MXPA04009554A

MXPA04009554A - Construcciones epitopes que comrpenden antigeno presentando mecanismos de marcacion celular.

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Publication number: MXPA04009554A
Application number: MXPA04009554A
Authority: MX
Inventors: A Soltis Daniel
Original assignee: Euro Celtique Sa
Priority date: 2002-04-01
Filing date: 2003-04-01
Publication date: 2005-01-25
Also published as: IL164281A0; JP2005536987A; CA2478930A1; WO2003084467A3; AU2003224819A1; WO2003084467A2

Abstract

La invencion se refiere a productos y metodos para provocar una respuesta inmune marcada. En particular, la invencion se refiere a las construcciones epitope que comprenden el antigeno que presenta los mecanismos de marcacion celular.

Description

CONSTRUCCIONES EPÍTOPES QUE COMPRENDEN ANTÍGENO PRESENTANDO MECANISMOS DE MARCACIÓN CELULAR CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a productos y métodos para provocar una respuesta inmune deseada. En particular, la invención se refiere a construcciones que llevan un antígeno que presenta las secuencias epitope marcadas - celulares.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El cáncer continúa siendo la segunda causa de muerte en los Estados Unidos. La terapia no quirúrgica para la mama, el pulmón y el colon, así como muchos otros tumores sólidos es actualmente pobre.

Antígenos Asociados - Tumores Los a ntígenos asociados a tumores (TAAs) son marcadores bioquímicos importantes de las células tumorales e incluyen, por ejemplo, proteínas celulares mutadas tales como los productos del gen supresor del tumor mutado, los productos oncogenes (incluyendo proteínas de fusión) y las proteínas extranjeras tales como los productos de genes virales. Las proteínas celulares no mutadas también pueden ser TAAs si se expresan aberrantemente (es decir, en un compartimiento subcelular inapropiado) o en cantidades supernormales. Dadas las numerosas etapas de transformación celular y algunas veces los genotipos bizarros en las células cancerosas, podría argumentare que las células tumorales son probablemente para contener muchos antígenos nuevos potencialmente reconocibles por el sistema inmune. También se ha reportado que los diferentes tumores del tejido relacionado o el origen celular pueden compartir el mismo TAA (Sahasrabudhe et al., 1993, J. Immunol., 151 :6302-6310; Shamamian er al., 1994, Cáncer Immunol. Immunoosther., 39:73-83; Cox ef al., 1994, Science 264:716; Peoples er al., 1993, J. Immunol., 151 :5481 -5491 ; Jerome et al., 1991 , Cáncer Res., 51 :2908-2916; Morioke er a/., 1994, J. Immunol., 153:5650-5658): Estos datos soportan la posibilidad que los TAAs de elección de ¡nmunoterapia anti-tumor específicas, tales como las vacunas, pueden ser activos en contra de más de una forma de cáncer.

Inmunoterapia de Cáncer En el cáncer, las células T específicas en tumores que son capaces de unirse a y lisar las células tumorales que despliegan los epítopes y antígenos asociados con los tumores en sus superficies celulares pueden derivarse de los pacientes. Las células T e specíficas-tumorales s e localizan en varios sitios en los pacientes con cáncer, incluyendo en la sangre (en donde ellos pueden encontrarse en las fracciones celulares mononucleares y periféricas), en el tejido linfoide secundario y primario, es decir, el bazo, en ascitis de fluido en los pacientes con cáncer en los ovarios (linfocitos a sociados a l t umor o " TALS"), o d entro d el t umor e n s í m ismo ( linfocitos con infiltración en el tumor o "TILS"). De estas poblaciones de células T, los TlLs han demostrado ser los más útiles en la identificación de los antígenos tumorales y los epítopes del mismo.

La especificidad de las células T específicas-tumorales se basa en la habilidad del receptor de la célula T (TCR) para reconocer y unir una secuencia de aminoácidos corta que se presenta en la superficie de las células tumorales por la clase I MHC y en algunos tipos de células, moléculas clase II. En breve, estas secuencias de enlace de aminoácidos (también llamadas "ligandos TAA" o "epítopes TAA") se derivan de la degradación proteolítica de las proteínas intracelulares codificadas por los genes que son únicamente o aberrantemente expresados en las células tumorales.

Los TAAs presentados en el contexto de los complejos clase I (MHC) del antígeno de mayor histocompatibilidad en la célula tumoral por sí mismos o en las células que presentan antígenos (APCs) son capaces de inducir linfocitos T citotóxicos específicos - tumorales (CTLs). La presencia de moléculas co-estimulantes, tales como B7-1 y B7-2, en los APCs y la secreción de IL-2 promueven la diferenciación de los linfocitos CD8+ reclutados en los CTLs.

En efecto, existe evidencia sustancial indicando que el sistema inmune juega un rol crítico en la prevención del cáncer y del control del crecimiento tumoral. Esto incluye la observación ocasional de la regresión de tumor espontáneo, la correlación de las regresiones espontáneas con la presencia de llnfocitos de infiltración tumoral (TlLs) y la identificación de los TlLs que son específicos para los TAAs. Sin embargo, como se evidencia por las proporciones de incidencia del cáncer, la respuesta inmune comúnmente no es suficiente para combatir exitosamente el tumor.

El crecimiento y la dispersión metastática de los tumores, a una gran extensión, dependen de su capacidad para evadir el control inmune del huésped y para superar las defensas del huésped. Todos los antígenos que expresan los tumores que se reconocen por una extensión variable por el sistema inmune, pero en muchos casos una respuesta inmune inadecuada se provoca debido al enmascaramiento del antígeno parcial o la activación inefectiva de las células efectoras. El escape del tumor de las células efectoras inmunes se causa más comúnmente por la débil inmunogenicidad de los TAAs, el enmascaramiento del antígeno o la inmunosupresión total, una característica del cáncer avanzado. La falla del procesamiento o enlace del antígeno a las moléculas MHC, inadecuada o baja afinidad de los complejos de MHC para los receptores de la célula T o la expresión inadecuada de las moléculas de adhesión co-estimuladoras junto con el complejo MHC de presentación del antígeno puede todo conducir a inmunogenicidad pobre de los TAAs y la respuesta antitumoral dañada.

En años recientes, ha existido un interés renovado en el desarrollo de vacunas para el cáncer. Esto ha resultado, en parte, de la identificación de TAAs nuevos y un entendimiento incrementado de la importancia de la presentación del antígeno y la activación de linfocitos. Las estrategias inmunoterapéuticas ahora se han aceptado como superiores en términos de la especificidad que ellos ofrecen en la marcación solamente de las células tumorales como opuestas a la quimioterapia existente o la terapia de radiación que es más general e invasora con muchos efectos colaterales asociados.

Las estrategias inmunoterapéuticas han desarrollado que el intento para "modular" los varios aspectos de la respuesta inmune asociada con el cáncer. La vacunación con péptidos inmunogénicos, la administración de células efectoras inmunes activadas y expandidas in vitro, la expansión celular efectora in vivo con las terapias de citoquina o la modificación genética de las células tumorales o efectoras inmunes con los genes de citoquina o los genes que codifican las moléculas co-estimuladoras se mostraron que activan las respuestas inmunes anti-tumorales.

La literatura revela que ni la transferencia adoptiva de los CTLs específicos-tumorales ni la inmunoterapia activa específica con las células tumorales completas o las preparaciones derivadas de las células conduce a la erradicación de los tumores o la supervivencia a largo plazo en más de una minoría de pacientes. En contraste, se ha demostrado in vitro que los péptidos han logrado prepararse en las células T en donde las preparaciones derivadas de las células han fallado. Por lo tanto se ha sugerido que los epítopes reconocidos por las líneas CTL múltiples serían candidatos prometedores para usarse en las vacunas anti-tumorales basadas en péptidos.

Importantemente, s in embargo, mientras que la administración de los péptidos sintéticos derivados de los TAAs provocó respuestas inmunes especificas tumorales in vitro, los intentos para provocar respuestas anti-tumorales in vivo mediante la vacunación con la proteína TAA o los fragmentos de péptidos comúnmente han sido infructuosos, presumiblemente porque estos fragmentos d e p éptido o p roteína fallan a l a ccesar e l c itosol d e u na c élula y p or l o tanto n o se procesaron y presentaron apropiadamente a las células efectoras.

De manera conjunta con el hecho de que los péptidos TAA generalmente se enlazan débilmente a las moléculas MHC, los datos descritos anteriormente sugieren que el mejoramiento de la afinidad de enlace de MHC y la marcación intracelular de los inmunogenes del péptido TAA deben mejorar su inmunogenicidad.

Varios nuevos prospectos para la preparación de las vacunas de la célula T se han sugerido con base en la identificación y caracterización de los péptidos HC asociados. Los péptidos sintéticos que corresponden a estos epítopes de célula T pueden representar las subunidades ideales para vacunas seguras. Sin embargo, los péptidos sintéticos son inmunogenes pobres debido a su tamaño molecular pequeño y la media vida del suero muy corta. Para circunvenir estas desventajas, se ha descrito una variedad de proteínas recombinantes que llevan los epítopes inmunogénicos (Leclerc et al., Int. Rev. Immunol. 1 1 :123-132 (1994); Freímuth y Steinman, Res. Microbiol. 141 : 995-1001 (1990); Evans ef al., Nature 339: 385-388 (1989); Bona ef al., Chem. Immunol. 65: 179-206 (1997); Baier ef al., J. Virol. 69: 2357-2365 (1995)). Por ejemplo, las moléculas de anticuerpos pueden funcionar de manera que los sistemas de distribución para los péptidos de célula T y tienen la ventaja de ser proteínas autónomas desprovistas de los efectos laterales algunas veces asociados con las vacunas microbiales y además, tienen una media vida grande comparada con los péptidos sintéticos (Billetta eí al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 88: 4713-4717 (1991 ); Zaghouani eí al., Science 259: 224-227 (1993); Rasmussen ef al., Proc. Natil. Acad. Sci. USA 2001 98:10296-301 ).

Identificación y Modificación de TAA El desarrollo de las inmunoterapias anti-tumorales basadas en péptidos además se entorpece por la ausencia de un método iterativo confiable para identificar los TAAs. Los protocolos actuales involucran el aislamiento y análisis extremadamente puro de las moléculas MHC de las células que presentan los antígenos (APCs) (Chicz y Urban, 1994, Immunol. Today, 15:155-160) o la determinación de las características estructurales de los complejos del péptido/MHC usando la cristalografía de rayos X (Meng y Butterfield, Pharm Res 19:926-32 (2002)). Se conocen en la técnica los m étodos c onvencionales p ara e I c ultivo y s ubclonación d e I as c élulas T e specíficas-tumorales. Una vez que la población celular T anti-tu moral potente se recupera, puede usarse para identificar los antígenos vía convencional, pero comúnmente es tediosa la metodología de clonación de expresión (Kawakami ef al. (1994) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 91 :3515-3519) o las pruebas de los epítopes producidos en las bibliotecas fago (Scott y Smith, 990, Science 249:386- 390; Cwirla er a/., 1990, Proc. Nati. Acad. Sci., 87:6378-6382; Devlin ef a/., 1990, Science, 249:404-406).

En u n p lanteamiento d iferente, requiriendo u n a ntígeno relacionado al tumor o patógeno conocido, se han desarrollado los métodos que intentan identificar el epítope nativo. Por ejemplo, los epítopes putativos pueden predecirse usando una computadora para analizar la secuencia del gen (antígeno) para las secuencias de aminoácidos que contienen un "motivo" o un diseño definido de residuos de aminoácidos asociados con un alelo (HLA) MHC particular. Ver, por ejemplo Englehard (1994) Annu. Rev. Immunol. 12.181; Rammenesee ef al. (1993) Annu. Rev. Immunol. 11 :213. Las secuencias epítope "pronosticadas" posteriormente pueden sintetizarse y probarse. Aunque muchas de las secuencias epítope se han "pronosticado" de las secuencias de proteína de longitud completa para análisis por el "motivo" en el examen en pruebas funcionales estándares, la vasta mayoría de estos epítopes "pronosticados" fallan por ser inmunogénicos. Otras técnicas incluyen por ejemplo, la elución péptida seguida por la búsqueda de bases de datos (Hunt ef al. (1992) Science 255:1261 ; Udaka eí al. (1992) Cell 69:989); el aislamiento e identificación del antígeno de las mezclas del antígeno complejo (Van de Wal eí al. (1998) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 95:10050; Lamb ef al. (1987) Immunology 60:1 ); bibliotecas de expresión de análisis y búsquedas de bases de datos subsecuentes (Boon ef al. (1994) Annu. Rev. Immunol. 12:337; Neophytou et al (1996) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 93:2014; Gavin et al. (1994) Eur. J. Immunol. 24:2124); análisis posicional de péptidos de las bibliotecas combinatorias (Gundlach et al. (1996) J. Immunol. M eth. 1 92:149; B lake e f al. (1996) J. Exp. Med. 184:121 ; Híemstra et al. (1997) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 94:10313; Hemmer et al. (1997) J. Exp. Med. 185:165 1 ) y los similares.

Más recientemente, ciertas proteínas relacionadas con los tumores y patógenos se han imitado ¡nmunológicamente con los péptidos sintéticos cuya secuencia de aminoácidos corresponde a esa de un dominio determinante antigéníco del patógeno o TAA. No obstante estos avances, los inmunogenes peptídicos basados en las secuencias nativas generalmente realizan menos que opcionalmente con respecto a la inducción de una respuesta inmune. Además, existe una necesidad para epítopes de péptidos antigénicos sintéticos modificados con propiedades inmunomoduladoras mejoradas.

Las metodologías de la química de no péptidos y péptidos combinatorias han proporcionado herramientas adicionales para determinar los epítopes de la célula T. Los epítopes de esta manera determinados típicamente "imitan" el epítope nativo en que ellos soportan una similitud de secuencia definible a ello (es decir, sustituciones conservadoras así como aminoácidos idénticos), pero no necesariamente identidad absoluta con los mismos. Los imitadores e pítopes pueden diseñarse mediante modificar directamente la secuencia de los epítopes conocidos o definidos de nuevo con bibliotecas moleculares aleatorias seguidas por la búsqueda de las bases de datos para identificar el antígeno nativo. (Gavin et al. (1994) Eur. J. Immunol. 24:2124; Blake ef al. (1996) J. Exp. Med. 184:121 ; Chen ef al. (1996) J. Immunol. 157:3783; Strausbauch et al. (1998) Intl. Immunol. 1 0:421 ; V almori e f a l. ( 2000) J . I mmunol 1 64(2): 1 125-1131 ; N eedels e r a/. 1993, P roc. N ati. A cad. Sci. USA 90:10700-4; Ohlmeyer ef al. 1993, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90:10922-10926; Van der Zee, 1989, Eur. J. Immunol, 19:43-47; Publicación de Patente Internacional No. WO 92/00252).

Además, existe una necesidad en la técnica para identificar los métodos efectivos para elegir las células tumorales para la limpieza inmune mediante la generación de una respuesta inmune anti-tumoral efectiva. En particular, existe una necesidad en la técnica para desarrollar nuevos inmunogenes basados en péptidos que inducirían una fuerte respuesta inmune anti-tumoral. Como se señaló anteriormente, en conexión con la necesidad de nuevos inmunogenes basados en péptidos mejorados, también existe una necesidad de desarrollar nuevos péptidos antigénicos sintéticos modificados con propiedades de elección e inmunomoduladoras mejoradas superiores a los péptidos derivados de los antígenos asociados con tumores nativos (TAAs).

La presente invención se dirige a estas y otras necesidades en la técnica con el descubrimiento de una terapia efectiva basada en la identificación de epítopes no nativos derivados de antígenos de cáncer y sus construcciones en serie epitope en el montaje, junto con la liberación elegida de estas construcciones en serie epítopes para las células de presentación de antígeno apropiado (APCs), así como la inclusión de secuencias en las construcciones para dirigir el procesamiento y presentación apropiados de los epítopes incorporados dentro de los APCs.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona una construcción de péptidos que comprende al menos una secuencia epitope, en donde la construcción también incluye o está asociada con un antígeno que presenta el mecanismo de selección celular (APC) y es capaz de estimular una respuesta inmune tal como, por ejemplo, una célula T citotóxica y/o la célula T auxiliar y/o la respuesta celular B.

El epitope contenido en la construcción del péptido de la presente invención puede ser, por ejemplo un epitope celular T CD8+, un epitope celular T CD4+, un epitope celular B o cualquier combinación de los mismos. Como se describió en este documento, el epitope puede derivarse de cualquier a ntígeno. P or ejemplo, e l e pitope p uede derivarse de un antígeno de cáncer (también llamado antígeno asociado con el tumor o TAA), un antígeno viral, un antígeno bacterial, un antígeno protozoario o un antígeno fúngico. De preferencia, el epitope se deriva de un TAA. En una de las modalidades, el TAA es un antígeno carcinoembriogénico (CEA).

De preferencia, el epitope es un epitope no nativo, que se enlaza con alta afinidad a las moléculas MHC y es útil para modular las respuestas inmunes para el epitope nativo correspondiente del cual este epitope no nativo se deriva. Las secuencias epítopes no nativas de la presente invención de preferencia difieren de sus contrapartes naturales en que ellas contienen alteraciones en la secuencia de aminoácidos, relativas a la secuencia nativa, en el dominio de enlace MHC, por lo tanto, confiriendo un enlace más fuerte a la molécula MHC. Alternativamente o en adición, pueden contener mutaciones en el dominio de enlace receptor de la célula T putativa, resultando en una afinidad incrementada para el receptor de la célula T (TCR). Estas diferencias de la secuencia nativa confieren ventajas en los métodos de la presente invención sobre el uso de la secuencia nativa, en que los epítopes no nativos de la invención han mejorado las propiedades inmunomoduladoras.

También, de preferencia, la construcción de péptidos de la invención es una construcción poliepítope que comprende más de un epítope, en donde dichos epítopes se derivan de uno o más antígenos diferentes. En las construcciones poliepítopes de la invención, al menos un epítope de preferencia es un epítope de célula T citotóxica (CTL). En una modalidad específica, la construcción representa una serie epítope con epítopes colocados consecutivamente.

También, de preferencia, cada uno de los epítopes en la construcción de péptidos de la invención se flanquea en al menos un costado y de preferencia en ambos lados por una secuencia espadadora (flanqueamiento) comprendiendo una secuencia de procesamiento interno. La secuencia de procesamiento interno se diseña para facilitar el procesamiento lisosomal y/o endosomal de la construcción una vez que se alcanza la célula que presenta el antígeno (APC).

El mecanismo de selección APC está comprendido de una secuencia de selección APC, que dirige la construcción a las células que presentan el antígeno (APCs) dentro del sujeto y opcionalmente (i¡) un vehículo, tal como, por ejemplo, una microesfera o liposoma, que también actúa como un mecanismo de selección y/o preserva la viabilidad de la construcción hasta que se ha alcanzado su APC intentado y/o media la liberación controlada de la construcción. La secuencia de selección APC puede unirse covalente o no covalentemente al epítope. De preferencia, la secuencia de marcación APC se une covalentemente al término C o al término N de la secuencia flanqueando respectivamente el primer o el último epítope en la serie epítope. En una modalidad específica, la secuencia de marcación APC se derivó de una secuencia capaz de mediar la interacción con dichas proteínas celular como, por ejemplo, el Receptor de Proteínas de Impacto al Calor (HSR) tal como CD91 , receptores de lectina de tipo C tal como el Receptor Mañosa (MR), DEC-205 y DC-SIGN y el receptor IgG Fe (FcR) tal como Fc(RI.

En una modalidad específica, la construcción de péptidos de la invención puede representarse por la siguiente fórmula general: N-[APC s ecuencia de selección]-[secuencia de flanqueo con secuencia de procesamiento interno]-[epítope 1]-[secuencia de flanqueo con secuencia de procesamiento interno]-[epítope 2]...[epítope n]-C o N-[epítope 1]-[secuencia de flanqueo con secuencia de procesamiento interno]-[epítope 2]...[epítope n]-[secuencia de flanqueo con secuencia de procesamiento interno]-[APC secuencia de selección]-C en donde n es el número de epítopes en la construcción y en donde la secuencia de procesamiento interno puede representarse por la siguiente fórmula general: [Leu y/o Asp y/o Pro]-[Xaa-Lys-Xaa-Lys-YT/c] en donde cada Xaa se selecciona independientemente de cualquier aminoácido e YT;c es un aminoácido que es susceptible para penetrarse por la tripsina o cimotripsina.

