EA023928B1

EA023928B1 - Композиция опухолеассоциированных пептидов и относящаяся к ним противораковая вакцина

Info

Publication number: EA023928B1
Application number: EA201300322A
Authority: EA
Inventors: Харпрет Сингх; Оливер Шор; Клаудиа Траутвайн; Норберт Хильф; Тони Вайншенк; Штеффен Вальтер; Петер Левандровски
Original assignee: Имматикс Байотекнолоджиз Гмбх
Priority date: 2007-07-27
Filing date: 2008-07-25
Publication date: 2016-07-29
Also published as: CA2694771A1; AU2008281013B2; PT2567707T; CN101765434A; AU2008281013A2; DK2567707T3; US7994276B2; EP2567707B1; US20090148400A1; EP2178557A1; NZ582823A; CN101765434B; AU2008281013A1; EA018457B1; EP2178557B1; EA201000208A1; CN103360466B; EA201300322A1; LT2567707T; BRPI0814140A2

Abstract

Изобретение относится к иммунотерапевтическим пептидам и их применению в иммунотерапии, в частности иммунотерапии рака. Настоящее изобретение раскрывает опухолеассоциированные пептидные эпитопы Т-хелперных клеток, в отдельности или в комбинации с другими опухолеассоциированными пептидами, которые служат как активные фармацевтические ингредиенты для композиций вакцины, которая стимулирует противоопухолевые иммунные ответы. В частности, композиция пептидов настоящего изобретения может быть использована в вакцинных композициях для инициации противоопухолевых иммунных ответов против колоректального рака.

Description

Настоящее изобретение относится к иммунотерапевтическим пептидам и их применению в иммунотерапии, в частности иммунотерапии рака. Настоящее изобретение раскрывает опухолеассоциированные пептидные эпитопы Т-хелперных клеток, в отдельности или в комбинации с другими опухолеассоциированными пептидами, которые служат как активные фармацевтические ингредиенты для композиций вакцины, которая стимулирует противоопухолевые иммунные ответы. В особенности композиция пептидов настоящего изобретения может быть использована в вакцинных композициях для инициации противоопухолевых иммунных ответов против колоректального рака.

В соответствии с целями настоящего изобретения все цитаты описания включены в их целостности путем ссылки.

Уровень техники

Колоректальная карцинома.

По данным Американского общества по борьбе с раком колоректальный рак (КРР) занимает третье место по частоте распространения в США, это заболевание поражает ежегодно более 175000 новых пациентов. В США, Японии, Франции, Германии, Италии, Испании и Великобритании оно поражает более 480000 пациентов. Это одна из наиболее частых причин смертности от рака в развитых странах.

Исследователи предполагают, что возникновение колоректального рака является результатом взаимодействия между наследственными факторами и факторами окружающей среды. В большинстве случаев появляются аденоматозные полипы, становясь предшественниками колоректальных опухолей, хотя процесс их перехода в опухоль может занять многие годы. Первостепенный фактор риска для заболевания колоректальным раком - это возраст, в 90% случаев диагноз был поставлен в возрасте более 50 лет. Другие факторы риска заболевания колоректальным раком по данным Американского общества по борьбе с раком включают употребление алкоголя, питание с высоким содержанием жиров и/или сырого мяса и неадекватное потребление фруктов и овощей. Число новых случаев продолжает расти, в особенности на территории таких стран, как Япония, где виновником может быть внедрение западных образцов питания с избыточным потреблением жира и мяса и снижение потребления волокнистой пищи. Несмотря на это частота заболеваемости растет не так быстро, как раньше, что может быть связано с увеличением количества скринингов и удалением полипов, предотвращая, таким образом, прогрессирование заболевания и переход полипов в рак.

Как и при большинстве солидных опухолей, терапия первого ряда - операция, однако только пациенты на ранней стадии могут получить от этого пользу, значительной же доле пациентов диагноз ставится лишь на поздних стадиях заболевания. В химиотерапии колоректального рака на поздних стадиях стандартом лечения являются лечебные схемы, основанные на фторурациле. Большинство данных лечебных схем представляют собой так называемые курсы лечения РОЬРОХ (вливание 5-РИ/лейковорин плюс оксалиплатин) и РОЬИКГ' (иринотекан, лейковорин, болюсное и продолжительное вливание 5Ρϋ).

Внедрение цитотоксических препаратов третьего поколения, таких как иринотекан и оксалиплатин, увеличило надежду на значительное улучшение эффективности, однако прогнозы до сих пор относительно безнадежные. Срок выживаемости при метастатической болезни, как правило, составляет приблизительно 20 месяцев и, в результате этого, остается высокой беспомощность медицины при данном заболевании.

Недавно стало доступным новое поколение медикаментов, действующих на молекулярные мишени, таких как Авастин (бевацизумаб) и Эрбитукс (цетуксимаб), а около 40 соединений находятся на поздней стадии клинических исследований для лечения различных стадий колоректального рака. Комбинации из нескольких таких соединений повышают число потенциальных возможностей лечения, ожидаемых в будущем. Подавляющее большинство веществ находятся на 2-й фазе исследований, при этом данные соединения более часто, чем другие разрабатываемые медикаменты против колоректального рака, адресованы против ΕΟΡΚ. (рецептор эпидермального фактора роста), что связано с тем фактом, что у ~80% пациентов с колоректальным раком наблюдается повышенная экспрессия ΕΟΡΚ.

На данный момент проводятся клинические исследования с пациентами II стадии с комбинацией химиотерапии с одобренными недавно моноклональными антителами (шАЬк) (цетуксимаб+иринотекан или РОЬЕОХ4; бевацизумаб в качестве монотерапии или вместе с РОЬЕОХ4). Для получения статистически достоверных результатов по данным исследованиям необходимы 3-4-годичные периоды наблюдения.

Моноклональные антитела (шАЬк), используемые в настоящее время в онкологии, в целом имеют превосходные шансы на то, что они не будут создавать помех активной иммунотерапии. Действительно, имеются доклинические данные, предполагающие, что элиминация фактора роста эндотелия сосудов ΥΕΟΡ (в случае бевацизумаба) вносит положительный вклад в опосредованную ДК (дендритные клетки) активацию Т-клеток.

На данный момент в около 16 исследованиях проверяется безопасность и потенциал новых иммунотерапевтических подходов для лечения КРР.

- 1 023928

Иммунотерапевтические подходы в лечении.

Стимуляция иммунных ответов зависит от присутствия антигенов, распознающихся иммунной системой хозяина как чужеродные. Открытие существования опухолеассоциированных антигенов повысило сейчас возможность использования иммунной системы хозяина для вмешательства в рост опухоли. Различные механизмы объединения обеих ветвей иммунной системы, как гуморальной, так и клеточной, исследуются в настоящее время для иммунотерапии рака.

Специфические элементы клеточных иммунных ответов способны к специфическому распознаванию и уничтожению опухолевых клеток. Изоляция цитотоксических Т-клеток (ЦТЛ) из популяций опухоль-инфильтрирующих клеток или из периферической крови предполагает, что такие клетки играют важную роль в естественной иммунной защите против рака (Сйссусг е1 а1., Аппа1к Ν.Υ. Асай. δει. 1993, 690:101-112; ΖεΗ Н.Е, Ретту-ЬаПеу И., Иий1еу М.Е., КокепЪегд δ.Α., Υαη§ ЕС.; 1. 1ттиио1. 1999, 162 (2):989-94; Н|дй а\аййу СТЬк ίοτ 1\\ό 8е1£-аийдеи8 йетопк1га1е киретют ίη νίΐτο апй ίη νίνο апйитот е£йсасу). В частности, СИ8-положительные Т-клетки (ΤΟΌ8+), которые распознают молекулы I класса главного комплекса гистосовместимости (МНС) с пептидами, имеющими обычно 8-10 остатков, образованными из белков или дефектных рибосомных продуктов (ΌΚΙΡδ) (8с1шЪег) и., Αηΐοη Ь.С., О1ЪЪк 1., ΝοτЪигу С.С., Υе\γйе11 ЕТО., Вепшпк ЕК.; Кар1й йедтайайоп οί а 1агде Гтасйоп οί пе\\1у куп!йе^ей ргоЮшк Ъу рто!еакошек; №Лиге 2000; 404(6779):770-774), находящихся в цитозоли, играют важную роль при этом ответе. Молекулы МНС человека называются также человеческими лейкоцитарными антигенами (НЬА).

Существуют два класса молекул МНС: молекулы МНС I класса, которые могут встречаться на большинстве клеток, имеющих ядро, которые презентируют пептиды, образующиеся из протеолитического расщепления эндогенных белков ΌΚΙΡδ и более крупных пептидов. Молекулы МНС II класса могут встречаться преимущественно на профессиональных антигенпрезентирующих клетках (АПК) и презентировать пептиды экзогенных белков, которые поглощаются АПК в период эндоцитоза и впоследствии процессируются. Комплексы из пептида и молекулы МНС класса I распознаются СИ8положительными цитотоксическими Т-лимфоцитами с соответствующим ТКР (Т-клеточный рецептор), комплексы из пептида и молекулы МНС класса II распознаются СО4-положительными хелперными Тклетками с соответствующим ТКР.

СО4-положительные хелперные Т-клетки играют важную роль в управлении эффекторными функциями противоопухолевых Т-клеточных ответов, и поэтому идентификация СЭ4-положительных Тклеточных эпитопов, образованных из опухолеассоциированных антигенов (ТАА), может быть чрезвычайно важна для разработки фармацевтических препаратов для инициации противоопухолевых иммунных ответов (КоЪауакЫ, Н., К. От1уа, М. Κωζ, Е. Ниайе, Р. δа^οЪе, 1.1. Ьакайе, М. №ηΉίζ, В. δаηд^ο. 1. Рпе1о, Р. Воггак-Сиек1а, апй Е. Сейк. [йепйПсайоп οί ап апйдешс ерйоре ίοτ йе1рег Т 1утрйосу1ек £тот сагсшоетЪтуотс апйдеп. Сйп. Сапсег Кек. 2002, 8:3219-3225, Ои)айс, δ., Ό. Айшс^ую, Е. 1адег, М. Ма1кио, А. δе1νакита^, Ν.Κ. АЙогкк К.О. Макк В. Иироп!, О. КШег, Υ.Τ. Сйеп, А. КпиИ, апй Ь.Е О1й. διιΐΛΌΥ οί па1ига11у осситпд ΕΌ4+ Т-се11 гекропкек ада1пк1 ΝΥ-ΒδΟ-1 ш сапсег райеп!к: Сотте1айоп тейй апйЪойу гекропкек. Ргос. №й1. Асай. δ^. ИЯ.А. 2003, 100 (15): 8862-7); СИ4+ Т- клетки могут приводить к локальному повышению уровня №Νγ (Οίπ Ζ., δсй^а^ιζкοрΓΓ 1., Ргайега Р., КаттегЮепк Т., δейде^ В., Рисйет Н., В1апкепк1ет Т.; А ст1йса1 гесцигетеп) οί иНегГсгоп датта-тей1а!ей апдюкйМк ίοτ 1итог ге.)есйоп Ъу ΟΌ8+ Т се11к; 1. Сапсег Кек; 2003, 63(14):4095-4100).

На моделях млекопитающих животных, например мышах, было показано, что даже при отсутствии эффекторных клеток цитотоксических Т-лимфоцитов (ЦТЛ) (т.е. СЭ8-положительных Т-лимфоцитов), СО4-положительных Т-клеток достаточно для ингибирующего проявления опухолей посредством ингибирования ангиогенеза при секреции интерферон-гамма ^ΕΝγ) (Οίικ Ζ. апй Т. В1апкепк1еик ΕΌ4+ Т-се11шей1а!ей 1итоиг те.)есйоп икокек шЫЪйюп οί апдюдепекк 1йа1 1к йерепйеп! оп ШИ датта гесер1ог ехргеккюп Ъу попйета!оро1ейс се11к. НпттШу. 2000, 12:677-686). К тому же было показано, что ΟΌ4положительные Т-клетки, распознающие пептиды из опухолеассоциированных антигенов, презентированные молекулами НЬА класса II, могут препятствовать опухолевой прогрессии посредством индукции ответов антител (АЪ) (Кеппейу, К.С., М.Н. δΙ^-ΜΌΚ А.М. ТОайк, апй К.К. ВйдйЕ 2003. ΕΌ4+ Т 1утрйосу1ек р1ау а сг1йса1 го1е ш апйЪойу ртойисйоп апй 1итог иптипйу адатк) ктиап уйик 40 1агде 1итог апйдеп. Сапсег Кек. 2003, 63:1040-1045). В отличие от опухолеассоциированных пептидов, связывающихся с молекулами НЬА класса I, до сих пор было описано лишь небольшое число лигандов класса II опухолеассоциированных антигенов (те^те.сапсепттипйу.огд, хухуху.куТреПНЕйе).

Так как конститутивная экспрессия молекул НЬА класса II обычно ограничена клетками иммунной системы (Масй, В., V. δΕητιΚ, Е. Ма^ι^ηеζ-δο^^а. апй ТО. Кейй. Кеди1а!юп οί МНС с1акк II депек: 1еккопк Ттош а йкеаке. Аппи. Реу. Iттиηο1. 1996, 14: 301-331), то возможность изоляции пептидов класса II напрямую из первичных опухолей считалась невозможной. Тем не менее, изобретателям недавно удалось идентифицировать ряд эпитопов МНС класса II напрямую из опухолей (ЕР 1642905, ЕР 1760088; Эепд|е1 1., №к1ке МГО., Оοийеίаηдеак С., Ойкюийк О., δΗιοοΓ О., АЙепЪетепй Р., Ми11ег М., Кгатег В., Мккюи А., δаШе^ М., Неппеп1о11ег 1., ТОетпе! Ό., δΕπζ1 А., Каттепкее Н.О., Кйпде1 К., δΕνη-ιον® δ.; Ипехрес!ей аЪипйапсе οί НЬА с1акк II ргекеп1ей рерййек ш рптагу гепа1 се11 сагстотак; Сйп Сапсег Кек. 2006; 12:4163- 2 023928

4170).

При отсутствии воспаления экспрессия молекул МНС II класса преимущественно рестриктирована по клеткам иммунной системы, в особенности профессиональным антигенпрезентирующим клеткам (АПК), например, моноцитам, образованным из моноцитов клеткам, макрофагам, дендритным клеткам. Неожиданным образом у пациентов с опухолевыми заболеваниями было обнаружено, что клетки опухолей экспрессируют молекулы МНС II класса (Эепд|е1 I. №-181ке Μ.Ό., СоийеГапдеа8 С., СЙ8Юиб18 С., 8сйоог О., АЙепЬегепб Р., Ми11ег Μ., Кгатег В., М188юи А., 8аи!ет Μ., Неппеп1ойет Т \Уегпе1 Ό., 81еп/1 А., Каттеизее Н.С., К1тде1 К., 81еуапоую 8.; Ипехрейеб аЪипбапсе оГ НЬА с1а88 II рге8ейеб рерйбе8 ίη рйтагу гепа1 се11 сагсшота8; С1ш Саисег Ке8. 2006; 12:4163-4170).

Для того чтобы пептид инициировал (вызывал) клеточный иммунный ответ, он должен связываться с молекулой МНС. Этот процесс зависит от аллеля молекулы МНС и специфических полиморфизмов аминокислотной последовательности пептида. Пептиды, связывающиеся с МНС класса I, имеют обычно 8-10 аминокислотных остатков в длину и обычно содержат два консервативных остатка (якорь) в их последовательности, которые взаимодействуют с соответствующей связывающей бороздкой молекулы МНС. Таким образом, каждый аллель МНС имеет соединительный элемент, определяющий, какие пептиды могут специфически связываться со связывающей бороздкой (Каттеп8ее Н.С., Васйтапп Т, 81еуапоую 8. МНС Идапб8 апб рерйбе тойГ8, Ьапбе8 Вю8с1епсе, И8А, 1997).

В зависящей от МНС I класса иммунной реакции пептиды не только должны быть в состоянии связываться с конкретными молекулами МНС I класса, экспрессируемыми опухолевыми клетками, но они также должны распознаваться Т-клетками, несущими Т-клеточные рецепторы (ТКР).

Антигены, которые распознаются опухолеспецифическими Т-лимфоцитами, т.е. их эпитопами, могут быть молекулами, образованными из любого класса белков, таких как ферменты, рецепторы, факторы транскрипции и т.д. Кроме того, опухолеассоциированные антигены, например, могут быть представлены также только в опухолевых клетках, например, как продукты мутировавших генов. Другой важный класс опухолеассоциированных антигенов представлен тканеспецифическими антигенами, такими как антигены СТ (раковый тестикул), которые экспрессированы в различных видах опухолей и здоровой ткани семенника.

Были выявлены различные опухолеассоциированные антигены. Затем, много усилий было потрачено на исследования по идентификации дополнительных опухолеассоциированных антигенов. Некоторые группы опухолеассоциированных антигенов, также именуемые в области техники как опухолеспецифические антигены, являются тканеспецифическими. Примеры включают, но не ограничиваются тирозиназой для меланомы, Р8А (простата-специфический антиген) и Р8МА (простата-специфический мембранный антиген) для рака простаты и хромосомными кроссоверами (транслокации), такими как Ъсг/аЪ1 в лимфоме. Тем не менее, многие опухолеассоциированные антигены, которые были идентифицированы, встречаются во множестве видов опухолей, и некоторые, такие как онкогенные белки и/или генысупрессоры опухоли (обзор генов-супрессоров опухоли для почечного рака дается, например, у Ыпейап \ν.Μ., ^аййет М.М., 2Ьаг В. Тйе депейс Ъа818 оГ сапсег оГ Хйе 1йбпеу. I. Ито1. 2003 Эес. 170 (6РЙ):2163-72), которые фактически вызывают трансформационное явление, встречаются практически во всех видах опухолей. Например, нормальные клеточные белки, контролирующие рост и дифференциацию клетки, такие как р53 (который является примером гена-супрессора опухоли), га8, с-те1, тус, рКВ, УНЕ и НЕК2/пеи, могут аккумулировать мутации, приводящие к повышенной экспрессии продуктов этих генов, делая их тем самым онкогенными (МсСайеу е1 а1. Сапсег Ке8еагсй 1998, 15:58, 2601-5; Όί8ΐ8 е1 а1. СаЬа Роипб. 8утр. 1994, 187:198-211). Эти мутантные белки также могут быть мишенью опухолеспецифического иммунного ответа при многих видах рака.

Иммунотерапия больных раком направлена особенно на активацию клеток иммунной системы, в особенности, т.н. цитотоксических Т-клеток (ЦТЛ, также известные как киллерные клетки, известные также как СН8-положительные Т-клетки) против опухолевых клеток, но не против здоровой ткани. Опухолевые клетки отличаются от здоровых клеток экспрессией опухолеассоциированных белков. Молекулы НЬА презентируют наружу на клеточной поверхности клеточное содержимое, таким образом, давая возможность цитотоксическим Т-клеткам отличать здоровую клетку от опухолевой. Это происходит путем расщепления всех белков внутри клетки на короткие пептиды, которые присоединяются, затем, к молекулам НЬА и презентируются на клеточной поверхности (Каттеп8ее, Н.С., Ра1к, К., апб Ко1/8сйке, О.; Рерйбе8 паШгайу рге8еп1еб Ъу МНС с1а88 I то1еси1е8, Аппи. Кеу. Тттипок, 1993, 11,213-244). Пептиды, представленные на опухолевых клетках, а не или в намного меньшей степени на здоровых клетках организма, называются опухолеассоциированными пептидами (ТИМАР8).

Для того чтобы белки были узнаны цитотоксическими Т-лимфоцитами в качестве опухолеспецифического или ассоциированного антигена, и чтобы они могли использоваться в терапии, должны выполняться особые предварительные требования. Антиген должен быть экспрессирован преимущественно опухолевыми клетками, а не здоровыми тканями или в сравнительно малом объеме. В дальнейшем желательно, чтобы соответствующий антиген не только присутствовал в каком-либо виде опухоли, но и также имел высокую концентрацию (т.е. число копий соответствующего пептида на клетку). Опухолеспецифические и опухолеассоциированные антигены часто бывают образованы из белков, напрямую задейство- 3 023928 ванных в трансформации нормальной клетки в опухолевую, в связи с функцией, например, при контроле клеточного цикла или апоптозе. В дополнение также мишени белков нисходящего каскада реакций, напрямую являющихся причиной трансформации, могут быть представлены в повышенном количестве и, таким образом, косвенно опухолеассоциированными. Такие косвенно опухолеассоциированные антигены могут также быть мишенями вакцинационного подхода. В обоих случаях необходимо присутствие эпитопов в аминокислотной последовательности антигена, поскольку такой пептид (иммуногенный пептид), который образован из опухолеассоциированного антигена, должен вести ίη νίΐτο или ίη νίνο к Т-клеточному ответу.

В основном любой пептид, способный связываться с молекулой МНС, может выполнять функцию Т-клеточного эпитопа. Предварительным условием для индукции Т-клеточного ответа ίη νίΐτο или ίη νίνο является присутствие Т-клетки с соответствующим ТКР и отсутствие толерантности к данному конкретному эпитопу. Т-хелперные клетки играют важную роль в управлении эффекторной функцией ЦТЛ в противоопухолевом иммунитете. Эпитопы Т-хелперных клеток, инициирующие ответы Т-хелперных клеток типа Т_Н1, поддерживают эффекторные функции СЭ8-положительных киллерных Т-клеток, которые включают цитотоксические функции, направленные против опухолевых клеток, проявляющих опухолеассоциированные пептиды/МНС-комплексы на их клеточной поверхности. Таким образом, опухолеассоциированные пептидные эпитопы Т-хелперных клеток, одни или в комбинации с другими опухолеассоциированными пептидами, могут служить в качестве активных фармацевтических ингредиентов вакцинных композиций, которые стимулируют противоопухолевые иммунные ответы.

Так как оба вида ответов, зависящие от СЭ8 и от СЭ4. вносят свой вклад в противоопухолевый эффект сообща и усиливая друг друга, то идентификация и характеристика опухолеассоциированных антигенов, распознаваемых как СЭ8+ ЦТЛ (молекула МНС I класса), так и СЭ4-положительными ЦТЛ (молекула МНС II класса) являются важными при разработке противоопухолевых вакцин. Поэтому целью настоящего изобретения является обеспечение композиций пептидов, которые содержат пептиды, связывающиеся с комплексами МНС любого класса.

Первые клинические испытания с использованием опухолеассоциированных пептидов были начаты в середине 1990 г. Буном (Βοοη) и коллегами, в основном, для показания меланома. Клинические ответы в лучших попытках достигали от 10 до 30%. О серьезных побочных эффектах или сильной аутоиммунности не сообщалось ни в одном клиническом исследовании с использованием основанной на пептидах вакцинной монотерапии. Сообщалось о слабых формах витилиго у некоторых пациентов, проходивших лечение меланома-ассоциированными пептидами.

Тем не менее, прайминга одного вида ЦТЛ обычно не достаточно для устранения всех опухолевых клеток. Опухоли обладают сильной мутагенностью и, таким образом, способны быстро реагировать на атаки ЦТЛ изменением своей белковой структуры для избегания узнавания ЦТЛ. Для контратаки по механизмам уклонения опухоли от ударов для вакцинации использовались различные специфические пептиды. Таким способом по опухоли могла быть произведена одновременная атака несколькими клонами ЦТЛ, действовавшим синхронно. Так могут быть снижены шансы опухоли на ускользание от иммунного ответа. Эта гипотеза недавно получила подтверждение в клиническом исследовании по лечению пациентов с меланомой на поздней стадии. С всего лишь несколькими исключениями пациенты, имевшие по меньшей мере три различных Т-клеточных ответа, демонстрировали объективные клинические ответы или стабильность заболевания (Вапскегеаи, ί., Ра1иска, А.К., ΟΗούαρΚαΓ, Μ., ΒΗΓΚοΗουοΓ, δ., ТасщеР Ν., Κοίίαηά, А., ТасщеР δ., ^диету, δ., \νί11ί<ο\ν8ΐ<ί„ Κ.Μ., Вкагй\уар Ν., Ρίηθίτο, Ь., δΐβίηωαη, К., апй Рау, ί.; Iттиηе апй сктса1 ^е8рοη8е8 ίη райеШз \уйк тейМаОс теίаηοта ΐο СЭ34 (+) ргодешЮг-йепуей йепйпОс се11 уассше, Сапсег Кее., 2001, 61, 6451-6458), а также увеличение выживаемости (личные беседы с ί. Вапскегеаи), в то время как подавляющему большинству пациентов, имевшему менее трех Т-клеточных ответов, был поставлен диагноз прогрессирования заболевания.

Исследование кандидатов демонстрировало похожий эффект, если пациенты, страдавшие от почечно-клеточной карциномы, проходили курс лечения с вакциной, составленной из 13 различных пептидов (Н. δ^ηдк-^а8и^а, δ. ХУаНее Т. ХУетзскепк, А. Мауег, Ρ.Υ. П1ейтск, Μ. δΐаек1е^, А. δΐеηζί, δ. δΐеνаηον^с, Н. Каттепзее, ί. Рпзск; СоггекЦюп οί Т-се11 ^е8рοп8е, сНтса асО\ку апй гедп1аЮгу Т-се11 ίеνеί8 ίη гепа1 се11 сагснюта райеп18 1геа1ей еНН 1МА901, а ηονеί тиШ-рерНйе νасс^ηе; АδСΟ Меейпд 2007 Ρο8ΐе^ # 3017; М. δΟκΗΦι; А. δΐеηζί, Р. Υ. 01е1г1сН, Т. Е18еп, А. НаГегкатр, ί. Веск, А. Мауег, δ. ХУаНен Н. δίη^Η, ί. Рпзск, С. С. δώί; Ап οреη 1аке1 8Шйу ΐο еνаίиаΐе ΐке 8аГе1у апй ίιηιηι.πκ^ηίαΙ\· οί ΐке реркйе казей сапсег νасс^ηе 1МА901, АδСΟ тееОпд 2007; Ρο8ΐ^'Γ # 3017).

Основной задачей в разработке вакцины против опухолей является, поэтому, не только идентификация и характеристика новых опухолеассоциированных антигенов и полученных из них иммуногенных Т-хелперных эпитопов, но и комбинирование различных эпитопов для увеличения вероятности ответа на более чем один эпитоп для каждого пациента. Поэтому целью настоящего изобретения является обеспечение комбинаций аминокислотных последовательностей таких пептидов, которые обладают способностью связываться с молекулой главного комплекса гистосовместимости человека (МНС) класса I (НЬА класса I) или II (НЬА класса II). Дальнейшей целью настоящего изобретения является обеспечение эффективной противораковой вакцины, которая основана на комбинации этих пептидов.

- 4 023928

В настоящем изобретении изобретатели изолировали и охарактеризовали пептиды, связывающиеся с молекулами НЬЛ класса I или II, напрямую из опухолей млекопитающих, т.е. колоректальных карцином.

Настоящее изобретение обеспечивает пептиды, которые образованы из антигенов, ассоциированных с генезом опухоли, и имеют способность связываться в достаточной мере с молекулами МНС (НЬЛ) II класса для инициации иммунного ответа человеческих лейкоцитов, в особенности лимфоцитов, в особенности Т-лимфоцитов, в особенности СИ4-положительных Т-лимфоцитов, в особенности СЭ4положительных Т-лимфоцитов, опосредующих иммунные ответы типа Т_Н1.

Настоящее изобретение обеспечивает также пептиды, которые образованы из антигенов, ассоциированных с генезом опухоли, и имеют способность связываться в достаточной мере с молекулами МНС (НЬЛ) I класса для инициации иммунного ответа человеческих лейкоцитов, в особенности лимфоцитов, в особенности Т-лимфоцитов, в особенности СЭ8-положительных цитотоксических Т-лимфоцитов, в равной степени как и комбинации обоих, которые особенно полезны для вакцинации пациентов, страдающих от рака.

В соответствии с настоящим изобретением поставленная задача решена обеспечением фармацевтической композиции, включающей по крайней мере два пептида, содержащих аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из 8ЕС ГО N0: 1 по 8ЕС ГО N0: 7, и/или содержащих вариантную аминокислотную последовательность, которая по крайней мере на 80% гомологична последовательностям с 8ЕС ГО N0: 1 по 8ЕС ГО N0: 7, и/или полинуклеотид, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую 8ЕС ГО N0: 1 по 8ЕС ГО N0: 7 или вариантную аминокислотную последовательность, и фармацевтически приемлемый носитель. Фармацевтические композиции по настоящему изобретению в дальнейшем могут включать по крайней мере один дополнительный пептид, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из 8ЕС ГО N0: 8 по 8ЕС ГО N0: 15, или содержащий вариантную аминокислотную последовательность, которая по крайней мере на 80% идентична последовательностям с 8ЕС ГО N0: 8 по 8ЕС ГО N0: 15, или полинуклеотид, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую 8ЕС ГО N0: 8 по 8ЕС ГО N0: 15 или вариантную аминокислотную последовательность. Пептиды могут иметь общую длину между 8 и 100, предпочтительно между 8 и 30, и особенно предпочтительно между 8 и 16 аминокислотами. Пептиды могут также иметь непептидные связи.

