JPH02107189A - 癌胎児抗原フラグメント - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明はＣＥＡ特異的エピトープを担うＣＥＡフラグメ
ントに関する。

（従来の技術） 癌胎児抗原（ＣＥＡ）は、１８０ｋｄのグリコジル化糖
蛋白質である。ＣＥＡは１９６５年に直腸癌のＩＩ！ｌ
Ｗｉマーカーであると報告された。

免疫学的ならびに生化学的研究によりｃＤＮＡが腫瘍特
異的でなく、共通エピトープを有する密接に関連した数
種の抗原の一つであることが判明した。正常時に出現す
る関連抗原のあるものは、ＣＥＡから区別できる独特の
エピトープを有するが、そうでない他の抗原は血清およ
び組織サンプル中でのＣＥＡの測定を妨げる可能性があ
る〔タワラギら、Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ｒ
ｅｓ、Ｃｏｍｍ、１５０．８９　（１９８７）；ノイマ
イヤー（Ｎｅｕｍａｉｅｒ）ら、Ｍｏｌ、１ｍｍｕｎｏ
＋、、２２．１２７３−１２７７　（１９８５）ｉノイ
マイヤー（Ｎｅｕｍａ　ｉｅｒ）Ｍ。

ら、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、、１３５．３６０４−３６０
９　（１９８５）；スベンベルグ（Ｓ　ｖ　ｅ　ｎｂｅ
ｒｇ）、Ｔ、、Ｉｎｋ、Ｊ、Ｃａｎｃｅｒ。

１７．５８８−５９６　（１９７６）；およびパーチン
（Ｂｕｒｔｉｎ）、Ｐ、ら、Ｊ、［ｍｍｕｎｏｆ、、　
　１１１．　１９２６　　１９２８　　（１９７３）〕
、広範な配列ホモロジーは、ＣＥＡ、その交叉反応性正
常抗原（ＮＣＡ）（上記タワラギ等；プーフエッガー（
Ｂｕｃｈｅｇｇｅｒ）、Ｆ。

ら、Ｉｎｔ、Ｊ、Ｃａｎｃｅｒ、３３．６４３６４９　
（１９８４）；フォンクライスト（ｖａｎＫｌｅｉｓむ
）、Ｓ、ら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、Ｓｃ　ｔ、ＵＳＡ、６９．２４９２−２４９
４　（１９７２）；およびマツダ（Ｍａｃｈ）Ｊ、Ｐ、
、　　ら、ｔｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ。

９．１０３１−１０３４　（１９７２））および更に最
近になって発見された１２８ｋｄ抗原〔ニューマイヤー
（Ｎｅｕｍａｉｅｒ）ら、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、１３５
．３６０４−３６０９　（１９８５）〕を、免疫グロブ
リンのスーパー遺伝子ファミリーに位置付けた（ＣＥＡ
およびＮＣＡに関しては、バクストン（Ｐａｘｔｏｎ）
、Ｒら、Ｐｒｏｃ、Ｎａ　ｔ　１．Ａｃａｄ、Ｓｅ　ｔ
、ＵＳＡ、８４．９２０−９２４　（１９８７）参照〕
、これらを識別する抗血清は入手困難である。

図表ＩＡ、ＩＢおよび１Ｃは、各々三次元構造であるＮ
ＣＡ、１２８ｋｄ抗原およびＣＥＡを直線的に示したド
メインのモデルである。なお、これら図表ＬＡ、ＩＢお
よび１Ｃにおいて、「Ｎ」ドメインは、Ｎ末端配列であ
り、ｒ　Ｍ　Ｊ　ドメインは疎水性のＣ末端配列である
。各々サブドメインＡおよびＢを持つ１ｇ様の三つのド
メインは、１、■および■で示される。Ｎドメインのア
ミノ末端に先立つシグナル配列は、成熟蛋白質中に存在
しないから、ここでは省略した。

［ＩＡ　　ＮＣＡのドメインのモデル ［ＭＩＢ　　１２８ｋｄ抗原のドメインのモデル図表１
ＣＣＥＡのドメインのモデル アミノ酸残基数 図表ＩＡ、ＩＢおよび１Ｃに示されているとおり、ＮＣ
Ａは１ｇ様１７８残暴ドメイン（１）を唯一つ有し、１
２８ｋｄ抗原はそのようなドメインを二つ（Ｉおよび■
）有し、そしてＣＥＡはそのようなドメインを三つ（ｌ
、■、および■）有している。