La invención también proporciona un método para preparar la construcción de péptidos descritos anteriormente. En una modalidad especifica, la construcción se produce sintéticamente. En otra modalidad, la construcción se produce recombinantemente.

En una modalidad adicional, la invención proporciona una molécula de ácido nucleico aislado que codifica la construcción peptídica descrita anteriormente. La invención también proporciona un vector de expresión que comprende dicho ácido nucleico, así como una célula huésped (es decir, APC) y/o el huésped no humano recombinante que comprende dicho ácido nucleico. De conformidad con una modalidad específica, el vector de expresión comprendiendo el ácido nucleico el ácido nucleico que codifica la construcción epítope de la invención además puede comprender o puede combinarse con un mecanismo de selección APC y por lo tanto puede seleccionarse directamente para expresarse en el APCs del huésped.

Además se proporcionan composiciones de vacunas y farmacéuticas que comprenden una cantidad inmunogénicamente efectiva de la construcción de péptidos de la invención o un ácido nucleico que codifica dicha construcción de péptidos y opcionalmente, además comprende un adyuvante o excipiente farmacéuticamente aceptable.

También proporciona en este documento es un método para inducir o aumentar la inmunidad (de preferencia, una respuesta inmune de la célula T citotóxica específica-antígeno (CTL)) inducida por un antígeno en un mamífero que comprende la administración al mamífero de la composición de vacuna o farmacéutica de la invención.

En una modalidad adicional, la invención proporciona un método terapéutico y/o profiláctico para tratar una enfermedad en un mamífero que comprende administrar a un mamífero al menos una dosis de la composición de vacuna o farmacéutica de la invención. Como se específica en este documento, este método puede ser útil para prevenir y/o tratar varias enfermedades neoplásticas, infecciones, enfermedades autoinmunes y las similares. En una modalidad específica, el método de la invención se emplea para tratar cáncer.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención se basa en el descubrimiento que las secuencias epítopes puede incorporarse en una construcción que (i) suministra el (los) epítope (s) para las células que presentan el antígeno (APCs) y (¡i) facilita el procesamiento apropiado de los epítopes una vez suministrado al APCs.

Específicamente, la presente invención proporciona una construcción peptídica que comprende al menos una secuencia epítope, en donde la construcción también incluye o se asocia con un mecanismo de selección de la célula que presenta el antigeno (APC) y es capaz de estimular una respuesta inmune tal como, por ejemplo, una respuesta celular B y/o la célula T auxiliadora y/o la célula T citotóxica.

El epítope contenido en la construcción epítope de la presente invención puede ser, por ejemplo, un epítope celular T CD8+, un epítope celular T CD4+, un epítope celular B o una combinación de los mismos. Como se describe en este documento, el epítope puede derivarse de cualquier a ntígeno. P or ejemplo, e l e pítope p uede derivarse de un antígeno de cáncer (también llamado antígeno asociado con el tumor o TAA), un antígeno viral, un antígeno bacterial, un antigeno protozoario o un antígeno fúngico. De preferencia, el epítope se deriva de un TAA. En una de las modalidades, el TAA es antígeno carcinoembriogénico (CEA).

La presente invención también proporciona epítopes no nativos novedosos para el enlace mejorado a las moléculas MHC y útiles para la modulación de respuestas inmunes para los péptidos nativos correspondientes de los cuales se derivan. De preferencia, las secuencias del epítope peptídico antigénico sintético de la presente invención difieren de sus contrapartes nativas en que contienen alteraciones en la secuencia de aminoácidos relativas a la secuencia nativa en el dominio de enlace clase I MHC, por lo tanto confiriendo el enlace más apretado para el MHC. Alternativamente o en adición, contienen mutaciones en el dominio de enlace (TCR) del receptor de la célula T putativa, resultando en una afinidad incrementada para el TCR. Estas diferencias de la secuencia nativa confieren las ventajas en los métodos de la presente invención a diferencia de la s ecuencia n ativa, e n q ue l os e pítopes peptídicos antigénicos sintéticos de la invención tienen propiedades ¡nmunomoduladoras mejoradas.

Las c onstrucciones d e I a i nvención c omprenden a I m enos u na s ecuencia e pítope o una combinación de secuencias epítopes que pueden ser la misma o diferente. De preferencia, la construcción peptídica de la ¡nvención es una construcción poliepítope que comprende más de un epítope, en donde dichos epítopes se derivan de uno o más antígenos diferentes. En las construcciones poliepítopes de la invención, al menos un epítope es de preferencia un epítope celular T citotóxico (CTL). En una modalidad específica, la construcción representa un epítope en línea con epítopes consecutivamente ordenados.

También de preferencia, cada uno de los epítopes en las construcciones peptídicas de la invención se flanquea en al menos un costado, de preferencia en ambos lados, mediante una secuencia espaciadora (flanqueamiento) comprendiendo una secuencia de procesamiento interna. La secuencia de procesamiento interno se diseña para facilitar el procesamiento lisosomal y/o endosomal de la construcción una vez que se ha alcanzado la célula de presentación de antígeno (APC).

Los residuos específicos que pueden incluirse en la secuencia de procesamiento interno incluyen, pero no se limitan a arginina (Arg, R), leucina (Leu, L), fenilalanina (Phe, F), ácido aspártico (Asp, D), lisina (Lys, K) o prolina (Pro, P). En una modalidad preferida, la secuencia de procesamiento interno incluye uno o más residuos Arg, Asp y Pro. Como la actividad proteolítica posee lisosomas y endosomas con la especificidad del sustrato similar a la tripsina o cimotripsina (ver Hershko et al., Ann. Rev. Biochem. 67: 425-79 (1998)), las secuencias epítope incluidas en las construcciones de la presente invención d e p referencia u nidas p or l os residuos d e a minoácidos que actúan como sustratos para aquellas enzimas, tal como lisina (Lys, K) o arginina (Arg, R) para tripsina y fenilalanina (Phe, F), triptofano (Trp, W) o tirosina (Tyr, Y) para cimotripsina.

En una modalidad específica, la secuencia de procesamiento interno además puede incluir una ubiquitinación de marcación de secuencia y/o una señal de selección adicional para transportar al ER, las endosomas o lisosomas. De conformidad con una modalidad específica, dicha señal de selección adicional puede contener uno o más de los residuos identificados anteriormente para la secuencia de procesamiento interno y seguido por una "secuencia interna" que contiene al menos uno o más residuos identificados anteriormente para la secuencia de procesamiento interno y se sigue por una "secuencia interna" que contiene al menos un residuo de lisina y de preferencia dos residuos de lisina en las posiciones 3 y 17 de la secuencia interna. Inmediatamente siguiente o adyacente a la secuencia interna, está la secuencia del epítope. Una o más secuencias de ubiquitinación y selección adicional pueden incorporarse en la construcción de la invención, una o más secuencias de selección siendo colocadas entre cada una de las secuencias epítopes. Con respecto a las secuencias de selección adicional, se hace referencia a Bachmair et al., Science, 1986, 234: 179-186; Dantuma et al., Nature Biotech., 2000, 18: 538-43; Velders eí al., J. Immunol. 2001 , 166: 5366-5373; Toes eí al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 1997, 94: 14660-14665; Thomson eí al., J. Viral., 1998, 72: 2246-2252; Ishioka eí al., J. Immünol. 1999, 162: 3915-3925; Thomson eí al., J. Immunol., 1998, 160: 1717-1723 y Publicaciones Internacionales de Patentes Nos. WO 01 /19408, WO 01/47541 y WO 97/35021.

De conformidad con la presente Invención, un "mecanismo de selección" es un sistema que es capaz de dirigir las construcciones de la invención APCs y facilitar el procesamiento interno apropiado de las construcciones una vez dentro de ios APCs. Específicamente, el mecanismo de selección APC está comprendido de (i) una secuencia de selección APC, que dirige la construcción al APCs dentro del sujeto y opcionalmente (ii) un vehículo, tal como, por ejemplo, una microesfera o liposoma, que también actúa como un mecanismo de selección y/o preserva la viabilidad de la construcción hasta que se ha alcanzado su APC intentado y/o media la liberación controlada de la construcción.

La secuencia de selección APC puede ser unida covalente o no covalentemente al epítope. De preferencia, la secuencia de selección APC se une covalentemente al término C o término N de la secuencia flanqueando respectivamente el primer o el último epítope en la serie epítope. En una modalidad específica, la secuencia de selección APC se deriva de una secuencia capaz de mediar la interacción con dichas proteínas de superficie celulares, como por ejemplo, Receptor de Proteína de Impacto al Calor (HSR) tal como C D91 , r eceptores d e l ectina t ipo C t ales c omo e l Receptor M añosa ( MR), D EC-205 y D C-SIGN y e l receptor IgG Fe (FcR) tal como Fc(RI. En el Ejemplo 1 proporcionado posteriormente, la secuencia de selección APC se incorpora en las construcciones en el término C y comprende la secuencia gp96 con la cual interactúa con el fragmento N-terminal de la subunidad alga de CD91 , que es un receptor para las p roteínas d e impacto al calor (ver Binder eí al., Nature Immunol. 1 : 151 -55 (2000)).

Por consiguiente, como se usa en este documento, el término "construcción" se refiere a una molécula que consiste de al menos una secuencia epítope y al menos una secuencia de selección APC que puede estar asociada con la secuencia epítope covalente o no covalentemente.

En una modalidad específica, la construcción peptídica de la invención puede estar representada por la siguiente fórmula general: N-[APC s ecuencia de selección]-[secuencia de flanqueo con secuencia de procesamiento interno] -[epítope 1]-[secuencia de flanqueo con secuencia de procesamiento interno]-[epítope 2]...[epítope n]-C o -[epítope 1]-[secuencia de flanqueo con secuencia de procesamiento interno]-[epítope 2]....[epítope n]-[secuencia de flanqueo con secuencia de procesamiento interno]-[secuencia de selección APC]-C en donde n es el número de epítopes en la construcción y en donde la secuencia de procesamiento interno puede representarse por la siguiente fórmula general: [Leu y/o Asp y/o Pro]-[Xaa-Lys-Xaa-Lys-YT;c] en donde cada Xaa se selecciona independientemente de cualquier aminoácido e YT/C es un aminoácido que es susceptible para penetrarse por tripsina o cimotripsina.

Como se describió anteriormente, en adición a la secuencia de selección APC, el mecanismo de selección de la invención puede incluir la incorporación de las construcciones de la presente invención en los vehículos tales como microesferas o liposomas que se internalizan, es decir, endocitados, fagocitados o pinocitados por el APCs y posteriormente procesados adicionalmente por las endosomas y/o lisosomas dentro de las células. A este respecto, se hace referencia a la Patente Norteamericana No. 6,312,731 , que se refiere a una composición para inducir o potenciar una respuesta inmune comprendiendo un antígeno y/o agente bioactivo encapsulado en una composición polimérica que consiste de un polímero presente en una cantidad suficiente para proporcionar integridad estructural a la composición y un componente rápidamente biodegradable, un componente rápidamente disoluble, un componente rápidamente aumentable o un componente que causa ruptura osmótica de la composición polimérica encapsulada.

Métodos para Elaborar Construcciones Peptídicas de la Invención La invención también proporciona métodos para preparar las construcciones peptídicas descritas anteriormente. Dichos métodos emplean técnicas convencionales. Debido a las construcciones peptídicas que contienen el epítope de la presente invención generalmente serán secuencias cortas, que pueden prepararse rutinariamente por síntesis química usando técnicas estándares. Las técnicas de síntesis de péptidos de fase sólida son particularmente convenientes (Ver, por ejemplo, Steward y Young, eds. (1968) "Síntesis de Péptidos de Fase Sólida" Freemantle, San Francisco, Calif.). Los sintetizadores de péptidos automatizados están comercialmente disponibles (tales como aquellos fabricados por Perkin Elmer/Applied Biosystems, Inc., Modelo 430A ó 431 A, Foster City, Calif. USA), como son los reactivos requeridos para su uso. Los péptidos también pueden prepararse usando técnicas recombinantes conocidas por aquellos expertos en la técnica usando las células huésped y los sistemas de vectores de ácido nucleico descritos posteriormente.

Una vez que se obtiene un péptido aislado de la invención, puede purificarse por los métodos estándares incluyendo cromatografía (es decir, afinidad de intercambio de iones y cromatografía de columna de dimensionamiento), centrifugación, solubilidad diferencial o por cualquier otra técnica estándar para la purificación de proteínas. Para la cromatografía de inmunoafinidad, un epítope puede aislarse mediante unirlo a una columna de afinidad comprendiendo anticuerpos que se elevan en contra de ese péptido o un péptido relacionado de la invención y se fijan a un soporte estacionario. Alternativamente, las etiquetas de afinidad tales como hexa-His (Invitrogen), el dominio de enlace de Maltosa (Nueva Inglaterra Biolabs), secuencia de revestimiento de la gripe (Kolodziej et al (1991) Methods Enzymol. 194:508-509) y la glutationa-S-transferasa puede unirse a los péptidos de la invención para facilitar la purificación por el paso sobre una columna de afinidad apropiada. Los péptidos aislados pueden caracterizarse físicamente usando dichas técnicas como proteólisis, resonancia magnética nuclear y cristalografía de rayos X.

Además se proporcionan composiciones de vacunas y farmacéuticas que comprenden una cantidad inmunogenéticamente efectiva de la construcción del péptido de la invención o el ácido nucleico que codifica dicha construcción de polipéptido y opcionalmente, además comprende un adyuvante o excipiente farmacéuticamente aceptable.

También se proporciona en este documento un método para inducir o aumentar la inmunidad (de preferencia, una respuesta inmune (CTL) celular T citotóxica específica-antígeno) inducida por un antígeno en una mamífero que comprende la administración a dicho mamífero la composición de vacunas o farmacéutica de la invención.

En una modalidad adicional, la invención proporciona un método terapéutico y/o profiláctico para tratar una enfermedad en un mamífero que comprende la administración a dicho mamífero al menos una dosis de la composición de vacuna o farmacéutica de la invención. Como se especifica en este documento, este método puede ser útil para prevenir y/o tratar varias enfermedades neoplásicas, infecciones, enfermedades autoinmunes y las similares. En una modalidad específica, el método de la invención se emplea para tratar un cáncer. Las construcciones de la presente invención de preferencia se designan para provocar una respuesta inmune anti-tumoral en un esfuerzo para disminuir la proporción de crecimiento tumoral, causa la regresión tumoral, incrementa el tiempo de reincidencia y disminuye la mortalidad.

Definiciones Generales Los términos usados en esta especificación generalmente tienen sus significados ordinarios en la técnica dentro del contexto de esta invención y en el contexto específico en donde se usa cada término. Ciertos términos se describen posteriormente o en otra parte en la especificación para proporcionar guía adicional al médico en describir las composiciones y métodos de la invención y como hacer y usarlos.

Los términos "cáncer", "neoplasma" y "tumores" se usan intercambiablemente y se refieren a células que han experimentado una transformación maligna que las hace patológicas al organismo huésped. Las células cancerosas primarias (esto es, las células obtenidas del sitio cercano a la transformación maligna) pueden distinguirse rápidamente de células no cancerosas mediante técnicas bien establecidas, particularmente el examen histológico. La definición de una "célula cancerosa", como se usa en este documento, incluye no solamente una célula cancerosa primaria, pero cualquier célula derivada de un progenitor celular canceroso. Esto incluye las células cancerosas con metástasis y los cultivos in vitro y las líneas celulares de las células cancerosas. Cuando se refieren a un tipo de cáncer que normalmente se manifiesta como un tumor sólido, un tumor "clínicamente detectable" es uno que es detectable en la base de masa tumoral, es decir, mediante procedimientos como análisis CAT, resonancia de imágenes (MRI), rayos X, ultrasonido o palpación. Los hallazgos ¡nmunológicos o bioquímicos solos pueden o no pueden ser suficientes para cumplir con esta definición.

El término "vacuna" se refiere a una composición que puede usarse para provocar la inmunidad protectora en un recipiente (es decir, una composición que comprende la construcción peptídica de la invención o el ácido nucleico que codifica dicha construcción). Deberá notarse que para ser efectiva, una vacuna de la invención puede provocar inmunidad en una porción de la población, como algunos individuales pueden caer para montar una respuesta robusta o inmune protectora o e n a lgunos c asos, c ualquier respuesta i nmune. E sta i nhabilidad p uede p rovenir del antecedente genético del individuo o debido a una condición de inmunodeficiencia (adquirida o congénita) o inmunosupresión (es decir, tratamiento con drogas inmunosupresoras para prevenir el rechazo a los órganos o suprimir una condición auto inmune). Puede establecerse eficacia en los modelos animales.

El término "vacuna ADN" es un término formal de la técnica y se usa en este documento para referirse a una vacuna suministrada por medio de un vector recombinante. Un término más descriptivo y alterno usado en este documento es "vacuna de vector" (dado qua algunos vectores potenciales, tales como retrovirus y lentivirus son los virus de ARN y dado que en algunos casos el ARN no viral en lugar del ADN se envía a las células a través del vector). Generalmente, el vector se a dministra e n vivo, p ero I a t ransducción ex vivo d e l as c élulas d e resentación d el a ntígeno apropiado presentando células, tales como células dendritas (DC), también se contempla con la administración de las células transferidas en vivo.

El término "inmunoterapia" se refiere a un régimen de tratamiento basado en la activación de una respuesta inmune específica-antígeno. Una administración de la vacuna puede ser una forma de inmunoterapia.

"Respuesta inmune" se refiere ampliamente a las respuestas específicas-antígeno de los linfocitos. Cualquier sustancia que pueda provocar una respuesta inmune se dice que es "inmunogénica" y se refiere como un "inmunogeno". Una respuesta inmune de esta invención puede ser humoral (vía la actividad del anticuerpo) o mediada con la célula (vía la activación celular T) o ambas.

Como s e u sa e n e ste documento, el término "inmunogénico" significa que el agente (es decir, proteína, péptido, polisacárido, glícoproteína, glicolípido, ácido nucleico o la combinación de los mismos) es capaz de provocar una respuesta inmune celular o humoral y de preferencia ambas, cuando se administra a un animal que tiene un sistema inmune. Un péptido inmunogénico también es antigénico. Una molécula es "antigénica" cuando es capaz de interactuar específicamente con una molécula de reconocimiento de antígenos del sistema inmune, tal como una inmunoglobulina (anticuerpo) o receptor celular T (TCR). Las secuencias de ligando antigénico que interactúan específicamente con los anticuerpos, moléculas clase I MHC y clase II MHC se describen en este documento. Una porción antigénica de un péptido, también llamada en este documento un epítope puede ser esa porción que es inmunodominante para el anticuerpo o el reconocimiento del receptor celular T o puede ser una porción usada para generar un anticuerpo para la molécula mediante la conjugación de la porción antigénica a un polipéptido portador para inmunización. Una molécula que es antigénica no necesita por si misma ser inmunogénica, es decir, capaz de provocar una respuesta inmune sin un portador, adyuvante o excipiente.

Antígenos y Epítopes de la Invención El término "antígeno" se refiere a cualquier agente (es decir, proteína, péptido, polisacárido, glicoproteína, gllcolípido, ácido nucleico o combinación del mismo) que cuando se introduce en un huésped teniendo un sistema inmune (directamente o en la expresión como en, por ejemplo las vacunas de ADN) se reconoce por el sistema inmune del huésped y es capaz de provocar una reacción inmune específica.

Los términos "antígeno tumor asociado (TAA)" y "antígeno específico-tumoral (TSA)" se usan intercambiablemente y se refieren a un péptido antigénico que se asocia con un tumor. Como se describe en la sección Antecedentes, TAAs incluye, por ejemplo, proteínas celulares mutadas tales como los productos de gen supresores de tumores mutados, productos oncogenes (incluyendo proteínas de fusión) y proteínas extranjeras tales como productos de gen vírales. Las proteínas celulares no mutadas también pueden ser TAAs si se expresan aberrantemente (es decir, en un compartimiento subcelular inapropiado) o en cantidades supernormales.

El término "epítope" o "determinante antigénico" se refiere a cualquier porción de un antígeno reconocido por las células B o las células T o ambas. De preferencia, la Interacción de un epítope con un sitio de reconocimiento de antígenos de una inmunoglobulina o TCR involucra el reconocimiento inmune antígeno-específico.

Las secuencias epítope CTL, las secuencias celulares auxiliares T y las secuencias epítope celulares B pueden incluirse en las construcciones de la invención. Los epítopes usados en las composiciones inmunogénicas (es decir, vacunas) de la presente invención pueden derivarse de c ualquier a ntígeno p resente en una célula eucariótica (es decir, tumores, parásitos, hongos), célula bacterial, partícula viral o cualquier porción del mismo.

