MX2011003539A - Novedoso inmunotratamiento contra diversos tumores incluidos tumores neuronales y cerebrales. - Google Patents

Novedoso inmunotratamiento contra diversos tumores incluidos tumores neuronales y cerebrales.

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Abstract

La presente invención se refiere a péptidos, ácidos nucleicos y células para usarse en métodos inmunoterapéuticos. En particular, la presente invención se refiere a la inmunoterapia de cáncer. La presente invención además se refiere a epítopos de péptido de célula T citotóxicos asociados con tumor (CTL), solos o en combinación con otros péptidos asociados con tumor que sirven como ingredientes farmacéuticos activos de composiciones de vacuna que estimulan respuestas inmunológicas anti-tumorales. La presente invención se refiere a 30 secuencias de péptido y sus variantes derivadas de moléculas de HLA clase I y clase II de células tumorales humanas que pueden ser utilizadas en composiciones de vacuna para producir respuestas inmunológicas anti-tumorales.

Description

NOVEDOSO INMUNOTR ATA MIE TO CONTRA DIVERSOS TUMORES INCLUIDOS TUMORES NEURONALES Y CEREBRALES Campo de la Invención La presente invención se refiere a péptidos, ácidos nucleicos y células para su utilización en métodos inmunoterapéuticos. En particular, la presente invención se refiere a la inmunoterapia del cáncer. La presente invención se refiere además a epítopos peptídicos de linfocitos T citotóxicos (CTL) asociados a tumores, solos o en combinación con otros péptidos asociados a tumores, que actúan como ingredientes activos de vacunas que estimulan las respuestas inmunológicas contra los tumores. La presente invención se refiere a 30 secuencias peptídicas y sus variantes derivadas de moléculas HLA de clase I y II de células de tumor humanas, que pueden usarse en la composición de vacunas para provocar respuestas inmunológicas antitumorales.
Antecedentes de la Invención Los gliomas son tumores de cerebro que se originan a partir de células gliales en el sistema nervioso. Las células gliales, denominadas comúnmente neuroglías o, simplemente, glías, son células no neuronales que proporcionan apoyo y nutrición, mantienen la homeostasis, forman la mielina y participan en la transmisión de señales en el sistema nervioso.
Los dos subgrupos más importantes de gliomas son los astrocitomas y los oligodendrogliomas, denominados conforme al tipo de célula glial normal del que se originan (astrocitos u oligodendrocitos, respectivamente). Como parte del subgrupo de astrocitomas, el glioblastoma multiforme (en adelante, glioblastoma) es el tipo de tumor cerebral maligno más común en adultos, responsable de, aproximadamente, un 40% de todos los tumores cerebrales malignos y un 50% de los gliomas. Invade de forma agresiva el sistema nervioso central y, de entre todos los gliomas, está clasificado con el nivel más alto de malignidad (grado IV). A pesar de que su tratamiento ha ido mejorando gracias a avances en los métodos de obtención de neuroimágenes, a la microcirugía y a diversas formas de tratamiento como la temozolomida o la radiación, los glioblastomas siguen siendo incurables. La tasa de mortalidad de este tumor es muy alta: la esperanza de vida es de 9 a 12 meses tras el primer diagnóstico. Durante el período de observación comprendido entre 1986 y 1990, la tasa de 5 años de supervivencia fue del 8,0%. Hasta hoy, la tasa de cinco años de supervivencia tras una terapia agresiva con resección de masa tumoral sigue siendo menor del 10%. En consecuencia, existe una gran necesidad médica de encontrar un método terapéutico alternativo y efectivo.
Las células tumorales de los glioblastomas son las más indiferenciadas de entre los tumores cerebrales, de forma que tienen una alto potencial de migración y proliferación y son altamente invasivas, por lo que su pronóstico es muy negativo. Los glioblastomas provocan la muerte debido a un crecimiento rápido, agresivo e infiltrante en el cerebro. La pauta de crecimiento infiltrante es la responsable de que estos tumores no sean extirpables. Los glioblastomas también son relativamente resistentes a la radiación y a la quimioterapia y, por tanto, las tasas de recurrencia tras el tratamiento son elevadas. Además, la respuesta inmune a las células neoplásicas no es muy efectiva en la erradicación completa de todas las células neoplásicas después de la resección y la terapia de radiación.
El glioblastoma se divide en glioblastoma primario (de novo) y glioblastoma secundario, en función de las diferencias en el mecanismo de los genes durante la transformación maligna de las células precursoras gliales o los astrocitos indiferenciados. El glioblastoma secundario aparece en población más joven, con edades de hasta 45 años. Durante una media de cuatro a 5 años, el glioblastoma secundario se desarrolla desde el astrocitoma de grado inferior hasta convertirse en astrocitoma indiferenciado. En comparación, el glioblastoma primario se produce principalmente en población de más edad, con una media de 55 años. Generalmente, el glioblastoma primario aparece en forma de glioblastoma fulminante, caracterizado por una progresión tumoral que se desarrolla en un espacio de tres meses a partir de un estado sin presencia de anormalidades clínicas o patológicas («Pathology and Genetics of the Nervous Systems», 29-39, IARC Press, Lion, Francia, 2000).
El glioblastoma migra a través de los nervios mielinados y se disemina ampliamente en el sistema nervioso central. En la mayoría de los casos, el tratamiento quirúrgico sólo logra un efecto terapéutico limitado. Las células de glioma malignas evaden la detección por el sistema inmune del huésped mediante la producción de agentes inmunodepresores que afectar a la proliferación de linfocitos T y la producción de la citocina inmunoestimulante IL-2.
Los neoplasmas intracraneanos pueden surgir a partir de cualquiera de las estructuras o tipos celulares presentes en el sistema nervioso central como, por ejemplo, el cerebro, las meninges, la glándula pituitaria, el cráneo e incluso, el tejido embrionario residual. La incidencia total de tumores cerebrales primarios al año en Estados Unidos es de 14 casos por cada 100.000 habitantes. Los tumores cerebrales primarios más comunes son los meningiomas, que constituyen el 27% de todos los tumores cerebrales primarios, y los glioblastomas, que constituyen el 23% de todos los tumores cerebrales primarios (mientras que los glioblastomas son responsables del 40% de los tumores cerebrales malignos en adultos). Muchos de estos tumores son agresivos y de grado alto. Los tumores cerebrales primarios son los tumores sólidos más comunes en los niños y la segunda causa más frecuente de muerte por cáncer en niños, después de la leucemia.
Actualmente se sigue buscando un tratamiento efectivo para los glioblastomas. Se ha investigado la inmunoterapia, o tratamiento a través del reclutamiento del sistema inmune, con el fin de luchar contra estas células neoplásicas. Los primeros resultados alentadores con enfoques inmunoterapéuticos en pacientes de glioblastoma fueron obtenidos por Northwest Biotherapeutics utilizando «DCVax Brain», un enfoque con vacunas basado en células que emplea células dendríticas derivadas de pacientes cargadas con Usados de células de tumor autólogas, y por Celldex, que utilizó un péptido de EGFRvIll para inducir respuestas de CTL específicas de antígenos, existiendo correlación con las tasas medias de supervivencia prolongadas en comparación con las tasas medias de supervivencia obtenidas con tratamientos estándar (Heimberger et al., 2006).
Carcinoma colorrectal Según la Sociedad Americana contra el Cáncer {American Cáncer Society), el cáncer colorrectal (CRC) es el tercer tipo de cáncer más habitual en Estados Unidos y afecta a más de 175.000 nuevos pacientes cada año. En Estados Unidos, Japón, Francia, Alemania, Italia, España y el Reino Unido afecta a más de 480.000 pacientes. En los países industrializados, es una de las causas más comunes de muerte por cáncer. La tasa de supervivencia de 1 y 5 años en personas con cáncer colorrectal es del 84% y del 64% respectivamente. La supervivencia sigue bajando después de los 5 años, hasta situarse, 10 años después del diagnóstico, en el 57%. Cuando se detecta el cáncer colorrectal en una fase inicial y localizada, la tasa de supervivencia de 5 años es del 90%. No obstante, tan solo el 39% de los cánceres colorrectales se diagnostica en esta fase, principalmente debido a los bajos índices de reconocimientos preventivos. Una vez que el cáncer se ha extendido por la región y afecta a los ganglios linfáticos o a los órganos adyacentes, la tasa de 5 años de supervivencia cae a un 68%. Para las personas con metástasis distante, la tasa de 5 años de supervivencia es del 10%.
Las investigaciones sugieren que la aparición del cáncer colorrectal es el resultado de interacciones entre factores heredados y medioambientales. En la mayor parte de los casos, parece que los pólipos adenomatosos son los precursores de los tumores colorrectales. No obstante, la transición puede durar muchos años. El principal factor de riesgo para el cáncer colorrectal es la edad: el 90% de los casos se diagnostican pasados los 50 años. Otros factores de riesgo en el cáncer colorrectal incluyen, según la American Cáncer Society, el consumo de alcohol, una dieta con un alto consumo de grasas o carnes rojas y una cantidad insuficiente de frutas y verduras. La incidencia continúa aumentando, especialmente en zonas como Japón, en donde la causa podría deberse a la adopción de dietas de tipo occidental, con un exceso de grasas y carne y una reducción en el consumo de fibra. No obstante, las tasas de incidencia no están aumentando tan rápido como antes, lo cual puede deberse a un aumento de las exploraciones preventivas y a la eliminación de pólipos que, de lo contrario, se habrían convertido en cánceres.
Al igual que en la mayor parte de los tumores sólidos, el tratamiento de primera línea es la cirugía, aunque sus beneficios siguen limitándose a los pacientes en fase inicial, a pesar de que una parte importante de los pacientes es diagnosticada en fases avanzadas de la enfermedad. Para el cáncer colorrectal avanzado, los regímenes de quimioterapia basados en el. fluorouracilo son los tratamientos más habituales. La mayor parte de estos regímenes son los protocolos denominados FOLFOX (leucovorina/5-FU infusional más oxaliplatino) y FOLFIRI (irinotecán, leucovorina, bolo e infusión continua de 5-FU).
La introducción de citotóxicos de tercera generación, como el irinotecán y el oxaliplatino ha aumentado las esperanzas de lograr una mayor eficacia, aunque el pronóstico sigue siendo relativamente negativo y el índice de supervivencia suele ser de, aproximadamente, 20 meses cuando la enfermedad se encuentra en estado de metástasis. Por lo tanto, la necesidad de mejorar los resultados contra la enfermedad sigue siendo muy alta.
Recientemente ha salido al mercado una nueva generación de medicamentos, agentes dirigidos a las moléculas, como por ejemplo Avastin® (bevacizumab) y Erbitux® (cetuximab), y alrededor de 40 compuestos para diferentes fases del cáncer colorrectal se encuentran en las últimas etapas de desarrollo clínico. Las combinaciones de varios de estos compuestos aumentan el número de opciones de tratamiento posibles que pueden esperarse de cara al futuro. La inmensa mayoría de sustancias se encuentra en fase 2, y, en los ensayos de cáncer colorrectal, estos compuestos abordan al EGFR con mayor frecuencia que a cualquier otro blanco, lo cual se debe a que cerca del 80% de los pacientes de cáncer colorrectal presentan una expresión de EGFR regulada ascendentemente.
En la actualidad se están llevando a cabo ensayos clínicos con pacientes en fase II, que combinan la quimioterapia con los anticuerpos monoclonales recientemente autorizados (cetuximab + irinotecán o FOLFOX4; bevacizumab como agente único o junto con FOLFOX4). Se esperan períodos de observación de entre tres y cuatro años hasta obtener, a partir de dichos ensayos, resultados significativos desde el punto de vista estadístico.
Los anticuerpos monoclonales que actualmente se utilizan en oncología tienen, en general, una excelente probabilidad de no interferir con la inmunoterapia activa. De hecho, existen pruebas preclínicas (Gabrilovich, 1999) y clínicas que apuntan a que el agotamiento de VEGF (por bevacizumab) contribuye positivamente a la activación mediada por DC de las células T (Osada T., G. Chong, R. Tansik, T. Hong T., N. Spector, R. Kumar, H. I. Hurwitz, I. Dev, A. B. Nixon, H. K. Lyerly, T. Clay y M .A.Morse; http://www.ncbi.nlm.nih.gOv/pubmed/18193223?ordinalpos=1 & ito ol = EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubm ed_RVDocSum; «The effect of anti-VEGF therapy on immature myeloid cell and dendritic cells in cáncer patients»; Cáncer Immunol Immunother. 10 de enero de 2008).
Carcinoma de próstata y otros tumores Con una cifra estimada de 27.050 fallecimientos en 2007, el cáncer de próstata es la principal causa de muerte por cáncer en varones. Aunque los índices de deceso se han reducido entre la población blanca y afroamericana desde principios de los 90, el nivel registrado entre los varones afroamericanos es más del doble con respecto al de los hombres de raza blanca. El cáncer de próstata es el que se diagnostica con mayor frecuencia en los varones. Por motivos que siguen sin estar claros, los niveles de incidencia son significativamente mayores entre los varones afroamericanos que entre los de raza blanca. Los niveles de incidencia del cáncer de próstata han cambiado notablemente durante los últimos 20 años: experimentaron un rápido incremento de 1988 a 1992, se redujeron drásticamente de 1992 a 1995 y volvieron a incrementarse ligeramente a partir de 1995. Estas tendencias reflejan, en gran parte, el aumento de reconocimientos preventivos de cáncer de próstata mediante el análisis sanguíneo del antígeno específico de la próstata (PSA). Es posible que el moderado incremento de la incidencia durante la última década pueda atribuirse a la generalización del reconocimiento preventivo del PSA entre varones menores de 65 años. Los índices de cáncer de próstata se han estabilizado entre los varones de 65 años en adelante. Los índices marcaron su máximo entre hombres de raza blanca en 1992 (237,6 por cada 100.000 varones) y, en 1993, entre hombres afroamericanos (342,8 por cada 100.000 varones).
El tratamiento para el cáncer de próstata puede implicar una espera en observación, cirugía, radiación, terapia, ultrasonidos focalizados de alta intensidad (HIFU), quimioterapia, terapia hormonal o alguna combinación. El hecho de determinar qué opción es la mejor depende de la fase de la enfermedad, de la escala Gleason y del nivel de PSA. Otros factores importantes son la edad del varón, su estado general de salud y sus sentimientos acerca de posibles tratamientos y sus efectos secundarios. Debido a que todos los tratamientos pueden presentar importantes efectos secundarios, como por ejemplo disfunción eréctil e incontinencia urinaria, los debates sobre dichos tratamientos suelen centrarse en equilibrar los objetivos de la terapia y los riesgos de las alteraciones en el estilo de vida.
Si el cáncer se hubiera extendido más allá de la próstata, las opciones de tratamiento cambian significativamente, por lo que la mayor parte de los médicos que trata el cáncer de próstata utiliza una serie de nomogramas para pronosticar la probabilidad de la propagación. Los tratamientos mediante la espera en observación, HIFU, radioterapia, criocirugía y cirugía suelen ofrecerse a varones cuyo cáncer aún permanece dentro de la próstata. La terapia hormonal y la quimioterapia suelen reservarse para casos en los que la enfermedad se ha extendido fuera de la próstata. No obstante, hay excepciones: la radioterapia puede utilizarse para algunos tumores avanzados, y la terapia hormonal se emplea para algunos tumores en fase inicial. La crioterapia, la terapia hormonal y la quimioterapia también pueden ofrecerse si el tratamiento inicial falla y el cáncer avanza.
En un número importante de pacientes con carcinoma de próstata sometidos a una prostatectomía radical como consecuencia de la sospecha clínica de un crecimiento limitado por el órgano, un análisis histológico definitivo de la preparación quirúrgica muestra un tumor extensivo a nivel local que se propaga fuera de los límites del órgano. Estos pacientes presentan un elevado riesgo de recurrencia local temprana, normalmente detectable como un incremento de los niveles de PSA en términos de una recaída bioquímica. Las opciones terapéuticas en esta situación incluyen la radioterapia externa y la ablación hormonal. No obstante, el valor de estos enfoques terapéuticos, especialmente en lo que respecta a prolongar la supervivencia del paciente a largo plazo, no deben considerarse como probados. Además, deben tenerse en cuenta posibles complicaciones asociadas con el tratamiento, como por ejemplo el desarrollo de una estenosis uretral (radioterapia), la pérdida de libido e impotencia, el riesgo de una reducción de las sales cálcicas esqueletales en términos de osteoporosis y un marcado incremento en el riesgo de fracturas óseas patológicas (ablación hormonal).
Más del 90% de todos los cánceres de próstata se descubren en las fases local y regional. El índice de supervivencia relativa tras 5 años para los pacientes cuyos tumores se diagnostican en estas fases se aproxima al 100%. Durante los últimos 25 años, el índice de supervivencia combinado tras 5 años para la totalidad de las fases ha pasado del 69% a casi el 90%. Según los datos más recientes, la supervivencia relativa a 10 años es del 93%, mientras que a 15 años es del 77%. Las mejoras drásticas en términos de supervivencia, especialmente tras 5 años, son parcialmente atribuibles a diagnósticos más tempranos y a mejoras en el tratamiento. Sin embargo, el índice de supervivencia cae notablemente tras la extensión a otros tejidos y órganos.
Cáncer de pulmón Se estima que en 2007 se diagnosticarán 210.000 nuevos casos en Estados Unidos, cifra que representa en torno al 15% de los diagnósticos de cáncer. El nivel de incidencia está cayendo notablemente entre los hombres, desde un máximo de 102 casos por cada 100.000 varones en 1984 hasta un 78,5 en 2003. En las mujeres, el nivel está estabilizándose tras un largo período de incremento. Clínicamente, el cáncer de pulmón se divide, a efectos de tratamiento, en dos grupos: el carcinoma microcítico de pulmón (13%) y el resto de tipos (87%).
El cáncer de pulmón representa la mayor parte de fallecimientos relacionados con el cáncer tanto en hombres como en mujeres. Se estima que en 2007 se producirán 160.390 fallecimientos, que representan alrededor del 29% de la totalidad de las muertes por cáncer. Desde 1987, cada año han fallecido más mujeres a causa del cáncer de pulmón que por cáncer de mama. En los varones, los índices de fallecimiento han seguido cayendo notablemente entre 1991 y 2003 a un nivel aproximado de un 1,9% por año. Los índices de cáncer de pulmón entre mujeres están estabilizándose, tras haber estado en constante aumento durante varias décadas. Estas tendencias en la mortalidad por cáncer de pulmón reflejan el descenso en los índices de fumadores durante los últimos 30 años.
Las opciones de tratamiento vienen determinadas por el tipo (microcítico o no) y la fase del cáncer, e incluyen cirugía, radioterapia, quimioterapia y terapias biológicas dirigidas, como las de bevacizumab (Avastin®) y erlotinib (Tarceva®). Para cánceres localizados, la cirugía suele ser el tratamiento utilizado. Algunos estudios recientes indican que la tasa de supervivencia con cáncer de pulmón en fase inicial y no microcítico se ve mejorada si tras la cirugía se aplica quimioterapia. Debido al hecho de que la enfermedad suele estar extendida cuando se descubre, suelen utilizarse la radioterapia y la quimioterapia, a veces en combinación con la cirugía. La quimioterapia por sí sola o combinada con radiación es el tratamiento que suele elegirse para el carcinoma microcítico de pulmón. Con este régimen, un alto porcentaje de pacientes experimentan remisión, que en algunos casos es duradera.
El índice de supervivencia relativa del cáncer de pulmón después de 1 año se ha incrementado ligeramente desde el 37% en 1975-1979 hasta el 42% en 2002, en gran parte gracias a las mejoras en técnicas quirúrgicas y en terapias combinadas. No obstante, el índice combinado de supervivencia tras 5 años para todas las fases es tan solo del 16%. El índice de supervivencia es del 49% en los casos detectados cuando la enfermedad aún está localizada. No obstante, tan solo el 16% de los cánceres de pulmón se diagnostica en esta fase inicial.
Por lo tanto, se siguen necesitando nuevas opciones de tratamiento eficaces y seguras para glioblastomas, tumores de próstata, cáncer de mama, cáncer de esófago, cáncer colorrectal, cáncer de células renales de células claras, cáncer de pulmón, cáncer pancreático, cáncer ovárico, cáncer del SNC, melanoma, carcinoma de células escamosas, leucemia y meduloblastoma y otros tumores que muestran sobreexpresión de survivin y/o las otras proteínas de la presente invención, potenciándose el bienestar de los pacientes sin utilizar agentes quimioterapéuticos u otros agentes que podrían conllevar graves efectos secundarios.
Breve Descripción de la Invención En un primer aspecto, la presente invención está relacionada con un péptido que comprende una secuencia que se selecciona del grupo de secuencias SEQ ID n.° 1 a SEQ ID n.° 30, o una variante de las mismas que es homologa, al menos, en un 85% a las secuencias SEQ ID n.° 1 a SEQ ID n.° 30, o una variante que induce a los linfocitos T a reaccionar de forma cruzada con el mencionado péptido variante. El péptido mencionado no es el polipéptido completo de la survivina humana. Preferentemente, el mencionado péptido se selecciona a partir de un péptido con un subtipo de HLA específico, como HLA-A*02 o HLA-DR.
En un segundo aspecto, la presente invención está relacionada con un ácido nucleico que codifica un péptido conforme a la presente invención o con un vector de expresión capaz de expresar dicho ácido nucleico.
En un tercer aspecto, la presente invención está relacionada con una célula huésped que comprende el ácido nucleico o el vector de expresión con arreglo a esta misma invención, donde, preferiblemente, la mencionada célula huésped será una célula presentadora de antígenos, en concreto una célula dendrítica o una célula presentadora de antígenos.
En un cuarto aspecto, la presente invención está relacionada con un método para producir linfocitos T citotóxicos (CTL) activados in vitro, método que comprende el contacto in vitro de los CTL con moléculas humanas MHC de clase I con carga de antígenos, expresadas en la superficie de una célula presentadora de antígenos adecuada o un constructor artificial que mimetiza una célula presentadora de antígenos durante un periodo de tiempo suficiente para activar, de una forma propia de antígeno, dichos CTL, en los que el antígeno es un péptido con arreglo a la presente invención.
En un quinto aspecto de la presente invención, ésta se refiere a la utilización de un péptido según la presente invención, el ácido nucleico o el vector de expresión según la presente invención, la célula según la presente invención, o un linfocito T citotóxico activado producido según la presente invención para el tratamiento del cáncer o para la fabricación de un medicamento contra el cáncer, en la que dicho medicamento es preferentemente una vacuna. Preferentemente, dicho cáncer se seleccionará a partir del astrocitoma, astrocitoma pilocítico, tumor neuroepitelial disembrioplásico, oligodendrogliomas, ependimoma, glioblastoma multiforma, gliomas combinados, oligoastrocitomas, meduloblastoma, retinoblastoma, neuroblastoma, germinoma, teratoma, gangliogliomas, gangliocitoma, gangliocitoma central, tumores neuroectodermales primitivos (PNET, por ejemplo meduloblastoma, meduloepitelioma, neuroblastoma, retinoblastoma, ependimoblastoma), tumores del parénquima pineal (por ejemplo pineocitoma, pineoblastoma), tumores de células ependimales, tumores del plexo coroideo, tumores neuroepiteliales de origen incierto (por ejemplo, gliomatosis cerebri, astroblastoma), tumor prostático, glioblastoma, cáncer de mama, cáncer de esófago, cáncer de colon, cáncer colorrectal, carcinoma de células renales, carcinoma de células renales con célula clara, cáncer de pulmón, CNS, ovarios, melanoma, cáncer de páncreas, carcinoma escamocelular, leucemia y meduloblastoma, y otros tumores o cánceres que muestran una sobreexpresión de Survivin y/o las otras proteínas de la presente invención.
En un sexto aspecto de la misma, la presente invención se refiere a un kit que comprende: (a) un envase con un compuesto farmacéutico que contiene un péptido según la presente invención, el ácido nucleico o el vector de expresión según la presente invención, una célula según la presente invención o un linfocito T citotóxico activado según la presente invención, en solución o en forma liofilizada; (b) opcionalmente, un segundo envase que contiene un diluyente o una solución reconstituyente para la formulación liofilizada; (c) opcionalmente, al menos un péptido seleccionado del grupo que consiste en los péptidos según las SEQ ID n.° 1 a 30, y (d) opcionalmente, instrucciones para la utilización de la solución y/o la reconstitución y/o la utilización de la formulación liofilizada. En una realización preferida el péptido se selecciona del grupo de las SEQ ID n.° 1 a SEQ ID 24.
En un séptimo aspecto de la misma, la presente invención se refiere a un método para producir un anticuerpo recombinante que se une específicamente a un complejo principal de histocompatibilidad humano (MHC) de clase I o II que forma un complejo con un antígeno restringido a HLA, comprendiendo dicho método: la inmunización de un mamífero no humano sometido a ingeniería genética que consta de células que expresan dicho complejo mayor de histocompatibilidad humano (MHC) de clase I o II con una forma soluble de la molécula MHC de clase I o II combinada con el mencionado antígeno restringido a HLA; el aislamiento de moléculas de ARN-m de las células productoras de anticuerpos del mencionado mamífero no humano; la producción de una biblioteca de expresión en fago en la que aparezcan las moléculas de proteínas codificadas por dichas moléculas de ATN-M; y el aislamiento de, al menos, un fago de dicha biblioteca de expresión en fagos, con al menos un fago mostrando dicho anticuerpo conectable al mencionado complejo mayor de histocompatibilidad humano (MHC) de clase I o II, combinado con el mencionado antígeno restringido a HLA.
En un octavo aspecto de la misma, la presente invención se refiere a un anticuerpo que se une específicamente a un complejo principal de histocompatibilidad humano (MHC) de clase I o II que forma un complejo con un antígeno restringido a HLA, en el que el anticuerpo es preferentemente un anticuerpo policlonal, un anticuerpo monoclonal y/o un anticuerpo quimérico.
Breve Descripción de los Dibujos La figura 1A a 1D muestra los espectros de masas de cromatografía de líquidos ESI que identifican péptidos asociados a tumores (TUMAP) IGF2BP3-001 de la muestra de glioblastoma GB6010 que se presentó de una forma restringida a MHC de clase I.
La figura 2a y 2b representa el perfil de expresión del ARNm de los genes diana de la invención que se encuentran altamente sobreexpresados en las muestras de glioblastoma. La expresión de estos genes es inexistente o muy baja en los tejidos normales, mientras que aumenta fuertemente en las muestras de glioblastoma. Se muestran las expresiones relativas de ARNm de varios tejidos normales y muestras individuales de glioblastoma multiforme (GBM) medidas por análisis de matrices de ADN. Los valores son relativos a los niveles de expresión en el riñón normal (el valor siempre se establece arbitrariamente en 1.0). Los valores para los tejidos normales se generaron mediante conjuntos de ARNm disponibles en el mercado. Las letras entre paréntesis indican la «lectura de detecciones» dada por el programa de análisis. La «lectura de detecciones» indica si un transcrito se detectó específicamente en la muestra o si no se observaron detecciones significativas. Puede adoptar los valores «P» (presente), «A» (ausente), o «M» (detección marginal).
La figura 3 muestra el análisis tetramérico de la proliferación por microesfera de linfocitos CD8+ específicos de NLGN4X-001 y CSP-001 de sangre periférica de un donante sano. Se estimularon semanalmente 1 x 106 PBMC por pocilio enriquecidas con CD8+ con microesferas acopladas a anti-CD28 más antígeno A*0201 /CSP-001 de tumor de alta densidad (panel izquierdo) o anti-CD28 más antígeno A*0201/NLGN4X-001 de tumor de alta densidad (panel derecho). Después de tres estimulaciones in vitro, se tiñeron todas las células con anticuerpo CD8 FITC, y tetrámeros marcados por fluorescencia A*0201/ CSP-001 y A*0201/ NLGN4X-001. Las células son separadas (gated) en linfocitos CD8 + ; los números representan el porcentaje de células en el cuadrante indicado entre los linfocitos CD8+.
La figura 4 muestra la afinidad de los péptidos HLA de clase I de la invención con la molécula MHC codificada por el alelo HLA-A*0201. Se midieron las constantes de disociación (KD) de TUMAP de HLA de clase I de la invención y el péptido de control HBV-001 (aglutinante fuerte A*02) mediante un análisis de replegamiento de MHC basado en ELISA.
Descripción Detallada de la Invención Más abajo se definen todos los términos según se utilizan en el presente documento, a menos que se indique de otra manera.
El término «péptido» se usa aquí para designar una serie de residuos de aminoácidos conectados entre sí típicamente mediante enlaces peptídicos entre los grupos amino-alfa y carbonilo de los aminoácidos adyacentes. La longitud típica de los péptidos es de 9 aminoácidos, pero puede acortarse a 8 aminoácidos de longitud, y alargarse hasta 16 ó 10, 11, 12, 13, 14 ó 15 aminoácidos de longitud.
El término «oligopéptido» se usa aquí para designar una serie de residuos de aminoácidos conectados entre sí típicamente mediante enlaces peptídicos entre los grupos amino-alfa y carbonilo de los aminoácidos adyacentes. La longitud del oligopéptido no es crucial en la invención, siempre que se mantenga el epítopo o epítopos adecuados. Suelen tener una longitud inferior a unos 30 aminoácidos y mayor de 14.
El término «polipéptido» designa una serie de residuos de aminoácidos conectados entre sí típicamente mediante enlaces peptídicos entre los grupos amino-alfa y carbonilo de los aminoácidos adyacentes. La longitud del polipéptido no es crucial en la invención, siempre que se mantengan los epítopos adecuados. En contraste con los términos «péptido» y «oligopéptido» , el término «polipéptido» se refiere a las moléculas de más de unos 30 residuos de aminoácidos de longitud.
Un péptido, oligopéptido, proteína o polinucleótido que codifica dicha molécula es «inmunógeno» (y, por lo tanto, un inmunogén en la presente invención), si es capaz de inducir una respuesta inmune. En el caso de la presente invención, la inmunogenicidad se define más específicamente como la habilidad para inducir una respuesta de una célula T. Por lo tanto, un imunogén seria una molécula que es capaz de inducir una repuesta inmune y, en el caso de la presente invención, una molécula capaz de inducir una respuesta de una célula T.
Un «epítopo» de una célula T requiere un péptido corto que esté vinculado a un receptor MHC de clase I o clase II, formando un complejo ternario (MHC clase I de cadena alfa, beta-2-microglobulina y péptido) que puede ser reconocido por una célula T que lleve un receptor de célula T que coincida y que se una al complejo MHC/péptido con la afinidad adecuada.
Los péptidos que se unen a moléculas MHC de clase I suelen tener una longitud de entre 8 y 14 aminoácidos de longitud, habitualmente de 9 aminoácidos. Los epítopos de linfocitos T que se unen a moléculas MHC de clase II suelen tener una longitud de entre 12 y 30 aminoácidos. En el caso de los péptidos que se unen a moléculas MHC de clase II, el mismo péptido y el epítopo de la célula T correspondiente pueden compartir un segmento central común y diferir en la longitud total como consecuencia de las secuencias de flanqueo de diferentes longitudes en dirección ascendente del extremo amino de la secuencia central y descendente con respecto a su terminal carboxílico respectivamente. Los receptores MHC de clase II presentan una conformación más abierta; de la misma manera, los péptidos unidos a receptores MHC de clase II no se enclavan completamente en la estructura del surco de unión al péptido de la molécula MHC de clase II, como ocurre con el surco de unión del péptido de la molécula MHC de clase I. Sorprendentemente, este no es el caso del péptido según la SEQ ID n.° 1, puesto que variaciones pequeñas en la longitud del péptido conllevan una disminución extrema de la actividad (véase más abajo).
En humanos, hay tres locus genéticos diferentes que codifican las moléculas MHC de clase I (las moléculas MHC de los humanos también se denominan antígenos de leucocito humano [HLA]). HLA-A, HLA-B y HLA-C. HLA-A*0I, HLA-A*02 y HLA-A*11 son ejemplos de distintos alelos MHC de clase I que se pueden expresar desde estos locus.
Hay tres locus diferentes en el genoma humano para los genes MHC de clase II: HLA-DR, HLA-DQ, y HLA-DP. Los receptores MHC de clase II son heterodímeros que constan de una cadena alfa y una beta, las cuales se enclavan en la membrana celular a través de una región transmembranosa. HLA-DRB1 *04 y HLA-DRB1 *07 son dos ejemplos de diferentes alelos beta MHC de clase II que se sabe que están codificados en estos locus. Los alelos de clase II son muy polimorfos: por ejemplo, se han descrito varios cientos de alelos HLA-DRB1 distintos. Por tanto, a efectos terapéuticos y de diagnóstico es altamente deseable contar con un péptido que se una, con la afinidad adecuada, a varios receptores diferentes HLA de clase II. Un péptido que se une con varias moléculas HLA de clase II diferentes recibe el nombre de aglutinante promiscuo.
La referencia a una secuencia de ADN incluye tanto ADN monocatenario como bicatenario, tal y como se usa aquí. Por lo tanto, la secuencia específica, a menos que el contexto indique otra cosa, se refiere al ADN monocatenario de dicha secuencia, el dúplex de dicha secuencia con su complemento (ADN bicatenario) y el complemento de dicha secuencia. El término «región codificante» hace referencia a la porción de un gen que, o bien de forma natural o normal, codifica el producto de expresión de dicho gen en su ambiente genómico natural, por ejemplo, la región que codifica in vivo el producto de expresión nativo del gen.
La región codificante se puede formar a partir de un gen normal, mutado o alterado, o incluso puede provenir de una secuencia de ADN, o gen, sintetizado completamente en el laboratorio con métodos bien conocidos para los expertos en la síntesis de ADN.
El término «secuencia nucleotídica» hace referencia a un heteropol ímero de desoxiribonucleótidos.
La secuencia nucleotídica que codifica un péptido, un oligopéptido o un polipéptido en particular puede ser natural o estar construida de forma sintética. Generalmente, los segmentos de ADN que codifican los péptidos, polipéptidos y proteínas de la presente invención se ensamblan a partir de fragmentos de ADNc y ligadores cortos de oligonucleótidos, o a partir de una serie de oligonucleótidos, con el fin de proporcionar un gen sintético capaz de ser expresado en una unidad transcripcional recombinante que comprenda elementos reguladores derivados de un operón microbiano o vírico.
El término «producto de expresión» define al polipéptido o a la proteína que es el producto natural de traducción del gen y cualquier secuencia de ácidos nucleicos que codifican equivalentes resultantes de la degeneración del código genético y, por lo tanto, que codifican el mismo aminoácido o aminoácidos.
El término «fragmento», cuando se refiere a una secuencia de codificación, define una porción de ADN que no comprende la región codificante completa, cuyo producto de expresión retiene esencialmente la misma actividad o función biológica que el producto de expresión de la región codificante completa.
El término «segmento de ADN» hace referencia a un polímero de ADN, en la forma de un fragmento separado o como componente de un constructo de ADN mayor, que deriva de ADN aislado por lo menos una vez en una forma sustancialmente pura, es decir, sin materiales endógenos contaminantes y en una cantidad o concentración que permite la identificación, la manipulación y la recuperación del segmento y sus secuencias nucleotídicas de componentes mediante métodos bioquímicos estándar como, por ejemplo, mediante el uso de un vector de clonación. Dichos segmentos se suministran en forma de un marco de lectura abierto sin interrupciones de secuencias internas no traducidas, o intrones, que suelen estar presentes en los genes eucarióticos. Las secuencias de ADN no traducido pueden estar presentes en dirección 3' desde el marco de lectura abierto, donde no interfieren con la manipulación o la expresión de las regiones codificantes.
El término «cebador» define una secuencia corta de ácidos nucleicos que puede aparearse con una cadena de ADN y que suministra un extremo 3?? libre en el que una polimerasa de ADN comienza la síntesis de una cadena de desoxiribonucleótidos.
El término «promotor» define una región de ADN implicada en la unión de la polimerasa de ARN para iniciar la transcripción.
El término «marco de lectura abierto (ORF)» hace referencia a una serie de codificación de tripletes para aminoácidos sin codones de terminación, y es una secuencia (potencialmente) traducible en proteína.
El término «aislado» define el material que se elimina de su entorno original (por ejemplo, el entorno natural si ocurre de forma natural). Por ejemplo, un polinucleótido o un polipéptido natural presente en un animal vivo no está aislado, pero el mismo polinucleótido o polipéptido, separado de parte o de todos los materiales coexistentes en el sistema natural, está aislado. Dichos polinucleótidos podrían ser parte de un vector y/o dichos polinucleótidos o polipéptidos podrían ser partes de una composición y seguir estando aislados de forma que dicho vector o composición no fuera parte de su entorno natural.
Los polinucleótidos y los polipéptidos recombinantes o inmunógenos, descritos de acuerdo con la presente invención también pueden presentarse en una forma «purificada». El término «purificado» no implica pureza absoluta; más bien, se utiliza como definición relativa y puede incluir preparaciones altamente purificadas o preparaciones tan sólo parcialmente purificadas, tal y como los expertos en la materia entienden dichos términos. Por ejemplo, los clones individuales aislados a partir de una genoteca de ADNc se han purificado de manera convencional a una homogeneidad electroforética. Se contempla expresamente la purificación del material de inicio o del material natural hasta, al menos, un orden de magnitud; preferiblemente, dos o tres órdenes de magnitud; y, con mayor preferencia, cuatro o cinco órdenes de magnitud. Además, se contempla expresamente el polipéptido reivindicado que tiene una pureza de, preferiblemente, el 99, 999%, o, al menos, del 99, 99% o el 99, 9%; y, más convenientemente, del 99% por peso o mayor.
Los productos de expresión de los polipéptidos y los ácidos nucleicos descritos conforme a la presente invención, así como los vectores de expresión que contienen dichos ácidos nucleicos y/o dichos polipéptidos, pueden utilizarse en «forma enriquecida». Tal y como se usa aquí, el término «enriquecido» significa que la concentración del material es, al menos, unas 2, 5, 10, 100 o 1000 veces su concentración natural (por ejemplo), más ventajosamente 0, 01 %, por peso, y, preferiblemente, cerca de 0, 1%, al menos, por peso. Las preparaciones enriquecidas de cerca del 0, 5%, 1%, 5%, 10% y 20% por peso también se contemplan. Las secuencias, constructos, vectores, clones y otros materiales que comprenden la presente invención pueden utilizarse, según convenga, en su forma enriquecida o aislada.
El término «fragmento activo» define un fragmento que genera una respuesta inmune (es decir, que tiene una actividad inmunógena) cuando se administra -solo o, opcionalmente, con un adyuvante adecuado- a un animal, que puede ser un mamífero como, por ejemplo, un conejo o un ratón, sin excluir a un humano; respuesta inmune que adopta la forma de estimulación de una respuesta de célula T en el animal receptor como, por ejemplo, el humano. De forma alternativa, el «fragmento activo» también se puede usar para inducir una respuesta de célula T in vitro.
Tal y como se usan aquí, los términos «porción», «segmento» y «fragmento», cuando se utilizan en relación a los polipéptidos, hacen referencia a una secuencia continua de residuos, como residuos de aminoácidos, secuencia que es un subconjunto de una secuencia mayor. Por ejemplo, si un polipéptido se somete a un tratamiento con cualquiera de las endopeptidasas habituales, como la tripsina o la quimotripsina, los oligopéptidos resultantes de dicho tratamiento representarán porciones, segmentos o fragmentos del polipéptido de inicio. Esto significa que cualquiera de esos fragmentos, necesariamente y como parte de su secuencia de aminoácidos, va a contener un segmento, fragmento o porción que sea sustancialmente idéntica, si no lo es exactamente, a una secuencia de la SEQ ID n.° 1 a 30, que corresponde a las proteínas « progenitoras» o naturales de la SEQ ID n.° 1 a 30.
Utilizados en relación con los polinucleótidos, dichos términos se refieren a los productos generados por el tratamiento de dichos polinucleótidos con cualquiera de las endonucleasas habituales.
Conforme a la presente invención, el término «identidad porcentual» o «porcentaje idéntico», al referirse a una secuencia, significa que una secuencia se compara con una secuencia reivindicada o descrita tras la alineación de la secuencia que se va a comparar (la «secuencia comparada») con la secuencia descrita o reivindicada (la «secuencia de referencia»). La identidad porcentual se determina entonces conforme a la siguiente fórmula: Identidad porcentual = 100 [I -(C/R)] donde C es el número de diferencias entre la secuencia de referencia y la secuencia comparada a lo largo de la alineación de la secuencia de referencia y la secuencia comparada, donde (i) cada base o aminoácido de la secuencia de referencia que no tiene una base o aminoácido alineados en la secuencia comparada y (ii) cada gap de la secuencia de referencia y (iii) cada base o aminoácido alineado de la secuencia de referencia que es distinta de una base o aminoácido alineado de la secuencia comparada, constituye una diferencia; y R es el número de bases o aminoácidos de la secuencia de referencia a lo largo de la alineación con la secuencia comparada con cualquier gap creado en la secuencia de referencia, también contabilizado como una base o un aminoácido.
Si existe una alineación entre la secuencia comparada y la secuencia de referencia para la que la identidad porcentual, calculada como se ha especificado, es aproximadamente igual o mayor que una identidad porcentual mínima especificada, entonces la secuencia comparada tiene la identidad porcentual mínima especificada para la secuencia de referencia aunque puedan existir alineaciones en las que la identidad porcentual calculada más arriba es menor que la identidad porcentual especificada.
Los péptidos originales descritos aquí se pueden modificar mediante la sustitución de uno o más residuos en sitios diferentes, posiblemente selectivos, dentro de la cadena peptídica, si no se especifica de otra manera. Dichas sustituciones pueden ser de naturaleza conservadora como, por ejemplo, si un aminoácido es reemplazado por un aminoácido de estructura y características similares, como en el caso en el que un aminoácido hidrofóbico es sustituido por otro aminoácido hidrofóbico. Aún más conservador sería el reemplazo de aminoácidos de tamaño y naturaleza química igual o similar como, por ejemplo, si la leucina se reemplaza por isoleucina. En diversos estudios de variaciones de secuencias en familias de proteínas homologas naturales, determinadas sustituciones de aminoácidos se toleran más habitualmente que otras, y éstas muestran a menudo una correlación con similitudes de tamaño, carga, polaridad e hidrofobicidad entre el aminoácido original y su reemplazo, siendo ésta la base para la definición de las «sustituciones conservadoras».
Las sustituciones conservadoras se definen como intercambios dentro de uno de los siguientes cinco grupos: Grupo 1: residuos alifáticos pequeños no polares o ligeramente polares (Ala, Ser, Thr, Pro, Gly); grupo 2: residuos polares cargados negativamente y sus amidas (Asp, Asn, Glu, Gln); grupo 3: residuos polares cargados positivamente (His, Arg, Lys); grupo 4: residuos alifáticos grandes no polares (Met, Leu, lie, Val, Cys); y grupo 5: residuos grandes aromáticos (Phe, Tyr, Trp).
Las sustituciones menos conservadoras pueden implicar el reemplazo de un aminoácido por otro con características similares pero diferenciado de alguna manera en el tamaño, como en el reemplazo de un residuo de isoleucina por alanina. Los reemplazos altamente no conservadores pueden implicar la sustitución de un aminoácido acídico por otro polar, o incluso por uno de carácter básico. Estas sustituciones «radicales» no se pueden descartar, sin embargo, como potencialmente inefectivas, ya que los efectos químicos no son totalmente predecibles y las sustituciones radicales bien pueden provocar efectos no esperados imposibles de predecir de otra forma a partir de principios químicos simples.
Naturalmente, dichas sustituciones pueden implicar estructuras distintas que los aminoácidos L habituales. De esta forma, los aminoácidos D pueden ser sustituidos por los aminoácidos L que habitualmente se encuentran en los péptidos antigénicos de la invención y, aún así, englobarse en la descripción del presente documento. Además, los aminoácidos que procesan grupos R no estándar (es decir, grupos R distintos de los que se encuentran en los 20 aminoácidos comunes de las proteínas naturales) también se pueden usar para sustituciones, con el fin de producir inmunogenes y polipéptidos inmunógenos conformes a la presente invención.
Si se descubre que las sustituciones en más de una posición resultan en un péptido con actividad antigénica sustancialmente equivalente o mayor, como se define más abajo, entonces las combinaciones de dichas sustituciones se probarán para determinar si las sustituciones combinadas provocan efectos aditivos o de sinergia en la antigenicidad del péptido. Como máximo, no se sustituirán más de 4 posiciones simultáneamente dentro del péptido.
