ES2612466T3 - Composición de péptidos asociados a tumores y vacuna contra el cáncer relacionada con ellos para el tratamiento del glioblastoma (GBM) y de otros tipos de cáncer - Google Patents

Abstract

Composición farmacéutica, que comprende el péptido con la SEQ ID N.º 1 y el péptido con la SEQ ID N.º 2, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

Description

imagen1

imagen2

imagen3

Localización

Estimación de nuevos casos Estimación de fallecimientos

Ambos sexos

Varones Mujeres Ambos sexos Varones Mujeres

Glioma y cerebro

20.500 11.170 9.330 12.740 7.150 5.590

Mama

180.510 2.030 178.480 40.910 450 40.460

Próstata

218.890 218.890 27.050 27.050

Esófago

15.560 12.130 3.430 13.940 10.900 3.040

Colon

112.340 55.290 57.050 52.180 26.000 26.180

Riñón

51.190 31.590 19.600 12.890 8.080 4.810

Páncreas

37.170 18.830 18.340 33.370 16.840 16.530

Carcinomas escamocelulares; neoplasias queratinocíticas cutáneo

1.000.000 sin datos sin datos sin datos sin datos sin datos

Leucemia

44.240 24.800 19.440 21.790 12.320 9.470

Pulmón

213.380 114.760 98.620 160.390 89.510 70.880

Linfoma no hodgkiniano

63.190 34.210 28.990 18.660 9.600 9.060

Ovarios

22.430 22.430 15.280 15.280

Melanoma

59.940 33.910 26.030 8.110 5.220 2.890

Así pues, sigue existiendo necesidad de nuevas opciones de tratamiento eficaz y seguro para el glioblastoma, tumor de próstata, cáncer de mama, cáncer de esófago, cáncer colorrectal, carcinoma de células claras de células renales, cáncer de pulmón, del SNC, cáncer de ovarios, melanoma, cáncer de páncreas, carcinomas escamocelulares,

5 leucemia y meduloblastoma, así como para otros tumores que muestran una sobreexpresión de survivina, de forma que se mejore el bienestar de los pacientes sin utilizar quimioterapia u otros fármacos que puedan provocar efectos secundarios graves.

WO 2005/116051 da a conocer el péptido de la SEQ ID N.º 1 en el contexto del cáncer renal (CCR).

Descripción detallada de la invención

10 Todos los términos utilizados en la presente memoria se definen del modo indicado a continuación a menos que se indique lo contrario. El término «péptido» designa aquí una serie de residuos de aminoácidos conectados entre sí típicamente mediante enlaces peptídicos entre los grupos amino-alfa y carbonilo de los aminoácidos adyacentes. Los péptidos tienen preferiblemente 9 aminoácidos de longitud.

El término «oligopéptido» designa aquí una serie de residuos de aminoácidos conectados entre sí típicamente

15 mediante enlaces peptídicos entre los grupos amino-alfa y carbonilo de los aminoácidos adyacentes. La longitud del oligopéptido no es crucial en la invención, siempre que se mantenga el epítopo o epítopos adecuados. Los oligopéptidos suelen tener una longitud inferior a unos 30 aminoácidos y mayor de 14, aproximadamente.

El término «polipéptido» designa una serie de residuos de aminoácidos conectados entre sí típicamente por enlaces peptídicos entre los grupos amino-alfa y carbonilo de los aminoácidos adyacentes. La longitud del polipéptido no es

20 crucial en la invención, siempre que se mantengan los epítopos adecuados. En contraste con los términos «péptido» y «oligopéptido», el término «polipéptido» se refiere a las moléculas de más de unos 30 residuos de aminoácidos de longitud

Un péptido, oligopéptido, proteína o polinucleótido que codifica dicha molécula es «inmunogénico» (y, por lo tanto, un inmunógeno en la presente invención), si es capaz de inducir una respuesta inmunitaria. En el caso de la 25 presente invención, la inmunogenicidad se define más específicamente como la capacidad para desatar una respuesta por parte de los linfocitos Tipo lo tanto, un inmunógeno sería una molécula que es capaz de inducir una

5

imagen4

imagen5

imagen6

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

Las sustituciones menos conservadoras pueden implicar el reemplazo de un aminoácido por otro con características similares pero diferenciado de alguna manera en el tamaño, como en el reemplazo de un residuo de isoleucina por alanina. Los reemplazos muy poco o nada conservadores pueden implicar la sustitución de un aminoácido ácido por otro polar, o incluso por uno de carácter básico. Estas sustituciones «radicales» no se pueden descartar, sin embargo, como potencialmente inefectivas, ya que los efectos químicos no son totalmente predecibles y las sustituciones radicales bien pueden provocar efectos inesperados imposibles de predecir de otra forma a partir de principios químicos simples.

Naturalmente, dichas sustituciones pueden implicar otras estructuras distintas de los aminoácidos L habituales. De esta forma, aminoácidos D podrían sustituir a los aminoácidos L que habitualmente se encuentran en los péptidos antigénicos de la invención y, aún así, quedar englobados en la descripción del presente documento. Además, los aminoácidos que poseen grupos R no estándar (es decir, grupos R distintos de los presentes en los 20 aminoácidos comunes de las proteínas naturales) también pueden ser utilizados como sustitutos para producir inmunógenos y polipéptidos inmunogénicos de conformidad con la presente descripción.

Si se descubre que las sustituciones en más de una posición dan lugar a un péptido con actividad antigénica sustancialmente equivalente o mayor, como se define más abajo, entonces las combinaciones de dichas sustituciones se probarán para determinar si las sustituciones combinadas provocan efectos aditivos o sinérgicos en la antigenicidad del péptido. Como máximo, se sustituirán hasta 4 posiciones simultáneamente dentro del péptido.

El término «respuesta de linfocitos T» define la proliferación y la activación específicas de las funciones efectoras inducidas por un péptido in vitro o in vivo. En el caso de los linfocitos T citotóxicos (CTL) restringidos a MHC de clase I, las funciones efectoras pueden consistir en la lisis de células diana presentadoras naturales de péptido o bien sensibilizadas de manera repetida con un péptido o con un precursor del mismo; la secreción de citocinas, preferiblemente de interferón gamma, TNF-alfa o IL-2 inducida por péptido; la secreción de moléculas efectoras, preferiblemente granzimas o perforinas inducidas por péptido; o la desgranulación. En el caso de los linfocitos T cooperadores restringidos a MHC de clase II, las funciones efectoras pueden ser la secreción inducida por péptido de citocinas, preferiblemente de IFN-gamma, TNF-alfa, IL-4, IL-5, IL-10 o IL-2, o la desgranulación inducida por péptido. Las funciones efectoras posibles de los CTL y de los linfocitos T cooperadores no se limitan a esta lista.

Abordajes inmunoterapéuticos para el tratamiento

La estimulación de una respuesta inmunitaria depende de la presencia de antígenos que sean reconocidos como extraños por el sistema inmunitario del hospedador. El descubrimiento de la existencia de antígenos asociados a tumores ha suscitado la posibilidad de utilizar el sistema inmunitario del hospedador para intervenir sobre el crecimiento de los tumores. Actualmente se están explorando diversos mecanismos para aprovechar los mecanismos de defensa humorales y celulares del sistema inmunitario en la inmunoterapia contra el cáncer.

Ciertos elementos de la respuesta inmunitaria celular son capaces de reconocer específicamente y destruir las células tumorales. El aislamiento de linfocitos T citotóxicos (CTL) entre las células infiltradas en los tumores o en la sangre periférica hace pensar que tales células desempeñan un papel importante en las defensas inmunitarias naturales contra el cáncer. En concreto, en dicha respuesta desempeñan un papel importante los linfocitos T CD8positivos, los cuales reconocen péptidos incorporados en las moléculas de clase I del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC), que normalmente están compuestos por 8 a 10 residuos de aminoácidos procedentes de proteínas o productos ribosómicos defectuosos (DRIP) localizados en el citosol (Schubert U, Antón LC, Gibbs J, Norbury CC, Yewdell JW, Bennink JR.; Rapid degradation of a large fraction of newly synthesized proteins by proteasomes; Nature 2000; 404(6779):770-774). Las moléculas MHC del ser humano también se denominan antígenos leucocitarios humanos (HLA).