Los ejemplos de los antígenos preferidos de la presente invención incluyen antígenos tumor-asociados (TAAs) tal como receptores ErbB, Melan A [MART1], gp100, tirosinasa, TRP-1/gp 75 y TRP-2 (en melanoma, para ejemplos adicionales, ver también una lista de antígenos proporcionados en Storkus y Zarour, Foro (Genova), 2000 Jul-Sep, 10(3):256-270); MAGE-1 y MAGE-. (en la vejiga, cabeza y cuello y el carcinoma de células no pequeñas); HPV EG y proteínas E7 (en el cáncer cervical); Mucin [MUC-1] (en cánceres de mama, páncreas, colon y próstata); el antígeno específico-próstata [PSA] (en cáncer de próstata); antígeno carcinoembriónico [CEA] (en cánceres de colon, mama, pulmón, tiroides y gastrointestinales), antígeno tumor P1A (es decir, como se describe en la Publicación de Patente Internacional No. WO 98/56919) y dichos antígenos específicos tumorales compartidos como MAGE-2, MAGE-4, MAGE-6, MAGE-10, MAGE-12, BAGE-1 , CAGE-1 ,2,8, CAGE-3 a 7; LAGE-1 , NY-ESO-1 /LAGE-2, NA-88 y GnTV {ver, por ejemplo la Publicación de Patente Internacional No. WO 98/56919).

En una modalidad específica, las construcciones de la presente invención incluyen al menos un epítope derivado del antígeno carcinoembriónico (CEA). CEA se asocia con los neoplasmas de origen epitelial incluyendo los carcinomas del tracto gastrointestinal, de la mama, del pulmón y tiroides y por lo tanto las construcciones de la invención que incluyen los epítopes CEA pueden usarse para tratar los neoplasmas de origen epitelial.

Otros antígenos de la invención incluyen pero no s e l imitan a ( i) a ntígenos p rotozoaríos tales como aquellos derivados de Plasmodium sp. Toxoplasma sp., Pneumocystis carinii, Leishmania sp. y Trypanosoma sp.; (ii) proteína viral o antígenos péptidos tales como aquellos derivados del virus de la gripe (es decir, hemaglutínina de las glicoproteínas de superficie (HA) y neuraminidasa (NA) o la neuroproteína (NP) como se describe en Bodmer ef al., Céll, 52:253, 1988 y Tsuji eí al., J. Virol. 72: 6907-6910, 1998 o epitopes NP CTL como se describe en Gould eí al., J. Virol., 65:5401 , 1 991 ; M urata e í a l., C ell I mmunol., 1 73:96-107, 1 996 y Solicitud de Patente No. WO 98/56919); virus de inmunodeficiencia (es decir, un antígeno del virus de inmunodeficiencia en simios (SIV) [es decir, epítope SlV-env CTL como se describe en la S olicitud d e P CT N o. W O 98/56919] o un antígeno del virus de inmunodeficiencia humana (VIH-1 ) tal como los epitopes CTL gp120 como se describen, es decir en la Solicitud de PCT No. WO 98/56919, gp160, antígeno p18 [es decir, epitopes celulares CD8+ T y epitopes gp41 CTL como se describe, es decir en la Solicitud de PCT No. WO 98/56919], Gag p24 epitopes celulares T CD8+, Gag p17 epitopes celulares T CD8+, Tat, Pol, epitopes CTI Nef como se describen, es decir en la Solicitud de PCT NO. WO 98/56919] y los epitopes Env CTL como se describen, es decir en la Solicitud de PCT No. WO 98/56919]; virus del herpes (es decir, una glicoproteína, por ejemplo del virus del herpes felino, virus del herpes equino, virus del herpes bovino, virus de las pseudorabias, virus del herpes canino, virus de herpes simple (HSV, es decir HSV tk, gB, gD), virus del herpes zoster, Virus de la Enfermedad de Marek, virus del herpes de los pavos (HVT), citomegalovirus (CMV) o virus Epstein-Barr); virus de la hepatitis C; virus del papiloma humano (VPH); virus de la leucemia de células T humana (HTLV-1 ); virus de la leucemia bovina (es decir, antígeno de la envoltura gp51 ,30); virus de la leucemia felina (FeLV) (es decir, proteína de sobre FeLV, un virus de la Enfermedad de Newcastle (NDV) antígeno, por ejemplo, HN o F); virus asociado con roedores de tamaño inusual (tales como RAV-1 env); virus de bronquitis infecciosa (es decir, matriz y/o preplomer); flavivirus (es decir, un antígeno del virus de encefalitis Japonesa (JEV), un antígeno de la Fiebre Amarilla o un antígeno del virus del Dengue); Morbillivirus (es decir, un antígeno del virus del moquillo canino, un antígeno del sarampión o antígeno de la plaga de las vacas tal como HA o F); rabias (es decir, glicoproteína G de las rabias); parvovirus (es decir, un antígeno del parvovirus canino); virus de la hepatitis C (HCV); poxvirus (es decir, un antígeno ectromelia, un antígeno del poxvirus de canarios o un antígeno poxvirus de aves de corral tal como el antígeno zoster de la varicela del virus de varicela de pollos); virus de la enfermedad de bolsa infecciosa (es decir, VP2, VP3 o VP4); virus Hantaan; virus de las paperas y virus del sarampión; (iii) antígenos bacteriales tales como Mycobacterium tuberculosis específica (es decir proteína Bacillus Calmette-Guérin [BCG] -38kD; complejo del antígeno 85 [como se describe en Klein ef al., J. Infect. Dis. 183:928-34, 2001 ], ver también una lista de antígenos en Klein y McAdam, Arch. Immunol. Ther. Exp. (Warsz), 47:313-320, 1999), Listeria monocytogenes-específicos (es decir, como se describió en Finelli et al., Immunol. Res., 19:211 -223, 1999), Salmonela rypft/V-específica, Shigella flexner/'-específica, estafilococos-específico, estreptococos-específico, pneumococos-especifico (es decir, PspA [ver la Publicación de PCT No. WO 92/14488]), Neisseria gonorrea-específica, 6orre//a-específica (es decir, antígenos OspA, OspB, OspC de Borrelia asociados con la enfermedad de Lima tal como Borrelia burgdorferi, Borrelia afzelli y Borrelia garinni [ver, por ejemplo, Patente Norteamericana No. 5,523,089; Solicitudes de PCT Nos. WO 90/0441 1 , WO 91/09870, WO 93/04175, WO 96/06165, WO 93/08306; PCT/US92/08697; Bergtrom ef al., Mol. Microbiol., 3: 479-486, 1989; Johnson ef al., Infect. e Immun. 60: 1845-1853, 1992; Johnson ef al., Vacuna 13: 1086-1094, 1995; The Sixth International Conference on Lyme Barreliosis: Progress on the Development of Lyme Disease Vaccine, Vacuna 13: 133-135, 1995]), ros co/wu/s/Va-específica A., S. paratifoidea A y especifica A y B, difteria específica C, féfanos-específico C. botulina C. específico, per/fr/r/ges-específico, A . árjfrax-específico, A. pesfe-específica, V. có/era-específica, H. gr/pe-específica, T. Palladium-específico, tracoma chlamidia-específtca (es decir, como se describe en Kim et al., J. Immunol., 162: 6855-6866, 1999) y las proteínas o péptidos específicos-pseudomonas y (iv) antígenos fúngicos tales como aquellos aislados de la Cándida (es decir manoproteína 65 kDa [MP65] de la candida albicans), trichophyton o ptyrosporum.

La lista precedente de antígenos se intenta como ejemplarizadora, a medida que el antígeno de interés puede derivarse de cualquier tumor o patógeno humano o animal. Con respecto a los antígenos derivados de patógenos que codifican el ADN de interés, la atención se dirige a, por ejemplo, Patentes Norteamericanas Nos. 4,722,848; 5,174,993; 5,338,683; 5,494,807; 5,503,834; 5,505,941 ; 5,514,375; 5,529,780; Patente Británica No. GB 2 269 820 B y Publicaciones de PCT Nos. WO 92/22641 ; WO 93/03145; WO 94/16716; WO 96/3941 ; PCT/US94/06652. Con respecto a los antígenos derivados de los virus tumorales, también se hace referencia a Molecular Biology of Tumor Viruses, RNA Tumor Viruses, Segunda Edición, Editado por Weiss et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1982. Para una lista adicional de antígenos útiles en las composiciones de la invención ver también el Diccionario Médico de Stedman (24ava Edición, 1982).

Para proporcionar epítopes celulares T y B derivados de antígenos adicionales para usarse en las construcciones de la presente invención, estos epítopes pueden identificarse por uno o una combinación de varios métodos bien conocidos en la técnica, tales como por ejemplo, mediante (i) fragmentación del antígeno de interés en los péptidos de traslapo usando enzimas proteol (ticas, seguidas por la prueba de la habilidad de los p éptidos i ndividuales p ara u nirse a u n a nticuerpo provocado por el antígeno de longitud completa o para inducir la activación de la célula B o l a célula T (ver, por ejemplo, Janis Kuby, Immunology, pp. 79-80, W. H. Freeman, 1992); (ii) preparar los péptidos sintéticos, las secuencias de los cuales son segmentos o análogos de un antígeno dado (ver, por ejemplo, Alexander et al. Immunity, 1 : 751-61 , 1994; Hammer eí al., J. Exp. Med., 180: 2353-8, 1994) o construcciones basadas en dichos segmentos, o análogos unidos o fusionados a un portador o un antígeno heterólogo y probar la habilidad de dichos péptidos sintéticos para provocar los anticuerpos antígeno-específicos o la activación celular T (por ejemplo, probar su habilidad para ¡nteractuar con las moléculas clase II MHC ambas in vitro y en vivo [ver, por ejemplo O'Sullivan eí al., J. Immunol. 147: 2663-9, 1991 ; Hill et al., J. Immunol., 147: 189-197, 1991]); para la determinación de los epítopes de la célula T, los péptidos deberían ser al menos de 8 a 10 aminoácidos de largo para ocupar la ranura de la molécula de la clase I MHC y ai menos de 13 a 25 aminoácidos de largo para ocupar la ranura de la molécula de la clase II MHC, de preferencia, l os p éptidos d eberán s er m ás grandes, estos péptidos también deberán obtener un motivo de sujeción apropiado que los habilitará para unirse a varias moléculas MHC de clase I o clase II con alta afinidad suficiente y especificidad para generar una respuesta inmune (ver Bocchia eí al., Blood, 85: 2680-2684, 1995; Englehard, Ann. Rev. Immunol., 12: 181 , 1994); (iii) secuenciar los péptidos asociados con las moléculas MHC purificadas (ver por ejemplo, Nelson et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 94:628-33, 1997); (iv) análisis de una biblioteca de despliegue de péptidos para el enlace de alta afinidad a las moléculas clase II MHC, TCR, anticuerpos elevados en contra de un antígeno de amplitud completa, etc. (ver por ejemplo, Hammer ef a/.,J. Exp. ed. 176:1007-13, 1992); (v) analizar computacionalmemte las diferentes secuencias de proteínas para identificar, por ejemplo, alargamientos hidrofílicos (los residuos de aminoácidos hidrofílicos comúnmente se ubican en la superficie de la proteina y por lo tanto son accesibles a los anticuerpos) y/o TCR de alta afinidad o motivos alelo específicos de clase II MHC, por ejemplo, mediante comparar la secuencia de la proteína de interés con las estructuras publicadas de los péptidos asociados con las moléculas MHC (Mallios, Bioinformatics, 15: ¿432-439, 1999; Milik eí al., Nat. Biotechnol., 16: 753-756, 1998; Brusic ef al., Nuc. Acids Res, 26: 368-371 , 1998; Feller y de la Cruz, Nature, 349: 720-721 , 1991 ); (vi) realizando un análisis cristalográfico de rayos X del complejo de anticuerpos de antígeno nativo (Janis Kuby, Immunology, p. 80, W. H. Freeman, 1992) y (vii) generando los anticuerpos monoclonales para varias porciones del antígeno de interés y posteriormente comprobando si aquellos anticuerpos atuenan el crecimiento en vivo o in vitro del patógeno o tumor del cual el antígeno se deriva (ver la Patente Norteamericana No. 5,019,384 y las referencias citadas en este documento).

Epítopes No Nativos y Métodos para Su Generación Un epítope "nativo", de "tipo salvaje", "natural" o "autónomo" es un epítope. Que se ha aislado de una fuente biológica natural y que puede reconocerse por el sistema inmune.

Un epítope "alterado" o "no natural" o "no nativo" o "modificado" o "sintético" es uno que tiene una secuencia primaria que es diferente de esa del epítope nativo correspondiente. Aunque usando los epítopes con las secuencias peptídicas no nativas puede inducirse las respuestas inmunes que no son especificas para el blanco intentado, de conformidad con la presente invención, se prefirió el uso de epítopes no nativos por las siguientes razones. Primero, es probable que las secuencias de péptidos nativos derivadas de antígenos (por ejemplo, antígenos asociados a tumores (TAAs) o antígenos autónomos en enfermedades autoinmunes) pueden reconocerse por el sistema inmune como autónomos y los pacientes puede se tolerantes a estas secuencias d e p éptidos. S egundo, m uchas s ecuencias d e p éptidos n ativos n o se unen con alta afinidad a las moléculas MHC. Como se ha observado que la resistencia de la respuesta inmune a un epítope particular se relaciona con la afinidad de enlace del epítope para el complejo clase I MHC (es decir, respuestas inmunes más fuertes pueden inducirse por los péptidos que se enlazan con afinidad más alta a las moléculas MHC), es probable que la respuesta inmune para los epítopes nativos será menor que las respuestas inmunes a los epítopes no nativos que se enlazan con más alta afinidad a las moléculas MHC.

Los epítopes de péptidos no nativos pueden producirse usando cualquier método conocido en la técnica. Lo siguiente proporciona ejemplos no limitantes de dichos métodos. Además. Pueden usarse modificaciones o combinaciones de cualquiera de los métodos siguientes.

Los epítopes no nativos pueden derivarse de epítopes nativos (es decir, usando mutagénesis en sitio dirigido) mediante modificarlos en cualquier forma conocida en la técnica, tanto como la modificación no previene completamente su habilidad para generar una respuesta inmune. En particular, las construcciones de la invención pueden tener una o más sustituciones de aminoácidos, omisiones o inserciones. Por ejemplo, dichas sustituciones de aminoácidos pueden incluir sustituciones de residuos de aminoácidos funcionalmente equivalentes. Uno o más residuos de aminoácidos pueden sustituirse por otro aminoácido de una polaridad similar que actúa como un equivalente funcional resultando en una alteración silenciosa. Los sustitutos para un aminoácido puede seleccionarse de otros miembros de la clase a la cual pertenece el aminoácido. Por ejemplo, los aminoácidos no polares (hidrofóbicos) incluyen alanina, leucina, isoleucina, valina, prolina, fenilalanina, triptofano y metionina. Los aminoácidos neutrales polares incluyen glicina, serina, treonina, cisteína, tirosina, asparagina y glutamina. Los aminoácidos positivamente cargados (básicos) incluyen arginina, lisina e histidina. Los aminoácidos negativamente cargados (ácidos) incluyen ácido aspártico y ácido glutámico.

Adicionalmente, uno o más residuos de aminoácidos puede sustituirse por un aminoácido no clásico o análogos del aminoácido químico. Los aminoácidos no clásicos incluyen pero no se limitan a los D-isómeros de los aminoácidos comunes, ácido isobutirico alfa-amino, ácido 4-amino butírico, á cido 2 -amino b utírico, á cido 6-amino hexanóico, ácido 2-amino butírico, ácido 3-amino propiónico, ornítina, norleucina, norvalina, hidroxiprolina, sarcosina, citrulina, ácido cistéico, t-butilglicina, t-butilalanina, fenilglicina, ciclohexilalanina, beta-alanina, aminoácidos de flúor, aminoácidos diseñadores tales como aminoácidos beta metilo, aminoácidos C-(-met¡lo, aminoácidos N-(-metilo y análogos aminoácidos en general. Los péptidos de la invención también comprenden varios aminoácidos "diseñadores" (por ejemplo, aminoácidos (-metilo, aminoácidos C-(-metilo y aminoácidos N-(-metilo, etc.) para transportar las propiedades especiales a los péptidos. Adicionalmente, mediante la asignación de aminoácidos específicos en etapas de acoplamiento específicas, pueden generarse los péptidos con (-hélices, (-giro, (-hojas, (-vueltas y péptidos cíclicos. Generalmente, se cree que se prefiere la estructura secundaria (-helical o la estructura secundaria aleatoria.

Los siguientes aminoácidos no clásicos pueden incorporarse en los péptidos de la invención para introducir los motivos conformacionales particulares: 1 ,2,3,4-tetrahidroisoquinolina-3-carbox¡lato (Miyake et al. (1989) J. Takeda Res. Labs 43:53-76), ácido carboxílico isoquinolina histidlna (Zechel et al. (1991 ) Int. J. Pep. Protein Res. 43) y HIC (urea cíclica histidina (Dharanipragada).

Los siguientes análogos aminoácidos y los peptodomiméticos pueden incorporarse en un péptido para inducir o favorecer las estructuras secundarias específicas: LL-Acp (ácido LL-3-amino-2-propenidona-6-carboxílico), un análogo depeptídico induciendo el (-giro (Kemp et al. (1985) J. Org. C hem. 50:5834-5838); a nálogos i nduciendo l a ( -hoja ( Kemp et a l. ( 1988) T etrahedron Lett. 29:5057-5060); análogos induciendo las (-hélices (Kemp et al. (1988) Tetrahedron Lett. 29:4935-4938); análogos induciendo (-giro (Kemp ef al. (1989) J. Org. Chem. 54:109-1 15) y los análogos proporcionados por las referencias siguientes: Nagai y Sato (1985) Tetrahedron Lett. 26:647-650; DiMaio et al. (1989) J. Chem. Soc. Perkin Trans. P. 1687; también un análogo de giro Gly-Ala (Kahn ef al. (1989) Tetrahedron Lett. 30: 2317); isostere de enlace amida (clones eí al. (1988) Tetrahedron Lett. 29:38S3-38S6); tetrazol (Zabrocki eí al. (1988) J. Am. Chem. Soc. 1 10:587S-5880); DTC (Samanen et al. (1990) Int. J. Protein Pep. Res. 35:501 :509) y los análogos pensados en Olson eí al. (1990) J. Am. Chem. Sci. 1 12:323-333 y Garvey et al. (1990) J. Org. Chem. 56:436. Conformacionalmente los miméticos restringidos de los giro beta y las protuberancias beta y los péptidos que los contienen se describen en la Patente Norteamericana No. 5,440,013.

Además, la presente invención imagina la preparación de los péptidos que tienen más propiedades estructurales bien definidas y el uso de peptimiméticos y enlaces peptidomiméticos, tales como los enlaces éster para preparar los péptidos con propiedades novedosas. En otra modalidad, un péptido puede generarse para incorporar un enlace péptido reducido, es decir, R1 — CH2 NH — R2, en donde R1 y R2 son residuos o secuencias de aminoácidos. Un enlace de péptidos reducido puede introducirse como una subunidad bipeptídica. Dicha molécula sería resistente a la hidrólisis de enlace de péptidos, por ejemplo, actividad proteasa. Dichas moléculas proporcionarían ligandos con la función y actividad única, tal como las medias vidas extendidas in vivo debido a la resistencia al rompimiento metabólico o la actividad proteasa.

En una modalidad específica, los epítopes no nativos se derivan de los epítopes nativos recombinantemente mediante la introducción de las modificaciones post-traducciones, es decir mediante fosforilación, glicosilación, reticulación, acilación, penetración proteolítica, unión a una molécula del anticuerpo, molécula de la membrana u otro epítope (Ferguson et al. Ann. Rev. Biochem. 1988, 57:285-320).