El término «respuesta de linfocitos T» define la proliferación y activación específicas de las funciones efectoras inducidas por un péptido en vivo o in vitro. Para los CTL restringidos a MHC de clase I, las funciones efectoras pueden ser la lisis de células diana sensibilizadas de manera repetida con péptido, con precursor o presentadoras naturales de péptido; la secreción de citocinas, preferiblemente interferón gamma, TNF-alfa o IL-2 inducido por péptido; la secreción de moléculas efectoras, preferiblemente granzimas o perforinas inducidas por péptido; o la desgranulación. Para los linfocitos T colaboradores restringidos a MHC de clase II, las funciones efectoras pueden ser la secreción inducida por péptido de citocinas, preferiblemente, IFN-gamma, TNF-alfa, IL-4, IL5, IL-10 o IL-2, o la desgranulación inducida por péptido. Las funciones efectoras posibles de los CTL y los linfocitos T colaboradores no se limitan a esta lista.
Preferentemente, cuando los CTL específicos de un péptido de las SEQ ID n.° 1 a 30 se analizan con respecto a los péptidos sustituidos, la concentración peptídica con la que los péptidos sustituidos logran la mitad del incremento máximo de lisis relativa al fondo no es mayor de aproximadamente 1 mM, preferentemente no es mayor de aproximadamente 1 µ?, más preferentemente no es mayor de aproximadamente 1 nM, y aún más preferentemente no es mayor de aproximadamente 100 p , y con la máxima preferencia no es mayor de aproximadamente 10 pM. También se prefiere que el péptido sustituido sea reconocido por CTL de más de un individuo, al menos de dos, y, preferiblemente, de tres individuos.
De esta forma, los epítopos de la presente invención pueden ser idénticos a epítopos naturales específicos de tumor o asociados a tumor o pueden incluir epítopos que difieran en no más de 4 residuos del péptido de referencia, siempre su actividad antigénica sea sustancialmente idéntica.
La estimulación de la respuesta inmunológica depende de la presencia de antígenos, reconocidos como extraños por el sistema inmune huésped. El descubrimiento de la existencia de antígenos asociados a tumor ha sugerido la posibilidad de utilizar un sistema inmune huésped para promover una respuesta inmune específica de antígenos diana expresados en la superficie de células tumorales y que, a través de este mecanismo de acción, es capaz de inducir una regresión, un estancamiento o una disminución en la velocidad de crecimiento del tumor. En la inmunoterapia del cáncer, actualmente se están explorando diversos mecanismos para aprovechar las ramas humorales y celulares del sistema inmune.
Elementos específicos de la respuesta inmunológica celular son capaces de reconocer y destruir células tumorales. El aislamiento de linfocitos T citotóxicos (CTL) de poblaciones de linfocitos destructores de tumores o de sangre periférica sugiere que dichas células desempeñan una función importante en las defensas inmunes naturales contra el cáncer (Cheever et al., 1993; Zeh, III et al., 1999). En base al análisis de 415 especímenes de pacientes de cáncer colorrectal, Galón y col. pudieron demostrar que el tipo, la densidad y la ubicación de las células inmunes en el tejido tumoral son en realidad mejores factores de predicción de la supervivencia del paciente que la muy utilizada clasificación TNM de tumores (Galón et al., 2006).
Los péptidos MHC de clase I presentes que resultan de la segmentación proteolítica de proteínas predominantemente endógenas, DRIP y péptidos mayores, las moléculas MHC de clase II, que se encuentran predominantemente en células especializadas presentadoras de antígenos (APC), y principalmente presentan péptidos de proteínas exógenas o transmembranosas que son absorbidos por las APC durante el proceso de endocitosis y, posteriormente, son procesadas (Cresswell, 1994). Los complejos peptídicos y las moléculas MHC de clase I son reconocidas por los linfocitos T citotóxicos CD8+ portadores del TCR adecuado (receptor de célula T), y los complejos de péptido y moléculas MHC de clase II son reconocidos por células T colaboradoras CD4+ portadoras del TCR adecuado. Es bien sabido que el TCR, el péptido y el MHC están presentes en una cantidad estequiométrica de 1:1:1.
Los linfocitos T colaboradores CD4+ desempeñan una función importante en la inducción y el mantenimiento de respuestas eficaces mediante linfocitos T citotóxicos CD8 + (Wang and Livingstone, 2003; Sun and Bevan, 2003; Shedlock and Shen, 2003). Inicialmente, la sensibilización y expansión de CTL en ganglios linfático viene respaldada por células T CD4 + (Schoenberger et al., 1998). Por tanto, un mecanismo podría ser la orientación de células CD8+ originales hacia el lugar de la interacción de la célula T funcional CD4+ - APC (Castellino et al., 2006). Finalmente, la generación de células funcionales de memoria CD8+, en la mayor parte de los casos, depende de la asistencia de células T CD4+ (Sun and Bevan, 2003; Janssen et al., 2003). Por estas razones, la identificación de epítopos de linfocitos T CD4+ derivados de antígenos asociados a tumor (TAA) es de gran importancia para el desarrollo de productos farmacéuticos para desencadenar respuestas inmunes antitumorales (Kobayashi et al., 2002; Qin et al., 2003; Gnjatic et al., 2003). En el lugar del tumor, las células T colaboradoras permiten un entorno adecuado de citocina (Qin and Blankenstein, 2000; Mortara et al., 2006) y atraen a las células efectoras, p. ej. CTLS, células NK, macrófagos, granulocitos (Marzo et al., 2000; Hwang et al., 2007).
En ausencia de inflamación, la expresión de moléculas MHC de clase II está restringida principalmente a células del sistema inmune, especialmente a células especializadas presentadoras de antígenos (APC) como, por ejemplo, monocitos, células derivadas de monocitos, macrófagos o células dendríticas. En los pacientes de cáncer, se ha descubierto que, sorprendentemente, las células del tumor expresan moléculas MHC de clase II (Dengjel et al., 2006).
En modelos de mamíferos como, por ejemplo, ratones, se demostró que, aun en ausencia de células efectoras CTL (es decir, de linfocitos T CD8 + ), los linfocitos T CD4+ son suficientes para inhibir la manifestación de tumores mediante la inhibición de la angiogénesis por secreción de interferón-gamma (IFNy) (Qin and Blankenstein, 2000). Asimismo, la destrucción directa de células tumorales mediante células T CD4+ citotóxicas a través de linfotoxinas y granzimas B también se ha propuesto (Penna et al., 1992; Littaua et al., 1992).
Adicionalmente, se demostró que los linfocitos T CD4+ que reconocían péptidos de antígenos asociados a tumor presentados por moléculas HLA de clase II pueden contrarrestar la evolución tumoral mediante la inducción de respuestas de anticuerpos (Ab) (Kennedy et al., 2003).
A diferencia de los péptidos asociados a tumores unidos a moléculas HLA de clase I, hasta ahora sólo se ha descrito un pequeño número de ligandos de clase II de los antígenos asociados a tumores (TAA).
Teniendo en cuenta que la expresión constitutiva de moléculas HLA de clase II normalmente está limitada a células del sistema inmune (Mach et al., 1996), la posibilidad de aislar péptidos de clase II directamente de tumores primarios no se consideró posible. Sin embargo, Dengjel y col. lograron recientemente la identificación de una serie de epítopos MHC de clase II directamente de tumores (WO 2007/028574, EP 1 760088 B1; (Dengjel et al., 2006).
Los antígenos que son reconocidos por los linfocitos T citotóxicos específicos de tumor, es decir, sus epítopos, pueden ser moléculas derivadas de cualquier clase de proteína -como enzimas, receptores, factores de transcripción, etc. expresadas y, en comparación con células no alteradas del mismo origen, reguladas ascendentemente en las células del tumor en cuestión.
La clasificación actual de los antígenos asociados a tumor (TAA) comprende los siguientes grupos principales (Novellino et al., 2005): 1. Antígenos de cáncer de testículo: los primeros TAA identificados que pueden ser reconocidos por linfocitos T (van der Bruggen et al., 1991) pertenecen a esta clase a la que originalmente se llamó antígenos de cáncer de testículo (CT) por la expresión de sus miembros en tumores humanos histológicamente distintos y, entre tejidos normales, sólo en los espermatocitos/espermatogonia del testículo y, ocasionalmente, en la placenta. Debido a que las células del testículo no expresan moléculas HLA de clase I y II, estos antígenos no pueden ser reconocidos por linfocitos T en tejidos normales y, por lo tanto, se pueden considerar como ¡nmunológicamente específicos de tumor. Ejemplos muy conocidos de antígenos CT son los miembros de la familia MAGE o el NY-ESO-1. 2. Antígenos de diferenciación: estos TAA son compartidos entre los tumores y el tejido normal del que surgieron; la mayoría se encuentran en melanomas y melanocitos normales. Muchas de estas proteínas relacionadas con el número de líneas de los melanocitos están implicadas en la biosíntesis de melanina y no son, por lo tanto, específicas de tumor pero, sin embargo, se utilizan muy ampliamente en la inmunoterapia contra el cáncer. Algunos ejemplos son la tirosinasa y la Melan-A/MART-1 para el melanoma o el PSA para el cáncer de próstata. 3. TAA sobreexpresados: los genes que codifican TAA ampliamente expresados han sido detectados en tipos de tumor histológicamente diferentes, así como en muchos tejidos normales, generalmente con niveles de expresión más bajos. Es posible que muchos de los epitopos procesados y presentados potencialmente por tejidos normales se encuentren por debajo del umbral de reconocimiento de linfocitos T, mientras que su sobreexpresion en las células tumorales puede desencadenar una respuesta anticancerosa mediante la ruptura de la tolerancia previamente establecida. Ejemplos prominentes de esta clase de TAA son Her-2/neu, Survivin, Telomerasa o WT1. 4. Antígenos específicos de tumor: estos TAA únicos surgen a partir de mutaciones de genes normales (como ß-catenina, CDK4, etc). Algunos de estos cambios moleculares están asociados a la transformación y/o progresión neoplásica. Los antígenos específicos de tumor suelen ser capaces de inducir respuestas inmunes fuertes sin el riesgo de reacciones autoinmunes contra los tejidos normales. Por otro lado, estos TAA en la mayoría de los casos sólo son pertinentes para el tumor exacto en el que se identificaron, y no suelen ser compartidos por muchos tumores individuales. 5. TAA que surgen de modificaciones anormales postraduccionales:: estos TAA pueden surgir a partir de proteínas que no son ni específicas ni están sobreexpresadas en los tumores pero que, sin embargo, se asocian a tumores mediante procesos postraduccionales activos, principalmente, en los tumores. Algunos ejemplos pueden surgir de pautas alteradas de glicosilación que llevan a nuevos epítopos en tumores como para MUC1 o sucesos como el empalme de proteínas durante la degradación que puede o no ser específico de tumor (Hanada et al., 2004; Vigneron et al., 2004). 6. Proteínas oncovíricas: estos TAA son proteínas víricas que es posible que desempeñen una función crítica en el proceso oncogénico y, debido a que son foráneas (no de origen humano), pueden suscitar una respuesta de linfocitos T. Algunos ejemplos son las proteínas del virus del papiloma humano de tipo 16, E6 y E7, que se expresan en el carcinoma cervical.
Para que las proteínas puedan ser reconocidas por linfocitos T citotóxicos como antígenos específicos de tumores o asociados a ellos, y para que se puedan utilizar en terapia, deben cumplirse una serie de requisitos. El antígeno debe estar expresado principalmente por células tumorales, y no por tejidos sanos normales o en cantidades comparablemente pequeñas. También es deseable, no sólo que el antígeno correspondiente esté presente en un tipo de tumor, sino que, además, aparezca en concentraciones altas (es decir, en número de copias por célula del péptido respectivo). Los antígenos específicos de tumor y asociados a ellos suelen derivar de proteínas implicadas de forma directa en la transformación de una célula normal en célula de tumor debido a una función, por ejemplo, en el control del ciclo celular o la supresión de la apóptosis. Adicionalmente, también las dianas en dirección descendente de las proteínas directamente responsables de una transformación podrían ser reguladas ascendentemente y quedar así asociadas a tumor de forma indirecta. Tales antígenos asociados a tumor indirectamente podrían ser también dianas en un enfoque dirigido a la vacunación (Singh-Jasuja et al., 2004). En ampos casos es esencial que los epítopos estén presentes en la secuencia de aminoácidos del antígeno, ya que el péptido («péptido inmunógeno») que deriva de un antígeno asociado a un tumor debe inducir una respuesta de los linfocitos T in vitro o en vivo.
Básicamente, cualquier peptide capaz de unir una molécula MHC podría funcionar como epítopo de linfocito T. La presencia de un linfocito T con un TCR correspondiente y la ausencia de tolerancia inmunológica para este epítopo en particular es un prerrequisito para la inducción de una respuesta de linfocitos T in vitro o en vivo.
Por lo tanto, los antígenos asociados a tumores son un punto de partida en el desarrollo de una vacuna antitumoral. Los métodos para la identificación y caracterización de TAA están basados en el uso de CTL que puede aislarse a partir de pacientes o sujetos sanos, o están basados en la generación de perfiles de transcripción diferencial o en pautas diferenciales de expresión peptídica entre tumores y tejidos normales (Lemmel et al., 2004; Weinschenk et al., 2002).
Sin embargo, la identificación de genes sobreexpresados en tejidos de tumor o en líneas celulares humanas de tumor, o expresados de forma selectiva en dichos tejidos o líneas celulares, no proporciona información precisa sobre cómo usar en una inmunoterapia los antígenos transcritos desde estos genes. Esto se debe a que tan sólo una subpoblación individual de epítopos de estos antígenos es adecuada para dicha aplicación, ya que es necesario que esté presente el linfocito T con el TCR correspondiente y que no exista tolerancia inmunológica para este epítopo particular, o, si existe, debe ser mínima. Por lo tanto, es importante seleccionar tan sólo aquellos péptidos de proteínas sobreexpresadas, o expresadas selectivamente, que se presenten en conexión con moléculas MHC contra las que haya un linfocito T funcional. Dicho linfocito T funcional se define como un linfocito T que, al ser estimulado con un antígeno específico, puede expandirse clonalmente y es capaz de ejecutar funciones efectoras («linfocito T efector»).
En la inmunización contra los tumores, los linfocitos T colaboradores desempeñan una función importante en la organización de la función efectora de los CTL. Los epítopos de linfocitos T colaboradores que desencadenan una respuesta de los linfocitos T colaboradores del tipo TH1 apoyan las funciones efectoras de los linfocitos T citotóxicos CD8 + , que incluyen funciones citotóxicas dirigidas contra células tumorales que presentan MHC/péptidos asociados a tumores en sus superficies. De esta forma, los epítopos peptídicos de linfocitos T colaboradores asociados a tumores, solos o en combinación con otros péptidos asociados a tumores, pueden actuar como ingredientes activos de vacunas que estimulen las respuestas inmunológicas contra los tumores.
Teniendo en cuenta que ambos tipos de respuesta, la dependiente de CD8 y la dependiente de CD4, contribuyen conjuntamente y de forma sinérgiea al efecto antitumoral, la identificación y caracterización de antígenos asociados a un tumor reconocidos por CTL CD8+ (ligando: molécula MHC de clase I + epítopo peptídico) o por células T colaboradoras CD4 + (ligando: molécula MHC de clase II + epítopo peptídico) son importantes en el desarrollo de vacunas antitumorales.
Teniendo en cuenta los importantes efectos secundarios y los gastos asociados con el tratamiento del cáncer, se antoja fundamental contar con mejores métodos de pronóstico y diagnóstico. Por ende, existe la necesidad de identificar otros factores que representen los biomarcadores para el cáncer el general y el glioblastoma en particular. Además, existe la necesidad de identificar factores que puedan utilizarse en el tratamiento del cáncer en general y del glioblastoma en particular.
De hecho, no existe un diseño terapéutico establecido para pacientes con cáncer de próstata con recaída bioquímica tras una prostatectomía radical, generalmente causada por un tumor residual que queda in situ en presencia de un crecimiento localmente avanzado del tumor. Sería deseable contar con nuevos enfoques terapéuticos que confirieran una menor morbidez con una eficacia terapéutica comparable en relación con los enfoques terapéuticos actualmente disponibles.
La presente invención proporciona péptidos que son útiles para el tratamiento del glioblastoma, el cáncer de próstata y otros tumores que sobreexpresan survivin y/o CSP y/o otros péptidos de la invención. Mediante espectrometría de masas se mostró de forma parcialmente directa que estos péptidos son presentados naturalmente por moléculas HLA en muestras de glioblastoma humano primario (véase el ejemplo 1 y la figura 1), o en el caso de la SEQ ID n.° 26 se predijo según el algoritmo de predicción SYFPEITHI (Rammensee et al., 1995) su función como aglutinantes promiscuos a los alelos de HLA-DR HLA-DRB1*01, DRB1*03, DRB1*04, DRB1*11, y DRBV15. Según estos datos y las frecuencias de estos alelos DRB1 frecuentes, puede suponerse que el 92% de los caucásicos A*02 positivo expresan al menos un alelo DRB1 que enlaza al péptido según la SEQ ID n.° 26.
Se mostró que el gen de origen del que derivan las SEQ ID n.° 26 a 30 (survivin) se encuentra altamente sobreexpresado en glioblastomas, tumores de próstata, cáncer de mama, cáncer esofágico, cáncer colorrectal, carcinoma de células renales de células claras, cáncer de pulmón, cáncer pancreático, del SNC, ovárico, melanoma (Tamm et al. 1998), carcinoma de células escamosas, leucemia y meduloblastoma en comparación con tejidos normales (véase el ejemplo 2 y la figura 2), lo que demuestra un grado alto de asociación tumoral del péptido, es decir, que estos péptidos se presentan intensamente en tejidos tumorales pero no en tejidos normales. El documento WO 2004/067023 describe péptidos restringidos a MHC de clase I derivados del antígeno asociado a tumores survivin, que los péptidos son capaces de unir a moléculas HLA de clase I con una afinidad alta.
Los péptidos unidos a HLA pueden ser reconocidos por el sistema inmune, específicamente por linfocitos T. Los linfocitos T pueden destruir las células que presentan el complejo HLA/péptido reconocido, por ejemplo, células tumorales de glioblastoma que presentan péptidos derivados. Las células T colaboradoras activadas por los péptidos derivados de la survivina pueden inhibir la vascularización de los tumores, atraer células efectoras del sistema inmune y facilitar la sensibilización y la proliferación de CTL, así como una respuesta sostenida de linfocitos T CD8+.
Se ha demostrado que todos los péptidos de la presente invención son capaces de estimular respuestas de linfocitos T (véase el ejemplo 3 y la figura 3). De esta forma, los péptidos son útiles para la generación de una respuesta inmune en un paciente, mediante la que se pueden destruir las células tumorales. Una respuesta inmune en un paciente se puede inducir mediante la administración directa al paciente de los péptidos descritos o sustancias precursoras adecuadas (por ejemplo, péptidos alargados, proteínas o ácidos nucleicos que codifiquen estos péptidos), idealmente en combinación con un agente que potencie la inmunogenicidad (es decir, un adyuvante). Se puede esperar que la respuesta inmune que se origina de una vacunación terapéutica de estas características sea altamente específica contra las células tumorales, porque los péptidos diana de la presente invención no están presentados en tejidos normales en números de copia suficientes, lo que previene el riesgo de reacciones autoinmunes no deseadas contra células normales del paciente.
Las composiciones farmacéuticas constan de los péptidos, ya sea en forma libre o en forma de sal aceptable desde el punto de vista farmacéutico.
Tal y como se utiliza aquí, una «sal aceptable desde el punto de vista farmacéutico» hace referencia a un derivado de los péptidos liberados en el que el péptido se modifica elaborando sales ácidas o básicas del agente. Por ejemplo, las sales ácidas se preparan a partir de la base libre (normalmente, en los casos en los que la forma neutra del medicamento presenta un grupo -NH2 neutro), lo que implica la reacción con un ácido adecuado. Los ácidos adecuados para preparar sales ácidas incluyen tanto los ácidos orgánicos, como ácido acético, propiónico, glicólico, pirúvico, oxálico, málico, malónico, succínico, maléico, fumárico, tartárico, cítrico, benzoico, cinnámico, mandélico, metanosulfónico, etanosulfónico, p-toluenosulfónico, salicílico y similares, como también los inorgánicos, como por ejemplo hidroclórico, hidrobrómico, sulfúrico, nítrico, fosfórico y similares. En cambio, la preparación de sales básicas de regiones ácidas que pueden estar presentes en un péptido se preparan utilizando una base aceptable desde el punto de vista farmacéutico, como por ejemplo hidróxido de sodio, hidróxido de potasio, hidróxido de amonio, hidróxido de calcio, trimetilamina o similares.
En una modalidad especialmente preferida, las composiciones farmacéuticas constan de los péptidos como sales de ácido acético (acetatos) o ácido hidroclórico (cloruros).
Además de su utilidad para el tratamiento del cáncer, los péptidos de la presente invención también son útiles con fines diagnósticos. Debido a que los péptidos se generaron a partir de glioblastoma y a que se determinó que no estaban presentes en tejidos normales, estos péptidos pueden usarse para diagnosticar la presencia de un cáncer.
La presencia en biopsias de tejidos de los péptidos reivindicados puede ayudar al patólogo a diagnosticar el tipo de cáncer. El patólogo puede saber si el tejido es maligno o está inflamado o afectado en general por medio de la detección de determinados péptidos con anticuerpos, espectrometría de masas u otros métodos conocidos por los expertos en la materia. La presencia de grupos de péptidos puede permitir la clasificación o subclasificación de tejidos enfermos.
La detección de péptidos en muestras de tejido afectado permite decidir acerca del beneficio de terapias que impliquen al sistema inmune, especialmente si se sabe o se espera que los linfocitos T estén implicados en el mecanismo de acción. La pérdida de expresión de MHC es un mecanismo bien conocido mediante el cual las células malignas o infectadas escapan a la vigilancia inmune. De esta forma, la presencia de TUMAP demuestra que este mecanismo no es aprovechado por las células analizadas.
Pueden utilizarse los péptidos para analizar las respuestas de linfocitos contra los péptidos tales como las respuestas de linfocitos T o respuestas de anticuerpos contra los péptidos o los que forman un complejo con las moléculas MHC. Estas respuestas de los linfocitos pueden usarse como marcadores de pronóstico para decidir las siguientes etapas de la terapia. Estas respuestas también pueden usarse como marcadores secundarios en enfoques inmunoterapéuticos dirigidos a inducir respuestas de linfocitos por medios distintos, como, por ejemplo, mediante vacunación de proteínas, ácidos nucleicos, material autólogo o traslado adoptivo de linfocitos. En la terapia génica, las respuestas de los linfocitos contra los péptidos pueden considerarse en la evaluación de los efectos secundarios. La monitorización de las respuestas de los linfocitos también puede ser una herramienta útil en los estudios de seguimiento de terapias de transplante, como, por ejemplo, para detectar enfermedades del injerto contra el huésped y del huésped contra el injerto.
Los péptidos pueden usarse para generar y desarrollar anticuerpos específicos contra complejos MHC/péptido. Éstos pueden utilizarse en terapia, direccionalizándose toxinas o sustancias radioactivas al tejido afectado. Otra forma de utilización de estos anticuerpos puede consistir en la direccionalización de radionuclidos al tejido afectado destinada a la formación de imágenes, como la tomografía PET. Esto puede ayudar a detectar pequeñas metástasis o a determinar el tamaño y la localización precisa de los tejidos afectados.
Además, pueden utilizarse para verificar el diagnóstico de cáncer del patólogo, basado en una muestra de biopsia.
La tabla 1 muestra los péptidos conforme a la presente invención, su número de secuencia (SEQ ID) correspondiente, los alelos HLA a los que se unen los péptidos correspondientes y las proteínas fuente de las que pueden surgir estos péptidos. Es especialmente interesante el hecho de que el péptido relativo a la SEQ ID n°: 1 se une al HLA-DR al igual que al HLA-A*02, provocando así dos respuestas diferentes.
Tabla 1: péptidos de la presente invención 13 GRI-001 NILEQIVSV HLA-A*02 GRIA4 14 IGF2BP3-001 IQE1LTQV HLA-A*02 IGF2BP3 15 MLC-001 SVVEVIAGI HLA-A*02 MLC1 16 NES-001 GLQSQIAQV HLA-A*02 NES 17 NES-002 SLQENLESL HLA-A*02 NES 18 NES-003 FLFPGTENQEL HLA-A*02 NES 19 NES-004 NLAEELEGV HLA-A*02 NES 20 NR2EI-001 IISEIQAL HLA-A*02 NR2E1 21 NRCAM-001 GLWHHQTEV HLA-A*02 NRCAM 22 PDP1M-001 TLVGIIVGV HLA-A*02 PDPN 23 TNC-001 AMTQLLAGV HLA-A*02 TNC 24 TNC-002 QLLAGVFLA HLA-A*02 T C 25 CSP-001 TMLARLASA HLA-A*02 CSPG4 26 BIR-002 TLGEFLKLDRERAKN HLA-DR y BIRC5/Survivin HLA-A*02 27 BIR-002a TLGEFLKLDRERAKD HLA-DR BIRC5/Survivin 28 BIR-002b FTELTLGEF HLA-A1 BIRC5/Survivin 29 BIR-002c LMLGEFL L HLA-A2 BIRC5/Survivin 30 BIR-002d EPDLAQCFY HLA-B35 BIRC5/Survivin Proteoglicano 4 de sulfato de condroitina (CSPG4) El CSPG4 (proteoglicano de sulfato de condroitina) representa un proteoglicano de sulfato de condroitina de membrana integral en pericitos nacientes con un papel funcional en la neovascularización (Ozerdem, 2006). Durante la embriogénesis, el proteoglicano CSPG4 se expresa en vasos capilares inmaduros, pero a medida que éstos maduran, van perdiendo esta expresión. Se conoce como marcador temprano de la evolución de melanomas de la superficie celular que estimula la proliferación, migración e invasión de las células tumorales. El CSPG4 aparece muy expresado en más del 90% de las lesiones humanas por melanomas. Aunque el CSPG4 no es estrictamente específico de tumores, las respuestas de los linfocitos T CD4+ reactivos a tumores en pacientes con melanoma e individuos sanos reconocen al CSPG4693-709 en las células de melanoma que expresan HLA-DR11, en ausencia de autoinmunidad (Erfurt et al., 2007).
La expresión de CSPG4 potencia la dispersión de las células mediadas por integrinas, la fosforilación de la quinasa de adhesión focal (FAK) y la activación de la quinasa extracelular regulada por señales (ERK1/2) (Yang et al., 2004). Además, según los datos recogidos in vitro, cada vez hay más indicios de que el CSPG4 desempeña una función importante en la angiogénesis de los tumores. Así, se ha descubierto que los tumores con resultados positivos de CSPG4 presentan tasas de neovascularización y volúmenes vasculares significativamente mayores, y que el CSPG4 aisla a la angiostatina, la cual suele inhibir la proliferación de las células endoteliales y la angiogénesis. Los vasos inmaduros también contienen pericitos con CSPG4, lo que sugiere que esta población de células modula la proliferación de las células endoteliales mediante el bloqueo de los efectos inhibidores de la angiostatina durante el desarrollo de los vasos (Chekenya et al., 2002b).
Además de los pericitos activados, algunos tejidos normales también han registrado expresión de CSPG4, como las células endoteliales, los condrocitos, las fibras musculares lisas, ciertos queratinocitos básales de la epidermis y algunas células del folículo piloso (Campoli et al., 2004).
Durante la angiogénesis y como respuesta a patologías del SNC, las células CSPG4 de alta motilidad experimentan rápidos cambios morfológicos y son reclutadas a sitios donde se está produciendo crecimiento y reparación de vasos. El CSPG4 es sobreexpresado por perícitos y células tumorales en los vasos sanguíneos de los tumores cerebrales malignos (Chekenya and Pilkington, 2002). Al implantar células de una línea celular humana de glioma CSPG4-positiva en cerebros de ratas desnudas inmunodeficientes, se mostró que estos tumores tenían una mayor densidad microvascular en comparación con los controles, lo que sugiere que la expresión de CSPG4 regula tanto la función como la estructura de la vasculatura del tumor derivada del huésped (Brekke et al., 2006). En un experimento con heteroinjertos en el que se implantaron esferoides de biopsia de GBM en ratas desnudas, se identificó que el CSPG4 estaba asociado principalmente con los vasos sanguíneos en los componentes de la membrana basal y el pericito de la vasculatura del tumor y la expresión también se asoció a áreas de alta proliferación celular (Chekenya et al., 2002a). Además, la expresión de CSPG4 fue paralela a la evolución del tumor en un modelo de implantación de glioma (Wiranowska et al., 2006).
La evolución maligna se mantiene mediante interferencias entre el tumor y su estroma, donde el estroma activado nutre a las células neoplásicas invasivas y proliferativas, proporcionando neovasculatura, componentes de la matriz extracelular y factores de crecimiento de estimulación. En este contexto, el CSPG4 desempeña una función principal en la activación del estroma del tumor mediante alteraciones en la proliferación, migración y adhesión celulares, y la morfogénesis vascular (Chekenya and Immervoll, 2007).
El CSPG4 se expresa dif erencialmente en gliomas humanos con mayor expresión en gliomas de grado alto en comparación con los de grado bajo (Chekenya et al., 1999). La expresión elevada de CSPG4 guarda correlación con la resistencia a más de un fármaco mediada por la activación aumentada de la transducción ??3?/a3ß1 integrina y sus blancos en dirección 3", fomentando la supervivencia celular (Chekenya et al., 2008).
Se encontró CSP-001 en los siguientes órganos/tejidos y cánceres: Cerebro: - glioblastoma; - glioblastoma secundario (derivado del astrocitoma) Colon: - adenocarcinoma (excluido el tipo mucoso), primario; Recto: - adenocarcinoma, metástasis Estómago: - adenocarcinoma (excluido el tipo de célula anillo de sello), primario; Riñon: - carcinoma de células renales, línea celular; -carcinoma de células renales, tipo de células claras, metástasis, todos los sitios secundarios; - carcinoma de células renales, tipo de células claras, primario; - carcinoma de células renales, primario Pulmón: - adenocarcinoma, primario; - carcinoma adenoescamoso, primario; - cáncer primario; - carcinoma microcítico, primario; - carcinoma de células escamosas, primario; Páncreas: - adenocarcinoma, primario; - tumor de células insulares, maligno, metástasis Próstata: - adenocarcinoma, primario Piel: - melanoma maligno metastásico, metástasis del ganglio linfático Por lo tanto, una composición farmacéutica que contiene un péptido según la SEQ ID n.° 1 se prefiere particularmente para el tratamiento de Cerebro: - glioblastoma; - glioblastoma secundario (derivado del astrocitoma) Colon: - adenocarcinoma (excluido el tipo mucoso), primario; Recto: - adenocarcinoma, metástasis Estómago: - adenocarcinoma (excluido el tipo de célula anillo de sello), primario; Riñon: - carcinoma de células renales, línea celular; carcinoma de células renales, tipo de células claras, metástasis, todos los sitios secundarios; carcinoma de células renales, tipo de células claras, primario; carcinoma de células renales, primario Pulmón: - adenocarcinoma, primario; fase I - carcinoma adenoescamoso, primario; - cáncer primario; - carcinoma microcítico, primario; - carcinoma de células escamosas, primario; Páncreas: - adenocarcinoma, primario; - tumor de células insulares, maligno, metástasis Próstata: - adenocarcinoma, primario Piel: - melanoma maligno metastásico, metástasis del ganglio linfático Acyl-CoA sintetasa miembro 1 de la familia bubblegum (ACSBG1) La proteína que codifica este gen posee actividad sintetasa acyl-CoA de cadena larga. Se cree que desempeña una función central en el cerebro en la activación de la mielinogénesis y el metabolismo de ácidos grasos de cadena muy larga. La activación de los ácidos grasos mediante tioesterificación a Acetyl-CoA es un requisito en la mayoría de las reacciones que implican esta clase de moléculas. En la bibliografía sobre la materia no se han descrito aún funciones específicas de cáncer o sobreexpresión. La pauta de expresión de ACSBG1 en el cerebro, la glándula adrenal, el testículo, y el ovario y su función sugiere un papel de esta proteína en la patología bioquímica de adrenoleucodístrofia ligada al cromosoma X (XALD). La XALD es un trastorno neurodegenerativo grave, a menudo mortal, que se caracteriza por unos niveles de plasma y tejido elevados de ácidos grasos saturados de cadena muy larga (Asheuer et al., 2005; Pei et al., 2003).
Brevican (BCAN) Brevican es una proteína de la matriz extracelular que se expresa fuertemente desde el nacimiento hasta los 8 años de edad y a, los 20 años, aparece regulada descendentemente a niveles bajos que se mantienen en el cortex normal adulto. Una isoforma de GPI se expresa a niveles uniformemente bajos a lo largo del desarrollo (Gary et al., 2000). Los gliomas malignos invaden de forma agresiva al cerebro normal circundante, lo que podría estar mediado por proteínas extracelulares específicas de tumores o de tejidos. De esta forma, la matriz extracelular puede modular, en parte, la permisividad de un tejido al movimiento celular. En consecuencia, es posible que la habilidad de los gliomas para modificar la ECM del SNC medie la invasividad de estas células. Una molécula ECM que muestra una regulación ascendente considerable en los gliomas es BCAN, un proteoglicano de sulfato de condroitina específico del cerebro. La expresión de BCAN también se encuentra regulada ascendentemente durante los periodos de motilidad aumentada de las células gliales en el desarrollo y después de una lesión cerebral. En el glioma se puede detectar un aumento en la expresión unas dos veces superior a los niveles normales (Gary et al., 2000; Gary et al., 1998). Además de la regulación ascendente de BCAN en el glioma, es posible que el procesamiento proteolítico de la proteína de longitud completa también contribuya a la invasión (Gary et al., 1998; Nutt et al., 2001). Se pudo mostrar que el procesamiento proteolítico de BCAN por parte de metaloproteasas de la familia de ADAMTS es un paso necesario para la mediación de su efecto pro-invasivo en el glioma. El mutante, forma «no escindible» de BCAN, es incapaz de potenciar la invasión celular del glioma in vitro y la evolución tumoral in vivo (Viapiano et al., 2008). El ARNm para BCAN no es detectable en el córtex normal de adultos ni en tumores que no sean gliomas, por lo que se considera que BCAN es un marcador único y selectivo en el glioma (Jaworski et al., 1996). Además, el análisis de proteínas no sólo describió una expresión aumentada del BCAN completo sino también la presencia de isoformas adicionales y únicas en el glioma. De esta forma, B/b^ es un producto de longitud completa del ARNm de BCAN que surge a partir de una glicosilación reducida o incompleta de la proteína central. En el cerebro adulto normal, B/bAg es inexistente pero sí se encuentra en muestras de glioma de alto grado (Viapiano et al., 2005).
Se ha descrito a BCAN como sobreexpresada de forma selectiva en un tipo de célula tumoral de tipo citoblasto derivada del glioblastoma (Gunther et al., 2008). Este subtipo de células de tipo citoblasto mostró pluripotencia y oncogenia máximas in vivo.
Quitinasa 1 de tipo 3 (glicoproteína-39 del cartílago) (CHI3L1) La CHI3L1, miembro de las «proteínas de tipo quitinasa de los mamíferos», es expresada y secretada por varios tipos de tumores sólidos. Es producida por células de cáncer y macrófagos asociados a tumores, exhibe actividad de factor de crecimiento para células implicadas en procesos de remodelación de tejidos y es posible que tenga alguna función en la proliferación, diferenciación, supervivencia, invasividad y metástasis de las células de cáncer, en la angiogénesis y en la inflamación y remodelación de la matriz extracelular que rodea al tumor (Johansen et al., 2006; Johansen et al., 2007; Ringsholt et al., 2007). Además, la CHI3L1 es un autoantígeno candidato en la artritis reumatoide. Las líneas celulares de linfocitos T CD4 de donantes sanos dirigidas contra CHI3L1 expresaron CD25, receptores del factor de necrosis de tumor inducida por glucocorticoides, y moléculas Foxp3 y fueron capaces de inhibir respuestas de linfocitos T específicas de antígenos. Las respuestas en el 50% de los pacientes con artritis reumatoide exhiben polarización hacia un fenotipo de linfocito T colaborador 1 proinflamatorio y su capacidad para inhibir respuestas de memoria específicas de antígenos es significativamente menor (van Bilsen et al., 2004).
La CHI3L1 está regulada ascendentemente por la oncostatina M, que se sabe que es inducida en el sistema nervioso como resultado del estrés celular, se expresa en la mayoría de tumores cerebrales humanos y activa el sistema de transducción de señales JAK/STAT (Krona et al., 2007). La expresión de CHI3L1 también se asoció con la expresión de p-MAPK, p-mTOR y p-p70S6K en el glioblastoma (Pelloski et al., 2006).
En varios estudios sobre la expresión génica se mostró que la expresión de CHI3L1 era más alta en el glioblastoma en comparación con el cerebro normal, con una elevación entre 3 y 62 superior al cerebro normal (Saidi et al., 2007; Kroes et al., 2007; Shostak et al., 2003; Tanwar et al., 2002). Estudios inmunohistoquímicos desvelaron que todas las células con un núcleo funcional son capaces de expresar CHI3L1 en su citoplasma, pero la intensidad de la expresión de CHI3L1 dependía de la actividad celular. Así, las células conocidas por ejercer una actividad metabólica alta tendían a mostrar la tinción citoplasmática más intensa (Ringsholt et al., 2007). Además se pudo mostrar mediante inmunohistoquímica que los glioblastomas muestran de forma sorprendente mayor expresión de CHI3L1 que los oligodendrogliomas anaplásicos (Nutt et al., 2005) . Los análisis de membrana de Western de muestras de glioma de los niveles de proteína CHI3L1 revelaron un aumento sustancial en el 65% de GBM y niveles imperceptibles en gliomas de grado más bajo (grados II y III) o en tejido cerebral normal (Tanwar et al., 2002). En comparación con el astrocitoma pilocítico, que no se disemina y puede curarse con cirugía, sólo el glioblastoma expresa CHI3L1 (Colín et al., 2006) .
Los niveles de suero de CHI3L1 son elevados en una variedad de malignidades y se han asociado con una supervivencia menos favorable. Los niveles de suero de CHI3L1 más altos se encontraron en pacientes con cáncer metastásico con el intervalo libre de recurrencia más corto y la supervivencia total más corta. Específicamente en el suero de pacientes de glioblastoma, la expresión de CHI3L1 se encontraba elevada (Kim et al., 2007; Johansen et al., 2007; Johansen et al., 2006; Junker et al., 2005; Tanwar et al., 2002). Los pacientes de GBM con tumor activo tienen un nivel significativamente más alto de CHI3L1 que los pacientes sin indicios radiográficos de enfermedad. Además, existe una asociación inversa significativa entre CHI3L1 y supervivencia en los GBM (Hormigo et al., 2006; Pelloski et al., 2005).
Además, se puede observar expresión de CHI3L1 elevada en el cáncer de mama, en el que guarda correlación con un mayor tamaño del tumor, una menor diferenciación tumoral y una menor supervivencia sin enfermedad (Kim et al., 2007; Coskun et al., 2007). Por otra parte, en el carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello se detectaron niveles de suero de CHI3L1 elevados en el 53%. La supervivencia de los pacientes con suero de CHI3L1 elevado es más corta que la de los pacientes con suero de CHI3L1 normal (33 frente a 84 meses) (Roslind et al., 2008).
Los pacientes con cáncer de próstata mostraron niveles de suero de CHI3L1 significativamente mayores en comparación con pacientes con BPH o personas sanas (Kucur et al., 2008). Dominio CAP-GLY que contiene la proteína conectora 2 (CLIP2) La proteína codificada por CLIP2 pertenece a la familia de proteínas conectoras citoplasmáticas, de las que se ha sugerido que median en la interacción entre orgánulos membranosos específicos y microtúbulos. Se descubrió que CLIP2 se asocia tanto con los microtúbulos como con un orgánulo denominado «cuerpo lamelar dendrítico» (información general de la página web del NCBI).
El CLIP2 se localiza en los extremos de los microtúbulos tirosinados, pero no en los extremos de los microtúbulos destirosinados. La tubulina-tirosina ligasa (TTL), la enzima que cataliza la adición de un residuo de tirosina de extremo C a la alfa-tubulina en el ciclo de tirosinación de la tubulina, participa en la evolución del tumor y tiene una función vital en la organización neuronal (Peris et al., 2006). Un estudio sobre el ADN genómico de secciones congeladas de 30 casos de glioblastomas primarios con GenoSensor Array 300 describió amplificaciones génicas, deleciones génicas, e información cromosómica en todo el genoma. Los genes amplificados habitualmente incluían =CLIP2 (63,3%), EGFR (53,3%), IL6 (53,3%), ABCB1 (MDR1) (36,7%), y PDGFRA (26,7%) (Suzuki et al., 2004).
Familia de transportadores aniones orgánicos de vehículos solutos, miembro 1C1 (SLC01C1) El SLC01C1 se expresa de forma selectiva en la barrera hematoencefálica (Chu et al., 2008). El SLC01C1 presenta una preferencia selectiva de sustrato y es posible que desempeñe una función importante en la disposición de las hormonas tiroideas en el cerebro y los testículos (Pizzagalli et al., 2002). El SLC01C1 no se detectó específicamente mediante inmunofluorescencia. El SLC01A2 y el SLC02B1 se detectaron mediante microscopía inmunofluorescente en la membrana luminal de células endoteliates que forman la barrera hematoencefálica y la barrera hematotumoral, pero no en las células de glioma (Bronger et al., 2005).
Distrobrevi na, alfa (DTNA) La distrobrevina alfa se ha descrito principalmente como componente citoplasmático del complejo distrofina-glicoproteína en células del músculo esquelético. Las isoformas de DTNA muestran distintas ubicaciones en células y tejidos; en las membranas basolaterales de células epiteliales, las distrobrevinas median en el contacto con las proteínas transmembranosas, de la periferia y la matriz extracelular y el citoesqueleto de actina filamentosa. Además de su función estructural, se supone que las DTNA son importantes en la transducción celular de señales y en la diferenciación celular y se asocian con las uniones herméticas durante su reorganización (Sjo et al., 2005). Es posible que las DTNA participen en la formación y estabilidad de las sinapsis y en la agrupación de receptores colinérgicos de nicotina.
Receptor del factor de crecimiento epidérmico (homólogo del oncogén viral de la leucemia de eritroblastosis [v-erb-b], aviar) (EGFR) Un área de reciente interés es el receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR), ya que sus anormalidades son una de las aberraciones moleculares más comunes en el glioblastoma. Especialmente el EGFRvIll (variante III del receptor del factor de crecimiento epidérmico) es una forma muíante oncógena constitutivamente activa del EGFR que se expresa comúnmente en el glioblastoma (Zawrocki and Biernat, 2005). El EGFR participa en la activación de una serie de sistemas de transducción que regulan el fenotipo de las células progenitoras. La actividad tirosina-quinasa del EGFR activado potencia la migración, proliferación y supervivencia de los neurocitoblastos. Puesto que se sabe que la transducción de señales del EGFR desempeña una función en el glioblastoma, puede concluirse que el glioblastoma deriva de un citoblasto de cáncer y que las señales del EGFR suelen estar alteradas en estas células precursoras (Yuso-Sacido et al., 2006).
Los glioblastomas primarios surgen de novo en los pacientes de más edad y a menudo sobreexpresan el EGFR. La sobreexpresión del EGFR guarda correlación con un aumento de angiogénesis, edemas e invasiones (Aghi et al., 2005). Además, los glioblastomas con amplificación de EGFR son resistentes a la radiación (Barker et al., 2001) y reaparecen más rápidamente después del tratamiento (Schlegel et al., 1994).
El GBM es el único tumor humano no epitelial en el que la activación excesiva de EGFR se ha vinculado con el crecimiento tumoral y la supervivencia del paciente, y la activación del EGFR promueve la infiltración de GBM in vitro (Penar et al., 1997).
El EGFR es el protoncogén de erbB. La sobreexpresión del EGFR puede incrementar el crecimiento celular debido al aumento en la formación de complejos activos ligando:receptor. La amplificación génica es el mecanismo que subyace a la sobreexpresión de los receptores del EGF en los tumores de GBM (Thompson and Gilí, 1985). Se sabe que el gen del EGFR en el cromosoma 7 aumenta con frecuencia su número de copias en los gliomas de grado alto (Okada et al., 2007). La disminución de EGFR mediante ARN interferente corto suprime la oncogenia de células de glioblastoma (Huang et al., 2007).
