JP5746251B2

JP5746251B2 - 腫瘍関連ペプチドおよび関連抗癌ワクチンの組成物

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Publication number: JP5746251B2
Application number: JP2013061688A
Authority: JP
Inventors: シン，ハープリート; スホール，オリバー; トラウトヴァイン，クラウディア; ヒルフ，ノルベルト; ヴァインシェンク，トーニ; ウォルター，シュテッフェン; レワンドロウスキ，ピーター
Original assignee: イマティクスバイオテクノロジーズゲーエムベーハー
Priority date: 2007-07-27
Filing date: 2013-03-25
Publication date: 2015-07-08
Anticipated expiration: 2028-07-25
Also published as: CA2694771A1; EA023928B1; AU2008281013B2; PT2567707T; CN101765434A; AU2008281013A2; DK2567707T3; US7994276B2; EP2567707B1; US20090148400A1; EP2178557A1; NZ582823A; CN101765434B; AU2008281013A1; EA018457B1; EP2178557B1; EA201000208A1; CN103360466B; EA201300322A1; LT2567707T

Description

本発明は、免疫療法ペプチド、および免疫療法 (特に癌の免疫療法)におけるそれらの使用に関する。本発明は、単独としてもしくは他の腫瘍関連ペプチドとの組み合わせとして、抗腫瘍免疫応答を刺激するワクチン組成物の有効医薬成分として作用する腫瘍関連Tヘルパー細胞ペプチドエピトープを開示する。具体的には、本発明のペプチド組成物は、結腸直腸癌に対する抗腫瘍免疫応答を引き出すワクチン組成物に使用することができる。
本発明の目的上、本明細書に含まれる全ての参考文献は、参照によりその全文がここに組み込まれる。

結腸直腸癌
米国癌協会 (American Cancer Society)によれば、結腸直腸癌 (CRC)は米国で3番目に多い癌であり、新患者数は毎年175,000人以上である。米国、日本、フランス、ドイツ、イタリア、スペイン、イギリスの結腸直腸癌患者数は480,000人以上に及ぶ。先進国における癌による死亡原因として最も多いのが結腸直腸癌である。

遺伝因子と環境因子の相互作用の結果、結腸直腸癌が発症することが研究により示されている。ほとんどの症例で、腺腫様ポリープが結腸直腸腫瘍の前駆症状として認められるようだが、ポリープが腫瘍に移行するまで長年かかることがある。結腸直腸癌の主要危険因子は加齢であり、症例の90％が50歳以上の年齢で診断されている。米国癌協会によれば、結腸直腸癌のその他の危険因子として含まれるのは、アルコール摂取、高脂肪の食事および／または赤身の肉、野菜果物の摂取不足である。発生率は増え続けており、特に日本のような場所で顕著に増加しており、西洋化された食事すなわち脂肪と肉の摂取過多および繊維の摂取の減少が原因である可能性がある。しかし、発生率の上昇はかつてほどの勢いではなく、スクリーニングおよびポリープ切除の増加によりポリープから癌への進行を防いでいることがそれに寄与している可能性がある。

ほとんどの固形腫瘍の場合と同じく、最初の治療は外科手術であるが、それが効果を示すのは早期段階の患者に未だに限られているにもかかわらず、患者の大半は、進行した結腸直腸癌の段階で診断されている。進行した結腸直腸癌に対しては、フルオロウラシルを使用する化学療法レジメンが標準的治療である。これらのレジメンの大半は、いわゆるFOLFOX (フルオロウラシル/ロイコボリンとオキサリプラチンの静注)およびFOLFIRI (イリノテカン、ロイコボリン、ボーラス、およびフルオロウラシル継続静注)である。

イリノテカンおよびオキサリプラチンのような第３世代の細胞傷害性薬の導入によって、効能の大幅な改善の望みが増したが、予後はなお比較的悪く、転移性の場合の生存率は一般に約20ヶ月に維持されており、この病気に対処する必要性は未だに高い。

最近、アヴァスチン (ビバシズマブ)やエルビタックス (セツキシマブ)のような新世代の薬品である分子標的薬剤が入手可能となり、異なる段階の結腸直腸癌のための約40の化合物が後期臨床開発段階にある。これらの化合物のいくつかを組み合わせることにより、潜在的な治療の選択肢の数が増すことが将来的に期待される。これらの物質のほとんどはフェーズ2にあり、EGFRに対しては、結腸直腸癌のために開発中の他のどの薬剤よりも多くこれらの化合物が使われており、その理由は、約80%の結腸直腸癌患者でEGFRの発現が上方調節されるからである。

最近承認されたモノクローナル抗体 (mAbs) (セツキシマブ＋イリノテカンまたはFOLFOX4；単独薬またはFOLFOX4との組み合わせとしてのビバシズマブ)と化学療法の組み合わせを使った治験が、ステージIIの患者で現在行われている。これらの治験から統計的に有意な結果が得られるまでの観察期間は3〜4年に及ぶだろう。

モノクローナル抗体 (mAbs)は、現在、癌に一般的に使用されており、有効な免疫療法を妨害しない可能性が非常に高い。事実、DC媒介T細胞活性化にVEGF (ビバシズマブ)の低減が有効であることを示す前臨床の証拠がある。

現在、CRCの治療としての新規免疫療法の安全性と可能性を試す約16の治験が行われている。

免疫療法による治療
免疫応答は、宿主免疫系が抗原を異質な存在として認めることによって刺激される。腫瘍関連抗原の存在の発見によって、宿主免疫系を使って腫瘍の成長を妨害する可能性が高まった。癌の免疫療法のために体液性および細胞性の両方の免疫応答を刺激する様々なメカニズムの研究が現在行われている。

細胞性免疫応答の特異的要素は、腫瘍細胞を特異的に認識および破壊する能力を有する。腫瘍浸潤性細胞集団または末梢血からの細胞傷害性T細胞（CTL）の単離は、これらの細胞が、癌に対する天然の免疫防御に重要な役割を果たしていることを示唆している (Cheever et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 1993 690:101-112（非特許文献１）; Zeh HJ, Perry-Lalley D, Dudley ME, Rosenberg SA, Yang JC; J Immunol. 1999, 162(2):989-94（非特許文献２）； High avidity CTLs for two self-antigens demonstrate superior in vitro and in vivo antitumor efficacy)。特に、サイトゾルにあるタンパク質または欠陥リボソーム産物 (DRIPS)に通常由来する8〜10個の残基である、主要組織適合性遺伝子複合体 (MHC)を負担するペプチドのクラスI分子を認識するCD8陽性T細胞 (TCD8+)は、この応答において重要な役割を果たす(Schubert U, Anton LC, Gibbs J, Norbury CC, Yewdell JW, Bennink JR.; Rapid degradation of a large fraction of newly synthesized proteins by proteasomes; Nature 2000; 404(6779):770-774（非特許文献３）) 。ヒトのMHC分子は、ヒト白血球抗原 (HLA)としても指定されている。

MHC分子には2つのクラスがある。 MHCクラスI分子は、ほとんどの有核細胞にあり、内因性タンパク質DRIPSのタンパク分解切断の産物であるペプチド、およびより大きいペプチドを提供する。 MHCクラスII分子は、主にプロフェッショナル抗原提示細胞 (APC)にあり、エンドサイトーシスの間にAPCによって摂取および処理される外因性タンパク質のペプチドを提供する。ペプチドとMHCクラスI分子の複合体は適切なTCRを負担するCD8陽性細胞傷害性Tリンパ球によって認識され、ペプチドとMHCクラスII分子の複合体は適切なTCRを負担するCD4陽性ヘルパーT細胞によって認識される。

CD4陽性ヘルパーT細胞は抗腫瘍T細胞応答のエフェクターとしての機能の調整において重要な役割を果たすので、腫瘍関連抗原 (TAA)に由来するCD4陽性T細胞エピトープは抗腫瘍免疫応答を起こさせる医薬品の開発にとり非常に重要である可能性がある (Kobayashi,H., R. Omiya, M. Ruiz, E. Huarte, P. Sarobe, J. J. Lasarte, M. Herraiz, B. Sangro, J. Prieto, F. Borras-Cuesta, and E. Celis. Identification of an antigenic epitope for helper T lymphocytes from carcinoembryonic antigen. Clin. Cancer Res. 2002, 8:3219-3225.（非特許文献４）, Gnjatic, S., D. Atanackovic, E. Jaeger, M. Matsuo, A. Selvakumar, N.K. Altorki, R.G. Maki, B. Dupont, G. Ritter, Y.T. Chen, A. Knuth, and L.J. Old. Survey of naturally occurring CD4+ T-cell responses against NY-ESO-1 in cancer patients: Correlation with antibody responses. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2003, 100 (15): 8862-7（非特許文献５）)。 CD4+T細胞は、IFNγの局在的増加に至る場合がある(Qin Z, Schwartzkopff J, Pradera F, Kammertoens T, Seliger B, Pircher H, Blankenstein T; A critical requirement of interferon gamma-mediated angiostasis for tumor rejection by CD8+ T cells; J Cancer Res; 2003, 63(14): 4095-4100（非特許文献６）)。

CD4陽性T細胞は、細胞傷害性Tリンパ球 (CTL)エフェクター細胞 (すなわちCD8陽性Tリンパ球)が欠如していてもインターフェロンガンマ (IFNγ)を分泌して血管形成を阻害して腫瘍の発現を十分に阻害することが、哺乳動物モデル (例：マウス)で示された (Qin, Z. and T. Blankenstein. CD4+ T-cell--mediated tumour rejection involves inhibition of angiogenesis that is dependent on IFN gamma receptor expression by nonhematopoietic cells. Immunity. 2000, 12:677-686（非特許文献７）)。加えて、HLAクラスII分子によって提示される腫瘍関連抗原からのペプチドを認識するCD4陽性T細胞は抗体 (Ab)応答の誘発によって腫瘍の進行を抑えることができることが示された(Kennedy, R.C., M.H. Shearer, A.M. Watts, and R.K. Bright. CD4+ T lymphocytes play a critical role in antibody production and tumour immunity against simian virus 40 large tumour antigen. Cancer Res. 2003, 63:1040-1045（非特許文献８）)。HLAクラスI分子に結合する腫瘍関連ペプチドと対照的に、これまでのところ、TAAのクラスIIリガンドについての記述はごく少数である(www.cancerimmunity.org, www.syfpeithi.de)。

HLAクラスII分子の構成的発現は通常、免疫系の細胞に限定されるので (Mach, B., V. Steimle, E. Martinez-Soria, and W. Reith. Regulation of MHC class II genes: lessons from a disease. Annu. Rev. Immunol. 1996, 14: 301-331（非特許文献９）)、クラスIIペプチドを原発巣から直接に単離することは不可能と考えられてきた。しかし、本発明の発明者らは、最近、腫瘍からMHCクラスIIエピトープを直接に特定することに成功した (EP 1642905（特許文献１）, EP 1760088（特許文献２）; Dengjel J, Nastke MD, Gouttefangeas C, Gitsioudis G, Schoor O, Altenberend F, Mueller M, Kraemer B, Missiou A, Sauter M, Hennenlotter J, Wernet D, Stenzl A, Rammensee HG, Klingel K, Stevanovic S.; Unexpected abundance of HLA class II presented peptides in primary renal cell carcinomas; Clin Cancer Res. 2006; 12:4163-4170（非特許文献１０）)。

炎症がない場合、MHCクラスII分子の発現は主に免疫系の細胞、特にプロフェッショナル抗原提示細胞 (APC)(例：単球、単球由来細胞、マクロファージ、樹枝状細胞)に限定される。腫瘍患者において、驚くべきことに、腫瘍細胞がMHCクラスII分子を発現することが発見された (Dengjel J, Nastke MD, Gouttefangeas C, Gitsioudis G, Schoor O, Altenberend F, Mueller M, Kramer B, Missiou A, Sauter M, Hennenlotter J, Wernet D, Stenzl A, Rammensee HG, Klingel K, Stevanovic S.; Unexpected abundance of HLA class II presented peptides in primary renal cell carcinomas; Clin Cancer Res. 2006; 12:4163-4170（非特許文献１０）)。

細胞の免疫応答を起動するには、ペプチドはMHC分子に結合する必要がある。このプロセスは、MHC分子の対立遺伝子およびそのペプチドのアミノ酸配列に特異の多型に依存する。 MHCクラスI結合ペプチドは、通常、8〜10個のアミノ酸残基の長さであり、通常、2個の保存残基 (アンカー)をその配列に含むことにより、MHC分子の対応する結合溝と相互作用する。このように、各MHCの対立遺伝子は、どのペプチドがどの結合溝に特異的に結合するかを決定する「結合モチーフ」を有する (Rammensee HG, Bachmann J, Stevanovic S. MHC ligands and peptide motifs, Landes Bioscience, USA, 1997（非特許文献１１）)。

MHCクラスI依存性免疫応答において、ペプチドは腫瘍細胞が発現する特異的MHCクラスI分子と結合可能でなくてはならないだけでなく、T細胞を負担する特異的T細胞受容体 (TCR)によって認識されなくてはならない。

腫瘍特異的Tリンパ球によって認識される抗原すなわちエピトープは、酵素、受容体、転写因子など、あらゆるタンパク質クラスに由来する分子であり得る。さらに、例えば腫瘍関連抗原も、例えば変異遺伝子の産物として腫瘍細胞のみに存在する可能性がある。腫瘍関連抗原のもう1つの重要なクラスは、CT(「癌精巣」)のような組織特異的抗原、すなわち精巣の異なる種類の腫瘍および健康な組織で発現する抗原である。

これまでに様々な腫瘍関連抗原が特定されてきた。さらに、追加的な腫瘍関連抗原を特定するための研究が多く行われている。当該技術分野で腫瘍特異的抗原とも呼ばれる、腫瘍関連抗原の一部のグループは、組織特異的である。限定はしないが、例としては、メラノーマでのチロシナーゼ、前立腺癌でのPSAおよびPSMA、リンパ腫での染色体クロスオーバー (転座) (bcr/abl など)が含まれる。しかし、特定された多くの腫瘍関連抗原は複数の腫瘍型に発生し、かつ、実際に形質転換イベントを引き起こす発癌タンパク質および／または腫瘍抑制遺伝子 (例えば、Linehan WM, Walther MM, Zbar B. The genetic basis of cancer of the kidney. J Urol. 2003 Dec; 170 (6Pt1):2163-72（非特許文献１２）では、腎臓癌の場合の腫瘍抑制遺伝子が評価されている) のような一部のものは、ほぼ全ての腫瘍型に発生する。例えば、p53 (腫瘍抑制遺伝子の一例)、ras、c-met、myc、pRB、VHL、 HER-2/neuのような、細胞の成長と分化を制御する正常な細胞タンパク質は、変異を蓄積してこれらの遺伝子産物の発現を上方調節し、癌に至らせる (Cancer Research, 1998, 15:58 2601-5（非特許文献１３）; Disis et al. Ciba Found. Symp. 1994, 187:198-211（非特許文献１４）)。これら変異タンパク質は、様々なタイプの癌において、腫瘍特異的免疫応答の標的となり得る。

癌患者に対する免疫療法は、特定の免疫系の細胞、特にいわゆる細胞傷害性T細胞 (CTL。「キラー細胞」もしくはCD8陽性T細胞としても知られる)を、健康な組織に対しては活性化せず、腫瘍細胞に対して活性化することをその狙いとする。腫瘍細胞は、正常細胞とは腫瘍関連タンパク質の発現が異なる。細胞表面のHLA分子は細胞内含有量を外側に提示するので、細胞傷害性T細胞は健康な細胞と腫瘍細胞とを差別化できる。これは、細胞内の全てのタンパク質が短いペプチドに分解され、それらのペプチドがHLA分子に付着して細胞表面に提示されることによって実現される (Rammensee, HG, Falk, K, and Rotzschke, O; Peptides naturally presented by MHC class I molecules, Annu. Rev. Immunol., 1993, 11, 213-244（非特許文献１５）)。身体の腫瘍細胞上には提示されるが健康な細胞には提示されない(もしくは提示されるとしてもはるかに低レベルで提示される)ペプチドは、腫瘍関連ペプチド (TUMAP)と呼ばれる。

タンパク質が細胞傷害性Tリンパ球によって腫瘍特異的または腫瘍関連抗原として認識され、療法に使用されるためには、特定の前提条件が満たされなくてはならない。該抗原は、主に腫瘍細胞によって発現されるべきであり、正常な健康細胞によっては発現されるべきではないか、比較的少量で発現されるべきである。さらに、該各抗原は１つの型の腫瘍に存在するだけでなく、高濃度 (すなわち１細胞につき各ペプチドのコピー数)で存在するのが望ましい。腫瘍特異的および腫瘍関連抗原は、しばしば、ある機能による正常細胞から腫瘍細胞への形質転換(例えば細胞周期制御またはアポトーシスにおいて)に直接関与するタンパク質に由来する。加えて、形質転換の直接の原因である下流標的タンパク質も上方調節される場合があり、したがって間接的に腫瘍関連である。そのような間接的な腫瘍関連抗原もワクチン接種法の標的となり得る。両方のケースに欠かせないのは、抗原のアミノ酸配列におけるエピトープの存在であり、それは、腫瘍関連抗原に由来するそのようなペプチド (「抗原性ペプチド」)が、in vitroまたはin vivoのT細胞応答を導くべきだからである。

基本的に、MHC分子と結合できる任意のペプチドはT細胞エピトープとして機能することができる。 in vitroまたはin vivoのT細胞応答を誘発する前提条件は、対応するTCRに伴うT細胞の存在と、この特定のエピトープに対する耐性の欠如である。 Tヘルパー細胞は、抗腫瘍免疫におけるCTLのエフェクター機能の調整に重要な役割を果たす。 TH1型のTヘルパー細胞応答を起動するTヘルパー細胞エピトープは、CD8陽性キラーT細胞のエフェクター機能 (細胞表面に腫瘍関連ペプチド/MHC複合体を表示する腫瘍細胞に対抗する細胞傷害性機能を含む)を支援する。このように、単独として、もしくは他の腫瘍関連ペプチドとの組み合わせとしての腫瘍関連Tヘルパー細胞ペプチドエピトープは、抗腫瘍免疫応答を刺激するワクチン組成物の有効医薬成分として作用することができる。

CD8およびCD4依存性という応答型の両方が共同かつ相乗的に抗腫瘍効果に寄与するので、CD8+ CTL (MHCクラスI分子)またはCD4陽性CTL (MHCクラスII分子)のいずれかによって認識される腫瘍関連抗原の特定および特徴付けは、腫瘍ワクチンの開発において重要である。したがって、本発明の目的は、どちらのクラスのMHC複合体にも結合するペプチドを含むペプチド組成物を提供することである。

腫瘍関連ペプチドを使う最初の治験は、Boonらによって主にインディケーションメラノーマに対する治験として1990年代半ばに始まった。最良の治験における臨床応答は10％〜30％の範囲であった。ペプチドを用いるワクチン単剤療法を使用したいずれの治験でも、重度の副作用または重度の自己免疫は報告されていない。メラノーマ関連ペプチドによる治療を受けた患者の一部に軽度の白斑が報告されている。

しかし、1種類のCTLのプライミングでは、通常、全ての腫瘍細胞をなくすには不十分である。腫瘍は非常に変異性が高いので、CTLによる認識を回避するためにそのタンパク質パターンを変化させることによってCTLの攻撃に急速に応答することができる。この腫瘍回避のメカニズムに対抗するために、様々な特異的ペプチドがワクチン接種に用いられる。そうすれば、いくつかのCTLクローンによって、腫瘍を同時かつ広範に攻撃することができる。これにより、腫瘍が免疫応答を回避する可能性を減らすことができる。この仮説は、最近、後期メラノーマ患者の治療のための治験で確認された。わずか数例の例外を除き、少なくとも3回の明確なT細胞応答のあった患者は、目的の臨床応答または安定性疾患 (Banchereau, J, Palucka, AK, Dhodapkar, M, Burkeholder, S, Taquet, N, Rolland, A, Taquet, S, Coquery, S, Wittkowski, KM, Bhardwaj, N, Pineiro, L, Steinman, R, and Fay, J; Immune and clinical responses in patients with metastatic melanoma to CD34(+) progenitor-derived dendritic cell vaccine, Cancer Res., 2001, 61, 6451-6458（非特許文献１６）) 、および生存率の増加 (J. Banchereauとの個人的通信)を示し、T細胞応答が３回未満であったほとんどの患者は進行性疾患と診断された。

該治験申請者の研究では、腎臓細胞癌患者を13の異なるペプチドを有するワクチンで治療したところ、同様の効果が示された (H. Singh-Jasuja, S. Walter, T. Weinschenk, A. Mayer, P. Y. Dietrich, M. Staehler, A. Stenzl, S. Stevanovic, H. Rammensee, J. Frisch; Correlation of T-cell response, clinical activity and regulatory T-cell levels in renal cell carcinoma patients treated with IMA901, a novel multi-peptide vaccine; ASCO Meeting 2007 Poster # 3017（非特許文献１７）; M. Staehler, A. Stenzl, P. Y. Dietrich, T. Eisen, A. Haferkamp, J. Beck, A. Mayer, S. Walter, H. Singh, J. Frisch, C. G. Stief; An open label study to evaluate the safety and immunogenicity of the peptide based cancer vaccine IMA901, ASCO meeting 2007; Poster # 3017（非特許文献１８）)。