Para la generación de grandes números de nuevas secuencias de epítopes no nativos, pueden construirse las bibliotecas de "despliegue de fago" bacteriófagos (entidades químicas 106-108) (Scott y Smith (1990) Science 249:386-390; Cwirla et al. (1990) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 87:6378-6382; Deblin eí al. (1990) Science 249:440-406). Otros métodos involucran los métodos de síntesis primeramente químicas de los cuales el método Geysen (Geysen et al. (1986) Inmunología Molecular 23:709-715; Geysen et al. (1987) Método Inmunológíco J. 102:259-274) y el método de Fodor ef al. (1991 ) Science 251 :767-773) son ejemplos. Ver también Furka et al. (1988) 14avo. Congreso Internacional de Bioquímica, Volumen 5. Resumen FR:013; Furka, (1991 ) Int. J. Peptide Protein Res. 37:487-493). Ver también las Patentes Norteamericanas Nos. 4,631 ,21 1 y 5,101 ,175, las cuales d escriben m étodos p ara p roducir u na m ezcla d e p éptidos. O tros m étodos que pueden emplearse involucran el uso de bibliotecas sintéticas (Needles et al. (1993) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90:10700-4; Ohlmeyer eí al. (1993) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90:10922-10926; Publicación de Patente Internacional No. WO 92/00252) y técnicas basadas en la sustracción del cADN o el despliegue diferencial (Hedrick eí al. (1984) Nature 308:149; Lian y Pardee (1992) Science 257:967). Otra técnica que puede usarse es la técnica del "análisis de péptidos" (Van der Zee (1989) Eur. J. Immunol. 19:43-47), en la cual varias docenas de péptidos se sintetizan simultáneamente en las barras de polietileno ordenadas en un diseño de placa de microconcentración de 96 pozos, similar a una biblioteca con índices de manera que cada espiga define la síntesis histórica en ella. Los péptidos posteriormente se penetran químicamente desde el soporte de sólidos y se suministra a los timocitos singénicos irradiados para la presentación del antígeno. Una línea CTL clonada posteriormente puede probarse para reactividad en una prueba de proliferación monitoreada por la incorporación de timidina 3H.

En una modalidad específica, los epítopes no naturales de la presente invención se generan de una biblioteca recombinante de oligopéptidos unidos a los soportes de fase sólida usando tecnología SPHERE™, que se describe en la Publicación de Patente Internacional No. WO 97/35035, Patentes Norteamericanas Nos. 6,528,060 y 6,338,945 y la Solicitud Norteamericana Publicada No. 2002/0164346. Este avance usa bibliotecas de péptidos combinatorias sintetizadas en lechos de poliestireno en donde cada lecho contiene una población pura de un péptido único que puede liberarse químicamente de los lechos en alícuotas discretas. Los péptidos unidos a un solo lecho tienen esencialmente la misma secuencia de aminoácidos. La historia de la síntesis de cada lecho péptido puede registrarse en cada soporte sólido en un código de etiquetas moleculares inertes, de manera que dichos lechos de interés pueden decodificarse rápida y eficientemente. Un reticulador fotopenetrable permite la liberación de algún oligopéptido mediante la exposición a la luz UV. Las etiquetas moleculares, si están presentes, continúan covalentemente unidas a los lechos para el análisis post-prueba. El péptido liberado de las series de lechos agrupados se analizan usando métodos para detectar la activación celular T, incluyendo por ejemplo, la incorporación 3H-timidina (para las células CD4+ o CD8+), la prueba de liberación 51Cr (para CTLs), o la producción IL-2 (para las células T CD4+) para identificar los grupos de péptidos capaces de activar una célula T de interés. Mediante la utilización de una estrategia de liberación/grupos de péptidos iterativos, es posible para analizar más de 107 péptidos en justo pocos días. El análisis del péptido residual en los lechos positivos correspondientes (>100 pmoles) permiten la identificación rápida e inequívoca de la secuencia epítope.

Como se especificó anteriormente, los epítopes no nativos de la invención pueden unirse a las moléculas MHC con mayor afinidad que los epítopes nativos correspondientes. El enlace de los epítopes de la invención a las moléculas MHC pueden medirse mediante métodos que son conocidos en la técnica e incluyen pero no se limitan a calcular la afinidad basada en un algoritmo (ver, por ejemplo, Parker et al. (1992) J. Immunol. 149:3580-3587) y la afinidad de enlace experimentalmente determinante (ver, por ejemplo, Tan et al. (1997) J. Immunol. Meth. 209:25-36). Por ejemplo, el enlace relativo de un péptido a una molécula MHC puede medirse en la base del enlace de un péptido estándar radiomarcado para las moléculas MHC solubilizadas en detergente, usando varias concentraciones de péptidos de prueba (es decir, oscilando desde 100 mM a 1 nM). Por ejemplo, cadena pesada clase I MHC y (2-microglobulina pueden co-incubarse con una concentración fijada (es decir, 5 nM) del péptido nativo radiomarcado (control) y varias concentraciones de un péptido no nativo correspondiente por un periodo de tiempo apropiado (es decir, 2 horas a 72 horas) a temperatura ambiente en la presencia de una mezcla de inhibidores de proteasa. El porcentaje de radioactividad del enlace MHC se determina por filtración de gel. El IC50 (concentración del péptido de prueba que resulta en la inhibición del 50% del enlace del péptido de control) se calcula para cada péptido.

Como sé específico anteriormente, los epítopes no nativos de la invención también pueden unirse a TCRs con una afinidad más alta que los epítopes nativos correspondientes. Los métodos para determinar la afinidad de enlace para los TCRs se conocen en la técnica e incluyen pero no se limitan a, aquellos descritos en al-Ramadi et al. (1992) J. Imunol. 155(2):662-673 y Zuegel et al. (1998) J. Immunol. 161 (4):1705-1709.

Células Efectoras Inmunes El término "células efectoras inmunes" se refiere a células capaces de enlazar un antígeno y el cual por lo tanto media una respuesta inmune. Estas células incluyen, pero no se limitan a células T, células B, monocitos, macrófagos, células NK y linfocitos T citotóxicos (CTLs). La activación de las células T mediante las células que presentan el antígeno profesional (APCs) conduce a su proliferación y la diferenciación de su progenitura en las células T efectoras armadas que pueden actuar en cualquier célula blanco que despliega el antígeno en su superficie. Las células T efectoras pueden mediar una variedad de funciones. Un juego de funciones importantes es la destrucción de las células, es decir las células cancerosas o las células infectadas por el virus o la bacteria, mediante CD8+ CTLs y la activación de macrófagos por las células TH1 , que juntas aumentan la inmunidad mediada por las células. Además, las células B se activan por las células TH2 para producir diferentes tipos de anticuerpos, además conduciendo la respuesta inmune humoral.

El término "células que presentan el antígeno" o "APCs" se refieren a una clase de células capaces de presentar uno o más antígenos en la forma de complejos MHC-antígenos reconocibles por las células efectoras específicas del sistema inmune y por lo tanto induciendo una respuesta inmune celular efectiva en contra del antígeno o antígenos siendo presentados. Mientras muchos tipos de células pueden ser capaces de presentar antígenos en su superficie celular para el reconocimiento celular T, solamente los APCs profesionales tienen la capacidad para presentar antígenos en una cantidad suficiente y además activar las células T para las respuestas CTL. Los APCs incluyen, por ejemplo, macrófagos, células B y células dendritas (DCs).

El término "células dendritas" o los "DCs" se refieren a una población diversa de tipos de células morfológicamente similares encontradas en una variedad de tejidos linfoides y no linfoides (Steinman (1991 ) Ann. Rev. Immunol. 9:271 -296). Los DCs constituyen los APCs más potentes y preferidos en el organismo. Un subconjunto, si no todo, de los DCs se derivan de las células progenitoras de la médula espinal, circula en pequeños números en la sangre periférica y aparece como c élulas d e L angerhans e specíficas o c élulas m aduras terminantemente diferenciadas. Los DCs son APCs profesionales que efectivamente capturan antígenos en los tejidos periféricos y procesan estos antígenos para formar los complejos del péptido MHC. Después de la ingesta del antígeno, estos DCs inmaduros adquieren la única capacidad para migrar de la periferia a las áreas de la célula T de los órganos linfoides secundarios. A medida que viajan las células, ellas maduran y alteran su perfil de moléculas de superficie celular para atraer las células T latentes y presentar su carga antigénica (Shaw ef al. (1986) Nature 323, 262-264; Adema et ai, (1997) Nature 387, 713-717; Banchereau y Steinman, (1998) Nature 392, 245-252). Mientras los DCs pueden diferenciarse de los monocltos, ellos poseen fenotipos distintos. Por ejemplo, un marcador de diferenciación particular, el antígeno CD14, no se encuentra en los DCs pero está poseído por monocitos. También, los DCs maduros no son fagocíticos, en vista de que los monocitos son células fuertemente fagocitadas. Se ha demostrado que los DCs proporcionan todas las señales necesarias para la activación y proliferación celular T.

Las células T reconocen las proteínas solamente cuando ellas se han penetrado en péptidos más pequeños y se presentan en un complejo llamado "complejo de histocompatibilidad principal (MHC)" ubicado en la otra superficie celular. Los términos "complejo de histocompatibilidad principal" o "MHC" se refieren a un complejo de genes que codifica las moléculas de la superficie celular que se requieren para la presentación del antígeno para las células T y para el rápido rechazo del injerto. En humanos, el MHC también se conoce como el "antigeno leucocito humano" o el complejo "HLA". Las proteínas codificadas por el MHC se conocen como "moléculas MHC" y se clasifican en las moléculas MHC de clase I y clase II. El MHC de clase I incluye proteínas heterodiméricas de membrana hechas de una cadena ( codificada en el MHC no covalentemente unido con la microglobulina (2. Las moléculas MHC de clase I se expresan por todas las células casi nucleadas y se ha demostrado para funcionar en la presentación del antígeno a las células T CD8+, es decir, las células T que tienen la proteína CD8 en su superficie. Las células T CD8+, se unen específicamente a los complejos del péptido/clase I MHC vía el receptor celular T (TCR). Esto conduce a l as a ctividades e fectoras c itoliticas v ía e l receptor c elular T ( TCR). E sto c onduce a I as a ctividades efectoras citoliticas. Las moléculas de clase I incluyen HLA-A, B y C en humanos. Las moléculas MHC de clase II también incluyen proteínas heterodiméricas de membrana que consisten de cadenas ( y ( no covalentemente asociadas. Los complejos MHC de clase II se encuentran solamente en APCs y se usan para péptidos presentes de los antígenos que se han endocítado por los APCs. Las células T que tienen la proteína CD4 en su superficie, es decir, las células CD4+ T se unen a los complejos del péptido/clase II MHC vía TCR. Esto conduce a la síntesis de citoquinas específicas que estimulan una respuesta inmune. Los MHCs en la clase II en humanos incluyen HLA-DP, DQ y DR. Aquellos expertos en la técnica son familiares con los serotipos y genotipos de HLA (ver Rammensee, H. G., Bachmann, J., y Stevanovic, S. Los motivos de los ligandos y péptidos MHC (1977) Chapman & Hall Publíshers; Schreuder er al., El diccionario HLA, Antígenos del Tejido 1999, 54:409-437). Para reconocerse efectivamente por el sistema inmune vía la presentación de la clase I MHC, un polipéptido antigénico tiene que contener un epítope de al menos 8 a 10 aminoácidos, mientras se reconocen efectivamente por el sistema inmune vía la presentación de la clase II MHC, un polipéptido antigénico tiene que contener un epítope de al menos aproximadamente 13 a 25 aminoácidos. Ver, por ejemplo, Fundamental Immunology, 3era. Edición, W. E. Paul ed., 1999, Lippincott-Raven Publ.

El término "anticuerpos nativos" o "¡nmunoglobulinas" se refiere a glicoproteínas usualmente heterotetraméricas de aproximadamente 150,000 daltons, compuesta de dos cadenas de luz idénticas (L) y dos cadenas pesadas idénticas (H). En la mayoría de las clases de moléculas de ¡ nmunoglobulinas, c ada cadena d e l uz s e u ne a u na cadena pesada por un enlace bisulfuro covalente, mientras el número de enlaces de bisulfuro varía entre las cadenas pesadas de diferentes ¡ sotipos d e i nmunoglobulina. C ada c adena p esada y d e l uz también t iene puentes de bisulfuro de inter-cadenas regularmente espaciadas. Cada cadena pesada tiene un extremo en un dominio variable (VH) seguido por un número de dominios constantes. Cada cadena de luz tiene un d ominio v ariable ( VL) e n u n e xtremo y un dominio constante en su otro extremo; el dominio constante de la cadena de luz se alinea con el primer dominio constante de la cadena pesada y el dominio variable de la cadena de luz se alinea con el dominio variable de la cadena pesada. Se cree que los residuos de aminoácidos particulares se cree que forman una interfase entre los dominios v ariables d e c adena p esada y d e l uz ( Clothia eí al., J. Mol. Biol., 186: 651 -663, 1985; Novotny y Haber, Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 82: 4592-4596, 1985).

El término "anticuerpo" o "Ab" se usa en el sentido más amplio y específicamente cubre no solamente los anticuerpos nativos pero también anticuerpos monoclonales simples (incluyendo agonistas y anticuerpos antagonistas), las composiciones del anticuerpo con especificidad poliepitópica, asi como fragmentos de anticuerpos (es decir, Fab, F(ab')2, scFv y Fv), tan prolongado como ellos exhiben la actividad biológica deseada.

El término "reactivo-cruzado" se usa para describir los compuestos de la invención que son funcionalmente t raslapados. M ás p articularmente, I as p ropiedades i nmunogénicas d e u n epítope nativo y/o las células efectoras inmunes por lo tanto se comparten a una cierta extensión por el epítope no nativo derivado de los mismos de manera que el epítope no nativo es "reactivo-cruzado" con el epítope nativo y/o las células efectoras inmunes por lo tanto activadas. Para los propósitos de esta invención, la reactividad cruzada puede manifestarse en niveles múltiples: (i) en el nivel epítope, es decir, los epítopes no nativos pueden unirse por el TCR de y activar los CTLs específicos-epítope nativo; (ii) en el nivel celular T, es decir, los epítopes no nativos de la invención unen el TCR y activan una población de las células T (distintas de la población de CTLs de epítope nativo específicos) que pueden seleccionarse efectivamente y lisar las células que despliegan el epítope nativo y (iii) en el nivel del anticuerpo, es decir, pueden detectarse anticuerpos epítope "anti"-no nativos, reconocerse e iniciar los mecanismos efectores en una respuesta inmune.

Definiciones Terapéuticas Como se usa en este documento, el término "induciendo una respuesta inmune en un sujeto" es un término bien entendido en la técnica y significa que un incremento en una respuesta inmune para un antígeno (o epítope) puede detectarse o medirse, después de introducir la construcción en el sujeto, relativo a la respuesta inmune (si cualquiera) antes de la introducción de la construcción en el sujeto. Los métodos para determinar si una respuesta inmune para un antígeno dado (o epítope) se ha inducido son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, el anticuerpo antígeno-específico puede detectarse usando cualquiera de una variedad de inmunopruebas conocidas en la técnica, incluyendo, pero no limitadas a ELISA, en donde, por ejemplo, el enlace de un anticuerpo en una muestra para un antígeno inmovilizado (o epítope) se detecta con un segundo anticuerpo detectablemente marcado (es decir, anticuerpo Ig anti-humano de ratón enzima marcado).

El término "tratar" se usa en este documento para dar el significado de aliviar o mitigar al menos un síntoma de una enfermedad o condición en un sujeto. Dentro del significado de la presente invención, el término "tratar" puede significar prolongar la prepatencia, es decir, el periodo entre la infección o la transformación neoplásica y la manifestación clínica de una enfermedad. El término "protector" se usa en este documento como el significado de tratar o prevenir o ambos, el desarrollo o continuación de una enfermedad en un sujeto. Dentro del significado de la presente invención, la enfermedad se selecciona del grupo que consiste del tumo maligno (es decir, tumores sanguíneos o sólidos tales como sarcomas, carcinomas, gliomas, blastomas, cáncer pancreático, cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer de próstata, linfoma, leucemia, melanoma, etc.), infección (es decir, viral, bacterial, parasítica o fúngica) y una enfermedad inmune (es decir, la mayoría de las forma de artritis, ulceras, colitis, asma o esclerosis múltiple). Por ejemplo, si el (los) epítope(s) incorporados en esta construcción de la invención es(son) derivados del CEA (antígeno carcinoembriónico), que se asocia con los neoplasmas de origen epitelial, incluyendo los carcinomas del tracto gastrointestinal, mama, pulmón y tiroides, la construcción de la invención puede administrarse para prevenir o tratar los neoplasmas de origen epitelial en un sujeto en necesidad de dicho tratamiento. Por lo tanto, el uso intentado de las construcciones de la invención dependerá grandemente del origen del (de los) epítope (s). La administración profiláctica de la vacuna puede proteger el sujeto receptor en riesgo de desarrollar dicho cáncer, es decir, como se determina de la historia familiar.

La frase "farmacéuticamente aceptable" como se usa en conexión con las composiciones de la invención, se refiere a entidades moleculares y otros ingredientes de dichas composiciones que se toleran fisiológicamente y no producen típicamente reacciones adversas cuando se administran a un humano. De preferencia, como se usa en este documento, el término "farmacéuticamente aceptable" significa por una agencia reguladora aprobada del Gobierno Federal o del gobierno del estado o listado en la farmacopea Norteamericana u otra farmacopea generalmente reconocida para usarse en mamíferos y más particularmente en humanos.

El término "adyuvante" e "inmunoadyuvante" se usan intercambiablemente en la presente invención y se refiere a un compuesto o mezcla que puede ser no inmunogénico cuando se administra a un huésped solo, pero que aumenta la respuesta inmune para otro antígeno cuando se administra unido con ese antígeno.

El adyuvante de la invención puede administrarse como parte de una composición de vacuna o farmacéutica que comprende un antígeno o como una formulación separada. Los adyuvantes de la invención incluyen, pero no se limitan a adyuvantes basados en emulsificantes y emulsión-aceite tal como el adyuvante de Freund, el adyuvante incompleto de Freund, MF59 o SAF; geles minerales tales como hidróxido de aluminio (alumbre), fosfato de aluminio o fosfato de calcio, adyuvantes microbiológicamente derivados tales como toxina del cólera (TC), toxina de la tos convulsiva, toxina inestable al calor Escherichia coli (LT), toxinas mutantes (es decir LTK63 ó LTR72), Bacille Calmette-Guerin (BCG), Corynebacterium parvum, motivos CpG del ADN, dipéptido muramil o lípido monofosforilo A; adyuvantes particulares tales como complejos inmunoestimulatorios (ISCOMs), liposomas, microesferas biodegradables o saponinas (es decir, QS-21 ); citoquinas tales como IFN-(, IL-12 o GM-CSF; adyuvantes sintéticos tales como copolímeros de bloque noniónicos, análogos del péptido muramil (es decir., N-acetil-muramil-L-treonil-D-isoglutamina [Thr- DP], N-acetil-nor-muramil-L-alanil-D-isoglutamina, N-acetilmuramil-L-alanil-D-isoglutam¡nil-Lalanina-2-[1 '-2'-dipalmitoil-sn-glicero-3-hidroxifosforioxi]-etil^ polifosfacenos o polinucleótidos sintéticos y sustancias activas de superficie tales como lisolecitina, polioles plurónicos, polianiones, péptidos, emulsiones de hidrocarburo o hemocianinas de lapa de bocallave (KLH). De preferencia, estos adyuvantes son farmacéuticamente aceptables para usarse en humanos.

Dentro del significado de la presente invención, el término "administración unida" se usa para referirse a la administración de un adyuvante inmune y un antígeno simultáneamente en una composición o simultáneamente en diferentes composiciones o secuencialmente.

El término "excipiente" aplicado a las composiciones de vacuna o farmacéuticas de la invención se refieren a un diluyente o vehículo con el cual se administra un compuesto que contiene antígeno y/o un adyuvante. Dichos excipientes pueden ser líquidos estériles, tales como agua y aceites, incluyendo aquellos del petróleo, animales, vegetales o de origen sintético, tales como aceite de cacahuate, aceite de soya, aceite mineral, aceite de ajonjolí y l os s imilares. L a solución acuosa o de agua, las soluciones salinas y las soluciones de glicerol y de dextrosa acuosa de preferencia se emplean como excipientes, particularmente para las soluciones inyectables. Los excipientes farmacéuticos apropiados se describen en "Remington's Pharmaceutical Sciences" por E. W. Martín, 18ava Edición.