Existen dos clases de moléculas MHC: las moléculas MHC de clase I, que se encuentran en la mayoría de células nucleadas y presentan péptidos derivados de la escisión proteolítica principalmente de proteínas endógenas, citosólicas o nucleares, DRIPS y péptidos grandes. No obstante, los péptidos derivados de compartimentos endosómicos o de fuentes exógenas también se encuentran con frecuencia ligados a moléculas de MHC de clase I. Esta vía no clásica de presentación por la clase I se denomina presentación cruzada en la bibliografía. Las moléculas de MHC de clase II, presentes mayoritariamente en las células presentadoras de antígeno (APC) especializadas, presentan predominantemente péptidos de proteínas exógenas que son captadas por las APC mediante endocitosis y después son procesadas por las mismas. Al igual que en la clase I, en las moléculas de MHC de clase II se han descrito otras vías alternativas para el procesamiento de antígenos que permiten a los péptidos procedentes de fuentes endógenas ser presentados por ellas (p. ej., autofagocitosis). Los complejos formados por un péptido y una molécula de MHC de clase I son reconocidos por los linfocitos T citotóxicos CD8-positivos portadores del TCR apropiado y, por su parte, los complejos formados por un péptido y una molécula de MHC de clase II son reconocidos por los linfocitos T cooperadores CD4-positivos portadores del TCR apropiado.

Los linfocitos T cooperadores CD4+ cumplen un importante papel en la organización de las funciones efectoras de las respuestas antitumorales de los linfocitos T y, por esta razón, la identificación de los epítopos derivados de antígenos asociados a tumor (AAT) que reconocen los linfocitos T CD4+ puede ser de gran importancia para el desarrollo de productos farmacéuticos que desencadenen respuestas inmunitarias antitumorales (Gnjatic, S., D.

9

imagen7

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

La inmunoterapia en pacientes con cáncer tiene por objeto activar específicamente células del sistema inmunitario, sobre todo los llamados linfocitos T citotóxicos (CTL, también llamados «células asesinas» o linfocitos T CD8positivos), contra las células tumorales pero no contra el tejido sano. Las células tumorales difieren de las células sanas por la expresión de proteínas asociadas a tumor. Las moléculas HLA situadas en la superficie de la célula presentan partes del contenido celular al exterior, lo cual permite a los linfocitos T citotóxicos distinguir una célula sana de una tumoral. Esto se lleva a cabo descomponiendo todas las proteínas del interior de la célula en péptidos cortos que a continuación se ligan a moléculas HLA y se presentan en la superficie celular (Rammensee et al., 1993). Los péptidos que son presentados en las células tumorales, pero nada o muy poco en las células sanas del cuerpo, se denominan péptidos asociados a tumor (TUMAP).

Para que las proteínas sean reconocidas por los linfocitos T citotóxicos como antígenos específicos o asociados a tumor y puedan ser empleadas como tratamiento, deben cumplir ciertos prerrequisitos. El antígeno debe ser expresado principalmente por células tumorales y no por tejidos sanos normales o, de hacerlo, deben serlo en cantidades comparativamente pequeñas. Y no solo es conveniente que el antígeno de interés esté presente únicamente en un tipo de tumor, sino que lo esté también en altas concentraciones (número de copias del péptido por célula). Los antígenos específicos de tumor y asociados a tumor proceden a menudo de proteínas que intervienen directamente en la transformación de una célula normal en una célula tumoral a causa de su función, por ejemplo porque intervienen en el control del ciclo celular o en la apoptosis. Además, también las dianas ulteriores de las proteínas que son las causantes directas de la transformación pueden estar reguladas al alza y, por tanto, estar asociadas indirectamente al tumor. Tales antígenos asociados indirectamente a los tumores también pueden ser las dianas para una estrategia de vacunación. En ambos casos es esencial que la secuencia de aminoácidos del antígeno contenga epítopos, puesto que el péptido (péptido inmunogénico) derivado de un antígeno asociado a tumor debe desencadenar una respuesta de los linfocitos T en condiciones in vitro o in vivo.

Básicamente, cualquier péptido capaz de unirse a una molécula de MHC puede actuar como un epítopo de linfocito

T. Un prerrequisito para la inducción de una respuesta de linfocitos T in vitro o in vivo es la presencia de un linfocito T dotado del correspondiente TCR y la ausencia de tolerancia hacia ese epítopo en particular. Los linfocitos T cooperadores desempeñan un papel importante en la coordinación de la función efectora de los CTL en la inmunidad antitumoral. Los epítopos reconocidos por los linfocitos T cooperadores que desencadenan una respuesta de los linfocitos T cooperadores del tipo TH1 apoyan las funciones efectoras de los CTL CD8+, que incluyen funciones citotóxicas dirigidas contra las células tumorales que muestran en su superficie complejos de MHC/péptido asociado a tumor. De esta forma, los epítopos de los péptidos asociados a tumores que son reconocidos por los linfocitos T cooperadores, solos o en combinación con otros péptidos asociados a tumores, pueden servir como principios activos farmacéuticos en composiciones vacunales destinadas a estimular respuestas inmunitarias antitumorales.

Dado que ambos tipos de respuesta, la dependiente de CD8 y la de CD4, contribuyen conjunta y sinérgicamente al efecto antitumoral, la identificación y caracterización de los antígenos asociados a tumor reconocidos por los CTL CD8+ (moléculas de MHC de clase I) o por los CTL CD4-positivos (moléculas de MHC de clase II) es importante para el desarrollo de vacunas antitumorales. Por consiguiente uno de los fines de la presente invención consiste en proveer composiciones de péptidos que contengan péptidos de unión a complejos MHC de cualquiera de las clases.

Los primeros ensayos clínicos con péptidos asociados a tumores fueron iniciados a mediados de la década de 1990 por Boon y cooperadores, principalmente para la indicación de melanoma. Las mejores respuestas clínicas en los ensayos oscilaron entre el 10% y el 30%. En ningún ensayo clínico sobre una vacuna peptídica en monoterapia se han descrito efectos adversos graves o autoinmunidad severa. Se han descrito formas leves de vitíligo en algunos pacientes que habían sido tratados con péptidos asociados a melanoma.

Sin embargo, la sensibilización de un tipo de CTL no suele bastar para erradicar todas las células tumorales. Los tumores mutan mucho y, por tanto, son capaces de responder rápidamente a los ataques de los CTL cambiando su patrón de proteínas para no ser reconocidos por estos. A fin de contrarrestar los mecanismos de evasión tumoral, en la vacunación se emplean diversos péptidos específicos. De este modo se puede desplegar un amplio ataque simultáneo contra el tumor por parte de varios clones de CTL a la vez. Así se puede reducir la posibilidad de que el tumor eluda la respuesta inmunitaria. Esta hipótesis ha sido confirmada recientemente en un estudio clínico que trataba a pacientes con melanoma avanzado. Con pocas excepciones, los pacientes que presentaban al menos tres respuestas de linfocitos T distintas, manifestaron respuestas clínicas objetivas o enfermedad estable (Banchereau et al., 2001) así como un aumento de la supervivencia (comunicación personal de J. Banchereau), mientras que a la inmensa mayoría de los pacientes con menos de tres respuestas de los linfocitos T se les diagnosticó enfermedad en progresión.

En un estudio de los solicitantes se observaron efectos semejantes en pacientes aquejados por carcinoma de células renales que fueron tratados con una vacuna compuesta de 13 péptidos distintos (H. Singh-Jasuja, S. Walter,

T. Weinschenk, A. Mayer, P. Y. Dietrich, M. Staehler, A. Stenzl, S. Stevanovic, H. Rammensee, J. Frisch; Correlation of T-cell response, clinical activity and regulatory T-cell levels in renal cell carcinoma patients treated with IMA901, a novel multi-peptide vaccine; Reunión de ASCO 2007 Póster n. º 3017; M. Staehler, A. Stenzl, P. Y. Dietrich, T. Eisen,

A. Haferkamp, J. Beck, A. Mayer, S. Walter, H. Singh, J. Frisch, C. G. Stief; An open label study to evaluate the safety and immunogenicity of the peptide based cancer vaccine IMA901, Reunión de ASCO 2007; Póster n. º 3017).

11 5

10

15

20

25

30

35

La tarea más importante en el desarrollo de una vacuna antitumoral no solo consiste en identificar y caracterizar nuevos antígenos asociados a tumores y los epítopos inmunogénicos para los linfocitos T cooperadores derivados de los mismos, sino también en combinar diferentes epítopos para aumentar las probabilidades de obtener una respuesta contra más de un epítopo en cada paciente. Por consiguiente, uno de los objetos de la presente invención consiste en ofrecer combinaciones de secuencias de aminoácidos de péptidos que tengan la capacidad de unirse a una molécula del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) de clase I (HLA de clase I). Otro objeto de la presente invención consiste en ofrecer una vacuna antitumoral eficaz que esté basada en una combinación de los péptidos.

En la presente invención, los inventores aislaron directamente de tumores de mamífero y después caracterizaron péptidos que se unen a moléculas HLA de clase I o II, es decir, muestras primarias procedentes principalmente de pacientes con glioblastoma, pero también muestras de tejido primario de cáncer colorrectal, carcinoma de células renales, cáncer de pulmón, cáncer de páncreas, melanoma maligno y cáncer de estómago.

