстз апб шист Ьтбтд рго(етз т со1огес!а1 сапсег, Сапсег Ме(аз(аз1з Кеу., 2004, 23, 77-99), указывая на то, что повышенный уровень МИС1 может быть вовлечен в прогрессирование КРР. Рак толстой кишки с метастазами экспрессирует МИС1 более сильно, чем рак без метастазов (Накашоп 8., О!а Э.М., С1еагу К.К., 8Н1то!аш К апб Шшита Т.; МНС1 шист ехртеззюп аз а тагкег о! ргодгеззюп апб ше!аз!аз1з о! Нитап со1огес(а1 сатсшоша, Саз!тоейето1оду, 1994, 106, 353-361), и окрашивание МНС1 было положительным при всех видах колоректального рака с поражением печени в рамках одного исследования (Ма!зиба К., Мазак1 Т., Па!аиаЬе Т., КНауаша 1., Ыадага Н., Ми(о Т. апб Арока Υ.; С1шка1 з1дшйсапсе о! МНС1 апб МНС2 шист апб р53 рто!еш ехртеззюп ш со1огес(а1 сатсшота, 1рп. 1 С1т Опсо1, 2000, 30, 89-94). Во время недавнего иследования у 462 пациентов с колоректальным раком было обнаружено, что экспрессия МНС1 является независимым прогностическим маркером плохого прогноза (Эппсап Т.1., \Уа(зоп Ν.Ρ., А1-Айат, А.Н., 8сНо1ейе1б кН. апб Опггап( Й.С.; ТНе го1е о! МиС 1 апб МНС3 ш (Не Ью1оду апб ргодпоз1з о! со1огес(а1 сапсег, \Мог1б 1 8игд. Опсо1, 2007, 5, 31).

Существует патофизиологическая значимость циркулирующих антител анти-МиС1 при КРР: антитела анти-МиС1 были обнаружены у 5 из 31 (16,1%) здоровых субъектов и у 27 из 56 (48,2%) пациентов с колоректальным раком (Накатит Н., Ншоба Υ., Nакадага Ν., МайдисЫ Υ., 1(оН Р., Епбо Т. апб 1ша1 К.; Ое(ес(юп о! сйси1айпд апй-МиС1 шист соге рго(ет апйЬоб1ез т райейз гйН со1огес!а1 сапсег, 1 Саз(гоеп1ето1, 1998, 33, 354-361).

Помимо своей роли в качестве мишени для антител МиС1 является также хорошо известной мишенью для цитотоксических Т-клеток. В некоторых сообщениях демонстрируется, что цитотоксические нерестриктированные по МНС Т-клетки из опухолей яичника, груди, поджелудочной железы и множественной миеломы могут распознавать эпитопы центральной части белка МиС1, находящейся в тандемном повторе (Ароз!о1орои1оз, V апб МсКет1е, 1Р; Се11и1аг шпстз: (агде(з !ог 1шшипо!Нетару, СтН Кеу. 1штипо1, 1994, 14, 293-309; Ртп О1, 1еготе КК, Непбегзоп КА, РесНег С, ЭотепесН Ν, Мадапап-В1апбег 1, апб Ваггай-Воуез 8М; МНС-1 ерйНейа1 (итог шисш-Ьазеб Нпттйу апб сапсег уассшез, 1шшипо1. Кеу., 1995, 145, 61-89; Вагпб ОЬ, Ьап М8, Мейдаг К8 апб Ртп О1; 8рес1йс, та)ог Н|з(осотра(|Ьб|(у сошр1ехппгез(пс(еб гесодшйоп о! (птог-аззос1а(еб шпстз Ьу Нитап су(о(охю Т се11з, Ргос. №1(1. Асаб 8с1 и.8А, 1989, 86, 7159-7163; ТакаНазй Т., МайдисНт Υ. Ншоба. Υ. КакшсНк Н. Nакадага Ν, 1та1 К апб ΥηΟιί А; Ехртеззюп о! МНС1 оп туе1ота се11з апб тбисйоп о! НкА-ипгез(пс(еб СТЬ адатз! МНС1 !гош а шиШр1е туе1ота райей, 1. 1шшипо1, 1994, 153, 2102-2109; №(о Н., ТакаНазН Т., Мак1дисН1 Υ, НауазН Т, Ншоба, Υ, апб 1тап К; Су(о(ох1с Т 1утрНосу(ез бепхеб !гош Ьопе таггог топопис1еаг се11з о! шиШр1е туе1ота райейз гесодгте ап ипбегд1усозу1а!еб !огш о! МНС1 тист, 1п(. 1шшипо1, 1997, 9, 791-798). Однако были также идентифицированы рестриктированные по НЬА-А*02 Т-клеточные эпитопы, образованные из белка МНС1 (Ароз(о1орои1оз V., Каташказ V., Нашит 18, апб МсКет1е 1Р; 1пбисйоп о! НЬЛ-А2-гез(г1с(еб СТЬз (о 1Не тист 1 Нитап Ьгеаз( сапсег апйдеп, 1 1шшипо1., 1997, 159, 5211-5218; Втоззай Р., НешпсН К8, 8(иН1ег С., ВеНпке Ь., КекНатб! УН, 8(ехапох1с 8., МиНш А., Катшепзее НС, Кат Ь. апб Вгиддег 1бепййсайоп о! Η^Л-А2-^езί^^сίеб Т-се11 ерйорез бейуеб !гош 1Не МНС1 (итог апйдеп !ог Ьгоаб1у аррйсаЫе уассше !Нетар1ез, В1ооб, 1999, 93, 4309-4317). Одним из этих пептидов является МНС-001. Он образован из участка тандемного повтора белка МНС1. Индукция ответов цитотоксических Т-лимфоцитов ш у1уо после вакцинаций пациентов с распространенным раком груди или яичника дендритными клетками с введенным импульсным методом пептидом, используя пептиды МНС1, была успешной (Втоззай Р., \Уй(Нз 8., 8(иН1ег С., КейНатб! УН, Кат Ь. апб Вгиддег 1пбисйоп о! су(о(ох1с Т-1утрНосу(е гезропзез т У1уо айег уасапайопз гйН рерйбе-ри1зеб бепбпйс се11з, В1ооб, 2000, 96, 3102-3108; \У1егеску 1., Мие11ег

- 12 018457

М., апй Вгоззай Р.; ЭепйгШс се11-Ьа8ей сапсег 1тшцпо!йегару !агдейпд МиС-1, Сапсег 1ттипо1 1ттипо111сг. 2005 Арг. 28: 288-94). Более того, такие вакцинации успешно индуцировали клинические ответы у пациентов с почечно-клеточной карциномой (\У|егеску 1., Ми11ег МВ, \Уй1йз 8., На1йег-Оей1ег Е., ЭогГе1 Ό., 8сйт1й! 8.М., Нап!зсйе1 М., Вгцддег 8сйгойег 8., Ногдег М8, Каи/ Ь. апй Вгоззай Р.; 1ттипо1од1с апй сйшса1 гезропзез айег уасстайопз тейй рерййе-рц1зей йепйпйс се11з ш те!аз!айс гепа1 сапсег райеп!з, Сапсег Вез, 2006, 66, 5910-5918).

Повышенный уровень иммунореактивного МИС1 при колоректальном раке в большинстве случаев не основан на гиперэкспрессии мРНК, но скорее вызван его пониженным гликозилированием, что разоблачает эпитопы для распознавания антителами, в особенности на участке тандемного повтора МИС1. Данная дегликозиляция обеспечивает, в то же самое время, возможность для генерирования Т-клеточных эпиотопов при измененном процессинге антигенов в опухолевых клетках, чему в нормальных клетках препятствует гликозилирование. Данный механизм может объяснить исключительные черты МИС-001 в качестве опухолеассоциированного Т-клеточного эпитопа, несмотря на отсутствие сильной гиперэкспрессии мРНК. Некоторая очевидность того, что изменения в гликозилировании могут действительно повлиять на процессинг антигенов, возникает из недавнего наблюдения, что измененное гликозилирование МИС1 при колоректальном раке может быть действительно обнаружено антигенпрезентирующими клетками с помощью рецептора, специфически распознающего опухолевые гликоформы (8ае1апй Е., уап УйеГ 81, Васкзйош М., уап, йВ, V., Сеу!епЬеек, Т.В., Меуег, С.А. апй уап, ΚΥ; 2006, Тйе С-!уре 1есйп МСБ ехргеззей Ьу йепйпйс се11з йе1ес1з д1усап сйапдез оп МНС1 ш со1оп сагсшота, Сапсег 1ттипо1. 1ттипо!йег., 2007, 56(8): 1225-36). Специфическое поглощение и процессинг опухолевых гликоформ антигенпрезентирующими клетками может также объяснить тот факт, что МИС-001-специфические Т-клетки наблюдались в естественных условиях (без иммунизации) у пациентов с раком груди (ВепЦзсй, С, Каузег, 8, 81итт, 8., ^а!е^таии, .I, ^а11ег, 8., 8!еуапоу1с, 8., \Уа11\у1епег, Ό., апй Сиске1, В.; Еуа1иайоп оГ ргеех1з!еп! йптипйу ш райеп!з \νί(1ι рптагу Ьгеаз! сапсег: то1еси1аг апй се11и1аг аззауз 1о уиапйГу апйдепзресШс Т 1утрйосу!ез ш репрйега1 Ь1оой топопис1еаг се11з, С1ш Сапсег Вез., 2003, 9, 4376-4386) и колоректальным раком (0Шта1т 1., Ке11ег-Ма!зсйке, К., ХУетзсйепк Т., Кгай, Т., Неск, Т., Вескег, Н.И., 8!еуапоук, 8., Ваттепзее, Н.С. апй СоийеГапдеаз, С.; СИ8+ Т-се11 гезропзе ада1пз! МБС1-йепуей рерййез ш даз!гош!езйпа1 сапсег зигу1уогз, Сапсег 1ттипо1. 1ттипо!йег., 2005, 54, 750-758). Для этих пациентов не было заявлено об аутоиммунных эффектах. Это демонстрирует естественную роль МИС-001 как опухолеассоциированного пептида, индуцирующего специфические Т-клетки, и позволяет предположить, что введение МИС-001 может считаться безопасным, хотя для антигена МИС1 не может быть обнаружена гиперэкспрессия на уровне мРНК.

Ме!-протоонкоген (рецептор фактора роста гепатоцитов) (с-Ме!)

Белковый продукт протоонкогена МЕТ является рецептором фактора роста гепатоцитов. Он содержит домен тирозинкиназы, который активирует сигнальные пути, задействованные в клеточной пролиферации, подвижности, адгезии и инвазии (Тгизойпо Ь. апй Сошодйо, Р.М.; 8сайег-Гас1ог апй зетарйопп гесер!огз: се11 з1дпа111пд Гог шуаз1уе дгоМй, №11. Веу. Сапсег, 2002, 2, 289-300).

В исследованиях различных видов опухолей было продемонстрировано несколько механизмов для активации с-Ме1, включая аутокринную петлю НСБ/с-Ме1, активирующую точечные мутации, белок слияния ТРВ-Ме1 и неспособность расщепления с-Ме! на α- и β-цепи (Όί Вето, М.Б., Ойуего М., Маг1опе, Т., МаГГе А., Маддюга Р., 8!еГат А.И., Vа1епΐе С., Сюгйапо 8., Сойезша С. апй Сошодйо Р.М.; 8отайс тШайопз оГ !йе МЕТ опсодепе аге зе1ес!ей йийпд те!аз!айс зргеай оГ йитап НЫ8С сагсшотаз, Опсодепе, 2000, 19, 1547-1555; ЕЬей М., Υокоуата М., Бпезз Н., Висй1ег МАУ. апй Когс М.; Соехргеззюп оГ !йе с-те! рго1о-опсодепе апй йера!осу1е дгоМй Гас1ог ш йитап рапсгеайс сапсег, Сапсег Вез., 1994, 54, 57755778; Мопйшо, А., Сюгйапо, 8., апй Сотодйо, Р.М.; ИеГесйуе роз11гапз1а1юпа1 ргосеззшд асйуа!ез !йе !угозше ктазе епсойей Ьу !йе МЕТ рго1оопсодепе (йера!осу!е дгоМй Гас1ог гесер!ог), Мо1. Се11 Вю1, 1991, 11, 6084-6092; Ойуего М., Vа1епΐе С., ВагйеШ А., Ьопдай Р., Беггего Ν., Сгассо С., Теггопе С., Восса-Воззе!й

8., Сошодйо Р.М. апй Όί Вето, М.Б.; №ге1 тШайоп ш !йе АТР-Ьшйшд з11е оГ !йе МЕТ опсодепе !угозте кшазе ш а НРВСС Гатйу, 1п! 1 Сапсег, 1999, 82, 640-643; Рагк М., Эеап М., Соорег С.8., 8сйт1й! М., ОВпеп, 81, В1ай, ИС апй Vапйе ^оийе, СБ; Месйашзт оГ те! опсодепе асйуайоп, Се11, 1986, 45, 895-904; Рагк, №8, Иопд, 8М, К1т, 8Υ, №, Е^ 8йт, М8, Р1, 1Н, К1т, В1, Вае, 1Н, Нопд, ΥΚ, Бее, К8, Бее, 8Н, Υоо, N1, 1апд, Л, Раск 8, 2йиапд Ζ, 8сйт1й! Б, Ζ^π В апй Бее, 1Υ; 1999, 8отайс ти!айопз ш !йе ктазе йоташ оГ !йе Ме!/йера!осу!е дгоМй Гас!ог гесер!ог депе ш сййййоой йера!осе11и1аг сагсшотаз, Сапсег Вез., 59, 307-310; Вай1т1, Ν, ТгетЬ1ау Е., МсАйат Б., Рагк М., 8сй\га11 В апй ЕШо!! В; 1996, 1йепййсайоп оГ а йера!осу!е дгоМй Гас!ог аи!осппе 1оор ш а тигше таттагу сагсшота, Се11 Сго\\1й ЭйТет 7, 263-270; 8сйт1й!, Б., Ицй, Б.М., Сйеп, Б., К1зй1йа, Т., Скпщ С., Сйоуке, Р., 8сйегег, 8.^., Ζйиапд Ζ., БиЬепзку, I., Иеап, М., А111кте!з В., СЫйатЬагат А., Вегдегйете, И.В., Бе1йз, БТ., Сазайеуа11 С, Ζата^^оп А., Вегпиез М., Вюйагй 8., Б1рз, С.Б, ^а1!йег, М.М., Тзш, Б.С., Сей Б., Огси!! М.Б., 8!аскйоизе Т., Б1рап 1., 811Ге Б., Вгаисй Н., Иескег 1., №ейапз С., Нидйзоп МИ, Мосй Н., 8!огке1 8., Бегтап М.1., Бтейап \У.М. апй ΖΗηγ В.; 1997, Сегтйпе апй зотайс ти!айопз ш !йе !угозше ктазе йоташ оГ !йе МЕТ рго!оопсодепе ш рарй1агугепа1 сагсшотаз, №!.Сепе!., 16, 68-73; 8сйт1й!, Б., йшкег К., ХУетсй, С., С1епп, С., Сйоуке, Р., БиЬепзку, I., Ζйиапд, Ζ., 1ей'егз, М., Vапйе, ^.С., Nеитаии, Н., ХУаИйег М., Бтейап ^.М., апй Ζ^ιγ В.; 1998,

- 13 018457

Ттео ΝοΠίι Атепсап Гат111ез тейй йетеййату рарШагу гепа1 сатсшота апй 1йепйса1 поус1 ти!а!юпз ίη !йе МЕТ рго!о-опсодепе, Сапсег Рез., 58, 1719-1722). Как свойственно механизму, гиперэкспрессия с-Ме! кооперирует с онкогенной мутацией К1-газ с усилением канцерогенности раковых клеток толстой кишки 1п у1уо (Ьопд, Ι.8., Нап, Κ., Ь1, М., 8й1газатеа, 8., 8азахик|, Т., 1ойпз!оп, М., апй Тзао, М.8.; Ме! гесер!ог оуетехргеззюп апй опсодешс Κί-таз ти!а!юп соорега!е !о епйапсе Штопдешсйу о! со1оп сапсег се11з т у1уо, Мо1. Сапсег Рез., 2003, 1, 393-401).

Интересно, что существует некоторая очевидность для взаимодействия сигнальных реакций МЕТ с каскадом реакций ЭДп!/бета-катенина, зачастую представленного в повышенном количестве при раке толстой кишки. МЕТ может активироваться простагландином Е2 (РСЕ2) и РСЕ2-активированный с-Ме! ассоциируется с β-катенином, увеличивая его тирозиновое фосфорилирование, тем самым индуцируя инвазивность раковых клеток при раке толстой кишки (Рай Р., Иакатига, Т., Мооп, ЭД.8., апй Татпатезкц А.8.; Ргоз!ад1апй1пз ргото!е со1оп сапсег се11 шуазюп; з1дпайпд Ьу сгозз-!а1к Ье!теееп !тео й1з!тс! дготе!й Гас!ог гесер!огз, ЕА8ЕВ 1, 2003, 17, 1640-1647). Недавно была описана совместная активация МЕТ и бетакатенина, приводящая к положительному контуру обратной связи между этими двумя ключевыми игроками при колоректальном онкогенезе (Разо1а А., Еаззе!!а М., Эе В.Е., П'А1еззапйто Ь., Статадйа Ό., Όί Репхо, М.Е. апй Сотодйо Р.М.; А розй1уе ГеейЬаск 1оор Ье!теееп йера!осу!е дготе!й Гас!ог гесер!ог апй Ье!аса!ешп зиз!атз со1огес!а1 сапсег се11 туазгче дготе!й, Опсодепе, 2007, 26, 1078-1087).

Уровень экспрессии с-Ме! мРНК в первичных опухолях КРР (п = 36) является важным предсказывающим маркером для инвазии на ранних стадиях и региональных метастазов заболевания, таким образом, находясь в прямом соотношении со стадией рака толстой кишки (ТакеисЫ, Н., В11сй1к, А., 8айа, 8., Титпет, Р., ЭД1езе, Ό., Тапака, М., Кио, С., ЭДапд, Н.Т апй Нооп, Ό.8.; с-МЕТ ехртеззюп 1еуе1 ш рптагу со1оп сапсег: а ртейю!ог оГ !итог шуазюп апй 1утрй пойе те!аз!азез, Сйп Сапсег Рез., 2003, 9, 1480-1488). Другой анализ экспрессии с-Ме! в 130 пробах КРР показал гиперэкспрессию (Т/Ν > 2,0) с-Ме! в 69% случаев первичного КРР и значительно повышенные уровни с-Ме! при КРР с поражением кровеносных сосудов (Р = 0,04) и на поздней стадии (Р = 0,04), подтверждая роль с-Ме! в прогрессированиии и распространении метастазов при КРР человека (2епд, Ζ., ЭДе1зет, М.Р., П'А1еззю, М., Стасе, А., 81иа, 1. апй Ра!у, Р.В.; 1ттипоЬ1о! апа1уз1з оГ с-Ме! ехртеззюп т йитап со1огес!а1 сапсег: оуетехргеззюп 1з аззос1а!ей \\Й11 айуапсей з!аде сапсег, Сйп Ехр. Ме!аз!аз1з, 2004, 21, 409-417). В другом исследовании в 69 и 48% из 60 аденокарцином толстой кишки было установлено повышение с-Ме! мРНК в более чем 2 и более чем 10 раз соответственно по сравнению со смежной нормальной слизистой оболочкой (Катти1а, и.8., Кип!/, Е.Т, Егапсопе, Τ.Ό., Ζеηд, Ζ., 8й1а, 1., Ьапйтапп, Р.С., Ра!у, Р.В. апй ЭДе1зег, М.Р.; Мо1еси1аг соехртеззюп оГ !йе с-Ме! опсодепе апй йера!осу!е дготе!й Гас!ог ш рйшату со1оп сапсег ртейю!з !итог з!аде апй сйшса1 ои!соте, Сапсег Ье!!., 2007, 248, 219-228). Таким образом, увеличение передачи сигналов с-Ме! является широко распространенным явлением на ранней стадии КРР, но и проявляющееся даже с еще большей экспрессией на поздних стадиях и при метастатической болезни.