El término "inmunidad protectora" se refiere a una respuesta inmune en un animal huésped (ya sea activa/adquirida o pasiva/innata o ambas) que conduce a la inactivación y/o reducción en la carga de un antígeno y para la generación de la inmunidad (que se adquiere, es decir a través de la producción de anticuerpos), que previenen o retrasan el desarrollo de una e nfermedad e n l a exposición repetida a la misma o a un antígeno relacionado. Una "respuesta inmune protectora" involucra la inmunidad humoral (anticuerpo) o inmunidad celular o ambas, efectiva, es decir, para reducir un peso del tumor en un sujeto inmunizado (vacunado) o para eliminar o reducir el incremento en, la carga de un patógeno o célula infectada (o producir cualquier otro alivio mensurable de la infección). Dentro del significado de la presente invención, la inmunidad protectora puede ser parcial. En las modalidades específicas de la invención, la inmunidad protectora se reflejó por cualquier mejora en cualquier condición o síntoma siendo tratada, incluyendo cualquiera de una de las siguientes: una disminución de la progresión de la enfermedad, incrementando la longitud para la recaída, la proporción de disminución del crecimiento tumoral, la regresión del tumor, la mortalidad disminuida, etc.

Como se usa en este documento, el término "aumentar la respuesta inmune" significa mejorar o extender la duración de la respuesta inmune o ambas.

La frase "mejorar la respuesta inmune" dentro del significado de la presente invención se refiere a I a p ropiedad o proceso de incrementar la escala y/o eficiencia de la inmunoreactividad para un antígeno dado, dicha inmunoreactividad siendo humoral o inmunidad celular o ambas. Una respuesta inmune se cree que se mejora, si cualquier parámetro mensurable de la inmunoreactividad específica del antígeno (es decir, la concentración del anticuerpo, la producción de células T) se incrementa en al menos dos veces, de preferencia treinta veces.

El término " modular u na r espuesta i nmune" incluye inducir (incrementar o provocar) una respuesta inmune y reducir (suprimir) una respuesta inmune. Un método ¡nmunomodulador (o protocolo) es uno que modula una respuesta inmune en un sujeto.

El término "cerca" o "aproximadamente" usualmente significa dentro del 20%, más preferiblemente dentro del 10% y más preferiblemente aún dentro del 5% de un valor o rango dado. Alternativamente, especialmente en los sistemas biológicos (es decir, cuando se mide una respuesta inmune), el término "aproximadamente" significa dentro de un logaritmo (es decir, un orden de magnitud) de preferencia dentro de un factor de dos de un valor dado.

Definiciones Relacionadas a la Biología Molecular El término "aislado" significa separado de los constituyentes, celulares y de otra manera, en los cuales la molécula del ácido nucleico, péptido, polipéptido, proteína o fragmentos de los mismos, se asocien normalmente en naturaleza. Por ejemplo, con respecto a una molécula de ácido nucleico, un ácido nucleico aislado es uno que se separa de las secuencias de 5' y 3' con las cuales se asocia normalmente en el cromosoma. Como es aparente para aquellos expertos en la técnica, un polinucleótido de ocurrencia no natural, polipéptido, proteína o fragmentos del mismo no requieren "aislamiento" para distinguirlo de su contraparte de ocurrencia natural. Además, una molécula de ácido nucleico "diluida", "separada" o "concentrada", péptido, polipéptido, proteína o fragmentos del mismo, es distinguible de su contraparte de ocurrencia natural en que la concentración o el número de moléculas por volumen es mayor que el "concentrado" o menos que el "separado" que ese de su contraparte de ocurrencia natural. Una molécula de ácido nucleico, péptido, polipéptido, proteina o fragmentos del mismo, que difiere de la contraparte de ocurrencia natural en su primera secuencia o por ejemplo, por su diseño de glicosilación, no necesita presentarse en su forma aislada hasta que se distinga de su contraparte de ocurrencia natural por su secuencia primaria, o alternativamente por otra característica tal como el diseño de glicosilación. Aunque no se declare explícitamente por cada una de las invenciones descritas en este documento, se entiende que todas las modalidades anteriores para cada una de las composiciones descritas p osteriormente y b ajó l as condiciones apropiadas, se proporcionan por esta invención. Además, un ácido nucleico de ocurrencia no natural se proporciona como una modalidad separada del ácido nucleico de ocurrencia natural aislado. Una proteína producida en una célula bacterial se proporciona como una modalidad separada de la p roteína d e ocurrencia n atural a islada d e u na célula eucariótica en la cual se produce en la naturaleza.

"Codificación de secuencia" o "una codificación de secuencia ", un producto de expresión, tal como un ARN, polipéptido, proteína o enzima, es una secuencia de nucleótido que cuando se expresa, resulta en la producción de ese ARN, polipéptido, proteína o enzima, es decir, la secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos para ese polipéptido, proteína o enzima. Una secuencia de codificación puede i ncluir u n c odón d e i nicio ( usualmente ATG) y un codón de detención.

El término "gen" también llamado un "gen estructural" significa una secuencia de ADN que codifica para o corresponde a una secuencia particular de aminoácidos que comprende todas o parte de uná o más proteínas y puede o no puede incluir las secuencias de ADN reguladoras, tal como las secuencias promotoras, que determinan por ejemplo las condiciones bajo las cuales el gen se expresa. La región transcrita de un gen puede incluir l as r egiones 5 ' y 3 ' n o t raducidas (UTRs) y los intrones en adición a la región traducida (codificación).

Una "secuencia promotora" es una región de ADN capaz de enlazar la polimerasa de ARN en una célula e iniciar la transcripción de una secuencia de codificación descendente (dirección 3'). Para propósitos de definir la presente invención, la secuencia promotora se une en su término 3' por el sitio de inicio de la transcripción y se extiende ascendente (dirección 5') para incluir el número mínimo de bases o elementos necesarios para iniciar la transcripción en niveles detectables antes del fondo. Dentro de la secuencia promotora se encontrarán un sitio de iniciación de la transcripción (convenientemente definido por ejemplo, mediante la el trazo de mapas con la nucleasa S1 ), así como los dominios de enlace de proteínas (secuencias consenso) responsables para el enlace de polimerasa ARN.

Una secuencia de codificación está "bajo el control" de u "operablemente" (u operativamente) asociada con" las secuencias de control de traducciones y transcripciones en una célula. La polimerasa de ARN transcribe la secuencia de codificación en mARN, que es posteriormente trans-ARN empalmado (si contiene intrones) y se traduce en la proteína codificada por la secuencia de codificación. "Operativamente asociado" se refiere a una yuxtaposición en donde los elementos están en un arreglo que les permite funcionar en convenio.

Los términos "expresar" y "expresión" significa que permiten o causan la información en un gen o secuencia de ADN para llegar a manifestarse, por ejemplo produciendo una proteína mediante la activación de las funciones celulares involucradas en la transcripción y traducción de un gen correspondiente o secuencia de ADN. Una secuencia de ADN se expresa en o mediante una célula para formar un "producto de expresión" tal como un mARN o una proteína. El producto de expresión por si mismo, es decir, el mARN o proteína resultante, también puede decirse "expresado" por la célula. Un producto de expresión puede caracterizarse como intracelular, extracelular o secretado. El término "intracelular" significa algo que está dentro de una célula. El término "extracelular" significa algo fuera de una célula. Una sustancia se "secreta" por una célula si aparece en medición significante fuera de la célula, en alguna parte o dentro de la célula. "Condiciones que permiten la expresión" in vitro son condiciones de cultivo de temperatura (generalmente aproximadamente 37° C), la humedad (atmósfera húmeda), concentración del dióxido de carbono para mantener el pH (generalmente aproximadamente 5% de C02 a aproximadamente 15% de C02), el pH (generalmente aproximadamente 7.0 a 8.0, de preferencia 7.5) y los componentes del fluido de cultivo que dependen del tipo de célula huésped. In vivo, las condiciones que permiten la expresión, son primeramente la salud del animal transgénico no humano, que depende de la nutrición adecuada, agua, habitación y condiciones ambientales (ciclo luz-oscuridad, temperatura, humedad, nivel de ruido). En el sistema, la expresión puede depender de un represor o un sistema de control inductor, así como se conocen en la técnica.

El término "heterólogo" se refiere a una combinación de elementos de ocurrencia no natural en un sitio particular. Por ejemplo, el ADN heterólogo se refiere al ADN no naturalmente ubicado en la célula o en un sitio cromosomal particular de la célula. Un elemento regulador de expresión heteróloga es tal un elemento operativamente asociado con un gen diferente que uno que se asocia operativamente con la naturaleza. En el contexto de la presente invención, una construcción de s ecuencia de codificación es heterologa para el vector de ADN en el cual se inserta para la clonación o expresión y es heterólogo para una célula huésped que contiene un dicho vector en el cual se expresa, por ejemplo, una célula CHO.

El término "liberación del gen", "transferencia del gen", "transfección" y los similares como se usan en este documento significan la introducción de un gen "extranjero" (es decir, extrínseco o extracelular), secuencia de ADN o ARN en una célula huésped, de manera que la célula huésped expresará el gen o secuencia introducida para producir una sustancia deseada, típicamente una proteína o enzima codificada mediante el gen o secuencia introducida. El gen o secuencia introducida también puede llamarse un gen o secuencia "clonado" o "extranjero", puede incluir secuencias de control o reguladoras, tal como inicio, detección, promotor, señal, secreción u otras sustancias usadas por una maquinaria genética de la célula. El gen o secuencia puede incluir las secuencias o secuencias no funcionales con la función no conocida. Una célula huésped recibe y expresa un ADN o ARN introducido que se ha "transfectado" y es un "transfectante" o un "clon". El ARN o ADN introducido a una célula huésped puede llegar a ser de cualquier fuente, incluyendo las células del mismo género o especies como la célula huésped o células de un género o especies diferentes.

Un "vehículo de liberación del gen" se define como cualquier molécula que puede portar polinucleótidos insertados en una célula huésped. Los ejemplos de los vehículos de liberación de genes son liposomas, polímeros biocompatibles, incluyendo polímeros naturales y polímeros sintéticos; lipoproteínas, polipéptidos, polisacáridos, lipopolisacáridos, sobres virales artificiales, partículas metálicas y bacterias, virus, tales como baculovirus, adenovirus, retrovirus, lentivirus y adeno-virus asociado, bacteriófago, cósmido, plásmido, vectores fúngicos y otros vehículos de recombinación típicamente usados en la técnica, que se han d escrito p ara I a e xpresión e n u na variedad de huéspedes eucaríóticos y procarióticos y pueden usarse para la terapia en genes así como para la expresión de proteína simple.

Los términos "vector", "vector de clonación" y "vector de expresión" significan el vehículo de liberación d e g enes p or e I c ual u na s ecuencia d e A DN o A RN ( es d ec/'r, gen extranjero) puede introducirse en una célula huésped, así como para transformar el huésped y promover la expresión (es decir, transcripción y traducción) de la secuencia introducida.

Los vectores típicamente comprenden el ADN de un agente transmisible en el cual el ADN extranjero se inserta. Una ruta común para insertar un segmento del ADN en otro segmento de ADN involucra el uso de enzimas llamadas enzimas de restricción que penetran el ADN en sitios específicos (grupos específicos de nucleótidos) llamados sitios de restricción. Un "cásete" se refiere a un segmento de ADN que puede insertarse en un vector o en otra pieza de ADN en un sitio de restricción definido. De preferencia, un cásete es un "cásete de expresión" en el cual el ADN es una secuencia de codificación o segmento de ADN que codifica para un producto de expresión que puede insertarse en un vector en sitios de restricción definidos. Los sitios de restricción definidos generalmente se designan para asegurar la inserción del cásete en el recuadro de lectura apropiado. Generalmente, el ADN extranjero se inserta en uno o más sitios de restricción del ADN del vector y posteriormente se lleva por el vector en una célula huésped, junto con el ADN del vector transmisible. Un segmento o secuencia de ADN que tiene insertado o agregado el ADN, tal como un vector de expresión, también puede llamarse una "construcción de ADN". Un tipo común de vector es un "plásmido" que generalmente es una molécula auto-contenida de ADN de doble hebra, usualmente de origen bacterial, que puede aceptar rápidamente el ADN tradicional (extranjero) y que puede introducirse rápidamente en una célula huésped apropiada. Un vector plásmido contiene el ADN de codificación y el ADN promotor y tiene uno o más sitios de restricción apropiados para insertar el ADN extranjero. Un gran número de vectores, incluyendo el plásmido y los vectores fúngicos se han descrito para la replicación y/o expresión en una v ariedad d e h uéspedes eucarióticos y procarióticos. Los ejemplos no limitantes incluyen los plásmidos pKK (Amersham Pharmacia Biotech), plásmidos pUC, plásmidos pET (Novagen, Inc. Madison, Wl), pret o plásmidos pREP (Invitrogen, San Diego, CA) o plásmidos pMAL (New England Biolabs, Beverly, MA) y muchas células huésped apropiadas, usando los métodos descritos o citados en este documento o de otra manera conocidos por aquellos expertos en la técnica. Los vectores de clonación recombinantes comúnmente incluyen uno o más sistemas de replicación para la clonación o expresión, uno o más marcadores para la selección en el huésped, es decir, resistencia al antibiótico y uno o más casetes de expresión.

El término "célula huésped" o "célula receptora" significa cualquier célula de cualquier organismo que se selecciona, modifica, transforma, cultiva o se usa o manipula en cualquier forma por introducción de un ácido nucleico o vector que codifica una construcción de la variante, para la producción de una sustancia por la célula, por ejemplo la expresión por la célula de un gen, una secuencia de ADN o ARN o proteína, es decir, la construcción de la variante. La célula huésped puede e ncontrarse in vitro, e s d ecir, e n e l c ultivo d el t ejido o en vivo, es decir, en un microbio, planta o animal. Estos términos se intenta que incluyen progenitura de una sola célula y la progenitura no puede necesariamente ser completamente idéntica (en morfología o en el complemento de ADN total o genómico) para la célula madre original debido a la mutación o introducción deliberada, natural o accidental de variaciones adicionales. Las células pueden ser procarióticas o eucarióticas e incluyen pero no se limitan a células bacteriales, células de levadura, células animales y células de mamíferos, es decir, de murinos, de ratas, de hámsteres, de simios o células humanas.

El término "sistema de expresión" significa una célula huésped y el vector compatible bajo condiciones apropiadas, es decir, para la expresión de una proteína codificada por el ADN extranjero llevado por el vector e introducido a la célula huésped. De preferencia, el ácido nucleico introducido se mantiene estable o transitoriamente en la célula huésped. El mantenimiento estable típicamente requiere que el ácido nucleico introducido contenga un origen de replicación compatible c on la célula huésped o se integre en un replicón de la célula huésped tal como un replicón extracromosomal (es decir, un plásmido) o un cromosoma mitocondrial o nuclear. Los sistemas de expresión común incluyen las células huésped E-coli y los vectores de plásmido, las células huésped de insectos y los vectores Baculovirus y las células huésped de mamíferos y vectores. En una modalidad específica, la construcción se expresa en las células COS-1 o CHO. Otras células apropiadas incluyen células NSO, células HeLa, 293e (células de riñon humano), mioblastos primarios de ratones y células NIH 3T3.

El término "cultivar" se refiere a la propagación in vitro de las células huésped u organismos en o en medio de varias clases. De preferencia, el cultivo ocurre bajo condiciones que permiten la expresión de la construcción variante. Mediante "expandido" se entiende cualquier proliferación o división de células.

Los términos "muíante" o "mutación" significan cualquier cambio detectable en el material genético, es decir, el ADN o cualquier proceso, mecanismo o resultado de dicho cambio. Esto incluye las mutaciones de genes, en los cuales la estructura (es decir la secuencia de ADN) de un gen se altera, cualquier gen o ADN elevándose de cualquier proceso de mutación y cualquier producto de expresión (es decir, proteina o enzima) expresada por un gen modificado o secuencia de ADN. El término "variante" también puede usarse para indicar o modificar o un gen alterado, la secuencia de ADN, la enzima, la célula, etc., es decir cualquier clase de mutante.

Como se usa en este documento, el término "oligonucleótido" se refiere a un ácido nucleico, generalmente de al menos 10, de preferencia al menos 15 y más preferiblemente al menos 20 nucleótidos, de preferencia no más de aproximadamente 100 nucleótidos, que es hibridizable a una molécula de ADN genómico, una molécula de cADN o una molécula de mARN que tiene una secuencia de interés. Los oligonucleótidos pueden marcarse, por ejemplo, con 32P-nucleótidos o nucleótidos a los cuales una marca, tal como biotina, se ha conjugado covalentemente. En una modalidad, un oligonucleótido marcado puede usarse para detectar la presencia de un ácido nucleico. En otra modalidad, los oligonucleótidos (uno de ambos de los cuales puede marcarse) pueden usarse como iniciadores PCR, ya sea para clonación de longitud completa o un fragmento de la serie epítope o para detectar la presencia de ácidos nucleicos que codifican la serie epítope. En una modalidad adicional, un oligonucleótido de la invención puede formar una hélice triple con una molécula de ADN de codificación de la serie epítope, es decir, para los procesos de purificación. Generalmente, los oligonucleótidos se preparan sintéticamente, de preferencia en un sintetizador de ácido nucleico. Por consiguiente, los oligonucleótidos pueden prepararse con enlaces del análogo fosfoéster de ocurrencia no natural, tal como los enlaces tioéster, etc.

Para inducir una respuesta inmune en un sujeto, las construcciones del péptido de la invención pueden administrarse como polinucleótidos que codifican los polipéptidos. Los polinucleótidos pueden administrarse en un vehículo de liberación de genes o mediante insertarlos e una célula huésped que a su vez transcribe, traduce y procesa recombinantemente el polipéptido codificado. Las células huésped aisladas que contienen los polinucleótidos de esta invención en un portador farmacéuticamente aceptable pueden combinarse por lo tanto con cantidades efectivas y apropiadas de un adyuvante, la citoquina o la molécula co-estimuladora para un régimen de vacuna efectiva. En una modalidad, la célula huésped es un APC tal como una c élula d endrita (DC), un monocito/macrófago, un linfocito B u otro tipo (s) de célula que expresa las moléculas co-estimuladoras/ HC n ecesarias. L a c élula h uésped además puede modificarse mediante insertar un polinucleótido que codifica una cantidad efectiva de uno o ambos de una citoquina y una molécula co-estimuladora.

Los APCs pueden traducirse in vitro con vectores virales que codifican las construcciones de péptidos de la invención. Los vectores virales más comunes incluyen los poxvirus recombinantes tales como el virus vaccinia y el virus de varicela en aves de corral (Bronte, et al., PNAS 94:3183-3188; Kim et al. (1997) J. Immunother. 20:276-286) y preferentemente, el adenovirus (Arthur ef al. (1997) J. Immunol. 159:1393-1403; Wan, ef al. (1997) Human Gen Therapy 8:1355-1363; Huang ef al. (1995) J. Virol. 69: 2257-2263). El retrovirus también p uede usarse para la transducción (Marín, et al. (1996) J. Virol. 70:2957-2962). Los APCs traducidos pueden administrarse subsecuentemente al huésped vía una ruta de liberación intravenosa, subcutánea, intranasal, intramuscular o intraperitoneal. En una modalidad adicional, los APCs o las células efectoras inmunes se administran con una cantidad efectiva de una citoquina estimuladora, tal como IL-2 o una molécula co-estimuladora.

Alternativamente, la transducción in vivo de los DCs u otros APCs puede llevarse a cabo mediante la administración de vectores virales vía diferentes rutas incluyendo intravenosa, intramuscular, intranasal, intraperitoneal o liberación cutánea. El método preferido es liberación cutánea del vector Ad en sitios múltiples usando una dosis total de aproximadamente 1 x1010-1 x1012 i.u.

Aunque la liberación del gen viral es más eficiente, los DCs pueden traducirse in vitro/ex vivo por los métodos de liberación de gen no viral tales como electroporación, precipitación de fosfato de calcio o complejos de ADN del plásmido/lípido catiónico (Arthur eí al, ( 1997) C áncer Gene Therapy 4:17-25). La liberación del arma de gen o inyección de ADN en el plásmido desnudo en la piel también conduce a la transducción de los DCs (Condón ef al. (1996) Nature Med. 2:1 122-1 128; Raz et al (1994) PNAS 91 :9519-9523). La liberación intramuscular del ADN del plásmido también puede usarse para inmunización (Rosato eí al. (1997) Human Gen Therapy 8:1451-1458).

Ejemplos de los Receptores APC Útiles Señalados por las Construcciones de la Invención Como se especificó anteriormente, las construcciones de péptidos de la invención comprenden las secuencias de selección APC.