欧州特許第1642905号明細書欧州特許第1760088号明細書

Cheever et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 1993 690:101-112 Zeh HJ, Perry-Lalley D, Dudley ME, Rosenberg SA, Yang JC; J Immunol. 1999, 162(2):989-94 Schubert U, Anton LC, Gibbs J, Norbury CC, Yewdell JW, Bennink JR.; Rapid degradation of a large fraction of newly synthesized proteins by proteasomes; Nature 2000; 404(6779):770-774 Kobayashi,H., R. Omiya, M. Ruiz, E. Huarte, P. Sarobe, J. J. Lasarte, M. Herraiz, B. Sangro, J. Prieto, F. Borras-Cuesta, and E. Celis. Identification of an antigenic epitope for helper T lymphocytes from carcinoembryonic antigen. Clin. Cancer Res. 2002, 8:3219-3225. Gnjatic, S., D. Atanackovic, E. Jaeger, M. Matsuo, A. Selvakumar, N.K. Altorki, R.G. Maki, B. Dupont, G. Ritter, Y.T. Chen, A. Knuth, and L.J. Old. Survey of naturally occurring CD4+ T-cell responses against NY-ESO-1 in cancer patients: Correlation with antibody responses. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2003, 100 (15): 8862-7 Qin Z, Schwartzkopff J, Pradera F, Kammertoens T, Seliger B, Pircher H, Blankenstein T; A critical requirement of interferon gamma-mediated angiostasis for tumor rejection by CD8+ T cells; J Cancer Res; 2003, 63(14): 4095-4100 Qin, Z. and T. Blankenstein. CD4+ T-cell--mediated tumour rejection involves inhibition of angiogenesis that is dependent on IFN gamma receptor expression by nonhematopoietic cells. Immunity. 2000, 12:677-686 Kennedy, R.C., M.H. Shearer, A.M. Watts, and R.K. Bright. CD4+ T lymphocytes play a critical role in antibody production and tumour immunity against simian virus 40 large tumour antigen. Cancer Res. 2003, 63:1040-1045 Mach, B., V. Steimle, E. Martinez-Soria, and W. Reith. Regulation of MHC class II genes: lessons from a disease. Annu. Rev. Immunol. 1996, 14: 301-331 Dengjel J, Nastke MD, Gouttefangeas C, Gitsioudis G, Schoor O, Altenberend F, Mueller M, Kraemer B, Missiou A, Sauter M, Hennenlotter J, Wernet D, Stenzl A, Rammensee HG, Klingel K, Stevanovic S.; Unexpected abundance of HLA class II presented peptides in primary renal cell carcinomas; Clin Cancer Res. 2006; 12:4163-4170 Rammensee HG, Bachmann J, Stevanovic S. MHC ligands and peptide motifs, Landes Bioscience, USA, 1997 Linehan WM, Walther MM, Zbar B. The genetic basis of cancer of the kidney. J Urol. 2003 Dec; 170 (6Pt1):2163-72 McCarty et al., "Targeting p53 for Adoptive T-Cell Immunotherapy1 ", Cancer Research 1998 15:58 2601-5 Disis et al. Ciba Found. Symp. 1994, 187:198-211 Rammensee, HG, Falk, K, and Rotzschke, O; Peptides naturally presented by MHC class I molecules, Annu. Rev. Immunol., 1993, 11, 213-244 Banchereau, J, Palucka, AK, Dhodapkar, M, Burkeholder, S, Taquet, N, Rolland, A, Taquet, S, Coquery, S, Wittkowski, KM, Bhardwaj, N, Pineiro, L, Steinman, R, and Fay, J; Immune and clinical responses in patients with metastatic melanoma to CD34(+) progenitor-derived dendritic cell vaccine, Cancer Res., 2001, 61, 6451-6458 H. Singh-Jasuja, S. Walter, T. Weinschenk, A. Mayer, P. Y. Dietrich, M. Staehler, A. Stenzl, S. Stevanovic, H. Rammensee, J. Frisch; Correlation of T-cell response, clinical activity and regulatory T-cell levels in renal cell carcinoma patients treated with IMA901, a novel multi-peptide vaccine; ASCO Meeting 2007 Poster # 3017 M. Staehler, A. Stenzl, P. Y. Dietrich, T. Eisen, A. Haferkamp, J. Beck, A. Mayer, S. Walter, H. Singh, J. Frisch, C. G. Stief; An open label study to evaluate the safety and immunogenicity of the peptide based cancer vaccine IMA901, ASCO meeting 2007; Poster # 3017

したがって、腫瘍ワクチンの開発における主要なタスクは、新規腫瘍関連抗原およびそれらに由来する免疫Tヘルパーエピトープを特定し特徴付けるのみでなく、各患者が1つ以上のエピトープに応答する可能性を増すよう、異なるエピトープの組み合わせも特定し特徴付けることである。したがって、本発明の目的は、ヒト主要組織適合性遺伝子複合体 (MHC)クラスI(HLAクラスI)またはII(HLAクラスII)の分子に結合する能力を有する、そのようなペプチドのアミノ酸配列の組み合わせを提供する発明を提示することである。本発明の更なる目的は、該ペプチドの組み合わせに基づく効果的な抗癌ワクチンを提供することである。

本発明の発明者らは、哺乳動物腫瘍である結腸直腸癌からHLAクラスIまたはII分子に直接結合するペプチドを単離し、特徴付けた。

本発明が提供するペプチドは、腫瘍形成に関連する抗原に由来するものであり、かつMHC (HLA)クラスII分子に十分に結合してヒトの白血球の免疫応答、特にリンパ球、特にTリンパ球、特にCD4陽性Tリンパ球、特にCD4陽性Tリンパ球をもたらすTH1-型の免疫応答を起動する能力を有するものである。

また、本発明は、腫瘍形成に関連する抗原に由来し、かつMHC(HLA)クラスI分子に十分に結合してヒトの白血球、特にリンパ球、特にTリンパ球、特にCD8陽性細胞傷害性Tリンパ球の免疫応答を起動する能力を有するペプチドも提供し、かつまた、癌患者のワクチン接種として特に有用な2つのペプチドの組み合わせも提供する。

本発明によると、その目的は、配列番号１〜配列番号７からなる群から選択されるアミノ酸配列および／または配列番号１〜配列番号７のアミノ酸配列と少なくとも80％相同性のある変異アミノ酸配列を含む少なくとも２つのペプチド、および／または配列番号１〜配列番号７のアミノ酸配列またはそれらの変異アミノ酸配列をコードする核酸を含むポリヌクレオチドを含む医薬組成物、ならびに薬学的に許容される担体とを提供することによって達成される。本発明の医薬組成物は、配列番号８〜配列番号１５からなる群から選択されるアミノ酸配列または配列番号８〜配列番号１５のアミノ酸配列と少なくとも80％相同性のある変異アミノ酸配列を含む少なくとも１つの追加的なペプチド、または配列番号８〜配列番号１５もしくはこれらの変異アミノ酸配列をコードする核酸を含むポリヌクレオチドをさらに含む場合がある。該ペプチドの全長は8〜100個のアミノ酸、好ましくは8〜30個のアミノ酸、最も好ましくは8〜16個のアミノ酸からなり得る。該ペプチドは、非ペプチド結合も含む場合がある。

以下に説明するように、本発明の基礎となるペプチドは全て、MHCクラスIまたはIIがある細胞によって提示されるものとして特定されたものである。したがって、これら特定のペプチドおよびその配列を含む他のペプチド (すなわち由来ペプチド)は全て、特定のT細胞応答を引き出すが、そのような応答がどの程度引き出されるかは、各ペプチドおよび各患者によって異なる場合がある。例えば、該ペプチドの変異によって差異が生じる場合がある。当業者であれば、具体的に本明細書で挙げる例およびそれらの例に伴う文献を参照し、各ペプチドによって誘発される応答の度合いを決定するために使用可能な方法をよく認識している。

好ましくは、本発明の変異形は、本発明の対応するペプチドとT細胞の交差反応を誘発する。

ペプチドのアミノ酸配列または該ペプチドをコードする核酸配列と変異形との相同性のパーセンテージは、当技術分野で周知のアルゴリズムを用いて計算することができる。本発明において、「相同性のある」という言葉は、２つのアミノ酸配列すなわちペプチドまたはポリペプチド配列の配列間の一致の度合いを指す。前述の「相同性」は、それらの配列にかけて最適な条件下で整合された２つの配列の比較によって決定される。ここで比較されるアミノ酸または核酸配列に、それら２つの配列の最適な整合において追加または削除 (例えばギャップなど)がある場合がある。そのような配列の相同性は、例えばClustalW アルゴリズム (Nucleic Acid Res., 22(22):4673 4680 (1994)を用いて整合させることによって計算することができる。一般に市販されている配列分析ソフトウェア、より具体的には Vector NTI, GENETYX 、または公開データベースが提供する分析ツール(例：http://restools.sdsc.edu/biotools/biotools16.html )を使うこともできる。

薬学的に許容される担体は周知であり、通常、その中に治療有効薬剤が処方される。該担体は、一般に、該処方に薬理活性を一切提供しないが、化学的および／または生物的安定性、放出特性などを提供する場合がある。処方例は、例えば、Alfonso R. Gennaro. Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th Edition. Baltimore, MD: Lippincott Williams & Wilkins, 2000 に記載されており、生理食塩水、水、緩衝用水、0．3％グリシン、ヒアルロン酸、デキストロースなどを含むが、これらに限定されない。最近、患者への点滴に長年使われてきた特定の脂肪乳剤もペプチドの送達手段として有用であることがわかった。そのような乳剤の２つの例は、Intralipid および Lipofundinとして市販されている周知の脂肪乳剤である。「Intralipid」は、Kabi Pharmacia (スウェーデン)の登録商標であり、米国特許第3,169,094号に開示されている点滴用脂肪乳剤である。「Lipofundin」は、B. Braun Melsungen(ドイツ)の登録商標である。両方とも、脂肪として大豆油を含んでいる (1，000ｍｌの蒸留水に100ｇ (10％)または200ｇ (20％))。乳化剤としてIntralipidは卵黄リン脂質を使っており (蒸留水1リットル当たり12ｇ)、Lipofundinは卵黄レシチンを使っている (蒸留水1リットル当たり12ｇ)。 IntralipidとLipofundinの両方で、グリセロール (25 g/l)添加により等張性が得られる。

該ペプチドは、腫瘍関連抗原、特に例えばタンパク質分解、血管形成、細胞成長、細胞周期制御、細胞分裂、転写調節、組織浸潤などにおける機能を持つ腫瘍関連抗原に由来する。

表1: 本発明のペプチドおよび親タンパク質の機能

染色体20オープン・リーディング・フレーム42
C20orf42は、アクチン細胞骨格を血漿膜に付着させるプロセスおよびインテグリン媒介細胞プロセスに関与する限局性接着タンパク質である。機能喪失変異の結果生じるC20orf42欠乏は、キンドラー症候群 (皮膚の水疱を特徴とする常染色体後退遺伝性皮膚症)、進行性皮膚萎縮、光過敏症のほか、ときとして発癌につながる (Herz, C, Aumailley, M, Schulte, C, Schlotzer-Schrehardt, U, Bruckner-Tuderman, L, and Has, C; Kindlin-1 is a phosphoprotein involved in regulation of polarity, proliferation, and motility of epidermal keratinocytes, J Biol Chem., 2006, 281, 36082-36090)。最近、機能喪失変異の患者での重度の出血性大腸炎を伴う胃腸器官の症状が報告された (Sadler, E, Klausegger, A, Muss, W, Deinsberger, U, Pohla-Gubo, G, Laimer, M, Lanschuetzer, C, Bauer, JW, and Hintner, H; Novel KIND1 gene mutation in Kindler syndrome with severe gastrointestinal tract involvement, Arch. Dermatol., 2006, 142, 1619-1624)。

癌の場合では、癌関連の設定での遺伝子発現を調査する研究の範囲内でC20orf42について説明されている。 C20orf42は結腸癌の70％および肺癌の60％で過剰発現していた (ｎ＝10)。ノーザンブロットによる正常組織の発現は、神経筋組織に限定されていた (Weinstein, EJ, Bourner, M, Head, R, Zakeri, H, Bauer, C, and Mazzarella, R; URP1: a member of a novel family of PH and FERM domain-containing membrane-associated proteins is significantly over-expressed in lung and colon carcinomas, Biochim. Biophys. Acta, 2003, 1637, 207-216)。さらに、C20orf42は、 TGF-βを媒介とする細胞移動および腫瘍浸潤に関わる遺伝子として特定されている (Kloeker, S, Major, MB, Calderwood, DA, Ginsberg, MH, Jones, DA, and Beckerle, MC; The Kindler syndrome protein is regulated by transforming growth factor-beta and involved in integrin-mediated adhesion, J. Biol. Chem., 2004, 279, 6824-6833)。

NADPHオキシダーゼホモログ-1 (NOX1)
NOX1は、スーパーオキシド (O_2-)と過酸化水素 (H₂O₂)の活性酸素種の生成を触媒する成長因子応答酵素である。その発現は元々、結腸、前立腺、子宮、増殖血管平滑筋細胞において認められた。 (Suh, Y. A. et al. Cell transformation by the superoxide-generating oxidase Mox1. Nature 1999, 401, 79-82)。その発現は、細胞増殖、血管形成、および細胞内シグナル伝達経路の活性化を含む数多くの生物学的応答に関係している (Harper, R. W., Xu, C., Soucek, K., Setiadi, H. and Eiserich, J. P. A reappraisal of the genomic organization of human Nox1 and its splice variants. Arch. Biochem. Biophys. 2005, 435, 323-330)。

NOX1は結腸に高発現するが、結腸の生理または病理におけるその機能はいまだによく理解されていない。正常組織では、NOX1の発現は回腸で低く、右結腸で中程度であり、左結腸で高い。腺腫由来標本と、分化が十分または乏しい結腸腺癌標本との間に、NOX1の統計的差異はなかった。 NOX1は、腺窩および内腔表面の両方で、結腸上皮細胞に高発現した。結論として、NOX1は結腸上皮に構成的に発現する酵素であり、腫瘍形成に直接関連するものではない (Szanto, I. et al. Expression of NOX1, a superoxide-generating NADPH oxidase, in colon cancer and inflammatory bowel disease. J Pathol. 2005, 207, 164-176)。

免疫組織化学は、NOX1が粘膜表在細胞に構成的発現をしたことを示している。腺腫およびよく分化された腺癌はNOX1の発現を上方調節した。核因子 (NF)カッパBがNOX1を豊富に発現する腺腫および腺癌細胞で主に活性化されたことは、NOX1は結腸腫瘍にNFカッパB依存性の抗アポトーシス経路を刺激する可能性を示している (Fukuyama, M. et al.Overexpression of a novel superoxide-producing enzyme, NADPH oxidase 1, in adenoma and well differentiated adenocarcinoma of the human colon. Cancer Lett. 2005, 221, 97-104)。

Wnt3a/βカテニンシグナルがNOX1発現を誘発するという記述がある(Petropoulos, H. & Skerjanc, I. S. Beta-catenin is essential and sufficient for skeletal myogenesis in P19 cells.J Biol Chem. 2002, 277, 15393-15399)。

最近、活性酸素種（ROS）が、腫瘍細胞の様々な接着分子の発現を後に誘発する内皮アポトーシスを誘発することが示唆された。このことは、ROSの生成に対処することによって、遠位での腫瘍再発を防ぐことが実現可能であることを示唆している。 (Ten, KM, van der Wal, JB, Sluiter, W, Hofland, LJ, Jeekel, J, Sonneveld, P, and van Eijck, CH; The role of superoxide anions in the development of distant tumour recurrence, 2006, Br.J Cancer, )。

オルニチンデカルボキシラーゼ1 (ODC1)
ODC1は、オルニチンをプトレシンに触媒するポリアミン生合成経路の速度制限酵素である。この酵素の活性レベルは成長を促進する刺激に応じて変化し、他の哺乳類タンパク質に比べて高い代謝率を示す。

ポリアミン代謝は、上皮組織における発癌メカニズムの構成要素である。 ODC1の増加とともに正常細胞の成長が始まり、新生腫瘍細胞の成長が持続することはしばしばある。 ODC1阻害物質は、膀胱、胸、結腸、皮膚の発癌の実験モデルでの腫瘍形成を抑制する。 ODC1活性の過剰発現は、多くの癌でよく認識された特徴であり、ODC1はプロトオンコジーンと見なされている (Auvinen, M., Paasinen, A., Andersson, L. C. and Holtta, E. Ornithine decarboxylase activity is critical for cell transformation. Nature 1992, 360, 355-358)。

大腸腺腫様ポリポーシス (APC)遺伝子での生殖細胞変異は、結腸癌で最も顕著な遺伝的素因である。 APC変異は遊離βカテニンレベルの大幅な増加を引き起こし、核の中に移動して配列に特異な転写因子であるリンパ球エンハンサー因子 (LEF)/T細胞因子 (Tcf)ファミリーとの複合体を形成する。 c-myc癌遺伝子は、Tcf標的遺伝子の1つである (He, T. C. et al. Identification of c-MYC as a target of the APC pathway (Science 281, 1509-1512 (1998). c-Myc RNA and protein are overexpressed in both early and late stages of colorectal tumorigenesis))。 ODCはc-Myc標的遺伝子である。

APC機能の喪失は、ODC1の上方調節を引き起こす。 (Gerner, EW and Meyskens, FL, Jr., Polyamines and cancer: old molecules, new understanding, Nat. Rev. Cancer, 2004, 4, 781-792) また、過剰発現は結腸直腸癌で頻繁に観察されてきた(Hu, H. Y. et al. Ornithine decarboxylase gene is overexpressed in colorectal carcinoma, World J. Gastroenterol. 2005, 11, 2244-2248; Kitahara, O. et al. Alterations of gene expression during colorectal carcinogenesis revealed by cDNA microarrays after laser-capture microdissection of tumor tissues and normal epithelia; Cancer Res. 2001, 61, 3544-3549; Nemoto, T., Kubota, S., Ishida, H., Murata, N. and Hashimoto, D. Ornithine decarboxylase, mitogen-activated protein kinase and matrix metalloproteinase-2 expressions in human colon tumors. World J. Gastroenterol. 2005, 11, 3065-3069)。

ODC1は、エンドスタチン抑制剤として作用して血管新生を促進する特性を有する (Nemoto, T., Hori, H., Yoshimoto, M., Seyama, Y. & Kubota, S. Overexpression of ornithine decarboxylase enhances endothelial proliferation by suppressing endostatin expression. Blood 2002, 99, 1478-1481)。

ODC1とＳ-アデノシルメチオニンデカルボキシラーゼ (ポリアミン生合成経路のもう1つの重要な酵素)のアデノウィルス・エンコーディング・アンチセンスRNAがCRC細胞株HT-29に感染すると、CCND1の下方調節と細胞周期停止が起きる。さらに、βカテニンの核転座も阻害された (Gong, L, Jiang, C, Zhang, B, Hu, H, Wang, W, and Liu, X; Adenovirus-mediated Expression of Both Antisense Ornithine Decarboxylase and S-adenosylmethionine Decarboxylase Induces G(1) Arrest in HT-29 Cells, J Biochem. Mol. Biol, 2006, 39, 730-736)。該アデノウィルスは、ヌードマウスに確立された腫瘍の腫瘍退縮も誘発した (Zhang, B, Liu, XX, Zhang, Y, Jiang, CY, Hu, HY, Gong, L, Liu, M, and Teng, QS; Polyamine depletion by ODC-AdoMetDC antisense adenovirus impairs human colorectal cancer growth and invasion in vitro and in vivo, 2006, J Gene Med, 8, 980-989)。

ODC1の特異的かつ不可逆的阻害剤は2-ジフルオロメチルオルニチン (DMFO，エフロルニチン(Sanofi-Aventis))である。これは、睡眠病 (トリパノソーマを原因とする)の治療薬として市販されており、また、脱毛クリームVaniqaの有効成分である。
癌に関しては、DMFOはすでに前臨床モデルに広範に用いられており、ポリアミンレベルの低減による有望な抗腫瘍効果を示している (Gerner, EW and Meyskens, FL, Jr.; Polyamines and cancer: old molecules, new understanding, Nat. Rev. Cancer, 2004, 4, 781-792)。数種類の癌ですでに治験が終了しており、CRCでの治験が現在いくつか行われている。しかし、これらの研究のほとんどは、特にCRC (腺腫様ポリープ)になりやすい患者に対する予防的な設定での、組み合わせによるアプローチである。免疫原性ODCペプチドであるODC−001が先に特定されている (M. Diehl, PhD Thesis, University of Tubingen, 1998)。

増殖性細胞核抗原 (PCNA)
PCNAは核の中に存在するもので、DNAポリメラーゼデルタの補因子である。このエンコードされたタンパク質はホモトリマーとして作用し、DNA複製中のリーディング鎖合成のプロセッシビティの増加を助ける。したがって、PCNAはあらゆる増殖性細胞、特に腫瘍細胞に発現するものであり、増殖を検知するためのマーカーとして用いられている。

PCNA免疫組織化学分析により定義される腫瘍性および隣接の正常な粘膜での増殖指数は、結腸直腸癌患者の癌再発と低生存率の独立予測因子として周知である (al-Sheneber, IF, Shibata, HR, Sampalis, J, and Jothy, S; Prognostic significance of proliferating cell nuclear antigen expression in colorectal cancer, Cancer, 1993, 71, 1954-1959; Mayer, A, Takimoto, M, Fritz, E, Schellander, G, Kofler, K, and Ludwig, H; The prognostic significance of proliferating cell nuclear antigen, epidermal growth factor receptor, and mdr gene expression in colorectal cancer, Cancer, 1993, 71, 2454-2460; Nakamura, T, Tabuchi, Y, Nakae, S, Ohno, M, and Saitoh, Y; Serum carcinoembryonic antigen levels and proliferating cell nuclear antigen labeling index for patients with colorectal carcinoma. Correlation with tumor progression and survival, Cancer, 1996, 77, 1741-1746)。

DNAトポイソメラーゼＩＩ (TOP2)
TOP2AおよびTOP2Bは、転座が起きているDNAのトポロジーを制御し改変する酵素であるDNAトポイソメラーゼのイソフォームをコードする。この核酵素は、染色体凝縮、染色分体分離、およびDNAの転座と複製の間に生じるねじり応力の軽減のようなプロセスに関与する。2本鎖DNAの2本のストランドの過渡破壊と再結合を触媒するので、それらのストランドは互いに通り抜けができるようになり、したがって、DNAのトポロジーを改変することができる。この酵素の2つのイソフォームは、遺伝子複製イベントの可能な産物として存在する。α形をコードする遺伝子は染色体17に局在しており、β遺伝子は染色体3に局在している。

TOP2Aは、いくつかの抗癌剤の標的であり、この遺伝子での様々な変異は薬品耐性の進行と関連している。

TOP2A遺伝子は、乳癌で最もよく増幅される癌遺伝子であるHER-2癌遺伝子に隣接し、染色体位置17q12-q21にある遺伝子であり、HER-2の増幅を伴う原発性乳房腫瘍のほぼ90％で同等の頻度で増幅もしくは削除される (Jarvinen, TA and Liu, ET; Topoisomerase IIalpha gene (TOP2A) amplification and deletion in cancer--more common than anticipated, Cytopathology, 14, 309-313)。さらに、TOP2Aの増幅は他の癌でも報告されている。最近の実験的な数多くの大規模なマルチセンター治験により、TOP2Aの増幅 (および／または削除)が、一般に使用される細胞傷害性薬すなわちトポイソメラーゼII阻害剤 (アントラサイクリン等)に対する過敏症または耐性の両方の主原因である可能性があり、 Kellner, U, Sehested, M, Jensen, PB, Gieseler, F, and Rudolph, P; Culprit and victim -- DNA topoisomerase II, Lancet Oncol., 2002, 3, 235-243)、それはTOP2A遺伝子座での特定の遺伝子異常に依存することが示されている (Jarvinen, TA and Liu, ET; Simultaneous amplification of HER-2 (ERBB2) and topoisomerase IIalpha (TOP2A) genes--molecular basis for combination chemotherapy in cancer, Curr.Cancer Drug Targets., 2006, 6, 579-602)。

TOP2Aなしには、DNAの複製も細胞分裂も不可能である。このため、TOP2Aは、細胞殺傷の正確なメカニズムが未解明であるにもかかわらず、多くの抗腫瘍療法レジメンの主要な標的となっている(Kellner, U, Sehested, M, Jensen, PB, Gieseler, F, and Rudolph, P; Culprit and victim -- DNA topoisomerase II, Lancet Oncol., 2002, 3, 235-243)。このアプローチの成功は自然耐性の進行によって制限され、また、薬品に誘発されるDNAの損傷が悪性度を高める可能性がある。

