KR101167392B1

KR101167392B1 - 종양 관련 펩티드의 조성물 및 관련된 항암 백신

Info

Publication number: KR101167392B1
Application number: KR1020107001771A
Authority: KR
Inventors: 하르프레트 싱; 올리버 슈어; 클라우디아 트라우트바인; 노르베르트 힐프; 토니 바인쉔크; 스테펜 발터; 페터 레반드로브스키
Original assignee: 이매틱스 바이오테크놀로지스 게엠베하
Priority date: 2007-07-27
Filing date: 2008-07-25
Publication date: 2012-07-19
Also published as: CA2694771A1; EA023928B1; AU2008281013B2; PT2567707T; CN101765434A; AU2008281013A2; DK2567707T3; US7994276B2; EP2567707B1; US20090148400A1; EP2178557A1; NZ582823A; CN101765434B; AU2008281013A1; EA018457B1; EP2178557B1; EA201000208A1; CN103360466B; EA201300322A1; LT2567707T

Abstract

본 발명은 면역요법 펩티드, 및 면역요법, 특히 암 면역요법에서의 이의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 단독으로 또는 다른 종양 관련 펩티드와 함께 항종양 면역 반응을 자극하는 백신 조성의 약학적인 활성 성분의 역할을 하는 종양 관련 T-조력 세포 펩티드 에피톱을 개시한다. 특히, 본 발명의 펩티드의 조성물은 대장암(colorectal cancer)에 대한 항종양 면역 반응을 도출하는 백신 조성물에 사용될 수 있다.

Description

종양 관련 펩티드의 조성물 및 관련된 항암 백신{COMPOSITION OF TUMOUR-ASSOCIATED PEPTIDES AND RELATED ANTI-CANCER VACCINE}

본 발명의 목적을 위해, 본원에 인용된 모든 참고문헌은 이의 전체내용이 참고로서 혼입되어 있다.

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대장 암종

미국 암 학회에 따르면 대장암(CRC)은 미국에서 세 번째로 가장 일반적인 암이며, 매년 175,000명 초과의 새로운 환자를 괴롭힌다. 미국, 일본, 프랑스, 독일, 이탈리아, 스페인, 영국에서는 480,000명 초과의 환자를 괴롭힌다. 이것은 선진국의 암 사망률 중 가장 흔한 원인 중 하나이다.

연구 결과는 대장암의 발병이 선천적 인자와 환경적 인자의 상호 작용의 결과임을 시사한다. 대부분의 경우 선종성 용종이 대장 종양의 전조로 나타나지만, 전이는 수년이 걸릴 수 있다. 대장암의 주요 위험 인자는 연령이며, 진단된 경우의 90%가 50세 이상의 연령이다. 미국 암 학회에 따르면 대장암의 다른 위험 인자는 음주, 지방/붉은 고기가 높은 식이요법이나 과일과 야채의 섭취 부족이 있다. 특히 일본과 같은 지역에서의 발병률이 계속 올라가는 것은 지방과 고기의 섭취가 많고 섬유질 섭취가 적은 서구화된 식단을 채택한 것에 기인할 수 있다. 그러나, 발생률은 이전만큼 빨리 올라가지 않으며, 그 이유는 용종이 암으로 발전하는 것을 막는 검진과 제거 때문일 수 있다.

대부분의 단단한 종양과 마찬가지로, 1차 치료 방법은 수술이나, 환자들의 상당한 비율의 질병이 진행된 단계에서 진단을 받는 것에 비해, 그 혜택은 초기 단계의 환자에게 국한되어 있다. 플루오로우라실-기초 양생법을 기반으로 하는 진행된 대장암의 화학요법 양생법이 표준 치료법이다. 이 양생법의 대부분은 소위 말하는 폴폭스(FOLFOX)(주입 5-FU/류코보린 + 옥살리플라틴)와 폴피리(FOLFIRI)(이리노테칸, 류코보린, 볼루스 및 지속 주입 5-FU) 프로토콜이다.

이리노테칸과 옥살리플라틴 같은 제 3 세대 세포독성제(cytotoxics)의 도입은 효능을 크게 개선시킬 수 있는 희망을 제기했지만, 예후는 아직도 열등하며, 생존율은 일반적으로 전이성 질환에서는 약 20개월이며 그 결과로 상기 질환에서 충족되지 않은 요구는 높게 남아있다.

최근에 새로운 세대의 약물로서, 아바스틴(베바시주맙)과 얼비툭스(세툭시맙) 같은 분자 표적 약품이 사용가능하게 되었고, 대장암의 상이한 단계를 위한 약 40개의 화합물이 임상 개발 후기 단계에 있다. 이런 화합물의 여러 가지 조합은 미래에 가능성이 있는 치료 옵션의 수를 증가시킨다. 물질의 대부분은 상 2이고, EGFR은 대장암을 위해 개발되고 있는 다른 어떤 약물보다 이러한 화합물로 처리되는데, 이는 대장암 환자들의 약 80%에서 EGFR 발현이 상향조절(upregulating)된다는 점 때문이다.

현재 2기 환자들에게는 화학요법과 최근 승인된 단클론 항체(mAbs)(세툭시맙 + 이리노테칸 또는 폴폭스4; 단일 약품으로 또는 폴폭스4와 함께 쓰이는 베바시주맙)을 결합한 임상 실험을 실시하고 있다. 이 실험에서 통계적으로 유의한 결과를 얻으려면 3 내지 4년의 관찰 기간이 예상된다.

현재 종양학에서 쓰이는 단클론 항체(mAbs)는 일반적으로 활성 면역요법을 방해하지 않을 우수한 가능성이 있다. 사실, (베바시주맙에 의한) VEGF의 고갈이 T 세포의 DC 매개 활성에 긍정적으로 기여한다는 임상 전 증거가 있다.

현재 CRC 치료를 위한 새로운 면역요법적인 접근으로서 안전성과 가능성을 시험하는 약 16개의 실험이 있다.

치료를 위한 면역요법적인 접근

면역 반응 자극은 숙주 면역 시스템에 의해 이물질로서 인식되는 항원의 존재에 의존한다. 종양 관련된 항원의 발견은 숙주 면역 시스템을 사용하여 종양 성장을 방해하도록 쓰이는 가능성을 제기한다. 면역 시스템의 채액 및 세포 암(arm)둘 다를 이용하는 다양한 기전은 현재 암 면역요법을 위해 탐구된다.

세포 면역 반응의 특정 요소는 종양 세포를 구체적으로 인식하고 파괴할 수 있는 능력이 있다. 종양 침투 세포 집단 또는 말초 혈액으로부터의 세포독성 T 세포(CTL)의 단리는, 그러한 세포들이 암에 대한 자연 면역 방어에서 중요한 역할을 한다는 것을 시사한다(문헌[Cheever et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 1993 690: 101-112; Zeh HJ, Perry-Lalley D, Dudley ME, Rosenberg SA, Yang JC; J Immunol. 1999, 162(2):989-94]; 2개의 자기 항원의 높은 결합성 CTL은 우수한 생체내 및 생체외의 항종양 효능을 나타낸다). 특히, 시토졸에 있는 단백질 또는 결함 리보솜 생성물(DRIPS)로부터 유도된 통상적으로 8 내지 10개의 잔기로 이루어진 주요 조직 적합성 복합체(MHC)의 클래스 I 분자를 인식하는 CD8-양성 T 세포(TCD8⁺)(문헌[Schubert U, Anton LC, Gibbs J, Norbury CC, Yewdell JW, Bennink JR.; Rapid degradation of a large fraction of newly synthesized proteins by proteasomes; Nature 2000; 404(6779):770-774])는 상기 반응에서 중요한 역할을 한다. 인간의 MHC-분자는 인간 백혈구 항원(HLA)으로도 지칭된다.

MHC-분자에는 2개의 클래스가 있다: MHC 클래스 I 분자는 내인성 단백질 DRIPS의 단백질 가수 분해 분열로부터 생성된 펩티드 및 보다 큰 펩티드를 제공하는 핵을 갖는 대부분의 세포에서 찾을 수 있다. MHC 클래스 II 분자는 전문적인 항원 제공 세포(APC)에서 주로 찾을 수 있고, 세포내이입(endocytosis) 동안 APC에 의해 흡수되는 외인성 단백질의 펩티드를 제공하고, 이어서 처리된다. 펩티드와 MHC 클래스 I 분자의 복합체는 적당한 TCR을 함유한 CD8-양성 세포독성 T-임파구에 의해 인식되고, 펩티드와 MHC 클래스 II 분자의 복합체는 적당한 TCR을 함유한 CD4-양성 조력-T-세포에 의해 인식된다.

CD4-양성 조력 T-세포는 항종양 T-세포 반응의 효과기 기능을 조정하는데 중요한 역할을 하고, 이 때문에, 종양 관련된 항원(TAA)에서 유도된 CD4-양성 조력 T-세포의 식별이 항종양 면역 반응을 유발하는 약학 제품 개발에 매우 중요할 수 있다(문헌[Kobayashi, H., R. Omiya, M. Ruiz, E. Huarte, P. Sarobe, J. J. Lasarte, M. Herraiz, B. Sangro, J. Prieto, F. Borras-Cuesta, and E. Celis. Identification of an antigenic epitope for helper T lymphocytes from carcinoembryonic antigene. Clin. Cancer Res. 2002, 8:3219-3225., Gnjatic, S., D. Atanackovic, E. Jager, M. Matsuo, A. Selvakumar, N.K. Altorki, R.G. Maki, B. Dupont, G. Ritter, Y.T. Chen, A. Knuth, and L.J. Old. Survey of naturally occurring CD4+ T-cell responses against NY-ESO-1 in cancer patients: Correlation with antibody responses. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2003, 100 (15): 8862-7]). CD4+ T 세포는 IFNγ 수준을 국소적으로 증가시킬 수 있다(문헌[Qin Z, Schwartzkopff J, Pradera F, Kammertoens T, Seliger B, Pircher H, Blankenstein T; A critical requirement of interferon gamma-mediated angiostasis for tumor rejection by CD8+ T cells; J Cancer Res; 2003, 63(14): 4095-4100]).

쥐와 같은 포유류 동물 모델에서 보면, 세포독성 T 임파구(CTL) 효과기 세포(즉, CD8-양성 T 임파구)의 부재시에도, CD4 양성 T-세포는 인테페론-감마(IFNγ)의 분비에 의한 혈관신생의 억제를 통해 종양의 발현을 억제하기에 충분하다(문헌[Qin, Z. and T. Blankenstein. CD4+ T-cell-mediated tumour rejection involves inhibition of angiogenesis that is dependent on IFN gamma receptor expression by nonhematopoietic cells. Immunity. 2000, 12:677-686]). 또한, HLA 클래스 II 분자에 의해 제공된 종양 관련 항원으로부터 펩티드를 인식하는 CD4 양성 T-세포는 항체(Ab) 반응의 유도를 통해 종양의 진행을 방해할 수 있는 것으로 나타났다(문헌[Kennedy, R.C., M.H. Shearer, A.M. Watts, and R.K. Bright. CD4+ T lymphocytes play a critical role in antibody production and tumour immunity aginst simian virus 40 large tumour antigen. Cancer Res. 2003, 63:1040-1045]). HLA 클래스 I 분자와 결합하는 종양 관련 펩티드와 다르게, TAA의 클래스 II 리간드의 소수만이 지금까지 기술되었다(www.cancerimmunity.org, www.syfpeithi.de).

HLA 클래스 II 분자의 구조적인 발현이 일반적으로 면역 시스템의 세포로 제한되므로(문헌[Mach, B., V. Steimle, E. Martinez-Soria, and W. Reith. MHC class II genes: lessons from a disease. Annu. Rev. Immunol. 1996, 14: 301-331]), 원발성 종양에서 직접적으로 클래스 II 펩티드를 단리하는 것은 불가능하다고 간주되었다. 그러나, 발명자들은 최근에 다수의 MHC 클래스 II 에피톱을 종양에서 직접적으로 식별하는데 성공했다(EP 1642905, EP 1760088; 문헌[Dengjel J, Nastke MD, Gouttefangeas C, Gitsioudis G, Schoor O, Altenberend F, Muller M, Kramer B, Missiou A, Sauter M, Hennenlotter J, Wernet D, Stenzl A, Rammensee HG, Klingel K, Stevanovic S.; Unexpected abundance of HLA class II presented peptides in primary renal cell carcinomas; Clin Cancer Res. 2006; 12:4163-4170]).

염증의 부재시에는, MHC 클래스 II 분자의 발현은 주로 면역 시스템의 세포, 특히 전문적인 항원 제공 세포(APC) 예를 들면, 단핵 세포, 단핵 세포 유도 세포, 대식 세포, 수지상 세포로 제한된다. 놀랍게도, 종양 환자들에게서 종양 세포들이 MHC 클래스 II 분자들을 발현하는 것이 발견되었다(문헌[Dengjel J, Nastke MD, Gouttefangeas C, Gitsioudis G, Schoor O, Altenberend F, Muller M, Kramer B, Missiou A, Sauter M, Hennenlotter J, Wernet D, Stenzl A, Rammensee HG, Klingel K, Stevanovic S.; Unexpected abundance of HLA class II presented peptides in primary renal cell carcinomas; Clin Cancer Res. 2006; 12:4163-4170]).

펩티드가 세포 면역 반응을 유발하려면, MHC-분자에 결합해야 한다. 이 과정은 MHC-분자의 대립 유전자와 펩티드의 아미노산 서열의 특이적인 다형 현상에 의존한다. MHC 클래스 I에 결합하는 펩티드는 보통 8 내지 10의 아미노산 잔기이며 보통 MHC-분자의 상응하는 결합 홈과 상호작용하는 서열에 2개의 보존 잔기("앵커")를 가지고 있다. 이런 식으로 각각의 MHC 대립 유전자는 어떤 펩티드가 결합 홈에 특이적으로 결합하는가를 결정하는 "결합 모티프"를 가진다(문헌[Rammensee HG, Bachmann J, Stevanovic S. MHC ligands and peptide motifs, Landes Bioscience, USA, 1997]).

MHC 클래스 I에 의존하는 면역 반응에서, 펩티드는 종양 세포에 의해 발현되는 특정한 MHC 클래스 I 분자에 결합할 수 있어야 할 뿐만 아니라, 특이적인 T-세포 수용체(TCR)를 함유한 T-세포에 의해 인식되어야 한다.

종양 특이적인 T-임파구에 의해 인식되는 항원, 즉, 에피톱은 모든 단백질 클래스, 예를 들면 효소, 수용체, 전사 인자 등에서 유도된 분자일 수 있다. 또한, 예를 들어 종양 관련 항원은 종양 세포, 예컨대 돌연변이 유전자의 생성물에서만 제공될 수 있다. 또 다른 중요한 클래스의 종양 관련 항원은 상이한 종류의 종양과 건강한 고환 조직에서 발현되는 CT("암 고환")-항원 같은 조직-특이적인 항원이다.

다양한 종양 관련 항원이 식별되었다. 또한, 많은 연구 노력이 추가의 종양 관련 항원의 식별에 쓰인다. 당해 분야에서 종양 특이적인 항원으로 지칭되는 종양 관련 항원의 일부 군은 조직 특이적이다. 예는 비제한적으로 흑색종을 위한 티로시나아제, 전립선 암, 및 림프종의 bcr/abl 같은 염색체 교차(전좌)를 위한 PSA와 PSMA가 있다. 그러나 식별된 많은 종양 관련 항원은 여러 개의 종양 유형에서 발생하고, 그 중에 실질적으로 형질전환을 야기하는 종양 유전자 단백질 및/또는 종양 억제 유전자(종양 억제 유전자는, 예를 들면 문헌[Linehan WM, Walther MM, Zbar B. The genetic basis of cancer of the kidney. J Urol. 2003 Dec; 170 (6Pt1):2163-72]에서 신장암에 대해 검토된다)는 거의 모든 종양 유형에서 발생한다. 예를 들어, p53(종양 억제 유전자의 예), ras, c-Met, myc, pRB, VHL, HER-2/neu 같이, 세포 성장과 분화를 조절하는 정상 세포 단백질은 돌연변이를 누적시켜 이러한 유전자의 발현의 상향조절을 야기하고, 이에 의해 이들을 종양 유전자로 만들 수 있다(문헌[McCartey et al. Cancer Research, 1998, 15:58 2601-5; Disis et al. Ciba Found. Symp. 1994, 187:198-211]). 이런 돌연변이 단백질은 또한 여러 유형의 암에서 종양 특이적인 면역 반응의 표적이 될 수 있다.

암 환자의 면역요법의 목적은 면역 시스템의 세포, 특히 소위 세포독성 T-세포(CTL, 또는 "킬러 세포" 또는 CD8-양성 T-세포로서도 공지됨)를 건강한 조직이 아닌 종양 세포에 대해서 활성화시키는데 있다. 종양 세포는 종양 관련 단백질을 발현하는 점에서 건강한 세포와는 상이하다. 세포 표면에 있는 HLA 분자는 외부에 세포 내용물을 제공하고, 따라서 세포독성 T 세포가 건강한 세포와 종양 세포를 구별할 수 있도록 만들어 준다. 이것은 세포 속의 모든 단백질을 짧은 펩티드로 파괴하여, HLA 분자에 붙고 세포 표면에 제공됨으로써 실현된다(문헌[Rammensee, HG, Falk, K, and Rotzschke, O; Peptides naturally presented by MHC class I molecules, Annu. Rev. Immunol., 1993, 11, 213-244]). 종양 세포에 제공되지만, 신체의 건강한 세포에는 제공되지 않거나 훨씬 적게 제공되는 펩티드는 종양 관련 펩티드(TUMAP)라고 지칭된다.

단백질이 세포독성 T-임파구에 의해 종양 특이적 항원 또는 종양 관련 항원으로 인식되고, 요법에 쓰이기 위해서는 특정 전제 조건이 충족되어야 한다. 항원은 주로 종양 세포에 의해 발현되고, 건강한 조직에서는 발현되지 않거나 소량만 발현되어야 한다. 그리고 더 바람직한 것은, 각각의 항원이 임의의 유형의 종양에 존재할 뿐만 아니라, 농도(예를 들면, 세포 당 각각의 펩티드의 복제 수)도 높아야 한다. 종양 특이적 항원 및 종양 관련 항원은 종종, 예를 들어 세포 주기 조절 또는 세포사멸 같은 기능에 의한 정상 세포에서 종양 세포로의 형질전환에 직접 관련된 단백질에서 유도된다. 또한, 형질전환을 직접적으로 일으키는 단백질의 하위부분 표적은 상향조절될 수 있으며, 따라서 간접적으로 종양과 관련된다. 이런 간접적 종양 관련 항원은 백신 접근법의 표적이 될 수 있다. 종양 관련 항원에서 유도된 이런 펩티드("면역 펩티드")가 생체내 및 생체외 T 세포 반응을 야기하여야 하므로, 둘 다의 경우에서 항원의 아미노산 서열에 있는 에피톱의 존재가 필수적이다.

기본적으로, MHC 분자를 결합할 수 있는 임의의 펩티드가 T-세포 에피톱으로서 작용할 수 있다. 생체내 및 생체외 T 반응 유도의 전제 조건은 상응하는 TCR이 있는 T-세포의 존재와 이 특정 에피톱에 대한 내성의 부재이다. T-조력 세포는 항종양 면역에서 CTL의 효과기 기능을 조정하는데 중요한 역할을 한다. TH1 유형의 T-조력 세포 반응을 유발하는 T-조력 세포 에피톱은 종양 관련 펩티드/MHC 복합체를 세포 표면에 드러내는 종양 세포를 지향하는 세포독성 기능을 포함하는 CD8-양성 킬러 T-세포의 효과기 기능을 지원한다. 이 방법으로 단독으로, 또는 다른 종양 관련 펩티드와 조합된 종양 관련 T-조력 세포 펩티드 에피톱은 항종양 면역 반응을 자극하는 백신 조성물의 약학적인 활성 성분의 역할을 할 수 있다.

CD8과 CD4에 의존하는 유형의 반응 둘 다가 항종양 효과에 공동으로 그리고 상승적으로 기여하므로, CD8+ CTL(MHC 클래스 I 분자) 또는 CD4-양성 CTL(MHC 클래스 II 분자)에 의해 인식되는 종양 관련 항원의 식별과 특징화는 종양 백신의 개발에 중요하다. 따라서, MHC 복합체의 각각의 클래스에 결합하는 펩티드를 가진 펩티드 조성물을 제공하는 것이 본 발명의 목적이다.

종양 관련 펩티드를 이용한 첫 번째 임상 실험은 주로 흑색종 징후를 위해 1990년대 중반 분(Boon)과 동료들에 의해서 시작되었다. 임상 반응은 최고의 실험에서 10% 내지 30%의 범위를 나타냈다. 심각한 부작용과 심각한 자가 면역은 펩티드-기초 백신 단독 요법을 사용한 어떠한 임상 실험에서도 보고되지 않았다. 경도 형태의 백반이 흑색종 관련 펩티드로 치료된 일부 환자에 대해 보고되었다.

그러나, 한 종류의 CTL의 감작은 모든 종양 세포를 제거하기에는 보통 충분하지 않다. 종양은 매우 돌연변이 발생률이 높고, 이의 단백질 패턴을 바꿔 CTL의 인식을 피함으로써 CTL 공격에 신속하게 반응할 수 있다. 종양 회피 기전에 반격하기 위하여, 다양한 특이적인 펩티드가 백신 접종에 사용된다. 이러한 방식에서, 종양에 대한 광범위한 동시 공격이 여러 가지의 CTL 클론에 의해 동시에 개시될 수 있다. 이것은 종양이 면역 반응을 피할 가능성을 저하시킬 수 있다. 이 가설은 최근 말기 흑색종 환자를 치료하는 임상 연구에서 확인되었다. 단 몇 가지 예외를 제외하고, 3개 이상의 별개의 T-세포 반응을 보인 환자는 객관적인 임상 반응 또는 안정적인 질병(문헌[Banchereau, J, Palucka, AK, Dhodapkar, M, Burkeholder, S, Taquet, N, Rolland, A, Taquet, S, Coquery, S, Wittkowski, KM, Bhardwaj, N, Pineiro, L, Steinman, R, and Fay, J; Immune and clinical responses in patients with metastatic melanoma to CD34(+) progenitor-derived dendritic cell vaccin, Cancer Res., 2001, 61, 6451-6458]) 및 증가된 생존율(반처류(J. Banchereau)와의 사적인 통신)을 나타내지만, 3개 미만의 T-세포 반응을 보인 환자들의 대부분은 진행성 질병으로 진단되었다.

지원자의 연구 결과는 신장 세포 암종 환자들이 13개의 상이한 펩티드로 구성된 백신으로 치료되는 경우에 유사한 효과를 나타냈다(문헌[H. Singh-Jasuja, S. Walter, T. Weinschenk, A. Mayer, P. Y. Dietrich, M. Staehler, A. Stenzl, S. Stevanovic, H. Rammensee, J. Frisch; Correlation of T-cell response, clinical activity and regulatory T-cell levels in renal cell carcinoma patients treated with IMA901, a novel multi-peptide vaccine; ASCO Meeting 2007 Poster # 3017; M. Staehler, A. Stenzl, P. Y. Dietrich, T. Eisen, A. Haferkamp, J. Beck, A. Mayer, S. Walter, H. Singh, J. Frisch, C. G. Stief; An open label study to evaluate the safety and immunogenicity of the peptide based cancer vaccine IMA901, ASCO meeting 2007; Poster # 3017]).

따라서, 종양 백신의 개발의 주요 작업은 새로운 종양 관련 항원과 거기에서 유도된 면역성 T-조력 에피톱의 식별과 특징화뿐만 아니라, 각 환자의 하나 초과의 에피톱에 대한 반응의 확률을 높이기 위한 상이한 에피톱의 조합이다. 따라서, 인간의 주요 조직 적합성 복합체(MHC) 클래스 I(HLA 클래스 I) 또는 II(HLA 클래스 II)의 분자에 결합할 수 있는 펩티드의 아미노산 서열의 조합을 제공하는 것이 본 발명의 목표이다. 펩티드 조합을 기초로 하는 효과적인 항암 백신을 제공하는 것이 본 발명의 추가 목표이다.