La sobreexpresión de EGFR se detecta en el 40-70% de los GBM mientras que los astrocitomas pilocíticos, de grado bajo o anaplásicos son invariablemente EGFR negativos. (Agosti et al., 1992; Schwechheimer et al., 1995; Eppenberger and Mueller, 1994; Huncharek and Kupelnick, 2000; Liu et al., 2006a). Los niveles altos de suero de EGFR indican una supervivencia reducida (Quaranta et al., 2007). Además, se mostró que los pacientes que sobrevivieron durante un periodo prolongado con astrocitomas de grado alto son EGFRvIll negativos (Liang et al., 2008).
El Notch-1 regula ascendentemente la expresión del EGFR y se pueden encontrar correlaciones entre los niveles de EGFR y ARNm de Notch-1 en gliomas humanos primarios de grado alto (Purow et al., 2008). El propio EGFR participa en la activación constitutiva de la quinasa c-Jun de extremo NH2 (JNK), que participa en la proliferación, supervivencia y oncogenia en algunos tumores, incluidos los gliomas (Li et al., 2008a).
Aunque el EGFRvIll sólo es expresado por un pequeño porcentaje de células de glioma, la mayoría de las células presentan un fenotipo transformado. Se mostró que la expresión del EGFRvIll en células de gliomas indolentes estimula la formación de microvesículas vinculadas a balsas lipídicas que contienen EGFRvIll que se liberan al entorno celular y pueden unirse con las membranas de plasma de células de cáncer que carecen de EGFRvIll, lo que lleva a la transferencia de actividad oncógena (Al-Nedawi et al., 2008).
Proteína 7 de unión a ácidos grasos, cerebro (FABP7) Las proteínas de unión a ácidos grasos (FABP) son proteínas citosólicas de 14-15 kDa, de las que se cree que participan en la absorción, el transporte y el reconocimiento de ácidos grasos (FA). Es posible que modulen la concentración de FA y de esta forma influyan en la función de enzimas, membranas, receptores y canales iónicos, y expresiones génicas y crecimientos y diferenciaciones celulares. Se pueden distinguir nueve tipos de FABP con una distribución específica del tejido. A pesar de una identidad de secuencias aminoacídicas del 30-70%, poseen una estructura terciaria beta-c/am similar en la que el FA está unido. El tejido nervioso contiene cuatro tipos de FABP, con una distribución espacio-temporal bien diferenciada (Veerkamp and Zimmerman, 2001). La FABP7 se encuentra altamente expresada en la retina y el cerebro en desarrollo y su expresión se reduce de forma significativa en el SNC adulto (Godbout et al., 1998). Según ciertos resultados in vitro, se ha sugerido que la FABP7 es necesaria para el establecimiento del sistema glial radial del cerebro en desarrollo (Mita et al., 2007). En el cerebro normal la proteína FABP7 apenas se detecta, pero presenta una expresión citoplasmática y nuclear entre moderada y fuerte en varios GBM. Las células transfectadas con FABP7 manifiestan una migración 5 veces mayor que las células de control. De esta forma, la supervivencia general más breve que se asocia a la sobreexpresión de la FABP7, especialmente en el glioblastoma, podría deberse a una mayor migración de las células tumorales y su invasión del parénquima cerebral circundante (Liang et al., 2005). La traslocación nuclear de la FABP7 se vincula específicamente a la amplificación del EGFR y a tumores más invasores (Kaloshi et al., 2007). De esta forma, es posible que la FABP7 nuclear sea inducida por la activación del EGFR para promover la migración de células tumorales de GBM (Liang et al., 2006).
También se ha mostrado que la expresión de la FABP7 es un marcador para el carcinoma de células renales. La expresión de la FABP7 sólo puede detectarse en tejidos de carcinoma pero no en partes no cancerosas de muestras de riñon (Teratani et al., 2007). Se mostró que la expresión de la FABP7 en el carcinoma de células renales es 20 veces mayor en el tumor en comparación con el tejido de riñón normal (Domoto et al., 2007; Buchner et al., 2007). También se mostró que la FABP7 es expresada con frecuencia en el melanoma, donde es posible que participe en la proliferación e invasión celulares (Goto et al., 2006).
Proteína acídica fibrilar glial (GFAP) La GFAP codifica una de las principales proteínas intermedias de filamento de los astrocitos maduros. Se utiliza como marcador para distinguir los astrocitos de otras células gliales durante el desarrollo. Las mutaciones en este gen causan la enfermedad de Alexander, una enfermedad poco común de los astrocitos del sistema nervioso central. Se ha descrito una variante adicional de transcrito, pero su secuencia completa no se ha determinado. Se ha informado de un aumento de los niveles en cerebros autistas, mientras que los cerebros de personas con depresión grave presentaban GFAP reducidas.
Se analizaron cerebros de primates que desarrollaron tumores cíe novo diez años después de una radiación completa del cerebro. Los precursores tumorales mostraron mitosis y atipias celulares, y resultaron negativos para los marcadores asociados a tumores GFAP, EGFR y p53 (Lubensky et al., 2006).
En las neoplasias astrocíticas el número de células GFAP positivas y la intensidad de la tinción resultaron directamente proporcionales al grado de malignidad. Los 3 casos de oligodendroglioma mostraron una reacción negativa a la GFAP (Reyaz et al., 2005). Los ollgodendrogliomas puros son inmunohistológicamente negativos para GFAP (Mokhtari et al., 2005). Los niveles de suero de GFAP en pacientes con glioma de grado alto mostraron una correlación lineal con el volumen del tumor (Brommeland et al., 2007). Incluso entre pacientes de GB se puede detectar una correlación significativa entre el volumen del tumor, el volumen de necrosis de tumor, la cantidad de células GFAP positivas necróticas y el nivel de suero de GFAP (Jung et al., 2007).
Siguiendo el tratamiento de líneas celulares de glioblastoma con el inhibidor de histona deacetilasa 4-fenilbutirato, se registraron concentraciones aumentadas de GFAP no fosforilada, mientras que las isoformas fosforiladas permanecieron intactas (Asklund et al., 2004).
En una línea celular de glioblastoma tratada con TGF-alfa, la transcripción génica de GFAP, el nivel de ARNm, y la síntesis específica de proteínas descendió aproximadamente en un 50% (Zhou and Skalli, 2000).
Técnicamente, el promotor de GFAP se usa a menudo como herramienta en modelos de ratón para inducir la expresión de las proteínas deseadas en el sistema nervioso específicamente.
Los islotes pancreáticos de Langerhans están envueltos por células Schwann que rodean los islotes (pSC), que expresan GFAP. El reconocimiento autoinmune de elementos pancreáticos de tejido del sistema nervioso parece ser una parte temprana e integral de la diabetes natural de tipo 1 (Winer et al., 2003). Esta expresión pancreática no se refleja en los datos de expresión de immatics o externos de tejidos en masa. El GFAP-001 se ha publicado como un epítopo contra el que los pacientes de diabetes de tipo 1 y sus parientes no diabéticos con respuestas de anticuerpos contra autoantígenos de diabetes (aumento del riesgo de diabetes) mostraron una reactividad intensificada de CTL secretores de granzima B (ELISPOT ex vivo) en comparación con los donantes sanos (Standifer et al., 2006).
Es interesante el hecho de que parece que existe una correlación inversa entre la manifestación de enfermedades autoinmunes, especialmente la diabetes, y el riesgo de desarrollar glioma (Aronson and Aronson, 1965; Schlehofer et al., 1999; Brenner et al., 2002; Schwartzbaum et al., 2003; Schwartzbaum et al., 2005).
Receptor 56 acoplado a la proteína G (GPR56) El GPR56 es un receptor atípico acoplado a la proteína G (GPCR) con una región extracelular de extremo N excepcionalmente larga, que contiene una región larga rica en Ser/Thr que forma un tronco de tipo mucina, característica por la que se cree que el GPR56 desempeña una función en las interacciones célula-célula, o célula-matriz. Junto con el alto nivel de expresión de ARNm y su amplia distribución, se ha sugerido una posible función de este receptor en los procesos de interacción célula-célula (Liu et al., 1999). El GPR56 pertenece al GPCR de la familia de secretinas que participa en el desarrollo de células progenitoras neurales y se ha vinculado con malformaciones del desarrollo del cerebro humano. La mayor expresión de GPR56 guarda correlación con los fenotipos de transformaciones celulares de varios tejidos de cáncer en comparación con sus equivalentes normales, lo que implica una potencial función oncogénica. El silenciamiento del GPR56 mediado por interferencia de ARN resulta en la inducción de la apóptosis y en un reducido crecimiento independiente del anclaje de las células de cáncer mediante un aumento de la anoikis. El silenciamiento del GPR56 también reduce la adhesión celular a la matriz extracelular (Ke et al., 2007). Mediante genómica funcional, se ha demostrado la regulación ascendente del GPR56 en el glioblastoma multiforme. Estudios inmunohistoquímicos confirmaron la expresión del GPR56 en una mayoría de muestras de tumor de glioblastoma/astrocitoma con niveles imperceptibles de expresión en el cerebro adulto normal (Shashidhar et al., 2005). En las células pancreáticas de cáncer, el ARNm del GPR56 se expresa a niveles altos mientras que la proteína GPR56 es insignificante o imperceptible en estas células, lo que sugiere que la expresión de la proteína GPR56 se suprime en las células humanas de cáncer de páncreas (Huang et al., 2008). Estudios anteriores sobre la metástasis mostraron que el GPR56 se encuentra regulado descendentemente de forma marcada en variantes altamente metastásicas de una línea celular humana de melanoma, lo que implica que la sobreexpresión del GPR56 suprime el crecimiento tumoral y la metástasis. Se cree que esta supresión tumoral está mediada por la interacción del GPR56 con transglutaminasa de tejido (TG2), un componente extendido de tejido y estroma, que se ha implicado en la supresión de la evolución tumoral misma (Xu et al., 2006; Xu and Hynes, 2007). Se ha informado de otro impacto inhibidor del GPR56 en la migración de células progenitoras neurales (NPC). El GPR56 se encuentra altamente expresado en las NPC y es posible que participe en la regulación del movimiento de las mismas a través del sistema de transducción de señales Galpha(12/13) y Rho, lo que sugiere que el GPR56 desempeña una función importante en el desarrollo del sistema nervioso central (Iguchi et al., 2008).
Receptor de glutamato, ionotrófico, AMPA 4 (GRIA4) Los receptores de glutamato de tipo -amino-3-hidroxi-5-metil-4-isoxazolepropionato(AMPA)- (AMPAR) median en la neurotransmision rápida en sinapsis de excitación del SNC y están compuestos de subunidades tomadas de un juego de cuatro proteínas, GluR1 a GluR4 (GRIA4).
Las subunidades de GRIA4 se expresan de forma ubicua en células humanas de glioblastoma, actuando como A PAR permeables a Ca2+. La conversión a receptores impermeables a Ca2+ inhibe la locomoción celular e induce la apóptosis, mientras que la sobreexpresión de receptores de AMPA permeables a Ca2+ facilita la migración y proliferación de las células tumorales. Por ello, los receptores de AMPA permeables a Ca2+ parecen tener funciones cruciales en el crecimiento del glioblastoma (Ishiuchi et al., 2002).
Proteína 3 de unión al ARNm del factor de crecimiento insulinoide 2 (IGF2BP3) La IGF2BP3 forma parte de la familia de proteínas de unión del ARNm del factor de crecimiento insulinoide II, implicada en el control de la traducción, el metabolismo y la localización del ARNm. La proteína codificada contiene varios dominios de KH, importantes en la unión de ARN y que participan en el metabolismo y la síntesis del ARN. Se expresa principalmente durante el desarrollo embrionario y en algunos tumores. Por ello, la proteína IGF2BP3 se considera oncofetal (Liao et al., 2005). No se encontró información específica sobre la expresión de IGF2BP3 en el glioblastoma, pero se describe sobreexpresion de la IGF2BP3 en otros tumores malignos. Así, la IGF2BP3 se expresa en el 30% de 716 especímenes analizados de carcinoma de células renales claras. En este estudio, su expresión se asoció con fases y grados avanzados de tumores primarios además de otras características adversas, como la necrosis coagulativa de tumor y la diferenciación sarcomatoide. Además, la expresión positiva de IGF2BP3 se asoció con un riesgo entre 5 y 10 veces mayor de metástasis distantes y con un aumento del riesgo de muerte por RCC de entre el 42% y el 50%, lo que sugiere que la expresión de IGF2BP3 constituye un predictor independiente del comportamiento tumoral agresivo del carcinoma de células renales claras (Hoffmann et al., 2008; Jiang et al., 2006; Jiang et al., 2008). También se detectó expresión de IGF2BP3 en el melanoma maligno, a diferencia del nevo benigno, donde no se determinó expresión, ni siquiera con presencia de características displásicas (Pryor et al., 2008). En el cáncer de endometrio, la expresión de IGF2BP3 está asociada estrechamente con el cáncer de endometrio de tipo II y con un fenotipo histológico agresivo entre lesiones neoplásicas de endometrio (Zheng et al., 2008). En 20 pacientes de carcinoma de esófago de células escamosas, en el 40% de todos los casos se observó inducción de respuestas específicas de linfocitos T en TIL, linfocitos del nodulo linfático regional y linfocitos de sangre periférica contra un péptido de epítopo restringido a HLA-A2402 de IGF2BP3 (Mizukami et al., 2008). El IGF2BP3 también aparece con expresión alta en los carcinomas pancreáticos. En dos estudios, más del 90% de las muestras de tejido tumoral pancreático mostró expresión de IGF2BP3 tras la inmunotinción, mientras que los tejidos pancreáticos no neoplásicos dieron resultados negativos para IGF2BP3. Además, el ARNm de IGF2BP3 estaba sobreexpresado en los carcinomas pancreáticos en comparación con las muestras de tejido no neoplásico y la expresión aumentó progresivamente con la fase del tumor (Yantiss et al., 2005; Yantiss et al., 2008). La expresión de IGF2BP3 también se mostró significativamente aumentada en tumores uroteliales de grado alto, expresión que no suele aparecer en el urotelio benigno ni en tumores uroteliales de grado bajo Además, la tasa de supervivencia sin enfermedad y sin evolución en los pacientes con tumores IGF2BP3 positivo es mucho menor que en aquellos con tumores IGF2BP3 negativo. Los pacientes con IGF2BP3 positivo con carcinoma urotelial, invasivo y superficial al principio del diagnóstico también continuaron desarrollando metástasis, mientras que no se encontró metástasis en los pacientes con IGF2BP3 negativo. Además, los datos de estos estudios sugirieron que es posible que la IGF2BP3 participe en la evolución de tumores uroteliales desde el grado bajo al grado alto, tanto en las lesiones papilares como en las como en las planas (Li et al., 2008b; Sitnikova et al., 2008).
Leucoencef alopatía megaloencefálica con quistes subcorticales 1 (MLC1) La leucoencefalopatía megaloencefálica con quistes subcorticales ( LC) es una enfermedad autosómica recesiva de la sustancia blanca del cerebro que se da en niños. La MLC se debe a mutaciones en el gen MLC1 (lija Boor et al., 2006). Conforme al buen saber y entender de los inventores, en la bibliografía sobre la materia no existen informes sobre ningún tipo de asociación del MLC1 con tumores cerebrales.
En un trabajo se investigó la distribución celular y regional del MLC1 en él cerebro del ratón (Schmitt et al., 2003). La expresión máxima del MLC1 se detectó durante el periodo pre- y perinatal en células precursoras neurales multipotenciales. En el cerebro adulto de ratón, el ARNm del MLC1 sólo se detectó en las células gliales. En contraste con los astrocitos en desarrollo y maduros, los oligodendrocitos carecían de expresión de MLC1.
Nestina (NES) Durante el desarrollo, se produce expresión extensa de la nestina de filamento intermedia en las células neuroepiteliales en la capa ventricular, 11 semanas después de la concepción, en todas las partes del SNC, mientras que la inmunoreactividad de la nestina disminuye durante el segundo y el tercer trimestre (Takano and Becker, 1997; Lendahl et al., 1990; Zimmerman et al., 1994; Tohyama et al., 1992). Durante o después de la migración lejos de la capa ventricular de proliferación, la expresión de nestina se regula descendentemente de forma brusca en las neuronas postmitóticas (Arnold and Trojanowski, 1996). La tinción de nestinas de tejido no neoplásico de cerebro humano adulto sólo mostró una tinción débil de un número muy pequeño de células endoteliales (Dahlstrand et al., 1992). La nestina puede reexpresarse durante la transformación neoplásica (Veselska et al., 2006). En los tejidos de glioma, la inmunoreactividad de la nestina tiene lugar sólo en células tumorales y la cantidad de nestina producida aumenta a medida que el grado del glioma se vuelve más maligno hacia el glioblastoma. Los glioblastomas (grado IV de malignidad) expresan la incidencia máxima de células con valor positivo de nestina y, en general, los máximos niveles de tinción de nestina. La expresión de nestina se puede detectar en células tumorales de diversos tipos de tumores primarios del SNC, que son de origen neuroectodérmico, pero no en células de carcinoma en proceso de metástasis (Dahlstrand et al., 1992; Tohyama et al., 1992). La nestina prácticamente no se expresa en los astrocitomas difusos, se expresa de forma variable en los astrocitomas anaplásicos y se expresa con fuerza e irregularmente en los glioblastomas, donde su distribución varía de forma complementaria con GFAP y Vimentin (Schiffer et al., 2006). Clínicamente, los tumores de célula germinal del SNC con valor negativo de nestina no exhibieron diseminación, mientras que todos los tumores que exhibieron diseminación también expresaron fuertemente la proteína de nestina (Sakurada et al., 2007).
Las células de tumor que expresan fuertemente la nestina suelen estar ubicadas cerca de los vasos sanguíneos (Dahlstrand et al., 1992), (Kurihara et al., 2000; Sugawara et al., 2002; Florenes et al., 1994; Strojnik et al., 2007) y la expresión de la nestina por el endotelio activado se ha sugerido como marcador de la angiogénesis (Teranishi et al., 2007; Maderna et al., 2007; Amoh et al., 2005; Mokry et al., 2004).
El GBM comprende precursores transformados que portan el complemento completo de características funcionales que se esperan de los citoblastos, incluida la capacidad para la generación de tumores. Estas células pueden establecer GBM incluso con transplantes en serie y por tanto pueden identificarse como citoblastos neurales de tumor (Galli et al., 2004). Estas células pertenecen a la subpoblación de células CD133+ de tumores humanos de cerebro y coexpresan la nestina marcadora del SNC, pero no los marcadores de linajes neurales diferenciados (Singh et al., 2004b; Singh et al., 2003; Singh et al., 2004a; Mao et al., 2007). La presencia de una población CD133 + /nestina+ en los tumores cerebrales sugiere que es posible que un citoblasto neural normal sea la célula de origen de los gliomas (Shiras et al., 2007). Puesto que la transducción de señales Notch está activa en el tumor de cerebro y en los citoblastos, se ha mostrado que el promotor de nestina se activa en el cultivo mediante la actividad Notch (Shih and Holland, 2006).
La transfección de la línea celular C6 de astrocitoma de rata con el dúplex de siRNA de nestina desveló una influencia de supresión efectiva del siRNA de nestina en el crecimiento celular de células cultivadas de astrocitoma de una forma dependiente de dosis (Wei et al., 2008).
También se ha informado sobre la expresión de nestina para citoblastos de cáncer en el cáncer de próstata (Gu et al., 2007; Gipp et al., 2007) y el cáncer pancreático (Carriere et al., 2007), además del melanoma (Klein et al., 2007). Además, la nestina también se expresa en los siguientes tumores: GIST (Tsujimura et al., 2001; Sarlomo-Rikala et al., 2002), melanomas (Florenes et al., 1994; Brychtova et al., 2007), cáncer colorrectal (Teranishi et al., 2007) y tumores pancreáticos (Ohike et al., 2007; Kleeberger et al., 2007).
La expresión de nestina también se puede encontrar en diversos tejidos normales: Se ha informado de expresión de nestina en los podocitos de los glomérulos normales de riñón humano maduro. En condiciones normales, la nectina se expresa en varios tipos de células glomerulares en fases tempranas del desarrollo y se limita a los podocitos en los glomérulos maduros (Ishizaki et al., 2006), lo que indica que la nectina es crítica para algún aspecto de la función de los podocitos. Los glomérulos adultos manifiestan inmunoreactividad de nestina en células que expresan vimentina con la morfología de podocitos (Bertelli et al., 2007). Posiblemente la nestina sirve, mediante interacción con la vimentina, para reforzar la fuerza mecánica de los podocitos que experimentan gran tensión durante la filtración glomerular (Perry et al., 2007). Así, en el riñón humano, la nestina se expresa desde los primeros pasos de la glomerulogénesis en los podocitos, las células mesangiales, y las células endoteliales. Esta expresión se restringe entonces a los podocitos en los glomérulos maduros y no puede detectarse en otras estructuras del riñón humano adulto (Su et al., 2007). La inmunohistoquímica desveló una expresión de nestina constante en el córtex de glándulas adrenales humanas normales. Las células que expresan nestina se encuentran normalmente en la zona reticular, mientras que los carcinomas adrenales manifiestan un número variable de células inmunoreactivas a la nestina (Toti et al., 2005).
También se ha informado de expresión de nestina desde las células intersticiales de Cajal (ICC) en el tracto gastrointestinal normal. Por lo que la mayoría de ICC intramusculares en el antro y todas las ICC mientéricas del intestino delgado son inmunoreactivas a la nestina, además de algunas ICC mientéricas y la mayoría de ICC de la musculatura circular del colon ( Vanderwinden et al., 2002). En el páncreas se pueden encontrar células inmunoreactivas a la nestina en islotes y en la porción exocrina. En la zona de los grandes conductos pancreáticos, las células con valor positivo de nestina representan pequeños capilares dispersos por el tejido conectivo que rodea el epitelio del conducto. Así, la nestina se expresa mediante células endoteliales vasculares en el páncreas humano (Klein et al., 2003). En los propios islotes, se pueden encontrar células progenitoras de islotes que expresan nestina. Se plantea como hipótesis que estas células progenitoras derivadas de islotes y con valor positivo de nestina sean una población definida de células que residen dentro de islotes pancreáticos y posiblemente participen en la neogénesis de células endocrinas de islotes (Zulewski et al., 2001). En el hígado normal adulto se puede aislar una población de citoblastos de hígado humano con valor positivo de vimentina y nestina (Herrera et al., 2006). En los ensayos de cultivos celulares, los análisis de la composición de la matriz y el citoesqueleto mediante inmunotinción revelaron que las células adultas derivadas de la médula y las fetales derivadas del pulmón expresan proteínas de vimentina y nestina en filamentos intermedios (Sabatini et al., 2005). En la dentadura de adultos jóvenes se encuentra nestina en los odontoblastos funcionales. Su expresión está regulada descendentemente y la nestina está ausente de los dientes de adultos de más edad, mientras que vuelve a estar regulada ascendentemente en los dientes con caries y lesiones (About et al., 2000).
Los citoblastos adultos que expresan nestina también se pueden encontrar en la región perilumenal de la pituitaria anterior madura y, mediante cartografía genética de destino inducible, se demostró que sirven para generar subconjuntos de los seis tipos de células endocrinas terminalmente diferenciadas de la glándula pituitaria. Estos citoblastos, aunque no desempeñan una función importante en la génesis de órganos, sufren expansión postnatal y comienzan a producir progenie diferenciada, que coloniza el órgano que inicialmente constaba por completo de células diferenciadas derivadas de precursores embrionarios (Gleiberman et al., 2008).
Subfamilia 2 del receptor nuclear, grupo E, miembro 1 (NR2E1 ) El NR2E1 (TLX) es un factor de transcripción que es esencial para la regeneración y la proliferación de neurocitoblastos mediante el reclutamiento de deacetilasas (HDACs) de histona a sus genes diana en dirección 3' para reprimir su transcripción, que a cambio regula la proliferación de neurocitoblastos. El reclutamiento de HDAC conduce a la represión de la transcripción de genes diana TLX, el inhibidor de quinasa dependiente de ciclina, p21 (CIP1 / WAF1 )(p21 ), y el gen supresor de tumor, PTEN (Sun et al., 2007). La subfamilia de TLX/HOX11 de genes homeobox divergentes participa en diversos aspectos de la embriogénesis y, en el caso de TLX1/HOX11 y TLX3/HOX11 L2, figuran de forma prominente como oncogenes en la leucemia humana linfoblástica aguda de linfocitos T (Dixon et al., 2007). El NR2E1 subyace a un programa de desarrollo fundamental de organización retiniana y controla la generación de números adecuados de progenies retinianas y el desarrollo de células gliales durante el periodo prolongado de génesis de la retina (Miyawaki et al., 2004). No se encontró información específica de glioblastoma.
Molécula neuronal de adhesión celular (NRCAM) La NRCAM humana (molécula de adhesión celular vinculada a la neuroglía) está sobreexpresada en el tejido de glioblastoma multiforme (GMT) en comparación con el tejido cerebral normal (NBT). La NRCAM se describe como proteína de transmembrana de tipo I de paso único que interacciona con la anquirina. La molécula hNRCAM antisentido provocó reducción de la expresión de hNRCAM nativa, cambios en la morfología celular, una tasa reducida de proliferación celular y un alargamiento del ciclo celular. Además, la sobreexpresión de hNRCAM antisentido en estas células provocó reducción extensa del número de colonias de agar blando e invasión mediante gel de matriz extracelular (ECM) in vitro. La inyección subcutánea de células de glioblastoma que sobreexpresan hNRCAM antisentido en ratones desnudos provocó una inhibición completa de la formación tumoral en comparación con células sólo transfectadas con vector. La inoculación intratumoral de plásmido de expresión de hNRCAM antisentido también fue causante de un crecimiento lento del tumor en ratones desnudos in vivo (Sehgal et al., 1999). El análisis de RT-PCR específico de genes indicó que la hNRCAM está sobreexpresada en astrocitomas de grado alto, gliomas y tejidos de tumor de glioblastoma en comparación con el tejido cerebral normal (Sehgal et al., 1998). La NRCAM, una molécula de adhesión célula-célula de la familia de moléculas de adhesión celular de tipo ¡nmunoglobulina, conocida por su función en las orientaciones y los brotes neuronales, se identificó recientemente como gen diana de la transducción de señales de beta-catenina en tejidos y células de carcinomas de colon y melanomas humanos. La transducción mediada retrovíricamente de la NRCAM en los fibroblastos induce oncogenia y motilidad celular (Conacci-Sorrell et al., 2005). La inducción de la transcripción de la NRCAM mediante beta-catenina o placoglobina desempeña una función en la oncogenia de cáncer de colon y melanoma, probablemente mediante la estimulación de la motilidad y el crecimiento celular (Conacci-Sorrell et al., 2002). También otras dianas en la transducción de señales de beta-catenina se encuentran reguladas ascendentemente -como MYC (Liu et al., 2008). La NrCAM está sobreexpresada a nivel proteico y del ARNm en los carcinomas humanos de tiroides papilar, independientemente de la fase del tumor (Gorka et al., 2007).
La sobreexpresión en tumores del ARNm de la NRCAM se asocia con índices altos de proliferación y se asoció con un resultado desfavorable en los ependimomas (Zangen et al., 2007).
Podoplanina (PDPN) La PDPN es una glicoproteína de membrana integral de tipo I de tipo mucina con distribución diversa en los tejidos humanos. Participa en la migración, invasión, metástasis y evolución maligna de las células de cáncer y participa en la agregación plaquetaria. El CLEC-2 es el primer receptor patofisiológico identificado de la podoplanina (Kato et al., 2008). Se investigaron 115 glioblastomas utilizando inmunohistoquímica con un anticuerpo anti-PDPN. El 47% de los glioblastomas expresaron PDPN en las células de la superficie, especialmente alrededor de las células endoteliales de proliferación y las zonas necróticas. Además, la expresión de las proteínas y el ARN de PDPN en el glioblastoma eran marcadamente mayores que en los astrocitomas anaplásicos, lo que sugiere que la expresión de PDPN podría estar asociada con la malignidad de astrocítico (Mishima et al., 2006). En otros análisis, la PDPN también se mostró expresada en el 82,9% de los glioblastomas (29/35) (Shibahara et al., 2006). En un estudio de investigación de la expresión de PDPN y las actividades de agregación de plaquetas de líneas celulares de glioblastoma, LN319 expresó la PDPN en gran medida e indujo la agregación plaquetaria. El NZ-1, un anticuerpo anti-PDPN altamente reactivo, neutralizó la agregación plaquetaria mediante LN319, lo que sugiere que la PDPN es de las razones principales para la agregación plaquetaria inducida por (Kato et al., 2006). Los niveles de expresión génica de PDPN en los glioblastomas fueron significativamente mayores que en la sustancia blanca no neoplásica, lo que se confirmó mediante inmunohistoquímica (Scrideli et al., 2008). La PDPN es expresada específicamente por células endoteliales linfáticas, pero no por las sanguíneas, en cultivos y en la linfoangiogénesis asociada a tumores. Aunque la PDPN se encontraba principalmente ausente de la epidermis humana normal, su expresión se vio fuertemente inducida en 22 carcinomas de células escamosas de 28, lo que sugiere una función de la PDPN en la evolución tumoral (Schacht et al., 2005). La PDPN se encuentra regulada ascendentemente en el frente invasivo de una serie de carcinomas humanos. La investigación de la expresión de PDPN en células cultivadas de cáncer humano de mama, en un modelo de ratón de carcinogénesis de célula beta pancreática, y en biopsias de cáncer humano indicó que la PDPN estimula la invasión celular tumoral in vitro e in vivo. La PDPN induce la migración celular colectiva mediante la formación de filopodios a través de la regulación descendente de las actividades de GTPasas de familias Rho pequeñas. En conclusión, la PDPN induce un sistema de transducción alternativo de invasión de células tumorales en ausencia la transición epitelial-mesenquimática (Wicki et al., 2006). El nivel de expresión de PDPN se vio potenciado en la mayoría de los pacientes de tumor colorrectal (Kato et al., 2003). Al TGF-beta se le supone regulador fisiológico de la PDPN en las células de tumor (Suzuki et al., 2008). La PDPN es expresada por células de cáncer derivadas de células de esófago, pulmón, hígado, colon y mama, y por células endoteliales linfáticas (Kono et al., 2007).
Tenascina C (hexabraquion) (TNC) La expresión de la glicoproteína TNC de la matriz extracelular en el glioblastoma pero no en el cerebro normal y su asociación a membranas básales del endotelio de proliferación del glioblastoma sugirió ya en 1983 que la TNC podría ser un marcador útil de gliomas (Bourdon et al., 1983). Durante la evolución del tumor, la ECM de los tejidos tumorales es reorganizada y proporciona entonces un ambiente con mayor conducción para la evolución del tumor, en la que la angiogénesis es una etapa fundamental (Carnemolla et al., 1999). La TNC aparece sobreexpresada en los vasos de los tumores con un índice de proliferación elevado, lo que indica que participa en la angiogénesis neoplásica (Kim et al., 2000). En los tumores, la expresión de TNC puede ser inducida por hipoxia (Lal et al., 2001). La inducción de TNC es mediada por TGF-beta1, que proporciona un mecanismo para la invasión del parénquima sano por gliomas de grado alto (Hau et al., 2006). Además, la sobreexpresión de TNC es una consecuencia de la activación específica del promotor génico de la tenascina-C mediante la gastrina, conocida por modular de forma significativa la migración de células de glioblastoma humano (Kucharczak et al., 2001). La TNC regula descendentemente la tropomiosina-1 y, de esta forma, desestabiliza las fibras de estrés de actina. También provoca la regulación descendente de Dickkopfl , inhibidor del Wnt. Puesto que la expresión reducida de la tropomiosina-1 y la transducción Wnt aumentada están estrechamente vinculadas con la transformación y la oncogenia, la TNC modula específicamente estos sistemas de transducción de señales para potenciar la proliferación de las células de glioma (Ruiz et al., 2004).
En los tejidos de GBM se observa tinción perivascular de la TNC alrededor de los vasos sanguíneos del tumor, mientras que es menos frecuente en los gliomas de grado II y III de la OMS, lo que indica que la intensidad de la tinción de la tenascina guarda correlación con el grado del tumor y que la tinción más intensa revela un diagnóstico desfavorable (Herold-Mende et al., 2002; Zukiel et al., 2006). La máxima expresión de TNC se observa en el tejido conectivo que rodea a los tumores (Chiquet-Ehrismann and Tucker, 2004). La TNC también contribuye a la generación de un nicho de citoblastos dentro de la zona subventricular, que organiza la transducción del factor de crecimiento para acelerar el desarrollo de los neurocitoblastos. La TNC es esencial para la expresión oportuna del EGFR en los neurocitoblastos y potencia la transducción de señales de FGF2. El efecto predominante de la TNC en las células de la zona subventricular es la regulación de la evolución del desarrollo (Garcion et al., 2004). La TNC es el inductor más fuerte de la migración dirigida del SNC humano (haptotaxia). La matriz extracelular (ECM) producida por el tumor proporciona de esta forma un medio permisivo para el tropismo de los neurocitoblastos a células tumorales diseminadas (Ziu et al., 2006).
El sistema de transducción de TNC también desempeña una función importante en las metástasis y el crecimiento de tumores mamarios. Así, el silenciamiento o el bloqueo de la transducción de señales de TNC en células MDA-MB-435 tuvo como resultado una deficiencia significativa de la migración celular y la proliferación celular independiente del anclaje. Los ratones a los que se inyectaron células MDA-MB-435 clónicas con expresión reducida de TNC mostraron un descenso significativo en el crecimiento del tumor primario además de un descenso en la recaída del tumor tras la extirpación quirúrgica del tumor primario y un descenso en la incidencia de metástasis de pulmón (Calvo et al., 2008).
Survivina (BIRC5) La expresión del BIRC5 (survivina), miembro del inhibidor de la familia de la proteína de la apóptosis (IAP), se moviliza en tejidos fetales y en diversos cánceres humanos, con una expresión muchísimo menor en los tejidos diferenciados normales de un adulto, especialmente si su índice de proliferación es bajo. Survivin parece ser capaz de regular tanto la proliferación celular como la muerte celular apoptótica. Aunque la survivina suele encontrarse en la región citoplasmática de la célula y viene asociada con un pobre diagnóstico del cáncer, también se sabe que la localización nuclear es indicadora de un pronóstico favorable (O'Driscoll et al., 2003). La regulación de y a través de la survivina ha sido descrita a través de varios mecanismos. Parece que la survivina está asociada con la chaperona molecular Hsp60. En vivo, en Hsp60 aparece ampliamente expresada en tumores primarios de humanos en comparación con los tejidos normales correspondientes. La ablación aguda de Hsp60 mediante un ARN levemente interfiriente desestabiliza la mezcla mitocondrial de survivina, induce a la disfunción mitocondrial y activa la apóptosis dependiente de la caspasa (Ghosh et al., 2008). Además, la inhibición Ras desemboca en la liberación del «freno» de la survivina sobre la apóptosis y en la activación del sistema apoptótico mitocondrial. Especialmente en el glioblastoma, la resistencia a la apóptosis puede eliminarse mediante un inhibidor Ras dirigido a la survivina (Blum et al., 2006). También parece existir una correlación entre la hiperactividad NF-kapaB en gliomas e hiperexpresiones de survivina, uno de los genes objetivo del NF-kapaB. Así pues, los genes antiapoptósicos activados por NF-kapaB presentan sobreexpresión en las muestras tumorales. Especialmente en el glioblastoma pueden detectarse niveles muy altos de la expresión de survivin (Angileri et al., 2008). Se sugiere que la sobreexpresión de survivin en gliomas cerebrales puede desempeñar un importante papel en la proliferación maligna, la antiapóptosis y la angiogénesis (Zhen et al., 2005; Liu et al., 2006b). Se llevaron a cabo varios análisis para estudiar la expresión de la survivina y su impacto de supervivencia en el glioblastoma. Para resumir, la expresión de la survivina, especialmente la expresión simultánea en el núcleo y el citoplasma en tumores astrocíticos, se asoció de forma significativa con el nivel de malignidad (con la máxima expresión de suvivina en el glioblastoma) y tiempos de supervivencia general menores en comparación con pacientes que presentaban tumores negativos en survivina (Kajiwara et al., 2003; Saito et al., 2007; Uematsu et al., 2005; Mellai et al., 2008; Grunda et al., 2006; Xie et al., 2006; Sasaki et al., 2002; Chakravarti et al., 2002).
La sobreexpresión de la survivina también ha sido descrita para otras entidades tumorales. En el cáncer de mama, la expresión de la survivina está asociada con un mayor nivel y una menor supervivencia libre de enfermedades (Yamashita et al., 2007; Al-Joudi et al., 2007; Span et al., 2004). En las líneas celulares del cáncer de esófago se demostró que la actividad promotora de la survivina era 28,5 veces superior a la de los tejidos normales (Sato et al., 2006). En el cáncer colorrectal, la expresión de la survivina también está asociada con el grado patológico y la metástasis de los ganglios linfáticos (Tan et al., 2005). Se demostró que la agresividad del carcinoma de células renales con célula clara están asociados a la expresión de la survivina. Además, la expresión de la survivina está inversamente asociada a la supervivencia específica del cáncer (Kosari et al., 2005). La expression de la survivina puede detectarse en un panel de neoplasmas queratinocíticos y de lesiones dérmicas hiperproliferadoras, pero no en pieles normales (Bowen et al., 2004). En las líneas celulares del cáncer de páncreas, la survivina aumentó en el 58% de las líneas analizadas (Mahlamaki et al., 2002). En el carcinoma escamocelular, la expresión de la survivina puede ayudar a identificar casos con un fenotipo clínico más agresivo e invasivo (Lo et al., 2001).
Puesto que la survivina es un objetivo prometedor para la terapia contra el cáncer, los estudios que emplean péptidos derivados de la survivina mostraron que ésta es inmunógena en pacientes tumorales mediante la obtención de respuestas mediadas por células T CD8+. Además, la survivina estimulaba específicamente la reactividad de las células T CD4+ en los linfocitos sanguíneos periféricos de los mismos pacientes (Casati et al., 2003; Piesche et al., 2007).
La survivina (SVN, BIRC) aparece sobreexpresada en una multitud de entidades cancerosas. Así pues, en general, la sobreexpresión de la survivina se considera asociada con niveles generales de supervivencia más cortos y de una malignidad más elevada.
La presente invención se refiere además a proteínas marcadoras específicas que pueden usarse en el pronóstico del glioblastoma. Además, la presente invención se refiere también al uso de estas novedosas dianas para el tratamiento del cáncer.
Tal y como se estipula en el presente documento, las proteínas GFAP, FABP7, DTNA, NR2E1, SLC01C1, CHI3L1, ACSBG1 , IGF2BP3, NLGN4X, LC1, NRCAM, BCAN, EGFR, PDPN, NES, y CLIP2 se encuentran altamente sobreexpresadas en los glioblastomas en comparación con el cerebro normal y otros tejidos vitales (como el hígado, el riñon o el corazón). Se ha mostrado que las proteínas GRP56, CSPG4, NRCAM, TNC, BIRC5, CLIP2, NES, PDPN, EGFR, BCAN, GRIA4 desempeñan una función importante en la oncogenia porque participan en la transformación maligna, el crecimiento celular, la proliferación, la angiogénesis o la invasión del tejido normal.
Las proteínas NES, TNC, BIRC5, EGFR están asociadas con nichos de citoblastos o citoblastos de cáncer en el glioblastoma. Los citoblastos de cáncer son una subpoblación de células de tumor con potencial para autorregenerarse necesario para el crecimiento sostenido del tumor. Estas células residen en estructuras especializadas y muy organizadas, los llamados nichos de citoblastos de cáncer, necesarios para el mantenimiento del potencial de autorregeneración de los citoblastos de cáncer. Se ha mostrado que la sobreexpresión en tumores de las proteínas BIRC5, NRCAM, IGF2BP3 está relacionada con fases avanzadas de la enfermedad y pronósticos desfavorables para los pacientes.
Se ha mostrado que las BCA, CLIP2, DTNA, NLGNAX, NR2E1, NRCAM y PDPN, desempeñan una función importante en la reorganización del tejido necesaria para el crecimiento del tumor en el sistema nervioso. Por lo tanto, la expresión de BCA, CLIP2, DTNA, NLGNAX, NR2E1, NRCAM y PDPN se puede usar como marcador para distinguir al glioblastoma de otras formas de cáncer.
Así, la presente invención proporciona métodos para identificar a un animal, preferentemente un humano, con probabilidades de padecer glioblastoma. En una realización, la probabilidad determinada es entre el 80% y el 100%. Un método así comprende la determinación del nivel de al menos una de las proteínas BCA, CLIP2, DTNA, NLGNAX, NR2E1, NRCAM y PDPN en una muestra de tumor del sujeto animal. En una realización, la muestra se obtiene mediante cirugía radical. En otra realización, la muestra se obtiene mediante biopsia por aspiración.
Cuando el nivel de BCA, CLIP2, DTNA, NLGNAX, NR2E1, NRCAM o PDPN establecido se encuentra regulado ascendentemente en un 20% o más en las células relacionadas con las establecidas en las células epiteliales benignas de la misma muestra, el sujeto animal se identifica como susceptible de padecer glioblastoma.
Cuanto más reguladas ascendentemente se encuentren las distintas proteínas del grupo que comprende BCA, CLIP2, DTNA, NLGNAX, NR2E1, NRCAM, y PDPN, mayor será la probabilidad de que el sujeto animal se identifique como susceptible de padecer glioblastoma.
En una realización, la determinación del nivel de BCA, CLIP2, DTNA, NLGNAX, NR2E1 , NRCAM o PDPN se efectúa in situ. En otra realización, la determinación del nivel de BCA, CLIP2, DTNA, NLGNAX, NR2E1, NRCAM o PDPN se efectúa in vitro. En otra realización más, la determinación del nivel de BCA, CLIP2, DTNA, NLGNAX, NR2E1 , NRCAM o PDPN se efectúa in vivo. En una realización preferida, la determinación del nivel de BCA, CLIP2, DTNA, NLGNAX, NR2E1, NRCAM o PDPN se efectúa mediante Láser Capture Microscopy unido a la transferencia Western.
En una realización particular, la determinación del nivel de BCA, CLIP2, DTNA, NLGNAX, NR2E1, NRCAM o PDPN se efectúa con un anticuerpo específico para BCA, CLIP2, DTNA, NLGNAX, NR2E1, NRCAM o PDPN. En otra realización, la determinación del nivel de BCA, CLIP2, DTNA, NLGNAX, NR2E1, NRCAM o PDPN se efectúa mediante PCR con un cebador específico para un ARNm que codifica BCA, CLIP2, DTNA, NLGNAX, NR2E1, NRCAM o PDPN. En otra realización más, la determinación del nivel de BCA, CLIP2, DTNA, NLGNAX, NR2E1, NRCAM o PDPN se efectúa con una sonda nucleotídica específica para un ARNm que codifica BCA, CLIP2, DTNA, NLGNAX, NR2E1, NRCAM o PDPN. En una realización, la determinación del nivel de BCA, CLIP2, DTNA, NLGNAX, NR2E1, NRCAM o PDPN se efectúa utilizando una transferencia Northern. En otra realización, la determinación del nivel de BCA, CLIP2, DTNA, NLGNAX, NR2E1, NRCAM o PDPN se logra un ensayo de protección de ribonucleasa. En otras realizaciones, las pruebas inmunológicas como los enzimo-inmunoanálisis de adsorción (ELISA), los radioinmunoanálisis (RIA), y las transferencias Western pueden usarse para detectar polipéptidos de BCA, CLIP2, DTNA, NLGNAX, NR2E1, NRCAM, y PDPN en una muestra corporal de fluido (como sangre, suero, esputo, orina o fluido o fluido peritoneal). Las biopsias, las muestras de tejido, y las muestras de células (como los ovarios, los nodulos linfáticos, los raspados de células epiteliales superficiales del ovario, las biopsias de pulmón, las biopsias de hígado, y cualquier muestra de fluido que contiene células (como el fluido peritoneal, el esputo, y los derrames pleurales) pueden analizarse mediante desagregación y/o solubilización de la muestra de tejido o célula y sometiéndola a un inmunoanálisis para la detección de polipéptidos, como ELISA, RIA, o transferencia Western. Dichas muestras de tejido o célula también pueden analizarse con métodos basados en ácidos nucleicos, como la amplificación de la reacción en cadena de la polimerasa de transcripción inversa (RT-PCR), la hibridación Northern, o la transferencia por ranuras o por hoyos. Para visualizar la distribución de las células de tumor dentro de una muestra de tejido, se pueden utilizar pruebas de diagnóstico que conservan la estructura del tejido de una muestra, como la tinción inmunohistológica, la hibridación in situ del ARN o la RT-PCR in situ, para detectar ARNm o polipéptidos marcadores de glioblastoma, respectivamente. Para la localización in vivo de masas tumorales, se pueden emplear pruebas de imágenes, como la iconología de resonancia magnética (MRI), mediante la introducción en el sujeto de un anticuerpo que se une específicamente a un polipéptido BCA, CLIP2, DTNA, NLGNAX, NR2E1, NRCAM o PDPN (particularmente a un polipéptido ubicado en la superficie celular), en las que el anticuerpo se encuentra conjugado o acoplado de alguna otra forma a un trazador paramagnético (u otra región detectable apropiada, según el método iconológico utilizado); de forma alternativa, se puede detectar la ubicación de un anticuerpo específico de un marcador de tumor no marcado utilizando un anticuerpo secundario unido a una región detectable.