Циклин Б1 (ССМ)1)

ССКО1 относится к высоко консервативному семейству циклинов, члены которого характеризуются исключительной периодичностью наличия белков в течение клеточного цикла. Циклины выполняют функцию регуляторов СЭК (циклинзависимые киназы). Различным циклинам свойственна разная экспрессия и способы деградации, которые содействуют временной координации каждого этапа митоза. Этот циклин формирует комплекс с и функционирует как регуляторная субъединица СЭК4 или СЭК6, активность которой требуется для клеточного цикла перехода С1/8. Мутации, амплификация и гиперэкспрессия этого гена, который изменяет прогрессию клеточного цикла, часто наблюдались в различных опухолях и могут благоприятствовать онкогенезу (Ей, М., ЭДапд, С., Ь1, Ζ., 8акатакф Т., апй Рез!е11, Р.С.; М1штеу1ете: Сусйп Ό1: погта1 апй аЬпогта1 Гипсйопз, Епйосппо1оду, 2004, 145, 5439-5447).

Распространенный однонуклеотидный полиморфизм А/С (А870С) приводит к двум различным изоформам мРНК: а и Ь. Попеременно сплайсированная изоформа Ь кодирует усеченный белок, который был связан с более высокой заболеваемостью опухолевыми заболеваниями, включая рак легких, рак толстой кишки и другие виды рака (Ей М., ЭДапд С., Ь1 Ζ., 8акатак1 Т. апй Рез!е11 РС; М1штеу1ете: Сусйп Ό1: погта1 апй аЬпогта1 Гипсйопз, Епйосппо1оду, 2004, 145, 5439-5447).

Гиперэкспрессия ί.'ί.'ΝΟ1 на уровне мРНК и белковом уровне была многократно описана для колоректального рака (8и!!ег Т., Эо1 8., Сатпеуа1е К.А., АгЬег Ν. апй ЭДешз!ет 1.В.; Ехртеззюп оГ сусйпз Ό1 апй Е 1п йитап со1оп айепосатсшотаз, 1 Мей, 1997, 28, 285-309; Метте1зй!ет А., Сегзоп А., ЭДа1йзсй 8., Эе1дайо В., 8йесй!ег-Маог С., Эе1дайо 1., Еюй, А. апй СйеЬег, Ь.; Ехртеззюп оГ Э-1уре сусйпз т со1оп сапсег апй ш се11 йпез Ггот со1оп сагстотаз, Вг. 1 Сапсег, 2005, 93, 338-345; Ва1сегсхак Е, Разх-ЭДа1схак С, Китог Р., Рапсхук М., Когйек Р., ЭД|егхЫск| Р. апй Мйотезкг М.; Сусйп Ό1 рго!ет апй ΕΕΝΩ1 депе ехргеззюп т со1огес!а1 сапсег, Еиг. 1 8игд.Опсо1., 2005, 31, 721-726; Вопй1 1., Низйа1 А., Викйо1т С., Иез1апй 1.М., Вакка А. апй Викйо1т, 1.Р.; Ехртеззюп апй депе атрййса!юп оГ рптагу (А, В1, Ό1, Ό3, апй Е) апй зесопйагу (С апй Н) сусйпз ш со1оп айепосатсшотаз апй сотте1а!юп тейй райеп! ои!соте, 1 Сйп Ра!йой 2005, 58, 509-514; Рете/ Р., ЭДи Ν., КйрГе1 А.А. апй Веаг! Р.ЭД., 1т.; А Ьейет се11 сус1е !агде! Гог депе !йегару оГ со1огес!а1 сапсег: сусйп С, 1 Саз!тот!ез!. 8игд., 2003, 7, 884-889; ЭДопд КА., Мотз Р.С., МсСопйосЫе

- 14 018457

А, Вабег 8, бобгс11 Ό1 апб Натзоп, Ό1; Сус11п Ό11 оуегехргеззюп ίη со1огес(а1 сагсшота ίη νίνο 1з берепбеп( оп Ье(а-са(ешп рго(еш бузгеди1айоп, Ьи( по! к-газ ти(а(1оп, 1 Ра(Но1., 2002, 197, 128-135; МсКау, 1.А., Войдке И, Козз, У.6., Сиггап, 8., Мшгау, 6.Ι., Сазз1бу, 1. апб МсЬеоб, Н.Ь.; Сусбп Ό1 рго(еш ехргеззюп апб депе ро1утогрЫзт ш со1огес(а1 сапсег. АЬегбееп Со1огес(а1 1шйайуе, 1п(. 1 Сапсег, 2000, 88, 77-81; Ваг(коуа

1., Ьиказ 1., 8(гаизз М. апб Вайек 1.; ТНе РК.АЭ-1/сус1т Ό1 опсодепе ргобис( ассити1а(ез аЬеггапЙу ш а зиЬзе( о! со1огес(а1 сагстотаз, 1п(. 1 Сапсег, 1994,58,568-573).

Это может быть объяснено хорошо обоснованным фактом, что ССИЭ1 является геном-мишенью сигнального пути Р-катенин-ТСР/ЬЕР, зачастую представленного в повышенном количестве при колоректальном раке (8Н(и(тап М., 211иппзку 1., 81тсНа I, А1Ьапезе С., ЭАт1со М., Рез!е11 К. апб Веп-2е'еу, А'; ТНе сусйп Ό1 депе 1з а 1агде( о! (Не Ье1а-са!еп1п/ЬЕР-1 ра(Нгау, Ргос. Иа(1. Асаб. 8ск И.8.А, 1999, 96, 55225527; Те(зи О апб МсСогткк Р; Ве(а-са(епт геди1а(ез ехргеззюп о! сусНп Ό1 ш со1оп сагсшота се11з, Иа(иге, 1999, 398, 422-426).

Повышенная экспрессия ССИЭ1 была связана с более высокими стадиями опухоли, метастазами и снижению выживаемости (Ва1сегсхак Е., Разх-ЭДа1схак 6., Китог Р., Рапсхук М., Когбек К., ЭД|егхЫск| К. апб М1го^зк1 М.; СусНп Ό1 рго(еш апб ССИЭ1 депе ехргеззюп ш со1огес(а1 сапсег, Еиг. 1 8игд. Опсо1., 2005, 31, 721-726; ВаНпаззу А.А., 2екп А.К., Е1-Ноиззт1 8., Е1-8НеНаЬу А.М., МаНтоиб М.К., АЬба11аН 8. апб Е1-8егай М.; СусНп А. апб сусНп Ό1 аз з1дпгйсап( ргодпозйс тагкегз ш со1огес(а1 сапсег райеп(з, ВМС. 6аз(гоеп(его1, 2004, 4, 22; МсКау кА., Эоид1аз ЬЬ, Козз У.6., Сиггап 8., Миггау 6.Ι., Сазз1бу 1. апб МсЬеоб, Н.Ь.; СусНп Ό1 рго(еш ехргеззюп апб депе ро1утогрЫзт ш со1огес(а1 сапсег. АЬегбееп Со1огес(а1 1шйа!гуе, 1п(. 1 Сапсег, 2000, 88, 77-81; Маеба К., СНипд Υ., Капд 8., Ода\га М., Опоба Ν., МзЫдисЫ Υ., 1кеНага Т., Иака(а В., Окипо М. апб 8о\ха М.; СусНп Ό1 оуегехргеззюп апб ргодпоз1з ш со1огес(а1 абепосагсшота, Опсо1оду, 1998, 55, 145-151).

Матричная металлопротеиназа 7 (матрилизин, утерин) (ММР7)

Матричные металлопротеиназы (ММРз) являются крупным семейством структурно родственных цинк-зависимых протеиназ, описываемых типично как способные приводить к деградации компонентов внеклеточной матрицы. Были идентифицированы отдельные ММР, которые проявляют повышенную экспрессию при опухолях, и большинство опухолей демонстрировало усиленную активность ММР (Сиггап, 8. апб Миггау, 6.Ι.; 1999, Ма(пх те(а11орго(ешазез ш (итоиг туазюп апб те(аз(аз1з, 1 Ра!Но1., 189, 300-308; Сиггап, 8 апб Миггау, 61; 2000, Ма(пх те!а11орго!е1пазез: то1еси1аг азрес(з о! (Ней го1ез ш (итоиг туазюп апб те(аз(аз1з, Еиг. 1 Сапсег, 36, 1621-1630).

Базальная мембрана и внеклеточная матрица представляют собой два физических барьера для инвазии злокачественных заболеваний, и их разрушение ММР играет ключевую роль в прогрессировании опухоли и распространении метастазов (1оНпзеп, М., Ьипб, Ь.К, Кошег, 1., А1тНо1(, К. апб Эапо, К.; 1998, Сапсег туазюп апб йззие гетобейпд: соттоп (Нетез ш рго!ео1у11с та(пх бедгабайоп, Сигг.Орт. Се11 Вю1, 10, 667-671; Ие1зоп А.К., Ртд1е(оп В., Ко(НепЬегд М.Ь. апб Ма(пзйт Ь.М.; 2000, Ма(пх те!а11орго!е1иазез: Ью1одю ас!1У1(у апб сйшса1 1трНсайопз, 1 С1т Опсо1, 18, 1135-1149; ЭДапд Р.6., 8о 1., Ке1егз(аб 8. апб Р1зНтап, Ό.Λ.; 2005, Ма(п1узт (ММР-7) ргото(ез туазюп о! охапап сапсег се11з Ьу асйуайоп о! ргоде1айпазе, 1п( 1 Сапсег, 114, 19-31). Помимо данной функции на данный момент обсуждается участие ММР в развитии и прогрессировании опухоли, включая роли в апоптозе, клеточной пролиферации и дифференциации. Данные функции связаны с ММР-опосредованным протеолизом нематричных белков и действий, отличающихся от их ферментативной активности (ЕдеЬ1аб, М. апб ЭДегЬ, Ζ.; 2002, Ие\х Гипсбопз !ог (Не та(пх те(а11орго(етазез т сапсег ргодгеззюп, Иа(.Кеу.Сапсег, 2, 161-174; Ьеетап, МР, Сиггап, 8, апб Миггау, 61; 2003, Ие\х шз1дН(з 1п(о (Не го1ез о! та(пх те(а11орго(етазез ш со1огес(а1 сапсег бехе1ортеп( апб ргодгеззюп, 1. Ра(Но1., 201, 528-534).

Недавние исследования показали, что несколько матричных металлопротеиназ, в особенности матрилизин (ММР7), взаимодействуют со специфическими молекулярно-генетическими и сигнальными путями, задействованными в развитии колоректального рака. В частности, матрилизин активируется на ранней стадии колоректального онкогенеза сигнальными путями бета-катенина (ВгаЬ1е(х Т., 1ипд А., Эад

8., Н1иЬек Р. апб КйсНпег Т.; 1999, Ье(а-са(епт геди1а(ез (Не ехргеззюп о! (Не та(пх те(а11орго(етазе-7 щ Нитап со1огес(а1 сапсег, Ат. 1 Ра(Но1, 155, 1033-1038; Ьеетап МР, Сиггап 8. апб Миггау 61; 2003, Ие\х шз1дН(з 1п(о (Не го1ез о! та(пх те(а11орго(етазез ш со1огес1а1 сапсег бехе1ортеп( апб ргодгеззюп, б.Ра(Но1., 201, 528-534; ΖικΙ^γ 8. апб Уаспса 1; 2004, Ко1е о! та(пх те(а11орго(етазез (ММРз) ш со1огес1а1 сапсег, Сапсег Ме(аз(аз1з Кеу., 23, 101-117).

ММР7 гиперэкспрессирована как в доброкачественных, так и злокачественных колоректальных опухолях (Iз1ика\ха Т., 1с1лка\ха Υ., МНзиНазЫ М., Мот1уата Ν., СН1зН1та Т., Тапака К., Υатаοка Н., М1уахакю К., ИадазЫта Υ., Акйауа Т. апб 8Н1таба Н.; 1996, Майбузш 1з аззос1а(еб \χί(1ι ргодгеззюп о! со1огес1а1 (итог, Сапсег Ьей., 107, 5-10; МсЭоппеН 8., Иауге М., Со!!еу Кб, 1г. апб Ма(пз1ап ЬМ; 1991, Ехргеззюп апб 1осаНха(1оп о! (Не та(пх те(а11орго(етазе ритр-1 (ММР-7) ш Нитап даз(пс апб со1оп сагстотаз, МокСагсшод., 4, 527-533; М|уахак| К., На((оп Υ., итешзН1 Р., Υазит^(зи Н. апб Итеба, М.; 1990, Рилйса(юп апб сНагас(епха(юп о! ех(гасе11и1аг тайгх-бедгабшд те(а11орго(етазе, та(пп (ритр-1), зесге(еб !гот Нитап гес(а1 сагсшота се11 Нпе, Сапсег Кез., 50, 7758-7764; ИадазЫта Υ., Назеда\ха 8., Коз1ика\ха Ν., Так1 А., 1сН1ка^а Υ., Кйатига Н., М1зид1 К., К1Нйа Υ., Ма(ио Υ., Уазитйзи Н. апб М|уахак| К.; 1997, Ехргез- 15 018457 δΐοη оГ та(л1укт ίη уакси1аг епйо(НеНа1 сс11з ай)асеп( (о та(п1укт-ргойистд (итоге, Ιηΐ. ί Сапсег, 72, 441445; №\\е11 К.Н, \'Н(у ГР., Койдегк '.Н. апй Майгйап Ь.М.; 1994, Ехргекйоп апй 1оса11/айоп оГ тайгхйедгайтд те(а11орго(етакек йшгпд со1огес(а1 (итопдепейк, МоНСагстод., 10, 199-206; УокйтоФ М., 1(оН .Е, Уатато(о Н., Нтойа У., 1та1 К. апй УасЫ, А.; 1993, Ехргекйоп оГ ММР-7 (РИМР-1) тКЫА ш Нитап со1огес(а1 сапсегк, 1п1й Сапсег, 54, 614-618). ММР7 является одной из немногих ММР, которая фактически секретируется опухолевыми клетками (Оуега11, СМ апй К1ейе1й, О; 2006, Титоиг тФгоепупоптей ор1шоп: уаййайпд та(лх те(а11орго(етакек ак йгид 1агде1э апй ап(11агде(8 Фг сапсег (Негару, №11. Кеу.Сапсег, 6, 227-239). Кроме того, уровни экспрессии ММР7 мРНК соотносятся со стадией прогрессирования КРР (1кНкау Т., 1сН1кауа У., М1(кнНакН1 М., Мот1уата Ν., СйкЫта Т., Тапака К., Уатаока Н., М1уахак1с К, №дакйта У., АкНауа Т. апй 8йтайа Н.; 1996, Ма(гПу81п ίκ аккоаа(ей \уНН ргодгекйоп оГ со1огес(а1 (итог Сапсег Ьей., 107, 5-10; Мол М., Вагпагй С.Е., МПтол К., Иео Н., АкуокН Т. апй 8ид1тасН К.; 1995. ОуегехргеккФп оГ та(лх те(а11орго(е1паке-7 тКNА т Нитап со1оп сагсшотак, Сапсег, 75, 1516-1519). При метастазах при КРР ММР7 играет также центральную роль (АйасН1 У, Уатато(о Н., 1(оН Е., Нтойа У., Окайа У. апй 1та1 К.; 1999, Соп(лЬи(юп оГ та(л1укт (ММР-7) (о (Не те(ак(а(1с ра(11\уау оГ Нитап со1огес(а1 сапсегк, Си(, 45, 252-258; Мол М., Вагпагй С.Е., МПтол К., Иео Н., АкуокН Т. апй 8ид1тасН К.; 1995, ОуегехргеккФп оГ та(лх те(а11орго(етаке-7 тКNА т Нитап со1оп сагсшотак, Сапсег, 75, 1516-1519).

Повышенные уровни сыворотки ММР7 ассоциируются с плохим прогнозом для пациентов с колоректальным раком на поздних стадиях (Маиге1 I., №(йа1 С., Сагс1а-А1Ьетх X., Са11едо К., Сагсегепу Е., А1тепйго V., Магто1 М., Са11агйо Е., Мала А.!, Ьопдагоп К., Магйпех-Еетапйех А., Мо11па К., Сак(е11к А. апй Саксоп Р.; 2007, 8егит та(лх те(а11орго(етаке 7 1еуе1к Фепййек роог ргодпойк айуапсей со1огес1а1 сапсег райейк, 1й ί Сапсег, РиЬйкНей Ойше: 8 Мау 2007 ), а гиперэкспрессия у пациентов с КРР, ассоциирующаяся опять же с сокращением выживаемости, как предполагалось способствует ускользанию от иммунологического надзора путем расщепления Еак на опухолевых клетках ('апд '.8., СНеп Р.М., 'апд Н.8., Ыапд '.У. апй 8и У.; 2006, Ма(лх те(а11орго(етаке-7 тсгеакек геййапсе (о Еак-тей1а(ей арор(окге апй 1к а роог ргодпокйс Гас(ог оГ райейк \уНН со1огес(а1 сагстота, Сагсшодепейк, 27, 1113-1120).

Белки по изобретению могут быть мишенью опухолеспецифического иммунного ответа при многих видах рака.

Пептид корового антигена вируса гепатита В, НВУ-001, получен не из эндогенного опухолеассоциированного антигена человека, а из корового антигена вируса гепатита В. Во-первых, это позволяет количественные сравнения интенсивности Т-клеточных ответов, индуцированных ТИМАР, и, следовательно, позволяет сделать важные выводы о способности вызывать противоопухолевые ответы. Вовторых, он функционирует как важный положительный контроль в случае недостатка каких-либо Тклеточных ответов у пациента. И в-третьих, он также позволяет сделать заключение о статусе иммунокомпетентности пациента.

Инфицирование вирусом гепатита В (НВУ) является одной из самых распространенных причин заболевания печени, поражающим примерно 350 млн. человек по всему миру (КеНегтапп В. апй МаксимНет М.; 1ттипо1оду оГ Нераййк В уник апй Нераййк С уник 1пГес(1оп, Νι(. Кеу. 1ттипо1, 2005, 5, 215-229). В связи с простотой горизонтального и вертикального переноса и наличием потенциала для хронического заболевания это может привести к циррозу печени и гепатоклеточной карциноме, поэтому НВУ наносит сильный удар по системам здравоохранения многих стран мира. Геном НВУ (Ргеуйаш, Ν. апй ЬауапсНу, Ό.; 2002, Нераййк В., (ЕрФетк апй Рапйетю А1ег( апй Кекропке, 'ог1й НеаНН Огдай/айоп, Сепеуа, 2002)) включает частично двухнитевую кольцевую ДНК. В вирионах НВУ она окружена коровым белком НВс и другими белками, формируя нуклеокапсид, который защищен внешней оболочкой, содержащей липиды и поверхностные белки семейства НВк (называемые также оболочечными белками). Антигенные детерминанты, ассоциированные с НВс и НВк, обозначаются как НВсАд и НВкАд, соответственно. Эти антигены ассоциированы с серологической реакцией, т.е. ответами антител, обнаруженными в крови пациента, и находятся среди клинически наиболее применимых систем антиген-антитело для диагноза инфекции НВУ. НВс будет представлять новый чужеродный антиген у всех индивидов без предшествующей истории инфекции НВУ. Так как для этого антигена хорошо известны иммуногенные пептиды (ВегФ1еФ А., С’Нгеал ЕУ, Реппа А, Сш1Но( 8, Са1ай Ь, М1кка1е С, Еоу1ег Р, 8сНКсН( Ш, УФе11о А, СНекпнН КС, 1993, ОеГ1П1(1оп оГ а т1шта1 орйта1 суФФхк Т-се11 ерйоре у1(Н1п (Не Нераййк В уиик пис1еосарйй рго(ет, НУйоС 67, 2376-2380; Ыушдйоп В.Э., Стт С., Сгеу Н., 1кНюка С., СНгеал ЕУ, Е1кек I., Сгеу Н., СНекпй О'. апй 8ейе А.; 1997, ТНе Нераййк В уиик-кресШс СТЬ гекропкек тйисей ш Нитапк Ьу йрорерййе уасстайоп аге сотрагаЬ1е (о (Ноке ейсйей Ьу аси(е У1га1 1пГесйоп, I 1ттипо1., 159, 1383-1392), то в рамках исследований 1МА из НВсАд в качестве антигена для положительного контроля был выбран один пептид из 10 аминокислот. Индукция пептид-специфических ЦТЛ НВс будет, затем, использоваться как маркер иммунокомпетентности пациента и успешности вакцинации.

