CN111344402A - 受试者特异性肿瘤抑制细胞及其用途 - Google Patents
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Abstract
本公开内容涉及一种包含肿瘤抑制细胞(TIC)的药物组合物和一种用于产生所述TIC的方法。所述肿瘤抑制细胞可以衍生自免疫细胞，包括T细胞、NK细胞或其组合，其被修饰以具有失活的Cbl‑b基因等位基因并且不具有Cbl‑b的生物功能(Cbl‑bv‑/‑TIC)。所述Cbl‑b‑/‑TIC不含所述免疫细胞外源的脱氧核糖核酸。可以使用便携式细胞分离和修饰装置分离所述免疫细胞。本公开内容还涉及一种用于治疗受试者的肿瘤病症的方法。所述药物组合物可以提供受试者特异性的肿瘤治疗。
Description
技术领域
本公开内容涉及一种包含受试者特异性肿瘤抑制细胞(TIC)的药物组合物，以及用于治疗受试者的一种或多种肿瘤的用途。本公开内容还涉及一种通过修饰免疫细胞的一种或多种基因来产生受试者特异性肿瘤抑制细胞(TIC)的方法。
背景技术
免疫疗法是一种治疗肿瘤的治疗方法，它利用宿主免疫系统的天然能力来特异性靶向和破坏肿瘤细胞。但是，肿瘤细胞有时可以逃逸宿主免疫系统的检测和破坏。肿瘤细胞可以具有多种逃逸宿主免疫系统的机制，例如在肿瘤细胞表面表达抑制性分子，其可以使宿主免疫细胞失活，或者使宿主免疫系统更难检测到肿瘤细胞。肿瘤细胞还可以产生因子或诱导周围细胞释放抑制宿主免疫应答并刺激肿瘤细胞增殖的物质。例如，由肿瘤细胞或周围细胞产生的TGFβ是可以抑制T细胞增殖并对肿瘤细胞产生细胞毒性的机制之一。
已经开发了不同的免疫疗法方法来克服肿瘤细胞的免疫逃逸机制并增加免疫系统的功效以根除肿瘤细胞。
一种方法是免疫细胞疗法，也称为过继细胞疗法(ACT)，即在体外扩增和修饰从患者中纯化的免疫细胞(如T细胞或自然杀伤细胞(NK细胞))。随后，将这些经修饰的免疫细胞转移至同一患者中以治疗疾病，例如癌症。已经报道获得了有限的成功，例如在涉及T细胞的美国专利7,446,190；8,399,645；8,637,307；9,161,971和9,328,156，以及涉及NK细胞的美国专利8,026,097和8,313,943中所述的那些。不幸的是，转移回患者的免疫细胞必须面对敌对的肿瘤环境，这可能会使它们失去肿瘤杀伤或抑制效力，从而阻止它们诱导肿瘤消退。
另一种方法，称为嵌合抗原受体(CAR)-T细胞疗法(CAR-T)，其由其中T细胞具有重组T细胞抗原受体(TCR)的T细胞疗法组成，所述TCR识别与细胞内共刺激信号模块融合的肿瘤抗原的细胞外抗体结构域，该模块可同时提供TCR和共刺激信号。到目前为止，这种方法在治疗B细胞淋巴瘤方面已经显示出一些成功，并且最近获得了美国联邦食品药品监督管理局(US FDA)的批准，用于在小儿和年轻人患者中治疗患有复发性和难治性弥漫性大B细胞淋巴瘤和B细胞急性淋巴细胞性白血病的患者。但是，类似的CAR-T策略很难应用于实体瘤，因为CAR-T受体必须识别仅由肿瘤表达而不能由正常细胞表达的细胞表面蛋白抗原，这种情况在大多数肿瘤中都难以满足。此外，CAR-T的嵌合TCR识别由肿瘤细胞表达的单个表位；因此，如果肿瘤细胞随着疾病的进展而失去该特定表位，则该治疗会变得完全无用。在这方面，迫切需要开发新的策略，该策略不仅可以克服上述免疫逃逸机制，而且可以应用于多种肿瘤。
另一种方法是使用治疗性抗体，也称为抗体-药物缀合物(ADC)，其中，将生物活性细胞毒性物质以化学方法缀合至识别肿瘤的抗体或抗体片段以提供对肿瘤细胞的靶向细胞毒性。一些抗体甚至可以在没有缀合的细胞毒性物质的情况下破坏肿瘤细胞。FDA已经批准了许多ADC用于治疗乳腺癌、霍奇金淋巴瘤和某些类型的T细胞淋巴瘤。ADC的一些实例记载于美国专利8,337,856、7,829,531和5,736,137中。
可以阻断或限制免疫应答的化学抑制剂也可以用于免疫治疗。实例可包括称为检查点抑制剂的抑制剂，其可以阻断免疫检查点蛋白如CTLA4和PD-1的活性。多种免疫检查点抑制剂药物已被FDA批准用于治疗几种类型的癌症，包括黑色素瘤和非小细胞肺癌。但是，免疫检查点抑制剂通常仅对某些患者和有限类型的癌症有效。另外，由于它们不加区别的靶标，它们可能会引发导致自身免疫疾病的不想要的免疫应答。免疫检查点抑制剂的一些实例记载于美国专利7,741,345；8,846,681和8,722,019中。
癌症疫苗是增强患者宿主免疫系统以诱导肿瘤消退的另一种治疗方法。已报道治疗某些转移性前列腺癌的有限的成功。在美国专利8,153,120中记载了一个实例。
调节免疫系统活性的蛋白质也可以用于免疫治疗。这些蛋白质可包括细胞因子，例如白介素和干扰素，以及某些生长因子。这些蛋白质可以帮助刺激免疫细胞，并可以与免疫细胞疗法结合。
上述每种方法都有其局限性：某些方法仅对某些患者且仅对有限类型的癌症有效；某些方法具有短暂的作用；某些方法将细菌、病毒或逆转录病毒的DNA或RNA引入宿主免疫细胞，而某些方法可能会不加区别地干扰正常的免疫耐受。因此，临床上显然需要用于治疗肿瘤的新的和改进的方法和组合物。
发明内容
本公开涉及一种药物组合物，其包含肿瘤抑制细胞(TIC)群，其可包括由肿瘤特异性免疫细胞修饰而来的Cbl-b-/-肿瘤抑制细胞(Cbl-b-/-TIC)，其中所述Cbl-b-/- TIC具有失活的Cbl-b基因组等位基因且不具有Cbl-b的生物功能，并且其中所述Cbl-b-/- TIC不含所述免疫细胞外源的脱氧核糖核酸且不含病毒核酸。
本公开内容还涉及一种产生Cbl-b-/-肿瘤抑制细胞(Cbl-b-/- TIC)的方法，该方法包括以下步骤：使免疫细胞的基因组Cbl-b基因失活以产生Cbl-b-/- TIC，其中所述Cbl-b-/-TIC不具有Cbl-b的生物功能、不含免疫细胞外源的脱氧核糖核酸且不含病毒核酸。
本公开内容还涉及一种用于治疗有此需要的受试者的肿瘤病症的方法，所述方法包括以下步骤：
a)使受试者的肿瘤特异性免疫细胞的基因组Cbl-b基因失活以产生Cbl-b-/-肿瘤抑制细胞(Cbl-b-/- TIC)，其中所述Cbl-b-/- TIC具有失活的Cbl-b基因等位基因且不含Cbl-b的生物功能，并且其中所述Cbl-b-/- TIC不含免疫细胞外源的脱氧核糖核酸且不含病毒核酸；
b)任选地，在体外细胞培养物中增殖Cbl-b-/- TIC；
c)将Cbl-b-/- TIC给予受试者。
本公开内容还涉及一种产生Cbl-b-/-肿瘤抑制细胞(Cbl-b-/- TIC)的方法，其包括以下步骤：使免疫细胞的基因组Cbl-b基因失活以产生Cbl-b-/- TIC，其中所述Cbl-b-/- TIC不具有Cbl-b的生物功能、不含免疫细胞外源的脱氧核糖核酸且不含免疫细胞外源的病毒核酸。
本公开内容还涉及一种使用异种移植肿瘤产生Cbl-b-/- TIC的方法。
本公开内容还涉及通过使一种或多种靶基因失活而产生的肿瘤抑制细胞(TIC)，所述靶基因选自Cbl-b、CTLA4、PD-1、LAG3、TIM3、CD73、KIR(杀伤细胞抑制受体)、Fas、AHR(芳烃受体)、Smad2、Smad4、TGFBR(TGFβ受体)、ILT-3或其组合。
附图说明
图1.修饰的细胞治疗受试者的方法和用途的实例的示意图。通过手术从受试者中取出肿瘤样本，纯化并修饰TIL以在体外使Cbl-b基因失活，然后将其在体外扩增并随后输注给受试者。
图2A-D.新鲜人乳腺癌样本中TIL的分离和扩增。(A)从体外培养的乳腺癌样本中分离出的总肿瘤浸润细胞(TIL)的流式细胞分析，其中用线框(lined gate)表示T细胞，和(B)将(A)中框起的T细胞用抗CD4和抗CD8抗体染色，用FACS分类，示出了具有所示百分比的CD4+和CD8+T细胞。(C)在48孔组织培养板中生长的一片乳腺癌样本的DIC(微分干涉相差)显微图。(D)在培养基中的乳腺癌TIL的高倍放大DIC图。
图3.典型的Surveyor测定法的代表性结果，证实了原代人T细胞中Cbl-b基因的修饰。通过PCR扩增含有Cbl-b基因的靶向位点的400bp DNA片段，并对扩增的DNA片段进行变性、复性，然后用错配特异性核酸内切酶
核酸酶S消化。基于每个条带的密度计算野生型完整(上部条带)和切割的错配(下部条带)DNA片段的比例。切割的DNA的百分比表示在T细胞中失活的Cbl-b等位基因的比例。
图4A-B.细胞功能测定。响应于以下刺激条件，通过(A)CFSE测定法和(B)INF-γ分泌测定法评估T细胞增殖：
：无刺激；CD3，抗CD3；CD3+CD28，抗CD3+抗CD28；CD3+CD28+TGFβ，抗CD3+抗CD28和TGFβ。对照：模拟转染(mock transfected)的细胞；Cbl-b：Cas9-sgRNACbl-b转染的Cbl-b失活的人原代Cbl-b-/- T细胞。
图5.TGFβ和PDL1抑制测定。将人乳腺癌样本中的野生型对照T细胞(WT CD8+ T)和Cbl-b-/- T细胞(Cbl-b-/- CD8+ T)用CFSE标记并用人乳腺癌MDA-MB-231(MDA)细胞刺激，该细胞系为一种表达同种异体MHC-1和高水平PDL1和TGFβ的细胞系。培养72小时后，收获细胞，用抗CD8染色并在FACS上分析。示出了响应于MDA同种异体抗原并且抗TGFβ和PDL1抑制的增殖性CD8+(CFSElo)T细胞(每种细胞类型内的矩形)的百分比。
图6.分离的肿瘤响应细胞的实例。从人类乳腺癌样本中分离出TIL。将细胞模拟转染(对照细胞)或用Cas9-sgRNACbl-b(Cbl-b-/-细胞)转染，用CFSE标记并用MDA-MB-231肿瘤细胞刺激。基于CFSE强度，通过FACS对增殖细胞(CFSElo)和非增殖细胞(CFSEhi)进行纯化。与它们的模拟转染的对应细胞(对照)相比，人Cbl-b-/- TIL(Cbl-b-/-细胞)表现出更多的细胞分裂。
图7A-B.显示T细胞抗人肿瘤细胞系的抗肿瘤活性测定。将肿瘤响应性(CFSElo)和无响应性(CFSEhi)细胞与MDA-MB-231肿瘤细胞共培养24小时。分别通过ELISA和LDH释放测定法测定细胞因子分泌和肿瘤细胞杀伤活性。(A)：与MDA-MB-231肿瘤细胞共培养后，T细胞培养物的上清液中INF-γ产生的ELISA测量。(B)：通过LDH释放测定法测量的肿瘤细胞死亡。LDH释放与细胞死亡成正比。实心圆：CFSElo TIL细胞，来自模拟的或Cas9-sgRNACbl-b转染细胞的肿瘤响应细胞；实心方块：CFSEhi细胞，对MDA-MB-231肿瘤细胞无响应的TIL。
图8.输注至NSG小鼠中后人T细胞的扩增和存活。通过静脉(IV)注射将纯化的人CD8+ T细胞转移到NSG小鼠中。示出了IV输注28天后，血液循环中的人和小鼠CD45阳性细胞群的FACS分析。植入相同的NSG小鼠中的产生IL-15的经辐射细胞可支持人类T细胞的扩增。在每个图中，T细胞群用矩形表示，显示了总细胞的百分比。
具体实施方式
本领域普通技术人员通过阅读以下详细说明，将更容易理解本发明的特点和优势。应当理解，为清楚起见，在单独实施方案的上下文中的上述和下述的本发明的某些特点可以在单个实施方案中组合提供。相反，为简洁起见，在单个实施方案的上下文中描述的本发明的各个特征也可以单独地或以任何子组合的方式来提供。另外，单数形式的引用也可包括复数形式(例如，“一(a)”和“一个(an)”可以指代一个，或一个或多个)，除非上下文另有明确说明。
除非另外明确指出，否则在本申请中指定的各种范围内使用数值表示为近似值，正如在所述范围内的最小值和最大值都由单词“约”修饰。以这种方式，在所述范围之上和之下的微小变化可以用于获得与范围内的值基本相同的结果。同样，这些范围的公开内容旨在作为包括最小值和最大值之间的每个值的连续范围。
本公开内容涉及一种药物组合物，其包含由免疫细胞修饰而来的Cbl-b-/-肿瘤抑制细胞(Cbl-b-/- TIC)群，其中所述Cbl-b-/- TIC具有失活的Cbl-b基因组等位基因且不具有Cbl-b的生物功能，并且其中所述Cbl-b-/- TIC不含免疫细胞外源的脱氧核糖核酸(DNA)且不含免疫细胞外源的病毒核酸(包括病毒DNA和病毒RNA(核糖核酸))。
本发明的Cbl-b-/-肿瘤抑制细胞(Cbl-b-/- TIC)可以从肿瘤特异性免疫细胞修饰而来，其中所述Cbl-b-/- TIC可以抑制一种或多种特定肿瘤。
术语“Cbl-b-/-”是指细胞的基因型，其中该细胞的所有Cbl-b基因等位基因均失活，这意味着对于二倍体细胞而言，两个基因等位基因均无活性并且对于具有超过两个Cbl-b等位基因的细胞而言，所有这些基因等位基因均被失活。如在整个本公开内容中所使用的，Cbl-b-/-细胞不具有Cbl-b的生物功能。
除非另有说明，术语“肿瘤”和“癌症”在本公开内容中可互换使用，并且是指包括实体瘤和非实体瘤的组织或细胞的异常团块或生长。肿瘤可以是良性或恶性的。通常根据形成它们的细胞类型来命名不同类型的实体瘤。实体瘤的实例可包括肉瘤、癌、淋巴瘤和本文公开的或医学领域技术人员已知的其他实体瘤。白血病，通常也称为血细胞癌或恶性肿瘤，是非实体瘤的一个实例。恶性肿瘤是生长不受控制的细胞，如果不加以治疗，其可以侵入周围组织、转移(扩散到其他器官)并且最终可能致命。术语“肿瘤”还可包括瘤(neoplasm)，其是细胞的异常生长，其可比正常细胞生长更快或死亡更少。瘤会影响并破坏邻近的组织、细胞或器官结构。瘤可包括良性(通常可治愈)或恶性(癌性)生长。本公开内容中的术语“肿瘤”还可包括为非恶性或非癌性的良性肿瘤。良性肿瘤通常位于局部，并且不会扩散到身体的其他部位，尽管某些良性肿瘤会变得非常大，从而对周围组织或器官结构产生压力或具有其他负面影响。术语“肿瘤”可包括具有癌性生长的恶性肿瘤和恶性瘤。肿瘤可包括血管化、非血管化或尚未充分血管化的肿瘤。术语“肿瘤病症”是指本文所述的肿瘤或肿瘤可能发展或进展的受试者的病症。例如，如果检测到多种癌症指标或某些癌细胞，即使没有检测到任何肿瘤，患者也可能患有肿瘤病症。
术语“肿瘤抑制细胞”或“TIC”是指可以抑制肿瘤细胞生长、诱导肿瘤消退或破坏肿瘤细胞的细胞。肿瘤抑制细胞可包括天然和修饰的免疫细胞，例如T细胞(胸腺细胞)、B细胞(骨髓或囊来源的细胞)和NK细胞(自然杀伤细胞)，它们是先天的和适应性免疫应答的主要细胞组分。在一个实例中，肿瘤抑制细胞可包括天然或修饰的T细胞和NK细胞，其对肿瘤细胞具有有效的细胞毒性，从而导致肿瘤生长的抑制或肿瘤的破坏。在另一个实例中，肿瘤抑制细胞可包括CD8+细胞毒性T淋巴细胞(CTL)。在另一个实例中，肿瘤抑制细胞可包括产生针对肿瘤细胞的抗体的B细胞。修饰的免疫细胞可以用化学或生物试剂(例如化学抑制剂、活化剂、抗体、疫苗、不同组的细胞或其组合)进行修饰。修饰的免疫细胞可用遗传物质修饰，例如基因表达载体，其可以在免疫细胞中产生一种或多种所需的可影响细胞功能的蛋白质或核酸。实例可包括上述修饰的T细胞和NK细胞。修饰的免疫细胞可用遗传物质修饰，这些遗传物质会改变免疫细胞的一个或多个基因等位基因。在优选的实施方案中，修饰的免疫细胞可以是由免疫细胞修饰而来的Cbl-b-/-肿瘤抑制细胞(本文称为Cbl-b-/-TIC)，其中Cbl-b-/- TIC具有失活的Cbl-b基因组等位基因，不具有Cbl-b的生物功能。在另一个实施方案中，修饰的免疫细胞(Cbl-b-/- TIC)可包含Cbl-b-/- CD8+ T细胞、Cbl-b-/- NK细胞或其组合。
Cbl-b基因编码为Cbl蛋白家族成员的Cbl-b蛋白，其是参与各种信号转导途径的含RING指结构域的E3泛素连接酶。Gu等人报道说，在缺乏CD28共同刺激的情况下，T细胞中Cbl-b基因功能的丧失或减少可使T细胞抵抗TGFβ的抑制，并增强T细胞对弱肿瘤抗原的应答，从而在动物模型中根除肿瘤，如美国专利9,334,522中所述，该专利通过引用的方式纳入本文中。
本发明的Cbl-b-/- TIC不含免疫细胞外源的脱氧核糖核酸(DNA)且不含免疫细胞外源的病毒核酸。药物组合物也可以不含未修饰的T细胞外源的核酸，且不含病毒核酸(包括病毒DNA和病毒RNA)。如本文所述，Cbl-b-/- TIC可通过将不含免疫细胞外源的脱氧核糖核酸(DNA)且不含免疫细胞外源的病毒核酸(包括病毒DNA和病毒RNA)的基因组修饰成分引入免疫细胞中而产生。术语“免疫细胞外源的”是指添加到免疫细胞中的、起源于免疫细胞的宿主之外的或短暂存在于免疫细胞中的外源DNA，包括从非免疫细胞宿主的生物体分离或修饰而来的天然DNA或合成的DNA。外源DNA可包括表达载体；表达载体的片段；克隆载体；克隆载体的片段；功能性或非功能性DNA的片段，例如启动子、增强子、操纵子、编码区、非编码区、复制起点以及源自细菌、噬菌体、病毒或非免疫细胞的宿主的任何生物体的任何其他DNA。在整个本公开内容中，在免疫细胞的修饰之前或分离之前已经成为免疫细胞的稳定遗传内容的一部分的任何DNA、RNA、病毒DNA、病毒RNA、其他遗传物质或其组合分别被认为是免疫细胞、TIC或受试者内源的。