La presente invención también proporciona péptidos que proceden de antígenos asociados con la oncogénesis, y que tienen la capacidad de unirse lo suficiente a moléculas de MHC (HLA) de clase I para desencadenar una respuesta inmunitaria por parte de los leucocitos humanos, especialmente de los linfocitos, especialmente de los linfocitos T, especialmente de los linfocitos T citotóxicos CD8-positivos, así como combinaciones de los dos que sean especialmente útiles para la vacunación de pacientes aquejados de cáncer.

De acuerdo con la presente invención, el objeto se resuelve proporcionando una composición farmacéutica que comprende el péptido con la SEQ ID N.º 1 y el péptido con la SEQ ID N.º 2, y N.ºun vehículo farmacéuticamente aceptable. Las composiciones farmacéuticas de la presente invención también pueden comprender, además, como mínimo otro péptido adicional constituido por una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo consistente en la SEQ ID N.º N.º3 a SEQ ID N.º 20. Los péptidos también pueden incluir enlaces no peptídicos.

Tal y como se describe en la presenta memoria más adelante, se ha comprobado que, con la excepción de MET005, todos los péptidos que forman la base de la presente invención son presentados por células portadoras de MHC de clase I o II. Así pues, estos péptidos concretos, así como otros péptidos que contengan la secuencia (péptidos derivados), desencadenan una respuesta de linfocitos T específicos, aunque la magnitud de esa respuesta puede variar según el péptido de que se trate y según el paciente. Las diferencias, entre otras razones, podrían deberse a mutaciones en los péptidos. La persona versada en la materia conoce bien los métodos aplicables para determinar la magnitud de la respuesta que desata un péptido concreto, en particular si consulta los ejemplos expuestos en la presente memoria y en la bibliografía correspondiente.

Los péptidos proceden de antígenos asociados a tumores, especialmente de antígenos asociados a tumores que intervienen en procesos como, por ejemplo, la proteólisis, angiogénesis, crecimiento celular, regulación del ciclo celular, división celular, regulación de la transcripción, regulación de la traducción, invasión de tejidos, etc. La Tabla 3 expone los péptidos y la función de la proteína de la cual derivan.

Tabla 3: Péptidos que se dan a conocery función de la proteína original, las SEQ ID N.º 1 y 2 son de la invención

SEQ ID N.º

ID del péptido Secuencia Símbolo del gen Función Se une a MHC

1

CSP-001 TMLARLASA CSPG4 Proteoglucano transmembrana implicado en la neovascularización HLA-A*02

2

FABP7001 LTFGDVVAV FABP7 Proteína de unión a ácidos grasos específica del SNC HLA-A*02

3

NLGN4X001 NLDTLMTYV NLGN4X Molécula de adhesión celular HLA-A*02

4

TNC-001 AMTQLLAGV TNC Proteína de matriz extracelular HLA-A*02

5

NRCAM001 GLWHHQTEV NRCAM Molécula de adhesión a células neuronales HLA-A*02

6

IGF2BP3001 KIQEILTQV IGF2BP3 Proteína de unión a ARNm HLA-A*02

7

BCA-002 ALWAWPSEL BCAN Proteoglucano HLA-A*02

8

MET-005 TFSYVDPVITSISPKYG MET Receptor de factor de crecimiento TUMAP de HLA de clase I elongado

12 5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

Proteoglucano de sulfato de condroitina 4 (CSPG4)

El CSPG4 (proteoglucano de sulfato de condroitina) representa un proteoglucano de sulfato de condroitina integrado en la membrana. Es conocido por ser un marcador superficial de progresión precoz del melanoma, implicado en la estimulación de la proliferación, la migración y la invasión de las células tumorales. El CSPG4 se expresa intensamente en >90% de las lesiones de melanoma humano. Aunque el CSPG4 no es estrictamente específico de tumor, las respuestas de los linfocitos T CD4+ reactivos a tumores en pacientes con melanoma y en individuos sanos reconocen el CSPG4693-709 en células de melanoma que expresan el HLA-DR11 en ausencia de autoinmunidad (Erfurt et al., 2007).

La expresión del CSPG4 potencia la diseminación de las células mediada por integrinas, la fosforilación de FAK (cinasa de adhesión focal) y la activación de ERK1/2 (cinasa regulada por señal extracelular) (Yang et al., 2004). Asimismo, existen cada vez más indicios procedentes de datos in vitro de que el CSPG4 desempeña un importante papel en la angiogénesis tumoral. Así pues, en los tumores positivos para CSPG4 se ha observado una tasa de neovascularización y volúmenes vasculares notablemente elevados, y se ha comprobado que el CSPG4 secuestra la angiostatina, cosa que normalmente inhibe la proliferación de las células endoteliales y la angiogénesis. Los vasos inmaduros también contienen pericitos positivos para CSPG4, lo cual apunta a la intervención de esta población celular en la modulación de la proliferación de las células endoteliales por medio del bloqueo de los efectos inhibitorios de la angiostatina durante el desarrollo de los vasos (Chekenya et al., 2002b).

La expresión de CSPG4 también ha sido descrita en algunos tejidos normales aparte de en los pericitos activados en las células endoteliales, condrocitos, células musculares lisas, ciertos queratinocitos basales de la epidermis, así como en células del folículo piloso (Campoli et al., 2004).

En el curso de la angiogénesis y como respuesta a patologías del SNC, las células de alta motilidad que expresan el CSPG4 sufren rápidos cambios morfológicos y son reclutadas en puntos donde está teniendo lugar crecimiento y reparación vascular. El CSPG4 se sobreexpresa tanto en las células tumorales como en los pericitos de los vasos sanguíneos de tumores cerebrales malignos (Chekenya and Pilkington, 2002). Con la implantación de células procedentes de una línea celular humana de glioma positiva para CSPG4 en cerebros de ratas atímicas inmunodeficientes se pudo demostrar que estos tumores presentan una densidad microvascular superior a la de las ratas control, lo cual implica que la expresión del CSPG4 regula tanto la función como la estructura de la vasculatura tumoral derivada del hospedador (Brekke et al., 2006). En un experimento de xenoinjerto consistente en implantar material biópsico de GBM a ratas atímicas, el CSPG4 se identificó como asociado principalmente a los vasos sanguíneos tanto en los pericitos como en los componentes de la membrana basal de la vasculatura tumoral y su expresión también estuvo asociada con zonas de elevada proliferación celular (Chekenya et al., 2002a). Además, la expresión del CSPG4 corrió paralela a la progresión del tumor en un modelo de implantación de glioma (Wiranowska et al., 2006). La progresión maligna se mantiene por la intercomunicación entre el tumor y su estroma, por la cual el estroma activado nutre a las células neoplásicas proliferativas e invasivas, aportando nueva vasculatura, componentes de la matriz extracelular y factores de crecimiento estimuladores. En ese contexto, elCSPG4 desempeña un papel importante en la activación del tumor-estroma a través de alteraciones en la adhesión, migración y proliferación celulares y en la morfogénesis vascular (Chekenya and Immervoll, 2007).

El CSPG4 se expresa diferencialmente en los gliomas humanos, con mayor expresión en los gliomas de alto grado que en los de bajo (Chekenya et al., 1999). La elevada expresión del CSPG4 aparece correlacionada con la multirresistencia farmacológica mediada por el aumento de la activación de la vía de señalización de la 31integrina/PI3K y sus dianas ulteriores, que promueve la supervivencia de la célula (Chekenya et al., 2008).

Proteína de unión a ácidos grasos 7, cerebro (IMA-FABP7-001)

Las proteínas de unión a ácidos grasos (FABP) son proteínas citosólicas de 14-15 kDa, que supuestamente intervienen en la captación, transporte y orientación de los ácidos grasos (AG). Se cree que aumentan la solubilidad de los AG en el citoplasma durante su transporte entre los compartimentos con membrana y que transportan los AG hasta sus destinos nucleares (Glatz et al., 2002). Las FABP podrían modular la concentración de AG y de este modo influir en varias funciones celulares como la actividad enzimática, la expresión génica y el crecimiento y diferenciación celular (Glatz and Storch, 2001).

El tejido nervioso alberga cuatro de los nueve tipos de FABP conocidos, con una distribución espacio-temporal característica (Veerkamp and Zimmerman, 2001). La FABP7 se expresa mucho en las células gliales radiales en todo el sistema nervioso central en desarrollo, pero después disminuye gradualmente en el adulto (Feng and Heintz, 1995; Shimizu et al., 1997). Es necesaria para la diferenciación de la glía inducida por las neuronas y la subsiguiente migración de las neuronas a lo largo de las prolongaciones gliales, pero no ejerce efecto alguno en la proliferación y la adhesión celular (Feng et al., 1994; Kurtz et al., 1994). En las células de Schwann la expresión de FABP7 depende de la vía de señalización del EGFR independiente de Ras, y regula las interacciones entre dichas células y los axones en los nervios periféricos normales y en los tumores de nervios periféricos (Miller et al., 2003).