Как будет описано далее, пептиды, формирующие основу настоящего изобретения, были все идентифицированы как презентируемые несущими клетками МНС I или II класса. Таким образом, эти конкретные пептиды так же, как и другие пептиды, содержащие данную последовательность (т.е. дериваты пептидов), все вызывают специфический Т-клеточный ответ, хотя уровень, до которого такой ответ будет простимулирован, может варьироваться между отдельными пептидами и отдельными пациентами. Различия, например, могут быть вызваны мутациями в пептидах. Специалист данной области полностью осведомлен о способах, которые могут использоваться для определения силы, с которой был индуцирован ответ каждым отдельным пептидом, в частности, благодаря ссылкам на приведенные здесь примеры и соответствующую литературу.

Предпочтительным образом, варианты по изобретению будут индуцировать Т-клеточную перекрестную реакцию с соответствующим пептидом по изобретению.

Процентная доля гомологии между аминокислотной последовательностью пептида или последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей пептид, и вариантом может быть подсчитана с помощью алгоритмов, хорошо известных из уровня техники. В настоящем изобретении термин гомологичный относится к степени идентичности между последовательностями двух аминокислотных последовательностей, т.е. пептидных или полипептидных последовательностей. Упомянутая ранее гомология определяется при сравнении двух последовательностей, сопоставляемых в оптимальных условиях со сравниваемыми последовательностями. Сравниваемые здесь аминокислотные или нуклеинокислотные последовательности могут иметь дополнение или делецию (например, разрыв и т.п.) в оптимальном противопоставлении двух последовательностей. Такая гомология последовательности может быть подсчитана с помощью создания противопоставления, например, по алгоритму ОиЧаВУ (№с1ею Άαά Ке8., 22(22): 4673, 4680 (1994). Также может быть использовано широко распространенное программное обеспечение для анализа последовательностей, в частности, УесЮг N41 СЕХЕТУХ или аналитические инструменты, предоставляемые общественными банками данных, такие как, например,

1Шр://ге51оо15.505с.еби/Ью1оо15/Ью1оо1516.1ит1.

Фармацевтически приемлемые носители хорошо известны и обычно представляют собой жидкости, в которых приготавливается активное терапевтическое вещество. Носитель обычно не обеспечивает состав никакой фармакологической активностью, хотя он может обеспечивать химическую и/или биологическую стабильность, характеристики высвобождения и т.п. Примеры составов рассматриваются, например, у Л1Еои8о К. Сеппаго. РепипдЮп: Т1е §с1епсе апб Ргасйсе оГ РЬагтасу, 20ΐ1ι Ебйюи. ВаШтоге. ΜΌ: Ырршсой ^ййатк & ХУНки!^ 2000 и включают, но не ограничиваются, раствором натрия хлорида, водой, буферной водой, 0,3% глицином, гиалуроновой кислотой, декстрозой и т.п. Недавно было обнаружено, что определенные жировые эмульсии, которые в течение многих лет использовались для внутри- 5 023928 венного питания пациентов (людей), могут также выступать в роли наполнителя для пептидов. Два примера таких эмульсий представляют собой имеющиеся в продаже жировые эмульсии, известные как Интралипид (ΙηίΓαΙίρίό) и Липофундин (Προίπηάίη). ΙηΐΗίΠρίά является зарегистрированной торговой маркой фирмы КаЫ РЬагтааа, Швеция, для жировой эмульсии для внутривенного питания и описывается в патенте США И.8. Ра!. Νο. 3169094. Είροίπηάίη - это зарегистрированная торговая марка фирмы В. Вгаип Мсйшщсп. Германия. Обе эмульсии в качестве жира содержат масло соевых бобов (100 или 200 г на 1000 мл дистиллированной воды: 10% или 20% соответственно).

Фосфолипиды яичного желтка используются в качестве эмульгатора в Интралипиде (12 г/л дистиллированной воды) и лецитин яичного желтка - в Липофундине (12 г/л дистиллированной воды). Изотоничность является результатом добавления глицерола (25 г/л) как в Интралипид, так и в Липофундин.

Пептиды образованы из опухолеассоциированных антигенов, в особенности опухолеассоциированных антигенов с функциями, например, в протеолизе, ангиогенезе, росте клеток, регуляции клеточного цикла, делении клеток, регуляции транскрипции, регуляции трансляции, инвазии ткани и т.д. В табл. 1 представлены пептиды и функция белка, из которого они образованы.

Таблица 1

Пептиды настоящего изобретения и функция материнского белка

βες НО:	т пептида	Последовательность	Символ гена	Функция	Связывается с МНС
1	С20-001	АЬБНЪЕУТЬ	С20огГ42	задействован в присоединении актинового цитоскелета к ЕСМ	НЬА-А*02
2	ΝΟΧ-001	ΙΙιΑΡνίΙΎΙ	ΝΟΚ1	ΝΑϋΡίί-оксидаза	НЬА-А*02
3	ООС-001	ΙΣϋΟΚΙΝΕν	СЩС1	Орнитин- декарбоксилаза	НЬА-А*02
4	РСЫ-001	КЬМОЬОТЕОЬ	РСЫА	вспомогательный белок ДНК- полимеразы дельта	НЬА-А*02
5	ТСГВ1- 001	АЬГУРЬЬАЬА	Т0ЕБ1	тр а н с формирующий фактор роста, бетаин Аудированный	Н1±А-А*02
&	ТОР-001	ΚΙΕΌΕΐυνΝΑ	ТОР2А/ТОР2В	топоизомераза	ΗΙιΑ-Α*02
7	ΤΟΡΒΙ- 004	ТРРЮДНТКЫЬЬКНН	ТСГВ1	трансформирующий фактор роста, бетаин дуцированный	НЬА-ОН

Открытая рамка считывания 42 хромосомы 20.

С20ог£42 является белком фокальной адгезии, задействованным в присоединении актинового цитоскелета к плазменной мембране и в опосредованных интегрином клеточных процессах. Дефицит С20ог£42 как результат мутаций с потерей функции приводит к синдрому Киндлера, аутосомальному рецессивному генодерматозу, характеризующемуся образованием волдырей на коже, прогрессивной атрофией кожи, светочувствительностью и, изредка, к канцерогенезу (Нсг/. С., АитаШеу, М., 8сЬи1!е, С., БсН1о1/сг-БсНгсНагб1. и., В^искηе^-Τиάе^таη, Ь., аЫ На§, С.; Κίηά1ίη-1 ίδ а рйо8рйорго!ет шуокеб ίη геди1;·Ηίοη о£ ро1агЪу, ρΐΌ1ίΙοπ·ιΙίοη. ;тб то!Ш!у о£ ер16егта1 кега!тосу!е8, 1. Вю1 СЬет., 2006, 281, 3608236090). Недавно сообщалось о серьезном поражении желудочно-кишечного тракта с гемоколитом у пациента с мутацией с потерей функции (8а61ег, Е., К1аи8еддег, А., Ми88, V., ОеиъЪегдег. и., РоЬ1а-СиЬо, С., Ьа1тег, М., ЕащсЬиейег, С., Ваиег, Τ\ν.. ;·ιηά НшШег, Н.; Νο\ό1 ΚΙΝΏΙ депе ти!а!^οη ίη Кш61ег δνηбготе №ЙЬ 8еуеге даδ!^ο^η!еδ!^ηа1 !гас! шуокетей, АгсЬ. Эегта1о1.. 2006, 142, 1619-1624).

В контексте раковых заболеваний С20ог£42 описывался в исследованиях, занимающихся изучением экспрессии генов в окружении, имеющем отношение к раку. Как было обнаружено, он был гиперэкс- 6 023928 дрессирован в 70% случаев рака толстой кишки и 60% случаев рака легких (п=10). Нормальная тканевая экспрессия при нозерн-блоттинге (ШПйегп Βίοι) была ограничена нейромышечными тканями (\Уе1п81еип Е.Е, Воигпег, М., Неаб, К., 2акет1, Н., Ваиег, С., апб Ма//агс11а. К.; ИКР1: а шешЬет оГ а ηονβί Гатбу оГ РН апб РЕКМ ботат-соп1аййпд тетЬгапе-а880С1а1еб рго1еш8 ίδ 81дшйсапЙу о\'ег-е\рге88еб ίη 1ипд апб со1оп сагсшотаз, Вюсйип. Вюрйу8. Лс1а, 2003, 1637, 207-216). Кроме того, С20огГ42 был идентифицирован как ген, участвующий в ΤΟΡ-β-опосредованной клеточной миграции и опухолевой инвазии (К1оекег, 8., Ма_)от, М.В., Са1бетгеооб, Ό.Ά., СтзЬегд М.Н., 1опе8, Ό.Ά., апб Вескег1е, М.С.; Тйе Кшб1ет зупбготе ргсйет ίδ теди1а1еб Ьу 1гап8Гогт1пд дго\\1й Гас1ог-Ье1а апб икокеб ш т1едпп-теб1а1еб абйе8юп, I. Вю1. Сйет., 2004, 279, 6824-6833).

NЛ^РН-оксидазы гомолог-1 (N0X1).

N0X1 является чувствительным к факторам роста ферментом, который катализирует образование реактивных форм кислорода, высшего оксида (О_2-) и перекиси водорода (Н₂0₂). Его экспрессия была первоначально выявлена в толстой кишке, простате, матке и пролиферирующих васкулярных гладкомышечных клетках (8ип, Υ.Α. е1 а1. Се11 йатГоттайоп Ьу 1йе 8ирето\1бе-депегайпд оюба8е Мо\1. №йиге 1999, 401, 79-82). Его экспрессия связана с рядом биологических реакций, включая клеточную пролиферацию, ангиогенез и активацию клеточных сигнальных путей (Нагрет, К.^., Хи, С., 8оисек, К., §ейабц Н. апб Е18ейсй, ЕР. А теаррта18а1 оГ 1йе депопис огдаш/айоп оГ йитап №\1 апб Й8 8рйсе νа^^апΐ8. Лгсй. Вюсйет. Вюрйу8. 2005, 435, 323-330).

N0X1 высокоэкспрессирован в толстой кишке, но его функция в кишечной физиологии или патологии до сих пор плохо изучена. В нормальных тканях экспрессия N0X1 была низкой в подвздошной кишке, средней в восходящей ободочной кишке и высокой в нисходящей ободочной кишке. Статистических различий по экспрессии N0X1 не наблюдалось между пробами, взятыми из аденом, хорошо или плохо дифференцированных аденокарцином толстой кишки. N0X1 был высокоэкспрессирован в эпителиальных клетках толстой кишки, как в криптах, так и на люминальной поверхности. В заключение, N0X1 является ферментом, который конститутивно экспрессирован в эпителии толстой кишки и не ассоциирован напрямую с генезом опухоли (У/аШо, I. е1 а1. Ехрте88юп оГ N0X1, а 8ирето\1бе-депегайпд ΝΆΟΓΜ ох1ба8е, ш со1оп сапсег апб тПаттаЮгу Ьогее1 б18еа8е. Е Ра1Но1. 2005, 207, 164-176).

Иммуногистохимия показала, что N0X1 был конститутивно экспрессирован в поверхности слизистых клеток. Аденомы и хорошо дифференцированные аденокарциномы повышали уровень экспрессии N0X1. Ядерный фактор (ОТукарраВ был преимущественно активирован в клетках аденомы и аденокарциномы, экспрессирующих в избытке N0X1, приводя к предположению, что N0X1 может стимулировать ΝΡ-карраВ-зависимые антиапоптотические каскады реакций в опухолях толстой кишки (Рикиуата, М. е1 а1. 0\'еге\рге88юп оГ а пονе1 8ирето\1бе-ргобистд еп/уте, ΝΆΟΓΜ о\зба8е 1, ш абепота апб гее11 бЕГГегепРаЮб абепосагсшота оГ 1йе йитап со1оп. Сапсег Ьей. 2005, 221, 97-104).

Сигнальные реакции с ^п13а/Ье!а-катенином, как было описано, индуцируют экспрессию N0X1 (Ре1торои1о8, Н. & §кет)апс, I. 8. Ве1а-са1ешп 18 е88епйа1 апб 8иГйс1еп1 Гог 8ке1е1а1 туодепе818 ш Р19 се118. Е Вю1 Сйет. 2002, 277, 15393-15399).

Недавно предполагалось, что реактивные формы кислорода индуцируют эндотелиальный апоптоз, который впоследствии индуцирует экспрессию различных адгезивных молекул для опухолевых клеток. Это указывает на то, что при остановке выделения К08 (активные формы кислорода) препятствование рецидиву опухоли на отдаленных участках может быть обоснованным (Теп, К.М., νап бег \УаГ ЕВ., 8йШег, Нойапб, Ь.Е, .Гееке1, Е, δοппеνе1б, Р., апб νап Еуск, С.Н.; Тйе го1е оГ 8ирегох1бе атоп8 ш 1йе беνе1ортеЩ оГ б181ап1 Штоиг гесиггепсе, 2006, Вгб Сапсег).

Орнитин-декарбоксилаза 1 (0ИС1).

0ИС1 - это ограничивающий количество фермент при реакциях биосинтеза полиаминов, который катализирует орнитин в путресцин. Уровень активности фермента варьируется в зависимости от способствующих росту стимулов и проявляет высокую интенсивность обмена веществ по сравнению с другими белками млекопитающих.

Метаболизм полиаминов является неотъемлемым компонентом механизма канцерогенеза в эпителиальных тканях. Увеличения 0ИС1 часто ассоциируются с началом роста нормальных клеток и с продолжительным ростом опухолевых клеток. Ингибиторы 0ИС1 подавляют образование опухоли в экспериментальных моделях канцерогенеза мочевого пузыря, груди, толстой кишки и кожи. Г иперэкспрессия активности 0ИС1 - это хорошо известная черта многих видов рака, и 0ИС1 считался протоонкогеном (Л^шеп, М., Раа8шеп, Л., Лпбег88оп, Ь. С. апб Но1йа, Е. 0тпййте бесагЬо\у1а8е ас1кйу 18 сййса1 Гог се11 йатГоттайоп. №йиге 1992, 360, 355-358).

Мутации в линиях гоноцитов в гене аденоматозного полипоза толстой кишки (АРС) являются одной из наиболее явно выраженных наследственных предрасположенностей к раку толстой кишки.

Мутации АРС вызывают значительное увеличение уровней свободного β-катенина, который перемещается в ядро, где формирует комплекс с членами семейства лимфоидно-усиливающих факторов (ЬЕР)/Т-клеточных факторов (ТсГ) последовательность-специфических факторов транскрипции. Онкоген с-тус является одним из генов-мишеней ТсГ (Не, Т.С. е1 а1. Иепййсайоп оГ с-МΥС а8 а 1агде1 оГ 1йе АРС

- 7 023928 ра(к\хау 8аепсе 281, 1509-1512 (1998). с-Мус РНК и белок гиперэкспрессированы как на ранних, так и на поздних стадиях онкогенеза колоректального рака). ОЭС является геном-мишенью с-Мус.

Потеря функции АРС приводит к увеличению количества ОЭС1 (Оешег, Е.^. апб Меуккепк, Р.Ь., 1г., Ро1уаш1пек апб сапсег: о1б то1еси1ек, пе\е ипбегйапбшд, №ц. Кеу. Сапсег, 2004, 4, 781-792), и гиперэкспрессия наблюдается часто при колоректальной карциноме (Ни, Η.Υ. е! а1. ОгпйЫпе бесагЬоху1аке депе ίκ оуегехргеккеб ш со1огес!а1 сагсшота, \Уог1б 1. Оак!гоеп1его1. 2005, 11, 2244-2248; КЛакага, 0. е! а1. АНегаОопк оГ депе ехргеккюп бигшд со1огес!а1 сагсшодепеык геуеа1еб Ьу сОЫА тюгоаггаук айег 1акегсар!иге тюгобюкесЛоп оГ (итог Лккиек апб погта1 ерккеНа; Сапсег Кек. 2001, 61, 3544-3549; №то!о, Т., Кикой 8., 1кЫба, Н., Мигай, N. апб НакНто1о, Ό. ОгпбЫпе бесагЬоху1аке, тЛодеп-асЛуа!еб рго1ет ктаке апб тайтх те1а11орго1етаке-2 ехргеккюпк ш китап со1оп (итогк. \Уог1б 1. Сак1гоеп1его1. 2005, 11, 30653069).

ОЭС1 обладает проангиогенными свойствами, действуя в качестве супрессора эндостатина (№шо!о, Т., Ной, Н., Υоκк^тоΐо, М., 8еуата, Υ. & КиЬо1а, 8. Оуегехргеккюп оГ огпйЫпе бесагЬоху1аке епкапсек епбо(кека1 ргоШегайоп Ьу кирргеккшд епбок1айп ехргеккюп. В1ооб 2002, 99, 1478-1481).

Инфекция клеточной линии НТ-29 КРР аденовирусом, кодирующим антисмысловую РНК для ОЭС1 и 8-аденосилметионин декарбоксилазу (другой важный фермент при реакциях биосинтеза полиаминов), приводит к снижению уровня ί'.'ί'.'ΝΌ1 и блокировке клеточного цикла. Более того, ядерная транслокация бета-катенина была также ингибирована (Сопд, Ь., Лайд, С., 2капд, В., Ни, Н., ^апд, апб Ьш, X.; Абепо\агик-теб1а1еб Ехргеккюп оГ Во!к Апйкепке Огтбппе ЭесагЬоху1аке апб 8абепоку1те1Ыошпе ЭесагЬоху1аке 1пбисек С(1) Аггек! ш НТ-29 Се11к, 1. Вюскет. Мо1. Вю1, 2006, 39, 730736). Аденовирус индуцировал также регрессию опухоли уже сформировавшихся опухолей у голых мышей (2Ьапд, В., Ьш, Х.Х., 2капд, Υ., Лапд, ΟΥ., Ни, НУ., Оопд, Ь., Ьш, М., апб Тепд, О.8.; Ро1уатше бер1ейоп Ьу ОЭС-АбоМеЮС апйкепке абепоуЛик 1траЛк китап со1огес(а1 сапсег дгоМЛ апб шуакюп ш νίΙΐΌ апб ш У1уо, 2006, 1. Оепе Меб, 8, 980-989).

Специфическим и необратимо действующим ингибитором ОЭС1 является 2-дифтормегилорнитин (ОМРО, ЕйотйЫпе (8апой- Ауепйк)). Он применяется для лечения сонной болезни (вызываемой трипаносомами) и является активным ингредиентом крема для удаления волос Уашда.

Что касается раковых заболеваний, ОМРО широко использовался в преклинических моделях и проявил многообещающие антиопухолевые эффекты при снижении уровней полиамина (Оегпег, Е.^. апб Меуккепк, Р.Ь., 1г.; Ро1уатшек апб сапсег: о1б то1еси1ек, пе\г ипбе^κΐаиб^пд, \Уа1. Кеу. Сапсег, 2004, 4, 781792). Клинические исследования проводились для нескольких видов рака, и некоторые реализуются сейчас для КРР. Однако данные исследования представляют собой, в основном, комбинированные подходы, проводящиеся в профилактических целях для пациентов, особенно восприимчивых к КРР (аденоматозные полипы).

Иммуногенный ОЭС-пептид ОЭС-001 был идентифицирован ранее (М. П1еЫ, РЛЭ ТкекЛ Ишуегкйу оГ ТиЬшдеп, 1998).

Ядерный антиген пролиферирующих клеток (РСNА).

РСNА был обнаружен в ядре и является кофактором ДНК-полимеразы дельта. Кодируемый белок выступает в качестве гомотримера и помогает увеличить процессивность синтеза ведущей нити во время репликации ДНК. Поэтому он экспрессирован во всех пролиферирующих клетках, в особенности опухолевых клетках, и используется в качестве маркера для детекции пролиферации.

Индексы пролиферации в неопластической и смежной нормальной слизистой оболочке, как установлено при иммуногистохимическом анализе РСNА, на протяжении долгого времени известны как независимые прогностические факторы рецидива и низкой выживаемости пациентов с колоректальным раком (а1-8ЛепеЬег, 1.Р., 8ЫЬа1а, Н.К., 8атрайк, 1., апб 1о!Лу, 8.; Ргодпокйс ыдшйсапсе оГ ргоЛГегайпд се11 пис1еаг апйдеп ехргеккюп ш со1огес(а1 сапсег, Сапсег, 1993, 71, 1954-1959; Мауег, А., ТактюЮ, М., Ρηΐζ, Е., 8ске11апбе^. О., Койег, К., апб Ьибте1д, Н.; Тке ргодпокйс ыдшйсапсе оГ ргойГегайпд се11 пис1еаг апйдеп, ер1бегта1 дго\х1к Гас(ог гесер!ог, апб тбг депе ехргеккюп ш со1огес(а1 сапсег, Сапсег, 1993, 71, 2454-2460; Nакати^а. Т., Такискг Υ., Nакае, 8., Окпо, М., апб 8аЛок, Υ.; 8егит сагстоетЬгуошс апйдеп 1еуе1к апб ргоЛГегайпд се11 пис1еаг апйдеп 1аЬекпд шбех Гог раЛейк \хкк со1огес(а1 сагсшота. Согге1аЛоп \хкк (итог ргодгеккюп апб кигу1уа1, Сапсег, 1996, 77, 1741-1746).

ДНК-топоизомераза II (ТОР2).

ТОР2А и ТОР2В кодируют изоформы ДНК-топоизомеразы, фермента, который контролирует и меняет топологическое состояние ДНК во время транскрипции. Данный ядерный фермент задействован в таких процессах, как конденсация хромосом, сепарация хроматид и снятие торсионного напряжения, которое возникает во время транскрипции и репликации ДНК. Он катализирует временный разрыв и воссоединение двух нитей дуплекса ДНК, который позволяет нитям пройти сквозь друг друга, меняя тем самым топологию ДНК. Две изоформы данного фермента существуют, как предполагается, как продукты явления дупликации гена. Ген, кодирующий альфа-форму, локализован в хромосоме 17, а бета-ген локализован в хромосоме 3.

ТОР2А является мишенью для нескольких противораковых агентов, а ряд мутаций в этом гене был ассоциирован с развитием резистентности к лекарственным средствам.

- 8 023928

Ген ТОР2А расположен смежно с онкогеном НЕК-2, наиболее часто амплифицируемым онкогеном при раке груди, на хромосомной локализации 17ς12-ς21. и либо амплифицирован, либо делетирован, с одинаковой частотой, в почти 90% случаев первичных опухолей груди с амплификацией НЕК-2 (Затушеи, Т.А. апб Пи, Е.Т.; Торо1хотегахе Па1рка депе (ТОР2А) атрййсайоп апб бе1ейоп ίη сапсег-тоге соттоп Шап апйс1ра1еб, Су1ора1ко1оду, 14, 309-313). Более того, об амплификациях ТОР2А сообщалось и в связи с другими видами рака. Недавние экспериментальные, а также многочисленные, крупные, мультицентровые клинические исследования позволяют сделать предположение, что амплификация (и/или делеция) ТОР2А может сказываться как в чувствительности, так и резистентности к используемым обычно цитотоксическим лекарственным препаратам, т.е. ингибиторам топоизомеразы-ΙΙ (антрациклины и т.д. Ке11пег, и., ЗекехЮб, М., йпхеп Р.В., 01ехе1ет, Р., апб Кибо1рк, Р.; Си1ргй апб уюйт-ОЫА ЮроБотегахе II, Ьапсе! Опсо1., 2002, 3, 235-243), в зависимости от специфического генетического дефекта на локусе ТОР2А Цатушеп, ТА апб Ьш, ЕТ; ЗШшкапеоих атркПсакоп оГ НЕК-2 (ЕКВВ2) апб ЮроБотегахе II а1рка (ТОР2А) депе8-то1еси1аг Ьах1х Гот сотЫпайоп скетоШегару ш сапсег, Сигг.Сапсег Эгид ТагдеК, 2006, 6, 579-602).

Без ТОР2А невозможны репликация ДНК и деление клетки. Поэтому он стал основной мишенью многих лечебных схем при лечении опухолей, хотя точный механизм уничтожения клеток остается неясным (Ке11пег, и., ЗекехЮб, М., йпхеп Р.В., 01ехе1ет, Р., апб Кибо1рк, Р.; Си1ргй апб уюйш - ΌΝΑ ЮроБотегахе II, Ьапсе! Опсо1., 2002, 3, 235-243). Успех данного подхода ограничивается возникновением спонтанной резистентности, и индуцированное медикаментами повреждение ДНК может увеличить злокачественность.

Внимание исследований рака не было в такой степени сконцентрировано на ТОР2В, втором потенциальном белковом источнике для ТОР-001, потому что он находится в хромосомном регионе (3р24), известном по частой амплификации при опухолях. Однако ТОР2В по первичной структуре сходен с ТОР2А и имеет практически идентичные каталитические свойства (Ьеопйои, С., ЫдЬшМетх, К., Ьакеу, ЕН., апб Аихйп, С.А.; Кшейс апа1ух1х оГ 1штап Юро1хотегахе Па1рка апб Ье1а ΌΝΑ Ьшбшд Ьу хигГасе р1ахтоп гехопапсе, РЕВЗ Ьей., 2003, 554, 206-210). В другом исследовании было показано, что обе изоформы могут заменять друг друга (Закадискк А. апб К1кисЫ, А.; Рцпсйопа1 сотраОЬПку ЬеОуееп 1хоГогт а1рка апб Ье1а оГ 1уре II ^NΑ корокхотетахе, ί. Се11 Зек, 2004, 117, 1047-1054).

В настоящем изобретении изобретатели обеспечивают неопровержимую очевидность того, что опухолеассоциированные пептиды, в достаточной мере связывающиеся с молекулами НЬА I класса, способны вызывать иммунные ответы, опосредованные СО8-положительными цитотоксическими Тлимфоцитами человека, демонстрируя также, что заявленные пептиды пригодны для инициации ответов человеческой иммунной системы против выбранных пептидов пептидомы опухолевых клеток.

Аналогично было обнаружено, что опухолеассоциированные пептиды, в достаточной мере связывающиеся с молекулами НЬА II класса, в особенности с такими аллелями НЬА II класса, которые генетически закодированы локусом НЬА ΌΚ человеческого генома, способны вызывать иммунные ответы, опосредованные СО4-положительными Т-клетками человека. СО4-положительные Т-клетки были изолированы из периферической крови человека, демонстрируя, что заявленные пептиды пригодны для инициации Т-клеточных ответов человеческой иммунной системы против выбранных пептидов пептидомы опухолевых клеток. Как поясняется далее на примере с пептидом из Т0РВЕ004, этот связывающийся с НЬА-ΌΚ опухолеассоциированный пептид, как было обнаружено, распознается СЭ4положительными Т-клетками.

Так как пептиды могут быть синтезированы химическим путем и могут быть использованы в качестве активных фармацевтических ингредиентов в фармацевтических препаратах, то пептиды, обеспечиваемые настоящим изобретением, могут быть использованы для иммунотерапии, предпочтительно для иммунотерапии рака.

В другом аспекте фармацевтическая композиция в дальнейшем включает по крайней мере один дополнительный пептид, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из ЗЕО ГО NО: 8 по ЗЕО ГО NО: 15, или содержащий вариантную аминокислотную последовательность, которая по крайней мере на 80% гомологична последовательностям с ЗЕО ГО NО: 8 по ЗЕО ГО NО: 15, или полинуклеотид, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую ЗЕО ГО NО: 8 по ЗЕО ГО NО: 15 или вариантную аминокислотную последовательность. Пептиды с ЗЕО ГО NО: 8 по ЗЕО ГО NО: 13 и 15 являются иммуногенными пептидами, идентифицированными ранее, и связываются с молекулами МНС I класса и МНС II класса (см. табл. 2).

Было показано, что данные пептиды вызывают Т-клеточные ответы Ш у1уо у пациентов, страдающих от почечно-клеточной карциномы (ПКК) (Н. ЗюдкНахфа, З. ХУакег, Т. ХУешхскепк, А. Мауег, Р.У. О1е1пск, М. З1аек1ег, А. З1еп/1, З. З1еуапоую, Н. Катгаепхее, ί. Рпхск; Сотте1айоп оГ Т-се11 гехропхе, сИшса1 асОуку апб тедц1а1огу Т-се11 1еуе1х ш гепа1 се11 сагсшота райейх 1теа1еб \ткк ГМА901, а поуе1 ишШ-рерОбе уассше; АЗСО Меейпд 2007 Рох1ет # 3017; М. З1аеЫет, А. З1еп/1, Р.У. 0|е1г1ск, Т. Е|хеп, А. НаГегкатр, ί. Веск, А. Мауег, З. ^аИет, Н. Зшдк, ί. Рпхск, С.О. ЗйеГ; Ап ореп 1аЬе1 хШбу 1о еуа1иа1е Ше хаГе1у апб 1шшцподешсйу оГ Ше рерйбе Ьахеб сапсег уассше ГМА901, АЗСО теейпд 2007; Рох1ет # 3017). Так как материнские белки гиперэкспрессированы не только в ПКК, но и также в КРР и других видах рака, эти пеп- 9 023928 тиды полезны также в вакцинах для лечения опухолей других видов, в частности в вакцинах против КРР.

Таблица 2

Дополнительные иммуногенные пептиды, полезные для композиции по изобретению

1» после- дова- тель- ности	пептида	Последователь ность	Символ гена	Функция	Связывается с МНС
а	СЕА-ООб	5Ρ0Υ3ΗΗΙΝ6ΙΡΰ0ΗΤ	СЕАСАМ5	КарЦИНОМО ЭМбрИОН&ЛЬ ный антиген	НЕА-ОЕ
9	ССЦ-С01	ЬЪСАТСМГУ	ССЦО1	Циклил ϋΐ	НЬА-А*02
10	мис-οοι	ΞΤΑΡΡνΗΝν	МОС1	Муцин 1	НЬА-А*02
11	ММР-001	ΒΟΟΰΙΚΘΙΰΚΙΛΌΚΚδ	ММР7	Металлопротеиназа 7	НЬА-ОЕ
12	СЕА-005	УЬЗСАОЬКЪ	СЕАСАМ5	Вариант пептида СЕА	НЬА-А*02
13	МЕТ-001	ΥνΟΡνίΤΞΙ	МЕТ	Протоонкоген Меб	НЬА-А‘02
14	(НВУ-001)	ГЬРЗОЕТРЗУ		Контрольный пептид
15	СЕА-004	УЬЗСАЦЬЫЬ	СЕАСАК5	Пептид СЕА	ЯЬА-А*02

Карциномоэмбриональная, родственная антигену молекула клеточной адгезии 5.