Cbl-b-/- TIC可以是自体的。Cbl-b-/- TIC还可以与受试者(例如人类受试者或肿瘤患者)在组织学上相容，这意味着Cbl-b-/- TIC不被受试者的免疫应答排斥，也不作用于受试者的正常细胞或组织。免疫细胞可以来自同一受试者(肿瘤患者，即自体的)。免疫细胞也可以来自肿瘤产生之前的受试者(肿瘤前患者)。免疫细胞也可以来自具有主要组织相容性复合体(MHC)和与受试者相容的其他免疫应答成分的供体受试者。在一个实施方案中，免疫细胞来自受试者。在另一个实施方案中，免疫细胞来自供体受试者，其中免疫细胞与受试者是MHC相容的。在另一个实施方案中，免疫细胞来自已经患有肿瘤的受试者。
本文使用的术语“受试者”可包括患有或没有肿瘤的动物，没有肿瘤的健康人，患有肿瘤或转移性肿瘤的人类患者，通过手术、化学疗法、放射疗法、免疫疗法或其组合切除或破坏肿瘤或转移性肿瘤的人类患者。在一个实例中，所述受试者是人类受试者。
免疫细胞可以来自受试者的外周血、受试者的淋巴器官、受试者的淋巴液、受试者的组织、受试者的一个或多个器官或其组合。
免疫细胞可包括来自受试者的肿瘤、源自受试者的肿瘤的异种移植肿瘤或其组合的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)，并且Cbl-b-/- TIC可以是对受试者的肿瘤特异性的。Cbl-b-/-TIC可以具有由TCR(T细胞受体)介导的肿瘤特异性细胞毒性。TIL是可以迁移到肿瘤中的免疫细胞，并且通常可包括可变比例的T细胞、NK细胞、树突状细胞和巨噬细胞。通常，T细胞是TIL中最丰富的细胞。
异种移植肿瘤可以是通过将一部分肿瘤异种移植到哺乳动物中产生。对于异种移植的人肿瘤，可以通过医疗行业或研究团体已知的常规方法将动物人源化。
可使用商业介质(例如可从GE Healthcare Life Sciences获得的Percoll密度离心介质)进行梯度离心，从血液样品或肿瘤样本中分离免疫细胞。可以使用亲和柱或FACS(荧光激活细胞分选)分离免疫细胞的特定谱系。例如，可以使用CD45 MicroBeads
柱从肿瘤样本中分离CD45+细胞，所述柱以相应商标获自美国加利福尼亚州圣地亚哥的Miltenyi Biotec Inc。在另一个实例中，可用CD8和TCFβ(T细胞受体β)的特异性抗体对CD8+ T细胞进行染色，然后通过FACS分选将其纯化为CD8+ TCRβ+细胞。市售的FACS设备，例如来自BD Biosciences(Becton，Dickinson and Company，美国新泽西州富兰克林湖市)的那些FACS设备可以是合适的。
免疫细胞中的基因组Cbl-b基因可以通过向免疫细胞中引入基因组修饰成分而失活，该成分包含Cas9蛋白和靶向免疫细胞的基因组Cbl-b基因的sgRNACbl-b，其中基因组修饰成分不含免疫细胞外源的脱氧核糖核酸且不含病毒核酸。免疫细胞中的基因组Cbl-b基因也可以通过向免疫细胞中引入基因组修饰成分而失活，该成分包含Cas9蛋白和靶向免疫细胞的基因组Cbl-b基因的crRNA/TracrRNA(也称为cr:tracrRNA)，其中基因组修饰成分不含免疫细胞外源的脱氧核糖核酸且不含病毒核酸。
Cas9蛋白，CRISPR(规律成簇间隔短回文重复(Clustered RegularlyInterspaced Short Palindromic Repeat))相关蛋白质-9核酸酶，是一种RNA引导的内切核酸酶，其通过在与向导RNA互补的位点上切割双链DNA来催化双链DNA的位点特异性切割(M.Jinek et al.,Science,337,816,2012.DOI:10.1 126/Science.1225829)。CRISPR-Cas9系统已用于原核和真核细胞的基因组编辑中，例如美国专利8,697,359和美国专利公开2014/0068797中所述的。在这些常规的CRISPR-Cas9系统中，将包含编码单个向导RNA(sgRNA)的DNA片段和编码Cas9蛋白的Cas9基因的表达载体或载体的组合引入宿主细胞。单个向导RNA(sgRNA)的功能是将Cas9引导到特定的基因组位置，从而实现靶向基因组编辑。Cas9蛋白可以是其天然形式，或是通过基因工程修饰的形式。Cas9基因可以来自化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)或其他生物体。为了在真核细胞中表达，一个或多个表达载体还可以具有源自细菌或病毒的DNA，其提供基因表达调控，例如启动子。例如，通常使用CMV(巨细胞病毒)启动子。表达载体通常可以含有来自细菌的DNA序列，以允许载体在细菌中增殖。
本发明的申请人出乎意料地发现，当将包含Cas9蛋白和靶向所需基因组基因的sgRNA的基因组修饰成分引入真核细胞中时，可以实现所需的对基因组基因等位基因的基因编辑，而无需包含真核细胞外源的DNA且含有源自细菌或病毒的DNA或RNA的表达载体。
适用于本发明的Cas9蛋白可以是修饰的重组Cas9蛋白。在一个实施方案中，修饰的重组Cas9蛋白包含未修饰的Cas9蛋白的C末端核定位信号区。在一个实例中，可以使用PCR(聚合酶链反应)扩增含有C末端核定位信号区的经修饰的Cas9基因，并将其克隆到具有多组氨酸(His)标签蛋白的表达载体中以产生His标签融合的Cas9蛋白，其允许进行亲和纯化。具有His标签的表达载体的实例可包括可商购的pET28质粒
(ClontechLaboratories，美国加利福尼亚，以相应商标)。具有用于亲和纯化的不同蛋白质标签(例如获自GE Healthcare Life Sciences的pGEX载体的GST标签)的其他表达载体也可适合于产生修饰的重组Cas9蛋白。
可以将靶向免疫细胞的基因组Cbl-b基因座中特定位点的sgRNACbl-b(单向导核糖核酸)设计成具有约20个核苷酸(nt)的向导序列，例如长度为约17nt至约28nt，该向导序列与位于Cbl-b基因的RING指结构域上游的序列同源，以避免产生导致截短的显性负性形式的Cbl-b突变蛋白的突变基因。可以优化向导序列以降低脱靶(OT)突变的风险。向导序列的长度可以是20nt，并且经选择以基于向导序列的总长度计与Cbl-b基因具有80％至100％的同源性，并且与受试者的整个基因组中的其他区域具有最少的错配。在一个实例中，向导序列在受试者的整个基因组(例如人基因组)中可以具有5至0个错配，在另一个实例中，具有3至0个错配，在又一个实例中，具有1至0个错配，在另一个实例中，具有0个错配。sgRNACbl-b可包含核酸序列
GAGGUCCACCAGAUUAGCUCUGG(Seq.No.1)，与所述Seq.No.1的序列具有80％至100％的同源性的核酸序列或其组合。在设计sgRNACbl-b时，考虑脱靶(OT)突变以使OT的可能性最小化。在一个特定实例中，sgRNACbl-b包含核酸序列
GAGGUCCACCAGAUUAGCUCUGG。
一旦选择了靶向基因组Cbl-b基因的sgRNACbl-b的序列，就可以通过化学合成来产生，并例如通过高效液相色谱法(HPLC)来纯化。可以使用各种可商购的克隆和表达载体系统，例如来自CELLUTRON Life Tech，GE Dharmacon(Lafayette，CO，美国)或QIAGEN(QIAGENGmbH，Hilden，德国)的那些将sgRNACbl-b的序列克隆至载体中。可以纯化产生的sgRNACbl-b。靶向基因组Cbl-b基因的sgRNACbl-b也可以通过使用诸如Cbl-b基因DNA或PCR扩增的基因组Cbl-b基因DNA的模板通过体外转录来产生。市售的MEGAshortscript T7试剂盒(LifeTechnologies)可以是合适的。
可以通过转染、电穿孔或显微注射将包含Cas9蛋白和靶向基因组Cbl-b基因的sgRNACbl-b的基因组修饰成分引入免疫细胞中，以产生修饰的免疫细胞，其可包括修饰的T细胞、修饰的NK细胞或其组合。在一个实施方案中，可以将包含Cas9蛋白和sgRNACbl-b的基因组修饰成分电穿孔到T细胞、NK细胞或其组合中。T细胞可包括CD8+ T细胞和CD4+T细胞。NK细胞可包括CD56+ NK细胞、CD16+ NK细胞或其组合。Cbl-b基因失活以及随后Cbl-b蛋白表达丧失的效率可通过使用抗Cbl-b抗体进行细胞内染色来测量，并通过FACS、通过使用
突变检测试剂盒(以相应商标获自Integrated DNA Technologies，美国伊利诺伊州斯科基)的Surveyor测定法、通过其他基于DNA的分析方法(例如PCR)或其组合来分析。在一个实例中，全部修饰的混合免疫细胞中约5％至约90％的修饰的混合免疫细胞的Cbl-b基因失活，在另一个实例中可以在约5％至约60％的范围内，在又一个实例中可以在约5％至约40％的范围内，在另一个实例中可以在约5％至约20％的范围内，在另一个实例可以在约20％到约50％的范围内，基于总的可检测的Cbl-b基因的百分比。例如，可以基于可检测条带或峰的密度来计算Cbl-b基因的野生型完整和切割的错配DNA片段的比例。切割的DNA的百分比表示细胞中失活的Cbl-b等位基因的比例。
可以进行各种功能测定以确定细胞增殖、免疫细胞对肿瘤细胞的毒性或其他功能。现在通常使用的或将来新开发的测定或试验也是适用的。
本公开内容还涉及一种产生Cbl-b-/-肿瘤抑制细胞(TIC)的方法，该方法包括以下步骤：
a)使免疫细胞的基因组Cbl-b基因失活以产生Cbl-b-/- TIC，其中所述Cbl-b-/-TIC不具有Cbl-b的生物功能、不含免疫细胞外源的脱氧核糖核酸且不含免疫细胞外源的病毒核酸。
如上所述，可以通过将包含Cas9蛋白和靶向免疫细胞的基因组Cbl-b基因的sgRNACbl-b的基因组修饰成分引入免疫细胞而使基因组Cbl-b基因失活，并且其中所述基因组修饰成分不含免疫细胞外源的脱氧核糖核酸且不含病毒核酸。
免疫细胞可包括未修饰的T细胞、未修饰的NK细胞或其组合。免疫细胞还可包括纯化的未修饰的CD8+ T细胞、CD56+ NK细胞、CD16+NK细胞或其组合。
如上所述，免疫细胞可以来自受试者的外周血、受试者的淋巴器官、受试者的淋巴液、受试者的其他器官或组织或其组合，可以是来自受试者的肿瘤、源自受试者的肿瘤的异种移植肿瘤或其组合的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)。异种移植肿瘤可以通过将一部分肿瘤异种移植到哺乳动物中而产生，如本文公开的。
该方法可包括在使Cbl-b基因失活之前分离和扩增受试者的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)以产生免疫细胞的额外步骤。TIL可以含有大多数肿瘤特异性T细胞，包括CD4辅助T细胞和CD8细胞毒性T细胞。TIL可以如下文所述进行分离和扩增。
由肿瘤特异性免疫细胞(如本文提及的TIL)修饰而来的本发明的Cbl-b-/-肿瘤抑制细胞(Cbl-b-/- TIC)可以抑制一种或多种特定肿瘤，包括从中分离出所述TIL的肿瘤。在一个实例中，由从受试者的乳腺癌中分离的TIL产生的Cbl-b-/- TIC可以特异性地抑制受试者的原发性乳腺癌。在另一个实例中，由从受试者的乳腺癌中分离的TIL产生的Cbl-b-/-TIC可以特异性地抑制所述受试者中的一种或多种转移性肿瘤。
在本公开内容的一个实施方案中，涉及一种产生Cbl-b-/-肿瘤抑制细胞(Cbl-b-/-TIC)的方法，该方法包括以下步骤：
a)使免疫细胞的基因组Cbl-b基因失活以产生Cbl-b-/- TIC，其中所述Cbl-b-/-TIC不具有Cbl-b的生物功能，不含免疫细胞外源的脱氧核糖核酸且不含免疫细胞外源的病毒核酸，其中所述免疫细胞是从受试者的肿瘤分离并任选地扩增的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)。
在另一个实施方案中，免疫细胞是从受试者的肿瘤中分离并任选地扩增的肿瘤浸润T细胞。本文公开的用于分离和任选地扩增免疫细胞(包括T细胞)的任何方法都是合适的。
Cbl-b-/- TIC可包括Cbl-b-/- CD8+ T细胞、Cbl-b-/- NK细胞或其组合。在另一个实例中，Cbl-b-/- TIC可包括Cbl-b-/- NK细胞。在又一个实例中，Cbl-b-/- TIC可包括CD8+ T细胞或NK细胞的Cbl-b-/- TIL。
在一个实例中，Cbl-b-/- TIC可包括范围从10％至100％的Cbl-b-/-CD8+ T细胞，在另一个实例中为30％至100％，在又一个实例中为50％至100％，在另一个实例中为75％至100％，在又一个实例中为85％至100％，基于总Cbl-b-/- TIC群的百分比计。Cbl-b-/- CD8+T细胞不含受试者外源的脱氧核糖核酸且不含受试者外源的病毒核酸。
在一个实例中，Cbl-b-/- TIC可包括范围从10％至100％的Cbl-b-/- NK细胞，在另一个实例中为30％至100％，在又一个实例中为在50％至100％之间，在另一个实例中为75％至100％，在又一个实例中为85％至100％，基于总Cbl-b-/- TIC群的百分比计。Cbl-b-/-NK细胞不含受试者外源的脱氧核糖核酸且不含受试者外源的病毒核酸。
Cbl-b-/- NK细胞也可以是CD3-，并且可以是优选的。Cbl-b-/- TIC可包括Cbl-b-/-CD3- CD56+ NK细胞、Cbl-b-/- CD3- CD16+ NK细胞或其组合。
如上所述，可以通过转染、电穿孔或显微注射将包含Cas9蛋白和靶向基因组Cbl-b基因的sgRNACbl-b的基因组修饰成分引入免疫细胞中。任何上述Cas9蛋白和靶向基因组Cbl-b基因的sgRNACbl-b都是合适的。
该方法可以进一步包括以下步骤：
b)在体外细胞培养物中增殖Cbl-b-/- TIC；和
c)从体外细胞培养物中收获Cbl-b-/- TIC。
Cbl-b-/- CD8+ T细胞可以在由生长因子IL-2、IL-15、TGFβ或其组合支持的体外培养系统中增殖。在一个实施方案中，Cbl-b-/- CD8+ T细胞可以扩增约104倍。
Cbl-b的失活可使NK细胞更有效地杀伤肿瘤细胞(M.Paolino et al.,Nature,Vol.507,第508页,2014年3月27日.DOI:10.1038/Nature1 2998)。NK细胞可以通过体外细胞培养进行扩增，如S.Carlens等人(Human Immunology 62,1 092-1098,2001)详细描述的，该文献通过引用的方式纳入本文中。简言之，可以在补充有IL-2的无血清培养基中培养含有NK细胞的免疫细胞。
如本文所公开的，Cbl-b-/- CD8+ T细胞、Cbl-b-/- NK细胞或其组合可以被纯化和收获。Cbl-b-/- CD8+ T细胞可以如上所述通过磁铁矿柱分选(MACS)或FACS纯化和收获。还可以通过在存在TGFβ的情况下培养总的CD8+ T细胞来富集Cbl-b-/- CD8+ T细胞。可以通过MACS或FACS纯化和收获Cbl-b-/- CD16+ NK细胞和Cbl-b-/- CD56+ NK细胞。在一个实例中，将NK细胞用缀合有荧光染料的单克隆抗CD16抗体和抗CD56抗体染色，随后用FACS分选。来自Becton-Dickinson(Becton，Dickinson and Company，美国新泽西州富兰克林湖)的抗体可以是合适的。通过使用抗CD3、抗CD16和抗CD56抗体染色，可以纯化并收获Cbl-b-/- CD3-CD56+ NK细胞和Cbl-b-/- CD3- CD16+ NK细胞。
本公开内容还涉及一种用于治疗受试者的肿瘤病症的方法，该方法包括以下步骤：
a)使受试者的免疫细胞的基因组Cbl-b基因失活以产生Cbl-b-/-肿瘤抑制细胞(Cbl-b-/- TIC)，其中所述Cbl-b-/- TIC具有失活的Cbl-b基因等位基因且不含Cbl-b的生物功能，并且其中所述Cbl-b-/- TIC不含免疫细胞外源的脱氧核糖核酸且不含免疫细胞外源的病毒核酸；
b)任选地，在体外细胞培养物中增殖Cbl-b-/- TIC；
c)将Cbl-b-/- TIC给予受试者。
如上文所述，免疫细胞可以从受试者中分离，并且可以来自受试者的外周血、受试者的淋巴器官、受试者的淋巴液、受试者的其他器官或组织或其组合。免疫细胞也可以是来自受试者的肿瘤、源自受试者的肿瘤的异种移植肿瘤或其组合的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)，且Cbl-b-/- TIC是特异性针对受试者的肿瘤。如本文所述，Cbl-b-/- TIC可具有可通过TCR(T细胞受体)介导的肿瘤特异性细胞毒性。受试者可以是人类受试者。受试者可以是已经患有肿瘤的患者。受试者也可以是在分离免疫细胞时没有肿瘤的人。
该方法可包括在使Cbl-b基因失活之前分离和扩增受试者的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的额外步骤，其中所述肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)主要含有肿瘤特异性T细胞，包括CD4+辅助T细胞和CD8+细胞毒性T细胞。