TOP-001の第2の潜在タンパク質源であるTOP2Bは、腫瘍が頻繁に増幅する染色体部位としては知られていない3ｐ24にあるため、癌研究でさほど注目されてこなかった。しかし、TOP2BはTOP2Aに類似した一次構造であり、ほぼ同一の触媒特性を有する (Leontiou, C, Lightowlers, R, Lakey, JH, and Austin, CA; Kinetic analysis of human topoisomerase IIalpha and beta DNA binding by surface plasmon resonance, FEBS Lett., 2003, 554, 206-210)。さらに別の研究で、両方のイソフォームが相互置換可能であることも示されている (Sakaguchi, A and Kikuchi, A; Functional compatibility between isoform alpha and beta of type II DNA topoisomerase, J Cell Sci., 2004, 117, 1047-1054)。

本発明において、その発明者らは、HLAクラスI分子に十分結合する腫瘍関連ペプチドに、ヒトCD8陽性細胞傷害性Tリンパ球が媒介する免疫応答を引き出す能力があることを裏付ける決定的証拠を提供し、かつ、本請求項のペプチドが、腫瘍細胞ペプチドームの選択的ペプチドに対してヒト免疫系の応答を起動するために適していることを実証する。

同様に、HLAクラスII分子に十分結合する腫瘍関連ペプチド、特にヒトゲノムのHLA DR座によって遺伝的にエンコードされるHLAクラスIIの対立遺伝子に、ヒトCD4陽性T細胞により媒介される免疫応答を引き出す能力があることがわかった。 CD4陽性T細胞がヒト末梢血から単離されたことは、腫瘍細胞ペプチドームの選択的ペプチドに対するヒト免疫系のT細胞応答を起動するために該請求項のペプチドが適していることを実証している。以下にペプチドTGFBI-004を例に挙げて説明するように、このHLA-DRと結合する腫瘍関連ペプチドはCD4陽性T細胞によって認識されることがわかった。

ペプチドは化学合成が可能であり、製薬の有効医薬成分として使用可能であるので、本発明が提供する該ペプチドは免疫療法、好ましくは癌の免疫療法に使用可能である。

別の態様において、該医薬組成物は、配列番号８〜配列番号１５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むもしくは配列番号８〜配列番号１５に少なくとも80％相同性のある変異アミノ酸配列を含む少なくとも1つの追加的ペプチド、もしくは配列番号８〜配列番号１５またはその変異アミノ酸配列をコードする核酸を含むポリヌクレオチドをさらに有する。配列番号８〜配列番号１３および１５のペプチドは、先に特定済みの免疫原性ペプチドであり、MHCクラスIおよびMHCクラスII分子に結合する (表２を参照)。

これらのペプチドは腎臓細胞癌 (RCC)患者の生体内でT細胞応答を引き出すことが示されている (H. Singh-Jasuja, S. Walter, T. Weinschenk, A. Mayer, P. Y. Dietrich, M. Staehler, A. Stenzl, S. Stevanovic, H. Rammensee, J. Frisch; Correlation of T-cell response, clinical activity and regulatory T-cell levels in renal cell carcinoma patients treated with IMA901, a novel multi-peptide vaccine; ASCO Meeting 2007 Poster # 3017; M. Staehler, A. Stenzl, P. Y. Dietrich, T. Eisen, A. Haferkamp, J. Beck, A. Mayer, S. Walter, H. Singh, J. Frisch, C. G. Stief; An open label study to evaluate the safety and immunogenicity of the peptide based cancer vaccine IMA901, ASCO meeting 2007; Poster # 3017)。親タンパク質はRCCだけでなくCRCおよび他のタイプの癌でも過剰発現するので、これらのペプチドは他の腫瘍型を治療するワクチン、特に抗CRCワクチンにも有用である。

表2: 本発明の組成物において有用なその他の免疫原性ペプチド

癌胎児性抗原に関係した細胞接着分子5
癌胎児性抗原(CEA = CEACAM5)は、180kDaで激しくグリコシル化された膜タンパク質であり、N末端 Ig V様の部位とC末端部位の間に挟まれた3つのC2 Ig様の反復単位から成り、グリコホスファチジルイノシトル結合部位を含む (Hegde, P, Qi, R, Gaspard, R, Abernathy, K, Dharap, S, Earle-Hughes, J, Gay, C, Nwokekeh, NU, Chen, T, Saeed, AI, Sharov, V, Lee, NH, Yeatman, TJ, and Quackenbush, J; Identification of tumour markers in models of human colorectal cancer using a 19,200-element complementary DNA microarray, Cancer Res., 2001, 61, 7792-7797)。

癌胎児性抗原であるCEAは、胎児発育中に発現するが、低レベルでは成人の胃腸器官上皮にも発現する。しかし、CEAは、胃腸器官癌、結腸直腸癌、膵臓癌の90％、非小細胞肺癌細胞の70％、乳癌の50％と、ヒト腫瘍に高い割合で過剰発現する(Thompson, JA, Grunert, F, and Zimmermann, W; Carcinoembryonic antigen gene family: molecular biology and clinical perspectives, J Clin Lab Anal., 5, 344-366 2005)。 CEAは腫瘍細胞で高発現し血清に分泌するため、腫瘍マーカーとして広く用いられてきた(Sikorska, H, Shuster, J, and Gold, P; Clinical applications of carcinoembryonic antigen, Cancer Detect.Prev., 12, 321-355 1988) また、結腸直腸癌監視の標準血清マーカーである(Locker, GY, Hamilton, S, Harris, J, Jessup, JM, Kemeny, N, Macdonald, JS, Somerfield, MR, Hayes, DF, and Bast, RC, Jr.; ASCO 2006 update of recommendations for the use of tumour markers in gastrointestinal cancer, J Clin Oncol, 24, 5313-5327, 2006)。

CEAは腫瘍細胞で過剰発現するにもかかわらず、癌患者はこの抗原に対する免疫応答を通常示さない(Orefice, S, Fossati, G, Pietrojusti, E, and Bonfanti, G; Delayed cutaneous hypersensitivity reaction to carcinoembryonic antigen in cancer patients, Tumouri, 1982, 68, 473-475,)。通常、CEAは身体に低レベルで発現しているので、免疫系はCEAに対して耐性を得るのが普通である。しかし、一連のワクチン治験で、CEAの免疫原性が実証された (Sarobe, P, Huarte, E, Lasarte, JJ, and Borras-Cuesta, F; Carcinoembryonic antigen as a target to induce anti-tumour immune responses, Curr. Cancer Drug Targets., 2004, 4, 443-454)。特に、結腸直腸癌 (CRC)で顕著であった (Mosolits, S, Ullenhag, G, and Mellstedt, H; Therapeutic vaccination in patients with gastrointestinal malignancies.A review of immunological and clinical results, Ann.Oncol., 2005, 16, 847-862)。また、CEAは、この腫瘍型で試された中で最大数のワクチンプラットフォームを持つ腫瘍関連抗原 (TAA)である (von Mehren, M; Colorectal cancer vaccines: what we know and what we don't yet know, Semin. Oncol., 2005, 32, 76-84)。

CEAのいくつかの細胞傷害性およびヘルパーT細胞エピトープの記述があり (Crosti, M, Longhi, R, Consogno, G, Melloni, G, Zannini, P, and Protti, MP; Identification of novel subdominant epitopes on the carcinoembryonic antigen recognized by CD4+ T-cells of lung cancer patients, J Immunol., 2006, 176, 5093-5099; Novellino, L, Castelli, C, and Parmiani, G; A listing of human tumour antigens recognized by T-cells: March 2004 update, Cancer Immunol.Immunother., 2004, 54, 187-207; Ruiz, M, Kobayashi, H, Lasarte, JJ, Prieto, J, Borras-Cuesta, F, Celis, E, and Sarobe, P; Identification and characterization of a T-helper peptide from carcinoembryonic antigen, Clin Cancer Res., 2004, 10, 2860-2867)、 CRCに対しペプチドを使用した様々なワクチン接種治験が可能となった (Babatz, J, Rollig, C, Lobel, B, Folprecht, G, Haack, M, Gunther, H, Kohne, CH, Ehninger, G, Schmitz, M, and Bornhauser, M; Induction of cellular immune responses against carcinoembryonic antigen in patients with metastatic tumours after vaccination with altered peptide ligand-loaded dendritic cells, Cancer Immunol.Immunother., 2006, 55, 268-276; Fong, L, Hou, Y, Rivas, A, Benike, C, Yuen, A, Fisher, GA, Davis, MM, and Engleman, EG; Altered peptide ligand vaccination with Flt3 ligand expanded dendritic cells for tumour immunotherapy, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A, 2001, 98, 8809-8814; Liu, KJ, Wang, CC, Chen, LT, Cheng, AL, Lin, DT, Wu, YC, Yu, WL, Hung, YM, Yang, HY, Juang, SH, and Whang-Peng, J; Generation of carcinoembryonic antigen (CEA)-specific T-cell responses in HLA-A*0201 and HLA-A*2402 late-stage colorectal cancer patients after vaccination with dendritic cells loaded with CEA peptides, Clin Cancer Res., 2004, 10, 2645-2651; Matsuda, K, Tsunoda, T, Tanaka, H, Umano, Y, Tanimura, H, Nukaya, I, Takesako, K, and Yamaue, H; Enhancement of cytotoxic T-lymphocyte responses in patients with gastrointestinal malignancies following vaccination with CEA peptide-pulsed dendritic cells, Cancer Immunol. Immunother., 2004, 53, 609-616; Ueda, Y, Itoh, T, Nukaya, I, Kawashima, I, Okugawa, K, Yano, Y, Yamamoto, Y, Naitoh, K, Shimizu, K, Imura, K, Fuji, N, Fujiwara, H, Ochiai, T, Itoi, H, Sonoyama, T, Hagiwara, A, Takesako, K, and Yamagishi, H; Dendritic cell-based immunotherapy of cancer with carcinoembryonic antigen-derived, HLA-A24-restricted CTL epitope: Clinical outcomes of 18 patients with metastatic gastrointestinal or lung adenocarcinomas, Int. J Oncol., 2004, 24, 909-917; Weihrauch, MR, Ansen, S, Jurkiewicz, E, Geisen, C, Xia, Z, Anderson, KS, Gracien, E, Schmidt, M, Wittig, B, Diehl, V, Wolf, J, Bohlen, H, and Nadler, LM; Phase I/II combined chemoimmunotherapy with carcinoembryonic antigen-derived HLA-A2-restricted CAP-1 peptide and irinotecan, 5-fluorouracil, and leucovorin in patients with primary metastatic colorectal cancer, Clin Cancer Res., 2005, 11, 5993-6001)。これまでに行われたこれらおよび他の治験は、CEAワクチン接種の安全性と、この抗原に対する免疫応答の誘発の証拠を示している (von Mehren, M; Colorectal cancer vaccines: what we know and what we don't yet know, Semin.Oncol., 2005, 32, 76-84)。

すでに、CEA-006の変異形は公開されている (Ruiz, M, Kobayashi, H, Lasarte, JJ, Prieto, J, Borras-Cuesta, F, Celis, E, and Sarobe, P; Identification and characterization of a T-helper peptide from carcinoembryonic antigen, Clin Cancer Res., 2004, 10, 2860-2867)。 CEA-005は、単一のアミノ酸交換がある変異形であり、中枢性免疫耐性を克服することが報告されている (Zaremba, S, Barzaga, E, Zhu, M, Soares, N, Tsang, KY, and Schlom, J; Identification of an enhancer agonist cytotoxic T lymphocyte peptide from human carcinoembryonic antigen, Cancer Res., 1997, 57, 4570-4577)。

形質転換成長因子、β誘発性 (TGFBI)
TGFBIは、TGFβ誘発性遺伝子としてヒトの肺腺癌細胞株で最初に特定された。分泌された細胞外基質タンパク質のエンコードをするもので、細胞接着と細胞外基質組成に作用すると考えられている。

TGFBIは、結腸直腸癌で最も激しく発現上昇する遺伝子の１つであることが示されており、腺腫にも高レベルで発現する。定量PCRの結果は、未精製腫瘍細胞と精製腫瘍上皮細胞の両方に高い上昇を示した。したがって、in situのハイブリダイゼーション実験では、TGFBIが間質および上皮のどちらのコンパートメントでも多くの細胞型で発現することが明らかになった (Buckhaults, P, Rago, C, St, CB, Romans, KE, Saha, S, Zhang, L, Vogelstein, B, and Kinzler, KW; Secreted and cell surface genes expressed in benign and malignant colorectal tumours, Cancer Res., 2001, 61, 6996-7001)。

結腸直腸癌の遺伝子発現を調査する研究のメタ分析では、TGFBIは、 (TGFBIの4つの研究で)繰り返し上方調節されると報告されているわずか９つの遺伝子の１つとして特定されている (Shih, W, Chetty, R, and Tsao, MS; Expression profiling by microarrays in colorectal cancer, Oncol.Rep., 2005, 13, 517-524)。

ヒトの膵臓組織で、膵臓癌のTGFBI mRNAレベルは、正常な対照組織に比べ32．4倍増加した。 in situハイブリダイゼーション分析により、TGFBI mRNAは主に膵臓腫瘤内の癌細胞で発現することが明らかになった (Schneider, D, Kleeff, J, Berberat, PO, Zhu, Z, Korc, M, Friess, H, and Buchler, MW; Induction and expression of betaig-h3 in pancreatic cancer cells, Biochim.Biophys.Acta, 2002, 1588, 1-6)。

TGFBIは血管形成促進遺伝子としてin vitroモデルで特定された。加えて、いくつかの腫瘍にTGFBIの発現の劇的な強調が見られた。 TGFBIに対するアンチセンス・オリゴヌクレオチドがin vitroで遺伝子発現と上皮管形成の両方を遮断したことは、TGFBIが上皮細胞と基質の相互作用において重要な役割を果たしている可能性を示唆している (Aitkenhead, M, Wang, SJ, Nakatsu, MN, Mestas, J, Heard, C, and Hughes, CC; Identification of endothelial cell genes expressed in an in vitro model of angiogenesis: induction of ESM-1, (beta)ig-h3, and NrCAM, Microvasc. Res., 2002, 63, 159-171 )。

ムチン1 (MUC1)
ムチンは高分子量の上皮糖タンパク質であり、トレオニン、セリン、プロリンの豊富なタンデムリピートペプチドにO-グリコシド結合したクラスター化されたオリゴ糖の含有量が高い。ムチンは、構造的および機能的に異なる明確な２つのクラスに分けられる。膜貫通ムチンと分泌型ゲル形成ムチンであり、MUC1は前者に属する。結腸癌ムチンは、炭水化物の構造に違いがあり、診断および予後マーカーとして、また癌ワクチンの標的として研究されている。

MUC1タンパク質の細胞外ドメインは、よく保存された20のアミノ酸リピートで作られており、実際の数は対立遺伝子によって異なり、25〜100である。各タンデムリピートはグリコシル化潜在部位を5つ含み、トレオニンとセリンのダブレットの間に、様々な抗MUC1抗体により認識されるエピトープを含む免疫優勢部位がある (Taylor-Papadimitriou, J, Burchell, J, Miles, DW, and Dalziel, M; MUC1 and cancer, Biochim. Biophys. Acta, 1999, 1455, 301-313)。

他のほとんどの上皮に比べ、結腸のMUC1はより激しくグリコシル化されているため、MUC1特異的抗体による免疫組織化学的染色に必要なMUC1タンパク質がマスクされる。結腸直腸腺癌ではMUC1のグリコシル化がより少ないので、免疫検出が可能である。異常にグリコシル化されたMUC1は新しい結合特性を与え、ある程度の分子特異性を持って接着分子との結合の媒介と遮断を同時に行うことができるので、腫瘍細胞の転移において二重の役割を果たすことができる (McDermott, KM, Crocker, PR, Harris, A, Burdick, MD, Hinoda, Y, Hayashi, T, Imai, K, and Hollingsworth, MA; Overexpression of MUC1 reconfigures the binding properties of tumor cells, Int. J Cancer, 2001, 94, 783-791)。

免疫学的に検出されるMUC1が結腸癌で発現を増すことは予後の悪化と相関しており (Byrd, JC and Bresalier, RS; Mucins and mucin binding proteins in colorectal cancer, Cancer Metastasis Rev., 2004, 23, 77-99)、このことはMUC1の上方調節がCRCの進行に関与している可能性を示唆している。転移のない結腸癌に比べ、転移のある結腸癌はMUC1を強く発現し (Nakamori, S, Ota, DM, Cleary, KR, Shirotani, K, and Irimura, T; MUC1 mucin expression as a marker of progression and metastasis of human colorectal carcinoma, Gastroenterology, 1994, 106, 353-361)、また、１つの研究で、肝臓が関与する全ての結腸直腸癌でMUC1の染色は陽性であった(Matsuda, K, Masaki, T, Watanabe, T, Kitayama, J, Nagawa, H, Muto, T, and Ajioka, Y; Clinical significance of MUC1 and MUC2 mucin and p53 protein expression in colorectal carcinoma, Jpn. J Clin Oncol., 2000, 30, 89-94)。結腸直腸癌患者462人を対象とした最近の研究では、MUC1の発現が貧しい予後の独立予後マーカーとなることが発見された (Duncan, TJ, Watson, NF, Al-Attar, AH, Scholefield, JH, and Durrant, LG; The role of MUC1 and MUC3 in the biology and prognosis of colorectal cancer, World J Surg. Oncol, 2007, 5, 31)。

CRCでの抗MUC1循環抗体には病態生理学的重要性がある。抗MUC1抗体は、健康な被験者31人中5人 (16．1％)に検出され、結腸直腸癌患者56人中27人 (48．2％)に検出された (Nakamura, H, Hinoda, Y, Nakagawa, N, Makiguchi, Y, Itoh, F, Endo, T, and Imai, K; Detection of circulating anti-MUC1 mucin core protein antibodies in patients with colorectal cancer, J Gastroenterol., 1998, 33, 354-361)。

抗体標的としての役割のほかに、MUC1は細胞傷害性T細胞の標的としても十分に確立されている。いくつかのレポートは、卵巣腫、乳房腫、膵臓腫、多発性骨髄腫からの細胞傷害性のMHC非拘束T細胞が、タンデムリピートに局在するMUC1タンパク質コアのエピトープを認識できることを実証した (Apostolopoulos, V and McKenzie, IF; Cellular mucins: targets for immunotherapy, Crit Rev. Immunol., 1994, 14, 293-309; Finn, OJ, Jerome, KR, Henderson, RA, Pecher, G, Domenech, N, Magarian-Blander, J, and Barratt-Boyes, SM; MUC1 epithelial tumor mucin-based immunity and cancer vaccines, Immunol. Rev., 1995, 145, 61-89; Barnd, DL, Lan, MS, Metzgar, RS, and Finn, OJ; Specific, major histocompatibility complex-unrestricted recognition of tumor-associated mucins by human cytotoxic T cells, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A, 1989, 86, 7159-7163; Takahashi, T, Makiguchi, Y, Hinoda, Y, Kakiuchi, H, Nakagawa, N, Imai, K, and Yachi, A; Expression of MUC1 on myeloma cells and induction of HLA-unrestricted CTL against MUC1 from a multiple myeloma patient, J. Immunol., 1994, 153, 2102-2109; Noto, H, Takahashi, T, Makiguchi, Y, Hayashi, T, Hinoda, Y, and Imai, K; Cytotoxic T lymphocytes derived from bone marrow mononuclear cells of multiple myeloma patients recognize an underglycosylated form of MUC1 mucin, Int. Immunol., 1997, 9, 791-798)。しかし、MUC1タンパク質に由来するHLA-A*02拘束T細胞エピトープも特定された (Apostolopoulos, V, Karanikas, V, Haurum, JS, and McKenzie, IF; Induction of HLA-A2-restricted CTLs to the mucin 1 human breast cancer antigen, J Immunol., 1997, 159, 5211-5218; Brossart, P, Heinrich, KS, Stuhler, G, Behnke, L, Reichardt, VL, Stevanovic, S, Muhm, A, Rammensee, HG, Kanz, L, and Brugger, W; Identification of HLA-A2-restricted T-cell epitopes derived from the MUC1 tumor antigen for broadly applicable vaccine therapies, Blood, 1999, 93, 4309-4317)。それらのペプチドの1つはMUC-001である。これは、MUC1のタンデムリピート部位に由来する。これらのMUC1ペプチドを使い、進行性乳癌または卵巣癌患者にペプチドパルス樹状細胞のワクチン接種を行い、生体内での細胞傷害性Tリンパ球応答の誘発に成功した(Brossart, P, Wirths, S, Stuhler, G, Reichardt, VL, Kanz, L, and Brugger, W; Induction of cytotoxic T-lymphocyte responses in vivo after vaccinations with peptide-pulsed dendritic cells, Blood, 2000, 96, 3102-3108; Wierecky, J, Mueller, M, and Brossart, P; Dendritic cell-based cancer immunotherapy targeting MUC1, Cancer Immunol. Immunother., 2005 Apr. 28: 288-94)。さらに、そのようなワクチン接種は、腎細胞癌患者での臨床応答の誘発にも成功した (Wierecky, J, Muller, MR, Wirths, S, Halder-Oehler, E, Dorfel, D, Schmidt, SM, Hantschel, M, Brugger, W, Schroder, S, Horger, MS, Kanz, L, and Brossart, P; Immunologic and clinical responses after vaccinations with peptide-pulsed dendritic cells in metastatic renal cancer patients, Cancer Res., 2006, 66, 5910-5918)。

結腸直腸癌での免疫反応性MUC1の上方調節は、ほとんどがmRNA過剰発現に基づくものではなく、むしろ、グリコシル化の低減によって、特にMUC1のタンデムリピート部位で抗体認識のためのエピトープがむき出されることによるものであった。このグリコシル化の低減は、同時に、腫瘍細胞での改変した抗原処理 (正常細胞ではグリコシル化によって防がれている)によるT細胞エピトープの生成の機会を提供する。このメカニズムによって、mRNAの過剰発現が強くないにもかかわらず腫瘍関連T細胞エピトープとして優れたMUC-001の特徴が解明される可能性がある。グリコシル化の改変が実際に抗原処理に影響する可能性を裏付ける一部の証拠は、特異的に腫瘍糖型を認識する受容体を介して実際に結腸直腸癌でのMUC1のグリコシル化の変化が検出可能であるという最近の観察によるものである (Saeland, E, van Vliet, SJ, Backstrom, M, van, dB, V, Geijtenbeek, TB, Meijer, GA, and van, KY; 2006, The C-type lectin MGL expressed by dendritic cells detects glycan changes on MUC1 in colon carcinoma, Cancer Immunol.Immunother., 2007, 56(8): 1225-36)。抗原提示細胞による腫瘍糖型の特異的摂取および処理は、自然の状態で (免疫付与をせずに)乳癌患者 (Rentzsch, C, Kayser, S, Stumm, S, Watermann, I, Walter, S, Stevanovic, S, Wallwiener, D, and Guckel, B; Evaluation of pre-existent immunity in patients with primary breast cancer: molecular and cellular assays to quantify antigen-specific T lymphocytes in peripheral blood mononuclear cells, Clin Cancer Res., 2003, 9, 4376-4386) および結腸直腸癌患者 (Dittmann, J, Keller-Matschke, K, Weinschenk, T, Kratt, T, Heck, T, Becker, HD, Stevanovic, S, Rammensee, HG, and Gouttefangeas, C; CD8+ T-cell response against MUC1-derived peptides in gastrointestinal cancer survivors, Cancer Immunol. Immunother., 2005, 54, 750-758)でMUC-001特異性のT細胞が観察されたという事実の説明にもなり得る。これらの患者で、自己免疫効果は報告されていない。このことは、特異的T細胞を誘発する腫瘍関連ペプチドとしてのMUC-001の天然の役割を実証し、かつ、mRNAレベルでMUC1抗原の過剰発現が検出できなくともMUC-001の投与が安全と見なされる可能性を示唆する。