Карциномоэмбриональный антиген (СЕА=СЕАСАМ5), 180 кДа, является обильно гликозилированным мембранным белком, состоящим из трех С2 1д-подобных повторяющихся звеньев, примыкающих к Ν-концевому 1д У-подобному участку и С-концевому участку, который включает участок сцепления гликофосфатидилинозитола (Недйе, Р., Οί, К., Оазрагй, К., ЛЬсгпа1Ну. К., ЭНагар. 8., Еаг1е-Нидкез, 1., Оау, С., ^уокекек Ν.υ., СНеп, Т., 8аеей, А1, 8кагоу, V., Ьее, Ν.Η., Уеа1тап, Т.1., аий ОиаскеиЬизк, 1.; Иеиййсайои οί 1итоиг тагкегз ш тойе1з οί китаи со1огес!а1 саисег изшд а 19,200-е1етеи1 сотр1етейагу ΌΝΑ ткгоаггау, Саисег Кез., 2001, 61, 7792-7797).

Являясь онкофетальным антигеном, СЕА экспрессируется во время эмбрионального развития, но и также, на низком уровне, в желудочно-кишечном эпителии взрослых. Однако СЕА гиперэкспрессирован в высокой степени в опухолях человека, включая 90% случаев желудочно-кишечного, колоректального рака и рака поджелудочной железы, 70% клеток немелкоклеточного рака легких и 50% случаев рака груди (Ткотрзои, ТА., Огиией, Р., аий 21ттегтаии, ^.; СагсшоетЬгуошс аийдеи деие ίί·ιιηί1ν: то1еси1аг Ыо1оду аий с1ййса1 регзресйуез, 1. С1ш ЬаЬ Аиа1, 5, 344-366, 2005). Из-за своего высокого уровня экспрессии в опухолевых клетках и секреции в сыворотку СЕА широко использовался в качестве опухолевого маркера (81когзка, Н., 8киз1ег, 1., аий Оо1й, Р.; С1шка1 аррйсайоиз οί сагсиюетЬгуошс аийдеи, Саисег Эе1ес1. Ргеу., 12, 321-355, 1988) и является стандартным сывороточным маркером для мониторинга колоректального рака (Ьоскег, Ο.Υ., НатШош 8., Натз, 1., 1еззир, ТМ., Кетеиу, Ν., Масйоиа1й, 1.8., 8οте^Πе1й. М.К., Науез, Ό.Ε., аий Ваз!, К.С., 1г.; А8СО 2006 ирйа!е οί гесоттеийайоиз кг 1ке изе οί 1итоиг тагкегз ш дазйош!езйиа1 саисег, 1. С1ш Оисо1, 24, 5313-5327, 2006).

Несмотря на гиперэкспрессию СЕА в опухолевых клетках, раковые пациенты обычно не дают иммунного ответа на данный антиген (Огейсе, 8, Роззай, О, Рк!ю)изй, Е, аий Войаий, О; Ое1ауей си!аиеоиз курегзеизИуку геасйои !о сагсшоетЬгуошс аийдеи ш саисег райейз, Титошт, 1982, 68, 473-475). Иммунная система обычно становится толерантной к СЕА, потому что он в нормальном случае экспрессирован в организме на низком уровне. Однако в сериях клинических исследований вакцин была продемонстрирована иммуногенность СЕА (8агоЬе, Р., Ниайе, Е., йазайе, ТТ, аий Воггаз-Сиез1а, Р.; СагсиюетЬгуошс аийдеи аз а 1агде1 !о шйисе аий-1итоиг 1ттиие гезроизез, Сигг. Саисег Эгид Тагде1з., 2004, 4, 443-454), в особенности при колоректальном раке (КРР) (МозоШз, 8., ийеикад, О., аий Ме11з!ей!, Н.; Ткегареийс уасаиайои ш райейз уйк даз!гот!езйиа1 тайдиаискз. А ге\зе\у οί 1ттиио1одка1 аий сПтса1 гезикз, Аии.Оисо1., 2005, 16, 847-862), и СЕА является опухолеассоциированным антигеном (ТАА) с обширным количеством вакцин, протестированных на данном виде опухоли (уои Мекгеи, М.; Со1огес1а1 саисег уассшез: ука! уе киоу аий ука! уе йои'! уе! киоу, 8етш. Оисо1., 2005, 32, 76-84).

Несколько цитотоксических и хелперных Т-клеточных эпитопов были описаны для СЕА (Сгозй, М., ЬоидЫ, К., Соизодио, О., Ме11ош, О., 2аишй, Р., аий Рго!й, М.Р.; Иеиййсайои οί иоуе1 зиЬйотшай ер1!орез ои !ке сагсиюетЬгуошс аийдеи гесодш/ей Ьу СИ4+ Т-се11з οί 1иид саисег райейз, 1. 1ттиио1., 2006, 176, 5093-5099; №уе11шо, Ь., Саз!еШ, С., аий Рагт1ат, О.; А йзйид οί китаи !итоиг аийдеиз гесодш/ей Ьу Т-се11з: Магск 2004 ирйа!е, Саисег 1ттиио1. 1ттиио!кег., 2004, 54, 187-207; Вш/, М., КоЬауазЫ, Н., Ьа- 10 023928 кайс. ЕЕ. РпсЮ. I.. Вотгак-Сиск1а. Р.. СсПк. Е.. апб 8агоЬс. Р.; Испййсайоп апб сНагасЮп/абоп оГ а Т-йс1рсг рсрОбс Ггот сатсшостЬтуошс апйдсп. СПп Сапссг Иск.. 2004. 10. 2860-2867). позволяющих проведение ряда основанных на пептидах клинических исследований вакцин против КРР (ВаЬа1/. Е. ИоШд. С.. ЬоЬс1. В.. Ро1ргесЙ. С.. Нааск. М.. Сиййст. Н.. Койпс. С.Н.. Ейшпдсг. С.. 8сЬтЙ7. М.. апб Вотйаиксг. М.; 1пбисйоп оГ сс11и1аг 1ттипс гскропкск адатй сатсшостЬтуошс апйдсп ш райсйк уйй шйакййс Нтоитк айсг уасстайоп \\ЙП айсгсб рсрббс Пдапб-1оабсб бспбййс сс11к. Сапссг 1ттипо1. 1ттипо1йсг.. 2006. 55. 268276; Ропд. Ь.. Нои. Υ.. Юуак. А.. Всйкс. С.. Уисп. А.. Рйбсг. С.А.. Бау1к. М.М.. апб Епд1стап. Е.С.; А11сгсб рсрббс Пдапб уасстаПоп \уйП Р1!3 Пдапб схрапбсб бспбййс сс11к Гог Нтоит ПптипоНсгару. Ргос. Ыаб. Асаб. δοΐ. И8А. 2001. 98. 8809-8814; Ии. К.Е. V апд. С.С.. Сйсп. Ь.Т.. Сйспд. А.Ь.. Ьт. Б.Т.. Ж У.С.. Уи. \ν.Ε. Нипд. У.М.. Уапд. Н.У.. 1иапд. 8.Н.. апб \УНапд-Рспд. 1.; Сспсгайоп оГ сатсшостЬтуошс апйдсп (СЕА)-крсс1йс Т-сс11 гскропкск ш НЬА-А*0201 апб НЬА-А*2402 1а1с-к1адс со1отсс!а1 сапссг райсйк айст уасстайоп \уйП бспбййс сс11к 1оабсб уйй СЕА рсрПбск. С1ш Сапссг Иск.. 2004. 10. 2645-2651; Ма!киба. К.. Ткипоба. Т.. Тапака. Н.. Итапо. Υ.. Таштига. Н.. Ыикауа. I.. Такскако. К.. апб Уатаис. Н.; ЕпЬапсстсп! оГ суИИхю Т-1утрйосу1с гскропкск ш райсйк уйй дак1гоПИскНпа1 таПдпапаск Го11о\утд уасстайоп \уйП СЕА рсрйбс-рц1ксб бспбййс сс11к. Сапссг 1ттипо1. 1ттипо1йсг.. 2004. 53. 609-616; Исба. Υ.. йой. Т.. Νηкауа. I.. КауакЫта. I.. Окида\уа. К.. Уапо. Υ.. УататоЮ. Υ.. №пЮН. К.. 8ΠΠηίζιι. К.. 1тига. К.. Рщк N.. Рцр\уага. Н.. ОсПкб. Т.. Пок Н.. Зопоуата. Т.. Надцуага. А.. Такскако. К.. апб УатадйПк Н.; Бспбййс сс11Ьаксб 1ттипо1йсгару оГ сапссг \уйП сатсшостЬтуошс апПдсп-бспусб. НЕА-А24-гскйтс1сб СТЬ срйорс: Сййса1 ойсотск оГ 18 райсйк уйй тс!ак1айс дакйош1скйпа1 ог 1ипд абспосагстотак. 1пй 1. Опсо1.. 2004. 24. 909-917; ^сбиаисП. М.И.. Апксп. 8.. Ιιπίύ^τχζ. Е.. Ссйсп. С.. Х1а. Ζ.. Апбсгкоп. К.8.. Сгасюп. Е.. 8с1шиб1. М.. ^ййд. В.. Бюй1. V.. ^о1Г. 1.. ВоЫсп. Н.. апб №И1сг. Ь.М.; Рйакс Ι/ΙΙ сотЫпсб сйстоштипо!йсгару уйй сатсшостЬтуошс апйдсп-бсйусб НЕА-А2-гскйтс1сб САР-1 рсрйбс апб йбюЮсап. 5Ппогопгасб. апб 1сисоуойп ш райсйк уйй рйтату шс!ак1айс со1отсс!а1 сапссг. С1ш Сапссг Иск.. 2005. 11. 5993-6001). Данные и другие клинические исследования на данный момент продемонстрировали безопасность вакцинаций с СЕА и доказательства для индукции иммунного ответа против данного антигена (уоп Мсйгсп. М; Со1отсс1а1 сапссг уассшск: уйа! ус кпоу апб уйа! ус боп'1 ус! кпоу. 8стш.Опсо1.. 2005. 32. 76-84).

Вариант СЕА-006 был опубликован ранее (Βηίζ. М.. КоЬауакЫ. Н.. Ьакайс. ЕЕ. Рйс1о. 1.. ВоггакСиск!а. Р.. Ссйк. Е.. апб 8агоЬс. Р.; Испййсайоп апб сЬа^асΐсйζайоп оГ а Т-Ьс1рсг рсрйбс Ггот сагстостЬгуотс апйдсп. С1ш Сапссг Иск.. 2004. 10. 2860-2867). СЕА-005 является мутантом с единственной аминокислотной заменой. о котором сообщалось. что он преодолевает центральную иммунную толерантность ЖгешЬа. 8.. Вагаада. Е.. ΖΠιι. М.. 8оагск. N.. Ткапд. К.У.. апб 8сЬ1от. 1.; Испййсайоп оГ ап спЬапссг адотк! суИИхю Т 1утрйосу1с рсрйбс Ггот Ьитап сатсшостЬтуошс апйдсп. Сапссг Иск.. 1997. 57. 45704577).

Трансформирующий фактор роста. бета-индуцированный (ТСРВ1).

ТСРВ1 был первым геном. идентифицированным в качестве ТСР-бета-индуцированного. в клеточной линии человеческой аденокарциномы легких. Он кодирует секретируемый внеклеточный матричный белок. который. как предполагается. задействован в присоединении клеток и формировании внеклеточной матрицы.

Как было показано. ТСРВ1 находится среди генов с наиболее значительно повышенным уровнем при колоректальном раке. и он также экспрессирован на высоком уровне в аденомах. Результаты количественной ПЦР демонстрируют сильное повышение. как в неочищенных опухолях. так и очищенных эпителиальных клетках опухоли. Соответственно проведенные ш кйи эксперименты по гибридизации показали. что ТСРВ1 экспрессирован во многих видах клеток. как в стромальных. так и эпителиальных компартментах (Вискйаийк. Р.. Иадо. С.. 81. С.В.. Иотапк. К.Е.. 8аЬа. 8.. Ζ1κπ^. Ь.. ^дс1к1сш. В.. апб КбШсг. 1<.\ν.; 8ссгс1сб апб сс11 кигГасс дспск схргскксб ш Ьстдп апб таПдпай со1огсс!а1 !итоигк. Сапссг Иск.. 2001. 61. 6996-7001).

При мега-анализе исследований. изучающих экспрессию генов при колоректальном раке. было установлено. что ТСРВ1 является одним из всего девяти генов. которые были описаны как содержащиеся многократно в повышенном количестве (4 исследования для ТСРВ1) (8ЫП. V.. СЬсйу. И.. апб Ткао. М.8.; Ехргеккюп ртоййпд Ьу тютоаттаук ш со1огсс!а1 сапссг. Опсо1.Иср.. 2005. 13. 517-524).

В человеческих тканях поджелудочной железы наблюдалось повышение уровня ТСРВ1 мРНК в 32.4 раза при раке поджелудочной железы в сравнении с нормальными контрольными тканями. Гибридизационный анализ ш кйи показывает. что ТСРВ1 тРР1К был экспрессирован. в основном. в раковых клетках внутри опухолевой массы поджелудочной железы (8сЬпсИст. Б.. К1ссГГ. 1.. ВсгЬсга!. Р.О.. Ζ1ιιι. Ζ.. Когс. М.. Рйскк. Н.. апб ВисЬ1сг. М.^.; 1пбисйоп апб схртсккюп оГ Ьс1а1д-Ь3 ш рапстсайс сапссг сс11к. ВюсЫш.Вюрйук.Ас1а. 2002. 1588. 1-6).

В модели щ уйто было установлено. что ТСРВ1 является геном. способствующим ангиогенезу. К тому же резко повышенный уровень экспрессии ТСРВ1 был обнаружен в нескольких видах опухолей. Антисмысловые олигонуклеотиды к ТСРВ1 блокировали как экспрессию генов. так и образование эндотелиальных трубок ш уйто. позволяя предположить. что ТСРВ1 может играть ведущую роль во взаимодействиях в эндотелиальной клеточной матрице (Айксийсаб. М.. ^апд. 8.Е. Nакаΐки. М.К. Мск!ак. 1..

- 11 023928

Неагй, С., апй НидНек, С.С.; Иепййсайоп о£ епйо(НеПа1 се11 депек ехргеккей ίη ап ίη νίίΓΟ тойе1 о£ апдюдепек1к: шйисйоп о£ Ε8Μ-1, (Ье(а)1д-Н3, апй №САМ, Мкютазс. Кек., 2002, 63, 159-171).

Муцин-1 (МИС1).

Муцины - это высокомолекулярные эпителиальные гликопротеины с высоким содержанием кластерных олигосахаридов, соединенных о-гликозидной связью с пептидами тандемного повтора, богатыми треонином, серином и пролином. Существуют два класса муцинов, различающихся по структуре и функциям: трансмембранные муцины, к которым относится МИС1, и секретируемые гелеобразующие муцины. Муцины рака толстой кишки имеют различия в углеводных структурах, которые исследуются как диагностические и прогностические маркеры, а также как мишени для противораковых вакцин.

Внеклеточный домен белка МИС1 образован из высококонсервативных повторов 20 аминокислот, фактическое число варьируется между 25 и 100 в зависимости от аллеля. Каждый тандемный повтор содержит пять потенциальных сайтов гликозилирования, а между дублетами треонинов и серинов находится иммунодоминантный участок, содержащий эпитопы, распознаваемые различными антителами анти-МИС1 (Тау1ог-Рарайшйпои. ί.. ВигсНе11. ί.. МПек. Ό.\ν.. апй Оа1/1е1. М.; МИС1 апй сапсег, ВюсЫт. ВюрНук. Ас(а. 1999, 1455, 301-313).

В сравнении с большинством других эпителиев МИС1 толстого кишечника более сильно гликозилирован, тем самым маскируя белок МИС1 от иммуногистохимического окрашивания МИС1специфическими антителами. В колоректальных аденокарциномах МИС1 менее гликозилирован, позволяя осуществление иммунодетекции.

Аберрантно гликозилированный МИС1 предоставляет новые связующие способности и может одновременно опосредовать и блокировать связывание с адгезивными молекулами с некоторой молекулярной специфичностью, тем самым играя двойственную роль в метастатическом распространении опухолевых клеток (МсЭегтоН. К.М., Сгоскег, Р.К., Нагпк. А., Вигйюк. МП.. Ншойа, Υ., НауакЫ, Т., 1та1, К., апй Но11тдк\уог(Н. М.А.; О\'еге.хргеккюп о£ МИС1 гесопйдигек 1Не Ьшйшд ргорегйек о£ (итог се11к, 1п(. ί. Сапсег, 2001, 94, 783-791).

Как было установлено иммунологическим путем МИС1 имеет повышенный уровень при экспрессии при раке толстой кишки, что соотносится с худшим прогнозом (Вугй, 1С. апй ВгекаНег, К.8.; Мисшк апй тисш Ьшйшд рго(етк ш со1огес(а1 сапсег, Сапсег Ме(ак(ак1к Ке\'.. 2004, 23, 77-99), указывая на то, что повышенный уровень МИС1 может быть вовлечен в прогрессирование КРР. Рак толстой кишки с метастазами экспрессирует МИС1 более сильно, чем рак без метастазов (Ракатоп. 8., О(а, Э.М.. С1еагу, К.К., 8Ыго(ат. К, апй Ытига, Т; МИС1 тисш ехргеккюп ак а тагкег о£ ргодгеккюп апй те(ак(ак1к о£ Нитап со1огес(а1 сагсшота, Оак(гоеп(его1оду. 1994, 106, 353-361), и окрашивание МИС1 было положительным при всех видах колоректального рака с поражением печени в рамках одного исследования (Ма(кийа, К., Макак!, Т., VаίаηаЬе, Т., Кйауаша, ί.. Ыада^а, Н., Ми(о. Т., апй Арока. Υ.; СНшса1 ыдшйсапсе о£ МИС1 апй МиС2 тисш апй р53 рго(ет ехргеккюп ш со1огес(а1 сагсшота, 1рп. ί. С1ш Опсо1., 2000, 30, 89-94). Во время недавнего исследования у 462 пациентов с колоректальным раком было обнаружено, что экспрессия МиС1 является независимым прогностическим маркером плохого прогноза (Энпсап. Т.Й., Vаίкоη, Ν.Ρ., А1-А((аг. А.Н., 8сНо1еПе1й. кН.. апй Онггап(. Ь.О.; ТНе го1е о£ МИС1 апй МИС3 ш (Не Ью1оду апй ргодпоык о£ со1огес(а1 сапсег, Vо^1й ί. 8игд. Опсо1, 2007, 5, 31).

Существует патофизиологическая значимость циркулирующих антител анти-МИС1 при КРР: антитела анти-МИС1 были обнаружены у 5 из 31 (16,1%) здоровых субъектов и у 27 из 56 (48,2%) пациентов с колоректальным раком (Ааканшга. Н., Ншойа, Υ., №-(када\\а. Ν., МаЫдисЫ, Υ., 1(оН. Ρ., Εηйо, Т., апй 1та1, К.; Ое(ес(юп о£ сйсйайпд апй-МИС1 тисш соге рго(ет ап(1Ьой1ек ш ра(1еп(к \уНН со1огес(а1 сапсег, ί. Оак(гоеп(его1.. 1998, 33, 354-361).

Помимо своей роли в качестве мишени для антител МИС1 является также хорошо известной мишенью для цитотоксических Т-клеток. В некоторых сообщениях демонстрируется, что цитотоксические нерестриктированные по МНС Т-клетки из опухолей яичника, груди, поджелудочной железы и множественной миеломы могут распознавать эпитопы центральной части белка МИС1, находящейся в тандемном повторе (Арок(о1орои1ок. V. апй МсКеп/1е. Ι.Ρ.; Се11и1аг тисшк: (агде(к £ог 1ттнпо(Негару. Сп( Ре\'. 1ттипо1., 1994, 14, 293-309; Р1пп, О.!, 1еготе. К.К., Непйегкоп, К.А., РесНег, О., ЭотепесН. Ν., МадапапВ1апйег, ί.. апй Ваггай-Воуек, 8.М.; МИС-1 ерННеЫй (итог тисш-Ьакей 1ттипНу апй сапсег \асстек. 1ттипо1. Ре\'.. 1995, 145, 61-89; Вагпй, ΌΡ., Ьап, М.8., Ме(/даг. К.8., апй Ршп, ОР; 8ресШс, та)ог Ык(осотрайЬПНу сотр1е.х-ипгек(пс(ей гесодтйоп о£ (нтог-аккос1а(ей тисшк Ьу Нитап су(о(ох1с Т се11к, Ргос. №ι(1. Асай. 8с1. И8А, 1989, 86, 7159-7163; ТакаНакЫ, Т., МаЫдисЫ, Υ., Ншойа, Υ., КакшсЫ, Н., №-(када\\а. Ν., 1та1, К., апй АасНк А.; Р.хргеккюп о£ МИС1 оп туе1ота се11к апй шйисйоп о£ НЬА-ипгек(г1с(ей СТЬ адатк( МИС1 £гот а ти1йр1е туе1ота райей, 1. 1ттипо1., 1994, 153, 2102-2109; №(о. Н., ТакаНакЫ, Т., МаЫдисЫ, Υ., Науакй, Т., Ншойа, Υ., апй 1тй, К.; Су(о(ох1с Т 1утрНосу(ек йегйей йот Ьопе тагго\у топопис1еаг се11к о£ ти1йр1е туе1ота ра(1еп(к гесодт/е ап ипйегд1усоку1а(ей £огт о£ МИС1 тисш, 1п(. 1ттипо1., 1997, 9, 791-798). Однако были также идентифицированы рестриктированные по НЬА-А*02 Т-клеточные эпитопы, образованные из белка МИС1 (Арок(о1орои1ок. V., Кагапкак, V., Нашит, 18.. апй МсКеп/1е. Ι.Ρ.; 1пйисйоп о£ НЬА-А2-гек(г1с(ей СТЬк (о (Не тисш 1 Нитап Ьгеак( сапсег ап(1деп. ί. 1ттипо1., 1997, 159, 5211-5218; Вгоккай, Р., НешпсН, К.8., 8(иН1ег. О., ВеНпке, Ь., КеюНагйр νΡ., 8(е\апо\'1с. 8., МиНт, А.,

- 12 023928

Каттепкее, Н.С., Кап/. И., апб Вгиддег, У.; Иепбйсабоп ой НЬА-А2-гек1ггс1еб Т-се11 ерборек бебуеб йот (Нс МиС1 (итог апбдеп йог Ъгоаб1у аррНсаЫе уассше (Негар1е5. В1ооб, 1999, 93, 4309-4317). Одним из этих пептидов является МиС-001. Он образован из участка тандемного повтора белка МиС1. Индукция ответов цитотоксических Т-лимфоцитов ш угуо после вакцинаций пациентов с распространенным раком груди или яичника дендритными клетками с введенным импульсным методом пептидом, используя пептиды МиС1, была успешной (Вгоккаб, Р., УгбНк, 8., 81иН1ег, О., КеюНагбН У.Ь., Кап/, Ь., апб Вгиддег, У.; 1пбисбоп ой су(о(о\1с Т-1утрбосу1е гекропкек ш угуо айег уассшабопк \νί(1ι рерббе-ри1кеб бепбббс се11к, В1ооб, 2000, 96, 3102-3108; Угегеску, 1., Мие11ег, М., апб Вгоккаб, Ρ.; Иепбббс се11-Ъакеб сапсег гттипо(бегару 1агдебпд МИС-1, Сапсег 1ттипо1. 1ттипо1бег., 2005 Арг. 28: 288-94). Более того, такие вакцинации успешно индуцировали клинические ответы у пациентов с почечно-клеточной карциномой (^У1егеску, 1., Ми11ег, М.К., Угббк, 8., На1бег-Оеб1ег, Е., Эобеб Ό., 8сНшгб1, 8.М., НайксНе1, М., Вгиддег, У., 8сбгобег, 8., Ногдег, М.8., Кап/, Ь., апб Вгоккаб, Р.; 1ттипо1одгс апб сбйса1 гекропкек айег уассгпабопк \\а(Н рерббе-ри1кеб бепбббс се11к ш те(ак(абс гепа1 сапсег рабейк, Сапсег Кек., 2006, 66, 5910-5918).

Повышенный уровень иммунореактивного МИС1 при колоректальном раке в большинстве случаев не основан на гиперэкспрессии мРНК, но скорее вызван его пониженным гликозилированием, что разоблачает эпитопы для распознавания антителами, в особенности на участке тандемного повтора МИС1. Данная дегликозиляция обеспечивает, в то же самое время, возможность для генерирования Т-клеточных эпиотопов при измененном процессинге антигенов в опухолевых клетках, чему в нормальных клетках препятствует гликозилирование. Данный механизм может объяснить исключительные черты МИС-001 в качестве опухолеассоциированного Т-клеточного эпитопа, несмотря на отсутствие сильной гиперэкспрессии мРНК. Некоторая очевидность того, что изменения в гликозилировании могут действительно повлиять на процессинг антигенов, возникает из недавнего наблюдения, что измененное гликозилирование МИС1 при колоректальном раке может быть действительно обнаружено антигенпрезентирующими клетками с помощью рецептора, специфически распознающего опухолевые гликоформы (8ае1апб, Е., уап УНе1, 8.1, Васккбот, М., уап, бВ, V., Оеу 1епЪеек, Т.В., Меуег, О.А., апб уап, ΚΥ; 2006, ТНе С-1уре 1есбп МОЙ ехргеккеб Ъу бепбббс се11к бе(ес(к д1усап сНапдек оп МИС1 ш со1оп сагстота, Сапсег 1ттипо1. 1ттипоШег., 2007, 56(8): 1225-36). Специфическое поглощение и процессинг опухолевых гликоформ антигенпрезентирующими клетками может также объяснить тот факт, что МИС-001-специфические Т-клетки наблюдались в естественных условиях (без иммунизации) у пациентов с раком груди (Кеп(/ксб С., Каукег, 8., 8(1111-1111 8., \Уа(егтапп I., Уабег, 8., 81еуапоу1с, 8., Уайхгепег, Ό., апб Оиске1, В.; Еуа1иабоп ой ргее\1к(еп( штипйу ш рабейк \\г(Н рбтагу Ъгеак( сапсег: то1еси1аг апб се11и1аг аккаук (о с.]иапбйу апбдепкресгйс Т 1утрНосу(ек ш ребрбега1 Ъ1ооб топопис1еаг се11к, Сбп Сапсег Кек., 2003, 9, 4376-4386) и колоректальным раком (ОШтапп 1., Ке11ег-Ма1ксНке, К., Уе1пксбепк, Т., Кгаб, Т., Неск, Т., Вескег, Н.И., 8(еуапоую, 8., Каттепкее, Н.О., апб Ооибейапдеак, С.; СЭ8+ Т-се11 гекропке адагпй МИС1-бебуеб рерббек ш дакбогйекбпа1 сапсег кшугуогк, Сапсег 1ттипо1. 1ттипо1бег., 2005, 54, 750-758). Для этих пациентов не было заявлено об аутоиммунных эффектах. Это демонстрирует естественную роль МИС-001 как опухолеассоциированного пептида, индуцирующего специфические Т-клетки, и позволяет предположить, что введение МИС-001 может считаться безопасным, хотя для антигена МИС1 не может быть обнаружена гиперэкспрессия на уровне мРНК.

Ме(-протоонкоген (рецептор фактора роста гепатоцитов) (с-Ме().

Белковый продукт протоонкогена МЕТ является рецептором фактора роста гепатоцитов. Он содержит домен тирозинкиназы, который активирует сигнальные пути, задействованные в клеточной пролиферации, подвижности, адгезии и инвазии (Тгикобпо, Ь апб Сотодбо, РМ; 8са((ег-йас(ог апб кетарбобп гесер(огк: се11 кгдпаШпд йог туакгуе дгоМН, №К. Кеу. Сапсег, 2002, 2, 289-300).