Típicamente, las células que presentan los antígenos (APCs) presentan el antígeno exógeno en las moléculas del complejo de mayor histocompatibilidad clase II (MHC) y el antígeno endógenamente sintetizado en las moléculas MHC I. En antígenos exógenos de circunstancias excepcionales pueden presentarse en las moléculas MHC I, este fenómeno es central para la presentación indirecta de antígenos, particularmente como se relaciona a la preparación de linfocitos CD8+ T sin tratamiento específicos para los tumores y otros agentes no infecciosos (Bevan, J. Exp. Med. 182, 639-641 (1995)).

Para generar una respuesta CTL primaria a los antígenos asociados con los tumores (TAAs) con la capacidad para eliminar las células tumorales, los APCs tiene que presentar péptidos complejos a la clase I MHC. Ahora ha llegado a ser aparente que los monocitos APCs, DCs profesionales y los macrófagos son capaces de internar los antígenos exógenos para el procesamiento y presentación en las moléculas clase I MHC. Se han reportado varios mecanismos por los cuales los APCs pueden incorporar los péptidos y presentar los péptidos en asociación con la clase I MHC. Primeramente, l os p éptidos de l as p roteínas d egradadas p ueden p roducirse e n altas concentraciones externamente y posteriormente intercambiarse con los péptidos en la superficie de las moléculas de clase I MHC (Carbone y Bevan (1990) J. Exp. Med. 171 :377-387; Pfeifer ef al. (1993) Nature 361 : 359-362). Alternativamente, los APCs pueden tomar el antígeno mediante endocitosis o fagocitosis, procesarlo en la vesícula endosomal en donde se asocia con la clase I MHC y posteriormente transportarse a la superficie sin tener nunca ingresado el citosol (Bachmann et al. (1995) Eur. J. Immunol. 25: 1739-1743; Liu et al. (1997) Scand. J. Immunol. 45: 527-533). Recientemente, un tercer mecanismo por medio del cual los antígenos exógenos se internan por los APCs, transferidos al citosol, procesados y posteriormente presentados vía la ruta de la clase I MHC endógena clásica se demostró para ambos macrófagos (Kovacsovics-Bankowski y Rock, (1995) Science 267: 243-246) y DCs (Rodríguez ef al., (1999) Nature Cell BioL 1 :362-368.

Se ha demostrado previamente que los antígenos exógenos acompañados por las proteínas de impacto al calor (HSP) tal como gp96 pueden tomarse por los APCs y presentarse a través de sus moléculas I MHC, conduciendo a la estimulación de las células CD8+ T antígeno-específicas (Suto y Srivastava, Science 269, 1585-1588 (1995)). Una amplia serie de péptidos se acompañan por el gp96, dependiendo de la fuente de la cual ellos se aislan (Srivastava et al., Immunity 8, 657-665 (1998)). El gp96 derivado del tumor porta los péptidos antigénicos del tumor (Ishii ef al., J. Immunol. 162, 1303-1309 (1999)), las preparaciones de gp96 de las células infectadas con virus portan los epítopes virales (Suto y Srivastava, Science 269, 1585-1588 (1995); Nieland et al., Proc. Nati. Acad. Sc¡. USA 95, 1800-1805 (1998)) y las preparaciones gp96 de las células transfectadas con los antígenos modelo tales como ovalbúmina o galactosidasa se asociaron con los epítopes correspondientes (Arnoid et al., J. Exp. Med. 182, 885-889 (1995); Breloer et al., Eur. J. Immunol. 28, 1 016-1021 ( 1998)). L a a sociación d e g p96 c on l os p éptidos ocurre en vivo (Ménoret y Srivastava, Biochem. Biophys. Res. Común. 262, 813-818 (1999)). Los complejos de gp96 con los péptidos, si se aislan de las células (Tamura ef al., Science 278, 117-120 (1997) o reconstituidos in vitro (Blachere eí al., J. Exp. Med. 186, 1 183-1406 (1997)) son inmunogenes excelentes y s e h an u sado e xtensivamente p ara p rovocar I as respuestas C D8+ T específicas para los péptidos antigénicos acompañados gp96.

Brinder e f al. ( Nature I mmunol. ( 2000) 1 :151 -155) ha demostrado que los APCs pueden tomar los péptidos antigénicos exógenos acompañados por el gp96 de la proteína de impacto al calor y representarlos a través de la ruta endógena en sus moléculas clase I MHC. La alta eficiencia de este proceso se ha atribuido previamente a un receptor APRA el gp96 en los APCs. La molécula CD91 (también llamada r eceptor 2 -macroglobulina'o l a p roteína r elacionada c on l a lipoproteína de baja densidad) se sugirió por Binder et al. para ser un receptor de superficie celular para el gp96 de proteína de impacto al calor. El CD91 está presente en las células de linaje monocítico asi como hepatocitos, fibroblatos y queratinocitos. Binder et al. ha demostrado que el gp96 HSP es un ligando para el CD91 . El fragmento p80 de CD91 demostró que el enlace gp96 directamente e s u n p roducto d e degradación N-terminal de la subunidad ( CD91. La interacción APC-gp96 conduce a la interacción de gp96 con el CD91 y la re-presentación consecuente de los péptidos acompañados por gp96 por las moléculas I MHC del APC, seguida por la estimulación de las células T antígeno específicas (Suto y Srivastava, Science 269, 1585-1588 (1995)) y la secreción de las citoquinas pro-inflamatorias tales como TNF, el factor de estimulación de la colonia macrófago-granulocito ( GM-CSF) y l a i nterleuquina 1 2 ( Basu et a l., I nt. I mmunol. ( 2000) 12:1539-1546).

Similarmente, Suzie et al. (Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 94:13146-13151 (1997)) ha demostrado que una proteína de fusión hsp70 soluble que tiene un gran fragmento de ovalbúmina de pollo como parte de fusión podría, en la ausencia de adyuvantes estimular los ratones H-2b para producir ovalbúmina específica CD8+ CTL. Los ratones inmunizados con proteínas de impacto al calor (hsps) aislados de las células tumorales de ratón (células donadoras) producen linfocitos T citotóxicos CD8+ (CTL) que reconocen los péptidos de las células donadoras en asociación con las proteínas de clase I (MHC) del complejo de histocompatibilidad principal del ratón correspondiente.

Sigue que las moléculas hsp son capaces de enviar péptidos no covalentemente asociados a las proteínas clase I MHC de otras células (receptoras), incluyendo los APCs. Por consiguiente, en una de las modalidades de la presente invención, la secuencia de selección de APC se deriva de una secuencia hsp, que media la interacción con el receptor hsp (HSR) en la superficie de APC (es decir, receptor CD91 ).

Los DCs internan los antígenos exógenos mediante la pinocitósis de fase fluida o mediante la endocitosis mediada por el receptor. Los DCs expresan varios receptores que facilitan la internalización y presentación de antígenos, incluyendo los receptores de lectina de tipo C tal como el r eceptor m añosa ( Sallusto e f al., ( 1995) J . E xp. M ed. 1 82:389), D EC205 ( Jiang et al., (1995) Nature 375:151 ) y DC-SIGN (Engering ef al., J. Immunol. (2002) 168:2 18-2126), así como los receptores para el dominio Fe de Igs (Sallusto y Lanzavecchia (1994) J. Exp. Med. 179:1109).

Los FcRs se expresan en la mayoría de las células de los linajes hemopoyéticos, incluyendo los DCs y juegan un rol de giro en la unión de los brazos celulares y humorales de la respuesta inmune. Los complejos de antígeno-lgG (complejos inmunes (ICs)), que enlazan a y reticulan los FcRS, median una variedad de respuestas in vitro oscilando de fagocitosis al anticuerpo mediado con citotoxicidad celular. La internalización mediada por FcR de los ICs por el DCs se asocia con la presentación mejorada de ambos péptidos de enlace de clase II MHC y clase I MHC derivados del antígeno presente en los ICs y conduce a la activación de los DCs y habilita los DCs para preparar los CTLs CD8+ de péptido específico en vivo (Amigorena y Bonnerot (1999) immunol. Rev. 172:279; Regnault et al. (1999) J. Exp. Med. 189:371 ).

Schuurhuis et al. (J. Immunol (2002) 168:2240-2246) ha demostrado que los OVA/anti-OVA IC-tratados DCs preparados CTLs en contra del epítope CTL dominante derivado del OVA Ag está presente en los ICs.

Entre la mayoría de los ocho miembros de la familia del receptor IgG Fe, un receptor, Fc(RI (CD64), se expresa constitutivamente solamente en los monocitos, macrófagos y DCs (Pan ef al. (1990) J. Immunol. 145: 267-275; Fanger et al. (1997) J. Immunol. 158: 3090-3098). El antígeno de selección para Fc(RI en DC en la forma de ICs se mostró para resultar en la presentación restringida clase I eficiente que requiere degradación proteosomal y fue dependiente del TAP funcional (transportador asociado con el procesamiento del antígeno) (Regnault eí al. (1999) J. Exp. Med., 189: 371 -380). Kaufman ef al. ((1996) Tumor Target. 2: 17-28) ha demostrado en las pruebas clínicas en humanos que un anticuerpo biespecifico específico para Fc(RI eficientemente selecciona los monocitos e induce la respuesta anti-tumoral del huésped en algunos pacientes. Por lo tanto, Wallace eí al. ((2001 ) J. Immunol. Methods 248: 183-194) ha demostrado recientemente que una proteína de fusión basada en un anticuerpo monoclonal (mAb) que selecciona el Fc(RI, en el cual los dominios de la cadena pesada CH2 y CH3 se remueven y se reemplazan con el antígeno e specifico d e p róstata ( PSA), s e i nternó y rocesó p or l a I ínea c elular THP-1 mieloide humana resultando en la presentación de los péptidos PSA asociados clase I MHC y la lisis del THP-1 por el CTL humano PSA específico.

Sigue que los complejos basados en IgG (es decir, complejos inmunes (ICs) o polipéptidos de fusión IgG quiméricos), que enlazan a los FcRs son capaces de enviar los péptidos no covalentemente enviados a las proteínas de clase I MHC de otras células (receptoras), incluyendo los APCs. Por consiguiente, en una de las modalidades de la presente invención, la secuencia de selección APC se deriva de una secuencia IgG que media la interacción con el FcT en la superficie de APC (es decir, Fc(RI).

Varios receptores expresados por los DCs inmaduros pertenecen a la superfamilia de la lectina d e t ipo C , incluyendo Langerin (CD207), el receptor mañosa (MR; CD206) y el DEC-205 (CD205) (Masón, ed. En Leucocyte Typing Vol. VII: 2000 Oxford University Press, Oxford).

El mucino (MUC1 ) se expresa altamente en los adenocarcinomas. En los ratones, el mannan oxidado unido a MUC1 (M-FP), dado en vivo, indujo MHC potente CTL restringido y protección tumoral. Apostolopoulos eí al. (Vaccine (2000) 18: 3174-84) ha mostrado que el receptor mañosa murino (MR) que soporta los macrófagos derivados de las células exudadas perifonéales (PEC) y cultivados ex vivo con M-FP pueden, después de la transferencia adoptiva, presentar eficientemente MUC1 a las células T, conduciendo a la generación de la alta frecuencia de CTL y la protección del reto tumoral. El M-FP selecciona el MR y asegura su paso rápido de péptidos a las moléculas de clase I MHC y también puede estimular directamente in vitro la producción IL-12 por l os m acrófagos. Además, l a selección MR en otros estudios se demostró que conduce a la presentación de la clase II eficiente, como después de unirse al MR existe internación con el pasaje para los lisosomas y fagosomas (Tan ef al. (1997) Eur. J. Immunol. 27: 2426-2432; Engering e í a l. ( 1997) Eur. J. Immunol. 27: 2417-2425; Wileman (1985) J. Biochem. 260: 7387-7393; Prigozy (1997) Immunity 6: 187-193).

Mahnke eí al. (J. Cell Biol. (2000) 151 :673-84) ha demostrado en los DCs que el receptor de multilectina DEC 205 selecciona los endosomas o lisosomas atrasados ricos en productos clase II MHC, por cuanto el receptor de mañosa macrófago homólogo (MMR) se encontró en endosomas más periféricos. Se concluyó que el dominio citosólico DEC-205 media una nueva ruta de la endocitosis mediada con el receptor que trae consigo reciclaje eficiente a través de grandes endosomas y una eficiencia grandemente mejorada de la presentación del antígeno para las células CD4+T.

Geijtenbeek ef al. ((2000) Cell 100:575) ha identificado recientemente una lectina de tipo C novedosa, el DC específico, el ICAM-de asimiento no integrina (DC-SIGN; CD209) que se expresa exclusivamente e n I os D Cs, e n c ontraste a I M R y D EC-205, q ue t ambién s e e xpresan e n o tros tipos de células. El DC-SIGN funciona como el receptor de adhesión celular mediado con ambas, activación celular T y migración DC. El DC-SIGN también funciona como un VIH-1 R que captura el VIHgp120 y facilita la transmisión de VIH inducida por DC de las células T. Los motivos de internamiento en la cola citoplásmica del DC-SIGN indican una función del DC-SIGn como receptor endocítico. Engering ef al. (J. Immunol (2002) 168:2118-2126) ha demostrado que en los DCs, el DC-SIGN se interna rápidamente en el enlace del ligando soluble y se selecciona para los endosomas/lisosomas atrasados. Además, los ligandos i nternados p or e l D C-SIGN s e p rocesan eficientemente y se presentan a las células CD4+.

Sigue que el menos alguno de los receptores de lectina tipo C en la superficie de APCs (tal como el receptor de mañosa (MR; CD206), DEC-205 (CD205) y DC-SIGN (CD209)) tiene la potencia para usarse por los antígenos de selección (es decir, TAAs) especialmente para los APCs (es decir, DCs) para inducir la inmunidad específica del antígeno. Por consiguiente, en una modalidad específica, la secuencia de selección APC de la invención comprende la secuencia de selección de los receptores de lectina tipo C.

Vacunas del Gen y Ácidos Nucleicos Los ácidos nucleicos recombinantes, particularmente las moléculas de ADN, proporcionan la expresión eficiente de las construcciones de péptidos de la invención. En una modalidad, la invención proporciona una molécula de ácido nucleico que codifica la construcción de péptido seleccionada APC descrita anteriormente. La invención también proporciona un vector de expresión que comprende tal ácido nucleico operablemente asociado con una secuencia de control de expresión y una célula huésped (es decir, APC transferido o transformado con el vector de expresión) y un huésped no humano recombínate que comprende dicho ácido nucleico. De conformidad con una modalidad específica, el vector de expresión que comprende el ácido nucleico codificando las construcciones epítopes de la invención además puede comprender o puede combinarse con un mecanismo de selección APC y por lo tanto puede seleccionarse directamente para expresarse en los APCs del huésped. La construcción de péptidos de la invención puede producirse recombinantemente por el aislamiento de la mismo de las células huésped cultivadas bajo condiciones que permiten la expresión del ácido nucleico que la codifica.

De conformidad con la presente invención puede emplearse biología molecular convencional, microbiología y técnicas de ADN recombinante dentro de la habilidad de la técnica. Dichas t écnicas s e e xplican a mpliamente e n I a I iteratura. V er, p or ejemplo S ambrook, F ritsch & Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Segunda Edición (1989) Coid Spring Harbor Laboratory Press, Coid Spring Harbor, New York (en este documento " Sambrook e t a l., 989"); Cloning ADN: A Practica! Approach, Volúmenes I y II (Glover ed. 1985); Oligonucleotide Synt esis (Gaid ed. 1984); Nucleic Acid Hybridization, Hames & Higgins eds. (1985); Transcription And Translation, Hames & Higgins, eds. (1984); Animal Cell Culture, Freshney. Ed. (1986); Immobilized Cells And Enzymes, IRL Press, (1986); Perbal, A Practica! Guide To Molecular Cloning (1984); Ausubel et al. (eds), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. Goeddel et al., Gene Expression Technology, Academic Press (1991 ); Gacesa y Ramji, Vectors: Essential Data Series, John Wiley & Sons (1994).

En una modalidad específica, los vectores que comprende la secuencia de nucleótidos que codifican la construcción de péptidos de la Invención se administran para tratar o prevenir una enfermedad o desorden asociado con la expresión o función de una molécula para la cual la construcción provoca una respuesta inmune específica.

Cualquiera de los métodos de terapia de genes disponible en la técnica puede usarse de conformidad con la presente invención. Los métodos ejemplarizadores se describen posteriormente.

Para revisión general de los métodos de la terapia de genes, ver, Patentes Norteamericanas Nos. 6,228,844; 5,693,622; 5,589,466; 5,580,859; 6,214,804 y 5,703,055.

Publicación de Patente Internacional Nos. WO 90/1 1092, WO 89/12458, WO 94/29469, EP 1026253, Goldspiel et ai, Clinical Pharmacy 1993, 12:488-505; Wu y Wu, Biotherapy 1991 , 3:87-95; Tolstoshev, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 1993, 32:573-596; Mulligan, Science 1993, 260:926-932 y Morgan y Anderson, Ann. Rev. Biochem. 1993, 62:191-217 y May, TIBTECH 1993, 1 :155-215. Los métodos comúnmente conocido en la técnica de la tecnología de ADN recombinante que puede usarse se describió en Ausubel et al., (eds), 1993, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY; Kriegler, 1990, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY y en los Capítulos 12 y 13, Dracopoli eí al., (eds.), 1994, Current Protocols in Human Genetics, John Wiley & Sons, NY. Se describieron anteriormente los vectores apropiados para la terapia de genes.

La presente invención también proporciona vehículos de liberación apropiados para el suministro de una molécula de ácido nucleico de la invención en las células (ya se en vivo, ex vivo o in vitro). La molécula de ácido nucleico de la invención puede contenerse dentro de un vector de clonación o de expresión. Estos vectores (especialmente los vectores de expresión) pueden a su vez manipularse para asumir cualquier número de formas que pueden, por ejemplo, facilitar la liberación a y/o entrar en una célula.

Cuando l os vectores s e u san p ara I a t erapia d e g enes in vivo o e x vivo, s e refiere u n vector farmacéuticamente aceptable, tal como un vector adenoviral o retroviral de replicación-incompetente. Los vectores farmacéuticamente aceptable que contiene los ácidos nucleicos de esta invención además pueden modificarse para la expresión estable o transitoria del polinucleótido insertado.

Las células huésped que contienen los ácidos nucleicos de la invención son útiles para la replicación recombinante de los polinucleótidos y para la producción recombinante de los péptidos. Alternativamente, las células pueden usarse para inducir una respuesta inmune en un sujeto en los métodos descritos en este documento. Cuando las células huésped son APCs, ellos pueden usarse para expandir una población de células efectoras inmunes tales como linfocitos de infiltración (TLs) que a su vez son útiles en inmunoterapias adoptivas.

En un aspecto, el vector terapéutico comprende una molécula de ácido nucleico que expresa la construcción en un huésped apropiado. En particular, dicho vector tiene un promotor operativamente unido a la secuencia de codificación para la construcción epítope del péptido. El promotor puede ser inducible o constitutivo y opcionalmente de tejido específico. En otra modalidad, u na molécula de ácido nucleico se usa en la cual las secuencias de codificación de anticuerpos y c ualquier otra s ecuencia d eseada s e flanquea por las regiones que promueven la recombinación homologa en un sitio deseado en el genoma, además proporcionando la expresión de la construcción de una molécula de ácido nucleico que se ha integrado en el genoma (Koller y Smithies, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 1989, 86:8932-8935; Zijlstra et al., Nature 1989, 342:435-438).

El suministro del vector en un paciente puede ser directo, en cuyo caso el paciente se expone directamente al vector o un complejo de liberación o indirecto, en cuyo caso, las células primero se transforman con el vector in vitro posteriormente se transplantan en el paciente. Estos dos avances se conocen, respectivamente como terapia de genes en vivo y ex vivo.

En una modalidad específica, el vector se administra directamente in vivo, en donde ingresa las células del organismo y media la expresión de las construcciones. Esto puede llevarse a cabo por cualquier método conocido en la técnica, es decir, mediante construirlo como parte de un vector de expresión apropiado y administrarlo de manera que llegue a ser intracelular, por ejemplo, m ediante i nfección u sando u n r etroviral a tenuado o d efectuoso u o tro v ector v iral ( er, Patente Norteamericana No. 4,980,286) o mediante inyección directa del ADN desnudo o mediante el uso de bombardeo de micropartículas (es decir, una pistola de genes, Biolistic, Dupont) o e l recubrimiento con lípido o receptores de superficie celular o agentes de transfección, encapsulación en biopolímeros (es decir, polisacárido poli-(1 -4-N-acetilglucosamina, ver la Patente Norteamericana No. 5,635,493), encapsulación en liposomas, micropartículas o microcápsulas, mediante la administración en unión a un péptido u otro ligando conocido para ingresar el núcleo o mediante la administración en la unión a un sujeto ligando para la endocitosis mediada con el receptor {ver, por ejemplo Wu y Wu, J. Biol. Chem. 1987, 62:4429-4432), etc. En otra modalidad, un complejo ligando/ácido nucleico puede formarse e n e l c ual e l l igando comprende u n p éptido viral fusogénico para interrumpir los endosomas, permitiendo al ácido nucleico evitar la degradación lisosomal. En aún otra modalidad, el ácido nucleico puede seleccionarse in vivo para la ingesta y expresión específica celular, mediante la selección de un receptor específico (ver, por ejemplo, las Publicaciones de PCT Nos. WO 92/06180, WO 92/22635, WO 92/20316 y WO 93/14188). Estos métodos son en adición a aquellos descritos anteriormente junto con los "Vectores No Virales y Virales".