[도 1]
말초 혈액으로부터의 OCD-001과 NOX-001 특이적인 CD8+ 임파구의 마이크로스피어 유도된 증식의 사량체 분석. 건강한 HLA-A*0201+ 공여체 HD100의 웰의 1 x 10⁶ CD8+ 강화된 PBMC는 항-CD28 플러스 고밀도 종양 항원 A*0201/ODC-001(상부 패널) 또는 항-CD28 플러스 고밀도 종양 항원 A*0201/NOX-001(하부 패널)과 커플링된 마이크로스피어로 매주 자극되었다. 생체외 자극 후, 모든 세포들은 항체 CD8 FITC 플러스 사량체 A*0201/NOX-001 PE와 A*0201/ODC-001 APC로 염색되었다. 세포는 임파구 집단 또는 CD8+ 임파구(오른쪽 패널)에 게이팅(gating)되고, 숫자는 CD8+ 임파구의 사량체+의 백분율을 나타낸다.
[도 2]
5회의 자극 주기 후 IFNγ 엘리스포트(ELISPOT)에 의해 검출된 TGFBI-004의 생체외 면역성. 세포는 감작되고 TGFBI-004로 반복적으로 자극된 후, 관련된 TGFBI-004(웰 1, 2, 3 및 4)와 관련 없는 (음성 대조군) 펩티드로 각각 배양되었다. IFNγ 엘리스포트 후 분석은 엘리스포트 판독기(미국 클리블랜드 소재 CTL)에서 수행되었다. PHA-이오노마이신은 양성 대조군으로서 역할을 했다. 숫자는 양성 점의 수를 나타낸다.
[도 3]
5회의 자극 주기 후 ICS에 의해 검출된 TGFBI-004의 생체외 면역성. 세포들은 TGFBI-004 로딩된 자가조직 DC에 의해 감작되며 자가조직 PBMC 플러스 TGFBI-004로 반복적으로 재자극되었다. 판독을 위해 세포들은 관련된 TGFBI-004(웰 1, 2, 3 및 4)와 관련 없는 (음성 대조군) 펩티드로 각각 배양되었다. 세포내 IFNγ 염색에 추가적으로, 세포는 CD4-FITC와 CD8-PerCP 항체로 또한 염색되었다. 분석은 4색 FACSCalibur 세포 계산기(독일 소재 베데 바이오사이언시스(BD Biosciences))에서 수행되었다.
[도 4]
NOX-001 펩티드의 생체외 재자극에 따른 T 세포주에 의한 IFNγ 생산의 엘리스포트 분석. A. 공여체 HBC-154(정렬된 CD8+ NOX-001 사량체+)의 T 세포주 7+; B. 공여체 HBC-154(정렬된 CD8+ NOX-001 사량체-)의 T 세포주 7-. 정렬된 CD8+ NOX-001 사량체+(A.)와 CD8+ NOX-001 사량체-(B.) 세포들은 관련 없는 (MLA-001)(상부 웰)과 관련된 (NOX-001)(하부 웰) 펩티드(10㎍/ml)의 재자극 후 IFNγ 엘리스포트에 의해 분석되었다. 숫자는 양성 점의 수를 나타낸다.
[도 5]
유동 세포 계산기 분석에 의해 측정된 CEA-004의 생체외 자극에 따른 4 HLA-A2 건강한 공여체의 CEA-004-특이적인 CD8+ T 세포의 빈도.
[도 6]
HLA-A*0201 대립 유전자에 의해 코딩된 MHC 분자에 대한 본 발명의 HLA 클래스 I 펩티드의 친화력.

본 발명에서, 대장암 같은 포유류의 종양에서 발명자들은 HLA 클래스 I 또는 II 분자에 결합하는 펩티드를 분리하고 성분 분석했다.

본 발명은 종양생성과 관련된 항원에서 생기고, 인간 백혈구, 특히 임파구, 그 중에 T 임파구, 그 중에 CD4 양성 T 임파구, 그 중에 TH1 유형 면역 반응을 매개하는 CD4 양성 T 임파구의 면역 반응을 자극하기 위해 MHC (HLA) 클래스 II 분자에 충분히 결합할 수 있는 펩티드를 제공한다.

본 발명은 또한 종양생성과 관련된 항원에서 생기고, 인간 백혈구, 특히 임파구, 그 중에 T 임파구, 그 중에 CD8 양성 T 임파구 면역 반응을 자극하기 위해 MHC (HLA) 클래스 II 분자에 충분히 결합할 수 있는 펩티드뿐만 아니라 암에 걸린 환자의 백신에 특히 유용한 두 가지의 조합을 제공한다.

본 발명에 따르면 그 목표는 서열식별번호 1번 내지 서열식별번호 7번으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열 및/또는 서열식별번호 1번 내지 서열식별번호 7번과 80% 이상 동일한 변종 아미노산 서열을 함유하는 2개 이상의 펩티드, 및/또는 서열식별번호 1번 내지 서열식별번호 7번 또는 변종 아미노산 서열을 코딩하는 핵산을 함유하는 폴리뉴클레오티드, 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학 조성물을 제공함에 따라 목표는 해결된다. 본 발명의 약학 조성물은 또한 서열식별번호 8번 내지 서열식별번호 15번으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열, 또는 서열식별번호 8번 내지 서열식별번호 15번과 80% 이상 동일한 변종 아미노산 서열을 함유하는 하나 이상의 부가적인 펩티드, 또는 서열식별번호 8번 내지 서열식별번호 15번 또는 변종 아미노산 서열을 코딩하는 핵산을 함유하는 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함할 수 있다. 펩티드는 길이가 8에서 100인 아미노산이며, 8에서 30이 더 선호되고, 8에서 16이 더 선호된다.

밑에서 언급한대로, 본 발명을 기초로 한 펩티드는 MHC 클래스 I이나 II로 나타내어지는 세포로 식별되었다. 그러므로 그 서열을 가지고 있는 펩티드(예를 들면, 유도된 펩티드)뿐만 아니라 이런 특정한 펩티드는 펩티드에 따라 그리고 환자들에 따라 다르지만, 모두 특정한 T 세포 반응을 유도한다. 예를 들면, 다른 점들은 펩티드에 있는 변이 때문에 발생 할 수 있다. 현재 기술을 가지고 있는 당업자는 어느 정도의 반응이 펩티드에 의해 유도되는 가를 정하는 방법, 특히, 여기에 나오는 실례와 문헌에 참조된 방법을 알고 있다.

본 발명의 변종이 본 발명의 각각의 펩티드에 대한 T 세포 교차 반응을 유도하는 것이 바람직하다.

펩티드의 아미노산 서열 또는 펩티드에 코딩하는 핵산 서열과 변종의 상동 비율은 이 분야에서 잘 알려진 알고리즘을 이용해 계산 할 수 있다. 본 발명에서, "상동" 이라는 용어는 예를 들면, 펩티드 또는 폴리펩티드 서열과 같은 두 가지의 아미노산 서열의 동종 정도를 가리킨다. 앞에서 말한 "상동"은 최적의 상태에서 2개의 서열을 비교될 서열에 비교하는 것으로 결정된다. 여기서 비교가 될 아미노산이나 핵산 서열은 2개의 서열의 최적의 정렬에서 더해지거나 지워질 수 있다(예를 들면, 격차와 같은). 이런 서열 상동은, 예를 들면, ClustalW 알고리즘(문헌[Nucleic Acid Res., 22(22): 4673 4680 (1994)])을 사용하여 정렬을 만들어 계산될 수 있다. 일반적으로 통용하는 서열 분석 소프트웨어, 좀 더 구체적으로, Vector NTI, GENETYX 또는 공용 데이터베이스(예를 들면 http://restools.sdsc.edu/biotools/biotools16.html)가 제공하는 분석 도구도 사용될 수 있다.

약학적으로 허용되는 담체는 잘 알려져 있고 활성 치료 약제가 제형화되어 있는 액체이다. 담체는 일반적으로 제형에 약리학적 활동을 제공하지 않지만, 화학적 및/또는 생물학적 안정성을 제공하거나 성질을 공개할 수 있다. 대표적인 제형은 예를 들면 문헌[Alfonso R. Gennaro. Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th Edition. Baltimore, MD: Lippincott Williams & Wilkins, 2000]에서 찾을 수 있고, 비제한적으로 염수, 물, 완충물, 0.3% 글리신, 히알루론산, 포도당 등을 포함할 수 있다. 최근에, 수년 동안 인간 환자의 정맥 주사 영양을 위해 쓰인 특정 지방 유화제가 펩티드를 위한 수단으로 쓰일 수 있는 것이 발견되었다. 상업적으로 쓰이는 지방 유화제의 두 가지 예로는 인트라리피드(Intralipid)와 리포푼딘(Lipofundin)이 있다. 미국특허 제3,169,094호에서 설명된 대로 인트라리피드는 정맥 주사 영양을 위한 지방 유화제로 스웨덴 소재의 카비 파마시아(Kabi Pharmacia)의 등록 상표이다. 리포푼딘은 독일 소재의 베.브라운 멜순겐(B.Braun Melsungen)의 등록 상표이다. 둘 다 콩기름을 지방으로 가지고 있다(1,000ml의 물에 100 또는 200g: 10% 또는 20%). 계란 노른자 인지질은 인트라리피드의 유상화제로 쓰이고(12g/l 증류수) 계란 노른자 레시틴은 리포푼딘(12g/l 증류수)에서 쓰인다. 글리세린(12g/l)의 추가의 결과는 인트라리피드와 리포푼딘에서 둘 다 등장이다.

펩티드는 종양 관련 항원에서. 특히 단백질 가수 분해, 혈관신생, 세포 성장, 세로 주기 조절, 세포 분열, 전사 조절, 전이 조절, 조직 침입에 기능이 있는 종양 관련 항원에서 나온다.

염색체 20 개방 판독틀 42

C20orf42는 액틴 세포 골격의 원형질 세포막 부착과 인테그린 매개 세포 과정에 관련된 초점 접착 단백질이다. 기능 결실 변이로 생긴 C20orf42 결핍은 피부 물집, 진행성 피부 위축증, 감광성과 종종은 발암으로 나타나는 상염색체 열성 유전성 피부증인 킨들러(Kindler) 증후군을 일으킨다(문헌[Herz, C, Aumailley, M, Schulte, C, Schlotzer-Schrehardt, U, Bruckner-Tuderman, L, and Has, C; Kindlin-1 is a phosphoprotein involved in regulation of polarity, proliferation, and motility of epidermal keratinocytes, J Biol Chem., 2006, 281, 36082-36090]). 최근에, 심각한 출혈성 대장염과 관련된 위장 부위가 기능 손실 변이 환자에서 보고되었다(문헌[Sadler, E, Klausegger, A, Muss, W, Deinsberger, U, Pohla-Gubo, G, Laimer, M, Lanschuetzer, C, Bauer, JW, and Hintner, H; Novel KINDI gene mutation in Kindler syndrom with severe gastrointestinal tract involvement, Arch. Dermatol., 2006, 142, 1619-1624]).

암의 맥락에서, C20orf42는 암 관련 환경의 유전자 발현 조사 연구에서 설명된다. 그것은 실험(n=10)된 결장 암종의 70%에서 그리고 폐암의 60%에서 과발현되는 것으로 밝혀졌다. 노턴 블롯(Northern Blot)에 의해 발현된 정상 조직은 신경근육학 조직으로 제한된다(문헌[Weinstein, EJ, Bourner, M, Head, R, Zakeri, H, Bauer, C, and Mazzarella, R; URP1: a member of a novel family of PH and FERM domain-containing membrane-associated protein is significantly over-expressed in lung and colon carcinomas, Biochim. Biophys. Acta, 2003, 1637, 207-216]). 또한 C20orf42는 TGF-β 매개 세포 이전과 종양 침입에 관련된 유전자로 발견되었다(문헌[Kloeker, S, Major, MB, Calderwood, DA, Ginsberg, MH, Jones, DA, and Beckerle, MC; The Kindler syndrome protein is regulated by transforming growth factor-beta and involved in integrin-mediated adhesion, J. Biol. Chem., 2004, 279, 6824-6833]).

NADPH 산화효소 동족체-1(NOX1)

NOX1은 반응적 산소 종 초과산화물(O₂-)와 과산화수소(H₂O₂)의 형성을 촉진하는 성장 인수-반응 효소이다. 그것의 발현은 원래 결장, 전립선, 자궁 그리고 분열증식 혈관의 부드러운 근육 세포들에서 발견되었다(문헌[Suh, Y. A. et al. Cell transformation by the superoxide-generating oxidase Mox1. Nature 1999, 401, 79-82]). 그 발현은 세포 분열 증식, 혈관신생, 그리고 세포 신호 전달 경로의 활성화 같은 여러 생물학적 반응과 관련된다(문헌[Harper, R. W., Xu, C., Soucek, K., Setiadi, H. and Eiserich, J. P. A reappraisal of the genomic organization of human Nox1 and its splice variants. Arch. Biochem. Biophys. 2005, 435, 323-330]).

NOX1은 결장에서 많이 발현되고 있으나, 결장 생리학이나 병리학에서 그것의 기능은 제대로 이해되지 않고 있다. 정상 조직에서, NOX1의 발현은 회장에서는 낮았고, 오른쪽 결장에서는 중간, 왼쪽 결장에서는 높았다. 선종에서, 충분히 차별화된 결장 선암이나 불완전하게 차별화된 결장 선암에서 유도된 샘플에서의 NOX1 발현은 통계학적으로 차이를 보이지 않았다. NOX1은 결장 상피 세포의 소낭 안, 그리고 구경 표면 둘 다에서 많이 발현되었다. 결론적으로, NOX1은 결장 상피에서 구조적으로 발현되는 효소이며 종양생성과 직접적으로 관련되지 않았다(문헌[Szanto, I. et al. Expression of NOX1, a superoxide-generating NADPH oxidase, in colon cancer and inflammatory bowel disease. J Pathol. 2005, 207, 164-176]).

면역 조직 화학은 NOX1이 점막 세포 표피에서 조직적으로 발현되는 것을 보여준다. 선종과 충분히 차별화된 선암은 NOX1 발현을 상향조절한다. 핵 인자(NF)-카파B는 주로 NOX1을 풍부하게 발현하는 선종과 선암 세포에서 활성화되었고, 이것은 NOX1이 결장 종양의 NF-카파B에 의존하는 세포사멸 경로를 자극하는 것을 암시한다(문헌[Fukuyama, M. et al. Overexpression of a novel superoxide-producing enzyme, NADPH oxidase 1, in adenoma and well differentiated adenocarcinoma of the human colon. Cancer Lett. 2005, 221, 97-104]).

Wnt3a/베타-카테닌 신호는 NOX1의 발현을 유도하는 것으로 설명된다(문헌[Petropoulos, H. & Skerjanc, I. S. Beta-catenin is essential and sufficient for skeletal myogenesis in P19 cells. J Biol Chem. 2002, 277, 15393-15399]).

최근, 반응적 산소 종은 내피 세포사멸을 유도하고, 그 이후 종양 세포의 여러 가지 접착 분자의 발현을 유도한다고 알려져 있다. 이것은 ROS 생성을 방해함으로써 원거리 부위에서의 종양 재발 방지가 가능하다는 것을 나타낸다(문헌[Ten, KM, van der Wal, JB, Sluiter, W, Hofland, LJ, Jeekel, J, Sonneveld, P, and van Eijck, CH; The role of superoxide anions in the development of distant tumour recurrence, 2006, Br. J Cancer]).

오르니틴 탈탄산효소 1 (ODC1)

ODC1은 오르니틴을 푸트레신으로 촉진하는 폴리아민 생합성 경로의 속도 결정 효소이다. 효소의 활동 수준은 성장을 추진하는 촉매에 따라 반응을 달리 하고 다른 포유류의 단백질보다 더 높은 전도율을 보인다.

폴리아민 대사는 상피 조직의 발암 기전에서 핵심 구성 요소이다. OCD1의 증가는 종종 정상 세포 성장의 개시와 종양 세포 성장의 지속과 관련된다. ODC1의 억제제는 방광, 유방, 결장과 피부 발암 실험 모델에서 종양 형성을 억압한다. ODC1 활동의 과발현은 여러 암의 잘 알려진 특징이며 ODC1은 원형종양 유전자로 간주된다(문헌[Auvinen, M., Paasinen, A., Andersson, L. C. and Holtta, E. Ornithine decarboxylase activity is critical for cell transformation. Nature 1992, 360, 355-358]).

선종성 대장 용종(APC) 유전자의 생식 변이는 결장암의 가장 명확한 유전된 성질 중 하나이다. APC 변이는 자유 β-카테닌 수준을 높이고, 그것은 핵으로 이동하여 서열-특정 전사 요소의 임파-강화 요소(LEF)/T-세포 요소(Tcf) 계열의 요원들과 합성물을 만든다. c-myc 종양 유전자는 Tcf 목적 유전자들 중 하나이다(문헌[He, T. C. et al. Identification of c-MYC as a target of the APC pathway (Science 281), 1509-1512 (1998)]). c-MYc RNA와 단백질은 대장 종양 형성의 초기와 말기에서 과발현된다. ODC는 c-Myc 표적 유전자이다.

APC기능의 손실은 ODC1의 상향조절을 일으키고(문헌[Gerner, EW and Meyskens, FL, Jr., Polyamines and cancer: old molecules, new understanding, Nat. Nat. Rev. Cancer, 2004, 4, 781-792]) 대장 암종에서 과발현은 자주 관찰되었다(문헌[Hu, H. Y. et al. Ornithine decarboxylase gene is overexpressed in colorectal carcinoma, World J. Gastroenterol. 2005, 11, 2244-2248; Kitahara, O. et al. Alterations of gene expression during colorectal carcinogenesis revealed by cDNA microarrays after laser-capture microdissection of tumor tissues and normal epithelia; Cancer Res. 2001, 61, 3544-3549; Nemoto, T., Kubota, S., Ishida, H., Murata, N. and Hashimoto, D Ornithine decarboxylase, mitogen-activated protein kinase and matrix metalloproteinase-2 exressions in human colon tumors. World J. Gastroenterol. 2005, 11, 3065-3069]).

ODC1은 엔도스타틴을 억압하는 역할을 함으로써 찬-맥관의 속성이 있다(문헌[Nemoto, T., Hori, H., Yoshimoto, M., Seyama, Y. & Kubota, S. Overexpression of ornithine decarboxylase enhances endothelial proliferation by suppressing endostatin expression. Blood 2002, 99, 1478-1481]).

CRC 세포주 HT-29의 ODC1의 아데노바이러스 코딩 반의미 RNA와 S-아데노실메티오닌 탈탄산 효소와의 감염은 CCND1의 다운 규칙과 세포 주기 저지를 이끈다. 또한, 베타-카테닌의 핵 변위도 억제되었다(문헌[Gong, L, Jiang, C, Zhang, B, Hu, H, Wang, W, and Liu, X; Adenovirus-mediated Expression of Both Antisense Ornithine Decarboxylase and S-adenosylmethionine Decarboxylase Induces G(1) Arrest in HT-29 Cells, J Biochem. Mol. Biol, 2006, 39, 730-736]). 아데노바이러스는 또한 누드마우스에 정착한 종양의 퇴행을 유발했다(문헌[Zhang, B, Liu, XX, Zhang, Y, Jiang, CY, Hu, HY, Gong, L, Liu, M, and Teng, QS; Polyamine depletion by OCD-AdoMetDC antisense adenovirus impairs human colorectal cancer growth and invasion in vitro and in vivo, 2006, J Gene Med, 8, 980-989]).

특이적이고 비가역적인 ODC1의 억제제는 2-다이플루오로메틸로니틴이다(DMFO, 에플로니신(Sanofi-Aventis)). 이것은 (편모충에 의한) 수면병의 치료를 위해 선전되고, 제모 크림 바니콰(Vaniqa)의 활성 성분이다.

암에서, DMFO는 임상전 모델에서 널리 사용되었고, 폴리아민 레벨을 감소함으로써 장래성 있는 항종양 효과를 보였다(문헌[Gerner, EW and Meyskens,FL,Jr.; Polyamine and cancer: old molecules, new understanding, Nat. Rev. Cancer, 2004, 4, 781-792]). 임상 시험은 여러 암에 대해 수행되었고, 몇 가지는 CRC를 위해 진행 중이다. 그러나, 이 시험은 대부분 특히 CRC(선종성 용종)에 민감한 환자들에게 예방적 세팅에서 조합적인 접근으로 수행되었다. 면역원 ODC 펩티드 ODC-001은 이전에 발견되었다(문헌[M. Diehl, PhD Thesis, University of Tubingen, 1998]).

세포 핵 항원 분열증식(PCNA)

PCNA는 핵에서 발견되며 DNA 중합효소 델타의 공동인자이다. 코딩된 단백질은 동형 삼량체의 역할을 하며 DNA 복제에서 선도 가닥 조성의 진행도를 증가시키는 것을 도와준다. 따라서, 그것은 모든 분열증식 세포, 특히 종양 세포에서 발현되며, 분열증식을 검출하는 마커로 사용된다.

종양이고 정상 점막 옆의 분열증식 지표는, PCNA 면역 화학 분석에 정의된 대로, 대장암 환자들의 재발과 낮은 생존율의 독립적인 예보자로서 오랫동안 알려져 왔다(문헌[al-Sheneber, IF, Shibata, HR, Sampalis, J, and Jothy, S; Prognostic significance of proliferating cell nuclear antigen expression in colorectal cancer, Cancer, 1993, 71, 1954-1959; Mayer, A, Takimoto, M, Fritz, E, Schellander, G, Kofler, K, and Ludwig, H; The prognostic significance of proliferating cell nuclear antigen, epidermal growth factor receptor, and mdr gene expression in colorectal cancer, Cancer, 1993, 71, 2454-2460; Nakamura, T, Tabuchi, Y, Nakae, S, Ohno, M, and Saitoh, Y; Serum carcinomebryonic antigen levels and roliferating cell nuclear antigen labeling index for patients with colorectal carcinoma. Correlation with tumor progression and survival, Cancer, 1996, 77, 1741-1746]).

DNA 위상이성질화효소 II(TOP2)

TOP2A와 TOP2B는 DNA의 전사 중 위상 상태를 조절하고 변경하는 효소인 DNA 위상이성질화효소의 이성질형을 코딩한다. 이 핵 효소는 염색체 응축, 염색분체 분리, DNA 전사와 복제 중 일어나는 비틀린 스트레스의 등의 공정에 참여한다. 이중 DNA의 두 가닥의 일시적인 분리와 재결합을 촉진시키고, 이것은 가닥들을 서로 통과할 수 있게 만드며, DNA 위상을 변경한다. 이 효소의 2개의 이성질형은 유전자 복제 이벤트의 가능성 있는 산출물이다. 알파 양식을 코딩하는 유전자는 염색체 17에 지역화되고 베타 유전자는 염색체 3에 지역화된다.

TOP2A는 여러 항암 요원의 대상이며 이 유전자의 다양한 변이는 약물 저항의 개발에 관련되어 왔다.

TOP2A 유전자는 HER-2 종양 유전자 옆에 자리하고 있으며, 유방암에서 가장 자주 증폭되는 종양 유전자이며, 17q12-q21 염색체에 자리하고 있으며, HER-2 증폭된 유방암 종양의 거의 90%에서 같은 빈도로 증폭되거나 결실된다(문헌[Jarvinen, TA and Liu, ET; Topoisomerase IIalpha gene (TOP2A) amplification and deletion in cancer-more common than anticipated, Cytopathology, 14, 309-313]). 또한, TOP2A 증폭은 다른 암에서도 보고되었다. 수많은 실험뿐만 아니라 최근의 실험에서도, 크고 멀티-센터 시험은 TOP2A의 증폭(및/또는 결실)이 TOP2A 유전자 좌에서의 특이적인 유전자 결함에 따라서 일반적으로 사용되는 세포독성 약물, 즉 위상이성질화효소 II 억제제(안트라사이클린 등, 문헌[Kellner, U, Sehested, M, Jensen, PB, Gieseler, F, and Rudolph, P; Culprit and victim - DNA topoisomerase II, Lancet Oncol., 2002, 3, 235-243])에 대한 민감도 또는 내성 둘 다의 이유가 될 수도 있다(문헌[Jarvinen, TA and Liu, ET; Simultaneous amplification of HER-2 (ERBB2) and topoisomerase IIalpha (TOP2A) genes-molecular basis for combination chemotherapy in cancer, Curr.Cancer Drug Targets., 2006, 6, 579-602]).

TOP2A 없이는 DNA 복제와 세포 분열은 불가능하다. 그래서 세포를 죽이는 정확한 기전이 불명확하지만 많은 항종양 요법의 주요 목적이 되었다(문헌[Kellner, U, Sehested, M, Jensen, PB, Gieseler, F, and Rudolph, P; Culprit and victim - DNA topoisomerase II, Lancet Oncol., 2002, 3, 235-243]). 이 접근법의 성공은 자발적인 내성의 발달에 의해 제한되며 약물-유발 DNA 손상은 악성도를 증가시킬 수 있다.

두 번째 가능성 있는 TOP-001의 단백질 근원인 TOP2B는 종양에서 자주 증폭되지 않는다고 알려진 염색체 영역(3p24)에 자리 잡고 있기 때문에 암 연구에서 잘 알려지지 않았다. 그러나, TOP2B는 TOP2A와 기본 구조가 거의 비슷하며 거의 동일한 촉매 속성이 있다(문헌[Leontiou, C, Lightowlers, R, Lakey, JH, and Austin, CA; Kinetic analysis of human topoisomerase IIalpha and beta DNA binding by surgace plasmon resonace, FEBS Lett., 2003, 554, 206-210]). 다른 연구에서 두 이성질형이 서로 치환될 수 있음이 나타났다(문헌[Sakaguchi, A and Kikuchi, A; Functional compatibility between isoform alpha and beta of type II DNA topoisomerase, J Cell Sci., 2004, 117, 1047-1054]).

본 발명에서 발명자들은 HLA 클래스 I 분자에 충분히 결합하는 종양 관련 펩티드가 인간 CD0-양성 세포독성 T-임파구에 의해 매개된 면역 반응을 유도할 수 있다는 결정적 증거를 제공하고, 또한 종양 세포 펩티돔의 선택된 펩티드에 대한 인간 면역 시스템의 반응을 자극하는데 요구된 펩티드가 적합하다는 것을 입증한다.

마찬가지로, HLA 클래스 II 분자에 충분히 결합하는 종양 관련 펩티드, 특히 인간 게놈의 HLA DR loci에 의해서 유전자 적으로 코딩된 HLA 클래스 II 대립 유전자들이 인간 CD4 양성 T-세포에 의해 매개된 면역 반응을 유도하는 것이 밝혀졌다. CD4 향성 T-세포는 인간 말초 혈액에서 분리되었고, 종양 세포 펩티돔의 선택된 펩티드에 대한 인간 면역 시스템의 반응을 자극하는데 요구된 펩티드가 적합하다는 것을 입증했다. 아래의 펩티드 TGFBI-004에서 실증되었듯이, 이 HLA-DR 결합, 종양 관련된 펩티드는 CD4 양성 T 세포에 의해 인식된다는 것이 발견되었다.