１２８ｋｄ抗原はＣＥＡが蛋白質分解酵素で分解された
フラグメントであると考えられる。アミノ酸配列による
研究によれば１２８ｋｄ抗原には、ドメインＮ、Ｉおよ
び■が存在し、それらドメインのアミノ酸配列はＣＥＡ
のものと同一である。ドメイン■は存在しない、ＣＥＡ
およびＮＣＡに関する蛋白質構造研究によれば、ｃＤＮ
Ａ配列から予測されたＭドメインは成熟蛋白質に存在し
ないことが明らかにされた。ＣＥＡの場合には、このド
メインはホスホイノシトールグリカン成分で置換されて
いる。同様の事実はＮＣＡにも当てはまるであろう。

各ドメイン１、■および■に含まれるサブドメインＡお
よびＢは、それぞれ９２および８６アミノ酸残基を含む
〔オイカワ、コサキおよびナカザトＢｉｏｃｈｅｍ、　
Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ。

Ｃｏｍｍ、１４，４６４　（１９８７）；および前記タ
ワラギ参照〕。

下記の式１の配列は、ＣＥＡドメイン■のヌクレオチド
配列およびアミノ酸配列を示し、サブドメインに関して
も示されている。

５’　　ＧＡＧＣＴＧＣＣＣＡＡＧＣＣＣＴＣＣＳｅｒ
Ａｌａ　　　３’ 上記配列の情報は、オイカワら、Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉ
ｏｐｈｙｓ、Ｒｅｓ、Ｃｏｍｍ、１４２゜５１１　（１
９８６）の第５１５頁の第２Ｂ図に記載されている。

（発明が解決しようとする課題） ニューマイヤー（Ｎｅｕｍａｉｅｒ）らは、抗体Ｔ８４
，６６−Ａ３．１−Ｈ１ｌ　（ＡＴＣＣ受託番号第ＨＢ
８７４７）（Ｔａ２．６６）はＣＥＡと反応しそして１
２８ｋｄ抗原と反応しないことを報告した（Ｍｏ１．Ｉ
ｍｍｕｎｏ＋、、２２゜１２７３　（１９８５））、Ｃ
ＥＡおよび１２８ｋｄの抗原は、他の点では同一である
から、ドメイン■がこの独特のＴａ２．６６のエピトー
プを含むことは明らかである。従って、本発明は、その
ようなエピトープを含む種々の天然および合成の好まし
くは実質的に純粋なＣＥＡフラグメント、該フラグメン
トを用いてＮＣＡまたは１２８ｋｄ抗原その他の関連抗
原も一緒に含み得るサンプル中のＣＥＡの存在ＩＩＩを
決定するために行うアッセイ、およびそのようなアッセ
イを行うために有用なキットを提供する。

（課題を解決するための手段） ＣＥＡドメイン■の立体構造 ＮＣＡ、１２８ｋｄ抗原およびＣＥＡの間には、相当す
る各ドメインに広範なホモロジーが存在する。

Ｎドメインについて、ホモロジーはアミノ酸レベルで８
５％、そしてヌクレオチドレベルで９５％である。ＣＥ
ＡのドメインＩ、ＩＩおよび■中の１ｇ様操り返し１７
８残基の３コピー中のヌクレオチドを１’　２８　ｋｄ
抗原のドメイン１および■中の同じ残基の２コピーおよ
びＮＣＡのドメイン■の１コピー中の同じ残店と、ヌク
レオチドレベルで比較すると、第二および第三のコピー
でのホモロジーが夫々８３％および８６％であるのに比
べて、第一のコピーでのホモロジーは９０％と最高であ
る。

このように高度のホモロジーは、ＮＣＡ、１２８ｋｄ抗
原およびＣＥＡが１ｇスーパー遺伝子ファミリーの一員
である前記事実と合わせて考えると、ＣＥＡは類似する
免疫グロブリンのドメインのように折り畳まれているの
ではないかと推測される。