Metプロトオンコジーン (肝細胞成長因子受容体) (c-Met)
METプロトオンコジーンタンパク質産物は、肝細胞成長因子受容体である。細胞の増殖、運動性、接着、浸潤に関わるシグナル伝達経路を活性化するチロシンキナーゼドメインを含有する (Trusolino, L and Comoglio, PM; Scatter-factor and semaphorin receptors: cell signalling for invasive growth, Nat. Rev. Cancer, 2002, 2, 289-300)。

様々な腫瘍型での研究は、HGF/c-Met自己分泌ループ、活性点変異、TPR-Met融合タンパク質、およびc-Metからαおよびβ鎖への開裂の失敗を含む、c-Met活性化のいくつかのメカニズムを実証した (Di Renzo, MF, Olivero, M, Martone, T, Maffe, A, Maggiora, P, Stefani, AD, Valente, G, Giordano, S, Cortesina, G, and Comoglio, PM; Somatic mutations of the MET oncogene are selected during metastatic spread of human HNSC carcinomas, Oncogene, 2000, 19, 1547-1555; Ebert, M, Yokoyama, M, Friess, H, Buchler, MW, and Korc, M; Coexpression of the c-met proto-oncogene and hepatocyte growth factor in human pancreatic cancer, Cancer Res., 1994, 54, 5775-5778; Mondino, A, Giordano, S, and Comoglio, PM; Defective posttranslational processing activates the tyrosine kinase encoded by the MET proto-oncogene (hepatocyte growth factor receptor), Mol. Cell Biol., 1991, 11, 6084-6092; Olivero, M, Valente, G, Bardelli, A, Longati, P, Ferrero, N, Cracco, C, Terrone, C, Rocca-Rossetti, S, Comoglio, PM, and Di Renzo, MF; Novel mutation in the ATP-binding site of the MET oncogene tyrosine kinase in a HPRCC family, Int. J Cancer, 1999, 82, 640-643; Park, M, Dean, M, Cooper, CS, Schmidt, M, O'Brien, SJ, Blair, DG, and Vande Woude, GF; Mechanism of met oncogene activation, Cell, 1986, 45, 895-904; Park, WS, Dong, SM, Kim, SY, Na, EY, Shin, MS, Pi, JH, Kim, BJ, Bae, JH, Hong, YK, Lee, KS, Lee, SH, Yoo, NJ, Jang, JJ, Pack, S, Zhuang, Z, Schmidt, L, Zbar, B, and Lee, JY; 1999, Somatic mutations in the kinase domain of the Met/hepatocyte growth factor receptor gene in childhood hepatocellular carcinomas, Cancer Res., 59, 307-310; Rahimi, N, Tremblay, E, McAdam, L, Park, M, Schwall, R, and Elliott, B; 1996, Identification of a hepatocyte growth factor autocrine loop in a murine mammary carcinoma, Cell Growth Differ., 7, 263-270;Schmidt, L, Duh, FM, Chen, F, Kishida, T, Glenn, G, Choyke, P, Scherer, SW, Zhuang, Z, Lubensky, I, Dean, M, Allikmets, R, Chidambaram, A, Bergerheim, UR, Feltis, JT, Casadevall, C, Zamarron, A, Bernues, M, Richard, S, Lips, CJ, Walther, MM, Tsui, LC, Geil, L, Orcutt, ML, Stackhouse, T, Lipan, J, Slife, L, Brauch, H, Decker, J, Niehans, G, Hughson, MD, Moch, H, Storkel, S, Lerman, MI, Linehan, WM, and Zbar, B; 1997, Germline and somatic mutations in the tyrosine kinase domain of the MET proto-oncogene in papillary renal carcinomas, Nat.Genet., 16, 68-73; Schmidt, L, Junker, K, Weirich, G, Glenn, G, Choyke, P, Lubensky, I, Zhuang, Z, Jeffers, M, Vande, WG, Neumann, H, Walther, M, Linehan, WM, and Zbar, B; 1998, Two North American families with hereditary papillary renal carcinoma and identical novel mutations in the MET proto-oncogene, Cancer Res., 58, 1719-1722)。機構的には、c-Met過剰発現は発癌Ki-ras変異と協力して、生体内の結腸癌細胞の腫瘍原性を強化する (Long, IS, Han, K, Li, M, Shirasawa, S, Sasazuki, T, Johnston, M, and Tsao, MS; Met receptor overexpression and oncogenic Ki-ras mutation cooperate to enhance tumorigenicity of colon cancer cells in vivo, Mol.Cancer Res., 2003, 1, 393-401)。

興味深いことに、METシグナルと、結腸癌で頻繁に上方調節されるWnt/βカテニン経路との相互作用の証拠がいくつかある。 METはプロスタグランジンE2 (PGE2)により活性化され得るもので、PGE2で活性されたc-Metはβカテニンと関連してそのチロシンリン酸化反応を増すことによって結腸癌細胞の浸潤を誘発する (Pai, R, Nakamura, T, Moon, WS, and Tarnawski, AS; Prostaglandins promote colon cancer cell invasion; signaling by cross-talk between two distinct growth factor receptors, FASEB J, 2003, 17, 1640-1647)。最近、METとβカテニンの相互活性について説明され、結腸直腸腫瘍形成において重要な役割を果たすこれら2つの物質間のポジティブなフィードバックループが得られた (Rasola, A, Fassetta, M, De, BF, D'Alessandro, L, Gramaglia, D, Di Renzo, MF, and Comoglio, PM; A positive feedback loop between hepatocyte growth factor receptor and beta-catenin sustains colorectal cancer cell invasive growth, Oncogene, 2007, 26, 1078-1087)。

原発CRC腫瘍でのmRNA発現レベル (n＝36)は、早期ステージ浸潤および部分的転移の重要な予測マーカーであり、結腸癌のステージと直接相関する (Takeuchi, H, Bilchik, A, Saha, S, Turner, R, Wiese, D, Tanaka, M, Kuo, C, Wang, HJ, and Hoon, DS; c-MET expression level in primary colon cancer: a predictor of tumor invasion and lymph node metastases, Clin Cancer Res., 2003, 9, 1480-1488)。 130のCRC標本でのc-Met発現の別の分析で、原発CRCの69％に過剰発現 (T/N > 2.0)が見られ、血管浸潤を伴うCRC (P = 0.04)および進行ステージ (P = 0.04)のCRCに有意に高いc-Metレベルが示されたことは、ヒトのCRCの進行および転移におけるc-Metの役割を裏付けている (Zeng, Z, Weiser, MR, D'Alessio, M, Grace, A, Shia, J, and Paty, PB; Immunoblot analysis of c-Met expression in human colorectal cancer: overexpression is associated with advanced stage cancer, Clin Exp. Metastasis, 2004, 21, 409-417)。別の研究では、隣接の正常粘膜に比べ結腸腺癌60例の69％に2倍以上、48％に10倍以上のc-Met mRNAの上昇が示された (Kammula, US, Kuntz, EJ, Francone, TD, Zeng, Z, Shia, J, Landmann, RG, Paty, PB, and Weiser, MR; Molecular co-expression of the c-Met oncogene and hepatocyte growth factor in primary colon cancer predicts tumor stage and clinical outcome, Cancer Lett., 2007, 248, 219-228)。したがって、c-Metシグナルの上昇は、CRC早期ステージでよく発生するが、進行および転移ステージでは発現がさらに高まる。

サイクリンD1(CCND1)
CCND1は、非常によく保存されるサイクリンファミリーに属する。サイクリンファミリーの特徴は、細胞周期全体を通してタンパク質量に劇的な周期性があることである。サイクリンはCDKキナーゼの調節剤として機能する。サイクリンによって異なる明確な発現と分解のパターンは、各分裂イベントの時間整合に寄与する。このサイクリンは、細胞周期のG1/S遷移に必要な活性を提供するCDK4またはCDK6との複合体を形成し、また、それらの調節サブユニットとして機能する。細胞周期の進行を改変するこの遺伝子の変異、増幅、過剰発現は、様々な腫瘍に頻繁に観察されており、腫瘍形成に寄与する可能性がある (Fu, M, Wang, C, LI, Z, Sakamaki, T, and Pestell, RG; Minireview: Cyclin D1: normal and abnormal functions, Endocrinology, 2004, 145, 5439-5447)。

A/G共有の単一ヌクレオチド多型 (A870G)は、２つの特異なmRNAイソフォームaおよびｂを生む。交互にスプライスされたイソフォームｂは、肺癌、結腸癌、および他のタイプの癌を含む腫瘍の発生率の増加に関係する短縮タンパク質をコードする (Fu, M, Wang, C, LI, Z, Sakamaki, T, and Pestell, RG; Minireview: Cyclin D1: normal and abnormal functions, Endocrinology, 2004, 145, 5439-5447)。

結腸直腸癌では、mRNAおよびタンパク質レベルでのCCND1の過剰発現は頻繁に記述されている (Sutter, T, Doi, S, Carnevale, KA, Arber, N, and Weinstein, IB; Expression of cyclins D1 and E in human colon adenocarcinomas, J Med, 1997, 28, 285-309; Mermelshtein, A, Gerson, A, Walfisch, S, Delgado, B, Shechter-Maor, G, Delgado, J, Fich, A, and Gheber, L; Expression of D-type cyclins in colon cancer and in cell lines from colon carcinomas, Br. J Cancer, 2005, 93, 338-345; Balcerczak, E, Pasz-Walczak, G, Kumor, P, Panczyk, M, Kordek, R, Wierzbicki, R, and Mirowski, M; Cyclin D1 protein and CCND1 gene expression in colorectal cancer, Eur.J Surg.Oncol., 2005, 31, 721-726; Bondi, J, Husdal, A, Bukholm, G, Nesland, JM, Bakka, A, and Bukholm, IR; Expression and gene amplification of primary (A, B1, D1, D3, and E) and secondary (C and H) cyclins in colon adenocarcinomas and correlation with patient outcome, J Clin Pathol., 2005, 58, 509-514; Perez, R, Wu, N, Klipfel, AA, and Beart, RW, Jr.; A better cell cycle target for gene therapy of colorectal cancer: cyclin G, J Gastrointest. Surg., 2003, 7, 884-889; Wong, NA, Morris, RG, McCondochie, A, Bader, S, Jodrell, DI, and Harrison, DJ; Cyclin D1 overexpression in colorectal carcinoma in vivo is dependent on beta-catenin protein dysregulation, but not k-ras mutation, J Pathol., 2002, 197, 128-135; McKay, JA, Douglas, JJ, Ross, VG, Curran, S, Murray, GI, Cassidy, J, and McLeod, HL; Cyclin D1 protein expression and gene polymorphism in colorectal cancer. Aberdeen Colorectal Initiative, Int.J Cancer, 2000, 88, 77-81; Bartkova, J, Lukas, J, Strauss, M, and Bartek, J; The PRAD-1/cyclin D1 oncogene product accumulates aberrantly in a subset of colorectal carcinomas, Int. J Cancer, 1994, 58, 568-573)。

このことは、CCND1が結腸直腸癌で頻繁に上方調節されるβカテニンTCF/LEF経路の標的遺伝子であるという周知の事実によって説明できる (Shtutman, M, Zhurinsky, J, Simcha, I, Albanese, C, D'Amico, M, Pestell, R, and Ben-Ze'ev, A; The cyclin D1 gene is a target of the beta-catenin/LEF-1 pathway, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A, 1999, 96, 5522-5527; Tetsu, O and McCormick, F; Beta-catenin regulates expression of cyclin D1 in colon carcinoma cells, Nature, 1999, 398, 422-426)。

CCND1の強発現は、高腫瘍グレード、転移、および生存率低下と関係づけられた (Balcerczak, E, Pasz-Walczak, G, Kumor, P, Panczyk, M, Kordek, R, Wierzbicki, R, and Mirowski, M; Cyclin D1 protein and CCND1 gene expression in colorectal cancer, Eur. J Surg. Oncol., 2005, 31, 721-726; Bahnassy, AA, Zekri, AR, El-Houssini, S, El-Shehaby, AM, Mahmoud, MR, Abdallah, S, and El-Serafi, M; Cyclin A and cyclin D1 as significant prognostic markers in colorectal cancer patients, BMC. Gastroenterol., 2004, 4, 22; McKay, JA, Douglas, JJ, Ross, VG, Curran, S, Murray, GI, Cassidy, J, and McLeod, HL; Cyclin D1 protein expression and gene polymorphism in colorectal cancer. Aberdeen Colorectal Initiative, Int. J Cancer, 2000, 88, 77-81; Maeda, K, Chung, Y, Kang, S, Ogawa, M, Onoda, N, Nishiguchi, Y, Ikehara, T, Nakata, B, Okuno, M, and Sowa, M; Cyclin D1 overexpression and prognosis in colorectal adenocarcinoma, Oncology, 1998, 55, 145-151)。

マトリックスメタロペプチダーゼ7 (マトリリシン、子宮) (MMP7)
マトリックスメタロプロティナーゼ (MMP)は、構造的に関係する亜鉛依存型プロティナーゼを含む大きなファミリーであり、通常、細胞外基質の構成要素を分解する能力があるとされている。腫瘍での発現増加を示す個々のMMPがすでに特定されており、ほとんどの腫瘍はMMP活性の強化を示している (Curran, S and Murray, GI; 1999, Matrix metalloproteinases in tumour invasion and metastasis, J Pathol., 189, 300-308; Curran, S and Murray, GI; 2000, Matrix metalloproteinases: molecular aspects of their roles in tumour invasion and metastasis, Eur.J Cancer, 36, 1621-1630)。

基底膜および細胞外基質は悪性浸潤に対する2つの物理的障害であり、MMPによるこれらの分解は腫瘍の進行と転移拡散において重要な役割を果たす (Johnsen, M, Lund, LR, Romer, J, Almholt, K, and Dano, K; 1998, Cancer invasion and tissue remodeling: common themes in proteolytic matrix degradation, Curr.Opin.Cell Biol., 10, 667-671; Nelson, AR, Fingleton, B, Rothenberg, ML, and Matrisian, LM; 2000, Matrix metalloproteinases: biologic activity and clinical implications, J Clin Oncol., 18, 1135-1149; Wang, FQ, So, J, Reierstad, S, and Fishman, DA; 2005, Matrilysin (MMP-7) promotes invasion of ovarian cancer cells by activation of progelatinase, Int.J Cancer, 114, 19-31)。この機能とは別に、腫瘍の発育と進行におけるMMPの関わり (アポトーシス、細胞増殖、細胞分化における役割を含む)が現在議論されている。これらの機能は、MMPを媒介とした非基質タンパク質のタンパク質分解およびそれらの酵素活性とは別の作用と関係している (Egeblad, M and Werb, Z; 2002, New functions for the matrix metalloproteinases in cancer progression, Nat.Rev.Cancer, 2, 161-174; Leeman, MF, Curran, S, and Murray, GI; 2003, New insights into the roles of matrix metalloproteinases in colorectal cancer development and progression, J.Pathol., 201, 528-534)。

最近の研究は、いくつかのマトリックスメタロプロティナーゼ、特にマトリリシン (MMP7)が、結腸直腸癌の発育に関わる特異な分子遺伝・シグナル伝達経路と相互作用することを示している。具体的には、マトリリシンは結腸直腸腫瘍形成の早期ステージでβカテニンシグナル伝達経路によって活性化される (Brabletz, T, Jung, A, Dag, S, Hlubek, F, and Kirchner, T; 1999, beta-catenin regulates the expression of the matrix metalloproteinase-7 in human colorectal cancer, Am.J Pathol., 155, 1033-1038; Leeman, MF, Curran, S, and Murray, GI; 2003, New insights into the roles of matrix metalloproteinases in colorectal cancer development and progression, J.Pathol., 201, 528-534; Zucker, S and Vacirca, J; 2004, Role of matrix metalloproteinases (MMPs) in colorectal cancer, Cancer Metastasis Rev., 23, 101-117)。

MMP7 は、良性および悪性の両方の結腸直腸腫瘍に過剰発現する。 (Ishikawa, T, Ichikawa, Y, Mitsuhashi, M, Momiyama, N, Chishima, T, Tanaka, K, Yamaoka, H, Miyazakic, K, Nagashima, Y, Akitaya, T, and Shimada, H; 1996, Matrilysin is associated with progression of colorectal tumor, Cancer Lett., 107, 5-10; McDonnell, S, Navre, M, Coffey, RJ, Jr., and Matrisian, LM; 1991, Expression and localization of the matrix metalloproteinase pump-1 (MMP-7) in human gastric and colon carcinomas, Mol.Carcinog., 4, 527-533; Miyazaki, K, Hattori, Y, Umenishi, F, Yasumitsu, H, and Umeda, M; 1990, Purification and characterization of extracellular matrix-degrading metalloproteinase, matrin (pump-1), secreted from human rectal carcinoma cell line, Cancer Res., 50, 7758-7764; Nagashima, Y, Hasegawa, S, Koshikawa, N, Taki, A, Ichikawa, Y, Kitamura, H, Misugi, K, Kihira, Y, Matuo, Y, Yasumitsu, H, and Miyazaki, K; 1997, Expression of matrilysin in vascular endothelial cells adjacent to matrilysin-producing tumors, Int.J Cancer, 72, 441-445; Newell, KJ, Witty, JP, Rodgers, WH, and Matrisian, LM; 1994, Expression and localization of matrix-degrading metalloproteinases during colorectal tumorigenesis, Mol.Carcinog., 10, 199-206; Yoshimoto, M, Itoh, F, Yamamoto, H, Hinoda, Y, Imai, K, and Yachi, A; 1993, Expression of MMP-7(PUMP-1) mRNA in human colorectal cancers, Int.J Cancer, 54, 614-618)。 MMP7は、腫瘍細胞によって実際に分泌される数少ないMMPの1つである (Overall, CM and Kleifeld, O; 2006, Tumour microenvironment - opinion: validating matrix metalloproteinases as drug targets and anti-targets for cancer therapy, Nat.Rev.Cancer, 6, 227-239)。さらに、MMP7 mRNA発現レベルは、CRCの進行段階と相関する (Ishikawa, T, Ichikawa, Y, Mitsuhashi, M, Momiyama, N, Chishima, T, Tanaka, K, Yamaoka, H, Miyazakic, K, Nagashima, Y, Akitaya, T, and Shimada, H; 1996, Matrilysin is associated with progression of colorectal tumor, Cancer Lett., 107, 5-10; Mori, M, Barnard, GF, Mimori, K, Ueo, H, Akiyoshi, T, and Sugimachi, K; 1995, Overexpression of matrix metalloproteinase-7 mRNA in human colon carcinomas, Cancer, 75, 1516-1519)。 MMP7はCRCの転移においても重要な役割を果たす (Adachi, Y, Yamamoto, H, Itoh, F, Hinoda, Y, Okada, Y, and Imai, K; 1999, Contribution of matrilysin (MMP-7) to the metastatic pathway of human colorectal cancers, Gut, 45, 252-258; Mori, M, Barnard, GF, Mimori, K, Ueo, H, Akiyoshi, T, and Sugimachi, K; 1995, Overexpression of matrix metalloproteinase-7 mRNA in human colon carcinomas, Cancer, 75, 1516-1519)。

高MMP7血清レベルは、予後の貧しい進行性結腸直腸癌患者 (Maurel, J, Nadal, C, Garcia-Albeniz, X, Gallego, R, Carcereny, E, Almendro, V, Marmol, M, Gallardo, E, Maria, AJ, Longaron, R, Martinez-Fernandez, A, Molina, R, Castells, A, and Gascon, P; 2007, Serum matrix metalloproteinase 7 levels identifies poor prognosis advanced colorectal cancer patients, Int.J Cancer, Published Online: 8 May 2007 )およびCRC患者での過剰発現と関連付けられているほか、生存率の低減とも関連付けられており、腫細胞の開裂Fasによる免疫学的監視からの逃避を促進すると言われている (Wang, WS, Chen, PM, Wang, HS, Liang, WY, and Su, Y; 2006, Matrix metalloproteinase-7 increases resistance to Fas-mediated apoptosis and is a poor prognostic factor of patients with colorectal carcinoma, Carcinogenesis, 27, 1113-1120)。

本発明のタンパク質は、様々なタイプの癌において、腫瘍特異的免疫応答の標的となる可能性がある。

B型肝炎ウィルスコア抗原ペプチドHBV-001は、内因性ヒト腫瘍関連抗原に由来するものではなく、B型肝炎ウィルスコア抗原に由来する。第1に、それはTUMAPによって誘発されるT細胞応答の強度の定量的比較を可能にするので、抗腫瘍応答を引き出す能力に関する重要な結論を可能にする。第2に、患者にT細胞応答が欠如している場合に、重要な正の対照として機能する。そして第3に、患者の免疫能力ステータスについての結論も可能にする。

B型肝炎ウィルス (HBV)感染は、肝臓病の原因として最も多いものの1つであり、世界中で約3億5千万人の人が感染している (Rehermann, B and Nascimbeni, M; Immunology of hepatitis B virus and hepatitis C virus infection, Nat.Rev.Immunol., 2005, 5, 215-229)。容易に水平感染も垂直感染もし、肝硬変および肝細胞癌に至る場合のある慢性病の可能性を与えるHBVは、世界の多くの国の公衆衛生制度に大きな影響を与えている。 HBVゲノムは、(Previsani, N and Lavanchy, D; 2002, Hepatitis B, (Epidemic and Pandemic Alert and Response, World Health Organization, Geneva, 2002)) 部分的な環状二本鎖DNAを有する。 HBVゲノムは、コアタンパク質HBc および他のタンパク質と共にHBVビリオンに凝集して、脂質と表面タンパク質ファミリーHBを含む外側の包み (外膜タンパク質とも呼ばれる)に取り囲まれたヌクレオカプシドを形成している。 HBc およびHBsに関連する抗原決定基は、各々HbcAgおよびHbsAgである。これらの抗原は血清学的応答すなわち患者の血液における抗体応答に関連し、HBV感染の診断にとり臨床上最も有用な抗原抗体システムに含まれる。 HBcは、HBV感染の前歴がない全ての人にとり新規の外来抗原となる。免疫原性ペプチドはこの抗原で周知であるので、 (Bertoletti, A, Chisari, FV, Penna, A, Guilhot, S, Galati, L, Missale, G, Fowler, P, Schlicht, HJ, Vitiello, A, Chesnut, RC, and .; 1993, Definition of a minimal optimal cytotoxic T-cell epitope within the hepatitis B virus nucleocapsid protein, J.Virol., 67, 2376-2380;Livingston, BD, Crimi, C, Grey, H, Ishioka, G, Chisari, FV, Fikes, J, Grey, H, Chesnut, RW, and Sette, A; 1997, The hepatitis B virus-specific CTL responses induced in humans by lipopeptide vaccination are comparable to those elicited by acute viral infection, J.Immunol., 159, 1383-1392)IMA内のHbcAgからの10個のアミノ酸からなるペプチドを選択した。次に、HBcペプチドに特異なCTLを誘導して患者の免疫能力マーカーとして用い、ワクチン接種に成功した。