El ARNm de la FABP7 se expresa en tejidos de origen neuroepitelial, así como en gliomas (grados III y IV de la OMS). El gen se ha localizado en la banda cromosómica 6q22-23, región que también acoge el protooncogén c-myc

13 5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

y que con frecuencia sufre pérdida de heterocigosidad en el glioma. El análisis de estirpes celulares de glioma ha demostrado que la FABP7 se coexpresa a menudo con la proteína ácida fibrilar de la glía (GFAP), lo cual sugiere que la célula de origen del glioma maligno podría ser una célula precursora de astrocitos que es capaz de expresar ambas proteínas en condiciones normales o como resultado de la formación de un tumor (Godbout et al., 1998). La proteína FABP7 presenta una expresión moderada o intensa en el núcleo y en el citoplasma en el marco del GBM. Las células de glioma transfectadas con FABP7 presentan una migración cinco veces mayor que las células control. Así pues, la supervivencia total más breve asociada con la sobreexpresión de FABP7, especialmente en el GBM, podría deberse al aumento de la migración y la invasión de las células tumorales en el parénquima cerebral circundante (Liang et al., 2005). Otros análisis de la distribución de FABP7 en tumores de astrocitoma indican la presencia de niveles elevados de esta proteína en regiones infiltrantes de los tumores, lo cual apunta a una importante función de la FABP7 en la infiltración de las células malignas en los tejidos cerebrales adyacentes (Mita et al., 2007). La FABP7 muestra niveles variables de expresión y de localización intracelular en los tejidos gliales y en todos los grados de astrocitoma. No obstante, sobre todo en lo relativo a su localización nuclear, la FABP7 parece estar asociada con el fenotipo infiltrante de las células de glioma y las vías del EGFR, puesto que se detecta su translocación nuclear tras la activación del EGFR y está asociada con un mal pronóstico en el GBM EGFRpositivo. Asimismo, en el astrocitoma de grado I no se observa inmunorreactividad nuclear a la FABP7 (Liang et al., 2006; Kaloshi et al., 2007).

Neuroligina 4, ligada al cromosoma X (IMA-NLGN4X-001)

La neuroligina 4, ligada al cromosoma X pertenece a la familia de proteínas de adhesión celular que parecen desempeñar un papel en la maduración y la función de las sinapsis neuronales. Los miembros de la familia de la neuroligina presentan una organización estructural afín, con un péptido señal N-terminal, un dominio similar a la esterasa con dos sitios de corte y empalme alternativo, una pequeña región de conexión con baja identidad de secuencia situada frente al dominio transmembrana, y una corta parte citosólica con un extremo C-terminal muy conservado. En el corazón se han hallado concentraciones relativamente altas del ARNm de la neuroligina 4. En el hígado, el músculo esquelético y el páncreas se han detectado niveles de expresión más bajos, en tanto que en el cerebro, la placenta, el pulmón y el riñón apenas se detecta ARNm de dicha proteína (Bolliger et al., 2001).

Las mutaciones del gen NLGN4 ligado a X son una causa potencial de trastornos del espectro autista y se han descrito mutaciones en varios pacientes con autismo, síndrome de Asperger y retraso mental (Jamain et al., 2003; Laumonnier et al., 2004; Lawson-Yuen et al., 2008).

Se han descrito algunas asociaciones del NLGN4X con el cáncer: En tumores estromales gastrointestinales se ha observado sobreexpresión del NLGN4X en pacientes pediátricos y adultos jóvenes respecto a los adultos de edad más avanzada (Prakash et al., 2005).

Tenascina C (hexabraquión) (IMA-TNC-001)

La matriz extracelular que rodea las células tumorales es distinta de la matriz extracelular de los tejidos normales. La tenascina C (TNC) es una proteína de la matriz extracelular que experimenta una regulación al alza muy acusada en procesos estrechamente vinculados con la actividad migratoria como son el desarrollo embrionario (Bartsch et al., 1992), la cicatrización de heridas (Mackie et al., 1988) y los procesos neoplásicos (Chiquet-Ehrismann, 1993; Chiquet-Ehrismann and Chiquet, 2003). Además, la TNC aparece sobreexpresada en vasos tumorales que muestran un elevado índice proliferativo, lo cual indica su implicación en la angiogénesis neoplásica (Kim et al., 2000). En el tejido humano normal la expresión de la TNC solo se detecta en raras ocasiones, mientras que en los gliomas presenta elevados niveles de expresión (Bourdon et al., 1983). La hipoxia puede estimular la expresión de la TNC (Lal et al., 2001), bien a través del TGFbeta1, lo cual proporciona un mecanismo para la invasión del parénquima sano por los gliomas de alto grado (Hau et al., 2006), bien a través de la gastrina, que modula significativamente la migración de las células de GBM humanas (Kucharczak et al., 2001). La TNC regula a la baja la tropomiosina1 y por ello desestabiliza las fibras de estrés de actina. Además, causa la regulación a la baja del inhibidor de la ruta de Wnt Dickkopf1. Dado que el descenso de la expresión de la tropomiosina1 y el aumento de la vía de señalización de las Wnt están vinculados estrechamente con la transformación y la oncogénesis, la TNC modula específicamente estas vías de señalización potenciando la proliferación de las células de glioma (Ruiz et al., 2004).

En los tejidos de GBM se observa tinción perivascular de TNC alrededor de los vasos sanguíneos que irrigan el tumor, mientras que ésta es menos frecuente en los gliomas de grado II y III de la OMS, lo cual indica que la intensidad de la tinción de TNC está correlacionada con el grado del tumor y que cuanto más intensa es, peor es el pronóstico (Herold-Mende et al., 2002). La TNC también contribuye a generar un nicho de citoblastos dentro de la zona subventricular (ZSV), interviniendo en la organización de la señalización de los factores de crecimiento para acelerar el desarrollo de los neurocitoblastos. El efecto predominante de la TNC sobre las células situadas en la ZSV consiste en la regulación de la progresión del desarrollo (Garcion et al., 2004). La TNC es el inductor más potente de la migración dirigida de los neurocitoblastos humanos. Así, la matriz extracelular producida por el tumor ofrece un entorno permisivo para el tropismo de los neurocitoblastos en células tumorales diseminadas (Ziu et al., 2006).

14 5

15

25

35

45

55

Molécula de adhesión celular neuronal (IMA-NRCAM-001)

La NRCAM (molécula de adhesión celular neuronal) es una molécula de adhesión celular transmembrana de neuronas que contiene varios dominios de tipo C2 similares a inmunoglobulina y dominios de fibronectina de tipo III. Interviene en la guía, el desarrollo de ramificaciones y la fasciculación de las neuronas (Grumet et al., 1991; Morales et al., 1993; Stoeckli and Landmesser, 1995; Perrin et al., 2001; Sakurai et al., 2001) mediante la formación de interacciones homofílicas y heterofílicas con otras IgCAM (Volkmer et al., 1996; Sakurai et al., 1997; Zacharias et al., 1999). La NRCAM unida a anquirina (Davis and Bennett, 1994) está regulada al alza en las células endoteliales que forman tubos, lo que sugiere su posible intervención en la formación de los tubos y en la angiogénesis (Aitkenhead et al., 2002).

La NRCAM es un gen diana de la ß-catenina y del complejo de plakoglobina-LEF/TCF que contribuye a la oncogénesis (Conacci-Sorrell et al., 2002). El dominio exterior de NRCAM se puede desprender de la superficie celular por actividades similares a las de las metaloproteasas. Este dominio desprendido es capaz de activar varias vías de señalización, potenciar la motilidad celular y desatar la oncogénesis en ratones (Conacci-Sorrell et al., 2005).

La NRCAM aparece regulada al alza en astrocitomas anaplásicos y en tejidos de GBM en comparación con el cerebro normal, y las concentraciones elevadas están correlacionadas con el comportamiento invasivo (Sehgal et al., 1998). El ARN antisentido dirigido contra la NRCAM reduce la capacidad oncogénica de las células de GBM humanas (Sehgal et al., 1999).

Proteína de unión 3 al ARNm del factor de crecimiento insulinoide 2 (IMA-IGF2BP3-001)

La IGF2BP3 pertenece a la familia de las proteínas de unión al ARNm del factor de crecimiento insulinoide-II, implicada en la localización, recambio y control traduccional del ARNm. La proteína contiene varios dominios KH (homólogo con K), que son importantes para la unión al ARN, y se sabe que intervienen en la síntesis y el metabolismo del ARN. La expresión ocurre principalmente en el desarrollo embrionario y ha sido descrita en algunos tumores. Por ello, la IGF2BP3 se considera una proteína oncofetal (Liao et al., 2005). La presencia de altas concentraciones del transcrito de IGF2BP3 en numerosos tejidos tumorales en comparación con tejidos de control indica que dicha proteína podría desempeñar una función en las células transformadas en proliferación. Esta hipótesis está avalada por el hallazgo de que el único tejido humano no canceroso que expresa el transcrito de la IGF2BP3 es la placenta, tejido caracterizado por el crecimiento y la proliferación celular (Mueller-Pillasch et al., 1997).