La forma y la cantidad del ácido nucleico imaginado para usarse depende del tipo de enfermedad y severidad del efecto deseado, estado del paciente, etc. y puede determinarse por un experto en la técnica.

Uso Terapéutico de las Construcciones de la Invención La invención también proporciona métodos para tratar una enfermedad mediante la administración de un terapéutico de la invención. Dichos terapéuticos incluyen las construcciones de péptidos de la invención y los ácidos nucleicos que codifican las construcciones de la invención.

En las composiciones descritas, las construcciones de péptidos de la invención o los ácidos nucleicos que codifican las construcciones de la invención están presentes en cantidades inmunogénicamente efectivas. Para cada antígeno específico, la cantidad inmunogénicamente efectiva se determina experimentalmente rápidamente (tomando en consideración las características específicas de un paciente dado y/o tipo de tratamiento) usando métodos bien conocidos. Generalmente, esta cantidad está en el rango de 0.1 (g-100 mg de un antígeno por kg de peso corporal.

Los sujetos a los cuales la presente invención es aplicable pueden ser cualquier especie de vertebrado o mamífero que incluye, pero no se limita a, vacas, caballos, ovejas, cerdos, aves de corral (es decir, gallinas), cabras, gatos, petos, hámsteres, ratones, ratas, monos, conejos, chimpancés y humanos. En una modalidad preferida, el sujeto es un humano.

Los métodos para mejorar la inmunogenicidad de la invención pueden usarse para combatir varios cánceres, que incluyen sin limitación fibrosarcoma, mixosarcoma, liposarcoma, clondrosarcoma, sarcoma osteogénico, cordoma, angiosarcoma, endoteliosarcoma, linfangiosarcoma, linfangiosarcoma, linfangioendotelio-sarcoma, sinovioma, mesotelioma, tumor de Ewings, leiomiosarcoma. rabdomiosarcoma, carcinoma de colon, cáncer pancreático, cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer de próstata, linfoma, leucemia, carcinoma celular escamoso, carcinoma celular basal, adenocarcinoma, hepatocarcinoma, carcinoma de glándula dulce, carcinoma de glándula sebácea, carcinoma papilar, adenocarcinoma papilar, cistadenocarcinoma, carcinoma medular, carcinoma broncogénico, carcinoma celular renal, hepatoma, carcinoma del ducto biliar, coriocarcinoma, seminoma, carcinoma embrional, tumor de Wilms, cáncer cervical, tumor testicular, carcinoma de pulmones, carcinoma de pulmón de células pequeñas, carcinoma de vejiga, c arcinoma e pitelial, g liorna, a strocitoma, m eduloblastoma, craniofaringioma, ependimoma, pinealoma, hemangioblastoma, neuroma acústico, oligodendroglioma, meningioma, melanoma, neuroblastoma y retinoblastoma, entre otros.

Los métodos de la invención también son útiles en el tratamiento de infecciones, que incluyen, pero no se limitan a infecciones parasíticas (tales como aquellas tratadas mediante especies plasmodiales, etc.), infecciones virales (tales como aquellas causadas por virus de gripa, virus de leucemia, virus de inmunodeficiencia tal como VIH, virus del papiloma, virus del herpes, virus de la hepatitis, virus de sarampión, virus de varicela, virus de paperas, citomegalovirus [CMV], virus Epstein-Barr, etc.), infecciones bacteriales que involucra la clase I MHC (tales como aquellos causados por estafilococos, estreptococos, pneumococos, Niesseria gonorrea, Borrelia, pseudomonas, micobacterias, Salmonella, etc.) e infecciones fúngicas (tales como aquellas causadas por Candida, Trichophyton, Ptyrosporum, etc).

Los métodos de la invención también son útiles en el tratamiento de enfermedades autoinmunes, que incluyen pero no se limitan a la mayoría de las formas de artritis, colitis ulcerativa, asma, esclerosis múltiple, lupus y miastenia grave.

Tratamiento y Prevención de Cánceres En una modalidad preferida, la invención proporciona métodos para tratar o prevenir los cánceres. El método incluye administrar a un sujeto en necesidad de dicho tratamiento o prevención una construcción de péptido de la invenció o un ácido nucleico que lo codifique.

Los cánceres, incluyendo cualquier enfermedad o desorden caracterizado por el crecimiento celular no controlado, en el cual las células tumorales expresan un antígeno asociado con el tumor como se describió en este documento teniendo propiedades inmunogénicas relevantes para los cánceres humanos, pueden tratarse o prevenirse mediante la construcción de la invención. Si un terapéutico particular es efectivo para tratar o prevenir cierto tipo de cáncer debe determinarse por cualquier método conocido en la técnica.

En otras modalidades de la invención, el sujeto siendo tratado con la construcción puede, opcionalmente tratarse con otros tratamientos para el cáncer, tales como terapia de radiación, cirugía o quimioterapia. En particular, el terapéutico de la invención usado para tratar o prevenir el cáncer puede administrarse junto con uno o una combinación de agentes quimioterapéuticos incluyendo pero no limitados a metotrexato, taxol, taxotero, mercaptopurina, tioguanina, hidroxiurea, c itabarina, c iclofosfamido, i fosfamida, n itrosoureas, c isplatin, c arboplatin, m itomicina, dacarbazina, procarbizina, etopósidos, campatecinas, bleomicina, doxorubicina, idarubicina, daunorubicina, dactinomicína, plicamicina, mitoxantrona, asparaginasa, vinblastuna, vincristina, vinorelbina, paclitaxel, docetaxel, etc.

Formulaciones y Administración de Vacunas La invención también proporciona formulaciones de vacunas que contienen construcciones de péptidos de la invención o de ácidos nucleicos que los codifican, cuyas formulaciones de vacuna son apropiadas para administración, para provocar una respuesta inmune protectora (humoral y/o mediada celular) en contra de las células cancerosas soportando un ligando como se describió en este documento, es decir, para el tratamiento y prevención de las enfermedades.

Las construcciones de péptidos de la invención o ácidos nucleicos que los codifican pueden usarse en una variedad de formulaciones, las cuales pueden variar dependiendo del uso intentado.

Las c onstrucciones d e p éptidos d e I a i nvención o I os á cidos n ucleicos que los codifican pueden estar covalentemente o no covalentemente unidos (en complejo) a varias otras moléculas, la naturaleza de las cuales puede variar dependiendo del propósito particular. Por ejemplo, un péptido de la invención puede se un complejo covalente o no covalente para un portador macromolecular, incluyendo pero no limitado a polímeros sintéticos y naturales, proteínas, polisacáridos, poli(aminoácidos), alcohol polivinílico, pirrolidona polivinilo y lípidos. Un péptido puede conjugarse a un ácido graso, para la introducción en un liposoma. La Patente Norteamericana No. 5,837,249. Un péptido sintético de la invención puede ser complejo covalente o no covalentemente con u n s oporte s olido, u na v ariedad d el c ual s e c onoce e n I a t écnica . U n epítope de péptido antigénico sintético de la invención puede asociarse con una matriz de presentación de antígeno con o sin moléculas estimuladoras, como se d escribe e n m ás d etalle posteriormente.

Ejemplos de portadores de proteína incluyen, pero no se limitan a superantígenos, albúmina en suero, toxoide tetánico, ovalbúmina, tiroglobulina, mioglobulina e inmunoglobulina.

Los polímeros portadores de la proteína-péptido pueden formarse usando agentes de reticulación convencionales tales como carbodiimidas. Los ejemplos de carbodiimidas son 1 -ciclohexil-3-(2-morfolinil-(4-etil) carbodiimida (CMC), 1 -etil-3-(3-dimetilaminopropil) carbodiimida (EDC) y 1 -etil-3-(4-azonia-44-dimetilpentil) carbodiimida.

Ejemplos de otros agentes de reticulación apropiados son bromuro de cianógeno, glutaraldehido y anhídrido succínico. En general, puede usarse cualquiera de . un número de agentes homobifuncíonales incluyendo un aldehido homobifuncional, un epóxido homobifuncional, un imidoéster homobifuncional, un éster N-hidroxisuccinamida homobifuncional, una maleimida homobifuncional, un haluro alquilo homobifuncional, un bisulfuro de piridilo homobifuncional, un haluro arilo homobifuncional, una hidracida homobifuncional, un derivado diazonio homobifuncional y un compuesto foto-reactivo homobifuncional. También se incluyen compuestos heterobifuncionales, por ejemplo, compuestos que tienen una amina reactiva y un grupo reactivo sulfidrilo, compuestos con un reactivo amina y un grupo foto-reactivo y compuestos con un reactivo carbonilo y un grupo sulfidrilo reactivo.

Los ejemplos específicos de dichos agentes de reticulación homobifuncíonales incluyen los ésteres N-hidroxisuccinamida bifuncionales ditiobis(succinimidilpropionato), suberato de disuccinimidil y tartarato de disuccinimidil; adipimidato dimetilo de los ¡midoésteres bifuncionales, pimelimidato de dimetilo y suberimidato de dimetilo, los reticuladores reactivos sulfidrilo bifuncionales 1 ,4-di-[3'-(2'-pir¡d¡ltio) propion-amidojbutano, bismaleímidohexano y bis-N-maleimído-1 ,8-octano; los haluros arilo bifuncionales 1 ,5-difluoro-2,4-dimitrobenceno y 4,4'-difluoro-3,3'-dinitrofenilsulfona; los agentes foto reactivos bifuncionales tal como bis-[b-(4-az¡dosalicilamído)etil]bísulfuro; el formaldehído de los aldehidos bifuncionales, malondialdehído, succinaldehído, glutaraldehido y adipaldehído, un epóxido bifuncional tal como éter diglicidílo 1 ,4-butanodiol, las hidrácidas bifuncionales del dihidrazido del ácido adípico, carbohidrácida y la dihidrácída del ácido succínico, los diazonios o-tolidína bifuncionales, bencidina bís-diazotizada, los alquilhaluros bifuncionales NIN'-etileno-bis(yodoacetamida), 1 N'-hexametileno- bis(yodoacetamida), NI N'-undecametileno-bis(yodoacetamida), así como bencilhaluros y halomostazas, tales como ácido ala'-diyodo-p-xileno sulfónico y tri(2-cloroetil)amina, respectivamente.

Los ejemplos de otros agentes de reticulación heterobifuncionales que pueden usarse para efectuar la conjugación de las proteínas para los péptidos incluyen pero no se limitan a S MCC succinimidil-4-(N-maleimidometil)ciclohexano-1 -carboxilato), MBS (éster m-meleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida), SIAB (N-succin¡m¡dil(4-yodoacetil)aminobenzoato), SMPB (succinimidil-4-(p-maleimidofenil)butirato), GMBS (N-gamma.-maleimidobutiriloxi)éster succinimida), MPBH (4-(4-N-maleimidofenil) h idracida d el ácido butírico), M2C2H (4-(N-maleimidometil)ciclohexano-1 -carboxil-hidrazida), SMPT ( succinimidilox¡carbonil-a-metil-a-(2-piridilditio)tolueno) y S PDP(N-succinimidil 3 -(2-piridiltio)propionato).

La reticulación puede llevarse a cabo mediante el acoplamiento de un grupo carbonilo a un grupo amino o a un grupo hidracida mediante aminación reductiva.

Las construcciones de péptidos de la invención también pueden formularse como unión no covalente de monómeros a través de interacciones bioespecíficas, iónicas o absorbentes. Los complejos de péptidos con moléculas altamente cargadas positivas o negativamente pueden hacerse a través de una formación de puente de sal bajo los ambientes de resistencia iónica baja, tal como en el agua deionizada. Los grandes complejos pueden crearse usando polímeros cargados tales como poli-(ácido L-glutámico) o poli-(L-lisina) que contiene numerosas cargas positivas o negativas, respectivamente. La absorción de los péptidos puede hacerse a superficies tales como lechos de látex microparticulados o a otros polímeros hidrofóbicos, formando complejos de péptidos-super-antígeno no covalentemente asociados imitando efectivamente la proteína químicamente polimerizada o reticulada. Finalmente, los péptidos pueden unirse no covalentemente a través del uso de interacciones bioespecíficas entre otras moléculas. Por ejemplo, el uso de la fuerte afinidad de biotina para las proteínas tales como avidina o estreptavidina o sus derivados podrían usarse para formar los complejos péptidos. Estas proteínas de enlace biotina contienen cuatro sitios de enlace que pueden interactuar con la biotina en solución o pueden unirse covalentemente a otra molécula. Wilchek (1988) Anal. Biochem. 171 :1 -32. Los péptidos pueden modificarse para poseer grupos biotina usando reactivos de biotinilación común tales como éster N-hidroxisuccinimidil de la D-biotina (biotina-NHS) que reacciona con los grupos amina disponible en la proteína. Los péptidos biotinilados posteriormente pueden incubarse con avidina o estreptavidina para crear complejos grandes. La masa molecular de dichos polímeros puede regularse a través del control cuidadoso de la proporción molar del péptido biotinilado para la avidina o estreptavidina.

Las construcciones de péptido de esta invención también pueden combinarse con varios portadores de fase líquida, tales como soluciones acuosas o estériles, portadores farmacéuticamente aceptables, suspensiones y emulsiones. Los ejemplos de los solventes no acuosos incluyen etilenglicol propilo, polietilenglicol y aceites vegetales. Cuando se usan para preparar anticuerpos, los portadores también pueden incluir un adyuvante que es útil para aumentar no específicamente una respuesta inmune específica. Un experto en la técnica fácilmente determinará si un adyuvante se requiere y selecciona uno. Sin embargo, para el propósito de ilustración solamente, los adyuvantes apropiados incluyen, pero no se limitan a: solución Completa e Incompleta de Freund, sales minerales y polinucleótidos.

Las preparaciones apropiadas de dichas vacunas y terapéuticos incluyen inyectables, como soluciones o suspensiones líquidas; también pueden prepararse formas sólidas apropiadas para la solución en, suspensión en, líquido antes de la inyección. La preparación también puede ser emulsificada o las construcciones de anticuerpos encapsuladas en los liposomas. Los ingredientes inmunogénicos activos comúnmente se mezclan con los excipientes que son farmacéuticamente aceptables y compatibles con el ingrediente activo. Los excipientes apropiados, son por ejemplo, agua, solución salina, solución salina estabilizada, dextrosa, glicerol, etanol, estabilizador a cuoso i sotónico estéril o los similares y combinaciones del mismo. Además, si se desea, la preparación de vacuna también puede incluir cantidades menores de sustancias auxiliares tales como agentes emulsificantes o de humectación, agentes de estabilización del pH y/o adyuvantes que mejoran la efectividad de la vacuna. La construcción cuando se prepara como una vacuna puede introducirse en microesferas o microcapsulas, es decir, se prepara de PGLA (ver, las Patentes Norteamericanas Nos. 5,814,344; 5,100,669 y 4,849,222; Publicaciones de PCT Nos. WO 95/1 1010 y WO 93/07861 ).

La efectividad de un adyuvante puede determinarse mediante medir la inducción de una respuesta inmune dirigida en contra del antígeno seleccionado. La composición, vacunas y terapéuticos pueden ser una solución líquida, suspensión, emulsión, tableta, pildora, cápsula, formulación de liberación prolongada o polvo. Para la administración oral, los terapéuticos pueden tomar la forma de, por ejemplo, tabletas o cápsulas preparadas mediante medios convencionales con excipientes farmacéuticamente aceptables tales como agentes de enlace (es decir, almidón de maíz pregelatinizado, poli inilpirrolidona o metilcelulosa hidroxipropilo); agentes de relleno (es decir, lactosa, celulosa microcristalina o fosfato de hidrógeno de calcio), lubricantes (es decir, estearato de magnesio, talco o sílice); desintegrantes (es decir, almidón de papa o glicolato de almidón de sodio) o agentes humectantes (es decir, sulfato de lauril de sodio). Las tabletas pueden cubrirse mediante métodos bien conocidos en la técnica. Las preparaciones líquidas para la administración oral pueden tomar la forma de, por ejemplo, soluciones, jarabes, emulsiones o suspensiones o pueden presentarse como un producto seco para la constitución con agua u otro vehículo apropiado antes de usarse. Dichas preparaciones líquidas pueden prepararse mediante medios convencionales con aditivos farmacéuticamente aceptables tales como agentes de suspensión (es decir, jarabe de sorbitol, derivados de celulosa o grasas comestibles hidrogenadas); agentes emulsificantes (es decir, lecitina o acacia); vehículos no acuosos (es decir, aceite de almendra, ésteres aceitosos, alcohol etílico o aceites vegetales fraccionados) y preservativos (es decir, metilo o hidroxibenzoatos p-propilo o ácido sórbico). Las preparaciones también pueden contener sales estabilizantes, saborizantes, agentes edulcorantes y colorantes, como sea apropiado.

Generalmente, los ingredientes se suministran separada o mezclados juntos en forma de dosis unitaria, por ejemplo, como un polvo liofilizado seco o concentrado libre de agua en un contenedor sellado tal como una ampolleta o saquito indicando la cantidad del agente activo. En donde la composición se administra mediante inyección, una ampolleta de diluyente estéril puede proporcionarse de manera que los ingredientes pueden mezclarse antes de la administración.

En una modalidad específica, la construcción liofilizada de la invención se proporciona en un primer contenedor, un segundo contenedor comprende un diluyente que consiste de una solución acuosa de 50% de glicerina, 0.25% de fenol y un antiséptico (es decir, 0.005% de verde brillante).

La invención también proporciona un paquete farmacéutico o juego que comprende uno o más contenedores llenos con uno o más ingredientes de las formulaciones de vacuna de la invención. Puede existir asociado con dicho (s) contenedor (es) un aviso en la forma prescrita por una agencia de gobierno que regula la fabricación, uso o venta de los farmacéuticos o productos biológicos, dicho aviso refleja la aprobación por la agencia de fabricación, el uso o venta para la administración humana.

Muchos métodos pueden usarse para introducir las formulaciones de vacuna de la invención; estos incluyen pero no se limitan a rutas oral, intracerebral, intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, subcutánea intranasal y vía escarificación (rasguñado a través de las capas superiores de la piel, es decir usando una aguja bifurcada) o cualquier otra ruta estándar de inmunización.

Dosis Efectiva y Evaluaciones de Seguridad De conformidad con los métodos de la presente invención, las composiciones farmacéuticas y vacunas descritas en este documento se administran a un paciente en dosis inmunogénicamente efectivas, de preferencia, con toxicidad mínima. Como se establece en la Sección titulada "Definiciones", "dosis inmunogénicamente efectiva" o "dosis terapéuticamente efectiva" de las formulaciones descritas se refiere a esa cantidad de una composición que contiene antígeno que es suficiente para producir una respuesta inmune efectiva en el sujeto tratado y por lo tanto suficiente para resultar en un beneficio saludable para dicho sujeto.

Siguiendo las metodologías que son bien establecidas en la técnica (ver, por ejemplo, reportes e n I a e valuación d e I as formulaciones d e v acunas e n u n e sfuerzo colaborador entre el Centro para la Evaluación Biológica y la Administración de Comida y Drogas y el Instituto de Alergia y Enfermedades Infecciosas [Goldenthal eí al., National Cooperative Vaccine Development Working Group. SIDA Res. Hum. Retrovirus, 1993, 9:545-549]), dosis efectivas y toxicidad de los compuestos y composiciones de la presente invención primero se determinan en estudios preclínicos usando modelos de animales pequeños (por ejemplo, ratones) en los cuales estos compuestos y composiciones se han encontrado para ser inmunogénicos y que pueden inmunizarse reproduciblemente por la misma ruta propuesta para las pruebas clínicas humanas.