この医薬組成物は、効果を増すための追加的ペプチドおよび／または賦形剤をさらに含むが、これについて以下にさらに説明する。

本発明者らが言う、与えられたアミノ酸配列の「変異アミノ酸配列」とは、例えば、１または２のアミノ酸残基の側鎖が改変しており (例えば、それらが別の天然生成アミノ酸残基の側鎖または他の何らかの側鎖で置換されており)、該ペプチドが該与えられたアミノ酸配列からなるペプチドと実質的に同じようにHLA分子に結合可能であることを意味する。例えば、ペプチドを修飾することにより、該ペプチドがHLA-Aまたは-DRのような適切なMHC分子と相互作用し結合する能力を改善しないまでも少なくとも維持することができ、かつ、本発明の態様の中で定義するようなアミノ酸配列を含むポリペプチドを発現する細胞を認識して殺すことができる活性CTLを該ペプチドが生成する能力を改善しないまでも少なくとも維持することができる。該データベースから得られるように、HLA-A結合ペプチドの特定の位置は、通常、HLA結合溝の結合モチーフに適合するコア配列を形成するアンカー残基である。

T細胞受容体との相互作用に必須ではないアミノ酸残基を、組み込まれてもT細胞反応性に実質的に影響せず、関係MHCとの結合も削除しない別のアミノ酸と置換することによって修飾することができる。したがって、与えられた条件とは無関係に、本発明のペプチドとしては、与えられたアミノ酸配列またはそれらの一部または変異形を含む任意のペプチド (本発明者らがこう言う場合、オリゴペプチドまたはポリペプチドを含む)が可能である。

MHCクラスIIが提示するペプチドに関しさらに周知のように、これらのペプチドは「コア配列」からなるものであり、該コア配列は、その機能を妨害しない (すなわち該ペプチドと該T細胞との相互作用に無関係とされる)特定のHLA特異的アミノ酸モチーフ、および選択的にN-および／またはC-末端伸張を有する。該N-および／またはC-末端伸張は、例えば、各々1個から10個のアミノ酸を全長とすることができる。これらのペプチドを、MHCクラスII分子を負荷するために直接使うこと、または以下に説明するように、その配列をクローンしてベクターにすることができる。これらのペプチドは細胞内のより大きいペプチドの処理から得られる最終産物を形成するので、より長いペプチドを使うこともできる。本発明のペプチドとして任意のサイズが可能であるが、通常、それらのペプチドの分子量は100,000未満であり、好ましくは50,000未満であり、さらに好ましくは10,000未満であり、通常約5,000である。アミノ酸残基の数に関しては、本発明のペプチドは1,000残基未満であり、好ましくは500残基未満であり、より好ましくは100残基未満である。したがって、本発明は、ペプチドおよびその変異形の組成物も提供するものであり、該ペプチドまたは変異形の全長は8から100個のアミノ酸、好ましくは8から30個のアミノ酸、最も好ましくは8から16個、すなわち8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 または16 個のアミノ酸である。

したがって、本発明のペプチドとT細胞との交差反応を誘発する変異形は、しばしば、長さ変異形である。

約12個のアミノ酸残基より長いペプチドを直接用いてMHCクラスII分子を結合する場合、コアHLA結合部を挟む残基は、該ペプチドが該MHCクラスII分子結合溝と特異的に結合する能力または該ペプチドを該CTLに提示する能力に実質的に影響を与えないことが好ましい。しかし、すでに上述したように、より大きいペプチドを使用できることが評価される。特にポリヌクレオチドによってエンコードされる場合はそうであって、その理由は、より大きいペプチドは適切な抗原提示細胞によってフラグメント化できるからである。

また、MHCクラスIエピトープ (通常、長さは8から10個のアミノ酸であるが)を、実際に該エピトープを含む、より長いペプチドまたはタンパク質から処理されるペプチドによって生成することも可能である。 MHCクラスIIエピトープの場合と同様に、その結合部を挟む残基が、該MHCクラスI分子の結合溝に特異的に結合する能力または該ペプチドを該CTLに提示する能力に実質的に影響を与えないこと、およびタンパク分解切断のための場所をマスクしないことが好ましい。

したがって、本発明は、MHCクラスIエピトープのペプチドおよび変異形も提供するものであり、その全長は8から100個のアミノ酸、好ましくは8から30個のアミノ酸、最も好ましくは8から16個、すなわち8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 または16個のアミノ酸である。

当然、本発明のペプチドまたは変異形は、ヒト主要組織適合性複合体 (MHC)クラスIまたはIIの分子と結合する能力を持つであろう。当該技術分野で周知の方法により、MHC複合体とのペプチドまたは変異形の結合を試験することが可能であり、例えば、以下に本発明の実施例に記述されている方法や、異なるMHCクラスII対立遺伝子の文献に記述されている方法がある (例：Vogt AB, Kropshofer H, Kalbacher H, Kalbus M, Rammensee HG, Coligan JE, Martin R; Ligand motifs of HLA-DRB5*0101 and DRB1*1501 molecules delineated from self-peptides; J Immunol. 1994; 153(4):1665-1673; Malcherek G, Gnau V, Stevanovic S, Rammensee HG, Jung G, Melms A; Analysis of allele-specific contact sites of natural HLA-DR17 ligands; J Immunol. 1994; 153(3):1141-1149; Manici S, Sturniolo T, Imro MA, Hammer J, Sinigaglia F, Noppen C, Spagnoli G, Mazzi B, Bellone M, Dellabona P, Protti MP; Melanoma cells present a MAGE-3 epitope to CD4(+) cytotoxic T cells in association with histocompatibility leukocyte antigen DR11; J Exp Med. 1999; 189(5): 871-876; Hammer J, Gallazzi F, Bono E, Karr RW, Guenot J, Valsasnini P, Nagy ZA, Sinigaglia F; Peptide binding specificity of HLA-DR4 molecules: correlation with rheumatoid arthritis association; .J Exp Med. 1995 181(5):1847-1855; Tompkins SM, Rota PA, Moore JC, Jensen PE; A europium fluoroimmunoassay for measuring binding of antigen to class II MHC glycoproteins; J Immunol Methods. 1993;163(2): 209-216; Boyton RJ, Lohmann T, Londei M, Kalbacher H, Halder T, Frater AJ, Douek DC, Leslie DG, Flavell RA, Altmann DM; Glutamic acid decarboxylase T lymphocyte responses associated with susceptibility or resistance to type I diabetes: analysis in disease discordant human twins, non-obese diabetic mice and HLA-DQ transgenic mice; Int Immunol. 1998 (12):1765-1776)。

該ペプチドの、MHC分子のエピトープとして機能する形成部分では必ずしもない追加的なN-および／またはC-末端位のアミノ酸ストレッチであっても、本発明のペプチドを細胞に効果的に導入するために重要となる可能性がある場合がある。本発明の1実施形態において、本発明のペプチドは、例えば、NCBI, GenBank登録番号X00497に由来するような、HLA-DR抗原関連不変鎖 (下記「Ii」のｐ33)のN-末端アミノ酸80個を有する融合タンパク質である (Strubin, M., Mach, B. and Long, E.O. The completesequence of the mRNA for the HLA-DR-associated invariant chain reveals a polypeptide with an unusual transmembrane polarity EMBO J. 3 (4), 869-872 (1984))。

好ましくは医薬組成物であり、そのペプチドは8から100個のアミノ酸、好ましくは8から30個のアミノ酸、最も好ましくは8から16個のアミノ酸を全長として有する。

加えて、より強力な免疫応答を引き出すために、安定性および／またはMHC分子への結合を改善するよう、該ペプチドまたは変異形をさらに修飾することができる。そのようなペプチド配列の最適化の方法は当業者に周知であり、例えば、逆ペプチド結合または非ペプチド結合の導入を含む。

したがって、本発明の別の態様により、医薬組成物を提供し、この医薬組成物において、その少なくとも1つのペプチドまたは変異形は非ペプチド結合を含む。

逆ペプチド結合におけるアミノ酸残基は、ペプチド(-CO-NH-)により結合されておらず、そのペプチド結合は逆になっている。そのようなレトロ-インバースペプチド模倣薬は、当業者に周知の方法を用いて作ることができ、例えば、ここに参照として組み込むMeziere et al (1997) J. Immunol. 159, 3230-3237に記述されている方法がある。このアプローチには、バックボーンが関与する変更を含むが側鎖の配向は関与しない擬ペプチドの作成が関与する。 Meziereら(1997) は、MHCおよびＴヘルパー細胞応答にこれら擬ペプチドが有用であることを示している。 CO-NHペプチド結合の代わりにNH-CO結合を含むレトロ-インバースペプチドは、タンパク質分解に対する抵抗力がはるかに強い。

非ペプチド結合とは、例えば、-CH₂-NH、-CH₂S-、-CH₂CH₂-、-CH=CH-、-COCH₂-、 -CH(OH)CH₂-、-CH₂SO-である。米国特許第4,897,445号は、ポリペプチド鎖にある非ペプチド結合 (-CH₂-NH)の固相合成の方法を提供しており、これには標準的手順により合成するポリペプチドと、アミノアルデヒドとアミノ酸をNaCNBH₃存在下で反応させて合成する非ペプチド結合が関与する。

上述の本発明の配列を有するペプチドは、例えばそれらペプチドの安定性、バイオアベイラビリティ、および／またはアフィニティを強めるために、それらのアミノ末端および／またはカルボキシ末端にある追加的な化学基と合成できる。例えば、該ペプチドのアミノ末端に、カルボベンゾキシル基、ダンジル基、またはｔ-ブチルオキシカルボニル基のような疎水性の基を加えることができる。同様に、該ペプチドのアミノ末端に、アセチル基または9−フルオレニルメトキシーカルボニル基を置くことができる。加えて、例えば前記の疎水性の基であるｔ-ブチルオキシカルボニル基またはアミド基を該ペプチドのカルボキシ末端に加えることができる。

さらに、本発明の全てのペプチドは、それらの立体配置を変えるように合成することができる。例えば、該ペプチドの１つもしくはそれ以上のアミノ酸残基のD-異性体を、通常のL-異性体の代わりに使用することができる。またさらに、本発明のペプチドの少なくとも１つのアミノ酸残基を、周知の非天然アミノ酸残基の１つと置換することができる。これらのような改変は、本発明のペプチドの安定性、バイオアベイラビリティ、および／または結合作用を増す働きをすることができる。

同様に、該ペプチドの合成の前または後に特定のアミノ酸を反応することにより、本発明のペプチドまたは変異形を化学修飾することができる。そのような修飾の例は当該技術分野で周知であり、例えば、この参照によりここに組み込まれるR. Lundblad, Chemical Reagents for Protein Modification, 3rd ed. CRC Press, 2005に要約されている。アミノ酸の化学修飾として、アシル化、アミジン化、リシンのピリドキシル化、還元的アルキル化、2, 4, 6-トリニトロベンゼンスルホン酸 (TNBS)によるアミノ基のトリニトロベンゼン化、カルボキシル基のアミド修飾および過ギ酸によるスルフィドリル修飾、システインからシステイン酸への酸化、水銀誘導体の生成、他のチオール化合物との混合ジスルフィドの生成、マレイミドとの反応、ヨード酢酸またはヨードアセトアミドとのカルボキシメチル化、およびアルカリｐＨでのシアン酸塩とのカルバモイル化による修飾を含むが、これらに限定されない。これに関し、当業者は、Current Protocols In Protein Science, Eds. Coligan et al. (John Wiley & Sons NY 1995-2000) により、タンパク質の化学修飾に関するより広範な方法論を参照できる。

要約すると、例えばタンパク質のアルギニン残基の修飾は、フェニルグリオキサル、2,3-ブタンジオン、および1,2-シクロヘキサンジオンのような隣接ジカルボニル化合物の反応に基づく付加物の形成であることが多い。別の例は、メチルグリコサルとアルギニン残基の反応である。システインは、リシンおよびヒスチジンのような他の求核的部位の同時修飾なしに修飾することができる。そのため、システインの修飾には多数の試薬を利用可能である。具体的な試薬の情報は、Pierce Chemical Company、Sigma-Aldrich、および他のウェブサイトに提供されている。

タンパク質におけるジスルフィド結合の選択的還元もよく行われる。ジスルフィド結合は、バイオ医薬の熱処理の間に形成および酸化することができる。

WoodwardのReagent K を用いて、特定のグルタミン酸残基を修飾することができる。 N-(3-(ジメチルアミノ)プロピル)-N'-エチルカルボジイミドを用いて、リシン残基とグルタミン酸残基の間に分子内クロスリンクを形成することができる。

例えば、ジエチルピロカルボナートは、タンパク質内のヒスチジル残基を修飾する試薬である。ヒスチジンも、4-ヒドロキシ-2-ノネナールを用いて修飾することができる。

リシン残基と他のαアミノ基の反応は、例えば、ペプチドと表面の結合またはタンパク質/ペプチドのクロスリンクに有用である。リシンはポリ (エチレン)グリコールが付着する部位であり、タンパク質の糖化における修飾の主要部位である。

タンパク質のメチオニン残基は、例えばヨードアセトアミド、ブロモエチルアミン、クロルアミンTで修飾することができる。

テトラニトロメタンおよびN-アセチルイミダゾルは、チロシル残基の修飾に用いることができる。ジチロシンの形成によるクロスリンクは、過酸化水素/銅イオンによって達成できる。

トリプトファンの修飾に関する最近の研究では、N-ブロモサクシンイミド、2-ヒドロキシ-5-ニトロベンジルブロマイドまたは 3-ブロモ-3-メチル-2-(2-ニトロフェニルメルカプト)-3H-インドル (BPNS-スカトール)が使用された。

PEGで治療用タンパク質およびペプチドを適切に修飾するには、しばしば、循環半減期の延長が伴い、ヒドロゲルの調製には、グルタルアルデヒド、ポリエチレングリコールジアクリレートおよびホルムアルデヒドによるタンパク質のクロスリンクが用いられる。免疫療法のためのアレルゲンの化学修飾は、しばしば、シアン酸カリウムによるカルバミル化によって達成される。

一般に、ペプチドおよび変異形 (少なくともアミノ酸残基間にペプチドリンクを含むもの)は、Lu et al (1981) J. Org. Chem. 46, 3433およびその参照が開示するように、例えば固相ペプチド合成のFmoc-ポリアミド形態を使って合成できる。

精製は、再結晶化、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、および(通常は)例えばアセトニトリル/水傾斜分離を使う逆相高速液体クロマトグラフィーのような手法の1つもしくは組み合わせによって行うことができる。

ペプチドの分析は、薄層クロマトグラフィー、電気泳動法、特にキャピラリー電気泳動法、固相抽出 (CSPE)、逆相高速液体クロマトグラフィー、酸加水分解後のアミノ酸分析、高速原子衝撃 (FAB)質量分析、MALDIおよびESI-Q-TOF 質量分析を用いて行うことができる。

本発明のさらに別の態様は、本発明のペプチドまたは変異形をコードする核酸 (例えばポリヌクレオチド)を提供する。該ポリヌクレオチドとしては、例えば、DNA、cDNA、PNA、CNA、RNA、単鎖および／または二本鎖、または天然または安定形のポリヌクレオチド、例えばホスホロチオアートバックボーンを有するポリヌクレオチド、またはそれらの組み合わせが可能であり、該ペプチドをコーディングするポリヌクレオチドである限り、イントロンの含有は不可欠ではない。当然、天然に生じるペプチド結合によって結合された天然に生じるアミノ酸残基を含むペプチドのみが、ポリヌクレオチドによってエンコードされる。本発明のまたさらに別の態様は、本発明によるポリペプチドを発現する能力のある発現ベクターを提供する。異なる細胞型の発現ベクターは当該技術分野で周知であり、特別な実験をせずに選択することができる。

一般に、DNAはプラスミドのような発現ベクターに、正しい配向で、発現のために正しいリーディングフレームで挿入される。必要であれば、望ましい宿主によって認識される適切な転写・翻訳調節管理ヌクレオチド配列にDNAをリンクすることができるが、そのような管理機能は一般に発現ベクターに入っている。次に、標準的手法によって該ベクターを宿主に導入する。
これについては、Sambrook et al (1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NYを参照することができる。

しかし、本発明の特に好ましい実施形態において、該医薬組成物は、配列番号１〜配列番号１５のアミノ酸配列を含む少なくとも２つのペプチドを有する。

該ワクチンに含まれる核ペプチドの最適な量および最適な用量のレジメンは、特別な実験をしなくとも当業者であれば決定することができる。例えば、該ペプチドまたはその変異形は、静脈 (i.v.)注射、皮下 (s.c.)注射、皮内 (i.d.)注射、腹膜内 (i.p.)注射、筋内 (i.m.)注射として調製することができる。ペプチド注射の好ましい投与経路はs.c.、i.d.、i.p.、i.m.、i.v. である。DNA注射の好ましい投与経路は、i.d.、i.m.、s.c.、i.p.、 i.v.である。例えば、1〜500ｍｇ、50 μg〜1.5 mg、好ましくは125 μg〜500 μgのペプチドまたはDNAを投与することができ、用量は各ペプチドまたはDNAに依存する。この範囲の用量はこれまでの治験で用いられ、成功している (Brunsvig PF, Aamdal S, Gjertsen MK, Kvalheim G, Markowski-Grimsrud CJ, Sve I, Dyrhaug M, Trachsel S, Muller M, Eriksen JA, Gaudernack G; Telomerase peptide vaccination: a phase I/II study in patients with non-small cell lung cancer; Cancer Immunol Immunother. 2006; 55(12):1553-1564; M. Staehler, A. Stenzl, P. Y. Dietrich, T. Eisen, A. Haferkamp, J. Beck, A. Mayer, S. Walter, H. Singh, J. Frisch, C. G. Stief; An open label study to evaluate the safety and immunogenicity of the peptide based cancer vaccine IMA901, ASCO meeting 2007; Abstract No 3017)。

本発明の医薬組成物をコンパイルすることにより、該組成物に存在するペプチドの選択、数、および／または量を、組織、癌、および／または患者に特異のものにすることができる。例えば、与えられた患者の組織のタンパク質の発現パターンによってペプチドの正しい選択を導くことにより、副作用を避けることができる。この選択は、治療を受ける患者に特定の癌のタイプおよび該疾病の状態、それまでの治療レジメン、患者の免疫ステータス、および当然、患者のHLAハプロ型に依存する場合がある。さらに、本発明によるワクチンは、特定の患者の個人的な必要に応じて個別の構成要素を含むことができる。例としては、特定の患者の、関係TAAの発現、個人のアレルギーまたはその他の治療による副作用、一連の初期治療計画後の2次的治療の調整に応じた異なるペプチドの量である。

CRCのワクチンとして用いられる組成物の場合、例えば、正常組織に親タンパク質が高い量で発現されるペプチドは回避されるか、もしくは本発明の組成物に低量で存在する。一方、患者の腫瘍が特定のタンパク質を高い量で発現することがわかっている場合、この癌の治療のための各医薬組成物は高い量で存在できる、および／またはこの特定のタンパク質または経路に特異な複数のペプチドを含むことができる。
当業者であれば、in vitroでのT細胞形成、それらの効能、および全体的な提示、特定のペプチドに対する特定のT細胞の増殖、アフィニティ、拡大、およびT細胞の機能性を、例えばIFN-γ 生成の分析によって試験することによって、免疫原性ペプチドの好ましい組み合わせを選択することができる (下記の例も参照のこと)。通常、次に、最も効率的なペプチドを、上述の目的のためにワクチンとして組み合わせる。

適切なワクチンは、好ましくは1〜20個のペプチド、より好ましくは2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20個の異なるペプチド、さらに好ましくは6、7、8、9、10、11、12、13、または14個の異なるペプチド、最も好ましくは14個の異なるペプチドを含有する。癌のワクチンとして用いられる該ペプチドの長さは、任意の適切なペプチドでよい。具体的には、適切な9-merのペプチドまたは適切な7-mer または8-mer または10-mer または11-mer のペプチドまたは12-mer 、13-mer 、14-mer または15-mer のペプチドとすることができる。より長いペプチドも適切である場合があり、添付の表１および２に記述されているように、MHCクラスIペプチドには9-merまたは10-merのペプチドが好ましく、MHCクラスIIペプチドには12-から15-merが好ましい。

該ペプチドは腫瘍または癌ワクチンを構成する。該腫瘍または癌ワクチンは、患者に直接にその疾病器官または全身に投与すること、または患者からの細胞またはヒト細胞株に生体外適用したものを該患者に投与すること、またはin vitroで用いて患者の免疫細胞からのサブポピュレーションを選択して再び該患者に投与することができる。

該ペプチドは実質的に純粋であること、または免疫刺激性アジュバント (下記参照)と組み合わせること、または免疫刺激性サイトカインと組み合わせて使うこと、または適切な送達系 (例えばリポソーム)と共に投与することができる。該ペプチドは、キーホールリンペットヘモシアニン (KLH)またはマンナンのような適切な担体と接合することもできる (WO 95/18145号およびLongenecker et al (1993) Ann. NY Acad. Sci. 690,276-291を参照)。該ペプチドをタグ付けすること、または融合タンパク質にすること、またはハイブリッド分子にすることもできる。本発明においてその配列が与えられているペプチドは、CD4またはCD8 CTLを刺激することが期待される。しかし、反対のCDに対して陽性のT細胞が助けを提供する方が刺激の効率は高まる。したがって、CD4 CTLを刺激するMHCクラスIIエピトープの場合、その融合パートナーまたはハイブリッド分子のセクションが、CD8陽性T細胞を刺激するエピトープを適切に提供する。一方、CD8 CTLを刺激するMHCクラスIエピトープの場合は、その融合パートナーまたはハイブリッド分子のセクションが、CD4陽性T細胞を刺激するエピトープを適切に提供する。 CD4およびCD8刺激性エピトープは、当該技術分野で周知であり、本発明で特定するものを含む。