Фармацевтическая композиция в дальнейшем может содержать дополнительные пептиды и/или наполнители для большей эффективности, как это будет пояснено ниже.

Вариантной аминокислотной последовательностью данной аминокислотной последовательности изобретатели обозначают, что боковые цепи, например, одного или двух аминокислотных остатков изменены (например, при их замещении боковой цепью другого встречающегося в природе аминокислот

- 16 018457 ного остатка или какой-либо другой боковой цепью), так что пептид по-прежнему способен связываться с молекулой НЬА, по существу, таким же путем, как и пептид, состоящий из данной аминокислотной последовательности. Например, пептид может быть модифицирован таким образом, что он, по крайней мере, сохранит, если не улучшит, способность взаимодействовать и связываться с подходящей молекулой МНС, такой как НЬА-А или -ЭВ, и так что он, по крайней мере, сохранит, если не улучшит, способность генерировать активированные ЦТЛ, которые могут распознавать и уничтожать клетки, которые экспрессируют полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, как определено в аспектах данного изобретения. Как может быть извлечено из базы данных, некоторые позиции связывающихся с НЬА-А пептидов являются типичными якорными остатками, образующими центральную последовательность, подходящую к соединительному элементу НЬА-связывающей бороздки.

Те аминокислотные остатки, которые не обязательны для взаимодействия с Т-клеточным рецептором, могут быть модифицированы при замещении другой аминокислотой, чье включение, по существу, не влияет на реактивность Т-клетки и не устраняет связь с релевантным МНС. Таким образом, помимо данного условия, пептид по изобретению может быть любым пептидом (в обозначение которого изобретатели включают олигопептиды или полипептиды), который включает аминокислотные последовательности или их участок или их вариант, как дано.

В дальнейшем известно, что пептиды, презентированные МНС класса II, образованы коровой последовательностью, имеющей конкретный НЬА-специфический аминокислотный фрагмент и, факультативно, Ν- и/или С-терминальные удлиняющие сегменты, которые не препятствуют функции коровой последовательности (т.е. считаются нерелевантными для взаимодействия пептида и Т-клетки). Ν- и/или С-терминальные удлиняющие сегменты могут иметь длину, например, от 1 до 10 аминокислот, соответственно. Эти пептиды могут быть использованы как непосредственно для погрузки на молекулы МНС класса II, так и последовательность может быть клонирована на векторы в соответствии с описанным ниже. Так как эти пептиды образуют конечный продукт процессинга более длинных пептидов внутри клетки, то более длинные пептиды могут использоваться в равной степени. Пептиды по изобретению могут быть любого размера, но, в основном, они могут иметь молекулярный вес меньше, чем 100000, предпочтительно меньше чем 50000, более предпочтительно меньше чем 10000 и типично около 5000. В отношении числа аминокислотных остатков пептиды по изобретению могут иметь менее чем 1000 остатков, предпочтительно менее чем 500 остатков, более предпочтительно менее, чем 100 остатков. Соответственно, настоящее изобретение обеспечивает также композиции из пептидов и их вариантов, в которых пептид или вариант имеет общую длину между 8 и 100, предпочтительно между 8 и 30 и наиболее предпочтительно между 8 и 16, а именно 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 или 16 аминокислот.

В соответствии с этим варианты, которые индуцируют Т-клеточную перекрестную реакцию с пептидом по изобретению, часто являются вариантами по длине.

Если пептид, который длиннее, чем около 12 аминокислотных остатков, непосредственно используется для связывания с молекулой МНС II класса, предпочтительно, чтобы остатки, которые примыкают к центральному НЬА-связывающему региону, по существу, не влияли на способность пептида специфически связываться со связывающей бороздкой молекулы МНС II класса или презентировать пептид ЦТЛ. Тем не менее, как уже было указано выше, следует понимать, что могут быть использованы более крупные пептиды, в особенности, если они закодированы полинуклеотидом, потому что такие крупные пептиды могут быть разделены на фрагменты подходящими антигенпрезентирующими клетками.

Также возможно, чтобы эпитопы МНС I класса, хотя они обычно имеют длину между 8-10 аминокислотами, генерировались при процессинге пептидов из более длинных пептидов или белков, включающих истинный эпитоп. Аналогично с эпитопами МНС II класса предпочтительно, чтобы остатки, которые примыкают к связывающему региону, по существу, не влияли на способность пептида специфически связываться со связывающей бороздкой молекулы МНС I класса или презентировать пептид ЦТЛ и не маскировали сайты для протеолитического расщепления, необходимые для выявления истинного эпитопа во время процессинга.

Соответственно, настоящее изобретение обеспечивает также пептиды и варианты эпитопов МНС I класса, имеющие общую длину между 8 и 100, предпочтительно между 8 и 30, и наиболее предпочтительно между 8 и 16, а именно 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 или 16 аминокислот.

Разумеется, пептид или вариант в соответствии с настоящим изобретением будет обладать способностью связываться с молекулой главного комплекса гистосовместимости человека (МНС) I или II класса. Связывание пептида или варианта с комплексом МНС может быть проверено методами, известными из уровня техники, например, теми, что описываются в примерах настоящего изобретения или в литературе для различных аллелей МНС II класса (е.д. Уод! А.В., КгоркйоГег Н., Ка1йасйег Н., Ка1йик М., Ваттепкее НС, СоНдап ЬЕ., Майт В.; Ыдапб тойГк оГ НЬА-0ВВ5*0101 апб ОВВ1*1501 то1еси1ек бе1теа1еб Ггот ке1Г-рерйбек; 1 Iттиηо1. 1994; 153(4): 1665-1673; Ма1сйегек С., Спаи V., 81еуапо\зс 8., Ваттепкее НС, 1ипд С., Ме1тк А.; Апа1ук1к оГ а11е1е-крес1йс соп1ас1 кйек оГ па1ига1 НЬА-ЭВ17 йдапбк; 1 Iттиηо1. 1994; 153(3): 1141-1149; Матс1 8., 81игшо1о Т., Ито МА, Наттег 1., 81шдад11а Р., №рреп С., 8радпо11 С., Ма/ζί В, Ве11опе М, ЬеНаЬопа Р, Ргой1 МР; Ме1апота се11к ргекеп! а МАСЕ-3 ерйоре 1о СЬ4(+) суЮЮхю Т се11к т аккотайоп \νί11ι ЫкФсотраййййу 1енкосу1е апйдеп ОВ11; 1Ехр Меб. 1999; 189(5): 871-876; Наттег

- 17 018457

I., Са11ах/1 Р., Воио Е., Кагг В.^., Сиепо( I., УаЛакшш Р., №ду Ζ.Α., 81шдад11а Р.; Рерббе Ьшбшд кресгПсЛу оГ Η6Α-ΌΒ4 тоЛсиЛк: согге1абои ^ЛЛ гЛеита1о1б айЛпбк аккоаабои; I Ехр Меб. 1995 181(5): 18471855; Тотркшк 8.М., Во(а Р.А., Мооге 1.С., кикеи Р.Е.; А еигоршт ПиогоНпншпоаккау Гог теакилид Ьтб1ид оГ аибдеи (о с1акк ΙΙ МНС д1усорго(еЛ1к; I Iттиηо1 Мебюбк. 1993;163(2): 209-216; Воу(оп В.к, ЬоЛтапп Т., Ьоибе1 М., Ка1ЬасЛег Н., На1бег Т., РгаЛг А.1, Эонек Э.С., БекНе Ό.Ο., Р1ауе11 В.А., АЛтапп Э.М.; С1и1ат1с ас1б бесагЬоху1аке Т 1утрЛосу1е гекропкек аккоааЛб ^ЛЛ киксербЬЛЛу ог гекЛ(апсе (о (уре Ι б1аЬе1ек: апа1укЛ ш бЛеаке бЛсогбап( Литап АуЛю, поп-оЬеке б1аЬебс тке апб НБА-ЭО (гапкдепЛ тЛе; Ιπΐ Iттипо1. 1998 (12): 1765-1776).

Дополнительные фрагменты аминокислот, находящиеся на Ν- и/или С-конце, не являющиеся обязательно формирующими часть пептида, которая функционирует как эпитоп для молекул МНС, могут, тем не менее, быть важны для обеспечения эффективного введения пептида в соответствии с настоящим изобретением в клетки. В одном воплощении настоящего изобретения пептид по изобретению является белком слияния, который включает, например, 80 Ν-терминальных аминокислот НЬА-ЭВ антигенассоциированной инвариантной цепи (р33, в дальнейшем б), как взятая из банка данных NСВI, инвентарный номер - СеиВаик Ассеккюп-иитЬег Х00497 (8(гнЫп, М., МасЛ, В. апб Ьоид, Е.О. ТЛе сотр1е(е кециепсе оГ (Не шΒNΑ Гог (Не НЬА-ЭВ-аккоааЛб туапап! сЛаш геуеаЛ а ро1урерббе \νί(1ι ап ипикиа1 (гапктетЬгапе ро1агЛу ЕМВОГ 3 (4), 869-872 (1984)).

Предпочтительной является фармацевтическая композиция, в которой пептиды имеют общую длину между 8 и 100, предпочтительно между 8 и 30 и особенно предпочтительно между 8 и 16 аминокислотами.

Кроме того, пептид или вариант может быть модифицирован в дальнейшем для улучшения стабильности и/или связывания с молекулами МНС в целях получения более сильного иммунного ответа. Методы для такой оптимизации пептидной последовательности хорошо известны из уровня техники и включают, например, введение обратных пептидных или непептидных связей.

Таким образом, в соответствии с другим аспектом изобретение обеспечивает фармацевтическую композицию, в которой по крайней мере один пептид или вариант включает непептидные связи.

В пептидах с обратной связью аминокислотные остатки присоединены не пептидными связями (-СОΝ^), но пептидная связь является обратной. Такие ретро-обратные пептидомиметики могут быть получены методами, известными из уровня техники, например, такими, как описано в работе МехЛге е( а1. (1997) I. Ιιηтииок 159-3237, включенной сюда путем ссылки. Этот принцип охватывает получение псевдопептидов, содержащих изменения, которые охватывают остов, но не ориентацию боковых цепей. МехЛге е( а1. (1997) показывают, что эти псевдопептиды пригодны для ответов МНС и Т-хелперных клеток. Ретро-обратные пептиды, содержащие связи NΗ-СО вместо пептидных связей СО^Н, намного более устойчивы к протеолизу.

Непептидной связью является, например, -СН₂-№, -СН₂8-, -СН₂СН₂-, -СН=СН-, -СОСН₂-, СН(ОН)СН₂-, и -СН₂8О-. Патент США № 4,897,445 обеспечивает метод твердофазного синтеза непептидных связей (-СН₂-МН) в полипептидных цепях, что включает полипептиды, синтезированные с использованием стандартной методики, и непептидную связь, синтезированную при реакции аминоальдегида и аминокислоты в присутствии NаСNВΗз.

Пептиды, включающие последовательности по изобретению, описанные выше, могут быть синтезированы с дополнительными химическими группами, находящимися на их аминном и/или карбоксильном концах, для увеличения, например, стабильности, биологической доступности и/или аффинности пептидов. Например, гидрофобные группы, такие как карбобензоксильные, данзильные или третбутилоксикарбонильные группы, могут быть добавлены к аминным окончаниям пептидов. Подобным образом, ацетильная группа или 9-фторенилметокси-карбонильная группа может быть введена в аминные окончания пептидов. Кроме того, гидрофобная группа, трет-бутилоксикарбонильная или амидная группа может быть, например, добавлена к карбоксильным окончаниям пептидов.

Далее, все пептиды по изобретению могут быть синтезированы в целях изменения их пространственной конфигурации. Например, Ό-изомер одного или более аминокислотных остатков пептида может быть использован скорее, чем обычный Ь-изомер. Более того, по крайней мере, один из аминокислотных остатков пептидов по изобретению может быть замещен одним из хорошо известных не встречающихся в природе аминокислотных остатков. Изменения, такие как данные, могут служить для повышения стабильности, биологической доступности и/или связывающих свойств пептидов по изобретению.

Подобным образом, пептид или вариант по изобретению может быть модифицирован химическим способом посредством реакции специфических аминокислот как до, так и после синтеза пептида. Примеры таких модификаций хорошо известны из уровня техники и обобщаются, например, в работе В. ЬиибЫаб, СЛетЛа1 ВеадеиЛ Гог РгоЛт МобШсабои, 3гб еб. СВС Ргекк, 2005, которая включена сюда путем ссылки. Химическая модификация аминокислот включает, но не ограничивается, модификацией с помощью ацилирования, амидирования, пиридоксилирования лизина, восстановительного алкилирования, тринитробензилирования аминных групп 2,4,6-тринитробензолсульфоновой кислотой ^N68), амидной модификацией карбоксильных групп и сульфгидрильной модификации с помощью окисления надмуравьиной кислотой цистеина до цистеиновой кислоты, образованием ртутных производных, обра

- 18 018457 зованием смешанных дисульфидов с другими тиоловыми соединениями, реакцией с малеимидом, карбоксиметилированием йодоуксусной кислотой или йодацетамидом и карбамоилированием цианатом при щелочном уровне рН, хотя не ограничиваясь ими. В этой связи специалист данной области может проконсультироваться с главой 15 раздела Сиггей Рго1осо1к в журнале Рго1ет 8с1еисе, Ейк. Сойдаи е1 а1. (Дойн Уйеу & 8оик ΝΥ 1995-2000) для получения более обширной информации о методах, связанных с химической модификацией белков.

Вкратце, модификация, например, остатков аргинила в белках часто основана на реакции вицинальных дикарбонильных соединений, таких как фенилглиоксаль, 2,3-бутандион и 1,2-циклогександион для формирования аддукта. Другим примером является реакция метилглиоксаля с остатками аргинина. Цистеин может быть модифицирован без сопутствующей модификации других нуклеофильных сайтов, таких как лизин и гистидин. В результате для модификации цистеина доступно большое число реагентов. На веб-сайтах фирм Р1егсе Сйетка1 Сотраиу, 81дта-А1йпсй и других опубликована информация о специфических реагентах.

Также распространена селективная редукция дисульфидных связей в белках. Дисульфидные связи могут быть образованы и оксидированы во время тепловой обработки биофармацевтических средств.

К-реагент Вудворда может использоваться для модификации специфических остатков глютаминовой кислоты. №3-(диметиламинопропил)-Ы'-этилкарбодиимид может использоваться для формирования внутримолекулярных поперечных связей между остатком лизина и остатком глютаминовой кислоты.

Например, диэтилпирокарбонат является реагентом для модификации остатков гистидила в белках. Гистидин может также быть модифицирован при использовании 4-гидрокси-2-ноненала.

Реакция остатков лизина и других а-аминных групп полезна, например, при связывании пептидов с поверхностями или перекрестном связывании (кросс-линкинг) белков/пептидов. Лизин является сайтом присоединения поли(этилен)гликоля и основным сайтом модификации при гликировании белков.

Остатки метионина в белках могут быть модифицированы с помощью, например, йодацетамида, бромэтиламина, хлорамина Т.

Тетранитрометан и Ν-ацетилимидазол могут быть использованы для модификации остатков тирозила. Кросс-линкинг через образование дитирозина может быть произведен с ионами перекиси водорода/меди.

В последних исследованиях по модификации триптофана используются Ν-бромсукцинимид, 2гидрокси-5-нитробензилбромид или 3-бром-3-метил-2-(2-нитрофенилмеркапто)-3Н-индол (ВРН8скатол).

Успешная модификация терапевтических белков и пептидов с РЕС-полиэтиленгликолем часто ассоциируется с увеличением циркуляторного полураспада, в то время как кросс-линкинг белков с глутаральдегидом, полиэтиленгликоль-диакрилатом и формальдегидом используется для приготовления гидрогелей. Химическая модификация аллергенов для иммунотерапии часто достигается при карбамоилировании цианатом калия.

В целом, пептиды и варианты (по крайней мере, те, что содержат пептидные связи между аминокислотными остатками) могут быть синтезированы, к примеру, Етос-полиамидным способом твердофазного пептидного синтеза, как раскрыто у Ьи и соавторов (1981) I. Огд. Сйет. 46, 3433-3436 и в прилагающихся ссылках.

Очистка может быть произведена любой техникой или комбинацией таких техник как рекристаллизация, эксклюзивная хроматография, ионообменная хроматография, хроматография гидрофобного взаимодействия и (обычно) обратнофазная высокоэффективная жидкостная хроматография с использованием, к примеру, градиентного разделения ацетонитрил/вода.

Анализ пептидов может быть произведен при использовании тонкослойной хроматографии, электрофореза, в частности капиллярного электрофореза, твердофазной экстракции (ТФЭ), обратнофазной высокоэффективной жидкостной хроматографии, аминокислотного анализа после кислотного гидролиза и масс-спектрометрического анализа при быстрой бомбардировке атомами (РАВ), а также массспектрометрический анализ МАЙШ и Е8ГО-ТОЕ.

Дальнейший аспект изобретения обеспечивает нуклеиновую кислоту (например, полинуклеотид), кодирующую пептид или вариант по изобретению. Полинуклеотид может быть, к примеру, ДНК, кДНК, ПНК, ЦНК, РНК, как одно-, так и/или двухнитевыми; натуральными или стабилизированными формами полинуклеотидов, таких как, к примеру, полинуклеотиды с фосфоротиоатным остовом или их комбинациями и может или не может содержать интроны в период времени кодирования для пептида. Разумеется, только пептиды, содержащие встречающиеся в природе аминокислотные остатки, присоединенные природными пептидными связями, могут кодироваться полинуклеотидом. Еще один дальнейший аспект изобретения обеспечивает вектор экспрессии, способный экспрессировать полипептид в соответствии с изобретением. Векторы экспрессии для различных видов клеток хорошо известны из уровня техники и могут быть выбраны без проведения излишних экспериментов.

Как правило, ДНК вводится в вектор экспрессии, такой как плазмида, с правильной ориентацией и корректной рамкой считывания экспрессии. Если необходимо, то ДНК может быть сцеплена с адекватными транскрипционными и трансляционными регулирующими контрольными нуклеотидными после

- 19 018457 довательностями, распознающимися желательным хозяином, хотя такой контроль обычно имеется в векторе экспрессии. Вектор вводится затем хозяину стандартными способами. С руководством можно ознакомиться, к примеру, в работе 8;·ιιηΜοο1< и соавторов (1989) Μο1еси1а^ Οοηίηβ, А ^аЬο^аίο^у Мапиа1, Со1Т 8рппд На^г ^аЬο^аίο^у, Со1Т 8рппд ^Λογ, ΝΥ.

В особенно предпочтительном воплощении изобретения, однако, фармацевтическая композиция включает по крайней мере два пептида, состоящих из аминокислотных последовательностей в соответствии с 81X) II) № 1 по 8ЕО II) № 15.

Оптимальное количество каждого пептида, включаемого в вакцину, и оптимальная схема дозировки может быть определена специалистом данной области без проведения излишних экспериментов. Например, пептид или его вариант может приготавливаться для внутривенной (ί. ν.) инъекции, подкожной (з. с.) инъекции, внутрикожной (ί. Т.) инъекции, внутрибрюшной (ί. р.) инъекции, внутримышечной (ί. т.) инъекции. Предпочтительные пути введения пептидной инъекции - з.с, 1.Т., 1.р., 1.т. и ί.ν. Предпочтительными путями введения инъекции ДНК являются 1.Т., 1.т., з.с, 1.р. и ί.ν. Вводиться могут дозы, к примеру, между 1 и 500 мг, 50 и 1,5 мг, предпочтительно от 125 до 500 мкг пептида или ДНК и будут зависеть от соответствующего пептида или ДНК. Дозы в данных пределах успешно использовались в предыдущих клинических исследованиях (Βπιηδνίβ Р.Р., АатТа1 8., С)ег18еп М.К., КуаШенп С., Маг^у^кЕ СппъгиТ Ок, 8νе I., Оугкаид М., Тгаскзе1 8., Ми11ег М., Епкзеп кА., СаиТегпаск С.; ТеШтегазе рерПТе νΗ^ίηΗίίοη: а рказе VII зЦ.1Ту ίη ракегИз \νί11ι ηοη-зтаИ се11 1ипд сапсег; Сапсег Iттиηο1 [ттигтоШег. 2006; 55(12): 1553-1564; М. 81аек1ег А., 8ίеηζ1 Р. Υ., О1е1пск Т., Е1зеп А., НаГегкатр 1., Веск А., Мауег 8., \Уа11ег Н., 8шдк ί., Рпзск С. С., 8ПеГ; Ап οреη 1аЬе1 зФТу ίο еνа1иаίе 1ке заГЫу апТ ^ттиηοдеπ^с^ίу οί Не рер11Те ЬазеТ сапсег гассте ГМА901, А8СО теекпд 2007; АЬз1гас1 Νο 3017).