Además, la presente invención proporciona también proteínas/péptidos quiméricos/de fusión que comprenden los polipéptidos BCA, CLIP2, DTNA, NLGNAX, NR2E1, NRCAM y/o PDPN, y fragmentos de los mismos, incluidos fragmentos funcionales, proteolíticos y antigénicos.
Las secciones de fusión de una molécula híbrida proporcionan epítopos que estimulan a los linfocitos T CD4+. Estos epítopos son conocidos por los expertos en la materia e incluyen a los identificados en el toxoide tetánico. En otra realización preferida, el péptido es una proteína de fusión que comprende en particular aminoácidos aminoterminales de la cadena invariante (li) asociada al antígeno HLA-DR. En una modalidad, el péptido de la invención es una proteína humana truncada o una proteína de fusión de un fragmento proteico y otra porción de polipéptido, siempre que la porción humana incluya una o más secuencias de aminoácidos de invención.
También son parte de la presente invención los anticuerpos de los polipéptidos BCA, CLIP2, DTNA, NLGNAX, NR2E1, NRCAM o PDPN, de las proteínas quiméricas/de fusión que comprenden los polipéptidos BCA, CLIP2, DTNA, NLGNAX, NR2E1, NRCAM o PDPN, y de los fragmentos de los polipéptidos BCA, CLIP2, DTNA, NLGNAX, NR2E1, NRCAM o PDPN, incluidos fragmentos proteolíticos, y antigénicos, y de las proteínas/péptidos quiméricos/de fusión que comprenden estos fragmentos. Además, los métodos de utilización de dichos anticuerpos para el diagnóstico del cáncer, y del glioblastoma en particular, también son parte de la presente invención.
Los anticuerpos de la presente invención pueden ser anticuerpos policlonales, anticuerpos monoclonales y/o anticuerpos quiméricos. Las líneas celulares inmortales que producen un anticuerpo monoclonal de la presente invención también son parte de la presente invención.
El experto en la materia comprenderá que, en algunos casos, la expresión mayor de BCA, CLIP2, DTNA, NLGNAX, NR2E1, NRCAM o PDPN como gen marcador de tumor indicará un diagnóstico peor para el sujeto que padezca glioblastoma.
Por ejemplo, los niveles relativamente superiores de expresión de BCA, CLIP2, DTNA, NLGNAX, NR2E1, NRCAM o PDPN podrían indicar un tumor primario relativo grande, una carga tumoral mayor (por ejemplo, más metástasis), o un fenotipo de tumor relativamente más maligno.
Cuanto más distinta es la sobreexpresión de las distintas proteínas de grupo que comprende BCA, CLIP2, DTNA, NLGNAX, NR2E1, NRCAM y PDPN, peor es el pronóstico para el paciente.
Los métodos de diagnóstico y pronóstico de la invención implican la utilización métodos conocidos, por ejemplo métodos basados en anticuerpos para detectar polipéptidos BCA, CLIP2, DTNA, NLGNAX, NR2E1, NRCAM y PDPN y métodos basados en la amplificación y/o la hibridación de ácidos nucleicos para detectar ARNm de PDPN, BCA, CLIP2, DTNA, NLGNAX, NR2E1 y/o NRCAM.
Además, como la destrucción rápida de células tumorales suele resultar en la generación de autoanticuerpos, los marcadores de tumor de glioblastoma de la invención se pueden usar en análisis serológicos (como un análisis ELISA del suero de un sujeto) para detectar autoanticuerpos contra BCA, CLIP2, DTNA, NLGNAX, NR2E1, NRCAM o PDPN en un sujeto. Los niveles de autoanticuerpos específicos de polipéptidos BCA, CLIP2, DTNA, NLGNAX, NR2E1, NRCAM y PDPN que son al menos 3 veces mayores (y preferentemente al menos 5 o 7 veces mayores, y con la máxima preferencia, al menos 10 o 20 veces superior) que en la muestra de control son indicativos de glioblastomas.
Los polipéptidos BCA, CLIP2, DT A, NLGNAX, NR2E1, NRCAM y PDPN ubicados en la superficie celular, intracelulares y secretados pueden ser empleados para el análisis de biopsias, por ejemplo de muestras de células o tejidos (incluidas células obtenidas de muestras de líquidos como el fluido de la cavidad peritoneal) para identificar una biopsia de célula o tejido con contenido de células de glioblastoma. Una biopsia puede analizarse como un tejido intacto o como una muestra de célula completa, o la muestra de célula o tejido puede estar desagregada y/o solubilizada como sea necesario para el tipo concreto de prueba de diagnóstico que se vaya a utilizar. Por ejemplo, las biopsias o muestras pueden someterse a análisis de célula completa o de tejido completo de polipéptidos BCA, CLIP2, DTNA, NLGNAX, NR2E1, NRCAM y PDPN o niveles de ARNm in situ, por ejemplo mediante inmunohistoquímica, hibridación de ARNm in situ, o RT-PCR in situ. El experto en la materia sabrá cómo procesar tejidos o células para el análisis de niveles de polipéptidos o ARNm utilizando métodos inmunológicos como ELISA, inmunoelectrotransferencia, o métodos equivalentes, o análisis de niveles de ARNm mediante métodos analíticos basados en ácidos nucleicos como RT-PCR, hibridación Northern, transferencia por ranuras o por hoyos.
Kits para medir los niveles de expresión de BCA, CLIP2, DTNA, NLGNAX, NR2E1, NRCAM y PDPN La presente invención proporciona kits para detectar un nivel de expresión aumentado de BCA, CLIP2, DTNA, NLGNAX, NR2E1, NRCAM y PDPN como un gen marcador de glioblastoma en un sujeto. Un kit para detectar polipéptidos de marcador de glioblastoma contiene preferiblemente un anticuerpo que se une específicamente a un polipéptido marcador de glioblastoma elegido. Un kit para detectar ARNm de marcador de glioblastoma que contiene preferiblemente un ácido nucleico o más (por ejemplo, un cebador o sonda de oligonucleótidos o más, sondas de ADN, sondas de ARN, o moldes para generar sondas de ARN) que se híbrida específicamente con BCA, CLIP2, DTNA, NLGNAX, NR2E1, NRCAM y ARNm de PDPN.
Particularmente, el kit basado en anticuerpos puede usarse para detectar la presencia de, y/o medir el nivel de, un polipéptido BCA, CLIP2, DTNA, NLGNAX, NR2E1, NRCAM y/o PDPN que está unido específicamente por el anticuerpo o un fragmento inmunoreactivo del mismo. El kit puede incluir un reactivo de anticuerpo con el antígeno y un reactivo para detectar una reacción del anticuerpo con el antígeno. Un kit así puede ser un kit ELISA y puede contener un control (por ejemplo, una cantidad específica de un polipéptido particular marcador de glioblastoma), anticuerpos primarios y secundarios cuando sea necesario, y otros reactivos que sean necesarios, como regiones detectables, sustratos de enzimas y reactivos de color como los descritos más arriba. El kit de diagnóstico puede, de forma alternativa, ser un kit de ¡nmunotransferencia que comprende en general los componentes y reactivos aquí descritos.
Un kit basado en ácidos nucleicos puede usarse para detectar y/o medir el nivel de expresión de BCA, CLIP2, DTNA, NLGNAX, NR2E1, NRCAM y PDPN mediante la detección y/o medición de la cantidad de ARNm de PDPN, BCA, CLIP2, DTNA, NLGNAX, NR2E1 y NRCA en una muestra, como biopsias de células o tejidos. Por ejemplo, un kit RT-PCR para la detección de expresión elevada de BCA, CLIP2, DTNA, NLGNAX, NR2E1, NRCAM y PDPN contiene preferentemente cebadores de oligonucleótidos en cantidad suficiente para efectuar transcripciones inversas de ARNm de marcador de glioblastoma a ADNc y amplificación PCR de ADNc de marcador de glioblastoma, y preferentemente también contendrán cebadores y moléculas molde de PCR para efectuar los controles positivos y negativos adecuados, y los controles internos para la cuantificación. El experto en la materia sabrá cómo seleccionar los cebadores adecuados para realizar reacciones de PCR y transcripciones inversas, y las reacciones de control adecuadas que deban efectuarse. Las orientaciones para ello se encuentran, por ejemplo, en F. Ausubel et al., «Current Protocols in Molecular Biology», John Wiley & Sons, Nueva York, 1997. En el estado de la técnica, se conocen numerosas variantes de RT-PCR. En suministro direccionalizado de inmunotoxinas a BCA, CLIP2, DTNA, NLGNAX, NR2E1, NRCAM y PDPN puede emplearse como dianas terapéuticas para el tratamiento o prevención del glioblastoma. Por ejemplo, una molécula de anticuerpo que se une específicamente a un polipéptido BCA, CLIP2, DTNA, NLGNAX, NR2E1, NRCAM y PDPN ubicado en la superficie celular se puede conjugar con un radioisótopo u otro componente tóxico. Los conjugados de anticuerpo se administran al sujeto de forma que la unión del anticuerpo a su polipéptido de glioblastoma cognado tiene como resultado el suministro direccionalizado del compuesto terapéutico a las células de glioblastoma, y de este modo se trata un cáncer de ovario.
La región terapéutica puede ser una toxina, un radioisótopo, un fármaco, un producto químico, o una proteína (véase, por ejemplo, Bera et al. «Pharmacokinetics and antitumor activity of a bivalent disulfide-stabilized Fv immunotoxin with improved antigen binding to erbB2», Cáncer Res., 59:4018-4022 (1999)). Por ejemplo, el anticuerpo se puede vincular o conjugar a una toxina bacteriana (por ejemplo, toxina de difteria, exotoxina A de pseudomonas, toxina de cólera) o a una toxina de plantas (por ejemplo, toxina de la ricina) para el suministro direccionalizado de la toxina a una célula que expresa BCA, CLIP2, DTNA, NLGNAX, NR2E1, NRCAM y PDPN. Esta inmunotoxina se puede suministrar a una célula y al unir el polipéptido marcador de glioblastoma ubicado en la superficie celular, la toxina conjugada con el anticuerpo específico de marcador de glioblastoma será suministrada a la célula.
Otro aspecto de la presente invención está relacionado con un anticuerpo que, de forma específica, se une a un complejo mayor de histocompatibilidad humano (MHC) de clase I o II que forma un complejo con un antígeno restringido a HLA (en adelante, también denominado «anticuerpo específico del complejo»). Otro aspecto de la presente invención está relacionado con un método de producir dicho anticuerpo unido a un complejo mayor de histocompatibilidad humano (MHC) de clase I o clase II que forma un complejo con un antígeno restringido a HLA, que comprende: la inmunización de un mamífero no humano sometido a ingeniería genética que consta de células que expresan dicho complejo mayor de histocompatibilidad humano (MHC) de clase I o II con una forma soluble de la molécula MHC de clase I o II combinada con el mencionado antígeno restringido a HLA; el aislamiento de moléculas de ARN-m de las células productoras de anticuerpos del mencionado mamífero no humano; la producción de una biblioteca de expresión en fago en la que aparezcan las moléculas de proteínas codificadas por dichas moléculas de ATN- ; y el aislamiento de, al menos, un fago de dicha biblioteca de expresión en fagos, con al menos un fago mostrando dicho anticuerpo conectable al mencionado complejo mayor de histocompatibilidad humano (MHC) de clase I o II, combinado con el mencionado antígeno restringido a HLA. Los métodos respectivos para producir dichos anticuerpos y complejos mayores de histocompatibilidad de clase I y cadena simple, así como otras herramientas para la producción de estos anticuerpos, se recogen en los documentos WO 03/068201, WO 2004/084798, WO 01/72768, WO 03/070752, y Cohén CJ, Denkberg G, Lev A, Epel M, Reiter Y. Recombinant antibodies with MHC-restricted, peptide-specific, T-cell receptor-like specificity: new tools to study antigen presentation and TCR-peptide-MHC interactions. J Mol Recognit. 2003 sep-oct;16(5):324-32.; Denkberg G, Lev A, Eisenbach L, Benhar I, Reiter Y. Selective targeting of melanoma and APCs using a recombinant antibody with TCR-like specificity directed toward a melanoma differentiation antigen. J Immunol. 2003 sep 1 ;171(5):2197-207; y Cohén CJ, Sarig O, Yamano Y, Tomaru U, Jacobson S, Reiter Y. Direct phenotypic analysis of human MHC class I antigen presentation: visualization , quantitation , and in situ detection of human viral epitopes using peptide-specific, MHC-restricted human recombinant antibodies. J Immunol. 2003 abr 15; 170(8):4349-61 , los cuales, de cara al propósito de esta invención, están todos incorporados por referencia en su totalidad.
Preferiblemente, el anticuerpo estará unido con una afinidad de enlace por debajo de 20 nanomolares, y preferentemente por debajo de 10 nanomolares, al complejo, que se considera «específico» en el contexto de la presente invención.
El término «anticuerpo» se emplea en el presente documento en un sentido amplio, e incluye los anticuerpos tanto policlonales como monoclonales. Además de las moléculas intactas de inmunoglobulina, en el término «anticuerpo» también se incluyen los fragmentos o polímeros de aquellas moléculas de inmunoglobulina y versiones humanizadas de moléculas de inmunoglobulina, en la medida en que muestran algunas de las propiedades deseadas (p. ej., ser un anticuerpo específico del complejo, tal y como se ha mencionado anteriormente, liberar una toxina a una célula cancerosa que expresa un gen marcador de cáncer, preferentemente glioblastoma, a un mayor nivel y/o inhibir la actividad de un polipéptido marcador del cáncer, como la survivina) descritas en el presente documento.
Además, para cualquier polipéptido BCA, CLIP2, DTNA, NLGNAX, NR2E1 , NRCAM y PDPN para el que existe un ligando específico (por ejemplo, un ligando que se une a una proteína ubicada en la superficie celular), el ligando se puede usar en el lugar de un anticuerpo para direccionalizar un compuesto tóxico a una célula de glioblastoma, como se describe más arriba.
Cuando sea posible, los anticuerpos de la invención deberán adquirirse a partir de fuentes comerciales. Los anticuerpos de la invención también pueden generarse utilizando métodos bien conocidos. El experto en la material comprenderá que los polipéptidos marcadores de glioblastoma de longitud completa o fragmentos de éstos podrán utilizarse para generar los anticuerpos de la invención. Un polipéptido que vaya a utilizarse para generar un anticuerpo de la invención podrá ser purificado total o parcialmente a partir de una fuente natural, o podrá ser producido utilizando técnicas de ADN recombinante. Por ejemplo, un ADNc que codifique un polipéptido BCA, CLIP2, DTNA, NLGNAX, NR2E1, NRCAM o PDPN, o un fragmento de éste, puede expresarse en células procarióticas (p. ej., bacterias) o células eucarióticas (p. ej., células de levadura, de insectos o de mamíferos), después de lo cual la proteína recombinante puede ser purificada y utilizada para generar una preparación de anticuerpos monoclonales o policlonales que se unan de forma específica al polipéptido marcador del glioblastoma utilizado para generar el anticuerpo.
Los expertos en la material sabrán que la generación de una o más series diferentes de anticuerpos monoclonales o policlonales maximiza la probabilidad de obtener un anticuerpo con la especificidad y afinidad necesarias para su uso pretendido (p. ej., ELISA, inmunohistoquímica, generación de imágenes en vivo, terapia de inmunotoxinas). La comprobación de los anticuerpos para cerciorarse de que cumplan la actividad deseada se lleva a cabo mediante métodos conocidos, de acuerdo con el propósito para el que deben utilizarse los anticuerpos (p. ej., ELISA, inmunohistoquímica, inmunoterapia, etc.; para más datos sobre la generación y comprobación de los anticuerpos consulte, p. ej., Harlow y Lañe, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1988). Por ejemplo, los anticuerpos pueden analizarse con análisis ELISA, transferencias Western, tinción inmunohistoquímica de glioblastomas fijados con formalina o secciones de tejido congelado. Después de su caracterización inicial in vitro, los anticuerpos destinados al uso diagnóstico terapéutico o en vivo son comprobados con arreglo a conocidos métodos de ensayo clínico.
El término «anticuerpo monoclonal», tal y como se emplea aquí, hace referencia a un anticuerpo obtenido a partir de una población sustancialmente homogénea de anticuerpos, es decir: los anticuerpos individuales que constituyen la población son idénticos, excepto en el caso de que tengan lugar mutaciones naturales que podrían existir en pequeñas cantidades. Los anticuerpos monoclonales de este documento incluyen de forma específica a los anticuerpos «quiméricos», en los que una parte de la cadena pesada y/o ligera es idéntica u homóloga con respecto a las secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de una especia concreta o pertenecientes a una clase o subclase particular de anticuerpos, mientras que el resto de la(s) cadena(s) será idéntica u homóloga con respecto a las secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de otras especies o pertenecientes a otras clase o subclase de anticuerpos, así como fragmentos de dichos anticuerpos en la medida en que éstos muestran la actividad antagónica deseada (patente EUA n° 4.816.567).
Los anticuerpos monoclonales de la invención pueden prepararse utilizando métodos de hibridoma. En un método de hibridoma, un ratón u otro animal huésped adecuado suele ser inmunizado mediante un agente inmunizador, para así generar linfocitos que produzcan o sean capaces de producir anticuerpos que se unirán de forma específica al agente inmunizador. Como alternativa, los linfocitos podrán ser inmunizados in vitro.
Los anticuerpos monoclonales también pueden elaborarse a partir de métodos de ADN recombinante, como los que se describen en la patente EUA n° 4.816.567. El ADN que codifica los anticuerpos monoclonales de la invención puede aislarse y secuenciarse fácilmente utilizando procedimientos convencionales (p. ej., utilizando sustancias de oligonucleótidos que sean capaces de unirse de forma específica a los genes que codifican las cadenas ligeras y pesadas de los anticuerpos múridos).
Los métodos en vivo también son adecuados para preparar anticuerpos monovalentes. La digestión de los anticuerpos para producir fragmentos de éstos, concretamente fragmentos Fab, puede lograrse mediante la utilización de técnicas rutinarias conocidas en el sector. Por ejemplo, la digestión puede llevarse a cabo mediante papaína. Algunos ejemplos de digestión por papaína se describen en el documento WO 94/29348, publicado el 22 de diciembre de 1994, y en la patente EUA n° 4.342.566. La digestión de anticuerpos mediante papaína suele generar dos fragmentos idénticos vinculantes de antígenos, denominados fragmentos Fab, cada uno de los cuales consta con un solo lugar de unión con el antígeno, y un fragmento residual de Fe. El tratamiento por pepsina genera un fragmento que cuenta con dos lugares de combinación con un antígeno, y sigue siendo capaz de interconectar antígenos.
Los fragmentos de anticuerpo, independientemente de que estén unidos a otras secuencias o no, también podrán incluir inserciones, eliminaciones, sustituciones u otras modificaciones seleccionadas en regiones concretas, o bien residuos de aminoácidos concretos, siempre que la actividad del fragmento no se vea significativamente alterada o afectada en comparación con el anticuerpo no modificado o con el fragmento de éste. Estas modificaciones pueden dar lugar a acciones adicionales, como por ejemplo eliminar/añadir aminoácidos capaces de generar enlaces de disulfuro, incrementar su biolongevidad, alterar sus características de secreción, etc. En cualquier caso, el fragmento del anticuerpo deberá poseer una propiedad bioactiva, como actividad de enlace, regulación de enlace en el dominio de éste, etc. Las regiones funcionales o activas del anticuerpo pueden identificarse mediante la mutagénesis de una región concreta de la proteína, seguida de la expresión y comprobación del polipéptido expresado. Estos métodos resultan fácilmente accesibles para un profesional experimentado en la materia, y pueden incluir mutagénesis específica del lugar del ácido nucleico que codifica el fragmento del anticuerpo.
Los anticuerpos de la invención, además, pueden constar de anticuerpos humanizados o de anticuerpos humanos. Las formas humanizadas de los anticuerpos no humanos (p. ej., múridos) son inmunoglobulinas quiméricas, cadenas de inmunoglobulina o fragmentos de ésta (como Fv, Fab, Fab' u otras subsecuencias de anticuerpos enlazadoras de antígenos) que contienen una secuencia mínima derivada de la inmunoglobulina no humana. Los anticuerpos humanizados incluyen las inmunoglobulinas humanas (anticuerpo del receptor) en las que los residuos de una región de determinación complementaria (CDR) del receptor son sustituidos por residuos de una CDR de una especie no humana (anticuerpo del donante) como el ratón, la rata o el conejo con la especificidad, afinidad y capacidad deseadas. En algunos ejemplos, los residuos del marco Fv (FR) de la inmunoglobulina humana son sustituidos por los residuos no humanos correspondientes. Los anticuerpos humanizados pueden incluir también residuos que no se encuentran ni en el anticuerpo del receptor ni en las secuencias de la CDR importada o del marco. En general, los anticuerpos humanizados comprenderán esencialmente la totalidad de, al menos, un dominio de variables, y dos por regla general, en el que todas o casi todas las regiones CDR corresponden a aquellas de la inmunoglobulina no humana, y todas o casi todas las regiones FR son las de una secuencia consensuada de la inmunoglobulina humana. En circunstancias óptimas, el anticuerpo humanizado también constará, al menos, de una parte de una región constante de inmunoglobulina (Fe), normalmente de inmunoglobulina humana.
Los métodos para humanizar anticuerpos no humanos son bien conocidos en el sector; por regla general, un anticuerpo humanizado presenta uno o más residuos de aminoácidos introducidos en él a partir de un origen no humano. A estos residuos de aminoácido no humano se les suele denominar residuos «importados», que suelen ser tomados a partir de un dominio variable «de importación». La humanización puede ser llevada a cabo fundamentalmente mediante la sustitución de las secuencias correspondientes de un anticuerpo humano por las secuencias CDR del roedor. Por tanto, esos anticuerpos «humanizados» son anticuerpos quiméricos (patente de Estados Unidos n.° 4.816.567), en los que bastante menos de un dominio de variables humano ha sido sustituido por la secuencia correspondiente de una especie no humana. En la práctica, los anticuerpos humanizados suelen ser anticuerpos humanos en los que algunos residuos CDR y, posiblemente, algunos residuos FR, son sustituidos por residuos procedentes de emplazamientos análogos en los anticuerpos de los roedores.
Pueden emplearse animales transgénicos (p. ej., ratones) que sean capaces, mediante inmunización, de producir un abanico completo de anticuerpos humanos ante la ausencia de la producción de inmunoglobulina endógena. Por ejemplo, se ha descrito que la supresión homocigótica del gen de la región de unión de la cadena pesada de anticuerpos en ratones con mutación quimérica y de la línea germinal desemboca en la inhibición completa de la producción de anticuerpos endógenos. La transferencia de la selección de genes de la inmunoglobulina correspondiente a la línea germinal humana en dichos ratones con mutación de la línea germinal provocará la producción de anticuerpos humanos frente al desafío del antígeno. Los anticuerpos humanos también pueden producirse en genotecas de expresión de fagos.
Preferiblemente, los anticuerpos de la invención se administrarán a un sujeto en un vehículo apropiado desde el punto de vista farmacéutico. Por regla general, se utiliza una cantidad apropiada de una sal aceptable desde el punto de vista farmacéutico en la formulación para hacer que ésta se vuelva isotónica. Algunos ejemplos de vehículo adecuado desde el punto de vista farmacéutico son soluciones salinas, de Ringer y de dextrosa. El pH de la solución es preferible que se encuentre en el entorno de entre 5 y 8, y más preferiblemente aún que esté entre 7 y 7,5 aproximadamente. Otros vehículos pueden ser preparaciones de liberación sostenida, como matrices semipermeables de polímeros hidrófobos sólidos que contengan el anticuerpo, cuyas matrices se encuentren en forma de artículos formados, como por ejemplo películas, liposomas o micropartículas. Para las personas expertas en la materia, resultará evidente que determinados vehículos pueden ser más preferibles que otros en función, por ejemplo, de la vía de administración y de la concentración del anticuerpo que se esté administrando.
Los anticuerpos pueden administrarse al sujeto, paciente o célula mediante inyección (p. ej., intravenosa, intraperitoneal, subcutánea o intramuscular) o a través de otro método, como la infusión, que garantice su llegada al torrente sanguíneo de forma eficaz. Los anticuerpos también pueden administrarse por vías intratumorales o peritumorales, para así ejercer efectos terapéuticos tanto locales como sistémicos. Es preferible la inyección local o intravenosa.
Las dosis y los programas eficaces para administrar los anticuerpos podrán determinarse empíricamente, y dicha determinación se encuadrará dentro de la experiencia en la materia. Las personas expertas en esta materia entenderán que la dosis de anticuerpos que debe administrarse variará, por ejemplo, en función del sujeto que reciba dicha dosis, de la vía de administración, del tipo concreto de anticuerpo utilizado y de otros medicamentos que estén administrándose. Antibodies in Human Diagnosis and Therapy, Haber et al, eds. Raven Press, Nueva York (1977) pp. 365-389. Una dosis diaria habitual del anticuerpo utilizado en solitario puede oscilar entre alrededor de 1 pg/kg hasta 100 mg/kg de peso corporal o más al día, en función de los factores mencionados anteriormente. Tras la administración de un anticuerpo para tratar el glioblastoma, la eficacia del anticuerpo terapéutico puede evaluarse de diversas formas bien conocidas para el profesional experimentado. Por ejemplo, el tamaño, número y/o distribución del glioblastoma en un sujeto que esté recibiendo tratamiento puede controlarse mediante técnicas estándar de generación de imágenes de tumores. Un anticuerpo administrado terapéuticamente que detiene el crecimiento del tumor desemboca en la disminución de éste y/o evita el desarrollo de nuevos tumores, en comparación con el curso de la enfermedad que tendría lugar ante la ausencia de la administración de anticuerpos, es un anticuerpo eficaz para el tratamiento del glioblastoma.
Como el marcador de tumor de glioblastoma BCA, CLIP2, DTNA, NLGNAX, NR2E1, NRCAM y PDPN de la invención se encuentra altamente expresado en las células de glioblastoma y se expresa a niveles extremadamente bajos en las células normales, la inhibición de la actividad polipeptídica o la expresión de BCA, CLIP2, DTNA, NLGNAX, NR2E1, NRCAM o PDPN puede estar integrada en cualquier estrategia terapéutica para tratar o prevenir el glioblastoma.
El principio de la terapia antisentido se basa en la hipótesis de que la supresión específica de secuencia de la expresión génica (mediante la transcripción o la traducción) puede lograrse mediante la hibridación intracelular entre ARNm o ADN genómico y una especie antisentido complementaria. La formación de un dúplex híbrido de ácido nucleico así interfiere con la transcripción del ADN genómico que codifica el antígeno del tumor diana, o el procesamiento/transporte/traducción y/o estabilidad del ARNm del antígeno del tumor diana.
Los ácidos nucleicos antisentido pueden suministrarse de diversas formas. Por ejemplo, los oligonucleótidos antisentido o el ARN antisentido pueden administrarse directamente (por ejemplo, mediante inyección intravenosa) a un sujeto de una forma que permita la absorción en las células tumorales. De forma alternativa, los vectores virales o plasmídicos que codifican ARN antisentido (o fragmentos de ARN) pueden introducirse in vivo en las células. Los efectos antisentido también pueden inducirse mediante secuencias codificantes; sin embargo, el alcance de los cambios fenotípico es sumamente variable. Los cambios fenotípicos inducidos por terapia efectiva antisentido se calcular según los cambios en los niveles de ARNm diana, los niveles de proteína diana, y/o los niveles de actividad proteica diana, por ejemplo.
En un ejemplo específico, la inhibición de la función del marcador de glioblastoma mediante terapia génica antisentido puede lograrse mediante la administración directa de ARN de marcador de glioblastoma antisentido a un sujeto. El ARN del marcador de tumor antisentido puede producirse y aislarse mediante cualquier técnica estándar, pero la forma más inmediata de hacerlo es mediante transcripción in vitro utilizando un ADNc de marcador de tumor antisentido bajo el control de un promotor de gran eficiencia (por ejemplo, el promotor T7). La administración de ARN de marcador de tumor antisentido a las células puede efectuarse mediante cualquiera de los métodos para la administración directa de ácidos nucleicos descrita más arriba.
Una estrategia alternativa para la inhibir la función de PDPN, BCA, CLIP2, DTNA, NLGNAX, NR2E1 y/o NRCAM mediante terapia génica implica la expresión intracelular de un anticuerpo anti BCA, CLIP2, DTNA, NLGNAX, NR2E1 , NRCA o PDPN, o una porción de un anticuerpo anti BCA, CLIP2, DTNA, NLGNAX, NR2E1, NRCAM o PDP . Por ejemplo, el gen (o el fragmento de gen) que codifica un anticuerpo monoclonal que se une específicamente a un polipéptido BCA, CLIP2, DTNA, NLGNAX, NR2E1, NRCAM o PDPN e inhibe su actividad biológica se encuentra bajo el control transcripcional de una secuencia de regulación génica específica (por ejemplo, específica de tumor o de tejido), dentro de un vector de expresión de ácidos nucleicos. El vector se administra entonces al sujeto de tal forma que es absorbido por células de glioblastoma u otras células, que entonces secretan el anticuerpo anti BCA, CLIP2, DTNA, NLGNAX, NR2E1, NRCAM o PDPN y de esta forma bloquea la actividad biológica del polipéptido BCA, CLIP2, DTNA, NLGNAX, NR2E1, NRCAM y PDPN. Preferiblemente, los polipéptidos BCA, CLIP2, DTNA, NLGNAX, NR2E1 , NRCAM y PDPN están presentes en la superficie extracelular de las células de glioblastoma.
En los métodos descritos más arriba, que incluyen la administración y absorción de ADN exógeno en las células de un sujeto (por ejemplo, la transfección o transducción de genes), los ácidos nucleicos de la presente invención pueden encontrarse en la forma de ADN desnudo o los ácidos nucleicos pueden encontrarse en un vector para suministrar los ácidos nucleicos a las células para la inhibición de la expresión de la proteína marcadora de glioblastoma. El vector puede ser un preparado disponible comercialmente, como un vector de adenovirus (Quantum Biotechnologies, Inc.Laval, Quebec, Canadá). El suministro del ácido nucleico o el vector a las células puede realizarse mediante diversos mecanismos. Como ejemplo, el suministro puede efectuarse mediante un liposoma, utilizando preparados de liposomas disponibles en el mercado, como LIPOFECTIN, LIPOFECTAMINE (GIBCO- 25 BRL, Inc., Gaithersburg, Md.), SUPERFECT (Qiagen, Inc. Hilden, Alemania) y TRANSFECTAM (Promega Biotec, Inc., Madison, Wis.), además de otros liposomas desarrollados según procedimientos estándar en la materia. Además, el ácido nucleico o el vector de esta invención puede suministrarse in vivo mediante electroporación, tecnología disponible de Genetronics, Inc. (San Diego, California) además de mediante una máquina SONOPORATION (ImaRx Pharmaceutical Corp., Tucson, Arizona).
Como ejemplo, el suministro de vectores puede efectuarse mediante un sistema vírico, como un sistema de vectores retrovíricos que puede empaquetar un genoma retrovírico recombinante. El retrovirus recombinante puede usarse entonces para infectar y de esta forma suministrar a las células infectadas un ácido nucleico antisentido que inhibe la expresión de BCA, CLIP2, DTNA, NLGNAX, NR2E1, NRCAM o PDPN. El método exacto para introducir el ácido nucleico alterado en células de mamíferos no se limita, por supuesto, al uso de vectores retrovirales. Existen otras técnicas ampliamente extendidas para este procedimiento, incluido el uso de vectores adenovíricos, vectores víricos adenoasociados (AAV), vectores lentivíricos, vectores retrovíricos sometidos a la prueba del seudotipo. Las técnicas de transducción física también pueden usarse, como el suministro de liposomas y el mecanismo mediado por receptor y otros mecanismos de endocitosis. Esta invención puede usarse en conjunción con cualquiera de estos u otros métodos de transferencia de genes usados habitualmente.
Los anticuerpos también pueden utilizarse para ensayos de diagnóstico en vivo. Generalmente, el anticuerpo viene etiquetado con un radionucleótido (como 11 ln, "Te, 14C, 131l, 3H, 32 P o 35 S), de tal forma que el tumor puede localizarse utilizando la inmunoescintografía. En una modalidad, los anticuerpos o fragmentos de éstos se unen a los dominios extracelulares de dos o más dianas de BCA, CLIP2, DTNA, NLGNAX, NR2E1, NRCAM y PDPN, y el valor de afinidad (Kd) es menor a 1?10µ?.
Los anticuerpos para uso diagnóstico pueden etiquetarse con sustancias adecuadas para la detección mediante diversos métodos de generación de imágenes. Los métodos para la detección de sustancias incluyen, a modo enunciativo, la fluorescencia, luz, microscopía confocal y electrónica, generación de imágenes por resonancia magnética y espectroscopia, fluoroscopía, tomografía computarizada y tomografía de emisión de positrones. Algunas de las sustancias adecuadas, a título enunciativo, son la fluoresceína, rodamina, eosina y otros fluóforos, radioisótopos, oro, gadolinio y otros lantánidos, hierro paramagnético, flúor-18 y otros radionuclidos emisores de positrones. Además, las sustancias pueden ser bifuncionales o multifuncionales, así como detectables por más de uno de los métodos reflejados. Estos anticuerpos pueden ser etiquetados directa o indirectamente con estas sustancias. La unión de las sustancias a los anticuerpos incluye la unión covalente de ésta, la incorporación de dicha sustancia en el anticuerpo y la unión covalente de un compuesto quelante para la unión de la sustancia, entre otros sistemas bien conocidos en el sector. En el caso de la inmunohistoquímica, la muestra de tejido enfermo puede ser reciente o congelada, o bien puede ser introducida en parafina y fijada con un conservante, como la formalina. La sección fijada o introducida que contiene la muestra entra en contacto con un anticuerpo primario etiquetado y uno secundario, donde el anticuerpo se utiliza para detectar in situ la expresión de la proteína BCA, CLIP2, DTNA, NLGNAX, NR2E1, NRCA y PDPN.
La presente invención, en otro aspecto preferido de la misma, proporciona un péptido que comprende una secuencia que se selecciona del grupo de SEQ ID n.° 1 a SEQ ID n.° 30 o una variante de las mismas que es homologa en un 85% a las secuencias SEQ ID n.° 1 a SEQ ID n.° 30, o una variante de las mismas, que inducirá a los linfocitos T a reaccionar de forma cruzada con el mencionado péptido.
En una realización preferida, el péptido se selecciona de un grupo de péptidos que comprenden una secuencia que se selecciona del grupo de SEQ ID n.° 1 a SEQ ID n.° 24 o una variante de las mismas que es homologa en un 85% a las secuencias SEQ ID n.° 1 a SEQ ID n.° 24, o una variante de las mismas que inducirá a los linfocitos T a reaccionar de forma cruzada con el mencionado péptido.
Los péptidos de la invención tienen la habilidad de unirse a una molécula del complejo mayor de histocompatibilidad humano ( HC) de clase I o II.
En la presente invención, el término «homólogo» hace referencia al grado de identidad entre secuencias de dos secuencia de aminoácidos, es decir, secuencias de péptidos o polipéptidos. La mencionada «homología» se determina mediante la comparación de dos secuencias alineadas en condiciones óptimas con las secuencias que se van a comparar. Las secuencias que se van a comparar en el presente documento pueden sufrir una adición o deleción (un gap o similares) en la alineación óptima de las dos secuencias. Una homología de secuencias de estas características puede calcularse creando una alineación utilizando, por ejemplo, el algoritmo ClustalW (Nucleic Acid Res., 22[22]:. 4673 4680 (1994). Software de análisis de secuencias fácilmente disponible, y más concretamente, Vector NTI, GENETYX o herramientas de análisis suministradas por bases de datos públicas.
El experto en la materia será capaz de evaluar si los tinfocitos T inducidos por una variante de un péptido específico podrán reaccionar de forma cruzada con el propio péptido, valiéndose para ello de las siguientes referencias: (Fong et al., 2001); (Zaremba et al., 1997; Colombetti et al., 2006; Appay et al., 2006).
Al hablar de una «variante» de la secuencia de aminoácidos anterior, los inventores se refieren a que las cadenas laterales, por ejemplo, de uno o dos de los residuos de aminoácidos se alteran (por ejemplo, sustituyéndolas por la cadena lateral de otro residuo de aminoácido generado de forma natural o por otra cadena lateral) de tal forma que el péptido sigue teniendo la capacidad de unirse a una molécula HLA básicamente de la misma forma que un péptido que conste de la secuencia de aminoácidos detallada en SEQ ID n°: 1 a 30. Por ejemplo, un péptido puede ser modificado de tal forma que, al menos, mantenga, si no mejora, la capacidad de interactuar (y unirse) con el surco de unión de una molécula MHC adecuada, como HLA-A*02 o -DR, y de forma que, al menos, mantengo, si no mejora, la capacidad de unirse al TRC del CTL activado. Estos CTL pueden reaccionar posteriormente de forma cruzada con células y destruir las que expresan un polipéptido que contiene la secuencia natural de aminoácidos del péptido cognado, como se define en los aspectos de la invención. Como se puede concluir a partir de la literatura científica de la materia (Rammensee et al., 1997) y las bases de datos (Rammensee et al., 1999), determinadas posiciones de péptidos de unión a HLA normalmente son residuos conservados que forman una secuencia central que se ajusta al motivo de unión del receptor HLA, que se define mediante propiedades polares, electrof ísicas, hidrofóbicas y espaciales de las cadenas de polipéptido que constituyen el surco de unión. De esta forma, el experto en la materia sería capaz de modificar las secuencias de aminoácidos expuestas en las secuencias SEQ ID n° 1 a 30, mediante el mantenimiento de los residuos conservados conocidos, y sería capaz de determinar si dichas variantes mantienen la habilidad para unirse a moléculas MHC de clase I o II. Las variantes de la presente invención mantienen su habilidad para unirse al TCR de los CTL activados, que seguidamente puede reaccionar de forma cruzada y destruir células que expresan un polipéptido que contiene la secuencia natural de aminoácidos del péptido cognado como se define en los aspectos de la invención.
Los residuos de aminoácidos que no contribuyen sustancialmente a las interacciones con el receptor del linfocito T pueden ser modificados mediante el reemplazo con otro aminoácido cuya incorporación no afecte de forma sustancial a la reactividad del linfocito T ni elimine la unión con el MHC relevante. Por lo tanto, aparte de la condición dada, el péptido de la invención podrá ser cualquier péptido (en cuya definición los inventores incluyen a los oligopéptidos y a los polipéptidos) que incluya las secuencias de aminoácidos o una porción o variante de las mismas, tal y como se ha especificado.
Tabla 2: Variantes y motivo de los péptidos según las SEQ ID n.° 1 a 25.
Posición 1 2 3 4 5 6 7 8 9 CSP-001 Código del Péptido T M L A R L A s A SEQ ID 25 Variantes L L L E K I A G I I A E L Y P K Y F F T Y T H K P N M F Y S V V R Posición 1 2 3 4 5 6 7 8 9 ACS-00I Código del Péptido K I M E R I Q E V SEQ ID 3 Variantes M L L L K I A G I A L Y P K L Y F F T Y T H P N M F Y S V V R Posición 1 2 3 4 5 6 7 8 9 BCA-001 Código del Péptido F L G D P P E K L SEQ ID 4 Variantes M E I A G I I A E L Y P K L Y F T Y T H K P N M M F Y S V V R Posición 1 2 3 4 5 6 7 8 9 BCA-002 Código del Péptido A L W A W P S E L SEQ ID 5 Variantes M E I A G I I A L Y P K L Y F F T Y T H P N M M F Y S V V R Posición 1 2 3 4 5 6 7 8 9 CHI3L1-010 Código del Péptido T L Y G M L N T L SEQ ID 6 Variantes M E K I A I I A E L P K Y F F T Y T H K P N M M F Y S V V R Posición 1 2 3 4 5 6 7 8 9 CLIP2-001 Código del Péptido S L N E L R V L L SEQ ID 7 Variantes M 1 A G I I A E L Y P L Y F F T Y T H K P N M M F Y S V V R Posición 1 2 3 4 5 6 7 8 9 SLC01C 1-001 Código del Péptido Y L I A G I I S L SEQ ID 2 Variantes M E K I A G I A E L Y P L Y F F T Y T H K P N M M F S V V R Posición 1 2 3 4 5 6 7 8 9 DTNA-001 Código del Péptido L Q D E A Y Q V SEQ ID 8 Variantes M L L E I A G I I A E L Y P L F F T Y T H P N M M F Y S V V R Posición 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 EGFR-007 Código del Péptido A L A V L S N Y D A SEQ ID 9 Variantes M L L E K I A G I I A E L Y P K L Y F F T Y T H K P N M M F Y S V V R Posición 1 2 3 4 5 6 7 8 9 FABP7-001 Código del Péptido L T F G D V V A V SEQ ID 10 Variantes M L L L E K I A I I A E Y P K L Y F T Y T H K P N M M F Y S V V R Posición 1 2 3 4 5 6 7 8 9 GFAP-001 Código del Péptido N L A Q D L A T V SEQ ID 1 1 Variantes M L L M M F Y S V V R Posición 1 2 3 4 5 6 7 8 9 MLC-001 Código del Péptido s V V E V I A G I SEQ ID 15 Variantes M L L L I A G I E L Y P L Y F F T Y T H K P N M M F Y S V R Posición 1 2 3 4 5 6 7 8 9 NES-001 Código del Péptido G L Q S Q I A Q V SEQ ID 16 Variantes M L L E K I A G I E L Y P L Y F F T Y T H P N M F Y S V V R Posición 1 2 3 4 5 6 7 8 9 NES-002 Código del Péptido s L Q E N L E S L SEQ ID 17 Variantes M K I A G I I A E L Y P Y F F T Y T H K P M M F Y S V V R Posición 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 1 NES-003 Código del Péptido F L F P G T E N Q SEQ ID 18 Variantes M L L E K I A G I I A E L Y L Y T Y H P N M M F Y S V V R Posición 1 2 3 4 5 6 7 8 9 NES-004 Código del Péptido N L A E E L E G V SEQ ID 19 Variantes M L L K I G I I A E L Y P K Y F F T Y T H K P N M M F Y S V V R Posición 1 2 3 4 5 6 7 8 9 NLGN4X-001 Código del Péptido N L D T L M T Y V SEQ ID 1 Variantes M L L E I A G I I A E L Y P K L Y F F Y T H K P N M M F Y S V V R Posición 1 2 3 4 5 6 7 8 9 NR2E 1-001 Código del Péptido I I S E I ? A L SEQ ID 20 Variantes M L E I A G I A E L Y P L Y F F T Y T H P N M M F Y S V V R Posición 1 2 3 4 5 6 7 8 9 NRCAM-001 Código del Péptido G L W H H Q T E V SEQ 1D 21 Variantes M L L - E K I A G 1 1 A E L Y P L Y F F T Y T H K P N M M F Y S V V R Posición 1 2 3 4 5 6 7 8 9 PDPN-001 Código del Péptido T L V G I I V G V SEQ ID 22 Variantes M L L E K I A A E L Y P K L Y F F T Y T H K P N M M F Y S V V R Posición 1 2 3 4 5 6 7 8 9 TNC-001 Código del Péptido A M T Q L L A G V SEQ ID 23 Variantes L L L E I A G I I E L Y P Y F F T Y T H P N M M F Y S V V R Posición 1 2 3 4 5 6 7 8 9 T C-002 Código del Péptido 9 L L A G V F L A SEQ ID 24 Variantes M L L E K I A G I I A E L Y P L Y F F T Y T H K P N M M F Y S V V R Se sabe, además, que los péptidos presentados por MHC de clase II están compuestos de una «secuencia central» con una secuencia de aminoácidos que encaja con un determinado motivo específico de alelo-HLA y, opcionalmente, extensiones N- y/o C-terminal que no interfieren con la función de la secuencia central (es decir, son considerados irrelevantes para la interacción del péptido y todos los clones de linfocitos T, o un subconjunto de ellos, que reconocen al equivalente natural). Las extensiones de los extremos N y/o C pueden tener una longitud de entre 1 y 10 aminoácidos respectivamente, por ejemplo. Estos péptidos pueden ser usados o bien directamente, para cargar moléculas MHC de clase II, o bien la secuencia puede ser clonada en los vectores según la descripción que se detalla más abajo. Teniendo en cuenta que estos péptidos constituyen el producto final del procesamiento de péptidos más largos dentro de la célula, también pueden usarse péptidos más largos. Los péptidos de la invención pueden ser de cualquier tamaño, pero lo habitual es que sean menores de 100.000 en términos de peso molecular, preferiblemente menores de 50.000, más preferiblemente menores de 10.000 y, por regla general, en torno a 5.000. En términos del número de residuos de aminoácido, los péptidos de la invención pueden presentar menos de 1.000 residuos, preferiblemente menos de 500, más preferiblemente menos de 100, más preferiblemente aún menos de 100, y lo ideal sería que se encontraran entre 30 y 8 residuos. En consecuencia, la presente invención también proporciona péptidos y sus variantes en las que el mencionado péptido o variante tiene una longitud total de entre 8 y 100 aminoácidos, de donde se prefiere una longitud de entre 8 y 30, y de donde, a su vez, se prefiere que sea de entre 8 y 16 aminoácidos, a saber, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 o 16.