La bibliografía científica no contiene información específica sobre la expresión de la IGF2BP3 en el GBM, pero se ha descrito su sobreexpresión en otros tipos de cáncer.

Por ejemplo, la IGF2BP3 se expresa en muestras de carcinoma renal de células claras y su expresión está asociada con un estadio y un grado avanzado de los tumores primarios. Además, su expresión positiva está asociada con un aumento de entre 5 y 10 veces en el riesgo de metástasis a distancia y con un aumento del riesgo de muerte por carcinoma renal del 42% al 50% (Hoffmann et al., 2008; Jiang et al., 2006; Jiang et al., 2008). La expresión de la IGF2BP3 también se ha detectado en el melanoma en comparación con nevus benignos, en los que no se detectó expresión aún en presencia de rasgos displásicos (Pryor et al., 2008). En los pacientes aquejados de carcinoma epidermoide de esófago se pueden observar linfocitos T específicos para un epítopo peptídico restringido al HLAA*2402 derivado de la IGF2BP3 entre los linfocitos infiltrados en el tumor (TIL), los linfocitos de los ganglios linfáticos regionales y los linfocitos de sangre periférica en el 40% de los casos (Mizukami et al., 2008).

La IGF2BP3 también presenta un elevado nivel de expresión en los carcinomas pancreáticos. En dos estudios >90% de las muestras de tejido tumoral pancreático presentaron expresión de la IGF2BP3 revelada por inmunotinción, mientras que en los tejidos pancreáticos no neoplásicos dieron negativo. Asimismo, la expresión aumentó progresivamente con el estadio tumoral (Yantiss et al., 2005; Yantiss et al., 2008).

También se ha hallado una elevación significativa de la expresión de la IGF2BP3 en tumores uroteliales de alto grado, si bien en general no se expresa en el urotelio benigno ni en los tumores uroteliales de bajo grado. Asimismo, los pacientes con tumores IGF2BP3-positivos presentan unas tasas de supervivencia sin progresión y de supervivencia sin enfermedad mucho menores que los afectados por tumores IGF2BP3-negativos (Li et al., 2008; Sitnikova et al., 2008; Zheng et al., 2008).

BCAN -Brevicán (IMA-BCA-002)

El brevicán (BCAN) es un miembro específico del cerebro de la familia de proteoglucanos de sulfato de condroitina del lecticán. Se han descrito dos isoformas de BCAN: una isoforma entera que se segrega en la matriz extracelular y otra más corta con una secuencia que predice un anclaje de glucofosfatidilinositol (GPI). La isoforma segregada se expresa mucho desde el nacimiento hasta los 8 años de edad y queda regulada a la baja alrededor de los 20 años, manteniéndose en niveles bajos en la corteza adulta normal. La isoforma con GPI se expresa en niveles uniformemente bajos a lo largo del desarrollo (Gary et al., 2000). El BCAN pertenece a una familia de proteoglucanos que suelen ser descritos como moléculas de barrera que impiden la motilidad de las células y de las neuritas en el sistema nervioso adulto (Viapiano and Matthews, 2006). En condiciones in vivo, el BCAN se expresa

15 5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

alrededor de los límites del torrente migratorio rostral (Jaworski and Fager, 2000) y es un componente importante regulado al alza de las cicatrices gliales que aparecen a raíz de lesiones neurales (Jaworski et al., 1999).

El BCAN muestra una espectacular regulación al alza en los gliomas, pues la expresión se multiplica aproximadamente por siete respecto a los niveles normales (Gary et al., 2000; Gary et al., 1998). La expresión es detectable en los márgenes invasivos de tumores inducidos experimentalmente (Glass et al., 2005) y está elevada en tumores con perfiles infiltrativos elevados (Phillips et al., 2006). Desde el punto de vista clínico, la regulación al alza del BCAN conlleva una menor supervivencia en los pacientes con gliomas de alto grado (Liang et al., 2005). Además de la regulación al alza del BCAN en el glioma, es posible que el procesamiento proteolítico de la proteína entera también contribuya a la invasión (Gary et al., 1998; Nutt et al., 2001). La escisión del BCAN por metaloproteasas de la familia ADAMTS es un paso necesario para que tenga lugar su efecto favorecedor de la invasividad en el glioma. Generando una forma mutante específica de sitio que es resistente a la escisión por ADMATS se ha demostrado que este BCAN «indegradable» es capaz de potenciar la invasión de las células in vitro y la progresión tumoral in vivo en el marco del glioma (Zhang et al., 1998; Viapiano et al., 2008). A escala molecular, el BCAN promueve la activación del EGFR, aumenta la expresión de moléculas de adhesión celular y promueve la secreción de fibronectina (Hu et al., 2008).

El ARNm del BCAN no se ha detectado en muestras de corteza adulta humana procedentes de fallecidos sin complicaciones neurológicas. En marcado contraste, su ARNm sí se ha detectado en las 27 muestras quirúrgicas de glioma humano que componían una serie, lo cual sitúa al BCAN como un posible marcador único y selectivo del glioma (Jaworski et al., 1996).

La regulación al alza del BCAN en el glioma no solo conduce en general al aumento de la expresión sino también a la expresión de isoformas glucosiladas diferencialmente específica del glioma. A este respecto, B/bΔg es un producto entero del ARNm del BCAN que surge como resultado de la glucosilación incompleta o reducida de la proteína central. B/bΔg se expresa muy poco durante la segunda mitad del desarrollo prenatal y los primeros días del desarrollo postnatal, desaparece al primer año de vida y no se encuentra en el cerebro normal adulto, pero sí en muestras de glioma de alto grado. Un estudio demostró que B/bΔg estaba presente en todas las muestras de glioma de alto grado (grados 3 y 4) y que representaba la mitad de la sobreexpresión total por encima de los niveles del control del BCAN no escindido. Las muestras negativas para B/bΔg correspondían a los pacientes diagnosticados con tumores de bajo grado (Viapiano et al., 2005). Esta expresión específica del glioma de alto grado podría representar la reactivación de los programas tempranos de desarrollo, un mecanismo que ha sido implicado en la progresión del glioma (Seyfried, 2001). El IMA-BCA-002 contiene en su secuencia un posible sitio de glucosilación. Se ha demostrado que es muy inmunógeno en comparación con otro péptido derivado del BCAN (IMA-BCA-001) que carece de sitio de glucosilación. Es más, se ha descrito la sobreexpresión selectiva del BCAN en un tipo de citoblastos cancerosos del GBM que muestran la mayor pluripotencia y oncogenicidad in vivo conocidas (Gunther et al., 2008).

Protooncogén Met (receptor del factor de crecimiento de hepatocitos) (IMA-MET-005)

El protooncogén MET codifica c-Met, un receptor transmembrana con actividad tirosina-cinasa capaz de modular la proliferación, diferenciación, motilidad, adhesión e invasión celular. Es activado por el factor de crecimiento de hepatocitos (HGF) (Giordano et al., 1989; Trusolino and Comoglio, 2002).

La vía de señalización de c-Met interviene en la regeneración orgánica –tal y como se demuestra en el caso del hígado y del riñón, embriogénesis, hematopoyesis, desarrollo muscular, así como en la regulación de la migración y la adhesión de los linfocitos B y los monocitos normalmente activados(Naldini et al., 1991; Mizuno et al., 1993; Bladt et al., 1995; Schmidt et al., 1995; Zarnegar and Michalopoulos, 1995; van der Voort et al., 1997; Beilmann et al., 2000).

Estudios realizados con diversos tipos de tumores han demostrado la existencia de varios mecanismos de activación de c-Met, incluido el bucle autocrino HGF/c-Met, mutaciones puntuales activadoras, proteína de fusión TPR-Met y la falta de escisión dec-MET para formar las cadenas  y β (Park et al., 1986; Mondino et al., 1991; Ebert et al., 1994; Schmidt et al., 1997; Olivero et al., 1999; Park et al., 1999; Di Renzo et al., 2000). La activación constitutiva de c-Met a través de la fosforilación también ha sido identificada como un importante mecanismo de oncogénesis en el carcinoma renal de células claras (Nakaigawa et al., 2006).

Asimismo, numerosos estudios señalan la implicación de la sobreexpresión de c-Met en la transformación maligna y la invasividad de las células cancerosas. c-Met media en las actividades multifuncionales y potencialmente oncógenas del HGF (Bottaro et al., 1991; Rubin et al., 1993; Zarnegar and Michalopoulos, 1995). Con la unión al receptor, el HGF induce la autofosforilación de c-Met y activa la señalización descendente que abarca las vías de ras, fosfatidilinositol-3’-cinasa, fosfolipasa C, y la relacionada con la proteína-cinasa activada por mitógeno (Naldini et al., 1991; Ponzetto et al., 1993; Montesano et al., 1998; Furge et al., 2000; Dong et al., 2001; Furge et al., 2001).