Фармацевтическая композиция по изобретению может быть составлена так, что выбор, номер и/или количество пептидов, присутствующих в композиции является/являются ткане-, раково- и/или пациентспецифической/ими. Например, руководством для точного отбора пептидов могут служить образцы экспрессии родительских белков в данной ткани во избежание побочных эффектов. Выбор может зависеть от специфического типа рака, от которого страдает пациент, которому предназначено лечение, в равной степени, как и от статуса заболевания, ранних схем лечения, иммунного статуса пациента и, естественно, от НЬА-гаплотипа пациента. В дальнейшем вакцина в соответствии с изобретением может содержать индивидуализированные компоненты, соответствующие личным потребностям отдельного пациента. Примерами являются различные количества пептидов в соответствии с экспрессией связанных с ними ТАА у конкретного пациента, нежелательными побочными эффектами в связи с аллергиями или другими лечениями и согласованием для вторичного лечения, следующего за первым циклом или схемой лечения.

Для композиции, предназначенной для использования в качестве вакцины против КРР, например, будут избегаться пептиды, родительские белки которых экспрессированы в больших количествах в нормальных тканях, или они будут присутствовать в малых количествах в композиции по изобретению. С другой стороны, если известно, что опухоль пациента экспрессирует большие количества конкретного белка, то соответствующая фармацевтическая композиция для лечения данного вида рака может быть представлена в больших количествах и/или может включать более одного пептида, специфического для данного особенного белка или сигнального пути данного белка.

Специалист данной области будет способен выбрать предпочтительные комбинации иммуногенных пептидов при проверке, например, поколения Т-клеток ίη νίίτο в равной степени, как их эффективности и общего присутствия, пролиферации, аффинности и размножения конкретных Т-клеток для конкретных пептидов, и функциональных свойств Т-клеток, например, при анализе выработки ΣΕΝ-γ (см. также примеры ниже). Обычно наиболее эффективные пептиды комбинируются, затем, в качестве вакцины в соответствии с целями, описанными выше.

Подходящая вакцина будет предпочтительно содержать между 1 и 20 пептидами, более предпочтительно 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, или 20 различных пептидов, в дальнейшем предпочтительно 6, 7, 8, 9, 10 11, 12, 13, или 14 различных пептидов и наиболее предпочтительно 14 различных пептидов. Длина пептида для применения в вакцине против рака может быть любым подходящим пептидом. В особенности, он может быть подходящим 9-мерным пептидом или подходящим 7- или 8- или 10- или 11-мерным пептидом или 12-, 13-, 14- или 15-мером. Более длинные пептиды могут быть также подходящими; 9-мерные или 10-мерные пептиды, как описано в приложенных табл. 1 и 2, являются предпочтительными для пептидов МНС класса I, в то время как 12-15-меры предпочтительны для пептидов МНС класса II.

Пептид(ы) формирует(ют) вакцину против опухоли или рака. Она может вводиться непосредственно пациенту, в пораженный орган или систематично, или вноситься ех νίνο в клетки, полученные от пациента, или в человеческую клеточную линию, которые затем могут вводиться пациенту или использоваться ίη νίίτο для селекции субпопуляции из иммунных клеток, полученных от пациента, которые после этого вновь вводятся пациенту.

Пептид может быть, по существу, чистым или комбинированным с иммуностимулирующим адъювантом (см. ниже) или использоваться в комбинации с иммуностимулирующими цитокинами или вводиться с подходящей системой доставки, например, липосомами. Пептид может быть также конъюгиро

- 20 018457 ван в подходящий носитель, такой как гемоцианин лимфы улитки (КЬН) или маннан (см. \У0 95/18145 и Ьоидеиескег е1 а1 (1993) Аип. ΝΥ Асаб. 8сГ 690,276-291). Пептид может быть также меченым или являться белком слияния или гибридной молекулой. Пептиды, последовательность которых дана в настоящем изобретении, как ожидается, стимулируют СЭ4 или СЭ8 ЦТЛ. Тем не менее, стимуляция более эффективна в присутствии помощи, производимой Т-клетками, положительными для противоположного СО. Таким образом, для эпитопов МНС II класса, которые стимулируют СЭ4 ЦТЛ, партнеры слияния или секции гибридной молекулы адекватно обеспечивают эпитопы, которые стимулируют СЭ8положительные Т-клетки. С другой стороны, для эпитопов МНС I класса, которые стимулируют СЭ8 ЦТЛ, партнеры слияния или секции гибридной молекулы адекватно обеспечивают эпитопы, которые стимулируют СО4-положительные Т-клетки. СЭ4- и СО8-стимулирующие эпитопы хорошо известны из уровня техники и включают те, что были идентифицированы в настоящем изобретении.

Чтобы вызвать иммунный ответ, обычно необходимо включить наполнители, что приводит к большей иммуногенности композиции. Таким образом, в предпочтительном воплощении изобретения фармацевтическая композиция включает далее по крайней мере один подходящий адъювант.

Адъюванты - это вещества, которые неспецифически усиливают или потенцируют иммунный ответ (например, иммунные ответы, опосредованные ЦТЛ или хелперными Т-клетками (Т_Н) на антиген, и могут, таким образом, рассматриваться как полезные в медикаменте настоящего изобретения. Подходящие адъюванты включают, но не ограничиваются, 1018 Ι88, соли алюминия, Атрйуах, А815, ВСО, СР870,893, СрО7909, СуаА, б8Ь1М, ОМ-С8Е, 1С30, 1С31, Имиквимод, 1тиЕас! 1МР321, Ι8 Ра!сй, Ι88, Ι8СОМАТВ1Х. 1иу1ттиие, ЫроУас, МЕ59, монофосфорил липид А, Монтанид !М8 1312, Монтанид КА 206, Монтанид КА 50У, Монтанид КА-51, ОК-432, ОМ-174, ОМ-197-МР-ЕС, ОЭТАК, векторная система РерТе1®, микрочастицы РЬС, резиквимод, 8КЕ172, вирусомы и другие вирусоподобные частицы, ΥΡ17Ό, УЕСЕ 1гар, В848, Бета-глюкан, Рат3Сук, стимулон Ас.|ш1а'к 0821 (Ас.|ш1а Вю1есй, \Уогсек1ег, МА, И8А) который получают из сапонина, микобактериальные экстракты и синтетические имитации бактериальных клеточных стенок и другие запатентованные адъюванты, такие как В1Ь1'к ЭеЮх, 0ш1 или 8ирегГок. Предпочтительными адъювантами являются такие как неполный адъювант Фрейнда или ГМ-КСФ. Несколько иммунологических адъювантов (например, МЕ59), специфических для дендритных клеток, и их приготовление были описаны ранее (Оиршк М., Мигрйу Т.Е, Н1дд1пк Ό., идоххоК М., уаи №к! С., 0ΐΐ С., МсЭопа1б Э.М.; ОепбпРс се11к йИегпаКхе уассте аб)нуап( айег 1п1гатнкси1аг пцесРоп; Се11 ИптипоГ 1998; 186(1): 18-27; АШкои А.С.; Тйе тобе оГ асйои оГ 1ттиио1од1са1 аб)нуап1к; Эеу Вю1 81апб. 1998; 92:311). Также могут использоваться цитокины. Несколько цитокинов были присоединены напрямую для оказания влияния на миграцию дендритных клеток к лимфоидным тканям (например, Т№-а), ускоряя созревание дендритных клеток до эффективных, презентирующих антиген Т-лимфоцитам, клеток (например, ГМ-КСФ, ИЛ-1 и ИЛ-4) (патент США № 5849589, специфически включённый сюда в его целостности путём ссылки) и действуя как иммуноадъюванты (например, ИЛ-12) (СаЬгйоуюй Ό.Ι., Сипшидйат Н.Т., СагЬоие Э.Р.; ГО-12 аиб тн1ап( Р53 рерйбе-ри1кеб беибгШс се11к Гог Не кресШс иптипоШегару оГ саисег; 1 Етрйайк Титог Iттииο1. 1996 (6):414-418).

Об иммуностимулирующих олигонуклеотидах СрС также сообщалось, что они усиливают эффекты адъювантов в составе вакцин. Теоретически не связанные, СрС-олигонуклеотиды при активации врождённой (неадаптивной) иммунной системы действуют с помощью То11-подобных рецепторов (ТЬВ), в основном ТЬВ9. Вызванная СрО активация ТЬВ9 усиливает антиген-специфические гуморальные и клеточные ответы на широкий спектр антигенов, включая пептидные или белковые антигены, живые или убитые вирусы, вакцины из дендритных клеток, аутологичные клеточные вакцины и полисахаридные конъюгаты как в профилактических, так и терапевтических вакцинах. Более важно то, что улучшается созревание и дифференциация дендритных клеток, приводя к улучшенной активации Т_Н1 -клеток и интенсивной генерации цитотоксических Т-лимфоцитов (ЦТЛ) даже при отсутствии помощи СЭ4 Тклеток. Отклонение в сторону ТН1, вызванное стимуляцией ТЬВ9, сохраняется даже в присутствии вакцинных адъювантов, таких как квасцы или неполный адъювант Фрейнда (ГРА), которые обычно способствуют отклонению в сторону ТН2. СрС-олигонуклеотиды проявляют даже большую адъювантную активность, если они входят в состав или вводятся вместе с другими адъювантами или в таких составах как микрочастицы, наночастицы, липидные эмульсии или подобных составах, которые в особенности необходимы для инициации сильного ответа, если антиген относительно слаб. Они также ускоряют иммунную реакцию и позволяли снизить дозы антигена на приблизительно два порядка величины с ответами антитела, сравнимыми с полной дозой вакцины без СрО в некоторых экспериментах (АгГйиг М. Кпед, Тйегареийс ро1епРа1 оГ То11-11ке гесерЮг 9 асйуайоп, МИиге Веу1е^к, Эгид О|ксоуегу, 2006, 5, 471-484). В патенте США № 6406705 В1 описывается комбинированное применение СрО-олигонуклеотидов, адъювантов, не включающих нуклеиновые кислоты, и антигена для вызывания антиген-специфического иммунного ответа. Имеющимся в продаже антагонистом СрО ТЬВ9 является б8^IМ (контурный иммуномодулятор двойного действия) компании «Мо1одеп» (Берлин, Германия), который является предпочтительным компонентом фармацевтической композиции настоящего изобретения. Также могут быть использованы другие молекулы, связывающиеся с ТЬВ, такие как РНК, связывающаяся с ТЬВ 7, ТЬВ 8

- 21 018457 и/или ТЬВ 9.

Другие примеры полезных адъювантов включают, но не ограничиваются химически модифицированными СрС (например, СрВ, 1бега), Ро1у(1:С) (например, ро1у1:С12И), не-Срб бактериальной ДНК или РНК, а также иммуноактивными малыми молекулами и антителами, такими как имидазохинолины, циклофосфамид, сунитиниб, бевацизумаб, целебрекс, NСX-4016, силденафил, тадалафил, варденафил, сорафениб, X^-999, СР-547632, пазопаниб, ΖΌ2171, АΖ^2171, ипилимумаб, тремелимумаб и 8С58175, которые могут действовать терапевтически и/или как адъювант. Количества и концентрации адъювантов и вспомогательных веществ, полезных в контексте настоящего изобретения, могут быть легко определены опытным специалистом без проведения излишних экспериментов.

Предпочтительными адъювантами являются б8ЫМ, ВСС, 0К432, имиквимод, РеуГГег и 1иу1ттипе.

В предпочтительном воплощении фармацевтической композиции в соответствии с изобретением адъювант выбран из группы, состоящей из колониестимулирующих факторов, таких как гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (ГМ-КСФ, сарграмостим).

В предпочтительном воплощении фармацевтической композиции в соответствии с изобретением адъювантом является имиквимод.

Эта композиция используется для парентерального введения, такого как подкожное, внутрикожное, внутримышечное или оральное введение. Для этого пептиды и факультативно другие молекулы растворяются или суспендируются в фармацевтически приемлемом, предпочтительно водном носителе. Помимо этого, композиция может содержать наполнители, такие как буферы, связующие агенты, разрушающие агенты, разбавители, вкусоароматические добавки, смазочные вещества и т.д. Пептиды могут быть также введены вместе с иммуностимулирующими веществами, такими как цитокины. Пространный список наполнителей, которые могут быть использованы в такой композиции, может быть взят, например, из А. К1ЬЬе, НапбЬоок оГ Рйагтасеийса1 Ехс1р1еп1к, 3. Еб., 2000, изд. Атепсап Рйагтасеийса1 АккоааЕоп апб рйагтасеи11са1 ргекк. Композиция может применяться для предупреждения, профилактики и/или лечения аденоматозных или раковых заболеваний, предпочтительно КРР.

Цитотоксические Т-клетки (ЦТЛ) распознают антиген в форме пептида, связанного с молекулой МНС скорее, чем интактный чужеродный антиген сам по себе. Сама молекула МНС находится на клеточной поверхности антигенпрезентирующей клетки. Так, активация ЦТЛ возможна, только если имеется в наличии тримерный комплекс из пептидного антигена, молекулы МНС и АПК. Соответственно, иммунный ответ может быть усилен, если для активации ЦТЛ использован не только пептид, а если, кроме того, добавлены АПК с соответствующей молекулой МНС.

Поэтому в предпочтительном воплощении фармацевтическая композиция в соответствии с настоящим изобретением дополнительно содержит по крайней мере одну антигенпрезентирующую клетку.

Антигенпрезентирующая клетка (или клетка-стимулятор) типично имеет молекулу МНС I или II класса на своей поверхности и в одном воплощении является, по существу, не способной самостоятельно нагружать на молекулу МНС I или II класса выбранный антиген. Как более детально описано ниже, молекула МНС I или II класса может быть легко нагружена выбранным антигеном ш уйго.

Предпочтительно в клетке млекопитающих не хватает или имеется пониженный уровень или пониженная функция пептидного транспортера ТАР. Подходящие клетки, в которых не хватает пептидного транспортера ТАР, включают Т2, ВМА-8 и клетки дрозофилы. ТАР - это Транспортер, ассоциированный с Процессингом Антигена.

Нагружающая пептидом дефектная клеточная линия Т2 человека имеется в наличии в Атепсап Туре СиИиге Со11есйоп, 12301 Рагк1а\уп Опус, ВоскуШе, Магу1апб 20852, США под каталоговым № СВЬ 1992; клеточная линия дрозофилы линия 8сйпе1бег 2 имеется в наличии в АТСС под каталоговым № СВЬ 19863; клеточная линия мыши ВМА-8 описывается у Кагге и Ьщпддгеп (1985) 1. Ехр. Меб. 162, 1745. Данные клеточные линии могут быть использованы в качестве АПК, и из-за недостатка ТАР практически все пептиды, презентируемые МНС I класса, будут пептидами при тщательной проверке, использованными для загрузки извне пустых молекул МНС I класса этих клеточных линий, следовательно, все эффекты будут отчетливо относиться к использованным пептидам.

Предпочтительно, чтобы антигенпрезентирующие клетки являлись дендритными клетками. Подходящим образом, дендритные клетки являются аутологичными дендритными клетками, в которые импульсным методом введен антигенный пептид. Антигенный пептид может быть любым подходящим антигенным пептидом, который вызывает адекватный Т-клеточный ответ. Т-клеточная терапия с использованием аутологичных дендритных клеток с введенными импульсным методом пептидами из опухолеассоциированного антигена раскрывается у Мигрйу и соавторов (1996) Тйе Ргок1а1е 29, 371-380 апб Т)иа е1 а1 (1997) Тйе РгоккПе 32, 272-278.

Так, в предпочтительном воплощении настоящего изобретения в фармацевтическую композицию, содержащую по крайней мере одну антигенпрезентирующую клетку, введен импульсным методом или погружен пептид, к примеру, методом примера 4.

В качестве альтернативы антигенпрезентирующая клетка включает модель экспрессии, кодирующей пептид. Полинуклеотид может быть любым подходящим полинуклеотидом и предпочтительно, что

- 22 018457 бы он был способен к трансдукции дендритной клетки, таким образом, приводя к презентации пептида и индукции иммунитета.

Как правило, нуклеиновая кислота по изобретению может быть включена в вирусный полинуклеотид или вирус. Например, аденовирус-трансдуцированные дендритные клетки проявляли способность индуцировать антиген-специфический противоопухолевый иммунитет по отношению к МИС1 (см. 6опд е( а1 (1997) 6епе Ткег. 4, 1023-1028). Подобным образом могут быть использованы системы, основанные на аденовирусе (см., например, Мап е( а1 (1997) Нит. 6епе Ткег. 8, 1355-1363); могут быть использованы ретровирусные системы (8реск! е( а1 (1997) 1. Ехр. Мей. 186-1221 и 8хаЬо1ск е( а1 (1997)) также может быть использован опосредованный частицами крови перенос в дендритные клетки (Тийпд е( а1 (1997) Еиг. ί. Iттиηо1. 27-2707); а также может быть использована РНК (АкЫеу е( а1 (1997) ί. Ехр. Мей. 186 1182).

В целом, фармацевтическая композиция по изобретению, содержащая (а) нуклеиновую(ые) кислоту(ы) по изобретению, может вводиться подобным образом, как и те, что содержат пептид(ы) по изобретению, например, внутривенно, внутриартериально, внутрибрюшно, внутримышечно, внутрикожно, внутрь опухоли, орально, дермально, назально, буккально, ректально, вагинально, с помощью ингаляции или посредством топического введения.

По причине действия механизмов уклонения опухоль часто вырабатывает резистентность к медикаменту, которым она лечится. Резистентность к медикаменту может появиться во время лечения, и она проявляется в метастазах и рецидивировании опухоли. Во избежание таковой медикаментозной резистентности опухоль обычно лечат комбинацией медикаментов, и для лечения метастазов и опухоли, возвращающейся повторно после периода ремиссии, часто требуется комбинация, отличающаяся от первой. Поэтому, в одном аспекте изобретения фармацевтическая композиция вводится в соединении со вторым противораковым веществом. Второе противораковое вещество может вводиться до, после или одновременно с фармацевтической композицией по изобретению. Одновременное введение может быть достигнуто, например, при смешивании фармацевтической композиции по изобретению со вторым противораковым веществом, при условии совместимости их химических свойств. Другая возможность для одновременного введения - это введение композиции и противоракового вещества в один и тот же день, независимо от способа введения, так что фармацевтическая композиция по изобретению может быть, например, инъецирована, в то время как второе противораковое вещество вводится, например, орально. Фармацевтическая композиция и второе противораковое вещество могут также вводиться в рамках одного и того же курса лечения, но в разные дни и/или в рамках отдельных курсов лечения.

В другом аспекте настоящее изобретение обеспечивает метод для лечения или предупреждения рака у пациента, включающий введение пациенту терапевтически эффективного количества любой из фармацевтических композиций по изобретению.

Терапевтически эффективным количеством будет количество, достаточное для вызывания иммунного ответа, в частности, активации субпопуляции ЦТЛ. Специалист данной области может легко определить, будет то или иное количество эффективным, при использовании стандартных иммунологических методов, таких как те, что приводятся в примерах к настоящей спецификации. Другим способом мониторинга эффекта от конкретного количества фармацевтической композиции является наблюдение роста обработанной опухоли и/или ее рецидива.