基因组Cbl-b基因可以通过将包含Cas9蛋白和靶向免疫细胞的基因组Cbl-b基因的sgRNACbl-b的基因组修饰成分引入到免疫细胞中而失活，并且其中所述基因组修饰该成分不含免疫细胞外源的脱氧核糖核酸且不含病毒核酸。
任何上述Cas9蛋白都是合适的。Cas9蛋白可以是修饰的重组Cas9蛋白，其包含未修饰的Cas9蛋白的C末端核定位信号区。
Cbl-b-/- TIC可包括Cbl-b-/- CD8+ T细胞、Cbl-b-/- NK细胞或其组合。在一个实例中，Cbl-b-/- TIC可包括Cbl-b-/- CD8+ T细胞。Cbl-b-/- TIC可包括任何上述的Cbl-b-/- CD8+T细胞、Cbl-b-/- NK细胞或其组合。
已知肿瘤抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞可存在于患者的肿瘤内。从受试者(患者)的肿瘤分离的免疫细胞可以是优选的，因为这些免疫细胞含有肿瘤特异性CD8+ T细胞或NK细胞，其可以被修饰以产生特异性针对受试者的肿瘤的Cbl-b-/- TIC，即所述Cbl-b-/-TIC可以具有肿瘤抗原特异性细胞毒性。
可通过注射、输注或其组合将Cbl-b-/- TIC给予受试者。在一个实例中，可将Cbl-b-/- TIC直接注射到受试者的肿瘤中或受试者肿瘤周围的特定组织或区域。在另一个实例中，可以将Cbl-b-/- TIC静脉内输注到受试者中。在另一个实例中，可以将Cbl-b-/- TIC注射并输注给受试者。注射和输注的组合对于在一个部位(例如肿瘤原发部位)治疗原发性肿瘤，以及在受试者的不同部位治疗一个或多个转移性肿瘤特别有用。通常，在一个实例中0.5×109至5×1010个细胞，在另一个实例中0.5×108至5×1010，在另一个实例中0.5×107至5×1010，在另一个实例中0.5×107至5×108，在另一个实例中0.5×107至5×109，可用于输注给受试者。在其他实例中，可以使用1×105至5×107细胞/kg(千克)受试者体重来输注给受试者。
图1中示出了修饰的免疫细胞治疗受试者的方法和用途的实例的示意图。可以按照批准的步骤通过手术从受试者中取出肿瘤样本。可以如下文公开的纯化TIL，并对其进行修饰以在体外使Cbl-b基因失活以产生Cbl-b-/- TIC。然后可以将修饰的Cbl-b-/- TIC在体外扩增，然后输注给受试者。修饰的Cbl-b-/- TIC也可以直接输注给受试者，而不在体外扩增。
Cbl-b-/- TIC可以在液氮中储存和冷冻保存。可以将储存的Cbl-b-/-TIC解冻并给予受试者。在将Cbl-b-/- TIC给予受试者之前或给予受试者期间，可以将可药用的载体与Cbl-b-/- TIC混合，所述载体包括已获得美国食品和药物管理局(FDA)批准用于人类使用的一种或多种非活性药物成分和“GRAS”(通常公认安全的)材料、来自受试患者的血浆、受试患者的血液或其一部分或其组合。
异种移植肿瘤可以通过将一部分肿瘤异种移植到哺乳动物中来产生。
异种移植肿瘤可以通过包括以下步骤的方法产生：
A)将一部分肿瘤分散到肿瘤细胞悬液中；
B)任选地用一种或多种选择标记物从肿瘤细胞悬液中纯化肿瘤细胞以产生纯化的肿瘤细胞；和
C)将肿瘤细胞悬液或纯化的肿瘤细胞移植到哺乳动物中以形成异种移植肿瘤。
对于由人肿瘤产生的异种移植肿瘤，可以使用可商购的人源化动物。对于实体瘤或非实体瘤，可以将一部分肿瘤或荷瘤组织切成或分成小的组织块，所述组织块的一个最大维度为例如在一个实例中尺寸为0.5mm至5mm，在另一个实例中为0.5mm至2mm，在另一个实例中为0.5mm至1mm，然后用诸如胶原酶的酶消化。消化的组织块可以物理方法分散(例如通过移液)到肿瘤细胞悬液中。
对于来自一些肿瘤或肿瘤干细胞的细胞，可以用选择标记物进行进一步的纯化。在一个实例中，乳腺癌干细胞(CSC)可通过用特异性针对血细胞谱系(Lin)标记物(如CD44和CD24)的抗体染色和FACS分选来纯化，以获得CD44+/CD24-/lo Lin-细胞。Lin-表示谱系标记物为阴性的细胞。血细胞谱系标记物可包括CD2、CD3、CD10、CD16、CD18、CD31、CD64和CD140b。大约1000种富集的乳腺CSC可以在免疫缺陷小鼠(例如NOD SCID小鼠)中产生异种移植肿瘤。Al-Hajj M等人(Proceedings of the National Academy of Sciences,100:3983-3988,2003)描述了详细的方法，该文献通过引用的方式纳入本文中。
可以将肿瘤细胞悬液或纯化的肿瘤细胞(例如纯化的CSC)移植到NOD SCID小鼠的乳房脂肪垫中，以建立一种或多种异种移植肿瘤。可商购的NOD SCID小鼠，例如来自Jackson实验室(Bar Harbor,ME USA,以相应商标)的NSGTM小鼠可以是合适的。肿瘤细胞悬液或纯化的肿瘤细胞也可以冷冻保存(例如保存在液氮中)以备后用。
哺乳动物可以选自小鼠、大鼠、山羊、兔子、猪、绵羊、豚鼠、马、狗、骆驼、驼马、美洲驼或羊驼。也可以使用适合于异种移植的任何其他动物。免疫缺陷的动物可以是优选的。可以进一步优选免疫缺陷小鼠，例如裸鼠和大鼠、SCID(严重联合免疫缺陷)小鼠、NOD(非肥胖糖尿病)小鼠或NOD SCID小鼠。
如本公开内容中所述，可以分离异种移植肿瘤中的TIL以产生Cbl-b-/- TIC。异种移植肿瘤可用于产生大量TIL，以产生Cbl-b-/- TIC，包括Cbl-b-/- T细胞、Cbl-b-/- NK细胞或其组合。
在一个实施方案中，用于产生Cbl-b-/-肿瘤抑制细胞(TIC)的方法可包括以下步骤：
a)通过以下步骤产生异种移植肿瘤：将受试者的一部分肿瘤分散到肿瘤细胞悬液中，任选地用一种或多种选择标记物从肿瘤细胞悬液中纯化肿瘤细胞以产生纯化的肿瘤细胞，并将肿瘤细胞悬液或纯化的肿瘤细胞移植到哺乳动物中以形成异种移植肿瘤；
b)从异种移植肿瘤获得肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)；
c)使TIL的基因组Cbl-b基因失活以产生Cbl-b-/- TIC，其中Cbl-b-/- TIC不具有Cbl-b的生物功能、不含肿瘤浸润淋巴细胞外源的脱氧核糖核酸且不含病毒核酸，其中基因组Cbl-b基因是通过将基因组修饰成分引入TIL中而失活，所述基因组修饰成分包含Cas9蛋白和靶向TIL的基因组Cbl-b基因的sgRNACbl-b，并且其中所述基因组修饰成分不含TIL外源的脱氧核糖核酸且不含病毒核酸。
携带异种移植肿瘤的动物(在本文中称为“异种移植肿瘤动物”)可以用作测试Cbl-b-/- TIC的效率的模型。可以将Cbl-b-/- TIC输注到异种移植肿瘤动物中。前述的免疫缺陷动物(例如免疫缺陷小鼠)可以是合适的。输注Cbl-b-/- TIC后，可以监测动物中异种移植肿瘤的消退。由于所述动物是免疫缺乏的，输注的Cbl-b-/- TIC通常不会被动物的免疫系统排斥。
本公开内容还涉及一种用于产生Cbl-b-/-肿瘤抑制细胞(TIC)的方法，该方法包括以下步骤：
a)使受试者的免疫细胞的基因组Cbl-b基因，以产生Cbl-b-/- TIC，其中所述Cbl-b-/- TIC不具有Cbl-b的生物功能、不含免疫细胞外源的脱氧核糖核酸且不含病毒核酸，其中通过将包含Cas9蛋白和靶向免疫细胞的基因组Cbl-b基因的sgRNACbl-b的基因组修饰成分引入免疫细胞中而使基因组Cbl-b基因失活，并且其中所述基因组修饰成分不含免疫细胞外源的脱氧核糖核酸且不含病毒核酸。
b)任选地在体外细胞培养物中增殖Cbl-b-/- TIC；
c)任选地从体外细胞培养物中收获Cbl-b-/- TIC；和
d)通过将Cbl-b-/- TIC输注到具有异种移植肿瘤的异种移植肿瘤动物中来测定Cbl-b-/- TIC的抗肿瘤效率，以产生Cbl-b-/- TIC的抗肿瘤效率数据，其中所述异种移植肿瘤源自受试者的肿瘤。
Cbl-b-/- TIC可包括任何前述的Cbl-b-/- CD8+ T细胞、Cbl-b-/- NK细胞或其组合。
异种移植肿瘤可以如本文所述产生。任何上述免疫缺陷动物都可以是合适的。免疫缺陷小鼠可以是优选的。
申请人观察到，不能通过将编码Cas9蛋白的质粒DNA或mRNA的电穿孔到人原代T细胞中而有效地实现Cbl-b基因的突变。申请人出乎意料地发现，使用与体外转录的sgRNACbl-b复合的纯化的重组Cas9蛋白可以在人原代T细胞中实现Cbl-b基因的有效失活，并且毒性较小。申请人的这一出乎意料的发现提供了本文所述的和下文所述的许多优点。
本发明的一个优点是，包括Cbl-b-/- CD8+ T细胞、Cbl-b-/- NK细胞或其组合的Cbl-b-/- TIC不含TIC(因此，受试者)外源的脱氧核糖核酸且不含病毒核酸。与当前可用的基因修饰的细胞疗法(包括CAR-T疗法和CRISPR介导的基因组编辑疗法)需要将至少一种含有外源DNA和病毒DNA或RNA的表达载体引入细胞中不同，包含本发明的Cbl-b-/- TIC的药物组合物可以提供免疫疗法，而未将外源DNA、病毒DNA或病毒RNA引入患者体内，且不需要用病毒或病毒载体进行转导，因此避免了与暴露于这些外源遗传物质相关的患者的任何已知和未知的潜在风险。
本发明的另一个优点是体外基因组修饰的Cbl-b-/- TIC不表达任何外源蛋白，因此不会引起受试者的免疫系统的免疫应答，该免疫应答可能破坏Cbl-b-/- TIC或对Cbl-b-/-TIC造成负面影响。当前的CRISPR介导的基因组编辑采用了表达载体，其在受试者的细胞中稳定表达Cas9蛋白。受试者自身的免疫系统可以针对外源蛋白质Cas9引发免疫应答，因此可以破坏表达Cas9的基因组修饰细胞，并对接受该治疗的受试者构成健康风险。本发明的Cbl-b-/- TIC是由Cas9-sgRNACbl-b核糖核蛋白复合体产生，该复合体可以在T细胞中快速降解。由于本发明的Cbl-b-/- TIC不表达Cas9蛋白，因此，受试者自身的免疫系统将不会对Cbl-b-/- TIC起反应或在接受Cbl-b-/- TIC用于肿瘤治疗的受试者中引起潜在的有害应答。
本发明的另一个优点是Cbl-b-/- TIC提供了用于治疗肿瘤的个体化药物。从受试者中分离的本发明的Cbl-b-/- TIC具有这样的T细胞受体(TCR)，即其可以识别肿瘤的细胞上的一个或多个表位，但不能识别正常器官和组织细胞上的一个或多个表位，因此，本发明的Cbl-b-/- TIC可以产生特异性地针对受试者的肿瘤的T细胞应答，而对正常组织或细胞没有细胞毒性。本发明的Cbl-b-/- TIC还可以用于治疗不同受试者的肿瘤，例如具有相同或相似免疫相容性(例如相容的MHC)的受试者。
本发明的另一个优点是肿瘤特异性CD4+和CD8+ T细胞的Cbl-b-/-TIC高度富集，因此自身免疫应答可以被最大程度地减至最小。
本发明的另一个优点是，与CAR-T疗法中的T细胞识别一种肿瘤抗原的特定表位不同，本发明的Cbl-b-/- TIC可以具有广谱的肿瘤抗原特异性，这适用于靶向许多不同类型的肿瘤，例如，起源不同、具有不同的癌基因且在多个器官部位中的实体瘤或非实体瘤。在一个实例中，从人类患者受试者产生的Cbl-b-/- TIC可用于治疗在其原发部位的原发性肿瘤，以及一个或多个不同器官或部位中的转移性肿瘤。在一个特定的实例中，从人类患者受试者产生的Cbl-b-/- TIC可用于治疗在其原发部位的原发性肿瘤，以及两个或多个不同器官或部位中的转移性肿瘤。如本文所用，可以通过CT扫描来检测或识别两个或更多个不同器官或部位中的转移性肿瘤。
本发明的另一个优点是，Cbl-b-/- TIC的广谱的肿瘤抗原特异性使Cbl-b-/- TIC能够靶向已经丢失了肿瘤抗原的一个或多个表位的肿瘤，因此超越目前可用的疗法，例如CAR-T疗法，其仅识别肿瘤抗原的单个表位，这可导致已丢失特定表位的肿瘤细胞的逃避。
本发明的另一个优点是Cbl-b基因产物控制几种免疫抑制途径，包括TGFβ、PD1/PD-L1、CTLA-4和其他检查点抑制剂。在一个实例中，Cbl-b-/- TIC可用于治疗具有一种或多种这些抑制性生物标志物的肿瘤，在另一个实例中，可用于治疗具有两种或更多种这些抑制性生物标志物的肿瘤。
本发明的另一个优点是Cbl-b-/- TIC可包括Cbl-b-/- CD8+ T细胞，其可以在存在IL-2、IL-15、TGFβ和检查点抑制剂(例如PD-1、PD-L1)或其组合的情况下富集和增殖，因此可以生成大量的肿瘤抑制细胞用于癌症免疫治疗。
本发明的另一个优点是，如本文实施例所示，Cbl-b-/- TIC可以在体内扩增。可以给予人受试者少量的Cbl-b-/- TIC，例如1×105至1×107细胞/kg，并且所述细胞可以在体内扩增以提供持久的肿瘤抑制作用，并且减少在目前的免疫治疗方法(例如CAR-T方法)中经常观察到的潜在的细胞毒性副作用。在一个实例中，输注到人类受试者中的Cbl-b-/- TIC的数量可为0.1×106至0.5×109个细胞，在另一个实例中为0.1×106至0.1×109个细胞，在另一个实例中为0.1×106至0.5×108个细胞，在另一个实例中为0.1×106至0.1×108个细胞，在又一个实例中为0.1×106至0.5×107个细胞，在又一个实例中为0.1×106至0.1×107个细胞，在又一个实例中为0.1×106至0.5×106个细胞。在特定的实例中，可以将5×106个细胞给予受试者。在另一个实例中，基于人类受试者的体重归一化的细胞数量，例如1×105至1×107个细胞/kg，可以是合适的。
本发明的Cbl-b-/- TIC可以冷冻保存以备将来使用。可以保存以任何前述方法产生的Cbl-b-/- TIC，以将来用于受试者的癌症复发的情况。
本发明产生的Cbl-b-/- TIC可用于治疗上述肿瘤和癌症，包括但不限于癌、母细胞瘤、肉瘤、黑素瘤，以及血液癌症(例如各种白血病)、淋巴瘤、霍奇金氏病、非霍奇金氏淋巴瘤、骨髓瘤、骨髓发育不良等。可以用本发明的Cbl-b-/- TIC治疗的肿瘤的实例可包括但不限于听神经瘤、腺癌、脑干神经胶质瘤、混合神经胶质瘤、基底细胞癌、胆管癌、膀胱癌、乳腺癌、支气管癌、宫颈癌、绒毛膜癌、结肠癌、室管膜瘤、生殖细胞瘤、胶质母细胞瘤、星形细胞瘤、血管母细胞瘤、肝细胞癌、肝癌、肺癌、淋巴恶性肿瘤、髓样癌、甲状腺髓样癌、髓母细胞瘤、黑素瘤、脑膜瘤、神经母细胞瘤、少突神经胶质瘤、卵巢癌、胰腺癌、乳头状腺癌、乳头状癌、乳头状甲状腺癌、嗜铬细胞瘤、皮脂腺癌、松果体瘤、前列腺癌、肾细胞癌、视网膜母细胞瘤和脑转移瘤、神经鞘膜瘤、颅咽管瘤、精原细胞瘤、鳞状细胞癌、汗腺癌、睾丸肿瘤、其他已知的肿瘤和随后鉴定或诊断出的肿瘤。
Cbl蛋白是参与各种信号传导途径的E3-泛素连接酶家族的成员(参见本文参考文献清单)。先前已在以Cbl和Cbl-b基因为靶标的小鼠中证明了它们在免疫系统中的作用。先前已经表明，该家族的成员之一Cbl-b在调节T细胞活化中起关键作用。Cbl-b-/-突变破坏了T细胞中的至少三个肿瘤抑制途径，包括TGFβ、CTLA4和PD1/PD-L1途径，其阻断了T细胞介导的针对肿瘤的应答。有证据表明Cbl-b-/-小鼠对接种的肿瘤具有抗性，并且单独的过继转移的Cbl-b-/- CD8+ T细胞就足以根除已建立的肿瘤。Cbl-b-/- T细胞还预防ATM-/-或p53-/-小鼠中的自发性淋巴瘤，以及小鼠中UV辐射诱发的自发性皮肤癌的发展。先前的研究表明，通过使用siRNA途径的RNA干扰方法可以在人原代T细胞中生成Cbl-b缺陷或敲除的人类T细胞。但是，siRNA敲除方法只能暂时抑制Cbl-b的表达，因此难以应用于肿瘤免疫治疗。
申请人发现靶向Cbl-b途径可以是产生用于癌症免疫疗法的“超级杀手”T细胞的有力方法，并且Cbl-b-/- T细胞可以识别在新出现的肿瘤上表达的未知肿瘤抗原。申请人进一步发现，本文公开的方法和基因组修饰成分可以实现持久的作用以在人原代T细胞中永久沉默Cbl-b表达，并具有上述优点。
本发明还涉及一种包含由免疫细胞修饰而来的肿瘤抑制细胞(TIC)群的药物组合物，其中所述TIC包含至少一种靶基因的至少一个失活的基因组等位基因，且不具有所述靶基因的生物功能，其中所述TIC不含所述免疫细胞外源的脱氧核糖核酸且不含免疫细胞外源的病毒核酸。
靶基因可包括Cbl-b、CTLA4、PD-1、LAG3、TIM3、CD73、KIR(杀伤细胞抑制受体)、Fas(肿瘤坏死因子(TNF)-受体成员)、AHR(芳烃受体)、Smad2、Smad4、TGFBR(TGFβ受体)、ILT-3或其组合。
在一个实例中，TIC可包括T细胞、NK细胞或其组合。在另一个实例中，TIC可包括Cbl-b-/- CD4+ T细胞、Cbl-b-/- CD8+ T细胞、Cbl-b-/- NK细胞、PD-1-/- T细胞、PD-1-/- NK细胞、CTLA-4-/- T细胞、CTLA4-/- NK细胞、TIM-3-/- T细胞、TIM-3-/- NK细胞、KIP-/- T细胞、KIR-/- NK细胞、LAG3-/- T细胞、LAG3-/- NK细胞、CD73-/- T细胞、CD73-/- NK细胞、Fas-/- T细胞、Fas-/- NK细胞、AHR-/- T细胞、AHR-/- NK细胞、Smad2-/- T细胞、Smad2-/- NK细胞、Smad4-/-T细胞、Smad4-/- NK细胞、TGFBR-/- T细胞、TGFBR-/- NK细胞、ILT-3-/- T细胞、ILT-3-/- NK细胞或其组合。在本文公开的药物组合物中，TIC与受试者在组织学上相容。