펩티드는 화학적으로 합성될 수 있으며, 제약 준비에서 활성 의약품 원료로 사용될 수 있으므로, 본 발명의 펩티드는 면역요법, 우선적으로 암 면역요법에 사용될 수 있다.

다른 측면에서, 이 약학 조성물은 또한 서열식별번호 8번 내지 서열식별번호 15번 및/또는 80% 이상이 서열식별번호 8번 내지 서열식별번호 15번과 동종인 변종 아미노산 서열을 함유하는 2개 이상의 펩티드, 및/또는 서열식별번호 1번 내지 서열식별번호 7번 또는 변종 아미노산 서열을 코딩하는 핵산을 함유하는 폴리뉴클레오티드, 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 서열식별번호 8번 내지 서열식별번호 13번과 15번의 펩티드는 이전에 발견된 면역성의 펩티드이며 MHC 클래스 I과 MHC 클래스 II 분자 (표 2 참조)에 결합한다.

이러한 펩티드는 신장 세포 암(RCC) 환자들 안에서 T 세포 반응을 일으키는 것으로 밝혀졌다(문헌[H. Singh-Jasuja, S. Walter, T. Weinschenk, A. Mayer, P. Y. Dietrich, M. Staehler, A. Stenzl, S. Stevanovic, H. Rammensee, J. Frisch; Correlation of T-cell response, clinical activity and regulatory T-cell levels in renal cell carcinoma patients treated with IMA901, a novel multi-peptide vaccine; ASCO Meeting 2007 Poster # 3017; M. Staehler, A. Stenzl, P. Y. Dietrich, T. Eisen, A. Haferkamp, J. Beck, A. Mayer, S. Walter, H. Singh, J. Frisch, C. G. Stief; An open label study to evaluate the safety and immunogenicity of the peptide based cancer vaccine IMA901, ASCO meeting 2007; Poster # 3017]). 모 단백질이 RCC뿐만 아니라 CRC와 다른 암 종류에서 과발현되기 때문에 이러한 펩티드는 다른 종양 타입의 치료 백신에서, 특히 항CRC백신에서 유용하다.

암배 항원 관련 세포 접착 분자 5

암배 항원(CEA=CEACAM5)은 3개의 C2 Ig 같은 N-말단 Ig V-같은 영역과 C-말단 영역 옆의 반복되는 단위를 가지고 있는 심하게 글리코실화된 180kDa 세포막 단백질이고, 글리코포스파티딜리노시톨 연결 영역을 포함한다(문헌[Hegde, P, Qi, R, Gaspard, R, Abernathy, K, Dharap, S, Earle-Hughes, J, Gay, C, Nwokekeh, NU, Chen, T, Saeed, AI, Sharov, V, Lee, NH, Yeatman, TJ, and Quackenbush, J; Identification of tumour markers in models of human colorectal cancer using a 19,200-element complementary DNA microarray, Cancer Res., 2001, 61, 7792-7797]).

종양 태아 성 항원으로써, CEA는 태아의 발달 과정 중에 발현되고, 낮은 수준이지만 또한 성인의 위장 상피에서도 발현된다. 그러나, CEA는 위장, 대장, 췌장암의 90%, 작지 않은 세포 폐암 세포의 70%와 유방암의 50%를 포함하는 인간 종양에서 높은 비율로 과발현된다(문헌[Thompson, JA, Grunert, F, and Zimmermann, W; Carcinoembryonic antigen gene family: molecular biology and clinical perspectives, J Clin Lab Anal., 5, 344-366 2005]). 종양 세포의 높은 발현과 혈청의 분비 때문에, CEA는 대장암 감시 종양 마커로서 광범위하게 사용되고(문헌[Sikorska, H, Shuster, J, and Gold, P; Clinical applications of carcinoembryonic antigen, Cancer Detect.Prev., 12, 321-355 1988]), 대장암 모니터링을 위한 표준 혈청 마커이다(문헌[Locker, GY, Hamilton, S, Harris, J, Jessup, JM, Kemeny, N, Macdonald, JS, Somerfield, MR, Hayes, DF, and Bast, RC, Jr.; ASCO 2006 update of recommendations for the use of tumour markers in gastrointestinal cancer, J Clin Oncol, 24, 5313-5327, 2006]).

종양 세포에서 CEA의 과발현에도 불구하고, 일반적으로 암 환자들은 항원에 대한 면역 반응을 보이지 않는다(문헌[Orefice, S, Fossati, G, Pietrojusti, E, and Bonfanti, G; Delayed cutaneous hypersesitivity reaction to carcinoembryonic antigen in cancer patienss, Tumouri, 1982, 68, 473-475]). 면역 시스템은 보통은 신체에서 낮은 수준으로 발현되기 때문에 일반적으로 CEA에 내성을 갖는다. 그러나, 여러 가지 임상 백신 시험에서 CEA의 면역성이 증명되었고(문헌[Sarobe, P, Huarte, E, Lasarte, JJ, and Borras-Cuesta, F; Carcinoembryonic antigen as a target to induce anti-tumour immune responses, Curr. Cancer Drug Targets., 2004, 4, 443-454]), 특히 대장 암종(CRC)에서 증명되었고(문헌[Mosolits, S, Ullenhag, G, and Mellstedt, H; Therapeutic vaccination in patients with gastrointestinall malignancies. A review of immunological and clinical results, Ann.Oncol., 2005, 16, 847-862]), CEA의 면역성이 증명되었고, CEA는 이 종양 유형에서 실험된 가장 많은 수의 백신 플랫폼을 가지고 있는 종양 관련 항원(TAA)이다(von Mehren, M; Colorectal cancer vaccines: what we know and what we don't yet know, Semin. Oncol., 2005, 32, 76-84]).

여러 가지 세포독성과 조력 T 세포 에피톱이 CEA에 대해 설명되었고(문헌[Crosti, M, Longhi, R, Consogno, G, Melloni, G, Zannini, P, and Protti, MP; Identification of novel subdominant epitopes on the carcinoembryonic antigen recognized by CD4+ T-cells of lung cancer patients, J Immunol., 2006, 176, 5093-5099; Novellino, L, Castelli, C, and Parmiani, G; A listing of human tumour antigens recognized by T-cells, March 2004 update, Cancer Immunol. Immunother., 2004, 54, 187-207; Ruiz, M, Kobayashi, H, Lasarte, JJ, Prieto, J, Borras-Cuesta, F, Celis, E, and Sarobe, P; Identification and characterization of a T-helper peptide from carcinoembryonic antigen, Cancer Res., 2004, 10, 2860-2867]), 이것은 CRC에서 다양한 펩티드-기초 백신 접종 시험을 가능하게 했다(문헌[Babatz, J, Rollig, C, Lobel, B, Folprecht, G, Haack, M, Gunther, H, Kohne, CH, Ehninger, G, Schmitz, M, and Bornhauser, M; Induction of cellular immune responses against carcinoembryonic antigen in patients with metastatic tumours after vaccination with altered peptide ligand-loaded dendritic cells, Cancer Immunol. Immunother., 2006, 55, 268-276; Fong, L, Hou, Y, Rivas, A, Benike, C, Yuen, A, Fisher, GA, Davis, MM, and Engleman, EG; Altered peptide ligand vaccination with Flt3 ligand expanded dendritic cells for tumour immunotherapy, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A, 2001, 98, 8809-8814; Liu, KJ, Wang, CC, Chen, LT, Cheng, AL, Lin, DT, Wu, YC, Yu, WL, Hung, YM, Yang, HY, Juang, SH, and Whang-Peng, J; Generation of caarcinoembryonic antigen (CEA)-specific T-cell responses in HLA-A*0201 and HLA-A*2402 late-stage colorectal cancer patients after vaccination with dendritic cells loaded with CEA peptides, Clin Cancer Res., 2004, 10, 2645-2651; Matsuda, K, Tsunoda, T, Tanaka, H, Umano, Y, Tanimura, H, Nukaya, I, Takesako, K, and Yamaue, H; Enhancement of cytotoxic T-lymphocyte responses in patients with gastrointestinal malignancies following vaccination with CEA peptide-pulsed dendritic cells, Cancer Immunol. Immunother., 2004, 53, 609-616; Ueda, Y, Itoh, T, Nukaya, I, Kawashima, I, Okugawa, K, Yano, Y, Yamamoto, Y, Naitoh, K, Shimizu, K, Imura, K, Fuji, N, Fujiwara, H, Ochiai, T, Itoi, H, Sonoyama, T, Hagiwara, A, Takesako, K, and Yamagishi, H; Dendritic cell-based immunotherapy of cancer with carcinoembryonic antigen-derived, HLA-A24-restricted CTL epitope: Clinical outcomes of 18 patients with metastatic gastrointestinal or lung adenocarcinomas, Int. J Oncol., 2004, 24, 909-917; Weihrauch, MR, Ansen, S, Jurkiewicz, E, Geisen, C, Xia, Z, Anderson, KS, Gracien, E, Schmidt, M, Wittig, B, Diehl, V, Wolf, J, Bohlen, H, and Nadler, LM; Phase I/II combined chemoimmunotherapy with carcinoembryonic antigen-derived HLA-A2-restricted CAP-1 peptide and irinotecan, 5-fluorourcil, and leucovorin in patients with primary metastatic colorectal cancer, Clin Cancer Res., 2005, 11, 5993-6001]). 이 임상 실험들과 지금까지 있었던 다른 임상 실험들에서 CEA 백신과 항원에 대한 면역 반응 유도의 증거가 증명되었다(문헌[von Mehren, M; Colorectal cancer vaccins: what we know and what we don't yet know, Semin.Oncol., 2005, 32, 76-84]).

CEA-006의 변종은 이전에 공개되었다(문헌[Ruiz, M, Kobayashi, H, Lasarte, JJ, Prieto, J, Borras-Cuesta, F, Celis, E, and Sarobe, P; Identification and characterization of a T-helper peptide from carcinoembryonic antigen, Clin Cancer Res., 2004, 10, 2860-2867]). CEA-005는 1개의 아미노산 교환이 있는 변이이며, 중심 면역 내성을 극복할 수 있는 것으로 보고되었다(문헌[Zaremba, S, Barzaga, E, Zhu, M, Soares, N, Tsang, KY, and Schlom, J; Identification of an enhancer agonist cytotoxic T lymphocyte peptide form human carcinoembryonic antigen, Cancer Res., 1997, 57, 4570-4577]).

형질전환 성장 인자, 베타-유도(TGFBI)

TBFBI는 인간 폐 선암 세포주의 TFG-베타-유도 가능한 유전자로 처음 식별되었다. 이것은 세포 접착과 세포 밖 세포간질 구성에 작용하는 세포 밖 세포간질 단백질 분비를 위해 코딩한다.

TGFBI는 대장암에서 가장 많이 증가된 유전자 중 하나이고, 선종에서도 높은 수준으로 발현되는 것으로 밝혀졌다. 정량적 PCR 결과는 순도가 낮은 종양과 정제된 종양 상피 세포에서 둘 다 강한 증가를 보였다. 따라서, 원위치 교배 실험은 TGFBI이 많은 세포 유형, 간질성과 상피 구획에서 발현된다고 밝혔다(문헌[Buckhaults, P, Rago, C, St, CB, Romans, KE, Saha, S, Zhang, L, Vogelstein, B, and Kinzler, KW; Secreted and cell surface genes expressed in benign and malignant colorectal tumours, Cancer Res., 2001, 61, 6996-7001]).

대장 선암 유전자 발현 메타 연구 결과, TGFBI는 반복되어 상향조절되는 오직 아홉개의 유전자 중 하나로 식별되었다(TGFBI를 위한 4개의 연구)(문헌[Shih, W, Chetty, R, and Tsao, MS; Expression profiling by microarrays in colorectal cancer, Oncol.Rep., 2005, 13, 517-524]).

인간의 췌장 조직에서, 췌장암의 TGFBI mRNA 수준은 정상 조절 조직에 비해서 32.4배의 증가가 있었다. 원위치 교배 분석은 TGFBI mRNA가 대부분 췌장 암 밀집의 암 세포에서 발현된 것을 밝혀냈다(문헌[Schneider, D, Kleeff, J, Berberat, PO, Zhu, Z, Korc, M, Friess, H, and Buchler, MW; Induction and expression of betaig-h3 in pancreatic cancer cells, Biochim.Biophys.Acta, 2002, 1588, 1-6]).

TGFBI는 생체외 모델에서 유전자 증진 혈관신생로 식별되었다. 또한, 획기적으로 향상된 TGFBI의 발현이 여러 가지 종양에서 발견됐다. 반의미 올리고 뉴클레오티드에서 TGFBI는 유전자 발현과 생체외 시험관 형성 둘 다 차단했고, 이것은 TGFBI가 내피 세포 간질 상호작용에서 중요한 역할을 하는 것을 시사한다(문헌[Aitkenhead, M, Wang, SJ, Nakatsu, MN, Mestas, J, Heard, C, and Hughes, CC; Identification of endothelial cell genes expressed in an in vitro model of angiogenesis: induction of ESM-1, (beta)ig-h3, and NrCAM, Microvasc. Res., 2002, 63, 159-171]).

무친-1 (MUC1)

무친은 트레오닌, 세린과 프롤린이 풍부한 직렬로 반복되는 펩티드와 O-글리코시딕 연결된 무리를 이룬 올리고당의 함유가 높은 고분자 무게 내피 당단백질이다. 무친에는 두 가지 구조적과 기능적으로 독특한 종류가 있다: MUC1이 속하는 막을 통해서 생기는 무친, 그리고 분비된 겔-형성 무친이 있다. 결장암 무친은 진단 및 전조 마커로 조사되고 암 백신의 목표가 되는 탄수화물 구조에 차이가 있다.

MUC1 단백질 세포 밖 영역은 잘 보존되어 있는 20의 아미노산의 반복에 의해 만들어지고, 대립 유전자에 의해 실제 숫자는 25에서 100까지 다양하다. 각각의 직렬 반복은 5개의 잠재적 당화 부위를 가지고 있으며, 이중 트레오닌과 세린 사이에는 다양한 항-MUC1 항체에 의해 인식되는 에피톱을 가진 면역 우세 영역이 있다(문헌[Taylor-Papadimitriou, J, Burchell, J, Miles, DW, and Dalziel, M; MUC1 and cancer, Biochim. Biophys. Acta, 1999, 1455, 301-313]).

대부분의 다른 내피에 비해서, 결장의 MUC1은 더 심하게 글리코실화되었으며, MUC1 단백질을 MUC1-특정 항체에 의해 면역 화학 염색 마스킹한다. 대장 선암에서, MUC1은 덜 글리코실화 되고 면역 검출을 가능하게 한다. 변종 글리코실화된 MUC1은 새로운 결합 특징을 주며, 동시에 접착 분자의 결합을 분자 특징으로 매개하고 차단할 수 있고, 그러므로 종양 세포의 전이성 확산에서 두 가지 역할을 한다(문헌[McDermott, KM, Crocker, PR, Harris, A, Burdick, MD, Hinoda, Y, Hayashi, T, Imai, K, and Hollingsworth, MA; Overexpression of MUC1 reconfigure the binding properties of tumor cells, Int. J Cancer, 2001, 94, 783-791]).

면역적으로 검출되는 MUC1은 결장암의 발현에서 증가되며, 더 나쁜 예후와 관련이 있으며(문헌[Byrd, JC and Bresalier, RS; Mucins and mucin binding proteins in colorectal cancer, Cancer Metastasis Rev., 2004, 23, 77-99]), 이것은 CRC의 진행에 MUC1의 상향조절이 관여할 수 있다는 것을 보여준다. 전이성 결장암은 전이성이 없는 것보다, MUC1을 더 강하게 발현하며(문헌[Nakamori, S, Ota, DM, Cleary, KR, Shirotani, K, and Irimura, T; MUC1 mucin expression as a marker of progression and metastasis of human colorectal carcinoma, Gastroenterology, 1994, 106, 353-361]), 하나의 연구에서 MUC1 염색은 간장과 관계가 있는 모든 대장암에서 양성이었다(문헌[Matsuda, K, Masaki, T, Watanabe, T, Kitayama, J, Nagawa, H, Muto, T, and Ajioka, Y; Clinical significance of MUC1 and MUC2 mucin and p53 protein expression in colorectal carcinoma, Jpn. J Clin Oncol., 2000, 30, 89-94]). 462명의 대장암 환자들을 대상으로 한 최근의 연구에서 MUC1 발현이 열등한 예후의 독립적인 진행 마커라는 것이 밝혀졌다(문헌[Duncan, TJ, Watson, NF, Al-Attar, AH, Scholefield, JH, and Durrant, LG; The role of MUC1 and MUC3 in the biology and prognosis of colorectal cancer, World J Surg. Oncol, 2007, 5, 31]).

항-MUC1 항체를 CRC에서 순환시키는 것은 병리 생리학적 중요성이 있다: 항-MUC1 항체는 31개의 건강한 대상의 5개(16.1%)에서 발견되었고, 56명의 대장암 환자 중 27명(48.2%)에서 발견되었다(문헌[Nakamura, H, Hinoda, Y, Nakagawa, N, Makiguchi, Y, Itoh, F, Endo, T, and Imai, K; Detection of circulating anti-MUC1 mucin core protein antiodies in patients with colorectal cancer, J Gastroenterol., 1998, 33, 354-361]).

항체 표적로서의 역할뿐만 아니라, MUC1은 세포독성 T 세포의 잘 설립된 표적이다. 여러 보고서는 난소암, 유방암, 췌장암 그리고 여러 골수 종양의 세포독성 MHC-제한이 없는 T 세포가 핵심 현지화된 직렬 반복 MUC1 단백질을 인식할 수 있다고 밝혔다(문헌[Apostolopoulos, V and McKenzie, IF; Cellular mucins: targets for immunotherapy, Crit Rev. Immunol., 1994, 14, 293-309; Finn, OJ, Jerome, KR, Henderson, RA, Pecher, G, Domenech, N, Magarian-Blander, J, and Barratt-Boyes, SM; MUC-1 epithelial tumor mucin-based immunity and cancer vaccines, Immunol. Rev., 1995, 145, 61-89; Barnd, DL, Lan, MS, Metzgar, RS, and Finn, OJ; Specific, major histocompatibility complex-unrestricted recognition of tumor-associated mucins by human cytotoxic T cells, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A, 1989, 86, 7159-7163; Takahashi, T, Makiguchi, Y, Hinoda, Y, Kakiuchi, H, Nakagawa, N, Imai, K, and Yachi, A; Expression of MUC1 on myeloma cells and induction of HLA-unrestricted CTL against MUC1 form a mutiple myeloma patient, J. Immunol., 1994, 153, 2102-2109; Noto, H, Takahashi, T, Makiguchi, Y, Hayashi, T, Hinoda, Y, and Imai, K; Cytotoxic T lymphocytes derived from bone marrow mononuclear cells of multiple myeloma patients recognize an underglycosylated form of MUC1 mucin, Int. Immunol., 1997, 9, 791-798]). 그러나, MUC1 단백질에서 유도된 HLA-A*02 제한된 T 세포 에피톱도 발견되었다(문헌[Apostolopoulos, V, Karanikas, V, Haurum, JS, and McKenzie, IF; Induction of HLA-A2-restricted CTLs to the mucin 1 human breast cancer antigen, J Immunol., 1997, 159, 5211-5218; Brossart, P, Heinrich, KS, Stuhler, G, Behnke, L, Reichardt, VL, Stevanovic, S, Muhm, A, Rammensee, HG, Kanz, L, and Brugger, W; Identification of HLA-A2-restricted T-cell epitopes derived from the MUC1 tumor antigen for broadly applicable vaccine therapies, Blood, 1999, 93, 4309-4317]). 그 펩티드 중의 하나는 MUC-001이다. 이것은 MUC1 단백질의 직렬 반복 영역에서 유도된다. 이 MUC1 펩티드를 이용한 말기의 유방암과 난소암 환자들의 펩티드-펄싱 수지상 세포의 백신 후에 세포독성 T임파구 반응의 유도는 성공적이었다(문헌[Brossart, P, Wirths, S, Stuhler, G, Reichardt, VL, Kanz, L, and Brugger, W; Induction of cytotoxic T-lymphocyte responses in vivo after vaccinations with peptide-pulsed dendritic cells, Blood, 2000, 96, 3102-3108; Wierecky, J, Mueller, M, and Brossart, P; Dendritic cell-based cancer immunotherapy targeting MUC-1, Cancer Immunol. Immunother., 2005 Apr. 28: 288-94]). 또한, 이런 백신은 신장 선암 환자들의 임상 반응을 유도하는데 성공했다(문헌[Wierecky, J, Muller, MR, Wirths, S, Halder-Oehler, E, Dorfel, D, Schmidt, SM, Hantschel, M, Brugger, W, Schroder, S, Horger, MS, Kanz, L, and Brossart, P; Immunologic and clinical responses after vaccinations with peptide-pulsed dendritic cells in metastatic renal cancer patients, Cancer Res., 2006, 66, 5910-5918]).

대장암의 면역 반응성 MUC1의 상향조절은 대부분 mRNA 과발현에 기반되어 있지 않고, 에피톱을 항체 인식, 특히 MUC1의 직렬 반복 영역에 나타나는 감소된 글리코실화에 의해 발생한다. 같은 시간에 이 탈당화는 보통 세포에서는 글리코실화에 의해 방해되는 종양 세포에서 변형된 항암 처리에 의한 T 세포 에피톱 제조의 기회를 제공한다. 이 기전은 강한 mRNA 과발현의 부재에도 불구하고 종양 관련 T 세포 에피톱으로의 MUC-001의 두드러진 특징을 설명할 수 있다. 글리코실화 변화가 항원 과정에 정말 영향을 준다는 증거는 대장암의 변화된 MUC1의 글리코실화가 항원을 보이는 세포에서 종양 당형을 특별히 인식하는 수용체에 의해 검출된다는 최근의 관찰에서 나왔다(문헌[Saeland, E, van Vliet, SJ, Backstrom, M, van, dB, V, Geijtenbeek, TB, Meijer, GA, and van, KY; 2006, The C-type lectin MGL expressed by dendritic cells detects glycan changes on MUC1 in colon carcinoma, Cancer Immunol. Immunother., 2007, 56(8): 1225-36]). 항원을 보이는 세포의 종양 당형의 특정 이해와 처리는 MUC-001 특정 T 세포가 유방암(문헌[Rentzsch, C, Kayser, S, Stumm, S, Watermann, I, Walter, S, Stevanovic, S, Wallwiener, D, and Guckel, B; Evaluation of pre-existent immunity in patients with primary breast cancer: molecular and cellular assays to quantify antigen-specific T lymphocytes in peripheral blood mononuclear cells, Clin Cancer Res., 2003, 9, 4376-438) 및 대장암(문헌[Dittmann, J, Keller-Matschke, K, Weinschenk, T, Kratt, T, Heck, T, Becker, HD, Stevanovic, S, Rammensee, HG, and Gouttefangeas, C; CD8+ T-cell response against MUC1-derived peptides in gastrointestinal cancer survivors, Cancer Immunol. Immunother., 2005, 54, 750-758]) 환자들에서 자연적으로 (면역 없이) 관찰되는 것을 설명할 수 있다. 이 환자들에게서 자기 면역 영향은 보고되지 않았다. 이것은 MUC-001의 특정T 세포를 유도하는 종양 관련 펩티드로의 자연적인 역할을 시사하고, MUC-001의 투여는 mRNA수준에서 MUC1 항원의 과발현이 검출되지는 않지만 안전하다고 간주된다.

Met 원종양 유전자(간세포 성장 인자 수용체)(c-Met)

Met 원종양 유전자 단백질 산출물은 간세포 성장 인자 수용체이다. 그것은 세포 증식, 운동성, 접착력과 침입에 관여된 신호 경로를 활성화시키는 타이로신 카이네이즈 도메인을 가지고 있다(문헌[Trusolino, L and Comoglio, PM; Scatter-factor and semaphorin receptors: cell signalling for invasive growth, Nat. Rev. Cancer, 2002, 2, 289-300]).