También se pueden utilizar péptidos más largos. Tal y como se describe en la tabla 2 de arriba, se prefieren los péptidos de 9 y 10 unidades para el complejo principal de histocompatibilidad de clase I y los péptidos de 12 y 15 unidades para el de clase II.
Para los péptidos restringidos a MGC de clase II pueden presentarse varios péptidos diferentes con la misma secuencia central en la molécula MHC. Como la interacción con el linfocito T (colaborador) de reconocimiento se define mediante una secuencia central de entre 9 y 11 aminoácidos, diversas variantes de longitud pueden ser reconocidas por el mismo clon de linfocito T (colaborador). Así, diversas variantes de longitud diferentes de una secuencia de unión central pueden usarse para la carga directa de moléculas MHC de clase II sin necesidad de procesamiento ni cortes adicionales en los extremos amino y carboxiloterminales. De la misma manera, las variantes naturales o artificiales que inducen la reacción cruzada de linfocitos T con un péptido de la invención suelen ser variantes en cuanto a la longitud.
Si un péptido que es mayor de unos 12 residuos de aminoácidos es usado directamente para unirse a una molécula MHC de clase II, se prefiere que los residuos que flanquean la región central de unión de HLA sean los que no afecten de forma sustancial a la habilidad del péptido de unirse específicamente al surco de unión de la molécula MHC de clase II o de presentar al péptido al linfocito T (colaborador). Sin embargo, tal y como se indicó anteriormente, se apreciará que pueden usarse péptidos más largos, por ejemplo, si están codificados por un polinucleótido, ya que estos péptidos más largos pueden ser fragmentados por células presentadoras de antígenos adecuadas. No obstante, en los mismos casos se ha demostrado que la secuencia central que flanquea las regiones puede influir sobre el enlace de los péptidos con la molécula MHC de clase II o sobre la interacción del complejo peptídico MHC dimérico con el TCR en ambas direcciones en comparación con un péptido de referencia con la misma secuencia central. Las estructuras terciarias intramoleculares dentro del péptido (p. ej., formación de bucles) suelen reducir las afinidades hacia el MHC o el TCR. Las interacciones intramoleculares de las regiones de flanqueo con partes del MHC o TCR junto a los surcos de unión del péptido pueden estabilizar la interacción. Estos cambios en la afinidad pueden tener una influencia drástica sobre el potencial de un péptido MHC de clase II para inducir respuestas de la célula T (colaboradora).
También cabe la posibilidad de que los epítopos de MHC de clase I, aunque habitualmente tienen una longitud de entre 8 y 10 aminoácidos, sean generados por procesamiento peptídico de proteínas o péptidos más largos que incluyen el epítopo. Se prefiere que los residuos que flanquean al epítopo real sean de tal forma que no afecten sustancialmente la segmentación proteolítica necesaria para exponer al epítopo durante el procesamiento.
Se prefieren por tanto los péptidos con una secuencia central seleccionada de un grupo compuesto de las secuencias SEQ ID n.° 1, SEQ ID n.° 30con extensiones de 1 a 10 aminoácidos en los extremos C y/o N, prefiriéndose que el número total de estos aminoácidos flanqueadores sea de 1 a 12, más preferentemente de 1 a 10, más preferentemente de 1 a 8, más preferentemente de 1 a 6, más preferentemente de 1 a 4 y aún más preferentemente de 1 a 2, pudiendo distribuirse los aminoácidos flanqueadores en cualquier proporción en los extremos C y N (por ejemplo, se pueden añadir todos los aminoácidos flanqueadores a un extremo o distribuirse equitativamente en ambos extremos o en cualquier otro orden), siempre que el péptido aún sea capaz de unirse a una molécula HLA de la misma forma que el mencionado péptido conforme a cualquiera de las secuencias SEQ ID n.° 1 a SEQ ID n.° 30.
Los aminoácidos flanqueadores también pueden reducir la velocidad de la degradación in vivo de los péptidos de forma que la cantidad del péptido real disponible para los CTL es mayor en comparación con el péptido sin aminoácidos flanqueadores, y así actuando como profármacos.
En consecuencia, la presente invención también proporciona péptidos y variantes de epítopos MHC de clase I, donde el mencionado péptido o variante tiene una longitud total de entre 8 y 100 aminoácidos, de donde se prefiere una longitud de entre 8 y 30, y de donde, a su vez, se prefiere que sea de entre 8 y 16 aminoácidos, a saber, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ó 16.
Por supuesto, el péptido o variante conforme a la presente invención tendrá la habilidad de unirse a una molécula del complejo mayor de histocompatibilidad humano (MHC) de clase I o II. La unión de un péptido o una variante a un complejo MHC se puede probar por métodos conocidos por los expertos como, por ejemplo, los descritos en la literatura de la materia para distintos alelos MHC de clase II (Vogt et al., 1994; Malcherek et al., 1994; Manici et al., 1999; Hammer et al., 1995; Tompkins et al., 1993; Boyton et al., 1998).
En una forma de realización particularmente preferida de la invención el péptido consta, o consta esencialmente de, una secuencia de aminoácidos conforme a las secuencias SEQ ID n°: 1 a SEQ ID n°: 30.
«Constar esencialmente de» significa que un péptido de la presente invención contiene, además de la secuencia según cualquiera de las SEQ ID n° 1 a SEQ ID n° 30 o una variante de la misma, cadenas de aminoácidos adicionales localizadas en el N-terminal o el C-terminal que no necesariamente forman parte del péptido que actúa como un epítopo para epítopos de moléculas MHC.
Sin embargo, estas cadenas pueden ser importantes para proporcionar una introducción eficiente en las células del péptido de la presente invención. En una modalidad de la presente invención, el péptido es una proteína de fusión que comprende, por ejemplo, los 80 aminoácidos N-terminal de la cadena invariante asociada al antígeno HLA-DR (p33, en la siguiente «li»), como se deriva de la base de datos del NCBI, número de registro del GenBank X00497 (Strubin, M. et al 1984).
Además, el péptido o variante puede modificarse más para mejorar la estabilidad y/o la unión a moléculas MHC con el fin provocar una respuesta inmune más potente. Los métodos para dicha optimización de una secuencia de péptido son bien conocidos por los expertos en la materia e incluyen, por ejemplo, la introducción de enlaces peptídicos inversos o enlaces no peptídicos.
En un enlace peptídico inverso, los residuos de aminoácido no están unidos por enlaces peptídicos (-CO-NH-), sino que el enlace peptídico está invertido. Estas formas retro-inverso pueden hacerse mediante métodos conocidos por los expertos en la materia, como los descritos por Meziere y col. (1997), J. Immunol., 159, 3230-3237, incluidos aquí como referencia. Este enfoque implica hacer pseudopéptidos que contengan modificaciones en el esqueleto y no en la orientación de las cadenas laterales. Meziere y col. (1997) demuestran que, para respuestas de linfocitos T colaboradores y de unión a MHC, estos pseudopéptidos son útiles. Los péptidos de tipo retro-inverso, que contienen uniones NH-CO en lugar de uniones peptídicas CO-NH, son mucho más resistentes a la proteólisis.
Ejemplos de enlaces no peptídicos son -CH2-NH, -CH2S-, -CH2CH2-, -CH = CH-, -COCH2-, -CH(OH)CH2-, y -CH2SO-. La patente de Estados Unidos n° 4.897.445 proporciona un método para la síntesis de fase sólida de enlaces no peptídicos (-CH2-NH) en cadenas de polipéptidos que implica la sintetización de polipéptidos mediante procedimientos normalizados y la sintetización de enlaces no peptídicos mediante la reacción de un aminoaldehído y un aminoácido con presencia de NaCNBH3.
Los péptidos que comprenden las secuencias descritas más arriba pueden ser sintetizados con grupos químicos adicionales presentes en los extremos N y/o C de forma que, para así mejorar la estabilidad, la biodisponibilidad y/o la afinidad de los péptidos. Por ejemplo, los grupos hidrofóbicos como los grupos carbobenzoxil, dansil o t-butiloxicarbonil pueden añadirse a los extremos amínicos de los péptidos. De la misma forma, se puede situar un grupo acetil o un grupo 9-fluorenilmetoxi-carbonil en los extremos amínicos de los péptidos. Además, se puede añadir el grupo hidrofóbico, t-butiloxicarbonil , o un grupo amido a los extremos carboxílicos de los péptidos.
Además, los péptidos de la invención pueden sintetizarse para alterar su configuración esférica. Por ejemplo, se puede utilizar el D-isómero de uno o más residuos de aminoácido del péptido, en lugar del L-isómero habitual. Más aún, al menos uno de los residuos de aminoácido de los péptidos de la invención puede sustituirse por uno de los residuos de aminoácido no naturales conocidos por los expertos. Alteraciones como éstas pueden servir para aumentar la estabilidad, la biodisponibilidad y/o la acción de unión de los péptidos de la invención.
De forma similar, un péptido o variante de la invención puede modificarse químicamente mediante la reacción de aminoácidos específicos antes o después de la síntesis del péptido. Los expertos en la materia conocen bien los ejemplos de tales modificaciones y se resumen, por ejemplo, en Lundblad, R., «Chemical Reagents for Protein Modification», 3a edición, CRC Press, 2005, incluido aquí como referencia. Entre las modificaciones químicas posibles de los aminoácidos se encuentran la acilación, la amidinación, la piridoxilación de la Usina, la alquilacion por reducción, la trinitrobencilacion de los grupos amino con ácido 2, 4, 6-trinitrobencenosulfónico (TNBS), la amidación de los grupos carboxílicos y la modificación sulfhidrílica de la cisteína en ácido cisteico mediante la oxidación con ácido perfórmico, la formación de derivados de mercurio, la formación de disulfuros mixtos con otros compuestos de tiol, la reacción con maleimida, la carboximetilación con ácido iodoacético o iodoacetamida y la carbamoilación con cianato en un medio de pH alcalino, entre otras. En este sentido, se remite a la persona especializada al capítulo 15 de Current Protocols In Protein Science, Eds. Coligan et al. (John Wiley & Sons NY 1995-2000) para consultar metodologías más amplias en relación con la modificación química de las proteínas.
La modificación de péptidos y proteínas terapéuticos con macrogol se suele asociar a la prolongación de la semivida circulatoria, mientras que la interconexión de las proteínas con glutaral, diacrilato de polietilenglicol y formaldehído se aplica en la preparación de hidrogeles. La modificación química de los alérgenos para la inmunoterapia se suele lograr mediante la carbamoilación con cianato de potasio.
Una forma de realización preferida de la invención consiste en un péptido o variante, donde el péptido se modifica o incluye enlaces no peptídicos. En general, los péptidos y las variantes (al menos los que contienen enlaces peptídicos entre residuos de aminoácidos) se pueden sintetizar, por ejemplo, mediante el modo de poliamida Fmoc de síntesis de péptidos de fase sólida, tal y como se explica en Lu y col. (1981) y la bibliografía ahí contenida. La protección temporal del grupo N-amino se debe al grupo 9-fluorenilmetiloxicarbonilo (Fmoc). La división repetitiva de este grupo de protección de alta base lábil se lleva a cabo utilizando piperidina al 20% en N, N-dimetilformamida. Las funcionalidades de la cadena lateral pueden estar protegidas como sus butil éteres (en el caso de la serina treonina y de la tirosina), butil ésteres (en el caso del ácido glutámico y del ácido aspártico), derivado del butiloxicarbonilo (en el caso de la Usina y la histidina), derivado del trifilo (en el caso de la cisteína) y de 4-metoxi-2, 3, 6-trimetilbencenosulfonilo (en el caso de la arginina). En donde la glutamina o la asparagina son residuos C-terminales, se hace uso del grupo 4, 4'-dimetoxibencihidrilo para la protección de las funcionalidades amido de la cadena lateral. El apoyo de la fase sólida se basa en un polímero polidimetil-acrilamido constituido a partir de los tres monómeros dimetilacnlamido (monómero esqueleto), bisacriloiletileno diamino (interconector) y acriloilsarcosino metil éster (agente funcionalizador). El agente ligado divisible péptido-resina usado es el derivado del ácido 4-hidroximetil-fenoxiacético ácido lábil. Todos los derivados de aminoácidos se añaden como sus derivados anhídridos simétricos preformados, con la excepción de la asparagina y la glutamina, que se añaden usando un procedimiento inverso de acoplamiento mediado por N, N-diciclohexil-carbodiimida/1 hidroxibenzotriazol. Todas las reacciones de acoplamiento y desprotección son controladas usando procedimientos analíticos de isotina, ácido trinitrobencenosulfónico o ninhidrina. Al completarse la síntesis, los péptidos se separan de la resina con eliminación concomitante de los grupos de protección de la cadena lateral por medio del tratamiento con ácido trifluoroacético al 95% que contenga una mezcla depuradora al 50%. Entre los depuradores utilizados normalmente se incluyen etanoditiol, fenol, anisol y agua. La elección exacta depende de los aminoácidos constituyentes del péptido que se esté sintetizando. También es posible una combinación de metodologías de fase sólida y fase de solución para la síntesis de los péptidos (véase, por ejemplo, Bruckdorfer et al. 2004, y las referencias ahí citadas).
El ácido trifluoroacético se elimina por evaporación en vacío, con la posterior trituración con éter dietílico, proporcionando el péptido crudo. Los depuradores se eliminan por un procedimiento de extracción simple que, en la liofilización de la fase acuosa, proporciona un péptido crudo libre de depuradores. Los reactivos para la síntesis de péptidos se pueden adquirir, por ejemplo, en Calbiochem-Novabiochem (UK) Ltd, Nottingham NG72QJ, UK.
La purificación se puede realizar mediante técnicas, o combinación de técnicas, como la recristalización, la cromatografía de exclusión, la cromatografía de intercambio de iones, la cromatografía de interacción hidrofóbica y, normalmente, la cromatografía líquida de alto rendimiento en fase invertida, utilizando, por ejemplo, separación por gradiente de agua/acetonitril .
El análisis de los péptidos puede efectuarse mediante cromatografía en capa delgada, electroforesis -en particular, electroforesis capilar-, extracción en fase sólida (CSPE), cromatografía líquida de alto rendimiento en fase invertida, análisis de los aminoácidos tras hidrólisis ácida mediante espectrometría de masas por bombardeo con átomos rápidos (FAB) y análisis de espectrometría de masas MALDI y ESI-Q-TOF.
Otro aspecto más de la invención consiste en proporcionar un ácido nucleico (es decir, un polinucleótido) que codifica un péptido o variante de éste de la invención. El polinucleótido puede ser, por ejemplo, ADN, ADNc, PNA, CNA, ARN o combinaciones de los mismos, en forma monocatenaria y/o binaria, o formas nativas o estabilizadas de nucleótidos -como, p. ej., polinucleótidos con un esqueleto de fosforotioato- y puede contener intrones o no contenerlos, siempre que codifique el péptido. Naturalmente, sólo son codificables por el polinucleótido los péptidos que contienen residuos de aminoácidos naturales unidos por enlaces peptídico naturales. Otro aspecto de la invención consiste en proporcionar un vector de expresión capaz de expresar un poiipéptido conforme a la invención.
Se han desarrollado una variedad de métodos para unir polinucleótidos, especialmente ADN, a vectores mediante, por ejemplo, extremos cohesivos complementarios. Por ejemplo, se pueden añadir extensiones complementarias del homopolímero al segmento de ADN que se vaya a insertar en el ADN vector. El vector y el segmento de ADN se unen entonces, mediante un enlace de hidrógeno, entre las colas homopoliméricas complementarias para formar moléculas de ADN recombinante.
Los conectores sintéticos que contengan uno o más sitios de restricción proporcionan un método alternativo para unir el segmento de ADN a los vectores. Los ligadores sintéticos que contienen una variedad de sitios de endonucleasa de restricción se pueden adquirir de diversas fuentes, incluyendo International Biotechnologies Inc, New Haven, CN, EUA.
Un método deseable de modificación del ADN que codifica el polipéptido de la invención utiliza la reacción en cadena de la polimerasa descrita por Saiki y col. (1988). Este método puede ser usado para introducir el ADN en un vector adecuado, por ejemplo, mediante ingeniería en sitios de restricción adecuados, o puede usarse para modificar el ADN de otras formas útiles conocidas por los expertos en la materia. Si se emplean vectores virales, se prefieren vectores de virus de viruela o de adenovirus.
El ADN (o, en el caso de los vectores retrovirales, el ARN) se expresa entonces en un huésped apropiado para producir un polipéptido que comprende el péptido o variante de la invención. Así, el ADN que codifica el péptido o variante de la invención puede ser usado de acuerdo con técnicas conocidas, modificadas convenientemente en vista de las enseñanzas contenidas en la presente invención, para construir un vector de expresión que entonces es usado para transformar una célula huésped apropiada para la expresión y producción del polipéptido de la invención. Dichas técnicas incluyen las descritas en las patentes de EUA n. 0 4.440.859, 4.530.901, 4.582.800, 4.677.063, 4.678.751, 4.704.362, 4.710.463, 4.757.006, 4.766.075 y 4.810.648.
El ADN (o, en el caso de los vectores retrovirales, el ARN) que codifica el polipéptido que constituye el compuesto de la invención puede unirse a una amplia variedad de secuencias de ADN para su introducción en el huésped adecuado. El ADN acompañante dependerá de la naturaleza del huésped, de la forma de introducción del ADN en el huésped y de si se desea la integración o el mantenimiento episomal.
Generalmente, el ADN se inserta en un vector de expresión como, por ejemplo, un vector plasmídico, con la orientación adecuada y el marco de lectura correcto para la expresión. Si es necesario, el ADN puede unirse a las secuencias adecuadas de nucleótidos de control regulador de traducción y transcripción reconocidas por el huésped deseado, aunque tales controles suelen estar disponibles en el vector de expresión. El vector se introduce entonces en el huésped mediante las técnicas habituales. Generalmente, no todos los huéspedes serán transformados por el vector. Por lo tanto, será necesario seleccionar las células huésped transformadas. Una de las técnicas de selección implica la incorporación en el vector de expresión de una secuencia de ADN con los elementos de control necesarios, que codifique un carácter seleccionable en la célula transformada como, por ejemplo, la resistencia a antibióticos.
De forma alternativa, el gen para dicho carácter seleccionable puede estar en otro vector, que es usado para cotransformar la célula huésped deseada.
Las células huésped que han sido transformadas por el ADN recombinante de la invención son cultivadas entonces durante el tiempo necesario y en las condiciones apropiadas, conocidas por los expertos en la materia en vista de las enseñanzas descritas en la presente invención, para permitir la expresión del polipéptido, que entonces puede ser recuperado.
Se conocen muchos sistemas de expresión, entre los que se encuentran bacterias (£. coli y Bacillus subtilis, por ejemplo), levaduras {Saccharomyces cerevisiae, por ejemplo), hongos filamentosos (Aspergillus spec, por ejemplo) y células de plantas, animales e insectos. Preferiblemente, el sistema puede consistir en células de mamífero como células CHO disponibles en ATCC Cell Biology Collection.
Un vector plasmídico celular habitual de mamífero para la expresión constitutiva comprende el promotor SV40 o CMV con una cola de poli-A adecuada y un marcador de resistencia, como la neomicina. Un ejemplo es pSVL, disponible en Pharmacia, Piscataway, NJ, EUA. Un ejemplo de vector de expresión inducible de mamífero es el p SG, que también puede adquirirse en Pharmacia. Los vectores plasmídicos de levadura pRS403-406 y pRS413-416 son útiles y, normalmente, pueden adquirirse en Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA 92037, EUA Los plásmidos pRS403, pRS404, pRS405 y pRS406 son plásmidos de integración de levadura (YIps) e incorporan los marcadores seleccionares de levadura HIS3, TRP1, LEU2 y URA3. Los plásmidos pRS413-416 son plásmidos de centrómero de levadura (Ycps). Los vectores basados en el promotor CMV (de Sigma-Aldrich , por ejemplo) proporcionan una expresión estable o pasajera, una secreción o expresión citoplasmática, y el marcado en los extremos N o C en diversas combinaciones de FLAG, 3xFLAG, c-myc o MAT. Estas proteínas de fusión permiten la detección, la purificación y el análisis de la proteína recombinante. Las fusiones marcadas doblemente proporcionan flexibilidad en la detección.
La región reguladora del fuerte promotor del citomegalovirus humano (CMV) conduce a los niveles de expresión de la proteína constitutiva a una proporción de hasta 1 mg/L en las células COS. Para líneas celulares menos potentes, los niveles proteicos suelen ser de ~0. 1 mg/L. La presencia del origen de replicación SV40 resultará en niveles altos de replicación de ADN en las células COS permisivas de replicación SV40. Los vectores CMV, por ejemplo, pueden contener el origen pMB1 (derivado del pBR322) para la replicación de células bacterianas, el gen b-lactamasa para la selección de la resistencia a la ampicilina en bacterias, hGH polyA, y el origen f1. Los vectores que contienen la secuencia líder de preprotripsina (PPT) pueden dirigir la secreción de las proteínas de fusión FLAG en el medio de cultivo para su purificación utilizando anticuerpos ANTI-FLAG, resinas y placas. Se conocen otros vectores y sistemas de expresión para ser usados con una variedad de células huésped.
La presente invención también hace referencia a una célula huésped transformada con un constructo vector polinucleótido de la presente invención. La célula huésped puede ser procariótica o eucariótica. En algunas circunstancias, las células bacterianas pueden ser preferentemente células huésped procarióticas y, normalmente, son una cepa de E. coli como, por ejemplo, las cepas E. coli DH5, que pueden adquirirse en Bethesda Research Laboratories Inc., Bethesda, MD, EUA, y RR1, que se puede adquirir en la American Type Culture Collection (ATCC) de Rockville, MD, EUA (No ATCC 31343). Las células huésped eucarióticas preferidas incluyen células de levadura, insectos y mamíferos y, con preferencia, células de vertebrados como, por ejemplo, de ratón, rata, mono o líneas celulares humanas de colon o fibroblásticas. Las células huésped de levadura incluyen las YPH499, YPH500 y YPH501, que normalmente pueden adquirirse en Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA 92037, EUA Las células huésped de mamíferos preferidas incluyen células de ovario de hámster chino (CHO), disponibles en la ATCC, como CCL61; células embrionarias de ratón suizo NIH NIH/3T3, disponibles en la ATCC, como CRL 1658; células COS-1 derivadas de riñon de mono, disponibles en la ATCC, como CRL 1650 y 293 células de riñon embrionario humano. Las células de insecto preferida son las células Sf9 que pueden sufrir transfección con vectores de expresión de baculovirus. Una perspectiva general con respecto a la elección de células huésped adecuadas para la expresión se puede encontrar, por ejemplo, en el libro de texto de Paulina Balbás y Argelia Lorence «Methods in Molecular Biology Recombinant Gene Expression, Reviews and Protocols», primera parte, segunda edición, ISBN 978-1-58829-262-9, y otras obras que conozca el experto en la materia.
La transformación de los huéspedes celulares apropiados con un constructo de ADN de la presente invención se lleva a cabo con métodos bien conocidos que suelen depender del tipo de vector usado. Con respecto a la transformación de las células huésped procarióticas, véase, por ejemplo, Cohén y col. (1972) «Proc. Nati. Acad. Sci. » EE. UU, 69, 2110 y Molecular Cloning, A Laboratory Manual de Sambrook y col. (1989) «Cold Spring Harbor Laboratory», Cold Spring Harbor, NY. La transformación de las células de levadura se describe en Methods In Yeast Genetics, A Laboratory Manual de Sherman y col. (1986) «Cold Spring Harbor» NY. También es útil The method of Beggs (1978) «Nature» 275, 104-109. Con respecto a las células de vertebrados, los reactivos útiles para la transfección de dichas células como, por ejemplo, el fosfato cálcico y el dextrán DEAE o las formulaciones de liposomas, se pueden adquirir en Stratagene Cloning Systems, o Life Technologies Inc., Gaithersburg, MD 20877, EUA La electroporación también es útil para la transformación y/o transfección de las células, y se conoce bien su uso para la transformación de células de levadura, bacterias, insectos y vertebrados.
Las células transformadas con éxito, es decir, las que contienen un constructo de ADN de la presente invención, pueden ser identificadas por medio de técnicas conocidas, como la PCR. De forma alternativa, la presencia la proteína en el sobrenadante puede ser detectada usando anticuerpos.
Se apreciará que algunas células huésped de la invención son útiles en la preparación de péptidos de la invención como, por ejemplo, células de bacterias, levadura e insectos. Sin embargo, también podrán ser útiles para ciertos métodos terapéuticos otras células huésped. Por ejemplo, las células presentadora de antígenos, como las células dendríticas, pueden ser usadas para expresar los péptidos de la invención de forma que sean cargadas en las moléculas MHC adecuadas. De esta forma, la presente invención proporciona una célula huésped que comprende un ácido nucleico o un vector de expresión conforme a la invención.
En una forma de realización preferida, la célula huésped es una célula presentadora de antígeno, en particular, una célula dendrítica o una célula presentadora de antígeno. Las células APC cargadas con una proteína de fusión recombinante con ácido prostético fosfatasa (PAP) se investigan actualmente para el tratamiento del cáncer de próstata (Sipuleucel-T) (Small EJ et al 2006; Rini et al 2006).
Otro aspecto de la invención proporciona un método para producir un péptido o su variante, método que comprende el cultivo de una célula huésped y el aislamiento del péptido de la célula huésped o de su medio de cultivo.
En otra modalidad, el péptido, el ácido nucleico o el vector de expresión de la invención se usan en medicina. Por ejemplo, se puede preparar el péptido o su variante para su administración mediante inyección intravenosa, subcutánea, intradérmica, intraperitoneal o intramuscular. Los métodos preferidos para la inyección del péptido son, en orden de preferencia, la subcutánea, la intradérmica, la intraperitoneal, la intramuscular y la intravenosa; y las preferidas para la inyección de ADN son, en orden de preferencia, la intradérmica, la intramuscular, la subcutánea, la intraperitoneal y la intravenosa. Se pueden administrar dosis de péptido o ADN de entre 50 pg y 1, 5 mg y, preferiblemente, de entre 125 \ig y 500 µ?, dependiendo del péptido o ADN correspondientes. En ensayos previos se utilizaron con éxito dosis de este rango (Brunsvig et al 2006; Staehler et al 2007).
En otro aspecto de la presente invención se incluye un método in vitro para producir linfocitos T activados, método que comprende el contacto in vitro de los linfocitos T con moléculas humanas MHC de clase I o II con carga de antígenos, expresadas en la superficie de una célula presentadora de antígenos adecuada durante un periodo de tiempo suficiente para activar el linfocito T de una forma propia de los antígenos, siendo el antígeno un péptido según la invención. Preferiblemente, una cantidad suficiente del antígeno se usa con una célula presentadora de antígeno.
En caso de que se use un epítopo MHC de clase II como antígeno, los linfocitos T son linfocitos colaboradores CD4+, preferiblemente del tipo THi - Las moléculas MHC de clase II se pueden expresar en la superficie de cualquier célula adecuada. Preferiblemente, la célula no expresa de forma natural moléculas MHC de clase II (en cuyo caso, la célula ha sido transfectada para expresar dicha molécula). De forma alternativa, si la célula expresa de forma natural moléculas MHC de clase II, se prefiere que sea defectuosa en los sistemas de procesamiento o presentación de antígenos. En este sentido, es posible que la célula que expresa la molécula MHC de clase II se cargue completamente con un antígeno del péptido antes de activar el linfocito T.
La célula presentadora de antígenos (o célula estimulante) se caracteriza por tener en su superficie una molécula MHC de clase II y, preferentemente, no ser capaz de realizar por sí misma la carga de dicha molécula con el antígeno seleccionado. La molécula MHC de clase II se puede cargar fácilmente con el antígeno seleccionado in vitro.
Preferentemente, la célula del mamífero carece o tiene un nivel o función reducida del transportador peptídico TAP. Entre las células adecuadas que carecen del transportador TAP se incluyen las T2, RMA-s y Drosophilia. TAP es el transportador asociado al procesamiento antigénico.
La línea celular humana T2 con carga peptídica defectuosa está disponible en la ATCC, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, EUA, con el n. 0 de catálogo CRL 1992. La línea 2 de Drosophila de Schneider está disponible en la ATCC, con el número de catálogo CRL 19863. La línea celular del ratón RMA-S se describe en Karre y col. (1985).
Preferiblemente, la célula huésped, antes de la transfección, no expresa moléculas MHC de clase I de forma sustancial. También se prefiere que la célula estimulante exprese una molécula importante proporcionar una señal coestimulante de linfocitos T como, por ejemplo, cualquiera de las B7.1, B7.2, ICAM-1 y LFA 3. Las secuencias de ácidos nucleicos de numerosas moléculas MHC de clase II, así como las moléculas de estimulación conjunta, están disponibles públicamente en las bases de datos GenBank y EMBL.
De forma similar, en el caso de un epítopo MHC de clase I utilizado como un antígeno, los linfocitos T son CTL CD8+.
Si una célula presentadora de antígenos se transfecta para expresar dicho epítopo, preferiblemente la célula constará de un vector de expresión capaz de expresar un péptido que contenga las secuencias SEQ ID n°: 1 a SEQ ID n°: 30 o una secuencia variante de aminoácidos de éstas.
Pueden usarse otros métodos para generar linfocitos T citotóxicos in vitro. Por ejemplo, en los métodos descritos en Peoples y col. (1995) y Kawakami y col. (1992) se utilizan linfocitos destructores de tumores autólogos en la generación de CTL. En Plebanski y col. (1995) se hace uso de linfocitos autólogos de sangre periférica (PLB) en la preparación de linfocitos T citotóxicos. En Jochmus y col. (1997) se describe la producción de linfocitos T citotóxicos autólogos por medio de la sensibilización de células dendríticas de forma reiterada con péptidos o polipéptidos o por medio de la infección con un virus recombinante. Hill y col. (1995) y Jerome y col. (1993) hacen uso de linfocitos B para la producción de CTL autólogos. Adicionalmente, también pueden usarse macrófagos sensibilizados de manera repetida con péptidos o polipéptidos, o infectados con virus recombinante. S. Walter y col. (2003) describen la sensibilización in vitro de células T por medio de células presentadoras de antígenos artificiales (aAPC), que también es adecuado para generar linfocitos T contra el péptido elegido. En este estudio, las aAPC se generaron mediante el acoplamiento de complejos de MHC:péptido preformados a la superficie de partículas de poliestireno (microesferas) mediante bioquímica de biotina:estreptavidina. Este sistema permite el control exacto de la densidad de MHC en las aAPC, lo que permite provocar de forma selectiva respuestas de linfocitos T específicas de antígeno de alta o baja avidez con gran eficiencia de las muestras de sangre. Además de los complejos M HC:péptido, las células aAPC deberían portar otras proteínas con actividad coestimulante como anticuerpos anti-CD28 acoplado a su superficie. Además, dichos sistemas basados en aAPC suelen requerir la adición de factores solubles adecuados como, por ejemplo, interleucina-12 similar a las citocinas.
Las células alogénicas también pueden ser usadas en la preparación de linfocitos T. Este método se describe en detalle en el documento WO 97/26328. Por ejemplo, además de las células de Drosophilia y T2, pueden usarse otras células para presentar antígenos, como las células CHO, las células de insecto infectadas por baculovirus o células diana de bacterias, levadura o infectadas por vaccinia. Adicionalmente, pueden usarse virus de plantas. Véase, por ejemplo, Porta y col. (1994), en donde se describe el desarrollo del virus del mosaico del garbanzo como un sistema de alto rendimiento para la presentación de péptidos foráneos.
Los linfocitos T activados, que son dirigidos contra los péptidos de la invención, son útiles para terapia. Así, otro aspecto de la invención proporciona linfocitos T activados que pueden obtenerse por los métodos anteriores.
Los linfocitos T activados, producidos por el método de arriba, reconocerán selectivamente una célula que expresa de forma aberrante un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos de las secuencias SEQ ID n° 1 a 30.
Con preferencia, el linfocito T reconoce la célula por interacción mediante su TCR con el complejo de péptidos/HLA (por ejemplo, de unión). Los linfocitos T son útiles en un método para matar células diana en un paciente cuyas células diana expresan de forma aberrante un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos de la invención, en el que al paciente se le administra un número efectivo de los linfocitos T activados. Los linfocitos T administrados al paciente pueden derivar del paciente y se activados tal y como se describe más arriba (es decir, son linfocitos T autólogos) De forma alternativa, los linfocitos T pueden no ser del paciente, sino de otro individuo. Evidentemente, se prefiere que se trate de un individuo sano. Por «individuo sano» los inventores entienden un individuo con buena salud en general, preferentemente con un sistema inmune competente y, más preferentemente, que no sufra ninguna enfermedad que pueda ser fácilmente detectable.
In vivo, las células diana para los linfocitos T CD4+ conforme a la presente invención pueden ser células del tumor (que, a veces, expresa MHC de clase II) y/o células del estroma que rodean al tumor (células tumorales) (que, a veces, también expresan MHC de clase II); (Dengjel et al., 2006)).
Los linfocitos T de la presente invención se pueden usar como ingredientes activos de una composición terapéutica. De esta forma, la invención también proporciona un método para destruir células diana en un paciente cuyas células diana expresan de forma aberrante un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos de la invención, método que comprende la administración al paciente de un número efectivo de linfocitos T como se define más arriba.
En el término «expresado de forma aberrante» los inventores también implican que el polipéptido está sobreexpresado en comparación con los niveles normales de expresión o que el gen es silencioso en el tejido del que deriva el tumor pero sí se expresa en el tumor. Con el término «sobreexpresado» los inventores implican que el polipéptido está presente a un nivel al menos 1, 2 veces mayor que en tejido normal. Preferentemente a un nivel 2 veces mayor y, más preferentemente, a un nivel 5 ó 10 veces mayor que en el tejido normal.
Se pueden obtener linfocitos T por métodos conocidos por los expertos, por ejemplo, los descritos más arriba.
Los expertos en la materia conocen bien los protocolos de este traslado conocido como «traslado adoptivo» de linfocitos T, y se pueden encontrar, por ejemplo, en: (Rosenberg et al., 1987; Rosenberg et al., 1988; Dudley et al., 2002; Yee et al., 2002; Dudley et al., 2005); revisados en: (Gattinoni et al., 2006) y en: (Morgan et al., 2006).
Cualquier molécula de la invención, es decir, el péptido, el ácido nucleico, el vector de expresión, la célula, los CTL activados, el receptor de linfocitos T o el ácido nucleico que lo codifica, es útil para el tratamiento de trastornos, caracterizados por células que escapan a la respuesta inmune. Por lo tanto, cualquier molécula de la presente invención puede ser usada como medicamento o en la fabricación de un medicamento. La molécula se puede usar por sí misma o en combinación con otra(s) molécula(s), de la invención o no.
Preferiblemente, el medicamento de la presente invención es una vacuna. Puede administrarse directamente al paciente, en el órgano afectado o sistémicamente, de forma intradérmica, intramuscular, subcutánea, intraperitoneal e intravenosa; o aplicarse ex vivo en células del paciente o de una línea celular humana que después se administra al paciente; o usada in vitro para seleccionar una subpoblación de células inmunes del paciente, al que luego se le vuelven a administrar. Si el ácido nucleico se administra in vitro en las células, puede ser útil para las células su transfección para coexpresar citocinas como la interleucina-2. El péptido podrá ser sustancialmente puro; o estar combinado con un adyuvante que estimule la respuesta inmune (véase más abajo) o usado en combinación con citocinas estimuladoras de la respuesta inmune; o ser administrado con un sistema de liberación apropiado como, por ejemplo, liposomas. El péptido también podrá conjugarse con un vehículo apropiado como la hemocianina de lapa californiana (KLH) o el mañano (véase el documento WO 95/18145 y Longenecker y col. (1993). El péptido también podrá estar etiquetado, o ser una proteína de fusión o ser una molécula híbrida. Los péptidos cuya secuencia se da en la presente invención han de estimular los linfocitos T CD4 o CD8. Sin embargo, la estimulación de CTL CD8 es más eficiente con la ayuda de linfocitos T colaboradores CD4. Así, para epítopos MHC de clase I que estimulan CTL CD8, las secciones o la pareja de fusión de una molécula híbrida proporciona de forma adecuada epítopos que estimulan a los linfocitos T CD4+. Los epítopos estimulantes de CD4 y CD8 son conocidos por los expertos en la materia e incluyen a los identificados en la presente invención.
En un aspecto, la vacuna comprende al menos un péptido que tenga su secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID n.° 1 o 20 y, al menos, un péptido adicional; preferiblemente, entre 2 y 50; con mayor preferencia aún, entre 2 y 25; más preferiblemente, entre 2 y 15; y, con absoluta preferencia, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 ó 13 péptidos. El/los péptido(s) pueden derivar de uno o más TAA específicos y pueden unirse a moléculas MHC de clase I y/o II.
El polinucleótido puede ser substanciálmente puro o estar contenido en un vector o en un sistema de liberación adecuados. El ácido nucleico puede ser ADN, ADNc, PNA, CNA, ARN o una combinación de los mismos. Los métodos para diseñar e introducir dicho ácido nucleico son bien conocidos en el sector. Algunos autores, como por ejemplo Pascólo S. 2006; Stan R. 2006, o A Mahdavi 2006, ofrecen una visión general al respecto. Las vacunas de polinucleótidos son sencillas de preparar, pero el modo de acción de estos vectores de cara a inducir una respuesta inmune no se comprende del todo. Entre los vectores y los sistemas de liberación adecuados se encuentran los el ADN y/o el ARN viral, como los sistemas basados en adenovirus, virus de la vaccinia, retrovirus, virus del herpes, virus adenoasociados o híbridos que contengan elementos de más de un virus. Los sistemas de liberación no virales incluyen lípidos catiónicos y polímeros catiónicos, conocidos por los expertos en la liberación de ADN. La liberación física por medio de una «pistola genética», por ejemplo, también puede usarse. El péptido o péptidos codificados por el ácido nucleico puede ser una proteína de fusión con un epítopo que estimule los linfocitos T para el CDR opuesto respectivo, como se indicó anteriormente.
El medicamento de la invención también puede incluir uno o más adyuvantes. Los adyuvantes son sustancias que mejoran o potencian, de forma no específica, la respuesta inmune (por ejemplo, las respuestas inmunes a un antígeno mediadas por CTL y linfocitos T [TH] colaboradores) y por eso se considerarían útiles en el medicamento de la presente invención. Entre los adyuvantes adecuados se incluyen 1018 ISS, sales de aluminio, Amplivax, AS15, BCG, CP-870, 893, CpG7909, CyaA, dSLIM, flagelina o ligandos TLR5 derivados de la flagelina, ligando FLT3, GM-CSF, IC30, IC31, Imiquimod (ALDARA), resimiquimod, ImuFact IMP321, interleucinas como IL-2, IL-13, IL-21, interferón-alfa o beta o derivados pegilados del mismo, IS Patch, ISS, ISCOMATRIX, ISCOM, Juvlmmune, LipoVac, MALP2, MF59, lípido monofosforil A, Montanide IMS 1312, Montanide ISA 206, Montanide ISA 50V, Montanide ISA-51, emulsiones de agua en aceite y aceite en agua, OK-432, OM-174, OM-197-MP-EC, ONTAK, OspA, sistema de vectores PepTel®, microparticulas de PLG y dextrano, resiquimod, SRL172, virosomas y otras partículas similares a virus, YF-17D, VEGF trap, R848, beta-glucano, Pam3Cys, estimulón QS21 de Aquila que deriva de la saponina, mimetismo de pared celular bacteriana sintética y extractos micobacterianos, y otros adyuvantes patentados como Detox. Quil de Ribi o Superfos. Se prefieren los adyuvantes como el GM-CSF o el adyuvante de Freund. Se han descrito diversos adyuvantes inmunológicos (por ejemplo, MF59) específicos de células dendríticas y su preparación (Dupuis M et al 1998; Allison 1998). También se pueden usar citocinas. Diversas citocinas se han vinculado directamente a una influencia en la migración de células dendríticas a los tejidos linfoides (por ejemplo, TNF-D), acelerando la maduración de las células dendríticas a células presentadoras de antígenos eficientes para linfocitos T (por ejemplo, GM-CSF, IL-1 e IL-4) (patente de EUA n.° 5.849.589, incluidas aquí específicamente como referencia) y actuando como inmunoadyuvantes (por ejemplo, IL-12, IL-15, IL-23, IL-7, IFN-alfa, IFN-beta) (Gabrilovich et al 1996).
También se sabe que los oligonucleótidos inmunoestimulantes de CpG potencian los efectos de los adyuvantes en el entorno de una vacuna. Sin restringirse a consideraciones teóricas, los oligonucleótidos de CpG actúan activando el sistema inmune innato (no adaptativo) mediante receptores Toll-Like (TLR), principalmente TLR9. La activación de TLR9 impulsada por CpG potencia las respuestas celular y humoral específicas de antígeno a una amplia variedad de antígenos, incluyendo antígenos de proteínas o péptidos, virus vivos o destruidos, vacunas de células dendríticas, vacunas celulares autólogas y conjugados de polisacáridos en vacunas tanto profilácticas como terapéuticas. Más destacable aún es el hecho de que potencia la maduración y diferenciación de las células dendríticas, lo que da como resultado una activación potenciada de células THi y una fuerte generación de CTL, incluso en ausencia de la ayuda de linfocitos T CD4. El sesgo muestral de TH1 inducido por la estimulación de TLR9 se mantiene incluso en presencia de adyuvantes de vacuna como el alum o el adyuvante de Freund incompleto (IFA) que normalmente promueve un sesgo muestral de TH2. Los oligonucleótidos de CpG muestran una actividad de adyuvante aún mayor cuando se formulan o se administran conjuntamente con otros adyuvantes o en formulaciones como micropartículas, nanopartículas, emulsiones lipídicas o formulaciones similares, que son especialmente necesarias para inducir una respuesta fuerte cuando el antígeno es relativamente débil. También aceleran la respuesta inmune y permiten que las dosis de antígeno se reduzcan en unos dos órdenes de magnitud, con respuestas de anticuerpo comparables a la dosis completa de vacuna sin CpG en algunos experimentos (Krieg y col., 2006). La patente de EUA n. 0 6. 406. 705 B1 describe el uso combinado de oligonucleótidos de CpG, adyuvantes sin ácidos nucleicos y un antígeno para inducir una respuesta inmune específica de antígeno. Un componente preferido de la composición farmacéutica de la presente invención es el antagonista del TLR9 del CpG conocido como dSLIM (inmunomodulador en horquilla doble), fabricado por Mologen (Berlín, Alemania). También es posible utilizar otras moléculas de unión al TLR como los TLR 7, TLR 8 y/o TLR 9 de unión al ARN.