В исследованиях различных видов опухолей было продемонстрировано несколько механизмов для активации с-МеН включая аутокринную петлю НОР/с-Ме!, активирующую точечные мутации, белок слияния ТРК-Ме( и неспособность расщепления с-Ме( на α- и β-цепи (Όί Кеи/о, М.Р., Обуего, М., Маг(опе, Т., Маййе, А., Маддюга, Р., 8(еГапк Α.Ό., Уа1ейе, О., Оюгбапо, 8., Собекгпа, О., апб Сотодбо, Р.М.; 8отабс тШабопк ой (Не МЕТ опсодепе аге ке1ес(еб бибпд те(ак(абс кргеаб ой Ьитаи НЫ8С сагсшотак, Опсодепе, 2000, 19, 1547-1555; ЕЪеб, М., Υокоуата, М., Рпекк, Н., ВисН1ег, М.У., апб Когс, М.; Сое\ргеккюп ой 1бе с-те( рго(о-опсодепе апб Нера(осу(е дго\у(Н йас(ог ш Нитап рапсгеабс сапсег, Сапсег Кек., 1994, 54, 5775-5778; Мопбгпо, А., Огогбапо, 8., апб Сотодбо, Р.М.; Эейесбуе рокбгапк1абопа1 ргосеккшд асбуа(ек (Не (угокше кгпаке епсобеб Ъу (Не МЕТ рго(о-опсодепе (Нера(осу(е дго\у(Н йас(ог гесер(ог), Мо1. Се11 Вю1., 1991, 11, 6084-6092; Обуего, М., Уа1ейе, О., ВагбеШ, А., Ьопдаб, Р., Реггего, Ν., Сгассо, С., Теггопе, С., Косса-Коккебг, 8., Сотодбо, Р.М., апб Όί Кето, М.Р.; №ус1 тйабоп ш (Не АТР-Ъгпбгпд кбе ой (Не МЕТ опсодепе 1угокше кгпаке ш а НРКСС йатбу, 1й. ί. Сапсег, 1999, 82, 640-643; Рагк, М., Оеат М., Соорег, С.8., 8сНтгб1, М., О'Впеп 8.Е, В1агг, Э.О., апб Уапбе Уоибе, О.Р.; МесНапгкт ой те1 опсодепе асбуабоп, Се11, 1986, 45, 895-904; Рагк, У.8., Оопд, 8.М., Кгт, 8.Υ., №, ΕΥ., 8Нгп, М.8., Рг, 1Н., Кгт, БД, Вае, 1Н., Нопд, У.К., Ьее, К.8., Ьее, 8.Н., Υоо, Ν.Ι., йапд, II, Раск, 8., /Ниапд, Ζ., 8сНтгб1, И., ΖΗηι В., апб Ьее, ΙΥ.; 1999, 8отабс тйабопк гп (Не кгпаке ботагп ой (Не МебНера1осу1е дгох(Н йас(ог гесер(ог депе гп сНг1бНооб Нера1осе11и1аг сагсшотак, Сапсег Кек., 59, 307-310; КаНгтг, Ν., ТгетЪ1ау, Е., МсАбат, И., Рагк, М., 8сНха11, К., апб Е1боб, В.; 1996, Иепбйсабоп ой а Нера1осу1е дгох(Н йас(ог айосбпе 1оор ш а тибпе тат- 13 023928 тагу сагсшота, Се11 Сго\г1к ΌίΓΓοΓ.. 7, 263-270; 8скипйТ Ь., Όιιΐι. Р.М., Скеп. Р., КэзЫйа, Т., О1епп, О., Скоуке. Р., 8скетег, 8.\ν.. Ζΐηιαηβ. Ζ., РиЬепзку, I., Эеап. М., А111кте!з, К., СШатЪагат, А., Вегдегке1т. и.К., Ре1кз, РТ., Сазайеуа11, С., Ζата^^оη. А., Вегпиез, М., Кюкагй, 8., Пре, С.Р, ^айкет, М.М., Тзш, Ь.С., Сей. Ь., Отсий, М.Ь., 81асккоизе. Т., Прап, Р. 8НГе. Ь., Втаиск, Н., Рескег. Р. №екапз, О., Нидкзоп. М.Р.. Моск, Н., 8!огке1, 8., Ьеттап, М.1., Шпекап, \νΜ.. апй Ζ^·ιγ. В.; 1997, СегтНпе апй зотайс ти1акопз ш 1ке !угозте ктпазе йотат оГ 1ке МЕТ рго!о-опсодепе ш рарШагу гепа1 сагстотаз, ИакСепеР 16, 68-73; 8скт1й!, Ь., 1ипкет, К., ^етск. О., О1епп, О., Скоуке, Р., РиЬепзку, I., Ζΐ^^, Ζ., 1еГГегз, М., Уапйе, ν.Ο., Иеитапп. Н., ^айкег, М., Ьтекап, №.МР апй ΖЬа^, В.; 1998, Тгоо Иойк Атепсап ГатШез хуйк кетеййагу рарШагу гепа1 сагсшота апй 1йепкса1 поуе1 тШакопз т 1ке МЕТ ргоЮ-опсодепе. Сапсег Кез., 58, 17191722). Как свойственно механизму, гиперэкспрессия с-Ме! кооперирует с онкогенной мутацией Κί-таз с усилением канцерогенности раковых клеток толстой кишки ш у1уо (Ьопд, Ι.8., Нап, К., Ы, М., 8кйаза\та. 8., 8аза/икт Т., 1окпз1оп, М., апй Тзао, М.8.; Ме! тесер1от оуетехртеззюп апй опсодептс Κί-таз тШакоп соорега!е !о епкапсе !итойдетсйу оГ со1оп сапсег се11з ш У1уо, Мо1. Сапсег Кез., 2003, 1, 393-401).

Интересно, что существует некоторая очевидность для взаимодействия сигнальных реакций МЕТ с каскадом реакций ΧνπΙ/бета-катенина. зачастую представленного в повышенном количестве при раке толстой кишки. МЕТ может активироваться иростагландином Е2 (РОЕ2), и РОЕ2-активированный с-Ме! ассоциируется с β-катенином, увеличивая его тирозиновое фосфорилирование, тем самым индуцируя инвазивность раковых клеток при раке толстой кишки (Рат К., Иакатига, Т., Мооп, ν.8., апй Тагпа\тзкт А.8.; Ргоз1ад1апй1пз ргото!е со1оп сапсег се11 туазюп; з1дпакпд Ьу сгозз-!а1к ЪеРтееп 1\го Фзкпс! дтоМк Гас!ог гесер!огз, РА8ЕВ 1, 2003, 17, 1640-1647). Недавно была описана совместная активация МЕТ и бетакатенина, приводящая к положительному контуру обратной связи между этими двумя ключевыми игроками при колоректальном онкогенезе (Казо1а, А., Раззейа, М., Ре. В.Р., Р'А1еззапйго. Ь., Отатадка, Ό., Όί Кеп/о. М.Р., апй Сотодйо, Р.М.; А розйуе ГеейЪаск 1оор ЪеРтееп кера!осу!е дтоМк Гас!ог гесер!ог апй Ье!а-са!епт зизкнпз со1огес!а1 сапсег се11 шуаз1уе дгоМк, Опсодепе, 2007, 26, 1078-1087).

Уровень экспрессии с-Ме! мРНК в первичных опухолях КРР (п=36) является важным предсказывающим маркером для инвазии на ранних стадиях и региональных метастазов заболевания, таким образом, находясь в прямом соотношении со стадией рака толстой кишки (Такеискт, Н., ВксЫк, А., 8ака, 8., Титпет, К., ^1езе. Ό., Тапака, М., Кио, С., ^апд. Н.Р, апй Нооп, Ό.8.; с-МЕТ ехргеззюп 1еуе1 ш рптагу со1оп сапсег: а ртейю!от оГ !итог туазюп апй 1утрк пойе те1аз1азез. С1ш Сапсег Кез., 2003, 9, 1480-1488). Другой анализ экспрессии с-Ме! в 130 пробах КРР показал гиперэкспрессию (Т/И>2,0) с-Ме! в 69% случаев первичного КРР и значительно повышенные уровни с-Ме! при КРР с поражением кровеносных сосудов (Р=0,04) и на поздней стадии (Р=0,04), подтверждая роль с-Ме! в прогрессировании и распространении метастазов при КРР человека (^епд. Ζ., ^е1зег. М.К., Р'А1еззю. М., Огасе, А., 8кта, 1., апй Ра1у. Р.В.; 1ттипоЬ1о! апа1уз1з оГ с-Ме! ехргеззюп ш китап со1огес!а1 сапсег: оуетехртеззюп 1з аззота!ей \ткк айуапсей з!аде сапсег, С1ш Ехр. Ме!аз!аз1з, 2004, 21, 409-417). В другом исследовании в 69% и 48% из 60 аденокарцином толстой кишки было установлено повышение с-Ме! мРНК в более чем 2 и более чем 10 раз, соответственно, по сравнению со смежной нормальной слизистой оболочкой (Катти1а, и.8., Кип!/, Е.Ь., Ргапсопе, Т.Р., Ζеηд, Ζ., 8Ыа, 1., Рапйтапп, К.О., Ра!у. Р.В., апй ^е1зег. М.К.; Мо1еси1аг со-ехртеззюп оГ !ке с-Ме! опсодепе апй кера!осу!е дтоМк Гас!ог ш рптагу со1оп сапсег ртейю!з !итог з!аде апй скптса1 ои!соте, Сапсег Ье!!., 2007, 248, 219-228). Таким образом, увеличение передачи сигналов с-Ме! является широко распространенным явлением на ранней стадии КРР, но и проявляющееся даже с еще большей экспрессией на поздних стадиях и при метастатической болезни.

Циклин Ό1 (ССИР1).

ССИР1 относится к высококонсервативному семейству циклинов, члены которого характеризуются исключительной периодичностью наличия белков в течение клеточного цикла. Циклины выполняют функцию регуляторов СРК (циклинзависимые киназы). Различным циклинам свойственна разная экспрессия и способы деградации, которые содействуют временной координации каждого этапа митоза. Этот циклин формирует комплекс с - и функционирует как - регуляторная субъединица СРК4 или СРК6, активность которой требуется для клеточного цикла перехода О1/8. Мутации, амплификация и гиперэкспрессия этого гена, который изменяет прогрессию клеточного цикла, часто наблюдались в различных опухолях и могут благоприятствовать онкогенезу (Ри, М., ^апд. С., Ы, Ζ., 8акатак1, Т., апй Рез!е11, К.О.; Мкигеу1е\т: Сусйп Ό1: погта1 апй аЬпогта1 Гипсйопз, Епйостшо1оду, 2004, 145, 5439-5447).

Распространенный однонуклеотидный полиморфизм А/О (А870О) приводит к двум различным изоформам мРНК: а и Ь. Попеременно сплайсированная изоформа Ь кодирует усеченный белок, который был связан с более высокой заболеваемостью опухолевыми заболеваниями, включая рак легких, рак толстой кишки и другие виды рака (Ри, М., ^апд. С., Ы, Ζ., 8акатак1, Т., апй Рез!е11, К.О.; Мкигеу1е\т: Сускп Ό1: погта1 апй аЬпогта1 Гипсйопз, Епйосйпо1оду, 2004, 145, 5439-5447).

Гиперэкспрессия ССИР1 на уровне мРНК и белковом уровне была многократно описана для колоректального рака (8и!!ег, Т., Рот 8., Сатеуа1е, К.А., АгЬег, Ν., апй ^етз1ет. 1В; Ехргеззюп оГ сускпз ΌΙ апй Е ш китап со1оп айепосатсшотаз, 1. Мей, 1997, 28, 285-309; Метте1зк!ет, А., Оегзоп, А., ^а1Пзск. 8., Ре1дайо. В., 8Ьеск!ег-Маог, О., Ре1дайо. 1., Рюк, А., апй ОкеЬет, Ь.; Ехргеззюп оГ Р-1уре сускпз ш со1оп сапсег апй ш се11 кпез Ггот со1оп сагстотаз. Вг. 1. Сапсег, 2005, 93, 338-345; Ва1сегс/ак. Е., Раз/-^а1с/ак.

- 14 023928

С., Китог, Р., Рапс/ук, М., Когбек, К., ХУюг/Ыскк К., апб Мйо\узкк М.; Сусйп ΌΙ рго1ст апб ΟΟΝΌΙ депе ехргезз1оп ίη со1огес!а1 сапсег, Еиг. 1. 8игд.Опсо1., 2005, 31, 721-726; Βοη6ί, I., Низба1, А., Викйо1т, С., №з1апб, 1.М., Вакка, А., апб Викйо1т, Ι.Κ.; Ехргеззюп апб депе атрййсайоп о£ рптагу (А, В1, Ό1, Ό3, апб Е) апб зесопбагу (С апб Н) сусйпз ш со1оп абепосагстотаз апб согге1айоп νίΛ райеп! оШсоте, 1. Сйп РаЛо1., 2005, 58, 509-514; Регел К., \Уи, Ν., Кйр£е1, А.А., апб Веай, К.У., 1г.; А Ьейег се11 сус1е 1агде1 £ог депе Легару о£ со1огес1а1 сапсег: сусйп С, I. Сазйот1езк 8игд., 2003, 7, 884-889; Уопд, КА., Мотз, К.С., МсСопбосЫе, А., Вабег, 8., бобге11, Ό.Ι., апб Натзоп, Э.к; Сусйп ΌΙ оуегехргеззюп ш со1огес!а1 сагсшота 1п νί\Ό 13 берепбеп! оп Ье1а-са1ешп рго1ет бузгедЛайоп, Ьи1 по! к-газ ти1айоп, 1. РаЛо1., 2002,197, 128-135; МсКау, кА., Поид1аз, кк, Козз, У.С., Сиггап, 8., Миггау, С.1., Сазз1бу, I., апб МсЬеоб, Н.Ь.; Сусйп ΌΙ рго1ет ехргеззюп апб депе ро1утогрЫзт т со1огес!а1 сапсег. АЬегбееп Со1огес1а1 Юйайуе, Лк 1. Сапсег, 2000, 88, 77-81; Вайкоуа, к, Ьиказ, к, 8йаизз, М., апб Вайек, 1.; Тйе ΡΚΛΌ-1/сусйп Ό1 опсодепе ргобис! асситикйез аЬеггапбу ш а зпЬзе! о£ со1огес1а1 сагсшотаз, йй. 1. Сапсег, 1994, 58, 568-573).

Это может быть объяснено хорошо обоснованным фактом, что ί'.'ί''ΝΌ1 является геном-мишенью сигнального пути β-катенин-ТСР/ЬЕР, зачастую представленного в повышенном количестве при колоректальном раке (8й1и1тап, М., 2йийпзку, I., 81тсйа, Ι., А1Ьапезе, С., Э'Атюо, М., Резке11, К., апб Веп2е'еу, А.; Тйе сусйп Ό1 депе 1з а 1агде1 о£ 1йе Ье1а-са1етп/ЕЕР-1 раЛетау, Ргос. №й1. Асаб. 8ск И8А, 1999, 96, 5522-5527; Тейт О. апб МсСогтюк, Р.; Ве1а-са1ешп гедпкйез ехргеззюп о£ сусйп ΌΙ ш со1оп сагсшота се11з, №Лге, 1999,398, 422-426).

Повышенная экспрессия ί'.'ί''ΝΌ1 была связана с более высокими стадиями опухоли, метастазами и снижению выживаемости (Ва1сегс/ак Е., Раз/-\Уа1с/ак С., Китог, Р., Рапс/ук, М., Когбек, К., \У1ег/Ыскк К., апб Мйо\узкк М.; Сусйп Ό1 рго1ет апб ί.’ί'’ΝΌ1 депе ехргеззюп ш со1огес1а1 сапсег, Еиг. 1. 8игд. Опсо1., 2005, 31, 721-726; Вайпаззу, А.А., 2екй, А.К., Е1-Ноизз1т, 8., Е1-8йейаЬу, А.М., Майтоиб, М.К., АЬба11ай, 8., апб Е1-8егай, М.; Сусйп А апб сусйп Ό1 аз з1дпгйсап1 ргодпозйс тагкегз ш со1огес1а1 сапсег райеп!з, ВМС. Сазйоеп1его1, 2004, 4, 22; МсКау, кА., Эоид1аз, кк, Козз, У.С., Сиггап, 8., Миггау, Ο.Ι., Сазз1бу, I., апб МсЬеоб, Н.Ь.; Сусйп Ό1 рго1ет ехргеззюп апб депе ро1утогрЫзт ш со1огес!а1 сапсег. АЬегбееп Со1огесйб Шйайуе, йй. 1. Сапсег, 2000, 88, 77-81; Маеба, К., Сйипд, Υ., Капд, 8., Ода\\т М., Опоба, Ν., №зйй дисй1, Υ., Лейага, Т., Nакаίа, В., Окипо, М., апб 8о\\т М.; Сусйп Ό1 оуегехргеззюп апб ргодпоз1з ш со1огес1а1 абепосагсшота, Опсо1оду, 1998, 55, 145-151).

Матричная металлопротеиназа 7 (матрилизин, утерин) (ММР7).

Матричные металлопротеиназы (ММРз) являются крупным семейством структурно родственных цинк-зависимых протеиназ, описываемых типично как способные приводить к деградации компонентов внеклеточной матрицы. Были идентифицированы отдельные ММР, которые проявляют повышенную экспрессию при опухолях, и большинство опухолей демонстрировало усиленную активность ММР (Сиггап, 8 апб Миггау, ΟΙ; 1999, МаЛх те1а11орго1етазез ш 1итоиг шуазюп апб те!аз1аз1з, 1. Ра!йо1., 189, 300308; Сиггап, 8 апб Миггау, ΟΙ; 2000, МаЛх те1а11орго1етазез: то1еси1аг азресй о£ Лей го1ез ш Лтоиг шуазюп апб те1аз1аз1з, Епг.1 Сапсег, 36, 1621-1630).

Базальная мембрана и внеклеточная матрица представляют собой два физических барьера для инвазии злокачественных заболеваний, и их разрушение ММР играет ключевую роль в прогрессировании опухоли и распространении метастазов Пойпзет М., Ьипб, Ь.К., Котег, к, А1тйой, К., апб Эапо, К.; 1998, Сапсег шуазюп апб йззие гетобейпд: соттоп Летез ш рго1ео1уйс пкйпх бедгабайоп, Сшт.Орт.Се11 Вю1., 10, 667-671; №1зоп, А.К., Ршд1е1оп, В., КоЛепЬегд, М.Ь., апб Ма1йз1ап, Ь.М.; 2000, МаЛх те!а11орго1ешазез: Ью1одю асйуйу апб сйтса1 шрйсайопз, 1. Сйп Опсо1., 18, 1135-1149; Уапд, Е.р., 8о, к, Ке1егз!аб, 8., апб Изйтап, Э.А.; 2005, Маййузш (ММР-7) ргото1ез шуазюп оГ оуапап сапсег се11з Ьу асйуайоп оГ ргоде1айпазе, Λί. 1. Сапсег, 114, 19-31). Помимо данной функции на данный момент обсуждается участие ММР в развитии и прогрессировании опухоли, включая роли в апоптозе, клеточной пролиферации и дифференциации. Данные функции связаны с ММР-опосредованным протеолизом нематричных белков и действий, отличающихся от их ферментативной активности (ЕдеЬ1аб, М. апб УегЬ, Ζ.; 2002, Νον Лпсйопз Гог Ле пкйпх те1а11орго1етазез ш сапсег ргодгеззюп, №й.Веу.Сапсег 2, 161-174; Ьеетап, М.Р., Сиггап, 8., апб Миггау, Ο.Ι.; 2003, №ν шз1дй!з шЛ 1йе го1ез оГ таЛх те1а11орго1етазез ш со1огес!а1 сапсег беуе1ортеп1 апб ргодгеззюп, I. РаЛо1., 201, 528-534).

Недавние исследования показали, что несколько матричных металлопротеиназ, в особенности матрилизин (ММР7), взаимодействуют со специфическими молекулярногенетическими и сигнальными путями, задействованными в развитии колоректального рака. В частности, матрилизин активируется на ранней стадии колоректального онкогенеза сигнальными путями бета-катенина (ВгаЫе!/, Т., Лпд, А., Эад, 8., Н1иЬек, Р., апб Кйсйпег, Т.; 1999, Ье1а-са1ешп гедикйез Ле ехргеззюп оГ 1йе таЛх те1а11орго1еЛазе-7 ш йитап со1огес!а1 сапсег, Ат. I. РаЛо1., 155, 1033-1038; Ьеетап, М.Р., Сиггап, 8., апб Миггау, Ο.Ι.; 2003, Ναν шз1дй!з шЛ 1йе го1ез оГ пийпх те1а11орго1етазез ш со1огес!а1 сапсег беуе1ортеп1 апб ргодгеззюп, ЬРаЛок, 201, 528-534; ΖικΙ^Γ 8. апб Уасйса, 1.; 2004, Ко1е оГ таЛх те1а11орго1етазез (ММРз) ш со1огес!а1 сапсег, Сапсег Ме1аз1аз1з Кеу., 23, 101-117).

ММР7 гиперэкспрессирована как в доброкачественных, так и злокачественных колоректальных опухолях (ПЫкатеа, Т., Iсй^каνа. Υ., Мйзийазйц М., Мот1уата, Ν., СЫзЫта, Т., Тапака, К., Υатаοка, Н., М1уа/акю, К., №дазЫта, Υ., Акйауа, Т., апб 8й1таба, Н.; 1996, Майбузт 1з аззоскйеб νίΛ ргодгеззюп оГ

- 15 023928 со1огеска1 (итог, Сапсег Ьекк., 107, 5-10; МсЭоппеП, 8, Хауге, Μ, СоГГеу, КГ 1г., апб Макпккпг ЬМ; 1991, Ехргеккюп апб 1осаП/акюп оГ (Не таких тека11оргокетаке ритр-1 (ММР-7) ш Нитап даккпс апб со1оп сагси потак, МоГСагстод., 4, 527-533; М1уа/акк К, Найоп, Υ, итеткЫ, Р, Уакитйъи, Н, апб Итеба, М; 1990, Рипйсайоп апб сНагаскеп/акюп оГ ехйасе11и1аг тайкх-бедгабтд текаПоргокетаке, такпп (ритр-1), кесгекеб Ггот Нитап гес1а1 сагстота се11 1те, Сапсег Кек., 50, 7758-7764; ^дакИта, Υ, Накеда\\а, 8, КокЫката, N Так1, А, [сШка^а, Υ, Кйатига, Н, М1кид1, К, КШга, Υ, Майю, Υ, Υакитйки, Н, апб М1уа/акк К; 1997, Ехргеккюп оГ тайбукт ш уакси1аг епбокНейа1 се11к аб)асепк ко тайбукт-ргобистд китогк, Шк. 1. Сапсег, 72, 441-445; Хе\γе11. КГ \νίΠν, ГР, Кобдегк, \УН, апб Макпккт, ЬМ; 1994, Ехргеккюп апб 1оса1^ζак^оп оГ тайкхбедгабшд тека11оргокетакек бигтд со1огеска1 китопдепекХ, МоГСагстод., 10, 199-206; Уок1йто1о, М, Кой, Р, Υататоко, Н, Ншоба, Υ, Нпак К, апб Υ;·ιΗιί, А; 1993, Ехргеккюп оГ ММР-7(РИМР-1) тКУА ш Нитап со1огес1а1 сапсегк, Шк. Г Сапсег, 54, 614-618). ММР7 является одной из немногих ММР, которая фактически секретируется опухолевыми клетками (0уега11, СМ апб К1ейе1б, О; 2006, Титоиг т^с^оепν^^оитепк орбиоп: уаббабпд таких текайоргокетакек ак бгид 1агде1к апб апй-кагдекк Гог сапсег кНегару, Nак.Кеν.Сапсе^, 6, 227-239). Кроме того, уровни экспрессии ММР7 мРНК соотносятся со стадией прогрессирования КРР (бкНбмпуа, Т, [сНгка^а, Υ, МйкиНакЫ, М, Мот1уата, N СЫкЫта, Т, Танака, К, Υатаока, Н, М|уа/ак1с, К, ^дакН^а, Υ, Акйауа, Т, апб 8Ытаба, Н; 1996, Маййукш ίκ аккотакеб \\ЙН ргодгекК1оп оГ со1огес1а1 (итог, Сапсег Ьей., 107, 5-10; Моп, М, Вагпагб, СР, Мппоп, К, Иео, Н, АкГуокЫ, Т, апб 8ид1тасЫ, К; 1995, 0уегехргеккюп оГ таких те(а11орго(етаке-7 тКИА ш Нитап со1оп сагстотак, Сапсег, 75, 1516-1519). При метастазах при КРР ММР7 играет также центральную роль (АбасЫ, Υ, Υататоко, Н, Кой, Р, Ншоба, Υ, 0каба, Υ, апб Нпак К; 1999, СопкиБийоп оГ таййукш (ММР-7) ко Не текаккайс ракЫгау оГ Нитап со1огеска1 сапсегк, Сик, 45, 252-258; Моп, М, Ватагб, СР, Мбиоп, К, Иео, Н, АЫуокЫ, Т, апб 8ид1тасЫ, К; 1995, 0уегехргеккюп оГ таких те(а11орго(етаке-7 тКИА ш Нитап со1оп сагстотак, Сапсег, 75, 1516-1519).

Повышенные уровни сыворотки ММР7 ассоциируются с плохим прогнозом для пациентов с колоректальным раком на поздних стадиях (Маиге1, 1, №ба1, С, Сагс1а-А1Ьеш/, X, Са11едо, К, Сагсегепу, Е, А1тепбго, V, Магто1, М, Са11агбо, Е, Мапа, АГ Еопдагоп, К, Μа^к^пеζ-Ре^иапбеζ, А, Мойпа, К, Сакке11к, А, апб Саксоп, Р; 2007, 8егит таких текайоргокетаке 7 1еуе1к 1бепййек роог ргодпоык абуапсеб со1огеска1 сапсег райепкк, кК. Г Сапсег, РиЬйкНеб 0Ыше: 8 Мау 2007), а гиперэкспрессия у пациентов с КРР, ассоциирующаяся опять же с сокращением выживаемости, как предполагалось способствует ускользанию от иммунологического надзора путем расщепления Рак на опухолевых клетках (^ап§, \У8, СНеп, РМ, \Уапд, Н8, Ыапд, ^Υ, апб 8и, Υ; 2006, Майях текаборгокеб'1аке-7 шсгеакек геаккапсе ко Рак-теб1акеб ароркоык апб 1к а роог ргодпокйс Гаског оГ райепкк \\йН со1огеска1 сагстота, Сагстодепеак, 27, 1113-1120).

Белки по изобретению могут быть мишенью опухолеспецифического иммунного ответа при многих видах рака.

Пептид корового антигена вируса гепатита В, НВV-001, получен не из эндогенного опухолеассоциированного антигена человека, а из корового антигена вируса гепатита В. Во-первых, это позволяет количественные сравнения интенсивности Т-клеточных ответов, индуцированных ШМАР, и, следовательно, позволяет сделать важные выводы о способности вызывать противоопухолевые ответы. Вовторых, он функционирует как важный положительный контроль в случае недостатка каких-либо Тклеточных ответов у пациента. И, в-третьих, он также позволяет сделать заключение о статусе иммунокомпетентности пациента.

Инфицирование вирусом гепатита В (НВУ) является одной из самых распространенных причин заболевания печени, поражающим примерно 350 млн человек по всему миру (КеНегтапп, В апб Хаκс^тЬеи^. М; [ттипокду оГ Нераййк В уйик апб Нераййк С уйик бКесбоп, Nак.Кеν.Iттипо1., 2005, 5, 215-229). В связи с простотой горизонтального и вертикального переноса и наличием потенциала для хронического заболевания это может привести к циррозу печени и гепатоклеточной карциноме, поэтому НВV наносит сильный удар по системам здравоохранения многих стран мира. Геном НВV (РгеуХапк N апб ЕауапсНу, И; 2002, Нераййк В, (Ер1бетю апб Рапбетю А1егк апб Кекропке, \Уог1б Неа1кН Ο^даи^ζак^оп, Сепеуа, 2002)) включает частично двухнитевую кольцевую ДНК. В вирионах НВV она окружена коровым белком НВс и другими белками, формируя нуклеокапсид, который защищен внешней оболочкой, содержащей липиды и поверхностные белки семейства НВк (называемые также оболочечными белками). Антигенные детерминанты, ассоциированные с НВс и НВк, обозначаются как НВсАд и НВкАд соответственно. Эти антигены ассоциированы с серологической реакцией, т.е. ответами антител, обнаруженными в крови пациента, и находятся среди клинически наиболее применимых систем антиген-антитело для диагноза инфекции НВV. НВс будет представлять новый чужеродный антиген у всех индивидов без предшествующей истории инфекции НВV. Так как для этого антигена хорошо известны иммуногенные пептиды (Вегко1екй, А, СЫкагк Εν, Реппа, А, СийНок, 8, Са1ай, Ь, М1кка1е, С, РоМег, Р, 8сННсЫ, НГ VIбебо, А, СНекпик, КС, апб; 1993, ИейЫйоп оГ а тпита1 орйта1 сукокохю Т-се11 ерйоре \\ЦЫп кНе Нераййк В уйик пис1еосарк1б ргокебг ΓνίΐΌ1., 67, 2376-2380; ^^ν^пдκкои, ВИ, Сптк С, Сгеу, Н, [кИока, С, СЫкагк Εν, Р1кек, Г Сгеу, Н, СНекпик, К\У, апб 8екке, А; 1997, ТНе Нераййк В уйик-креаПс СТЬ гекропкек шбисеб т Нитапк Ьу Ирорерйбе уассшайоп аге сотрагаЫе ко кНоке ейсйеб Ьу асике уйа1 бКесбоп, Пттипок, 159, 1383-1392), то в рамках исследований ГМА из НВсАд в качестве антигена для положительного контроля

- 16 023928 был выбран один пептид из 10 аминокислот. Индукция пептид-специфических ЦТЛ НВс будет, затем, использоваться как маркер иммунокомпетентности пациента и успешности вакцинации.

Фармацевтическая композиция в дальнейшем может содержать дополнительные пептиды и/или наполнители для большей эффективности, как это будет пояснено ниже.