如本文所公开的，免疫细胞可以来自受试者的外周血、受试者的淋巴器官、受试者的淋巴液、受试者的其他器官或组织或其组合。免疫细胞可包括来自受试者的肿瘤、源自受试者的肿瘤的异种移植肿瘤或其组合的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)，如上所述。
本发明还涉及一种产生肿瘤抑制细胞(TIC)的方法，该方法包括以下步骤：
a)使至少一种靶基因和免疫细胞的至少一个基因组等位基因失活以产生不具有所述靶基因的生物功能的TIC，其中所述TIC不含免疫细胞外源的脱氧核糖核酸且不含免疫细胞外源的病毒核酸；
其中所述至少一种靶基因包括Cbl-b、CTLA4、PD-1、LAG3、TIM3、CD73、KIR(杀伤细胞抑制受体)、Fas、AHR(芳烃受体)、Smad2、Smad4、TGFBR(TGFβ受体)、ILT-3或其组合。
如上所述，可以通过将包含Cas9蛋白和靶向免疫细胞的至少一种靶基因的至少一种sgRNA的基因组修饰成分引入免疫细胞中来使所述靶基因的基因组等位基因失活，其中所述基因组修饰成分不含免疫细胞外源的脱氧核糖核酸且不含病毒核酸。上文和下文公开的任何Cas9蛋白和sgRNA或sgRNA的组合都可以是合适的。
如上文和下文所公开的，免疫细胞可包括未修饰的T细胞、未修饰的NK细胞或其组合。免疫细胞还可包括纯化的未修饰的T细胞、纯化的未修饰的NK细胞或其组合。上文和下文所公开的纯化的T细胞、NK细胞可以是合适的。上文或下文所公开的用于分离和纯化T细胞或NK细胞的方法可以是合适的。免疫细胞可包括来自受试者的肿瘤、源自受试者的肿瘤的异种移植肿瘤或其组合的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)。受试者可以是人类受试者。
异种移植肿瘤可以通过将受试者的一部分肿瘤异种移植到哺乳动物动物中而产生，例如免疫缺陷小鼠，如上文和下文所公开的。
由本文公开的方法产生的Cbl-b-/- TIC可包括Cbl-b-/- T细胞，其包括Cbl-b-/-CD4+ T细胞、Cbl-b-/- CD8+ T细胞、Cbl-b-/- NK细胞或其组合。在一个实例中，Cbl-b-/- TIC可包含5％至100％的Cbl-b-/- T细胞，在另一实例中可包含10％至100％的Cbl-b-/- T细胞，在另一个实例中可包含15％至100％的Cbl-b-/- T细胞，在另一个实例中可包含20％至100％的Cbl-b-/- T细胞，在另一个实例中可包含40％至100％的Cbl-b-/- T细胞，在一个实例中可包含50％至100％的Cbl-b-/- T细胞，在另一个实例中可包含60％至100％的Cbl-b-/-T细胞，在另一个实例中可包含70％至100％的Cbl-b-/- T细胞，在另一个实例中可包含80％至100％的Cbl-b-/- T细胞，在另一个实例中可包含90％至100％的Cbl-b-/- T细胞，在另一个实例中可包含95％至100％的Cbl-b-/- T细胞，基于总Cbl-b-/- TIC群的百分比计。Cbl-b-/- TIC还可包含5％至100％的Cbl-b-/- NK细胞，在另一个实例中可包含10％至100％的Cbl-b-/- NK细胞，在另一个实例中可包含15％至100％的Cbl-b-/- NK细胞，在另一个实例中可包含20％至100％的Cbl-b-/-NK细胞，在另一个实例中可包含40％至100％的Cbl-b-/- NK细胞，在一个实例中可包含50％至100％的Cbl-b-/- NK细胞，在另一个实例中可包含60％至100％的Cbl-b-/- NK细胞，在另一个实例中可包含70％至100％的Cbl-b-/- NK细胞，在另一个实例中可包含80％至100％的Cbl-b-/- NK细胞，在另一个实例中可包含90％至100％的Cbl-b-/- NK细胞，在另一个实例中可包含95％至100％的Cbl-b-/- NK细胞，基于总Cbl-b-/-TIC群的百分比计。
本文公开的方法可以进一步包括以下步骤：
b)在体外细胞培养物中增殖TIC；和
c)从体外细胞培养物中收获TIC。
上文和下文公开的用于增殖、收获、选择和纯化TIC的任何方法都可以是合适的。
本发明还涉及一种治疗有需要的受试者的肿瘤病症的方法，该方法包括以下步骤：
a)使受试者的免疫细胞的至少一种靶基因的至少一个基因组等位基因失活，以产生不具有所述靶基因的生物功能的肿瘤抑制细胞(TIC)，其中所述TIC不含免疫细胞外源的脱氧核糖核酸且不含免疫细胞外源的病毒核酸，并且其中所述靶基因选自Cbl-b、CTLA4、PD-1、LAG3、TIM3、CD73、KIR(杀伤细胞抑制受体)、Fas、AHR(芳烃受体)、Smad2、Smad4、TGFBR(TGFβ受体)、ILT-3或其组合；
b)任选地，在体外细胞培养物中增殖TIC；和
c)将TIC给予受试者。
TIC可以不具有所述靶基因中至少两种靶基因的生物功能。在一个实例中，本发明的TIC不具有所述靶基因中至少一种靶基因的生物功能。在另一个实例中，本发明的TIC不具有两种或更多种靶基因的生物功能。靶基因的任何组合可以是合适的，例如但不限于，在一个实例中，Cbl-b与PD-1、CTLA4、LAG3、TIM3、CD73、KIR、Fas、AHR、Smad2、Smad4、TGFBR或ILT-3中的一种或多种；在另一个实例中，PD-1与Cbl-b、CTLA4、LAG3、TIM3、CD73、KIR、Fas、AHR、Smad2、Smad4、TGFBR或ILT-3中的一种或多种；在另一个实例中，CTLA4与PD-1、Cbl-b、LAG3、TIM3、CD73、KIR、Fas、AHR、Smad2、Smad4、TGFBR或ILT-3中的一种或多种；以及在另一个实例中，LAG3与PD-1、CTLA4、TIM3、CD73、KIR、Fas、AHR、Smad2、Smad4、TGFBR或ILT-3中的一种或多种。
如上所述，可以通过将包含Cas9蛋白和至少一种靶向免疫细胞的靶基因的sgRNA的基因组修饰成分引入免疫细胞来使所述靶基因的基因组等位基因失活，其中所述基因组修饰成分不含免疫细胞外源的脱氧核糖核酸且不含病毒核酸。TIC可包括Cbl-b-/- CD4+ T细胞、Cbl-b-/- CD8+ T细胞、Cbl-b-/- NK细胞、PD-1-/- T细胞、PD-1-/- NK细胞、CTLA-4-/- T细胞、CTLA4-/- NK细胞、TIM-3-/- T细胞、TIM-3-/- NK细胞、KIP-/- T细胞、KIR-/- NK细胞、LAG3-/- T细胞、LAG3-/- NK细胞、CD73-/- T细胞、CD73-/- NK细胞、Fas-/- T细胞、Fas-/- NK细胞、AHR-/- T细胞、AHR-/- NK细胞、Smad2-/- T细胞、Smad2-/- NK细胞、Smad4-/- T细胞、Smad4-/- NK细胞、TGFBR-/- T细胞、TGFBR-/- NK细胞、ILT-3-/- T细胞、ILT-3-/- NK细胞或其组合。免疫细胞可以来自受试者的外周血、受试者的淋巴器官、受试者的淋巴液、受试者的其他器官或组织或其组合。受试者可以是人类受试者，例如癌症患者。TIC可以通过注射、输注或其组合给予受试者。免疫细胞可以是来自受试者的肿瘤、源自受试者的肿瘤的异种移植肿瘤或其组合的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)。异种移植肿瘤可以通过将受试者的一部分肿瘤异种移植到哺乳动物(例如小鼠或免疫缺陷小鼠)中来产生。
可以根据本文所述的“靶向Cbl-b的sgRNA的设计”来设计用于检查点基因CTLA4的靶标sgRNA。也可以使用商业工具和指南，例如可在CLONETECH(http://www.clontech.com)获得的工具和指南。可以将Cas9蛋白与一种或多种sgRNA混合，以转染免疫细胞或TIL。可以如本文所述测定基因靶向/缺失的效率。
可以根据本文所述的“靶向Cbl-b的sgRNA的设计”来设计用于另一检查点基因PD-1的靶标sgRNA。也可以使用商业工具和指南，例如可在CLONETECH(http://www.clontech.com)获得的工具和指南。可以将Cas9蛋白与一种或多种sgRNA混合，以转染免疫细胞或TIL。可以如本文所述测定基因靶向/缺失的效率。
可以根据本文所述的“靶向Cbl-b的sgRNA的设计”来设计用于另一检查点基因LAG3的靶标sgRNA。也可以使用商业工具和指南，例如可在CLONETECH(http://www.clontech.com)获得的工具和指南。可以将Cas9蛋白与一种或多种sgRNA混合，以转染免疫细胞或TIL。可以如本文所述测定基因靶向/缺失的效率。
可以根据本文所述的“靶向Cbl-b的sgRNA的设计”来设计用于另一检查点基因TIM3的靶标sgRNA。也可以使用商业工具和指南，例如可在CLONETECH(http://www.clontech.com)获得的工具和指南。可以将Cas9蛋白与一种或多种sgRNA混合，以转染免疫细胞或TIL。可以如本文所述测定基因靶向/缺失的效率。
可以根据本文所述的“靶向Cbl-b的sgRNA的设计”来设计用于另一检查点基因CD73的靶标sgRNA。也可以使用商业工具和指南，例如可在CLONETECH(http://www.clontech.com)获得的工具和指南。可以将Cas9蛋白与一种或多种sgRNA混合，以转染免疫细胞或TIL。可以如本文所述测定基因靶向/缺失的效率。
可以根据本文所述的“靶向Cbl-b的sgRNA的设计”来设计用于另一检查点基因KIR的靶标sgRNA。也可以使用商业工具和指南，例如可在CLONETECH(http://www.clontech.com)获得的工具和指南。可以将Cas9蛋白与一种或多种sgRNA混合，以转染免疫细胞或TIL。可以如本文所述测定基因靶向/缺失的效率。
可以根据本文所述的“靶向Cbl-b的sgRNA的设计”来设计用于另一检查点基因Fas的靶标sgRNA。也可以使用商业工具和指南，例如CLONETECH(http://www.clontech.com)获得的工具和指南。可以将Cas9蛋白与一种或多种sgRNA混合，以转染免疫细胞或TIL。可以如本文所述测定基因靶向/缺失的效率。
可以根据本文所述的“靶向Cbl-b的sgRNA的设计”来设计用于另一检查点基因AHR的靶标sgRNA。也可以使用商业工具和指南，例如可在CLONETECH(http://www.clontech.com)获得的工具和指南。可以将Cas9蛋白与一种或多种sgRNA混合，以转染免疫细胞或TIL。可以如本文所述测定基因靶向/缺失的效率。
可以根据本文所述的“靶向Cbl-b的sgRNA的设计”来设计用于另一检查点基因Smad2的靶标sgRNA。也可以使用商业工具和指南，例如可在CLONETECH(http://www.clontech.com)获得的工具和指南。可以将Cas9蛋白与一种或多种sgRNA混合，以转染免疫细胞或TIL。可以如本文所述测定基因靶向/缺失的效率。
可以根据本文所述的“靶向Cbl-b的sgRNA的设计”来设计用于另一检查点基因Smad4的靶标sgRNA。也可以使用商业工具和指南，例如可在CLONETECH(http://www.clontech.com)获得的工具和指南。可以将Cas9蛋白与一种或多种sgRNA混合，以转染免疫细胞或TIL。可以如本文所述测定基因靶向/缺失的效率。
可以根据本文所述的“靶向Cbl-b的sgRNA的设计”来设计用于另一检查点基因TGFBR的靶标sgRNA。也可以使用商业工具和指南，例如可在CLONETECH(http://www.clontech.com)获得的工具和指南。可以将Cas9蛋白与一种或多种sgRNA混合，以转染免疫细胞或TIL。可以如本文所述测定基因靶向/缺失的效率。
可以根据本文所述的“靶向Cbl-b的sgRNA的设计”来设计用于另一检查点基因ILT-3的靶标sgRNA。也可以使用商业工具和指南，例如可在CLONETECH(http://www.clontech.com)获得的工具和指南。可以将Cas9蛋白与一种或多种sgRNA混合，以转染免疫细胞或TIL。可以如本文所述测定基因靶向/缺失的效率。
本文公开的方法可以进一步包括将一种或多种癌症药物、一种或多种检查点抑制剂、额外的一种或多种治疗剂或其组合给予受试者。可以在给予TIC之前、给予TIC过程中或给予TIC之后将所述癌症药物、检查点抑制剂或其组合给予受试者。在一个实例中，可以在给予TIC之前的1至10天到约10分钟至约20小时将所述癌症药物、检查点抑制剂或其组合给予受试者，在另一个实例中在给予TIC之前的1天至约180天，在另一个实例中在给予TIC过程中将所述癌症药物、检查点抑制剂或其组合与TIC一起混合，在另一个实例中在给予TIC过程中将所述癌症药物、检查点抑制剂或其组合单独给予受试者，在另一个实例中在给予TIC之后的几天至几小时内，在另一个实例中在给予TIC之后的1天至约180天。也可将所述癌症药物、检查点抑制剂或其组合多次给予受试者，例如在给予TIC之前、在给予TIC过程中和给予TIC之后的组合。也可以将癌症药物植入受试者体内，例如用于控制释放或局部释放。
合适的癌症药物可包括小分子药物、化学疗法药物、疫苗、大分子药物或其组合，并且可以选自美国国立卫生研究院(NIH)(NIH列表的URL：https://www.cancer.gov/about-cancer/treatment/drugs)列出且可以从各种供应商处获得的癌症药物，或选自开发的且可获得的任何新的抗癌药物。药物的实例可以是单一药物或药物的组合，可以包括但不限于阿贝西尼(Abemaciclib)、乙酸阿比特龙(Abiraterone Acetate)、Abitrexate(甲氨蝶呤(Methotrexate))、Abraxane(紫杉醇白蛋白稳定的纳米粒子制剂)、ABVD(A＝盐酸多柔比星(Doxorubicin,Hydrochloride)(阿霉素(Adriamycin))、B＝博来霉素(Bleomycin)、V＝硫酸长春碱(Vincristine Sulfate)和D＝达卡巴嗪(Dacarbazine)的组合)、ABVE(A＝盐酸多柔比星(阿霉素)、B＝博来霉素、V＝硫酸长春新碱和E＝磷酸依托泊苷(EtoposidePhosphate))、ABVE-PC(ABVE和P＝泼尼松(Prednisone)、C＝环磷酰胺(Cyclophosphamide))、AC(A＝盐酸多柔比星(阿霉素)、C＝环磷酰胺)、阿卡替尼(Acalabrutinib)、AC-T(AC和T＝紫杉醇(Paclitaxel)(紫杉醇(Taxol)))、本妥昔单抗(Adcetris(Brentuximab Vedotin))、ADE(A＝阿糖胞苷(Ara-C)、D＝盐酸柔红霉素(Daunorubicin Hydrochloride)和E＝磷酸依托泊苷)、曲妥珠单抗-美坦新偶联物(Ado-Trastuzumab Emtansine)、阿霉素(盐酸多柔比星)、马来酸氢阿法替尼(AfatinibDimaleate)、Afinitor(依维莫司(Everolimus))、Akynzeo(奈妥匹坦(Netupitant)和盐酸帕洛诺司琼(Palonosetron Hydrochloride))、艾特乐(Aldara)(咪喹莫德(Imiquimod))、阿地白介素(Aldesleukin)、艾乐替尼(Alecensa)(阿来替尼(Alectinib))、阿来替尼、阿仑珠单抗(Alemtuzumab)、力比泰(Alimta)(培美曲塞二钠(Pemetrexed Disodium))、Aliqopa(Copanlisib Hydrochloride)、用于注射的爱克兰(Alkeran)(盐酸美法仑(MelphalanHydrochloride))、爱克兰片剂(美法仑)、Aloxi(盐酸帕洛诺司琼)、Alunbrig(布吉替尼(Brigatinib))、Ambochlorin(苯丁酸氮芥(Chlorambucil))、Amboclorin(苯丁酸氮芥)、氨磷汀(Amifostine)、氨基酮戊酸(Aminolevulinic Acid)、阿那曲唑(Anastrozole)、阿瑞匹坦(Acrepitant)、阿可达(Aredia)(帕米膦酸二钠(Pamidronate Disodium))、瑞宁得(阿那曲唑)、阿诺新(依西美坦)、Arranon(奈拉滨(Nelarabine))、三氧化二砷、Arzerra(奥法木单抗)、门冬酰胺酶菊欧文氏菌(Asparaginase Erwinia