여러 종류의 종양에 대한 연구는 HCG/c-Met 자가분비 루프를 가지고 있고, 점돌연변이, TPR-Met 융합 단백질, c-Met를 α와 β 서열로 분리하는 것의 실패를 활성화키고, c-Met 활성화의 여러 가지 기전을 시사했다(문헌[Di Renzo, MF, Olivero, M, Martone, T, Maffe, A, Maggiora, P, Stefani, AD, Valente, G, Giordano, S, Cortesina, G, and Comoglio, PM; Somatic mutations of the MET oncogene are selected during metastatic spread of human HNSC carcinomas, Oncogene, 2000, 19, 1547-1555; Ebert, M, Yokoyama, M, Friess, H, Buchler, MW, and Korc, M; Coexpression of the c-met poroto-oncogene and hepatocyte growth factor in human pancreatic cancer, Cancer Res., 1994, 54, 5775-5778; Mondino, A, Giordano, S, and Comoglio, PM; Defective posttranslational processing activates the tyrosine kinase encoded by the Met proto-oncogene (hepatocyte growth factor receptor), Mol. Cell Biol., 1991, 11, 6084-6092; Olivero, M, Valente, G, Bardelli, A, Longati, P, Ferrero, N, Cracco, C, Terrone, C, Rocca-Rossetti, S, Comoglio, PM, and Di Renzo, MF; Novel mutation in the APT-binging site of the MET oncogene tyrosine kinase in a HPRCC family, Int. J Cancer, 1999, 82, 640-643; Park, M, Dean, M, Cooper, CS, Schmidt, M, O'Brien, SJ, Blair, DG, and Vande Woude, GF; Mechanism of met oncogene activation, Cell, 1986, 45, 895-904; Park, WS, Dong, SM, Kim, SY, Na, EY, Shin, MS, Pi, JH, Kim, BJ, Bae, JH, Hong, YK, Lee, KS, Lee, SH, Yoo, NJ, Jang, JJ, Pack, S, Zhuang, Z, Schmidt, L, Zbar, B, and Lee, JY; 1999, Somatic mutations in the kinase domain of the Met/hepatocyte growth factor receptor gene in childhood hepatocellular carinomas, Cancer Res., 59, 307-310; Rahimi, N, Tremblay, E, McAdam, L, Park, M, Schwall, R, and Elliott, B; 1996, Identification of a hepatocyte growth factor autocrine loop in a murine mammary carcinoma, Cell Growth Differ., 7, 263-270;Schmidt, L, Duh, FM, Chen, F, Kishida, T, Glenn, G, Choyke, P, Scherer, SW, Zhuang, Z, Lubensky, I, Dean, M, Allikmets, R, Chidambaram, A, Bergerheim, UR, Feltis, JT, Casadevall, C, Zamarron, A, Bernues, M, Richard, S, Lips, CJ, Walther, MM, Tsui, LC, Geil, L, Orcutt, ML, Stackhouse, T, Lipan, J, Slife, L, Brauch, H, Decker, J, Niehans, G, Hughson, MD, Moch, H, Storkel, S, Lerman, MI, Linehan, WM, and Zbar, B; 1997, Germline and somatic mutations in the tyrosine kinase domain of the MET proto-oncogene in papillary renal carcinomas, Nat.Genet., 16, 68-73; Schmidt, L, Junker, K, Weirich, G, Glenn, G, Choyke, P, Lubensky, I, Zhuang, Z, Jeffers, M, Vande, WG, Neumann, H, Walther, M, Linehan, WM, and Zbar, B; 1998, Two North American families with hereditary papillary renal carcinoma and identical novel mutations in the MET proto-oncogene, Cancer Res., 58, 1719-1722]). 기계론적으로 c-Met 과발현은 종양 유전자 Ki-ras 돌연변이와 조합하여 결장암 세포 안의 종양 형성 가능성을 높힌다(문헌[Long, IS, Han, K, Li, M, Shirasawa, S, Sasazuki, T, Johnston, M, and Tsao, MS; Met receptor overexpression and oncogenic Ki-ras mutation cooperate to enhance tumorigenicity of colon cancer cells in vivo, Mol.Cancer Res., 2003, 1, 393-401]).

흥미롭게도, Met 신호와 Wnt/베타-카테닌 경로의 상호 작용이 결장암에서 자주 상향조절되는 증거가 있다. Met는 프로스타글란딘 E2(PGE2)에 의해 활성화될 수 있으며, PGE2-활성된 c-Met는 베타-카테닌과 관련되어 타이로신 인산화를 증가시키므로 결장암 세포 침습성을 유도한다(문헌[Pai, R, Nakamura, T, Moon, WS, and Tarnawski, AS; Prostaglandins promote colon cancer celll invasion; signaling by cross-talk between two distinct growth factor receptors, FASEB J, 2003, 17, 1640-1647]). 최근에, Met와 베타-카테닌의 상호 활성화는 설명되었고, 이것은 대장 종양 형성의 두 주요 참가자 사이의 긍정적인 반응 루프를 유래한다(문헌[Rasola, A, Fassetta, M, De, BF, D'Alessandro, L, Gramaglia, D, Di Renzo, MF, and Comoglio, PM; A positive feedback loop between hepatocyte growth factor receptor and beta-catenin sustains colorectal cancer cell invasive growth, Oncogene, 2007, 26, 1078-1087]).

초기 CRC 종양(n=36)에서 c-Met mRNA 발현 수준은 초기 침입과 국부 질병 전이의 중요한 전조 마커이고, 결장암 단계와 직접적으로 관련되어 있다(문헌[Takeuchi, H, Bilchik, A, Saha, S, Turner, R, Wiese, D, Tanaka, M, Kuo, C, Wang, HJ, and Hoon, DS; c-Met expression level in primary colon cancer: a predictor of tumor invasion and lymph node metastases, Clin Cancer Res., 2003, 9, 1480-1488]). 130 CRC 샘플의 c-Met 발현의 분속은 초기 CRC의 69%에서 c-Met의 과발현(T/N > 2.0)을 보이고, 혈관 침입이 있는 CRC(p=0.04)의 c-Met 레벨이 상당히 높으며, 말기(p=0.04)에서는 인간 CRC 진행과 전이에서 c-Met의 역할을 보조한다(문헌[Zeng, Z, Weiser, MR, D'Alessio, M, Grace, A, Shia, J, and Paty, PB; Immunoblot analysis of c-Met expression in human colorectal cancer: overexpression is associated with advanced stage cancer, Clin Exp. Metastasis, 2004, 21, 409-417]). 다른 연구는, 결장 선암 60개의 69%와 48%가 인접한 정상의 점막보다 2배 크고 c-Met mRNA가 10배 높은 것을 보였다(문헌[Kammula, US, Kuntz, EJ, Francone, TD, Zeng, Z, Shia, J, Landmann, RG, Paty, PB, and Weiser, MR; Molecular coexpression of the c-Met oncogene and hepatocyte growth factor in primary colon cancer predicts tumor stage and clinical outcome, Cancer Lett., 2007, 248, 219-228]). 그러므로, 증가된 c-Met 신호는 CRC초기의 일반적인 출현이지만, 말기와 전이성의 질병에서는 더 큰 발현이 일어난다.

사이클린 D1(CCND 1)

CCND1은 세포 주기에 걸쳐 단백질의 풍부함을 극적 주기성으로 나타내는 일원을 가진 고도 보존된 사이클린 계열에 속한다. 사이클린은 CDK 키나아제의 조절기 역할을 한다. 다른 사이클린은 독특한 발현과 각각의 유사분열 사건의 일시적인 조정에 기여하는 저하 패턴을 보인다. 이 사이클린은 세포 주기 G1/S 전환에 필요한 활동을 하는 CDK4 또는 CDK6 조절 하위 단위로의 역할을 하는 조합을 만든다. 세포 주기 진행을 변경하는, 이 유전자의 변이, 증폭 그리고 발현은 여러 가지의 종양에서 자주 관찰되며 종양 생성에 기여할 수 있다(문헌[Fu, M, Wang, C, LI, Z, Sakamaki, T, and Pestell, RG; Minireview: Cyclin D1: normal and abnormal functions, Endocrinology, 2004, 145, 5439-5447]).

일반적인 A/G 단 뉴클레오티드 동질이상(A870G)은 두 가지 독특한 mRNA 이성질형 a 와 b를 유래한다. 교대 접합된 이성질형 b는 폐암, 결장암 그리고 다른 암 종류를 포함한 종양 습격의 더 높은 빈도에 관련 있는 불완전한 단백질에 코딩한다(문헌[Fu, M, Wang, C, LI, Z, Sakamaki, T, and Pestell, RG; Minireview: Cyclin D1: normal and abnormal functions, Endocrinology, 2004, 145, 5439-5447]).

대장암의 mRNA과 단백질 수준에서 CCND1의 과발현은 자주 설명되었다(문헌[Sutter, T, Doi, S, Carnevale, KA, Arber, N, and Weinstein, IB; Expression of cyclins D1 and E in human colon adenocarcinomas, J Med, 1997, 28, 285-309; Mermelshtein, A, Gerson, A, Walfisch, S, Delgado, B, Shechter-Maor, G, Delgado, J, Fich, A, and Gheber, L; Expression of D-type cyclins in colon cancer and in cell lines from colon carcinomas, Br. J Cancer, 2005, 93, 338-345; Balcerczak, E, Pasz-Walczak, G, Kumor, P, Panczyk, M, Kordek, R, Wierzbicki, R, and Mirowski, M; cyclin D1 protein and CCND1 gene expression in colorectal cancer, Eur. J Surg. Oncol., 2005, 31, 721-726; Bondi, J, Husdal, A, Bukholm, G, Nesland, JM, Bakka, A, and Bukholm, IR; Expression and gene amplification of primary (A, B1, D1, D3, and E) and secondary (C and H) cyclins in colon adenocarcinomas and correlation with patient outcom, J Clin Pathol., 2005, 58, 509-514; Perez, R, Wu, N, Klipfel, AA, and Beart, RW, Jr.; A better cell cycle target for gene therapy of colorectal cancer: cyclin G, J Gastrointest. Surg., 2003, 7, 884-889; Wong, NA, Morris, RG, McCondochie, A, Bader, S, Jodrell, DI, and Harrison, DJ; Cyclin D1 overexpression in colorectal carcinoma in vivo is dependent on beta-catenin protein dysregulation, but not k-ras mutation, J Pathol., 2002, 197, 128-135; McKay, JA, Douglas, JJ, Ross, VG, Curran, S, Murray, GI, Cassidy, J, and McLeod, HL; Cyclin D1 protein expression and gene polymorphism in colorectal cancer. Aberdeen Colorectal Initiative, Int. J Cancer, 2000, 88, 77-81; Bartkova, J, Lukas, J, Strauss, M, and Bartek, J; The PRAD-1/cyclin D1 oncogene product accumulates aberrantly in a subset of colorectal carcinomas, Int. J Cancer, 1994, 58, 568-573]).

이것은 대장암 선암에서 자주 상향조절되는 CCND1이 베타-카테닌-TCF/LEF 경로의 표적 유전자라는 잘 확립된 사실을 설명한다(문헌[Shtutman, M, Zhurinsky, J, Simcha, I, Albanese, C, D'Amico, M, Pestell, R, and Ben-Ze'ev, A; The cyclin D1 gene is a target of the beta-catenin/LEF-1 pathway, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A, 1999, 96, 5522-5527; Tetsu, O and McCormick, F; Beta-catenin regulates expression of cyclin D1 in colon carcinoma cells, Nature, 1999, 398, 422-426]).

CCND1 발현의 증가는 더 높은 종양 단계, 전이 그리고 감소된 생존과 관련되어 있다(문헌[Balcerczak, E, Pasz-Walczak, G, Kumor, P, Panczyk, M, Kordek, R, Wierzbicki, R, and Mirowski, M; Cyclin D1 protein and CCND1 gene expression in colorectal cancer, Eur. J Surg. Oncol., 2005, 31, 721-726; Bahnassy, AA, Zekri, AR, El-Houssini, S, El-Shehaby, AM, Mahmoud, MR, Abdallah, S, and El-Serafi, M; Cyclin A and cyclin D1 as significant prognostic markers in colorectal cancer patients, BMC. Gastroenterol., 2004, 4, 22; McKay, JA, Douglas, JJ, Ross, VG, Curran, S, Murray, GI, Cassidy, J, and McLeod, HL; Cyclin D1 protein expression and gene polymorphism in colorectal cancer. Aberdeen Colorectal Initiative, Int. J Cancer, 2000, 88, 77-81; Maeda, K, Chung, Y, Kang, S, Ogawa, M, Onoda, N, Nishiguchi, Y, Ikehara, T, Nakata, B, Okuno, M, and Sowa, M; Cyclin D1 overexpression and prognosis in colorectal adenocarcinoma, Oncology, 1998, 55, 145-151).

매트릭스 메탈로펩티다제 7(메트리라이신, 자궁)(MMP7)

매트릭스 메탈로펩티다제(MMP)는 세포 밖 매트릭스의 구성 요소를 퇴화시킬 수 있다고 설명되는 구조적으로 관련된 아연에 의존하는 단백질 분해효소의 큰 계열이다. 개개의 MMP는 종양에서 증가된 과발현을 보여주는 것으로 식별되었고 대부분의 종양은 증가된 MMP 활동을 보였다(문헌[Curran, S and Murray, GI; 1999, Matrix metalloproteinases in tumour invasion and metastasis, J Pathol., 189, 300-308: Curran, S and Murray, GI; 2000, Matrix metalloproteinases: molecular aspects of their roles in tumour invasion and metastasis, Eur. J Cancer, 36, 1621-1630]).

기초 세포막과 세포 밖 매트릭스는 악성 침입의 2개의 물리적인 장벽을 상징하고, MMP에 의한 그것들의 하락은 종양 진행과 전이성 퍼짐에 중요한 역할을 한다(문헌[Johnsen, M, Lund, LR, Romer, J, Almholt, K, and Dano, K; 1998, Cancer invasion and tissue remodeling: common themes in proteolytic matrix degradation, Curr. Opin. Cell Biol., 10, 667-671; Nelson, AR, Fingleton, B, Rothenberg, ML, and Matrisian, LM; 2000, Matrix metalloproteinases: biologic activity and clinical implications, J Clin Oncol., 18, 1135-1149; Wang, FQ, So, J, Reierstad, S, and Fishman, DA; 2005, Matrilysin (MMP-7) promotes invsion of ovarian cancer cells by activation of progelatinase, Int. J Cancer, 114, 19-31]). 이 역할 이외에도, MMP는 세포사멸, 세포 증식 그리고 세포 분리를 포함하는 종양 발달과 진행에 대한 참여에 대해 논의된다. 이런 역할들은 MMP-매개된 매트릭스 아닌 단백질의 단백질 가수 분해와 효소 활동과 다른 작용과 관련되어 있다(문헌[Egeblad, M and Werb, Z; 2002, New functions for the matrix metalloproteinases in cancer progression, Nat. Rev. Cancer, 2, 161-174; Leeman, MF, Curran, S, and Murray, GI; 2003, New insights into the roles of matrix metalloproteinases in colorectal cancer development and progression, J.Pathol., 201, 528-534]).

최근의 연구는 여러 가지 매트릭스 금속 효소, 특히 메트리라이신(MMP7)이 특정 분자 유전자와 대장암 발달에 관련된 신호 경로와 상호 작용한다는 것을 보였다. 특히, 메트리라이신은 베타-카테닌 신호 경로에 의한 대장 종양 형성의 초기에 활성화된다(문헌[Brabletz, T, Jung, A, Dag, S, Hlubek, F, and Kirchner, T; 1999, beta-catenin regulates the expression of the matrix metalloproteinas-7 in human colorectal cancer, Am.J Pathol., 155, 1033-1038; Leeman, MF, Curran, S, and Murray, GI; 2003, New insights into the roles of matrix metalloproteinases in colorectal cancer development and progression, J. Pathol., 201, 528-534; Zucker, S and Vacirca, J; 2004, Role of matrix metalloproteinases (MMPs) in colorectal cancer, Cancer Metastasis Rev., 23, 101-117]).

MMP7은 양성과 악성의 대장암 둘 다에서 과발현된다(문헌[Ishikawa, T, Ichikawa, Y, Mitsuhashi, M, Momiyama, N, Chishima, T, Tanaka, K, Yamaoka, H, Miyazakic, K, Nagashima, Y, Akitaya, T, and Shimada, H; 1996, Matrilysin is associated with progression of colorectal tumor, Cancer Lett., 107, 5-10; McDonnell, S, Navre, M, Coffey, RJ, Jr., and Matrisian, LM; 1991, Expression and localization of the matrix metalloproteinase pump-1 (MMP-7) in human gastric and colon carcinomas, Mol. Carcinog., 4, 527-533; Miyazaki, K, Hattori, Y, Umenishi, F, Yasumitsu, H, and Umeda, M; 1990, Purification and characterization of extracellular matrix-degrading metalloproteinase, matrin (pump-1), secreted from human rectal carcinoma cell line, Cancer Res., 50, 7758-7764; Nagashima, Y, Hasegawa, S, Koshikawa, N, Taki, A, Ichikawa, Y, Kitamura, H, Misugi, K, Kihira, Y, Matuo, Y, Yasumitsu, H, and Miyazaki, K; 1997, Expression of matrilysin in vascular endothelial cells adjacent to matrilysin-producing tumors, Int. J Cancer, 72, 441-445; Newell, KJ, Witty, JP, Rodgers, WH, and Matrisian, LM; 1994, Expression and localization of matrix-degrading metalloproteinases during colorectal tumorigenesis, Mol. Carcinog., 10, 199-206; Yoshimoto, M, Itoh, F, Yamamoto, H, Hinoda, Y, Imai, K, and Yachi, A; 1993, Expression of MMP-7 (PUMP-1) mRNA in human colorectal cancers, Int. J Cancer, 54, 614-618]). MMP7은 종양 세포에 의해 실제로 분비되는 단지 몇 개뿐인 MMP들 중 하나이다(문헌[Overall, CM and Kleifeld, O; 2006, Tumour microenvironment - opinion: validating matrix metalloproteinases as drug targets and anti-targets for cancer therapy, Nat. Rev. Cancer, 6, 227-239]). 또한, MMP7 mRNA 발현의 수준은 CRC진행의 단계와 관련되어 있다(문헌[Ishikawa, T, Ichikawa, Y, Mitsuhashi, M, Momiyama, N, Chishima, T, Tanaka, K, Yamaoka, H, Miyazakic, K, Nagashima, Y, Akitaya, T, and Shimada, H; 1996, Matrilysin is associated with progression of colorectal tumor, Cancer Lett., 107, 5-10; Mori, M, Barnard, GF, Mimori, K, Ueo, H, Akiyoshi, T, and Sugimachi, K; 1995, Overexpression of matrix metalloproteinase-7 mRNA in human colon carcinomas, Cancer, 75, 1516-1519]). CRC 전이에서, MMMP7은 또한 중요한 역할을 한다(문헌[Adachi, Y, Yamamoto, H, Itoh, F, Hinoda, Y, Okada, Y, and Imai, K; 1999, Contribution of matrilysin (MMP-7) to the metastatic pathway of human colorectal cancers, Gut, 45, 252-258; Mori, M, Barnard, GF, Mimori, K, Ueo, H, Akiyoshi, T, and Sugimachi, K; 1995, Overexpression of matrix metalloproteinase-7 mRNA in human colon carcinomas, Cancer, 75, 1516-1519]).

증가된 MMP7 혈청 수준은 말기 대장암 환자의 열등한 예후와 관련이 되어있고(문헌[Maurel, J, Nadal, C, Garcia-Albeniz, X, Gallego, R, Carcereny, E, Almendro, V, Marmol, M, Gallardo, E, Maria, AJ, Longaron, R, Martinez-Fernandez, A, Molina, R, Castells, A, and Gascon, P; 2007, Serum matrix metalloproteinase 7 levels identifies poor prognosis advanced colrctal cancer patients, Int. J Cancer, Published Online: 8 May 2007]), CRC 환자의 과발현은 감소된 생존과 관련되어 있으며 이것은 종양 세포의 Fas를 분열함으로써 면역 감시로부터 벗어나는 것을 장려한다고 시사되고 있다(문헌[Wang, WS, Chen, PM, Wang, HS, Liang, WY, and Su, Y; 2006, Matrix metalloproteinase-7 increases resistance to Fas-mediated apoptosis and is a poor prognostic factor of patients with colorectal carcinoma, Carcinogenesis, 27, 1113-1120]).

발명의 단백질은 여러 종양 유형의 종양 특정 면역 반응의 표적이 될 수 있다.

B형 간염 바이러스 핵심 항원 펩티드 HBV-001은 내인성 인간 종양 관련 항원에서 유도되지 않고, B형 간염 바이러스 핵심 항원에서 유도되었다. 첫째, TUMAP에 의해 유도된 T-조력 반응의 규모를 양적으로 비교할 수 있게 하고, 따라서 항종양 반응을 유도하는 능력에 대한 중요한 결론을 내릴 수 있게 한다. 둘째, 환자에게 T 세포 반응이 없는 경우 중요한 양성 대조군의 역할을 한다. 그리고 셋째로, 환자의 면역 능력의 상태에 대한 결론을 내릴 수 있게 한다.

B형 간염 바이러스(HBV) 감염은 전세계에 3억 5천만명 정도에 영향을 끼치는 간 질병의 주요 원인 중 하나이다(문헌[Rehermann, B and Nascimbeni, M; Immunology of hepatitis B virus and hepatitis C virus infection, Nat. Rev. Immunol., 2005, 5, 215-229]). 수평과 수직 전송의 용이성과 간경변과 간암으로 이를 수 있는 만성 질병의 가능성 때문에, HBV는 전세계의 많은 나라의 공중 보건 시스템에 큰 영향을 미친다. HBV 게놈(문헌[Previsani, N and Lavanchy, D; 2002, Hepatitis B, (Epidemic and Pandemic Alert and Response, World Health Organization, Geneva, 2002)])은 부분적으로 2배의 요소 원형 DNA로 구성되어 있다. HBV 비리온에서, 그것은 핵심 단백질 HBc와 다른 단백질과 같이 채워져 지질을 가지고 있는 밖 외피와 표면 단백질 계열 HBs(외피 단백질이라고도 불림)에 둘러 쌓인 뉴클레오캡시드를 만든다. HBc 및 HBs와 관련된 항원의 결정자는 HBcAg와 HBsAg로 기록된다. 이 항원들은 예를 들면 환자의 신체에서 찾을 수 있는 항체 반응 같은 혈청학과 관련이 되어있고, HBV 감염을 진단하는데 임상적으로 가장 유용한 항원-항체 시스템 중 하나이다. HBc는 HBV 감염의 병력이 없는 모든 개인의 새로운 이질적인 항원을 나타낸다. 면역성 펩티드가 이 항원에 잘 알려져 있으므로(문헌[Bertoletti, A, Chisari, FV, Penna, A, Guilhot, S, Galati, L, Missale, G, Fowler, P, Schlicht, HJ, Vitiello, A, Chesnut, RC, and .; 1993, Definition of a minimal optimal cytotoxic T-cell epitope within the hepatitis B virus nucleocapsid protein, J. Virol., 67, 2376-2380; Livingston, BD, Crimi, C, Grey, H, Ishioka, G, Chisari, FV, Fikes, J, Grey, H, Chesnut, RW, and Sette, A; 1997, The hepatitis B virus-specific CTL responses induced in humans by lipopeptide vaccination are comparable to those elicited by acute viral infection, J. Immunol., 159, 1383-1392]), HBcAg의 아미노산 펩티드 10개 중 하나가 IMA의 양성 대조군으로 선택된다. HBc 펩티드 특이적인 CTL의 유도는 환자 면역가능성과 성공적인 백신의 마커로 쓰인다.

아래에서 더 설명되어 있는 것 같이, 약학 조성물은 더 효과적이기 위해 또 추가적인 펩티드 및/또는 첨가제를 가질 수 있다.

주어진 아미노산 서열의 "변종 아미노산 서열"로서 발명자들은 측면 서열, 예를 들면, 하나 또는 2개의 아미노산 잔기가 펩티드가 HLA 분자에 주어진 아미노산 서열을 가지고 있는 펩티드가 하는 것처럼 충분히 결합할 수 있도록 변경된다(예를 들면 다른 자연적으로 생기는 아미노산 잔기 또는 어떤 다른 측면 서열로 교체함). 예를 들면, 펩티드는 HLA-A 또는 -DR 같은 적합한 MHC 분자와 상호 작용을 하고 결합할 수 있는 능력을 유지하거나 진보시킬 수 있도록 수정될 수 있고, 이 발명의 관점에서 정의된 것처럼 아미노산 서열을 가진 폴리펩티드를 발현하는 세포를 인식하고 소멸시킬 수 있는 활성화된 CTL을 생성할 수 있는 능력을 유지하거나 진보시킬 수 있다. 데이터베이스에서 추론되듯이 HLA-A 결합 펩티드의 특정 위치는 일반적으로 잔기를 고정시키고 HLA 결합 적합의 결합 모티프에 맞는 핵심 서열을 만든다.

T-세포 수용체와 상호 작용을 하지 않아도 되는 아미노산 잔기는 혼합이 T-세포 반응에 실질상 영향을 미치지 않고 관련된 MHC에의 결합을 제거하지 않는 변종 아미노산에 의한 교체에 의해 수정될 수 있다. 따라서, 주어진 조건 말고, 발명의 펩티드는 아미노산 서열 또는 그 일부 또는 주어진 변종을 포함한 모든 펩티드(발명자들이 포함한 용어는 올리고펩티드 또는 폴리펩티드)가 될 수 있다.

또한 MHC-클래스 II가 있는 펩티드는 어떤 HLA-특정 아미노산 모티프가 있는 "핵심 서열" 그리고 선택적으로 핵심 서열의 기능을 방해하지 않는 N- 및/또는 C-말단 확장을 가지고 있는 것으로 알려져 있다(예를 들면, 펩티드와 T 세포의 상호 작용에 관계가 없는 것으로 간주된다). N- 및/또는 C-말단 확장은 예를 들면 아미노산의 길이가 각각 1 내지 10일 수 있다. 이 펩티드들은 MHC 클래스 II 분자를 취하는데 직접적으로 쓰이거나 서열은 밑의 설명과 같이 벡터로 복제될 수 있다. 이 펩티드들이 세포 안의 큰 펩티드 처리의 최종 산출물을 만들기 때문에 더 긴 펩티드도 사용될 수 있다. 본 발명의 펩티드는 임의의 크기일 수 있으나 일반적으로 분자 무게가 100,000보다 낮고, 50,000보다 낮은 것이 선호되고, 10,000보다 낮은 것이 더 선호되고, 일반적으로 5,000이다. 아미노산 잔기의 숫자 측면에서, 발명의 펩티드는 1000보다 적은 잔기를 가지고 있으며, 500보다 적은 것이 선호되고, 100보다 적은 것이 더 선호된다. 따라서 본 발명은 펩티드와 변종도 제공하는데, 그 변종의 총괄적인 길이가 8 내지 100, 8 내지 30이 더 선호되고, 8 내지 16, 즉 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 또는 16의 아미노산이 제일 선호된다.