Вариантной аминокислотной последовательностью данной аминокислотной последовательностью изобретатели обозначают, что боковые цепи, например, одного или двух аминокислотных остатков изменены (например, при их замещении боковой цепью другого встречающегося в природе аминокислотного остатка или какой-либо другой боковой цепью), так что пептид по-прежнему способен связываться с молекулой НЬА по существу таким же путем, как и пептид, состоящий из данной аминокислотной последовательности. Например, пептид может быть модифицирован таким образом, что он, по крайней мере, сохранит, если, не улучшит, способность взаимодействовать и связываться с подходящей молекулой МНС, такой как НЬА-А или -ЭК, и так что он, по крайней мере, сохранит, если не улучшит, способность генерировать активированные ЦТЛ, которые могут распознавать и уничтожать клетки, которые экспрессируют полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, как определено в аспектах данного изобретения. Как может быть извлечено из базы данных, некоторые позиции связывающихся с НЬА-А пептидов являются типичными якорными остатками, образующими центральную последовательность, подходящую к соединительному элементу НЬА-связывающей бороздки.

Те аминокислотные остатки, которые не обязательны для взаимодействия с Т-клеточным рецептором, могут быть модифицированы при замещении другой аминокислотой, чье включение, по существу, не влияет на реактивность Т-клетки и не устраняет связь с релевантным МНС. Таким образом, помимо данного условия, пептид по изобретению может быть любым пептидом (в обозначение которого изобретатели включают олигопептиды или полипептиды), который включает аминокислотные последовательности или их участок или их вариант, как дано.

В дальнейшем известно, что пептиды, презентированные МНС класса II, образованы коровой последовательностью, имеющей конкретный НЬА-специфический аминокислотный фрагмент и, факультативно, Ν- и/или С-терминальные удлиняющие сегменты, которые не препятствуют функции коровой последовательности (т.е. считаются нерелевантными для взаимодействия пептида и Т-клетки). Ν- и/или С-терминальные удлиняющие сегменты могут иметь длину, например, от 1 до 10 аминокислот соответственно. Эти пептиды могут быть использованы как непосредственно для погрузки на молекулы МНС класса II, так и последовательность может быть клонирована на векторы в соответствии с описанным ниже. Так как эти пептиды образуют конечный продукт процессинга более длинных пептидов внутри клетки, то более длинные пептиды могут использоваться в равной степени. Пептиды по изобретению могут быть любого размера, но, в основном, они могут иметь молекулярный вес меньше чем 100000, предпочтительно меньше чем 50000, более предпочтительно меньше чем 10000 и типично около 5000. В отношении числа аминокислотных остатков пептиды по изобретению могут иметь менее чем 1000 остатков, предпочтительно менее чем 500 остатков, более предпочтительно менее чем 100 остатков. Соответственно, настоящее изобретение обеспечивает также композиции из пептидов и их вариантов, в которых пептид или вариант имеет общую длину между 8 и 100, предпочтительно между 8 и 30 и наиболее предпочтительно между 8 и 16, а именно 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 или 16 аминокислот.

В соответствии с этим, варианты, которые индуцируют Т-клеточную перекрестную реакцию с пептидом по изобретению, часто являются вариантами по длине.

Если пептид, который длиннее, чем около 12 аминокислотных остатков, непосредственно используется для связывания с молекулой МНС II класса, предпочтительно, чтобы остатки, которые примыкают к центральному НЬА- связывающему региону, по существу, не влияли на способность пептида специфически связываться со связывающей бороздкой молекулы МНС II класса или презентировать пептид ЦТЛ. Тем не менее, как уже было указано выше, следует понимать, что могут быть использованы более крупные пептиды, в особенности, если они закодированы полинуклеотидом, потому что такие крупные пептиды могут быть разделены на фрагменты подходящими антигенпрезентирующими клетками.

Также возможно, чтобы эпитопы МНС I класса, хотя они обычно имеют длину между 8-10 аминокислотами, генерировались при процессинге пептидов из более длинных пептидов или белков, включающих истинный эпитоп. Аналогично с эпитопами МНС II класса предпочтительно, чтобы остатки, которые примыкают к связывающему региону, по существу, не влияли на способность пептида специфически связываться со связывающей бороздкой молекулы МНС I класса или презентировать пептид ЦТЛ и не маскировали сайты для протеолитического расщепления, необходимые для выявления истинного эпитопа во время процессинга.

Соответственно, настоящее изобретение обеспечивает также пептиды и варианты эпитопов МНС I класса, имеющие общую длину между 8 и 100, предпочтительно между 8 и 30, наиболее предпочтительно между 8 и 16, а именно 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 или 16 аминокислот.

Разумеется, пептид или вариант в соответствии с настоящим изобретением будет обладать способностью связываться с молекулой главного комплекса гистосовместимости человека (МНС) I или II класса. Связывание пептида или варианта с комплексом МНС может быть проверено методами, известными из уровня техники, например, теми, что описываются в примерах настоящего изобретения или в литера- 17 023928 туре для различных аллелей МНС II класса (е.д. Υο§1 АВ, Кгор81юГег Н, Ка1каскег Н, Ка1ки8 М, Каттепзее НС, СкИдам ΙΕ, Магйп К; Ыдапй ιηοΙίΕ οί НЬА-0КВ5*0101 апй ЭКВ 1*1501 тοίесиίе8 йеИпеакй Ггот 8е1Г-рерРйе8; ί. Iттиηοί. 1994; 153 (4):1665-1673; Ма1скегек С, Спаи V, δΐеνаηον^с δ, Каттепзее НС, Етд С, Ме1т8 А; Апа1у818 ο£ а11е1е-8рескк оттас! 811е8 ο£ па1ига1 НБА-ОК17 Ндапй8; ί. Iттиηοί. 1994; 153(3): 1141-1149; Маша δ, δΙιιιηίο1ο Т, Инга МА, Наттег ί, δ^п^дадί^а Р, Шрреп С, διορ^ΜοΗ С, Ма/ζί В, Ве1кпе М, ^е11акοηа Р, ΡγοΙΙι МР; Мекиюта се118 рге8еп1 а МАСЕ-3 ер1кре ΐο СЭ4(+) суЮЮхк Т се118 ίη а88οс^аί^οη \\кк к^8ΐοсοтраΐ^к^ί^ίу ίеикοсуΐе апкдеп ЭК11; ί. Ехр Мей. 1999; 189(5): 871-876; Наттег ί, Ο;·ι11;·ιζζί Р, Βοηο Е, Кагг К\У, β^ηοί ί, ν;·ι18;·ΐ8ηίηί Р, №ду ЪК, δ^η^дадί^а Р; Реркйе Ыпйтд 8реакску ο£ НБА-ОК4 тοίесиίе8: сο^^еίакοη \\кк гкеитаЮк аПкпЫ а88οс^аΐ^οη; ί. Ехр Мей. 1995, 181(5): 1847-1855; Тοтрк^η8 8М, Εοα РА, Μοο^е ίί'.’, 1еп8еп РЕ; А еигоршт ίίиο^ο^ттиηοа88ау Εοτ теа8икпд Ыпйтд ο£ апНдеп ΐο с1а88 II МНС дίусοр^οΐе^η8; ί. Iттиηοί ΜеίЬοЙ8. 1993; 163(2): 209-216; Βοуΐοη КЕ Εο1ιιη;·ιηη Т, Εοηйе1 М, Ка1каскег Н, Накег Т, Рга1ег АЕ ΩοικΕ ОС, Ье8ке ОС, Р1агек КА, Актапп ОМ; СкНатк аай йеса^кοxуίа8е Т ίутрЬοсуΐе ^е8рοη8е8 а88οс^аΐей еНН 8и8серРЫЫу ογ ге8181апсе ΐο 1уре I Ыакек8: апа1у818 ίη й18еа8е й^8сο^йапΐ китап 1\ут8, ηοη-οке8е й1аке11с тке апй НЬА-ОЦ 1гап8депк тке; кН Iттиηοί. 1998 (12):1765-1776).

Дополнительные фрагменты аминокислот, находящиеся на Ν-и/или С-конце, не являющиеся обязательно формирующими часть пептида, которая функционирует как эпитоп для молекул МНС, могут, тем не менее, быть важны для обеспечения эффективного введения пептида в соответствии с настоящим изобретением в клетки. В одном воплощении настоящего изобретения пептид по изобретению является белком слияния, который включает, например, 80 Ν-терминальных аминокислот НЬА-ЭК антигенассоциированной инвариантной цепи (р33, в дальнейшем к), как взятая из банка данных NСΒI, инвентарный номер - СепВапк Ассе88кп-питкег Х00497 (δι^ик^η. М., Маск, В. апй ίοι^, Е.О. Тке сοтрίеΐе 8есщепсе ο£ 1ке тКЫА ίοτ 1ке Н^А-^К-а88οс^аΐей туапаШ скат геуеак а рοίуреркйе \\кк ап ипи8иа1 1гап8теткгапе рοίакίу ЕМВОЕ 3 (4), 869-872 (1984)).

Предпочтительной является фармацевтическая композиция, в которой пептиды имеют общую длину между 8 и 100, предпочтительно между 8 и 30 и особенно предпочтительно между 8 и 16 аминокислотами.

Кроме того, пептид или вариант может быть модифицирован в дальнейшем для улучшения стабильности и/или связывания с молекулами МНС в целях получения более сильного иммунного ответа. Методы для такой оптимизации пептидной последовательности хорошо известны из уровня техники и включают, например, введение обратных пептидных или непептидных связей.

Таким образом, в соответствии с другим аспектом изобретение обеспечивает фармацевтическую композицию, в которой по крайней мере один пептид или вариант включает непептидные связи.

В пептидах с обратной связью аминокислотные остатки присоединены не пептидными связями (-СО-ΝΉ-), но пептидная связь является обратной. Такие ретро-обратные пептидомиметики могут быть получены методами, известными из уровня техники, например, такими, как описано в работе Μеζ^е^е еΐ а1. (1997), ί. Iттиηοί. 159-3237, включенной сюда путем ссылки. Этот принцип охватывает получение псевдопептидов, содержащих изменения, которые охватывают остов, но не ориентацию боковых цепей. Μеζ^е^е еΐ а1. (1997) показывают, что эти псевдопептиды пригодны для ответов МНС и Т-хелперных клеток. Ретро-обратные пептиды, содержащие связи N4-00 вместо пептидных связей СО-NН, намного более устойчивы к протеолизу.

Непептидной связью, является, например, -^^Ν^ -СН₂8-, -СН₂СН₂-, -СН=СН-, -СОСН₂-, -СН(ОН)СН₂- и -СН₂8О-. Патент США № 4897445 обеспечивает метод твердофазного синтеза непептидных связей (-СН₂-NН) в полипептидных цепях, что включает полипептиды, синтезированные с использованием стандартной методики, и непептидную связь, синтезированную при реакции аминоальдегида и аминокислоты в присутствии NаСNΒНз.

Пептиды, включающие последовательности по изобретению, описанные выше, могут быть синтезированы с дополнительными химическими группами, находящимися на их аминном и/или карбоксильном концах, для увеличения, например, стабильности, биологической доступности и/или аффинности пептидов. Например, гидрофобные группы, такие как карбобензоксильные, данзильные или третбутилоксикарбонильные группы, могут быть добавлены к аминным окончаниям пептидов. Подобным образом, ацетильная группа или 9-фторенилметокси-карбонильная группа может быть введена в аминные окончания пептидов. Кроме того, гидрофобная группа, трет-бутилоксикарбонильная или амидная группа может быть, например, добавлена к карбоксильным окончаниям пептидов.

Далее, все пептиды по изобретению могут быть синтезированы в целях изменения их пространственной конфигурации. Например, Ό-изомер одного или более аминокислотных остатков пептида может быть использован скорее, чем обычный Ь-изомер. Более того, по крайней мере один из аминокислотных остатков пептидов по изобретению может быть замещен одним из хорошо известных не встречающихся в природе аминокислотных остатков. Изменения, такие как данные, могут служить для повышения стабильности, биологической доступности и/или связывающих свойств пептидов по изобретению.

Подобным образом, пептид или вариант по изобретению может быть модифицирован химическим способом посредством реакции специфических аминокислот как до, так и после синтеза пептида. При- 18 023928 меры таких модификаций хорошо известны из уровня техники и обобщаются, например, в работе К. ЬипбЫаб, СНетюа1 Кеадейз £ог Рго1еш МобШсайои, 3гб еб. СКС Рге88, 20 05, которая включена сюда путем ссылки. Химическая модификация аминокислот включает, но не ограничивается, модификацией с помощью ацилирования, амидирования, пиридоксилирования лизина, восстановительного алкилирования, тринитробензилирования аминных групп 2,4,6-тринитробензолсульфоновой кислотой (ΤΝΒ8), амидной модификацией карбоксильных групп и сульфгидрильной модификации с помощью окисления надмуравьиной кислотой цистеина до цистеиновой кислоты, образованием ртутных производных, образованием смешанных дисульфидов с другими тиоловыми соединениями, реакцией с малеимидом, карбоксиметилированием йодоуксусной кислотой или йодацетамидом и карбамоилированием цианатом при щелочном уровне рН, хотя не ограничиваясь ими. В этой связи специалист данной области может проконсультироваться с главой 15 раздела Сиггей Рго1осо1з в журнале Рго1еш §с1епсе, Ебз. Сойдаи е! а1. (1ойи \УПеу & §оп8 ΝΥ 1995-2000) для получения более обширной информации о методах, связанных с химической модификацией белков.

Вкратце, модификация, например, остатков аргинила в белках часто основана на реакции вицинальных дикарбонильных соединений, таких как фенилглиоксаль, 2,3-бутандион и 1,2-циклогександион для формирования аддукта. Другим примером является реакция метилглиоксаля с остатками аргинина. Цистеин может быть модифицирован без сопутствующей модификации других нуклеофильных сайтов, таких как лизин и гистидин. В результате для модификации цистеина доступно большое число реагентов. На веб-сайтах фирм Р1егсе СНет1са1 Сотрапу, 5Ндта-А1бпсН и других опубликована информация о специфических реагентах.

Также распространена селективная редукция дисульфидных связей в белках. Дисульфидные связи могут быть образованы и оксидированы во время тепловой обработки биофармацевтических средств.

К-реагент Вудворда может использоваться для модификации специфических остатков глютаминовой кислоты. ^(3-(диметиламинопропил)-№-этилкарбодиимид может использоваться для формирования внутримолекулярных поперечных связей между остатком лизина и остатком глютаминовой кислоты.

Например, диэтилпирокарбонат является реагентом для модификации остатков гистидила в белках. Гистидин может также быть модифицирован при использовании 4-гидрокси-2-ноненала.

Реакция остатков лизина и других α-аминных групп полезна, например, при связывании пептидов с поверхностями или перекрестном связывании (кросс-линкинг) белков/пептидов. Лизин является сайтом присоединения поли(этилен)гликоля и основным сайтом модификации при гликировании белков.

Остатки метионина в белках могут быть модифицированы с помощью, например, йодацетамида, бромэтиламина, хлорамина Т.

Тетранитрометан и Ν-ацетилимидазол могут быть использованы для модификации остатков тирозила. Кросс-линкинг через образование дитирозина может быть произведен с ионами перекиси водорода/меди.

В последних исследованиях по модификации триптофана используются Ν-бромсукцинимид, 2гидрокси-5-нитробензилбромид или 3-бром-3-метил-2-(2-нитрофенилмеркапто)-3Н-индол (ВР№скатол).

Успешная модификация терапевтических белков и пептидов с РЕС-полиэтиленгликолем часто ассоциируется с увеличением циркуляторного полураспада, в то время как кросс-линкинг белков с глутаральдегидом, полиэтиленгликоль-диакрилатом и формальдегидом используется для приготовления гидрогелей. Химическая модификация аллергенов для иммунотерапии часто достигается при карбамоилировании цианатом калия.

В целом пептиды и варианты (по крайней мере, те, что содержат пептидные связи между аминокислотными остатками) могут быть синтезированы, к примеру, Ртос-полиамидным способом твердофазного пептидного синтеза, как раскрыто у Ьи и соавторов (1981), 1. Огд. СНет. 46, 3433-3436 и в прилагающихся ссылках.

Очистка может быть произведена любой техникой или комбинацией таких техник как рекристаллизация, эксклюзивная хроматография, ионообменная хроматография, хроматография гидрофобного взаимодействия и (обычно) обратнофазная высокоэффективная жидкостная хроматография с использованием, к примеру, градиентного разделения ацетонитрил/вода.

Анализ пептидов может быть произведен при использовании тонкослойной хроматографии, электрофореза, в частности капиллярного электрофореза, твердофазной экстракции (ТФЭ), обратнофазной высокоэффективной жидкостной хроматографии, аминокислотного анализа после кислотного гидролиза и масс-спектрометрического анализа при быстрой бомбардировке атомами (РАВ), а также массспектрометрический анализ ΜΑΣΌΣ и Е81-Ц-ТОР.

Дальнейший аспект изобретения обеспечивает нуклеиновую кислоту (например, полинуклеотид), кодирующую пептид или вариант по изобретению. Полинуклеотид может быть, к примеру, ДНК, кДНК, ПНК, ЦНК, РНК, как одно-, так и/или двухнитевыми; натуральными или стабилизированными формами полинуклеотидов, таких как, к примеру, полинуклеотиды с фосфоротиоатным остовом или их комбинациями и может или не может содержать интроны в период времени кодирования для пептида. Разумеется, только пептиды, содержащие встречающиеся в природе аминокислотные остатки, присоединенные

- 19 023928 природными пептидными связями, могут кодироваться полинуклеотидом. Еще один дальнейший аспект изобретения обеспечивает вектор экспрессии, способный экспрессировать полипептид в соответствии с изобретением. Векторы экспрессии для различных видов клеток хорошо известны из уровня техники и могут быть выбраны без проведения излишних экспериментов.

Как правило, ДНК вводится в вектор экспрессии, такой как плазмида, с правильной ориентацией и корректной рамкой считывания экспрессии. Если необходимо, то ДНК может быть сцеплена с адекватными транскрипционными и трансляционными регулирующими контрольными нуклеотидными последовательностями, распознающимися желательным хозяином, хотя такой контроль обычно имеется в векторе экспрессии. Вектор вводится затем хозяину стандартными способами.

С руководством можно ознакомиться, к примеру, в работе БатЪгоок и соавторов (1989), Мо1еси1аг С1отпд, А ЬаЪога!огу Мапиа1, СоИ Бргшд НагЪог ЬаЪога!огу, СоИ Бргшд НагЬог, ΝΥ.

В особенно предпочтительном воплощении изобретения, однако, фармацевтическая композиция включает по крайней мере два пептида, состоящих из аминокислотных последовательностей в соответствии с БЕЦ ГО N0: 1 по БЕЦ ГО N0: 15.

Оптимальное количество каждого пептида, включаемого в вакцину, и оптимальная схема дозировки может быть определена специалистом данной области без проведения излишних экспериментов. Например, пептид или его вариант может приготавливаться для внутривенной (ί.ν.) инъекции, подкожной (к.с.) инъекции, внутрикожной (ί.ά.) инъекции, внутрибрюшной (ί.ρ.) инъекции, внутримышечной (кт.) инъекции.

Предпочтительные пути введения пептидной инъекции - 8.с, ί.ά., ί.ρ., 1.т. и ί.ν. Предпочтительными путями введения инъекции ДНК являются ί.ά., 1.т., 8.с, ί.ρ. и ί.ν. Вводиться могут дозы, к примеру, между 1 и 500 мг, 50 мкг и 1,5 мг, предпочтительно от 125 мкг до 500 мкг пептида или ДНК и будут зависеть от соответствующего пептида или ДНК. Дозы в данных пределах успешно использовались в предыдущих клинических исследованиях (Вгшъзад Р.Р., Аатάа1 Б., С|сг15еп М.К., КуаШеип С., МагкомъкССппъпй С.1, Бνе I., Эугкаид М., ТгасЬ8е1 Б., Ту1с11егМ., Епкхеп ТА., Саийетаск С.; Те1отега8е ρορίίάο νасс^паί^οη: а ρΙΐΗδο Ι/ΙΙ 51тГОу ίη ρаί^еηίδ \νί!ΐι поп-8та11 се11 1ипд сапсег; Сапсег Iттиηο1 БптипоШег. 2006; 55(12):15531564; М. Б!аеЬ1ег, А. Б1еп/1. Ρ.Υ. ΏίοΐΓ®1ι. Т. Е18еп, А. ΒηΓοΓίΜπηρ. ί. Веск, А. Мауег, Б. Vа1ίе^, Н. БшдЬ, ί. Рг18сЬ, С.С. БиеГ; Ап οροη 1аЪе1 δΐιιάγ ίο еνа1иаΐе 1Не 5аГе1у аМ 1ттиподетсЬу оГ 1Не ρορίίάο Ъаδеά сапсег уассте ГМА901, АБС0 тееИпд 2007; АЪзЬас! Νο 3017).

Фармацевтическая композиция по изобретению может быть составлена так, что выбор, номер и/или количество пептидов, присутствующих в композиции является/являются ткане-, раково- и/или пациентспецифической(ими). Например, руководством для точного отбора пептидов могут служить образцы экспрессии родительских белков в данной ткани во избежание побочных эффектов. Выбор может зависеть от специфического типа рака, от которого страдает пациент, которому предназначено лечение, в равной степени, как и от статуса заболевания, ранних схем лечения, иммунного статуса пациента и, естественно, от НЬА-гаплотипа пациента. В дальнейшем вакцина в соответствии с изобретением может содержать индивидуализированные компоненты, соответствующие личным потребностям отдельного пациента. Примерами являются различные количества пептидов в соответствии с экспрессией связанных с ними ТАА у конкретного пациента, нежелательными побочными эффектами в связи с аллергиями или другими лечениями и согласованием для вторичного лечения, следующего за первым циклом или схемой лечения.

Для композиции, предназначенной для использования в качестве вакцины против КРР, например, будут избегаться пептиды, родительские белки которых экспрессированы в больших количествах в нормальных тканях, или они будут присутствовать в малых количествах в композиции по изобретению. С другой стороны, если известно, что опухоль пациента экспрессирует большие количества конкретного белка, то соответствующая фармацевтическая композиция для лечения данного вида рака может быть представлена в больших количествах и/или может включать более одного пептида, специфического для данного особенного белка или сигнального пути данного белка.

Специалист данной области будет способен выбрать предпочтительные комбинации иммуногенных пептидов при проверке, например, поколения Т-клеток ίη νίίτο в равной степени, как их эффективности и общего присутствия, пролиферации, аффинности и размножения конкретных Т-клеток для конкретных пептидов, и функциональных свойств Т-клеток, например, при анализе выработки ΙΡΝ-γ (см. также примеры ниже). Обычно наиболее эффективные пептиды комбинируются, затем, в качестве вакцины в соответствии с целями, описанными выше.

Подходящая вакцина будет предпочтительно содержать между 1 и 20 пептидами, более предпочтительно 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 различных пептидов, в дальнейшем предпочтительно 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 или 14 различных пептидов и, наиболее предпочтительно, 14 различных пептидов. Длина пептида для применения в вакцине против рака может быть любым подходящим пептидом. В особенности, он может быть подходящим 9-мерным пептидом или подходящим 7-, или 8-, или 10-, или 11-мерным пептидом или 12-, 13-, 14- или 15-мером. Более длинные пептиды могут быть также подходящими; 9-мерные или 10-мерные пептиды, как описано в табл. 1 и 2, являются предпочтительными для пептидов МНС класса Ι, в то время как 12-ти - 15-меры предпочтительны для пепти- 20 023928 дов МНС класса II.

Пептид(ы) формирует(ют) вакцину против опухоли или рака. Она может вводиться непосредственно пациенту, в пораженный орган или систематично, или вноситься ех νί\Ό в клетки, полученные от пациента, или в человеческую клеточную линию, которые затем могут вводиться пациенту или использоваться ш уйго для селекции субпопуляции из иммунных клеток, полученных от пациента, которые после этого вновь вводятся пациенту.

Пептид может быть, по существу, чистым или комбинированным с иммуностимулирующим адъювантом (см. ниже) или использоваться в комбинации с иммуностимулирующими цитокинами или вводиться с подходящей системой доставки, например, липосомами. Пептид может быть также конъюгирован в подходящий носитель, такой как гемоцианин лимфы улитки (КЬН) или маннан (см. νθ 95/18145 и Ьоп§епескег еХ а1. (1993), Апп. ΝΥ Асаб. 8сХ 690, 276-291). Пептид может быть также меченым или являться белком слияния или гибридной молекулой. Пептиды, последовательность которых дана в настоящем изобретении, как ожидается, стимулируют С'.Н4 или СЭ8 ЦТЛ. Тем не менее, стимуляция более эффективна в присутствии помощи, производимой Т-клетками, положительными для противоположного СН. Таким образом, для эпитопов МНС II класса, которые стимулируют СН4 ЦТЛ, партнеры слияния или секции гибридной молекулы адекватно обеспечивают эпитопы, которые стимулируют СЭ8положительные Т-клетки. С другой стороны, для эпитопов МНС I класса, которые стимулируют СН8 ЦТЛ, партнеры слияния или секции гибридной молекулы адекватно обеспечивают эпитопы, которые стимулируют СН4-положительные Т-клетки. С'.Н4- и СО8-стимулирующие эпитопы хорошо известны из уровня техники и включают те, что были идентифицированы в настоящем изобретении.

Чтобы вызвать иммунный ответ, обычно необходимо включить наполнители, что приводит к большей иммуногенности композиции. Таким образом, в предпочтительном воплощении изобретения фармацевтическая композиция включает далее по крайней мере один подходящий адъювант.

Адъюванты - это вещества, которые неспецифически усиливают или потенцируют иммунный ответ (например, иммунные ответы, опосредованные ЦТЛ или хелперными Т-клетками (Т_Н) на антиген, и могут, таким образом, рассматриваться как полезные в медикаменте настоящего изобретения. Подходящие адъюванты включают, но не ограничиваются, 1018 ^8, соли алюминия, АтрНуах, А815, ВСС, СР870,893, СрС7909, СуаА, б8ММ, СМ-С8Р, ТС30, ΣΟ31, Имиквимод, ^иРасХ ТМР321, Σ8 РаХсй, Σ88, ΣδСОМАТКТХ, ХиНттипе, ЫроУас, МР59, монофосфорил липид А, Монтанид !М8 1312, Монтанид КА 206, Монтанид КА 50У, Монтанид КА-51, ОК-432, ОМ-174, ОМ-197-МР-ЕС, ОЭТАК, векторная система РерТе1®, микрочастицы РЬС, резиквимод, 8КР172, вирусомы и другие вирусоподобные частицы, ΥΡ17Ό, УЕСР Хгар, К848, Бета-глюкан, Рат3Су8, стимулон АсцйкЕ 0821 (Асцйк) ВюХесй, Vо^се8Хе^, МА, И8А) который получают из сапонина, микобактериальные экстракты и синтетические имитации бактериальных клеточных стенок и другие запатентованные адъюванты, такие как Κίόί'8 ОеХох, Ош1 или 8ирегГо8. Предпочтительными адъювантами являются такие, как неполный адъювант Фрейнда или ГМ-КСФ. Несколько иммунологических адъювантов (например, МР59), специфических для дендритных клеток, и их приготовление были описаны ранее (Нирш8 М, Мигрйу Т1, Ш§§ш8 Ό, и§о//ой М, уап №8Х С, ОХХ С, МсЭопа1б ОМ; Непбтйю се118 ййегпаН/е уассше аб]нуапХ аГХег 1пХгатн8сн1аг Й1|есХюп; Се11 Iттиио1. 1998; 186(1): 18-27; А1Й8оп АС; Тйе тобе оГ асХюп оГ иптипоЕдЫй аб]нуапХ8; Эеу Вю1 8Хапб. 1998; 92:3-11). Также могут использоваться цитокины. Несколько цитокинов были присоединены напрямую для оказания влияния на миграцию дендритных клеток к лимфоидным тканям (например, ΊΝΡ-α), ускоряя созревание дендритных клеток до эффективных, презентирующих антиген Т-лимфоцитам, клеток (например, ГМ-КСФ, ИЛ-1 и ИЛ-4) (патент США № 5849589, специфически включенный сюда в его целостности путем ссылки) и действуя как иммуноадъюванты (например, ИЛ-12) (СаЪтйоуюй Ό1, Сипшпдйат НТ, СагЬопе ЭР; [Ь-12 апб тиХапХ Р53 рерХ1бе-ри18еб бепбгйю се118 Гог Хйе 8ресйю ХттипоХйетару оГ сапсег; Σ. ПптипоХйег Етрйа818 Титог Iттиио1. 1996 (6):414-418).