繰り返しドメインＩ、■および■の各コピーは二つのＩ
ｇ様サすドメインＡおよびＢを有する。

これらのサブドメインは類似免疫グロブリンのドメイン
ＣＨ２およびＣＨ３に近似しており、同様に相互作用的
でそして二量体性二本鎖構造を有すると考えられる。さ
らに考えられることは、ＣＥＡの折り畳みパターンは事
実１ｇ様であり、グリコジル化部位が主として分子の表
面〔オイカワら。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ｒｅｓ、Ｃ。

ｍｍ、１４２，６３４−６４２　（１９８７）およびニ
ューマイヤー　Ｍ、ら、Ｊ、１ｍｍｕｎｏｌ。

、１３５．３６０４−３６０９　（１９８５）参照〕ま
たはβシートの末端に出現し、そのようにして折り畳み
による不所望の相互作用および阻害を防いでいるのであ
ろう。

第１図はヒト免疫グロブリンの重鎮のＣＨ−１ドメイン
の定常領域の立体構造を示す図である〔ニューマイヤー
ら、Ｊ、Ｂｉｏ　１．Ｃｈｅｍ、。

２６３．３２０２−３２０７　（１９８Ｂ）；蛋白質の
配列および構造の地図（Ａｔｌａｓ　　ｏｆＰｒｏｔｅ
ｉｎ　　５ｅｑｕｅｎｃｅ　　ａｎｄ　　５ｔｒｕｃｔ
ｕｒｅ）、ナショナルバイオ医学研究施設（Ｎａｔｉｏ
ｎａｌ　　ＢｉｏｍｅｄｉｃａｌＲｅｓｅａｒｃｈ　　
Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ）。

１９７Ｂ、Ｖｏｌ、５　　増補版３，２１２．ジョージ
タウン大学医学センター（Ｇｅｏｒｇｅｔ。

ｗｎ　　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　　ＭｅｄｉｃａｌＣｅ
ｎｔｅｒ）、　ワシントン市２０００７）。

第２Ａ図、第３Ａ図および第４Ａ図は、それぞれＣＥＡ
のドメイン１、ドメイン■およびドメイン■のサブドメ
インＡの立体構造を示す図である。

第２Ｂ図、第３Ｂ図および第４Ｂ図は、それぞれＣＥＡ
のドメイン１１　ドメイン■およびドメイン■のサブド
メインＢの立体構造を示す図である。

第２Ａ図、第３Ａ図、第４Ａ図、第２Ｂ図、第３Ｂ図お
よび第４Ｂ図の各々において、アルファベット文字Ａ、
Ｂ、Ｃ，Ｄ、　Ｅ、ＦおよびＧは、第１図に示したヒト
免疫グロブリンドメインのβシートに相当するβシート
を示す、グリコジル化部位は７字型の突起で示されてい
る。βシートＣおよびＦの間の同様位置に存在するジス
ルフィド結合も各図に示されている。

これらの図が示しているように、ＣＥＡのドメイン１、
■および■の各サブドメインＡおよびＢのグリコジル化
部位は、主としてループ上またはβシートの末端、従っ
て分子表面に出現する。

従って、本発明は、ＣＥＡのドメインｎｌＡおよびｔｌ
ｌＢの各々に実質的に相当するヌクレオチドおよびアミ
ノ酸配列を有する、Ｉｇ様様体体構造ＣＥＡフラグメン
トを包含する。

ＣＥＡのサブドメインＡおよびＢのアミノ酸配列をｒｇ
の軽鎖および重鎖のそれと比較しても、両分子の類似性
が証明される。第１表および第２表は、ドメインＩＡ（
残基１０８）に始まり、予測されたβ−ストランド（斜
体文字）および相互結合ループ（普通の文字）に到るＣ
ＥＡのアミノ酸配列を示す、この配列はＩＡカラムの上
から下へ続き（第１表）、さらにカラムＩＢ（第２表）
、カラム２Ａ（第１表）、カラム２Ｂ（第２表）、カラ
ム３Ａ（第１表）、カラム３Ｂ（第２表）へ続いている
。比較のため、免疫グロブリンのＣＨ２およびＣＨ３ド
メインも示されている〔オイカワら、Ｂｉｏｃｈｅｍ、
Ｂｉｏｐｈｙｓ、ＲｅｓＣｏｍｍ、１４２，６３４−６
４２　（１９８７）およびニューマイヤー　Ｍ、ら、Ｊ
、Ｉｍｍｕｎｏ＋、、１３５．３６０４−３６０９　（
１９８５）参照〕。