Entre los ejemplos de adyuvantes útiles también se incluyen CpG modificados químicamente (por ejemplo, CpR, Idera), análogos de ARNds como Poly (l:C) y AmpliGen, ARN o ADN bacteriano sin CpG así como anticuerpos y moléculas pequeñas inmunoactivas como ciclofosfamida, sunitinib, bevacizumab, celebrex, NCX-4016, sildenafil, tadalafil, vardenafil, sorafenib, temozolomida, temsirolimus, XL-999, CP-547632, pazopanib, VEGF Trap, ZD2171, AZD2171, anti-CTLA4 y SC58175, que pueden actuar de forma terapéutica y/o como adyuvantes. El experto en la materia puede determinar fácilmente las cantidades y concentraciones de adyuvantes y aditivos útiles en el contexto de la presente invención sin necesidad de experimentación excesiva. Los adyuvantes preferidos son dSLIM, interferón-alfa y beta, CpG7909, IC31, Imiquimod, resimiquimod, PeviTer, RNA, tadalafil, temozolomida y Juvlmmune.
Los adyuvantes preferidos son dSLIM, BCG, OK432, imiquimod, resimiquimod, GM-CSF, interferón alfa, PeviTer y Juvlmmune o combinaciones de los mismos.
En una modalidad preferida de la composición farmacéutica conforme a la invención, el adyuvante se selecciona del grupo constituido por factores estimulantes de la colonia, como el factor estimulante de colonias granulocito-macrófago (GM-CSF, sargramostim), imiquimod, resiquimod e interferón alfa.
En una modalidad aún más preferida de la composición farmacéutica conforme a la invención, el adyuvante es imiquimod o resimiquimod. En una modalidad aún más preferida de la composición farmacéutica conforme a la invención, el adyuvante es la combinación de GM-CSF e imiquimod.
Esta composición se administra por vía parenteral como, por ejemplo, subcutánea, intradérmica, intramuscular o por vía oral. Para ello, los péptidos y, opcionalmente, otras moléculas son disueltos o suspendidos en un vehículo farmacéuticamente aceptable y preferiblemente acuoso. Además, la composición puede contener excipientes como soluciones reguladoras, aglutinantes, agentes blásticos, diluyentes, aromas, lubricantes, etc. Los péptidos también pueden administrase junto con substancias estimulantes de la respuesta inmune, como las citocinas. Una lista completa de excipientes que pueden usarse para esta composición aparece, por ejemplo, en A. Kibbe, «Handbook of Pharmaceutical Excipiente», 3. Ed., 2000, American Pharmaceutical Association and pharmaceutical press. La composición puede usarse para la prevención, profilaxis y/o terapia de enfermedades adenomatosas o cancerosas.
La presente invención proporciona un medicamento que resulta útil en el tratamiento contra el cáncer, en concreto contra el glioma y el cáncer cerebral, cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer de esófago, cáncer colorrectal, cáncer renal, cáncer de páncreas, carcinomas escamocelulares y neoplasmas queratinocíticos de la piel, leucemia, cáncer de pulmón, cáncer de ovarios y melanoma.
La presente invención incluye un equipo que comprende: (a) un envase que contiene una composición farmacéutica como la descrita más arriba, en forma liofilizada o en solución; (b) opcionalmente un segundo envase con una solución diluyente o reconstituyente para la formulación liofilizada; y (c) opcionalmente, instrucciones para (i) el uso de la solución o (ii) la reconstitución y/o el uso de la formulación liofilizada.
El equipo puede constar, además, de uno o varios (iii) amortiguadores, (iv) diluyentes, (v) filtros, (vi) agujas o (v) jeringuillas. Se prefiere que el contenedor sea una botella, un vial, una jeringuilla o un tubo de ensayo; puede ser multiuso. Se prefiere que la composición farmacéutica esté liofilizada.
Los equipos de la presente invención comprenden, preferiblemente, una formulación liofilizada de la presente invención en un contenedor adecuado e instrucciones para su reconstitución y/o uso. Entre los contenedores apropiados se incluyen, por ejemplo, botellas, viales (viales de cámara doble, p. ej. ), jeringuillas (como jeringuillas de cámara doble) y tubos de ensayo. El contenedor puede estar hecho de una variedad de materiales, como vidrio o plástico. Se prefiere que el equipo y/o el contenedor disponga(n) de instrucciones relacionadas con el contenedor que indiquen cómo utilizarlos y/o realizar la reconstitución. Por ejemplo, la etiqueta puede indicar que la formulación liofilizada debe reconstruirse con las concentraciones de péptido descritas más arriba. La etiqueta también puede indicar que la formulación es útil o está destinada para su administración subcutánea.
El recipiente que contenga la formulación puede ser un vial multiuso, lo que permite administraciones repetidas (de 2 a 6 administraciones, p. ej. ) de la formulación reconstituida. El equipo puede constar, además, de un segundo contenedor que comprenda un diluyente adecuado (por ejemplo, una solución de bicarbonato sódico).
Al mezclar el diluyente y la formulación liofilizada, la concentración final de péptidos en la formulación reconstituida es, preferiblemente, de al menos 0, 15 mg/mL/péptido (= 75pg) y, preferiblemente, no mayor de 3 mg/mL/péptido (= 1500pg). El equipo también puede incluir otros materiales deseables desde un punto de vista comercial y de uso, como otros amortiguadores, diluyentes, filtros, agujas, jeringuillas u otros añadidos con instrucciones de uso.
Los equipos de la presente invención pueden constar de un recipiente único que contenga la formulación de las composiciones farmacéuticas conforme a la presente invención junto con otros componentes o sin ellos (por ejemplo, otros compuestos o composiciones farmacéuticas de estos otros compuestos), o, por el contrario, pueden constar de recipientes distintos para cada uno de los componentes.
Preferiblemente, los equipos de la invención incluyen una formulación de la invención embalada para su uso en combinación con la administración conjunta de un segundo compuesto (como adyuvantes [p. ej., G -CSF], un agente quimioterapéutico, un producto natural, una hormona o un antagonista, un inhibidor de la angiogénesis, un agente de inducción de apóptosis o un quelante) o una composición farmacéutica de la misma. Los componentes del equipo pueden estar previamente combinados o bien cada componente puede estar en un contenedor distinto antes de la administración al paciente. Los componentes del equipo pueden proporcionarse en una o varias soluciones líquidas, preferiblemente en una solución acuosa y, con mayor preferencia, en una solución acuosa estéril. Los componentes del equipo también se pueden proporcionar en forma de sólido, que se podrán convertir en líquidos mediante la adición de disolventes adecuados, que se suministrarán, preferiblemente, en un contenedor distinto.
El contenedor de un equipo terapéutico puede ser un vial, un tubo de ensayo un matraz, una botella, una jeringuilla o cualquier otro recipiente que pueda contener un sólido o un líquido. Normalmente, cuando hay más de un componente, el equipo contendrá un segundo vial u otro contenedor, lo que permite la dosificación por separado. El equipo también puede contener otro recipiente con un líquido farmacéuticamente aceptable. Preferiblemente, el equipo terapéutico contendrá una serie de aparatos (por ejemplo, una o varias agujas, jeringuillas, cuentagotas, pipetas, etc. ) que permitan la administración de los agentes de la invención que componen el presente equipo.
La presente formulación es aquella adecuada para la administración de los péptidos por cualquier vía adecuada como la oral (enteral), nasal, oftal, subcutánea, intradérmica, intramuscular, intravenosa o transdérmica. Se prefiere la administración subcutánea y, con mayor preferencia, la intradérmica. Se puede utilizar una bomba de infusión para la administración.
Puesto que los péptidos de la invención derivados de BCA, CLIP2, DTNA, NLGNAX, NR2E1, NRCAM y PDPN se aislaron del glioblastoma, el medicamento de la invención se usa preferentemente para tratar el glioblastoma.
A continuación, se describirá la presente invención en los siguientes ejemplos y figuras, los cuales ejemplifican las formas de realización preferidas de la misma, sin que sean, sin embargo, las únicas posibles. Para cumplir con los objetivos de la presente invención, todas las referencias aquí citadas se incorporan íntegramente.
Figura 1: Exemplary mass spectrum from IGF2BP3-001 demonstrating its presentation on primary tumor sample GB6010. NanoESI-LCMS was performed on a peptide pool eluted from the GBM sample GB6010. The mass chromatogram for m/z 536.3238 ± 0.001 Da, z = 2 shows a peptide peak at the retention time 49.89 min. B) The detected peak in the mass chromatogram at 48.76 min revealed a signal of m/z 536.3239 in the MS spectrum. C) A collisionally induced decay mass spectrum from the selected precursor m/z 536.3239 recorded in the nanoES l-LCMS experiment at the given retention time confirmed the presence of IGF2BP3-001 in the GB6010 tumor sample. D) The fragmentation pattern of the synthetic IGF2BP3-001 reference peptide was recorded and compared to the generated natural TUMAP fragmentation pattern shown in C for sequence verification .
La figura 2a muestra los perfiles de expresión del ARNm de proteínas seleccionadas en tejidos normales y en 19 muestras de glioblastoma.
La figura 2b muestra los perfiles de expresión del ARNm de proteínas seleccionadas en tejidos normales y en 19 muestras de glioblastoma.
La figura 3 muestra la inmunogenicidad in vitro de ejemplo de los TUMAP IMA950 de clase I.
La figura 4 muestra las afinidades de unión de ejemplo de los péptidos HLA de clase I de la invención a A*02.
Las SEQ ID n.° 1 a 24 muestran las secuencias de los péptidos asociados a tumor preferidos conforme a la presente invención.
EJEMPLOS Los péptidos FTELTLGEF (HLA-A1; laboratorios PolyPeptide Laboratories, Wolfenbüttel, Alemania), LMLGEFLKL (HLA-A2; Clinalfa, Sissach, Suiza), y EPDLAQCFY (HLA-B35; laboratorios PolyPeptide Laboratories) se obtuvieron todos con calidad farmacéutica.
EJEMPLO 1: Identificación de péptidos asociados a tumor presentados en la superficie celular Muestras de tejido Los tejidos de pacientes de tumor fueron suministrados por el Hospital Cantonal Universitario de Ginebra (laboratorio médico-oncológico de inmunología de tumor) y la Clínica Universitaria de Neurocirugía de Heidelberg (laboratorio de biología molecular). Se obtuvieron los consentimientos por escrito de todos los pacientes antes de proceder a la cirugía. Se congelaron por choque los tejidos en nitrógeno líquido, inmediatamente después de la cirugía, y se guardaron hasta el aislamiento de los TUMAP a -80 °C.
Aislamiento de péptidos HLA de muestras de tejido Las mezclas de péptidos HLA derivados de las muestras de tejido congelado por choque se obtuvieron mediante precipitación inmune de tejidos sólidos conforme a un protocolo ligeramente modificado (Falk, K. et al., 1991; Seeger, F.H. et al. T 1999) utilizando el anticuerpo BB7.2 específico de HLA*02 o el anticuerpo W6/32 específico de HLA-A, -B, -C, sefarosa activada por CNBr, tratamiento ácido y ultrafiltración.
Métodos: Las mezclas de péptidos HLA obtenidas se separaron conforme a su hidrofobicidad mediante cromatografía en fase invertida (sistema Acquity UPLC, Waters) y los péptidos de elución se analizaron en un espectómetro de masas híbrido LTQ- Orbitrap (ThermoElectron), equipado con una fuente ESI. Las mezclas de péptidos se cargaron directamente en la columna analítica microcapilar de silicio fundido (75 µ? de intradérmica x 250 mm) embalados con 1, 7 µ?t? de material C18 de fase invertida (Waters), aplicando una tasa de flujo de 400 nl_ por minuto. Posteriormente, los péptidos se separaron utilizando un gradiente binario de 180 minutos en dos pasos del 10% al 33% B con tasas de flujo de 300 nl_ por minuto. El gradiente estaba compuesto de disolvente A (0,1% de ácido fórmico en agua) y disolvente B (0, 1% de ácido fórmico en acetonitrilo). Se utilizó un capilar de vidrio con revestimiento de oro (PicoTip, New Objective) para la introducción en la fuente micro-ESI. El espectómetro de masas LTQ-Orbitrap se utilizó en el modo dependiente de datos utilizando una estrategia TOP5. En resumen, se inició un ciclo de escaneado con un escaneo completo de gran exactitud de masa, realizados en Orbitrap (R = 30 000), seguido de escaneos MS/MS, también en Orbitrap (R = 7500) en los 5 iones precursores más abundantes con exclusión dinámica de iones previamente seleccionados. Los espectros de masa en tándem fueron interpretados con SEQUEST y control manual adicional. La secuencia peptídica identificada se aseguró mediante comparación de la pauta de fragmentación peptídica natural generada con la pauta de fragmentación de un péptido de referencia sintético de secuencia idéntica. La figura 1 muestra un espectro ejemplar obtenido de tejido de tumor para el péptido IGF2BP3-001 asociado a MHC de clase I y su perfil de elución en el sistema UPLC.
EJEMPLO 2 Perfil de expresión de los genes que codifican los péptidos de la invención No todos los péptidos identificados como presentados en la superficie de células tumorales por moléculas MHC son adecuados para la inmunoterapia, porque la mayoría de estos péptidos derivan de proteínas celulares normales expresadas por muchos tipos celulares. Sólo algunos de estos péptidos están asociados a tumor y tienen probabilidad de inducir linfocitos T con una alta especificidad de reconocimiento para el tumor del que derivaron. Con el fin de identificas dichos péptidos y minimizar el riesgo de autoinmunidad inducido por la vacunación, los inventores se centraron en aquellos péptidos que derivan de proteínas que están sobreexpresadas en las células tumorales en comparación con la mayoría de los tejidos normales.
El péptido ideal se derivará de una proteína que es única para el tumor y que no está presente en ningún otro tejido. Con el fin de identificar péptidos derivados de genes con un perfil de expresión similar al ideal, los péptidos identificados se asignaron a las proteínas y a los genes, respectivamente, de los que se derivaron y se generaron perfiles de expresión de estos genes.
Fuentes de ARN y preparación Se utilizaron muestras de tejido obtenido quirúrgicamente, suministradas por dos clínicas (véase el ejemplo 2) con el consentimiento previo por escrito de cada paciente. Los especímenes de tejido de tumor se congelaron rápidamente en nitrógeno líquido inmediatamente después de la cirugía y más adelante se homogeneizaron con mortero y mano de mortero bajo nitrógeno líquido. El ARN total se preparó a partir de estar muestras utilizando TRIzol (Invitrogen, Karlsruhe, Alemania), seguido de una limpieza con RNeasy (QIAGEN, Hilden, Alemania); ambos métodos se efectuaron conforme al protocolo del fabricante.
El ARN total de tejidos humanos sanos se obtuvo de forma comercial (Ambion, Huntingdon, Reino Unido; Clontech, Heidelberg, Alemania; Stratagene, Amsterdam, Holanda; BioChain, CA, EUA). El ARN de varios individuos (entre 2 y 123) se mezcló de tal forma que al ARN de cada individuo se le dio el mismo peso. Los leucocitos se aislaron de muestras de sangre de 4 voluntarios sanos.
La calidad y la cantidad de todas las muestras de ARN se calcularon con Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent, Waldbronn, Alemania), utilizando el equipo de ARN 6000 Pico LabChip (Agilent).
Experimentos de micromatrices El análisis de la expresión génica de todas las muestras de ARN de tejido normal y tumoral se efectuó con micromatrices de oligonucleótidos Affymetrix Human Genome (HG) U133A o HG-U133 Plus 2. 0 (Affymetrix, Santa Clara, CA, EUA). Todos los pasos se llevaron a cabo con arreglo al Affymetrix manual. En breve, el ADNc bicatenario se sintetizó a partir de 5 - 8 ÍQ del ARN total, utilizando SuperScript RTII (Invitrogen) y el cebador oligo-dT-T7 (MWG Biotech, Ebersberg, Alemania) como se describe en el manual. La transcripción in vitro se efectuó con el equipo BioArray High Yield RNA Transcript Labelling Kit (ENZO Diagnostics, Inc., Farmingdale, NY, EUA) para las matrices U133A o con el equipo GeneChip IVT Labelling Kit (Affymetrix) para las matrices U133 Plus 2. 0, seguido de la fragmentación, hibridación y tinción de ARNc con estreptavidina-ficoeritrina y anticuerpo biotinilado anti-estreptavidina (Molecular Probes, Leiden, Holanda). Las imágenes se escanearon con el escáner Agilent 2500A GeneArray Scanner (U133A) o el Affymetrix Gene-Chip Scanner 3000 (U133 Plus 2. 0), y se analizaron los datos con el programa GCOS (Affymetrix), utilizando las disposiciones predeterminadas en todos los parámetros. Para la normalización, se usaron 100 genes de mantenimiento proporcionados por Affymetrix. Los valores de expresión relativa se calcularon a partir de los ratios de los registros de señal obtenidos del programa y la muestra normal de riñon se estableció arbitrariamente en 1.0.
Los perfiles de expresión de los genes fuente de la presente invención altamente sobreexpresados en el glioblastoma de la presente invención se muestran en la figura 2.
EJEMPLO 3: Inmunogenicidad in vitro para péptidos IMA950 presentados por HC de clase I Para obtener información referente a la inmunogenicidad de los TUMAP de la presente invención, procedimos a investigar con ayuda de una plataforma arraigada de estimulación in vitro ya descrita con anterioridad (Walter, S, Herrgen, L, Schoor, O, Jung, G, Wernet, D, Buhring, HJ, Rammensee, HG, and Stevanovic, S; 2003, Cutting edge: predetermined avidity of human CD8 T cells expanded on calibrated MHC/anti-CD28-coated microspheres, J. Immunol., 171, 4974-4978). De esta forma, pudimos mostrar una inmunogenicidad considerablemente alta para 13 TUMAP restringidos a HLA-A*0201 de la invención (en >= 50% de los donantes de la prueba no se pudieron detectar CTL específicos de TUMAP), lo que demuestra que estos péptidos son epítopos de linfocitos T contra los que existen linfocitos T precursores CD8+ en humanos (tabla 3).
Sensibilización in vitro de linfocitos T CD8 + Con el fin de efectuar estimulaciones in vitro mediante células artificiales presentadoras de antígeno (aAPC) cargadas con complejo de péptido-MHC y anticuerpo anti-CD28, aislamos, en primer lugar, células PBMC (células mononucleares de sangre periférica) de capas de leucocitos frescas de HLA-A*02 + utilizando medio de separación de gradiente de densidad estándar (PAA, Cólbe, Alemania). Las capas de leucocitos se obtuvieron del banco de sangre de Tubinga y del Katharinenhospital de Stuttgart. Las células PBMC aisladas se incubaron durante la noche en medio de linfocitos T (TCM) para la sensibilización in vitro humana consistente en RPMI-Glutamax (Invitrogen, Karlsruhe, Alemania) con un suplemento de suero AB humano inactivado por calor al 10% (PAA, Cólbe, Alemania), 100 U/ml de penicilina / 100 pg/ml de estreptomicina (Cambrex, Verviers, Bélgica). 1 mM de piruvato de sodio (CC Pro, Neustadt, Alemania) y 20 pg/ml de gentamicina (Cambrex). Se aislaron los linfocitos CD8+ utilizando el equipo de selección positiva MACS CD8+ (Miltenyi, Bergisch Gladbach, Alemania) conforme a las instrucciones del fabricante. Los linfocitos T CD8+ obtenidos se incubaron hasta su uso en TCM suplementado con 2, 5 ng/ml de IL-7 (PromoCell, Heidelberg, Alemania) y 10 U/ml de IL-2 (Chiron, Múnich, Alemania). La generación de esferas revestidas de pMHC/anti-CD28, las estimulaciones de linfocitos T y la lectura se efectuaron como se describió anteriormente (Walter et al., 2003) con pequeñas modificaciones. Brevemente, se generaron moléculas HLA-A*0201 recombinantes biotiniladas sin dominio transmembranoso y biotiniladas en el terminal carboxi de la cadena pesada siguiendo un método descrito en documento de Altman y col. sobre el análisis fenotípico de linfocitos T específicos de antígeno (Altman et al., 1996). El Ac 9,3 del CD28 anti-humano de lgG2a de ratón purificado y de estimulación conjunta (Jung et al., 1987) fue biotinilado químicamente usando sulfo-N-hidroxisuccinimidobiotina, siguiendo las recomendaciones del fabricante (Perbio, Bonn, Alemania). Las esferas utilizadas consistían en partículas de poliestireno revestidas de estreptavidina de 5, 60 µ?t? de grosor (Bangs Laboratories, Illinois, EUA). Como controles positivo y negativo de pMHC se usaron A*0201 /MLA-001 (péptido ELAGIGILTV de Melan-A/M ART-1 modificado) y A*0201/DDX5-001 (YLLPAIVHI de DDX5) o A*0201 /HBV-001 (FLPSDFFPSV), respectivamente.
Se revistieron 800. 000 esferas / 200 µ? en placas de 96 pocilios en presencia de 600 ng de anti-CD28 de biotina y 200 ng de biotina-pM HC relevante (esferas de alta densidad) o 2 ng de MHC relevante más 200 ng de MHC irrelevante (archivo de pMHC) (esferas de baja densidad). Se iniciaron las estimulaciones en placas de 96 pocilios mediante la coincubación de 1 x 106 de linfocitos T CD8+ con 2 x 105 esferas revestidas y lavadas en 200 µ? de TCM suplementadas con 5 ng/ml de IL-12 (PromoCell) durante 3 - 4 días, a una temperatura de 37 °C. La mitad del medio se intercambió entonces por TCM fresco suplementado con 80 U/ml de IL-2 y la incubación continuó durante 3 - 4 días a 37 "C. Este ciclo de estimulación se efectuó tres veces en total. Finalmente, se realizaron análisis tetraméricos con tetrámeros fluorescentes de MHC, producidos como se describe en el documento de Altman y col. (Altman et al., 1996), más un clon CD8-FITC SK1 de anticuerpo (BD, Heidelberg, Alemania) en un FACSCalibur de cuatro colores (BD). Las células específicas de péptido se calcularon como porcentaje del total de linfocitos T CD8 + . El análisis tetramérico se evaluó con el programa informático FCS Express (De Novo Software). La sensibilización in vitro de linfocitos CD8+ de tetrámero+ específicos se detectó mediante la selección adecuada y mediante la comparación con estimulaciones de control negativo. La inmunogenicidad de los antígenos concretos se pudo detectar si se detectó que, al menos un pocilio evaluable estimulado in vitro de un donante sano, contenía una línea celular específica de linfocitos T CD8 + tras la estimulación in vitro (es decir, este pocilio contenía, al menos, un 1% de tetrámero+ entre los linfocitos T CD8+ y el porcentaje de células de tetrámero+ específicas era, al menos, 10 veces la mediana de las estimulaciones de control negativo).
Inmunogenicidad in vitro para péptidos IMA950 La inmunogenicidad in vitro de 10 péptidos HLA de clase I de 10 probados se pudo demostrar mediante la generación de líneas de linfocitos T específicas de péptidos. Los resultados de ejemplo de citometría de flujo tras la tinción de tetrámero específica de TUMAP para dos péptidos de la invención se muestran en la figura 3. Los resultados de 13 péptidos de la invención se resumen en la tabla 3.
Tabla 3: Inmunogenicidad in vitro de péptidos HLA de clase I altamente inmunógenos de la invención Además de estos resultados obtenidos de donantes de sangre sanos, los péptidos BCA-002, CHI3LI-001, y NLGN4X-001 también se probaron en un número pequeño de pacientes de glioblastoma. Todos los péptidos demostraron ser inmunógenos de forma parecida en comparación con los donantes sanos, lo que demuestra la existencia de linfocitos T precursores en una población diana adecuada para la vacuna. EJEMPLO 4 Unión de péptidos restringidos a HLA de clase I de la invención a HLA-A*0201 Objetivo y resumen El objetivo de este análisis fue evaluar la afinidad de los péptidos HLA de clase I con la molécula MHC codificada por el alelo HLA-A*0201 , ya que éste constituye un parámetro importante para la forma de actuación de péptidos como parte de inmunoterapias de cáncer. Las afinidades con HLA-A*0201 fueron entre medias y altas para todos los péptidos 0 restringidos a HLA de clase I probados de la invención, con constantes de disociación en el rango del péptido de control positivo HBV-001, un conocido aglutinante A*02 fuerte derivado del antígeno central del virus de la hepatitis B. Estos resultados confirmaron la fuerte afinidad de unión de todos los péptidos HLA de clase I de la presente invención.
Principio de la prueba Los complejos HLA/péptido estables constan de tres moléculas: la cadena pesada de HLA, la microglobulina beta-2 (b2m) y el ligando peptídico. La actividad exclusiva de las moléculas de cadena pesada HLA-A*0201 recombinante desnaturalizada se puede preservar haciendo de ellas equivalentes funcionales de «moléculas HLA-A*0201 vacías».
Cuando se diluyen en un amortiguador acuoso con b2m y un péptido apropiado, estas moléculas se pliegan con rapidez y eficazmente de una forma completamente dependiente del péptido. La disponibilidad de estas moléculas se utiliza en un análisis basado en ELISA para medir la afinidad de la interacción entre el péptido y la molécula HLA de clase I (Sylvester-Hvid y col., 2002).
Las moléculas HLA-A*0201 recombinantes purificadas se incubaron junto con b2m y dosis niveladas del péptido en cuestión. La cantidad de complejos HLA/péptido plegados de novo se determinó mediante un análisis ELISA cuantitativo. Las constantes de disociación (valores KD) se calcularon con una curva estándar registrada de diluciones de un complejo HLA/péptido calibrado.
Resultados En la figura 4 se muestran los resultados. Un valor KD inferior refleja una mayor afinidad a HLA-A*0201. Todos los péptidos probados de la invención presentaron fuertes afinidades a HLA-A*0201 alrededor del KD para el péptido HBV-001 de control positivo, un conocido aglutinante A*02 fuerte. Así, todos los TUMAP de clase I de la invención tienen una fuerte afinidad de unión a la molécula de MHC A*02.
Lista de referencias citadas About I, Laurent-Maquin D, Lendahl U, Mitsiadis TA (2000). Nestin expression in embryonic and adult human teeth under normal and pathological conditions. Am J Pathol. 157, 287-295.
Aghi M, Gaviani P, Henson JW, Batchelor TT, Louis DN, Barker FG (2005). Magnetic resonance imaging characteristics predict epidermal growth factor receptor amplification status in glioblastoma. Clin Cáncer Res. 11, 8600-8605.
Agosti RM, Leuthold M, Gullick WJ, Yasargil MG, Wiestler OD (1992). Expression of the epidermal growth factor receptor in astrocytic tumours is specifically associated with glioblastoma multiforme. Virchows Arch. A Pathol. Anat. Histopathol. 420, 321-325.
Al-Joudi FS, Iskandar ZA, Imran AK (2007). Survivin expression correlates with unfavourable prognoses in invasive ductal carcinoma of the breast. Med J alaysia 62, 6-8.
Al-Nedawi K, Meehan B, Micallef J, Lhotak V, May L, Guha A, Rak J (2008). Intercellular transfer of the oncogenic receptor EGFRvIll by microvesicles derived from tumour cells. Nat. Cell Biol.
Altman JD, Moss PA, Goulder PJ, Barouch DH, Heyzer-Williams MG, Bell Jl, McMichael AJ, Davis MM (1996). Phenotypic analysis of antigen-specific T lymphocytes. Science 274, 94-96.
Amoh Y, Yang M, Li L, Reynoso J, Bouvet M, Moossa AR, Katsuoka K, Hoffman RM (2005). Nestin-linked green fluorescent protein transgenic nude mouse for imaging human tumor angiogenesis. Cáncer Res. 65, 5352-5357.
Angileri FF, Aguennouz M, Conti A, La TD, Cardali S, Crupi R, Tomasello C, Germano A, Vita G, Tomasello F (2008). Nuclear factor-kappaB activation and differential expression of survivin and Bcl-2 in human grade 2-4 astrocytomas. Cáncer.
Appay V, Speiser DE, Rufer N, Reynard S, Barbey C, Cerottini JC, Leyvraz S, Pinilla C, Romero P (2006). Decreased specific CD8+ T cell cross-reactivity of antigen recognition following vaccination with Melan-A peptide. Eur. J Immunol. 36, 1805-1814.
Arnold SE, Trojanowski JQ (1996). Human fetal hippocampal development: II. The neuronal cytoskeleton. J Comp Neurol. 367, 293-307.
ARONSON SM, ARONSON BE (1965). CENTRAL NERVOUS SYSTEM IN DIABETES MELLITUS: LOWERED FREQUENCY OF CERTAIN I NTRACRAN I AL NEOPLASMS. Arch. Neurol. 12, 390-398.
Asheuer M, Bieche I, Laurendeau I, Moser A, Hainque B, Vidaud M, Aubourg P (2005). Decreased expression of ABCD4 and BG1 genes early in the pathogenesis of X-linked adrenoleukodystrophy. Hum. Mol. Genet. 14, 1293-1303.
Asklund T, Appelskog IB, Ammerpohl O, Ekstrom TJ, Almqvist PM (2004). Histone deacetylase inhibitor 4-phenylbutyrate modulates% glial fibrillary acidic protein and connexin 43 expression, and enhances gap-junction communication , in human glioblastoma cells. Eur. J Cáncer 40, 1073-1081.
Barker FG, Simmons ML, Chang SM, Prados MD, Larson DA, Sneed PK, Wara WM, Berger MS, Chen P, Israel MA, Aldape KD (2001). EGFR overexpression and radiation response in glioblastoma multiforme. Int. J Radiat. Oncol Biol. Phys. 51, 410-418.
Bertelli E, Regoli M, Fonzi L, Occhini R, Mannucci S, Ermini L, Toti P (2007). Nestin expression in adult and developing human kidney. J Histochem. Cytochem. 55, 411-421.
Blum R, Jacob-Hirsch J, Rechavi G, Kloog Y (2006). Suppression of survivin expression in glioblastoma cells by the Ras inhibitor farnesylthiosalicylic acid promotes caspase-dependent apoptosis. Mol. Cáncer Ther. 5, 2337-2347.
Bourdon MA, Wikstrand CJ, Furthmayr H, Matthews TJ, Bigner DD (1983). Human glioma-mesenchymal extracellular matrix antigen defined by monoclonal antibody. Cáncer Res. 43, 2796-2805.
Bowen AR, Hanks AN, Murphy KJ, Florell SR, Grossman D (2004). Proliferation, apoptosis, and survivin expression in keratinocytic neoplasms and hyperplasias. Am J Dermatopathol . 26, 177-181.
Boyton RJ, Lohmann T, Londei M, Kalbacher H, Halder T, Frater AJ, Douek DC, Leslie DG, Flavell RA, Altmann DM (1998). Glutamic acid decarboxylase T lymphocyte responses associated with susceptibility or resistance to type I diabetes: analysis in disease discordant human twins, non-obese diabetic mice and HLA-DQ transgenic mice. Int. Immunol. 10, 1765-1776.
Brekke C, Lundervold A, Enger PO, Brekken C, Stalsett E, Pedersen TB, Haraldseth O, Kruger PG, Bjerkvig R, Chekenya M (2006). NG2 expression regulates vascular morphology and function in human brain tumours. Neuroimage. 29, 965-976.
Brenner AV, Linet MS, Fine HA, Shapiro WR, Selker RG, Black PM, Inskip PD (2002). History of allergies and autoimmune diseases and risk of brain tumors in adults. Int. J Cáncer 99, 252-259.
Brommeland T, Rosengren L, Fridlund S, Hennig R, Isaksen V (2007). Serum levéis of glial fibrillary acidic protein correlate to tumour volume of high-grade gliomas. Acta Neurol. Scand. 116, 380-384.
Bronger H, Konig J, Kopplow K, Steiner HH, Ahmadi R, Herold-Mende C, Keppler D, Nies AT (2005). ABCC drug efflux pumps and organic anion uptake transporters in human gliomas and the blood-tumor barrier. Cáncer Res. 65, 11419-11428.
Brychtova S, Fiuraskova M, Hlobilkova A, Brychta T, Hirnak J (2007). Nestin expression in cutaneous melanomas and melanocytic nevi. J Cutan. Pathol. 34, 370-375.
Buchner A, Castro M, Hennig A, Popp T, Assmann G, Hofstetter A, Stief C, Zimmermann W (2007). [Transcriptome analyses in renal cell carcinoma. Combination of láser microdissection and microarrays]. Urologe A 46, 1170-1175.
Calvo A, Catena R, Noble MS, Carbott D, Gil-Bazo I, González-Moreno O, Huh Jl, Sharp R, Qiu TH, Anver MR, Merlino G, Dickson RB, Johnson MD, Green JE (2008). Identification of VEGF-regulated genes associated with increased lung metastatic potential: functional involvement of tenascin-C in tumor growth and lung metástasis. Oncogene.
Campoli MR, Chang CC, Kageshita T, Wang X, McCarthy JB, Ferrone S (2004). Human high molecular weight-melanoma-associated antigen (HMW-MAA): a melanoma cell surface chondroitin sulfate proteoglycan (MSCP) with biological and clinical significance. Crit Rev. Immunol. 24, 267-296.
Carnemolla B, Castellani P, Ponassi M, Borsi L, Urbini S, Nicolo G, Dorcaratto A, Viale G, Winter G, Neri D, Zardi L (1999). Identification of a glioblastoma-associated tenascin-C isoform by a high affinity recombinant antibody. Am J Pathol. 154, 1345-1352.
Carriere C, Seeley ES, Goetze T, Longnecker DS, Korc M (2007). The Nestin progenitor lineage is the compartment of origin for pancreatic intraepithelial neoplasia. Proc Nati. Acad.
Sci. U. S. A 704, 4437-4442.
Casati C, Dalerba P, Rivoltini L, Gallino G, Deho P, Rini F, Belli F, Mezzanzanica D, Costa A, Andreola S, Leo E, Parmiani G, Castelli C (2003). The apoptosis inhibitor protein survivin induces tumor-specific CD8+ and CD4+ T cells in colorectal cáncer patients. Cáncer Res. 63, 4507-4515.
Castellino F, Huang AY, tan-Bonnet G, Stoll S, Scheinecker C, Germain RN (2006). Chemokines enhance immunity by guiding naive CD8+ T cells to sites of CD4+ T cell-dendritic cell interaction. Nature 440, 890-895.
Chakravarti A, Noli E, Black PM, Finkelstein DF, Finkelstein DM, Dyson NJ, Loeffler JS (2002). Quantitatively determined survivin expression levéis are of prognostic value in human gliomas. J Clin Oncol 20, 1063-1068.
Cheever MA, Chen W, Disis ML, Takahashi M, Peace DJ (1993). T-cell immunity to oncogenic proteins including mutated ras and chimeric bcr-abl. Ann N. Y. Acad. Sci. 690, 101-112.
Chekenya M, Enger PO, Thorsen F, Tysnes BB, Al-Sarraj S, Read TA, Furmanek T, Mahesparan R, Levine JM, Butt AM, Pilkington GJ, Bjerkvig R (2002a). The glial precursor proteoglycan, NG2, is expressed on tumour neovasculature by vascular pericytes in human malignant brain tumours. Neuropathol. Appl. Neurobiol. 28, 367-380.
Chekenya M, Hjelstuen M, Enger PO, Thorsen F, Jacob AL, Probst B, Haraldseth O, Pilkington G, Butt A, Levine JM, Bjerkvig R (2002b). NG2 proteoglycan promotes angiogenesis-dependent tumor growth in CNS by sequestering angiostatin. FASEB J 16, 586-588.
Chekenya M , Immervoll H (2007). NG2/HMP proteoglycan as a cáncer therapeutic target. Methods Mol. Biol. 361, 93-117.
Chekenya M, Krakstad C, Svendsen A, Netland IA, Staalesen V, Tysnes BB, Selheim F, Wang J, Sakariassen PO, Sandal T, Lonning PE, Flatmark T, Enger PO, Bjerkvig R, Sioud M, Stallcup WB (2008). The progenitor cell marker NG2/MPG promotes chemoresistance by activation of integrin-dependent PI3K/Akt signaling. Oncogene.
Chekenya M, Pilkington GJ (2002). NG2 precursor cells in neoplasia: functional, histogenesis and therapeutic implications for malignant brain tumours. J Neurocytol. 31, 507-521.
Chekenya M, Rooprai HK, Davies D, Levine JM, Butt AM, Pilkington GJ (1999). The NG2 chondroitin sulfate proteoglycan: role in malignant progression of human brain tumours. Int J Dev. Neurosci. 17, 421-435.
Chiquet-Ehrismann R, Tucker RP (2004). Connective tissues: signalling by tenascins. Int. J Biochem. Cell Biol. 36, 1085-1089.
Chu C, Li JY, Boado RJ, Pardridge WM (2008). Blood-brain barrier genomics and cloning of a novel organic anión transporter. J Cereb. Blood Flow Metab 28, 291-301.
Colín C, Baeza N, Bartoli C, Fina F, Eudes N, Nanni I, Martin PM, Ouafik L, Figarella-Branger D (2006). Identification of genes differentially expressed in glioblastoma versus pilocytic astrocytoma using Suppression Subtractive Hybridization. Oncogene 25, 2818-2826.
Colombetti S, Basso V, Mueller DL, Mondino A (2006).
Prolonged TCR/CD28 engagement drives IL-2-independent T cell clonal expansión through signaling mediated by the mammalian target of rapamycin. J Immunol. 176, 2730-2738.
Conacci-Sorrell M, Kaplan A, Raveh S, Gavert N, Sakurai T, Ben-Ze'ev A (2005). The shed ectodomain of Nr-CAM stimulates cell proliferation and motility, and confers cell transformaron. Cáncer Res. 65, 11605-11612.
Conacci-Sorrell ME, Ben-Yedidia T, Shtutman M, Feinstein E, Einat P, Ben-Ze'ev A (2002). Nr-CAM is a target gene of the beta-catenin/LEF-1 pathway in melanoma and colon cáncer and its expression enhances motility and confers tumorigenesis.
Genes Dev. 16, 2058-2072.
Coskun U, Yamac D, Gulbahar O, Sancak B, Karaman N, Ozkan S (2007). Locally advanced breast carcinoma treated with neoadjuvant chemotherapy: are the changes in serum levéis of YKL-40, MMP-2 and MMP-9 correlated with tumor response? Neoplasma 54, 348-352.
Cresswell P (1994). Assembly, transport, and function of MHC class II molecules. Annu. Rev. Immunol. 12, 259-293.
Dahlstrand J, Collins VP, Lendahl U (1992). Expression of the class VI intermedíate filament nestin in human central nervous system tumors. Cáncer Res. 52, 5334-5341.
Dengjel J, Nastke MD, Gouttefangeas C, Gitsioudis G, Schoor O, Altenberend F, Muller M, Kramer B, Missiou A, Sauter M, Hennenlotter J, Wernet D, Stenzl A, Rammensee HG, Klingel K, Stevanovic S (2006). Unexpected Abundance of HLA Class II Presented Peptides in Primary Renal Cell Carcinomas. Clin Cáncer Res. 12, 4163-4170.
Dixon DN, Izon DJ, Dagger S, Callow MJ, Taplin RH, Kees UR, Greene WK (2007). TLX1/HOX11 transcription factor inhibits differentiation and promotes a non-haemopoietic phenotype in murine bone marrow cells. Br. J Haematol. 138, 54-67.
Domoto T, iyama Y, Suzuki H, Teratani T, Arai K, Sugiyama T, Takayama T, Mugiya S, Ozono S, Nozawa R (2007). Evaluation of S100A10, annexin II and B-FABP expression as markers for renal cell carcinoma. Cáncer Sci. 98, 77-82.
Dudley ME, Wunderlich JR, Robbins PF, Yang JC, Hwu P, Schwartzentruber DJ, Topalian SL, Sherry R, Restifo NP, Hubicki AM, Robinson MR, Raffeld M, Duray P, Seipp CA, Rogers-Freezer L, Morton KE, Mavroukakis SA, White DE, Rosenberg SA (2002). Cáncer regression and autoimmunity in patients after clonal repopulation with antitumor lymphocytes. Science 298, 850-854.
Dudley ME, Wunderlich JR, Yang JC, Sherry RM, Topalian SL, Restifo NP, Royal RE, Kammula U, White DE, Mavroukakis SA, Rogers LJ, Gracia GJ, Jones SA, Mangiameli DP, Pelletier MM, Gea-Banacloche J, Robinson MR, Berman DM, Filie AC, Abati A, Rosenberg SA (2005). Adoptive cell transfer therapy following non-myeloablative but lymphodepleting chemotherapy for the treatment of patients with refractory metastatic melanoma. J. Clin. Oncol. 23, 2346-2357.
Eppenberger U, Mueller H (1994). Growth factor receptors and their ligands. J Neurooncol. 22, 249-254.
Erfurt C, Sun Z, Haendle I, Schuler-Thurner B, Heirman C, Thielemans K, van der BP, Schuler G, Schultz ES (2007). Tumor-reactive CD4+ T cell responses to the melanoma-associated chondroitin sulphate proteoglycan in melanoma patients and healthy individuáis in the absence of autoimmunity. J Immunol. 178, 7703-7709.
Florenes VA, Holm R, Myklebost O, Lendahl U, Fodstad O (1994). Expression of the neuroectodermal intermedíate filament nestin in human melanomas. Cáncer Res. 54, 354-356.
Fong L, Hou Y, Rivas A, Benike C, Yuen A, Fisher GA, Davis MM, Engleman EG (2001). Altered peptide ligand vaccination with Flt3 ligand expanded dendritic cells for tumor immunotherapy. Proc. Nati. Acad. Sci. U. S. A 98, 8809-8814.
Galli R, Binda E, Orfanelli U, Cipelletti B, Gritti A, De VS, Fiocco R, Foroni C, Dimeco F, Vescovi A (2004). Isolation and characterization of tumorigenic, stem-like neural precursors from human glioblastoma. Cáncer Res. 64, 7011-7021.
Galón J, Costes A, Sanchez-Cabo F, Kirilovsky A, Mlecnik B, Lagorce-Pages C, Tosolini M, Camus M, Berger A, Wind P, Zinzindohoue F, Bruneval P, Cugnenc PH, Trajanoski Z, Fridman WH, Pages F (2006). Type, density, and location of immune cells within human colorectal tumors predict clinical outcome. Science 313, 1960-1964.
Garcion E, Halilagic A, Faissner A, ffrench-Constant C (2004). Generation of an environmental niche for neural stem cell development by the extracellular matrix molecule tenascin C. Development 131 , 3423-3432.
Gary SC, Kelly GM, Hockfield S (1998). BEHAB/brevican: a brain-specific lectican ¡mpMcated in gliomas and glial cell motility. Curr. Opin. Neurobiol. 8, 576-581.
Gary SC, Zerillo CA, Chiang VL, Gaw JU, Gray G, Hockfield S (2000). cDNA cloning, chromosomal localization , and expression analysis of human BEHAB/brevican, a brain specific proteoglycan regulated during cortical development and in glioma. Gene 256, 139-147.
Gattinoni L, Powell DJ, Jr., Rosenberg SA, Restifo NP (2006). Adoptive immunotherapy for cáncer: building on success. Nat. Rev. Immunol. 6, 383-393.
Ghosh JC, Dohi T, Kang BH, Altieri DC (2008). Hsp60 regulation of tumor cell apoptosis. J Biol. Chem. 283, 5188-5194.
Gipp J, Gu G, Crylen C, Kasper S, Bushman W (2007). Hedgehog pathway activity in the LADY prostate tumor model. Mol. Cáncer 6, 19.
Gleiberman AS, Michurina T, Encinas JM, Roig JL, Krasnov P, Balordi F, Fishell G, Rosenfeld MG, Enikolopov G (2008). Genetic approaches identify adult pituitary stem cells. Proc Nati. Acad. Sci. U. S. A 105, 6332-6337.
Gnjatic S, Atanackovic D, Jager E, Matsuo M, Selvakumar A, Altorki NK, Maki RG, Dupont B, Ritter G, Chen YT, Knuth A, Old LJ (2003). Survey of naturally occurring CD4+ T cell responses against NY-ESO-1 in cáncer patients: correlation with antibody responses. Proc Nati. Acad. Sci. U. S. A 700, 8862-8867.
Godbout R, Bisgrove DA, Shkolny D, Day RS, III (1998).
Correlation of B-FABP and GFAP expression in malignant glioma. Oncogene 16, 1955-1962.
Gorka B, Skubis-Zegadlo J, Mikula M, Bardadin K, Paliczka E, Czarnocka B (2007). NrCAM, a neuronal system cell-adhesión molecule, is induced in papilla ry thyroid carcinomas.
Br. J Cáncer 97, 531-538.
Goto Y, Matsuzaki Y, Kurihara S, Shimizu A, Okada T, Yamamoto K, Murata H, Takata M, Aburatani H, Hoon DS, Saida T, Kawakami Y (2006). A new melanoma antigen fatty acid-binding protein 7, involved in proliferation and invasión, is a potential target for immunotherapy and molecular target therapy. Cáncer Res. 66, 4443-4449.