В особенно предпочтительном воплощении настоящего изобретения фармацевтическая композиция применяется в качестве противораковой вакцины.

Композиция, содержащая пептиды или кодирующие пептиды нуклеиновые кислоты, может также формировать вакцину против опухоли или рака. Она может вводиться непосредственно пациенту в пораженный орган или систематично, или вноситься ех у1уо в клетки, полученные от пациента, или в человеческую клеточную линию, которые затем могут вводиться пациенту или использоваться ш νί(ΐΌ для селекции субпопуляции из иммунных клеток, полученных от пациента, которые после этого вновь вводятся пациенту.

Композиция по изобретению может использоваться в методе лечения или в качестве вакцины против рака. Рак может быть раком ротовой полости и глотки, раком пищеварительного тракта, раком толстой кишки, прямой кишки и анального отверстия, раком дыхательных путей, раком груди, раком шейки матки, влагалища и наружных половых органов, раком тела матки и яичника, раком мужских половых путей, раком мочевыводящих путей, раком костной и мягкой ткани и саркомой Капоши, меланомой кожи, меланомой глаза и немеланомным раком глаза, раком головного мозга и центральной нервной системы, раком щитовидной железы и других эндокринных желез, лимфомой Ходжкина, лимфомой неХоджкина и миеломой, предпочтительно раком почки, колоректальным раком, раком легкого, раком груди, раком поджелудочной железы, раком простаты, раком желудка, раком головного мозга, гастроинтестинальной стромальной опухолью (6!8Т) или глиобластомой.

В наиболее предпочтительном воплощении метода лечения или вакцины в соответствии с изобретением вакцина является комплексной пептидной противоопухолевой вакциной для лечения колоректального рака. Предпочтительно, чтобы вакцина включала комплекс опухолеассоциированных пептидов, выбранных из последовательностей 8ЕО ГО № 1 по 15, которые локализованы и были идентифицирова

- 23 018457 ны на первичных клетках колоректального рака. Этот комплекс включает пептиды НЬА класса I и II. Пептидный комплекс может также содержать по крайней мере один пептид, например, из корового антигена НВУ, используемый в качестве пептида положительного контроля, служащего как антигенный маркер для проверки эффективности внутрикожного введения. В одном особенном воплощении вакцина состоит из 14 отдельных пептидов (в соответствии с 8ЕЦ Ш № 1 по 15) с весом каждого пептида от около 1500 до около 75 мкг, предпочтительно от около 1000 до около 750 мкг и более предпочтительно от около 500 до около 600 мкг и наиболее предпочтительно около 578 мкг, которые все могут быть очищены на ВЭЖХ и ионообменной хроматографии и получены в виде белого до серовато-белого порошка. Лиофилизат предпочтительно растворяют в гидрокарбонате натрия и используют для внутрикожной инъекции в течение 30 мин после восстановления при комнатной температуре. В соответствии с настоящим изобретением предпочтительные количества пептидов могут варьироваться между около 0,1 и 100 мг, предпочтительно между около 0,1 до 1 мг и, наиболее предпочтительно, между около 300 до 800 мкг на 500 мкл раствора. Термин около подразумевает здесь +/- 10% заданного объема, если не указано другое. Специалист данной области будет способен установить фактическое количество пептида для использования, исходя из нескольких факторов, таких как, например, иммунный статус отдельного пациента и/или количество ТИМАР (опухолеассоциированный пептид), который презентируется в конкретном виде рака. Пептиды настоящего изобретения могут обеспечиваться в других подходящих формах (стерильные растворы и т.д.) вместо лиофилизата.

Фармацевтический препарат по настоящему изобретению, содержащий пептиды и/или нуклеиновую(ые) кислоту(ы) в соответствии с изобретением, водится пациенту, страдающему аденоматозным или раковым заболеванием, ассоциированным с соответствующим пептидом или антигеном. Тем самым может быть инициирован иммунный ответ, опосредованный Т-клетками.

Предпочтительна фармацевтическая композиция в соответствии с изобретением, в которой количество (в особенности опухолеассоциированного(ых)) пептида(ов), нуклеиновых(ой) кислот(ы) в соответствии с изобретением или вектора(ов) экспрессии в соответствии с изобретением, как присутствующие в указанной композиции, являе(ю)тся ткане-, раково- и/или пациент-специфическим.

В другом предпочтительном воплощении изобретения вакцина является вакциной из нуклеиновой кислоты. Известно, что инокуляция вакциной из нуклеиновой кислоты, такой как ДНК-вакцина, кодирующей полипептид, приводит к Т-клеточному ответу. Она может вводиться непосредственно пациенту, в пораженный орган или систематично, или вноситься ех у1уо в клетки, полученные от пациента, или в человеческую клеточную линию, которые затем могут вводиться пациенту или использоваться ш уйго для селекции субпопуляции из иммунных клеток, полученных от пациента, которые после этого вновь вводятся пациенту. Если нуклеиновая кислота введена в клетки ш уйго, то может быть полезно, чтобы клетки были трансфецированными, чтобы ко-экспрессировать иммуностимулирующие цитокины, такие как интерлейкин-2 или ГМ-КСФ (СМ-С8Р). Нуклеиновая(ые) кислота(ы) может/могут быть, по существу, чистым или комбинированным с иммуностимулирующим адъювантом или использоваться в комбинации с иммуностимулирующими цитокинами или вводиться с подходящей системой доставки, например, липосомами. Вакцина из нуклеиновой кислоты может также вводиться с адъювантом, таким как те, что описывались выше для пептидных вакцин. Предпочтительно, если вакцина из нуклеиновой кислоты вводится без адъюванта.

Полинуклеотид может быть, по существу, чистым или содержаться в подходящем векторе или системе доставки. Подходящие векторы и системы доставки включают вирусные системы, такие как те, что основаны на аденовирусе, вирусе осповакцины, ретровирусах, вирусе герпеса, аденоассоциированном вирусе или гибридах, содержащих элементы более чем одного вируса. Невирусные системы доставки включают катионные липиды и катионные полимеры, хорошо известные из уровня техники в области доставки ДНК. Также может быть использована физическая доставка, такая как посредством генпистолета. Пептид или закодированный нуклеиновой кислотой пептид может быть белком слияния, например, с эпитопом из столбнячного токсина, который стимулирует СИ4-положительные Т-клетки.

Соответственно, любая нуклеиновая кислота, вводимая пациенту, является стерильной и свободной от пирогенов. Обнаженная ДНК может вводиться внутримышечно или внутрикожно или подкожно. Обычно вакцина из нуклеиновой кислоты может включать любое подходящее средство доставки нуклеиновой кислоты. Нуклеиновая кислота, предпочтительно ДНК, может быть также доставлена в липосоме или как часть системы доставки вирусного вектора. Предпочтительно, если вакцина из нуклеиновой кислоты, такая как ДНК-вакцина, вводится в мышцу, тогда как пептидные вакцины предпочтительно вводятся к.с. или 1.й. Предпочтительно также, если вакцина вводится в кожу.

Полагают, что поглощение нуклеиновой кислоты и экспрессия закодированного полипептида профессиональными антигенпрезентирующими клетками, такими как дендритные клетки, может быть механизмом прайминга иммунного ответа; тем не менее, дендритные клетки могут не быть трансфецированы, однако они по-прежнему важны, так как они могут поглощать экспрессированный пептид из трансфецированных клеток в ткани (кросс-прайминг, например Тйотак А.М., 8аи1атк1его Ь.М., Йи1х Е.В., Агткйоид Т.И., Сйеи Υ.Ο., Ниаид Ь.р., Ьайети И.А., Соддшк М., НгиЬаи В.Н., 1аГГее Е.М. Меко1йе1ш-кресШс СИ8(+) Т-се11 гекроикек ртоу1йе еу1йеисе оГ ш у1уо сгокк-рйтшд Ьу аийдеи-ргекеийид се11к ш уасс1иа1ей

- 24 018457 рапсгеайс сапсег райейз. 1 Ехр Мей. 2004 Аид 2;200(3):297-306).

Полинуклеотид-опосредованная иммунизационная терапия против рака описывается у Сопгу и соавторов (1996) 8ет1пагз т Опсо1оду 23, 135-147; Сопйоп е( а1. (1996) Иайие Мейкте 2, 1122-1127; Сопд е( а1 (1997) Иайие Мейкте 3,558-561; Ζΐιηί е( а1 (1996) 1. Iттиηο1. 156, 700-710; Сгайат е( а1 (1996) Ш 1. Сапсег 65, 664-670; и Вцгсйей е( а1 (1996) стр. 309-313 В: Вгеаз! Сапсег, Айуапсез т Ью1оду апй (йегареийсз, Са1уо е( а1 (ейз), 1ойп ЫЬЬеу Епго1ех1, которые все включены в описание путем ссылки.

Можно также с пользой направлять вакцину в специфические популяции клеток, например, в антигенпрезентирующие клетки либо на месте инъекции с использованием нацеленных векторов и систем доставки, либо при селективной очистке такой клеточной популяции у пациента с введением ех угуо пептида или нуклеиновой кислоты (например, дендритные клетки могут быть отсортированы, как описывается у ΖΙμι! и соавторов (1995) В1оой 86, 3295-3301; РоШ е( а1 (1996) 8сапй. 1. Iттиηο1οду 43, 646651). Например, нацеленные векторы могут включать ткане- или опухолеспецифический промотор, который направляет экспрессию антигена в подходящее место.

Наконец, вакцина в соответствии с изобретением может зависеть от специфического типа рака, от которого страдает пациент, которому предназначено лечение, в равной степени, как и от статуса заболевания, ранних схем лечения, иммунного статуса пациента и, естественно, от НЬА-гаплотипа пациента. В дальнейшем вакцина в соответствии с изобретением может содержать индивидуализированные компоненты, соответствующие личным потребностям отдельного пациента. Примерами являются различные количества пептидов в соответствии с экспрессией связанных с ними ТАА у конкретного пациента, нежелательными побочными эффектами в связи с аллергиями или другими лечениями и согласованием для вторичного лечения, следующего за первым циклом или схемой лечения.

Кроме того, пептиды настоящего изобретения полезны не только для лечения рака, но и также в качестве диагностических средств. Так как пептиды были получены из глиобластомы, и так как было определено, что данные пептиды не присутствуют в нормальных тканях, то эти пептиды могут быть использованы для постановки диагноза о наличии рака.

Присутствие пептидов настоящего изобретения на тканевых биоптатах может помочь патологу в постановке диагноза рака. Детекция конкретных пептидов настоящего изобретения с помощью антител, масс-спектрометрии или других методов, известных из уровня техники, может дать знать патологу, что ткань поражена злокачественным или воспалительным или же заболеванием общего порядка. Присутствие групп пептидов настоящего изобретения может сделать возможной классификацию или субклассификацию пораженных заболеванием тканей.

Детекция пептидов настоящего изобретения на образцах пораженной заболеванием ткани может позволить принять решение о преимуществах от терапии, воздействующей на иммунную систему, в особенности, если Т-лимфоциты, как известно или ожидается, задействованы в механизме действия. Отсутствие экспрессии МНС является хорошо описанным механизмом, при котором инфицированные или злокачественные клетки уклоняются от иммунного надзора. Так, присутствие пептидов настоящего изобретения показывает, что данный механизм не используется проанализированными клетками.

Пептиды настоящего изобретения могут использоваться для анализа ответов лимфоцитов на пептиды настоящего изобретения, таких как ответы Т-клеток или ответы антител на пептиды настоящего изобретения или пептиды настоящего изобретения в комплексе с молекулами МНС. Данные иммунные ответы лимфоцитов могут использоваться в качестве прогностических маркеров для принятия решения о дальнейших этапах терапии. Данные иммунные ответы могут также использоваться в качестве суррогатных маркеров в иммунотерапевтических подходах, направленных на индуцирование ответов лимфоцитов с помощью различных средств, как, например, вакцинации белком, нуклеиновыми кислотами, аутологичными материалами, адоптивного переноса лимфоцитов. При генной терапии ответы лимфоцитов на пептиды настоящего изобретения могут быть рассмотрены в рамках оценки побочных эффектов. Мониторинг ответов лимфоцитов может также быть ценным инструментом для последующих обследований в случае трансплантации, к примеру, для детекции реакций хозяин против трансплантата и трансплантат против хозяина.

Пептиды настоящего изобретения могут использоваться для генерации и разработки специфических антител к комплексам МНС/пептид. Они могут быть использованы в терапии, нацеливающей токсины или радиоактивные вещества на пораженную ткань. Другим видом использования данных антител может быть нацеливание радионуклидов на пораженную ткань в целях визуализации, такой как РЕТ (позитронно-эмиссионная томография). Это может помочь в обнаружении небольших метастазов или в определении размера и точного расположения пораженных тканей. Кроме того, пептиды могут быть использованы для верификации диагноза патолога, поставленного на основании биоптата.

В другом его аспекте настоящее изобретение относится к комплекту, включающему: (а) контейнер, содержащий фармацевтическую композицию, описанную выше, в виде раствора или в лиофилизованной форме; (Ь) опционально - второй контейнер, содержащий разбавитель или восстанавливающий раствор для лиофилизованного состава; и (с) опционально - инструкции по (ί) применению раствора или (ίί) восстановителя, и/или по применению лиофилизованного состава. В дальнейшем оборудование может включать один или более (ίίί) буфер, (ίν) разбавитель, (ν) фильтр, (νί) иглу или (νίί) шприц. Контейнер

- 25 018457 является предпочтительно флаконом, ампулой, шприцем или пробиркой; и он также может быть контейнером многоразового использования. Фармацевтическая композиция предпочтительно лиофилизована.

Вспомогательное оборудование настоящего изобретения предпочтительно включает лиофилизованный состав настоящего изобретения в подходящем контейнере и инструкции для ее восстановления и/или по ее применению. Подходящие контейнеры включают, например, флаконы, ампулы (например, двухкамерные ампулы), шприцы (такие как двухкамерные шприцы) и пробирки. Контейнер может быть сделан из разнообразных материалов, таких как стекло или пластик. Предпочтительным образом, вспомогательное оборудование и/или контейнер содержит инструкции для, или связанные с контейнером, которые дают указания для восстановления и/или применения. Например, на этикетке может быть указано, что лиофилизованный состав должен восстанавливаться до пептидных концентраций, как те, что описаны выше. На этикетке в дальнейшем может быть указано, что состав применяется или предназначается для подкожного введения.

Контейнер с составом может быть ампулой многоразового использования, которая позволяет повторное введение (например, от 2-6 введений) восстановленного состава. Вспомогательное оборудование может включать в дальнейшем второй контейнер, включающий подходящий разбавитель (например, раствор бикарбоната натрия).

При смешивании разбавителя и лиофилизованного состава окончательная концентрация пептида в восстановленном составе составляет предпочтительно по крайней мере 0,15 мг/мл/пептид (=75 мкг) и предпочтительно не более чем 3 мг/мл/пептид (=1500 мкг). Вспомогательное оборудование может в дальнейшем включать другие материалы, желательные с коммерческой и с точки зрения пользователя, включая другие буферы, разбавители, фильтры, иглы, шприцы и упаковочные вкладыши с инструкциями по применению.

Вспомогательное оборудование настоящего изобретения может иметь один контейнер, который содержит состав фармацевтических композиций в соответствии с настоящим изобретением с или без других компонентов (например, других соединений или фармацевтических композиций этих других соединений) или может иметь отдельные контейнеры для каждого компонента.

Вспомогательное оборудование по изобретению предпочтительно включает состав по изобретению, укомплектованный для применения в комбинации с ко-введением второго соединения (такого как адъюванты (например, ГМ-КСФ), химиотерапевтического средства, натурального продукта, гормона или антагониста, средства против ангиогенеза или ингибитора; апоптоз-индуцирующего средства или хелатора) или их фармацевтической композиции. Компоненты вспомогательного оборудования до введения пациенту могут предварительно быть организованы в комплекс, или же каждый компонент может находиться в отдельном отличном контейнере. Компоненты вспомогательного оборудования могут обеспечиваться одним или несколькими жидкостными растворами, предпочтительно водным раствором, более предпочтительно стерильным водным раствором. Компоненты вспомогательного оборудования могут также обеспечиваться твердой формой, которая может быть превращена в жидкости при добавлении подходящих растворителей, которые предпочтительным образом предоставляются в другом, отличном, контейнере.

Контейнер терапевтического оборудования может быть ампулой, пробиркой, колбой, флаконом, шприцем или любыми другими средствами, заключающими в себе твердое вещество или жидкость. Обычно, если имеются более одного компонента, оборудование содержит вторую ампулу или другой контейнер, который позволяет отдельную дозировку. Оборудование может также содержать другой контейнер для фармацевтически приемлемой жидкости. Терапевтическое оборудование будет предпочтительно содержать приспособление (например, одну или более иглу, шприцы, пипетки для глаз, пипетки и т.д.), которое позволяет введение веществ по изобретению, которые являются компонентами настоящего оборудования.

Фармацевтический состав настоящего изобретения подходит для введения пептидов любым приемлемым способом, таким как оральный (энтеральный), назальный, офтальный, подкожный, внутрикожный, внутримышечный, внутривенный или трансдермальный. Предпочтительно, чтобы введение было к.с, и наиболее предпочтительно 1.б. Введение может производиться инфузионным насосом.

Должно быть понятно, что отличительные черты изобретения, раскрываемые и описываемые здесь, могут быть использованы не только в соответственной комбинации, как было показано, но и также по отдельности без выхода из рамок, обозначенных настоящим изобретением. В соответствии с целями настоящего изобретения все цитаты описания включены в их целостности путем ссылки.

Теперь изобретение будет описано более детально посредством ссылок на последующие фигуры, список последовательностей и примеры. Следующие примеры приведены исключительно для иллюстрационных целей и не направлены на ограничение изобретения.

Краткое описание фигур

Фиг. 1: Тетрамерный анализ стимулированной микросферой пролиферации ООС-001 и ΝΟΧ-001специфических СЭ8+ лимфоцитов из периферической крови. ПК, обогащенные на лунку 1 х 10⁶ СЭ8' здорового донора НЬА-А*0201+ НЭ100 стимулировались еженедельно микросферами, связанными с анти-СЭ28 плюс опухолевый антиген высокой плотности А*0201/ОЭС-001 (верхняя секция) или анти

- 26 018457

СЭ28 плюс опухолевый антиген высокой плотности А*0201/ХОХ-001 (нижняя секция). После трех стимуляций 1п уйго все клетки были окрашены антителом СЭ8 Е1ТС плюс тетрамеры А*0201^ОХ-001 РЕ и А*0201/ОЭС-001 АРС. Клетки высаживаются в популяцию лимфоцитов или СЭ8+ лимфоцитов (правая секция), и числа показывают процентную долю тетрамера внутри лимфоцитов СЭ8+.

Фиг. 2: Иммуногенность ш уйго ТСЕВ1-004, обнаруженного ΙΕΝγ ЕБ18РОТ после пяти циклов стимуляции. Клетки примировали и стимулировали повторно ТСЕВ1-004, а затем инкубировали с релевантным ТСЕВ1-004 (лунки 1, 2, 3 и 4) и нерелевантным (отриц. контроль) пептидом соответственно. Анализ после ΙΕΝγ ЕЫ8РОТ был произведен на ЕЫ8РОТ-ридере (СТЬ, С1еуе1апб, США). ФГА-иономицин служил положительным контролем. Числа указывают на количество положительных точек.

Фиг. 3: Иммуногенность ш уйго ТСЕВ1-004, обнаруженного методом 1С8 после пяти циклов стимуляции. Клетки примировали аутологичными ДК с нагруженным ТСЕВ1-004 и рестимулировали аутологичными МПК плюс ТСЕВ1-004. Для считывания клетки инкубировали с релевантным ТСЕВ1-004 (лунки 1, 2, 3 и 4) и нерелевантным (отриц. контроль) пептидом соответственно. В дополнение к внутриклеточному окрашиванию ΙΕΝγ, клетки были также окрашены антителами СЭ4-Е1ТС и СЭ8-РегСР. Анализ проводили на четырехцветном цитометре ЕАС8Са11Ьиг (ВЭ Вюзс1епсез, Германия).