第１表は、ＣＥＡのドメイン１、■および■の各Ａサブ
ドメインの予測されたβシートのアミノ酸配列および相
互結合ループのアミノ酸配列をＩｇＧのドメインＣＨ３
のアミノ酸配列と比較するものである。βシート配列は
斜体文字で示される。

予測はチョウおよびファスマン（ｃｈｏｕ　　ａｎｄ　
　Ｆａｓｍａｎ）、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ。

１３．２２２−２２４　（１９７４）の方法で行った。

第２表はＣＥＡのドメイン！、■および［１の各々のβ
サブドメインのβシートおよびループのアミノ酸配列を
、ＩｇＧのドメインＣｌ１ｌおよびＣＨ２のアミノ酸配
列と比較したものである。

βシ ート配列は、 斜体文字で示されている。

免疫グロブリン分子は４−３パターンに配置された７個
のβシートを含む折り畳みを持っている（第３図参照）
、この中の２個のβシートグループはジスルフィド結合
によって、繋がっている。

従って、免疫グロブリン中の一つのドメイン（例えば、
ＣＨ２またはＣＨ３）は、ジスルフィド結合に関わる二
つのシスティン残基を有する。ＣＥＡがそのシスティン
残基（、）をＣＨ２またはＣＨ３（このモデル中におい
て）と同じβシートに有する事実は、このＣＥＡのモデ
ル（Ｉｇに基づく）が正しいことの証拠である。

本発明の重要な部分には、ＣＥＡドメイン■のＡドメイ
ンおよびＢドメインのβシートおよび結合ループの一定
部分を含むアミノ酸配列が含まれる。特に、本発明は下
記配列の各々からなるもしくは各々を含む合成ペプチド
を包含する：配列■ ＫＤＡＶＡＦＴＣＥＰＥＴＱＤＡＴＹＬＷＷＶＮＮ　Ｑ
　Ｓ　Ｌ　Ｐ　Ｖ　Ｓ　Ｐ　Ｒｌ−Ｑ　Ｌ　Ｓ　Ｎ　Ｇ
　Ｎ　ＲＴ　＋−′ｒＬ　ＦＮＶＴＲＮＤＴＡＳＹＫＣ
ＥＴＱＮ　（６０７，／酸） この配列はＣＥＡのＩＡサブドメインの１２６−１８５
残基を含む。これは五つのβストランドＢからＦ（第４
Ａ図）およびジスルフィド架橋を含む、これはＮＣＡと
は１２個のアミノ酸の相違を持っている（下線部）。

配列ｍ ＥＤＡＶＡＬＴＣＥＰＥＩＱＮＴＴＹＬＷＷＶＮＮＱＳ
ＬＰＶＳＰＲＬＱＬＳＮＤＮＲＴＬＴＬＬＳＶＴＲＮＤ
ＶＧＰＹＥＣＧ土ＱＮ（６０７ミノ酸） この配列は、ＣＥＡのＩＩＡサブドメインの３０４−３
６３残基を含む、これは配列■と相同である。ＮＣＡと
の１３アミノ酸の相違は下線で示す。

配列■ ＫＤＡＶＡＦＴＣＥＰＥ八ＱＮ工ＴＹＬＷＷＶへＧＱＳ
ＬＰＶＳＰＲＬ凭ＬＳＮＧＮＲＴＬＴＬＦＮＶ工ＲＮＤ
ＡＲ人ＹＶＸＧ　Ｉ　ＱＮ　（６０７ミノ酸） この配列は、ＣＥＡのｍＡサブドメインの４８２−５４
１残基を含む、これは配列■および■と相同である。Ｎ
ＣＡと相違する１１アミノ酸を下線で示す。

配列■ ＮＬＳＣＨＡＡＳＮＰＰＡｉＹＳＷＦＶ凡ＧＴＦＱＱＳ
ＴＱＥＬＦＩＰＮＩＴＶＮＮＳＧＳＹ″ＴＣＱＡＨＮＳ
　（４９アミノ酸） この配列は、ＣＥＡのＩＢサブドメインの２２２−２７
０残基を含む、これは五つのβストランドを含み、そし
てＮＣＡと四つのアミノ酸が相違する（下線部）。