유사하게, 발명의 펩티드가 있는 T-세포 교차 반응을 유도하는 변종은 종종 길이 변종이다.

만약 펩티드가 12의 아미노산 정도 보다 길면, 잔기는 MHC 클래스 II 분자에 직접 결합하는데 쓰이고, 핵심 HLA 결합 영역의 측면에 있는 잔기는 펩티드가 MHC 클래스 II 분자의 결합 적합에 특이적으로 결합하는 능력에 크게 영항을 주지 않고 펩티드를 CTL에 나타내는 것이 선호된다. 그러나, 위에서 말한 대로, 특히 폴리뉴클레오티드에 의해 결합될 때, 더 큰 펩티드가 적합한 항원을 보이는 세포에 의해 조각날 수 있으므로 더 큰 펩티드가 쓰일 수도 있다.

또한 MHC 클래스 I 에피톱은 보통 8 내지 10의 아미노산 정도의 길이이지만, 더 긴 펩티드의 펩티드 처리 또는 실제의 에피톱을 포함한 단백질에 의해 생성될 가능성도 있다. MHC 클래스 II 에피톱과 비슷하게, 결합 영역 측면의 잔기는 펩티드가 MHC 클래스 I 분자의 결합 홈에 특정하게 결합할 수 있거나 CTL에 펩티드를 발현할 수 있거나 처리 도중 실제의 에피톱을 드러내기 위해 필요한 단백질 가수 분해 분할을 위한 영역을 마스킹하는 능력에 실질상 영향을 끼치지 않는다.

따라서 본 발명은 전체 길이가 8 내지 100, 더욱 바람직하게는 8 내지 30, 가장 바람직하게는 8 내지 16, 즉 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 또는 16인 펩티드와 MHC 클래스 I 에피톱의 변종을 제공한다.

물론, 본 발명에 따른 펩티드 또는 변종은 인간 주요 조직 적합성 조합(MHC) 클래스 I 또는 II의 분자에 결합할 수 있는 능력을 가진다. 펩티드 또는 변종의 MHC 조합에 대한 결합은 이 기술에서 알려진 방법들로 시험 될 수 있다, 예를 들면, 본 발명에서 예로 든 밑의 예들이나 다른 MHC 클래스 II 대립 유전자에 대한 문헌에서 설명한 것들이다(예를 들어, 문헌[Vogt AB, Kropshofer H, Kalbacher H, Kalbus M, Rammensee HG, Coligan JE, Martin R; Ligand motifs of HLA-DRB5*0101 and DRB1*1501 molecules delineated from self-peptides; J Immunol. 1994; 153(4):1665-1673; Malcherek G, Gnau V, Stevanovic S, Rammensee HG, Jung G, Melms A; Analysis of allele-specific contact sites of natural HLA-DR17 ligands; J Immunol. 1994; 153(3):1141-1149; Manici S, Sturniolo T, Imro MA, Hammer J, Sinigaglia F, Noppen C, Spagnoli G, Mazzi B, Bellone M, Dellabona P, Protti MP; Melanoma cells present a MAGE-3 epitope to CD4(+) cytotoxic T cells in association with histocompatibility leukocyte antigen DR11; J Exp Med. 1999; 189(5): 871-876; Hammer J, Gallazzi F, Bono E, Karr RW, Guenot J, Valsasnini P, Nagy ZA, Sinigaglia F; Peptide binding specificity of HLA-DR4 molecules: correlation with rheumatoid arthritis association; .J Exp Med. 1995 181(5):1847-1855; Tompkins SM, Rota PA, Moore JC, Jensen PE; A europium fluoroimmunoassay for measuring binding of antigen to class II MHC glycoproteins; J Immunol Methods. 1993;163(2): 209-216; Boyton RJ, Lohmann T, Londei M, Kalbacher H, Halder T, Frater AJ, Douek DC, Leslie DG, Flavell RA, Altmann DM; Glutamic acid decarboxylase T lymphocyte responses associated with susceptibility or resistance to type I diabetes: analysis in disease discordant human twins, non-obese diabetic mice and HLA-DQ trasgenic mice; Int Immunol. 1998 (12):1765-1776]).

추가적인 N- 및/또는 C-말기 발견된 MHC 분자의 에피톱으로서 작용하는 펩티드의 부분을 형성하지 않는 아미노산의 확장이지만, 그럼에도 불구하고, 본 발명에 따르면 펩티드의 세포로의 효율적인 도입을 제공하는데 중요할 수 있다. 본 발명의 구현 중 하나에서는, 본 발명의 펩티드는 예를 들면 NCBI, 젠뱅크(GenBank) 등록번호 X00497(문헌[Strubin, M., Mach, B. and Long, E.O. The complete sequence of the mRNA for the HLA-DR-associated invariant chain reveals a polypeptide with an unusual transmembrane polarity EMBO J. 3 (4), 869-872 (1984)])에서 나온 것처럼 HLA-DR 항원 관련된 불변의 서열(페이지 33, 아래의 "li")의 80N-말기 아미노산을 가지고 있는 용해 단백질이다.

펩티드가 8 내지 100, 바람직하게는 8 내지 30, 가장 바람직하게는 8 내지 16의 아미노산의 전체 길이를 갖는 약학 조성물이 바람직하다.

추가적으로, 펩티드나 그 변형은 안정성 및/또는 더 강한 면역 반응을 유도하기 위한 MHC 분자에 대한 결합을 증진시키기 위해서 더 수정될 수 있다. 펩티드 서열의 최적화를 위한 방법은 이 분야에 잘 알려졌으며 예를 들면 역 펩티드 결합 또는 비-펩티드 결합을 포함한다.

따라서, 발명의 다른 측면에 따르면, 발명은 하나 이상의 펩티드 또는 변형이 비-펩티드 결합을 포함하는 약학 조성물을 제공한다.

역 펩티드 결합에서는 아미노산 잔기는 펩티드(-CO-NH-) 연결에 의해서 결합되지 않지만, 펩티드 결합은 바뀐다. 이런 레트로-인버르 펩타이드모방체학은 문헌[Meziere et al (1997) J. Immunol. 159, 3230-3237]에서 설명되고 여기에서 참조로 통합된 예와 같은, 이 분야에 알려진 방법을 사용하여 만들어 질 수 있다. 이 접근 방법은 등뼈와 관련된 차이를 가진 유사펩티드를 만드는 것을 포함하지만, 측면 서열의 지향은 포함하지 않는다. 메지어(Meziere, 1997) 등은 MHC와 T 조력 세포 반응에서, 이 유사 펩티드는 유용하다고 했다. CO-NH 펩티드 결합 대신에 NH-CO 결합을 가지고 있는 레트로-인버스 펩티드는 단백질 가수 분해에 더 저항력이 있다.

비-펩티드 결합은 예를 들면 -CH₂-NH, -CH₂S-, -CH₂CH₂-, -CH=CH-, -COCH₂-, -CH(OH)C_H2- 및 -CH₂SO-이다. 미국특허 제4,897,445호는 표준 절차에 의해 혼합된 폴리펩티드와 아미노 알데히드와 NaCNBH₃이 있는 아미노산에 반응하는 비-펩티드 결합 혼합에 관련된 폴리펩티드 서열의 비-펩티드 결합(-CH₂-NH) 혼합의 고체 단계를 위한 방법을 제공한다.

위에 설명된 발명의 서열로 구성된 펩티드는 예를 들면, 안정성, 생물학적 이용가능성, 및/또는 펩티드와의 친화력을 증진시키기 위해서 아미노 및/또는 카르복시 테르미니가 있는 추가적인 화학적 기와 함께 혼합될 수 있다. 예를 들면, 카보벤족실, 단실, t-부틸옥시카본일 등의 소수성 기는 펩티드의 아미노 테르미니에 더해질 수 있다. 비슷하게, 아세틸 기 또는 9-플루오렌일메톡시-카본일 기는 펩티드의 아미노 테르미니에 자리 잡을 수 있다. 추가적으로, 소수성 기, t-부틸옥시카본일 또는 아미노 기는 펩티드의 카르복시 테르미니에 더해질 수 있다.

또한, 발명의 모든 펩티드는 입체 배열을 변경하기 위해 혼합될 수 있다. 예를 들면, 하나 또는 여러 펩티드 아미노산 잔기의 D-이성질체는 보통 L-이성질체 대신에 쓰일 수 있다. 또한, 이 발명의 펩티드의 하나 이상의 아미노산 잔기는 다른 잘 알려진 비 자연적으로 나타나는 아미노산 잔기로 대신될 수 있다. 이런 변경은 안정성, 생물학적 이용가능성, 그리고 또는 발명의 펩티드의 결합 작용을 증진시킬 수 있다.

비슷하게, 발명의 펩티드 또는 변형은 펩티드 합성의 이전 또는 이후에 특정 아미노산에 반응함으로써 화학적으로 수정될 수 있다. 이런 수정의 예는 이 분야에서 잘 알려져있고, 예를 들면, 문헌[R. Lundblad, Chemical Reagents for Protein Modification, 3rd ed. CRC Press, 2005]에서 요약되고 여기에서 참조에 의해 통합되었다. 아미노산의 화학적 수정은 아실화, 아미드화, 리신의 피리독실화, 감소하는 알킬화, 2,4,6-트라이니트로벤젠 술포닉 산(TNBS)이 있는 아미노 기의 트라이니트로벤젠화, 카르복실 기의 아미드 수정 그리고 시스테인의 시스테인산으로의 퍼포민산 산화작용에 의한 설피드릴 수정, 수은 유도의 형성, 다른 티올 화합물과 섞인 다이설피드 형성, 말레이 미드와의 반응, 요오드화 아세트산 또는 요오드 아세트 아미드와의 카르복시 메틸화, 알칼리성 pH에서의 시안산염의 카바밀화가 있지만 이것 뿐은 아니다. 이것에 대해서, 당업자는 단백질의 화학적 수정에 관한 더 광대한 방법을 위해서 문헌[Chapter 15 of Current Protocols In Protein Science, Eds. Coligan et al. (John Wiley & Sons NY 1995-2000)]을 참조한다.

간단하게, 예를 들어 단백질의 알지닐 잔기의 수정은 부가물을 형성하기 위해서 페닐글리옥살, 2,3-뷰탄다이온, 그리고 1,2-시클로헥산 다이온 같은 인근 카보닐 화합물의 반응에 기반을 두고 있다. 또 다른 예는 알지닐 잔기에 대한 메틸 글리 옥살의 반응이다. 시스테인은 다른 리신과 히스티딘 같은 친핵성 부위의 부수물 수정 없이도 수정될 수 있다. 피어스 케미칼 캄파니(Pierce Chemical Company), 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich)의 다른 회사의 웹 사이트는 특정 반응물에 대한 정보를 제공한다.

단백질의 이황화물 결합의 선택적인 감소도 일반적이다. 이황화물 결합은 생물 의약품의 열 치료 동안 형성되고 산화될 수 있다.

우드워드(Woodward) 시약 K는 특정 글루타민산 잔기를 수정하는데 쓰일 수 있다. N-(3-(다이메틸아미노)프로필)-N'-에틸카보다이이미드는 분자내 리신 잔기와 글루타민산 잔기 사이의 연결 고리를 형성하는 데 쓰일 수 있다.

예를 들면, 다이에틸파이로카보네이트는 단백질의 히스티딘 잔기의 수정을 위한 반응물이다. 히스티딘은 또한 4-하이드록시-2-노넨알을 사용하여 수정될 수 있다.

리신 잔기와 다른 α 아미노 기의 반응은, 예를 들면, 펩티드가 표면에 결합하거나 단백질/펩티드의 교차 결합하는데 유용하다. 리신은 폴리(에틸렌)글리콜의 접착 부위이며 단백질의 글리케이션의 수정의 주요 부위이다.

단백질에 메티오닌 잔기는 예를 들면, 요오드아세트아미드, 브로모에틸라민, 클로라민 T로 인해 수정될 수 있다.

테트라니트로메탄과 N-아세틸이미다졸은 티로실 잔기의 수정을 위해 쓰일 수 있다. 다이타이로신의 형성을 통한 교차 결합은 과산화 수소/구리 이온과 같이 수행될 수 있다.

트립토판의 수정에 대한 최근의 연구는 N-브로모석시니미드, 2-히드록시-5-니트로벤질 브로마이드 또는 3-브로모-3-메실-2-(2-니트로페닐메르캅토)-3H-인돌(BPNS-스카톨)을 사용했다.

PEG로의 치료적인 단백질과 펩티드의 성공적인 수정은 순환계 반감기의 확장과 자주 연결이 되고, 단백질의 글루타르알데히드, 폴리에틸렌 글리콜 아크릴레이트와 포름알데히드와의 교차 결합은 히드로겔의 준비에 쓰인다. 면역요법을 위한 알레르기의 화학적 수정은 자주 카바밀화와 칼륨시안산염에 의해서 얻어진다.

일반적으로 펩티드와 변형물(최소한 아미노산 잔기 사이에 펩티드 서열을 가지고 있는 것들)은 합성될 수 있다, 예를 들면, 문헌[Lu et al (1981) J. Org. Chem. 46, 3433] 및 이의 참고 문헌에서 밝혀진 대로 고체 단계 펩티드 합성물의 Fmoc-폴리아미드 모드를 쓴다.

정제는 재결정 작용, 크기 배제 크로마토그래피, 이온-교환 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피와 (보통) 예를 들면, 아세 니트릴/물 감증 분리를 사용하는 역상 고성능액체 크로마토그래피와 같은 기술 혼자 또는 여러 개의 합동으로 효력이 있을 수 있다.

펩티드의 분석은 박막 크로마토그래피, 겔전기 영동법, 특히, 모세관 전기, 고체 상 추출(CSPE), 역상 고성능액체 크로마토그래피, 산 가수분해 후 아미노산 분석과 고속 원자 폭격(FAB) 대량 분광계 분석과 MALDI와 ESI-Q-TOF 대량 분광계 분석을 사용하여 수행될 수 있다.

발명의 추가 측면은 발명의 펩티드나 변형물에 코딩하는 핵산(예를 들면, 폴리뉴클레오티드)을 제공한다. 폴리뉴클레오티드는 예를 들면, DNA, cDNA, PNA, CNA, RNA, 단독- 및/또는 이중-꼬임, 또는 원시 또는 예를 들면, 티오 인산 에스테르 척추가 있는 폴리뉴클레오티드 같은 안정된 폴리뉴클레오티드 형, 또는 이것들의 조합일 수 있고, 그것은 펩티드를 위해 코딩만 한다면 인트론을 가질 수도 안 가질 수도 있다. 물론, 자연적으로 일어나는 아미노산 잔기를 가진 펩티드만이 자연적으로 일어나는 펩티드 결합과 만나 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된다. 이 발명의 또 다른 측면은 발명에 따른 폴리펩티드를 발현할 수 있는 발현 벡터를 제공한다. 다른 세포 종류의 발현 벡터는 이 분야에서 잘 알려져 있으며 과도한 실험 없이도 선택될 수 있다.

일반적으로, DNA는 발현에 적절한 방침과 리딩프레임에서 플라스미드와 같은 발현 벡터에 삽입된다. 필요하다면, 제어가 일반적으로 발현 벡터에서 유용하지만, 원하는 호스트에 의해 인정되는 적절한 복사와 해석 규제 제어 뉴클레오티드 서열에 연결될 수 있다. 벡터는 표준 기술에 의해 호스트에 도입된다. 안내는 예를 들면, 문헌[Sambrook et al (1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY]에서 찾을 수 있다.

그러나, 이 발명의 특히 바람직한 양태에서는, 약학 제형은 서열식별번호 1번 내지 서열식별번호 15번에 따른 아미노산 서열로 이루어진 2개 이상의 펩티드를 포함한다.

백신에 포함될 각 펩티드의 최적의 양과 처방은 이 분야의 당업자가 과도한 실험 없이도 정할 수 있다. 예를 들면, 펩티드나 그 변형물은 정맥(i.v.) 주사, 피하(s.c.) 주사, 피내(i.d.) 주사, 복막내(i.p.) 주사, 근육내(i.m.) 주사에 의해 준비 될 수 있다. 선호되는 펩티드 주사 방법은 s.c., i.d., i.p., i.m.과 i.v.이다. 선호되는 DNA 주사 방법은 i.d., i.m., s.c., i.p. 및 i.v.이다. 예를 들면, 1 내지 500mg, 50㎍ 내지 1.5mg, 더 선호되는 125㎍ 내지 500㎍의 펩티드 또는 DNA 처방을 줄 수 있고 각각의 펩티드와 DNA에 따라 다르다. 이 범위의 처방은 전 실험에 성공적으로 쓰였다(문헌[Brunsvig PF, Aamdal S, Gjertsen MK, Kvalheim G, Markowski-Grimsrud CJ, Sve I, Dyrhaug M, Trachsel S, Mㆈller M, Eriksen JA, Gaudernack G; Telomerase peptide vaccination: a phase I/II study in patients with non-small cell lung cancer; Cancer Immunol Immunother. 2006; 55(12):1553-1564; M. Staehler, A. Stenzl, P. Y. Dietrich, T. Eisen, A. Haferkamp, J. Beck, A. Mayer, S. Walter, H. Singh, J. Frisch, C. G. Stief; An open label study to evaluate the safety and immunogenicity of the peptide based cancer vaccine IMA901, ASCO meeting 2007; Abstract No 3017]).

발명의 약학 조성물은 조성에 있는 펩티드의 선택, 개수 및/또는 양은 조직, 암, 및/또는 환자-특정이 되도록 소집될 수 있다. 예를 들면, 정확한 펩티드의 선택은 부작용을 피하기 위해 주어진 조직의 모 단백질의 발현 패턴에 의해 안내될 수 있다. 이 선택은 환자가 앓고 있는 특정 암 유형, 질병의 상태, 이전에 치료 계획, 환자의 면역 상태, 그리고 물론 환자의 HLA-일배체형에 의존 할 수 있다. 또한, 발명에 따른 백신은 개인의 필요에 따른 구성 요소를 가질 수 있다. 예로는 특정 환자의 관련 TAA의 발현에 따른 펩티드의 양의 차이, 개인적인 알레르기와 다른 치료에 따른 원치 않는 부작용, 첫 라운드 또는 치료 방식에 따른 두 번째 치료의 조정이 있다.

CRC의 백신에 쓰이는 조성물에서, 예를 들면, 모 단백질이 정상 조직에서 많은 양이 발현되는 펩티드는 회피되고 또는 발명의 조성물에서 낮은 양으로 존재한다. 다른 한편, 종양 환자가 특정 단백질이 많은 양으로 발현되는 것이 알려지면 그에 따른 이 암에 대한 치료를 위한 약학 조성물은 많은 양으로 존재할 수 있으며/있거나 이 특정 단백질 또는 단백질의 경로의 펩티드는 하나 이상 포함될 수 있다. 당업자는 시험에 의해 선호되는 면역성 펩티드 조합을 선택할 수 있다, 예를 들면, 생체외 T 세포의 효율성, 전체적인 존재, 확장, 친화력, T 세포의 특정 펩티드를 위한 확대, T 세포의 기능뿐만 아니라 생성이다, 예를 들면, IFNγ 제조(밑의 예 참조)를 분석한다. 보통, 가장 효율적인 펩티드는 위에 설명된 목적을 위한 백신으로 결합된다.

적합한 백신은 1 내지 20의 펩티드, 더 선호되는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20의 다른 펩티드, 더 선호되는 6, 7, 8, 9, 10 11, 12, 13 또는 14의 펩티드, 그리고 가장 선호되는 14의 다른 펩티드를 가진다. 암 백신에서 쓰이는 펩티드의 길이는 어떤 적당한 펩티드일 수 있다. 특히, 9-mer 펩티드 또는 7-mer 또는 8-mer 또는 10-mer 또는 11-mer 펩티드 또는 12-mer, 13-mer, 14-mer 또는 15-mer 펩티드가 적당할 수 있다. 더 긴 펩티드도 적당할 수 있다, 첨부된 표 1과 2에서 설명된 9-mer 또는 10-mer 펩티드는 MHC 클래스 I 펩티드로 선호되고, 12-에서 15-mers는 MHC 클래스 II 펩티드로 선호된다.

펩티드는 종양 또는 암 백신을 구성한다. 그것은 영향을 받는 기관이나 체계적으로 환자에게 직접 투여될 수도 있고, 환자에서 유도된 세포나 인간 세포주에 생체외 적용하여 그 후 환자에게 투여될 수도 있고, 또는 환자에서 유도된 면역 세포 부분모집단을 선택하기 위해 생체외에서 쓰여 다시 환자에게 투여될 수도 있다.

펩티드는 상당히 순수할 수 있고, 또는 면역-자극 보조제(밑 참조)와 결합될 수 있고 또는 면역-자극 사이토카인과 결합하여 쓰일 수 있고, 또는 예를 들면 리포솜 같은 적당한 배급 시스템으로 투여될 수 있다. 펩티드는 또한 열쇠구멍 삿갓조개 헤모시아닌(KLH)이나 마난(국제특허공개공보 제95/18145호와 문헌[Longenecker et al (1993) Ann. NY Acad. Sci. 690,276-291] 참조) 같은 담체와 결합될 수도 있다. 펩티드는 태그될 수도 있고, 융합 단백질일 수도 있고, 하이브리드 분자일 수도 있다. 본 발명에서 주어진 서열의 펩티드는 CD4 또는 CD8 CTL을 자극하도록 예상된다. 그러나, 반대의 CD에서 T 세포 양성의 도움이 있으면 자극은 더 효율적이다. 따라서, CD4 CTL을 자극하는 MHC 클래스 II 에피톱에서, 융합 파트너나 하이브리드 분자의 부분은 CD8양성 T 세포를 자극하는 에피톱을 적절하게 제공한다. 다른 한편, CD8 CTL을 자극하는 MHC 클래스 I 에피톱에서, 융합 파트너나 하이브리드 분자의 부분은 CD4양성 T 세포를 자극하는 에피톱을 적절하게 제공한다. CD4- 와 CD8-자극 에피톱은 이 분야에서 잘 알려졌으며 본 발명에서 식별된 것을 포함한다.

면역 반응을 유도하기 위해서는 조성을 더 면역성있게 만드는 첨가제가 필요하다. 따라서, 발명의 선호되는 구현에서는, 약학 조성물은 하나 이상의 보조제를 가진다. 보조제는 특정하지 않게 면역 반응을 향상시키거나 강력하게 하는 물질이다(예를 들면, 항원에 대한 CTL와 조력-T(TH) 세포에 의해 매개된 면역 반응, 따라서 본 발명의 약제에 유용하다고 간주된다). 적절한 보조제는 1018 ISS, 알루미늄 염, 암플리백스, AS15, BCG, CP-870,893, CpG7909, 사이아에이(CyaA), dSLIM, GM-CSF, IC30, IC31, 이미퀴모드, 이무팩트(ImuFact) IMP321, IS 패치(Patch), ISS, 이스코마트릭스(ISCOMATRIX), 주브이뮨(JuvImmune), 리포백(LipoVac), MF59, 모노포스포릴 리피드 A, 몬타나이드(Montanide) IMS 1312, 몬타나이드 ISA 206, 몬타나이드 ISA 50V, 몬타나이드 ISA-51, OK-432, OM-174, OM-197-MP-EC, 온택(ONTAK), 펩텔(PepTel; 등록상표) 벡터 시스템, PLG 극미립자, 레시퀴모드, SRL172, 비로좀(Virosome) 및 다른 바이러스-형 입자, YF-17D, VEGF 트랩, R848, 베타-글루칸, Pam3Cys, 사포닌에서 유도된 아퀼라스(Aquila's) QS21 스티물론(미국 메사츄세스주 워체스터 소재 아퀼라 바이오텍(Aquila Biotech)), 마이코 박테리아 추출물과 합성 박테리아 세포 벽 의태, 리비스 데톡스 퀼(Ribi's Detox. Quil) 또는 수퍼포스(Superfos)와 같은 다른 독점 보조제들이 있고 이들이 다는 아니다. 비완성된 프로인드스(Freund's)나 GM-CSF 같은 보조제가 선호된다. 수지상 세포와 그 준비에 특정한 여러 면역학적 보조제(예를 들면 MF59)는 이전에 설명되었다(문헌[Dupuis M, Murphy TJ, Higgins D, Ugozzoli M, van Nest G, Ott G, McDonald DM; Dendritic cells internalize vaccine adjuvant after intramuscular injection; Cell Immunol. 1998; 186(1):18-27; Allison AC; The mode of action of immunological adjuvants; Dev Biol Stand. 1998; 92:3-11]). 또한 사이토카인도 쓰일 수 있다. 여러 가지 사이토카인은 임파 조직으로의(예를 들면, TNF-α), 수지상 세포 이전에 영향을 미친다고 직접적으로 연결되어있고, 수지상 세포를 T-임파구(예를 들면, GM-CSF, IL-1 및 IL-4)(미국특허 제5,849,589호, 전체적으로 특정하게 참조로서 합동됨)를 위한 효율적인 항원 제공 세포로의 성숙을 가속시키고, 면역 보조제의 역할을 한다(예를 들면, IL-12)(문헌[Gabrilovich DI, Cunningham HT, Carbone DP; IL-12 and mutant P53 peptide-pulsed dendritic cells for the specific immunotherapy; J Immunother Emphasis Tumor Immunol. 1996 (6):414-418]).