Фиг. 4: Анализ ЕБ18РОТ выработки ΙΕΝγ линиями Т-клеток при рестимуляции ш уйго пептидом NОX-001. А. Т-клеточная линия 7+ донора НВС-154 (отсортированы СЭ8+ NОX-001 тетрамер+); В. Тклеточная линия 7- донора НВС-154 (отсортированы СЭ8+ NОX-001 тетрамер-). Отсортированные клетки СЭ8+ NОX-001 тетрамер+ (А.) и СЭ8+ NОX-001 тетрамер- (В.) анализировали методом ΙΕΝγ ЕЫ8РОТ после рестимуляции нерелевантным (МЬА-001) (верхние лунки) и релевантным ЩОХ-001) (нижние лунки) пептидом (10 мкг/мл). Числа указывают на количество положительных точек.

Фиг. 5: Частотность СЕА-004-специфических СЭ8+ Т-клеток у 4 НЬА-А2 здоровых доноров после стимуляции 1п уйго СЕА-004, как было определено проточным цитометрическим анализом.

Фиг. 6: Аффинность пептидов НЬА Ι класса по изобретению к молекуле МНС, закодированной аллелем НЬА-А*0201.

Примеры

1. Синтез и структура

Пептиды были синтезированы стандартным и общепринятым методом твердофазного синтеза с использованием способа Етос. После очистки на препаративной ВЭЖХ проводилась ионообменная процедура для внедрения физиологически совместимых противоионов (ацетат или хлорид). Наконец, после лиофилизации были получены белые или серовато-белые твердые вещества. Все пептиды ТиМАР вводят в виде солей ацетата за исключением IМΑ-ССN-001, который применяется в виде соли хлорида - это обусловлено техническими причинами во время процесса производства.

Особенно важно, что принадлежность и чистота пептидов могут быть легко определены, причем с высокой точностью, с помощью масс-спектрометрии, аминокислотного анализа и аналитической ВЭЖХ. Как показали аналитические результаты все пептиды, использованные для вакцины ГМА910, обладают правильной структурой с чистотой > 95%.

Таблица 3. Физическо-химические характеристики пептидов в ГМА910

№	ГО пептида	Длина пептида (число аминокислот)	Форма соля	Физическая форма	Г игроскопичность
1	1МА-С20-001	9	Ацетат	Белый до	Хранится как
2	1МА-ССХ-001	9	Хлорид	серовато-	замороженный
3	1МЛ-СЕЛ-004	9	Ацетат	белого	сухой порошок.
4	1МА-СЕА-006	16	Ацетат	порошок	Лиофилизованные
5	ΙΜΑ-ΗΒν-001	10	Ацетат		пептиды, в
6	ΙΜΑ-ΜΕΤ-001	9	Ацетат		основном, имеют
7	ΙΜΑ-ΜΜΡ-00!	16	Ацетат		гигроскопичные
8	Емл-мис-со1	9	Ацетат		свойства.
9	ΙΜΑ-ΝΘΧ-001	9	Ацетат
10	1МА-СЮС-001	9	Ацетат
И	ΙΜΑ-ΡΌΝ-ΟΟΙ	10	Ацетат
12	ΙΜΑ-ΤΟΕΒΙ- 001	10	Ацетат
13	ΙΜΑ-ΤΟΕΒΙ- 004	15	Ацетат
14	ΙΜΑ-ΤΟΡ-001	10	Ацетат

Измерение распределения размеров частиц и формы частиц, полученных после восстановления, производили при получении прямого изображения каждой отдельной частицы в диапазоне от 0,25 до 100 мкм с последующим анализом изображений. В результате большинство (> 95%) частиц находилось в диапазоне от 0,25 до 2,7 мкм. Итак, не наблюдалось существенных различий по размеру и распределе

- 27 018457 нию формы в течение 1, 2 или 3 ч после восстановления.

2. Компоненты на примере фармацевтической композиции 1МА910

1МА910 составлена из коктейля синтетических опухолеассоциированных пептидов (ТИМАРз), большинство из которых было выявлено на первичных клетках колоректального рака. Пептиды ТИМАР включают 10 пептидов, связывающихся с НЬА I класса, со способностью активировать цитотоксические Т-клетки (СЭ8+ Т-клетки) и 3 пептида, связывающиеся с НЬА II класса, со способностью активировать хелперные Т-клетки (СЭ4+ Т-клетки). Хелперные Т-клетки играют центральную роль при поддержке функции цитотоксических Т-клеток при высвобождении цитокинов, которые усиливают киллерную функцию СЭ8+ Т-клеток и могут также напрямую выступать против опухолевых клеток (Кпи!зоп, К.Ь. апй О1з1з, М.Ь.; Ацдтепйпд Т йе1рег се11 1ттцпйу т сапсег, Сигг.Эгид Тагде!з.1ттипе.Епйосг.Ме!аЬо1.П1зогй., 2005, 5, 365-371). В дополнение к этому данные 13 ТИМАРпептидов 1МА910 содержат один вирусный контрольный пептид.

Пробы хирургически удаленной злокачественной и нормальной ткани пациентов с КРР и кровь здоровых доноров были проанализированы поэтапно.

Сначала для определения гиперэкспрессированных генов в злокачественной ткани по сравнению с диапазонами показателей для нормальных органов и тканей применялся анализ экспрессии мРНК всего генома с помощью микрочипов.

На втором этапе лиганды НЬА злокачественного материала идентифицировались с помощью массспектрометрии.

Затем идентифицированные лиганды НЬА сравнивали с данными по генной экспрессии. Пептиды, кодируемые выборочно экспрессированными или гиперэкспрессироваными генами, выявленными на этапе 1, считались подходящими ТИМАР-кандндатами для мультипептидной вакцины.

Был произведен поиск литературы для выявления дополнительных свидетельств, подтверждающих релевантность идентифицированных в качестве ТИМАР пептидов.

Наконец, периферические СЭ8+ Т-клетки здоровых индивидов тестировали на реактивность по отношению к опухолеассоциированным лигандам НЬА посредством нескольких иммунных анализов (ш уйго Т-клеточные анализы).

Таблица 4. 1МА910: композиция ТИМАР.

1МА910 содержит 10 НИА-А*02 (класс I) и 3 НИА-ЭР (класс II) пептидов ТИМАР. Кроме того, будет включен вирусный пептид-маркер НВУ-001, которого нет в списке.

τόμαρ го	Название	Функция / комментарии
1П.А-А *02 ТиМАРк
С20-001	Открытая рамка считывания 42 хромосомы 20	Плохо охарактеризована, сильная гиперэкспрессия
ССЫ-ОСП	Циклин ϋΐ	Регуляция клеточного цикла, часто повышенное количество при многих видах рака
СЕА-004	Карциномоэмбриональная, родственная антигену молекула клеточной адгезии 5 (СЕА)	Хорошо изученный ТАА при КРР, клеточная адгезия, метастазы
МЕТ-001	Протоонкоген Ме1	Пролиферация, подвижность, адгезия и инвазия
мис-οοι	Муцин 1	Хорошо изученный ТАА при КРР, разоблачение эпитопов из-за изменения гликозилирования в опухолях
ΝΟΧ-001	ΝΑϋΡΗ оксидаза 1	Сильная гиперэкспрессия, ингибирование апоптоза
0ОС-ОО1	Орнитин-декарбоксилаза 1	Трансформация, про-ангиогенные свойства
ΡΟΝ-ΟΟΙ	Ядерный антиген пролиферирующих клеток	Пролиферация (репликация ДНК)
ΤΟΕΒΙ-ΟΟΙ	Трансформирующий фактор роста, бета-индуцированный	Ремодуляция ткани, ангиогенез
ТОР-ООI	Топоизомераза (ДНК) II	Пролиферация (репликация ДНК)
ΗΕΑ-ΰΡ ТиМАРз
СЕА-006	Карциномоэмбриональная, родственная антигену молекула клеточной адгезии 5 (СЕА)	Хорошо изученный ТАА при КРР, клеточная адгезия, метастазы
ММР-001	Матричная металлопротеиназа 7 (матрилизин, утерин)	Ремодуляция ткани, ингибирование апоптоза
Т6РВ1-004	Трансформирующий фактор роста, бета-индуцированный	Ремодуляция ткани, ангиогенез

- 28 018457

3. Презентация эпитопов, содержащихся в 1МА910, в опухолевых пробах

Получение

Хирургически удаленные тканевые препараты были предоставлены Университетской клиникой общей, висцеральной и трансплантационной хирургии г. Тюбинген (Германия) после получения формы информированного согласия от каждого пациента.

Изоляция пептидов НЬА из проб тканей

Пептидные пулы НЬА из подвергнутых шоковой заморозке проб тканей были получены методом иммунопреципитации из плотных тканей в соответствии с незначительно измененным протоколом (Еа1к Κ., Вокζксйке О., 8кеуапоу1с 8., 1ипд С. & Ваттепкее Н.С. А11е1е-крес1йс тойГк геуеа1еб Ьу кедиепстд оГ ке1£-рерйбек е1икеб Ггот МНС то1еси1ек. №11иге 1991, 351, 290-296; 8еедег Е.Н. ек а1. Тке НЬА-А*6601 рерйбе той!: ргебкйоп Ьу роскек ккгискиге апб уепйсайоп Ьу рерйбе апа1ук1к. ^типодепейск 1999, 49, 571576) при использовании НЬА-А*02-специфического антитела ВВ7.2 или НЬА-А, -В, -С-специфического антитела к6/32, СNВ^-активированной сефарозы, кислотной обработки и ультрафильтрации.

Детекция пептидов ТИМАРк масс-спектрометрическим анализом с Е81-жидкостной хроматографией (Е81-ИСМ8)

Проводили систематический поиск эпитопов, содержащихся в 1МА910, на пробах колоректальных опухолей с помощью масс-спектрометрии. Полученные пулы пептидов НЬА были разделены в соответствии с гидрофобностью обратнофазной хроматографией (СарЬС, какегк), и элюированные пептиды анализировали на гибридном квадрупольном времяпролетном тандемном масс-спектрометре с ортогональным ускорением ионов (О-ТОЕ ИШта, какегк), снабженном источником Е81. Пептидные пулы наносили на предколонку С18 для концентрирования и опреснения. После нанесения предколонку помещали в линию для разделения с помощью микрокапиллярной колонки из плавленого кварца (75 мкм гб. х 250 мм) с обратнофазным материалом С18 в 5 мкм (Июпех). Растворителем А был ацетат аммония/вода, 4 мМ. Растворителем В были 2 мМ ацетата аммония в 80% ацетонитрил/вода. В обоих растворителях был установлен уровень рН в 3,0 муравьиной кислотой. Был сформирован бинарный градиент от 15 до 60% В в течение 90 мин, с применением скорости потока в 5 мкл/мин, сниженного до приблизительно 200 нл/мин с помощью распределительной системы. Позолоченный стеклянный капилляр (Р1соТ1р, №те ОЬ|ес11уе) использовали для введения в источник микро-Е81. Временем интеграции для ТОЕанализатора было 1,9 с с временем задержки между измерениями в 0,1 с. Для детекции дефинированных пептидов в рамках данного вида экспериментов Е81-БСМ8 проводили высокочувствительный скрининг на основе известных молекулярных масс и времени удерживания пептидов в хроматографической системе. Поэтому прилагаемый список значений ш/ζ предварительно идентифицированных пептидов (однои/или двухзарядные) применялся для выбора предшественников. Затем определяли последовательность анализом индуцированного столкновением (СГО) масс-спектра (Е81-БСМ8/М8). Последовательность пептида ТИМАР подтверждали сравнением генерированного фрагментационного образца естественного пептида ТИМАР с фрагментационным образцом синтетического контрольного пептида с идентичной последовательностью. Оценку выхода пептида НЬА после очистки и воспроизводимость аналитической системы, включая время удерживания, производили с использованием интенсивности и времени удерживания избыточного эндогенного пептида НЬА-А*02 (Υ^^РАIVΗI из ΌΌΧ5) в качестве внутреннего стандарта. Поэтому критерий включения пробы КРР для детекции предварительно идентифицированного пептида ТИМАР в данных экспериментах был установлен на уровне минимальной интенсивности в 650 импульсов на измерение внутреннего двухзарядного стандартного сигнала (Υ^^РАIVΗI) в эксперименте БСМ8/М8 в целях подтверждения успешной изоляции пептида НЬА и правильности работы аналитической системы.

В табл. 5 представлены результаты анализа проб при раке толстой и прямой кишки на различных стадиях, а также метастазов, возникающих из одного или другого первичного участка опухоли. Все пептиды НЬА-А*02 ТИМАР были обнаружены на большинстве проб. Частота повторной детекции пептидов НЬА-ЭВ ТИМАР была, в основном, ниже. Этого можно ожидать, так как для пептидов НЬА II класса могут существовать несколько вариантов длин для каждой коровой последовательности.

- 29 018457

Таблица 5. Повторная детекция пептидов ТИМАР в пробах КРР

ТЦМАР обнаружен повторно (♦) или не обнаружен (·) масс-спекгрометрическим анализом класс | класс И *

N2

Проба КРР

Масса опухоли (Г)

МестонаХОЖД. опухоли

Стадия опухоли

МЕТ- 001

С20001

ΤΟΡΒΙ- 001

ТОР· 001

ΝΟΧ· 001

ΡΟΝ- 001

оос· 001

сси- 001

мис· 001

СЕА· 004

СЕА- 006

ММР- 001

ТСРВ1- 004

ССА062

7

толстая кишка

I

л а

η а

п а

η а

η а

л а

η а

-

*

-

2

ССА740

4,0

толстая кишка

II

-

+

+

+

+

+

+

п а

л а

η а

3

ССА165

10,8

толстая кишка

II

+

+

+

+

+

+

-

4

ССА712

1,2

толстая кишка

III

+

+

+

+

-

+

п а

л а

п а

5

ССА707

3,1

толстая кишка

III

+

+

+

+

+

+

л а

η а

л а

6

ССА718

3.4

толстая кишка

III

+

+

+·

+

+

η а

л а

η а

7

ССА739

3,4

толстая кишка

III

+

+

*

+·

η а

η а

η а

8

ССА166

5,3

толстая кишка

III

+

+

+

+

+

+

(+>

+

-

9

ССА734

18,1

толстая кишка

III

+

+

+

+

η а

л а

п а

10

ССА719

1.3

толстая кишка

IV

-

+

+

+

+

-

+

о 2

о 2

о 2

η а

η а

л а

11

ССА725

2,7

толстая кишка

IV

-

+

+

+

-

+

X ш & о

!

п а

η а

л а

12

ССА164

5,0

толстая кишка

IV

+

+

+

-

+

+

3 & о

е 5“ о

д о о

-

-

13

ССА167

5,2

толстая кишка

IV

п а

п а

η а

л а

л а

п а

л а

«и X

ф X

ф X

(+)

+

14

ССА056

1,8

толстая кишка

О

п а

η а

η а

η а

п а

п а

п а

15

ССА305

4,0

толстая кишка

?

л а

η а

п а

п а

п а

п а

η а

-

20

ССА708

3,2

толстая кишка метастаз

IV

+

+

+

+

+

+

+

+

16

ССА160

36

прямая кишка

II

+

+

+

+

+

+

+

+

(+>

+

17

ССА754

3.6

прямая кишка

II

-

+

+

+

+

+

л а

л а

η а

18

ССА170

4,6

прямая кишка

Ш

п а

л а

п а

п а

η а

η а

η а

(+)

+

19

ССА171

ю.з

прямая кишка

IV

η а

п а

п а

п а

п а

п а

η а

+

21

ССА724

4.8

прямая кишка метастаз

IV

+

+

+

+

+ 1

Обнаружены в % проанализированных проб

33%

100% |

100%

87%

67%

80%

100%

-

33%

42%

33% |

п.а. не проанализировано

4. Иммуногенность 1и У1бо для пептидов ^А910, презентируемых МНС Ι класса

Для получения информации об иммуногенности пептидов, включенных в ГМА910 нами были проведены исследования с использованием хорошо известных методов стимуляции, уже описанных у (\Уа1Еег 8., Неггдеп Ь., 8сЛоог О., 1ипд С., ХУегпеЕ Ό., Вибппд Н.Р, Ваттепкее Н.С. апб 8Ееуапоу1с, 8.; 2003, СиЕбпд ебде: ргебеЕеттеб ау1ббу оГ Литап СЭ8 Т се11к ехрапбеб оп саНЬга(еб МНС/ап(1-СЭ28-соа(еб ш1сгокрЛегек, I. ^типоЕ, 171, 4974-4978). Таким способом мы могли представить положительные данные по иммуногенности для 10 из 10 проанализированных пептидов, рестриктированных по НЬА-А*0201 и содержащихся в вакцине ЕМА910, демонстрируя, что эти пептиды являются Т-клеточными эпитопами, против которых у человека существуют СЭ8+ Т-клетки-предшественники. Только один другой пептид НЬА Ι класса, содержащийся в ^А910 (МИС-001), не мог быть проанализирован данным методом из-за относительно низкой аффинности к А*0201 данного пептида ТИМАР.

Недавно полученные свидетельства ставят под сомнение пригодность СЕА-005 для противораковой вакцины. В недавнем всестороннем исследовании (Чего, М., 8циагс1па, Р., Вотего, Р., СиШаите, Р., 8сагкеШ, Е., Сеппо, В., СаггаЬЬа, М., ТоиЕпак, О., РатиапЕ С., В1уо1бш, Ь.; боие ТСВ ау1ббу апб 1аск оГ (итог се11 гесодшбоп 1п СИ8(+) Т се11к рптеб \νί(1ι ЕЛе СЕА-апа1одие САР1-6И рерббе, Сапсег Iтшипо1 ЕптипоШег. 2007 Иес; 56(12): 1979-91) авторы впервые систематически охарактеризовали эффекторные функции СЕА-005-примированных Т-клеток против природной последовательности СЕА-004. Наблюдалось, что в многочисленных пробах крови пациентов с КРР и здоровых доноров прайминг Т-клеток с СЕА-005 достоверно способствует образованию низкоаффинных Т-клеток с недостатком способности по распознаванию клеток колоректального рака, экспрессирующих СЕА и презентирующих природную последовательность. Такое неэффективное низкоаффинное кросс-распознавание природных последовательностей может стать основной проблемой в курсах вакцинации с использованием измененных пептидных лигандов, как это было подтверждено недавно обнародованными похожими результатами для другого пептида СЕА и его измененных агонистов (А1уек Р.М., У1аЕЕе 8., РадегЬегд Т., М1сЫе1ш О., Вбсагб С., Воихоигепе Н., Уш11еит1ег Н., Кгидег Т., С1уе1 1С., Ьеуу Р., 8реЛег ЭЕ, СегоЕбп1 1С, Вотего Р.; Iтшиηодешс^Еу оГ ЕЛе сагстоетЬгуошс апЕ1деп бебуеб рерббе 694 1п Н6А-А2 Леа1ЕЛу бопогк апб со1огесЕа1 сагитта рабепЕк, Сапсег ^типоЕ Iшшипо(Не^.. 2007, 56, 1795-1805). Кроме того, такие же результаты

- 30 018457 были обнародованы для природной последовательности хорошо известного меланомного антигена Ме^-А/МАКТИ и его агониста (Ό. 8ре1зег, регзопа1 сотпшшса(юп).

В общем, несмотря на обычно улучшенную иммуногенность измененных пептидов-агонистов, недавно полученные свидетельства заставляют предположить, что природные пептиды могут быть более привлекательными кандидатами для вакцины в связи с неэффективным кросс-распознаванием природной последовательности Т-клетками, простимулированными измененными агонистами. Это предполагает, что предпочтение должно отдаваться СЕА-004 (САР1), а не его агонистам, описанным в патенте №О9919478А1, таким как СЕА-005 (САР1-6Э) или САР1-6П,71.