Об иммуностимулирующих олигонуклеотидах СрС также сообщалось, что они усиливают эффекты адъювантов в составе вакцин. Теоретически не связанные, СрС- олигонуклеотиды при активации врожденной (неадаптивной) иммунной системы действуют с помощью То11-подобных рецепторов (ТЬК), в основном ТЬК9. Вызванная СрС активация ТЬК9 усиливает антиген-специфические гуморальные и клеточные ответы на широкий спектр антигенов, включая пептидные или белковые антигены, живые или убитые вирусы, вакцины из дендритных клеток, аутологичные клеточные вакцины и полисахаридные конъюгаты как в профилактических, так и терапевтических вакцинах. Более важно то, что улучшается созревание и дифференциация дендритных клеток, приводя к улучшенной активации Т_Н1-клеток и интенсивной генерации цитотоксических Т-лимфоцитов (ЦТЛ) даже при отсутствии помощи СН4 Тклеток. Отклонение в сторону ТН1, вызванное стимуляцией ТЬК9, сохраняется даже в присутствии вакцинных адъювантов, таких как квасцы или неполный адъювант Фрейнда (КА), которые обычно способствуют отклонению в сторону ТН2. СрС-олигонуклеотиды проявляют даже большую адъювантную активность, если они входят в состав или вводятся вместе с другими адъювантами или в таких составах как микрочастицы, наночастицы, липидные эмульсии или подобных составах, которые в особенности необходимы для инициации сильного ответа, если антиген относительно слаб. Они также ускоряют иммун- 21 023928 ную реакцию и позволяли снизить дозы антигена на приблизительно два порядка величины с ответами антитела, сравнимыми с полной дозой вакцины без СрО в некоторых экспериментах (Аййиг М. Кпед, Тйегареийс ро1епйа1 οί То11-Пке гесер1ог 9 ас1Ка1юп, №Ииге Κеγ^е\γк. Эгид ^^ксονе^у, 2006, 5, 471-484). В патенте США № 6406705 В1 описывается комбинированное применение СрО-олигонуклеотидов, адъювантов, не включающих нуклеиновые кислоты, и антигена для вызывания антиген-специфического иммунного ответа. Имеющимся в продаже антагонистом СрО ТЬК9 является йδ^IМ (контурный иммуномодулятор двойного действия) компании Мо1одеп (Берлин, Германия), который является предпочтительным компонентом фармацевтической композиции настоящего изобретения. Также могут быть использованы другие молекулы, связывающиеся с ТЬК, такие как РНК, связывающаяся с ТЬК 7, ТЬК 8 и/или ТЬК 9.

Другие примеры полезных адъювантов включают, но не ограничиваются химически модифицированными СрО (например, СрК, !йега), Ро1у(ЕС) (например, ро1укС12и), не-СрО бактериальной ДНК или РНК, а также иммуноактивными малыми молекулами и антителами, такими как имидазохинолины, циклофосфамид, сунитиниб, бевацизумаб, целебрекс, ^Х-4016, силденафил, тадалафил, варденафил, сорафениб, ХЬ-999, СР-547632, пазопаниб, ΖΌ2171, ΑΖ^2171, ипилимумаб, тремелимумаб и δС58175, которые могут действовать терапевтически и/или как адъювант. Количества и концентрации адъювантов и вспомогательных веществ, полезных в контексте настоящего изобретения, могут быть легко определены опытным специалистом без проведения излишних экспериментов.

Предпочтительными адъювантами являются йδ^IМ, ВСО, ОК432, имиквимод, РемНет и ЛИттипе.

В предпочтительном воплощении фармацевтической композиции в соответствии с изобретением адъювант выбран из группы, состоящей из колониестимулирующих факторов, таких как гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (ГМ-КСФ, сарграмостим).

В предпочтительном воплощении фармацевтической композиции в соответствии с изобретением адъювантом является имиквимод.

Эта композиция используется для парентерального введения, такого как подкожное, внутрикожное, внутримышечное или оральное введение. Для этого пептиды и факультативно другие молекулы растворяются или суспендируются в фармацевтически приемлемом, предпочтительно водном носителе. Помимо этого, композиция может содержать наполнители, такие как буферы, связующие агенты, разрушающие агенты, разбавители, вкусоароматические добавки, смазочные вещества и т.д. Пептиды могут быть также введены вместе с иммуностимулирующими веществами, такими как цитокины. Пространный список наполнителей, которые могут быть использованы в такой композиции, может быть взят, например, из А. КЪЪе, НапйЪоок οί Рйаттасеийса1 Ехс1р1еп1к, 3. Ей., 2000, изд. Атепсап Рйаттасеийса1 АккотаНоп апй рйаттасеи1юа1 ргекк. Композиция может применяться для предупреждения, профилактики и/или лечения аденоматозных или раковых заболеваний, предпочтительно КРР.

Цитотоксические Т-клетки (ЦТЛ) распознают антиген в форме пептида, связанного с молекулой МНС скорее, чем интактный чужеродный антиген сам по себе. Сама молекула МНС находится на клеточной поверхности антигенпрезентирующей клетки. Так, активация ЦТЛ возможна, только если имеется в наличии тримерный комплекс из пептидного антигена, молекулы МНС и АПК. Соответственно, иммунный ответ может быть усилен, если для активации ЦТЛ использован не только пептид, а если, кроме того, добавлены АПК с соответствующей молекулой МНС.

Поэтому в предпочтительном воплощении фармацевтическая композиция в соответствии с настоящим изобретением дополнительно содержит по крайней мере одну антигенпрезентирующую клетку.

Антигенпрезентирующая клетка (или клетка-стимулятор) типично имеет молекулу МНС I или II класса на своей поверхности и в одном воплощении является, по существу, не способной самостоятельно нагружать на молекулу МНС I или II класса выбранный антиген. Как более детально описано ниже, молекула МНС I или II класса может быть легко нагружена выбранным антигеном ш νίΐτο.

Предпочтительно в клетке млекопитающих не хватает или имеется пониженный уровень или пониженная функция пептидного транспортера ТАР. Подходящие клетки, в которых не хватает пептидного транспортера ТАР, включают Т2, КМА-δ и клетки дрозофилы. ТАР - это транспортер, ассоциированный с процессингом антигена.

Нагружающая пептидом дефектная клеточная линия Т2 человека имеется в наличии в Атепсап Туре СиЙите СоПесйоп, 12301 Рагк1а\гп ΌιΚό, Кос^Ше, Магу1апй 20852, США под каталоговым № СКЬ 1992; клеточная линия дрозофилы линия δΗιικ^Γ 2 имеется в наличии в АТСС под каталоговым № СКЬ 19863; клеточная линия мыши КМА-δ описывается у Капе и Ципддтеп (1985), ί. Ехр. Мей. 162, 1745. Данные клеточные линии могут быть использованы в качестве АПК, и из-за недостатка ТАР практически все пептиды, презентируемые МНС I класса, будут пептидами при тщательной проверке, использованными для загрузки извне пустых молекул МНС I класса этих клеточных линий, следовательно, все эффекты будут отчетливо относиться к использованным пептидам.

Предпочтительно, чтобы антигенпрезентирующие клетки являлись дендритными клетками. Подходящим образом, дендритные клетки являются аутологичными дендритными клетками, в которые импульсным методом введен антигенный пептид. Антигенный пептид может быть любым подходящим ан- 22 023928 тигенным пептидом, который вызывает адекватный Т-клеточный ответ. Т-клеточная терапия с использованием аутологичных дендритных клеток с введенными импульсным методом пептидами из опухолеассоциированного антигена раскрывается у Мигрйу и соавторов (1996), Тйе Рго81а1е 29, 371-380 апб Т)иа е! а1. (1997), Тйе Рго81а1е 32, 272-278.

Так, в предпочтительном воплощении настоящего изобретения в фармацевтическую композицию, содержащую по крайней мере одну антигенпрезентирующую клетку, введен импульсным методом или погружен пептид, к примеру, методом примера 4.

В качестве альтернативы антигенпрезентирующая клетка включает модель экспрессии, кодирующей пептид. Полинуклеотид может быть любым подходящим полинуклеотидом, и, предпочтительно, чтобы он был способен к трансдукции дендритной клетки, таким образом, приводя к презентации пептида и индукции иммунитета.

Как правило, нуклеиновая кислота по изобретению может быть включена в вирусный полинуклеотид или вирус. Например, аденовирус-трансдуцированные дендритные клетки проявляли способность индуцировать антиген-специфический противоопухолевый иммунитет по отношению к МИС1 (см. Оопд е! а1. (1997), Оепе Тйег. 4, 1023-1028). Подобным образом могут быть использованы системы, основанные на аденовирусе (см., например, \Уап е! а1. (1997), Нит. Оепе Тйег. 8, 1355-1363); могут быть использованы ретровирусные системы (8ресй1 е! а1. (1997), I. Е\р. Меб. 186-1221 и 8/аЬо1с8 е! а1. (1997), также может быть использован опосредованный частицами крови перенос в дендритные клетки (Тийпд е! а1. (1997), Еиг. I. 1ттипо1. 27-2707); а также может быть использована РНК (Л8й1еу е! а1. (1997), I. Е\р. Меб. 186, 1182).

В целом фармацевтическая композиция по изобретению, содержащая (а) нуклеиновую(ые) кислоту(ы) по изобретению, может вводиться подобным образом, как и те, что содержат пептид(ы) по изобретению, например, внутривенно, внутриартериально, внутрибрюшно, внутримышечно, внутрикожно, внутрь опухоли, орально, дермально, назально, буккально, ректально, вагинально, с помощью ингаляции или посредством топического введения.

По причине действия механизмов уклонения опухоль часто вырабатывает резистентность к медикаменту, которым она лечится. Резистентность к медикаменту может появиться во время лечения, и она проявляется в метастазах и рецидивировании опухоли. Во избежание таковой медикаментозной резистентности опухоль обычно лечат комбинацией медикаментов, и для лечения метастазов и опухоли, возвращающейся повторно после периода ремиссии, часто требуется комбинация, отличающаяся от первой. Поэтому, в одном аспекте изобретения фармацевтическая композиция вводится в соединении со вторым противораковым веществом. Второе противораковое вещество может вводиться до, после или одновременно с фармацевтической композицией по изобретению. Одновременное введение может быть достигнуто, например, при смешивании фармацевтической композиции по изобретению со вторым противораковым веществом, при условии совместимости их химических свойств. Другая возможность для одновременного введения - это введение композиции и противоракового вещества в один и тот же день, независимо от способа введения, так что фармацевтическая композиция по изобретению может быть, например, инъецирована, в то время как второе противораковое вещество вводится, например, орально. Фармацевтическая композиция и второе противораковое вещество могут также вводиться в рамках одного и того же курса лечения, но в разные дни и/или в рамках отдельных курсов лечения.

В другом аспекте настоящее изобретение обеспечивает метод для лечения или предупреждения рака у пациента, включающий введение пациенту терапевтически эффективного количества любой из фармацевтических композиций по изобретению.

Терапевтически эффективным количеством будет количество, достаточное для вызывания иммунного ответа, в частности, активации субпопуляции ЦТЛ. Специалист данной области может легко определить, будет то или иное количество эффективным, при использовании стандартных иммунологических методов, таких как те, что приводятся в примерах к настоящей спецификации. Другим способом мониторинга эффекта от конкретного количества фармацевтической композиции является наблюдение роста обработанной опухоли и/или ее рецидива.

В особенно предпочтительном воплощении настоящего изобретения фармацевтическая композиция применяется в качестве противораковой вакцины.

Композиция, содержащая пептиды или кодирующие пептиды нуклеиновые кислоты, может также формировать вакцину против опухоли или рака. Она может вводиться непосредственно пациенту, в пораженный орган или систематично, или вноситься ех νί\Ό в клетки, полученные от пациента, или в человеческую клеточную линию, которые затем могут вводиться пациенту или использоваться ш уйго для селекции субпопуляции из иммунных клеток, полученных от пациента, которые после этого вновь вводятся пациенту.

Композиция по изобретению может использоваться в методе лечения или в качестве вакцины против рака. Рак может быть раком ротовой полости и глотки, раком пищеварительного тракта, раком толстой кишки, прямой кишки и анального отверстия, раком дыхательных путей, раком груди, раком шейки матки, влагалища и наружных половых органов, раком тела матки и яичника, раком мужских половых путей, раком мочевыводящих путей, раком костной и мягкой ткани и саркомой Капоши, меланомой ко- 23 023928 жи, меланомой глаза и немеланомным раком глаза, раком головного мозга и центральной нервной системы, раком щитовидной железы и других эндокринных желез, лимфомой Ходжкина, лимфомой неХоджкина и миеломой, предпочтительно раком почки, колоректальным раком, раком легкого, раком груди, раком поджелудочной железы, раком простаты, раком желудка, раком головного мозга, гастроинтестинальной стромальной опухолью (СШТ) или глиобластомой.

В наиболее предпочтительном воплощении метода лечения или вакцины в соответствии с изобретением вакцина является комплексной пептидной противоопухолевой вакциной для лечения колоректального рака. Предпочтительно, чтобы вакцина включала комплекс опухолеассоциированных пептидов, выбранных из последовательностей ЗЕО ГО NО: 1 по 15, которые локализованы и были идентифицированы на первичных клетках колоректального рака. Этот комплекс включает пептиды НЬА класса I и II. Пептидный комплекс может также содержать по крайней мере один пептид, например, из корового антигена НВУ, используемый в качестве пептида положительного контроля, служащего как антигенный маркер для проверки эффективности внутрикожного введения. В одном особенном воплощении вакцина состоит из 14 отдельных пептидов (в соответствии с ЗЕО ГО NО: 1 по 15) с весом каждого пептида от около 1500 мкг до около 75 мкг, предпочтительно от около 1000 мкг до около 750 мкг и, более предпочтительно, от около 500 мкг до около 600 мкг и, наиболее предпочтительно, около 578 мкг, которые все могут быть очищены на ВЭЖХ и ионообменной хроматографии и получены в виде белого до сероватобелого порошка. Лиофилизат предпочтительно растворяют в гидрокарбонате натрия и используют для внутрикожной инъекции в течение 30 мин после восстановления при комнатной температуре. В соответствии с настоящим изобретением предпочтительные количества пептидов могут варьироваться между около 0,1 и 100 мг, предпочтительно между около 0,1 до 1 мг и, наиболее предпочтительно, между около 300 мкг до 800 мкг на 500 мкл раствора. Термин около подразумевает здесь ±10% процентов заданного объема, если не указано другое. Специалист данной области будет способен установить фактическое количество пептида для использования, исходя из нескольких факторов, таких как, например, иммунный статус отдельного пациента и/или количество ТИМАР (опухолеассоциированный пептид), который презентируется в конкретном виде рака. Пептиды настоящего изобретения могут обеспечиваться в других подходящих формах (стерильные растворы и т.д.) вместо лиофилизата.

Фармацевтический препарат по настоящему изобретению, содержащий пептиды и/или нуклеиновую(ые) кислоту(ы) в соответствии с изобретением, водится пациенту, страдающему аденоматозным или раковым заболеванием, ассоциированным с соответствующим пептидом или антигеном. Тем самым может быть инициирован иммунный ответ, опосредованный Т-клетками.

Предпочтительна фармацевтическая композиция в соответствии с изобретением, в которой количество (в особенности опухолеассоциированного(ых)) пептида(ов), нуклеиновых(ой) кислот(ы) в соответствии с изобретением или вектора(ов) экспрессии в соответствии с изобретением, как присутствующие в указанной композиции, являе(ю)тся ткане-, раково- и/или пациент-специфическим.

В другом предпочтительном воплощении изобретения вакцина является вакциной из нуклеиновой кислоты. Известно, что инокуляция вакциной из нуклеиновой кислоты, такой как ДНК-вакцина, кодирующей полипептид, приводит к Т-клеточному ответу. Она может вводиться непосредственно пациенту, в пораженный орган или систематично, или вноситься ех νί\Ό в клетки, полученные от пациента, или в человеческую клеточную линию, которые затем могут вводиться пациенту или использоваться ш νίΙΐΌ для селекции субпопуляции из иммунных клеток, полученных от пациента, которые после этого вновь вводятся пациенту. Если нуклеиновая кислота введена в клетки ш уПго, то может быть полезно, чтобы клетки были трансфецированными, чтобы коэкспрессировать иммуностимулирующие цитокины, такие как интерлейкин-2 или ГМ-КСФ (ОМ-СЗР). Нуклеиновая(ые) кислота(ы) может/могут быть, по существу, чистым или комбинированным с иммуностимулирующим адъювантом или использоваться в комбинации с иммуностимулирующими цитокинами или вводиться с подходящей системой доставки, например, липосомами. Вакцина из нуклеиновой кислоты может также вводиться с адъювантом, таким как те, что описывались выше для пептидных вакцин. Предпочтительно, если вакцина из нуклеиновой кислоты вводится без адъюванта.

Полинуклеотид может быть, по существу, чистым или содержаться в подходящем векторе или системе доставки. Подходящие векторы и системы доставки включают вирусные системы, такие как те, что основаны на аденовирусе, вирусе осповакцины, ретровирусах, вирусе герпеса, аденоассоциированном вирусе или гибридах, содержащих элементы более чем одного вируса. Невирусные системы доставки включают катионные липиды и катионные полимеры, хорошо известные из уровня техники в области доставки ДНК. Также может быть использована физическая доставка, такая как посредством генпистолета. Пептид или закодированный нуклеиновой кислотой пептид может быть белком слияния, например, с эпитопом из столбнячного токсина, который стимулирует СГО4-положительные Т-клетки.

Соответственно, любая нуклеиновая кислота, вводимая пациенту, является стерильной и свободной от пирогенов. Обнаженная ДНК может вводиться внутримышечно или внутрикожно или подкожно. Обычно вакцина из нуклеиновой кислоты может включать любое подходящее средство доставки нуклеиновой кислоты. Нуклеиновая кислота, предпочтительно ДНК, может быть также доставлена в липосоме или как часть системы доставки вирусного вектора. Предпочтительно, если вакцина из нуклеиновой

- 24 023928 кислоты, такая как ДНК-вакцина, вводится в мышцу, тогда как пептидные вакцины предпочтительно вводятся к.с. или 1.б. Предпочтительно также, если вакцина вводится в кожу.

Полагают, что поглощение нуклеиновой кислоты и экспрессия закодированного полипептида профессиональными антигенпрезентирующими клетками, такими как дендритные клетки, может быть механизмом прайминга иммунного ответа; тем не менее, дендритные клетки могут не быть трансфецированы, однако они по-прежнему важны, так как они могут поглощать экспрессированный пептид из трансфецированных клеток в ткани (кросс-прайминг, например, Ткотак АМ, 8айагк1его ЬМ, Лий ЕК, АтткЛопд ТЭ, Скеп ΥΟ, Ниапд ЬО, Ьакеги ЭЛ, Ооддтк М, НгиЬап КН, 1аПсе ЕМ. Меко1кекп-крес1Пс СЭ8(+) Т-се11 гекропкек ргоу1бе еу1бепсе оП т у1уо сгокк-рпттд Ьу апЛдеп-ргекепЛпд се11к т уассша!еб рапсгеаЛс сапсег раЛеп!к. I. Ехр Меб. 2004 Аид 2; 200(3):297-306).

Полинуклеотид-опосредованная иммунизационная терапия против рака описывается у Сопгу и соавторов (1996), 8еттагк ш Опсо1оду 23, 135-147; Сопбоп е! а1. (1996), №-11иге Мебюте 2, 1122-1127; Оопд е! а1. (1997), №Циге Мебюте 3,558-561; 2ка1 е! а1. (1996), I. 1ттипо1. 156, 700-710; ОгаЬат е! а1. (1996), 1й

I. Сапсег 65, 664-670; и ВигскеИ е! а1. (1996), с. 309-313 В: Вгеак! Сапсег, Абуапсек ш Ыо1оду апб !кегареиЛск, Са1уо е! а1. (ебк), 1окп ЫЬЬеу Еиго!ех1, которые все включены в описание путем ссылки.

Можно также с пользой направлять вакцину в специфические популяции клеток, например, в антигенпрезентирующие клетки либо на месте инъекции с использованием нацеленных векторов и систем доставки, либо при селективной очистке такой клеточной популяции у пациента с введением ех У1уо пептида или нуклеиновой кислоты (например, дендритные клетки могут быть отсортированы, как описывается у 2Ьои и соавторов (1995), В1ооб 86, 3295-3301; Ко!к е! а1. (1996), 8сапб. I. 1штипо1о§у 43, 646651). Например, нацеленные векторы могут включать ткане- или опухолеспецифический промотор, который направляет экспрессию антигена в подходящее место.

Наконец, вакцина в соответствии с изобретением может зависеть от специфического типа рака, от которого страдает пациент, которому предназначено лечение, в равной степени, как и от статуса заболевания, ранних схем лечения, иммунного статуса пациента и, естественно, от НЬА-гаплотипа пациента. В дальнейшем вакцина в соответствии с изобретением может содержать индивидуализированные компоненты, соответствующие личным потребностям отдельного пациента. Примерами являются различные количества пептидов в соответствии с экспрессией связанных с ними ТАА у конкретного пациента, нежелательными побочными эффектами в связи с аллергиями или другими лечениями и согласованием для вторичного лечения, следующего за первым циклом или схемой лечения.

Кроме того, пептиды настоящего изобретения полезны не только для лечения рака, но и также в качестве диагностических средств. Так как пептиды были получены из глиобластомы, и так как было определено, что данные пептиды не присутствуют в нормальных тканях, то эти пептиды могут быть использованы для постановки диагноза о наличии рака.

Присутствие пептидов настоящего изобретения на тканевых биоптатах может помочь патологу в постановке диагноза рака. Детекция конкретных пептидов настоящего изобретения с помощью антител, масс-спектрометрии или других методов, известных из уровня техники, может дать знать патологу, что ткань поражена злокачественным или воспалительным или же заболеванием общего порядка. Присутствие групп пептидов настоящего изобретения может сделать возможной классификацию или субклассификацию пораженных заболеванием тканей.

Детекция пептидов настоящего изобретения на образцах пораженной заболеванием ткани может позволить принять решение о преимуществах от терапии, воздействующей на иммунную систему, в особенности, если Т-лимфоциты, как известно или ожидается, задействованы в механизме действия. Отсутствие экспрессии МНС является хорошо описанным механизмом, при котором инфицированные или злокачественные клетки уклоняются от иммунного надзора. Так, присутствие пептидов настоящего изобретения показывает, что данный механизм не используется проанализированными клетками.

Пептиды настоящего изобретения могут использоваться для анализа ответов лимфоцитов на пептиды настоящего изобретения, таких как ответы Т-клеток или ответы антител на пептиды настоящего изобретения или пептиды настоящего изобретения в комплексе с молекулами МНС. Данные иммунные ответы лимфоцитов могут использоваться в качестве прогностических маркеров для принятия решения о дальнейших этапах терапии. Данные иммунные ответы могут также использоваться в качестве суррогатных маркеров в иммунотерапевтических подходах, направленных на индуцирование ответов лимфоцитов с помощью различных средств, как, например, вакцинации белком, нуклеиновыми кислотами, аутологичными материалами, адаптивного переноса лимфоцитов. При генной терапии ответы лимфоцитов на пептиды настоящего изобретения могут быть рассмотрены в рамках оценки побочных эффектов. Мониторинг ответов лимфоцитов может также быть ценным инструментом для последующих обследований в случае трансплантации, к примеру, для детекции реакций хозяин против трансплантата и трансплантат против хозяина.

Пептиды настоящего изобретения могут использоваться для генерации и разработки специфических антител к комплексам МНС/пептид. Они могут быть использованы в терапии, нацеливающей токсины или радиоактивные вещества на пораженную ткань. Другим видом использования данных антител может быть нацеливание радионуклидов на пораженную ткань в целях визуализации, такой как РЕТ

- 25 023928 (позитронно-эмиссионная томография). Это может помочь в обнаружении небольших метастазов или в определении размера и точного расположения пораженных тканей. Кроме того, пептиды могут быть использованы для верификации диагноза патолога, поставленного на основании биоптата.

В другом его аспекте настоящее изобретение относится к комплекту, включающему (а) контейнер, содержащий фармацевтическую композицию, описанную выше, в виде раствора или в лиофилизованной форме; (Ь) опционально, второй контейнер, содержащий разбавитель или восстанавливающий раствор для лиофилизованного состава; и (с) опционально, инструкции по (ί) применению раствора или (ίί) восстановителя, и/или по применению лиофилизованного состава. В дальнейшем оборудование может включать один или более (ίίί) буфер, (ίν) разбавитель, (ν) фильтр, (νί) иглу или (νίί) шприц. Контейнер является, предпочтительно, флаконом, ампулой, шприцем или пробиркой; и он также может быть контейнером многоразового использования. Фармацевтическая композиция предпочтительно лиофилизована.

Вспомогательное оборудование настоящего изобретения предпочтительно включает лиофилизованный состав настоящего изобретения в подходящем контейнере и инструкции для ее восстановления и/или по ее применению. Подходящие контейнеры включают, например, флаконы, ампулы (например, двухкамерные ампулы), шприцы (такие как двухкамерные шприцы) и пробирки. Контейнер может быть сделан из разнообразных материалов, таких как стекло или пластик. Предпочтительным образом, вспомогательное оборудование и/или контейнер содержит инструкции для, или связанные с контейнером, которые дают указания для восстановления и/или применения. Например, на этикетке может быть указано, что лиофилизованный состав должен восстанавливаться до пептидных концентраций, как те, что описаны выше. На этикетке в дальнейшем может быть указано, что состав применяется или предназначается для подкожного введения.

Контейнер с составом может быть ампулой многоразового использования, которая позволяет повторное введение (например, от 2-6 введений) восстановленного состава. Вспомогательное оборудование может включать в дальнейшем второй контейнер, включающий подходящий разбавитель (например, раствор бикарбоната натрия).

При смешивании разбавителя и лиофилизованного состава окончательная концентрация пептида в восстановленном составе составляет предпочтительно по крайней мере 0,15 мг/мл/пептид (=75 мкг) и предпочтительно не более чем 3 мг/мл/пептид (=1500 мкг). Вспомогательное оборудование может в дальнейшем включать другие материалы, желательные с коммерческой и с точки зрения пользователя, включая другие буферы, разбавители, фильтры, иглы, шприцы и упаковочные вкладыши с инструкциями по применению.

Вспомогательное оборудование настоящего изобретения может иметь один контейнер, который содержит состав фармацевтических композиций в соответствии с настоящим изобретением с или без других компонентов (например, других соединений или фармацевтических композиций этих других соединений) или может иметь отдельные контейнеры для каждого компонента.

Вспомогательное оборудование по изобретению предпочтительно включает состав по изобретению, укомплектованный для применения в комбинации с ковведением второго соединения (такого как адъюванты (например, ГМ-КСФ), химиотерапевтического средства, натурального продукта, гормона или антагониста, средства против ангиогенеза или ингибитора; апоптоз-индуцирующего средства или хелатора) или их фармацевтической композиции. Компоненты вспомогательного оборудования до введения пациенту могут предварительно быть организованы в комплекс, или же каждый компонент может находиться в отдельном отличном контейнере. Компоненты вспомогательного оборудования могут обеспечиваться одним или несколькими жидкостными растворами, предпочтительно, водным раствором, более предпочтительно, стерильным водным раствором. Компоненты вспомогательного оборудования могут также обеспечиваться твердой формой, которая может быть превращена в жидкости при добавлении подходящих растворителей, которые, предпочтительным образом, предоставляются в другом, отличном, контейнере.

Контейнер терапевтического оборудования может быть ампулой, пробиркой, колбой, флаконом, шприцем или любыми другими средствами, заключающими в себе твердое вещество или жидкость. Обычно, если имеются более одного компонента, оборудование содержит вторую ампулу или другой контейнер, который позволяет отдельную дозировку. Оборудование может также содержать другой контейнер для фармацевтически приемлемой жидкости. Терапевтическое оборудование будет предпочтительно содержать приспособление (например, одну или более иглу, шприцы, пипетки для глаз, пипетки и т.д.), которое позволяет введение веществ по изобретению, которые являются компонентами настоящего оборудования.

Фармацевтический состав настоящего изобретения подходит для введения пептидов любым приемлемым способом, таким как оральный (энтеральный), назальный, офтальный, подкожный, внутрикожный, внутримышечный, внутривенный или трансдермальный. Предпочтительно, чтобы введение было 8.с, и, наиболее предпочтительно, 1.б. Введение может производиться инфузионным насосом.

Должно быть понятно, что отличительные черты изобретения, раскрываемые и описываемые здесь, могут быть использованы не только в соответственной комбинации, как было показано, но и также по

- 26 023928 отдельности без выхода из рамок, обозначенных настоящим изобретением. В соответствии с целями настоящего изобретения все цитаты описания включены в их целостности путем ссылки.

Теперь изобретение будет описано более детально посредством ссылок на последующие фигуры, список последовательностей и примеры. Следующие примеры приведены исключительно для иллюстрационных целей и не направлены на ограничение изобретения.

Краткое описание фигур

Фиг. 1. Тетрамерный анализ стимулированной микросферой пролиферации ОЭС-001 и NОX-001специфических СЭ8+ лимфоцитов из периферической крови. ПК, обогащенные на лунку 1х10⁶ СЭ8+ здорового донора НЬА-А*0201+НЭ100 стимулировались еженедельно микросферами, связанными с анти-СЭ28 плюс опухолевый антиген высокой плотности А*0201/ОЭС-001 (верхняя секция) или антиСЭ28 плюс опухолевый антиген высокой плотности А*0201/ЫОХ-001 (нижняя секция). После трех стимуляций ш νίΙΐΌ все клетки были окрашены антителом СЭ8 Р1ТС плюс тетрамеры А*0201/ХОХ-001 РЕ и А*0201/ОЭС-001 АРС. Клетки высаживаются в популяцию лимфоцитов или СЭ8+ лимфоцитов (правая секция), и числа показывают процентную долю тетрамера+ внутри лимфоцитов СЭ8+.

Фиг. 2. Иммуногенность ш νίΙΐΌ ТОРВ1-004, обнаруженного ΙΡΝ-γ ЕЫ8РОТ после пяти циклов стимуляции. Клетки примировали и стимулировали повторно ТОРВ1-004, а затем инкубировали с релевантным ТОРВ1-004 (лунки 1, 2, 3 и 4) и нерелевантным (отриц. контроль) пептидом соответственно. Анализ после ΙΡΝ-γ ЕЫ8РОТ был произведен на ЕЬ18РОТ-ридере (СТЬ, С1еуе1аий, США). ФГАиономицин служил положительным контролем. Числа указывают на количество положительных точек.