CpG 면역 촉진 작용 올리고 뉴클레오티드도 백신 환경에서 보조제의 효과를 향상시킨다고 보고되었다. 이론에 의한 구속이 없이, CpG 올리고 뉴클레오티드는 주로 TLR9 같은 톨-유사 수용체(TLR)를 통해 고유의 (적응하지 않은) 면역 시스템을 활성화시키는 활동을 한다. CpG가 촉진한 TLR9 활성화는 살아있는 또는 죽은 바이러스, 수지상 세포 백신, 자가조직의 세포 백신 그리고 예방과 치료 백신의 다당류 결합 같은 펩티드 또는 단백질 항원을 포함한 여러 가지 종류의 항원에 대한 항원 특정 체액성 그리고 세포성 반응을 향상시킨다. 더 중요한 것은, TH1 세포의 향상된 활성화와 CD4 T 세포의 도움이 없을 때도 강한 세포독성 T-임파구(CTL) 생성의 결과를 낳는 수지상 세포 성숙과 분화를 향상시킨다. TLR9 자극에서 유도된 TH1 경향은 명반 또는 보통 TH2 경향을 증진시키는 불완성된 프로인드스 보조제(IFA) 같은 백신 보조제의 존재에도 유지된다. CpG 올리고 뉴클레오티드는 항원이 비교적 약할 때 강한 반응을 유도하는 마이크로입자, 나노입자, 지질 유화제 또는 비슷한 배합 같은 다른 보조제와 함께 배합되거나 투여될 때 더욱 큰 보조제 활동을 보인다. 그것들은 면역 반응을 가속시킬 수 있고, 어떤 실험에서는 CpG 없는 전체 용량 백신에 대한 비교할 만한 항체 반응으로 항원 복용을 두 가지 등급 정도로 감소시킬 수 있다(문헌[Arthur M. Krieg, Therapeutic potential of Toll-like receptor 9 activation, Nature Reviews, Drug Discovery, 2006, 5, 471-484]). 미국특허 제6,406,705 B1호는 CpG 올리고 뉴클레오티드, 비-핵산 산 보조물 그리고 항원-특정 면역 반응을 유도하는 항원의 결합된 이용을 설명한다. 상용되는 CpG TLR9 경쟁자는 본 발명의 선호되는 약학 조성물의 성분인 몰로겐(Mologen, 독일 베를린 소재) dSLIM이다(이중 줄기 루프 면역 조절제). RNA 결합 TLR 7, TLR 8 및/또는 TLR 9 같은 다른 TLR 결합 분자 역시 쓰일 수 있다.

유용한 보조제의 다른 예로는 치료적으로 및/또는 보조제의 역할을 하는 이미다조퀴놀린, 시클로포스파미드, 수니티닙, 베바시주맙, 쎄레브렉스, NCX-4016, 실데나필, 타다라필, 바데나필, 소라피닙, XL-999, CP-547632, 파조파닙, ZD2171, AZD2171, 이피리뮤맙, 트레메리뮤맙 그리고 SC58175뿐만 아니라 화학적으로 수정된 CpG(예를 들면, CpR, 이데라(Idera)), 폴리(Poly)(I:C)(예를 들어, 폴리I:C12U), 비-CpG 박테리아 DNA 또는 RNA0가 있고 이는 다가 아니다. 보조제와 본 발명의 상황에서 용이한 첨가제의 양과 농축은 장인이 과다한 실험 없이도 쉽게 정할 수 있다.

선호되는 보조제는 dSLIM, BCG, OK432, 이미퀴모드, 페비테르(PeviTer)와 주브이뮨(JuvImmune)이 있다.

발명에 따른 약학 조성물의 선호되는 구현에서, 보조제는 그래뉼로사이트 마크로파지 콜로니 자극 인자(GM-CSF, 사르그라모스팀)와 같은 콜로니-자극 인자로 이루어진 군으로부터 선택된다.

발명에 따른 약학 조성물의 선호되는 구현에서, 보조제는 이미퀴모드이다.

피하, 피부내, 근육내 또는 구두의 투약 등의 비경구 투약에 쓰인다. 이것을 위해서, 펩티드와 선택에 따라 다른 분자들은 약학적으로 허용되는 담체에서, 수성이 선호되는, 녹여지거나 중지된다. 추가로, 조성은 버퍼, 결합 약제, 발파 약제, 희석제, 향미료, 윤활제 등의 첨가제를 함유할 수 있다. 또한 펩티드는 사이토카인 같은 면역 자극 물질과 같이 투여될 수 있다. 이런 조성에서 쓰일 수 있는 첨가제의 광범위한 목록은 예를 들면 문헌[A. Kibbe, Handbook of Pharmaceutical Excipients, 3. Ed. 2000, American Pharmaceutical Association and pharmaceutical press]에서 찾을 수 있다. 이 조성은 선종성 또는 CRC가 선호되는 암 질병의 예방, 및/또는 치료에 쓰일 수 있다.

세포독성 T 세포(CTL)는 항원을 완전한 이질적인 항원 그 자체가 아닌 MHC 분자에 결합한 펩티드의 형상으로 인식한다. MHC 분자 그 자체는 항원 제공 세포의 세포 표면에 자리잡고 있다. 따라서 CTL의 활성화는 펩티드 항원, MHC 분자, 그리고 APC의 삼량체 합성이 있을 때만 가능하다. 유사하게, 펩티드가 CTL의 활성화에만 쓰이는 것이 아니라 상응하는 MHC 분자가 있는 APC가 더해지면 면역 반응을 강화시킬 수 있다.

그러므로, 본 발명에 따른 약학 조성물의 선호되는 구현은 추가로 하나 이상의 항원 제공 세포를 가진다.

일반적으로 항원 제공 세포(또는 자극 세포)는 MHC 클래스 I 또는 II 분자를 표면에 가지고 있으며 한 구현에서 선택된 항원으로 MHC 클래스 I이나 II에 로딩하기는 상당히 부족하다. 밑에서 더 설명되듯이, MHC 클래스 I 또는 II 분자는 선택된 생체외 항원으로 쉽게 로딩될 수 있다.

가급적이면 포유 동물 세포는 TAP 펩티드 운송의 기능이 없거나, 감소되었거나 기능이 떨어진다. TAP 펩티드 운송기가 없는 적당한 세포에는 T2, RMA-S와 초파리 세포가 있다. TAP는 항원 처리와 관련된 운송기이다.

결핍 세포주 T2를 로딩한 인간 펩티드는 미국 메릴랜드주 20852 록빌 파크론 드라이브 12301 소재의 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(American Type Culture Collection, ATCC)에서 카탈로그 번호 CRL 1992로 구할 수 있다. 초파리 세포주 슈나이더 라인 2는 ATCC에서 카탈로그 번호 CRL 19863으로 구할 수 있고; 쥐 RMA-S 세포주는 문헌[Karre and Ljunggren (1985) J. Exp. Med. 162, 1745]에서 설명된다. 이 세포는 APC로서 사용될 수 있고 TAP 결여 때문에 거의 대부분의 MHC 클래스 I에 나타나는 펩티드는 이 세포주의 빈 MHC 클래스 I 분자의 외부 로딩을 위해서 감시 아래 쓰이고, 따라서 모든 효과는 사용된 펩티드에 명확히 제시된다.

가급적, 항원 제공 세포는 수지상 세포이다. 적당하게, 수지상 세포는 항원성 펩티드로 펄싱된 자가조직 수지상 세포이다. 항원성 펩티드는 적절한 T 세포 반응에 증가를 주는 어떤 적당한 항원성 펩티드일 수 있다. 종양 관련 항원의 펩티드로 펄싱된 자가조직 수지상 세포를 사용하는 T 세포 치료는 문헌[Murphy et al (1996) The Prostate 29, 371-380 and Tjua et al (1997) The Prostate 32, 272-278]에서 개시된다.

따라서, 예를 들면, 실시예 4에 있는 방법으로, 본 발명의 선호되는 구현에서 하나 이상의 항원 제공 세포의 약학 조성물은 펩티드로 펄싱되거나 로딩된다.

대안으로써 발현이 포함된 세포를 나타내는 항원은 펩티드 코딩을 구성한다. 폴리뉴클레오티드는 어떤 적절한 폴리뉴클레오티드일 수 있으며, 수지상 세포를 변환하여 펩티드와 면역유도를 이끌 수 있는 것이 선호된다.

편리하게도, 발명의 핵산은 바이러스 폴리뉴클레오티드 또는 바이러스로 구성될 수 있다. 예를 들면, 아데노바이러스-변환된 수지상 세포는 MUC1과 관련된 항원-특정 항종양 면역을 유도하는 것으로 보여졌다(문헌[Gong et al (1997) Gene Ther. 4, 1023-1028] 참조). 마찬가지로, 아데노바이러스 기반의 시스템은 사용될 수 있고(예를 들면, 문헌[Wan et al (1997) Hum. Gene Ther. 8, 1355-1363]); 레트로바이러스 시스템이 사용될 수 있다(문헌[Specht et al (1997) J. Exp. Med. 186, 1213-1221 and Szabolcs et al (1997)]). 혈액 입자-매개된 수지상 세포로의 이동도 사용될 수 있고(문헌[Tuting et al (1997) Eur. J. Immunol. 27, 2702-2707]); RNA도 사용될 수 있다(문헌[Ashley et al (1997) J. Exp. Med. 186, 1177 1182] 참조)

일반적으로, 발명의 핵산을 가진 발명의 약학 조성물은 발명의 펩티드를 가지고 있는 약학 조성물과 비슷한 방식으로, 예를 들면, 정맥내로, 동맥내로, 복막내로, 근육내로, 진피내로, 종양내로, 경구적으로, 피부로, 비강으로, 협측으로, 직장으로, 질로, 흡입에 의해 또는 국소 투여에 의해 투여될 수 있다.

회피 기전 때문에 종양은 자주 치료에 쓰이는 약물에 내성을 개발한다. 약물 내성은 치료 중 생길 수 있으며, 암의 전이와 재발에서 나타난다. 약물 내성을 피하기 위해서는 일반적으로 종양은 약물의 혼합으로 치료되고, 병의 프리기간이 지나면 전이와 재발은 다른 혼합을 필요로 한다. 그러므로, 발명의 한 측면에서 약학 조성물은 두 번째 항암 약제와 함께 투여된다. 두 번째 약제는 발명의 약학 조성물의 전, 후, 또는 동시에 투여될 수 있다. 동시 투여는 예를 들면, 화학적으로 호환되는 경우, 발명의 약학 조성물과 두 번째 항암 약제를 섞어서 달성될 수 있다. 동시 투여의 또 다른 방법은 예를 들면 발명의 약학 조성물이 주사로 투여되는 동안 두 번째 항암 약제는 경구 투여되는 것처럼, 같은 날 조성과 다른 방법으로 항암 약제를 투여할 수 있다. 약학 조성물과 두번째 항암 약제는 같은 치료 코스에서 투여될 수 있으나 다른 날 및/또는 다른 치료 코스에서 투여된다.

본 발명의 다른 측면은 발명의 약학 조성물의 치료적으로 효과적인 양을 투여함으로써 환자의 암 치료와 예방 방법을 제공한다.

치료적으로 효과적인 양은 면역 반응을 유도, 특히 CTL의 소집단을 활성화하기에 충분한 양이다. 이 분야에 당업자는 현재 명세서에 제공된 실시예 같은 표준 면역 방법을 이용하여 효과적인 양을 쉽게 정할 수 있다. 다른 약학 조성물의 특정 양의 효과의 모니터링하는 방법은 치료된 종양의 성장 및/또는 재발을 관찰하는 것이다.

본 발명에 특히 선호되는 구현에서는 약학 조성물은 항암 백신으로 쓰인다.

펩티드 또는 펩티드 코딩 핵산을 가지고 있는 조성은 종양 또는 암 백신을 만들 수 있다. 그것은 영향을 받는 기관이나 체계적으로 환자에게 직접 투여될 수도 있고, 환자에서 유도된 세포나 인간 세포주에 생체외 적용하여 그 후 환자에게 투여될 수도 있고, 또는 환자에서 유도된 면역 세포 부분모집단을 선택하기 위해 생체외에서 쓰여 다시 환자에게 투여될 수도 있다.

발명의 조성은 암의 치료 방법 또는 백신으로 쓰일 수 있다. 암은 구강 및 인두의 암, 소화관의 암, 결장, 직장 및 항문의 암, 기도의 암, 유방암, 자궁 경부, 질 및 외음부의 암, 자궁 체부 및 난소의 암, 남성 요로 생식기의 암, 요로의 암, 뼈 및 연조직의 암, 카포시 육종, 피부의 흑색종, 안구 흑색종, 비-흑색종 안구암, 뇌 및 중추 신경계의 암, 갑상선 및 내분비샘의 암, 호지킨(Hodgkin) 림프종, 비-호지킨 림프종, 골수종, 바람직하게는 신장암, 대장암, 폐암, 유방암, 췌장암, 전립선암, 위암, GIST 또는 교모세포종일 수 있다.

발명에 따른 치료 방법과 백신의 가장 선호되는 구현에서, 백신은 대장 선암 치료의 여러 펩티드 종양 백신이다. 가급적이면, 백신은 초기 대장암 세포에서 인식되고 자리잡은 서열식별번호 1번 내지 서열식별번호 15번에서 선택된 종양 관련 펩티드 세트를 가지고 있다. 이 세트는 HLA 클래스 I과 클래스 II 펩티드를 포함하고 있다. 펩티드 세트는 HBV 핵심 항원 같은 피부내 투여의 효율성을 시험하는 면역 마커로 쓰이는 양성 대조군 팹티드로 쓰이는 하나 이상의 펩티드를 또한 포함한다. 하나의 특정 구현에서 백신은 각각 펩티드의 1500㎍ 내지 약 75㎍, 더 선호되는 약 1000㎍ 내지 약 750㎍과 더 선호되는 약 500㎍ 내지 약 600㎍, 그리고 가장 선호되는 약 578㎍인 14개의 개개 펩티드(서열식별번호 1번 내지 서열식별번호 15번에 따름)로 구성되어 있고, 이들은 모두 HPLC와 이온 교환 크로마토그라피로 정제될 수 있으며, 흰색이나 회색이 도는 흰색으로 보인다. 동결 건조물은 가급적이면 탄산 수소 나트륨에서 녹여지며, 실내 온도에서 재구성 후 30분 이내에 피부내 주사된다. 본 발명에 따르면, 펩티드의 선호되는 양은 용해의 500㎕ 마다 0.1 내지 100mg, 약 0.1 내지 1mg가 더 선호되고, 약 300㎍ 내지 800㎍가 제일 선호된다. 여기서 "약"이라는 용어는 달리 정해지지 않으면 주어진 숫자의 +/- 10%이다. 당업자는 펩티드의 실제로 쓰이는 양을 개개 환자의 면역 상태 및/또는 특정 암 유형에 나타나는 TUMAP 양 등의 여러 가지 인자를 기반으로 두어 조절할 수 있다. 본 발명의 펩티드는 동결 건조물 대신에 다른 적당한 형태(무균 용해, 등)로 제공될 수 있다.

해당하는 펩티드나 항원과 관련된 선종이나 암 질병 환자에게 투여되는 본 발명의 제약의 준비는 펩티드 및/또는 핵산으로 구성된다. 이렇게 함으로써 T 세포 매개 면역 반응이 일어날 수 있다.

발명에 따른 바람직한 약학 조성물은 펩티드의 양(특히 종양 관련), 핵산의 양이 발명 또는 본 발명의 약학 조성물에 따른 발현 벡터가 조직-, 암- 및/또는 환자-특이적이다.

발명의 또 다른 구현에서 백신은 핵산 백신이다. 폴리펩티드에 코딩하는 DNA 백신 같은 핵산 백신의 접종은 T 세포 반응을 이끌어 낸다. 그것은 영향을 받는 기관이나 체계적으로 환자에게 직접 투여될 수도 있고, 환자에서 유도된 세포나 인간 세포주에 생체외 적용하여 그 후 환자에게 투여될 수도 있고, 또는 환자에서 유도된 면역 세포 부분모집단을 선택하기 위해 생체외에서 쓰여 다시 환자에게 투여될 수도 있다. 만약 핵산이 생체외 세포에 투여되면, 세포들이 인터루킨-2 또는 GM-CSF 같은 면역 자극 사이토카인과 같이 공동 발현하도록 감염시키는 것이 유용할 수도 있다. 핵산은 상당히 순수할 수 있고, 또는 면역 자극 보조제와 섞일 수 있고, 또는 면역 자극 사이토카인과 섞여 사용될 수 있고, 또는 리포솜 같은 적당한 전달 시스템과 투여될 수 있다. 핵산 백신은 위의 펩티드 백신에서 설명된 보조제와 같이 투여될 수도 있다. 핵산 백신이 보조제 없이 투여되는 것이 선호된다.

폴리뉴클레오티드는 상당히 순수하거나 적당한 벡터나 전달 시스템에 포함 될 수 있다. 적당한 벡터와 전달 시스템은 아데노바이러스, 우두 바이러스, 레트로 바이러스, 헤르페스 바이러스 아데노 관련 바이러스 또는 하나 이상의 바이러스를 가진 하이브리드에 기반을 둔 바이러스를 포함한다. 비 바이러스성 전달 시스템은 양이온 리피드를 포함하며 양이온 중합체도 DNA 전달 방면에서 잘 알려졌다. "유전자 총" 같은 물리적 전달도 쓰일 수 있다. 펩티드나 핵산으로 코딩된 펩티드는 예를 들면 CD4-양성 T 세포를 자극하는 파상품 톡소이드의 에피톱 같은 용해 단백질 일 수 있다.

적당하게, 환자에게 투여된 어떤 핵산도 무균이고 발열원이 없다. 노출된 DNA는 근육내 또는 피부내 또는 피하에 줄 수 있다. 편리하게도, 핵산 백신은 임의의 적당한 핵산 전달 방법으로 구성 될 수 있다. 핵산, 가급적이면 DNA는 리포좀 또는 바이러스 벡터 전달 시스템의 부분으로 전달 될 수 있다. DNA 백신 같은 핵산 백신이 근육 안으로 투여되는 것이 선호되고, 펩티드 백신은 s.c. 또는 i.d.로 투여되는 것이 선호된다. 백신이 피부 안으로 투여되는 것도 선호된다.

핵산과 수지상 세포 같은 세포를 보이는 전문 항원 코딩된 폴리펩티드의 발현의 이해는 면역 반응 감작의 기전이 될 수 있다고 여겨진다; 그러나, 수지상 세포는 감염되지 않을 수 있으나 조직의 감염된 세포에서 발현된 펩티드를 가져올 수 있기 때문에 여전히 중요하다("교차-감작" 예를 들면, 문헌[Thomas AM, Santarsiero LM, Lutz ER, Armstrong TD, Chen YC, Huang LQ, Laheru DA, Goggins M, Hruban RH, Jaffee EM. Mesothelin-specific CD8(+) T cell responses provide evidence of in vivo cross-priming by antigen-presenting cells in vaccinated pancreatic cancer patients. J Exp Med. 2004 Aug 2;200(3):297-306]).

암의 폴리뉴클레오티드-매개된 면역요법은 문헌[Conry et al (1996) Seminars in Oncology 23, 135-147; Condon et al (1996) Nature Medicine 2, 1122-1127; Gong et al (1997) Nature Medicine 3, 558-561; Zhai et al (1996) J. Immunol. 156, 700-710; Graham et al (1996) Int J. Cancer 65, 664-670; and Burchell et al (1996) 309-313 In: Breast Cancer, Advances in biology and therapeutics, Calvo et al (eds), John Libbey Eurotext]에서 기술되어 있고, 이의 전체 내용이 참고로서 본원에 혼입되어 있다.

주사의 부위, 벡터와 전달 시스템의 표적화의 사용, 환자의 세포 집단의 선택적인 정제, 및 펩티드 또는 핵산(예를 들면, 문헌[Zhou et al (1995) Blood 86, 3295-3301; Roth et al (1996) Scand. J. Immunology 43, 646-651]에서 설명된 것처럼 정렬될 수 있는 수지상 세포)의 생체외 투여에 의해 특이적인 세포 집단, 예를 들어 항원 제공 세포를 백신의 표적으로 하는 것은 유용하다. 예를 들면, 표적 벡터는 항원의 발현을 적당한 장소에 이끄는 조직- 또는 종양-특이적인 조촉매로 구성될 수 있다.

마지막으로, 발명에 따른 백신은 환자가 앓고 있는 특정 암 유형, 질병의 상태, 이전 치료 방법, 환자의 면역 상태 그리고 물론 환자의 HLA-일배체형에서 독립적일 수 있다. 또한, 발명에 따른 백신은 특정 환자의 요구 사항에 따라 개인적인 구성 요소를 포함할 수 있다. 예로는 특정 환자의 관련 TAA의 발현에 따른 펩티드의 양의 차이, 개인적인 알레르기와 다른 치료에 따른 원치 않는 부작용, 첫 라운드 또는 치료 방식에 따른 두 번째 치료의 조정이 있다.

암의 치료에 유용한 것 이외에도, 본 발명의 펩티드는 진단에도 유용하다. 펩티드들이 교모세포종에서 생성되고, 정상 조직에서는 나타나지 않기 때문에 펩티드들은 암의 존재를 진단하는데 사용될 수 있다.

조직 생체 검사에서 본 발명의 펩티드의 존재는 암 진단 병리학을 도울 수 있다. 항체, 질량 분석 또는 이 분야에 알려진 다른 방법으로의 본 발명의 특정 펩티드의 검출은 조직이 악성, 염증 또는 일반적인 질병이 있는 가를 병리학적으로 말할 수 있다. 본 발명의 펩티드 기의 존재는 질병 조직의 분류 또는 하위분류를 가능하게 한다.

본 발명의 펩티드의 질병 조직 표본에서의 검출은, 특히 T 임파구가 알려졌거나 실행의 기전에 관련될 것이라고 예상될 때, 면역 시스템에 관련된 치료의 혜택에 대한 결정을 할 수 있게 한다. MHC 발현의 손실은 감염된 악성 세포가 면역 감시를 피하는 기전을 잘 설명한다. 따라서, 본 발명의 펩티드의 존재는 이 기전이 분석된 세포에 의해 악용되지 않는 것을 보여준다.

본 발명의 펩티드는 T 세포 반응이나 본 발명의 펩티드 또는 MHC 분자에 혼합된 본 발명의 펩티드에 대한 항체 반응 같은 본 발명의 펩티드에 대한 임파구 반응을 분석하는데 쓰일 수 있다. 임파구 반응은 추가 치료 단계의 전조 마커로 쓰일 수 있다. 이 반응은 다른 방법들, 예를 들면, 단백질의 백신, 핵산, 자가조직 물질, 임파구의 양자 전달 등을 이용해서 임파구 반응을 유도하려고 하는 면역요법 접근의 대리 마커로 쓰일 수 있다. 유전자 치료 환경에서, 본 발명의 펩티드에 대한 임파구 반응은 부작용에 대한 평가로 고려할 수 있다. 임파구 반응의 관찰은 예를 들면, 이식 대 숙주병이나 숙주병 대 이식의 검출 같은, 이식 치료의 사후 평가의 유용한 도구가 될 수 있다.

본 발명의 펩티드는 MHC/펩티드 혼합물에 대한 특정 항체를 생성하고 개발할 수 있다. 이들은 독소 또는 방사성 물질을 질병 조직에 표적화함으로써 이용될 수 있다. 항체의 다른 사용은 PET 같은 영상 목적으로 방사성 핵종을 질병 조직에 표적화하는 것이다. 이 사용은 작은 전이를 검출하거나 질병 조직의 정확한 부위와 크기를 정하는데 도움이 된다. 추가로, 펩티드는 생체 진단을 기반으로 한 병리학 진단을 확인하는 데 사용될 수 있다.

이것의 또 다른 측면은, 본 발명은 이하의 것들을 가지고 있는 도구와 관련된 것이다 (a) 위에서 설명된 약학 조성물을 용액 또는 동결 건조된 상태로 가지고 있는 용기 (b) 선택적으로, 동결 건조 공식을 위한 희석액 또는 재구성 용액을 가지고 있는 용기; 그리고 (c) 선택적으로, (i) 용액의 사용 또는 (ii) 동결 건조 공식의 재구성 및/또는 사용의 사용법. 도구는 또한 이하 중 하나 또한 여러 가지를 가질 수 있다: (iii) 버퍼 (iv) 희석액 (v) 필터 (vi) 바늘, (v) 주사. 용기는 가급적이면 병, 약병, 주가지 또는 시험관이며; 그것은 다중 사용 용기일 수 있다. 약학 조성물은 가급적이면 동결 건조된다.

본 발명의 도구는 적당한 용기 안에 있는 본 발명의 동결 건조와 그것의 재구성 및/또는 사용의 사용법으로 구성되어있다. 적당한 용기는, 예를 들면, 병, 약병(예를 들면, 듀얼 챔버 약병), 주사(듀얼 챔버 주사 같은) 그리고 시험관이다. 용기는 유리나 플라스틱 같은 여러 가지 재질로써 만들어 질 수 있다. 가급적으로 도구 및/또는 용기는 재구성 및/또는 사용에 관한 방침을 나타내는 설명서를 가지고 있거나 그런 용기와 관련이 되어 있다. 예를 들면, 라벨이 동결 건조 공식은 위에서 설명한 대로 펩티드 농축을 재구성하는 것이라고 나타낼 수 있다. 라벨은 또한 공식이 피하 투여에 유용하고 계획되었다는 것도 나타낼 수 있다.