chrysanthemi)、阿特珠单抗(Atezolizumab)、阿瓦斯丁(贝伐珠单抗)、阿维鲁单抗(Avelumab)、AxicabtageneCiloleucel、阿昔替尼、阿扎胞苷、Bavencio(阿维鲁单抗)、BEACOPP(B＝博来霉素、E＝磷酸依托泊苷、A＝盐酸多柔比星(阿霉素)、C＝环磷酰胺、O＝硫酸长春新碱(VincristineSulfate)(硫酸长春新碱(Oncovin))、P＝盐酸丙卡巴肼和P＝泼尼松)、卡莫司汀(Becenum)(卡莫司汀(Carmustine))、Beleodaq(贝林司他)、贝林司他、盐酸苯达莫司汀、BEP、Besponsa(伊珠单抗奥加米星)、贝伐珠单抗、贝沙罗汀、Bexxar(托西莫单抗(Tositummomab)和碘I131托西莫单抗)、比卡鲁胺、BiCNU(卡莫司汀)、博来霉素、兰妥莫单抗、Blincyto(兰妥莫单抗)、硼替佐米、Bosulif(波舒替尼)、波舒替尼、本妥昔单抗(Brentuximab Vedotin)、布加替尼(Brigatinib)、BuMel、白消安(Busulfan)、白消安(Busulfex)(白消安(Busulfan))、卡巴他赛、卡博替尼(Cabometyx)(苹果酸卡博替尼(Cabozantinib-S-Malate))、苹果酸卡博替尼、CAF(C＝环磷酰胺、A＝盐酸多柔比星(阿霉素)和F＝氟尿嘧啶)、Calquence(阿卡替尼)、Campath(阿仑珠单抗)、Camptosar(盐酸依立替康)、卡培他滨(Capecitabine)、CAPOX(CAP＝卡培他滨和OX＝奥沙利铂)、氟尿嘧啶(Carac)(氟尿嘧啶-外用的)、卡铂、卡铂-紫杉醇(CARBOPLATIN-TAXOL)、卡非佐米、卡莫司汀(Carmubris)(卡莫司汀(Carmustine))、卡莫司汀(Carmustine)、卡莫司汀植入物、康士得(比卡鲁胺)、CEM(C＝卡铂、E＝磷酸依托泊苷和M＝盐酸美法仑)、色瑞替尼(Ceritinib)、柔红霉素(Cerubidine)(盐酸柔红霉素(Daunorubicin Hydrochloride))、希瑞适(Cervarix)(重组HPV二价疫苗)、西妥昔单抗、CEV(C＝卡铂、E＝磷酸依托泊苷、V＝硫酸长春新碱)、苯丁酸氮芥、苯丁酸氮芥-泼尼松、CHOP(C＝环磷酰胺、H＝盐酸多柔比星(羟基柔红霉素)、O＝硫酸长春新碱(Vincristine Sulfate)(硫酸长春新碱(Oncovin))、P＝泼尼松)、顺铂、克拉立滨、环磷酰胺(Clafen)(环磷酰胺(Cyclophosphamide))、氯法拉滨、Clofarex(氯法拉滨)、Clolar(氯法拉滨)、CMF、考比替尼(Cobimetinib)、Cometriq(苹果酸卡博替尼)、Copanlisib Hydrochloride、COPDAC(C＝环磷酰胺、O＝硫酸长春新碱(Vincristine Sulfate)(硫酸长春新碱(Oncovin))、P＝泼尼松、DAC＝达卡巴嗪)、COPP(C＝环磷酰胺、O＝硫酸长春新碱(Vincristine Sulfate)(硫酸长春新碱(Oncovin))、P＝盐酸丙卡巴肼、P＝泼尼松)、COPP-ABV、更生霉素(Cosmegen)(放线菌素D(Dactinomycin))、Cotellic(考比替尼(Cobimetinib))、克唑替尼(Crizotinib)、CVP、环磷酰胺、Cyfos(异环磷酰胺)、Cyramza(雷莫芦单抗)、阿糖胞苷、阿糖胞苷脂质体(Cytarabine Liposome)、赛德萨-U(阿糖胞苷)、环磷酰胺(Cytoxan)(环磷酰胺(Cyclophosphamide))、达拉非尼(Dabrafenib)、达卡巴嗪、Dacogen(地西他滨)、放线菌素D、达雷木单抗、Darzalex(达雷木单抗)、达沙替尼、盐酸柔红霉素、盐酸柔红霉素和阿糖胞苷脂质体、地西他滨、去纤苷钠、Defitelio(去纤苷钠)、地加瑞克、地尼白介素2、地舒单抗、脂质体阿糖胞苷(DepoCyt)(阿糖胞苷脂质体)、地塞米松、盐酸右丙亚胺、达妥昔单抗(Dinutuximab)、多西他赛、Doxil(盐酸多柔比星脂质体)、盐酸多柔比星、盐酸多柔比星脂质体、Dox-SL(盐酸多柔比星脂质体)、DTIC-Dome(达卡巴嗪)、度伐利尤单抗(Durvalumab)、氟尿嘧啶(Efudex)(氟尿嘧啶-外用的)、Elitek(拉布立酶)、盐酸表柔比星(Ellence)(盐酸表柔比星(EpirubicinHydrochloride))、依洛珠单抗、乐沙定(奥沙利铂)、艾曲波帕(Eltrombopag Olamine)、Emend(阿瑞匹坦)、Empliciti(依洛珠单抗)、甲磺酸恩西地平(Enasidenib Mesylate)、恩扎卢胺(Enzalutamide)、盐酸表柔比星、EPOCH、艾比特思(Erbitux)(西妥昔单抗)、甲磺酸艾瑞布林(Eribulin Mesylate)、Erivedge(维莫德吉(Vismodegib))、盐酸厄洛替尼、Erwinaze(门冬酰胺酶菊欧文氏菌)、氨磷汀(Ethyol)(氨磷汀(Amifostine))、凡毕复(磷酸依托泊甙)、依托泊苷、磷酸依托泊苷、阿霉素脂质体(盐酸多柔比星脂质体)、依维莫司、易维特(盐酸雷洛昔芬)、Evomela(盐酸美法仑)、依西美坦、5-FU(氟尿嘧啶注射液)、5-FU(氟尿嘧啶-外用的)、法乐通(托瑞米芬)、Farydak(帕比司他)、Faslodex(氟维司群)、FEC(F＝氟尿嘧啶、E＝盐酸表柔比星、C＝环磷酰胺)、弗隆(来曲唑)、非格司亭、福达华(磷酸氟达拉滨)、磷酸氟达拉滨、氟尿嘧啶(Fluoroplex)(氟尿嘧啶-外用的)、氟尿嘧啶注射液、氟尿嘧啶-外用的、氟他胺、Folex(甲氨蝶呤)、Folex PFS(甲氨蝶呤)、FOLFIRI、FOLFIRI-贝伐单抗、FOLFIRI-西妥昔单抗、FOLFIRINOX、FOLFOX、Folotyn(普拉曲沙)、FU-LV(FU＝氟尿嘧啶和LV＝亚叶酸钙)、氟维司群、佳达修(Gardasil)(重组HPV四价疫苗)、佳达修9(重组HPV九价疫苗)、Gazyva(阿托珠单抗)、吉非替尼、盐酸吉西他滨、吉西他滨-顺铂、吉西他滨-奥沙利铂、吉姆单抗奥佐米星、健择(Gemzar)(盐酸吉西他滨)、Gilotrif(马来酸阿法替尼)、阿法替尼(甲磺酸伊马替尼)、Gliadel(卡莫司汀植入物)、Gliadel晶片(卡莫司汀植入物)、谷卡匹酶、醋酸高锡林、Halaven(甲磺酸艾立布林)、Hemangeol(盐酸普萘洛尔)、赫赛汀(曲妥珠单抗)、重组HPV二价疫苗、重组HPV九价疫苗、重组HPV四价疫苗、和美新(盐酸拓扑替康)、羟基脲(Hydrea)(羟基脲(Hydroxyurea))、羟基脲、Hyper-CVAD、爱博新(Ibrance)(哌柏西利(Palbociclib))、替伊莫单抗、依鲁替尼(Ibrutinib)、ICE(I＝异环磷酰胺、C＝卡铂、E＝磷酸依托泊苷)、lclusig(盐酸帕纳替尼(Ponatinib Hydrochloride))、依达比星(Idamycin)(盐酸伊达比星(Idarubicin Hydrochloride))、盐酸伊达比星、艾德拉尼(Idelalisib)、Idhifa(甲磺酸恩西地平)、Ifex(异环磷酰胺)、异环磷酰胺、匹服平(异环磷酰胺)、IL-2(阿地白介素)、甲磺酸伊马替尼、伊布替尼(Imbruvica)(依鲁替尼)、英飞凡(Imfinzi)(度伐利尤单抗)、咪喹莫德、Imlygic(Talimogene Laherparepvec)、Inlyta(阿昔替尼)、伊珠单抗奥加米星、重组干扰素α-2b、白介素-2(阿地白介素)、内含子A(重组体干扰素α-2b)、碘I131托西莫单抗和托西莫单抗、伊匹木单抗、易瑞沙(吉非替尼)、盐酸依立替康、盐酸依立替康脂质体、Istodax(罗米地新)、伊沙匹隆、柠檬酸伊沙佐米(IxazomibCitrate)、Ixempra(伊沙匹隆)、Jakafi(磷酸鲁索替尼(Ruxolitinib Phosphate))、JEB(J＝卡铂(JM8)、E＝磷酸依托泊苷、B＝博来霉素)、Jevtana(卡巴他赛)、Kadcyla(曲妥珠单抗-美坦新偶联物)、雷洛昔芬(Keoxifene)(盐酸雷洛昔芬(Raloxifene Hydrochloride))、凯望斯(帕利夫明)、可瑞达(Keytruda)(帕博利珠单抗(Pembrolizumab))、Kisqali(瑞博西尼(Ribociclib))、Kymriah(Tisagenlecleucel)、Kyprolis(卡非佐米)、醋酸兰瑞肽(Lanreotide Acetate)、二甲苯磺酸拉帕替尼、Lartruvo(奥拉单抗(Olaratumab))、来那度胺、甲磺酸仑伐替尼(Lenvatinib Mesylate)、Lenvima(甲磺酸仑伐替尼)、来曲唑、亚叶酸钙、留可然(苯丁酸氮芥)、醋酸亮丙瑞林、克拉屈滨(Leustatin)(克拉屈滨(Cladribine))、果聚糖(Levulan)(氨基酮戊酸)、Linfolizin(苯丁酸氮芥)、LipoDox(盐酸多柔比星脂质体)、洛莫司汀、Lonsurf(曲氟尿苷和盐酸替匹嘧啶)、醋酸亮丙瑞林(Lupron)(醋酸亮丙瑞林(Leuprolide Acetate))、醋酸亮丙瑞林贮库型(Lupron Depot)(醋酸亮丙瑞林)、醋酸亮丙瑞林贮库型悬液(Lupron Depot-Ped)(醋酸亮丙瑞林)、Lynparza(奥拉帕利)、Marqibo(硫酸长春新碱脂质体)、盐酸丙卡巴肼(Matulane)(盐酸丙卡巴肼(ProcarbazineHydrochloride))、盐酸氮芥、醋酸甲地孕酮、Mekinist(曲美替尼(Trametinib))、美法仑、盐酸美法仑、巯嘌呤、美司钠、美司钠(Mesnex)(美司钠(Mesna))、替莫唑胺(Methazolastone)(替莫唑胺(Temozolomide))、甲氨蝶呤、甲氨蝶呤LPF(甲氨蝶呤)、溴甲钠曲酮、氨甲喋呤钠(Mexate)(甲氨蝶呤)、氨甲喋呤钠-AQ(甲氨蝶呤)、米哚妥林、丝裂霉素C、盐酸米托蒽醌、Mitozytrex(丝裂霉素C)、MOPP(M＝盐酸氮芥、O＝硫酸长春新碱(Vincristine Sulfate)(硫酸长春新碱(Oncovin))、P＝盐酸丙卡巴肼、P＝泼尼松)、Mozobil(普乐沙福)、氮芥(盐酸氮芥)、丝裂霉素(丝裂霉素C)、马利兰(白消安)、Mylosar(阿扎胞苷)、麦罗塔(吉姆单抗奥佐米星)、紫杉醇纳米粒子(紫杉醇白蛋白稳定的纳米粒子制剂)、诺维本(酒石酸长春瑞滨)、奈昔木单抗、奈拉滨、环磷酰胺(Neosar)(环磷酰胺(Cyclophosphamide))、马来酸奈拉替尼、Nerlynx(马来酸奈拉替尼)、奈妥匹坦和盐酸帕洛司琼、Neulasta(培非司亭)、优保津(非格司亭)、多吉美(甲苯磺酸索拉非尼)、Nilandron(尼鲁米特)、尼洛替尼、尼鲁米特、Ninlaro(柠檬酸伊沙佐米)、甲苯磺酸尼拉帕尼一水合物、纳武利尤单抗(Nivolumab)、诺瓦得士(柠檬酸他莫昔芬)、Nplate(罗米司亭)、阿托珠单抗、Odomzo(索尼德吉(Sonidegib))、OEPA(O＝硫酸长春新碱(Vincristine Sulfate)(硫酸长春新碱(Oncovin))、E＝磷酸依托泊苷、P＝泼尼松、A＝盐酸多柔比星(Adriamycin))、奥法木单抗、OFF(O＝奥沙利铂、F＝氟尿嘧啶、F＝亚叶酸钙(亚叶酸))、奥拉帕利、奥拉单抗、高三尖杉酯碱(Omacetaxine Mepesuccinate)、培门冬酶(Oncaspar)(培门冬酶(Pegaspargase))、盐酸昂丹司琼、Onivyde(盐酸依立替康脂质体)、Ontak(DenileukinDiftitox)、欧狄沃(Opdivo)(纳武利尤单抗)、OPPA(O＝硫酸长春新碱(VincristineSulfate)(硫酸长春新碱(Oncovin))、P＝盐酸丙卡巴肼、P＝泼尼松、A＝盐酸多柔比星(阿霉素))、奥西替尼(Osimertinib)、奥沙利铂、紫杉醇、紫杉醇白蛋白稳定的纳米粒子制剂、PAD(P＝硼替佐米(PS-341)、A＝盐酸多柔比星(阿霉素)、D＝地塞米松)、帕博西尼(Palbociclib)、帕利夫明、盐酸帕洛司琼、盐酸帕洛司琼和奈妥匹坦、帕米膦酸二钠、帕木单抗、帕比司他、Paraplat(卡铂)、伯尔定(卡铂)、盐酸帕唑帕尼、PCV、PEB、聚乙二醇天冬酰胺酶(Pegaspargase)、聚乙二醇非格司亭(Pegfilgrastim)、聚乙二醇干扰素α-2b(Peginterferon Alfa-2b)、PEG-内含子(聚乙二醇干扰素α-2b)、帕博利珠单抗、培美曲塞二钠、Perjeta(培妥珠单抗)、培妥珠单抗、顺铂(Platinol)(顺铂(Cisplatin))、顺铂-AQ(顺铂)、普乐沙福、泊马度胺、Pomalyst(泊马度胺)、盐酸帕纳替尼、Portrazza(奈昔木单抗)、普拉曲沙、泼尼松、盐酸丙卡巴肼、阿地白介素(Proleukin)(阿地白介素(Aldesleukin))、Prolia(地舒单抗)、Promacta(艾曲泊帕(Eltrombopag Olamine))、盐酸普萘洛尔、普罗文奇(Provenge)(Sipuleucel-T)、巯嘌呤(Purinethol)(巯嘌呤(Mercaptopurine))、Purixan(巯嘌呤)、二氯化镭223、盐酸雷洛昔芬、雷莫芦单抗、拉布立酶、R-CHOP(R＝利妥昔单抗和CHOP)、R-CVP(R＝利妥昔单抗和CVP)、重组人乳头瘤病毒(HPV)二价疫苗、重组人乳头瘤病毒(HPV)九价疫苗、重组人乳头瘤病毒(HPV)四价疫苗、重组干扰素α-2b、瑞戈非尼、Relistor(溴甲钠曲酮)、R-EPOCH、Revlimid(来那度胺)、甲氨蝶呤(Rheumatrex)(甲氨蝶呤(Methotrexate))、立博昔利布(Ribociclib)、R-ICE(R＝利妥昔单抗和ICE)、B细胞单克隆抗体(利妥昔单抗)、Rituxan Hycela(利妥昔单抗和人透明质酸酶(Hyaluronidase Human))、利妥昔单抗、利妥昔单抗和人透明质酸酶、盐酸罗拉匹坦、罗米地新、罗米司亭、柔红霉素(Rubidomycin)(盐酸柔红霉素(DaunorubicinHydrochloride))、Rubraca(樟磺酸瑞卡帕布(Rucaparib Camsylate))、樟磺酸瑞卡帕布、磷酸鲁索替尼、Rydapt(米哚妥林)、Sclerosol Intrapleural Aerosol(滑石)、司妥昔单抗、Sipuleucel-T、索马杜林贮库型(醋酸兰瑞肽)、索尼德吉(Sonidegib)、甲苯磺酸索拉非尼、Sprycel(达沙替尼)、STANFORD V、无菌滑石粉(滑石)、Steritalc(滑石)、Stivarga(瑞戈非尼)、苹果酸舒尼替尼、索坦(苹果酸舒尼替尼)、Sylatron(聚乙二醇干扰素α-2b)、Sylvant(司妥昔单抗)、Synribo(美琥他辛)、硫鸟嘌呤(Tabloid)(硫鸟嘌呤(Thioguanine))、TAC(T＝多西他赛(泰索帝)、A＝盐酸多柔比星(阿霉素)、C＝环磷酰胺)、Tafinlar(达拉非尼(Dabrafenib))、泰瑞沙(Tagrisso)(奥西替尼(Osimertinib))、滑石、Talimogene Laherparepvec、醋酸他莫昔芬、Tarabine PFS(阿糖胞苷)、特罗凯(Tarceva)(盐酸厄洛替尼)、Targretin(贝沙罗汀)、Tasigna(尼洛替尼)、紫杉醇(Taxol)(紫杉醇(Paclitaxel))、泰索帝(Taxotere)(多西他赛)、特善奇(Tecentriq)(阿特珠单抗)、Temodar(替莫唑胺)、替莫唑胺、坦西莫司、沙利度胺(Thalidomide)、沙利度胺(Thalomid)(沙利度胺(Thalidomide))、硫鸟嘌呤、塞替派(Thiotepa)、Tisagenlecleucel、Tolak(氟尿嘧啶-外用的)、盐酸拓扑替康、托瑞米芬(Toremifene)、Torisel(坦西莫司)、托西莫单抗和碘I131托西莫单抗、Totect(盐酸右丙亚胺)、TPF(T＝多西他赛(泰索帝)、P＝顺铂(Cisplatin)(顺铂(Platinol)、F＝氟尿嘧啶)、曲贝替定(Trabectedin)、曲美替尼、曲妥珠单抗、Treanda(盐酸苯达莫司汀)、曲氟尿苷和盐酸替匹嘧啶(Tipiracil Hydrochloride)、三氧化二砷(Trisenox)(三氧化二砷(Arsenic Trioxide))、Tykerb(二甲苯磺酸拉帕替)、Unituxin(达妥昔单抗(Dinutuximab))、三醋酸尿苷、VAC(V＝硫酸长春新碱、A＝放线菌素D(Dactinomycin)(放线菌素D(Actinomycin-D))、C＝环磷酰胺)、戊柔比星(Valrubicin)、Valstar(戊柔比星)、凡德他尼、VAMP(V＝硫酸长春新碱、A＝盐酸多柔比星(阿霉素)、M＝甲氨蝶呤、P＝泼尼松)、Varubi(盐酸罗拉匹坦)、Vectibix(帕木单抗)、VelP(Ve＝硫酸长春碱(Velban)、l＝异环磷酰胺、P＝顺铂(Cisplatin)(顺铂(Platinol))、长春碱(硫酸长春碱)、万珂(硼替佐米)、Velsar(硫酸长春碱)、维莫非尼(Vemurafenib)、Venclexta(维奈托克(Venetoclax))、维奈托克、Verzenio(阿贝西尼)、Viadur(醋酸亮丙瑞林)、阿扎胞苷(Vidaza)(阿扎胞苷(Azacitidine))、硫酸长春碱、硫酸长春新碱注射剂(Vincasar PFS)(硫酸长春新碱(Vincristine Sulfate))、硫酸长春新碱、硫酸长春新碱脂质体、酒石酸长春瑞滨、VIP、维莫德吉、Vistogard(三醋酸鸟苷)、Voraxaze(谷卡匹酶)、伏林司他、Votrient(盐酸帕唑帕尼)、Vyxeos(盐酸柔红霉素和阿糖胞苷脂质体)、亚叶酸钙(Wellcovorin)(亚叶酸钙(Leucovorin Calcium))、Xalkori(克唑替尼)、希罗达(Xeloda)(卡培他滨)、XELIRI(XEL＝卡培他滨(希罗达)、IRI＝盐酸伊立替康)、XELOX(XEL＝卡培他滨(希罗达)和OX＝奥沙利铂)、Xgeva(地舒单抗)、Xofigo(二氯化镭223)、Xtandi(恩扎卢胺)、Yervoy(伊匹木单抗)、Yescarta(Axicabtagene Ciloleucel)、Yondelis(曲贝替定)、Zaltrap(阿柏西普)、Zarxio(非格司亭)、Zejula(甲苯磺酸尼拉帕尼一水合物)、Zelboraf(维莫非尼)、泽娃灵(Zevalin)(替伊莫单抗)、Zinecard(盐酸右丙亚胺)、阿柏西普(ziv-aflibercept)、枢复宁(Zofran)(盐酸昂丹司琼)、诺雷德(Zoladex)(唑来膦酸(GoserelinAcetate))、唑来膦酸(Zoledronic Acid)、Zolinza(伏林司他)、择泰(Zometa)(唑来膦酸)、Zydelig(艾德拉尼)、Zykadia(色瑞替尼)、Zytiga(醋酸阿比特龙)或其组合。