Фиг. 3. Иммуногенность ш νίΙΐΌ ТОРВ1-004, обнаруженного методом 1С8 после пяти циклов стимуляции. Клетки примировали аутологичными ДК с нагруженным ТОРВ1-004 и рестимулировали аутологичными МПК плюс ТОРВ1-004. Для считывания клетки инкубировали с релевантным ТОРВ1-004 (лунки 1, 2, 3 и 4) и нерелевантным (отриц. контроль) пептидом соответственно. В дополнение к внутриклеточному окрашиванию ΙΡΝ-γ, клетки были также окрашены антителами СЭ4-Р1ТС и СЭ8-РегСР. Анализ проводили на четырехцветном цитометре РАС8СаНЬиг (ВЭ Вюзиеисез, Германия).

Фиг. 4. Анализ ЕЫ8РОТ выработки ΙΡΝ-γ линиями Т-клеток при рестимуляции ш νίΙΐΌ пептидом NОX-001. А. Т-клеточная линия 7+ донора НВС-154 (отсортированы СЭ8+ NОx-ΟΟ1 тетрамер+); В. Тклеточная линия 7- донора НВС-154 (отсортированы СЭ8+ NОX-001 тетрамер-). Отсортированные клетки СЭ8+ NОX-001 тетрамер+ (А.) и СЭ8+ NОX-001 тетрамер- (В.) анализировали методом ΙΡΝ-γγγγ ЕЫ8РОТ после рестимуляции нерелевантным (МЬА-001) (верхние лунки) и релевантным ^ОХ-001) (нижние лунки) пептидом (10 мкг/мл). Числа указывают на количество положительных точек.

Фиг. 5. Частотность СЕА-004-специфических СЭ8+ Т-клеток у 4 НЬА-А2 здоровых доноров после стимуляции ш νίΙΐΌ СЕА-004, как было определено проточным цитометрическим анализом.

Фиг. 6. Афинность пептидов НЬА Ι класса по изобретению к молекуле МНС, закодированной аллелем НЬА-А*0201.

Примеры

1. Синтез и структура.

Пептиды были синтезированы стандартным и общепринятым методом твердофазного синтеза с использованием способа Ртос. После очистки на препаративной ВЭЖХ проводилась ионообменная процедура для внедрения физиологически совместимых противоионов (ацетат или хлорид). Наконец, после лиофилизации были получены белые или серовато-белые твердые вещества. Все пептиды ТиМАР вводят в виде солей ацетата за исключением ГМА-СС^001, который применяется в виде соли хлорида - это обусловлено техническими причинами во время процесса производства.

Особенно важно, что принадлежность и чистота пептидов могут быть легко определены, причем с высокой точностью, с помощью масс-спектрометрии, аминокислотного анализа и аналитической ВЭЖХ. Как показали аналитические результаты все пептиды, использованные для вакцины ГМА910, обладают правильной структурой с чистотой >95%.

- 27 023928

Таблица 3

Физическо-химические характеристики пептидов в 1МЛ910

№	ΙΌ пептида	Длина пептида (число аминокислот)	Форма соли	Физическая форма	Гигроско- пичность
1	1МА-С20-001	9	Ацетат
2	1МА-ССЫ-001	9	Хлорид
3	1МА-СЕА-004	9	Ацетат		Хранится как
4	1НА-СЕА-006	16	Ацетат		замороженный
5	ΙΜΑ-ΗΒν-001	10	Ацетат	Белый до	сухой порошок*
6	ΙΜΑ-ΜΕΤ-001	9	Ацетат	серовато-	Лиофилизованные
7	ΙΜΑ-ΜΜΡ-001	16	Ацетат	белого	пептиды, в
3	1МА-МИС-001	9	Ацетат	порошок	основном, имеют
9	ΙΜΑ-ΝΟΧ-001	9	Ацетат		гигроскопичные
10	ΙΜΑ-ΟϋΟ-ΟΟΙ	9	Ацетат		свойства.
11	ΙΜΑ-ΡΟΝ-ΟΟΙ	10	Ацетат
12	1МА-ТСГВ1-001	10	Ацетат
13	ΙΜΑ-Τ6ΕΒΙ-004	15	Ацетат
14	ΙΜΑ-ΤΟΡ-ΟΟΙ	10	Ацетат

Измерение распределения размеров частиц и формы частиц, полученных после восстановления, производили при получении прямого изображения каждой отдельной частицы в диапазоне от 0,25 до 100 мкм с последующим анализом изображений. В результате большинство (>95%) частиц находилось в диапазоне от 0,25 до 2,7 мкм. Итак, не наблюдалось существенных различий по размеру и распределению формы в течение 1, 2 или 3 ч после восстановления.

2. Компоненты на примере фармацевтической композиции 1МЛ910.

1МЛ910 составлена из коктейля синтетических опухолеассоциированных пептидов (ТиМЛР8), большинство из которых было выявлено на первичных клетках колоректального рака. Пептиды ТИМЛР включают 10 пептидов, связывающихся с НЬЛ I класса, со способностью активировать цитотоксические Т-клетки (ί'Ό8+ Т-клетки) и 3 пептида, связывающиеся с НЬЛ II класса, со способностью активировать хелперные Т-клетки (СЭ4+ Т-клетки). Хелперные Т-клетки играют центральную роль при поддержке функции цитотоксических Т-клеток при высвобождении цитокинов, которые усиливают киллерную функцию ί'Ό8+ Т-клеток и могут также напрямую выступать против опухолевых клеток (Кпи18оп, КИ апб ΟΪ8Ϊ8, МЬ; Лидтепйпд Т йе1рег се11 иптипйу ш сапсег, Сигг.Эгид ТагдеКНптипе.Епбосг. Ме!аЬо1. И18огб., 2005, 5, 365-371). В дополнение к этому данные 13 ТиМЛР-пептидов !МЛ910 содержат один вирусный контрольный пептид.

Пробы хирургически удаленной злокачественной и нормальной ткани пациентов с КРР и кровь здоровых доноров были проанализированы поэтапно:

Сначала для определения гиперэкспрессированных генов в злокачественной ткани по сравнению с диапазонами показателей для нормальных органов и тканей применялся анализ экспрессии мРНК всего генома с помощью микрочипов.

На втором этапе лиганды НЬЛ злокачественного материала идентифицировались с помощью массспектрометрии.

Затем, идентифицированные лиганды НЬЛ сравнивали с данными по генной экспрессии. Пептиды, кодируемые выборочно экспрессированными или гиперэкспрессироваными генами, выявленными на этапе 1, считались подходящими ТИМЛР-кандидатами для мультипептидной вакцины.

Был произведен поиск литературы для выявления дополнительных свидетельств, подтверждающих релевантность идентифицированных в качестве ТИМЛР пептидов.

Наконец, периферические ί'Ό8+ Т-клетки здоровых индивидов тестировали на реактивность по отношению к опухолеассоциированным лигандам НЬЛ посредством нескольких иммунных анализов (ш νίίΐΌ Т-клеточные анализы).

- 28 023928

Таблица 4

1МА910: композиция ТИМАР

1МА910 содержит 10 НЬА-А*02 (класс I) и 3 НЬА-ИК (класс II) пептидов ТИМАР. Кроме того, будет включен вирусный пептид-маркер НВ^001, которого нет в списке

тидар ιρ	Название	Функция/комментарии
НЬА-А*02ТЦМАРз
С20-001	Открытая рамка считывания 42 хромосомы 20	Плохо охарактеризована, сильная гиперэкспрессия
ССИ-001	Циклин 01	Регуляция клеточного цикла, часто повышенное количество при многих видах рака
СЕА-004	Карциномоэмбриональная, родственная антигену молекула клеточной адгезии 5 (СЕА)	Хорошо изученный ТАА при КРР, клеточная адгезия, метастазы
мет-001	Протоонкоген МеС	Пролиферация, подвижность, адгезия и инвазия
мис-оо1	Муцин 1	Хорошо изученный ТАА при КРР, разоблачение эпитопов из-за изменения гликозилирования в опухолях
ΝΟΧ-Ο01	ΝΑϋΡΗ оксидаза 1	Сильная гиперэкспрессия, ингибирование апоптоза
ОЭС-001	Орнитин-декарбоксилаза 1	Трансформация, про-ангиогенные свойства
рсн-001	Ядерный антиген пролиферирующих клеток	Пролиферация (репликация ДНК)
Τ6ΡΒΙ-001	Трансформирующий фактор роста, бета- индуцированный	Ремодуляция ткани, ангиогенез
ТОР-001	Топоизомераза (ДНК) II	Пролиферация (репликация ДНК)
НЬА-РР ТиМАРз
СЕА-О06	Карциномоэмбриональная, родственная антигену молекула клеточной адгезии 5 (СЕА)	Хорошо изученный ТАА при КРР, клеточная адгезия, метастазы
ММР-001	Матричная металлопротеиназа 7(матрилизин, утерин)	Ремодуляция ткани, ингибирование апоптоза
ТСГВ1-004	Трансформирующий фактор роста, бета- индуцированный	Ремодуляция ткани, ангиогенез

3. Презентация эпитопов, содержащихся в ГМА910, в опухолевых пробах.

Получение.

Хирургически удаленные тканевые препараты были предоставлены Университетской клиникой общей, висцеральной и трансплантационной хирургии г. Тюбинген (Германия) после получения формы информированного согласия от каждого пациента.

- 29 023928

Изоляция пептидов НЬА из проб тканей.

Пептидные пулы НЬА из подвергнутых шоковой заморозке проб тканей были получены методом иммунопреципитации из плотных тканей в соответствии с незначительно измененным протоколом (Ра1к, К., Ко1/5сНке, О., Б1еуапоу1с, Б., Лтд, С. & Каттепкее, Н.С. А11е1е-8ρес^Г^с тоЬГк гехеа^ Ъу 5ес.]иепстд оГ 5θ1Γ-ρορΙίάθ5 ο1ιιΙοά Ггот МНС то1еси1е8. №!иге 1991, 351, 290-296; Беедег, Р.Н. е! а1. ТЬе НЬА-А*6601 ρορίίάο тоЬГ: ρΐΌάΗΐίοη Ъу ροскеί 8!гис!иге аМ уепПсаИоп Ъу ρορίίάο апа1у818. ПптиподепеИск 1999, 49, 571-576) при использовании НЬА-А*02-специфического антитела ВВ7.2 или НЬА-А, -В, -Сспецифического антитела ν6/32, СИВг-активированной сефарозы, кислотной обработки и ультрафильтрации.

Детекция пептидов ТИМАРк масс-спектрометрическим анализом с ЕБ1-жидкостной хроматографией (ЕБНЬСМБ).

Проводили систематический поиск эпитопов, содержащихся в ГМА910, на пробах колоректальных опухолей с помощью масс-спектрометрии. Полученные пулы пептидов НЬА были разделены в соответствии с гидрофобностью обратнофазной хроматографией (ΟΑρΡί’. ^а1ег5), и элюированные пептиды анализировали на гибридном квадрупольном времяпролетном тандемном масс-спектрометре с ортогональным ускорением ионов (Ц-Т0Р И1Ьта, ^а1ег5), снабженном источником ЕБЬ Пептидные пулы наносили на предколонку С18 для концентрирования и опреснения. После нанесения предколонку помещали в линию для разделения с помощью микрокапиллярной колонки из плавленого кварца (75 мкм ί.ά. х250 мм) с обратнофазным материалом С18 в 5 мкм (Июпех). Растворителем А был ацетат аммония/вода, 4 мМ. Растворителем В были 2 мМ ацетата аммония в 80% ацетонитрил/вода. В обоих растворителях был установлен уровень рН в 3,0 муравьиной кислотой. Был сформирован бинарный градиент от 15% до 60% В в течение 90 минут, с применением скорости потока в 5 мкл/мин, сниженного до приблизительно 200 нл/мин с помощью распределительной системы. Позолоченный стеклянный капилляр ^^οΉρ, Νον 0Ъ_)ес!гуе) использовали для введения в источник микро-ЕБЬ Временем интеграции для Т0Р-анализатора было 1,9 сек с временем задержки между измерениями в 0,1 с. Для детекции дефинированных пептидов в рамках данного вида экспериментов ЕБИЬСМБ проводили высокочувствительный скрининг на основе известных молекулярных масс и времени удерживания пептидов в хроматографической системе. Поэтому прилагаемый список значений т/ζ предварительно идентифицированных пептидов (одно- и/или двухзарядные) применялся для выбора предшественников. Затем определяли последовательность анализом индуцированного столкновением (СГО) масс-спектра (ЕБИЬСМБ/МБ).

Последовательность пептида ТИМАР подтверждали сравнением генерированного фрагментационного образца естественного пептида ТИМАР с фрагментационным образцом синтетического контрольного пептида с идентичной последовательностью. Оценку выхода пептида НЬА после очистки и воспроизводимость аналитической системы, включая время удерживания, производили с использованием интенсивности и времени удерживания избыточного эндогенного пептида НЬА-А*02 (УЬИРАШЖ из ΌΌΧ5) в качестве внутреннего стандарта. Поэтому критерий включения пробы КРР для детекции предварительно идентифицированного пептида ТИМАР в данных экспериментах был установлен на уровне минимальной интенсивности в 650 импульсов на измерение внутреннего двухзарядного стандартного сигнала (УкИРАШЖ) в эксперименте ЬСМБ/МБ в целях подтверждения успешной изоляции пептида НЬА и правильности работы аналитической системы.

В табл. 5 представлены результаты анализа проб при раке толстой и прямой кишки на различных стадиях, а также метастазов, возникающих из одного или другого первичного участка опухоли. Все пептиды НЬА-А*02 ТИМАР были обнаружены на большинстве проб. Частота повторной детекции пептидов НЬА-ЭК ТИМАР была, в основном, ниже. Этого можно ожидать, так как для пептидов НЬА ΙΙ класса могут существовать несколько вариантов длин для каждой коровой последовательности.

- 30 023928

Повторная детекция пептидов ТИМАР в пробах КРР

Таблица 5

ТиМАР обнаружен повторно (+) или не образуен (-) масс-спектрометрическим анализом

' Класс I

Класс II

№

Проба КРР

Масса опухоли (г)

Место- нахожд. опухоли

Стадия опухоли

МЕТ- 001

С20- 001

ΤΟΡΒΙ- 001

ТОР- 001

ΝΟΧ- 001

ρεΝ- 001

оос- 001

ΟΟΝ- 001

мис- 001

СЕА- 004

СЕА- -006

ММР- 001

ТОР ΒΙ- 004

ССА062

9

Толстая кишка

I

п.а.

Не осуществимо

-

2

ССА740

4,0

Толстая кишка

11

+

4-

+

па.

п.а.

3

ССА165

10,8

Толстая кишка

ΙΪ

+

-

4

ССА712

1,2

Толстая кишка

111

+

4-

-

+

п.а.

5

ССА707

3,1

Толстая кишка

III

+

4-

+

п.а.

6

ССА718

3,4

Толстая кишка

III

-

4

+

4-

+

4-

+

п.а.

7

ССА739

3,4

Толстая кишка

111

-

ч-

+

4-

+

п.а.

8

ССА166

5,3

Толстая кишка

III

+

4-

+

4

4-

(+)

+

-

9

ССА734

18,1

Толстая кишка

IV

-

+

4-

+

4-

п.а.

10

ССА719

1,3

Толстая кишка

IV

-

+

п.а.

11

ССА725

2,7

Толстая кишка

[V

-

4

+

-

4-

+

п.а.

12

ССА164

5,0

Толстая кишка

IV

+

4-

+

-

4-

-

13

ССА167

5,2

Толстая кишка

?

п.а.

(+)

+

-

14

ССА056

1,8

Толстая кишка

9

п.а.

-

15

ССА305

4,0

Толстая кишка

7

П.а.

п.а.

-

20

ССА708

3,2

Толстая кишка метастаз

IV

-

+

4-

-

+

4-

16

ССА160

3,6

Прямая кишка

I!

4-

+

4-

(+)

4-

17

ССА754

3,6

Прямая кишка

11

-

+

4

-

+

п.а.

18

ССА170

4,6

Прямая кишка

III

п.а.

п,а.

п.а.

(+)

-

4-

19

ССА171

10,3

Прямая кишка

IV

п.а

п.а.

•

4’

21

ССА724

4,8

Прямая кишка

IV

+

-

4-

•

-

4-

Обнаружены в % проанализированных проб

33%

100%

87%

67%

80%

100%

-

33%

42%

33%

п.а. не проанализировано

4. Иммуногенность ш νίΙΐΌ для пептидов ^А910, презентируемых МНС I класса.

Для получения информации об иммуногенности пептидов, включенных в ГМА910 нами были проведены исследования с использованием хорошо известных методов стимуляции, уже описанных у (\Ма11ег, З., Неггдеп, И, Зскоог, О., 1ипд, О., ХУегпек Ό., ВиЬгшд, Н.1, Катте^ее, Н.О., апб Зйуапоую, З.; 2003, СиШпд ебде: ргебе1епптеб ηνίόίΐν оГ китам СИ8 Т се11х ехрапбеб оп саккга1еб МНС/апй-СИ28соа1еб ткгохркегех, ί. Iтшиηо1., 171, 4974-4978). Таким способом мы могли представить положительные данные по иммуногенности для 10 из 10 проанализированных пептидов, рестриктированных по НЬАА*0201 и содержащихся в вакцине ГМА910, демонстрируя, что эти пептиды являются Т-клеточными эпитопами, против которых у человека существуют СИ8+ Т-клетки-предшественники. Только один другой пептид НЬА I класса, содержащийся в ГМА910 (МИС-001), не мог быть проанализирован данным методом из-за относительно низкой аффинности к А*0201 данного пептида ТИМАР.

- 31 023928

Недавно полученные свидетельства ставят под сомнение пригодность СЕА-005 для противораковой вакцины. В недавнем всестороннем исследовании Дега, М., δί-μι/παπ;·!, Р., Κοιι^ΐΌ, Р., СиШаите, Р., δ«ιι^11ί, Е., Ссгню, К., Саггакка, М., ΉπΐΕ^, О., Рагтат, С., ΚίνοΕίπί, Ь.; Εον ТСК аскку апй 1аск ο£ ΙιιιηοΓ се11 ^есοдη^ι^οη ίη СЭ8(+) Т се118 рктей укк ΐке СЕА-апакдие САР1-6Э реркйе, Сапсег Iттиηοί Iттиηοίке^. 2007 Эес; 56(12): 1979-91) авторы впервые систематически охарактеризовали эффекторные функции СЕА-005-примированных Т-клеток против природной последовательности СЕА-004. Наблюдалось, что в многочисленных пробах крови пациентов с КРР и здоровых доноров прайминг Т-клеток с СЕА-005 достоверно способствует образованию низкоаффинных Т-клеток с недостатком способности по распознаванию клеток колоректального рака, экспрессирующих СЕА и презентирующих природную последовательность. Такое неэффективное низкоаффинное кросс-распознавание природных последовательностей может стать основной проблемой в курсах вакцинации с использованием измененных пептидных лигандов, как это было подтверждено недавно обнародованными похожими результатами для другого пептида СЕА и его измененных агонистов (АЫе8, Р.М., Ыайе, δ., РадегЬегд, Т., МкЫеНп, О., Вксагй, С., Βοиζοи^еηе, Н., Vи^ίίеит^е^, Н., Кгидег, Т., Ске1, ЕС., Ье-еу, Р., δре^8е^, О.Е., Сегокт, ЕС., Κοтего, Р.; Iттиηοдетс^ίу οΕ ΐке са^с^ηοетЬ^уοπ^с апкдеп йегкей рер11йе 694 ίη НЬА-А2 кеакку ^ηοΐΈ апй сοίο^есίаί сагспюта ракепК Сапсег Iттиηοί. Iттиηοΐке^., 2007, 56, 1795-1805). Кроме того, такие же результаты были обнародованы для природной последовательности хорошо известного меланомного антигена Ме1ап-А/МАКТ-1 и его агониста (Ό. δре^8е^. ре^8οηа1 сοттиη^саΐ^οη).

В общем, несмотря на обычно улучшенную иммуногенность измененных пептидов-агонистов, недавно полученные свидетельства заставляют предположить, что природные пептиды могут быть более привлекательными кандидатами для вакцины в связи с неэффективным кросс-распознаванием природной последовательности Т-клетками, простимулированными измененными агонистами. Это предполагает, что предпочтение должно отдаваться СЕА-004 (САР1), а не его агонистам, описанным в патенте ν09919478Ά1, таким как СЕА-005 (САР1-6О) или САР1-6П,7Е

Действительно, обширные данные демонстрируют значительную иммуногенность ίη νίνο самой природной последовательности СЕА-004. Среди раковых пациентов, но не здоровых доноров, в нескольких исследованиях наблюдались спонтанно индуцированные Т-клеточные ответы против этого пептида (№·^ο^η, Ό., КеЛкЕ, и., Κίνο1ΐίπί, Ь., δскт^ΐΐеί, А., йейск, А., А8ет188еп, А.М., Вегдег, С., Викг, Н.Е, Т1ке1„ Е., δске^ЬеηЬοдеη. С.; №кига1 Т-се11 ^е8рοη8е адакм МНС с1а88 I ер1Юре8 οΕ ерккеНа1 се11 айке8юп тοίесиίе, кег-2/пеи, апй са^с^ηοетЬ^уοπ^с апкдеп ίη раНеп18 укк ^кгек^ сапсег, Сапсег Ке8. 2000, 60, 4850-4854; ^екгаиск, М.К., Ап8еп, δ., кчЫеу^, Е., Се18еп, С., Х1а, Ζ., Аηйе^8οη. 1<.δ., Сгааеп, Е., δскт^йΐ, М., ^ккд, В., 0|ек1, V., \νο1Ε ί., Βοк1еη, Н., №к1ег, Ь.М.; Рка8е СП тотЬ^ей скетο^ттиηοίке^ару укк са^с^ηοетЬ^уοπ^с а^дем-йе^ей НЙА-А2-ге81г1с1ей САР-1 реркйе апй ^^^ηοΐесаπ, 5-Ε1иο^οи^ас^ί, апй Φικονοπη ίη ракеп18 укк рктагу теΐа8ίакс сοίο^есίаί сапсег, Скп Сапсег Ке8. 2005, 11, 5993-6001; ΒаЬаίζ, ί., Κ.ο11ΐ§, С., Εο^1, В., Рοίр^ескΐ, С., Нааск, М., Сийкег, Н., Кгокпе, С.Н., Ектпдег, С., δскт^ίζ, М., Βο^πкаи8е^, М.; Σηάπο^π ο£ секкаг 1ттипе ^е8рοη8е8 адакт са^с^ηοетЬ^уοη^с апкдеп ίη ракеп18 укк те1а81аНс ктюго акег νасс^ηакοη укк а11егей реркйе Ндапй-кайей йепйг111с се118, Сапсег ^титЕ Iттиηοίке^. 2006, 55, 268-276). Кроме того, способы вакцинации пациентов с КРР с использованием СЕА-004 или белка СЕА продемонстрировали эффективную стимуляцию Т-клеточных ответов против СЕА-004 (Т8апд, К.У., Ζа^етЬа. δ., №егойа, С.А., ΖΗη, МХ., НаткГОп, ЕМ., δск1οт, ί.; Сеηе^акοη ο£ китап суЮЮхю Т се118 8реакс кг китап са^с^ηοетк^уοη^с апкдеп ер1Юре8 Ггот ракеп18 кпти^ей νίΐΗ гесοтк^πаηΐ уиссхпри-СЕА гассте, ί. №к. Сапсег Σηδί. 1995, 87, 982-990; Μο^8е, М.А., Эепд, У., Сοίетаη, Ό., Ни11, δ., Ккгек-Рккег, Е., №пг, δ., δск1οт, ί., Кукаск, М.Е., Ьуег1у, Н.К.; А Рка8е I 81пйу ο£ аскге кттпюкегару укк са^с^ηοетЬ^уοη^с апкдеп реркйе (САР-1)-ри18ей, ;ιιΙο^οιι8 китап сикигей йепйг111с се118 ίη раНеп18 укк теΐа8ίакс такдпапае8 ехрге88шд са^с^ηοетк^уοη^с апкдеп, Скп Сапсег Ке8. 1999, 5, 13311338; ΖΗη, М^., Маг8ка11, ί., Ске, Ό., δск1οт, ί., Т8апд, К.У.; δрес^Г^с сук1укс Т-се11 ^е8рοη8е8 ΐο китап СЕА Ггот ра11еп18 кппи^ей νίΐΗ ^есοтк^ηаηΐ аν^рοx-СΕА хассте, Скп Сапсег Ке8. 2000, 6, 24-33; \УеС кгаиск, М.К., Ап8еп, δ., кгкеу^, Е., Се18еп, С., Х1а, Ζ., Аηйе^8οη, 1<.δ., Сгааеп, Е., δскт^йΐ, М., ^ккд, В., 0|ек1, ν.,\νο1Ε ί., Βοк1еη, Н., №-1й1ег, Ь.М.; Рка8е СП тотЬмей скетο^ттиηοΐке^ару укк са^с^ηοетк^уοηφ а^дем-йе^ей НЙА-А2-ге81г1с1ей САР-1 реркйе апй ^^^ηοΐесаη, 5-ί1иο^οи^ас^ί, апй Φικ:ο\Όπη ίη раНеп18 укк рктагу тейМакс сапсег, Скп Сапсег Ке8. 2005, 11, 5993-6001).

Прайминг ίη νίΐτο СЭ8+ Т-клеток.

Для проведения стимуляций ίη νίΐτο искусственных антигенпрезентирующих клеток (аАРС), нагруженных комплексом пептид-МНС (рМНС) и антителом анти-СО28, мы сначала изолировали МПК (моноциты периферической крови) из свежей лейкоцитарной пленки НЬА-А*02+ с использованием стандартной среды для градиентного разделения (РАА, Сοίке, Германия). Лейкоцитарные пленки были получены либо из банка крови г. Тюбинген, либо из госпиталя 1<акаппеп1ю8рНа1 г. Штутгарта. Изолированные МПК инкубировали в течение ночи для прайминга человеческого материала ίη νίΐτο в Тклеточной среде (ТСМ), состоящей из КРМЕС^атах (Iην^ΐ^οдеη, Каг18гике, Германия) с добавлением 10% инактивированной нагреванием человеческой сыворотки АВ (РАА, Сοίке, Германия), 100 и/мл пенициллина/100 мкг/мл стрептомицина (СатЬгех, Vе^ν^е^8, Бельгия), 1 мМ пирувата натрия (СС Рго, №и81айй Германия) и 20 мкг/мл гентамицина (СатЬгех). Лимфоциты СЭ8+ были изолированы с использова- 32 023928 нием СЭ8+ МΑСδ - оборудования для положительного отбора (МШепур Вегдксй О1айЪасй, Германия) в соответствии с указаниями производителя. Полученные СЭ8+ Т-клетки инкубировали до использования в ТСМ с добавлением 2,5 нг/мл ИЛ-7 (РготоСе11, Не1йе1Ъегд, Германия) и 10 и/мл ИЛ-2 (СЫтоп, Митсй, Германия). Получение покрытых гранул рМНС/анти-СЭ28, Т-клеточные стимуляции и считывание производили, как описывалось ранее (ТОа11ег, δ., Неггдеп, Ь., δΛοοτ, О., 1ипд, О., ТОегпе1, Ό., Вийгтд, Н.Е, Каттепкее, Н.О., апй δΐеνаηον^с, δ.; Сийшд ейде: ргейе1ептпей а\зййу οί йитап СЭ8 Т се11к ехрапйей оп сайЪга1ей МНС/ап11-СЭ28-соа1ей тюгокрйегек, ί. Iттиηο1., 2003, 171, 4974-4978) с минимальными модификациями. Вкратце, биотинилированные рекомбинантные молекулы НЬА-А*0201, в которых не хватает трансмембранного домена, и которые были биотинилированы на карбоксильном конце тяжелой цепи, были получены в соответствии с методом, описанным у (АЙтап, ΕΌ., Мокк, Р.А., Оои1йег, Р.Е, Вагоисй, Э.Н., Ηеуζе^-ТО^Шатк, М.О., Ве11, ЕЕ, МсМ1сйае1, А.Е, апй О-улк, М.М.; Рйепо1ур1с апа1ук1к οί апйдепкресШс Т 1утрйосу1ек, δ^ιτ^, 1996, 274, 94-96). Очищенный костимулированный мышиный ^О2а к антителам человека СЭ28 АЪ 9.3 (1ипд, О., ЬейЪейет, ЕА., апй Мийег-ЕЪегйагй, Н.Е; Шйисйоп οί суЮЮ.мсίΐν ш гекНпд йитап Т 1утрйосу1ек Ъоипй ΐο 1итог се11к Ъу апйЪойу йе1егосоп)ида1ек, Ргос. №ιΐ1. Асай. δω И5А 1987, 84, 4611-4615) был химически биотинилирован с использованием сульфо-Νгидроксисукцинимидобиотина, как рекомендуется изготовителем (РегЫо, Вопп, Германия).

Использованные гранулы были покрытыми стрептавидином полистироловыми частицами величиной 5, 60 мкм (Вапдк ЬаЪотаЫйек, Ийпо1к/США). рМНС, использованные в качестве положительных и отрицательных контролей, были А*0201/МЬА-001 (пептид Е^ΑОIОI^ΤV из модифицированного Ме1апА/МАКТ-1) и А*0201/ЭЭХ5-001 (УЪЬРАГУШ из ΌΌΧ5) или Α*0201/ΗВV-001 (Р^Ρδ^РРΡδV) соответственно.