공식을 가지고 있는 용기는 재구성된 공식의 만족적인 투여(예를 들면, 2-6 투여)를 가능하게 하는 다중-사용 약병일 수 있다. 도구는 적절한 희석액(예를 들면, 나트륨 중탄산염 용액)을 가지고 있는 두 번째의 용기를 가지고 있을 수 있다.

희석액과 동결 건조된 공식을 섞으므로써, 재구성된 공식에서 최종적 펩티드 농축은 가급적이면 0.15mg/mL/펩티드(75㎍) 이상이며 가급적이면 3mg/mL/펩티드 (1500㎍)를 넘지 않는다. 도구는 버퍼, 희석액, 필터, 바늘, 주사, 사용법이 있는 패키지 삽입물 등 상업 및 사용자의 관점에서 바람직한 다른 물질을 가지고 포함할 수 있다.

본 발명의 도구는 본 발명에 따른 약학 조성물을 가진 하나의 용기를 다른 구성 요소(예를 들면, 다른 화합물이나 다른 화합물의 약학 조성물)와 함께 또는 없이 가질 수 있고, 또는 각각의 구성 요소를 위한 다른 용기를 가질 수 있다.

가급적이면, 발명의 도구는 두 번째 화합물(보조제 (예를 들면, GM-CSF), 화학치료법 약제, 자연적인 물질, 호르몬이나 길항제, 항-혈관신생 약제나 반응 억제제, 세포사멸-유도하는 약제나 킬레이트 같은)이나 그것의 약학 조성물과 공동 투여를 위해 패키지된 제형을 포함한다. 도구의 구성 요소는 혼합 전이거나 각각의 구성 요소는 환자에게 투여 전까지 다른 용기에 담겨 있을 수 있다. 도구의 구성 요소는 하나 또는 여러 가지 액체 용액으로 제공될 수 있으며, 수성의 용액이 선호되고, 무균 수성 용액이 더 선호된다. 도구의 구성 요소는 또한 적절한 용매가 더해졌을 때 액체로 바뀌는 고체로 제공될 수 있고, 다른 용기에 제공되는 것이 더 선호된다.

치료 도구의 용기는 약병, 시험관, 병, 주사기, 또는 어떤 다른 고체나 액체를 동봉하는 수단이 될 수 있다. 일반적으로, 하나 이상의 구성 요소가 있을 때, 도구는 두 번째 병, 또는 다른 용기를 가지며, 이것은 분리된 복용을 허락한다. 도구는 또한 약학적으로 허용되는 액체를 위한 다른 용기를 가질 수 있다. 가급적으로, 치료 도구는 현재의 도구에 있는 발명의 약제의 투여를 가능하게 하는 장치(예를 들면, 하나 또는 여러 바늘, 주사, 점안기, 피펫 등)를 가진다.

본 발명의 약학 조성물은 구두(경구 투여), 코, 눈, 피하, 피부내, 근육내, 정맥내 또는 경피성 같은 어떤 펩티드 투여 방법도 적합하다. 가급적으로 투여는 s.c.이고 i.d.가 제일 선호된다. 투여는 주입 펌프로 될 수 있다.

여기서 개시되고 설명된 발명의 특징은 지적된 해당의 조합에서만 쓰일 수 있는게 아니라 현재의 의도된 범위를 벗어나지 않고, 단독으로도 쓰일 수 있다는 것이 이해되어야 한다. 본 발명의 목적을 위해 여기에 쓰인 모든 참조는 전체적으로 특정하게 참조로서 합동된다.

발명은 이제 도면, 서열목록과 예를 참조하여 더 자세히 설명된다. 아래의 예는 설명의 목적으로만 사용되었고 발명을 제한하기 위한 것이 아니다.

합성 및 구조

펩티드는 표준과 잘 설립된 고체 단계 합성에 의해서 Fmoc 화학을 사용하여 합성되었다. 예비 HPLC에 의한 정제 후, 이온-교환 절차는 생리적으로 호환 카운터 이온(아세트산이나 염화물)을 통합시키기 위해 수행되었다. 마지막으로, 동결 건조 후 백색이거나 회색에 가까운 백색의 고체가 취득되었다. TUMAP는 제조 과정 중에 기술적인 이유로 염화물 염으로 공급되는 IMA-CCN-001을 제외하고 아세트산 염으로 투여되었다.

중요한 것은, 펩티드의 정체성과 순도는 질량 분석법, 아미노산 분석과 분석적인 HPLC를 사용하여 높은 정밀도로 정해질 수 있다. 분석 결과에 따르면 IMA910 백신에 쓰이는 모든 펩티드는 순도 95% 초과에서 정확한 구조를 보여줬다.

IMA910의 펩티드의 물리-화학적 특성

재구성 후 취득된 입자의 크기 분포와 입자 모양 측정은 0.25에서 100㎛ 범위의 각각의 입자의 직접적인 이미지를 캡쳐하고 이미지 분석을 함으로써 수행되었다. 결과, 대부분의 입자는 0.25 에서 2.7㎛의 범위에 나타났다. 지금까지, 크기와 모양 분포의 큰 차이는 재구성의 1, 2 및 3시간까지 발견되지 않았다.

모범적인 제약 구성 IMA910의 구성 요소

IMA 910은 대부분이 초기 대장암 세포에서 발견된 합성 종양 관련 펩티드(TUMAP)의 혼합으로 구성되어 있다. TUMAP는 세포독성 T 세포(CD8+ T 세포)를 활성화할 수 있는 용량이 있는 10 HLA 클래스 I 결합 펩티드와 T 조력 세포(CD4+ T 세포)를 활성화할 수 있는 용량이 있는 3 HLA 클래스 II 결합 펩티드를 포함한다. T 조력 세포는 세포독성 T 세포를 CD8+ T 세포의 살기능을 증진시키는 사이토카인을 방출함으로써 도와주며 종양 세포에 대하여 직접적으로 작용할 수 있다(문헌[Knutson, KL and Disis, ML; Augmenting T helper cell immunity in cancer, Curr. Drug Targets. Immune. Endocr. Metabol. Disord., 2005, 5, 365-371]). 이 13 TUMAP에 추가적으로 IMA910은 하나의 바이러스 조절 펩티드를 포함한다.

수술에서 제거된 CRC 환자의 악성과 정상 조직 샘플과 건강한 공여체의 혈액은 계단식의 방법으로 분석되었다. 처음, 마이크로어래이에 의한 게놈 영역 mRNA 발현 분석은 정상 기관과 조직의 범위에 비해서 악성 조직에서의 유전자 과발현을 인식하는데 사용되었다.

두 번째 단계에서, 악성 물질에서의 HLA 리간드는 질량 분석기에 의해 인식되었다.

이후, 인식된 HLA 리간드는 유전자 발현 데이터와 비교되었다. 1 단계에서 검출된, 선택적으로 발현되거나 과발현된 유전자에 의해서 코딩된 펩티드는 멀티-펩티드 백신을 위한 TUMAP에 적당한 후보로 간주되었다.

TUMAP 같은 인식된 펩티드의 관련을 보조하는 추가적인 증거를 식별하기 위해 문헌적인 수색은 수행되었다.

마지막으로, 건강한 사람의 말초 CD8+ T 세포는 종양 관련 HLA 리간드에 대한 반동성은 여러 가지 면역 분석(생체외 T 세포 분석)을 이용해 시험되었다.

IMA910 TUMAP 구성

IMA910은 10 HLA-A*02(클래스 I)와 3HLA-DR(클래스 II) TUMAP를 포함한다. 추가적으로, 바이러스 마커 펩티드 HBV-001은 여기에 나열되지 않았지만 포함된다.

종양 샘플의 IMA910에 들어있는 에피톱의 표시

준비

각각의 환자들의 서면 동의를 받은 후 수술로 제거된 조직 표본은 독일 튀빈겐 소재 우니버시태츠클리니크 피어 알게마인, 피스체랄- 운트 트란스플란타티온쉬구르지(Universitatsklinik fur Allgemeine, Viszeral- und Transplantationschirurgie)에 의해 제공되었다.

조직 샘플에서 HLA 펩티드의 단리

충격 냉동된 조직 샘플의 HLA 펩티드 풀은 HLA-A*02-특이적인 항체 BB7.2 또는 HLA-A, -B, -C-특정 항체 W6/32, CNBr-활성화된 세파로오스, 산성치료와 한외 여과를 이용하는 약간 수정된 프로토콜에 따르는 단단한 조직의 면역 촉진에 의해 취득되었다(문헌[Falk, K., Rotzschke, O., Stevanovic, S., Jung, G. & Rammensee, H. G. Allele-specific motifs revealed by sequencing of self-peptides eluted from MHC molecules, Nature 1991, 351, 290-296; Seeger, F. H. et al. The HLA-A*6601 peptide motif: prediction by pocket structure and verification by peptide analysis. Immunogenetics 1999, 49, 571-576])

ESI-액체 크로마토그라피-질량 분석법(ESI-LCMS)에 의한 TUMAP의 검출

IMA910에 들어있는 에피톱은 질량 분석법에 의한 대장암 샘플을 위해 체계적으로 검색되었다. 취득된 HLA 펩티드 공동 출자는 반대 크로마토그래피 단계(CapLC, 워터스(Waters))에 의한 소수성에 따라 분리되고, 녹여서 분리된 펩티드는 ESI 출처로 장비된 비행 직렬식 질량 분석기(Q-TOF 울티마(Ultima), 워터스)의 하이브리드 직교 4중극 가속 시간에서 분석되었다. 펩티드 공동 출자는 농축과 탈염을 위해 C18 프리-컬럼에 로드되었다. 로딩 후, 프리-컬럼은 5㎛ C18 반대 위상 자료(다이오넥스(Dionex))로 꽉 찬 융합 - 실리카 마이크로 모세관 컬럼(75㎛ i.d. x 250mm)에 의한 분리를 위해 라인에 배치되었다. 솔벤트 B는 80% 아세토니트릴/물의 2mM 암모늄 아세테이트였다. 솔벤트는 둘 다 포름산에 의해 pH 3.0로 조절되었다. 15%에서 60%B의 이전 증감도가 수행되었으며, 5㎕/분의 흐름 속도를 사용한 후 분할 시스템에 의해 약 200nl/min으로 감소되었다. 골드 코딩 유리 모세관(피코팀(PicoTip), 뉴 옵젝티브New Objective))은 마이크로-ESI 출처에의 도입을 위해 사용되었다. TOF 분석기의 통합 시간은 1.9s였고 0.1s의 인터스캔 지연이 있었다. 알려진 분자 무게와 색층 시스템의 펩티드 유지 시간을 기반으로 하여, 정의된 펩티드 고 민감 검사는 ESI-LCMS 유형의 실험에서 실행되었다. 그러므로, 이전의 정의된 펩티드(단독 및/또는 이중 장전)의 m/z 값을 포함한 목록은 전조 선택에 적용되었다. 이후, 서열은 충동 부패 유발(CID) 질량 분석법(ESI-LCMS/MS)에 의해 밝혀졌다. TUMAP 서열은 생성된 자연 TUMAP 조각 패턴을 합성 서열-동일 참조 펩티드와 비교함으로써 확신되었다. 보존 기간의 안정성을 포함한 HLA 펩티드 정제 수율 및 분석 시스템의 재현성의 평가는 풍부한 내인성 HLA-A*02 펩티드(DDX5로부터 YLLPAIVHI)의 강도와 보존 시간을 내부 표준으로 사용함으로써 수행되었다. 그러므로, 이 실험에서 이전 식별된 TUMAP의 검출의 CRC 샘플 포함 기준은 LCMS/MS 실험의 내부 이중 장전 기준 신호(YLLPAIVHI)의 최저 강도 1분에 650 스캔으로 정해졌으며 이는 성공적인 HLA 펩티드 분리와 분석 시스템의 정확한 성능을 보장하기 위해서다.

표 3은 다른 단계의 결장암과 직장암 샘플의 분석과 둘 중 하나의 초기 종양 부위에서 발생한 전이의 분석의 결과를 보여준다. 모든 HLA-A*02 TUMAP는 샘플의 대부분에서 발견되었다. HLA-DR TUMAP 재검색 빈도는 일반적으로 더 낮다. 이것은 HLA 클래스 II 펩티드에서 각각의 핵심 서열의 여러 가지 길이의 변종이 존재할 수 있으므로 예상된다.

n.a. 분석되지 않음

MHC 클래스 I 제시된 펩티드를 위한 생체외 면역성

IMA910에 포함된 펩티드의 면역성에 대한 정보를 얻기 위해서, 이미 문헌[Walter, S, Herrgen, L, Schoor, O, Jung, G, Wernet, D, Buhring, HJ, Rammensee, HG, and Stevanovic, S; 2003, Cutting edge: predetermined avidity of human CD8 T cells expanded on calibrated MHC/anti-CD28-coated microspheres, J. Immunol., 171, 4974-4978])에 의해서 설명된 잘 설립된 생체외 자극 플랫폼을 이용한 조사를 수행했다. 이 방법으로 우리는 실험된 IMA910에 있는 HLA-A*0201 제한된 펩티드의 10/10이 양성의 면역성 데이터를 보여줄 수 있었으며, 이것은 이 펩티드들이 인간에 존재하는 CD8+ 전조 T 세포에 대한 T 세포 에피톱이라는 것을 보여주었다. IMA910에 있는 유일한 다른 HLA 클래스 I 펩티드(MUC-001)는 이 TUMAP에 비교적 낮은 유사성 때문에 이 방법으로 실험하지 못했다.

최근의 증거는 암 백신으로의 CEA-005의 실용성에 대해 심각하게 이의를 제기한다. 최근의 포괄적인 연구(문헌[Iero, M, Squarcina, P, Romero, P, Guillaume, P, Scarselli, E, Cerino, R, Carrabba, M, Toutirais, O, Parmiani, G, Rivoltini, L; Low TCR avidity and lack of tumor cell recognition in CD8(+) T cells primed with the CEA-analogue CAP1-6D peptide, Cancer Immunol Immunother. 2007 Dec; 56(12): 1979-91])에서 저자들은 처음으로 기본 서열 CEA-004에 대한 CEA-005-감작된 T 세포의 효과기 기능을 체계적으로 성향 분석했다. CRC 환자들과 건강한 공여체로부터의 많은 혈액 샘플에서 CEA-005 감작된 T-세포가 기본 서열을 보이는 CEA-발현 대장 선암 세포를 인식할 수 있는 능력이 없는 낮은 친화력 T 세포의 생성을 재현성 증진하는 것이 발견되었다. 그런 효과적이지 않고 낮은 친화력을 가진 기본 서열의 상호 인정은 다른 CEA 펩티드와 그것의 변경된 작용제(문헌[Alves, PM, Viatte, S, Fagerberg, T, Michielin, O, Bricard, G, Bouzourene, H, Vuilleumier, H, Kruger, T, Givel, JC, Levy, F, Speiser, DE, Cerottini, JC, Romero, P; Immunogenicity of the carcinoembryonic antigen derived peptide 694 in HLA-A2 healthy donor and colorectal carcinoma patients, Cancer Immunol. Immunother., 2007, 56, 1795-1805])에서 최근 비슷한 반응이 보고되어 확증된 변경된 펩티드 리간드를 쓰는 백신 프로토콜의 일반적인 문제일 수도 있다. 또한, 이런 결과는 잘 설립된 흑색종 항원 Melan-A/MART-1과 그것의 작용제(스파이서(D. Speiser)와의 개인적인 통신)의 기본 서열에서 또한 보고되었다.

합해서, 변경된 작용제 펩티드의 일반적으로 증가된 면역성에도 불구하고, 최근의 증거는 기본 펩티드가 변경된 작용제에 의해 자극된 T 세포 기본 서열의 비효율적인 상호 인식 때문에 더 매력적인 백신 후보일 수도 있다고 시사한다.

사실, 풍부한 자료는 기본 CEA-004 서열 자체의 생체 안 면역성을 보여준다. 건강한 공여체가 아닌 암 환자들에게서 자발적으로 유도된 이 펩티드에 대한 T 세포 반응은 여러 연구에서 관찰되었다(문헌[Nagorsen, D, Keilholz, U, Rivoltini, L, Schmittel, A, Letsch, A, Asemissen, AM, Berger, G, Buhr, HJ, Thiel, E, Scheibenbogen, C; Natural T-cell response against MHC class I epitopes of epithelial cell adhesion molecule, her-2/neu, and carcinoembryonic antigen in patients with colorectal cancer, Cancer Res. 2000, 60, 4850-4854; Weihrauch, MR, Ansen, S, Jurkiewicz, E, Geisen, C, Xia, Z, Anderson, KS, Gracien, E, Schmidt, M, Wittig, B, Diehl, V, Wolf, J, Bohlen, H, Nadler, LM; Phase I/II combined chemoimmunotherapy with carcinoembryonic antigen-derived HLA-A2-restricted CAP-1 peptide and irinotecan, 5-fluorouracil, and leucovorin in patients with primary metastatic colorectal cancer, Clin Cancer Res. 2005, 11, 5993-6001; Babatz, J, Rollig, C, Lobel, B, Folprecht, G, Haack, M, Gunther, H, Kohne, CH, Ehninger, G, Schmitz, M, Bornhauser, M; Induction of cellular immune responses against carcinoembryonic antigen in patients with metastatic tumors after vaccination with altered peptide ligand-loaded dendritic cells, Cancer Immunol. Immunother. 2006, 55, 268-276]). 또한, CRC 환자에게 CEA-004 또는 CEA 단백질을 이용한 백신 접근법은 CEA-004에 대한 T 세포 반응의 효율적인 자극을 시사했다(문헌[Tsang, KY, Zaremba, S, Nieroda, CA, Zhu, MZ, Hamilton, JM, Schlom, J; Generation of human cytotoxic T cells specific for human carcinoembryonic antigen epitopes from patients immunized with recombinant vaccinia-CEA vaccine, J Natl. Cancer Inst. 1995, 87, 982-990; Morse, MA, Deng, Y, Coleman, D, Hull, S, Kitrell-Fisher, E, Nair, S, Schlom, J, Ryback, ME, Lyerly, HK; A phase I study of active immunotherapy with carcinoembryonic antigen peptide (CAP-1)-pulsed, autologous human cultured dendritic cells in patients with metastatic malignancies expressing carcinoembryonic antigen, Clin Cancer Res. 1999, 5, 1331-1338; Zhu, MZ, Marshall, J, Cole, D, Schlom, J, Tsang, KY; Specific cytolytic T-cell responses to human CEA from patients immunized with recombinant avipox-CEA vaccine, Clin Cancer Res. 2000, 6, 24-33; Weihrauch, MR, Ansen, S, Jurkiewicz, E, Geisen, C, Xia, Z, Anderson, KS, Gracien, E, Schmidt, M, Wittig, B, Diehl, V, Wolf, J, Bohlen, H, Nadler, LM; Phase I/II combined chemoimmunotherapy with carcinoembryonic antigen-derived HLA-A2-restricted CAP-1 peptide and irinotecan, 5-fluorouracil, and leucovorin in patients with primary metastatic colorectal cancer, Clin Cancer Res. 2005, 11, 5993-6001]).

CD8+ T 세포의 생체외 감작

펩티드-MHC 복합체(pMHC)과 항-CD28 항체로 로딩된 인공 항원 제공 세포(aAPC)에 의한 생체외 자극을 실행하기 위해서 우선 표준 밀도 증감 분리 매질(PAA, 독일 쾰베 소재)을 사용하여 새로운 HLA-A*02+ 버피 코트에서 PBMC(말초 혈액 단핵 세포)를 분리했다. 버피 코트는 블루드 방크 튀빈겐(Blood Bank Tubingen) 또는 카타리넨호스피탈 스투트가르트(Katharinenhospital Stuttgart)에서 획득되었다. 분리된 PBMC는 T-세포 매질(TCM)에서 10% 열 활성화된 인간 AB 혈청(PAA, 독일 쾰베 소재), 100U/ml 페니실린/100㎍/ml 스트렙토마이신(벨기에 베르비어스 소재 캄브렉스(Cambrex)), 1mM 나트륨 피루브산(독일 노이스타트 소재 체체 프로(CC Pro)) 및 20㎍/ml 겐타 마이신(캄브렉스)이 추가된 RPMI-글루타맥스(Glutamax)(독일 칼스뤼에 소재 인비트로겐(Invitrogen))를 가진 인간 생체외 감작을 위해 하룻밤 동안 배양되었다. pMHC/항-CD28 코팅된 비드의 생성, T 세포 자극과 실행된 판독은 이전에 사소하게 수정이 되어 설명되었다(문헌[Walter, S, Herrgen, L, Schoor, O, Jung, G, Wernet, D, Buhring, HJ, Rammensee, HG, and Stevanovic, S; Cutting edge: predetermined avidity of human CD8 T cells expanded on calibraated MHC/anti--CD28-coated microspheres, J.Immunol., 171, 4974-4978]). 간단히 말해서, 막을 통해서 생기는 도메인이 결핍되고 무거운 체인의 카르복시 말단에서 바이오틴화된 항체 재조합 HLA-A*0201 분자는 문헌[Altman, JD, Moss, PA, Goulder, PJ, Barouch, DH, Heyzer-Williams, MG, Bell, JI, McMichael, AJ, and Davis, MM; Phenotypic analysis of antigen-specific T lymphocytes, Science, 1996, 274, 94-96]에 의해 설명된 방법에 따라 만들어졌다. 정제된 동시자극 마우스 IgG2a 항 인간 CD28 Ab 9.3(문헌[Jung, G, Ledbetter, JA, and Muller-Eberhard, HJ; Induction of cytotoxicity in resting human T lymphocytes bound to tumor cells by antibody heteroconjugates, Proc Natl Acad Sci USA, 1987, 84, 4611-4615])은 제조 업체(독일 본 소재 페르비오(Perbio))가 권장하 는대로 설포-N-하이드록시석신이미도바이오틴을 이용하여 화학적으로 바이오틴화되었다. 사용된 비드는 크기가 5.60㎛ 스트렙트 아비딘 코팅된 스티로폼 입자였다(미국 일리노이주 소재 방스 래보러토리스(Bangs Labooratories)). 양성과 음성 대조군으로 쓰인 pMHC는 각각 A*0201/MLA-001(수정된 Melan-A/MART-1의 펩티드 ELAGIGILTV)과 A*0201/DDX5-001(DDX5의 YLLPAIVHI) 또는 A*0201/HBV-001(FLPSDFFPSV)였다.

600ng의 바이오틴 항-CD28 플러스 200ng의 관련된 바이오틴-pMHC(고 밀도 비드) 또는 2ng의 관련 플러스 200ng 비관련 (pMHC 라이브러리) MHC(저 밀도 비드)의 존재에 800,000 비드/200㎕은 96-웰 플레이트에 코팅되었다. 96-웰 플레이트의 자극은 1x106 CD8+ T 세포와 씻겨지고 코팅된 비드 2x105를 5ng/ml IL-12(프로모셀(PromoCell)) 추가된 200㎕의 TCM에서 3 내지 4일간 37℃에서 공동배양함으로써 시작된다. 매질의 반은 80U/ml IL-2로 추가된 새로운 CM에 의해 교환되고 배양은 37℃에서 3 내지 4일간 계속되었다. 이 자극 주기는 총 3회 수행되었다. 결국, 사량체 분석은 형광 MHC 사량체(문헌[Altman, JD, Moss, PA, Goulder, PJ, Barouch, DH, Heyzer-Williams, MG, Bell, JI, McMichael, AJ, and Davis, MM; Phenotypic analysis of antigen-specific T lymphocytes, Science, 1996, 274, 94-96])에서 설명된 대로 산출되었다) 플러스 4색 팩스칼리부르(FACSCalibur, BD) 위의 항체 CD8-FITC 복제 SK1(독일 하이델베르그 소재 BD)에 의해 수행되었다. 펩티드 특정 세포는 총 CD8+ T 세포의 백분율로 계산되었다. 사량체 분석의 평가는 FCS 엑스프레스(Express) 소프트웨어(데 노보 소프트웨어(De Novo Software))를 사용하여 수행되었다. 특정 사량체 + CD8+ 임파구의 생체외 감작은 적절한 통문과 음성 대조군 자극과 비교함으로써 발견되었다. 주어진 항원의 면역성은 건강한 공여체의 하나 이상의 생체외 자극된 평가 가능한 웰이 생체외 자극 후 CD8+ T 세포주를 보이면 발견되었다(예를 들면, 이 웰은 CD8+ T 세포 중 1% 이상의 특정 사량체+를 가졌으며 특정 사량체+ 세포의 백분율은 음성 대조군 자극의 매질보다 10배 이상여야 한다).

10 IMA910 펩티드의 생체외 면역성

HLA 클래스 I 펩티드 실험 중 10/10에서, 생체외 면역성은 펩티드 특정 T 세포주의 형성에 의해 입증될 수 있다. NOX-001와 ODC-001 특정의 T 세포주 형성의 대표적인 오점은 도 1에서 보여진다. 결과는 표 4에 요약되어 있다. IMA910에 있는 유일한 다른 HLA 클래스 I 펩티드(MUC-001)는 이 TUMAP에 비교적 낮은 유사성 때문에 이 방법으로 실험하지 못했고, 따라서 pMHC 단량체를 사용한 생체외 자극을 수행하는 것은 방법론적으로 불가능하다는 것을 표현한다.