Grunda JM, Nabors LB, Palmer CA, Chhieng DC, Steg A, Mikkelsen T, Diasio RB, Zhang K, Allison D, Grizzle WE, Wang W, Gillespie GY, Johnson MR (2006). Increased expression of thymidylate synthetase (TS), ubiquitin specific protease 10 (USP10) and survivin is associated with poor survival in glioblastoma multiforme (GBM). J Neurooncol. 80, 261-274.
Gu G, Yuan J, Wills M, Kasper S (2007). Prostate cáncer cells with stem cell characteristics reconstitute the original human tumor in vivo. Cáncer Res. 67, 4807-4815.
Gunther HS, Schmidt NO, Phillips HS, Kemming D, Kharbanda S, Soriano R, Modrusan Z, Meissner H, Westphal M, Lamszus K (2008). Glioblastoma-derived stem cell-enriched cultures form distinct subgroups according to molecular and phenotypic criteria. Oncogene 27, 2897-2909.
Hammer J, Gallazzi F, Bono E, Karr RW, Guenot J, Valsasnini P, Nagy ZA, Sinigaglia F (1995). Peptide binding specificity of HLA-DR4 molecules: correlation with rheumatoid arthritis association. J Exp. Med 181, 1847-1855.
Hanada K, Yewdell JW, Yang JC (2004). Immune recognition of a human renal cáncer antigen through post-translational protein splicing. Nature 427, 252-256.
Hau P, Kunz-Schughart LA, Rummele P, Arslan F, Dorfelt A, Koch H, Lohmeier A, Hirschmann B, Muller A, Bogdahn U, Bosserhoff AK (2006). Tenascin-C protein is induced by transforming growth factor-betal but does not correlate with time to tumor progression in high-grade gliomas. J Neurooncol. 77, 1-7.
Heimberger AB, Hussain SF, Aldape K, Sawaya R, Archer GA, Friedman H, Reardon D, Friedman A, Bigner DD, Sampson JH. Tumor-specific peptide vaccination in newly-diagnosed patients with GBM. Journal of Clínica! Oncology, 2006 ASCO Annual Meeting Proceedings Part I Vol 24, No. 18S (June 20 Supplement), 2006: 2529. 6-20-2006.
Herold-Mende C, Mueller MM, Bonsanto MM, Schmitt HP, Kunze S, Steiner HH (2002). Clinical impact and functional aspects of tenascin-C expression during glioma progression. Int. J Cáncer 98, 362-369.
Herrera MB, Bruno S, Buttiglieri S, Tetta C, Gatti S, Deregibus MC, Bussolati B, Camussi G (2006). Isolation and characterization of a stem cell population from adult human liver. Stem Cells 24, 2840-2850.
Hoffmann NE, Sheinin Y, Lohse CM, Parker AS, Leibovich BC, Jiang Z, Kwon ED (2008). External validation of IMP3 expression as an independent prognostic marker for metastatic progression and death for patients with clear cell renal cell carcinoma. Cáncer 112, 1471-1479.
Hormigo A, Gu B, Karimi S, Riedel E, Panageas KS, Edgar MA, Tanwar MK, Rao JS, Fleisher M, DeAngelis LM, Holland EC (2006). YKL-40 and matrix metalloproteinase-9 as potential serum biomarkers for patients with high-grade gliomas. Clin Cáncer Res. 12, 5698-5704.
Huang J, Hu J, Bian X, Chen K, Gong W, Dunlop NM, Howard OM, Wang JM (2007). Transactivation of the epidermal growth factor receptor by formylpeptide receptor exacerbates the malignant behavior of human glioblastoma cells. Cáncer Res. 67, 5906-5913.
Huang Y, Fan J, Yang J, Zhu GZ (2008). Characterization of GPR56 protein and its suppressed expression in human pancreatic cáncer cells. Mol. Cell Biochem. 308, 133-139.
Huncharek M, Kupelnick B (2000). Epidermal growth factor receptor gene amplification as a prognostic marker in glioblastoma multiforme: results of a meta-analysis. Oncol Res. 12, 107-112.
Hwang ML, Lukens JR, Bullock TN (2007). Cognate memory CD4+ T cells generated with dendritic cell priming influence the expansión, trafficking, and differentiation of secondary CD8+ T cells and enhance tumor control. J Immunol. 179, 5829-5838.
Iguchi T, Sakata K, Yoshizaki K, Tago K, Mizuno N, Itoh H (2008). Orphan G protein-coupled receptor GPR56 regulates neural progenitor cell migration via a Galpha 12/13 and Rho pathway. J B i o I . Chem. lija Boor PK, de GK, Mejaski-Bosnjak V, Brenner C, van der Knaap MS, Scheper GC, Pronk JC (2006). Megalencephalic leukoencephalopathy with subcortical cysts: an update and extended mutation analysis of MLC1. Hum. Mutat. 27, 505-512.
Ishiuchi S, Tsuzuki K, Yoshida Y, Yamada N, Hagimura N, Okado H, Miwa A, Kurihara H, Nakazato Y, Tamura M, Sasaki T, Ozawa S (2002). Blockage of Ca(2 + )-permeable AMPA receptors suppresses migration and induces apoptosis in human glioblastoma cells. Nat. Med 8, 971-978.
Ishizaki M, Ishiwata T, Adachi A, Tamura N, Ghazizadeh M, Kitamura H, Sugisaki Y, Yamanaka N, Naito Z, Fukuda Y (2006). Expression of nestin in rat and human glomerular podocytes. J Submicrosc. Cytol. Pathol. 38, 193-200.
Janssen EM, Lemmens EE, Wolfe T, Christen U, von Herrath MG, Schoenberger SP (2003). CD4+ T cells are required for secondary expansión and memory in CD8+ T lymphocytes. Nature 421, 852-856.
Jaworski DM, Kelly GM, Piepmeier JM, Hockfield S (1996). BEHAB (brain enriched hyaluronan binding) is expressed in surgical samples of glioma and in intracranial grafts of invasive glioma cell Unes. Cáncer Res. 56, 2293-2298.
Jiang Z, Chu PG, Woda BA, Rock KL, Liu Q, Hsieh CC, Li C, Chen W, Duan HO, McDougal S, Wu CL (2006). Analysis of RNA-binding protein IMP3 to predict metástasis and prognosis of renal-cell carcinoma: a retrospective study. Lancet Oncol 7, 556-564.
Jiang Z, Lohse CM, Chu PG, Wu CL, Woda BA, Rock KL, Kwon ED (2008). Oncofetal protein IMP3: a novel molecular marker that predicts metástasis of papillary and chromophobe renal cell carcinomas. Cáncer 112, 2676-2682.
Johansen JS, Jensen BV, Roslind A, Nielsen D, Price PA (2006). Serum YKL-40, a new prognostic biomarker ¡n cáncer patients? Cáncer Epidemiol. Biomarkers Prev. 15, 194-202.
Johansen JS, Jensen BV, Roslind A, Price PA (2007). Is YKL-40 a new therapeutic target in cáncer? Expert. Opin. Ther. Targets. 11, 219-234.
Jung CS, Foerch C, Schanzer A, Heck A, Píate KH, Seifert V, Steinmetz H, Raabe A, Sitzer (2007). Serum GFAP is a diagnostic marker for glioblastoma multiforme. Brain 130, 3336-3341.
Jung G, Ledbetter JA, Muller-Eberhard HJ (1987).
Induction of cytotoxicity in resting human T lymphocytes bound to tumor cells by antibody heteroconjugates. Proc Nati Acad Sci U S A 84, 4611-4615.
Junker N, Johansen JS, Hansen LT, Lund EL, Kristjansen PE (2005). Regulation of YKL-40 expression during genotoxic or microenvironmental stress in human glioblastoma cells. Cáncer Sci. 96, 183-190.
Kajiwara Y, Yamasaki F, Hama S, Yahara K, Yoshioka H, Sugiyama K, Arita K, Kurisu K (2003). Expression of survivin in astrocytic tumors: correlation with malignant grade and prognosis. Cáncer 97, 1077-1083.
Kaloshi G, Mokhtari K, Carpentier C, Taillibert S, Lejeune J, Marie Y, Delattre JY, Godbout R, Sansón M (2007). FABP7 expression in glioblastomas: relation to prognosis, invasión and EGFR status. J Neurooncol. 84, 245-248.
Kato Y, Fujita N, Kunita A, Sato S, Kaneko M, Osawa M, Tsuruo T (2003). Molecular ¡dentification of Aggrus/T1 alpha as a platelet aggregation-inducing factor expressed in colorectal tumors. J Biol. Chem. 278, 51599-51605.
Kato Y, Kaneko MK, Kunita A, Ito H, Kameyama A, Ogasawara S, Matsuura N, Hasegawa Y, Suzuki-lnoue K, Inoue O, Ozaki Y, Narimatsu H (2008). Molecular analysis of the pathophysiological binding of the platelet aggregation-inducing factor podoplanin to the C-type lectin-like receptor CLEC-2. Cáncer Sci. 99, 54-61.
Kato Y, Kaneko MK, Kuno A, Uchiyama N, Amano K, Chiba Y, Hasegawa Y, Hirabayashi J, Narimatsu H, Mishima K, Osawa M (2006). Inhibition of tumor cell-induced platelet aggregation using a novel anti-podoplanin antibody reacting with its platelet-aggregation-stimulating domain. Biochem. Biophys. Res. Commun. 349, 1301-1307.
Ke N, Sundaram R, Liu G, Chionis J, Fan W, Rogers C, Awad T, Grifman M, Yu D, Wong-Staal F, Li QX (2007). Orphan G protein-coupled receptor GPR56 plays a role in cell transformation and tumorigenesis involving the cell adhesión pathway. Mol. Cáncer Ther. 6, 1840-1850.
Kennedy RC, Shearer MH, Watts AM, Bright RK (2003). CD4+ T lymphocytes play a critical role in antibody production and tumor immunity against simian virus 40 large tumor antigen. Cáncer Res. 63, 1040-1045.
Kim CH, Bak KH, Kim YS, Kim JM, Ko Y, Oh SJ, Kim KM, Hong EK (2000). Expression of tenascin-C in astrocytic tumors: its relevance to proliferation and angiogenesis. Surg Neurol. 54, 235-240.
Kim SH, Das K, Noreen S, Coffman F, Hameed M (2007).
Prognostic implications of immunohistochemically detected YKL-40 expression in breast cáncer. World J Surg Oncol 5, 17.
Kleeberger W, Bova GS, Nielsen ME, Herawi M, Chuang AY, Epstein Jl, Berman DM (2007). Roles for the stem cell associated intermedíate filament Nestin in prostate cáncer migration and metástasis. Cáncer Res. 67, 9199-9206.
Klein T, Ling Z, Heimberg H, Madsen OD, Heller RS, Serup P (2003). Nestin is expressed in vascular endothelial cells in the adult human páncreas. J Histochem. Cytochem. 51, 697-706.
Klein WM, Wu BP, Zhao S, Wu H, Klein-Szanto AJ, Tahan SR (2007). Increased expression of stem cell markers in malignant melanoma. Mod. Pathol. 20, 102-107.
Kobayashi H, Omiya R, Ruiz M, Huarte E, Sarobe P, Lasarte JJ, Herraiz M, Sangro B, Prieto J, Borras-Cuesta F, Celis E (2002). Identification of an antigenic epitope for helper T lymphocytes from carcinoembryonic antigen. Clin Cáncer Res. 8, 3219-3225.
Kono T, Shimoda M, Takahashi M, Matsumoto K, Yoshimoto T, Mizutani M, Tabata C, Okoshi K, Wada H, Kubo H (2007). Immunohistochemical detection of the lymphatic marker podoplanin in diverse types of human cáncer cells using a novel antibody. Int J Oncol 31, 501-508.
Kosari F, Parker AS, Kube DM, Lohse CM, Leibovich BC, Blute ML, Cheville JC, Vasmatzis G (2005). Clear cell renal cell carcinoma: gene expression analyses identify a potential signature for tumor aggressiveness. Clin Cáncer Res. 11, 5128-5139.
Kroes RA, Uawson G, Moskal JR (2007). Focused microarray analysis of glyco-gene expression in human glioblastomas. J Neurochem. 103 Suppl 1, 14-24.
Krona A, Aman P, Orndal C, Josefsson A (2007).
Oncostatin M-induced genes in human astrocytomas. Int. J Oncol 31, 1457-1463.
Kucharczak J, Pannequin J, Camby I, Decaestecker C, Kiss R, Martínez J (2001). Gastrin induces over-expression of genes involved in human U373 glioblastoma cell migration.
Oncogene 20, 7021-7028.
Kucur M, Isman FK, Balci C, Onal B, Hacibekiroglu M, Ozkan F, Ozkan A (2008). Serum YKL-40 levéis and chitotriosidase activity as potential biomarkers in primary prostate cáncer and benign prostatic hyperplasia. Urol. Oncol 26, 47-52.
Kurihara H, Zama A, Tamura M, Takeda J, Sasaki T, Takeuchi T (2000). Glioma/glioblastoma-specific adenoviral gene expression using the nestin gene regulator. Gene Ther. 7, 686-693.
Lal A, Peters H, St CB, Haroon ZA, Dewhirst MW, Strausberg RL, Kaanders JH, van der Kogel AJ, Riggins GJ (2001). Transcriptional response to hypoxia in human tumors. J Nati. Cáncer Inst. 93, 1337-1343.
Lemmel C, Weik S, Eberle U, Dengjel J, Kratt T, Becker HD, Rammensee HG, Stevanovic S (2004). Differential quantitative analysis of MHC ligands by mass spectrometry using stable isotope labeling. Nat. Biotechnol. 22, 450-454.
Lendahl U, Zimmerman LB, McKay RD (1990). CNS stem cells express a new class of intermedíate filament protein. Cell 60, 585-595.
Li JY, Wang H, May S, Song X, Fueyo J, Fuller GN, Wang H (2008a). Constitutive activation of c-Jun N-terminal kinase correlates with histologic grade and EGFR expression in diffuse gliomas. J Neurooncol. 88, 11-17.
Li L, Xu H, Spaulding BO, Cheng L, Simón R, Yao JL, di Sant'agnese PA, Bourne PA, Huang J (2008b). Expression of RNA-binding protein IMP3 (KOC) in benign urothelium and urothelial tumors. Hum. Pathol.
Liang ML, Ma J, Ho M, Solomon L, Bouffet E, Rutka JT, Hawkins C (2008). Tyrosine kinase expression in pediatric high grade astrocytoma. J Neurooncol. 87, 247-253.
Liang Y, Bollen AW, Aldape KD, Gupta N (2006). Nuclear FABP7 immunoreactivity is preferentially expressed in infiltrative glioma and is associated with poor prognosis in EGFR-overexpressing glioblastoma. BMC. Cáncer 6, 97.
Liang Y, Diehn M, Watson N, Bollen AW, Aldape KD, Nicholas MK, Lamborn KR, Berger MS, Botstein D, Brown PO, Israel MA (2005). Gene expression profiling reveáis molecularly and clinically distinct subtypes of glioblastoma multiforme. Proc. Nati. Acad. Sci. U. S. A 102, 5814-5819.
Liao B, Hu Y, Herrick DJ, Brewer G (2005). The RNA-binding protein IMP-3 is a translational activator of insulin-like growth factor II leader-3 mRNA during proliferation of human K562 leukemia cells. J Biol. Chem. 280, 18517-18524.
Littaua RA, Takeda A, Cruz J, Ennis FA (1992). Vaccinia virus-specific human CD4+ cytotoxic T-lymphocyte clones. J Virol. 66, 2274-2280.
Liu M, Parker RM, Darby K. Eyre HJ, Copeland NG, Crawford J, Gilbert DJ, Sutherland GR, Jenkins NA, Herzog H (1999). GPR56, a novel secreti n-like human G-protein-coupled receptor gene. Genomics 55, 296-305.
Liu S, Ginestier C, Charafe-Jauffret E, Foco H, Kleer CG, Merajver SD, Dontu G, Wicha MS (2008). BRCA1 regulates human mammary stem/progenitor cell fate. Proc Nati. Acad. Sci. U. S. A 105, 1680-1685.
Liu W, Putnam AL, Xu-Yu Z, Szot GL, Lee MR, Zhu S, Gottlieb PA, Kapranov P, Gingeras TR, de St Groth BF, Clayberger C, Soper DM, Ziegler SF, Bluestone JA (2006a). CD127 expression inversely correlates with FoxP3 and suppressive function of human CD4( + ) T reg cells. J Exp. Med 203, 1701-1711.
Liu X, Chen N, Wang X, He Y, Chen X, Huang Y, Yin W, Zhou Q (2006b). Apoptosis and proliferation markers in diffusely infiltrating astrocytomas: profiling of 17 molecules. J Neuropathol. Exp. Neurol. 65, 905-913.
Lo ML, Staibano S, Pannone G, Mignogna MD, Mariggio A, Salvatore G, Chieffi P, Tramontano D, De RG, Altieri DC (2001). Expression of the apoptosis inhibitor survivin in aggressive squamous cell carcinoma. Exp. Mol. Pathol. 70, 249-254.
Lubensky IA, Vortmeyer AO, Kim S, Lonser RR, Park DM, Ikejiri B, Li J, Okamoto H, Walbridge S, Ryschkewitsch C, Major E, Oldfield EH, Zhuang Z (2006). Identification of tumor precursor cells in the brains of primates with radiation-induced de novo glioblastoma multiforme. Cell Cycle 5, 452-456.
Mach B, Steimle V, Martinez-Soria E, Reith W (1996). Regulation of MHC class II genes: lessons from a disease. Annu. Rev. Immunol. 14, 301-331.
Maderna E, Salmaggi A, Calatozzolo C, Limido L, Pollo B (2007). Nestin, PDGFRbeta, CXCL12 and VEGF in Glioma Patients: Different Profiles of (Pro-Angiogenic) Molecule Expression Are Related with Tumor Grade and May Provide Prognostic Information. Cáncer Biol. Ther. 6.
Mahlamaki EH, Barlund , Tanner M, Gorunova L, Hoglund M, Karhu R, Kallioniemi A (2002). Frequent amplificaron of 8q24, 11q, 17q, and 20q-specific genes in pancreatic cáncer. Genes Chromosomes. Cáncer 35, 353-358.
Malcherek G, Gnau V, Stevanovic S, Rammensee HG, Jung G, Melms A (1994). Analysis of allele-specific contact sites of natural HLA-DR17 ligands. J Immunol. 753, 1141-1149.
Manici S, Sturniolo T, Imro MA, Hammer J, Sinigaglia F, Noppen C, Spagnoli G, Mazzi B, Bellone M, Dellabona P, Protti MP (1999). Melanoma cells present a MAGE-3 epitope to CD4( + ) cytotoxic T cells in association with histocompatibility leukocyte antigen DR11. J Exp. Med 189, 871-876.
Mao Y, Zhou L, Zhu W, Wang X, Yang G, Xie L, Mao X, Jin K (2007). Proliferative status of tumor stem cells may be correlated with malignancy grade of human astrocytomas. Front Biosci. 12, 2252-2259.
Marzo AL, Kinnear BF, Lake RA, Frelinger JJ, Collins EJ, Robinson BW, Scott B (2000). Tumor-specific CD4+ T cells have a major "post-licensing" role in CTL mediated anti-tumor immunity. J Immunol. 165, 6047-6055.
Mellai M, Caldera V, Patrucco A, Annovazzi L, Schiffer D (2008). Survivin expression in glioblastomas correlates with proliferation, but not with apoptosis. Anticancer Res. 28, 109-118.
Mishima K, Kato Y, Kaneko MK, Nishikawa R, Hirose T, Matsutani M (2006). Increased expression of podoplanin in malignant astrocytic tumors as a novel molecular marker of malignant progression. Acta Neuropathol. 111, 483-488.
Mita R, Coles JE, Glubrecht DD, Sung R, Sun X, Godbout R (2007). B-FABP-expressing radial glial cells: the malignant glioma cell of origin? Neoplasia. 9, 734-744.
Miyawaki T, Uemura A, Dezawa M, Yu RT, Ide C, Nishikawa S, Honda Y, Tanabe Y, Tanabe T (2004). Tlx, an orphan nuclear receptor, regulates cell numbers and astrocyte development in the developing retina. J Neurosci. 24, 8124-8134.
Mizukami Y, Kono K, Daigo Y, Takano A, Tsunoda T, Kawaguchi Y, Nakamura Y, Fujii H (2008). Detection of novel cancer-testis antigen-specific T-cell responses in TIL, regional lymph nodes, and PBL in patients with esophageal squamous cell carcinoma. Cáncer Sci.
Mokhtari K, París S, guirre-Cruz L, Privat N, Criniere E, Marie Y, Hauw JJ, Kujas M, Rowitch D, Hoang-Xuan K, Delattre JY, Sansón M (2005). Olig2 expréssion, GFAP, p53 and 1p loss analysis contribute to glioma subclassification. Neuropathol. Appl. Neurobiol. 31, 62-69.
Mokry J, Cizkova D, Filip S, Ehrmann J, Osterreicher J, Kolar Z, English D (2004). Nestin expression by newly formed human blood vessels. Stem Cells Dev. 13, 658-664.
Morgan RA, Dudley ME, Wunderlich JR, Hughes MS, Yang JC, Sherry RM, Royal RE, Topalian SL, Kammula US, Restifo NP, Zheng Z, Nahvi A, de Vries CR, Rogers-Freezer LJ, Mavroukakis SA, Rosenberg SA (2006). Cáncer Regression in Patients After Transfer of Genetically Engineered Lymphocytes. Science.
Mortara L, Castellani P, Meazza R, Tosí G, De Lerma BA, Procopio FA, Comes A, Zardi L, Ferrini S, Accolla RS (2006). Cl ITA-induced MHC class II expression in mammary adenocarcinoma leads to a Th1 polarization of the tumor microenvironment, tumor rejection, and specific antitumor memory. Clin Cáncer Res. 12, 3435-3443.
Novellino L, Castelli C, Parmiani G (2005). A listing of human tumor antigens recognized by T cells: March 2004 update. Cáncer Immunol. Immunother. 54, 187-207.
Nutt CL, Betensky RA, Brower A, Batchelor TT, Louis DN, Stemmer-Rachamimov AO (2005). YKL-40 is a differential diagnostic marker for histologic subtypes of high-grade gliomas. Clin Cáncer Res. 11, 2258-2264.
Nutt CL, Matthews RT, Hockfield S (2001). Glial tumor invasión: a role for the upregulation and cleavage of BEHAB/brevican. Neuroscientist. 7, 113-122.
O'Driscoll L, Linehan R, Clynes (2003). Survivin: role in normal cells and in pathological conditions. Curr. Cáncer Drug Targets. 3, 131-152.
Ohike N, Sato M, Hisayuki T, Imataka H, Sato S, Wada Y, Saito K, Takahashi M, Tajiri T, Kunimura T, Morohoshi T (2007). Immunohistochemical analysis of nestin and c-kit and their significance in pancreatic tumors. Pathol. Int. 57, 589-593.
Okada Y, Ohno C, Ueki K, Ogino M , Kawamoto S, Kim P (2007). Comparison of numerical change of epidermal growth factor receptor gene among pre- and postradiation glioma, and gliosis, and its clinical use. Brain Tumor Pathol. 24, 15-18.
Ozerdem U (2006). Targeting of pericytes diminishes neovascularization and lymphangiogenesis in prostate cáncer. Prostate 66, 294-304.
Pei Z, Oey NA, Zuidervaart MM, Jia Z, Li Y, Steinberg SJ, Smith KD, Watkins PA (2003). The acyl-CoA synthetase "bubblegum" (lipidosin): further characterization and role in neuronal fatty acid beta-oxidation. J Biol. Chem. 278, 47070-47078.
Pelloski CE, Lin E, Zhang L, Yung WK, Colman H, Liu JL, Woo SY, Heimberger AB, Suki D, Prados M, Chang S, Barker FG, III, Fuller GN, Aldape KD (2006). Prognostic associations of activated mitogen-activated protein kinase and Akt pathways in glioblastoma. Clin Cáncer Res. 12, 3935-3941.
Pelloski CE, Mahajan A, Maor M, Chang EL, Woo S, Gilbert M, Colman H, Yang H, Ledoux A, Blair H, Passe S, Jenkins RB, Aldape KD (2005). YKL-40 expression is associated with poorer response to radiation and shorter overall survival in glioblastoma. Clin Cáncer Res. 11, 3326-3334.
Penar PL, Khoshyomn S, Bhushan A, Tritton TR (1997). Inhibition of epidermal growth factor receptor-associated tyrosine kinase blocks glioblastoma invasión of the brain. Neurosurgery 40, 141-151.
Penna A, Fowler P, Bertoletti A, Guilhot S, oss B, Margolskee RF, Cavalli A, Val I i A, Fiaccadori F, Chisari FV, . (1992). Hepatitis B virus (HBV)-specific cytotoxic T-cell (CTL) response in humans: characterization of HLA class ll-restricted CTLs that recognize endogenously synthesized HBV envelope antigens. J Virol. 66, 1193-1198.
Peris L, Thery M, Faure J, Saoudi Y, Lafanechere L, Chilton JK, Gordon-Weeks P, Galjart N, Bornens M, Wordeman L, Wehland J, Andrieux A, Job D (2006). Tubulin tyrosination is a major factor affecting the recruitment of CAP-Gly proteins at microtubule plus ends. J Cell Biol. 174, 839-849.
Perry J, Ho M, Viero S, Zheng K, Jacobs R, Thorner PS (2007). The intermedíate filament nestin is highly expressed in normal human podocytes and podocytes in glomerular disease. Pediatr. Dev. Pathol. 10, 369-382.
Piesche M, Hildebrandt Y, Zettl F, Chapuy B, Schmitz M, Wulf G, Trumper L, Schroers R (2007). Identification of a promiscuous HLA DR-restricted T-cell epitope derived from the inhibitor of apoptosis protein survivin. Hum. Immunol. 68, 572-576.
Pizzagalli F, Hagenbuch B, Stieger B, Klenk U, Folkers G, Meier PJ (2002). Identification of a novel human organic anión transporting polypeptide as a high affinity thyroxine transporter. Mol. Endocrinol. 16, 2283-2296.
Pryor JG, Bourne PA, Yang Q, Spaulding BO, Scott GA, Xu H (2008). IMP-3 is a novel progression marker in malignant melanoma. Mod. Pathol. 21, 431-437.
Purow B, Sundaresan TK, Burdick MJ, Kefas B, Comeau L, Hawkinson M, Su Q, Kotliarov Y, Lee J, Zhang W, Fine HA (2008). Notch-1 Regulates Transcription of the Epidermal Growth Factor Receptor Through p53. Carcinogenesis.
Qin Z, Blankenstein T (2000). CD4+ T cell--mediated tumor rejection involves inhibition of angiogenesis that is dependent on IFN gamma receptor expression by nonhematopoietic cells. Immunity. 12, 677-686.
Qin Z, Schwartzkopff J, Pradera F, Kammertoens T, Seliger B, Pircher H, Blankenstein T (2003). A critical requirement of interferon gamma-mediated angiostasis for tumor rejection by CD8+ T cells. Cáncer Res. 63, 4095-4100.
Quaranta M, Divella R, Daniele A, Di TS, Venneri MT, Lolli I, Troccoli G (2007). Epidermal growth factor receptor serum levéis and prognostic valué in malignant gliomas. Tumori 93, 275-280.
Rammensee HG, Bachmann J, Emmerich NP, Bachor OA, Stevanovic S (1999). SYFPEITHI: datábase for MHC ligands and peptide motifs. Immunogenetics 50, 213-219.
Rammensee.H.G., Bachmann.J., and Stevanovic.S. (1997). MHC Ligands and Peptide Motifs. Springer-Verlag, Heidelberg, Germany).
Rammensee HG, Friede T, Stevanoviic S (1995). MHC ligands and peptide motifs: first listing. Immunogenetics 41, 178-228.
Reyaz N, Tayyab M, Khan SA, Siddique T (2005). Correlation of glial fibrillary acidic protein (GFAP) with grading of the neuroglial tumours. J Coll. Physicians Surg. Pak. 15, 472-475.
Ringsholt M, Hogdall EV, Johansen JS, Price PA, Christensen LH (2007). YKL-40 protein expression in normal adult human tissues--an immunohistochemical study. J Mol. Histol. 38, 33-43.
Rosenberg SA, Lotze MT, Muul LM, Chang AE, Avis FP, Leitman S, Linehan WM, Robertson CN, Lee RE, Rubin JT, . (1987) . A progress report on the treatment of 157 patients with advanced cáncer using lymphokine-activated killer cells and interleukin-2 or high-dose interleukin-2 alone. N. Engl. J. Med. 316, 889-897.
Rosenberg SA, Packard BS, Aebersold PM, Solomon D, Topalian SL, Toy ST, Simón P, Lotze MT, Yang JC, Seipp CA, . (1988) . Use of tumor-infiltrating lymphocytes and interleukin-2 in the immunotherapy of patients with metastatic meianoma. A preliminary report. N. Engl. J Med 319, 1676-1680.
Roslind A, Johansen JS, Christensen IJ, Kiss K, Balslev E, Nielsen DL, Bentzen J, Price PA, Andersen E (2008). High serum levéis of YKL-40 in patients with squamous cell carcinoma of the head and neck are associated with short survival. Int. J Cáncer 122, 857-863.
Ruiz C, Huang W, Hegi ME, Lange K, Hamou MF, Fluri E, Oakeley EJ, Chiquet-Ehrismann R, Orend G (2004). Growth promoting signaling by tenascin-C [corrected]. Cáncer Res. 64, 7377-7385.
Sabatini F, Petecchia L, Tavian M, Jodon dV, V, Rossi GA, Brouty-Boye D (2005). Human bronchial fibroblasts exhibit a mesenchymal stem cell phenotype and multilineage differentiating potentialities. Lab Invest 85, 962-971.
Saidi A, Javerzat S, Bellahcene A, De VJ, Bello L, Castronovo V, Deprez M, Loiseau H, Bikfalvi A, Hagedorn M (2007). Experimental anti-angiogenesis causes upregulation of genes associated with poor survival in glioblastoma. Int. J Cáncer.
Saito T, Arifin MT, Hama S, ajiwara Y, Sugiyama K, Yamasaki F, Hidaka T, Arita K, Kurisu K (2007). Survivin subcellular localization in high-grade astrocytomas: simultaneous expression in both nucleus and cytoplasm is negative prognostic marker. J Neurooncol. 82, 193-198.
Sakurada K, Saino M, Mouri W, Sato A, Kitanaka C, Kayama T (2007). Nestin expression in central nervous system germ cell tumors. Neurosurg. Rev.
Sarlomo-Rikala M, Tsujimura T, Lendahl U, Miettinen M (2002). Patterns of nestin and other intermedíate filament expression distinguish between gastrointestinal stromal tumors, leiomyomas and schwannomas. APMIS 110, 499-507.
Sasaki T, Lopes MB, Hankins GR, Helm GA (2002). Expression of survivin, an inhibitor of apoptosis protein, in tumors of the nervous system. Acta Neuropathol. 104, 105-109.
Sato F, Abraham JM, Yin J, Kan T, Ito T, Mori Y, Hamilton JP, Jin Z, Cheng Y, Paun B, Berki AT, Wang S, Shimada Y, Meltzer SJ (2006). Polo-like kinase and survivin are esophageal tumor-specific promoters. Biochem. Biophys. Res. Commun. 342, 465-471.
Schacht V, Dadras SS, Johnson LA, Jackson DG, Hong YK, Detmar M (2005). Up-regulation of the lymphatic marker podoplanin, a mucin-type transmembrane glycoprotein, in human squamous cell carcinomas and germ cell tumors. Am J Pathol. 166, 913-921.
Schiffer D, Manazza A, Tamagno I (2006). Nestin expression in neuroepithelial tumors. Neurosci. Lett. 400, 80-85.
Schlegel J, Merdes A, Stumm G, Albert FK, Forsting M, Hynes N, Kiessling M (1994). Amplification of the epidermal-growth-factor-receptor gene correlates with different growth behaviour in human glioblastoma. Int. J Cáncer 56, 72-77.
Schlehofer B, Blettner M, Preston-Martin S, Niehoff D, Wahrendorf J, Arslan A, Ahlbom A, Choi WN, Giles GG, Howe GR, Little J, Menegoz F, Ryan P (1999). Role of medical history in brain tumour development. Results from the international adult brain tumour study. Int. J Cáncer 82, 155-160.
Schmitt A, Gofferje V, Weber M, Meyer J, Mossner R, Lesch KP (2003). The brain-specific protein MLC1 implicated in megalencephalic leukoencephalopathy with subcortical cysts is expressed in glial cells in the murine brain. Glia 44, 283-295.
Schoenberger SP, Toes RE, van d, V, Offringa R, Melief CJ (1998). T-cell help for cytotoxic T lymphocytes is mediated by CD40-CD40L interactions. Nature 393, 480-483.
Schwartzbaum J, Jonsson F, Ahlbom A, Preston-Martin S, Lonn S, Soderberg KC, Feychting M (2003). Cohort studies of association between self-reported allergic conditions, immune-related diagnoses and glioma and meningioma risk. Int. J Cáncer 106, 423-428.
Schwartzbaum J, Jonsson F, Ahlbom A, Preston-Martin S, Malmer B, Lonn S, Soderberg K, Feychting M (2005). Prior hospitalization for epilepsy, diabetes, and stroke and subsequent glioma and meningioma risk. Cáncer Epidemiol. Biomarkers Prev. 14, 643-650.
Schwechheimer K, Huang S, Cavenee WK (1995). EGFR gene amplification--rearrangement in human glioblastomas. Int. J Cáncer 62, 145-148.
Scrideli CA, Carlotti CG, Jr., Okamoto OK, Andrade VS, Cortez MA, Motta FJ, Lucio-Eterovic AK, Neder L, Rosemberg S, Oba-Shinjo SM, Marie SK, Tone LG (2008). Gene expression profile analysis of primary glioblastomas and non-neoplastic brain tissue: identification of potential target genes by oligonucleotide microarray and real-time quantitative PCR. J Neurooncol .
Sehgal A, Boynton AL, Young RF, Vermeulen SS, Yonemura KS, Kohler EP, Aldape HC, Simrell CR, Murphy GP (1998). Cell adhesión molecule Nr-CAM is over-expressed in human brain tumors. Int J Cáncer 76, 451-458.
Sehgal A, Ricks S, Warrick J, Boynton AL, Murphy GP (1999). Antisense human neuroglia related cell adhesión molecule hNr-CAM, reduces the tumorigenic properties of human glioblastoma cells. Anticancer Res. 19, 4947-4953.
Shashidhar S, Lorente G, Nagavarapu U, Nelson A, Kuo J, Cummins J, Nikolich K, Urfer R, Foehr ED (2005). GPR56 is a GPCR that is overexpressed in gliomas and functions in tumor cell adhesión. Oncogene 24, 1673-1682.
Shedlock DJ, Shen H (2003). Requirement for CD4 T cell help in generating functional CD8 T cell memory. Science 300, 337-339.
Shibahara J, Kashima T, Kikuchi Y, Kunita A, Fukayama M (2006). Podoplanin is expressed in subsets of tumors of the central nervous system. Virchows Arch. 448, 493-499.
Shih AH, Holland EC (2006). Notch signaling enhances nestin expression in gliomas. Neoplasia. 8, 1072-1082.
Shiras A, Chettiar ST, Shepal V, Rajendran G, Prasad GR, Shastry P (2007). Spontaneous transformation of human adult nontumorigenic stem cells to cáncer stem cells is driven by genomic instability in a human model of glioblastoma. Stem Cells 25, 1478-1489.
Shostak K, Labunskyy V, Dmitrenko V, Malisheva T, Shamayev M, Rozumenko V, Zozulya Y, Zehetner G, Kavsan V (2003). HC gp-39 gene is upregulated ¡n glioblastomas. Cáncer Lett. 798, 203-210.
Singh SK, Clarke ID, Hide T, Dirks PB (2004a). Cáncer stem cells in nervous system tumors. Oncogene 23, 7267-7273.
Singh SK, Clarke ID, Terasaki M, Bonn VE, Hawkins C, Squire J, Dirks PB (2003). Identification of a cáncer stem cell in human brain tumors. Cáncer Res. 63, 5821-5828.
Singh SK, Hawkins C, Clarke ID, Squire JA, Bayani J, Hide T, Henkelman RM, Cusimano MD, Dirks PB (2004b). Identification of human brain tumour initiating cells. Nature 432, 396-401.
Singh-Jasuja H, Emmerich NP, Rammensee HG (2004). The Tubingen approach: identification, selection, and validation of tumor-associated HLA peptides for cáncer therapy. Cáncer Immunol. Immunother. 53, 187-195.
Sitnikova L, Mendese G, Liu Q, Woda BA, Lu D, Dresser K, Mohanty S, Rock KL, Jiang Z (2008). IMP3 predicts aggressive superficial urothelial carcinoma of the bladder. Clin Cáncer Res. 14, 1701-1706.
Sjo A, Magnusson KE, Peterson KH (2005). Association of alpha-dystrobrevin with reorganizing tight junctions. J Membr. Biol. 203, 21-30.
Span PN, Sweep FC, Wiegerinck ET, Tjan-Heijnen VC, Manders P, Beex LV, de Kok JB (2004). Survivin is an independent prognostic marker for risk stratification of breast cáncer patients. Clin Chem. 50, 1986-1993.
Standifer NE, Ouyang Q, Panagiotopoulos C, Verchere CB, Tan R, Greenbaum CJ, Pihoker C, Nepom GT (2006). Identification of Novel HLA-A*0201 -Restricted Epitopes in Recent-Onset Type 1 Diabetic Subjects and Antibody-Positive Relatives. Diabetes 55, 3061-3067.
Strojnik T, Rosland GV, Sakariassen PO, Kavalar R, Lah T (2007). Neural stem cell markers, nestin and musashi proteins, in the progression of human glioma: correlation of nestin with prognosis of patient survival. Surg Neurol. 68, 133-143.
Su W, Chen J, Yang H, You L, Xu L, Wang X, Li R, Gao L, Gu Y, Lin S, Xu H, Breyer MD, Hao CM (2007). Expression of nestin in the podocytes of normal and diseased human kidneys. Am J Physiol Regul. Integr. Comp Physiol 292, R1761-R1767.
Sugawara K, Kurihara H, Negishi M, Saito N, Nakazato Y, Sasaki T, Takeuchi T (2002). Nestin as a marker for proliferative endothelium in gliomas. Lab Invest 82, 345-351.
Sun G, Yu RT, Evans RM, Shi Y (2007). Orphan nuclear receptor TLX recruits histone deacetylases to repress transcription and regúlate neural stem cell proliferation. Proc Nati. Acad. Sci. U. S. A 104, 15282-15287.
Sun JC, Bevan MJ (2003). Defective CD8 T cell memory following acute infection without CD4 T cell help. Science 300, 339-342.
Suzuki H, Kato Y, Kaneko MK, Okita Y, Narimatsu H, Kato M (2008). Induction of podoplanin by transforming growth factor-beta in human fibrosarcoma. FEBS Lett. 582, 341-345.
Suzuki T, Maruno M, Wada K, Kagawa N, Fujimoto Y, Hashimoto N, Izumoto S, Yoshimine T (2004). Genetic analysis of human glioblastomas using a genomic microarray system. Brain Tumor Pathol. 21, 27-34.
Takano T, Becker LE (1997). Developmental change of the nestin-immunoreactive midline raphe glial structure in human brainstem and spinal cord. Dev. Neurosci. 19, 202-209.
Tan HY, Liu J, Wu S , Luo HS (2005). Expression of a novel apoptosis inhibitor-survivin in colorectal carcinoma. World J Gastroenterol. 11, 4689-4692.
Tanwar MK, Gilbert MR, Holland EC (2002). Gene expression microarray analysis reveáis YKL-40 to be a potential serum marker for malignant character in human glioma. Cáncer Res. 62, 4364-4368.
Teranishi N, Naito Z, Ishiwata T, Tanaka N, Furukawa K, Seya T, Shinji S, Tajiri T (2007). Identification of neovasculature using nestin in colorectal cáncer. Int. J Oncol 30, 593-603.
Teratani T, Domoto T, uriki K, Kageyama T, Takayama T, Ishikawa A, Ozono S, Nozawa R (2007). Detection of transcript for brain-type fatty Acid-binding protein in tumor and uriñe of patients with renal cell carcinoma. Urology 69, 236-240.
Thompson DM, Gilí GN (1985). The EGF receptor: structure, regulation and potential role in malignancy. Cáncer Surv. 4, 767-788.
Tohyama T, Lee VM, Rorke LB, arvin M, McKay RD, Trojanowski JQ (1992). Nestin expression in embryonic human neuroepithelium and in human neuroepithelial tumor cells. Lab Invest 66, 303-313.
Tompkins SM, Rota PA, Moore JC, Jensen PE (1993). A europium fluoroimmunoassay for measuring binding of antigen to class II MHC glycoproteins. J Immunol. Methods 163, 209-216.
Toti P, Regoli M, Nesi G, Occhini R, Bartolommei S, Fonzi L, Bertelli E (2005). Nestin expression in normal adrenal gland and adrenocortical tumors. Histol. Histopathol. 20, 1115-1120.
Tsujimura T, Makiishi-Shimobayashi C, Lundkvist J, Lendahl U, Nakasho K, Sugihara A, Iwasaki T, Mano M, Yamada N, Yamashita K, Toyosaka A, Terada N (2001). Expression of the intermedíate filament nestin in gastrointestinal stromal tumors and interstitial cells of Cajal. Am J Pathol. 158, 817-823.
Uematsu M, Ohsawa I, Aokage T, Nishimaki K, Matsumoto K, Takahashi H, Asoh S, Teramoto A, Ohta S (2005). Prognostic significance of the immunohistochemical índex of survivin in glioma: a comparatíve study with the MIB-1 index. J Neurooncol. 72, 231-238. van Bilsen JH, van DH, Lard LR, van d, V, Elferink DG, Bakker AM, Miltenburg AM, Huizinga TW, de Vries RR, Toes RE (2004). Functional regulatory immune responses against human cartilage glycoprotein-39 in health vs. proinflammatory responses in rheumatoid arthritis. Proc. Nati. Acad. Sci. U. S. A 101, 17180-17185. van der Bruggen P, Traversari C, Chomez P, Lurquin C, De PE, Van den EB, Knuth A, Boon T (1991). A gene encoding an antigen recognized by cytolytic T lymphocytes on a human melanoma. Science 254, 1643-1647.
Vanderwinden JM, Gillard K, De Laet MH, Messam CA, Schiffmann SN (2002). Distribution of the intermedíate filament nestin in the muscularis propria of the human gastrointestinal tract. Cell Tissue Res. 309, 261-268.
Veerkamp JH, Zimmerman AW (2001). Fatty acid-binding proteins of nervous tissue. J Mol. Neuroscí. 16, 133-142.
Veselska R, Kuglik P, Cejpek P, Svachova H, Neradil J, Loja T, Relichova J (2006). Nestin expression in the cell lines derived from glioblastoma multiforme. BMC. Cáncer 6, 32.
Viapiano MS, Bi WL, Piepmeier J, Hockfield S, Matthews RT (2005). Novel tumor-specific isoforms of BEHAB/brevican identified in human malignant gliomas. Cáncer Res. 65, 6726-6733.
Viapiano MS, Hockfield S, Matthews RT (2008). BEHAB/brevican requires ADAMTS-mediated proteolytic cleavage to promote glioma invasión. J Neurooncol.
Vigneron N, Stroobant V, Chápiro J, Ooms A, Degiovanni G, Morel S, van der BP, Boon T, Van Den Eynde BJ (2004). An antigenic peptide produced by peptide splicing in the proteasome. Science 304, 587-590.
Vogt AB, Kropshofer H, Kalbacher H, Kalbus M, Rammensee HG, Coligan JE, Martin R (1994). Ligand motifs of HLA-DRB5*0101 and DRB1*1501 molecules delineated from self-peptides. J Immunol. 153, 1665-1673.
Walter S, Herrgen L, Schoor O, Jung G, Wernet D, Buhring HJ, Rammensee HG, Stevanovic S (2003). Cutting edge: predetermined avidity of human CD8 T cells expanded on calibrated M HC/anti-CD28-coated microspheres. J. Immunol. 171, 4974-4978.
Wang JC, Livingstone AM (2003). Cutting edge: CD4+ T cell help can be essential for primary CD8+ T cell responses in vivo. J Immunol. 171, 6339-6343.
Wei LC, Shi M, Cao R, Chen LW, Chan YS (2008). Nestin small ¡nterfering RNA (siRNA) reduces cell growth in cultured astrocytoma cells. Brain Res. 1196, 103-112.