免疫応答を引き出すために、通常は、該組成物の免疫原性を高める賦形剤を含める必要がある。したがって、本発明の好ましい実施形態の医薬組成物は、少なくとも1つの適切なアジュバントをさらに有する。
アジュバントは、抗原に対する免疫応答 (例えばCTLおよびヘルパーT (TH)細胞が媒介する免疫応答)を非特異的に強化または促進する物質であるので、本発明の薬剤にとって有用と考えられる。限定はしないが、適切なアジュバントは、1018 ISS、アルミニウム塩、アンプリヴァックス、AS15、BCG、CP-870、893、CpG7909、CyaA、dSLIM、GM-CSF、IC30、IC31、イミキモド、ImuFact IMP321、IS Patch、ISS、ISCOMATRIX、JuvImmune、LipoVac、MF59、モノホスホリル脂質A、モンタナイドIMS 1312、モンタナイドISA 206、モンタナイドISA 50V、モンタナイドISA-51、OK-432、 OM-174、OM-197-MP-EC、ONTAK、PepTel(R)ベクターシステム、PLG微粒子、レジキモド、SRL172、ウィロソームおよび他のウィルス様粒子、YF-17D、VEGFトラップ、R848、βグルカン、Pam3Cys、Aquila のQS21スティミュロン (Aquila Biotech, Worcester, MA, USA) (サポニン由来物質)、マイコバクテリア抽出物、および合成細菌細胞壁模倣物、および他の専有アジュバント (RibiのDetox、Quil、またはSuperfosなど) である。フロイント不完全またはGM-CSFのようなアジュバントが好ましい。樹状細胞に特異ないくつかの免疫学的アジュバント (例えばMF59)およびそれらの製剤についてはすでに記述がある (Dupuis M, Murphy TJ, Higgins D, Ugozzoli M, van Nest G, Ott G, McDonald DM; Dendritic cells internalize vaccine adjuvant after intramuscular injection; Cell Immunol. 1998; 186(1):18-27; Allison AC; The mode of action of immunological adjuvants; Dev Biol Stand. 1998; 92:3-11)。また、サイトカインを使うこともできる。いくつかのサイトカインは、樹状細胞がTリンパ球に対し効果的な抗原提示細胞に成熟する過程を加速するとして (例えばGM-CSF、IL-1、IL-4) (米国特許第5,849,589号 (この参照によりその全文が組み込まれる))、また、免疫アジュバントとして作用するとして (例えばIL-12) (Gabrilovich DI, Cunningham HT, Carbone DP; IL-12 and mutant P53 peptide-pulsed dendritic cells for the specific immunotherapy of cancer; J Immunother Emphasis Tumor Immunol. 1996 (6):414-418)、リンパ球組織 (例えばTNF-α)への樹状細胞の移動に与える影響と直接リンクされているものがある。

CpG免疫刺激性オリゴヌクレオチドもワクチン設定におけるアジュバントの効果を高めるという報告がある。理論に束縛されず、CpGオリゴヌクレオチドはトール様受容体 (TLR) (主にTLR9)を介して生来の (非適応の)免疫系を活性化する作用を持つ。 CpGが起動するTLR9活性は、予防ワクチンおよび治療ワクチンの両方で、ペプチドまたはタンパク質抗原、生のウィルスおよび殺傷されたィルス、樹状細胞ワクチン、自己細胞ワクチン、および多糖共役体を含む様々な抗原に対する体液性および細胞性の抗原特異的応答を高める。より重要なのは、たとえCD4T細胞の助けがなくても、それが樹状細胞の成熟と分化を増進し、TH1 細胞の活性および細胞傷害性Tリンパ球 (CTL)の生成を増進することである。 TLR9の刺激によって誘導されるTH1バイアスは、TH2バイアスを通常促進するミョウバンまたはフロイント不完全アジュバント (IFA)のようなワクチンアジュバントが存在していても維持される。 CpGオリゴヌクレオチドは、その他のアジュバントと共処方または併投与するか、もしくは微粒子、ナノ粒子、脂質エマルションまたは類似の処方にすることによって、さらに高いアジュバント活性を示すものであり、比較的弱い抗原の場合に強い応答を誘発するには特に必要である。それらは、免疫応答も加速するものであり、いくつかの実験では、CpGのない全用量ワクチンに匹敵する抗体応答が、約二桁低減した抗原用量で得られた(Arthur M. Krieg, Therapeutic potential of Toll-like receptor 9 activation, Nature Reviews, Drug Discovery, 2006, 5, 471-484)。米国特許第6,406,705号B1は、CpGオリゴヌクレオチドと非核酸アジュバントと抗原との組み合わせによって抗原特異的免疫応答を誘発することについて記述している。市販のCpG TLR9拮抗薬であるMologen (ドイツBerlin市)のdSLIM (double Stem Loop Immunomodulator)は、本発明の医薬組成物の好ましい構成要素である。 RNA結合TLR7、TLR8、および／またはTLR9のようなその他のTLR結合分子を使用することもできる。

限定するものでないが、有用なアジュバントのその他の例としては、化学修飾CpGs (例えばCpR、Idera)、ポリ (I:C) (例えばポリI：C12U)、非CpG細菌DNAまたはRNA、およびイミダゾキノリン、シクロホスファミド、スニチニブ、ビバシズマブ、セレブレックス、NCX-4016、シルデナフィル、タダラフィル、バルデナフィル、ソラフィニブ、XL-999、CP-547632、パゾパニブ、ZD2171、AZD2171、イピリムマブ、トレメリムマブ、SC58175を含み、これらは治療薬および／またはアジュバントとして作用することができる。本発明のコンテクストにおいて有用なアジュバントおよび添加剤の量および濃度は、当業者であれば特別な実験をせずに容易に決定できる。

好ましいアジュバントはdSLIM、BCG、OK432、イミキモド、PeviTer、および JuvImmuneである。

本発明の医薬組成物の好ましい実施形態において、該アジュバントは、グラニュロサイトマクロファージコロニー刺激因子 (GM-CSF、サルグラモスティム)のようなコロニー刺激因子を含む群から選択される。

本発明の医薬組成物の好ましい実施形態において、該アジュバントはイミキモドである。

この組成物は、皮下、皮内、筋内のような非経口投与または経口投与に用いられる。このための該ペプチドおよび選択的他の分子は、薬学的に許容される好ましくは水性の担体に溶解または懸濁される。加えて、該組成物は、緩衝剤、結合剤、爆破剤、希釈剤、香味料、潤滑剤のような賦形剤などを含むことができる。該ペプチドは、また、サイトカインのような免疫刺激性物質と共に投与することもできる。そのような組成物に使用可能な賦形剤の広範なリストは、例えば、A. Kibbe, Handbook of Pharmaceutical Excipients, 3. Ed. 2000, American Pharmaceutical Association and pharmaceutical pressから得られる。該組成物は、腫瘍または癌、好ましくはCRCの予防および／または療法として用いることができる。

細胞傷害性T細胞 (CTL)は、MHC分子と結合したペプチド形状抗原を認識し、そのままの外来抗原自体は認識しない。該MHC分子自体は、抗原提示細胞の細胞表面にある。したがって、CTLの活性化は、ペプチド抗原の三量体複合体とMHC分子とAPCの存在下でのみ可能である。したがって、ペプチドだけを用いてCTLを活性化するのではなく、各MHC分子と共にAPCも追加的に加えることによって免疫応答は増進される。

したがって、好ましい実施形態において、本発明の医薬組成物は少なくとも１つの抗原提示細胞を追加的に含む。

該抗原提示細胞 (または刺激細胞)は、通常、MHCクラスIまたはII分子をその表面に有し、１実施形態においては、その選択された抗原を有する該MHCクラスIまたはII分子をそれ自体に負荷することは実質的に不可能である。下記に詳細に述べるように、該MHCクラスIまたはII分子に、その選択された抗原をin vitroで容易に負荷することができる。

好ましくは、該哺乳動物細胞はTAPペプチドトランスポーターのレベルまたは機能が欠如しているか、または低下している。該TAPペプチドトランスポーターが欠如する適切な細胞は、T2、RMA-S、およびドロソフィラ細胞である。 TAPは抗原処理を伴うトランスポーターである。

該不完全細胞株T2負荷ヒトペプチドは、American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, USAから、カタログ番号CRL1992として入手可能である。該ドロソフィラ細胞株シュナイダー株2は、ATCCからカタログ番号CRL19863として入手可能である。該マウスRMA細胞株についての記述はKarre and Ljunggren (1985) J. Exp. Med. 162, 1745にある。これらの細胞株をAPCとして用いることは可能であり、TAPが欠如しているので、MHCクラスIによって提示されるほぼ全てのペプチドは、これら細胞株の空のMHCクラスI分子を外的に負荷するために使われる、精査下のペプチドであり、したがって、全ての効果は該使用ペプチドに明らかに起因する。

好ましくは、該抗原提示細胞は樹状細胞である。適切には、該樹状細胞は、抗原ペプチドをパルスした自己樹状細胞である。該抗原ペプチドは、適切なT細胞応答を引き出す任意の適切な抗原ペプチドでよい。腫瘍関連抗原からのペプチドをパルスした自己樹状細胞を用いるT細胞療法については、Murphy et al (1996) The Prostate 29, 371-380 and Tjua et al (1997) The Prostate 32, 272-278に開示されている。

したがって、本発明の好ましい実施形態において、少なくとも1つの抗原提示細胞を含む該医薬組成物は、例えば実施例4の方法によって、該ペプチドでパルスされる、または該ペプチドを負荷される。

あるいは、該抗原提示細胞は、該ペプチドをコードする発現コンストラクトを有する。該ポリヌクレオチドは、適切な任意のポリヌクレオチドでよく、ペプチドの提示および免疫力の導入が得られるよう樹状細胞を形質導入する能力のあるものが好ましい。
便利なことに、本発明の核酸はウィルスポリヌクレオチドまたはウィルスとして組成することができる。例えば、アデノウィルス形質導入樹状細胞は、MUC1関連の抗原特異的抗腫瘍免疫力の導入を示した (Gong et al (1997) Gene Ther. 4, 1023-1028)。同様に、アデノウィルスを使用した系を使うことができる (例えばWan et al (1997) Hum. Gene Ther. 8, 1355-1363を参照)。レトロウィルス系を使うこともできる (Specht et al (1997) J. Exp. Med. 186, 1213-1221 and Szabolcs et al (1997) )。血液粒子媒介による樹状細胞へのトランスファーも使うことができる (Tuting et al (1997) Eur. J. Immunol. 27, 2702-2707)。また、RNAを使うこともできる (Ashley et al (1997) J. Exp. Med. 186, 1177 1182)。

一般に、本発明の核酸を含む本発明の医薬組成物は、本発明のペプチドを含む医薬組成物と同様の方法で投与すること、すなわち静脈内、動脈内、腹膜内、筋内、皮内、腫瘍内、経口、経皮、経鼻腔、経口腔、経直腸、経膣投与、または吸入または局所投与することができる。

回避のメカニズムにより、腫瘍はしばしば治療薬に対する耐性を得る。この薬品耐性は治療中に生じ、転移および再発腫瘍として現れる場合がある。そのような薬品耐性を避けるために、一般に腫瘍の治療は薬品の組み合わせによって行われ、多くの場合、無病期間後の転移および腫瘍再発には異なる組み合わせが要求される。したがって、本発明の１つの態様において、該医薬組成物は第２の抗癌剤と併せて投与される。該第２の薬剤は、本発明の医薬組成物の前または後、またはそれと同時に投与することができる。同時投与は、例えば、化学特性に適合性があるならば本発明の医薬組成物を該第２の抗癌剤と混合して行うことができる。同時投与の別の方法は、例えば本発明の医薬組成物を注射し、第２の抗癌剤を例えば経口投与することにより、同日に該組成物と抗癌剤を独立の投与経路で投与することである。該医薬組成物と第２の抗癌剤を、異なる日に同じ治療コース内で投与、および／または別々の治療コース内で投与してもよい。

本発明の別の態様は、患者の癌を治療または予防する方法を提供するものであり、この方法は、任意の１つの本発明の医薬組成物を治療効果のある量で該患者に投与する工程を有する。

治療効果のある量とは、免疫応答の誘発、特に、CTLのサブポピュレーションの活性化に十分な量である。当業者であれば、本明細書の実施例に提供されているような標準的な免疫学的方法を用いて、効果のある量を容易に決定することができる。該医薬組成物の特定量の効果を監視する別の方法は、治療した腫瘍の成長および／または再発を観察することである。

本発明の特に好ましい実施形態において、該医薬組成物は抗癌ワクチンとして用いられる。

ペプチドまたはペプチドエンコーディング核酸を含む組成物は、腫瘍または癌ワクチンを構成することもできる。該腫瘍または癌ワクチンは、該患者に直接にその疾病器官または全身的に投与すること、または患者からの細胞またはヒト細胞株に生体外適用したものを該患者に投与すること、またはin vitroで用いて患者の免疫細胞からのサブポピュレーションを選択して再び該患者に投与することができる。

本発明の組成物は、癌を治療する方法として、またはワクチンとして使用することができる。該癌は、口腔、咽頭の癌、消化管癌、結腸、直腸、肛門の癌、気道癌、乳癌、子宮、膣、外陰の癌、子宮体、卵巣の癌、男性生殖管癌、尿道癌、骨および軟組織の癌、カポジ肉腫、皮膚メラノーマ、眼メラノーマ、非メラノーマ眼癌、脳、中枢神経系の癌、甲状腺および他の内分泌腺の癌、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、骨髄腫であり、好ましくは腎臓癌、結腸直腸癌、肺癌、乳癌、膵臓癌、前立腺癌、胃癌、脳癌、GISTまたはグリア芽腫である。

本発明の治療またはワクチン方法の最も好ましい実施形態において、該ワクチンは結腸直腸癌治療のためのマルチペプチド腫瘍ワクチンである。好ましくは、該ワクチンは、原発結腸直腸癌細胞にありすでに特定されている配列番号１〜配列番号１５から選択される腫瘍関連ペプチド一式を有する。この一式はHLAクラスIおよびクラスIIペプチドを含む。該ペプチド一式は、皮内投与の効能を試験するための免疫マーカーとなる正の対照ペプチドとして使われるHBVコア抗原のようなペプチドも少なくとも1つ含むことができる。特定の1実施形態において、該ワクチンは、各ペプチドが約1500μg〜約75 μg、好ましくは約1000 μg〜約750 μg、より好ましくは約500μg〜約600μg、最も好ましくは約578μgであるペプチド (配列番号１〜配列番号１５による)14個から成り、それらのペプチドは全て、HPLCおよびイオン交換クロマトグラフィーによって精製される、白色からオフホワイト色の粉末である。このリオフィリセートを好ましくは炭酸水素ナトリウムに溶解し、構成後30分以内に常温で皮内注射して用いる。本発明によると、ペプチドの好ましい量は500μl 溶液中に約0．1〜100ｍｇ、好ましくは約0．1〜1ｍｇ、最も好ましくは約300μg〜800 μg の間で変動することができる。ここで、「約」という言葉は、特に述べない限り、与えられた値の+/- 10パーセントを意味する。当業者であれば、例えば患者個人の免疫ステータスおよび／または特定のタイプの癌で提示されるTUMAPの量のようないくつかの因子に基づき、使用するペプチドの実際量を調整することができるであろう。本発明のペプチドは、リオフィリセート以外の他の適切な形状 (滅菌液等)として提供してもよい。

本発明によるペプチドおよび／または核酸を有する本発明の医薬組成物は、各対応するペプチドまたは抗原に関連する腺腫または癌疾病の患者に投与される。これにより、T細胞を媒介とする免疫応答が起動される

好ましくは本発明の医薬組成物であって、この本発明の医薬組成物のペプチド (特に腫瘍関連のペプチド)または核酸、または該組成物に存在する本発明の発現ベクターの量は、組織、癌、および／または患者に特異的である。

本発明の別の実施形態において、該ワクチンは核酸ワクチンである。ポリペプチドをコードするDNAワクチンのような核酸ワクチンの接種がT細胞応答を引き出すことは周知である。該腫瘍または癌ワクチンは、該患者に直接にその疾病器官または全身的に投与すること、または患者からの細胞またはヒト細胞株に生体外適用したものを該患者に投与すること、またはin vitroで用いて患者の免疫細胞からのサブポピュレーションを選択して再び該患者に投与することができる。該核酸をin vitroで細胞に投与する場合、インターロイキンー2またはGM-CSFのような免疫刺激性サイトカインを共発現するよう、該細胞の移入が有用である場合がある。該核酸は実質的に純粋であること、または免疫刺激性アジュバントと組み合わせること、または免疫刺激性サイトカインと組み合わせて使うこと、または適切な送達系 (例えばリポソーム)と共に投与することができる。該核酸ワクチンは、上記ペプチドワクチンに関して記述したようなアジュバントと共に投与してもよい。好ましくは、該核酸ワクチンをアジュバントなしに投与する。

該ポリヌクレオチドは、実質的に純粋である、または適切なベクターまたは送達系に含まれている場合がある。適切なベクターおよび送達系として含まれるのは、アデノウィルス、ワクシニアウィルス、レトロウィルス、ヘルペスウィルス、アデノ関連ウィルス、または複数のウィルスの要素を含むハイブリッドに基づく系のような、ウィルス性のものである。非ウィルス送達系として含まれるのは、DNA送達技術分野で周知のカチオン性脂質およびカチオン性ポリマーである。「遺伝子銃」のような物理的送達も使用することができる。該ペプチド、または該核酸によってエンコードされるペプチドは、融合タンパク質の場合があり、例えばCD4陽性T細胞を刺激する破傷風トキソイドからのエピトープとの融合タンパク質である。

適切には、該患者に投与される全てのペプチドは滅菌されていて発熱物質がない。裸のDNAは筋内、皮内、皮下注射により投与することができる。便利なことに、該核酸ワクチンは任意の核酸送達手段を有することができる。好ましくはDNAである該核酸は、リポソームにて送達することも、ウィルスベクター送達系の一部として送達することもできる。 DNAワクチンのような核酸ワクチンは筋肉に投与するのが好ましく、ペプチドワクチンはs.c.または i.d.にて投与するのが好ましい。該ワクチンを皮内に投与するのも好ましい。

樹状細胞のようなプロフェッショナル抗原提示細胞による核酸の摂取、およびエンコードされたポリペプチドの発現は、免疫応答のプライミングのメカニズムである可能性がある。しかし、樹状細胞は移入されない可能性があるとはいえ、組織内の移入された細胞から発現ペプチドを取り込むことができるので、なお重要である (「クロスプライミング」。例：Thomas AM, Santarsiero LM, Lutz ER, Armstrong TD, Chen YC, Huang LQ, Laheru DA, Goggins M, Hruban RH, Jaffee EM. Mesothelin-specific CD8(+) T cell responses provide evidence of in vivo cross-priming by antigen-presenting cells in vaccinated pancreatic cancer patients. J Exp Med. 2004 Aug 2;200(3):297-306)。

ポリヌクレオチドを媒介とする癌免疫療法についてはConry et al (1996) Seminars in Oncology 23, 135-147; Condon et al (1996) Nature Medicine 2, 1122-1127; Gong et al (1997) Nature Medicine 3, 558-561; Zhai et al (1996) J. Immunol. 156, 700-710; Graham et al (1996) Int J. Cancer 65, 664-670; and Burchell et al (1996) 309-313 In: Breast Cancer, Advances in biology and therapeutics, Calvo et al (eds), John Libbey Eurotextに記述されており、これら全ては参照によりその全文がここに組み込まれる。

注射部位、標的化ベクターおよび送達系の使用、または患者からの特異的細胞集団の選択的精製によって、該ワクチンの標的を、例えば抗原提示細胞のような特異的細胞集団とすること、および該ペプチドまたは核酸を生体外投与することも有用である可能性がある (例えば、Zhou et al (1995) Blood 86, 3295-3301; Roth et al (1996) Scand. J. Immunology 43, 646-651に記述されているように、樹状細胞をソートすることができる)。例えば、標的化ベクターは、適切な場所での抗原の発現を方向づける組織または腫瘍特異的プロモーターを有することができる。

最後になるが、本発明のワクチンは、治療を受ける患者に特定の癌のタイプおよび該疾病の状態、それまでの治療レジメン、患者の免疫ステータス、および当然、患者のHLAハプロ型に依存する場合がある。さらに、本発明によるワクチンは、特定の患者の個人的な必要に応じて個別の構成要素を含むことができる。例としては、特定の患者の、関係TAAの発現、個人のアレルギーまたはその他の治療による副作用、一連の初期治療計画後の2次的治療の調整に応じた異なるペプチドの量である。

本発明のペプチドは癌治療に有用なだけでなく、診断にも有用である。該ペプチドはグリア芽腫から生成されるものであり、これらのペプチドは正常組織には存在しないことが特定されているので、これらのペプチドを用いて癌の存在を診断することができる。

病理学者は、組織生検での本発明のペプチドの存在を癌の診断の助けとすることができる。病理学者は、抗体を使って行う本発明の特定のペプチドの検出、質量分析、または当該技術分野で周知の他の方法によって、該組織が悪性か、炎症または総じて罹患しているかを知ることができる。本発明のペプチドのグループの存在によって、罹患組織の分類または下位分類が可能になる。

罹患組織標本にある本発明のペプチドの検出は、作用のメカニズムにTリンパ球が関わることがわかっている場合または予期される場合は特に、その免疫系が関わる療法の恩恵についての決断を可能にする。 MHC発現の喪失はよく理解されているメカニズムであり、これによって悪性細胞は免疫監視を逃れる。したがって、本発明のペプチドの存在は、被分析細胞によってこのメカニズムが利用されていないことを示す。

本発明のペプチドは、本発明のペプチドに対するリンパ球応答の分析に用いることができ、例えば、本発明のペプチド、またはMHC分子との複合体である本発明のペプチドに対するT細胞応答または抗体応答を分析することができる。これらのリンパ球応答を、さらなる治療工程を決定するための予後マーカーとして用いることができる。これらの応答は、例えばタンパク質、核酸、自己物質、リンパ球免疫伝達のワクチン接種など異なる手段によってリンパ球応答を誘発しようとする免疫療法アプローチで、代理マーカーとして用いることもできる。遺伝子療法という設定では、副作用の評価において本発明のペプチドに対するリンパ球応答を考慮することができる。リンパ球応答の監視は、移植療法後のフォローアップ検査でも、例えば移植片対宿主および宿主対移植片の病気の検出などに有用である可能性がある。

本発明のペプチドは、MHC/ペプチド複合体に対し特異的な抗体の生成および発育に用いることができる。これらを療法に用いて、罹患組織を標的として毒素または放射性物質を当てることができる。これらの抗体の別の使い方として、PETのような画像法のために、罹患組織に対する放射性核種を標的としてこれらの抗体を当てることができる。この使用方法は、小さな転移の検出または罹患組織のサイズおよび正確な位置を決定するための助けとなり得る。加えて、該ペプチドは、病理学者が行う生検標本に基づく癌の診断の検証に用いることができる。

本発明のさらに別の態様において、本発明はキットに関するものであり、このキットは、 (a)上述の医薬組成物を溶液形状または凍結乾燥形状で包含する容器と、 (b)選択的に、該凍結乾燥製剤用の希釈剤または再構成液を包含する第２の容器と、 (c)選択的に、 (i)該溶液の使用または (ii)該凍結乾燥製剤の再構成および／または使用に関する説明書とを有する。該キットは、1もしくはそれ以上の(iii)緩衝剤、(iv) 希釈剤、 (v) フィルター、 (vi) 針、または (v) シリンジをさらに有する。該容器は、好ましくは瓶、バイアル瓶、シリンジ、または試験管であり、多用途容器でよい。該医薬組成物は、好ましくは乾燥凍結される。