Действительно, обширные данные демонстрируют значительную иммуногенность ш у1уо самой природной последовательности СЕА-004. Среди раковых пациентов, но не здоровых доноров, в нескольких исследованиях наблюдались спонтанно индуцированные Т-клеточные ответы против этого пептида (№догзеп Ό., КейНок и., К1уо1йш Ь., 8сН1ш((е1 А., йе(зсН А., Азеш1ззеп А.М., Вегдег С., ВиНг НД, ТЫе1 Е., 8сНе1ЬепЬодеп С.; Йа(нга1 Т-се11 гезропзе адашз! МНС с1азз I ерйорез о! ерйНе11а1 се11 абНезюп шо1еси1е, Нег-2/пеи, апб сагстоетЬгуошс апйдеп т райейз гйН со1огес(а1 сапсег, Сапсег Кез. 2000, 60, 4850-4854; ^еШгаисН МК, Апзеп 8., 1игк1ег^ Е., Се1зеп С., Х1а Ζ., Апбегзоп К.8., Сгааеп Е., 8сНш1б! М., ^ййд В., Э|еН1 V., ^о1! 1., ВоН1еп Н., Йаб1ег Ь.М.; РНазе Ι/ΙΙ сошЬшеб сНешо1шшипо!Негару гйН сагстоетЬгуошс апйдеп-бепуеб Η^Л-Л2-^ез(^^с(еб САР-1 рерйбе апб тпо(есап, 5-йиогоигасй, апб 1еисоуопп т райейз гйН рптагу те(аз(аВс со1огес(а1 сапсег, Сйп Сапсег Кез. 2005, 11, 5993-6001; ВаЬак 1., Ко1йд С., ЬоЬе1 В., Ро1ргесй С., Нааск М., СийНег Н., КоНпе С.Н., ЕНптдег С., 8сНш1к М., ВогпНаизег М.; 1пбисйоп о! се11и1аг 1шшипе гезропзез адате! сагстоетЬгуошс апйдеп ш райейз гйН те(аз(аВс (итогз айег уассшайоп гйН аНегеб рерйбе йдапб-1оабеб бепбпйс се11з, Сапсег 1шшипо1. 1ттипо(Нег. 2006, 55, 268-276). Кроме того, способы вакцинации пациентов с КРР с использованием СЕА-004 или белка СЕА продемонстрировали эффективную стимуляцию Т-клеточных ответов против СЕА-004 (Тзапд К.У., Ζа^ешЬа 8., №егоба С.А., ΖΝ.! МД., НашШоп ЕМ., 8сН1ош 1.; Сепегайоп о! Нишап су(о(охю Т се11з зреайс !ог Нитап сагстоешЬгуотс апйдеп ерйорез !гош райейз иптттеб гНН гесошЫпай уасаша-СЕА уассте, 1 Νη(1. Сапсег 1пз(. 1995, 87, 982-990; Могзе М.А., Эепд Υ., Со1ешап Ό., Ни11 8., Кйге11-Р1зНег Е., №и 8., 8сН1ош 1., КуЬаск М.Е., Ьуег1у Н.К.; А РНазе I з(ибу о! асйуе 1ттипо!Негару гйН сагстоетЬгуошс апйдеп рерйбе (САР-1)ри1зеб, айо1одоиз Нишап сиНигеб бепбпйс се11з т райейз гйН те(аз(аВс шайдпапаез ехргеззтд сагапоешЬгуойс апйдеп, Сйп Сапсег Кез. 1999, 5, 1331-1338; ΖΝ.! М^., МагзНа11 1., Со1е Ό., 8сН1ош 1., Тзапд Ε.Υ.; 8рес1йс су!о1уйс Т-се11 гезропзез (о Нишап СЕА !гош райейз иптттеб гНН гесошЬшай ау1рохСЕА уассте, Сйп Сапсег Кез. 2000, 6, 24-33; ^е1НгаисН М.К., Апзеп 8., 1игк1ег^ Е., Се1зеп С., Х1а Ζ., Апбегзоп К.8., Сгааеп Е., 8сНш1б! М., \νί((ίβ В., Э1еН1 V., ^о1! 1., ВоН1еп Н., Йаб1ег Ь.М.; РНазе Ι/ΙΙ сошЬтеб сНешо1ттипо!Негару гйН сагстоетЬгуошс апйдеп-бейуеб НЕА-А2-гез!г1с!еб САР-1 рерйбе апб тпοίесаи, 5-йиогоигаа1, апб 1еисоуопп т райейз гйН рптагу те(аз(аВс со1огес(а1 сапсег, Сйп Сапсег Кез. 2005, 11, 5993-6001).

Прайминг ΐη υϊΙιό СБ8+ Т-клеток

Для проведения стимуляций ш νί(ΐΌ искусственных антигенпрезентирующих клеток (аАРС), нагруженных комплексом пептид-МНС (рМНС) и антителом анти-СЭ28, мы сначала изолировали МПК (моноциты периферической крови) из свежей лейкоцитарной пленки Η^Л-Л*02+ с использованием стандартной среды для градиентного разделения (РАА, Со1Ье, Германия). Лейкоцитарные пленки были получены либо из банка крови г. Тюбинген, либо из госпиталя 1<а(НаппепНозрНа1 г. Штутгарта. Изолированные МПК инкубировали в течение ночи для прайминга человеческого материала т νί(ΐΌ в Тклеточной среде (ТСМ), состоящей из КРМ1-С1йашах (1пуйгодеп, Каг1згиНе, Германия) с добавлением 10% инактивированной нагреванием человеческой сыворотки АВ (РАА, Со1Ье, Германия), 100 и/мл пенициллина / 100 мкг/мл стрептомицина (СашЬгех, Vе^ν^е^з, Бельгия), 1 мМ пирувата натрия (СС Рго, №из!аб!, Германия) и 20 мкг/мл гентамицина (СашЬгех). Лимфоциты СЭ8+ были изолированы с использованием СЭ8+ МАС8 - оборудования для положительного отбора (Мй!епу1, Вегд1зсН С1абЬасН, Германия) в соответствии с указаниями производителя. Полученные СЭ8+ Т-клетки инкубировали до использования в ТСМ с добавлением 2,5 нг/мл ИЛ-7 (РгошоСе11, Не1бе1Ьегд, Германия) и 10 и/мл ИЛ-2 (СНйоп, МишсН, Германия). Получение покрытых гранул рМНС/анти-СЭ28, Т-клеточные стимуляции и считывание производили, как описывалось ранее (\Уа1(ег_ 8., Неггдеп, Ь., 8сНоог, О., 1ипд, С., \Уегпе(, Ό., ВиНппд, НД., Каттепзее, Н.С. апб 8(ехапох1с, 8.; Сййпд ебде: ргебе!егттеб ау1бйу о! Нишап СЭ8 Т се11з ехрапбеб опсайЬга!еб МНС/апй-СЭ28-соа!еб т1сгозрНегез, 1. 1ттипо1, 2003, 171, 4974-4978) с минимальными модификациями. Вкратце, биотинилированные рекомбинантные молекулы Η^Λ-Λ*0201. в которых не хватает трансмембранного домена, и которые были биотинилированы на карбоксильном конце тяжелой цепи, были получены в соответствии с методом, описанным у (А1!шап, Ι.Ό., Мозз, Р.А., Сои1бег, РД, ВагоисН, Э.Н., Неухег-ХУПНашз, М.С., Ве11 Ι.Ι., МсМ1сНае1 АД апб Эау1з М.М; РНепо(ур1с апа1уз1з о! апйдеп-зреайс Т 1утрНосу(ез, 8аепсе, 1996, 274, 94-96). Очищенный ко-стимулированный мышиный 1дС2а к антителам человека СЭ28 АЬ 9.3 (1ипд С., ЬебЬейег 1.А., апб Ми11ег-ЕЬегНагб, НД; 1пбисйоп о! су(о(ох1сбу 1п гезйпд Нишап Т 1ушрНосу(ез Ьоипб (о (итог се11з Ьу апйЬобу Не!егосоп)ида!ез, Ргос Νη(1 Асаб 8а и8А, 1987, 84, 4611-4615) был химически биотинилирован с использованием сульфо-Νгидроксисукцинимидобиотина, как рекомендуется изготовителем (РегЫо, Βοии, Германия). Использо

- 31 018457 ванные гранулы были покрытыми стрептавидином полистироловыми частицами величиной 5,60 мкм (Вапдк ЬаЬоогаЮпек, Шшой/США). рМНС, использованные в качестве положительных и отрицательных контролей, были А*0201/МЬА-001 (пептид ЕЬАбЮГОТУ из модифицированного Ме1ап-А/МАВТ-1) и А*0201/ЭЭХ5-001 (¥ЕЕРА1УН1 из ЭЭХ5) или А*0201/НВУ-001 (ЕЬР8ЭЕЕР8У), соответственно.

800000 гранул/200 мкл были покрыты в 96-луночном планшете в присутствии 600 нг биотина антиСЭ28 и 200 нг релевантного биотин-рМНС (высокоплотные гранулы) или 2 нг релевантного и 200 нг нерелевантного (библиотека рМНС) МНС (низкоплотные гранулы). Стимуляции были инициированы в 96-луночных планшетах при ко-инкубации 1х10⁶ СЭ8+ Т-клеток с 2х10⁵ промытых покрытых гранул в 200 мкл ТСМ с добавлением 5 нг/мл ИЛ-12 (РготоСе11) в течение 3-4 дней при 37°С. Половина среды была заменена на свежую ТСМ с добавлением 80 и/мл ИЛ-2, и инкубация была продолжена в течение 34 дней при 37°С. Данный цикл стимуляций проводили всего три раза. В заключение проводили тетрамерные анализы с флуоресцирующими тетрамерами МНС (полученными, как описывается у (А1(тап, Ч.Э., Мокк, Р.А., 6ои1йег, РН., ВагоисЬ, Э.Н., Неу/ег-М1Шатк, М.6., Ве11, Ы, МсМ1сЬае1, АЛ. апй Эауй, М.М.; Ркепо!ур1с апа1укй о! апйдеп-креайс Т 1утркосу!ек, 8с1епсе, 1996, 274, 94-96)) с антителом СЭ8ЕИС клона 8Ш (ВЭ, Не1йе1Ьегд, Германия) на четырехцветном цитометре ЕАС8Са11Ьиг (ВЭ). Пептидспецифические клетки были подсчитаны как процентная доля всех СЭ8+ Т-клеток. Оценку тетрамерного анализа проводили с помощью программы ЕС8 Ехргекк (Эе Иоуо 8ойтеаге). Прайминг ш уйго специфических лимфоцитов тетрамер+ СЭ8+ детектировался установкой подходящего гейта и при сравнении со стимуляциями негативного контроля. Иммуногенность для заданного антигена была детектирована, если было обнаружено, что по крайней мере в одной подлежащей оценке простимулированной ш νί(ΐΌ лунке одного здорового донора содержалась специфическая СЭ8+ Т-клеточная линия после стимуляции ш νί(ΐΌ (т.е. данная лунка содержала по крайней мере 1% специфического тетрамера+ среди СЭ8+ Т-клеток и процентная доля специфических клеток тетрамера+ была по крайней мере в 10 раз выше среднего значения стимуляций с негативным контролем).

Иммуногенность ΐη уйго для 10 пептидов 1МА910

Для 10 из 10 проанализированных пептидов НЬА I класса иммуногенность ш νί(ΐΌ могла быть продемонстрирована генерированием пептид-специфических Т-клеточных линий. Репрезентативное окрашивание, выявляющее образование Т-клеточных линий, специфических для ИОХ-001 и ОЭС-001, представлено на фиг. 1. Результаты обобщены в табл. 6. Только один другой пептид НЬА I класса, содержащийся в ГМА910 (МИС-001), не мог быть проанализирован данным методом из-за относительно низкой аффинности к А*0201 данного пептида ТИМАР, тем самым делая методологически невозможным проведение стимуляций 1п νί(ΐΌ с использованием мономеров рМНС.

Таблица 6. Иммуногенность 10 пептидов НЬА I класса, включенных в ГМА910

Антиген	Положительн. доноры / проанализированные доноры	Положительн. лунки / проанализированные лунки
1МА-НВУ- 001	7/16(44%)	10/107 (9%)
ΙΜΑΊΌΡΒΙ-001	3/4 ( 75%)	4/22 ( 18% )
ΙΜΑ-ΝΟΧ- 001	3/5 ( 60% )	9/60 (15%)
1МА-РСИ- 001	3/4 ( 75% )	4/42 ( 10%)
ΙΜΑ-ΤΟΡ- 001	2/5 (40% )	7/72 ( 10%)
1МА-С20- 001	1/5 (20% )	1/60 ( 2% )
1МА-ОЭС- 001	1/5 (20% )	1/60 (2%)
1МА-НВУ- 001	2/5 ( 40% )	10/54 ( 19%)
1МА-СЕА- 004	4/4 ( 100%)	50/60 ( 83%)
1МА-ССЫ- 001	5/5 ( 100%)	42/54 (78%)
ΙΜΑ-ΜΕΤ001	4/6 (67%)	30/72 (42% )

Здесь обобщены результаты экспериментов по иммуногенности ш уйго, проведенных фирмой 'Чштайск для 10 из 11 пептидов НЬА I класса, включенных в вакцину ГМА910. Приводимые результаты были получены при стимуляции клеток СЭ8+ высокоплотными гранулами. Так как различные партии человеческой сыворотки могут сильно влиять на результаты по иммуногенности, то вместе оценивались только те анализы, в которых была использована одна и та же партия сыворотки.

- 32 018457

1МА-СЕА-004 примированные ΐη νΐίΓθ Т-клетки из 6 доноров подлежали оценке. У всех четырех доноров мы могли успешно продемонстрировать индукцию СЕА-004-направленного Т-клеточного ответа ίη νίίτο при стимуляции СЕА-004 (см. таблицу и чертеж). Таким образом, было подтверждено, что пептид СЕА-004 является сильным индуцирующим фактором человеческих СЭ8+ Т-клеточных ответов ίη νίίτο. Особенно важно, что СЕА-004 был достоверно способен вызывать более высокую частотность СЕА-004-специфических Т-клеточных ответов в сравнении с СЕА-005 (83% лунок в сравнении с 64% лунок, см. табл. 4). Частотности СЕА-004специфических клеток внутри отдельных положительных лунок были также выше после прайминга СЕА-004 в сравнении с праймингом СЕА-005 (см. фиг. 5).

Пептид-специфический СБ8+ Т-клеточный ответ ΐη νΐίΓθ 4 здоровых доноров ИЬА-А *02, определенный проточным цитометрическим анализом

СЭ8+ Т-клетки примировали искусственными антигенпрезентирующими клетками с СЕА-004, СЕА-005 или нерелевантным пептидом (ЕМА-В8Е-001) соответственно. После трех циклов стимуляции детекция пептид-реактивных клеток производилась двойным окрашиванием тетрамерами СЕА-004 плюс СЕА-005 (табл. 7А) и СЕА-004- плюс нерелевантный А*0201-тетрамер (табл. 7В). Числа, указанные в таблице, представляют собой процентные доли лунок, содержащих СЕА-004+ или СЕА-005+ ЦТЛ. Номер партии человеческой сыворотки, использованной во всех экспериментах, С02104-0167.

Таблица 7А

Антигенный стимул	Лунки с клетками СЕА-004+ тетрамер+
СЕА-004	50/60 (83%)
СЕА-005	19/72 (26%)

Таблица 7В

Антигенный стимул	Лунки с клетками СЕА-004+ тетрамер+
СЕА-004	50/60 (83%)
СЕА-005	46/72 (64%)

СЭ8+ Т-клетки изолировали из МПК, примировали ίη νίίτο искусственными антигенпрезентирующими клетками с СЕА-004, В8Ь-001 или пептидом ΌΌΧ5-001, соответственно. После трех циклов стимуляции детекция пептид-реактивных клеток производилась окрашиванием СЕА-004- и нерелевантным А*0201-тетрамерами. Значения, указанные выше, представляют собой процентные доли СЕА-004специфических клеток каждой простимулированной лунки. Стимуляции В8Ь-001 и ΌΌΧ5-001 служили в качестве негативных контролей. На фиг. 5 представлены частотности СЕА-004-специфических СЭ8+ Тклеток у 4 НЬА-А2 здоровых доноров после стимуляции ίη νίίτο с СЕА-005, как было определено проточным цитометрическим анализом. Пороговые значения для положительных лунок указаны для каждого донора отдельно (—) и были дефинированы как 10-кратное среднее значение отрицательных контролей и по крайней мере 1%. Лунки с процентной долей свыше порогового значения (> 1%) рассматривались как положительные, и они представлены розовыми ромбами, в то время как отрицательные лунки представлены черными ромбами.

5. Иммуногенность ίη νίίτο для пептидов IΜА910, презентируемых МНС II класса

Хелперные Т-клетки играют важную роль в содействии ЦТЛ при активации и поддержке иммунных ответов против опухолевых клеток. Поэтому пептиды МНС II класса были включены в вакцину ЕМА910. ТСРΒI-004, один из трех пептидов II класса, содержащийся в ЕМА910, был проверен на его иммуногенный потенциал ίη νίίτο и подтвержден в качестве индуцирующего фактора как для специфических СЭ4+, так и СЭ8+ Т-клеток. Генерация СЭ4+ и функциональных СЭ8+ Т-лимфоцитов показана в экспериментах с использованием стимуляций, проведенных в аутологичной системе.

Принципы теста

Прайминг и экспансия специфических человеческих СЭ4+ и СЭ8+ клеток были проанализированы ίη νίίτο посредством прайминга МПК с пониженным содержанием моноцитов аутологичными ОС и повторной стимуляции аутологичными МПК. Вкратце, чтобы генерировать антигенспецифические СЭ4+ Т-клетки, МПК с пониженным содержанием моноцитов одного здорового донора (НЬА-генотип класса I: А1/А25/В8/В18 и класса II: ΌρΒ1*02/ϋρΒ1*06/ϋΒΒ1*03/0ΒΒ1*15/0ΒΒ3/ϋΒΒ5) были простимулированы с использованием аутологичных дендритных клеток с введенным импульсным методом пептидом и рестимулированы аутологичными МПК с пептидом. В качестве системы считывания выработку ΣΕΝγ при кратковременной рестимуляции анализировали по методике ЕЫ8РОТ и проточной цитометрии. Тклетки были проанализированы после восьми стимуляций по методике ЕЫ8РОТ и внутриклеточным окрашиванием ШЫу плюс СО4-Е1ТС и СЭ8-РегСР для определения процентного выражения ΣΕΝγвырабатывающих клеток в специфических Т-клеточных субпопуляциях. В этом эксперименте клетки, простимулированные пептидом ТСРΒI-004 из различных лунок, были объединены и инкубировались с нерелевантным пептидом для считывания и выступали в качестве негативных контролей.

- 33 018457

Получение дендритных клеток (ДК)

Человеческие дендритные клетки были получены из моноцитов, культивированных в среде ДК, состоящей из ΚРΜI 1640-С1и1атах/25тМ Нерек ([пуДгодеп, Германия) с добавлением 10% аутологичной плазмы // 100 и/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина. Сначала были получены лейкоцитарные пленки и плазма при центрифугировании крови здорового донора (Банк крови г. Тюбинген). МПК были изолированы из лейкоцитарной пленки стандартным градиентным разделением (Ьутрйосу1е 8ерагаБоп Мебшт, РАА, Австрия) и ресуспендировались в среде ДК для определения общего числа клеток. 100-120 млн. МПК были промыты, ресуспендированы в 15 мл среды Х-У1уо 20 (В|о\У1пЦакег, Бельгия) и перенесены в колбу с клеточной культурой. После 2 ч при 37°С удаляли среду, содержащую лейкоциты периферической крови (ЛПК), адгезивные моноциты промывали дважды 10 мл РВ8 и культивировали 6 дней в 10 мл среды ДК с 100 нг/сл ГМ-КСФ и 30 нг/мл ИЛ-4 (IттиηоТоо1к, Германия) или 20 нг/мл (В&Л кук1етк, Германия). На 3-й и 5-й день добавляли 100 нг/мл ГМ-КСФ и 30 нг/мл ИЛ-4 ^тщито^о^) или 20 нг/мл ИЛ-4 (В&О 8ук!етк, Германия). На 7-й день незрелые ДК активировали 10 нг/мл ΊΝΤ-α (В&Л 8ук1етк, Германия) и 20 мкг/мл ро1уДС) (81дта А1бпс11, Германия) или 100 нг/мл ЬР8 на 24 ч. Оставшиеся МПК и полученные ЛПК аликвотировали и замораживали.