800000 гранул/200 мкл были покрыты в 96-луночном планшете в присутствии 600 нг биотина антиСЭ28 и 200 нг релевантного биотин-рМНС (высокоплотные гранулы) или 2 нг релевантного и 200 нг нерелевантного (библиотека рМНС) МНС (низкоплотные гранулы). Стимуляции были инициированы в 96-луночных планшетах при коинкубации 1х10⁶ СЭ8+ Т-клеток с 2х10⁵ промытых покрытых гранул в 200 мкл ТСМ с добавлением 5 нг/мл ИЛ-12 (РготоСей) в течение 3-4 дней при 37°С. Половина среды была заменена на свежую ТСМ с добавлением 80 и/мл ИЛ-2, и инкубация была продолжена в течение 34 дней при 37°С. Данный цикл стимуляций проводили всего три раза. В заключение проводили тетрамерные анализы с флуоресцирующими тетрамерами МНС (полученными, как описывается у (А11тап, ΕΌ., Мокк, Р.А., Оои1йег, Р.Е, Вагоисй, Э.Н., Неу^ег-ТОПНатк, М.О., Ве11, ЕЕ, МсМ1сйае1, А.Е, апй □ахк, М.М.; Рйепо1ур1с апа1уык οί апйдеп-кресШс Т 1утрйосу1ек, δс^еηсе, 1996, 274, 94-96)) с антителом СЭ8ИТС клона δΙΗ (ВИ, Не1йе1Ъегд, Германия) на четырехцветном цитометре РΑСδСа1^Ъи^ (ВИ). Пептидспецифические клетки были подсчитаны как процентная доля всех СЭ8+ Т-клеток. Оценку тетрамерного анализа проводили с помощью программы РСδ Ехргекк (Эе Νονο δοΠ\γа^е). Прайминг ш νίΐτο специфических лимфоцитов тетрамерн+ С.Н8+ детектировался установкой подходящего гейта и при сравнении со стимуляциями негативного контроля. Иммуногенность для заданного антигена была детектирована, если было обнаружено, что по крайней мере в одной подлежащей оценке простимулированной ш νίΐτο лунке одного здорового донора содержалась специфическая С.Н8+ Т-клеточная линия после стимуляции ш νίΐτο (т.е. данная лунка содержала по крайней мере 1% специфического тетрамера+ среди СЭ8+ Т-клеток и процентная доля специфических клеток тетрамера+ была по крайней мере в 10 раз выше среднего значения стимуляций с негативным контролем).

Иммуногенность ш νίΐτο для 10 пептидов IМΑ910.

Для 10 из 10 проанализированных пептидов НЬА I класса, иммуногенность ш νίΐτο могла быть продемонстрирована генерированием пептид-специфических Т-клеточных линий.

Репрезентативное окрашивание, выявляющее образование Т-клеточных линий, специфических для NΟX-001 и ОЭС-001, представлено на фиг. 1. Результаты обобщены в табл. 6. Только один другой пептид НЬА I класса, содержащийся в IМΑ910 (МНС-001), не мог быть проанализирован данным методом из-за относительно низкой аффинности к А*0201 данного пептида ТНМАР, тем самым делая методологически невозможным проведение стимуляций ш νίΐτο с использованием мономеров рМНС.

- 33 023928

Таблица 6

Иммуногенность 10 пептидов НЬА I класса, включенных в 1МА910

Антиген	Положительные доноры/ проанализированные доноры	Положительные лунки/ проанализированные лунки
ΙΜΑ-ΗΒν-001	7/16 (44%)	10/107(9%)
1МА-ТСГВ1-001	3/4 (75%)	4/22 (18%)
ΙΜΑ-ΗΟΧ-001	3/5 (60%)	9/60 (15%)
1МА-РСН-001	3/4 (75%)	4/42 (10%)
ΙΜΑ-ΤΟΡ-001	2/5 (40%)	7/72 (10%)
1МА-С20-001	1/5 (20%)	1/60 (2%)
1МА-ООС-001	1/5 (20%)	1/60 (2%)
ΙΜΑ-ΗΒν-001	2/5 (40%)	10/54 (19%)
1МА-СЕА-004	4/4 (100%)	50/60 (83%)
1МА-СС^001	5/5 (100%)	42/54 (78%)
ΙΜΑ-ΜΕΤ-001	4/6 (67%)	30/72 (42%)

Здесь обобщены результаты экспериментов по иммуногенности ш У1(го, проведенных фирмой 1ттабск для 10 из 11 пептидов НЬА I класса, включенных в вакцину 1МА910. Приводимые результаты были получены при стимуляции клеток СЭ8+ высокоплотными гранулами. Так как различные партии человеческой сыворотки могут сильно влиять на результаты по иммуногенности, то вместе оценивались только те анализы, в которых была использована одна и та же партия сыворотки.

1МА-СЕА-004 премированные ш νί(ΐΌ Т-клетки.

из 6 доноров подлежали оценке. У всех четырех доноров мы могли успешно продемонстрировать индукцию СЕА-004-направленного Т-клеточного ответа ш \бго при стимуляции СЕА-004 (см. Таблицу и Фигуру). Таким образом, было подтверждено, что пептид СЕА-004 является сильным индуцирующим фактором человеческих СЭ8+ Т-клеточных ответов ш νί(ΐΌ. Особенно важно, что СЕА-004 был достоверно способен вызывать более высокую частотность СЕА-004-специфических Т-клеточных ответов в сравнении с СЕА-005 (83% лунок в сравнении с 64% лунок, см. табл. 4). Частотности СЕА-004специфических клеток внутри отдельных положительных лунок были также выше после прайминга СЕА-004 в сравнении с праймингом СЕА-005 (см. фиг. 5).

Пептид-специфический СЭ8+ Т-клеточный ответ ш νί(ΐΌ 4 здоровых доноров НЬА-А*02, определенный проточным цитометрическим анализом.

СЭ8+ Т-клетки примировали искусственными антигенпрезентирующими клетками с СЕА-004, СЕА-005 или нерелевантным пептидом (1МА-К86-001) соответственно. После трех циклов стимуляции детекция пептид-реактивных клеток производилась двойным окрашиванием тетрамерами СЕА-004 плюс СЕА-005 (табл. 7А) и СЕА-004 плюс нерелевантный А*0201-тетрамер (табл. 7В). Числа, указанные в таблице, представляют собой процентные доли лунок, содержащих СЕА-004+ или СЕА-005+ ЦТЛ. Номер партии человеческой сыворотки, использованной во всех экспериментах, С02104-0167.

Таблица 7А

Таблица 7В

Антигенный стимул	Лунки с клетками СЕА-004+ тетрамер+
СЕА-004	50/60 (83%)
СЕА-005	46/72 (64%)

СЭ8+ Т-клетки изолировали из МПК, примировали ш νί(ΐΌ искусственными антигенпрезентирующими клетками с СЕА-004, К86-001 или пептидом ΌΌΧ5-001 соответственно. После трех циклов стимуляции детекция пептид-реактивных клеток производилась окрашиванием СЕА-004- и нерелевантным А*0201-тетрамерами. Значения, указанные выше, представляют собой процентные доли СЕА-004- специфических клеток каждой простимулированной лунки. Стимуляции К86-001 и ΌΌΧ5-001 служили в

- 34 023928 качестве негативных контролей. На фиг. 5 представлены частотности СЕА-004-специфических СЭ8+ Тклеток у 4 НБА-А2 здоровых доноров после стимуляции ίη νίΙΐΌ с СЕА-005, как было определено проточным цитометрическим анализом. Пороговые значения для положительных лунок указаны для каждого донора отдельно (-) и были дефинированы как 10-кратное среднее значение отрицательных контролей и по крайней мере 1%. Лунки с процентной долей свыше порогового значения (>1%) рассматривались как положительные, и они представлены розовыми ромбами, в то время как отрицательные лунки представлены черными ромбами.

5. Иммуногенность ίη νίίΐΌ для пептидов ΙΜΑ910, презентируемых МНС II класса.

Хелперные Т-клетки играют важную роль в содействии ЦТЛ при активации и поддержке иммунных ответов против опухолевых клеток. Поэтому пептиды МНС II класса были включены в вакцину ΙΜΑ910. ТСРВ1-004, один из трех пептидов II класса, содержащийся в ГМА910, был проверен на его иммуногенный потенциал ίη νίΐΐΌ и подтвержден в качестве индуцирующего фактора как для специфических СИ4 +, так и СИ8+ Т-клеток. Генерация СИ4 + и функциональных СИ8+ Т-лимфоцитов показана в экспериментах с использованием стимуляций, проведенных в аутологичной системе.

Принципы теста.

Прайминг и экспансия специфических человеческих СИ4 + и СИ8+ клеток были проанализированы ίη νίΐΐΌ посредством прайминга МПК с пониженным содержанием моноцитов аутологичными ИС и повторной стимуляции аутологичными МПК. Вкратце, чтобы генерировать антигенспецифические СИ4+ Т-клетки, МПК с пониженным содержанием моноцитов одного здорового донора (НЬА-генотип класса I: А1/А25/В8/В18 и класса II: ΌΟΒ1*02/ΌΟΒ1*06/ΌΚΒ1*03/ϋΚΒ1*15/ϋΚΒ3/ΌΚΒ5) были простимулированы с использованием аутологичных дендритных клеток с введенным импульсным методом пептидом и рестимулированы аутологичными МПК с пептидом. В качестве системы считывания выработку ΓΡΝγ при кратковременной рестимуляции анализировали по методике ЕЫ8РОТ и проточной цитометрии. Тклетки были проанализированы после восьми стимуляций по методике ЕЫ8РОТ и внутриклеточным окрашиванием ΓΡΝ-γ плюс СО4-РГТС и СИ8-РегСР для определения процентного выражения ΓΕΝγвырабатывающих клеток в специфических Т-клеточных субпопуляциях. В этом эксперименте клетки, простимулированные пептидом ΤСΡΒI-004 из различных лунок, были объединены и инкубировались с нерелевантным пептидом для считывания и выступали в качестве негативных контролей.

Получение дендритных клеток (ДК).

Человеческие дендритные клетки были получены из моноцитов, культивированных в среде ДК, состоящей из КРΜI 1640-С1и!атах/25 тМ Нерек ОпуЦгодеп. Германия) с добавлением 10% аутологичной плазмы//100 и/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина. Сначала были получены лейкоцитарные пленки и плазма при центрифугировании крови здорового донора (Банк крови г. Тюбинген). МПК были изолированы из лейкоцитарной пленки стандартным градиентным разделением (ЬутрНосу1е 8ерагайои Мебшт, РАА, Австрия) и ресуспендировались в среде ДК для определения общего числа клеток. 100-120 млн. МПК были промыты, ресуспендированы в 15 мл среды Х-УАо 20 (ШоХУНШакег, Бельгия) и перенесены в колбу с клеточной культурой. После 2 ч при 37°С удаляли среду, содержащую лейкоциты периферической крови (ЛПК), адгезивные моноциты промывали дважды 10 мл РΒ§ и культивировали 6 дней в 10 мл среды ДК с 100 нг/сл ГМ-КСФ и 30 нг/мл ИЛ-4 ОттипоТооК Германия) или 20 нг/мл (К&И кук1етк, Германия). На 3-й и 5-й день добавляли 100 нг/мл ГМ-КСФ и 30 нг/мл ИЛ-4 ОттипоЮоК) или 20 нг/мл ИЛ-4 (К&И §ук1етк, Германия). На 7-й день незрелые ДК активировали 10 нг/мл ΊΉΡ-α (К&И §ук1етк, Германия) и 20 мкг/мл ро1у ^С) (§1дта АИпсН, Германия) или 100 нг/мл ЬР§ на 24 ч. Оставшиеся МПК и полученные ЛПК аликвотировали и замораживали.

Прайминг ίη νίΙΐΌ специфических Т-клеток.

Для получения СИ4+ Т-клеток 3 млн. МПК/ЛПК были простимулированы 2х10⁵ аутологичными ДК. ДК были собраны на 8-й день (см. раздел 3.1, Получение дендритных клеток (ДК)). В этих целях использовался РΒδ с 5 мМ ЕИТА, чтобы набрать как можно больше клеток (включая адгезивные клетки). После промывки средой ДК определяли число клеток. Для погрузки пептида ДК ресуспендировали в 1 мл среды ДК и инкубировали с 25 мкг/мл пептида в течение 2 ч при 37°С. Пептидами, использованными для введения импульсным способом в ДК, были ΤСΡΒI-004, Рокт1х (смесь пептидов, относящихся к ЕΒV и СМУ), Рабге и СМУ. Аутологичные МПК/ЛПК размораживали, промывали средой ДК (по меньшей мере, дважды) и высеивали в 24-луночный планшет с плотностью 3 млн. клеток/мл в 1 мл. Затем добавляли ДК с введенным пептидом (как 1 мл суспензии, содержащей пептид) в высеянные МПК/ЛПК и инкубировали в течение 7 дней при 37°С. После прайминга полученные ЦТЛ сначала рестимулировали криоконсервированными аутологичными МПК, нагруженными пептидом, которые были облучены (30 Су; Саттасе11 1000 ЕШе, Шгбюм Iηΐетаΐ^оηа1, Канада). В этих целях добавляли 5х10⁵ ЦТЛ и 2,5х10⁶МПК на лунку. Введение импульсным методом пептида в МПК было проведено, как упоминалось ранее (для ДК). На первый день после первой стимуляции добавляли ИЛ-2 (К&И §ук1етк, Германия) и ИЛ-7 до окончательной концентрации 2 нг/мл и 5 нг/мл соответственно. После этого на каждый 2-й и каждый 7-й день в среду добавляли ИЛ-2 и ИЛ-7. Вторую рестимуляцию проводили 7 дней спустя, но на этот раз пептид добавлялся в культивируемые ЦТЛ отдельно (без МПК). Рестимуляции проводили каждые 7 дней

- 35 023928 с нагруженными пептидом МПК и пептидом отдельно, добавляемом альтернативно. Анализы проводили после восьмой стимуляции с помощью внутриклеточного окрашивания ΞΕΝ-γ и методики ΞΕΝ-γ ЕЫ8РОТ.

Результаты.

Было возможно примировать СЭ4 + Т-клеточные линии, специфически реагирующие на интересующий пептид (фиг. 2 и 3). Т-клеточные ответы могли быть детектированы с помощью методики ЕЫ8РОТ в 2 из 4 Т-клеточных линий, тогда как в 3 из 4 Т-клеточных линиях ТСΕВI-004-специфические ΖΕΝγ-вырабатывающие СЭ4+ и/или СЭ8+ клетки были установлены с помощью Ю8.

Таким образом, ТСΕВI-004 был способен вызывать СЭ4+ и СЭ8+ Т-клеточные ответы у одного донора, подвергнутого анализу по описанной выше экспериментальной системе. В соответствии с этим многообещающим результатом данный пептид, скорее всего, является иммуногенным и имеет потенциал для индуцирования Т-клеточных ответов.

6. Функциональное подтверждение на примере NОX-001 и ТСΕВI-001.

Иммуногенность пептидов, включенных в вакцину IΜА910, была продемонстрирована ш у1Хго при использовании методики валидации для пептидов ТИМАР фирмы 1ттаХ1с8. Индукция специфических Т-клеток является индикатором способности пептидов успешно активировать иммунную систему. Так как получение эффективного противоопухолевого иммунного ответа возможно только в том случае, если активированные Т-клетки имеют высокую авидность и функциональность, то мы исследовали далее ТИМАР8 в целях прайминга высокоавидных, функциональных Т-лимфоцитов с их способностью вырабатывать ΖΕΝγ или убивать опухолевые клеточные линии. Два пептида, NОX-001 и ТСΕВI-001, были выбраны для более тщательной валидации из-за их способности индуцировать высокоавидные ЦТЛ ш у1Хго. Нам удалось доказать, что у человека существуют высокоавидные Т-клетки-предшественники, направленные против обоих пептидов, и что с помощью NОX-001 могут быть генерированы функциональные СЭ8+ Т-клеточные линии.

Принципы теста.

Чтобы глубже проникнуть в сущность иммуногенности пептидов [МА910 и свойства специфических Т-клеток, два пептида, NОX-001 и ТСΕВI-001, были выбраны для дальнейшей оценки. Эксперименты для этих целей проводились на фирме ИттайсБ (сортировку клеток проводили в Университете г. Тюбинген, лаб. Иг. Вийгшд).

В зависимости от их способности активироваться антигеном высокой или низкой плотности Тклеточные линии могут быть разделены на высоко- или низкоавидные. Как было продемонстрировано ранее ^а1Хег, 8., Неггдеп, Ь., 8сйоог, О., Лтд, С., Vе^ηеХ. Ό., Вийгшд, Н.Р, Каттеп8ее, Н.С., апб 8ХеуапоУ1с, 8.; СиХйпд ебде: ргебеХегтшеб ау1бйу оГ йитап СЭ8 Т се118 ехрапбеб оп сайЪгаХеб МНС/апХ1-СЭ28соаХеб Ш1сго8рйеге8, I Iттиио1., 2003, 171, 4974-4978), человеческие высокоавидные ЦТЛ могут быть успешно индуцированы, если для активации использовать меньше пептида, чем для низкоавидных СЭ8+ Т-клеток. Также было продемонстрировано, что обогащенные таким способом клетки являются более эффективными для распознавания экспрессирующих антиген клеточных линий опухоли, тем самым представляя собой, возможно, важнейший инструмент в разработке терапевтических стратегий.

Чтобы можно было определить способность пептидов к генерации высокоавидных линий ЦТЛ, изолированные человеческие клетки СЭ8+ примировали и обогащали посредством повторяемых стимуляций ш уйго гранулами, покрытыми низкоплотным рМНС (комплекс пептид-МНС) и антителом антиСЭ28 в присутствии ИЛ-12 и ИЛ-2. После трех стимуляций фракция примированных ш уйго Т-клеток была окрашена рМНС-тетрамером и обнаружена цитометрическим анализом. Тетрамер-положительные клетки каждого донора были, затем, объединены в соответствии с антигенной специфичностью, окрашены рМНС-тетрамером и человеческим антителом анти-СО8-ПТС и, в заключение, подвергнуты сортировке РАС8 на сортере РАС8Апа. Отсортированные клетки культивировали и обогащали в присутствии облученных питающих клеток, цитокинов и митогена. В качестве рамки считывания для генерирования примированных высокоавидных антиген-специфических клеток проводили окрашивание рМНСтетрамером. Для определения их функциональности проводили анализ выработки ΖΗΝ-γ по методике ЕЫ8РОТ и исследовали уничтожение опухолевых клеточных линий с использованием цитотоксического анализа, основанного на живом/мертвом окрашивании после рестимуляции клеток соответствующим пептидом и опухолевыми клеточными линиями.

Получение специфических СЭ8+ Т-клеточных линий.

Стимуляции ш уйго с использованием искусственных антигенпрезентирующих клеток (аАРС), нагруженных комплексом пептид-МНС (рМНС) и антителом анти-СО28, проводили, как было подробно описано выше. Единственным отличием от описанного метода был тот факт, что стимуляции проводили с гранулами, нагруженными 2 нг релевантного и 200 нг нерелевантного (рМНС) МНС из библиотеки (низкоплотные гранулы) вместо 200 нг релевантного МНС (высокоплотные гранулы). Таким образом, были получены высокоавидные Т-клетки для более детальной валидации пептидов. После трех стимуляций фракция примированных ш уйго Т -клеток была окрашена рМНС-тетрамером и обнаружена цитометрическим анализом. Иммуногенность для заданного антигена была детектирована, если было обнаруже- 36 023928 но, что по крайней мере в одной подлежащей оценке простимулированной ш укго лунке одного здорового донора содержалась специфическая СО8+ Т-клеточная линия после стимуляции ш У1!го (т.е. данная лунка содержала по крайней мере 1% специфического тетрамера+ среди СЭ8+ Т-клеток и процентная доля специфических клеток тетрамера+ была по крайней мере в 10 раз выше среднего значения стимуляций с негативным контролем). Тетрамер-положительные клетки каждого донора были, затем, объединены в соответствии с антигенной специфичностью, окрашены соответствующим рМНС-тетрамером и человеческим антителом анти-СЭ8-Р1ТС, клон 8К1, и, в заключение, подвергнуты сортировке РАС8 на сортере РАС8Апа (ВЭ Вюктепсек, Германия). Отсортированные клетки культивировали в Т-клеточной среде (КРМI-О1иίашаx с добавлением 10% инактивированной нагреванием человеческой сыворотки АВ, 100 и/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина, 1 мМ пирувата натрия и 20 мкг/мл гентамицина) в присутствии 5х10⁵ клеток/мл облученных свежих аллогенных М11К, 5х10⁴ клеток/мл облученных клеток ЬО2-ЕВУ, 150 и/мл 1Ь-2 (СЫгоп, МиЫск, Германия) и 0,5 мкг/мл РНА-Ь (Коске ЭГадпоккск, Маппке^ш. Германия). Экспансия данных клеток происходила в Т-клеточной среде, содержащей 150 и/мл ИЛ-2. В качестве рамки считывания для генерирования примированных высокоавидных антиген-специфических клеток проводили окрашивание рМНС-тетрамером, как было описано выше, и анализировали на четырехцветном цитометре РАС8СакЬиг (ВЭ Вюктепсек, Германия).

Проверка функциональности.

Для определения их функциональности проводили анализ выработки ΙΡΝγ по методике ЕЫ8РОТ (ΙΡΝ-γ ЕЫ8РОТ 8е!, ВЭ, Германия) после рестимуляции клеток соответствующим пептидом. Кроме того, опосредованную клетками цитотоксичность специфических ЦТЛ исследовали на примере уничтожения опухолевых клеточных линий с использованием оборудования для определения опосредованной клетками цитотоксичности иУЕ/ПЕАЭ се11-шеб^а!еб су!о!охюку Кк (Ь7010, [пуНгодеи Германия). Оба анализа проводились в соответствии с указаниями производителей, если не указано иное.

Результаты.

Оба пептида, NОX-001 и ТОРВ1-001, обладали иммуногенностью ш укго, как показано на примере успешного прайминга низкоплотным рМНС АПК. Как для NОX-001, так и для ТОРВ1-001 могли быть установлены специфические Т-клеточные линии методом РАС8, тем самым демонстрируя, что высокоавидные СЭ8+ Т-клеточные предшественники имеются у здоровых доноров.

Кроме того, для NОX-001 могла быть установлена одна Т-клеточная линия, которая также была подтверждена как функциональная методом ЕЫ8РОТ, так как она специфически экспрессировала ΙΡΝ-γ после рестимуляции этим пептидом (фиг. 4).

7. Связывание пептидов по изобретению, рестриктированных по НЬА класса I, с N^А-А*0201.

Целью данного анализа была оценка аффинности пептидов НЬА класса I по отношению к молекуле МКС, закодированной аллелем НЬА-А*0201, так как это является важным параметром для способа действия IМА910. Степень аффинности к НЬА-А*0201 была высокой для 9 из 10 пептидов в IМА910, рестриктированных по НЬА класса I, константы диссоциации (КО) находились в диапазоне от 0,001 до 0,2 нМ. Также и пептид вирусного маркера ГМА-НВУ-001 проявил сильное связывание. Аффинность для ГМА-МиС-001 была приблизительно на фактор 10² слабее. Данные результаты подтверждают сильную аффинность связывания 9 из 10 пептидов НЬА класса I из вакцины-кандидата ГМА910 к молекулам МНС.

Принципы теста.

Стабильные комплексы НЬА/пептид состоят из трех молекул: тяжелой цепи НЬА, бета-2 микроглобулина (Ь2ш) и пептидного лиганда. Активность денатурированных рекомбинантных молекул НЬАА*0201 с тяжелой цепью сама по себе может быть сохранена, делая их функциональными эквивалентами пустых молекул НЬА-А*0201. Если они растворены в водном буфере, содержащем Ь2ш и подходящий пептид, то данные молекулы быстро и эффективно сворачиваются в полной зависимости от пептида. Наличие данных молекул использовалось в анализе, основанном на методике ЕЫ8А, для измерения аффинности взаимодействия между пептидом и молекулой НЬА класса I (8у1уек!ег-Ну1б е! а1., 2002).

Очищенные рекомбинантные молекулы НЬА-А*0201 инкубировали вместе с Ь2ш и ступенчатыми дозами интересующего пептида.

Количество новообразовавшихся комплексов НЬА/пептид определялось количественным методом ЕЫ8А. Константы диссоциации (значения КО) вычислялись с использованием стандартной калибровочной кривой, записанной с титров комплекса калибровки НЬА/пептид.

Результаты.

Результаты представлены на фиг. 6. Более низкое значение КО отражает более высокую аффинность к НЬА-А*0201. Большинство из пептидов ГМА910 и вирусный контрольный пептид ГМА-НВУ-001 имели похожие и сильные аффинности к НЬА-А*0201 в диапазоне от 0,001 (IМА-ТОΡВI-001) до 0,2 нМ ДМА-ООС-001). Аффинность IМА-МυС-001 была на фактор 10² до 10³ ниже по сравнению с большинством включенных пептидов. Однако вакцинация ГМА-МиС-001 приводила к иммунным ответам у пациентов с почечно-клеточной карциномой в проведенном ранее фирмой кптакск клиническом исследовании, таким образом, низкая аффинность связывания ГМА-МυС-001 не дает повода для беспокойства.

- 37 023928

Перечень последовательностей <110> ИММАТИКС БАЙОТЕКНОЛОДЖИЗ ГМБХ <120> КОМПОЗИЦИЯ ОПУХОЛЕАССОЦИИРОВАННЫХ ПЕПТИДОВ И ОТНОСЯЩАЯСЯ К НИМ ПРОТИВОРАКОВАЯ ВАКЦИНА <130> 131238РСТ <160> 11 <170> РаЬепЫп уегз!оп 3.5 <210> 1 <211> 9 <212> РКТ <213> Ното зараепз <400> 1

А1а Ьеи ТЬг ТЬг Ьеи МеЬ Низ Οίη Ьеи 1 5 <210> 2 <211? 9 <212 > РКТ <213> Пото зарЬепз <400> 2

РЬе Ьеи Туг Ьуз Уа1 Не Ьеи 8ег Ьеи 1 5 <210> 3 <211> 9 <212> РКТ <213> Ното зарЬепз <400> 3

А1а 11е 11е Азр С1у Уа1 С1и Зег Уа1 1 5 <210> 4 <211> 9 <212> РКТ <213> Ното зариепз <400> 4

РЬе Ьеи Ьеи Рго Азр ТЬг Азр С1у Ьеи 1 5 <210> 5 <211> 9 <212> РКТ <213> Ното зарЬепз

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Пептид, включающий последовательность 8ЕЦ ГО N0: 8 (8РОУ8^К1ИС1РООНТ). который индуцирует Т-клеточную перекрестную реакцию с указанным пептидом, где указанный пептид или его вариант имеет общую длину между 16 и 100 аминокислотами.
2. Пептид по п.1, где указанный пептид или его вариант имеет общую длину между 16 и 30 аминокислотами.
3. Пептид по п.1 или 2, имеющий способность связываться с молекулой главного комплекса гистосовместимости человека (МНС) класса II.
4. Пептид по любому из пп.1-3, где пептид состоит из аминокислотной последовательности в соответствии с 8ЕЦ ГО N0: 8.
5. Пептид по любому из пп.1-4, где указанный пептид включает непептидные связи.

- 39 023928
6. Пептид по любому из пп.1-5, где пептид является частью слитого белка, содержащего Νтерминальные аминокислоты антиген-ассоциированной инвариантной цепи (К) НЬА-ЭК.
7. Нуклеиновая кислота, кодирующая пептид в соответствии с любым из пп.1-6.
8. Нуклеиновая кислота по п.7, которая представляет собой ДНК, кДНК, ПНК, ЦНК, РНК или их комбинации или вектор экспрессии, где данный вектор функционально связан с данной нуклеиновой кислотой.
9. Клетка-хозяин, включающая нуклеиновую кислоту или вектор экспрессии в соответствии с п.7 или 8, которая является антигенпрезентирующей клеткой, в частности дендритной клеткой или антигенпрезентирующей клеткой, где указанная клетка представляет собой нечеловеческую эмбриональную стволовую клетку.
10. Способ получения активированных цитотоксических Т-лимфоцитов (ЦТЛ) ш уйго. включающий контактирование ЦТЛ ш νίΙΐΌ с нагруженными антигеном молекулами человека МНС I или II класса, экспрессированными на поверхности подходящей антигенпрезентирующей клетки на период времени, достаточный для активации указанных ЦТЛ антиген-специфическим образом, где указанный антиген является пептидом в соответствии с любым из пп.1-6.
11. Активированный цитотоксический Т-лимфоцит (ЦТЛ), полученный с помощью способа в соответствии с п.10, который селективно распознает клетку, которая аберрантно экспрессирует полипептид, включающий аминокислотную последовательность, данную в любом из пп.1-4.
12. Применение пептида в соответствии с любым из пп.1-6, нуклеиновой кислоты или вектора экспрессии в соответствии с п.7 или 8, клетки в соответствии с п.9 или активированного цитотоксического Т-лимфоцита в соответствии с п.11 в качестве лекарственного средства для лечения рака.
13. Применение по п.12, где рак представляет собой глиобластому, колоректальный рак, рак поджелудочной железы, рак легкого, рак почки или рак желудка.
14. Применение по п.12 или 13, где указанное лекарственное средство является вакциной.