配列■ ５ＬＳＣＩＩＡＡＳＮＰＰＡＱＹＳＷＬ　Ｉ　ＤＧ反上
ＱＱ几ＴＱＥＬ、ＦＩＳＮＩＴ旦ＫＮＳＧＬＹ工ＣＱＡ
ＮＮＳ　（４９アミノ酸） この配列は、ＣＥＡのＩＩＢサブドメインの４００−４
４８残基を含む、この配列は配列Ｖと相同である。第二
のジスルフィドループを含む。ＮＣＡと相違する１３ア
ミノ酸には下線を付した。

配列■ ＮＬＳＣＨ３ＡＳＮＰＳヱＱヱＳＷ且ＩＮＧ［ＰＱＱＨ
ＴＱＶＬＦ　ＩＡＫＩＴＰＮＮＮＧ工ＹＡＣＦＶＳＮＬ
　（４９アミノ酸） この配列は、ＣＥＡのＩＩＩＢサブドメインの５７８−
６２６残基を含む、これは配列Ｖおよび■と相同である
。ＮＣＡと異なる１８アミノ酸には下線を付した。

ＣＥＡ−ンの　おび 本発明は、１ｇ様の各ドメイン１．ＩＩおよび■の一つ
もしくはそれ以上を含むＣＥＡ分子の天然もしくは合成
フラグメント：各サブドメインＩＡ。

１Ｂ、■Ａ、Ｉ［Ｂ、Ｉ［［Ａおよび［［［Ｂの一つも
しくはそれ以上；ならびにそのようなフラグメントの例
えば真核発現システム内での発現を包含する。

前記ペプチド配列■ないし■のいずれかをコードするフ
ラグメントを含む任意の所望ＣＥＡフラグメントをコー
ドする合成りＮＡは、公知の方法により、例えば５ｙｎ
Ｌｅｃ　　ｍ１ｃｒｏｓｙｎ１４５０自動ＤＮＡ合成装
置を用いてＵＡ製し、さらにポリアクリルアミドゲル電
気泳動および高性能液体クロマトグラフィーで精製する
ことができる。

ＣＥＡのｃＤＮＡ配列は知られている。例えば、オイカ
ワ、Ｓら、Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ｒｅｓ、
Ｃｏｍｍ、１４２：５１１−５１８（１９８７）および
オイカワ、Ｓら、Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ｒ
ｅｓ、Ｃｏｍｍ、１４４　：６３４−６４２　（１９８
７）を参照。種々のドメインおよびサブドメインの各々
を分離するための合成制限部位は、公知の方法によりＣ
ＥＡを変異させて提供することができる０例えば、’Ｍ
ｕｔａ−Ｇｅｎｅ”　　インビトロ　ミュークジェネシ
ス　キット　インストラクション　マニュアル”、（１
９８７）、Ｂｉｏ−Ｒａｄ　　Ｌａｂ。