本発明のキットは、好ましくは、本発明の乾燥凍結製剤およびその再構成および／または使用に関する説明書を、適切な容器内に有する。適切な容器として含まれるのは、例えば、瓶、バイアル瓶 (例えばデュアルチャンババイアル)、シリンジ (デュアルチャンパシリンジなど)、および試験管である。該容器は、ガラスまたはプラスチックのような様々な材料から形成することができる。好ましくは、該キットおよび／または容器は、該容器上にある、あるいは該容器に伴う、再構成および／または使用の方法を示す説明書を包含する。例えば、そのラベルは、該乾燥凍結製剤を再構成して上記のペプチド濃度にするという説明を示すことができる。該ラベルは、さらに、該製剤が皮下注射に有用であるもしくは皮下注射のためのものであるという説明を示すことができる。

該製剤の容器は、繰り返し投与 (例えば2〜6回の投与)に使うことができる多用途バイアル瓶でもよい。該キットは、さらに、適切な希釈剤 (例えば重曹溶液)を有する第２の容器を有することができる。

該希釈剤と該凍結乾燥製剤を混合して作られる再構成された製剤の最終ペプチド濃度は、好ましくは少なくとも0.15 mg/mL/ペプチド (=75μg) であり、好ましくは3 mg/mL/ペプチド (=1500μg)以下である。該キットは、さらに、商業的観点およびユーザーの観点から見て望ましいその他の材料 (その他の緩衝剤、希釈剤、フィルター、針、シリンジ、およびパッケージに挿入される使用説明書を含む)を含むことができる。

本発明のキットは、他の構成要素 (例えば他の化合物またはこれら他の化合物の医薬組成物)と共に、もしくはそれらなしに、本発明の医薬組成物の製剤を包含する単一の容器を有すること、または各構成要素によって別の容器を有することができる。

好ましくは、本発明のキットは、第２の化合物 (アジュバント (例えばGM-CSF)、化学療法薬剤、天然生成物、ホルモンまたは拮抗薬、抗血管形成剤または血管形成阻害剤、アポトーシス誘発剤またはキレート剤など)またはその医薬組成物の併投与との組み合わせとして使用するためにパッケージされた本発明の処方を含む。該キットの構成要素は、予め複合体として作られたもの、もしくは、患者に投与するまで各構成要素が異なる別々の容器に入ったものが可能である。該キットの構成要素は、１もしくはそれ以上の液体溶液として提供することができ、好ましくは水溶液であり、より好ましくは滅菌水溶液である。該キットの構成要素は、固体として提供することも可能であり、好ましくは別の異なる容器にて提供される適切な溶剤をそれに加えて液体に変換することができる。

療法キットの容器としては、バイアル、試験管、フラスコ、瓶、シリンジ、もしくは固体または液体を密封する他の任意の手段が可能である。通常、複数の構成要素がある場合、別々に投薬できるように、該キットは第２のバイアルまたはその他の容器を包含する。該キットは、薬学的に許容される液体用の別の容器も包含することができる。好ましくは、治療キットは、該キットの構成要素である本発明の薬剤を投与することを可能にする器具 (例えば１もしくはそれ以上の針、シリンジ、点眼器、ピペットなど)を包含する。

本発明の医薬組成物は、経口 (経腸)、経鼻腔、経眼、皮下、皮内、筋内、静脈内、または経皮のような任意の許容される経路によって該ペプチドを投与するのに適したものである。好ましくは該投与は皮下投与であり、最も好ましくは皮内投与である。投与は注入ポンプによって行うことができる。

本明細書に開示および記述される本発明の特徴は、記載されている各々の組み合わせによって使用可能なだけでなく、本発明の意図する範囲内で単独に用いることもできるものと理解すべきである。本発明の目的上、本明細書に含まれる全ての参考文献は、参照によりその全文がここに組み込まれる。

末梢血からのODC-001およびNOX-001特異的CD8+リンパ球の、ミクロスフェア駆動型増殖のテトラマー解析。健康なHLA-A*0201+ドナーHD100の、ウェル当たり1 x 10⁶ のCD8+強化PBMCを、抗CD28＋高密度腫瘍抗原A*0201/ODC-001 (上位パネル)または抗CD28＋高密度腫瘍抗原A*0201/NOX-001 (下位パネル)と連結したミクロスフェアで毎週刺激した。 in vitroで3回刺激した後、全ての細胞は抗体CD8 FITC＋テトラマーA*0201/NOX-001 PEおよびA*0201/ODC-001 APCで染色された。細胞はリンパ球集団またはCD8+リンパ球 (右パネル)でゲートされ、数字はCD8+リンパ球内のテトラマー＋のパーセンテージを表す。 5回の刺激サイクル後にIFNγ ELISPOTで検出したTGFBI-004のin vitro免疫原性。細胞はプライムし、TGFBI-004で繰り返し再刺激してから、関係TGFBI-004 (ウェル1、2、3、4)および無関係 (負の対照)ペプチドでそれぞれ培養した。 IFN ELISPOT後の解析は、ELISPOT Reader (CTL、米国Cleveland市)で行った。 PHA-イオノマイシンを正の対照として使った。数字は陽性スポット数を示す。 5回の刺激サイクル後にICSで検出したTGFBI-004のin vitro免疫原性。細胞は、TGFBI-004を負荷した自己DCでプライムし、自己PBMCとTGFBI-004で繰り返し再刺激した。読み取りのために、細胞は、関係TGFBI-004 (ウェル1、2、3、4)および無関係 (負の対照)ペプチドでそれぞれ培養した。細胞内IFNγ染色に加えて、細胞はCD4-FITCおよびCD8-PerCP抗体でも染色した。解析は4色FACSCaliburサイトメーター (BD Biosciences, Germany)で行った。 NOX-001ペプチドによるin vitroでの再刺激後のT細胞株によるIFNγ生成のELISPOT解析。A. ドナーHBC-154 (ソートしたCD8+ NOX-001 テトラマー+)からのT細胞株 7+ および B. ドナーHBC-154 (ソートしたCD8+ NOX-001 テトラマー-)からのT細胞株 7- 。ソートしたCD8+ NOX-001 テトラマー+ (A.)およびCD8+ NOX-001 テトラマー-(B.) 細胞は、無関係 (MLA-001) (上位ウェル)ペプチドおよび関係 (NOX-001) (下位ウェル)ペプチド (10 μg/ml)で再刺激後、 IFNγ ELISPOTで解析した。数字は陽性スポット数を示す。 4 HLA-A2健康ドナーでのCEA-004特異的CD8+ T細胞の頻度 (CEA-004でのin vitroでの刺激後。フローサイトメトリー解析により測定)。 HLA-A*0201対立遺伝子でコードされたMHC分子に対する、本発明のHLAクラスIペプチドのアフィニティ。

次に、本発明について、以下の図、配列リスト、および実施例を参照し、より詳細に述べる。以下の実施例は、それらによって本発明を限定する目的ではなく、あくまで例証を目的として提供される。

1. 合成および構造
ペプチドは、Fmoc化学を用いる標準的な確立された固相合成によって合成した。準備したHPLCで精製した後、フィジコロジカルに適合性のある対イオンを組み入れるためにイオン交換を行った (酢酸塩または塩化物)。凍結乾燥後、白色からオフホワイト色の固体を最終的に得た。製造手順上の技術的な理由から、IMA-CCN-001だけは塩化物塩として供給し、残りの全てのTUMAPは酢酸塩として投与した。

重要なのは、質量分析、アミノ酸分析、およびHPLC分析を用いて該ペプチドの識別および純度を容易に、かつ高精度で測定できることである。分析結果によると、IMA910ワクチンに使った全てのペプチドは純度 95%で、正しい構造を示した。

表： IMA910におけるペプチドの物理化学的特性

再構成後の粒子の粒径分布および粒子形測定は、画像分析後に0.25〜100 μmの範囲であった個々の粒子の直接画像を得て行った。その結果、該粒子の大半 (＞95％)は、0.25〜2.7 μmの範囲であった。これまでのところ、再構成後1、2、または3時間以内にサイズおよび形の分布の大きな変化は観察されていない。

2. 実施例の医薬組成物IMA910の構成要素
IMA910は、合成腫瘍関連ペプチド (TUMAP)のカクテルを有するものであり、それらの大半は原発結腸直腸癌細胞で特定済みのものである。該TUMAPは、細胞傷害性T細胞 (CD8+T細胞)活性能力のあるHLAクラスI結合ペプチド10個と、Tヘルパー細胞 (CD4+T細胞)活性能力のあるHLAクラスII結合ペプチド3個を含む。 Tヘルパー細胞は、CD8+T細胞の殺傷機能を増進するサイトカインを放出することによって細胞傷害性T細胞の機能を助けるという重要な役割を果たし、また、腫瘍細胞に対して直接作用することもできる (Knutson, KL and Disis, ML; Augmenting T helper cell immunity in cancer, Curr.Drug Targets.Immune.Endocr.Metabol.Disord., 2005, 5, 365-371)。これら13個のTUMAPに加え、IMA910は１つのウィルス制御ペプチドを包含する。

CRC患者から外科切除した悪性組織および正常組織からの標本と、健康ドナーからの血液を段階的に分析した。
第1の工程で、ミクロアレイによるゲノム全体のmRNA発現分析を用いて、悪性組織に過剰発現した遺伝子を様々な正常器官および組織と比較した。
第2の工程で、その悪性物質からのHLAリガンドを質量分析で特定した。
そのようにして特定したHLAリガンドを遺伝子発現データと比較した。工程1で検出した、選択的発現遺伝子または過剰発現遺伝子によってエンコードされるペプチドは、マルチペプチドワクチンのTUMAP候補として適切なものと見なされた。
TUMAPとして特定されたそれらのペプチドの関連性を裏付ける追加的証拠を特定するために文献を調査した。
最終的に、いくつかの免疫学的検定 (in vitroT細胞検定)を用いて、該腫瘍関連HLAリガンドに対する、健常者からの末梢CD8+T細胞の応答性を試験した。

表3： IMA910 TUMAP組成物
IMA910は、10個のHLA-A*02 (クラスI) TUMAPと3個のHLA-DR (クラスII) TUMAPを含む。加えて、そのウィルスマーカーペプチドであるHBV-001が含まれる (ここに記載せず)。

3. 腫瘍標本においてIMA910に含まれるエピトープの提示
調製
各患者からの書面によるインフォームドコンセントを入手後、外科切除した組織標本がUniversitaetsklinik fuer Allgemeine、Viszeral- und Transplantationschirurgie, Tuebingenから提供された。

組織標本からのHLAペプチドの単離
HLA-A*02-特異的抗体BB7.2またはHLA-A、-B、-C-特異的抗体 W6/32、CNBr-活性セファローズ、酸処理、および限外ろ過を用いて、若干修正したプロトコルにしたがい、固体組織からの免疫沈降によって、衝撃凍結組織標本からHLAペプチドプールを入手した (Falk,K., Rotzschke,O., Stevanovic,S., Jung,G. & Rammensee,H.G. Allele-specific motifs revealed by sequencing of self-peptides eluted from MHC molecules. Nature 1991, 351, 290-296; Seeger,F.H. et al. The HLA-A*6601 peptide motif: prediction by pocket structure and verification by peptide analysis. Immunogenetics 1999, 49, 571-576)。

ESI液体クロマトグラフィー質量分析 (ESI-LCMS)によるTUMAPの検出
IMA910に含まれるエピトープは、質量分析によって結腸直腸腫瘍標本から組織的に探した。入手したHLAペプチドプールは、それらの疎水性にしたがって逆相クロマトグラフィー (CapLC, Waters)によって分離し、溶出するペプチドをハイブリッド4重直交加速型時間飛行タンデム質量分析 (Q-TOF Ultima, Waters)で分析した。濃縮および脱塩のためにペプチドプールをC18プレカラムに投入した。投入後、該プレカラムをラインに配置し、5 μm C18逆相物質 (Dionex)を充填した溶融シリカマイクロキャピラリーカラム (75 μm i.d. x 250 mm)で分離した。溶剤Aは、4 mMの酢酸アンモニウム/水混合溶液である。溶剤Bは、80％アセトニトリル/水混合溶液に2mMの酢酸アンモニウムを加えたものである。どちらの溶剤もギ酸でpH3.0に調製した。 5 μl/分の流量を適用し、90分間に15％〜60％のバイナリーグラジエントが実施され、スプリットシステムにより約200 nl/分に低下した。金でコーティングしたガラスキャピラリー (PicoTip, New Objective)を使用し、マイクロESIソースに導入した。 TOFアナライザーの積分時間は1.9 s であり、スキャン間遅延は0.1 sであった。定義されたペプチドを検出するために、該クロマトグラフィーシステムにおいて、該ペプチドの既知の分子量および保持時間に基づき、このタイプのESI-LCMS実験で高感度スクリーニングを行った。したがって、以前に特定された (単一電荷および／または二重電荷)ペプチドのm/z値を含むリストを適用し、前駆体を選択した。その後、衝突誘起減衰 (CID)質量分析 (ESI-LCMS/MS)により、その配列を明らかにした。生成された天然TUMAPフラグメンテーションパターンを、合成の同一配列を持つ基準ペプチドと比較し、そのTUMAP配列を確認した。 HLAペプチド精製収率および分析システムの再現性の評価 (保持時間安定性を含む)は、内部標準として、豊富な内因性のHLA-A*02ペプチド (DDX5からのYLLPAIVHI)を用いて実行した。したがって、HLAペプチドの単離を成功させ、分析システムの正しい性能を確保するために、これらの実験においては、以前に特定されたTUMAPを検出するためのCRC標本の包含基準は、LCMS/MS実験において内部二重電荷標準シグナル (YLLPAIVHI)1スキャン当たり650カウントの最低強度に設定した。

表3（[表５]）は、異なるステージの結腸および直腸癌、および結腸または直腸癌の原発腫瘍部位からの転移の標本分析結果を示す。全てのHLA-A*02 TUMAPが、大半の標本に検出された。一般に、HLA-DR TUMAPの再検出頻度の方が低い。 HLAクラスIIペプチドの場合、各コア配列にいくつかの長さ変異形が存在する場合があるので、これは当然あり得ることである。

表3： CRC標本内のTUMAP再検出

4. IMA910 MHCクラスI 提示ペプチドのin vitro免疫原性
IMA910に含まれるペプチドの免疫原性に関する情報を得るために、上述の確立されたin vitro刺激プラットフォーム (Walter, S, Herrgen, L, Schoor, O, Jung, G, Wernet, D, Buhring, HJ, Rammensee, HG, and Stevanovic, S; 2003, Cutting edge: predetermined avidity of human CD8 T cells expanded on calibrated MHC/anti-CD28-coated microspheres, J.Immunol., 171, 4974-4978)を用いて調査した。この方法により、10/10が試験された、IMA910に含まれるHLA-A*0201限局ペプチドの陽性の免疫原性データによって、これらのペプチドがT細胞エピトープであり、これらのエピトープに対するCD8＋前駆T細胞がヒトに存在することを示すことができた。 IMA910に含まれる唯一の別のHLAクラスIペプチド (MUC-001)は、このTUMAPのA*0201アフィニティが比較的低いため、この方法では試験できなかった。

最近の証拠は、癌ワクチンとしてのCEA-005の有用性にかなり挑むものである。最近の包括的研究 (Iero, M, Squarcina, P, Romero, P, Guillaume, P, Scarselli, E, Cerino, R, Carrabba, M, Toutirais, O, Parmiani, G, Rivoltini, L; Low TCR avidity and lack of tumor cell recognition in CD8(+) T cells primed with the CEA-analogue CAP1-6D peptide, Cancer Immunol Immunother. 2007 Dec; 56(12): 1979-91)で、著者らは初めて、CEA-005でプライムしたT細胞のエフェクターとしての機能を、天然配列のCEA-004に対して体系的に特徴付けた。CRC患者および健常ドナーからの多数の血液サンプルで、CEA-005によるT細胞のプライムは、CEAを発現する、天然配列を提示する結腸直腸癌細胞を認識する能力に欠けるアフィニティの低いT細胞の生成を、再現性を持って促進した。そのような効果的でない低アフィニティの天然配列のクロス認識は、改変ペプチドリガンドを用いるワクチン接種プロトコルで一般的な問題となる可能性があり、別のCEAペプチドおよびその改変作動薬でも最近同様の結果が報告されている (Alves, PM, Viatte, S, Fagerberg, T, Michielin, O, Bricard, G, Bouzourene, H, Vuilleumier, H, Kruger, T, Givel, JC, Levy, F, Speiser, DE, Cerottini, JC, Romero, P; Immunogenicity of the carcinoembryonic antigen derived peptide 694 in HLA-A2 healthy donors and colorectal carcinoma patients, Cancer Immunol. Immunother., 2007, 56, 1795-1805)。さらに、そのような結果は、確立されたメラノーマ抗原Melan-A/MART-1およびその作動薬の天然配列でも報告されている (D. Speiser, personal communication)。

総合すると、改変作動薬ペプチドの一般に強い免疫原性にもかかわらず、最近の証拠は、改変作動薬によって刺激されるT細胞による天然配列のクロス認識の効率の悪さから、ワクチン候補としては天然ペプチドの方が魅力的である可能性を示唆している。このことは、CEA-004 (CAP1)の方が、WO9919478A1号に記述されているその作動薬 (CEA-005 (CAP1-6D) またはCAP1-6D,7Iなど)よりも好ましいはずであることを示唆している。

事実、たくさんのデータが、該天然CEA-004配列自体にかなりのin vivo免疫原性があることを実証している。このペプチドに対して、健常ドナーでは誘発されないが癌患者では自然誘発されるT細胞応答は、いくつかの研究で観察されている (Nagorsen, D, Keilholz, U, Rivoltini, L, Schmittel, A, Letsch, A, Asemissen, AM, Berger, G, Buhr, HJ, Thiel, E, Scheibenbogen, C; Natural T-cell response against MHC class I epitopes of epithelial cell adhesion molecule, her-2/neu, and carcinoembryonic antigen in patients with colorectal cancer, Cancer Res. 2000, 60, 4850-4854; Weihrauch, MR, Ansen, S, Jurkiewicz, E, Geisen, C, Xia, Z, Anderson, KS, Gracien, E, Schmidt, M, Wittig, B, Diehl, V, Wolf, J, Bohlen, H, Nadler, LM; Phase I/II combined chemoimmunotherapy with carcinoembryonic antigen-derived HLA-A2-restricted CAP-1 peptide and irinotecan, 5-fluorouracil, and leucovorin in patients with primary metastatic colorectal cancer, Clin Cancer Res. 2005, 11, 5993-6001; Babatz, J, Rollig, C, Lobel, B, Folprecht, G, Haack, M, Gunther, H, Kohne, CH, Ehninger, G, Schmitz, M, Bornhauser, M; Induction of cellular immune responses against carcinoembryonic antigen in patients with metastatic tumors after vaccination with altered peptide ligand-loaded dendritic cells, Cancer Immunol. Immunother. 2006, 55, 268-276)。さらに、CRC患者にCEA-004またはCEAタンパク質を用いるワクチン接種法は、CEA-004に対する効率的なT細胞応答の刺激を示している (Tsang, KY, Zaremba, S, Nieroda, CA, Zhu, MZ, Hamilton, JM, Schlom, J; Generation of human cytotoxic T cells specific for human carcinoembryonic antigen epitopes from patients immunized with recombinant vaccinia-CEA vaccine, J Natl. Cancer Inst. 1995, 87, 982-990; Morse, MA, Deng, Y, Coleman, D, Hull, S, Kitrell-Fisher, E, Nair, S, Schlom, J, Ryback, ME, Lyerly, HK; A Phase I study of active immunotherapy with carcinoembryonic antigen peptide (CAP-1)-pulsed, autologous human cultured dendritic cells in patients with metastatic malignancies expressing carcinoembryonic antigen, Clin Cancer Res. 1999, 5, 1331-1338; Zhu, MZ, Marshall, J, Cole, D, Schlom, J, Tsang, KY; Specific cytolytic T-cell responses to human CEA from patients immunized with recombinant avipox-CEA vaccine, Clin Cancer Res. 2000, 6, 24-33; Weihrauch, MR, Ansen, S, Jurkiewicz, E, Geisen, C, Xia, Z, Anderson, KS, Gracien, E, Schmidt, M, Wittig, B, Diehl, V, Wolf, J, Bohlen, H, Nadler, LM; Phase I/II combined chemoimmunotherapy with carcinoembryonic antigen-derived HLA-A2-restricted CAP-1 peptide and irinotecan, 5-fluorouracil, and leucovorin in patients with primary metastatic colorectal cancer, Clin Cancer Res. 2005, 11, 5993-6001)。

CD8＋T細胞のin vitroプライミング
ペプチド-MHC複合体 (pMHC)および抗CD28抗体を負荷した人工抗原提示細胞 (aAPC)によるin vitroでの刺激を与えるために、まず、標準的な密度勾配分離培地 (PAA，ドイツColbe市)を用いて、PBMC (末梢血単核細胞)を新鮮なHLA-A*02+軟膜から単離した。軟膜は、Blood Bank TubingenまたはKatharinenhospital Stuttgartのどちらかから入手した。単離したPBMCを一晩、10％加熱不活性化したヒトAB血清 (PAA, ドイツColbe市)と、100 U/mlペニシリン/ 100 μg/mlストレプトマイシン(Cambrex, ベルギーVerviers市)と、1 mMのピルビン酸ナトリウム(CC Pro, ドイツNeustadt市) と、20 μg/mlのゲンタマイシン (Cambrex)とを追加したRPMI-Glutamax (Invitrogen, ドイツKarlsruhe市) からなるヒトin vitroプライミング用T細胞培地 (TCM)で培養した。 CD8＋リンパ球は、CD8＋MACS陽性選択キット (Miltenyi, ドイツBergisch Gladbach市)を用いて、該製造業者の指示通りに単離した。入手したCD8＋T細胞は、2.5 ng/ml IL-7 (PromoCell, ドイツHeidelberg市) および10 U/ml IL-2 (Chiron, ドイツMunich市)を追加したTCMで培養後に用いた。 pMHC／抗CD28被覆ビーズ、T細胞刺激および読み出しは、前述の方法 (Walter, S, Herrgen, L, Schoor, O, Jung, G, Wernet, D, Buhring, HJ, Rammensee, HG, and Stevanovic, S; Cutting edge: predetermined avidity of human CD8 T cells expanded on calibrated MHC/anti-CD28-coated microspheres, J. Immunol., 2003, 171, 4974-4978) に若干の修正を加えて行った。端的に述べると、膜貫通ドメインが欠如しており、かつ重鎖のカルボキシ末端にてビオチン化されたビオチン化組み換えHLA-A*0201分子が、次の方法にしたがって生成された(Altman, JD, Moss, PA, Goulder, PJ, Barouch, DH, Heyzer-Williams, MG, Bell, JI, McMichael, AJ, and Davis, MM; Phenotypic analysis of antigen-specific T lymphocytes, Science, 1996, 274, 94-96)。精製された共刺激マウスIgG2a抗ヒトCD28 Ab9.3(Jung, G, Ledbetter, JA, and Muller-Eberhard, HJ; Induction of cytotoxicity in resting human T lymphocytes bound to tumor cells by antibody heteroconjugates, Proc Natl Acad Sci USA, 1987, 84, 4611-4615) は、スルホ-N-ヒドロキシサクシンイミドビオチンを用いて、その製造業者(Perbio, ドイツBonn市)が推奨する方法で化学的にビオチン化した。使用したビーズは大きさが5.60μmのストレプトアビジン被覆ポリスチレン粒子 (Bangs Labooratories, 米国Illinois州)である。正の対照として使用したpMHC はA*0201/MLA-001 (修飾メラン-A/Mart-1からのペプチドELAGIGILTV)であり、負の対照として使用したのはA*0201/DDX5-001 (DDX5からのYLLPAIVHI) またはA*0201/HBV-001 (FLPSDFFPSV)である。