Weinschenk T, Gouttefangeas C, Schirle M, Obermayr F, Walter S, Schoor O, Kurek R, Loeser W, Bichler KH, Wernet D, Stevanovic S, Rammensee HG (2002). Integrated functional genomics approach for the design of patient-individual antitumor vaccines. Cáncer Res. 62, 5818-5827.
Wicki A, Lehembre F, Wick N, Hantusch B, Kerjaschki D, Christofori G (2006). Tumor invasión in the absence of epithelial-mesenchymal transition: podoplanin-mediated remodeling of the actin cytoskeleton. Cáncer Cell 9, 261-272.
Winer S, Tsui H, Lau A, Song A, Li X, Cheung RK, Sampson A, Afifiyan F, Elford A, Jackowski G, Becker DJ, Santamaría P, Ohashi P, Dosch HM (2003). Autoimmune islet destruction in spontaneous type 1 diabetes is not beta-cell exclusive. Nat. Med 9, 198-205.
Wiranowska M, Ladd S, Smith SR, Gottschall PE (2006). CD44 adhesión molecule and neuro-glial proteoglycan NG2 as invasive markers of glioma. Brain Cell Biol. 35, 159-172.
Xie D, Zeng YX, Wang HJ, Wen JM, Tao Y, Sham JS, Guan XY (2006). Expression of cytoplasmic and nuclear Survivin in primary and secondary human glioblastoma. Br. J Cáncer 94, 108-114.
Xu L, Begum S, Hearn JD, Hynes RO (2006). GPR56, an atypical G protein-coupled receptor, binds tissue transglutaminase, TG2, and inhibits melanoma tumor growth and metástasis. Proc Nati. Acad. Sci. U. S. A 103, 9023-9028.
Xu L, Hynes RO (2007). GPR56 and TG2: possible roles in suppression of tumor growth by the microenvironment. Cell Cycle 6, 160-165.
Yamashita S, Masuda Y, Kurizaki T, Haga Y, Murayama T, Ikei S, Kamei M, Takeno S, Kawahara K (2007). Survivin expression predicts early recurrence in early-stage breast cáncer. Anticancer Res. 27, 2803-2808.
Yang J, Price MA, Neudauer CL, Wilson C, Ferrone S, Xia H, lida J, Simpson MA, McCarthy JB (2004). Melanoma chondroitin sulfate proteoglycan enhances FAK and ERK activation by distinct mechanisms. J Cell Biol. 165, 881-891.
Yantiss RK, Cosar E, Fischer AH (2008). Use of IMP3 in Identification of carcinoma in fine needle aspiration biopsies of páncreas. Acta Cytol. 52, 133-138.
Yantiss RK, Woda BA, Fanger GR, Kalos M, Whalen GF, Tada H, Andersen DK, Rock KL, Dresser K (2005). KOC (K homology domain containing protein overexpressed in cáncer): a novel molecular marker that distinguishes between benign and malignant lesions of the páncreas. Am J Surg Pathol. 29, 188-195.
Yee C, Thompson JA, Byrd D, Riddell SR, Roche P, Celis E, Greenberg PD (2002). Adoptive T cell therapy using antigen-specific CD8+ T cell clones for the treatment of patients with metastatic melanoma: in vivo persistence, migration, and antitumor effect of transferred T cells. Proc. Nati. Acad. Sci. U. S. A 99, 16168-16173. yuso-Sacido A, Graham C, Greenfield JP, Boockvar JA (2006). The duality of epidermal growth factor receptor (EGFR) signaling and neural stem cell phenotype: cell enhancer or cell transformer? Curr. Stem Cell Res. Ther. 1, 387-394.
Zangen I, Kneitz S, Monoranu CM, Rutkowski S, Hinkes B, Vince GH, Huang B, Roggendorf W (2007). Ependymoma gene expression profiles associated with histological subtype, proliferation, and patient survival. Acta Neuropathol. 113, 325-337.
Zaremba S, Barzaga E, Zhu M, Soares N, Tsang KY, Schlom J (1997). Identification of an enhancer agonist cytotoxic T lymphocyte peptide from human carcinoembryonic antigen. Cáncer Res. 57, 4570-4577.
Zawrocki A, Biernat W (2005). Epidermal growth factor receptor in glioblastoma. Folia Neuropathol. 43, 123-132.
Zeh HJ, III, Perry-Lalley D, Dudley ME, Rosenberg SA, Yang JC (1999). High avidity CTLs for two self-antigens demónstrate superior in vitro and in vivo antitumor efficacy. J Immunol. 162, 989-994.
Zhen HN, Zhang X, Hu PZ, Yang TT, Fei Z, Zhang JN, Fu LA, He XS, Ma FC, Wang XL (2005). Survivin expression and its relation with proliferation, apoptosis, and angiogenesis in brain gliomas. Cáncer 104, 2775-2783.
Zheng W, Yi X, Fadare O, Liang SX, Martel M, Schwartz PE, Jiang Z (2008). The oncofetal protein IMP3: a novel biomarker for endometrial serous carcinoma. Am J Surg Pathol. 32, 304-315.
Zhou R, Skalli O (2000). TGF-alpha differentially regulates GFAP, vimentin, and nestin gene expression in U-373 MG glioblastoma cells: correlation with cell shape and motility. Exp.
Cell Res. 254, 269-278.
Zimmerman L, Parr B, Lendahl U, Cunningham M, McKay R, Gavin B, Mann J, Vassileva G, McMahon A (1994).
Independent regulatory elements in the nestin gene direct transgene expression to neural stem cells or muscle precursors.
Neuron 12, 11-24.
Ziu M, Schmidt NO, Cargioli TG, Aboody KS, Black PM, Carroll RS (2006). Glioma-produced extracellular matrix ¡nfluences brain tumor tropism of human neural stem cells. J Neurooncol. 79, 125-133.
Zukiel R, Nowak S, Wyszko E, Rolle K, Gawronska I, Barciszewska MZ, Barciszewski J (2006). Suppression of human brain tumor with interference RNA specific for tenascin-C.
Cáncer Biol. Ther. 5, 1002-1007.
Zulewski H, Abraham EJ, Gerlach MJ, Daniel PB, Moritz W, Muller B, Vallejo M , Thomas MK, Habener JF (2001). Multipotential nestin-positive stem cells isolated from adult pancreatic islets differentiate ex vivo into pancreatic endocrine, exocrine, and hepatic phenotypes. Diabetes 50, 521-533.

Claims (22)

REIVINDICACIONES
1. Péptido que comprende una secuencia que se selecciona del grupo de SEQ ID n.° 1 a SEQ ID n.° 30 o una variante de las mismas que es al menos un 85% homóloga a las SEQ ID n.° 1 a SEQ ID n.° 30 o una variante de las mismas que induce la reacción cruzada de linfocitos T con la mencionada variante de péptido, en el que el mencionado péptido no es el polipéptido completo subyacente.
2. Péptido o variante del mismo según la reivindicación 1 , en el que el mencionado péptido o variante del mismo mantiene la habilidad para unirse a una molécula del complejo mayor de histocompatibilidad humana (MHC) de clase I o II, y en el que el mencionado péptido es capaz de estimular linfocitos T CD4 y/o CD8.
3. Péptido según la reivindicación 1 o 2, en donde la secuencia de aminoácidos del mismo comprende una cadena continua de aminoácidos según el grupo de secuencias SEQ ID n.° 1 a SEQ ID n.° 30.
4. Péptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde el mencionado péptido se selecciona de un péptido con un subtipo HLA específico según la tabla 2, que es capaz de estimular células CD8, y en el que el mencionado péptido comprende el motivo de aminoácido de residuo conservado específico como se describe en la tabla 2.
5. Péptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde el mencionado péptido o variante del mismo tiene una longitud total de entre 8 y 100, preferiblemente entre 8 y 30, y más preferiblemente entre 8 y 16 aminoácidos, y con la máxima preferencia en el que el péptido consta de o consta esencialmente de una secuencia de aminoácidos según las SEQ ID n.° 1 a SEQ ID n.° 30.
6. Péptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde el mencionado péptido es modificado y/o incluye enlaces no peptídicos.
7. Péptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde el mencionado péptido es una proteína de fusión, que en particular comprende aminoácidos aminoterminales de la cadena invariante (li) asociada al antígeno HLA-DR.
8. Ácido nucleico, que codifica un péptido según una cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 7.
9. Vector de expresión capaz de expresar un ácido nucleico según la reivindicación 8.
10. Péptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, ácido nucleico según la reivindicación 8 o vector de expresión según la reivindicación 9 para su uso en medicina.
11. Célula huésped que comprende el ácido nucleico según la reivindicación 8 o el vector de expresión según la reivindicación 9, donde la mencionada célula huésped es preferiblemente una célula presentadora de antígenos, en particular una célula dendrítica o una célula presentadora de antígenos.
12. Método para producir un péptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, comprendiendo el método el cultivo de la célula huésped según la reivindicación 11 que expresa el ácido nucleico según la reivindicación 8 o el vector de expresión según la reivindicación 9, y el aislamiento del péptido de la célula huésped o de su medio de cultivo.
13. Método in vitro para producir linfocitos T citotóxicos (CTL) activados, comprendiendo el método el contacto in vitro de los CTL con moléculas MHC de clase I o II humanas con carga de antígenos expresadas en la superficie de una célula presentadora de antígenos adecuada o un constructo artificial que mimetiza una célula presentadora de antígenos durante un periodo de tiempo suficiente para activar los mencionados CTL de una forma específica de antígeno, en donde el mencionado antígeno es un péptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10.
14. Linfocito T citotóxico (CTL) activado, producido mediante el método según la reivindicación 13, que reconoce de forma selectiva una célula que expresa de forma aberrante un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos dada en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.
15. Método para matar células diana en un paciente cuyas células diana expresan de forma aberrante un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos dada en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, comprendiendo el método la administración al paciente de un número efectivo de linfocitos T citotóxicos (CTL) como los definidos en la reivindicación 14.
16. Uso de un péptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, péptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, ácido nucleico según la reivindicación 8, vector de expresión según la reivindicación 9, célula según la reivindicación 11, o linfocito T citotóxico activado según la reivindicación 14 para el tratamiento del cáncer o en la fabricación de un medicamento contra el cáncer, donde el medicamento mencionado es preferiblemente una vacuna.
17. Uso conforme a la reivindicación 16, donde el mencionado cáncer es seleccionado de astrocitoma, astrocitoma pilocítico, tumor neuroepitelial disembrioplásico, oligodendrogliomas, ependimoma, glioblastoma multiforme, gliomas combinados, oligoastrocitomas, meduloblastoma, retinoblastoma, neuroblastoma , germinoma, teratoma, gangliogliomas, gangliocitoma, gangliocitoma central, tumores neuroectodermales primitivos (PNET, p. ej. meduloblastoma, meduloepitelioma, neuroblastoma, retinoblastoma, ependimoblastoma), tumores del parénquima pineal (p. ej., pineocitoma, pineoblastoma), tumores de células ependimales, tumores del plexo coroideo, tumores neuroepiteliales de origen incierto (p. ej., gliomatosis cerebri, astroblastoma), tumor prostético glioblastoma, cáncer de mama, cáncer de esófago, cáncer colorrectal, carcinoma de células renales de células claras, cáncer de pulmón, cáncer pancreático melanoma, ovárico, SNC, carcinoma de células escamosas, leucemia meduloblastoma, colon, recto, estómago, riñon, pulmón, páncreas, próstata, piel y otros tumores que muestran una sobreexpresión de survivina y/o CSPG4 y/o otras proteínas de las que derivan los péptidos de las SEQ ID n.° 1 a SEQ ID n.° 30.
18. Un kit, que comprende: (a) un envase que contiene una composición farmacéutica que contiene un péptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, el ácido nucleico según la reivindicación 8, el vector de expresión según la reivindicación 9, una célula según la reivindicación 11, o un linfocito T citotóxico activado según la reivindicación 14 como se describe más arriba, en solución o el forma liofilizada; (b) opcionalmente, un segundo envase que contiene una solución reconstituyente o diluyente para la formulación liofilizada; (c) opcionalmente, al menos un péptido más seleccionado del grupo compuesto de los péptidos según las SEQ ID n.° 1 a 30, y (d) opcionalmente, instrucciones para (i) el uso de la solución o (ii) la reconstitución y/o el uso de la formulación liofilizada.
19. Kit según la reivindicación 18, comprendiendo además uno o más de (iii)un amortiguador, (iv) un diluyente, (v) un filtro, (vi) una aguja, o (v) una jeringuilla.
20. Kit según la reivindicación 18 o 19, en donde el mencionado péptido se selecciona del grupo que consta de las SEQ ID n.° 1 y SEQ ID n.° 20.
21. Método para distinguir el glioblastoma de otras formas de cáncer que comprende el análisis de la expresión de BCA, CLIP2, DTNA, NLGNAX, NR2E1, NRCAM y/o PDPN en una muestra obtenida del cerebro u otro espécimen tumoral de un sujeto al que se vaya a diagnosticar.
22. Kit para medir el nivel de expresión de BCA, CLIP2, DTNA, NLGNAX, NR2E1, NRCAM y/o PDPN como gen(es) marcador(es) de glioblastoma, que comprende al menos un anticuerpo que se une específicamente a un polipéptido marcador de glioblastoma elegido, o uno o más ácidos nucleicos que se hibridan específicamente con ARNm de PDPN, BCA, CLIP2, DTNA, NLGNAX, NR2E1 y/o NRCAM, y, opcionalmente, un control (por ejemplo, una cantidad específica de un polipéptido marcador de glioblastoma particular), anticuerpos primarios y secundarios cuando sea necesario, y opcionalmente otros reactivos, como regiones detectables, substratos de enzima, y/o reactivos de color.
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Application Number Title Priority Date Filing Date
MX2011003539A MX2011003539A (es) 2008-10-01 2009-09-28 Novedoso inmunotratamiento contra diversos tumores incluidos tumores neuronales y cerebrales.
MX2011003540A MX2011003540A (es) 2008-10-01 2009-09-28 Composicion de peptidos asociados a tumores y vacunas contra el cancer relacionadas con ellos para el tratamiento del glioblastoma y de otros tipos de cancer.
MX2012012047A MX338294B (es) 2008-10-01 2009-09-28 Novedoso inmunotratamiento contra diversos tumores incluidos tumores neuronales y cerebrales.

Family Applications After (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
MX2011003540A MX2011003540A (es) 2008-10-01 2009-09-28 Composicion de peptidos asociados a tumores y vacunas contra el cancer relacionadas con ellos para el tratamiento del glioblastoma y de otros tipos de cancer.
MX2012012047A MX338294B (es) 2008-10-01 2009-09-28 Novedoso inmunotratamiento contra diversos tumores incluidos tumores neuronales y cerebrales.

Country Status (25)

Country Link
US (19) US8119139B2 (es)
EP (12) EP2172211B1 (es)
JP (10) JP5855940B2 (es)
KR (6) KR20220058655A (es)
CN (3) CN102170901B (es)
AU (2) AU2009300088B2 (es)
BR (2) BRPI0920759A2 (es)
CA (9) CA2936920C (es)
CY (11) CY1116302T1 (es)
DK (12) DK2172211T3 (es)
EA (3) EA023013B1 (es)
ES (12) ES2536465T3 (es)
HK (2) HK1159526A1 (es)
HR (12) HRP20201025T8 (es)
HU (11) HUE031030T2 (es)
LT (10) LT2172212T (es)
MX (3) MX2011003539A (es)
NZ (4) NZ624533A (es)
PL (12) PL2172211T3 (es)
PT (12) PT2172211E (es)
RS (12) RS53782B1 (es)
SI (12) SI2172211T1 (es)
TR (2) TR201900852T4 (es)
UA (3) UA110599C2 (es)
WO (2) WO2010037513A1 (es)

Families Citing this family (104)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8435507B2 (en) 2004-08-19 2013-05-07 University Of Maryland Prostate-specific antigen-derived MHC class II restricted peptides and their use in vaccines to treat or prevent prostate cancer
US20120052080A1 (en) * 2004-09-21 2012-03-01 University Of Pittsburgh - Of The Commonwealth System Of Higher Education Interleukin-13 receptor alpha 2 peptide-based brain cancer vaccines
US7612162B2 (en) 2004-09-21 2009-11-03 University Of Pittsburgh - Of The Commonwealth System Of Higher Education Peptide analogs capable of enhancing stimulation of a glioma-specific CTL response
PL2660248T3 (pl) * 2007-07-27 2015-11-30 Immatics Biotechnologies Gmbh Nowa immunoterapia przeciwko nowotworom mózgu
PT2113253E (pt) * 2008-04-30 2010-06-15 Immatics Biotechnologies Gmbh Formulações novas de peptídeos associados a tumores que se ligam a moléculas de classe i ou ii do antígeno leucocitário humano (hla) para vacinas
SI2119726T2 (en) * 2008-05-14 2018-03-30 Immatics Biotechnologies Gmbh New and powerful Class II MHC peptides derived from survivin and neurocane
ES2536465T3 (es) 2008-10-01 2015-05-25 Immatics Biotechnologies Gmbh Composición de péptidos tumor-asociados y relacionados con la vacuna contra el cáncer para el tratamiento de glioblastoma (GBM) y otros cánceres
TW201124530A (en) * 2009-12-01 2011-07-16 Oncotherapy Science Inc IMP-3 oligopeptides and vaccines including the same
SE535982C2 (sv) * 2009-12-15 2013-03-19 Theravac Pharmaceuticals Ab Ett nytt vaccin som angriper tumörkärl som ett effektivt redskap i tumörterapi
AU2015200751B2 (en) * 2010-03-19 2016-11-10 Immatics Biotechnologies Gmbh Novel immunotherapy against several tumors including gastrointestinal and gastric cancer
GB201004551D0 (en) * 2010-03-19 2010-05-05 Immatics Biotechnologies Gmbh NOvel immunotherapy against several tumors including gastrointestinal and gastric cancer
US20140017266A1 (en) * 2010-12-03 2014-01-16 The Government Of The United States, As Represented By The Secretary Of Hhs, Nih Anti-podoplanin antibodies and methods of use
AU2011344652B2 (en) * 2010-12-14 2015-11-19 Immatics Biotechnologies Gmbh HLA-binding peptides derived from prostate-associated antigenic molecules and methods of use thereof
US20140154269A1 (en) * 2011-04-26 2014-06-05 The Methodist Hospital Research Institute Targeted nanovectors and their use for treatment of brain tumors
WO2013040499A1 (en) * 2011-09-14 2013-03-21 Northwestern University Nanoconjugates able to cross the blood-brain barrier
GB201120779D0 (en) * 2011-12-02 2012-01-11 Immodulon Therapeutics Ltd Cancer therapy
CA2862706C (en) 2012-01-20 2021-08-03 Dennis Brown Use of substituted hexitols including dianhydrogalactitol and analogs to treat neoplastic disease and cancer stem cells including glioblastoma multforme and medulloblastoma
US10704021B2 (en) 2012-03-15 2020-07-07 Flodesign Sonics, Inc. Acoustic perfusion devices
CN103372217B (zh) * 2012-04-28 2014-12-10 中国科学院深圳先进技术研究院 聚合物纳米载体制剂及其制备方法和应用
DK3536334T3 (da) 2012-05-16 2021-09-13 Stemline Therapeutics Inc Cancer stamcelle målrettede cancer vacciner
CN112587671A (zh) * 2012-07-18 2021-04-02 博笛生物科技有限公司 癌症的靶向免疫治疗
PL3456339T3 (pl) 2013-08-05 2022-03-21 Immatics Biotechnologies Gmbh Nowa immunoterapia przeciwko szeregu nowotworom, takim jak rak płuc, w tym nsclc
TWI777194B (zh) * 2013-08-05 2022-09-11 德商伊瑪提克斯生物科技有限公司 新穎肽類，細胞及其用於治療多種腫瘤的用途，其製造方法及包含其等之醫藥組成物（一）
GB201319446D0 (en) 2013-11-04 2013-12-18 Immatics Biotechnologies Gmbh Personalized immunotherapy against several neuronal and brain tumors
MX2019013161A (es) * 2013-11-04 2020-02-03 Immatics Biotechnologies Gmbh Inmunoterapia personalizada contra diversos tumores cerebrales y neuronales.
CN104698059B (zh) * 2013-12-04 2017-07-21 苏州中赢医疗科技有限公司 一种脑胶质瘤肿瘤标志物及其应用
GB201322725D0 (en) 2013-12-20 2014-02-05 Immodulon Therapeutics Ltd Cancer therapy
WO2015105955A1 (en) 2014-01-08 2015-07-16 Flodesign Sonics, Inc. Acoustophoresis device with dual acoustophoretic chamber
KR101503341B1 (ko) 2014-03-12 2015-03-18 국립암센터 자가암항원 특이적 cd8+ t 세포의 분리 및 증식방법
DK3134432T3 (da) 2014-04-25 2020-03-30 Bluebird Bio Inc Kimære antigenreceptorer med mnd-promoter
JP6613526B2 (ja) * 2014-05-28 2019-12-04 学校法人東京女子医科大学 膠芽腫の予測方法
JP2015227292A (ja) * 2014-05-30 2015-12-17 国立大学法人高知大学 膵がん細胞浸潤転移抑制ワクチン
SG11201610170SA (en) * 2014-06-06 2017-01-27 Bluebird Bio Inc Improved t cell compositions
JP6366379B2 (ja) * 2014-06-20 2018-08-01 キヤノン株式会社 被検体情報取得装置
MX2017001079A (es) 2014-07-24 2017-09-12 Bluebird Bio Inc Receptores de antígeno quiméricos de antígeno de maduración de células b (bcma).
US10434157B2 (en) * 2014-11-06 2019-10-08 Ose Immunotherapeutics Therapeutic multi-peptides T specific immune therapy for treatment of brain metastasis
EP3230321B1 (en) 2014-12-12 2019-08-28 Bluebird Bio, Inc. Bcma chimeric antigen receptors
HUE057014T2 (hu) * 2014-12-23 2022-04-28 Immatics Biotechnologies Gmbh Új peptidek és peptidkombinációk, hepatocelluláris karcinóma (hcc) és más rákok elleni immunoterápiában történõ alkalmazásra
GB201501017D0 (en) * 2014-12-23 2015-03-04 Immatics Biotechnologies Gmbh Novel peptides and combination of peptides for use in immunotherapy against hepatocellular carcinoma (HCC) and other cancers
GB201423361D0 (en) * 2014-12-30 2015-02-11 Immatics Biotechnologies Gmbh Method for the absolute Quantification of naturally processed HLA-Restricted cancer peptides
GB201505585D0 (en) 2015-03-31 2015-05-13 Immatics Biotechnologies Gmbh Novel peptides and combination of peptides and scaffolds for use in immunotherapy against renal cell carinoma (RCC) and other cancers
US11377651B2 (en) 2016-10-19 2022-07-05 Flodesign Sonics, Inc. Cell therapy processes utilizing acoustophoresis
US11708572B2 (en) 2015-04-29 2023-07-25 Flodesign Sonics, Inc. Acoustic cell separation techniques and processes
GB201507719D0 (en) 2015-05-06 2015-06-17 Immatics Biotechnologies Gmbh Novel peptides and combination of peptides and scaffolds thereof for use in immunotherapy against colorectal carcinoma (CRC) and other cancers
JP6985153B2 (ja) * 2015-05-06 2021-12-22 イマティクス バイオテクノロジーズ ゲーエムベーハー 結腸直腸がん（ｃｒｃ）およびその他のがんに対する免疫療法で使用するための新規ペプチドおよびペプチドとそのスキャフォールドとの組み合わせ
NL2014935B1 (en) 2015-06-08 2017-02-03 Applied Immune Tech Ltd T cell receptor like antibodies having fine specificity.
US11305002B2 (en) 2015-06-09 2022-04-19 The Board Of Regents Of The University Of Oklahoma Compositions and treatments for Haemophilus influenzae
BR112017028163A2 (pt) 2015-06-24 2018-08-28 Immodulon Therapeutics Ltd inibidor da via de sinalização e um mycobacterium de célula inteira para o uso em terapia contra o câncer
GB201511546D0 (en) 2015-07-01 2015-08-12 Immatics Biotechnologies Gmbh Novel peptides and combination of peptides for use in immunotherapy against ovarian cancer and other cancers
MA42294B1 (fr) 2015-07-01 2020-11-30 Immatics Biotechnologies Gmbh Nouveaux peptides et combinaison de peptides à utiliser en immunothérapie contre le cancer de l'ovaire et d'autres cancers
EP4321172A3 (en) * 2015-07-06 2024-08-21 immatics biotechnologies GmbH Novel peptides and combination of peptides for use in immunotherapy against esophageal cancer and other cancers
MY189596A (en) * 2015-07-15 2022-02-18 Immatics Biotechnologies Gmbh A novel peptides for use in immunotherapy against epithelial ovarian cancer and other cancers
GB201513921D0 (en) * 2015-08-05 2015-09-23 Immatics Biotechnologies Gmbh Novel peptides and combination of peptides for use in immunotherapy against prostate cancer and other cancers
TWI782434B (zh) 2015-08-28 2022-11-01 德商英麥提克生物技術股份有限公司 用於多種癌症之免疫治療的新穎胜肽、胜肽的組合物及支架
GB201515321D0 (en) 2015-08-28 2015-10-14 Immatics Biotechnologies Gmbh Novel peptides, combination of peptides and scaffolds for use in immunotherapeutic treatment of various cancers
EP3344276B1 (en) 2015-09-03 2020-04-22 The Board of Regents of the University of Oklahoma Peptide inhibitors of clostridium difficile tcdb toxin
US11479755B2 (en) 2015-12-07 2022-10-25 2Seventy Bio, Inc. T cell compositions
GB201521746D0 (en) * 2015-12-10 2016-01-27 Immatics Biotechnologies Gmbh Novel peptides and combination of peptides for use in immunotherapy against CLL and other cancers
SG11201804957VA (en) 2015-12-16 2018-07-30 Gritstone Oncology Inc Neoantigen identification, manufacture, and use
US10604759B2 (en) 2016-01-15 2020-03-31 City Of Hope Targeting glioblastoma stem cells through the TLX-TET3 axis
GB201603568D0 (en) * 2016-03-01 2016-04-13 Immatics Biotechnologies Gmbh Efficient treatment options including peptides and combination of peptide and cell based medicaments for use in immunotherapy against urinary bladder cancer
CN105664134B (zh) * 2016-03-13 2019-04-26 浙江药苑生物科技有限公司 一种用于治疗骨癌的药物组合物
GB201604490D0 (en) * 2016-03-16 2016-04-27 Immatics Biotechnologies Gmbh Peptides combination of peptides for use in immunotherapy against cancers
GB201604494D0 (en) 2016-03-16 2016-04-27 Immatics Biotechnologies Gmbh Transfected T-Cells and T-Cell receptors for use in immunotherapy against cancers
EP4177264A1 (en) 2016-03-16 2023-05-10 Immatics Biotechnologies GmbH Transfected t-cells and t-cell receptors for use in immunotherapy against cancers
MX2018012152A (es) * 2016-04-06 2019-02-07 Immatics Biotechnologies Gmbh Nuevos peptidos y nuevas combinaciones de peptidos para el uso en la inmunoterapia contra la leucemia mieloide aguda (aml) y otros tipos de cancer.
US11214789B2 (en) 2016-05-03 2022-01-04 Flodesign Sonics, Inc. Concentration and washing of particles with acoustics
WO2017194170A1 (en) * 2016-05-13 2017-11-16 Biontech Rna Pharmaceuticals Gmbh Methods for predicting the usefulness of proteins or protein fragments for immunotherapy
KR101881300B1 (ko) 2016-06-30 2018-07-25 영남대학교 산학협력단 아조피라졸 화합물 및 은 촉매 반응을 이용한 이의 신규한 합성방법
EP3518948B1 (en) * 2016-10-03 2023-04-12 Ottawa Hospital Research Institute Compositions and methods for enhancing growth, spread, and oncolytic and immunotherapeutic efficacy of oncolytic rna viruses
KR102379955B1 (ko) 2016-12-08 2022-03-29 이매틱스 바이오테크놀로지스 게엠베하 짝짓기가 향상된 t 세포 수용체
DE102016123893A1 (de) 2016-12-08 2018-06-14 Immatics Biotechnologies Gmbh T-Zellrezeptoren mit verbesserter Bindung
EP3558339B1 (en) * 2016-12-22 2024-01-24 Cue Biopharma, Inc. T-cell modulatory multimeric polypeptides and methods of use thereof
US10174122B2 (en) 2017-01-06 2019-01-08 Eutilex Co., Ltd. Anti-human 4-1BB antibodies and uses thereof
GB201702863D0 (en) * 2017-02-22 2017-04-05 Evox Therapeutics Ltd Improved loading of EVs with therapeutic proteins
US20180248175A1 (en) * 2017-02-28 2018-08-30 Lyten, Inc. Mixed allotrope particulate carbon films and carbon fiber mats
PE20191842A1 (es) * 2017-05-08 2019-12-31 Gritstone Oncology Inc Vectores de neoantigeno de alfavirus
CN107034305A (zh) * 2017-06-19 2017-08-11 上海市第十人民医院 恶性胶质瘤的一种诊断标志物
CN107058596A (zh) * 2017-06-19 2017-08-18 上海市第十人民医院 一种与恶性胶质瘤诊断相关的标志物及其应用
CA3078744A1 (en) 2017-10-10 2019-04-18 Gritstone Oncology, Inc. Neoantigen identification using hotspots
CN111630602A (zh) 2017-11-22 2020-09-04 磨石肿瘤生物技术公司 减少新抗原的接合表位呈递
CN111480345B (zh) 2017-12-14 2022-04-29 弗洛设计声能学公司 声泳系统及其操作方法、控制声换能器及声学系统的方法
CN111344402A (zh) * 2017-12-14 2020-06-26 Ezy生物科技有限公司 受试者特异性肿瘤抑制细胞及其用途
FI3773689T3 (fi) * 2018-04-11 2023-01-31 Antigeenisiä peptidejä syövän ehkäisyyn ja hoitoon
CN108715832B (zh) * 2018-06-01 2020-11-10 段海峰 一种抑制肿瘤生长的间充质干细胞及制备方法和应用
WO2020110154A1 (en) * 2018-11-30 2020-06-04 Bharat Biotech International Limited A chimeric therapeutic vaccine
RU2706554C1 (ru) * 2018-12-13 2019-11-19 Российская Федерация, от имени которой выступает ФОНД ПЕРСПЕКТИВНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ Способ создания противоинфекционной иммунологической защиты к Salmonella typhimurium и Listeria monocytogenes с помощью трансгенеза Т-лимфоцитов
CN109796536B (zh) * 2019-02-22 2021-09-17 上海尚泰生物技术有限公司 一种靶向胶质母细胞瘤多种抗原表位的ctl的制备方法
CN113939320A (zh) * 2019-04-05 2022-01-14 医尔利有限公司 用于合成的生物标志物的改进的方法和组合物
EP3977402A1 (en) 2019-05-28 2022-04-06 PAIGE.AI, Inc. Systems and methods for processing images to prepare slides for processed images for digital pathology
CN110579457B (zh) * 2019-09-20 2021-11-02 郑州大学第一附属医院 波形蛋白特异响应性荧光探针及其制备方法和应用
CN112824427B (zh) * 2019-11-18 2022-06-24 杨小骏 一种抑制胶质瘤的短肽及其应用
CN113318225B (zh) * 2020-02-28 2024-01-19 无锡派列博生物医药科技有限公司 肿瘤免疫增强剂及其制法和应用
CN113388006A (zh) * 2020-03-18 2021-09-14 北京鼎成肽源生物技术有限公司 一种乳腺癌靶标抗原、乳腺癌靶标抗原刺激培养的ctl细胞及其应用
EP4127188A4 (en) 2020-03-31 2024-08-21 Walking Fish Therapeutics MODIFIED B CELLS AND METHODS OF USE THEREOF
BR112022019797A2 (pt) * 2020-03-31 2022-12-13 Walking Fish Therapeutics Células b modificadas e métodos para uso das mesmas
AU2021320896A1 (en) 2020-08-06 2023-03-23 Gritstone Bio, Inc. Multiepitope vaccine cassettes
KR20220022021A (ko) 2020-08-14 2022-02-23 서울대학교산학협력단 B형 간염 바이러스 유래 폴리펩티드를 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물
EP4203994A4 (en) * 2020-08-28 2024-07-03 Torigen Pharmaceuticals Inc PREPARATIONS WITH IMPROVED IMMUNE MEMORY AND USES THEREOF
US11058751B1 (en) 2020-11-20 2021-07-13 Think Therapeutics, Inc. Compositions for optimized RAS peptide vaccines
US11421015B2 (en) 2020-12-07 2022-08-23 Think Therapeutics, Inc. Method of compact peptide vaccines using residue optimization
US11464842B1 (en) 2021-04-28 2022-10-11 Think Therapeutics, Inc. Compositions and method for optimized peptide vaccines using residue optimization
WO2023192820A2 (en) * 2022-03-30 2023-10-05 Iogenetics, Llc Tumor-associated antigens in brain tumors
PL441229A1 (pl) * 2022-05-19 2023-11-20 Instytut Biologii Doświadczalnej im. Marcelego Nenckiego Polska Akademia Nauk Zaprojektowane, syntetyczne peptydy, zawierające je kompozycje i sposoby ich zastosowania w leczeniu glejaków złośliwych

Family Cites Families (70)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4440859A (en) 1977-05-27 1984-04-03 The Regents Of The University Of California Method for producing recombinant bacterial plasmids containing the coding sequences of higher organisms
US4704362A (en) 1977-11-08 1987-11-03 Genentech, Inc. Recombinant cloning vehicle microbial polypeptide expression
LU88258I2 (es) 1978-12-22 1994-02-03
US4530901A (en) 1980-01-08 1985-07-23 Biogen N.V. Recombinant DNA molecules and their use in producing human interferon-like polypeptides
US4342566A (en) 1980-02-22 1982-08-03 Scripps Clinic & Research Foundation Solid phase anti-C3 assay for detection of immune complexes
US4678751A (en) 1981-09-25 1987-07-07 Genentech, Inc. Hybrid human leukocyte interferons
US4766075A (en) 1982-07-14 1988-08-23 Genentech, Inc. Human tissue plasminogen activator
US4582800A (en) 1982-07-12 1986-04-15 Hoffmann-La Roche Inc. Novel vectors and method for controlling interferon expression
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4757006A (en) 1983-10-28 1988-07-12 Genetics Institute, Inc. Human factor VIII:C gene and recombinant methods for production
US4677063A (en) 1985-05-02 1987-06-30 Cetus Corporation Human tumor necrosis factor
US4810648A (en) 1986-01-08 1989-03-07 Rhone Poulenc Agrochimie Haloarylnitrile degrading gene, its use, and cells containing the gene
US4897445A (en) 1986-06-27 1990-01-30 The Administrators Of The Tulane Educational Fund Method for synthesizing a peptide containing a non-peptide bond
US5338839A (en) * 1988-04-12 1994-08-16 Massachusetts Institute Of Technology DNA encoding nestin protein
KR100235089B1 (en) 1992-05-14 1999-12-15 Mitsui Chemicals Inc Ptp or blister packaging articles and packaging material therefor
GB2267257A (en) 1992-05-14 1993-12-01 Ford Motor Co A vehicle load compartment liner.
ATE157100T1 (de) 1993-06-03 1997-09-15 Therapeutic Antibodies Inc Antikoerperfragmente in therapie
AUPM322393A0 (en) 1993-12-24 1994-01-27 Austin Research Institute, The Mucin carbohydrate compounds and their use in immunotherapy
ES2203782T3 (es) 1996-01-17 2004-04-16 Imperial College Innovations Limited Inmunoterapia que utiliza linfocitos t citotoxicos (ctl).
US5849589A (en) 1996-03-11 1998-12-15 Duke University Culturing monocytes with IL-4, TNF-α and GM-CSF TO induce differentiation to dendric cells
IL120561A0 (en) * 1996-04-24 1997-07-13 Akzo Nobel Nv Peptides suitable for use in immunosuppressive therapy
JP2002513381A (ja) * 1996-07-22 2002-05-08 ザ ロックフェラー ユニバーシティー ＨＴＬＶ―Ｉ感染およびＨＴＬＶ―ＩＩ感染を予防するためのｅｎｖ―糖タンパク質ワクチン
AU6240798A (en) 1997-01-15 1998-08-07 Zymogenetics Inc. Zppar6, human tailless nuclear hormone receptor (tlx receptor)
CA2243984A1 (en) * 1997-02-13 1998-08-20 Smithkline Beecham P.L.C. Neural cell adhesion molecule splicing variants
US6406705B1 (en) 1997-03-10 2002-06-18 University Of Iowa Research Foundation Use of nucleic acids containing unmethylated CpG dinucleotide as an adjuvant
EP1044263A2 (en) * 1997-12-02 2000-10-18 Medarex, Inc. CELLS EXPRESSING ANTI-Fc RECEPTOR BINDING COMPONENTS
US7258860B2 (en) * 1998-03-18 2007-08-21 Corixa Corporation Compositions and methods for the therapy and diagnosis of lung cancer
CA2328992A1 (en) * 1998-04-27 1999-11-04 Northwest Hospital Nr-cam gene, nucleic acids and nucleic acid products for therapeutic and diagnostic uses for tumors
US20030082586A1 (en) * 1999-06-29 2003-05-01 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Antibodies having diagnostic, preventive, therapeutic, and other uses
US20020090673A1 (en) * 2000-01-31 2002-07-11 Rosen Craig A. Nucleic acids, proteins, and antibodies
AU2001241407A1 (en) * 2000-01-31 2001-08-07 Human Genome Sciences, Inc. Nucleic acids, proteins, and antibodies
WO2001072768A2 (en) 2000-03-27 2001-10-04 Technion Research And Development Foundation Ltd. Single chain class i major histo-compatibility complexes, constructs encoding same and methods of generating same
US20040191260A1 (en) 2003-03-26 2004-09-30 Technion Research & Development Foundation Ltd. Compositions capable of specifically binding particular human antigen presenting molecule/pathogen-derived antigen complexes and uses thereof
EP1317275A1 (de) * 2000-09-06 2003-06-11 Müller, Friederike Arzneimittel mit einer für das rna-bindende koc-protein kodierenden dna-sequenz, einem koc-protein oder einer dna-sequenz des koc-promotors
AU2002226030A1 (en) * 2000-12-04 2002-06-18 Argonex Pharmaceuticals Cytotoxic t-lymphocyte-inducing immunogens for prevention, treatment, and diagnosis of cancer
US7919467B2 (en) * 2000-12-04 2011-04-05 Immunotope, Inc. Cytotoxic T-lymphocyte-inducing immunogens for prevention, treatment, and diagnosis of cancer
WO2002046767A2 (en) * 2000-12-08 2002-06-13 Oxford Glycosciences (Uk) Ltd. Diagnosis and treatment of alzheimer's disease
AU2002254482A1 (en) * 2001-03-19 2002-10-03 Corixa Corporation Compositions and methods for the therapy and diagnosis of kidney cancer
CA2364106A1 (fr) * 2001-11-30 2003-05-30 Christopher Gillberg Polynucleotide et proteine impliques dans la synaptogenese, variants de ceux-ci, et leurs applications therapeutiques et diagnostiques
US6589642B1 (en) 2001-12-21 2003-07-08 Kloeckner Pentaplast Of America, Inc. Three part high moisture barrier for packages
US7892559B2 (en) * 2002-01-30 2011-02-22 Survac Aps Survivin-derived peptides and use thereof
US6992176B2 (en) * 2002-02-13 2006-01-31 Technion Research & Development Foundation Ltd. Antibody having a T-cell receptor-like specificity, yet higher affinity, and the use of same in the detection and treatment of cancer, viral infection and autoimmune disease
JP2005533486A (ja) 2002-02-20 2005-11-10 ダイアックス、コープ Ｍｈｃ−ペプチド複合体結合リガンド
AU2003258134A1 (en) * 2002-08-09 2004-02-25 Applera Corporation Lung cancer target proteins and use thereof
JP4721633B2 (ja) * 2002-10-11 2011-07-13 財団法人癌研究会 血小板凝集促進活性を有する物質
JP2006516258A (ja) * 2002-12-27 2006-06-29 シェンジェンシチンファユアンシンシェンウイヤオカジヨウシャンゴンシ ワクチンおよび抗腫瘍ワクチンを調製する方法
US7273980B2 (en) 2004-01-13 2007-09-25 Wardle Scott A Position and velocity transducer using a phonograph disc and turntable
JP4579836B2 (ja) * 2004-01-23 2010-11-10 株式会社グリーンペプタイド 上皮細胞増殖因子受容体（ｅｇｆｒ）由来ペプチド
DE102004026135A1 (de) 2004-05-25 2006-01-05 Immatics Biotechnologies Gmbh An MHC-Moleküle bindende Tumor-assoziierte Peptide
WO2006026569A2 (en) * 2004-08-27 2006-03-09 Northeastern University Comprehensive characterization of complex proteins at trace levels
SI1642905T1 (sl) * 2004-10-02 2009-04-30 Immatics Biotechnologies Gmbh Imunogeni T-pomagalni epitop iz humanega tumornega antigena in imunoterapevtski postopki, ki uporabljajo navedeni epitop
US7902143B2 (en) * 2004-12-07 2011-03-08 Toray Industries, Inc. Cancer antigen peptide and the use thereof
KR100809410B1 (ko) * 2005-07-06 2008-03-05 주식회사 브레인가드 줄기세포 분화 유도용 조성물 및 그의 용도
EP1760089B1 (en) * 2005-09-05 2009-08-19 Immatics Biotechnologies GmbH Tumor-associated peptides binding to human leukocyte antigen (HLA) class I or II molecules and related anti-cancer vaccine
DK1806359T3 (da) 2005-09-05 2010-06-14 Immatics Biotechnologies Gmbh Tumorassocierede peptider, der bindes promiskuøst til Humant Leukocyt-Antigen (HLA) klasse II molekyler
WO2007047796A2 (en) 2005-10-17 2007-04-26 Institute For Systems Biology Tissue-and serum-derived glycoproteins and methods of their use
US20070248628A1 (en) * 2005-12-06 2007-10-25 Keller Lorraine H Immunogens in cancer stem cells
WO2007072494A1 (en) 2005-12-23 2007-06-28 Naik Praful Ramchandra Metallized packaging blister container
CA2665816C (en) * 2006-09-21 2016-07-12 Vaxil Biotherapeutics Ltd. Antigen specific multi epitope vaccines
EP2084267B1 (en) * 2006-09-26 2018-04-11 Cedars-Sinai Medical Center Cancer stem cell antigen vaccines and methods
WO2008109757A2 (en) * 2007-03-06 2008-09-12 Iterative Therapeutics, Inc. Methods and compositions involving polymeric immunoglobulin fusion proteins
EP2280731A1 (en) * 2008-04-09 2011-02-09 Technion Research and Development Foundation, Ltd. Anti human immunodeficiency antibodies and uses thereof
KR101184869B1 (ko) 2008-04-24 2012-09-20 이매틱스 바이오테크놀로지스 게엠베하 백신을 위한 인간 조직 적합성 항원(ｈｌａ) 종류 ｉ 또는 ｉｉ 분자에 결합하는 종양 관련 펩티드의 신규한 제형
PT2113253E (pt) * 2008-04-30 2010-06-15 Immatics Biotechnologies Gmbh Formulações novas de peptídeos associados a tumores que se ligam a moléculas de classe i ou ii do antígeno leucocitário humano (hla) para vacinas
ES2536465T3 (es) * 2008-10-01 2015-05-25 Immatics Biotechnologies Gmbh Composición de péptidos tumor-asociados y relacionados con la vacuna contra el cáncer para el tratamiento de glioblastoma (GBM) y otros cánceres
GB201004551D0 (en) 2010-03-19 2010-05-05 Immatics Biotechnologies Gmbh NOvel immunotherapy against several tumors including gastrointestinal and gastric cancer
GB201021289D0 (en) 2010-12-15 2011-01-26 Immatics Biotechnologies Gmbh Novel biomarkers for a prediction of the outcome of an immunotherapy against cancer
WO2015181756A1 (en) * 2014-05-28 2015-12-03 Nono Inc. Chloride salt of tat-nr2b9c
MA43477A1 (fr) * 2016-04-21 2019-05-31 Immatics Biotechnologies Gmbh Immunothérapie contre le mélanome et d'autres cancers
JP7382310B2 (ja) * 2017-09-06 2023-11-16 カリフォルニア インスティチュート オブ テクノロジー シグナリング及び抗原提示の２機能性レセプター（ｓａｂｒ）

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