合适的检查点抑制剂可包括抗PD1抗体(例如可瑞达或帕博利珠单抗、欧狄沃或纳武利尤单抗、阿维鲁单抗(Bavencio或Avelumab)、英飞凡或度伐利尤单抗、特善奇或阿特珠单抗)、抗PD-L1抗体、抗CTLA-4(细胞毒性T淋巴细胞相关抗原，也称为CD152)抗体、抗LAG3(淋巴细胞激活基因3)抗体、抗TIM-3(T细胞免疫球蛋白和粘蛋白结构域3)抗体或其组合。
合适的治疗剂可包括抗CD19抗体、抗CD20抗体(例如托西莫单抗)、细胞因子(例如白细胞介素、干扰素α2a(INF-α2a)、干扰素α(INF-α)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)或优保津(Neupogen)(也称为非格司亭(Filgrastim)))、T细胞受体(TCR)，嵌合抗原受体或嵌合抗原T细胞受体(CAR-T)或其组合。
本发明还涉及一种产生肿瘤抑制细胞(TIC)的方法，该方法包括以下步骤：
a)通过以下步骤产生异种移植肿瘤：将受试者的一部分肿瘤分散到肿瘤细胞悬液中，任选地用一种或多种选择标记物从肿瘤细胞悬液中纯化肿瘤细胞以产生纯化的肿瘤细胞，并将肿瘤细胞悬液或纯化的肿瘤细胞移植到哺乳动物中以形成异种移植肿瘤；
b)从异种移植肿瘤获得肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)；
c)通过向TIL中引入基因组修饰成分来使TIL的至少一种靶基因的至少一个基因组等位基因失活，所述基因组修饰成分包含Cas9蛋白和靶向TIL的所述靶基因的至少一种sgRNA，其中所述基因组修饰成分不含TIL外源的脱氧核糖核酸且不含病毒核酸；
其中所述靶基因包括Cbl-b、CTLA4、PD-1、LAG3、TIM3、CD73、KIR(杀伤细胞抑制受体)、Fas、AHR(芳烃受体)、Smad2、Smad4、TGFBR(TGFβ受体)、ILT-3或其组合。
通过本发明的这种方法产生的TIC可包括Cbl-b-/- CD4+ T细胞、Cbl-b-/- CD8+ T细胞、Cbl-b-/- NK细胞、PD-1-/- T细胞、PD-1-/- NK细胞、CTLA-4-/- T细胞、CTLA4-/- NK细胞、TIM-3-/- T细胞、TIM-3-/-NK细胞、KIP-/- T细胞、KIR-/- NK细胞、LAG3-/- T细胞、LAG3-/- NK细胞、CD73-/- T细胞、CD73-/- NK细胞、Fas-/- T细胞、Fas-/- NK细胞、AHR-/- T细胞、AHR-/- NK细胞、Smad2-/- T细胞、Smad2-/- NK细胞、Smad4-/- T细胞、Smad4-/- NK细胞、TGFBR-/- T细胞、TGFBR-/- NK细胞、ILT-3-/- T细胞、ILT-3-/- NK细胞或其组合。所述受试者可以是人类受试者。
上文和下文公开的用于产生异种移植肿瘤、纯化TIL、从异种移植肿瘤获得TIL、使靶基因失活的任何方法都可以是合适的。
本文引用的所有参考文献通过引用的方式纳入。
参考文献
1.Humphries，C.Adoptive cell therapy：Honing that killerinstinct.Nature 504，S13-15(2013).
2.Rosenberg，S.A.Cell transfer immunotherapy for metastatic solidcancer--what clinicians need to know.Nat.Rev.Clin.Oncol.8，577-585(2011).
3.Houghton，A.N.，Gold，J.S.&Blachere，N.E.Immunity against cancer：lessons learned from melanoma.Curr.Opin.Immunol.13，134-140(2001).
4.Rosenberg，S.A.Progress in human tumour immunology andimmunotherapy.Nature 411，380-384(2001).
5.Boon，T.，Cerottini，J.C.，Van den Eynde，B.，van der Bruggen，P.&Van Pel，A.Tumor antigens recognized by T lymphocytes.Annu.Rev.Immunol.12，337-365(1994).
6.Pardoll，D.M.Cancer vaccines.Nat.Med.4，525-531(1998).
7.Rosenberg，S.A.，Yang，J.C.&Restifo，N.P.Cancer immunotherapy：movingbeyond current vaccines.Nat.Med.10，909-915(2004).
8.Schuler，G.，Schuler-Thurner，B.&Steinman，R.M.The use of dendriticcells in cancer immunotherapy.Curr.Opin.Immunol.15，138-147(2003).
9.Somasundaram，R.et al.Inhibition of cytolytic T lymphocyteproliferation by autologous CD4+/CD25+ regulatory T cells in a colorectalcarcinoma patient is mediated by transforming growth factor-beta.CancerRes.62，5267-5272(2002).
10.Townsend，S.E.&Allison，J.P.Tumor rejection after directcostimulation of CD8+ T cells by B7-transfected melanoma cells.Science 259，368-370(1993).
11.Chen，L.et al.Tumor immunogenicity determines the effect of B7costimulation on Tcell-mediated tumor immunity.J.E×p.Med.179，523-532(1994).
12.Ramarathinam，L.，Castle，M.，Wu，Y.&Liu，Y.T cell costimulation by B7/BB1 induces CD8 T cell-dependent tumor rejection：an important role of B7/BB1in the induction，recruitment，and effector function of antitumor Tcells.J.Exp.Med.179，1205-1214(1994).
13.Robert，C.et al.lpilimumab plus dacarbazine for previouslyuntreated metastatic melanoma.N.Engl.J.Med.364，2517-2526(2011).
14.Robert.C.et al.Anti-programmed-death-receptor-1 treatment withpembrolizumab in ipilimumab-refractory advanced melanoma：a randomised dose-comparison cohort of a phase 1 trial.Lancet Lond.Engl.384，1109-1117(2014).
15.Boutros，C.et al.Safety profiles of anti-CTLA-4 and anti-PD-1antibodies alone and in combination.Nat.Rev.Clin.Oncol.13，473-486(2016).
16.Novartis CAR-T cell therapy CTL019 receives FDA BreakthroughTherapy designation for treatment of adult patients with r/r DLBCL.NovartisAvailable at：https://www.novartis.com/news/media-releases/novartis-car-t-cell-therapy-ctl019-receives-fda-breakthrough-therapy-designation.
17.Rao，N.，Dodge，I.&Band，H.The Cbl family of ubiquitin ligases：critical negative regulators of tyrosine kinase signaling in the immunesystem.J.Leukoc.Biol.71，753-763(2002).
18.Liu，Y.-C.&Gu，H.Cbl and Cbl-b in T-cell regulation.TrendsImmunol.23，140-143(2002).
19.ThieR，C.B.&Langdon，W.Y.Cbl：many adaptations to regulate proteintyrosine kinases.Nat.Rev.Mol.Cell Biol.2，294-307(2001).
20.Murphy，M.A.et al.Tissue hyperplasia and enhanced T-cell signallingvia ZAP-70 in c-Cbl-deficient mice.Mol.Cell.Biol.18，4872-4882(1998).
21.Bachmaier，K.et al.Negative regulation of lymphocyte activation andautoimmunity by the molecular adaptor Cbl-b.Nature 403，211-216(2000).
22.Chiang，Y.J.et al.Cbl-b regulates the CD28 dependence of T-cellactivation.Nature 403，216-220(2000).
23.Naramura，M.，Kole，H.K.，Hu，R.J.&Gu，H.Altered thymic positiveselection and intracellular signals in Cbl-deficient mice.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.95，15547-15552(1998).
24.Naramura，M.et al.c-Cbl and Cbl-b regulate T cell responsiveness bypromoting ligand-induced TCR down-modulation.Nat.Immunol.3，1192-1199(2002).
25.Chiang，J.Y.，Jang，I.K.，Hodes，R.&Gu，H.Ablation of Cbl-b providesprotection against transplanted and spontaneous tumors.J.Clin.Invest.117，1029-1036(2007).
26.Gu，H.，Jang，I.，Columbia，U.，Gu，H.&Jang，I.Agents and methods toelicit anti-tumor immune response.(2007).
27.Hinterleitner，R.et al.Adoptive Transfer of siRNA Cblb-Silenced CD8+ T Lymphocytes Augments Tumor Vaccine Efficacy in a B16 Melanoma Model.PLOSONE 7，e44295(2012).
28.Andersen，R.S.et al.Dissection of T-cell Antigen Specificity inHuman Melanoma.Cancer Res.72，1642-1650(2012).
29.Dudley，M.E.，Wunderlich，J.R.，Shelton，T.E.，Even，J.&Rosenberg，S.A.Generation of tumor-infiltrating lymphocyte cultures for use in adoptivetransfer therapy for melanoma patients.J.Immunother.Hagerstown Md 1997 26，332-342(2003).
30.Fu，Y.et al.High frequency off-target mutagenesis induced byCRISPR-Cas nucleases in human cells.Nat.Biotechnol.31，822-826(2013).
31.Pattanayak，V.et al.High-throughput profiling of off-target DNAcleavage reveals RNA-programmed Cas9 nuclease specificity.Nat.Biotechnol.31，839-843(2013).
32.H.su，P.D.et al.DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9nucleases.Nat.Biotechnol.31，827-832(2013).
33.DeRose.Y.S.et al.Patient-derived models of human breast cancer：protocols for in vitro and in vivo applications in tumor biology andtranslational medicine.Curr.Protoc.Pharmacol.Chapter 14，Unit14.23(2013).
34.Wang，X.et al.Engraftment of human central memory-derived effectorCD8+ T cells in immunodeficient mice.Blood 117，1888-1898(2011).
35.Kim，S.，Kim，D.，Cho，S.W.，Kim，J.&Kim，J.-S.Highly efficient RNA-guidedgenome editing in human cells via delivery of purified Cas9ribonucleoproteins.Genome Res.24，1012-1019(2014).