El gen c-Met se expresa predominantemente en células epiteliales y está sobreexpresado en varios tejidos y estirpes celulares malignas (Di Renzo et al., 1995; Ferracini et al., 1995; Tuck et al., 1996; Koochekpour et al., 1997; Fischer et al., 1998; Ramirez et al., 2000; Li et al., 2001; Maulik et al., 2002; Qian et al., 2002).

16

imagen8

imagen9

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

Quitinasa 3-Like 2 (CHI3L2)

El CHI3L2 se identificó originalmente en condrocitos y está regulado al alza, p. ej., en la artrosis (Steck et al., 2002). Aunque la proteína no está bien caracterizada todavía, lo más probable es que se segregue en el espacio extracelular. Se ha descrito frecuentemente como un antígeno diana en la artritis reumatoide. La inducción antiangiogénica en condiciones experimentales de una línea celular de glioma humano mediante la transfección con ARNpi (VEGF-A) causó la regulación al alza del CHI3L2.

Survivina (BIRC5)

La expresión de BIRC5 (survivina), miembro de la familia de las proteínas inhibidoras de la apoptosis (IAP), es elevada en tejidos fetales y en diversos tipos de cáncer humanos. La survivina parece ser capaz de regular tanto la proliferación celular como la muerte celular apoptósica. Y especialmente en el glioblastoma se detectan niveles sumamente elevados de expresión de la survivina (Angileri et al., 2008). Se ha planteado que la sobreexpresión de la survivina en los gliomas cerebrales podría desempeñar un papel importante en la proliferación maligna, los mecanismos anti-apoptósicos y la angiogénesis (Zhen et al., 2005; Liu et al., 2006). Especialmente en el caso del glioblastoma, pero también en el de otras entidades tumorales, la expresión de la survivina apareció relacionada significativamente con el grado de malignidad (con la mayor expresión de survivina en el glioblastoma) y con tiempos de supervivencia global más cortos que los pacientes con tumores negativos para la survivina (Kajiwara et al. , 2003; Saito et al., 2007; Uematsu et al., 2005; Mellai et al., 2008; Grunda et al., 2006; Xie et al., 2006; Sasaki et al., 2002; Chakravarti et al., 2002).

Antígeno central de la hepatitis B

Los péptidos inmunógenos de la proteína central HBc del virus de la hepatitis B (VHB) se conocen bien (Bertoletti et al., 1993; Livingston et al., 1997). En vacunas antitumorales basadas en la presente invención se puede incluir un péptido de 10 aminoácidos de la HBc como control positivo a fin de verificar la inmunocompetencia de los pacientes y el éxito de las inmunizaciones.

En una forma de realización preferida de la invención la composición farmacéutica comprende al menos dos péptidos que contienen una secuencia de aminoácidos conforme con la SEQ ID N.º 1 y una secuencia de aminoácidos conforme con la SEQ ID N.º 2 y la SEQ ID N.º 17.

La composición farmacéutica puede contener, además, otros péptidos adicionales y/o excipientes para aumentar la eficacia, tal y como se explicará más adelante.

Como se puede deducir a partir de bases de datos, ciertas posiciones de los péptidos de unión a HLA-A normalmente son residuos de anclaje que forman una secuencia central que encaja en el motivo de unión de la hendidura de unión del HLA.

Es sabido, además, que los péptidos presentados por el MHC de clase II están compuestos de una «secuencia central» dotada de un cierto motivo de aminoácidos específico del HLA y, opcionalmente, de extensiones N-y/o Cterminales que no interfieren con la función de la secuencia central (es decir, que se consideran irrelevantes para la interacción del péptido con el linfocito T). Las extensiones N-y/o C-terminales pueden, por ejemplo, tener entre 1 y 10 aminoácidos de longitud, respectivamente. Estos péptidos se pueden utilizar directamente para cargar las moléculas MHC de clase II o bien la secuencia se puede clonar en vectores de conformidad con la descripción ofrecida más adelante en la presente memoria. Dado que estos péptidos constituyen el producto final del procesamiento de péptidos más grandes en el interior de la célula, también pueden utilizarse péptidos más largos. Los péptidos como los dados a conocer pueden tener cualquier tamaño, pero normalmente tienen una masa molecular menor de 100.000, preferiblemente menos de 50.000, más preferiblemente menos de 10.000, más preferiblemente menos de 5.000, más preferiblemente menos de 2. 500 y normalmente entre 1000 y 2000 aproximadamente.

Si un péptido de más de aproximadamente 12 residuos de aminoácidos se utiliza directamente para unirse a una molécula MHC de clase II, es preferible que los residuos que flanquean la región central de unión a HLA sean residuos que no afecten sustancialmente a la capacidad del péptido para unirse específicamente a la hendidura de unión de la molécula MHC de clase II o presentar el péptido al CTL. No obstante, como se ha indicado arriba, se apreciará que es posible usar péptidos más grandes, especialmente los codificados por un polipéptido, ya que estos péptidos más grandes pueden ser fragmentados por células presentadoras de antígeno adecuadas. Además los aminoácidos flanqueantes reducen la velocidad de degradación del péptido in vivo, por lo que la cantidad real de péptido disponible para los CTL es mayor que cuando el péptido carece de tales aminoácidos flanqueantes.

También es posible que los epítopos de MHC de clase I, aunque suelen tener entre 8 y 10 aminoácidos de longitud, sean generados por el procesamiento de péptidos más largos o proteínas que incluyen el epítopo real. De forma similar a los epítopos de MHC de clase II, es preferible que los residuos flanqueantes de los péptidos precursores alargados situados por delante y/o por detrás de los extremos N-terminal y C-terminal del epítopo real, no alteren sustancialmente la presentación del péptido al CTL ni enmascaren los sitios de escisión proteolítica necesarios para obtener el epítopo real a partir del procesamiento del péptido elongado.

19 5

15

25

35

45

55

Por supuesto, el péptido según la presente invención tiene la capacidad de unirse a una molécula del MHC humano de clase I. La unión de un péptido a un complejo de MHC puede ser analizada mediante métodos conocidos en la técnica como, por ejemplo, los descritos más adelante en los ejemplos ofrecidos en la presente invención o los descritos en la bibliografía para diferentes alelos de MHC de clase II (p. ej., Vogt AB, Kropshofer H, Kalbacher H, Kalbus M, Rammensee HG, Coligan JE, Martin R; Ligand motifs of HLA-DRB5*0101 and DRB1*1501 molecules delineated from self-peptides; J Immunol. 1994; 153(4):1665-1673; Malcherek G, Gnau V, Stevanovic S, Rammensee HG, Jung G, Melms A; Analysis of allele-specific contact sites of natural HLA-DR17 ligands; J Immunol. 1994; 153(3):1141-1149; Manici S, Sturniolo T, Imro MA, Hammer J, Sinigaglia F, Noppen C, Spagnoli G, Mazzi B, Bellone M, Dellabona P, Protti MP; Melanoma cells present a MAGE-3 epitope to CD4(+) cytotoxic T cells in association with histocompatibility leukocyte antigen DR11; J Exp Med. 1999; 189(5): 871-876; Hammer J, Gallazzi F, Bono E, Karr RW, Guenot J, Valsasnini P, Nagy ZA, Sinigaglia F; Peptide binding specificity of HLA-DR4 molecules: correlation with rheumatoid arthritis association; J Exp Med. 1995 181(5):1847-1855; Tompkins SM, Rota PA, Moore JC, Jensen PE; A europium fluoro-immunoassay for measuring binding of antigen to class II MHC glycoproteins; J Immunol Methods. 1993;163(2): 209-216; Boyton RJ, Lohmann T, Londei M, Kalbacher H, Halder T, Frater AJ, Douek DC, Leslie DG, Flavell RA, Altmann DM; Glutamic acid decarboxylase T lymphocyte responses associated with susceptibility or resistance to type I diabetes: analysis in disease discordant human twins, non-obese diabetic mice and HLA-DQ transgenic mice; Int Immunol. 1998 (12):1765-1776).

Otros segmentos de aminoácidos localizados en las regiones N-y/o C-terminal que no forman necesariamente parte del péptido que actúa como epítopo real para las moléculas de MHC podrían, no obstante, ser importantes para conseguir introducir con eficiencia en las células el péptido conforme a la presente invención (véase arriba). En una forma de realización de la presente invención, el péptido de la presente invención es una proteína de fusión que comprende, por ejemplo, los 80 aminoácidos N-terminales de la cadena invariable asociada al antígeno HLA-DR (p33, en lo sucesivo «Ii») como la derivada del NCBI, número de acceso de GenBank X00497 (Strubin, M., Mach, B. and Long, E. O. The complete sequence of the mRNA for the HLA-DR-associated invariant chain reveals a polypeptide with an unusual transmembrane polarity EMBO J. 3 (4), 869-872 (1984)).