이매틱스(Immatics)에 의해 IMA 910에 포함된 11개 중 10개의 HLA 클래스 I 펩티드에 실시된 생체외 면역성 실험의 결과는 여기에 요약되어 있다. 보여진 결과는 고 밀도 비드가 있는 CD8+ 세포의 자극에 의해서 취득되었다. 인간 혈청과 다르게, 면역성의 결과는 많이 영향을 받을 수 있으며, 오직 같은 혈청이 쓰인 분석만 같이 평가되었다.

T 세포 생체외 감작된 IMA-CEA-004

4/6 공여체가 평가 가능했다. 4개의 공여체에서 CEA-004로 자극했을 때 모두 CEA-004-유도된 생체외 T 세포 반응의 유도를 성공적으로 보였다(표와 도면 참고). 따라서, CEA-004 펩티드는 인간 CD8+ T 세포 생체외 반응의 강력한 유도 인자로 증명되었다. 중요한 것은, CEA-004는 CEA-005(웰의 64%와 비교해서 웰의 84%, 표 4 참조)와 비교했을 때, 더 높은 빈도의 CEA-004 특정 T 세포 반응을 유도하는 것이 재현성 가능했다. 개개의 양성 웰의 CEA-004 특정 세포의 빈도는 CEA-004 감작 후에도 역시 CEA-005 감작 후 보다 높았다(도 5 참조).

유식 세포 분석에 의해 정해지는 4개의 건강한 HLA-A*02 공여체의 펩티드 특정 생체외 CD8+ T 세포 반응

CD8+ T 세포는 CEA-004, CEA-005 또는 관계 없는 펩티드(IMA-RSL-001)로 로딩된 인공 항원 제공 세포를 사용해서 감작된다. 세 번의 자극 주기 후, 펩티드-반응적인 세포의 검출은 CEA-004-플러스 CEA-005 사량체(표 5A)와 CEA-004-플러스 관계 없는 A*0201-사량체(표 5B)에 의한 이중 염색에 의해 수행되었다. 모든 실험에 쓰인 인간 혈청은 C02104-0167이다.

[표 5A]

[표 5B]

CD8+ T 세포는 PMBC에서 분리되었으며, CEA-004, RSL-001 또는 DDX5-001 펩티드로 로딩된 세포를 나타내는 인공 항원을 사용해 생체외 감작되었다. 세 번의 자극 주기 후, 펩티드-반응적인 세포의 검출은 CEA-004-플러스 관계 없는 A*0201-사량체 염색에 의해 수행되었다. 위에 보이는 숫자들은 각각의 자극된 웰의 CEA-004 특정 세포의 백분율을 나타낸다. RSL-001과 DDX5-001 자극은 음성 대조군 역할을 했다. 도 5는 유식 세포 분석에 의한 HLA-A2 건강한 공여체의 CEA-005 생체외 자극에 따른 CEA-004-특정 CD8+ T 세포의 빈도를 나타낸다. 양성 웰의 시초 값은 각각의 공여체에 따로 (-) 표시되었으며 음성 대조군 매질의 10배 그리고 최소 1%로 정의되었다. 기초 값보다 큰(1% 이상) 백분율 값을 가진 웰은 양성으로 간주되었고 분홍색 마름모꼴로 표시되었다.

IMA910 MHC 클래스 II를 나타내는 펩티드의 생체외 면역성

T 조력 세포는 CTL을 활성화시키고 종양 세포에 대한 면역 반응을 유지하는데 중요한 역할을 한다. 따라서, MHC 클래스 II 펩티드는 IMA910에 포함이 되었다. IMA910에 포함된 3개의 클래스 II 펩티드 중 하나인 TGFBI-004의 생체외 면역 가능성이 시험되었고, CD4+와 CD8+ T 세포의 특정 유도 인자로써 증명되었다. CD4+와 기능적인 CD8+ T 임파구의 생성은 자가조직 시스템에서 수행된 자극을 이용한 실험에서 보여졌다.

시험의 원리

특정 인간 CD4+와 CD/+ 세포의 감작과 확장은 자가조직 DC와 자가조직 PBMC의 재자극이 있는 단핵 세포-고갈된 PBMC의 생체외 감작에 의해 분석되었다. 간단히 말해서, 항원-특정 CD4+ T 세포의 생성을 위해서, 건강한 공여체(HLA 유전자형 클래스 I: A1/A25/B8/B18와 클래스 II: DQB1*02/DQB1*06/DRB1*03/DRB1*15/DRB3/DRB5)의 단핵 세포-고갈된 PBMC는 펩티드-펄싱 자가조직 DC에 의해서 자극되었으며 자가조직 PBMC 플러스 펩티드에 의해 재자극되었다. 판독 시스템으로써 단기 재자극에 의한 IFNγ 제조는 엘리스포트와 유식 세포에 의해 평가되었다. T 세포는 특정 T 세포 소집단에서 IFNγ 제조 세포의 백분율을 정하기 위해서 엘리스포트과 세포내의 IFNγ 염색 플러스 CD4-FITC와 CD8-PerCP에 의한 8 자극 후 분석되었다. 이 실험에서, 다른 웰의 TGFBI-004 펩티드로 자극된 세포들은 공동 출자되고 관계 없는 펩티드로 판독을 위해 배양되고 음성 대조군으로 수행되었다.

수지상 세포(DC)의 생성

인간 DC는 10% 자가조직 원형질//100U/ml 페니실린과 100㎍/ml 스트렙토마이신으로 보조되는 RPMI 1640-글루타맥스/25mM 헤페스(Hepes)(독일 소재 인비트로겐)를 가지고 있는 DC 매질에서 양식된 단핵 세포에서 취득되었다. 첫째, 버피 코트와 원형질은 건강한 공여체의 혈액(블루드 방크 튀빈겐)의 원심기에 의해서 취득되었다. 그 후 PBMC는 표본 밀도 증감 분리(임파구 분리 매질, PAA, 오스트리아)에 의해서 버피 코트에서 분리되었고 총 세포 숫자를 정하기 위해서 DC 매질에서 재부상되었다. PBMC의 100-120 Mio는 씻어지고 15ml X-Vivo 20(바이오휘트테이커(BioWhittaker), 벨기에) 매질에서 재부상되었고, 세포 배양 플라스크로 옮겨졌다. 37℃에서 2시간 후, 말초 혈액 백혈구(PBL)를 가진 매질은 제거되었고, 점착 단핵 세포는 10ml PBS에서 2회 씻어지고 100ng/ml GM-CSF와 30ng/ml IL-4(이뮤노툴스(ImmunoTools), 독일) 또는 20ng/ml(알앤디 시스템스(R&D systems), 독일)가 있는 10ml DC 매질에서 6일 동안 배양되었다. 3일과 5일째, 100ng/ml GM-CSF와 30ng/ml IL-4(이뮤노툴스) 또는 20ng/ml IL-4(알앤디 시스템스, 독일)가 더해졌다. 7일째, 미숙한 DC는 10ng/ml TNF-α(알앤디 시스템스, 독일) 및 20㎍/ml 폴리(IC)(시그마 알드리치, 독일) 또는 100ng/ml LPS에 의해서 24시간 동안 활성화되었다. 나머지 PBMC와 취득된 PBL은 분할되고 냉동되었다.

특정 T 세포의 생체외 감작

CD4+ T 세포를 생성하기 위해, 3 Mio PBMC/PBLssms 2 x 105 단핵 세포 DC로 자극되었다. DC는 8일째 수확되었다(챕터 3.1, DC의 생성 참고). 5mM EDTA가 있는 PBS는 가능한 많은 세포(접착 세포 포함)를 얻으려는 목적으로 쓰였다. DC 매질로 씻어진 후, 세포 숫자는 정해졌다. 펩티드 로딩을 위해, DC는 1ml DC 매질에서 재부상되었고 25㎍/ml 펩티드로 37℃에서 2시간 동안 배양되었다. DC 펄싱에 쓰인 펩티드는 TGFBI-004, 포스믹스(Posmix)(EBV와 CMV 관련 펩티드의 혼합물), 파드레(Padre) 그리고 CMV였다. 자가조직 PBMC/PBL는 해동되고, DC 매질에서 씻어지고(2회 이상) 24 웰 도금으로 1m에 3 Mio 세포/ml의 밀도로 도금되었다. 펩티드로 로딩된 DC는 그 후 도금된 PBMC/PBL에 더해졌고(펩티드를 가지고 있는 1ml 현탁으로) 37℃에서 7일간 배양되었다. 감작 후, 취득된 CTL은 우선 조사(30Gy; 감마셀 1000 엘리트(Gammacell 1000 Elite), 노르디온 인터내셔날(Nordion International), 카나다)된 동결 보존된 자가조직 펩티드 로딩된 PBMC로 재자극되었다. 웰 마다 5 x 105 CTL와 2,5 x 106 PBMC는 이 목적을 위해서 더해졌다. 펩티드와 PBMC의 펄싱은 위에서 말한대로 (DC) 수행되었다. 처음 재자극의 하루 후에, IL-2(알앤디 시스템스, 독일)와 IL-7은 2ng/ml와 5ng/ml의 최종 농축액에 각각 더해졌다. 그 후에, 매 2번째와 7째 날, IL-2와 IL-7은 각각 매질에 더해졌다. 두 번째 재자극은 7일 후에 행해졌으나, 이번에는 펩티드는 배양된 CTL에 혼자 더해졌다(PBMC 없이). 펩티드 로딩된 PMBC와 펩티드 혼자 번갈아 가며 재자극은 7일 주기로 수행되었다. 8번의 자극후 분석은 세포내 IFNγ 염색과 IFNγ에 의해 수행되었다.

결과

관계한 펩티드에 반응하는 특정 CD4+ T 세포주를 감작하는 것은 가능했다(도 2와 도 3). T 세포 반응은 엘리스포트에 의해 4 T 세포주 중 2개에서 검출될 수 있었으며, CD4+ 및/또는 CD8+ 세포를 생성하는 4 T 세포주 TGFBI-004 특정 IFNγ 중 3개는 ICS에 의해 보여졌다. 따라서, 위에 설명된 실험 시스템의 하나의 시험된 공여체에서 TGFBI-004는 CD4+ 와 CD8+ T 세포 반응을 유도할 수 있었다. 이 유망한 결과에 따르면, 펩티드는 면역성이 있고 T 세포 반응을 유도할 수 있는 능력이 있는 것의 가능성이 있다.

NOX-001과 TGFBI-001에 의해 예시된 기능적 검증

IMA910 백신에 포함된 펩티드의 면역성은 TUMAP 검증 플랫폼을 사용하여 생체외 검증되었다. 특정 T 세포의 유도는 펩티드가 면역성을 성공적으로 활성화시킬 수 있는 능력을 암시한다. 효율적인 항종양 면역 반응은 활성화된 T 세포가 친화력이 높고 기능적일 때만 가능하므로, 우리는 TUMAP가 그것들의 IFNγ 생성 능력 또는 종양 세포주 제거 능력에 의해 높은 친화력, 기능적인 T 임파구를 감작하는 것을 조사했다. 2개의 펩티드 NOX-001과 TGFBI-001은 생체외 높은 친화력의 CTL을 유도할 수 있는 능력 때문에, 더 깊은 검증을 위해서 선택되었다. 우리는 둘 다의 인간의 펩티드에 대해 높은 친화력 전조 T 세포가 존재한다는 것과 기능적인 CD8+ T 세포주가 NOX-001에 의해 생성될 수 있는 것을 증명할 수 있었다.

시험의 원리

IMA910 펩티드의 면역성과 특정 T 세포의 특성에 대한 통찰력을 얻기 위해, 두 가지 펩티드, NOX-001과 TGFBI-001이 추가적인 평가를 위해 선택되었다. 이를 목적으로 한 실험은 이매틱스에서(세포 정렬은 튀빈겐 대학 뷔링(Buhrin) 박사의 연구실에서 수행되었다) 수행되었다.

고 또는 저밀도 항원에 의해 활성화될 수 있는 능력에 따라, T 세포주는 고 또는 저친화력으로 나누어질 수 있다. 앞에서 보여졌듯이(문헌[Walter, S, Herrgen, L, Schoor, O, Jung, G, Wernet, D, Buhring, HJ, Rammensee, HG, and Stevanovic, S; Cutting edge: predetermined avidity of human CD8 T cells expanded on calibrated MHC/anti-CD28-coated microspheres, J. Immunol., 2003, 171, 4974-4978]) 인간 고친화력 CTL은 저친화력 CD8+ T 세포에 비해 더 적은 활성화를 위한 펩티드를 사용함으로써 성공적으로 높일 수 있다. 또한 이리하여 확장된 세포는 항원 발현 종양 세포주를 인식하는데 더 효율적인 것으로 보여졌고, 이것은 치료 전략 개발에 가능성이 큰 도구로 선정된다.

펩티드의 고친화력 CTL 라인을 생성할 수 있는 능력을 정하기 위해서, 분리된 인간 CD8+ 세포는 저밀도 pMHC(펩티드-MHC-복합체)와 IL-12와 IL-2의 존재 하에 항-CD28 항체가 있는 코팅된 비드의 반복되는 생체외 자극에 의해서 감작되고 확장되었다. 세 번의 자극 후에, 생체외 감작된 T 세포의 일부분은 pMHC-사량체 염색 되었고 유세포 분석에 의해서 검출되었다. 각각의 공여체의 사량체-양성 세포는 항원 특정, pMHC-사량체 염색 그리고 인간 항-CD8-FITC 항체에 의해 공동 출자되었고 최종적으로 FACSAria에 FACS 정렬의 주제가 되었다. 정렬된 세포는 방사능 피더 세포, 사이토카인과 미코겐의 존재 하에 배양되고 확장되었다. 감작된 고친화력 항원 특정 세포의 생성을 위한 판독으로서, pMHC-사량체 염색은 수행되었다. 그들의 기능을 정하기 위해서, IFNγ 제조는 엘리스포트에 의해서 분석되었으며, 종양 세포주의 제거는 해당하는 펩티드와 종양 세포주의 세포의 재자극 후 생/사 염색에 기반을 둔 세포독성 분석 결과를 이용하여 검사되었다.

특정 CD8+ T 세포주의 생성

펩티드-MHC 복합체(mMHC)와 항-CD28 항체로 로딩된 인공 항원을 보이는 세포(aAPC)를 이용한 생체외 자극은 위에서 말한 내용대로 실시되었다. 설명된 방법과 다른 유일한 점은 자극이 200ng 관련 MHC(고밀도 비드) 대신 2ng 관련 플러스 200ng 관계 없는 라이브러리(pMHC) MHC(저밀도 비드)로 로딩된 비드로 수행되었다는 점이다. 따라서, 주로 고친화력 T 세포가 펩티드의 더 깊은 검증을 위해서 생성되었다. 세 번의 자극 후, 생체외 감작된 T 세포의 일부분은 pMHC-사량체 염색되고 유세포 분석에 의해서 검출되었다. 주어진 항원의 면역성은 하나 이상의 건강한 공여체의 평가 가능한 생체외 자극된 웰이 생체외 자극(예를 들면, 이 웰은 CD8+ T 세포 중 1% 이상의 특정 사량체+를 가졌으며 특정 사량체+ 세포의 백분율은 음성 대조군 자극의 매질보다 10배 이상여야 한다) 후 특정 CD8+ T 세포주를 가지고 있다고 밝혀지면 검출되었다. 각각의 공여체의 사량체-양성 세포는 이 후에 항원 특정, pMHC-사량체 염색 그리고 인간 항-CD8-FITC 항체 복제 SK1에 따라 공동 출자되었고 최종적으로 FACSAria에 FACS 정렬의 주제가 되었다(비디 바이오사이언시스, 독일). 정렬된 세포는 5 x 105 세포/ml 방사능 새로운 동종이계의 PBMC, 5 x 104 세포/ml 방사능 LG2-EBV 세포, 150U/ml IL-2(키론(Chiron), 독일 뮌헨 소재) 및 0,5㎍/ml PHA-L(로슈 다이아그노스틱스(Roche Diagnostics), 독일 만하임 소재)의 존재 하에 T 세포 매질(10% 열 활성화된 인간 AB 혈청, 100U/ml 페니실린, 100㎍/ml 스트렙토마이신, 1mM 나트륨 피루브산 및 20㎍/ml 겐타마이신으로 보조된 RPMI-글루타맥스)에서 배양되었다. 이 세포들의 확장은 150U/ml IL-2를 가지고 있는 T 세포 매질에서 일어난다. 감작된 고친화력 항원 특정 세포의 생성의 판독으로서, pMHC 염색은 위와 같이 수행되었으며 4가지 색 팩스칼리부르(비디 바이오사이언시스, 독일)에서 분석되었다.

기능 시험

그들의 기능을 정하기 위해, IFNγ 제조는 해당하는 펩티드로 세포 재자극 후 엘리스포트(IFNγ 엘리스포트 세트, BD, 독일)에 의해 평가되었다. 추가로, 세포-매개된 특정 CTL의 세포독성은 종양 세포주를 생/사 세포-매개 세포독성 도구(L7010, 인비트로겐, 독일)를 사용함으로써 조사되었다. 두 분석은 따로 지적되지 않는 한 제조 업체의 지시에 따라 수행되었다.

결과

NOX-001과 TGFBI-001, 두 펩티드 모두 성공적인 저 pMHC 밀도 aAPC의 감작에서 보여지듯이 생체외 면역적이었다. TGFBI-001 특정 T 세포주뿐만 아니라 NOX-001도 FACS에 의해 확립될 수 있었고, 이것은 고친화력 CD8+ T 세포 전조가 건강한 공여체에게 존재한다는 것을 시사한다.

또한, NOX-001에서, 이 펩티드로의 (도 4) 재자극 후 IFNγ을 특정 발현했으므로 엘리스포트에 의해 기능적인 하나의 T 세포주는 확립될 수 있다는 것을 증명했다.

발명의 HLA 클래스 1 제한된 펩티드의 HLA-A*0201에 대한 결합

이 분석의 목적은 HLA 클래스 I 펩티드의 HLA-A*0201 대립 유전자로 코딩된 MHC 분자에 대한 친화력을 평가하기 위한 것이었고, 이는 이것이 IMA910의 행동의 양식에 중요한 매개 변수이기 때문이다. HLA-A*0201에 대한 친화력은 IMA910의 10개의 HLA 클래스 I 제한된 펩티드 중 9개에서 높았고, 분리 상수(KD)는 0.001에서 0.2nM 사이 범위에 있었다. 또한 바이러스 마커 펩티드 IMA-HBV-001은 강한 결합을 보였다. IMA-MUC-001의 친화력은 약 2 디케이드 정도 더 약했다. 이 결과들은 IMA 910 백신 후보의 MHC 분자에 대한 10개의 HLA 클래스 I 펩티드 중 9개의 강한 결합 친화력을 확인한다.

시험의 원리

안정된 HLA/펩티드 혼합물은 3개의 분자로 구성되어 있다: HLA 대량 서열, 베타-2 작은 글로불린(b2m) 그리고 펩티드 리간드. 변성된 재조합형 HLA-A*0201 대량 서열 분자 혼자의 활동은 "빈HLA-A*0201 분자"의 기능적인 등량이 되도록 보존될 수 있다. B2m과 적당한 펩티드를 가지고 있는 수성의 버퍼로 희석되었을 때, 이 분자들은 완전히 펩티드에 의존하는 방식으로 빠르고 효율적으로 접는다. 이 분자들의 가용성은 펩티드와 HLA 클래스 I 분자(실베스터-에이치비드(Sylvester-Hvid) 등, 2002)의 상호작용의 친화력을 측정하기 위해 ELISA를 기반으로 한 분석에서 쓰인다.

정제된 재조합 HLA-A*0201 분자는 b2m과 함께 배양되고 관심의 펩티드의 접종을 등급을 매겼다. 새로운-접힌 HLA/펩티드 혼합물의 양은 양적 ELISA에 의해 정해졌다. 분리 상수(KD 값)는 검량선용 시약 HLA/펩티드 혼합물의 희석물에서 기록된 표준 곡선을 사용해 계산되었다.

결과

결과는 도 6에서 보여진다. 더 낮은 KD 값은 더 높은 HLA-A*0201에 대한 친화력을 나타낸다. 대부분의 IMA910 펩티드와 바이러스 조절 펩티드 IMA-HBV-001은 유사하고 강한, 0.001(IMA-TGFBI-001) 내지 0.2nM(IMA-ODC-001)의 범위의 HLA-A*0201에 대한 친화력을 보였다. IMA-MUC-001의 친화력은 대부분의 포함된 리간드에 비해서 약 2-3 디케이드 정도 낮았다. 그러나, IMA-MUC-001을 사용하는 백신 접종은 이전에 주도된 이매틱스에 의한 임상 실험에서 신장 세포 선암 환자의 면역 반응을 야기하였고, 따라서 IMA-MUC-001의 낮은 결합 친화력은 관심받지 못한다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims

서열식별번호 1번 내지 서열식별번호 7번으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열 및/또는 서열식별번호 1번 내지 서열식별번호 7번과 80% 이상 동일한 변종 아미노산 서열을 함유하는 2개 이상의 펩티드, 및/또는 서열식별번호 1번 내지 서열식별번호 7번 또는 변종 아미노산 서열을 코딩하는 핵산을 함유하는 폴리뉴클레오티드, 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학 조성물.
제 1 항에 있어서,
서열식별번호 8번 내지 서열식별번호 15번으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열, 또는 서열식별번호 8번 내지 서열식별번호 15번과 80% 이상 동일한 변종 아미노산 서열을 함유하는 하나 이상의 부가적인 펩티드, 또는 서열식별번호 8번 내지 서열식별번호 15번 또는 변종 아미노산 서열을 코딩하는 핵산을 함유하는 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함하는 약학 조성물.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
펩티드가 8 내지 100, 바람직하게는 8 내지 30, 가장 바람직하게는 8 내지 16의 아미노산의 전체 길이를 갖는 약학 조성물.
제 1 항 내지 제 3 항중 어느 한 항에 있어서,
하나 이상의 펩티드가 비-펩티드 결합을 포함하는 약학 조성물.
제 1 항 내지 제 4 항중 어느 한 항에 있어서,
서열식별번호 1번 내지 서열식별번호 15번에 따른 아미노산 서열로 이루어진 2개 이상의 펩티드를 포함하는 약학 조성물.
제 1 항 내지 제 5 항중 어느 한 항에 있어서,
약학 조성물에 존재하는 펩티드의 선택, 개수 및/또는 양이 조직-, 암- 및/또는 환자-특이적인 약학 조성물.
제 1 항 내지 제 6 항중 어느 한 항에 있어서,
1018 ISS, 알루미늄 염, 암플리백스, AS15, BCG, CP-870,893, CpG7909, 사이아에이, dSLIM, GM-CSF, IC30, IC31, 이미퀴모드, 이무팩트 IMP321, IS 패치, 이스코마트릭스, 주브이뮨, 리포백, MF59, 모노포스포릴 리피드 A, 몬타나이드 IMS 1312, 몬타나이드 ISA 206, 몬타나이드 ISA 50V, 몬타나이드 ISA-51, OK-432, OM-174, OM-197-MP-EC, 온택, 펩텔 벡터 시스템, PLG 마이크로입자, 레시퀴모드, SRL172, 바이로솜 및 다른 바이러스-형 입자, YF-17DBCG, 아퀼라스 QS21 스티물론, 리비스 데톡스 퀼, 수퍼포스, 프로인드스, GM-CSF, 콜레라 톡신, 면역학적 보조제, MF59 및 사이토킨으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 적합한 보조제를 추가로 포함하는 약학 조성물.
제 7 항에 있어서,
보조제가 콜로니-자극 인자, 예컨대 그래뉼로사이트 마크로파지 콜로니 자극 인자(GM-CSF)로 이루어진 군으로부터 선택되는 약학 조성물.
제 1 항 내지 제 8 항중 어느 한 항에 있어서,
하나 이상의 항원 제공 세포를 추가로 함유하는 약학 조성물.
제 9 항에 있어서,
항원 제공 세포가 수지상 세포인 약학 조성물.
제 9 항 또는 제 10 항에 있어서,
하나 이상의 항원 제공 세포가 (a) 펩티드로 펄싱 또는 로딩되거나, 또는 (b) 펩티드를 코딩하는 발현 구성체를 포함하는 약학 조성물.
제 1 항 내지 제 11 항중 어느 한 항에 있어서,
약학 조성물이 정맥내로, 동맥내로, 복막내로, 근육내로, 진피내로, 종양내로, 경구적으로, 피부로, 비강으로, 협측으로, 직장으로, 질로, 흡입에 의해, 또는 국소 투여에 의해 투여되는 약학 조성물.
제 1 항 내지 제 12 항중 어느 한 항에 따른 약학 조성물의 치료 효과량을 환자에게 투여함을 포함하는, 환자의 암을 치료 또는 예방하는 방법.
제 13 항에 있어서,
약학 조성물이 항암 백신인 방법.
제 14 항에 있어서,
암이 구강 또는 인두의 암, 소화관의 암, 결장, 직장 또는 항문의 암, 기도의 암, 유방암, 자궁 경부, 질 또는 외음부의 암, 자궁 체부 또는 난소의 암, 남성 요로 생식기의 암, 요로의 암, 뼈 또는 연조직의 암, 카포시 육종, 피부의 흑색종, 안구 흑색종, 비-흑색종 안구암, 뇌 또는 중추 신경계의 암, 갑상선 또는 기타 내분비샘의 암, 호지킨 림프종, 비-호지킨 림프종, 골수종, 바람직하게는 결장암, 대장암, 폐암, 유방암, 췌장암, 전립선암, 위암, GIST 또는 교모세포종인 방법.
제 15 항에 있어서,
암이 대장암인 방법.