实施例
在以下实施例中进一步定义本发明。应当理解，这些实施例虽然指明了本发明的优选实施方案，但仅以举例说明的方式给出。从以上讨论和这些实施例，本领域技术人员可以确定本发明的基本特征，并且在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可以对本发明进行各种改变和修改以使其适应各种用途和条件。
材料和方法
T细胞来源：
从健康供体的外周血中纯化人原代T细胞。根据经批准的步骤和方案，从新鲜的乳腺肿瘤样本中分离出人类TIL。
从血液中分离T细胞：
从蒙特利尔临床研究所(Institut de Recherche Clinique de Montreal，IRCM)的临床机构招募的每位健康供体中，根据IRCM伦理委员会批准的方案，收集约40mL静脉血。
根据制造商的说明，使用STEMCELLTM Technologies(温哥华，BC，V6A 1B6，加拿大)的Lymphoprep培养基和SepMate管，通过梯度密度分离法分离外周血单核细胞(PBMC)。然后根据制造商的说明，使用STEMCELLTM Technologies的EasySepTM人类T细胞分离试剂盒或EasySep CD8+ T细胞分离试剂盒从PBMC中纯化人原代T细胞或CD8+T细胞。
分离肿瘤浸润(TIL)T细胞：
根据适当的伦理委员会批准的方案，从以当地伦理委员会批准的知情同意书招募的患者中获得新鲜的乳腺肿瘤样本。根据由已批准的实验室步骤修改的方案处理样本：简言之，用手术刀将肿瘤样本切成小片(大小约为2-3mm3)。将每个肿瘤样本片放入具有0.5mL补充有6000IU/mL rhIL-2的完全RPMI培养基(RPMI 1640、25mM Hepes pH7.2、100U/mL青霉素，100μg/mL链霉素，2mM L-谷氨酰胺和5.5×10-5Mβ-巯基乙醇，10％热灭活的胎牛血清)的48孔组织培养板的一个孔中。将板在37℃和5％CO2的培养箱中孵育。肿瘤浸润T细胞(也称为肿瘤浸润淋巴细胞(TIL))从样本片中作为单个细胞生长出来。当培养物达到80％汇合(confluence)时，将这些孔中的细胞合并，并在6厘米组织培养皿中，在存在5μg/mL抗CD3抗体(克隆OKT3)和5μg/mL抗CD28抗体(克隆CD28.2)以及1000U/mL IL-15的情况下，在完全RPMI培养基中以1.5×106细胞/mL的密度进一步培养，直到每个培养皿中的培养物汇合或几乎汇合，通常在2-3周内。图2A中示出了从乳腺癌样本中产生的总TIL并进行FACS分选，其中TIL中的T细胞如虚线区域所示被门控并收获。将T细胞用抗CD4和抗CD8抗体染色，并进行FACS分选，如图2B所示，其中标出了CD4+和CD8+细胞的百分比。还示出了DIC(微分干涉相差)视图：一片在48孔组织培养板中生长的乳腺癌样本(图2C)和培养物中的乳腺癌TIL的高倍放大图(图2D)。
靶向Cbl-b的sgRNACbl-b的设计
使用内部软件设计靶向Cbl-b基因的sgRNACbl-b。CRISPR-Cas9编辑方法可产生脱靶(OT)突变，这种突变可能产生不良后果，例如癌症。在这方面，有必要通过为Cbl-b基因突变选择合适的sgRNA来将该风险降到最低。当sgRNA在基因组中的另一个部位退火时，会诱发OT突变，即使脱靶序列与原始序列存在某些错配，也可能发生OT突变，尤其是在PAM远端区域。为了将OT事件的潜在危险降到最低并避免产生显性负性Cbl-b突变的可能性，使用内部软件设计靶向人Cbl-b基因的sgRNA，其与位于Cbl-b基因的RING指结构域上游的序列同源。所使用的sgRNA的序列如下：GAGGUCCACCAGAUUAGCUCUGG(SEQ ID.1)。
sgRNA
使用以下引物和PCR模板，通过PCR生成用于体外转录的模板：TTAATACGACTCACTATAGAGGTCCACCAGATTAGCTCGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAA(SEQID.2)和AAAAGCACCGACTCGGTGCCA(SEQ ID.3)，所述PCR模板由pUC57质粒组成，该质粒含有由
根据Church Lab公布的序列(可在此处获得：https://media.addgene.org/cms/files/hCRISPR_gRNA_Synthesis.pdf，在此通过引用纳入)合成的sgRNA支架。pUC57质粒中模板的序列如下：TGTACAAAAAAGCAGGCTTTAAAGGAACCAATTCAGTCGACTGGATCCGGTACCAAGGTCGGGCAGGAAGAGGGCCTATTTCCCATGATTCCTTCATATTTGCATATACGATACAAGGCTGTTAGAGAGATAATTAGAATTAATTTGACTGTAAACACAAAGATATTAGTACAAAATACGTGACGTAGAAAGTAATAATTTCTTGGGTAGTTTGCAGTTTTAAAATTATGTTTTAAAATGGACTATCATATGCTTACCGTAACTTGAAAGTATTTCGATTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACACCGAGTGTGGCGCGGGACTGCCGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTTCTAGACCCAGCTTTCTTGTACAAAGTTGGCATTA(SEQID.4)。
根据制造商的说明，使用Qiagen的
PCR纯化试剂盒纯化PCR产物，并使用MEGAshortscriptTM T7转录试剂盒(Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，美国)进行体外转录。最后，将最终的sgRNA产物sgRNACbl-b用
迷你试剂盒(Qiagen，Germantown，MD，美国)进行纯化。作为一种替代方法，还使用了来自商业来源(美国加利福尼亚州雷德伍德城的Synthego)的合成Cbl-b sgRNA。
重组Cas9蛋白的制备
使用质粒pET28a/Cas9-Cys(Addgene质粒#53261)产生重组Cas9蛋白，其C端具有核定位信号，N端具有6xHis标签。简言之，将质粒pET28a/Cas9-Cys转入到BL-21细菌中，并通过向细菌培养物中加入1mM IPTG来诱导重组Cas9的表达，并在30℃下进一步培养过夜。将细菌在含有20mM Tris、300mM NaCl、20nM咪唑、1mg/mL溶菌酶的缓冲液中裂解，然后超声处理10min。然后通过3500rpm离心30min澄清细菌裂解物，并用0.40μm的过滤器过滤上清液。然后，根据制造商的说明，使用带有HisTrapTM高效柱(GE Healthcare)的FPLC系统从上清液中纯化重组Cas9蛋白。纯化的重组Cas9蛋白用Vivaspin6 MWCO100离心浓缩仪(GEHealthcare)浓缩，并在-80℃下储存在含有300mM NaCl、10mM Tris-HCl(pH7.4)、0.2mMEDTA、2mM DTT和50％(v/v)甘油的缓冲液中。
人类T细胞的转染
通过将重组Cas9蛋白和以上制备的sgRNACbl-b在37℃下孵育5分钟来生产Cas9-sgRNACbl-b核糖核蛋白复合体(15μg Cas9蛋白+20μg sgRNACbl-b)。根据制造商针对未刺激的T细胞的说明，使用
人类T细胞
试剂盒(Lonza，Allendale，NJ，美国，以各自的注册商标)，用Cas9-sgRNACbl-b核糖核蛋白复合体转染约1×106至1×107个人类T细胞。为了进行模拟转染，将相同数量的人原代T细胞用15μg Cas9蛋白进行电穿孔，但没有sgRNACbl-b。电穿孔后，将T细胞在组织培养皿中以1.5×106个细胞/mL的密度铺板于补充有100IU/mL rhIL-2和5μM AZT的完全RPMI培养基中，并在5％CO2的培养箱中在30℃下孵育12小时。然后将转染的T细胞在37℃下培养扩增，如下文所述。
转染的人类T细胞的扩增
为了进一步扩增，在组织培养皿中补充有5μg/mL抗CD3(克隆OKT3)和5μg/mL抗CD28抗体(克隆CD28.2)以及1000U/mL IL-15的完全RPMI培养基中，将1-2×106细胞/mL转染的人类T细胞在37℃下与5％CO2孵育。每三天平分(split)一次细胞。
Cbl-b失活的T细胞的表征
靶向Cbl-b基因的效率：
SURVEYOR测定法用于确定人类T细胞中Cbl-b基因靶向失活的效率。简言之，从用Cas9-sgRNACbl-b核糖核蛋白复合体转染的细胞中提取基因组DNA。将来自模拟转染(Cas9蛋白，无sgRNACbl-b)的人类T细胞的野生型基因组DNA作为对照。通过PCR扩增了Cbl-b基因的含有sgRNACbl-b靶向修饰位点的400bp DNA片段。根据制造商的说明，将扩增的DNA片段变性、复性并用Surveyor核酸酶(Integrated DNA technologies)处理。通过在Agilent 2100生物分析仪(Agilent，威尔明顿，DE，美国)上运行消化产物来定量每个样品中野生型完整的和经切割的错配DNA片段的比例。代表性的结果如图3所示。
功能测定：
1.T细胞增殖测定
根据制造商的说明，将模拟转染的或Cas9-sgRNACbl-b转染的人类T细胞用CFSE(羧荧光素琥珀酰亚胺酯，Life Technologies)标记。然后将2.5×106CFES标记的人类T细胞在24孔板的1mL/孔的完全RPMI培养基中培养，并进行以下刺激：5μg/mL板装(plate-bound)的抗人CD3抗体(克隆OKT3，Biolegend，美国加利福尼亚州圣地亚哥)，其含或不含5ng/mL重组人TGFβ1(Prospec，美国新泽西州东布伦瑞克市)，或5μg/mL板装的抗人CD3以及2μg/mL可溶性抗人CD28抗体(克隆CD28.2，Biolegend)，其含或不含5ng/mL重组人TGFβ1。将在没有CD3或CD28刺激的完全RPMI培养基中的CFSE标记的T细胞作为阴性对照。4天后，通过FACS测量子细胞中由CFSE密度指示的T细胞的增殖。
在另外的刺激条件下，本发明人用人CD80和CD83转染MDA-MB-231人乳腺肿瘤细胞系(ATCC#CRM-HTB-26)，以产生“MDA选择物”细胞系，并将“MDA选择物”细胞系用于人类T细胞的同种异体刺激+CD28共刺激。将约5×105个细胞/孔的受辐射的“MDA选择物”细胞添加到2.5×106CFSE标记的模拟转染或Cas9-sgRNACbl-b转染的人类T细胞中，于24孔组织培养板中的1mL/孔的补充有200U/mL重组人IL-2的完全RPMI培养基中。7天后，用FACS测定由同种异体肿瘤细胞诱导的T细胞的增殖，以测量CFSE稀释度。
2.INFγ分泌测定
如上所述刺激模拟转染的或Cas9-sgRNACbl-b转染的人类T细胞。根据制造商的说明，通过ELISA(Affimetrix，Santa Clara，CA，美国)测量培养上清液中的INFγ。根据制造商的说明，还通过INFγ分泌测定-检测试剂盒(Miltenyi Biotech，GmbH，BergischGladbach，德国)确定INFγ分泌。
3.体外肿瘤细胞杀伤测定
将模拟转染的或Cas9-sgRNACbl-b转染的人类T细胞用CFSE标记，并与上述受辐射的“MDA选择物”细胞共培养。培养6天后，响应于“MDA选择物”细胞刺激的T细胞已旺盛地增殖并成为CFSElo细胞，而对“MDA选择物”无反应的T细胞未增殖并保持为CFSEhi细胞。通过FACS分选CFSElo和CFSEhi细胞，并分别与“MDA选择物”细胞一起再培养3天。通过ELISA或使用基于LDH的细胞毒性测定法(Promega，Madison，WI，美国)分别分析了T细胞的细胞因子产生(IFNγ)或“MDA选择物”(靶肿瘤细胞)的活力。
在人原代T细胞中Cbl-b基因的靶向失活：
申请人发现，通过在人原代T细胞中电穿孔编码Cas9蛋白的质粒DNA或mRNA不能有效地实现Cbl-b基因的突变。为了使人原代T细胞中的Cbl-b基因失活，如上所述，使用了与体外转录的sgRNACbl-b复合的重组Cas9蛋白。SURVEYOR测定法用于确定人类T细胞中Cbl-b基因的修饰的效率(图3)。在从外周血或乳腺肿瘤样本中分离的T细胞(TIL)中，约有30％的Cbl-b等位基因被位点特异性失活。具有失活的Cbl-b基因的人类T细胞分别称为人Cbl-b-/-T细胞或Cbl-b-/- TIL。
人Cbl-b-/- T细胞或Cbl-b-/- TIL的活化不依赖于CD28，并且与Cbl-b未修饰的人类T细胞相比具有更高的TGFβ抗性
本发明人先前的实验表明，与其野生型对应细胞不同，小鼠Cbl-b-/-CD8+ T细胞可通过抗CD3刺激来激活，而无需CD28共刺激，并且抵抗TGFβ介导的对细胞增殖和细胞因子产生的抑制。为了确定人Cbl-b失活的T细胞(人Cbl-b-/- T细胞)是否表现出相同的功能特性，在用抗CD3抗体刺激后，在存在或不存在抗CD28和TGFβ的情况下，测定T细胞增殖以及INF-γ产生。细胞增殖是通过CFSE稀释测定法确定(如图4A所示)，IFNγ产生是通过IFNγ分泌测定试剂盒进行测定(图4B)。用Cas9-sgRNACbl-b核糖核蛋白复合体转染的人类T细胞群含有约30％的人Cbl-b-/- T细胞。如在小鼠Cbl-b敲除的T细胞中所见的，用抗CD3单独刺激或用抗CD3结合抗CD28刺激后，与它们的模拟转染的对应细胞相比，人Cbl-b-/- T细胞增殖更旺盛并且产生更多的IFNγ。与未修饰的人类T细胞不同，Cbl-b-/- T细胞对TGFβ介导的抑制具有抗性。
人Cbl-b-/-肿瘤浸润T细胞(靶向Cbl-b的TIL)对TGFβ和PDL1抑制具有抗性
将来自上述制备的人乳腺癌样本的野生型对照T细胞(WT CD8+ T)和Cbl-b-/- T细胞(Cbl-b-/- CD8+ T)用CFSE标记，并用人乳腺癌MDA-MB-231(MDA)细胞刺激，该细胞系为一种表达同种异体MHC-1和高水平PDL1和TGFβ的细胞系。培养72小时后，收获细胞，用抗CD8染色并在FACS上分析。图5中显示了响应于MDA-MB-231同种异体抗原并且抗TGFβ和PDL1抑制的增殖性CD8+(CFSElo)Cbl-b-/- CD8+ T细胞的百分比(图中矩形，总细胞的34.1％)。这与仅11.3％的CFSElo WT CD8+ T细胞(对应图中的矩形)形成对比。
在人肿瘤细胞系刺激后，人Cbl-b-/- TIL与未经修饰的人类T细胞相比增殖更旺盛
模拟转染的(对照细胞)或Cas9-sgRNACbl-b转染的人类TIL(Cbl-b-/-细胞)的增殖由“MDA选择物”细胞刺激。并用CFSE标记。MDA选择物细胞是用人共刺激分子CD80和CD83转染的MDA-MB-231细胞。在这种刺激条件下，与模拟转染的对应细胞(对照)相比，人Cbl-b-/-TIL(Cbl-b-/-细胞)表现出更多的细胞分裂(图6)。
人Cbl-b-/- T细胞与它们的Cbl-b未修饰的对应细胞相比表现出增强的对人肿瘤细胞系的细胞毒性
为了评估人Cbl-b-/- T细胞的抗肿瘤潜力，进行了体外杀伤测定。
将来自外周血的人类T细胞模拟转染或用Cas9-sgRNACbl-b核糖核蛋白复合体转染，并用CFSE标记。然后将这些细胞与“MDA选择物”肿瘤细胞共培养。肿瘤细胞刺激的T细胞增殖导致CFSElo T细胞的出现，而CFSEhi T细胞对“MDA选择物”肿瘤细胞刺激无反应。
通过FACS分选纯化CFSElo和CFSEhi T细胞。与靶MDA选择物肿瘤细胞共培养后，测定它们的INFγ产生(图7A)和肿瘤杀伤活性(图7B)。相对于模拟转染的T细胞(实心圆：CFSElo细胞)(图7B)，响应于MDA选择物刺激的人Cbl-b-/- T细胞(实心圆：CFSElo细胞)产生更多的IFN-γ(图7A)，并且表现出更高的肿瘤杀伤活性(通过更多的LDH释放来测量)。对肿瘤无反应的CFSEhi T细胞(实心正方形：CFSEhi细胞)具有非常低的肿瘤细胞杀伤活性或无肿瘤细胞杀伤活性。
图7显示：(A)用MDA-MB-231肿瘤细胞刺激后，T细胞培养物的上清液中的INF-γ产生的ELISA测量；(B)通过LDH释放测定法测量的肿瘤细胞死亡。LDH释放与细胞死亡成正比。实心圆：CFSElo细胞，其响应于MDA选择物细胞；实心方块：CFSEhi细胞，对MDA选择物肿瘤细胞无响应。
免疫受损(immunocopromised)小鼠中人类T细胞的体内扩增
将约106个人类T细胞静脉内输注到NSG小鼠中，以通过人类产IL-15细胞建立可以支持它们植入和扩增的条件。在本发明的条件下，输注T细胞28天后就可以轻易检测到循环中的人类T细胞(图8)。这表明人类T细胞能够在体内存活和扩增。因此，该小鼠系统提供了以下证据：当将少量的Cbl-b-/- T细胞给予人患者时，它们可以在存在IL-15的情况下扩增并存活以诱导持久的抗肿瘤活性。
序列表
<110> EZYBio
<120> TIC
<130> EZY021PCT
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> SEQ ID. 1
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<221> sgRNA
<400> 1
gagguccacc agauuagcuc ugg 23
<210> SEQ ID. 2
<211> 60
<212> DNA
<213> 大肠杆菌（Escherichia coli）
<221> 引物1
<400> 2
ttaatacgac tcactataga ggtccaccag attagctcgt tttagagcta gaaatagcaa 60
<210> SEQ ID. 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 大肠杆菌（Escherichia coli）
<221> 引物2
<400> 3
aaaagcaccg actcggtgcc a 21
<210> 4
<211> 455
<212> DNA
<213> 大肠杆菌（Escherichia coli）
<221> pUC57
<400> 4
tgtacaaaaa agcaggcttt aaaggaacca attcagtcga ctggatccgg taccaaggtc 60
gggcaggaag agggcctatt tcccatgatt ccttcatatt tgcatatacg atacaaggct 120
gttagagaga taattagaat taatttgact gtaaacacaa agatattagt acaaaatacg 180
tgacgtagaa agtaataatt tcttgggtag tttgcagttt taaaattatg ttttaaaatg 240
gactatcata tgcttaccgt aacttgaaag tatttcgatt tcttggcttt atatatcttg 300
tggaaaggac gaaacaccga gtgtggcgcg ggactgccgt tttagagcta gaaatagcaa 360
gttaaaataa ggctagtccg ttatcaactt gaaaaagtgg caccgagtcg gtgctttttt 420
tctagaccca gctttcttgt acaaagttgg catta 455
Claims (62)
1.一种药物组合物，其包含由免疫细胞修饰而来的Cbl-b-/-肿瘤抑制细胞(Cbl-b-/-TIC)群，其中所述Cbl-b-/- TIC具有失活的Cbl-b基因组等位基因且不具有Cbl-b的生物功能，并且其中所述Cbl-b-/- TIC不含所述免疫细胞外源的脱氧核糖核酸且不含所述免疫细胞外源的病毒核酸。
2.权利要求1所述的药物组合物，其中所述Cbl-b-/- TIC包括Cbl-b-/- CD8+ T细胞、Cbl-b-/- NK细胞或其组合。
3.权利要求1所述的药物组合物，其中所述Cbl-b-/- TIC包括Cbl-b-/- T细胞。
4.权利要求1所述的药物组合物，其中所述Cbl-b-/- TIC与受试者在组织学上相容。