ｒａｔｏｒｉｅｓ、１４１４　　）ｌａｂｏｒ　　Ｗａ
ｙ　　５ｏｕＬｈ、　　リッチモンド、ＣＡ　　９４８
０４を参照。

図表２は、ＣＩＥＡのドメイン！、■および■の各々の
サブドメインＡおよびＢの接続部分での分離のための、
制限部位の導入の例である。

図表２ Ａ−Ｂドメイン接続部分 Ａｓｐ　　Ｓｅｒ　　Ｖａｌ　　ｌ１ｅ１　、ＧＡＴ　
　ＴＣＡ　　ＧＴＣＡＴＣＬｅｕ　　Ａｓｎ　　Ｖａｌ ＣＴＧ　　＾＾Ｔ　　ＧＴＣ Ａｓｐ　Ｐｒｏ　　Ｖａｔ　　Ｉｌｅ ■、　　ＧＡＣＣＣＡ　　ＧＴＣＡＴＣＬｅｕ　　Ａｓ
ｎ　　Ｖａｔ ＣＴＧ　　ＡＡＴ　　ＧＴＣ Ａｓｐ　　Ｐｒｏ　　Ｖａｌ　　Ｔｈｒ　　Ｌｅｕ　　
Ａｓｐ　　Ｖａｔｌ、　　ＧＡＣＣＣＡ　　ＧＴＣＡＣ
ＣＣＴＧ　　ＧＡＴ　　ＧＴＣＧＴＴ　　ＡＣＣ ｐａ　１ 上の例において、ドメイン接続部分に出来るだけ近い制
限部位が望ましい、ドメインの側のヌクレオチド配列を
Ｈｐａ１部位に変換するには、合成遺伝子中に単にＧＴ
Ｔ　　ＡＣＣを作成するか、または天然遺伝子中に部位
特異的ミュータジエネシスでＧＴＴ　　ＡＣＣを作成す
ることが出来る。

この変換は、１、■および■のＶａｌ残茫を変化させな
いが、しかしＶａｌの次の残基を三つのドメインの全て
においてＴｈｒに変換する（これは■には最初から存在
する）。

同様の代作は、ＣＥＡのドメインＩおよび■のサブドメ
インＡおよびＢの間に変異制限部位を提供するためにも
有用である。

ＣＥＡ分子の天然および合成フラグメントを、真核シス
テムで発現させる方法は、公知技術で行うことができる
。ＣＥＡ遺伝子フラグメントを真核発現ベクターに挿入
し、適当な細胞ライン、例えば５Ｐ２０のようなミエロ
ーマ細胞ラインを形質転換する。その＆作は、トランス
フエフトーマで免疫グロブリンを発現させるために報告
されている方法と同様である。その例は、モリソン（Ｍ
ｏｒｒｉｓｏｎ）ら、ＰＮＡＳ、８１．．６８５１−６
８５５　（１９８４）ｉサン（Ｓｕｎ）ら、ＰＮＡＳ、
８４，２１４−２１８　（１９８７）；ニジムラら、Ｃ
ａｎｃｅｒ　　Ｒｅｓ、４７，９９９−１００５　　（
１９Ｂ？）ｉルー（Ｌｕ）ら、ＰＮＡＳ、８４．３４３
９−３４４３　（１９Ｂ？）；シ二ネー（Ｓｃｈｎｅｅ
）ら、ＰＮＡＳ、８４゜６９０４−６９０８　（１９Ｂ
？）；ブラウン（Ｂｒｏｗｎ）ら、Ｃａｎｃｅｒ　　Ｒ
ｅｓ、４７．３５７７−３５８３　（１９８７）：シア
ウ（ＳｈａＷ）ら、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、、１３Ｂ、４
５３４４５３Ｂ　（１９８７）；およびホーネス（Ｈ。

ｎｅｓ）ら、Ｎａｔｕｒｅ、３２１．５２２　５２５　
（１９８６）に記載されている。ベクターの例は、形質
転換をモニターするためにｎｅｏまたはｇｐｔ遺伝子を
有するｐｓＶ２の誘導体である。

他のベクターは市販品として入手できる、例えばＣ１ｏ
ｎ　　ＴｅｃｈのＰＥＵＫ−Ｃである。

モリソンら、ＰＮＡＳ、８１．６８５１　（１９８４）
に記載されている、ｇｐｔまたはｎｅｏ遺伝子を持つｐ
ｓＶ２ベクターに、ＢａｍＨＩリンカ−から供給される
Ｂａｍ８１部位にクローン化されたＣＥＡ遺伝子を持た
せることができる。このベクターを、トネグゾーおよび
キーティング（Ｔｏｎｅｇｕｚｚｏ　　ａｎｄ　　Ｋｅ
ａＬｉｎｇ）、ＰＮＡＳ、８３．３４９６−３４９９　
（１９８６）に記載されたようにして、５Ｐ２１０細胞
中にエレクトロボレート法で導入することができる、こ
の細胞を適当な抗生物質の存在下で増殖させて、安定な
形質転換体を得ることができる。