Así pues, de acuerdo con otro aspecto la invención proporciona una composición farmacéutica, en la que al menos un péptido incluye enlaces no peptídicos.

En un enlace peptídico inverso los residuos de aminoácido no están unidos por enlaces peptídicos (-CO-NH-) sino que el enlace peptídico está invertido. Estos peptidomiméticos retro-inversos pueden sintetizarse con métodos conocidos en la técnica, como por ejemplo los descritos por Meziere et al. (1997) J. Immunol. 159, 3230-3237, y que se incorporan en la presente memoria como referencia. Esta estrategia implica la síntesis de seudopéptidos que contengan cambios en la estructura principal, pero no en la orientación de las cadenas laterales. Meziere et al. (1997) demuestran que estos seudopéptidos resultan útiles para las respuestas de MHC y de los linfocitos T cooperadores. Los péptidos retro-inversos, que contienen enlaces NH-CO en lugar de enlaces peptídicos CO-NH, son mucho más resistentes a la proteólisis.

Enlaces no peptídicos son, por ejemplo: -CH2-NH, -CH2S-, -CH2CH2-, -CH=CH-, -COCH2-, -CH(OH)CH2-y -CH2SO-. La patente de Estados Unidos 4.897.445 proporciona un método para la síntesis en fase sólida de enlaces no peptídicos (-CH2-NH) en cadenas polipeptídicas que implica la obtención de polipéptidos con procedimientos estándar y la síntesis del enlace no peptídico mediante la reacción de un aminoaldehído y un aminoácido en presencia de NaCNBH3.

Péptidos que comprenden las secuencias de la invención descritas arriba pueden ser sintetizados con otros grupos químicos añadidos en los extremos amino y/o carboxi, con el fin de mejorar, por ejemplo, la estabilidad, biodisponibilidad y/o afinidad de los péptidos. Por ejemplo, grupos hidrófobos como los grupos carbobenzoxilo, dansilo, o t-butiloxicarbonilo pueden añadirse a los extremos amino de los péptidos. De manera similar, se puede colocar un grupo acetilo o un grupo 9-fluorenilmetoxi-carbonilo en los extremos amino de los péptidos. Asimismo, p. ej., el grupo hidrófobo t-butiloxicarbonilo, o un grupo amido pueden ser añadidos en los extremos carboxi de los péptidos.

Adicionalmente, todos los péptidos de la invención pueden ser sintetizados para alterar su configuración estérica. Por ejemplo, puede utilizarse el isómero D de uno o más de los residuos de aminoácidos del péptido en lugar del isómero L habitual.

De manera similar, un péptido como el dado a conocer puede ser modificado químicamente mediante la reacción con aminoácidos específicos antes o después de la síntesis del péptido. Ejemplos de tales modificaciones son bien conocidos en la técnica y aparecen resumidos por ejemplo en R. Lundblad, Chemical Reagents for Protein Modification, 3rd ed. CRC Press, 2005. La modificación química de aminoácidos incluye, sin ánimo limitativo, la modificación por acilación, amidinación, piridoxilación de lisina, alquilación reductora, trinitrobencilación de grupos amino con ácido 2,4,6-trinitrobencenosulfónico (TNBS), transformación de grupos carboxilo en grupos amida y oxidación del grupo sulfhidrilo con ácido perfórmico para convertir la cisteína en ácido cisteico, formación de derivados mercuriales, formación de disulfuros mixtos con otros compuestos tiol, reacción con maleimida, carboximetilación con ácido yodoacético o yodoacetamida y carbamoilación con cianato a pH alcalino, aunque sin limitación a ello. A este respecto, se remite a las personas versadas en la técnica al Capítulo 15 de Current Protocols

20

imagen10

imagen11

imagen12

imagen13

imagen14

imagen15

imagen16

imagen17

imagen18

Tabla 6: Funciones de las proteínas de las que derivan los TUMAP

ID del TUMAP

Denominación Función / Comentarios

TUMAP de HLA-A*02

BCA-002

Brevicán Molécula de la matriz extracelular específica del cerebro que interviene en la invasión; se sobreexpresa y es desglucosilada específicamente en el glioma; asociada a nicho de citoblastos.

CHI-001

Quitinasa 3-like 2 Proteína extracelular de función poco clara; muy sobreexpresada en el glioblastoma.

CSP-001

Proteoglucano de sulfato de condroitina 4 Proteoglucano transmembrana implicado en la neovascularización; sobreexpresado por células tumorales y pericitos en los vasos sanguíneos de los tumores cerebrales malignos.

FABP7-001

Proteína de unión a ácidos grasos 7, cerebro Proteína citoplasmática implicada en el metabolismo de los ácidos grasos; asociada con el aumento de la motilidad de las células de GBM en el tejido circundante y con una supervivencia corta; muy sobreexpresada en el GBM.

IGF2BP3001

Proteína de unión 3 al ARNm del factor de crecimiento insulinoide 2 Interviene en el recambio y el control traduccional del ARNm; proteína oncofetal; descrita como sobreexpresada en varios tipos de cáncer donde está asociada con una supervivencia corta.

NLGN4X-001

Neuroligina 4, ligada al cromosoma X Molécula de adhesión celular; escasa bibliografía; muy inmunógena; elevada sobreexpresión en el GBM y el GIST; interviene en la invasión y la oncogénesis.

NRCAM-001

Molécula de adhesión celular neuronal Implicada en la vía de señalización de la betacatenina; papel importante en la invasión, crecimiento tumoral y oncogénesis; altos niveles de expresión correlacionados con supervivencia breve.

PTP-003

Proteína-tirosina-fosfatasa, tipo receptor, polipéptido Z 1 Proteína transmembrana de tipo I; muy sobreexpresada en glioblastoma, oligodendroglioma y otros tumores; papel funcional en la oncogénesis; con frecuencia experimenta amplificación génica en el GBM y en otros tipos de tumor.

PTP-005

TNC-001

Tenascina C Papel en la angiogénesis; actor importante en varias vías implicadas en la transformación y la proliferación tumoral; sobreexpresada en los vasos sanguíneos que irrigan el tumor; asociada a nicho de citoblastos cancerosos.

TUMAP de HLA-DR

BIR-002

Survivina Antígeno de supervivencia del tumor implicado en la regulación de la apoptosis y la proliferación; la sobreexpresión en gliomas y en otros tipos de tumor está asociada con un mal pronóstico.

TUMAP de HLA-A*02 elongado

MET-005

Protooncogén met Receptor del factor de crecimiento de hepatocitos; implicado en la transformación, la invasividad y la angiogénesis tumorales; descrito como asociado con nicho de GBM.

30

imagen19

N.º

Muestra de GBM Estadio tumoral (grado) TUMAP de clase I detectado (+) o no detectado (-) en el análisis por espectrometría de masas

IMA-BCA-002

IMA-CHI-001 IMA-CSP-001 IMA-FABP7-001 IMA-IGF2BP3001 IMA-NLGN4X-001 IMA-NRCAM-001 IMA-PTP-003 IMA-PTP-005 IMA-TNC-001

1

GB6010T GBM primario (IV) + + + + + + + + + +

2

GB1023T GBM primario (IV) + + + + + + + + + +

3

GB1021T GBM primario (IV) - + + - - - - + - +

4

GB6003T# GBM primario (IV) - + + - - - - + - -

5

GB1020T GBM primario (IV) - + + - - - + + - +

6

GB6027T GBM primario (IV) + + + - - + - + + +

7

GB1014T# GBM secundario (IV) - - + - - - - + - +

8

GB1012T GBM primario (IV) - - - - - - - + + -

9

GB6019T GBM primario (IV) - - + - - - - + + -

10

GB1002T GBM primario (IV) - + + - - - - + + +

11

GB6024T GBM primario (IV) - + + - - - - + + -

12

GB1006T GBM primario (IV) - - - + - - - + + -

13

GB1004T GBM primario (IV) - + + - - - - + - -

14

GB1008T GBM primario (IV) - + + - - - - + - +

15

GB1011T GBM primario (IV) - + + - - - - + + +

16

GB1005T GBM primario (IV) + + + - - - + + + +

17

GB6015T GBM primario (IV) - - - - - - - + - -

18

GB6016T GBM primario (IV) - - + - - - - + - +

4. Inmunogenicidad in vitro de los péptidos presentados por MHC de clase I de IMA950

Para obtener información relativa a la inmunogenicidad de los péptidos incluidos en IMA950, llevamos a cabo