5.权利要求4所述的药物组合物，其中所述免疫细胞来自受试者的外周血、受试者的淋巴器官、受试者的淋巴液、受试者的器官、受试者的组织或其组合。
6.权利要求4所述的药物组合物，其中所述免疫细胞是来自受试者的肿瘤、源自受试者的肿瘤的异种移植肿瘤或其组合的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)。
7.一种产生Cbl-b-/-肿瘤抑制细胞(TIC)的方法，该方法包括以下步骤：
a)使免疫细胞的基因组Cbl-b基因失活以产生Cbl-b-/- TIC，其中所述Cbl-b-/- TIC不具有Cbl-b生物功能、不含所述免疫细胞外源的脱氧核糖核酸且不含所述免疫细胞外源的病毒核酸。
8.权利要求7所述的方法，其中通过向所述免疫细胞中引入基因组修饰成分来使所述基因组Cbl-b基因失活，所述基因组修饰成分包含Cas9蛋白和靶向所述免疫细胞的基因组Cbl-b基因的sgRNACbl-b，并且其中所述基因组修饰成分不含所述免疫细胞外源的脱氧核糖核酸且不含病毒核酸。
9.权利要求8所述的方法，其中所述sgRNACbl-b包含核酸序列GAGGUCCACCAGAUUAGCUCUGG(SEQ ID.1)、与所述SEQ ID.1的序列具有80％至100％的同源性的核酸序列或其组合。
10.权利要求7所述的方法，其中所述免疫细胞包括未修饰的T细胞、未修饰的NK细胞或其组合。
11.权利要求7所述的方法，其中免疫细胞包括纯化的未修饰的T细胞。
12.权利要求7所述的方法，其中所述免疫细胞是来自受试者的肿瘤、源自受试者的肿瘤的异种移植肿瘤或其组合的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)。
13.权利要求12所述的方法，其中所述免疫细胞是从所述受试者的所述肿瘤分离的肿瘤浸润T细胞，并任选地扩增。
14.权利要求13所述的方法，其中所述受试者是人类受试者。
15.权利要求12所述的方法，其中所述异种移植肿瘤是通过将一部分肿瘤异种移植到哺乳动物中而产生。
16.权利要求7所述的方法，其中所述Cbl-b-/- TIC包括Cbl-b-/-CD8+ T细胞、Cbl-b-/- NK细胞或其组合。
17.权利要求7所述的方法，其中所述Cbl-b-/- TIC包含10％至100％的Cbl-b-/- T细胞，百分比是基于总Cbl-b-/- TIC群计。
18.权利要求7至17中任一项所述的方法，其还包括以下步骤：
b)在体外细胞培养物中增殖Cbl-b-/- TIC；和
c)从体外细胞培养物中收获Cbl-b-/- TIC。
19.一种用于治疗有此需要的受试者的肿瘤病症的方法，所述方法包括以下步骤：
a)使受试者的免疫细胞的基因组Cbl-b基因失活以产生Cbl-b-/-肿瘤抑制细胞(TIC)，其中所述Cbl-b-/- TIC具有失活的Cbl-b基因等位基因且不含Cbl-b生物功能，并且其中所述Cbl-b-/- TIC不含所述免疫细胞外源的脱氧核糖核酸且不含所述免疫细胞外源的病毒核酸；
b)任选地，在体外细胞培养物中增殖所述Cbl-b-/- TIC；和
c)将所述Cbl-b-/- TIC给予所述受试者。
20.权利要求19所述的方法，其中通过向所述免疫细胞中引入基因组修饰成分来使所述基因组Cbl-b基因失活，所述基因组修饰成分包含Cas9蛋白和靶向所述免疫细胞的基因组Cbl-b基因的sgRNACbl-b，并且其中所述基因组修饰成分不含所述免疫细胞外源的脱氧核糖核酸且不含病毒核酸。
21.权利要求19-20中任一项所述的方法，其中所述Cas9蛋白是修饰的重组Cas9蛋白，其包含来自未修饰的Cas9蛋白的C末端核定位信号区域。
22.权利要求19-21中任一项所述的方法，其中所述Cbl-b-/- TIC包括Cbl-b-/-CD8+ T细胞、Cbl-b-/- NK细胞或其组合。
23.权利要求19-22中任一项所述的方法，其中所述免疫细胞来自受试者的外周血、受试者的淋巴器官、受试者的淋巴液或其组合。
24.权利要求19-23中任一项所述的方法，其中所述受试者是人类受试者。
25.权利要求19-24中任一项所述的方法，其中所述受试者患有两种或更多种不同的肿瘤。
26.权利要求19-25中任一项所述的方法，其中给予所述受试者的Cbl-b-/- TIC的数量为约1×105至约5×107细胞/kg。
27.权利要求19-26中任一项所述的方法，其中所述Cbl-b-/- TIC是通过注射、输注或其组合给予所述受试者。
28.权利要求19-27中任一项所述的方法，其中所述免疫细胞是来自受试者的肿瘤、源自受试者的肿瘤的异种移植肿瘤或其组合的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)。
29.权利要求28所述的方法，其中所述异种移植肿瘤是通过将一部分肿瘤异种移植到哺乳动物中而产生。
30.权利要求19-29中任一项所述的方法，其还包括将癌症药物、检查点抑制剂或其组合给予所述受试者。
31.一种产生Cbl-b-/-肿瘤抑制细胞(TIC)的方法，该方法包括以下步骤：
a)通过以下步骤产生异种移植肿瘤：将受试者的一部分肿瘤分散到肿瘤细胞悬液中，任选地用一种或多种选择标记物从肿瘤细胞悬液中纯化肿瘤细胞以产生纯化的肿瘤细胞，并将肿瘤细胞悬液或纯化的肿瘤细胞移植到哺乳动物中以形成异种移植肿瘤；
b)从所述异种移植肿瘤获得肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)；
c)使TIL的基因组Cbl-b基因失活以产生Cbl-b-/- TIC，其中所述Cbl-b-/- TIC不具有Cbl-b的生物功能、不含肿瘤浸润淋巴细胞外源的脱氧核糖核酸且不含肿瘤浸润淋巴细胞外源的病毒核酸，其中通过将基因组修饰成分引入所述TIL中而使基因组Cbl-b基因失活，所述基因组修饰成分包含Cas9蛋白和靶向所述TIL的基因组Cbl-b基因的sgRNACbl-b，并且其中所述基因组修饰成分不含所述TIL外源的脱氧核糖核酸且不含病毒核酸。
32.权利要求31所述的方法，其中所述受试者是人类受试者。
33.一种药物组合物，其包含由免疫细胞修饰而来的肿瘤抑制细胞(TIC)群，其中所述TIC包含至少一种靶基因的至少一个失活的基因组等位基因且不具有所述靶基因的生物功能，并且其中所述TIC不含所述免疫细胞外源的脱氧核糖核酸且不含所述免疫细胞外源的病毒核酸。
34.权利要求33所述的药物组合物，其中所述至少一种靶基因包括Cbl-b、CTLA4、PD-1、LAG3、TIM3、CD73、KIR(杀伤细胞抑制受体)、Fas、AHR(芳烃受体)、Smad2、Smad4、TGFBR(TGFβ受体)、ILT-3或其组合。
35.权利要求33-34中任一项所述的药物组合物，其中所述TIC包括T细胞、B细胞、NK细胞或其组合。
36.权利要求33-35中任一项所述的药物组合物，其中所述TIC包括Cbl-b-/- CD4+ T细胞、Cbl-b-/- CD8+ T细胞、Cbl-b-/- NK细胞、PD-1-/- T细胞、PD-1-/- NK细胞、CTLA-4-/- T细胞、CTLA4-/- NK细胞、TIM-3-/- T细胞、TIM-3-/- NK细胞、KIP-/- T细胞、KIR-/- NK细胞、LAG3-/- T细胞、LAG3-/- NK细胞、CD73-/- T细胞、CD73-/- NK细胞、Fas-/- T细胞、Fas-/- NK细胞、AHR-/- T细胞、AHR-/- NK细胞、Smad2-/- T细胞、Smad2-/- NK细胞、Smad4-/- T细胞、Smad4-/- NK细胞、TGFBR-/- T细胞、TGFBR-/- NK细胞、ILT-3-/- T细胞、ILT-3-/- NK细胞或其组合。
37.权利要求33-36中任一项所述的药物组合物，其中所述TIC与受试者在组织学上相容。
38.权利要求37所述的药物组合物，其中所述免疫细胞来自受试者的外周血、受试者的淋巴器官、受试者的淋巴液或其组合。
39.权利要求38所述的药物组合物，其中所述免疫细胞包括来自受试者的肿瘤、源自受试者的肿瘤的异种移植肿瘤或其组合的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)。
40.一种产生肿瘤抑制细胞(TIC)的方法，该方法包括以下步骤：
a)使免疫细胞的至少一种靶基因的至少一个基因组等位基因失活以产生不具有所述靶基因的生物功能的TIC，其中所述TIC不含所述免疫细胞外源的脱氧核糖核酸且不含所述免疫细胞外源的病毒核酸；
其中所述至少一种靶基因包括Cbl-b、CTLA4、PD-1、LAG3、TIM3、CD73、KIR(杀伤细胞抑制受体)、Fas、AHR(芳烃受体)、Smad2、Smad4、TGFBR(TGFβ受体)、ILT-3或其组合。
41.权利要求40所述的方法，其中通过向所述免疫细胞中引入基因组修饰成分来使所述靶基因的基因组等位基因失活，所述基因组修饰成分包含Cas9蛋白和靶向所述免疫细胞的所述至少一种靶基因的至少一种sgRNA，并且其中所述基因组修饰成分不含所述免疫细胞外源的脱氧核糖核酸且不含病毒核酸。
42.权利要求40-41中任一项所述的方法，其中所述免疫细胞包括未修饰的T细胞、未修饰的NK细胞或其组合。
43.权利要求42所述的方法，其中免疫细胞包括纯化的未修饰的T细胞。
44.权利要求40-43中任一项所述的方法，其中所述免疫细胞包括来自受试者的肿瘤、源自受试者的肿瘤的异种移植肿瘤或其组合的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)。
45.权利要求44所述的方法，其中所述受试者是人类受试者。
46.权利要求45所述的方法，其中所述异种移植肿瘤是通过将受试者的一部分肿瘤异种移植到哺乳动物中而产生。
47.权利要求40-46中任一项所述的方法，其中所述TIC包括Cbl-b-/- CD8+ T细胞、Cbl-b-/- NK细胞或其组合。
48.权利要求40-47中任一项所述的方法，其中所述TIC包含10％至100％的Cbl-b-/- T细胞，百分比是基于总Cbl-b-/- TIC群计。
49.权利要求40-48中任一项所述的方法，其进一步包括以下步骤：
b)在体外细胞培养物中增殖TIC；和
c)从体外细胞培养物中收获TIC。
50.一种治疗有需要的受试者的肿瘤病症的方法，该方法包括以下步骤：
a)使受试者的免疫细胞的至少一种靶基因的至少一个基因组等位基因失活，以产生不具有所述靶基因的生物功能的肿瘤抑制细胞(TIC)，其中所述TIC不含所述免疫细胞外源的脱氧核糖核酸且不含所述免疫细胞外源的病毒核酸，并且其中所述靶基因选自Cbl-b、CTLA4、PD-1、LAG3、TIM3、CD73、KIR(杀伤细胞抑制受体)、Fas、AHR(芳烃受体)、Smad2、Smad4、TGFBR(TGFβ受体)、ILT-3或其组合；
b)任选地，在体外细胞培养物中增殖TIC；和
c)将所述TIC给予所述受试者。
51.权利要求50所述的方法，其中所述TIC不具有所述靶基因的至少两种生物功能。
52.权利要求50-51中任一项所述的方法，其中通过向所述免疫细胞中引入基因组修饰成分来使所述靶基因的基因组等位基因失活，所述基因组修饰成分包含Cas9蛋白和靶向所述免疫细胞的所述至少一种靶基因的至少一种sgRNA，其中所述基因组修饰成分不含所述免疫细胞外源的脱氧核糖核酸且不含病毒核酸。
53.权利要求50-52中任一项所述的方法，其中所述TIC包括Cbl-b-/- CD4+ T细胞、Cbl-b-/- CD8+ T细胞、Cbl-b-/- NK细胞、PD-1-/-T细胞、PD-1-/- NK细胞、CTLA-4-/- T细胞、CTLA4-/- NK细胞、TIM-3-/-T细胞、TIM-3-/- NK细胞、KIP-/- T细胞、KIR-/- NK细胞、LAG3-/- T细胞、LAG3-/- NK细胞、CD73-/- T细胞、CD73-/- NK细胞、Fas-/- T细胞、Fas-/- NK细胞、AHR-/-T细胞、AHR-/- NK细胞、Smad2-/- T细胞、Smad2-/- NK细胞、Smad4-/- T细胞、Smad4-/- NK细胞、TGFBR-/-T细胞、TGFBR-/- NK细胞、ILT-3-/- T细胞、ILT-3-/- NK细胞或其组合。
54.权利要求50-53中任一项所述的方法，其中所述免疫细胞来自受试者的外周血、受试者的淋巴器官、受试者的淋巴液或其组合。
55.权利要求50-54中任一项所述的方法，其中所述受试者是人类受试者。
56.权利要求50-55中任一项所述的方法，其中所述TIC是通过注射、输注或其组合给予受试者。
57.权利要求50-56中任一项所述的方法，其中所述免疫细胞是来自受试者的肿瘤、源自受试者的肿瘤的异种移植肿瘤或其组合的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)。
58.权利要求57所述的方法，其中所述异种移植肿瘤是通过将受试者的一部分肿瘤异种移植到哺乳动物中而产生。
59.权利要求50-58中任一项所述的方法，其还包括将癌症药物、检查点抑制剂或其组合给予所述受试者。
60.一种产生肿瘤抑制细胞(TIC)的方法，该方法包括以下步骤：
a)通过以下步骤产生异种移植肿瘤：将受试者的一部分肿瘤分散到肿瘤细胞悬液中，任选地用一种或多种选择标记物从肿瘤细胞悬液中纯化肿瘤细胞以产生纯化的肿瘤细胞，并将肿瘤细胞悬液或纯化的肿瘤细胞移植到哺乳动物中以形成异种移植肿瘤；
b)从所述异种移植肿瘤获得肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)；
c)通过向所述TIL中引入基因组修饰成分来使所述TIL的至少一种靶基因的至少一个基因组等位基因失活，所述基因组修饰成分包含Cas9蛋白和靶向所述TIL的所述靶基因的至少一种sgRNA，其中所述基因组修饰成分不含所述TIL外源的脱氧核糖核酸且不含病毒核酸；
其中所述靶基因包括Cbl-b、CTLA4、PD-1、LAG3、TIM3、CD73、KIR(杀伤细胞抑制受体)、Fas、AHR(芳烃受体)、Smad2、Smad4、TGFBR(TGFβ受体)、ILT-3或其组合。
61.权利要求60所述的方法，其中所述TIC包括Cbl-b-/- CD4+ T细胞、Cbl-b-/- CD8+ T细胞、Cbl-b-/- NK细胞、PD-1-/- T细胞、PD-1-/-NK细胞、CTLA-4-/- T细胞、CTLA4-/- NK细胞、TIM-3-/- T细胞、TIM-3-/- NK细胞、KIP-/- T细胞、KIR-/- NK细胞、LAG3-/- T细胞、LAG3-/- NK细胞、CD73-/- T细胞、CD73-/- NK细胞、Fas-/- T细胞、Fas-/- NK细胞、AHR-/- T细胞、AHR-/- NK细胞、Smad2-/- T细胞、Smad2-/- NK细胞、Smad4-/- T细胞、Smad4-/- NK细胞、TGFBR-/- T细胞、TGFBR-/- NK细胞、ILT-3-/- T细胞、ILT-3-/- NK细胞或其组合。
62.权利要求61所述的方法，其中所述受试者是人类受试者。
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Cited By (2)
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|---|---|---|---|---|
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Families Citing this family (2)
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|---|---|---|---|---|
| CN111662871A (zh) * | 2020-06-11 | 2020-09-15 | 福建医科大学孟超肝胆医院(福州市传染病医院) | 一种核酸适体功能化nk细胞及其制备与应用 |
| WO2022150392A1 (en) * | 2021-01-05 | 2022-07-14 | City Of Hope | Natural killer cells engineered to reduce or eliminate cbl-b and uses thereof |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20110287056A1 (en) * | 2006-09-13 | 2011-11-24 | The Government of the United States of America as represented by the Secretary of the Dept of the HH | Agents and methods to elicit anti-tumor immune response |
| NZ585646A (en) * | 2007-12-10 | 2012-05-25 | Univ Innsbruck | Method for increasing immunoreactivity of lymphocytes to antigen |
| US20170175128A1 (en) * | 2014-04-18 | 2017-06-22 | Editas Medicine, Inc. | Crispr-cas-related methods, compositions and components for cancer immunotherapy |
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Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20110287056A1 (en) * | 2006-09-13 | 2011-11-24 | The Government of the United States of America as represented by the Secretary of the Dept of the HH | Agents and methods to elicit anti-tumor immune response |
| NZ585646A (en) * | 2007-12-10 | 2012-05-25 | Univ Innsbruck | Method for increasing immunoreactivity of lymphocytes to antigen |
| CN106986919A (zh) * | 2008-10-01 | 2017-07-28 | 伊玛提克斯生物技术有限公司 | 抗神经元和脑肿瘤等几种肿瘤的新型免疫疗法 |
| US20170175128A1 (en) * | 2014-04-18 | 2017-06-22 | Editas Medicine, Inc. | Crispr-cas-related methods, compositions and components for cancer immunotherapy |
Non-Patent Citations (10)
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111705038A (zh) * | 2020-08-24 | 2020-09-25 | 江苏集萃药康生物科技有限公司 | 一种稳定表达人源pdl1/cd73蛋白细胞株的构建方法及其应用 |
| CN113577265A (zh) * | 2021-08-04 | 2021-11-02 | 诺赛联合(北京)生物医学科技有限公司 | Til细胞及其制备方法以及在癌症治疗中的用途 |
| CN113577265B (zh) * | 2021-08-04 | 2022-04-15 | 明济生物制药（北京）有限公司 | Til细胞及其制备方法以及在癌症治疗中的用途 |
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