800.000ビーズ/ 200 μlを、600ngのビオチン抗-CD28と200ngの関係ビオチン-pMHC (高密度ビーズ)、または2ngの関係および200ngの無関係 (pMHCライブラリ)MHC (低密度ビーズ)の存在下で、96ウェルプレートにて被覆した。刺激は、5 ng/ml IL-12 (PromoCell) を追加した200 μl TCMにて、1x10⁶ CD8+ T細胞を、洗浄された2x10⁵被覆ビーズと共に37℃で3〜4日間コンインキュベートすることによって、96ウェルプレートにて開始した。次に、培地の半分を、80 U/ml IL-2を追加した新鮮なTCMと交換し、37℃で3〜4日間培養を続けた。この刺激サイクルを合計3回行った。最後に、蛍光MHCテトラマー (次の記述に従って生成されたもの：(Altman, JD, Moss, PA, Goulder, PJ, Barouch, DH, Heyzer-Williams, MG, Bell, JI, McMichael, AJ, and Davis, MM; Phenotypic analysis of antigen-specific T lymphocytes, Science, 1996, 274, 94-96))と抗体 CD8-FITCクローンSK1 (BD, ドイツHeidelberg市) で、4色FACSCalibur (BD)上でテトラマー解析を行った。ペプチドに特異的な細胞は、合計CD8+細胞のパーセンテージとして計算した。テトラマー解析の評価は、FCS Express(De Novo Software)というソフトウェアを使って行った。特異的なテトラマー＋ CD8+リンパ球のin vitroでのプライミングは、適切なゲートおよび負対照の刺激との比較によって検出された。与えられた抗原の免疫原性は、in vitroでの刺激後に特異的CD8+T細胞株を含む、1健常ドナーの評価可能なin vitro刺激ウェルが少なくとも1つあれば検出された (すなわち、このウェルは、CD8+T細胞中に少なくとも1％の特異的テトラマー＋を含んでおり、特異的なテトラマー+細胞は負対照の刺激の中央値の少なくとも10倍であった)。

10個のIMA910ペプチドのin vitro免疫原性
試験されたHLAクラスIペプチド (10/10)のin vitro免疫原性は、ペプチドに特異的なT細胞株の生成によって実証可能である。NOX-001およびODC-001に特異的なT細胞株の生成を示す代表的染色を図１に示す。この結果を表４（[表６]）にまとめた。IMA910に含まれる唯一の別のHLAクラスIペプチド(MUC-001)は、このTUMAPのA*0201アフィニティが比較的低いために、pMHCモノマーを用いるin vitroでの刺激が方法論的に不可能であり、そのためこの方法で試験することはできなかった。

表4： IMA910に含まれる10個のHLAクラスIペプチドの免疫原性

IMA910に含まれる11個のHLAクラスIペプチドのうち、immaticsによって実施された10個のin vitro免疫原性の実験結果をここにまとめた。ここに示す結果は、高密度ビーズによるCD8+細胞の刺激によって得たものである。ヒト血清ロットが異なると免疫原性の結果に大きく影響するため、同一の血清ロットのみを使用したアッセイのみを評価した。

IMA-CEA-004in vitroプライムT細胞
4/6のドナーが評価可能であった。 CEA-004での刺激により、4人のドナー全てで、CEA-004によるin vitroでのT細胞応答の誘発が見事に示された (表および図を参照)。したがって、CEA-004ペプチドが、in vitroのヒトCD8+T細胞応答の強力な誘発剤であることが証明された。重要なのは、CEA-005より高い頻度で、かつ再現性を持って、CEA-004に特異的なT細胞応答を引き出す能力がCEA-004にあることである (ウェルの64％に対してウェルの83％。表４（[表６]）を参照)。個々の陽性ウェル内でのCEA-004特異的細胞の頻度も、CEA-005プライミングよりもCEA-004プライミング後の方が高かった (図5を参照)。

4人のHLA-A*02健常ドナーのペプチド特異的in vitro CD8+T細胞応答 (フローサイトメトリー解析により測定)
CD8+T細胞は、それぞれCEA-004、CEA-005、または無関係ペプチド (IMA-RSL-001)を負荷した人工抗原提示細胞を用いて行った。 3サイクルの刺激後、CEA-004+CEA-005テトラマー (表5A（[表７Ａ]）)およびCEA-004+無関係A*0201-テトラマー (表5B（[表７Ｂ]）)で二重染色してペプチド応答性細胞を検出した。表に示す数字は、CEA-004+またはCEA-005+CTLを含むウェルのパーセンテージを表す。全ての実験で使用されたヒト血清のロットはC02104-0167であった。

CD8+T細胞をPBMCから単離し、それぞれCEA-004、RSL-001、またはDDX5-001を負荷した人工抗原提示細胞を用いてin vitroでプライムした。 3サイクルの刺激後、CEA-004- +無関係 A*0201- テトラマーで染色してペプチド応答細胞を検出した。上記の値は、刺激された各ウェルのCEA-004特異的細胞のパーセンテージを表す。 RSL-001およびDDX5-001の刺激は負対照として用いた。図5は、4 HLA-A2健常ドナーでのCEA-004特異的CD8+ T細胞の頻度 (CEA-005でのin vitro刺激後にフローサイトメトリー解析により測定)を示す。陽性ウェルの閾値は各ドナー別に (―)示されており、負対照の中央値の10倍、少なくとも1％と定められた。閾値以上の (> 1%)パーセンテージ値のウェルは陽性と見なしピンクの菱形で表し、陰性のウェルは黒の菱形で表した。

5. IMA９１０ MHCクラスII提示ペプチドのin vitro免疫原性
Tヘルパー細胞は、CTLが腫瘍細胞に対する免疫応答を活性化および持続するのを支援する重要な役割を果たす。したがって、MHCクラスIIペプチドをIMA910に含めた。IMA910に含まれる3つのクラスIIペプチドの1つであるTGFBI-004の免疫原性をin vitroで試験し、TGFBI-004が特異的CD4+およびCD8+T細胞の誘発剤であることを証明した。自己システムにおいて発揮された刺激を用いた実験で、CD4+および機能的CD8+Tリンパ球の生成が示された。

試験方式
特異的なヒトCD4+およびCD8+細胞のプライミングと拡大は、単球欠損PBMCを自己DCでプライムし、自己PBMCで再刺激することにより、in vitroアッセイした。要約すると、抗原特異的なCD4+T細胞を生成するために、1健常ドナーの単球欠損PBMC (HLAゲノタイプクラスI： A1/A25/B8/B18およびクラスII: DQB1*02/DQB1*06/DRB1*03/DRB1*15/DRB3/DRB5)を、ペプチドパルス自己DCを用いて刺激し、自己PBMC＋ペプチドで再刺激した。読み出しシステムとして、短期再刺激でのIFNγ 生成をELISPOTおよびフローサイトメトリーにより評価した。 T細胞はELISPOTによる8回刺激および細胞内IFNγ 染色＋CD4-FITCおよびCD8-PerCPの後に分析し、特異的なT細胞サブポピュレーションにおけるIFNγ生成細胞のパーセンテージを測定した。この実験では、異なるウェルからのTGFBI-004ペプチドで刺激した細胞をプールし、読み出しのために無関係ペプチドで培養し、負対照として施行した。

樹上細胞 (DC)の生成
ヒトDCは、10％自己血漿//100 U/mlペニシリンおよび100μg/mlストレプトマイシンを追加した、 RPMI 1640-Glutamax/25mM Hepes (Invitrogen, ドイツ) からなるDC培地で培養した単球から得た。まず、健常ドナーからの血液 (Bloodbank Tubingen)を遠心分離して軟膜と血漿を得た。次に、PBMCを、標準的な密度勾配分離 (Lymphocyte Separation Medium, PAA, オーストリア)によって軟膜から単離し、DC培地に再懸濁し、細胞合計数を測定した。 100〜120 MioのPBMCを洗浄し、15 mlのX-Vivo 20培地(BioWhittaker, ベルギー) で再懸濁し、細胞培養フラスコに移した。 37℃で2時間後、末梢血白血球 (PBL)を含む培地を取り除き、接着した単球を10mlのPBSで2回洗浄し、GM-CSFを100 ng/mlとIL-4 を30 ng/ml(ImmunoTools, ドイツ) または20 ng/ml (R&D systems, ドイツ)有する10ml DC培地で6日間培養した。3日目および5日目に、100 ng/mlのGM-CSFおよび30 ng/mlのIL-4 (Immunotools)または20 ng/mlのIL-4 (R&D Systems, ドイツ) を加えた。 7日目に、未熟のDCを10 ng/mlのTNF-α (R&D Systems, ドイツ) および20 μg/mlのpoly(IC) (Sigma Aldrich, ドイツ) または100 ng/mlのLPSで24時間活性した。残りのPBMCおよび入手したPBLは等分して冷凍した。

特異的T細胞のin vitroプライミング
CD4+T細胞を生成するために、3MioのPBMC/PBLを2x10⁵の自己DCで刺激した。 DCは8日目に収穫した (3.1章「DCの生成」を参照)。この目的のために、できるだけ多くの細胞 (接着細胞を含む)を収穫すべく、5mMのEDTAと共にPBSを用いた。 DC培地で洗浄後、細胞数を測定した。ペプチドを負荷するために、DCを1mlのDC培地に再懸濁し、25 μg/mlのペプチドで2時間、37℃で培養した。DCのパルシングに用いたペプチドは、TGFBI-004、Posmix (EBV とCMV関係ペプチドの混合物)、Padre、およびCMVである。自己PBMC/PBLは解凍し、DC培地で (少なくとも2度)洗浄し、1ml中3Mio 細胞/mlの密度で、24ウェルプレートに載せた。次に、ペプチドを負荷したDCを (該ペプチドを含む1ml懸濁液として)、該プレートに載せたPBMC/PBLに加え、37℃で7日間培養した。プライミング後に得られたCTLは、まず、凍結保存された自己ペプチドを負荷した放射線照射PBMCで再刺激した (30 Gy; Gammacell 1000 Elite, Nordion International, カナダ)。この目的で、5 x 10⁵ のCTLおよび2,5 x 10⁶ のPBMCをウェルに加えた。 PBMCのペプチドパルシングは (DCについて)前述した方法で行った。第1の刺激から1日目に、IL-2 (R&D Systems, ドイツ) およびIL-7を加え、各々2 ng/mlおよび5 ng/mlの最終濃度とした。その後、2日毎および7日毎に該培地にIL-2およびIL-7を加えた。第2の再刺激は7日後に行ったが、この時はペプチドを単独で (PBMCなしに)該培養CTLに加えた。 7日サイクルで、ペプチドを負荷したPBMCを加えるのとペプチドのみを加えるのを交互に行い、再刺激を施行した。 8回の刺激後、細胞内IFNγ 染色とIFNγ ELISPOTにより分析を行った。

結果
関心のあるペプチドに特異的に応答するCD4+T細胞株をプライムすることは可能であった (図2および図3)。 T細胞応答は、4つのT細胞株のうち2つにELISPOTで検出され、4つのT細胞株のうち3つに、TGFBI-004に特異的なIFNγ を生成するCD4+およびCD8+細胞がICSを介して示された。
したがって、TGFBI-004は、上述の実験システムで試験された1ドナーにCD4+およびCD8+T細胞応答を引き出すことができた。この有望な結果によると、このペプチドが免疫原性で、T細胞応答を誘発する能力を有する可能性は高い。

6. NOX-001およびTGFBI-001を例とした機能検証
IMA910に含まれるペプチドの免疫原性は、immaticsのTUMAP検証プラットフォームを用いてin vitroで実証された。特異的T細胞の誘発は、ペプチドがその免疫系を活性化する能力を示す指標である。効率的な抗腫瘍免疫応答は、活性化されたT細胞のアビディティが高く機能的な場合のみ可能であるので、IFNγを生成するまたは腫瘍細胞株を殺すそれらの能力によって、高アビディティで機能的なTリンパ球をプライムするために、我々はTUMAPをさらに調査した。より厳しい検証のために、高アビディティのCTLをin vitroで誘発する能力のある2つのペプチド、NOX-001およびTGFBI-001を選んだ。ヒトにおいて両方のペプチドに対して高アビディティの前駆T細胞が存在すること、および機能的CD8+T細胞株をNOX-001で生成可能であることを、証明することができた。

試験方式
IMA910のペプチドの免疫原性および特異的T細胞の特性についてより深く知るために、2つのペプチド (NOX-001およびTGFBI-001)を選択し、さらに詳しく評価した。この目的で実施された実験は、immaticsで実行された (細胞のソートはUniversity of TubingenのBuehring博士の研究室で実施された)。

高密度または低密度抗原によってそれらが活性化される能力によって、T細胞株を高アビディティまたは低アビディティに分けた。すでに示されているように (Walter, S, Herrgen, L, Schoor, O, Jung, G, Wernet, D, Buhring, HJ, Rammensee, HG, and Stevanovic, S; Cutting edge: predetermined avidity of human CD8 T cells expanded on calibrated MHC/anti-CD28-coated microspheres, J. Immunol., 2003, 171, 4974-4978)、低アビディティのCD8+T細胞に比べて少ないペプチドで活性化し、ヒトの高アビディティCTLを誘起することができた。また、この方法で拡大した細胞が抗原発現腫瘍細胞株をより効率的に認識することも実証され、したがって、療法戦略の開発における主要なツールとなり得ることが実証された。

ペプチドが高アビディティのCTL株を生成する能力を測定するために、単離したヒトCD8+細胞をプライムし、IL-12およびIL-2存在下で、低密度pMHC (ペプチド-MHC複合体)で被覆したビーズと抗CD28抗体によるin vitro刺激を繰り返して拡大した。3回の刺激後、in vitroプライムしたT細胞の画分をpMHC-テトラマーで染色し、サイトメトリー解析で検出した。後に、各ドナーのテトラマー陽性細胞を抗原の特異性にしたがってプールし、pMHC-テトラマーとヒト抗CD8-FITC抗体で染色し、最後に、FACSAriaでFACSソートした。ソートした細胞を培養し、放射線照射フィーダー細胞、サイトカイン、およびマイトジェンの存在下で拡大した。プライムした高アビディティの抗原特異的細胞の生成の読み出しとして、pMHC-テトラマー染色を実施した。それらの機能性を測定するために、IFNγ生成をELISPOTによってアッセイし、腫瘍細胞株の殺傷を、対応するペプチドおよび腫瘍細胞株による細胞の再刺激後に生/死染色する細胞傷害性アッセイを用いて検査した。

特異的CD8+T細胞株の生成
ペプチド-MHC複合体 (pMHC)を負荷した人工抗原提示細胞(aAPC)と抗CD28抗体を用いるin vitroでの刺激は、上述の方法で実施した。上述の方法との唯一の違いは、200ngの関係MHC (高密度ビーズ)の代わりに、2ngの関係および200ngの無関係ライブラリ (pMHC)MHC (低密度ビーズ)で負荷したビーズで刺激を施行したことである。こうして、ペプチドをより深く検証するための主に高アビディティのT細胞が生成された。3回の刺激後、in vitroでプライムされたT細胞の画分をpMHC-テトラマー染色し、サイトメトリー解析により検出した。与えられた抗原の免疫原性は、in vitroでの刺激後に特異的CD8+T細胞株を含む、一健常ドナーの評価可能なin vitro刺激ウェルが少なくとも1つあれば検出された (すなわち、このウェルは、CD8+T細胞中に少なくとも1％の特異的テトラマー＋を含んでおり、特異的なテトラマー+細胞は負対照の刺激の中央値の少なくとも10倍であった)。後に、各ドナーのテトラマー陽性細胞を抗原の特異性にしたがってプールし、対応するpMHC-テトラマーとヒト抗CD8-FITC抗体クローンSK1で染色し、最後に、FACSAria (BD Biosciences、ドイツ)でFACSソートした。ソートした細胞を、5 x 10⁵細胞/mlの放射線照射した新鮮な同種PBMC、5 x 10⁴細胞/mlの放射線照射したLG2-EBV細胞、150 U/mlのIL-2 (Chiron, ドイツMunich市)、および0.5 μg/mlのPHA-L (Roche Diagnostics, ドイツMannheim市)の存在下で、T細胞培地 (10％加熱不活性化したヒトAB血清、100 U/mlのペニシリン、100 μg/mlのストレプトマイシン、1mMのピルビン酸ナトリウム、および20 μg/mlのゲンタマイシンを追加したRPMI-Glutamax)で培養した。これらの細胞の拡大は、150 U/mlのIL-2を含むT細胞培地で生じた。プライムされた高アビディティの抗原特異的細胞の生成の読み出しとして、pMHC-テトラマー染色を上述のように実施し、4色FACSCalibur (BD Biosciences、ドイツ)で解析した。

機能性試験
それらの機能性を測定するために、対応するペプチドでそれらの細胞を再刺激した後、ELISPOT (IFNγ ELISPOT Set, BD, ドイツ)でIFNγの生成を評価した。加えて、LIVE/DEAD細胞媒介細胞傷害性キット (L7010、Invitrogen、ドイツ)を用い、腫瘍細胞株の殺傷によって、特異的CTLの細胞媒介細胞傷害性を調査した。別に記述しない限り、アッセイは両方とも製造業者の指示通りに行った。

結果
ペプチドNOX-001およびTGFBI-001は両方とも、低pMHC密度のaAPCによるプライムの成功が示すように、in vitroで免疫原性であった。 NOX-001およびTGFBI-001の両方について、T細胞株がFACSによって確立可能であったことにより、健常ドナーに高アビディティのCD8+細胞前駆体が存在することが実証された。

加えて、NOX-001では、このペプチドでの再刺激後にIFNγを特異的に発現したことからELISPOTによって機能性が証明された1つのT細胞株を確立することができた (図4)。

7. 本発明のHLAクラスI拘束ペプチドとHLA-A*0201の結合
該HLA-A*0201対立遺伝子によってコードされるMHC分子に対する該HLAクラスIペプチドのアフィニティはIMA910の作用形態にとり重要なパラメーターであり、したがって、この分析の目的はそれを評価することである。 IMA910のHLAクラスI拘束ペプチド10個のうち9個に関し、解離定数 (KD)は0.001〜0.2nMの範囲であり、HLA-A*0201に対するアフィニティは高かった。また、ウィルスマーカーペプチドであるIMA-HBV-001も強結合を示した。 IMA-MUC-001に対するアフィニティは、約102弱かった。これらの結果により、IMA910ワクチン候補の10個のHLAクラスIペプチドのうち9個の、MHC分子に対する強い結合アフィニティが確認された。

試験方式
安定したHLA/ペプチド複合体は、 HLA重鎖、β-2ミクログロブリン(b2m)、およびそのペプチドリガンドという3つの分子からなる。変性した組み換えHLA-A*0201重鎖分子のみの活性は保存できるので、これらの分子は「空のHLA-A*0201分子」と機能的に同等である。 b2mおよび適切なペプチドを含む水性緩衝液中に希釈すると、これらの分子は急速かつ効率的に、完全にペプチドに依存した方法で折り畳まれる（フォールドする）。これらの分子のアベイラビリティは、ペプチドとHLAクラスI分子の相互作用のアフィニティを測定するために、ELISAを使用するアッセイで使われている (Sylvester-Hvid et al., 2002)。

精製された組み換えHLA-A*0201分子を、b2mおよび段階的用量の関心ペプチドとともに培養した。新たに折り畳まれた(フォールドされた)HLA/ペプチド複合体の量は、定量ELISAによって測定した。解離定数 (KD値)は、calibrantのHLA/ペプチド複合体の希釈から記録された基準曲線を用いて計算した。

結果
結果を図6に示す。KD値が低いほど、HLA-A*0201に対するアフィニティが高い。ほとんどのIMA910ペプチドおよびウィルス対照ペプチドIMA-HBV-001は、0.001 (IMA-TGFBI-001)〜0.2 nM (IMA-ODC-001)の範囲で、類似した強いアフィニティをHLA-A*0201に対して有していた。 IMA-MUC-001のアフィニティは、それらに含まれるリガンドの大半に比べ、約２から３桁低かった。しかし、IMA-MUC-001でのワクチン接種は、immaticsが実施した先の治験で腎細胞癌患者に免疫応答を引き出しており、したがって、IMA-MUC-001の結合アフィニティの方が低いことは懸念要因ではない。

Claims

配列番号８に記載のアミノ酸配列（ＳＰＱＹＳＷＲＩＮＧＩＰＱＱＨＴ）からなるペプチド。
ヒト主要組織適合性複合体（MHC）クラスII分子に結合できる、請求項１に記載のペプチド。
ペプチドは非ペプチド結合を含む、請求項１または２に記載のペプチド。
請求項１に記載のペプチドおよびHLA-DR抗原関連不変鎖のN-末端アミノ酸を含む融合ペプチド。
請求項１〜４のいずれか１つに記載のペプチドをコードする核酸。
核酸が、DNA、cDNA、RNA、もしくはこれらの組合わせであるか、または前記核酸が作動可能に組み込まれた発現ベクターである、請求項５に記載の核酸。
宿主細胞が、ヒト胚性幹細胞を除くものであり、樹状細胞を含む抗原提示細胞である、請求項５または６に記載の核酸または発現ベクターを含む宿主細胞。
活性化された細胞傷害性Tリンパ球（CTL）を作製するインビトロ方法であって、適切な抗原提示細胞の表面に発現するヒトMHCクラスIまたはII分子に負荷された抗原とCTLを抗原特異的にCTLが活性化されるのに十分な時間接触させることを含む方法であり、該抗原が請求項１〜４のいずれか１つに記載のペプチドである、インビトロ方法。
請求項１または２に記載のペプチドを含むポリペプチドを異常発現する細胞を選択的に認識する、請求項８に記載の方法で作製される活性化された細胞傷害性Tリンパ球（CTL）。
癌の治療用医薬品製造のための、請求項１〜４のいずれか１つに記載のペプチド、請求項５もしくは６に記載の核酸もしくは発現ベクター、請求項７に記載の細胞または請求項９に記載の活性化CTLの使用。
癌がグリア芽腫、結腸直腸癌、膵臓癌、肺癌、腎臓癌または胃癌である、請求項１０に記載の使用。
医薬品がワクチンである、請求項１０または１１に記載の使用。