En una modalidad específica, la eficiencia de las respuestas celulares CD8+ epítope específico para las composiciones de vacunas y farmacéuticas de la invención e determina por la técnica de inmunomanchado de enzima unida (ELISPOT). La ELISPOT es un método estándar en la técnica originalmente desarrollada por los presentes inventores y su co-trabajadores (Miyahira ef al., J. Immunol. Meth. 181 : 45-54, 1995) y usado ampliamente por otros (ver, por ejemplo, Guelly eí al., Eur. J. Immunol. 32:182-192, 2002; Nikitina y Gabrilovich, Int. J. Cáncer, 94:825-833, 2001 ; Field ef al., Immunol. Rev. 182:99-1 12, 2001 ; Altfeld ef al., J. Immunol., 167:2743-2752, 2001 ; Skoberne ef al., J. Immunol. 167: 2209-2218, 2001 ). Este método emplea pares de anticuerpos, dirigidos en contra de epítopes distintos de una citoquina y permite la visualización de la secreción de al citoquina por las células T individuales siguiendo la estimulación in vitro con un antígeno. La ELISPOT tiene la ventaja de detectar solamente las células T de memoria/activadas y la liberación de citoquina puede detectarse en los niveles celulares simples, permitiendo la determinación directa de las frecuencias de la célula T (Czerkinsky ef al., J. Immunol. Methods, 25:29, 1988; Taguchi eí a/., J. Immunol. Methods, 128:65, 1990). La citoquina capturada por el anticuerpo inmibilizado en la prueba ELISPOT se detectó ¡n situ usando un sustrato de peroxidasa insoluble. Además, la secreción de citoquina por las células individuales se visualizó claramente. La alta sensibilidad y el fácil funcionamiento, permitió una enumeración directa de las células T péptido reactivas sin antes la expansión in vitro, haciendo a la prueba ELISPOT eminentemente bien adaptada para monitorear y medir las respuestas celulares T, particularmente, las respuestas celulares CD8+ T de muy bajas frecuencias. De conformidad con las modalidades alternas, la eficiencia de las respuestas celulares T CD8+ epítope específicas para las composiciones de vacuna y farmacéuticas de la invención pueden determinarse usando otros métodos de inmunodetección de técnica-reconocida tal como, por ejemplo ELISA (Tanguay y Killion, Lymphokine Cytokine Res., 13:259, 1994) y |a tinción intracelular (Cárter y Swain, Curr. Opin. Immunol, 9:1977, 1997).

Como se describe en este documento, para cualquier composición farmacéutica o vacuna usada en los métodos de la invención, la dosis terapéuticamente efectiva puede estimarse inicialmente de modelos animales para lograr un rango de concentración de plasma de circulación que incluye el IC50 (es decir, la concentración del compuesto de prueba que logra una inhibición media-máxima de los síntomas). Las curvas de respuesta a las dosis derivadas de sistemas animales posteriormente se usan para determinar las dosis de prueba para los estudios clínicos iniciales en humanos. En determinaciones de seguridad para cada composición, la dosis y la frecuencia de inmunización debe reunir o exceder éstos anticipadamente para usarse en la prueba clínica.

La dosis de construcciones de péptidos, los ácidos nucleicos que las codifican y otros componentes en las composiciones de la presente invención se determinan para asegurar que la dosis administrada continuamente o intermitentemente no excederá una cierta cantidad en consideración d e l os r esultados e n l os a nimales de prueba y las condiciones individuales de un paciente. Una dosis específica naturalmente varía dependiendo del procedimiento de dosis, las condiciones de un paciente o un sujeto animal tales como edad, peso corporal, sexo, sensibilidad, alimentación, periodo de dosificación, drogas usadas en combinación, gravedad de la enfermedad. La dosis apropiada y los tiempos de dosis bajo ciertas condiciones pueden determinare por la prueba basada en los índices descritos anteriormente y deberá decidirse de conformidad con el juicio del médico y las circunstancias de cada paciente de conformidad con las técnicas clínicas estándares. En esta conexión, la dosis de un antígeno esta generalmente en el rango de 0.1 g-100 mg por kg del peso corporal.

La toxicidad y la eficacia terapéutica de las composiciones inmunogénicas de la invención pueden determinarse por los procedimientos farmacéuticos estándares en animales experimentales, es decir, mediante determinar el LD50 (la dosis letal para 50% de la población) y el ED50 (la dosis terapéuticamente efectiva en 50% de la población). La proporción de la dosis entre los efectos terapéuticos y tóxicos es el índice terapéutico y puede expresarse como la proporción LD50/ED50. Se prefieren las composiciones que exhiben grandes índices terapéuticos. Mientras los terapéuticos que exhiben efectos colaterales tóxicos pueden usarse (es decir, cuando las formas de tratamiento severos de cáncer o infecciones que amenazan la vida) debe tenerse cuidado para diseñar un sistema de liberación que seleccione dichas composiciones inmunogénicas al sitio especifico (es decir, un tumor o un órgano que soporta la replicación del agente infeccioso) para minimizar el daño potencial para otros tejidos y órganos y por lo tanto reducir los efectos colaterales. Como se describe en este documento, las construcciones de la invención no solamente son altamente inmunoestimulantes en dosis relativamente bajas (es decir, 0.1 -100 g por kg del peso corporal) pero también posee baja toxicidad y no produce efectos colaterales significantes.

Como se especificó anteriormente, los datos obtenidos de los estudios animales pueden usarse en la formulación de un rango de dosis para usarse en humanos. La dosis terapéuticamente efectiva de las composiciones de la presente invención en humanos cae de preferencia dentro de un rango de concentraciones que incluyen el ED50 con menos o sin toxicidad. La dosis puede variar dentro de este rango dependiendo de la forma de dosis empleada y la ruta de administración usada. Idealmente, una dosis simple deberá usarse.

EJEMPLO El siguiente Ejemplo ilustra la invención sin limitar su alcance.

Ejemplo 1 : Construcción de la Cadena Epítope que Contiene Secuencias de Aminoácidos del CEA El antígeno carcinoembriogénico (CEA) es un antígeno asociado con el tumor expresado por muchos tipos de células tumorales (Thomas et al., Biochem. Biophys. Acta, 1032: 177-79 (1990)). La secuencia de aminoácidos de CEA (SEC ID NO: 1 ; GenBank No. de Acceso AAA62835) se proporciona a continuación: MESPSAPPHR CIPWQRLLLTASLLTFWNPPTTA LTIESTPF1VAEGKEVLLLVHNLP QHLFGYSWYKGERVDGNRQIIGYVIGTQQATPGPAYSGREIIYPNASÍJLIQNIIQNDTG FYTLHVIKSDLVNEEATGQFRWPELPKPSISS NS PVEDKDAVAFTCEPETQDATYL WVm^QSLPVSPRLQLSNGNRTLTLFl TR DTASY CETQNPVSAJlRSDS\ LLWLYG PDAP ISPLNTSYRSGENLNLSCHAASNPPAQ SWFVNGTFQQSTQELFIPNITVWNSG SYTCQAHNSDTGLNRTTVTTIT AEPPKPFITSmSNPVEDEDAVALTGEPEIQNTTY LVWVIIRSLPVSPRLQLSWDNRTLTLLSVTRNDVGPYECGIQNELSVDHSDPVILNVLY GPDDPTISPSYTYYRPGVNLSLSCHAASWPPAQYSWLIDGNIQQHTQELFISNITEK S GLY CQA.NNSASGHSRTTVKTITVSAELPKPSISSKNSKPVEDKDAVAFTCE E QNTT YLWWVN GQSLPVSPRLQLSNGNRTLTLFWVTRNDARAYVCG IQNSVSANRSDPVTLDVL YGPDTPIISPPDSSYLS(-U^Ll^SCHSASÑPSPQYSWRlNGIPQQHTQVLLIAKIQP3íIN WGTYACFVSNIoATGRiMSIVKSITVSASGTSPGLSAGATAGIMJGVLVGV-SJjI Una cadena epítope que contiene los epítopes CTL del CEA humano se construye con las siguientes etapas y condiciones de clonación estándares.

Los siguientes epítopes CEA se incorporan en las construcciones de la cadena de epítope: Tipo de Secuencia Secuencia CTL CTL CEA1 : YLSGANLNL (SEC ID NO: 2), Zaremba S.. eí al. (1997) Cáncer Research 57(20), 4570-4577.

CTL CEA2: HLFGYSWYK (SEC ID NO: 3), Kawashima I., eí al. (1999) Cáncer Research 59(2), 431 -435.

CTL CEA3: IPQQHTQVL (SEC ID NO: 4); Lu J. y Celis E. (2000) Cáncer Research 60(18), 5223-5227. Epítope auxiliar T VIH gp120, aa 421 -444 KQIINMWQEVGKAMYAPPISGQIR (SEC ID NO: 5) Epítope de célula B Aminoácidos 524-57 del domino A3; aa 1 -107 del dominio N de CEA (SEC ID NO: 1 ) Las secuencias de epítope CEA posteriormente se unen a las secuencias de flanqueo apropiadas y la construcción de la cadena de epítope resultante se une al término C para la secuencia de marcación APC CD91 comprendiendo la secuencia gp96 que interactúa con el fragmento p80 N-terminal de la subunidad alfa de CD91 , el receptor para las proteínas de impacto al calor (ver Binder er a/., Nature Immunol. 1 :151 -55 (2000)).

La construcción de cadena de epítope final puede representarse por la siguiente fórmula general: N-[Leu-Xaa-Xaa-Asp-Xaa-Xaa-Pro][Xaa-Lys-Xaa-Lys-Phe]-[epítope CEA 1]-[Leu-Xaa-Xaa-Asp-Xaa-Xaa-Pro][Xaa-Lys-Xaa-Lys-Phe]-[epítope CEA 2]-...-[epítope CEA n]-[Leu-Xaa-Xaa-Asp-Xaa-Xaa-Pro][Xaa-Lys-Xaa-Lys-Phe]-[secuencia de marcación CD91 de pg96]-C en donde n representa el número de epítopes y Xaa representa cualquier aminoácido.

La presente invención no se limita en el alcance por las modalidades específicas descritas en este documento. En efecto, varias modificaciones de la invención en adición a aquellas descritas en este documento llegarán a ser aparentes para aquellos expertos en la técnica a partir de la descripción precedente. Dichas modificaciones se intentan que caigan dentro del alcance de las reivindicaciones anexas.

Todas las patentes, solicitudes, publicaciones, métodos de prueba, literatura y otros materiales citados en este documento se incorporan como referencia.

Claims

REIVINDICACIONES

1 . Una construcción de péptido capaz de estimular una respuesta inmune comprendiendo al menos una secuencia epítope y un antígeno que presenta el mecanismo de marcación celular (APC).

2. La construcción de conformidad con la reivindicación 1 , en donde al respuesta inmune se selecciona del grupo que consiste de una respuesta de la célula T citotóxica (CTL), una respuesta de la célula T auxiliar y una respuesta de la célula B.

3. La construcción de conformidad con la reivindicación 1 , en donde el epítope se selecciona del grupo que consiste de un epítope de la célula T CD8+, un epítope de la célula T CD4+ y un epítope de la célula B y una combinación de los mismos.

4. La construcción de conformidad con la reivindicación 1 , en donde el epítope se deriva de un antígeno seleccionado del grupo que consiste de un antígeno tumor asociado (TAA), un antígeno viral, un antígeno bacterial, un antígeno protozoario y un antígeno fúngico.

5. La construcción de conformidad con la reivindicación 1 , en donde el epítope se deriva de un antígeno tumor-asociado (TAA).

6. La construcción de conformidad con la reivindicación 5, en d onde e l a ntígeno t umor-asociado (TAA) es el antígeno carcinoembriogénico (CEA).

7. La construcción de conformidad con la reivindicación 6, en donde el epítope se selecciona del grupo que consiste de YLSGANLNL (SEC ID NO: 2), HLFGYSWYK (SEC ID NO:3) e IPQQHTQVL (SEC ID NO: 4).

8. La construcción de conformidad con la reivindicación 1 , en donde el epítope es un epítope no nativo que difiere del epítope nativo del cual este epítope no nativo se deriva en que contiene al menos una alteración en su secuencia de aminoácido.

9. La construcción de conformidad con la reivindicación 8, en donde el epítope no nativo difiere del epítope nativo del cual este epítope no nativo se deriva en que se une con mayor afinidad a la molécula MHC o al receptor celular T (TCR) o ambos.

10. La construcción de conformidad con la reivindicación 1 , que comprende más de un epítope, en donde los epítopes se derivan de uno o más diferentes antígenos.

1 1. La construcción de conformidad con la reivindicación 10, en donde los epítopes se organizan consecutivamente.

12. La construcción de conformidad con la reivindicación 10, en donde al menos un epítope es un epítope de célula T citotóxica (CTL.

13. La construcción de conformidad con la reivindicación 1 , en donde el epítope se flanquea en al menos un costado por una secuencia espaciadora (flanqueamiento) comprendiendo una secuencia de procesamiento interno.

14. La construcción de conformidad con la reivindicación 13, en donde el epítope se flanquea en ambos costados por la secuencia espaciadora (flanqueamiento).

15. La construcción de conformidad con la reivindicación 13, en donde la secuencia de procesamiento interno contiene una señal para el procesamiento endosomal o lisosomal de la construcción.

16. La construcción de conformidad con la reivindicación 13, en donde la secuencia de procesamiento interno se representa por la fórmula: [Leu y/o Asp y/o Pro]-[Xaa-Lys-Xaa-Lys-YT/c]. en donde cada Xaa se selecciona independientemente de cualquier aminoácido e YT/C es un aminoácido que es susceptible para penetrarse por la tripsina o cimotripsina.

17. La construcción de conformidad con la reivindicación 13, en donde la secuencia de procesamiento interno se representa por la fórmula: [Leu-Xaa-Xaa-Asp-Xaa-Xaa-Pro]-[Xaa-Lys-Xaa-Lys-Phe], en donde cada Xaa se selecciona independientemente de cualquier aminoácido.

18. La construcción de conformidad con la reivindicación 1 , en donde el antígeno que presenta el mecanismo de marcación celular (APC) comprende una secuencia de marcación APC, que dirige la construcción a las células que presentan el antígeno (APCs).

19. La construcción de conformidad con la reivindicación 8, en donde el antígeno que presenta la secuencia de marcación celular (APC) se une covalentemente a la secuencia que contiene el epítope.

20. La construcción de conformidad con la reivindicación 18, en donde el antígeno que presenta la secuencia de marcación celular (APC) se deriva de una secuencia capaz de mediar la interacción con una proteína de superficie celular del grupo que consiste de CD91 , Receptor Manosa(MR), DEC-205, DC-SIGN y FcyRI.

21. La construcción de conformidad con la reivindicación 18, en donde el antigeno que presenta el mecanismo de marcación celular (APC) además comprende un vehículo que realiza al menos una de las siguientes funciones: (i) media la marcación APC; (i¡) preserva la viabilidad de la construcción hasta que alcanza su APC intentado; (iii) media una liberación controlada de la construcción.

22. La construcción de conformidad con la reivindicación 21 , en donde el vehículo es una microesfera o un liposoma.

23. Un ácido nucleico aislado que codifica la construcción de la reivindicación 1.

24. Un vector de expresión que comprende el ácido nucleico de la reivindicación 23.

25. El vector de expresión de conformidad con la reivindicación 24, que además comprende un mecanismo de marcación APC.

26. Una célula huésped que comprende el ácido nucleico de la reivindicación 23.

27. La célula huésped de conformidad con la reivindicación 26, que es un APC.

28. Una composición farmacéutica que comprende una cantidad inmunogénicamente efectiva de la construcción de la reivindicación 1.

29. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 28, que además comprende un adyuvante o excipiente farmacéuticamente aceptable.

30. Una composición de vacuna que comprende una cantidad inmunogénicamente efectiva de la construcción de la reivindicación 1 .

31. La composición de vacuna de conformidad con la reivindicación 30, además comprende un adyuvante o excipiente farmacéuticamente aceptable.

32. Un método para generar una respuesta inmune en contra de un antígeno en un mamífero, cuyo método comprende administrar al mamífero al menos una dosis de la composición farmacéutica de la reivindicación 28.

33. El método de conformidad con la reivindicación 32, en donde el antígeno es un antígeno tumor asociado (TAA).

34. El método de conformidad con la reivindicación 33, en donde la administración de la composición farmacéutica de la reivindicación 28 induce una respuesta inmune de la célula T citotóxica antígeno específica (CTL).

35. Un método para aumentar la inmunidad inducida por un antígeno en un mamífero que comprende administrar a dicho mamífero la composición farmacéutica de la reivindicación 28.

36. Un método para tratar una enfermedad en un mamífero que comprende administrar a dicho mamífero al menos una dosis de la composición farmacéutica de la reivindicación 28.

37. El método de conformidad con la reivindicación 36, en donde la enfermedad se selecciona del grupo que consiste de enfermedades neoplásicas, infecciones y enfermedades autoinmunes.

38. El método de conformidad con la reivindicación 36, en donde la enfermedad es el cáncer.

39. Un método para tratar un tumor en un mamífero que comprende administrar a dicho mamífero al menos una dosis de una composición farmacéutica que comprende una cantidad inmunogénicamente efectiva de una construcción capaz de estimular una respuesta inmune anti- tumor, cuya construcción comprende al menos una secuencia de epitope derivada de un antígeno tumor asociado (TAA) y un antígeno que presenta el mecanismo de marcación celular (APC).

40. El método de conformidad con la reivindicación 39, en donde el epitope en la construcción se selecciona del grupo que consiste de un epitope de la célula T CD8+, un epitope de la célula T CD4+, un epitope de la célula B y una combinación de los mismos.

41. El método de conformidad con la reivindicación 39, en donde el antígeno tumor asociado (TAA) es un antígeno carcinoembriogénico (CEA).

42. El método de conformidad con la reivindicación 41 , en donde el epitope en la construcción se selecciona del grupo que consiste de YLSGANLNL (SEC ID NO: 2), HLFGYSWYK (SEC ID NO: 3) e IPQQHTQVL (SEC ID NO: 4).

43. El método de conformidad con la reivindicación 39, en donde el epitope en la construcción es un epitope no nativo, que difiere del epitope nativo del cual este epitope no nativo se deriva en que (i) contiene a lteraciones e n s u s ecuencia d e a minoácidos y ( ii) s e e nlaza c on mayor afinidad a la célula MHC o al receptor celular T (TCR) y es útil para la respuesta inmune de modulación para el epitope nativo del cual este epitope no nativo se deriva.

44. El método de conformidad con la reivindicación 39, en donde la construcción comprende más de un epitope, en donde los epítopes se derivan de uno o más antígenos tumor asociados diferentes (TAAs).

45. El método de conformidad con la reivindicación 44, en donde los epítopes en la construcción se ordenan consecutivamente.

46. El método de conformidad con la reivindicación 44, en donde al menos un epítope en la construcción es un epítope de célula T citotóxica (CTL).

47. El método de conformidad con la reivindicación 39, en donde el epítope en la construcción se flanquea en al menos un costado por una secuencia separadora (flanqueamiento) que comprende una secuencia de procesamiento interno.

48. El método de conformidad con la reivindicación 47, en donde el epítope se flanquea en ambos costados por la secuencia espaciadora (flanqueamiento).

49. El método de conformidad con la reivindicación 47, en donde la secuencia de procesamiento interno contiene una señal para el procesamiento endosomal o lisosomal de la construcción.

50. El método de conformidad con la reivindicación 39, en donde el antígeno que presenta el mecanismo de marcación celular (APC) comprende una secuencia de marcación APC, que dirige la construcción a las células de presentación de antígeno (APCs).

51. El método de conformidad con la reivindicación 50, en donde la secuencia de marcación de la célula que presenta el antígeno (APC) se une covalentemente a la secuencia que contiene el epítope.

52. El método de conformidad con la reivindicación 50, en donde la secuencia de marcación de la célula que presenta el antígeno (APC) se deriva de una secuencia capaz de mediar la interacción con la proteína de superficie celular seleccionada del grupo que consiste de CD91 , Receptor Mañosa (MR), DEC-205, DC-SIGN y FcyRI.

53. El método de conformidad con la reivindicación 50, en donde el mecanismo de marcación de la célula que presenta el antígeno (APC) además comprende un vehículo que realiza al menos una de las siguientes funciones: (i) media la marcación APC; (ii) preserva la viabilidad de la construcción hasta que se alcanza su APC intentado; (iii) media una liberación controlada de la construcción.

54. El método de conformidad con la reivindicación 53, en donde el vehículo es una microesfera o un liposoma.