Прайминг ΐη νϊΐΐ'ο специфических Т-клеток

Для получения СЭ4+ Т-клеток 3 млн. МПК/ЛПК были простимулированы 2 х 105 аутологичными ДК. ДК были собраны на 8-й день (см. раздел 3.1, Получение дендритных клеток (ДК)). В этих целях использовался РВ8 с 5 мМ ЕЭТА, чтобы набрать как можно больше клеток (включая адгезивные клетки). После промывки средой ДК определяли число клеток. Для погрузки пептида ДК ресуспендировали в 1 мл среды ДК и инкубировали с 25 мкг/мл пептида в течение 2 ч при 37°С. Пептидами, использованными для введения импульсным способом в ДК, были ТСΕВI-004, Рокт1х (смесь пептидов, относящихся к ЕВУ и СМУ), Рабге и СМУ. Аутологичные МПК/ЛПК размораживали, промывали средой ДК (по меньшей мере, дважды) и высеивали в 24-луночный планшет с плотностью 3 млн клеток/мл в 1 мл. Затем добавляли ДК с введенным пептидом (как 1 мл суспензии, содержащей пептид) в высеянные МПК/ЛПК и инкубировали в течение 7 дней при 37° С. После прайминга полученные ЦТЛ сначала рестимулировали криоконсервированными аутологичными МПК, нагруженными пептидом, которые были облучены (30 Су; Саттасе11 1000 Е1йе, №гбюп Iпΐе^иаΐ^оиа1, Канада). В этих целях добавляли 5 х 10⁵ ЦТЛ и 2,5 х 10⁶ МПК на лунку. Введение импульсным методом пептида в МПК было проведено, как упоминалось ранее (для ДК). На первый день после первой стимуляции добавляли ИЛ-2 (В&Э 8ук!етк, Германия) и ИЛ-7 до окончательной концентрации 2 и 5 нг/мл соответственно. После этого на каждый 2-й и каждый 7-й день в среду добавляли ИЛ-2 и ИЛ-7. Вторую рестимуляцию проводили 7 дней спустя, но на этот раз пептид добавлялся в культивируемые ЦТЛ отдельно (без МПК). Рестимуляции проводили каждые 7 дней с нагруженными пептидом МПК и пептидом отдельно, добавляемом альтернативно. Анализы проводили после восьмой стимуляции с помощью внутриклеточного окрашивания ΓΕΝγ и методики ΓΕΝγ ЕЫ8РОТ.

Результаты

Было возможно примировать СЭ4+ Т-клеточные линии, специфически реагирующие на интересующий пептид (фиг. 2 и 3). Т-клеточные ответы могли быть детектированы с помощью методики ЕЫ8РОТ в 2 из 4 Т-клеточных линий, тогда как в 3 из 4 Т-клеточных линиях ТСРВI-004-специфические ΓΕΝγвырабатывающие СЭ4+ и/или СЭ8+ клетки были установлены с помощью Κ.'8.

Таким образом, ТСЕВЕ004 был способен вызывать СЭ4+ и СЭ8+ Т-клеточные ответы у одного донора, подвергнутого анализу по описанной выше экспериментальной системе. В соответствии с этим многообещающим результатом данный пептид, скорее всего, является иммуногенным и имеет потенциал для индуцирования Т-клеточных ответов.

6. Функциональное подтверждение на примере NΟX-001 и ТСЕВЕ001

Иммуногенность пептидов, включенных в вакцину ГМА910, была продемонстрирована ш мйго при использовании методики валидации для пептидов ТИМАР фирмы нптаЕск. Индукция специфических Т-клеток является индикатором способности пептидов успешно активировать иммунную систему. Так как получение эффективного противоопухолевого иммунного ответа возможно только в том случае, если активированные Т-клетки имеют высокую авидность и функциональность, то мы исследовали далее ТИМАРк в целях прайминга высокоавидных, функциональных Т-лимфоцитов с их способностью вырабатывать ΓΕΝγ или убивать опухолевые клеточные линии. Два пептида, NΟX-001 и ТСЕВК001, были выбраны для более тщательной валидации из-за их способности индуцировать высокоавидные ЦТЛ ш уйго. Нам удалось доказать, что у человека существуют высокоавидные Т-клетки-предшественники, направленные против обоих пептидов, и что с помощью NΟX-001 могут быть генерированы функциональные СЭ8+ Т-клеточные линии.

Принципы теста

Чтобы глубже проникнуть в сущность иммуногенности пептидов ЕМА910 и свойства специфических Т-клеток, два пептида, NΟX-001 и ТСΕВI-001, были выбраны для дальнейшей оценки. Эксперименты для этих целей проводились на фирме ’Тттайск (сортировку клеток проводили в Университете г. Тюбинген, лаб. Όγ. Вийппд).

- 34 018457

В зависимости от их способности активироваться антигеном высокой или низкой плотности Тклеточные линии могут быть разделены на высоко- или низкоавидные. Как было продемонстрировано ранее (Уайет 8., Неггдеп Ь., 8сйоог 0., 1ипд 6., Уегпе! Ό., Вийппд Н.Ь, Ваттепкее Н.6. апб 81еуапоу1с 8.; СиШпд ебде: ргебе1егттеб ау1бйу оГ йитап СЭ8 Т се11к ехрапбеб оп сайЬга!еб МНС'7апи-СО28-соа1еб тюгокрйегек, 1. Iттипο1., 2003, 171, 4974-4978), человеческие высокоавидные ЦТЛ могут быть успешно индуцированы, если для активации использовать меньше пептида, чем для низкоавидных СЭ8+ Тклеток. Также было продемонстрировано, что обогащенные таким способом клетки являются более эффективными для распознавания экспрессирующих антиген клеточных линий опухоли, тем самым представляя собой, возможно, важнейший инструмент в разработке терапевтических стратегий.

Чтобы можно было определить способность пептидов к генерации высокоавидных линий ЦТЛ, изолированные человеческие клетки СО8+ примировали и обогащали посредством повторяемых стимуляций 1п уйго гранулами, покрытыми низкоплотным рМНС (комплекс пептид-МНС) и антителом антиСО28 в присутствии ИЛ-12 и ИЛ-2. После трех стимуляций фракция примированных ш уйго Т-клеток была окрашена рМНС-тетрамером и обнаружена цитометрическим анализом. Тетрамер-положительные клетки каждого донора были, затем, объединены в соответствии с антигенной специфичностью, окрашены рМНС-тетрамером и человеческим антителом анти-С08-ПТС и, в заключение, подвергнуты сортировке ЕАС8 на сортере ЕАС8Апа. Отсортированные клетки культивировали и обогащали в присутствии облученных питающих клеток, цитокинов и митогена. В качестве рамки считывания для генерирования примированных высокоавидных антиген-специфических клеток проводили окрашивание рМНСтетрамером. Для определения их функциональности проводили анализ выработки по методике ЕЫ8Р0Т и исследовали уничтожение опухолевых клеточных линий с использованием цитотоксического анализа, основанного на живом/мертвом окрашивании после рестимуляции клеток соответствующим пептидом и опухолевыми клеточными линиями.

Получение специфических СБ8+ Т-клеточных линий

Стимуляции 1п уйго с использованием искусственных антигенпрезентирующих клеток (аАРС), нагруженных комплексом пептид-МНС (рМНС) и антителом анти-СО28, проводили, как было подробно описано выше. Единственным отличием от описанного метода был тот факт, что стимуляции проводили с гранулами, нагруженными 2 нг релевантного и 200 нг нерелевантного (рМНС) МНС из библиотеки (низкоплотные гранулы) вместо 200 нг релевантного МНС (высокоплотные гранулы). Таким образом, были получены высокоавидные Т-клетки для более детальной валидации пептидов. После трех стимуляций фракция примированных ш уйго Т-клеток была окрашена рМНС-тетрамером и обнаружена цитометрическим анализом. Иммуногенность для заданного антигена была детектирована, если было обнаружено, что по крайней мере в одной подлежащей оценке простимулированной ш уйго лунке одного здорового донора содержалась специфическая СО8+ Т-клеточная линия после стимуляции ш уйго (т.е. данная лунка содержала по крайней мере 1% специфического тетрамера+ среди СЭ8+ Т-клеток и процентная доля специфических клеток тетрамера+ была по крайней мере в 10 раз выше среднего значения стимуляций с негативным контролем). Тетрамер-положительные клетки каждого донора были, затем, объединены в соответствии с антигенной специфичностью, окрашены соответствующим рМНС-тетрамером и человеческим антителом анти-СП8-Е1ТС, клон 8К1, и, в заключение, подвергнуты сортировке ЕАС8 на сортере ЕАС8Апа (ВО Вюкаепсек, Германия). Отсортированные клетки культивировали в Т-клеточной среде (РРМЬСйПатах с добавлением 10% инактивированной нагреванием человеческой сыворотки АВ, 100 и/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина, 1мМ пирувата натрия и 20 мкг/мл гентамицина) в присутствии 5 х 10⁵ клеток/мл облученных свежих аллогенных МПК, 5 х 10⁴ клеток/мл облученных клеток Ь62-ЕВУ, 150 и/мл [Ш-2 (СЫтоп, Мишсй, Германия) и 0,5 мкг/мл РНА-Ь (Восйе П1адпокйск, Маппйе1т, Германия). Экспансия данных клеток происходила в Т-клеточной среде, содержащей 150 и/мл ИЛ-

2. В качестве рамки считывания для генерирования примированных высокоавидных антигенспецифических клеток проводили окрашивание рМНС-тетрамером, как было описано выше, и анализировали на четырехцветном цитометре ЕАС8СайЬит (ВО Вюкшепсек, Германия).

Проверка функциональности

Для определения их функциональности проводили анализ выработки ΣΕ^ по методике ЕЫ8Р0Т ЕЫ8Р0Т 8е(, ВО, Германия) после рестимуляции клеток соответствующим пептидом. Кроме того, опосредованную клетками цитотоксичность специфических ЦТЛ исследовали на примере уничтожения опухолевых клеточных линий с использованием оборудования для определения опосредованной клетками цитотоксичности ЫУЕ/ОЕАП се11-теб!а1еб су1о(ох1с11у Кй (Й7010, Iηνй^οдеπ, Германия). Оба анализа проводились в соответствии с указаниями производителей, если не указано иное.

Результаты

Оба пептида, N0X^01 и Т6ЕΒI-001, обладали иммуногенностью ш уйго, как показано на примере успешного прайминга низкоплотным рМНС АПК. Как для N0X^01, так и для ТСЕВЕ001 могли быть установлены специфические Т-клеточные линии методом ЕАС8, тем самым демонстрируя, что высокоавидные СО8+ Т-клеточные предшественники имеются у здоровых доноров.

Кроме того, для N0X^01 могла быть установлена одна Т-клеточная линия, которая также была

- 35 018457 подтверждена как функциональная методом ЕБ18РОТ, так как она специфически экспрессировала ΙΡΝγ после рестимуляции этим пептидом (фиг. 4).

7. Связывание пептидов по изобретению, рестриктированных по НЬА класса I, с НЬА-А*0201

Целью данного анализа была оценка аффинности пептидов НЬА класса I по отношению к молекуле МНС, закодированной аллелем НЬА-А*0201, так как это является важным параметром для способа действия [МА910. Степень аффинности к НЬА-А*0201 была высокой для 9 из 10 пептидов в ^А910, рестриктированных по НЬА класса I, константы диссоциации (КО) находились в диапазоне от 0,001 до 0,2 нМ. Также и пептид вирусного маркера IМА-ΗВV-001 проявил сильное связывание. Аффинность для ГМА-МиС-001 была приблизительно на фактор 10² слабее. Данные результаты подтверждают сильную аффинность связывания 9 из 10 пептидов НЬА класса I из вакцины-кандидата ГМА910 к молекулам МНС.

Принципы теста

Стабильные комплексы НЬА/пептид состоят из трех молекул: тяжелой цепи НЬА, бета-2 микроглобулина (Ь2т) и пептидного лиганда. Активность денатурированных рекомбинантных молекул НЬАА*0201 с тяжелой цепью сама по себе может быть сохранена, делая их функциональными эквивалентами «пустых молекул НЬА-А*0201». Если они растворены в водном буфере, содержащем Ь2т и подходящий пептид, то данные молекулы быстро и эффективно сворачиваются в полной зависимости от пептида. Наличие данных молекул использовалось в анализе, основанном на методике ЕЫ8А, для измерения аффинности взаимодействия между пептидом и молекулой НЬА класса I (8у1уез!ег-Ну1й е! а1., 2002).

Очищенные рекомбинантные молекулы НЬА-А*0201 инкубировали вместе с Ь2т и ступенчатыми дозами интересующего пептида. Количество новообразовавшихся комплексов НЬА/пептид определялось количественным методом ЕЫ8А. Константы диссоциации (значения КО) вычислялись с использованием стандартной калибровочной кривой, записанной с титров комплекса калибровки НЬА/пептид.

Результаты

Результаты представлены на фиг. 6. Более низкое значение КО отражает более высокую аффинность к НЬА-А*0201. Большинство из пептидов ГМА910 и вирусный контрольный пептид IМА-ΗВV-001 имели похожие и сильные аффинности к НЬА-А*0201 в диапазоне от 0,001 (IМА-ТСБВI-001) до 0,2 нМ (IМА-О^С-001). Аффинность IМА-МυС-001 была на фактор 10² до 10³ ниже по сравнению с большинством включенных пептидов. Однако вакцинация ГМА-МиС-001 приводила к иммунным ответам у пациентов с почечно-клеточной карциномой в проведенном ранее фирмой ’Тттайсз клиническом исследовании, таким образом, низкая аффинность связывания IМА-МυС-001 не дает повода для беспокойства.

- 36 018457

Перечень последовательностей <110> ИММАТИКС БАЙОТЕКНОЛОДЖИЗ ГМБХ

<120>	Новая иммунотерапия против нейрональных опухолей и опухолей головного мозга
<130>	131238РСТ
<160>	11
<170>	РабепЫп уегеюп 3.5
<210> <211> <212> <213>	1 э РРТ Ното зарЬепз
<400>	1

А1а Ьеи ТЬг ТЬг Ьеи Меь Н1я О1п Ьеи

1	5
<210> <211> <212> <213>	2 9 РКТ Ното зартепз
<400>	2

РЬе Ьеи Туг Ьуз Уа1 11е Ьеи Зег Ьеи

1	5
<210> <211> <212> <213>	3 9 РКТ Ното заргепз
<400>	3

А1а Не 11е Азр <31у Уа1 О1и Зег Уа1

1	5
<210> <211> <212> <213>	4 9 РКТ Ното варЬепз
<400э	4

РЬе Ьеи Ьеи Рго Азр Ткг Азр <31у Ьеи

1	5
<210> <211> <212> <213>	5 9 РКТ Ното зарЬепз

- 37 018457

у Тгр Зег Туг Ткг С1у А1а 5	Ьеи Азп С1п Ьуз Азп 10
<210>	11
<211>	9
<212>	РКТ
<213>	Ното заркепз
<400>	11

- 38 018457

Claims (15)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Фармацевтическая композиция, включающая по крайней мере два пептида, содержащих аминокислотную последовательность 8ЕЦ ГО № 1 и 8ЕЦ ГО № 2, и/или содержащих вариантную аминокислотную последовательность, которая по крайней мере на 80% идентична последовательностям с 8ЕЦ ГО № 1 и 8ЕЦ ГО № 2, и/или полинуклеотид, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую 8ЕЦ ГО № 1 и 8ЕЦ ГО № 2, или вариантную аминокислотную последовательность, и фармацевтически приемлемый носитель, где указанные пептиды обладают способностью связываться с молекулой главного комплекса гистосовместимости человека (МНС) класса I или класса II и где пептиды имеют общую длину от 8 до 100 аминокислот.
2. 2. Фармацевтическая композиция в соответствии с п.1, дополнительно включающая по крайней мере один дополнительный пептид, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из 8НЦ ГО № 8 по 8ЕЦ ГО № 15, или содержащий вариантную аминокислотную последовательность, которая по крайней мере на 80% идентична 8ЕЦ ГО № 8 по 8ЕЦ ГО № 15, или полинуклеотид, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую 8ЕЦ ГО № 8 по 8ЕЦ ГО № 15, или вариантную аминокислотную последовательность.
3. 3. Фармацевтическая композиция в соответствии с п.1 или 2, где пептиды обладают общей длиной между 8 и 30 и наиболее предпочтительно между 8 и 16 аминокислотами.
4. 4. Фармацевтическая композиция в соответствии с любым из пп.1-3, где пептид включает непептидные связи.
5. 5. Фармацевтическая композиция в соответствии с любым из пп.1-4, включающая по крайней мере два пептида, состоящих из аминокислотных последовательностей в соответствии с 8ЕЦ ГО № 1 по 8ЕЦ ГО № 15.
6. 6. Фармацевтическая композиция в соответствии с любым из пп.1-5, где выбор, номер и/или количество пептидов, присутствующих в композиции, является/являются ткане-, раково- и/или пациентспецифической/ими.
7. 7. Фармацевтическая композиция в соответствии с любым из пп.1-6, дополнительно включающая по крайней мере один приемлемый адъювант, выбранный из группы, включающей 1018 ^8, соли алюминия, Атрйуах, А815, ВСС, СР-870,893, СрС7909, СуаА, ЙЗЫМ, СМ-С8Р, ГО30, ΣΟ31, Имиквимод, ИпиЕас! IМР321, К Ра1сй, КСОМАТК1Х, 1иу1ттиие, ЫроУас, МР59, монофосфорил липид А, Монтанид ПМ8 1312, Монтанид КА 206, Монтанид КА 50У, Монтанид КА-51, ОК-432, ОМ-174, ОМ-197-МР-ЕС, ОКГАК, векторную систему РерТе1, микрочастицы РЬС, резиквимод, 8КЕ172, виросомы и другие вирусоподобные частицы, УЕ-17ЭВСС, стимулон АсщПа'к 0821, В1Ь1'к ЭеЮх, Οιιί1, 8ирегГок, Егеиий'к, ГМКСФ, холерный экзотоксин, иммунологические адъюванты, МЕ59 и цитокины.
8. 8. Фармацевтическая композиция в соответствии с п.7, где адъювант выбран из группы, состоящей из колониестимулирующих факторов, таких как гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (ГМ-КСФ).
9. 9. Фармацевтическая композиция в соответствии с любым из пп.1-8, дополнительно содержащая по крайней мере одну антигенпрезентирующую клетку.
10. 10. Фармацевтическая композиция в соответствии с п.9, где антигенпрезентирующая клетка является дендритной клеткой.
11. 11. Фармацевтическая композиция в соответствии с п.9 или 10, где по крайней мере одна антигенпрезентирующая клетка является:

    a) клеткой с введенным импульсным методом или нагруженным пептидом или

    b) включает модель экспрессии, кодирующую пептид.
12. 12. Фармацевтическая композиция в соответствии с любым из предыдущих пунктов, где композиция вводится внутривенно, внутриартериально, внутрибрюшинно, внутримышечно, внутрикожно, внутрь опухоли, орально, дермально, назально, буккально, ректально, вагинально, с помощью ингаляции или посредством топического введения.
13. 13. Способ лечения или предупреждения рака у пациента, включающий введение пациенту терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции по любому из предыдущих пунктов.
14. 14. Способ в соответствии с п.13, где фармацевтическая композиция является противораковой вакциной.
15. 15. Способ в соответствии с п.14, где рак является раком ротовой полости и глотки, раком пищеварительного тракта, раком толстой кишки, прямой кишки и анального отверстия, раком дыхательных путей, раком груди, раком шейки матки, влагалища и наружных половых органов, раком тела матки и яичника, раком мужских половых путей, раком мочевыводящих путей, раком костной и мягкой ткани и саркомой Капоши, меланомой кожи, меланомой глаза и немеланомным раком глаза, раком головного мозга и центральной нервной системы, раком щитовидной железы и других эндокринных желез, лимфомой Ходжкина, лимфомой не-Ходжкина и миеломой, предпочтительно раком почки, колоректальным раком,