これらの細胞をＣＥＡの分泌生産についてＥＬＩＳＡに
より、または細胞表面生産の場合はＦＡＣ８によってス
クリーニングすることが可能である。

ＣＥＡの他の分子フラグメントの発現も、同様の方法で
行うことが可能であろう。

土友ム１Ｌ立不 本発明の分子フラグメントは、ＮＣＡおよび他のＣＥＡ
−関連抗原も一緒に含むサンプル中に存在するＣＥＡを
識別しおよび定量するための、任意の所望イムノアッセ
イ方法に有用である。本発明のこの観点は、いかなる特
定のアッセイ方法にも限定されない、直接および間接法
によるアッセイが使用可能である。

そのようなアッセイに使用するために、任意の所望割合
の蛍光標識、酵素標識、または化学発酵標識とともに、
ＣＥＡフラグメントを提供することができる。酵素イム
ノアッセイ（ＥＩＡ）、特に非競合的酵素結合免疫ソル
ベント（ＥＬＩＳＡ）アッセイが好ましい、ＣＥＡフラ
グメントを標識するために使用される酵素の一例には、
アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、西洋
ワサビペルオキシダーゼ、グルコース−６−ホスフェー
トデヒドロゲナーゼ、３−ホスホグリセレートキナーゼ
（ＰＧＫ）が含まれる。ＣＥＡフラグメントと酵素から
形成された融合蛋白質は、公知の適当な方法で造成され
る。例えば、シュネーら、ＰＮＡＳ、８４．６９０４−
６９０８　　（１９８７）により報告された、重鎮−Ｌ
ＰＡ融合蛋白質を参照。

酵素免疫アッセイ（ＥＩＡ）で既に一般化した、例えば
アルカリホスファターゼおよびβ−ガラクトシダーゼが
好ましい、天然遺伝子または合成遺伝子の何れも使用可
能である０両者のための細菌遺伝子は容易に得られる。

図表３は典型的融合遺伝子を表示する： 図表３ この融合遺伝子は、遺伝子成分を公知の方法で連結して
造成される。リンカ−は直接ＣＥＡ遺伝子中に合成する
ことが可能である。適当な制限部位を融合遺伝子内に作
成することができる。

この融合遺伝子をｐＳＶ２ベクター中に導入し、５ｐ２
１０内にエレクトロポレートで導入して発現させる。生
成物をＣＥＡおよび酵素活性に関してスクリーニングす
る。

二種類のモノクローナル抗体を用いたＣＥＡの典型的Ｅ
ＲＡは、ヘディン（Ｈｅｄｉｎ）ら、ＰＮＡＳ、８０．
３４７０−３４７４　（１９８３）に記載されているが
、図表４のようである。

本発明によれば、ヘディンのアッセイを図表５に示すよ
うに改変して、インヒビジョンアッセイに変えることが
可能である。

図表５ 固相 図表５に示されているように、改変アッセイは車上のモ
ノクローナル抗体（ＭＡＢ）を固相に結合して用いてい
る。酵素融合生成物はＣＥＡ−βガラクトシダーゼであ
る。この融合産物とモノクローナル抗体との免疫反応は
結合の直接の指標になるが、遊離ＣＥＡによって阻害さ
れる。従って、阻害程度が大きければ、分析されるサン
プル中のＴｉ離ＣＥＡの■が多いことを意味する。具体
的工程には、（１）ＭＡＢ−固相に対するサンプルおよ
びＣＥＡ−β−ガラクトシダーゼ融合産物の添加に続＜
　３０−６０分間のインキュベー）　；　（２）洗浄に
よる未結合物質の除去；（３）基質、例えば〇固■１ ニトロフェニル−β−ガラクトシドとのインキュベート
：および（４）得られた結果をスタンダードによる阻害
曲線と対比して結果を観察することを含むであろう。