5 análisis con una conocida plataforma de estimulación in vitro descrita por (Walter, S, Herrgen, L, Schoor, O, Jung, G, Wernet, D, Buhring, HJ, Rammensee, HG, and Stevanovic, S; 2003, Cutting edge: predetermined avidity of human CD8 T cells expanded on calibrated MHC/anti-CD28-coated microspheres, J. Immunol., 171, 4974-4978). De este modo pudimos demostrar datos positivos de inmunogenicidad en los diez péptidos restringidos a HLA-A*0201 contenidos en IMA950, lo cual demuestra que estos péptidos son epítopos de linfocitos T contra los cuales existen

10 linfocitos T precursores CD8+ en humanos. La inmunogenicidad de MET-005 no se puede analizar con este método puesto que en su forma elongada no se une al HLA-A*02. Así pues, con MET-005 no se pueden producir los tetrámeros que son indispensables para la estimulación in vitro. No obstante, se ha demostrado la inmunogenicidad in vitro del epítopo de HLA-A*02 incluido en MET-001 (YVDPVITSI, véase EP 1507795B1). Se supone que MET-005 estimula CTL específicos de MET-001 tras el adecuado procesamiento natural por las células presentadoras de

15 antígeno. La inmunogenicidad de MET-001 indica la presencia de CTL específicos de MET-001 en donantes sanos, lo que también es un prerrequisito para la eficacia de MET-005 como parte de una vacuna contra el cáncer. Así pues, la inmunogenicidad de MET-001 es un indicador bastante fiable de la inmunogenicidad de MET-005.

32

imagen20

imagen21

(continuación)

Total

% Mediana Rango

Rad. + Quimioterapia

1 5

Clasificación TNM en el momento de la prostatectomía radical (RPX)

T2a-c R0

6 32

T3a-c R0

6 32

T2a-c R1

3 16

T3a-c R1

3 16

T3aN2 R0

1 5

Escala de Gleason

5 -7

10 53

8 -10

3 16

Desconocido

6 32

Meses entre la RPX y la vacunación

41 9 -124

Primera recidiva postquirúrgica, meses

14 1 -90

PSA al iniciar la vacunación

0,76 0,14 – 10,8

Plan de tratamiento

Una vez descartadas las lesiones metastásicas manifiestas con la tomografía computarizada y la gammagrafía ósea,

5 la vacuna de péptidos específicos de la próstata se administró por vía subcutánea conforme a las diferentes formas de administración a pacientes con recidiva del PSA que habían sido sometidos a prostatectomía radical (aumento del PSA: elevación del 50% en dos análisis realizados como mínimo con 14 días de diferencia). La vacuna se administró ocho veces los días 0, 7, 14, 28, 42 y 56 (aproximadamente 100 microgramos de cada péptido en cada inyección). Después de cada vacunación y de nuevo el día 70, se midió la concentración de PSA para evaluar la

10 respuesta al tratamiento.

Si se detectaba respuesta del tumor (remisión completa [PSA-CR] o remisión parcial [PSA-PR] o estabilización clínica [sin cambio, PSA-NC]), el paciente recibía la vacuna una vez al mes como tratamiento de mantenimiento con la forma de administración seleccionada en cada caso. La respuesta del paciente al tratamiento de vacunación se evaluó detalladamente del modo indicado a continuación:

15 Remisión completa (PSA-CR): Normalización de la concentración de PSA inicialmente elevada, confirmada por la medición después de un intervalo mínimo de 4 semanas. La normalización se definió como un valor mínimo del PSA < 0,2 ng/ml, que cabría esperar después de la prostatectomía radical con extirpación completa del tumor o de la próstata.

Remisión parcial: a) PSA-PR ≤ 80% (Reducción de un 80% de la concentración de PSA inicialmente elevada,

20 confirmada por la medición después de un intervalo mínimo de 4 semanas); y b) PSA-PR ≤ 50% (Reducción de un 50% de la concentración de PSA inicialmente elevada, confirmada por la medición después de un intervalo mínimo de 4 semanas).

Enfermedad estable (PSA-SD): Ningún cambio significativo durante un período mínimo de cuatro semanas. Esto incluye la estabilización y una reducción inferior al 50% y un aumento inferior al 10%, confirmada por la medición

25 después de un intervalo de al menos 4 semanas.

Progresión (PSA-PD): Aumento de la concentración de PSA superior al 10%. El estudio se daba por concluido para el paciente si aparecía progresión del PSA.

Una vez admitidos los pacientes en el estudio se les administraba la vacuna de epítopos específicos; se tuvieron en cuenta las proteínas que se expresan específicamente en las células epiteliales de la próstata (p. ej. PSMA/PSCA).

35

imagen22

imagen23

imagen24

imagen25

5

10

15

20

25

30

DRB1 adecuado para IMA-BIR-002 es del 92,6% y para IMA-MET-005 es prácticamente del 100%. Por consiguiente, se predice que los dos péptidos de clase II de IMA950 son ligandos promiscuos de HLA-DR.

Aunque con este enfoque la frecuencia haplotípica de los alelos HLA-DRB1 que se unen se hubiera sobreestimado en un factor de dos, la frecuencia genotípica seguiría siendo >50% para todos los TUMAP de clase II contenidos en IMA950. Además, la confirmación experimental de la unión promiscua de IMA-BIR-002 a HLA-DR1, 3, 4 y 11 se obtuvo a partir de datos de unión in vitro (Figura 3). En el caso de los datos de unión in vitro de IMA-MET-005 los dos 15-ámeros solapados que abarcan la secuencia completa sugieren la unión a HLA-DR11; no obstante, el ensayo ProImmune REVEAL™ está pensado como un instrumento de cribado grosero para la identificación de posibles epítopos de HLA de clase II. Con este ensayo los ligandos de HLA-DR que presentan tasas de asociación lentas (on-rates) pueden dar un resultado falso negativo y no ser tomados por ligandos. Por consiguiente, de los datos negativos obtenidos in vitro con ProImmune REVEAL™ no se puede deducir que la unión a HLA-DR del IMAMET-005 in vivo no sea promiscua. Es perfectamente posible que el IMA-MET-0005 de IMA950 se una de esa forma promiscua al HLA-DR con la vacunación. Como no existen datos suficientes de las propiedades de unión y la frecuencia de los demás locus de clase II, HLA-DQ y -DP, estas moléculas se han excluido del cálculo. No obstante, estas moléculas ofrecen opciones de unión para los TUMAP de clase II de IMA950.

IMA-BIR-002 ha demostrado una amplia inmunogenicidad en un estudio clínico en pacientes con cáncer de próstata portadores de diversos alelos HLA-DR, por lo que la promiscuidad de este péptido de clase II se puede considerar claramente demostrada in vivo.

En conclusión, el análisis informático de las propiedades de unión a HLA-DR de los dos péptidos de clase II contenidos en IMA950 y otros datos experimentales procedentes de ensayos in vitro y de un estudio clínico con BIR002 indican con bastante claridad que estos TUMAP son ligandos promiscuos de las moléculas HLA de clase II humanas.

Tabla 11: Puntuaciones de unión de los TUMAP de clase II de IMA950 a alelos HLA-DR con motivo de unión conocido. Se muestran las puntuaciones de unión obtenidas con SYFPEITHI correspondientes a los alelos HLA-DRB1 más frecuentes en la población de raza blanca. El valor p ofrece las frecuencias haplotípicas entre los individuos de raza blanca positivos para HLA-A*02. Se consideró que el péptido se unía a una molécula HLA si la puntuación era igual o superior a 18. La acumulación de los valores p correspondientes a los alelos DRB1 que se unen da como resultado la frecuencia haplotípica mínima pmin. La extrapolación de esas frecuencias a todos los alelos DRB1, incluidos aquellos con una matriz de predicción de la unión incompleta o datos de frecuencia incompletos da la frecuencia haplotípica proyectada pproyectada que corresponde a la frecuencia genotípica Fproyectada.

s. d. = sin datos

IMA-BIR-002

Alelo DRB1*

0101 0301 0401 0404 0701 1101 1104 1501

Puntuación de SYFPEITHI

28 29 28 24 14 32 24 30

p

6,6% 5,9% 9,6% 6,0% 13,0% 4,4% 2,3% s. d.

Unión predicha

sí sí sí sí no sí sí sí

pmin

34,8%

Frecuencia haplotípica pproyectada

72,8%

Frecuencia genotípica Fproyectada

92,6%

IMA-MET-005

Alelo DRB1*

0101 0301 0401 0404 0701 1101 1104 1501

Puntuación de SYFPEITHI

28 20 26 26 28 20 22 22

p

6,6% 5,9% 9,6% 6,0% 13,0% 4,4% 2,3% s. d.

Unión predicha

sí sí sí sí sí sí sí sí

pmin

47,8%

Frecuencia haplotípica pproyectada

100,0%

Frecuencia genotípica Fproyectada

100,0%

40

imagen26

imagen27

imagen28

imagen29

imagen30

imagen31

imagen32

imagen33

imagen34

imagen35

Claims (1)

1. imagen1