【図面の簡単な説明】

第１図は、ヒト免疫グロブリンの重鎮のＣＨ−■ドメイ
ンの定常領域の立体構造を示す図である。 第２Ａ図は、ＣＥＡのドメインＩのサブドメインへの立
体構造を示す図である。 第２Ｂ図は、ＣＨＡのドメイン１のサブドメインＢの立
体構造を示す図である。 、第３Ａ図は、ＣＥＡのドメインＩＩのサブドメインＡ
の立体構造を示す図である。 第３Ｂ図は、ＣＥＡのドメインＨのサブドメインＢの立
体構造を示す図である。 第４Ａ図は、ＣＢへのドメイン■のサブドメインへの立
体構造を示す図である。 第４Ｂ図は、ＣＥＡのドメインＩ［ｌのサブドメインＢ
の立体構造を示す図である。 ＸＧＣＲＥ Ａ Ｆ工ＧＵＲＥ Ｆ工ＧＵＲＥ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、明細書中の図表１Ｃに示すＣＥＡのドメインIIIを
   含むＣＥＡ分子のフラグメントもしくはそのＣＥＡ特異
   的エピトープを担う任意の部分。 ２、明細書中の図表１Ｃに示すＣＥＡのドメインIIIＡ
   を含むがＣＥＡのドメインIIIＢは含まないＣＥＡ分子
   のフラグメントもしくはそのＣＥＡ特異的エピトープを
   担う任意の部分。 ３、明細書中の図表１Ｃに示すＣＥＡのドメインIIIＢ
   を含むがＣＥＡのドメインIIIＡは含まないＣＥＡ分子
   のフラグメントもしくはそのＣＥＡ特異的エピトープを
   担う任意の部分。 ４、明細書中の式 I の純化天然ＤＮＡ配列またはその
   ＣＥＡ特異的エピトープをコードする任意の部分。 ５、明細書中の式 I に示されているＣＥＡのサブドメ
   インIIIＡをコードする純化天然ＤＮＡ配列またはその
   ＣＥＡ特異的エピトープをコードする任意の部分。 ６、明細書中の式 I に示されているＣＥＡのサブドメ
   インIIIＢをコードする純化天然ＤＮＡ配列またはその
   ＣＥＡ特異的エピトープをコードする任意の部分。 ７、明細書中の式 I に示されている配列を有する合成
   ペプチドまたはそのＣＥＡ特異的エピトープを担う任意
   の部分。 ８、明細書中の式 I においてＣＥＡサブドメインIIIＡ
   として示されている配列を有する合成ペプチドまたはそ
   のＣＥＡ特異的エピトープを担う任意の部分。 ９、明細書中の式 I においてＣＥＡサブドメインIIIＢ
   として示されている配列を有する合成ペプチドまたはそ
   のＣＥＡ特異的エピトープを担う任意の部分。 １０、明細書中の式 I において示されているＣＥＡド
   メインIIIをコードする合成りＮＡ配列またはそのＣＥ
   Ａ特異的エピトープをコードする任意の部分。 １１、明細書中の式 I において示されているＣＥＡド
   メインIIIＡをコードするがＣＥＡドメインIIIＢをコー
   ドしない合成りＮＡ配列またはそのＣＥＡ特異的エピト
   ープをコードする任意の部分。 １２、明細書中の式 I において示されているＣＥＡド
   メインIIIＢをコードするがＣＥＡドメインIIIＡをコー
   ドしない合成りＮＡ配列またはそのＣＥＡ特異的エピト
   ープをコードする任意の部分。 １３、請求項１で定義されたＣＥＡ分子のフラグメント
   と酵素との融合物。 １４、請求項２で定義されたＣＥＡ分子のフラグメント
   と酵素との融合物。 １５、請求項３で定義されたＣＥＡ分子のフラグメント
   と酵素との融合物。 １６、請求項４で定義されたＤＮＡ配列と酵素との融合
   物。 １７、請求項５で定義されたＤＮＡ配列と酵素との融合
   物。 １８、請求項６で定義されたＤＮＡ配列と酵素との融合
   物。 １９、請求項１０で定義されたＤＮＡ配列と酵素との融
   合物。 ２０、請求項１１で定義されたＤＮＡ配列と酵素との融
   合物。 ２１、請求項１２で定義されたＤＮＡ配列と酵素との融
   合物。 ２２、式 I で示されているＣＥＡドメインIIIＢに相当
   する合成ヌクレオチド配列へ制限酵素開裂部位で連結さ
   れた、式 I で示されているＣＥＡドメインIIIＡに相当
   する合成ヌクレオチド配列。 ２３、明細書中のアミノ酸配列II、III、IV、Ｖ、VIま
   たはVIIを含む合成ペプチド。 ２４、第２Ａ図、第２Ｂ図、第３Ａ図、第３Ｂ図、第４
   Ａ図または第４Ｂ図に示す三次元構造のＣＥＡフラグメ
   ント。